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特許7375012ヒルジン突然変異体の抽出・精製方法およびその使用

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-10-27

(45)【発行日】2023-11-07

(54)【発明の名称】ヒルジン突然変異体の抽出・精製方法およびその使用

(51)【国際特許分類】

C07K 14/815 20060101AFI20231030BHJP

C07K 1/34 20060101ALI20231030BHJP

G01N 33/48 20060101ALI20231030BHJP

【ＦＩ】

C07K14/815 ZNA

C07K1/34

G01N33/48 K

【請求項の数】 18

(21)【出願番号】P 2021525292

(86)(22)【出願日】2019-04-16

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-07

(86)【国際出願番号】 CN2019082785

(87)【国際公開番号】W WO2020210965

(87)【国際公開日】2020-10-22

【審査請求日】2021-05-10

(73)【特許権者】

【識別番号】521198619

【氏名又は名称】サンゲンバイオサイエンスカンパニー，リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002572

【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】チェン，ジエペン

(72)【発明者】

【氏名】ドゥアン，リリ

(72)【発明者】

【氏名】チェン，ホングリュイ

(72)【発明者】

【氏名】フー，リウソン

(72)【発明者】

【氏名】チェン，ユファン

(72)【発明者】

【氏名】ホン，リン

(72)【発明者】

【氏名】シュー，ジカイ

(72)【発明者】

【氏名】イェ，ホングリン

(72)【発明者】

【氏名】ジ，イェユ

(72)【発明者】

【氏名】カイ，チュンリ

【審査官】小倉梢

(56)【参考文献】

【文献】中国特許出願公開第１０８２２０３６９（ＣＮ，Ａ）

【文献】特開昭６３－１５２９８７（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ１／００－１９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

大腸菌によりヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７（配列番号１）を発酵生産する発酵液からヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７を抽出・精製する方法であって、
大腸菌の発酵液を上昇した温度で処理することで、滅菌して不純物タンパク質を除去する工程、
滅菌された発酵液を、セラミックス膜または遠心分離機によって処理することで、菌体を除去する工程、
選択肢として、セラミックス膜または遠心分離機によって得られた発酵液を、限外ろ過膜によって処理することで、不純物タンパク質を除去する工程、
セラミックス膜または遠心分離機によって得られた発酵液、または限外ろ過膜によって得られた発酵液を、ナノろ過膜によって処理することで、粗分離された濃縮液を得る工程、
前記粗分離された濃縮液に、副材料として第一種の塩を添加して噴霧乾燥し、乾燥粉末を得る工程、
前記乾燥粉末を水に溶解し、ろ過して不純物を除去し、選択肢として、濾紙、サンドコア漏斗、または膜装置によってろ過を行う工程、
ろ液に対してモレキュラーシーブカラムクロマトグラフィーを１回のみ行い、水で溶出して溶出液を濃縮し、ヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７の粗生成物を得、前記モレキュラーシーブカラムクロマトグラフィーは、セファデックス(登録商標)Ｇ－２５（ｓｅｐｈａｄｅｘ(登録商標) Ｇ２５）、セファデックス(登録商標)Ｇ－５０（ｓｅｐｈａｄｅｘ(登録商標) Ｇ５０）、セファデックス(登録商標)Ｇ－７５（ｓｅｐｈａｄｅｘ(登録商標) Ｇ７５）、及びセファデックス(登録商標)Ｇ－１００（ｓｅｐｈａｄｅｘ(登録商標) Ｇ１００）からなる群から選ばれる工程、
前記ヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７の粗生成物を水に溶解した後、その中に第二種の塩または有機溶媒を添加することで、ヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７を沈殿させ、乾燥してヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７の純品を得て、選択肢として、真空乾燥を行い、さらに、選択肢として、凍結真空乾燥を行う工程、
を含む前記方法。

【請求項2】

高温滅菌された発酵液を遠心分離機によって処理し、選択肢として、前記遠心分離機が管状遠心分離機またはディスク型遠心分離機である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記高温での処理が、６５℃～６７℃で５～２０分間保持し、選択肢として１０分間保持する、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記第一種の塩または前記第二種の塩が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウムからなる群から選ばれる１種または２種以上である、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

モレキュラーシーブカラムクロマトグラフィーによって得られた溶出液の濃縮が、減圧真空濃縮、ナノろ過膜濃縮、または逆浸透膜濃縮によって行われる、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記有機溶媒が、エタノール、メタノール、アセトン、イソプロパノール、アセトニトリルからなる群から選ばれる１種または２種以上である、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

副材料として添加された第一種の塩のグラム単位の重量の数値は、粗分離された濃縮液のミリリットル単位の体積の数値の５％以上である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

前記乾燥粉末の溶解に用いる水のミリリットル単位の体積の数値は、前記乾燥粉末のグラム単位の重量の数値の１０倍以上である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

ヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７を沈殿させるために、添加された第二種の塩のグラム単位の重量の数値が、ヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７の粗生成物が溶解された水溶液のミリリットル単位の体積の数値の２０％～３０％であり、添加された有機溶媒の体積が、ヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７の粗生成物が溶解された水溶液の体積の５～９倍である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

前記大腸菌による発酵液が、ｐＢＨ－２を発現ベクターとするエシェリヒア・コリ株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ｐＢＨ２ＣＧＭＣＣＮｏ０９０８の培養によって生産されるものであり、選択肢として、前記培養は、好気条件下で、２５℃～３５℃の温度下で、対数増殖期終了まで培養した後、３５℃～４５℃まで昇温してヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７の収量がピークに達するまで培養を継続することを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

ヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７（配列番号１）の抗凝固採血管における使用であって、前記ヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７が、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法によって調製されるものであり、
前記抗凝固採血管が、血液一般、血液生化学、電解質、腫瘍マーカー、ホモシステイン、およびＢ型肝炎の５項目のうちの１種または２種以上を検出するための血液の収容用である、前記使用。

【請求項12】

前記ヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７の抗凝固活性が、１８０００ＡＴＵ／ｍｇ以上である、請求項１１に記載の使用。

【請求項13】

前記ヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７が、前記抗凝固採血管に直接添加される、請求項１１に記載の使用。

【請求項14】

前記ヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７が、コーティング層に含まれる形態で前記抗凝固採血管に適用される、請求項１１に記載の使用。

【請求項15】

前記ヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７の使用量は、８．５μｇ／ｍｌ血液である、請求項１３または１４に記載の使用。

【請求項16】

ヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７を、コーティング層に含まれる形態で前記抗凝固採血管に塗布した後、凍結真空乾燥によって前記コーティング層を乾燥する、請求項１４に記載の使用。

【請求項17】

ヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７（配列番号１）を抗凝固採血管に直接添加するか、またはヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７（配列番号１）を含むコーティング層を前記抗凝固採血管に塗布することを含み、前記ヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７は、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法によって生産されたヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７である、抗凝固採血管を製造する方法。

【請求項18】

前記ヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７の抗凝固活性が、１８０００ＡＴＵ／ｍｇ以上である、請求項１７に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願はバイオテクノロジー技術に関するものには限られず、特に大腸菌によりヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７（配列番号１）を発酵生産させる発酵液からヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７を抽出・精製する方法、およびこれにより得られる精製ヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７に関する。

【0002】

本願はさらに生体医療機器に関し、特に上記方法によって精製されたヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７の抗凝固採血管における使用に関する。

【背景技術】

【0003】

天然ヒルジン（Ｈｉｒｕｄｉｎ）は、ヒル（Ｌｅｅｃｈ）およびその唾液腺から抽出された複数種の活性成分の中で最も活性が著しく、最も多く研究されている成分であり、６５～６６個のアミノ酸からなる小分子タンパク質（ポリペプチド）である。ヒルはヒルジンを豊富に含み、ヒルジンはトロンビンに対して極めて強い抑制作用を有し、これまで発見された最も強いトロンビン天然特異抑制剤である。これは種々の血栓疾患、特に静脈血栓症、びまん性血管凝固症の治療に用いることができ、外科手術後の動脈血栓の形成の予防、血栓溶解後や血管再形成後の血栓の形成の予防にも使用することができ、体外血液循環および血液透析過程を改善することができる。顕微外科手術では、吻合部の血管塞栓による失敗がしばしば起こり、ヒルジンを採用して創傷癒合を促進することができる。研究によると、ヒルジンは腫瘍治療においても機能する。それは腫瘍細胞の転移を阻止することができ、線維肉腫、骨肉腫、血管肉腫、メラノーマ、白血病などの治療に有効であることが判明した。さらに、ヒルジンは、腫瘍における血流の促進により治療効果が増強されるため、化学療法と放射線療法とを配合することもできる。

【0004】

天然ヒルジンは生産能が低く、臨床上の使用量が多いため、中国国内外で多くの組換えヒルジンの研究が進められており、前世紀の８０年代末から天然ヒルジンと構造が類似し、機能が同じである組換えヒルジンを開発し、生産能が大きくなる。

【0005】

しかしながら、従来のタンパク質およびペプチド類の精製は、基本的に２種類または３種類以上の複数回のクロマトグラフィー分離を必要として純品を得ることができ、かつ溶出剤は多量の水および塩を含み、環境に対する汚染が大きく、汚水処理工程の負荷が大きい。

【0006】

現在、市場に使用されているヒルジン突然変異体は、抗凝固活性が１６０００ＡＴＵ／ｍｇであり、純度が９３％程度である。

【0007】

例えば、陳華友ら（安徽農業科学，２００９年，３７（３４）；１６７５７－１６７５９頁、および１６７６８頁）には、発酵液が、遠心分離され、トリクロロ酢酸で処理し、限外ろ過で濃縮・脱塩し、さらに陰イオン交換カラム、Ｓ１００モレキュラーシーブカラムに供し、最後に９５％の純品が得られることが開示されている。韋利軍ら（２００４年全国バイオテクノロジー学術セミナー論文集、１０４－１１２頁）には、マクロ孔質樹脂クロマトグラフィー、ＤＥＡＥクロマトグラフィー、逆相グラフィーを用いた３回のクロマトグラフィー法で分離して９５％の純品を得ることが開示されている。ただし、クロマトグラフィー工程が多いほど、コストが高くて時間がかかり、環境への汚染も大きくなる。

【0008】

したがって、プロセスが簡潔で、廃水が少なく、工業化に向けたスケールアップに適するヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７の抽出・精製方法が求められている。

【0009】

また、臨床生化学的検査において、血液検体の採取および分離が非常に重要であり、品質を保証する重要な一環である。従来の検体収集は、採血を開始してから血清の析出を機械的に検出するまで、長い時間を要する場合が多く、全自動生化学分析装置の効率性が制限されていた。一部の生化学的実験室はヘパリン抗凝固血漿を使用し、採血後に直ちに血漿を遠心分離して機械的に検出することができるが、ヘパリンナトリウムまたはヘパリンリチウム抗凝固血漿にかかわらず、何らかの生化学的指標に影響を与える。

【0010】

１９９７年に中国では真空採血技術を普及し始め、従来の採血方式に対する一回の重大な改善である。全閉システムで採血プログラムを完成するため、血液汚染やクロス感染の可能性を根本的に排除し、採血をより安全、より正確、より仕様化することで、普及および拡大しやすくなる。真空採血管内に、分離用ゲル、凝固促進剤、および様々な抗凝固剤を添加し、管キャップの色で異なる用途の採血管を区別することができる。

【0011】

近年、生化学検査において、凝固促進剤および分離用ゲルを含有する真空採血管は広く使用され、それは血液凝固の時間を大幅に短縮し、一般的に２０ｍｉｎ放置した後に血清を遠心分離することができるが、一定の割合の採血管の遠心分離効果が低く、血清にタンパク質が繊維状又はかたまりに凝固することが存在する。分離用ゲルは、複数種の化合物からなる半固形不活性ゲルであり、血清各成分の含有量に影響を与えないが、凝固促進管は凝固促進剤の原料の産地、性質、製造プロセスの違いにより、生化学的検出に異なる影響を与える可能性がある。

【0012】

天然ヒルジンは、吸血ヒル（蛭）の唾液腺から抽出し、分離して得られたポリペプチドであり、ヒル体内の重要な活性成分であるが、生産量が極めて限定され、臨床使用の要求を満たすことができない。

【0013】

そのため、抗凝固活性がより高く、供給源がより安定する抗凝固剤が求められている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0014】

以下、本発明の概要について詳細に説明する。本概要は特許請求の範囲を限定するためのものではない。

【0015】

本願は、プロセスが簡潔で、廃水が少なく、工業化に向けたスケールアップに適するヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７の抽出・精製方法を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0016】

本願の実施形態において、本願は、大腸菌によりヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７（配列番号１）を発酵生産するの発酵液からヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７を抽出・精製する方法を提供し、前記方法は、
大腸菌の発酵液を上昇した温度で処理することで、滅菌して不純物タンパク質を除去する工程、
滅菌された発酵液を、セラミックス膜または遠心分離機によって処理することで、菌体を除去する工程、
選択肢として、セラミックス膜または遠心分離機によって得られた発酵液を、限外ろ過膜によって処理することで、不純物タンパク質を除去する工程、
セラミックス膜または遠心分離機によって得られた発酵液、または限外ろ過膜によって得られた発酵液を、ナノろ過膜によって処理することで、粗分離された濃縮液を得る工程、
前記粗分離された濃縮液に、副材料として塩を添加して噴霧乾燥し、乾燥粉末を得る工程、
前記乾燥粉末を水に溶解し、ろ過して不純物を除去し、選択肢として、濾紙、サンドコア漏斗、または膜装置によってろ過を行う工程、
ろ液に対してモレキュラーシーブカラムクロマトグラフィーを１回のみ行い、水で溶出して溶出液を濃縮し、ヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７の粗生成物を得る工程、
前記ヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７の粗生成物を水に溶解した後、その中に塩または有機溶媒を添加することで、ヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７を沈殿させ、乾燥してヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７の純品を得る工程、を含む。

【0017】

上記または他の実施形態において、上昇した温度は６５℃、７５℃のような温度などの滅菌が可能な高温であり得る。

【0018】

上記または他の実施形態において、前記乾燥は真空乾燥であり得る。

【0019】

上記または他の実施形態において、前記乾燥は凍結真空乾燥であり得る。

【0020】

上記または他の実施形態において、遠心分離機により、滅菌された発酵液を処理する。

【0021】

上記または他の実施形態において、遠心分離機は管状遠心分離機またはディスク型遠心分離機であり得る。

【0022】

ここで、セラミックス膜処理または遠心分離機処理の目的は菌体を除去することであり、限外ろ過膜処理の目的は不純物タンパク質を除去することであり、かつナノろ過膜処理の目的は濃縮することである。

【0023】

上記または他の実施形態において、前記高温での処理は６５℃～６７℃で５～２０分間保持し、選択肢として１０分間保持する。

【0024】

上記または他の実施形態において、前記塩は塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウムからなる群から選ばれる１種または２種以上である。

【0025】

上記または他の実施形態において、前記モレキュラーシーブカラムクロマトグラフィーはｓｅｐｈａｄｅｘＧ２５、ｓｅｐｈａｄｅｘＧ５０、ｓｅｐｈａｄｅｘＧ７５、およびｓｅｐｈａｄｅｘＧ１００からなる群から選ばれることができる。当業者が理解できるように、上記のようなモレキュラーシーブカラムクロマトグラフィーはすべて市販品である。このうち、モレキュラーシーブカラムクロマトグラフィーを使用する主な目的は、色素、塩、およびヒルジンとの分子量の差が大きいポリペプチドおよび多糖を除去することである。

【0026】

上記または他の実施形態において、モレキュラーシーブカラムクロマトグラフィーによって得られた溶出液の濃縮は、減圧真空濃縮、ナノろ過膜濃縮、または逆浸透膜濃縮によって行われる。

【0027】

上記または他の実施形態において、前記有機溶媒は、エタノール、メタノール、アセトン、イソプロパノール、アセトニトリルからなる群から選ばれる１種または２種以上であり得る。

【0028】

上記または他の実施形態において、副材料として添加される塩のグラム単位の重量は、粗分離された濃縮液に基づいてミリリットル単位の体積の５％以上であり、選択肢として１０％以上である。本願の本発明者らは、上記のように重量体積分率が５％以上の量で塩を添加すると、本願の精製目的を達成し、添加される塩が５％未満であると、ヒルジンの損失が大きくなる一方で、添加される塩が多すぎると、コストがかかりすぎることを見出した。

【0029】

上記または他の実施形態において、前記乾燥粉末の溶解に用いる水のミリリットル単位の体積は、前記乾燥粉末のグラム単位の重量の１０倍以上である。ここで、乾燥粉末を溶解するために一定量の水を選ぶ目的は、塩のグラム単位の重量を、水溶液に基づくミリリットル単位の体積の５％以下に保つことにより、水不溶性の一部の不純物タンパク質をろ過して除去できることである。

【0030】

上記または他の実施形態において、ヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７を沈殿させるために、添加された塩のグラム単位の重量は、ヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７の粗生成物が溶解された水溶液のミリリットル単位の体積の２０％～３０％であり、添加された有機溶媒の体積は、ヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７の粗生成物が溶解された水溶液の体積の５～９倍である。

【0031】

ここで、組換えヒルジンを再沈殿させる工程は、ヒルジンとの分子量の差が小さい多糖およびポリペプチドを除去するためである

【0032】

上記または他の実施形態において、前記大腸菌の発酵液は、ｐＢＨ－２を発現ベクターとするエシェリヒア・コリ株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ｐＢＨ２ＣＧＭＣＣＮｏ０９０８の培養によって生産される。

【0033】

上記または他の実施形態において、前記培養は、好気条件下で、２５℃～３５℃の温度下で、対数増殖期終了まで培養した後、３５℃～４５℃まで昇温してヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７の収量がピークに達するまで培養を継続することを含む。

【0034】

本願において、ヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７の発酵液の取得については、中国出願番号２０１７１１２６２８１０．４の特許出願における生産方法を参照することができる。ここで、中国出願番号２０１７１１２６２８１０．４の特許出願は参照により本明細書に取り込まれ、本願のヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７は出願番号２０１７１１２６２８１０．４の特許出願において「組換えヒルジン」と呼ばれる。したがって、本願において、「ヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７」と「組換えヒルジン」は同じ物質を表わし、同義的に使用され得る。

【0035】

本願は、従来技術と比較して、膜技術、および１回のカラムクロマトグラフィー技術を採用し、水溶出のみを使用し、プロセスが簡潔で、廃水が少なく、工業化に向けたスケールアップでのヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７の生産に適する。

【0036】

別の態様では、本願は、以上の方法のいずれかに従って生産されたヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７を提供する。

【0037】

また、別の態様では、本願は、以上の方法のいずれかに従って生産された、抗凝固活性が１８０００ＡＴＵ／ｍｇ以上であり得るヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７を提供する。抗凝固活性が純度と異なることは当技術分野で知られ、抗凝固活性とは、タンパク質１ｍｇあたりの生物学的活性単位を指し、純度が高い場合、抗凝固活性が必ずしも高いとは限らず、これは活性タンパク質が立体配座の微細な変化により活性が低下する可能性があるためである。

【0038】

さらなる態様では、本願は、ヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７の抗凝固採血管における使用を提供する。

【0039】

上記または他の実施形態において、前記ヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７の抗凝固活性は１８０００ＡＴＵ／ｍｇ以上であり得る。

【0040】

上記または他の実施形態において、前記ヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７は、ｐＢＨ－２を発現ベクターとするエシェリヒア・コリ株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ｐＢＨ２ＣＧＭＣＣＮｏ０９０８の培養によって生産されるものであり、前記ヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７の抗凝固活性は１８０００ＡＴＵ／ｍｇ以上であり得る。

【0041】

上記または他の実施形態において、前記ヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７は、前記抗凝固採血管に直接添加される。

【0042】

上記または他の実施形態において、前記ヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７は、コーティング層に含まれる形態で前記抗凝固採血管に適用される。

【0043】

上記または他の実施形態において、前記ヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７の使用量は８．５ｕｇ／ｍｌ血液であり得る。

【0044】

上記または他の実施形態において、ヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７を、コーティング層に含まれる形態で前記抗凝固採血管に塗布した後、凍結真空乾燥によって前記コーティング層を乾燥することができる。本願の本発明者らは実験において、凍結真空乾燥によってヒルジン活性が失われないことを発見した。

【0045】

上記または他の実施形態において、前記抗凝固採血管は、血液一般、血液生化学、電解質、腫瘍マーカー、ホモシステイン、およびＢ型肝炎の5項目のうちの１種または２種以上を検出するための血液の収容用であり得る。本願のヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７は高純度であるため、検出結果に干渉がない。

【0046】

また、別の態様では、本願は、直接添加されたヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７を有し、またはヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７を含むコーティング層が塗布されてもよい抗凝固採血管を提供する。

【0047】

【0048】

本願の抗凝固採血管において、添加される必要があるヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７は相応に減少し、元の０．０１ｍｇ／ｍｌ血液から８．５μｇ／ｍｌ血液まで減少される。採血管の生産加工過程において、一般的に使用されるプロセスは高温乾燥であり、ヒルジン活性が１０％程度損失し、本願が凍結真空乾燥方法を採用し、ヒルジン活性活性が失われない。さらに、本願に使用されるヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７は高純度であるため、血液指標検出の際にほとんど干渉しない。

【発明の効果】

【0049】

本願の本発明者らは大量の臨床実験研究により、血液一般、血液生化学、電解質、腫瘍マーカー、ホモシステイン、およびＢ型肝炎の5項目などの複数の項目の検出に用いるヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７を含む抗凝固採血管を採用できることを見出した。ヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７を採血管の抗凝固剤とすることは、抗凝固剤の使用量が少なく、反応速度が速く、抗凝固処理をされた血漿の測定項目への干渉がないことが特徴であり、さらに、血液の本来の性状や特性、形態を保持することができ、他の抗凝固剤よりも血液に対する干渉が小さく、溶血現象がなく、偽性血小板減少現象がなく、重金属や不純物の干渉がなく、カルシウム系物質の数値の補正が不要である。

【0050】

さらに、実験によれば、抗凝固剤としてヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７を用いることで、いくつかの色の真空採血管を１つの採血管で置換することができ、医療従事者が採血管の色を区別して当該採血試料の所望用途を特定する負荷を徹底的に軽減し、医療従事者の作業負荷や誤差を軽減することができることが証明された。また、患者の採血量を少なくしたり、医療用ゴミの発生を低減したりすることができ、重大な社会的利益と経済的利益を有している。

【0051】

ここで、本願のヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７のアミノ酸配列は以下の通りである。
ＩｌｅＴｈｒＴｙｒＴｈｒＡｓｐＣｙｓＴｈｒＧｌｕＳｅｒＧｌｙＧｌｎＡｓｎＬｅｕＣｙｓＬｅｕＣｙｓＧｌｕＧｌｙＳｅｒＡｓｎＶａｌＣｙｓＧｌｙＬｙｓＧｌｙＡｓｎＬｙｓＣｙｓＩｌｅＬｅｕＧｌｙＳｅｒＡｓｎＧｌｙＬｙｓＧｌｙＡｓｎＧｌｎＣｙｓＶａｌＴｈｒＧｌｙＧｌｕＧｌｙＴｈｒＰｒｏＬｙｓＰｒｏＧｌｕＳｅｒＨｉｓＡｓｎＡｓｎＧｌｙＡｓｐＰｈｅＧｌｕＧｌｕＩｌｅＰｒｏＧｌｕＧｌｕＴｙｒＬｅｕＧｌｎ（配列番号１）
ジスルフィド結合位置：Ｃｙｓ６－Ｃｙｓ１４；Ｃｙｓ１６－Ｃｙｓ２８；Ｃｙｓ２２-Ｃｙｓ３９。

【0052】

天然ヒルジンに比べて、本願のヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７または組換えヒルジンは、天然ヒルジンの４７位のアスパラギンをリジンで置換したものである。

【0053】

図面および詳細な説明を読んで理解すると、その他の点でも明らかである。

【図面の簡単な説明】

【0054】

図面は本願の技術的解決手段をさらに理解するために提供したものであり、明細書の一部を構成し、本願の実施例とともに本願の技術的解決手段を解釈するためのものであり、本願の技術的解決手段の制限を構成するものではない。

【0055】

【図1】図１は実施例１で作製したヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７の電気泳動図である。

【図2】図２は実施例１で作製したヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７のＨＰＬＣ図であり、保持時間１８．９９１ｍｉｎのピークはヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７の対応ピークである。

【図3】図３はヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７のアミノ酸残基の配列図である。

【図4】図４は生体分子データベースのウェブページ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／）におけるヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７を模擬した３次元構造図である。

【発明を実施するための形態】

【0056】

本願の目的、技術的解決手段および利点をより明確にするために、以下では図面を参照しながら本願の実施例を詳細に説明する。なお、衝突しない場合、本願における実施例および実施例における特徴は互いに任意に組み合わせることが可能である。

【0057】

実施例１
発酵液の調製
ｐＢＨ－２工学菌（受託番号：ＣＧＭＣＣＮｏ．０９０８）のグリセロール受託菌を接種量５％で発酵培地に接種した。容量が１０ｍｌ／１００ｍｌの三角フラスコで、培養温度が３０℃で、回転数が２７０ｒｐｍである。好気条件下で、接種後に測定した菌液のＯＤ値の安定化、すなわち対数増殖期の終了まで発酵し、３．５時間かかり、その後、５分間で４０℃まで昇温し、顕微鏡検査でクリスタルバイオレット染色の後に菌体の着色が浅くなるまで培養を継続し、１１．５時間かかる。発酵周期は１５時間である。

【0058】

具体的な操作については出願番号２０１７１１２６２８１０．４の実施例２を参照する。

【0059】

ここで、培地は、グルコース１０ｇ／Ｌ、スクロース１０ｇ／Ｌ、酵母粉末１０ｇ／Ｌ、トリプトン１０ｇ／Ｌ、塩化アンモニウム０．５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．９ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム２ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１ｇ／Ｌ、硫酸ナトリウム５．０ｇ／Ｌ、クエンナトリウム０．８７ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１６ｇ／Ｌ、ビタミンＢ１０．０５ｍｇ／Ｌ、微量元素－硫酸第一鉄４０ｍｇ／Ｌ、硫酸アルミニウム２８ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン６．１ｍｇ／Ｌ、塩化コバルト４ｍｇ／Ｌ、塩化亜鉛０．９５ｍｇ／Ｌ、モリブデン酸ナトリウム２．１６ｍｇ／Ｌ、ホウ酸０．５ｍｇ／Ｌ、硫酸銅２．９３ｍｇ／Ｌ、硝酸ニッケル３２ｍｇ／Ｌからなり、ｐＨが７．２である。接種時に抗生物質ＡＭＰ０．５ｇ／Ｌを添加する。ここで、本実施例および以下の実施例において、ｇ／ＬにおけるＬは最終発酵培地の体積である。

【0060】

ここで、材料の由来は以下の表に示すとおりである

【0061】

以下の工程により、上記発酵液からヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７を抽出・精製する。
１）発酵液を６５℃で５ｍｉｎ高温滅菌して不純物を除去する工程、
２）工程１）における滅菌された発酵液を、管状遠心分離機（遼陽振興真空装置廠ＧＱＢ－７７０）によって遠心分離し、大腸菌を除去する工程、
３）工程２）における遠心分離された上澄みに対して、限外ろ過膜（廈門三達膜科技有限公司、型番：ＮＦＭ－８４Ｓ－６／３）によって不純物タンパク質を除去する工程、
４）工程３）における限外ろ過による透析液を、ナノろ過膜（廈門三達膜科技有限公司、型番：ＵＦＭ－８４Ｓ－２）によって濃縮して、粗分離された濃縮液を得る工程、
５）工程４）で得られた粗分離された濃縮液に、副材料として塩化ナトリウムを添加して噴霧乾燥し、乾燥粉末を得て、ここで、副材料として添加された塩のグラム単位の重量が、粗分離された濃縮液のミリリットル単位の体積の１０％である工程、
６）工程５）で得られた乾燥粉末を水に溶解し、ろ過して不純物を除去し、ろ液を得て、ここで、前記乾燥粉末の溶解に用いる水のミリリットル単位の体積が、前記乾燥粉末のグラム単位の重量の１０倍である工程、
７）工程６）におけるろ液を、モレキュラーシーブカラムクロマトグラフィー（ｓｅｐｈａｄｅｘＧ５０、メーカー：ＧｅｎｅｒａｌＥｌｅｃｔｒｉｃＣｏｍｐａｎｙ（ＧＥ））によって１回精製させ、純水で溶出し、溶出液を減圧して真空濃縮する工程、
８）工程７）得られた濃縮液に、９倍体積のエタノールを添加し、ヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７を沈殿させ、沈殿物を減圧真空乾燥によって得る工程。

【0062】

上記で作製したヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７について電気泳動分析を行った。図１に示すように、得られた電気泳動図に単一のバンドが呈しており（図１におけるヒルジン１に対応する図を参照。ここで、ヒルジン１は本願で作製したヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７を表す）、かつ電気泳動法により、得られた組換えヒルジン純品の分子量が理論値と一致することが確認された。

【0063】

ここで、電気泳動の操作条件は、濃縮ゲル３％、分離用ゲル１５％、試料ローディング量３０ｕＬ（１万ＡＴＵ／ｍｌ）、先の電圧１００ｖ、ゲル電気泳動時間１ｈ、次の電圧２００Ｖ、ゲル電気泳動時間２．２ｈである。

【0064】

電気泳動の具体的な操作は以下の通りである。
１、既製ゲルをｍｉｎｉ電気泳動計に装着し、ゲルの上部よりも高くなるように、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動緩衝液を加え、試料槽の櫛歯を抜き出した。
２、試料４０ｕＬを取り、５×タンパク質試料ローディング緩衝液１０ｕＬを加え、均一に混合した後、１００℃で５ｍｉｎ水浴し、４０ｕＬを取り、ゲルにおける試料槽に加えた。
３、試料ローディング完了後、電気泳動計を電源に接続し、電圧を１５０Ｖの定電圧とし、時間を５０ｍｉｎ程度とし、ブロモフェノールブルーのラインがゲルの底部に到着するまで電気泳動した。
４、２０ｍｉｎ固定し、２０ｍｉｎ染色し、２ｈ脱色した後、結果を観察した。

【0065】

抗凝固活性分析により、作製したヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７の生化学方法により測定した抗凝固活性は、１７０００ＡＴＵ／ｍｇであると計算した。具体的な抗凝固活性の測定については２００５年版の「中国薬典」の第８４頁左欄を参照ください。また、ゲル電気泳動におけるバンドの比率から算出したヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７の純度はすでに９５％に達していた。

【0066】

また、ＨＰＬＣの測定により、作製したヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７に有意に大きなヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７のピークが確実に存在することが確認された。図２に示す。

【0067】

実施例２
工程２）においてディスク型遠心分離機（Ａｌｆａｌａｖａｌｓｔａｉｎｌｅｓｓｐｒｏｄｕｃｔｓｓｋｏｇｓｔｏｐ：８８１０９５－０５－Ｓ／０１）を用いて大腸菌を除去し、工程５）において副材料として添加された塩のグラム単位の重量を、粗分離された濃縮液のミリリットル単位の体積の８％とした以外は、実施例１の方法と同様に、ヒルジン突然変異体ＨＶ２－Ｌｙｓ４７を調製・精製した。

【0068】