▶ マイクロバイオ・プロプライエタリー・リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-11-01
(45)【発行日】2023-11-10
(54)【発明の名称】バイオマーカーおよびその使用
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/04 20060101AFI20231102BHJP
C12Q 1/689 20180101ALI20231102BHJP
C12Q 1/6874 20180101ALI20231102BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20231102BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20231102BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20231102BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/04
C12Q1/689 Z ZNA
C12Q1/6874
C12N15/09 Z
C12M1/00 A
C12M1/34 B
【請求項の数】
14
(21)【出願番号】P 2020514306
(86)(22)【出願日】2018-05-17
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-07-09
(86)【国際出願番号】 AU2018050471
(87)【国際公開番号】W WO2018209398
(87)【国際公開日】2018-11-22
【審査請求日】2021-05-11
(31)【優先権主張番号】2017901846
(32)【優先日】2017-05-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】519408401
【氏名又は名称】マイクロバイオ・プロプライエタリー・リミテッド
【氏名又は名称原語表記】Ｍｉｃｒｏｂｉｏ Ｐｔｙ Ｌｔｄ
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100138911
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻井 陽子
(72)【発明者】
【氏名】フラビア・ハイゲンス
【審査官】小倉 梢
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１６－５２０３１４（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００ － １５／９０
Ｃ１２Ｑ １／００ － １／７０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
試料中の、Acinetobacter calcoaceticus；Enterobacter aerogenes；Enterobacter cloacae；Enterococcus faecalis；Enterococcus faecium；Escherichia coli；Klebsiella pneumoniae；Proteus mirabilis；Pseudomonas aeruginosa；Serratia marcescens；Staphylococcus aureus；Staphylococcus epidermidis；Streptococcus agalactiae；Streptococcus pneumoniaeおよびStreptococcus pyogenesからなる群から選択される少なくとも１つの細菌を同定または分類する方法であって、前記試料からの細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子または遺伝子生成物の少なくとも一部分を、その中の、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７および６５３に対応する位置における一塩基多型（ＳＮＰ）の存在の有無について分析することを含み、前記試料中の前記少なくとも１つの細菌は、下記の基準にしたがって同定または分類される方法：
（Ａ）前記少なくとも１つの細菌が、２７３位にＡがあり６５３位にＴがあるとき、グラム陽性細菌であると判定され；または
（Ｂ）前記少なくとも１つの細菌が、４４０位にＴがあるとき、グラム陽性細菌であると判定され；または
（Ｃ）前記少なくとも１つの細菌が、４１２位にＴがあるとき、Staphylococcus aureusであると同定され；または
（Ｄ）前記少なくとも１つの細菌が、６４７位にＧがあるとき、Enterococcus属に属すると分類され；または
（Ｅ）前記少なくとも１つの細菌が、６５３位にＧがあるとき、Enterobacter cloacaeであると同定され；または
（Ｆ）前記少なくとも１つの細菌が、３７８位にＡがあり４８８位にＴがあるとき、または４８８位および６４７位にＴがあるとき、Streptococcus pneumoniaeであると同定され；または
（Ｇ）前記少なくとも１つの細菌が、３７８位にＡがあり４８８位または６４７位にＡがあるとき、Streptococcus agalactiaeであると同定され；または
（Ｈ）前記少なくとも１つの細菌が、３７８位にＧがあり４８８位または６４７位にＡがあるとき、Streptococcus pyogenesであると同定され；または
（Ｉ）前記少なくとも１つの細菌が、２７３位、４４０位および６４７位にＡがあるとき、Acinetobacter calcoaceticusであると同定され；または
（Ｊ）前記少なくとも１つの細菌が、２７３位にＴがあり６５３位にＴがあるとき、Escherichia coliであると同定され；または
（Ｋ）前記少なくとも１つの細菌が、２７３位にＴがあり４８８位および６４７位にＣがあり６５３位にＡがあるとき、Klebsiella pneumoniaeであると同定され；または
（Ｌ）前記少なくとも１つの細菌が、４４０位および４８８位にＣがあり６４７位にＴがあるとき、Proteus mirabilisであると同定され；または
（Ｍ）前記少なくとも１つの細菌が、４４０位にＡがあり６４７位にＴがあるとき、Pseudomonas aeruginosaであると同定される。
【請求項2】
種を区別するために融解曲線分析を用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
Staphylococcus aureusおよびStaphylococcus epidermidisが、４１２位のＳＮＰの周囲のＤＮＡの高分解能融解曲線分析に基づいて互いから区別され；Enterococcus faecalisおよびEnterococcus faeciumが、６４７位のＳＮＰの周囲のＤＮＡの高分解能融解曲線分析に基づいて互いから区別され；Serratia marcescensおよびEnterobacter aerogenesが、４４０位、４８８位および６４７位のいずれか１つにあるＳＮＰの周囲のＤＮＡの高分解能融解曲線分析に基づいて互いから区別され；またはEnterococcus faecalis、Enterococcus faecium、Streptococcus agalactiaeおよびStreptococcus pyogenesが、３７８位のＳＮＰの周囲のＤＮＡの高分解能融解曲線分析に基づいて互いから区別される、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記試料が、喀痰、血液、脳脊髄液または尿を含む生体試料である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
前記分析工程が、高分解能融解分析、５’ヌクレアーゼ消化、分子ビーコン、オリゴヌクレオチドライゲーション、マイクロアレイ、制限断片長多型、抗体検出方法、直接配列決定または任意のその組合せを使用して前記ＳＮＰの存在の有無を判定することを含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
前記少なくとも１つの細菌が処置剤に抵抗性であるかどうか判定する工程をさらに含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
前記試料が、配列番号１６～３５に示すヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドを含む単離されたプローブのパネルと合わせられ、ここで、各プローブのオリゴヌクレオチドが配列番号１６～３５の１つに示すヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記単離されたプローブのパネルがアレイまたはバイオチップに含まれる、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
対象におけるAcinetobacter calcoaceticus；Enterobacter aerogenes；Enterobacter cloacae；Enterococcus faecalis；Enterococcus faecium；Escherichia coli；Klebsiella pneumoniae；Proteus mirabilis；Pseudomonas aeruginosa；Serratia marcescens；Staphylococcus aureus；Staphylococcus epidermidis；Streptococcus agalactiae；Streptococcus pneumoniaeおよびStreptococcus pyogenesからなる群から選択される少なくとも１つの細菌による細菌感染の診断を支援する、または抗生物質による処置の決定を支援する方法であって、前記対象から採取された試料において少なくとも１つの細菌を請求項１から８のいずれかに記載の方法によって同定または分類すること；および
該同定または分類の結果を、前記診断の支援または前記抗生物質による処置の決定の支援として提供すること
を含む、方法。
【請求項10】
試料中の、Acinetobacter calcoaceticus；Enterobacter aerogenes；Enterobacter cloacae；Enterococcus faecalis；Enterococcus faecium；Escherichia coli；Klebsiella pneumoniae；Proteus mirabilis；Pseudomonas aeruginosa；Serratia marcescens；Staphylococcus aureus；Staphylococcus epidermidis；Streptococcus agalactiae；Streptococcus pneumoniaeおよびStreptococcus pyogenesからなる群から選択される少なくとも１つの細菌を同定または分類することが可能である単離されたプローブのパネルであって、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子または遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７および６５３に対応する位置における一塩基多型（ＳＮＰ）と結合すること、前記ＳＮＰを検出することまたはその存在の有無を同定することが可能である、単離されたプローブのパネル。
【請求項11】
前記単離されたプローブが、配列番号１６～３５に示すヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを含み、ここで、各プローブのオリゴヌクレオチドが配列番号１６～３５の１つに示すヌクレオチド配列を含む、請求項１０に記載の単離されたプローブのパネル。
【請求項12】
請求項１０または請求項１１に記載の単離されたプローブのパネルを含むアレイ。
【請求項13】
固体基材および請求項１０または請求項１１に記載の単離されたプローブのパネルを含むバイオチップ。
【請求項14】
試料中の少なくとも１つの細菌を分類または同定するためのキットであって、請求項１０もしくは請求項１１に記載の単離されたプローブのパネル；請求項１２に記載のアレイ；または請求項１３に記載のバイオチップを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、微生物を同定および／または分類する方法および薬剤に一般的に関する。本方法および薬剤は、細菌の場合１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子または遺伝子生成物の中の、ならびに酵母生物体および糸状菌の場合１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子または遺伝子生成物の中の多型の検出に基づく。本発明は、本発明の診断方法に基づく細菌、酵母生物体または糸状菌の感染症の治療のための方法も特徴とする。
【背景技術】
【0002】
試料中の微生物（細菌など）、酵母生物体および糸状菌の迅速で正確な同定または分類が非常に望ましい。
【0003】
第１に、および最も重要なこととして、そのような感染症の迅速で正確な診断は、有効な治療または療法の早期の実行を可能にすることによって、患者の生死の分かれ目となる可能性がある。
【0004】
迅速で正確な同定または分類は、さもなければ生物体の福祉または溶液、材料もしくは食品の生産の質に対する脅威をもたらすかもしれない、汚染された溶液、材料または食品中の微生物、酵母生物体または糸状菌を管理、制御、根絶および／または除去する有効な制御措置の実行を助けることができる。
【0005】
さらに、迅速で正確な同定または分類は、試料中の天然の微生物、酵母生物体および糸状菌集団で、例えば、例えば、微生物多様性、門スペクトルおよび／または相対的門存在度の生態学的研究のために、または例えば腸、呼吸および皮膚の障害などの生物体の病的状態における正常状態からの平衡の逸脱をモニタリングするために助けることができる。
【0006】
療法、治療またはモジュレーションの後に、微生物、酵母または糸状菌を迅速におよび正確に同定または分類することが望ましいこともある。例えば、迅速な微生物同定または分類は、抗生物質、ステロイド、免疫モジュレータ、事前事後の生物質、土または水処理、濾過、滅菌処置および消毒剤の使用の分析で有益であることがある。
【0007】
現在、市販されているほとんどの診断技術は、培養を使用した試料からの生きている微生物、酵母生物体および糸状菌の単離および同定を一般的に必要とするが、この技術は、かなりのターンアラウンド時間ならびに最適以下の感度、特異性および的中率からマイナスの影響を受ける。それは、生物体のより広範囲にわたる取扱いを必要とすることもあり、そのことは、特にセキュリティに敏感な生物剤などの一部の生物体のために特に望ましくないかもしれない。
【0008】
利用可能な代替の診断技術には、特に培養と併用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用が含まれる。しかし、そのような技術の問題は、培養の結果または関連した臨床上のもしくは身体的症状の不在下での初期の陽性ＰＣＲ結果への信頼の欠如である。そのような技術の別の問題は、培養と同様に、宿主核酸のバックグラウンドにおける少量の微生物核酸を検出しようと試みるときの感度および特異性の欠如である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
したがって、細菌、酵母生物体および／または糸状菌の正確な診断のための迅速で信頼できる技術への認知された必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【0010】
様々な態様では、本発明は、細菌を含む原核生物の間での１６Ｓ（スベドベリ単位）リボソームＲＮＡ（１６Ｓ ｒＲＮＡ）遺伝子の高い保存、ならびに酵母生物体および糸状菌の間での１８ＳリボソームＲＮＡ（１８Ｓ ｒＲＮＡ）遺伝子の高い保存に一部基づき、さらに、試料中の微生物、特に細菌微生物、および酵母生物体および／または糸状菌の同定および分類において有益なことがある、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子および１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の複数の一塩基多型（ＳＮＰ）の発見に一部基づく。
【0011】
一般的に言って、細菌を含む原核生物は１６Ｓ ｒＲＮＡを含有し、それは原核生物リボソームの３０Ｓ小サブユニットの構成成分である。１６Ｓ ｒＲＮＡは長さが概ね１，５００ヌクレオチドであり、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ ｒＤＮＡとも呼ばれる）によってコードされ、それは、一般的に２３Ｓおよび５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子も含有する共転写されたオペロンの一部である。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ配列（したがって、１６Ｓ ｒＲＮＡ分子のＲＮＡ配列）は原核生物の間で高度に保存されているが、変異領域がある（Weisberg W.G., et al., 1991）。
【0012】
同様に、酵母および糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、原核生物の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の相同体である。１８Ｓ ｒＲＮＡは、４０Ｓの小さい真核生物リボソームサブユニットの構成成分である。１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ配列（したがって、１８Ｓ ｒＲＮＡ分子のＲＮＡ配列）は、酵母および糸状菌で同じく高度に保存されている。
【0013】
本発明の第１の態様により、試料中の少なくとも１つの細菌、酵母生物体または糸状菌を同定するか、部分的に同定するか、または分類する方法が提供される。
一実施形態では、前記方法は、試料からの細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分、または、試料からの酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分を、少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）の存在の有無について分析することを含み、
ここで、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７および６５３の少なくとも１つに対応する位置にあり；または
細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分における少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号４３に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中にあるかもしくはそれに対応し；または
試料中の少なくとも１つの細菌、酵母生物体もしくは糸状菌は、少なくとも１つのＳＮＰの存在の有無に基づいて同定されるか、部分的に同定されるか、もしくは分類される。
別の実施形態では、前記方法は、試料からの細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分、または、試料からの酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分を、少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）の存在の有無について分析することを含み、
ここで、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７、６５３、７３７、７５５、７６２および７７６の少なくとも１つに対応する位置にあり；
試料中の少なくとも１つの細菌、酵母生物体または糸状菌は、少なくとも１つのＳＮＰの存在の有無に基づいて同定されるか、部分的に同定されるか、または分類される。
一実施形態では、前記方法は、試料からの細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分、または、試料からの酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分を、少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）の存在の有無について分析することを含み、
ここで、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７および６５３の少なくとも１つに対応する位置にあり；または
細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分における少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号４３に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中にあるかもしくはそれに対応し；または
試料中の少なくとも１つの細菌、酵母生物体もしくは糸状菌は、少なくとも１つのＳＮＰの存在の有無に基づいて同定されるか、部分的に同定されるか、もしくは分類される。
別の実施形態では、前記方法は、試料からの細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分、または、試料からの酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分を、少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）の存在の有無について分析することを含み、
ここで、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７、６５３、７３７、７５５、７６２および７７６の少なくとも１つに対応する位置にあり；
試料中の少なくとも１つの細菌、酵母生物体または糸状菌は、少なくとも１つのＳＮＰの存在の有無に基づいて同定されるか、部分的に同定されるか、または分類される。
【0014】
本発明の第２の態様により、対象において細菌、酵母生物体または糸状菌の感染を同定するか、部分的に同定するか、分類するかまたは診断する方法が提供される。
一実施形態では、前記方法は、対象からの試料中の細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分、または、酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分における少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）の存在の有無について分析することを含み；
ここで、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７、６５３の少なくとも１つに対応する位置にあり；または、
細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分における少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号４３に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中にあるかもしくはそれに対応し；または、
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分、または１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分における少なくとも１つの前記ＳＮＰの存在の有無は、対象において細菌、酵母生物体または糸状菌の感染を同定するか、部分的に同定するか、分類するかまたは診断するために使用される。
別の実施形態では、前記方法は、対象からの試料中の細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分、または、酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分における少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）の存在の有無について分析することを含み；
ここで、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７、６５３、７３７、７５５、７６２および７７６の少なくとも１つに対応する位置にあり；
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分、または１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分における少なくとも１つの前記ＳＮＰの存在の有無は、対象において細菌、酵母生物体または糸状菌の感染を同定するか、部分的に同定するか、分類するかまたは診断するために使用される。
一実施形態では、前記方法は、対象からの試料中の細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分、または、酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分における少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）の存在の有無について分析することを含み；
ここで、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７、６５３の少なくとも１つに対応する位置にあり；または、
細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分における少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号４３に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中にあるかもしくはそれに対応し；または、
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分、または１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分における少なくとも１つの前記ＳＮＰの存在の有無は、対象において細菌、酵母生物体または糸状菌の感染を同定するか、部分的に同定するか、分類するかまたは診断するために使用される。
別の実施形態では、前記方法は、対象からの試料中の細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分、または、酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分における少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）の存在の有無について分析することを含み；
ここで、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７、６５３、７３７、７５５、７６２および７７６の少なくとも１つに対応する位置にあり；
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分、または１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分における少なくとも１つの前記ＳＮＰの存在の有無は、対象において細菌、酵母生物体または糸状菌の感染を同定するか、部分的に同定するか、分類するかまたは診断するために使用される。
【0015】
本発明の第３の態様により、細菌、酵母生物体または糸状菌の感染を有する対象を治療する方法であって、
対象において細菌、酵母生物体または糸状菌の感染を同定するか、部分的に同定するか、分類するかまたは診断するために、第２の態様の方法によって対象において細菌、酵母生物体または糸状菌の感染を同定するか、部分的に同定するか、分類するかまたは診断すること；
対象において細菌、酵母生物体または糸状菌の感染を治療するための療法または治療薬を対象に投与すること、
を含む方法が提供される。
対象において細菌、酵母生物体または糸状菌の感染を同定するか、部分的に同定するか、分類するかまたは診断するために、第２の態様の方法によって対象において細菌、酵母生物体または糸状菌の感染を同定するか、部分的に同定するか、分類するかまたは診断すること；
対象において細菌、酵母生物体または糸状菌の感染を治療するための療法または治療薬を対象に投与すること、
を含む方法が提供される。
【0016】
本発明の第４の態様により、少なくとも１つの単離されたプローブ、ツールまたは試薬が提供される。
【0017】
第４の態様の一実施形態では、少なくとも１つの単離された前記プローブ、ツールまたは試薬は、試料中の少なくとも１つの細菌、酵母生物体または糸状菌を同定するか、部分的に同定するか、または分類することが可能であり、プローブ、ツールまたは試薬は、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分、または、酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）を結合、検出することまたはその存在の有無を同定することが可能であり、
ここで、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７、６５３の少なくとも１つに対応する位置にあり；または
細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号４３に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中にあるかもしくはそれに対応する。
ここで、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７、６５３の少なくとも１つに対応する位置にあり；または
細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号４３に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中にあるかもしくはそれに対応する。
【0018】
第４の態様の別の実施形態では、少なくとも１つの単離された前記プローブ、ツールまたは試薬は、試料中の少なくとも１つの細菌、酵母生物体または糸状菌を同定するか、部分的に同定するか、または分類することが可能であり、プローブ、ツールまたは試薬は、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分、または、酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）を結合、検出することまたはその存在の有無を同定することが可能であり、
ここで、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７、６５３、７３７、７５５、７６２および７７６の少なくとも１つに対応する位置にある。
ここで、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７、６５３、７３７、７５５、７６２および７７６の少なくとも１つに対応する位置にある。
【0019】
第４の態様の別の実施形態により、少なくとも１つの単離された前記プローブ、ツールまたは試薬は、少なくとも１つの細菌、酵母生物体または糸状菌を含む試料と少なくとも１つの細菌、酵母生物体または糸状菌を含まない試料とを区別することが可能であり、プローブ、ツールまたは試薬は、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分、または、酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）を結合、検出することまたはその存在の有無を同定することが可能であり、
ここで、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７、６５３の少なくとも１つに対応する位置にあり；または
細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号４３に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中にあるかもしくはそれに対応する。
ここで、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７、６５３の少なくとも１つに対応する位置にあり；または
細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号４３に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中にあるかもしくはそれに対応する。
【0020】
第４の態様の別の実施形態により、少なくとも１つの単離された前記プローブ、ツールまたは試薬は、少なくとも１つの細菌、酵母生物体または糸状菌を含む試料と少なくとも１つの細菌、酵母生物体または糸状菌を含まない試料とを区別することが可能であり、プローブ、ツールまたは試薬は、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分、または、酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）を結合、検出することまたはその存在の有無を同定することが可能であり、
ここで、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７、６５３、７３７、７５５、７６２および７７６の少なくとも１つに対応する位置にある。
ここで、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７、６５３、７３７、７５５、７６２および７７６の少なくとも１つに対応する位置にある。
【0021】
本発明の第５の態様により、試料中の少なくとも１つの細菌、酵母生物体または糸状菌を同定するか、部分的に同定するか、または分類する方法が提供される。
一実施形態では、前記方法は：
第４の態様の少なくとも１つの単離されたプローブ、ツールまたは試薬を試料と合わせること；および
細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分、または、酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）の存在の有無に基づいて、少なくとも１つの細菌、酵母生物体または糸状菌を同定するか、部分的に同定するか、または分類することを含み、
ここで、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７、６５３の少なくとも１つに対応する位置にあり；または
細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号４３に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中にあるかもしくはそれに対応する。
別の実施形態では、前記方法は：
第４の態様の少なくとも１つの単離されたプローブ、ツールまたは試薬を試料と合わせること；および
細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分、または、酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）の存在の有無に基づいて、少なくとも１つの細菌、酵母生物体または糸状菌を同定するか、部分的に同定するか、または分類することを含み、
ここで、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７、６５３、７３７、７５５、７６２および７７６の少なくとも１つに対応する位置にある。
一実施形態では、前記方法は：
第４の態様の少なくとも１つの単離されたプローブ、ツールまたは試薬を試料と合わせること；および
細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分、または、酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）の存在の有無に基づいて、少なくとも１つの細菌、酵母生物体または糸状菌を同定するか、部分的に同定するか、または分類することを含み、
ここで、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７、６５３の少なくとも１つに対応する位置にあり；または
細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号４３に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中にあるかもしくはそれに対応する。
別の実施形態では、前記方法は：
第４の態様の少なくとも１つの単離されたプローブ、ツールまたは試薬を試料と合わせること；および
細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分、または、酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）の存在の有無に基づいて、少なくとも１つの細菌、酵母生物体または糸状菌を同定するか、部分的に同定するか、または分類することを含み、
ここで、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７、６５３、７３７、７５５、７６２および７７６の少なくとも１つに対応する位置にある。
【0022】
本発明の第６の態様により、第４の態様の複数の単離された前記プローブ、ツールまたは試薬を含むアレイ（特に、マイクロアレイ）が提供される。
【0023】
本発明の第７の態様により、固体基材および第４の態様の少なくとも１つの単離されたプローブ、ツールまたは試薬を含むバイオチップが提供される。
【0024】
本発明の第８の態様により、キットまたはアッセイが提供される。
【0025】
第８の態様の一実施形態では、キットまたはアッセイは、試料中の少なくとも１つの細菌または少なくとも１つの酵母生物体もしくは糸状菌を分類または同定するためのものであり、前記キットまたはアッセイは：第４の態様の少なくとも１つのプローブ、ツールまたは試薬；第６の態様のアレイ；および／または第７の態様のバイオチップを含む。
【0026】
第８の態様の別の実施形態では、キットまたはアッセイは、少なくとも１つの細菌、酵母生物体または糸状菌を含む試料と少なくとも１つの細菌、酵母生物体または糸状菌を含まない試料とを区別することが可能であり、キットまたはアッセイは、第４の態様のプローブ、ツールまたは試薬を含む。
【0027】
本発明の第９の態様により、少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）が提供される。
一実施形態では、少なくとも１つの前記ＳＮＰは、試料中の少なくとも１つの細菌、酵母生物体または糸状菌を分類するか、同定するか、または部分的に同定するための指標として使用するために、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分、または、酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分に存在し；
ここで、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７、６５３の少なくとも１つに対応する位置にあり；または
細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号４３に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中にあるかもしくはそれに対応する。
別の実施形態では、少なくとも１つの前記ＳＮＰは、試料中の少なくとも１つの細菌、酵母生物体または糸状菌を分類するか、同定するか、または部分的に同定するための指標として使用するために、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分、または、酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分に存在し、
ここで、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７、６５３、７３７、７５５、７６２および７７６の少なくとも１つに対応する位置にある。
一実施形態では、少なくとも１つの前記ＳＮＰは、試料中の少なくとも１つの細菌、酵母生物体または糸状菌を分類するか、同定するか、または部分的に同定するための指標として使用するために、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分、または、酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分に存在し；
ここで、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７、６５３の少なくとも１つに対応する位置にあり；または
細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号４３に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中にあるかもしくはそれに対応する。
別の実施形態では、少なくとも１つの前記ＳＮＰは、試料中の少なくとも１つの細菌、酵母生物体または糸状菌を分類するか、同定するか、または部分的に同定するための指標として使用するために、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分、または、酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分に存在し、
ここで、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７、６５３、７３７、７５５、７６２および７７６の少なくとも１つに対応する位置にある。
【0028】
本発明の第１０の態様により、第１の態様に規定される、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分、または、酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）、または、第４の態様の少なくとも１つの単離されたプローブ、ツールもしくは試薬の、試料中の少なくとも１つの細菌、酵母生物体または糸状菌の同定、部分的同定または分類における使用が提供され、ここで、少なくとも１つの前記細菌、酵母生物体または糸状菌は、試料からの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分、または１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つのＳＮＰの存在の有無に基づいて同定されるか、部分的に同定されるか、または分類される。
【0029】
本発明の第１１の態様により、本発明の第１、第２、第３または第５の態様のいずれか１つの方法で使用するための、プローブ、ツールまたは試薬を含むキットが提供される。
【0030】
本発明のさらなる態様が、下で提供される。
【0031】
本発明の第１２の態様により、試料中の少なくとも１つの細菌の同定または試料中の細菌の分類で使用するためのまたは使用するときの、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）；または試料中の少なくとも１つの酵母生物体もしくは糸状菌の同定または試料中の酵母生物体もしくは糸状菌の分類で使用するためのまたは使用するときの、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）が提供される。
【0032】
本発明の第１３の態様により、試料中の１つの細菌の同定または試料中の細菌の分類で使用するためのまたは使用するときの、少なくとも１つのＳＮＰを含有する試料中の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の少なくとも一部分を特異的に結合するか、検出するかまたは同定することが可能である、少なくとも１つの前記プローブ、ツールまたは試薬；または、試料中の少なくとも１つの酵母生物体もしくは糸状菌の同定または試料中の少なくとも１つの酵母生物体もしくは糸状菌の分類で使用するためのまたは使用するときの、少なくとも１つのＳＮＰを含有する試料中の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の少なくとも一部分を特異的に結合するか、検出するかまたは同定することが可能である、少なくとも１つの前記プローブ、ツールまたは試薬が提供される。
【0033】
本発明の第１４の態様により、試料中の少なくとも１つの細菌の同定または試料中の細菌の分類で使用するためのまたは使用するときの、配列番号１６～３５、５６または５７のいずれか１つに示すヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、少なくとも１つの前記プローブ、ツールまたは試薬；または、試料中の少なくとも１つの酵母生物体もしくは糸状菌の同定または試料中の少なくとも１つの酵母生物体もしくは糸状菌の分類で使用するためのまたは使用するときの、配列番号５３～５５のいずれか１つに示すヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、少なくとも１つのプローブ、ツールまたは試薬が提供される。
【0034】
本発明の第１５の態様により、第１２の態様に規定される少なくとも１つのＳＮＰ、または第１３もしくは第１４の態様に規定される少なくとも１つのプローブ、ツールまたは試薬の、試料中の少なくとも１つの細菌の同定または試料中の細菌の分類における使用であって、上記の試料からの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の少なくとも１つのＳＮＰの存在に基づいて少なくとも１つの前記細菌が同定されるかまたは前記細菌が分類される、使用；または、第１２の態様に規定される少なくとも１つのＳＮＰ、または第１３もしくは第１４の態様に規定される少なくとも１つのプローブ、ツールまたは試薬の、試料中の少なくとも１つの酵母生物体もしくは糸状菌の同定または試料中の少なくとも１つの酵母生物体もしくは糸状菌の分類における使用であって、上記の試料からの１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の少なくとも１つのＳＮＰの存在に基づいて少なくとも１つの前記酵母生物体もしくは糸状菌が同定または分類される、使用；が提供される。
【0035】
本発明の第１６の態様により、試料中の少なくとも１つの細菌を同定する方法であって、第１の態様に規定される少なくとも１つのＳＮＰについて試料からの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を分析することを含み、少なくとも１つの細菌は少なくとも１つのＳＮＰの存在に基づいて同定される方法；または試料中の少なくとも１つの酵母生物体または糸状菌を同定する方法であって、第１２の態様に規定される少なくとも１つのＳＮＰについて試料からの１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を分析することを含み、少なくとも１つの酵母生物体または糸状菌は少なくとも１つのＳＮＰの存在に基づいて同定される方法が提供される。
【0036】
一実施形態では、試料中の少なくとも１つの細菌を同定する方法であって、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７および６５３の少なくとも１つに対応する位置にある、少なくとも１つのＳＮＰについて試料からの核酸を分析することを含み、少なくとも１つの細菌は少なくとも１つのＳＮＰの存在に基づいて同定される方法が提供される。
【0037】
本発明の第１７の態様により、試料中の細菌を分類する方法であって、第１の態様に規定される少なくとも１つのＳＮＰについて試料からの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を分析することを含み、細菌は少なくとも１つのＳＮＰの存在に基づいて分類される方法；または、試料中の少なくとも１つの酵母生物体または糸状菌を分類する方法であって、第１２の態様に規定される少なくとも１つのＳＮＰについて試料からの１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を分析することを含み、少なくとも１つの酵母生物体または糸状菌は少なくとも１つのＳＮＰの存在に基づいて分類される方法が提供される。
【0038】
本発明の第１８の態様により、試料中の少なくとも１つの細菌を同定する方法であって、
第１３または第１４の態様に規定される少なくとも１つのプローブ、ツールまたは試薬を試料と合わせること；および
上で広く記載される試料からの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の少なくとも１つのＳＮＰの存在に基づいて少なくとも１つの細菌を同定することを含む方法；または、
試料中の少なくとも１つの酵母生物体または糸状菌を同定する方法であって、
第１３または第１４の態様に規定される少なくとも１つのプローブ、ツールまたは試薬を試料と合わせること；および
上で広く記載される試料からの１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の少なくとも１つのＳＮＰの存在に基づいて少なくとも１つの酵母生物体もしくは糸状菌を同定することを含む方法が提供される。
第１３または第１４の態様に規定される少なくとも１つのプローブ、ツールまたは試薬を試料と合わせること；および
上で広く記載される試料からの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の少なくとも１つのＳＮＰの存在に基づいて少なくとも１つの細菌を同定することを含む方法；または、
試料中の少なくとも１つの酵母生物体または糸状菌を同定する方法であって、
第１３または第１４の態様に規定される少なくとも１つのプローブ、ツールまたは試薬を試料と合わせること；および
上で広く記載される試料からの１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の少なくとも１つのＳＮＰの存在に基づいて少なくとも１つの酵母生物体もしくは糸状菌を同定することを含む方法が提供される。
【0039】
本発明の第１９の態様により、試料中の細菌を分類する方法であって、
第１３または第１４の態様に規定される少なくとも１つのプローブ、ツールまたは試薬を試料と合わせること；および
上で広く記載される試料からの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の少なくとも１つのＳＮＰの存在に基づいて細菌を分類することを含む方法；または
試料中の少なくとも１つの酵母生物体または糸状菌を分類する方法であって、
第１３または第１４の態様に規定される少なくとも１つのプローブ、ツールまたは試薬を試料と合わせること；および
上で広く記載される試料からの１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の少なくとも１つのＳＮＰの存在に基づいて少なくとも１つの酵母生物体もしくは糸状菌を分類することを含む方法が提供される。
第１３または第１４の態様に規定される少なくとも１つのプローブ、ツールまたは試薬を試料と合わせること；および
上で広く記載される試料からの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の少なくとも１つのＳＮＰの存在に基づいて細菌を分類することを含む方法；または
試料中の少なくとも１つの酵母生物体または糸状菌を分類する方法であって、
第１３または第１４の態様に規定される少なくとも１つのプローブ、ツールまたは試薬を試料と合わせること；および
上で広く記載される試料からの１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の少なくとも１つのＳＮＰの存在に基づいて少なくとも１つの酵母生物体もしくは糸状菌を分類することを含む方法が提供される。
【0040】
本発明の第２０の態様により、対象において細菌感染を診断する方法であって、第１２の態様に規定される少なくとも１つのＳＮＰについて対象から得た試料からの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を分析することを含み、細菌感染は、少なくとも１つのＳＮＰの存在に基づいて試料中の少なくとも１つの原因細菌を同定することによって診断される方法；または対象において少なくとも１つの酵母生物体または糸状菌の感染を診断する方法であって、第１２の態様に規定される少なくとも１つのＳＮＰについて対象から得た試料からの１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を分析することを含み、少なくとも１つの酵母生物体または糸状菌の感染は、少なくとも１つのＳＮＰの存在に基づいて試料中の少なくとも１つの原因酵母生物体または糸状菌を同定することによって診断される方法が提供される。
【0041】
本発明の第２１の態様により、対象において細菌感染を診断する方法であって、
第１３または第１４の態様に規定される少なくとも１つのプローブ、ツールまたは試薬を対象から得た試料と合わせること；および
上で広く記載される試料からの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の少なくとも１つのＳＮＰの存在に基づいて試料中の少なくとも１つの原因細菌を同定することによって細菌感染を診断することを含む方法；または
対象において少なくとも１つの酵母生物体または糸状菌の感染を診断する方法であって、
第１３または第１４の態様に規定される少なくとも１つのプローブ、ツールまたは試薬を対象から得た試料と合わせること；および
上で広く記載される試料からの１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の少なくとも１つのＳＮＰの存在に基づいて試料中の少なくとも１つの原因細菌を同定することによって少なくとも１つの酵母生物体または糸状菌の感染を診断することを含む方法が提供される。
第１３または第１４の態様に規定される少なくとも１つのプローブ、ツールまたは試薬を対象から得た試料と合わせること；および
上で広く記載される試料からの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の少なくとも１つのＳＮＰの存在に基づいて試料中の少なくとも１つの原因細菌を同定することによって細菌感染を診断することを含む方法；または
対象において少なくとも１つの酵母生物体または糸状菌の感染を診断する方法であって、
第１３または第１４の態様に規定される少なくとも１つのプローブ、ツールまたは試薬を対象から得た試料と合わせること；および
上で広く記載される試料からの１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の少なくとも１つのＳＮＰの存在に基づいて試料中の少なくとも１つの原因細菌を同定することによって少なくとも１つの酵母生物体または糸状菌の感染を診断することを含む方法が提供される。
【0042】
本発明の第２２の態様により、細菌感染を有する対象を治療する方法であって、
第２０または第２１の態様に規定される方法によって試料中の少なくとも１つの原因細菌を同定することによって細菌感染を診断すること；および
同定された少なくとも１つの原因細菌を処置するための療法または治療薬を対象に投与し、それによって細菌感染を治療することを含む方法；または
少なくとも１つの酵母生物体または糸状菌の感染を有する対象を治療する方法であって、
第２０または第２１の態様に規定される方法によって試料中の少なくとも１つの原因細菌を同定することによって少なくとも１つの酵母生物体または糸状菌の感染を診断すること；および
同定された少なくとも１つの原因酵母生物体または糸状菌を処置するための療法または治療薬を対象に投与し、それによって細菌感染を治療することを含む方法が提供される。
第２０または第２１の態様に規定される方法によって試料中の少なくとも１つの原因細菌を同定することによって細菌感染を診断すること；および
同定された少なくとも１つの原因細菌を処置するための療法または治療薬を対象に投与し、それによって細菌感染を治療することを含む方法；または
少なくとも１つの酵母生物体または糸状菌の感染を有する対象を治療する方法であって、
第２０または第２１の態様に規定される方法によって試料中の少なくとも１つの原因細菌を同定することによって少なくとも１つの酵母生物体または糸状菌の感染を診断すること；および
同定された少なくとも１つの原因酵母生物体または糸状菌を処置するための療法または治療薬を対象に投与し、それによって細菌感染を治療することを含む方法が提供される。
【0043】
本発明の第２３の態様により、試料中の少なくとも１つの細菌の同定または試料中の細菌の分類のためのオリゴヌクレオチドプローブのアレイであって、上で広く記載される試料中の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の少なくとも１つのＳＮＰにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含むプローブ；または試料中の少なくとも１つの酵母生物体もしくは糸状菌の同定または試料中の少なくとも１つの酵母生物体もしくは糸状菌の分類のためのオリゴヌクレオチドプローブのアレイであって、上で広く記載される試料中の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の少なくとも１つのＳＮＰにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含むプローブが提供される。
【0044】
本発明の第２４の態様により、試料中の少なくとも１つの細菌の同定または試料中の細菌の分類のためのオリゴヌクレオチドプローブを含むマイクロアレイであって、前記プローブは、上で広く記載される試料中の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の少なくとも１つのＳＮＰにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイ；または試料中の少なくとも１つの酵母生物体もしくは糸状菌の同定または試料中の少なくとも１つの酵母生物体もしくは糸状菌の分類のためのオリゴヌクレオチドプローブを含むマイクロアレイであって、前記プローブは、上で広く記載される試料中の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の少なくとも１つのＳＮＰにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイが提供される。
【0045】
本発明の第２５の態様により、固体基材および試料中の少なくとも１つの細菌の同定または試料中の細菌の分類のための少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを含むバイオチップであって、少なくとも１つの前記プローブは、上で広く記載される試料中の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の少なくとも１つのＳＮＰにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含むバイオチップ；または、固体基材および試料中の少なくとも１つの酵母生物体もしくは糸状菌の同定または試料中の少なくとも１つの酵母生物体もしくは糸状菌の分類のための少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを含むバイオチップであって、少なくとも１つの前記プローブは、上で広く記載される試料中の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の少なくとも１つのＳＮＰにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含むバイオチップが提供される。
【0046】
本発明の第２６の態様により、試料中の少なくとも１つの細菌の同定または試料中の細菌の分類のためのキットまたはアッセイであって、上記の少なくとも１つのプローブ、ツールまたは試薬；上記のオリゴヌクレオチドプローブのアレイ；上記のマイクロアレイ；および／または上記のバイオチップを含むキットまたはアッセイ；または、試料中の少なくとも１つの酵母生物体もしくは糸状菌の同定または試料中の少なくとも１つの酵母生物体もしくは糸状菌の分類のためのキットまたはアッセイであって、上記の少なくとも１つのプローブ、ツールまたは試薬；上記のオリゴヌクレオチドプローブのアレイ；上記のマイクロアレイ；および／または上記のバイオチップを含むキットまたはアッセイが提供される。
【0047】
本発明の第２７の態様により、対象において感染を同定するか、部分的に同定するか、分類するかまたは診断する方法が提供される。第２７の態様の一実施形態では、前記感染は、細菌、酵母生物体または糸状菌の感染であり、前記方法は、対象から得た生体試料を、少なくとも１つの細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物もしくはその一部分、または少なくとも１つの酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物もしくはその一部分の特性について検査することを含み、ここで、前記検査は、少なくとも１つの細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物もしくはその一部分、または少なくとも１つの酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物もしくはその一部分の中の少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）を検出することを含み、
細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物もしくはその一部分の中の少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７および６５３の少なくとも１つに対応する位置にあるか；または
細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物もしくはその一部分の中の少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号４３に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中にあるかまたはそれに対応するか；または
試料中の少なくとも１つの細菌、酵母生物体または糸状菌は、少なくとも１つのＳＮＰの存在の有無に基づいて同定されるか、部分的に同定されるか、分類されるかまたは診断される。
第２７の態様の別の実施形態では、前記感染は、細菌、酵母生物体または糸状菌の感染であり、前記方法は、対象から得た生体試料を、少なくとも１つの細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物もしくはその一部分、または少なくとも１つの酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物もしくはその一部分の特性について検査することを含み、ここで、前記検査は、少なくとも１つの細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物もしくはその一部分、または少なくとも１つの酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物もしくはその一部分の中の少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）を検出することを含み、
細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物もしくはその一部分の中の少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７、６５３、７３７、７５５、７６２および７７６の少なくとも１つに対応する位置にあり；
試料中の少なくとも１つの細菌、酵母生物体または糸状菌は、少なくとも１つのＳＮＰの存在の有無に基づいて同定されるか、部分的に同定されるか、分類されるかまたは診断される。
細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物もしくはその一部分の中の少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７および６５３の少なくとも１つに対応する位置にあるか；または
細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物もしくはその一部分の中の少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号４３に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中にあるかまたはそれに対応するか；または
試料中の少なくとも１つの細菌、酵母生物体または糸状菌は、少なくとも１つのＳＮＰの存在の有無に基づいて同定されるか、部分的に同定されるか、分類されるかまたは診断される。
第２７の態様の別の実施形態では、前記感染は、細菌、酵母生物体または糸状菌の感染であり、前記方法は、対象から得た生体試料を、少なくとも１つの細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物もしくはその一部分、または少なくとも１つの酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物もしくはその一部分の特性について検査することを含み、ここで、前記検査は、少なくとも１つの細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物もしくはその一部分、または少なくとも１つの酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物もしくはその一部分の中の少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）を検出することを含み、
細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物もしくはその一部分の中の少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７、６５３、７３７、７５５、７６２および７７６の少なくとも１つに対応する位置にあり；
試料中の少なくとも１つの細菌、酵母生物体または糸状菌は、少なくとも１つのＳＮＰの存在の有無に基づいて同定されるか、部分的に同定されるか、分類されるかまたは診断される。
【0048】
本発明の第１～２７の態様の特徴は、該当する場合、下記のようであってよい。
【0049】
一実施形態では、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子または遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つの前記ＳＮＰは、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７、６５３、７３７、７５５、７６２および７７６の少なくとも１つに対応する位置のＳＮＰから選択される。一部の実施形態では、複数のＳＮＰを本発明の方法において使用することができる。例えば、少なくとも２つのＳＮＰ、少なくとも３つのＳＮＰ、少なくとも４つのＳＮＰ、少なくとも５つのＳＮＰ、少なくとも６つのＳＮＰ、少なくとも７つのＳＮＰ、少なくとも８つのＳＮＰ、少なくとも９つのＳＮＰ、少なくとも１０個のＳＮＰまたはさらに少なくとも１１個のＳＮＰを使用することができる。
【0050】
一実施形態では、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子または遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つの前記ＳＮＰは、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７および６５３に対応する位置のＳＮＰから選択される。一部の実施形態では、複数のＳＮＰを本発明の方法において使用することができる。例えば、少なくとも２つのＳＮＰ、少なくとも３つのＳＮＰ、少なくとも４つのＳＮＰ、少なくとも５つのＳＮＰ、少なくとも６つのＳＮＰまたはさらに少なくとも７つのＳＮＰを使用することができる。
【0051】
別の実施形態では、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子または遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つの前記ＳＮＰは、配列番号４３に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中にあってもまたはそれに対応してもよい。配列番号４３に示す細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子または遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号４３に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置７４６、７６４、７７１または７８５（または、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置７３７、７５５、７６２または７７６）の少なくとも１つに対応する位置にあってもよい。少なくとも１つの前記ＳＮＰ、少なくとも２つの前記ＳＮＰ、少なくとも３つの前記ＳＮＰまたは少なくとも４つの前記ＳＮＰを使用することができる。
【0052】
別の実施形態では、酵母生物体または糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子または遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号３７に示す１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中にあってもまたはそれに対応してもよい。酵母生物体または糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子または遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号３７に示す１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置３４３、３７１、３８８、４１６および４６７の少なくとも１つに対応する位置にあってもよい。少なくとも１つの前記ＳＮＰ、少なくとも２つの前記ＳＮＰ、少なくとも３つの前記ＳＮＰ、少なくとも４つの前記ＳＮＰまたは少なくとも５つの前記ＳＮＰを使用することができる。
【0053】
さらなる実施形態では、前記方法は、試料からの細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分、または試料からの酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分を、
細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７および６５３に対応する位置にある一塩基多型；または
細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の、配列番号４３に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置７４６、７６４、７７１および７８５に対応する位置にある一塩基多型；または
酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の、配列番号３７に示す１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置３４３、３７１、３８８、４１６および４６７に対応する位置にある一塩基多型
の存在の有無について分析することを含む。
細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７および６５３に対応する位置にある一塩基多型；または
細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の、配列番号４３に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置７４６、７６４、７７１および７８５に対応する位置にある一塩基多型；または
酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の、配列番号３７に示す１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置３４３、３７１、３８８、４１６および４６７に対応する位置にある一塩基多型
の存在の有無について分析することを含む。
【0054】
さらなる実施形態では、前記方法は、試料からの細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分、または試料からの酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分を、
細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７、６５３、７３７、７５５、７６２および７７６の少なくとも４つに対応する位置にある一塩基多型；または
酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の、配列番号３７に示す１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置３４３、３７１、３８８、４１６および４６７に対応する位置にある一塩基多型
の存在の有無について分析することを含む。
細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７、６５３、７３７、７５５、７６２および７７６の少なくとも４つに対応する位置にある一塩基多型；または
酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の、配列番号３７に示す１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置３４３、３７１、３８８、４１６および４６７に対応する位置にある一塩基多型
の存在の有無について分析することを含む。
【0055】
一部の実施形態では、１つまたは複数の細菌は、哺乳動物（例えば、ヒト）関連の細菌、土壌関連の細菌および水関連の細菌の中から選択される。特定の実施形態では、１つまたは複数の細菌は、１つまたは複数の敗血症関連の細菌であってよい。
【0056】
一部の特定の実施形態では、１つまたは複数の細菌は、以下の少なくとも１つの中から選択される：Acinetobacter spp.；Actinobaccillus spp.；Actinomadura spp.；Actinomyces spp.；Actinoplanes spp.；Aeromonas spp.；Agrobacterium spp.；Alistipes spp.；Anaerococcus spp.；Arthrobacter spp.；Bacillus spp.；Bacteroides spp.；Brucella spp.；Bulleidia spp.；Burkholderia spp.；Cardiobacterium spp.；Citrobacter spp.；Clostridium spp.；Cornyebacterium spp.；Dermatophilus spp.；Dorea spp；Enterobacter spp.；Enterococcus spp.；Erysipelothrix spp.；Escherichia spp.；Eubacterium spp.；Ewardsiella spp.；Faecalibacterium spp.；Filifactor spp.；Finegoldia spp.；Flavobacterium spp.；Francisella spp.；Gallicola spp.；Haemophilus spp.；Helococcus spp.；Holdemania spp.；Hyphomicrobium spp.；Klebsiella spp.；Lactobacillus spp.；Legionella spp.；Listeria spp.；Methylobacterium spp.；Micrococcus spp.；Micromonospora spp.；Mobiluncus spp.；Moraxella spp.；Morganella spp.；Mycobacterium spp.；Neisseria spp.；Nocardia spp.；Paenibacillus spp.；Parabacteroides spp.；Pasteurella spp.；Peptoniphilus spp.；Peptostreptococcus spp.；Planococcus spp.；Planomicrobium spp.；Plesiomonas spp.；Porphyromonas spp.；Prevotella spp.；Propionibacterium spp.；Proteus spp.；Providentia spp.；Pseudomonas spp.；Ralstonia spp.；Rhodococcus spp.；Roseburia spp.；Ruminococcus spp.；Salmonella spp.；Sedimentibacter spp.；Serratia spp.；Shigella spp.；Solobacterium spp.；Sphingomonas spp.；Staphylococcus spp.；Stenotrophomonas spp.；Streptococcus spp.；Streptomyces spp.；Tissierella spp.；Vibrio spp.；およびYersinia spp.。
【0057】
一部のより特定の実施形態では、１つまたは複数の細菌は、以下の少なくとも１つの中から選択される：Acinetobacter baumannii；Acinetobacter calcoaceticus；Bacteroides fragilis；Bacteroides vulgatus；Citrobacter freundii；Enterobacter aerogenes；Enterobacter cloacae；Enterococcus avium；Enterococcus faecalis；Enterococcus faecium；Escherichia coli；Klebsiella oxytoca；Klebsiella pneumoniae；Proteus mirabilis；Pseudomonas aeruginosa；Serratia marcescens；Staphylococcus aureus；Staphylococcus epidermidis；Staphylococcus hominis；Staphylococcus saprophyticus；Stenotrophomonas maltophilia；Streptococcus agalactiae；Streptococcus anginosus；Streptococcus constellatus；Streptococcus intermedius；Streptococcus milleri；Streptococcus mitis；Streptococcus mutans；Streptococcus oralis；Streptococcus pneumoniae；Streptococcus pyogenes；Streptococcus sanguinis；およびStreptococcus sobrinus。
【0058】
特定の実施形態では、１つまたは複数の細菌は、以下の少なくとも１つの中から選択される：Acinetobacter calcoaceticus；Enterobacter aerogenes；Enterobacter cloacae；Enterococcus faecalis；Enterococcus faecium；Escherichia coli；Klebsiella pneumoniae；Proteus mirabilis；Pseudomonas aeruginosa；Serratia marcescens；Staphylococcus aureus；Staphylococcus epidermidis；Streptococcus agalactiae；Streptococcus pneumoniae；およびStreptococcus pyogenes。
【0059】
特定の実施形態では、１つまたは複数の細菌は、以下の少なくとも１つの中から選択される：Acinetobacter calcoaceticus；Enterobacter aerogenes；Enterobacter cloacae；Enterococcus faecalis；Enterococcus faecium；Escherichia coli；Klebsiella pneumoniae；Proteus mirabilis；Pseudomonas aeruginosa；Serratia marcescens；Staphylococcus aureus；Staphylococcus epidermidis；Streptococcus agalactiae；Streptococcus pneumoniae；Streptococcus pyogenes；Listeria monocytogenes；Clostridium perfringens；Corynebacterium jeikeium；Bacteroides fragilis；Neisseria meningitides；Haemophilus influenzae；Salmonella sp.；およびStaphylococcus epidermidis。別の実施形態では、１つまたは複数の細菌は、以下の少なくとも１つの中から選択される：Acinetobacter calcoaceticus；Enterobacter aerogenes；Enterobacter cloacae；Enterococcus faecalis；Enterococcus faecium；Escherichia coli；Klebsiella pneumoniae；Proteus mirabilis；Pseudomonas aeruginosa；Serratia marcescens；Staphylococcus aureus；Staphylococcus epidermidis；Streptococcus agalactiae；Streptococcus pneumoniae；Streptococcus pyogenes；Listeria monocytogenes；Clostridium perfringens；Corynebacterium jeikeium；Bacteroides fragilis；Neisseria meningitides；Haemophilus influenzae；Salmonella sp.；Staphylococcus epidermidis；Bacillus anthracis、Clostridium botulinum、Yersinia pestis、Francisella tularensis、Vibrio choleraeおよびBurkholderia pseudomallei。
【0060】
一実施形態では、１つまたは複数の細菌は、セキュリティセンシティブな生体作用物質（ＳＳＢＡ）である。ＳＳＢＡは、階層１作用物質または階層２作用物質であってよい。例示的な階層１作用物質には、以下の１つまたは複数が含まれる：Bacillus anthracis（炭疽）およびYesinia pestis（ペスト）。例示的な階層２作用物質には、以下の１つまたは複数が含まれる：Clostridium botulinum（ボツリヌス菌中毒、特に毒素産生株）；Francisella tularensis（野兎病）；Salmonella Typhi（腸チフス）およびVibrio cholerae（特にコレラ血清型Ｏ１またはＯ１３９）。一実施形態では、１つまたは複数の細菌は、以下からなる群の少なくとも１つの中から選択される：Bacillus anthracis、Clostridium botulinum、Yersinia pestis、Francisella tularensis、Vibrio choleraeおよびBurkholderia pseudomallei。
【0061】
一実施形態では、酵母生物体は、以下の少なくとも１つの中から選択することができる：Candida spp.、Cryptococcus spp およびRhodotorula spp.。例示的なCandida spp.は、Candida albicans、Candida tropicalis、Candida stellatoidea、Candida krusei、Candida parapsilosis、Candida glabrata、Candida guilliermondii、Candida viswanathii、Candida aurisおよびCandida lusitaniaeの少なくとも１つを含むことができる。例示的なCryptococcus spp.は、Cryptococcus neoformansおよびCryptococcus gattiiの少なくとも１つを含むことができる。例示的なRhodotorula spp.は、Rhodotorula mucilaginosaであってよい。
【0062】
一実施形態では、糸状菌は、以下の少なくとも１つから選択することができる：Aspergillus spp.およびFusarium spp.。例示的なFusarium spp.は、Fusarium solani、Fusarium oxysporum、Fusarium verticillioides、Fusarium proliferatum、Fusarium avenaceum、Fusarium bubigeum、Fusarium culmorum、Fusarium graminearum、Fusarium langsethiae、Fusarium poae、Fusarium sporotrichioides、Fusarium tricinctumおよびFusarium virguliforme；の少なくとも１つ、特にFusarium solani、Fusarium oxysporum、Fusarium verticillioidesおよびFusarium proliferatumの少なくとも１つを含むことができる。例示的なAspergillus spp.は、Aspergillus fumigatus、Aspergillus flavus、Aspergillus clavatus、Aspergillus lentulus、Aspergillus terreusおよびAspergillus nidulans；の少なくとも１つ、特にAspergillus fumigatus、Aspergillus flavusおよびAspergillus clavatusの少なくとも１つ；より特にAspergillus fumigatusを含むことができる。
【0063】
一実施形態では、酵母生物体または糸状菌は、以下からなる群の中の少なくとも１つである：Candida albicans、Candida tropicalis、Candida parapsilosis、Candida glabrata、Fusarium sp.、Aspergillus fumigatusおよびCryptococcus neoformans。
【0064】
一実施形態では、細菌、酵母生物体または糸状菌は、ヒト病原体である。
【0065】
一部の実施形態では、本発明の方法は、全身炎症応答症候群（ＳＩＲＳ）を有する対象からの血液を分析して、ＳＩＲＳの発生原因（例えば、細菌、酵母生物体または糸状菌）を決定するために使用することができる。他の実施形態では、本発明の方法は、対象が細菌、酵母生物体または糸状菌の感染源を有する敗血症を有するかどうか決定するために使用することができる。両方の実施形態では、本発明の方法は、試料中に存在する細菌、酵母生物体または糸状菌の存在を判定し、それを区別しおよび／または同定するために使用することができる。
【0066】
ＳＩＲＳは、感染性の病因または非感染性の病因（すなわち、感染陰性のＳＩＲＳまたはｉｎＳＩＲＳ）を有することができる圧倒的な全身反応である。敗血症は、感染の間に起こるＳＩＲＳである。この場合における敗血症は、臨床医によって（感染が疑われるとき）、または生物体の培養を通して診断される。ＳＩＲＳおよび敗血症は、心臓および呼吸速度、体温および白血球数における変化を含むいくつかの非特異的宿主応答パラメータによって規定される（Levy et al., 2003；Reinhart et al., 2012）。
【0067】
一部の実施形態では、少なくとも１つのＳＮＰまたは少なくとも１つのプローブ、ツールもしくは試薬は、試料中の細菌をグラム陽性の１つまたは複数の細菌またはグラム陰性の１つまたは複数の細菌として分類するために使用することができる。
【0068】
例えば、一部の実施形態では、１つまたは複数の細菌は、上記のＳＮＰのいずれか１つ、特に配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７および６５３の少なくとも１つに基づいてグラム陽性に分類することができる。そのような一実施形態では、１つまたは複数の細菌は、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３および６５３に対応する位置のＳＮＰに基づいて分類することができ、ここで、２７３位にＡがあり、６５３位にＴがあるとき、１つまたは複数の細菌はグラム陽性であると判定される。
【0069】
例えば、別の実施形態では、１つまたは複数の細菌は、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の４４０位に対応する位置の少なくとも１つのＳＮＰに基づいてグラム陽性に分類することができ、ここで、４４０位にＴがあるとき、１つまたは複数の細菌はグラム陽性であると判定される。逆に、４４０位にＴがないとき、１つまたは複数の細菌はグラム陰性であると判定される。
【0070】
さらに他の実施形態では、少なくとも１つのＳＮＰまたは少なくとも１つのプローブ、ツールもしくは試薬は、試料中の細菌、酵母生物体または糸状菌の群を分類するために使用することができる。
【0071】
例えば、一部の実施形態では、細菌は、上記のＳＮＰから選択される少なくとも１つのＳＮＰに基づいて特定の属に属すると分類することができる。そのような一実施形態では、細菌は、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置４１２および６４７に対応する位置のＳＮＰから選択される少なくとも１つのＳＮＰに基づいて特定の属に属すると分類することができる。例えば、試料中の１つまたは複数の細菌は、４１２位にＴがあるとき、Staphylococcus属に属すると分類することができる。例えば、試料中の１つまたは複数の細菌は、６４７位にＧがあるとき、Enterococcus属に属すると分類することができる。
【0072】
さらに他の実施形態では、少なくとも１つのＳＮＰまたは少なくとも１つのプローブ、ツールもしくは試薬は、上記の通り試料中の細菌を同定するために使用することができる。
【0073】
例えば、細菌Enterobacter cloacaeは、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の６５３位に対応する位置の少なくとも１つのＳＮＰに基づいて試料の中で同定することができ、ここで、６５３位にＧがあるとき、細菌Enterobacter cloacaeが同定される。
【0074】
例えば、Streptococcus pneumoniae、Streptococcus agalactiaeおよびStreptococcus pyogenesから選択される細菌は、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置３７８および４８８に対応する位置のＳＮＰに基づいて試料の中で同定することができ、ここで、細菌は：３７８位にＡがあり、４８８位にＴがあるときはStreptococcus pneumoniaeであり；３７８位にＡがあり、４８８位にＡがあるときはStreptococcus agalactiaeであり；３７８位にＧがあり、４８８位にＡがあるときはStreptococcus pyogenesである。
【0075】
例えば、一実施形態では、Acinetobacter calcoaceticus；Enterobacter cloacae；Escherichia coli；Klebsiella pneumoniae；Proteus mirabilis；Pseudomonas aeruginosa；Streptococcus agalactiae；Streptococcus pneumoniaeおよびStreptococcus pyogenesの中から選択される細菌は、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７および６５３に対応する位置にあるＳＮＰに基づいて試料の中で同定することができ、ここで、細菌は：２７３、４４０および６４７位にＡがあるときはAcinetobacter calcoaceticusであり；６５３位にＧがあるときはEnterobacter cloacaeであり；２７３位にＴがあり、６５３位にＴがあるときはEscherichia coliであり；２７３位にＴがあり、４８８および６４７位にＣがあり、６５３位にＡがあるときはKlebsiella pneumoniaeであり；４４０および４８８位にＣがあり、６４７位にＴがあるときはProteus mirabilisであり；４４０位にＡがあり、６４７位にＴがあるときはPseudomonas aeruginosaであり；３７８、４８８および６４７位にＡがあるときはStreptococcus agalactiaeであり；４８８および６４７位にＴがあるときはStreptococcus pneumoniaeであり；３７８位にＧがあり、４８８および６４７位にＡがあるときはStreptococcus pyogenesである。
【0076】
例えば、別の実施形態では、Acinetobacter calcoaceticus；Enterobacter cloacae；Escherichia coli；Klebsiella pneumoniae；Proteus mirabilis；Pseudomonas aeruginosa；Streptococcus agalactiae；Streptococcus pneumoniaeおよびStreptococcus pyogenes の中から選択される細菌は、以下の表に示すＳＮＰの存在に基づいて試料の中で同定することができる：
【0077】
【表1】
【0078】
例えば、別の実施形態では、Escherichia coli、Streptococcus pneumoniae、Streptococcus agalactiae、Streptococcus pyogenes、Proteus mirabilis、Enterobacter cloacae、Klebsiella pneumoniae、Pseudomonas aeruginosa、Acinetobacter calcoaceticus、Enterococcus faecalis、Listeria monocytogenes、Staphylococcus aureus、Clostridium perfringens、Corynebacterium jeikeium、Bacteroides fragilis、Neisseria meningitidis、Haemophilus influenzae、Serratia marcescens、Salmonella sp.およびStaphylococcus epidermidisの中から選択される細菌は、以下の表に示すＳＮＰの存在に基づいて試料の中で同定することができる：
【0079】
【表2】
【0080】
別の実施形態では、Bacillus anthracis、Clostridium botulinumＡ型、Clostridium botulinumＢ型、Clostridium botulinumＣ型、Clostridium botulinumＤ型、Clostridium botulinumＧ型、Yersinia pestis、Francisella tularensis、Vibrio choleraeおよびBurkholderia pseudomalleiの中から選択される細菌は、配列番号４３に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置７４６、７６４、７７１または７８５に対応する位置のＳＮＰに基づいて、試料の中で同定することができ、ここで、細菌は：７４６位にＴがあり、７６４位にＡがあり、７７１位にＣがあり、７８５位にＧがあるときはBacillus anthracisであり；７４６位にＴがあり、７６４位にＧがあり、７７１位にＣがあり、７８５位にＴがあるときはClostridium botulinumＡ型またはClostridium botulinumＢ型であり；７４６位にＴがあり、７６４位にＡがあり、７７１位にＴがあり、７８５位にＴがあるときはClostridium botulinumＣ型であり；７４６位にＣがあり、７６４位にＡがあり、７７１位にＴがあり、７８５位にＴがあるときはClostridium botulinumＤ型であり；７４６位にＴがあり、７６４位にＧがあり、７７１位にＣがあり、７８５位にＧがあるときはClostridium botulinumＧ型であり；７４６位にＣがあり、７６４位にＧがあり、７７１位にＴがあり、７８５位にＧがあるときはYersinia pestisであり；７４６位にＴがあり、７６４位にＡがあり、７７１位にＧがあり、７８５位にＧがあるときはFrancisella tularensisであり；７４６位にＣがあり、７６４位にＡがあり、７７１位にＴがあり、７８５位にＧがあるときはVibrio choleraeであり；７４６位にＣがあり、７６４位にＧがあり、７７１位にＣがあり、７８５位にＧがあるときはBurkholderia pseudomalleiである。
【0081】
例えば、別の実施形態では、Bacillus anthracis、Clostridium botulinumＡ型、Clostridium botulinumＢ型、Clostridium botulinumＣ型、Clostridium botulinumＤ型、Clostridium botulinumＧ型、Yersinia pestis、Francisella tularensis、Vibrio choleraeおよびBurkholderia pseudomalleiの中から選択される細菌は、以下の表に示すＳＮＰの存在に基づいて試料の中で同定することができる：
【0082】
【表3】
【0083】
上記の生物体を同定するために使用された４つのＳＮＰの累積差別指数は、１ＳＮＰでは０．６６７；２ＳＮＰでは０．８８９；３ＳＮＰでは０．９４４；および４ＳＮＰでは０．９７２である。
【0084】
配列番号４３に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の７４６位は、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の７３７位に対応する。配列番号４３に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の７６４位は、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の７５５位に対応する。配列番号４３に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の７７１位は、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の７６２位に対応する。配列番号４３に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の７８５位は、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の７７６位に対応する。
【0085】
したがって、別の実施形態では、Bacillus anthracis、Clostridium botulinumＡ型、Clostridium botulinumＢ型、Clostridium botulinumＣ型、Clostridium botulinumＤ型、Clostridium botulinumＧ型、Yersinia pestis、Francisella tularensis、Vibrio choleraeおよびBurkholderia pseudomalleiの中から選択される細菌は、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置７３７、７５５、７６２または７７６に対応する位置のＳＮＰに基づいて試料の中で同定することができ、ここで、細菌は：７３７位にＴがあり、７５５位にＡがあり、７６２位にＣがあり、７７６位にＧがあるときはBacillus anthracisであり；７３７位にＴがあり、７５５位にＧがあり、７６２位にＣがあり、７７６位にＴがあるときはClostridium botulinumＡ型またはClostridium botulinumＢ型であり；７３７位にＴがあり、７５５位にＡがあり、７６２位にＴがあり、７７６位にＴがあるときはClostridium botulinumＣ型であり；７３７位にＣがあり、７５５位にＡがあり、７６２位にＴがあり、７７６位にＴがあるときはClostridium botulinumＤ型であり；７３７位にＴがあり、７５５位にＧがあり、７６２位にＣがあり、７７６位にＧがあるときはClostridium botulinumＧ型であり；７３７位にＣがあり、７５５位にＧがあり、７６２位にＴがあり、７７６位にＧがあるときはYersinia pestisであり；７３７位にＴがあり、７５５位にＡがあり、７６２位にＧがあり、７７６位にＧがあるときはFrancisella tularensisであり；７３７位にＣがあり、７５５位にＡがあり、７６２位にＴがあり、７７６位にＧがあるときはVibrio choleraeであり；７３７位にＣがあり、７５５位にＧがあり、７６２位にＣがあり、７７６位にＧがあるときはBurkholderia pseudomalleiである。
【0086】
別の実施形態では、Candida albicans、Candida tropicalis、Candida parapsilosis、Candida glabrata、Fusarium spp.、Aspergillus fumigatusおよびCryptococcus neoformansの中から選択される酵母生物体または糸状菌は、配列番号３７に示す１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置３４３、３７１、３８８、４１６および４６７に対応する位置にあるＳＮＰに基づいて試料の中で同定することができ、ここで、酵母生物体または糸状菌は：３４３位にＣがあり、３７１位にＡがあり、３８８位にＴがあり、４１６位にＧがあり、４６７位にＧがあるときはCandida albicansであり；３４３位にＣがあり、３７１位にＡがあり、３８８位にＣがあり、４１６位にＧがあり、４６７位にＣがあるときはCandida tropicalisであり；３４３位にＣがあり、３７１位にＡがあり、３８８位にＣがあり、４１６位にＧがあり、４６７位にＧがあるときはCandida parapsilosisであり；３４３位にＴがあり、３７１位にＡがあり、３８８位にＣがあり、４１６位にＧがあり、４６７位にＧがあるときはCandida glabrataであり；３４３位にＣがあり、３７１位にＣがあり、３８８位にＴがあり、４１６位にＴがあり、４６７位にＧがあるときはFusarium spp.であり；３４３位にＣがあり、３７１位にＣがあり、３８８位にＴがあり、４１６位にＣがあり、４６７位にＧがあるときはAspergillus fumigatusであり；３４３位にＣがあり、３７１位にＡがあり、３８８位にＴがあり、４１６位にＴがあり、４６７位にＧがあるときはCryptococcus neoformansである。
【0087】
例えば、別の実施形態では、Candida albicans、Candida tropicalis、Candida parapsilosis、Candida glabrata、Fusarium spp.、Aspergillus fumigatusおよびCryptococcus neoformansの中から選択される酵母生物体または糸状菌は、以下の表に示すＳＮＰの存在に基づいて試料の中で同定することができる：
【0088】
【表4】
【0089】
細菌、酵母生物体または糸状菌は、上記のＳＮＰの１つまたは複数に基づいて部分的に同定するかまたは分類することができる。
【0090】
一実施形態では、本発明の方法における（特に、第１および第２の態様における）分析の前に、核酸が試料から抽出される。別の実施形態では、方法における（特に、第１および第２の態様における）分析工程は、核酸の増幅を含むことができる。核酸は、転写されたＲＮＡを増幅する１つまたは複数のオリゴヌクレオチド／プライマーを使用する、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）および逆転写－ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を限定されずに含む、当技術分野で公知の任意の方法によって増幅することができる。
【0091】
ＳＮＰは、以下を限定されずに含む、当技術分野で公知の任意の方法によって分析することができる：高分解能融解分析、５’ヌクレアーゼ消化（５’ヌクレアーゼ消化を含む）、分子ビーコン、オリゴヌクレオチドライゲーション、マイクロアレイ、制限断片長多型；抗体検出方法；直接配列決定または任意のその組合せ。一実施形態では、方法における（特に、本発明の第１および第２の態様における）分析工程は、高分解能融解分析、５’ヌクレアーゼ消化、分子ビーコン、オリゴヌクレオチドライゲーション、マイクロアレイ、制限断片長多型、抗体検出方法；直接配列決定または任意のその組合せを使用して少なくとも１つのＳＮＰの存在の有無を判定することを含む。ＳＮＰは、以下を限定されずに含む当技術分野で公知の任意の方法によって検出することができる：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）；ハイブリダイゼーション分析；高分解能融解分析；５’ヌクレアーゼ消化を含むヌクレアーゼによる消化；分子ビーコン；オリゴヌクレオチドライゲーション；マイクロアレイ；制限断片長多型；抗体検出方法；直接配列決定；または任意のその組合せ。
【0092】
例えば、一部の実施形態では、細菌の同定または細菌の分類は、上で広く記載されるＳＮＰおよびそれらの周囲のＤＮＡ配列のＤＮＡ融解特性、好ましくは高分解能融解分析にさらに基づくことができる。
【0093】
例えば、一部のそのような実施形態では、本発明の方法は、上で広く記載されるＳＮＰおよびそれらの周囲のＤＮＡ配列のＤＮＡ融解特性をさらに分析するために、高分解能融解（ＨＲＭ）分析をさらに含むことができる。特定の実施形態では、ＨＲＭ分析は、ＳＮＰの少なくとも１つおよび少なくとも１つの挿入蛍光色素を含有するＤＮＡ増幅生成物（すなわち、アンプリコン）を形成すること、ならびにその融点（Ｔｍ）を通してＤＮＡ増幅生成物を加熱することを含むことができる。ＤＮＡ増幅生成物に組み込まれている蛍光色素を使用して、ＨＲＭはリアルタイムでモニタリングされる。蛍光レベルは、二本鎖のＤＮＡの量が低減するに従って蛍光が低減するので温度上昇に伴いモニタリングされる。蛍光および温度における変化は、融解曲線として知られるグラフにプロットすることができる。
【0094】
当業者が理解するように、２つのＤＮＡ鎖が分離するＤＮＡ増幅生成物のＴｍは予測可能であり、ＤＮＡ増幅生成物を形成するヌクレオチド塩基の配列に依存する。したがって、融解曲線は異なって出現するので、多型（すなわち、１つまたは複数のＳＮＰ）を含有するＤＮＡ増幅生成物を含むＤＮＡ増幅生成物を区別することが可能である。実際、一部の実施形態では、周囲のＤＮＡ配列における差に基づいて、同じ多型を含有するＤＮＡ増幅生成物を区別することが可能である。
【0095】
例えば、Acinetobacter calcoaceticus；Enterobacter aerogenes；Enterobacter cloacae；Enterococcus faecalis；Enterococcus faecium；Escherichia coli；Klebsiella pneumoniae；Proteus mirabilis；Pseudomonas aeruginosa；Serratia marcescens；Staphylococcus aureus；Staphylococcus epidermidis；Streptococcus agalactiae；Streptococcus pneumoniaeおよびStreptococcus pyogenesの中から選択される細菌は、以下の表に示すＳＮＰの存在ならびにＳＮＰおよびそれらの周囲のＤＮＡ配列のＤＮＡ融解特性に基づいて試料の中で同定することができる：
【0096】
【表5】
【0097】
例えば、Escherichia coli、Streptococcus pneumoniae、Streptococcus agalactiae、Streptococcus pyogenes、Proteus mirabilis、Enterobacter cloacae、Klebsiella pneumoniae、Pseudomonas aeruginosa、Acinetobacter calcoaceticus、Enterococcus faecalis、Listeria monocytogenes、Staphylococcus aureus、Clostridium perfringens、Corynebacterium jeikeium、Bacteroides fragilis、Neisseria meningitidis、Haemophilus influenzae、Serratia marcescens、Salmonella sp.、Staphylococcus epidermidisの中から選択される細菌は、表２に示すＳＮＰの存在ならびにＳＮＰおよびそれらの周囲のＤＮＡ配列のＤＮＡ融解特性に基づいて試料の中で同定することができる。
【0098】
一実施形態では、Acinetobacter calcoaceticus；Enterobacter aerogenes；Enterobacter cloacae；Enterococcus faecalis；Enterococcus faecium；Escherichia coli；Klebsiella pneumoniae；Proteus mirabilis；Pseudomonas aeruginosa；Serratia marcescens；Staphylococcus aureus；Staphylococcus epidermidis；Streptococcus agalactiae；Streptococcus pneumoniaeおよびStreptococcus pyogenesから選択される細菌は、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７および６５３に対応する位置にあるＳＮＰならびにＳＮＰおよびそれらの周囲のＤＮＡの高分解能融解曲線分析に基づいて試料の中で同定することができる。
【0099】
例えば、Acinetobacter calcoaceticus；Enterobacter cloacae；Escherichia coli；Klebsiella pneumoniae；Proteus mirabilis；Pseudomonas aeruginosa；Streptococcus agalactiae；Streptococcus pneumoniaeおよびStreptococcus pyogenesの中から選択される細菌は、上記のＳＮＰ位置および／またはＳＮＰおよびそれらの周囲のＤＮＡの高分解能融解曲線分析に基づいて試料の中で同定することができる。
【0100】
一部の実施形態では、Staphylococcus aureus；Staphylococcus epidermidis；Enterococcus faecalis；Enterococcus faecium；Serratia marcescensおよびEnterobacter aerogenesから選択される細菌は、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置４１２、４４０、４８８および６４７に対応する位置にあるＳＮＰに基づいて試料の中で個々に同定することができ、ここで：Staphylococcus aureusおよびStaphylococcus epidermidisは、４１２位にＴがあるとき同定することができ、次に、４１２位のＳＮＰの周囲のＤＮＡの高分解能融解曲線分析に基づいてお互いからさらに区別することができ；Enterococcus faecalisおよびEnterococcus faecium は、６４７位にＧがあるとき同定することができ、次に、６４７位のＳＮＰの周囲のＤＮＡの高分解能融解曲線分析に基づいてお互いからさらに区別することができ；Serratia marcescensおよびEnterobacter aerogenesは、４４０および６４７位にＣがあり、４８８位にＴがあるとき同定することができ、次に、位置４４０、４８８および６４７のいずれか１つにあるＳＮＰの周囲のＤＮＡの高分解能融解曲線分析に基づいてお互いからさらに区別することができる。
【0101】
他の実施形態では、Enterococcus faecalis；Enterococcus faecium；Streptococcus agalactiaeおよびStreptococcus pyogenesから選択される細菌は、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の３７８位に対応する位置の少なくとも１つのＳＮＰ、および３７８位のＳＮＰの周囲のＤＮＡの高分解能融解曲線分析に基づいて試料の中で同定することができる。
【0102】
例えば、Bacillus anthracis、Clostridium botulinumＡ型、Clostridium botulinumＢ型、Clostridium botulinumＣ型、Clostridium botulinumＤ型、Clostridium botulinumＧ型Yersinia pestis、Francisella tularensis、Vibrio choleraeおよびBurkholderia pseudomalleiの中から選択される細菌は、以下の表に示すＳＮＰの存在ならびにＳＮＰおよびそれらの周囲のＤＮＡ配列のＤＮＡ融解特性に基づいて試料の中で同定することができる：
【0103】
【表6】
【0104】
上記のように、配列番号４３に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の７４６位は、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の７３７位に対応する。配列番号４３に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の７６４位は、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の７５５位に対応する。配列番号４３に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の７７１位は、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の７６２位に対応する。配列番号４３に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の７８５位は、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の７７６位に対応する。
【0105】
一実施形態では、Bacillus anthracis、Clostridium botulinumＡ型、Clostridium botulinumＢ型、Clostridium botulinumＣ型、Clostridium botulinumＤ型、Clostridium botulinumＧ型、Yersinia pestis、Francisella tularensis、Vibrio choleraeおよびBurkholderia pseudomalleiから選択される細菌は、配列番号４３に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置７４６、７６４、７７１または７８５（または、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置７３７、７５５、７６２または７７６）に対応する位置にあるＳＮＰならびにＳＮＰおよびそれらの周囲のＤＮＡの高分解能融解曲線分析に基づいて試料の中で同定することができる。
【0106】
例えば、Bacillus anthracis、Clostridium botulinumＡ型、Clostridium botulinumＢ型、Clostridium botulinumＣ型、Clostridium botulinumＤ型、Clostridium botulinumＧ型、Yersinia pestis、Francisella tularensis、Vibrio choleraeおよびBurkholderia pseudomalleiの中から選択される細菌は、上記のＳＮＰ位置および／またはＳＮＰおよびそれらの周囲のＤＮＡの高分解能融解曲線分析に基づいて試料の中で同定することができる。
【0107】
別の例では、Candida albicans、Candida tropicalis、Candida parapsilosis、Candida glabrata、Fusarium spp.、Aspergillus fumigatusおよびCryptococcus neoformansの中から選択される酵母生物体または糸状菌は、以下の表に示すＳＮＰの存在ならびにＳＮＰおよびそれらの周囲のＤＮＡ配列のＤＮＡ融解特性に基づいて試料の中で同定することができる：
【0108】
【表7】
【0109】
一実施形態では、Candida albicans、Candida tropicalis、Candida parapsilosis、Candida glabrata、Fusarium spp.、Aspergillus fumigatusおよびCryptococcus neoformansから選択される酵母生物体または糸状菌は、配列番号３７に示す１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置３４３、３７１、３８８、４１６および４６７に対応する位置にあるＳＮＰならびにＳＮＰおよびそれらの周囲のＤＮＡの高分解能融解曲線分析に基づいて試料の中で同定することができる。
【0110】
例えば、Candida albicans、Candida tropicalis、Candida parapsilosis、Candida glabrata、Fusarium spp.、Aspergillus fumigatusおよびCryptococcus neoformansの中から選択される酵母生物体または糸状菌は、上記のＳＮＰ位置および／またはＳＮＰおよびそれらの周囲のＤＮＡの高分解能融解曲線分析に基づいて試料の中で同定することができる。
【0111】
一部の実施形態では、分析、同定、分類および／または診断の前に、核酸を試料から抽出することができる。一般的に、分析、同定、分類および／または診断は、核酸の増幅を含むことができる。一部の実施形態では、分析、同定、分類および／または診断は、対象に例えば抗生物質などの治療剤を投与することをさらに含むことができる。別の実施形態では、治療の方法（例えば、本発明の第３の態様におけるような）は、少なくとも１つの細菌、酵母生物体または糸状菌が治療剤に抵抗性であるかどうか判定する工程をさらに含むことができる。
【0112】
一実施形態では、任意の適する試料を本発明の方法において使用することができる。例示的な試料は、喀痰、唾液、血液、脳脊髄液または尿試料を含むことができる。
【0113】
プローブ、ツールまたは試薬は、限定されずに、オリゴヌクレオチド、プライマー、核酸、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチドまたはポリペプチドであってよい。これらは、例えば、一本鎖もしくは二本鎖であってよく、天然に存在するか、単離されたか、精製されたか、化学改変されたか、組換えか、または合成されたかであってよい。
【0114】
プローブ、ツールまたは試薬は、限定されずに、少なくとも１つのＳＮＰを含有する試料中の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子または１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の少なくとも一部分に特異的に結合するか、それを検出するかまたは同定することが可能である、抗体または他のタイプの分子または化学実体であってよい。
【0115】
プローブ、ツールまたは試薬は、上記のものの任意の数または組合せであってよく、数および組合せは、達成すべき所望の結果－例えば、ゲノムレベル（遺伝子タイピング）またはＲＮＡ転写レベルでのＳＮＰの検出に依存する。
【0116】
プローブ、ツールまたは試薬は、単離されたものであってよい。プローブ、ツールまたは試薬は、検出可能に標識化されてもよい。検出可能な標識は、増幅反応に含まれてもよい。適する標識には、蛍光色素、例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリトリン、アロフィコシアニン、６－カルボキシフルオレセイン（６－ＦＡＭ）、２’，７’－ジメトキシ－４’，５’－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、６－カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）、６－カルボキシ－２’，４’，７’，４，７－ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、５－カルボキシフルオレセイン（５－ＦＡＭ）またはＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－６－カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、放射性標識、例えば３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ；等が含まれる。標識は、高親和性結合パートナー、例えばアビジン、特異的抗体等を有する、増幅されたＤＮＡがビオチン、ハプテン等にコンジュゲートされる２段階システムであってよく、ここで、結合パートナーは、検出可能な標識にコンジュゲートされる。標識は、プライマーの片方または両方にコンジュゲートされてもよい。あるいは、増幅において使用されるヌクレオチドのプールは、増幅生成物に標識を組み込むために標識化される。
【0117】
特定の実施形態では、少なくとも１つのプローブ、ツールまたは試薬は、ゲノムレベルまたは転写レベルでの、好ましくは前者でのＳＮＰの特異的結合、検出または同定のためである。
【0118】
好ましい実施形態では、少なくとも１つのプローブ、ツールまたは試薬は、表１から７のいずれか１つに示す少なくとも１つのＳＮＰを含有する試料中の１６Ｓ ｒＲＮＡもしくは１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子または遺伝子生成物の少なくとも一部分に特異的に結合するか、それを検出するかまたは同定するためである。
【0119】
細菌、酵母生物体もしくは糸状菌を同定、部分的に同定、分類するとき、または細菌、酵母生物体もしくは糸状菌の感染を同定、部分的に同定もしくは診断するとき、単一のプローブ（特にプライマー）を各試料で使用することができ、または、複数のプローブ（特にプライマー）を各試料で（すなわち、ワンポットにおいて）使用することができる。そのようなプローブ（特にプライマー）は、増幅（ＰＣＲなど）から得た生の溶液に加えることができる。
【0120】
一実施形態では、少なくとも１つのプローブ、ツールまたは試薬は２つのプライマーを含むことができ、その各々は、上記のＳＮＰを含有する、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（または遺伝子生成物）の少なくとも一部分、または酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（または遺伝子生成物）の少なくとも一部分にハイブリダイズする。別の実施形態では、少なくとも１つのプローブ、ツールまたは試薬は、上記のＳＮＰを含有する、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分、または酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分にハイブリダイズするプローブを含むことができる。
【0121】
一実施形態では、少なくとも１つの前記プローブ、ツールまたは試薬は、配列番号１６～３５および５３～５７の少なくとも１つに示す配列と、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列相同性または同一性を有するヌクレオチド配列を有する（または含むもしくはそれからなる）オリゴヌクレオチドを含む。前記プローブ、ツールまたは試薬は、プライマーであってよい。前記プローブ、ツールまたは試薬は、配列番号１６～３５および５３～５７の少なくとも１つに示すヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【0122】
一態様では、本発明は、少なくとも１つの単離されたプローブ、ツールまたは試薬を提供し、ここで、少なくとも１つの単離された前記プローブ、ツールまたは試薬は、配列番号１６～３５および５３～５７の少なくとも１つに示す配列と、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列相同性または同一性を有するヌクレオチド配列を有する（または含むもしくはそれからなる）オリゴヌクレオチドを含む。前記プローブ、ツールまたは試薬は、プライマーであってよい。
【0123】
配列番号４３に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ配列の中のＳＮＰの同定（特に、表３のＳＮＰの同定）のために適するプライマーは、下の表に示す通りであってよい。
【0124】
【表8】
【0125】
配列番号３７に示す１８Ｓ ｒＲＮＡ配列の中のＳＮＰの同定（特に、表４のＳＮＰの同定）のために適するプライマーは、下の表に示す通りであってよい。
【0126】
【表9】
【0127】
本明細書に記載される特徴のいずれも、本発明の範囲内の本明細書に記載される他の特徴のいずれか１つまたは複数との任意の組合せで組み合わせることができる。
【0128】
上記は、主に１６Ｓ ｒＲＮＡおよび１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の使用を議論する。しかし、上記は、１６Ｓ ｒＲＮＡおよび１８Ｓ ｒＲＮＡならびに他の１６Ｓ ｒＲＮＡおよび１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子生成物にも適用可能である。したがって、一部の実施形態では（該当する場合）、上下の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子および１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子への言及は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子生成物（または、１６Ｓ ｒＲＮＡ）および１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子生成物（または、１８Ｓ ｒＲＮＡ）で置き換えることができる。
【0129】
この明細書におけるいかなる先行技術への言及も、その先行技術が普通の一般的な知識の一部をなすということの承認でもいかなる形の示唆でもなく、それととるべきでもない。
【図面の簡単な説明】
【0130】
本発明の様々な実施形態が、以下の図面を参照して記載される。
【図1】図１は、以下の細菌種からの１６Ｓ ｒＲＮＡ分子をコードする代表的遺伝子のＣＬＵＳＴＡＬＷ配列アラインメントを示す：Acinetobacter calcoaceticus；Enterobacter aerogenes；Enterobacter cloacae；Enterococcus faecalis；Enterococcus faecium；Escherichia coli；Klebsiella pneumoniae；Proteus mirabilis；Pseudomonas aeruginosa；Serratia marcescens；Staphylococcus aureus；Staphylococcus epidermidis；Streptococcus agalactiae；Streptococcus pneumoniaeおよびStreptococcus pyogenes。ＣＬＵＳＴＡＬＷアラインメントによって判定される可変配列を取り出した。配列番号１に示すE. coliからの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７および６５３に対応する位置にあるＳＮＰは、整列させた配列の中の対応するヌクレオチドと一緒に強調されている。
【図2】図２は、実施例１で試験した以下の１５の細菌種のための正規化された高分解能融解（ＨＲＭ）曲線グラフを示す：Acinetobacter calcoaceticus；Enterobacter aerogenes；Enterobacter cloacae；Enterococcus faecalis；Enterococcus faecium；Escherichia coli；Klebsiella pneumoniae；Proteus mirabilis；Pseudomonas aeruginosa；Serratia marcescens；Staphylococcus aureus；Staphylococcus epidermidis；Streptococcus agalactiae；Streptococcus pneumoniaeおよびStreptococcus pyogenes。
【図4】図４は、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の４１２位に対応する位置のＳＮＰを含有するアンプリコンのためのStaphylococcus aureusおよびStaphylococcus epidermidisの正規化ＨＲＭ曲線グラフを示す。
【図5】図５は、ベースラインとしてS. aureusを使用した、図４に示すStaphylococcus aureusおよびStaphylococcus epidermidisのための差ＨＲＭ曲線グラフを示す。
【図6】図６は、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の３７８位に対応する位置のＳＮＰを含有するアンプリコンのためのEnterococcus faecalis、Enterococcus faecium、Streptococcus agalactiae；Streptococcus pneumoniaeおよびStreptococcus pyogenesの正規化ＨＲＭ曲線グラフを示す。
【図7】図７は、ベースラインとしてE. faecalisを使用した、図６に示すEnterococcus faecalis、Enterococcus faecium、Streptococcus agalactiae；Streptococcus pneumoniaeおよびStreptococcus pyogenesのための差ＨＲＭ曲線グラフを示す。
【図8】図８は、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の４１２位に対応する位置のＳＮＰを含有するアンプリコンのためのEscherichia coli、Enterobacter cloacae、Serratia marcescens、Acinetobacter calcoaceticus、Enterobacter aerogenes、Pseudomonas aeruginosa、Klebsiella pneumoniaeおよびProteus mirabilisの正規化ＨＲＭ曲線グラフを示す。
【図9】図９は、ベースラインとしてEscherichia coliを使用した、図８に示すEscherichia coli、Enterobacter cloacae、Serratia marcescens、Acinetobacter calcoaceticus、Enterobacter aerogenes、Pseudomonas aeruginosa、Klebsiella pneumoniaeおよびProteus mirabilisのための差ＨＲＭ曲線グラフを示す。
【図10】図１０は、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の３７８位に対応する位置のＳＮＰを含有するアンプリコンのためのStreptococcus agalactiae、Streptococcus pneumoniaeおよびStreptococcus pyogenesの正規化ＨＲＭ曲線グラフを示す。
【図11】図１１は、ベースラインとしてStreptococcus pneumoniaeを使用した、図１０に示すStreptococcus agalactiae、Streptococcus pneumoniaeおよびStreptococcus pyogenesのための差ＨＲＭ曲線グラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【0131】
配列表への鍵
【0132】
配列番号１：Escherichia coliの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＮＲ＿１０２８０４．１）；
【0133】
配列番号２：Staphylococcus aureusの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＮＲ＿０７５０００．１）；
【0134】
配列番号３：Staphylococcus epidermidisの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＮＲ＿０７４９９５．１）；
【0135】
配列番号４：Streptococcus pneumoniaeの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＮＲ＿０７４５６４．１）；
【0136】
配列番号５：Streptococcus agalactiaeの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＮＲ＿０４０８２１．１）；
【0137】
配列番号６：Streptococcus pyogenesの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＮＲ＿０７４０９１．１）；
【0138】
配列番号７：Enterococcus faecalisの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＮＲ＿０７４６３７．１）；
【0139】
配列番号８：Enterococcus faeciumの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＮＲ＿０４２０５４．１）；
【0140】
配列番号９：Proteus mirabilisの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＮＲ＿０７４８９８．１）；
【0141】
配列番号１０：Serratia marcescensの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＮＲ＿０４１９８０．１）；
【0142】
配列番号１１：Enterobacter aerogenesの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＮＲ＿０２４６４３．１）；
【0143】
配列番号１２：Enterobacter cloacaeの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＮＲ＿０２８９１２．１）；
【0144】
配列番号１３：Klebsiella pneumoniaeの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＮＲ＿０３６７９４．１）；
【0145】
配列番号１４：Pseudomonas aeruginosaの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＮＲ＿０７４８２８．１）；
【0146】
配列番号１５：Acinetobacter calcoaceticusの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託ＡＢ３０２１３２．１）；
【0147】
配列番号１６：フォワードプライマー(CCTCTTGCCATCGGATGTG);
【0148】
配列番号１７：リバースプライマー(CCAGTGTGGCTGGTCATCCT);
【0149】
配列番号１８：フォワードプライマー(GGGAGGCAGCAGTAGGGAAT);
【0150】
配列番号１９：フォワードプライマー(CCTACGGGAGGCAGCAGTAG);
【0151】
配列番号２０：リバースプライマー(CGATCCGAAAACCTTCTTCACT);
【0152】
配列番号２１：フォワードプライマー(AAGACGGTCTTGCTGTCACTTATAGA);
【0153】
配列番号２２：リバースプライマー(CTATGCATCGTTGCCTTGGTAA);
【0154】
配列番号２３：フォワードプライマー(TGCCGCGTGAATGAAGAA);
【0155】
配列番号２４：フォワードプライマー(GCGTGAAGGATGAAGGCTCTA);
【0156】
配列番号２５：フォワードプライマー(TGATGAAGGTTTTCGGATCGT);
【0157】
配列番号２６：リバースプライマー(TGATGTACTATTAACACATCAACCTTCCT);
【0158】
配列番号２７：リバースプライマー(CCAGTGTGGCTGGTCATCCT);
【0159】
配列番号２８：リバースプライマー(CGCTCGCCACCTACGTATTAC);
【0160】
配列番号２９：フォワードプライマー(GTTGTAAGAGAAGAACGAGTGTGAGAGT);
【0161】
配列番号３０：リバースプライマー(CGTAGTTAGCCGTCCCTTTCTG);
【0162】
配列番号３１：フォワードプライマー(GCGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAA);
【0163】
配列番号３２：フォワードプライマー(GGTCTGTCAAGTCGGATGTGAA);
【0164】
配列番号３３：フォワードプライマー(TCAACCTGGGAACTCATTCGA);
【0165】
配列番号３４：リバースプライマー(GGAATTCTACCCCCCTCTACGA);
【0166】
配列番号３５：リバースプライマー(GGAATTCTACCCCCCTCTACAAG);
【0167】
配列番号３６：Aspergillus fumigatus株ＭＪ－Ｘ６の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、完全配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託ＨＭ５９０６６３．１）；
【0168】
配列番号３７：Candida albicansの１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、完全配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＦ１１４４７０．１）；
【0169】
配列番号３８：Candida glabrata株ＳＺ２の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託ＫＴ２２９５４２．１）；
【0170】
配列番号３９：Candida parapsilosisの１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託ＤＱ２１８３２８．１）；
【0171】
配列番号４０：Candida tropicalisの１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＨ００９７７１．２）；
【0172】
配列番号４１：Cryptococcus neoformans var. grubii H99の１８ＳリボソームＲＮＡ ｒＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託／ＮＣＢＩ参照配列：ＸＲ＿００１０４５４６３．１）；
【0173】
配列番号４２：Fusarium sp.株Ｚ１０の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託ＭＦ９７３４６５．１）；
【0174】
配列番号４３：Bacillus anthracis株２００００３１６６４の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＹ１３８３８３．１）；
【0175】
配列番号４４：Burkholderia pseudomalleiの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＪ１３１７９０．１）；
【0176】
配列番号４５：Clostridium botulinumＡ型の１６Ｓ ＲＮＡ ｒｒｎ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｘ６８１８５．１）；
【0177】
配列番号４６：Clostridium botulinumＢ型の１６Ｓ ＲＮＡ ｒｒｎ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｘ６８１８６．１）；
【0178】
配列番号４７：Clostridium botulinumＣ型の１６Ｓ ｒＲＮＡ ｒｒｎ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｘ６８３１５．１）；
【0179】
配列番号４８：Clostridium botulinumＤ型の１６Ｓ ＲＮＡ ｒｒｎ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｘ６８１８７．１）；
【0180】
配列番号４９：Clostridium botulinumＧ型の１６Ｓ ｒＲＮＡ ｒｒｎ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｘ６８３１７．１）；
【0181】
配列番号５０：Francisella tularensis株Ｂ－３８の１６ＳリボソームＲＮＡ、部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託／ＮＣＢＩ参照配列：ＮＲ＿０２９３６２．１）；
【0182】
配列番号５１：Vibrio cholerae株ＤＬ２の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、部分配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託ＭＧ０６２８５８．１）；
【0183】
配列番号５２：Yersinia pestisの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、単離株：ＳＳ－Ｙｐ－１１６（ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＪ２３２２３８．１）；
【0184】
配列番号５３：フォワードプライマー(CATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCG);
【0185】
配列番号５４：リバースプライマー(GTTCAACTACGAGCTTTTTAAC);
【0186】
配列番号５５：リバースプライマー(GTTCGACTACGAGCTTTTTAAC);
【0187】
配列番号５６：フォワードプライマー(GTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAG);
【0188】
配列番号５７：リバースプライマー(TCGTTTACCGTGGACTACCAGGG).
【0189】
詳細な説明
１．定義
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての専門用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業技術者が通常理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるそれらに類似するかまたは同等であるいかなる方法および材料も本発明の実施または試験で使用することができるが、好ましい方法および材料が記載されている。本発明の目的上、以下の用語が下で定義される。
１．定義
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての専門用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業技術者が通常理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるそれらに類似するかまたは同等であるいかなる方法および材料も本発明の実施または試験で使用することができるが、好ましい方法および材料が記載されている。本発明の目的上、以下の用語が下で定義される。
【0190】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書でその冠詞の文法上の目的語の１つまたは複数（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「要素」は１つの要素または複数の要素を意味する。
【0191】
「増幅生成物」または「アンプリコン」は、核酸増幅技術によって生成された核酸生成物を指す。
【0192】
本明細書で用いる用語「生体試料」は、患者または対象由来の、抽出されたか、未処置であるか、処置されたか、希釈されたか、または濃縮されたものであってよい試料を指す。好適には、生体試料は、毛髪、皮膚、爪、組織または体液、例えば喀痰、唾液、脳脊髄液、尿および血液を限定されずに含む、患者または対象の体の任意の部分から選択される。
【0193】
本明細書およびクレーム（あるならば）では、単語「含んでいる（comprising）」ならびに「含む（comprises）」および「含む（comprise）」を含むその派生語は、明記された整数の各々を含むが、１つまたは複数のさらなる整数の含有を排除しない。
【0194】
本明細書で用いるように、「対応する」核酸位置またはヌクレオチドは、２つ以上の核酸分子の整列した遺伝子座に存在する位置またはヌクレオチドを指す。関連したかまたは変異体のポリヌクレオチドは、当業者に公知である任意の方法によって整列させることができる。そのような方法は一致を一般的に最大にし、手動アラインメントの使用、ならびに利用可能な多数のアラインメントプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＮ）および当業者に公知である他のものの使用などの方法を含む。ポリヌクレオチドの配列を整列させることによって、当業者は、同一のヌクレオチドをガイドとして使用して、対応するヌクレオチドまたは位置を同定することができる。例えば、E. coliの１６Ｓ ｒＲＮＡ（配列番号１に示す）をコードする遺伝子の配列を、別の種からの１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする遺伝子と整列させることによって、当業者は、保存されたヌクレオチドをガイドとして使用して対応する位置およびヌクレオチドを同定することができる。
【0195】
「遺伝子」は、ゲノム上の特異的座位を占有し、転写および／もしくは翻訳の調節配列ならびに／またはコード領域ならびに／または非翻訳配列（すなわち、イントロン、５’および３’非翻訳配列）からなる遺伝形質の単位を意味する。
【0196】
「遺伝子生成物」は、遺伝子の生成物を意味する。例えば、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の遺伝子生成物は、１６Ｓ ｒＲＮＡを含む。同様に、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の遺伝子生成物は、１８Ｓ ｒＲＮＡを含む。遺伝子生成物は、例えば、ｒＲＮＡ配列に由来するｃＤＮＡ配列も含む。遺伝子生成物は、ｒＲＮＡ遺伝子の中のＳＮＰが生成物において対応する変化をもたらすだろうｒＲＮＡの生成物を含むこともできる。
【0197】
「相同性」は、同一であるかまたは保存的置換を構成する核酸またはアミノ酸の百分率を指す。相同性は、ＧＡＰ（Deveraux et al. 1984）などの配列比較プログラムを使用して判定することができ、それは参照により本明細書に組み込まれる。この方法では、本明細書に引用されるものに類似のまたは実質的に異なる長さの配列はアラインメントへのギャップの挿入によって比較することができ、そのようなギャップは、例えばＧＡＰによって使用される比較アルゴリズムによって判定される。
【0198】
本明細書において、「ハイブリダイゼーション」は、ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリッドまたはＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドを生成するための相補性ヌクレオチド配列の対形成を表すために使用される。ＤＮＡでは、ＡはＴと対になり、ＣはＧと対になる。ＲＮＡでは、ＵはＡと対になり、ＣはＧと対になる。この点に関しては、本明細書で用いる用語「一致」および「ミスマッチ」は、相補性核酸鎖における対形成ヌクレオチドのハイブリダイゼーションの可能性を指す。上で指摘した古典的Ａ－ＴおよびＧ－Ｃ塩基対などのマッチしているヌクレオチドは、効率的にハイブリダイズする。ミスマッチは、効率的にハイブリダイズしないヌクレオチドの他の組合せである。ヌクレオチド記号は、以下の表に示す：
【0199】
【表10】
【0200】
「単離された」は、その天然の状態においてそれに通常付随する構成成分が実質的にまたは事実上含まれない材料を意味する。
【0201】
本明細書で用いる用語「オリゴヌクレオチド」は、ホスホジエステル結合を通して連結される多数のヌクレオチド残基（デオキシヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、またはその関連した構造変異体もしくは合成類似体）で構成されるポリマーを指す（または、その関連した構造変異体または合成類似体）。したがって、用語「オリゴヌクレオチド」はヌクレオチド残基およびそれらの間の連結が天然に存在するヌクレオチドポリマーを一般的に指すが、この用語が、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロアミデート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、２－Ｏ－メチルリボ核酸などを限定されずに含む様々な類似体もその範囲に含むことが理解される。分子の正確なサイズは、特定の適用によって異なることができる。オリゴヌクレオチドは長さが一般的に約１０から３０ヌクレオチド残基と一般的にかなり短いが、しかしこの用語は任意の長さの分子を指すことができるが、用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」は大きなオリゴヌクレオチドのために一般的に使用される。
【0202】
用語「患者」および「対象」は互換的に使用され、ヒトまたは他の哺乳動物の患者および対象を指し、本発明の方法を使用して検査または治療される任意の個体を含む。しかし、「患者」は、症状が存在することを暗示していないことが理解される。本発明の範囲に含まれる適した哺乳動物には、限定されずに、霊長類、畜産動物（例えば、ヒツジ、雌ウシ、ウマ、ロバ、ブタ）、臨床試験動物（例えば、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター）、コンパニオン動物（例えば、ネコ、イヌ）および狩猟野生動物（例えば、コアラ、クマ、野生のネコ、野生のイヌ、オオカミ、ディンゴ、キツネなど）が含まれる。
【0203】
本明細書で用いる用語「多型」は、別の個体の相同領域におけるヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較したときの、所与の領域のヌクレオチドまたはアミノ酸配列における差、特に、同じ種の個体の間で異なっている所与の領域のヌクレオチドまたはアミノ酸配列における差を指す。多型は、参照配列に対して一般的に規定される。多型は、単一ヌクレオチドの差、複数のヌクレオチドにおける差ならびに単一または複数のヌクレオチドの挿入、反転および欠失；ならびに単一アミノ酸の差、複数のアミノ酸の配列における差ならびに単一または複数のアミノ酸の挿入、反転および欠失を含む。「多型部位」は、変異が起こる遺伝子座である。多型が核酸配列に存在し、多型部位の特定の１つまたは複数の塩基の存在に言及する場合、本発明はその部位の相補鎖の上の１つまたは複数の相補的塩基を包含することを理解すべきである。
【0204】
本明細書で用いる用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはＤＮＡを指す。本用語は、長さが３０ヌクレオチド残基より大きいオリゴヌクレオチドを一般的に指す。
【0205】
「プライマー」は、ＤＮＡの鎖と対にしたとき、適する重合剤の存在下でプライマー伸長生成物の合成を開始することが可能であるオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは増幅の最高効率のために好ましくは一本鎖であるが、代わりに二本鎖であってもよい。プライマーは、重合剤の存在下で伸長生成物の合成をプライミングするのに十分に長くなければならない。プライマーの長さは、適用、用いる温度、鋳型反応条件、他の試薬およびプライマーの供給源を含む多くの因子に依存する。例えば、標的配列の複雑性によって、オリゴヌクレオチドプライマーは１５～３５またはより多くのヌクレオチド残基を一般的に含有するが、それはより少ないヌクレオチド残基を含有することができる。プライマーは、例えば約２００ヌクレオチドから数キロベースまたはより多くの大きなポリヌクレオチドであってもよい。プライマーは、それがハイブリダイズして合成開始のための部位の役割をするように設計される鋳型の上の配列に「実質的に相補的である」ように選択することができる。「実質的に相補的である」は、標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズするためにプライマーが十分に相補的であることを意味する。一部の実施形態では、プライマーはそれがハイブリダイズするように設計されている鋳型とのミスマッチを含有しないが、これは必須でない。例えば、非相補的ヌクレオチド残基をプライマーの５’末端に付着させることができるが、プライマー配列の残りは鋳型に相補的である。あるいは、非相補的ヌクレオチド残基またはひと続きの非相補的ヌクレオチド残基をプライマーに散在させることができるが、ただし、プライマー配列が、それとハイブリダイズし、それによってプライマーの伸長生成物の合成のための鋳型を形成するために、鋳型の配列と十分な相補性を有する場合に限る。
【0206】
「プローブ」は、特異的配列または部分配列または別の分子の他の部分に結合する分子を指す。別途指示がない限り、用語「プローブ」は、相補的塩基対形成を通して、しばしば「標的ポリヌクレオチド」と呼ばれる別のポリヌクレオチドに結合するポリヌクレオチドプローブを一般的に指す。プローブは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーによっては、プローブとの完全な配列相補性を欠いている標的ポリヌクレオチドに結合することができる。プローブは、直接または間接的に標識化することができる。
【0207】
本明細書において、用語「敗血症」は、臨床医学におけるその通常の意味に従って使用され、例えば、細菌感染症などの全身性および／または血液媒介性の感染症を含む。
【0208】
用語「敗血症関連細菌」は、対象において敗血症を引き起こすことができると同定されたか、または敗血症の対象の血液において同定された細菌を指す。したがって、「哺乳動物（例えば、ヒト）敗血症関連細菌」は、哺乳動物（例えば、ヒト）対象において敗血症を引き起こすことができると同定されたか、または敗血症の哺乳動物（例えば、ヒト）対象の血液において同定された細菌を指す。哺乳動物（例えば、ヒト）敗血症関連細菌の例には、Acinetobacter baumannii、Actinobacillus hominis、Actinomyces massiliensis、Aeromonas hydrophila、Bacillus anthracis、Bacteroides fragilis、Brucella abortus、Burkholderia cepacia、Campylobacter coli、Campylobacter fetus、Campylobacter jejuni、Campylobacter lari、Cardiobacterium valvarum、Chlamydia trachomatis、Chlamydophila abortus、Chlamydophila pneumoniae、Citrobacter freundii、Clostridium difficile、Clostridium perfringens、Corynebacterium diphtheriae、Corynebacterium jeikeium、Corynebacterium urealyticum、Dermatophilus congolensis、Edwardsiella tarda、Enterobacter aerogenes、Enterobacter cloacae、Enterococcus faecalis、Enterococcus faecium、Erysipelothrix rhusiopathiae、Escherichia coli、Eubacterium desmolans、Flavobacterium ceti、Haemophilus ducreyi、Haemophilus influenzae、Haemophilus parahaemolyticus、Haemophilus parainfluenzae、Helicobacter cinaedi、Helicobacter pylori、Klebsiella oxytoca、Klebsiella pneumonia、Lactobacillus intestinalis、Legionella pneumophila、Leptospira interrogans、Listeria monocytogenes、Micrococcus luteus、Mobiluncus curtisii、Moraxella catarrhalis、Morganella morganii、Mycobacterium tuberculosis、Neisseria gonorrhoeae、Neisseria meningitidis、Nocardia asteroids、Nocardia brasiliensis、Pasteurella multocida、Peptostreptococcus stomatis、Porphyromonas gingivalis、Prevotella buccae、Prevotella intermedia、Prevotella melaninogenica、Proteus mirabilis、Providencia alcalifaciens、Pseudomonas aeruginosa、Rhodococcus equi、Salmonella enterica、Serratia marcescens、Shigella dysenteriae、Shigella sonnei、Staphylococcus aureus、Staphylococcus epidermidis、Staphylococcus haemolyticus、Staphylococcus hominis、Staphylococcus saprophyticus、Stenotrophomonas maltophila、Streptococcus agalactiae、Streptococcus anginosus、Streptococcus bovis、Streptococcus constellatus、Streptococcus dysgalactiae、Streptococcus intermedins、Streptococcus mitis、Streptococcus mutans、Streptococcus oralis、Streptococcus pneumoniae、Streptococcus pyogenes、Streptococcus sanguinis、Streptococcus sobrinus、Streptomyces anulatus、Streptomyces somaliensis、Veillonella atypica、Veillonella denticariosi、Veillonella dispar、Veillonella parvula、Veillonella rogosae、Vibrio cholerae、Yersinia enterocoliticaおよびYersinia pestisが含まれる。
【0209】
本明細書で用いるように、「敗血症」は、推定されたかまたは確認された感染過程を有するＳＩＲＳであると規定される。感染過程の確認は、感染因子の微生物学的な培養または単離を使用して判定することができる。免疫学的観点から、敗血症は微生物または全身感染への全身性応答であると見ることができる。
【0210】
本明細書で用いるように、「全身炎症性応答症候群（ＳＩＲＳ）」は、以下の測定可能な臨床特性の２つ以上を有する非特異的傷害から生じる臨床応答を指す；３８度を超えるかもしくは３６度未満の体温、毎分９０を超える心拍数、毎分２０を超える呼吸数、１ｍｍ３につき１２，０００を超えるかもしくは１ｍｍ３につき４，０００未満の白血球数（全白血球）、または１０％を超えるバンド好中球百分率。免疫学的観点から、それは、傷害（例えば、大手術）または全身性炎症への全身性応答を表すものと見ることができる。したがって、本明細書で用いるように、「感染陰性ＳＩＲＳ（ｉｎＳＩＲＳ）」は、上記の、しかし識別可能な感染過程の不在下での臨床応答を含む。
【0211】
本明細書で用いる用語「配列同一性」は、比較ウインドウにわたって配列がヌクレオチドベースまたはアミノ酸ベースで同一である程度を指す。したがって、「配列同一性百分率」は、比較ウインドウにわたって２つの最適に整列させた配列を比較し、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ）が両方の配列に存在する位置の数を決定してマッチした位置の数を与え、マッチした位置の数を比較ウインドウの中の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で割り、結果を１００倍にして配列同一性百分率（％配列同一性）を与えることによって計算される。
【0212】
本明細書で用いるように、用語一塩基多型（ＳＮＰ）は、ゲノム配列の中の単一のヌクレオチド（Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ）が変更される（例えば、置換、付加または欠失を通して）ときに起こる、ヌクレオチド配列変異を指す。ＳＮＰは、原核生物または真核生物の微生物のゲノムなどのゲノムのコード（遺伝子）および非コード領域の両方に存在することができる。
【0213】
本明細書で用いるように、用語「治療」、「治療する」などは、所望の薬理学的および／または生理的効果を得ることを指す。この効果は、感染、状態もしくはその症状を完全にもしくは部分的に予防する点から予防的であってもよく、ならびに／または、感染、状態および／またはその感染もしくは状態に起因する有害作用のための部分的もしくは完全な治癒の点で治療的であってもよい。本明細書で用いる「治療」は、哺乳動物（例えば、ヒト）における感染または状態のいかなる治療も包含し、（ａ）感染または状態を抑制すること、すなわちその発達を抑えること；および（ｂ）感染または状態を軽減すること、すなわち感染または状態の退行を引き起こすことを含む。
【0214】
２．本発明の多型
本発明は、細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の（したがって、１６Ｓ ｒＲＮＡ分子内の）ＳＮＰが、細菌の個々の種を同定するために、および／または属に基づいてまたはグラム陽性であるかもしくはグラム陰性であると細菌を分類するために使用することができるという判定に一部基づく。本発明は、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の（したがって、１８Ｓ ｒＲＮＡ分子内の）ＳＮＰが、酵母生物体または糸状菌を同定、部分的に同定または分類するために使用することができるという判定にも一部基づく。
本発明は、細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の（したがって、１６Ｓ ｒＲＮＡ分子内の）ＳＮＰが、細菌の個々の種を同定するために、および／または属に基づいてまたはグラム陽性であるかもしくはグラム陰性であると細菌を分類するために使用することができるという判定に一部基づく。本発明は、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の（したがって、１８Ｓ ｒＲＮＡ分子内の）ＳＮＰが、酵母生物体または糸状菌を同定、部分的に同定または分類するために使用することができるという判定にも一部基づく。
【0215】
２．１ １６Ｓ ｒＲＮＡの中のＳＮＰを用いた細菌の分類
本発明は、属に基づいて細菌種を分類するための方法、ならびに試料中の細菌のグラム状態を判定するための、すなわち、その細菌がグラム陽性またはグラム陰性であるか判定する方法を提供する。
本発明は、属に基づいて細菌種を分類するための方法、ならびに試料中の細菌のグラム状態を判定するための、すなわち、その細菌がグラム陽性またはグラム陰性であるか判定する方法を提供する。
【0216】
本明細書に実証されるように、配列番号１に示すE. coliの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３および６５３に対応する、１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする遺伝子（したがって、１６Ｓ ｒＲＮＡ分子自体）のヌクレオチド位置の多型は、哺乳動物（例えば、ヒト）病原体（血液培養によって単離される、最も一般的に見出される細菌種を含む（Karlowsky et al.2004））を特に含む、試料中の選択された細菌種のグラム状態を判定するために使用することができる。
【0217】
最も詳細には、および図１に示すように、本発明は、以下の中から選択される細菌種を分類するための方法を提供する：Acinetobacter calcoaceticus；Enterobacter aerogenes；Enterobacter cloacae；Enterococcus faecalis；Enterococcus faecium；Escherichia coli；Klebsiella pneumoniae；Proteus mirabilis；Pseudomonas aeruginosa；Serratia marcescens；Staphylococcus aureus；Staphylococcus epidermidis；Streptococcus agalactiae；Streptococcus pneumoniaeおよびStreptococcus pyogenes。
【0218】
例えば、上の段落に掲載される試料中の細菌の１つのグラム状態を判定するための方法は、試料からの核酸を、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３および６５３に対応する位置にある１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（または、１６Ｓ ｒＲＮＡもしくはそのＤＮＡコピー）の中のＳＮＰについて分析することを含み、ここで、２７３位のＡおよび６５３位のＴは、試料中のその細菌がグラム陽性であることを示す。
【0219】
試料中の上の前記細菌の１つのグラム状態を判定するための別の方法は、試料からの核酸を、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の４４０位にある１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（または、１６Ｓ ｒＲＮＡもしくはそのＤＮＡコピー）の中のＳＮＰについて分析することを含み、ここで、４４０位のＴは、試料中のその細菌がグラム陽性であることを示す。
【0220】
試料中の上の前記細菌の少なくとも１つを特定の属に属すると分類するための方法は、試料からの核酸を、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置４１２および６４７に対応する位置にある１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（または、１６Ｓ ｒＲＮＡもしくはそのＤＮＡコピー）の中のＳＮＰについて分析することを含み、ここで：４１２位のＴは、その細菌がStaphylococcus属に属することを示し；または、６４７位のＧは、その細菌がEnterococcus属に属することを示す。
【0221】
２．２ １６Ｓ ｒＲＮＡのＳＮＰを使用した細菌の同定ならびに１８Ｓ ｒＲＮＡを使用した酵母生物体および糸状菌の同定
本発明は、試料中の細菌を同定するための方法も提供する。
本発明は、試料中の細菌を同定するための方法も提供する。
【0222】
本明細書に実証されるように、配列番号１に示すE. coliの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７および６５３のいずれか１つに対応する、１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする遺伝子（したがって、１６Ｓ ｒＲＮＡ分子自体）のヌクレオチド位置の多型は、哺乳動物（例えば、ヒト）病原体（血液培養によって単離される、最も一般的に見出される細菌種を含む（Karlowsky et al.2004））を特に含む、試料中の細菌を同定するために使用することができる。
【0223】
一実施形態では、および図１に示すように、本発明は、以下の中から選択される細菌を同定するための方法を提供する：Acinetobacter calcoaceticus；Enterobacter aerogenes；Enterobacter cloacae；Enterococcus faecalis；Enterococcus faecium；Escherichia coli；Klebsiella pneumoniae；Proteus mirabilis；Pseudomonas aeruginosa；Serratia marcescens；Staphylococcus aureus；Staphylococcus epidermidis；Streptococcus agalactiae；Streptococcus pneumoniaeおよびStreptococcus pyogenes。
【0224】
上記のＳＮＰを使用して試料中の上記の細菌種を同定するための一般的な規則は、表１および／または表５に示す。
【0225】
上記の細菌から、試料からの核酸を、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の６５３位に対応する位置にある１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（または、１６Ｓ ｒＲＮＡもしくはそのＤＮＡコピー）の中のＳＮＰについて分析することによって、細菌Enterobacter cloacaeを試料の中で同定することができ、ここで、６５３位のＧは、その細菌がEnterobacter cloacaeであることを示す。
【0226】
上記の細菌から、試料からの核酸を、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置３７８および４８８に対応する位置にある１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（または、１６Ｓ ｒＲＮＡもしくはそのＤＮＡコピー）の中のＳＮＰについて分析することによって、Streptococcus agalactiae、Streptococcus pneumoniaeおよびStreptococcus pyogenes から選択される細菌を試料の中で同定することができ、ここで：３７８位のＡおよび４８８位のＴは、その細菌がStreptococcus pneumoniaeであることを示し；３７８位および４８８位のＡは、その細菌がStreptococcus agalactiaeであることを示し；３７８位のＧおよび４８８位のＡは、その細菌がStreptococcus pyogenesであることを示す。
【0227】
上記の細菌から、本方法は、試料からの核酸を、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７および６５３に対応する位置にある１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（または、１６Ｓ ｒＲＮＡもしくはそのＤＮＡコピー）の中のＳＮＰについて分析することによってAcinetobacter calcoaceticus；Enterobacter cloacae；Escherichia coli；Klebsiella pneumoniae；Proteus mirabilis；Pseudomonas aeruginosa；Streptococcus agalactiae；Streptococcus pneumoniaeおよびStreptococcus pyogenesから選択される細菌を試料の中で同定することができ、ここで：位置２７３、４４０および６４７のＡは、その細菌がAcinetobacter calcoaceticusであることを示し；６５３位のＧは、その細菌がEnterobacter cloacaeであることを示し；２７３位および６５３位のＴは、その細菌がE. coliであることを示し；２７３位のＴ、４８８位および６４７位のＣ、ならびに６５３位のＡは、その細菌がKlebsiella pneumoniaeであることを示し；４４０位および４８８位のＣ、ならびに６４７位のＴは、その細菌がProteus mirabilisであることを示し；４４０位のＡおよび６４７位のＴは、その細菌がPseudomonas aeruginosaであることを示し；位置３７８、４８８および６４７のＡは、その細菌がStreptococcus agalactiaeであることを示し；４８８位および６４７位のＴは、その細菌がStreptococcus pneumoniaeであることを示し；３７８位のＧならびに４８８位および６４７位のＡは、その細菌がStreptococcus pyogenesであることを示す。
【0228】
上記のものに加えて、本発明の方法は、試料中の以下の細菌の存在を同定するために使用することもできる：Staphylococcus aureus；S. epidermidis；Enterococcus faecalis；Enterococcus faecium；Serratia marcescensおよびEnterobacter aerogenes。本方法も、試料からの核酸を、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７および６５３のいずれか１つに対応する位置にある１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（または、１６Ｓ ｒＲＮＡもしくはそのＤＮＡコピー）の中のＳＮＰについて分析することを含み、ここで：４１２位のＴは、その試料が細菌Staphylococcus aureusおよび／またはS. epidermidisを含むことを示し；６４７位のＧは、その試料が細菌Enterococcus faecalisおよび／またはEnterococcus faeciumを含むことを示し；４４０位および６４７位のＣならびに４８８位のＴは、その試料が細菌Serratia marcescensおよび／またはEnterobacter aerogenesを含むことを示す。
【0229】
上記に加えて、本発明の方法は、試料中のStaphylococcus aureus；S. epidermidis；Enterococcus faecalis；Enterococcus faecium；Serratia marcescensおよびEnterobacter aerogenesの各々を同定するために使用することもできる。本方法は、試料からの核酸を高分解能融解分析によってさらに分析することを含む（下の３．８を参照する）。高分解能融解分析は、異なる細菌に由来するが同じＳＮＰ（複数可）を含有する核酸配列を、周囲のヌクレオチド塩基における変異に基づいてお互いと区別することを可能にする。
【0230】
別の実施形態では、本発明は、以下の中から選択される細菌を同定するための方法を提供する：Escherichia coli、Streptococcus pneumoniae、Streptococcus agalactiae、Streptococcus pyogenes、Proteus mirabilis、Enterobacter cloacae、Klebsiella pneumoniae、Pseudomonas aeruginosa、Acinetobacter calcoaceticus、Enterococcus faecalis、Listeria monocytogenes、Staphylococcus aureus、Clostridium perfringens、Corynebacterium jeikeium、Bacteroides fragilis、Neisseria meningitidis、Haemophilus influenzae、Serratia marcescens、Salmonella sp.およびStaphylococcus epidermidis。上記のＳＮＰを使用して試料中の上記の細菌種を同定するための一般的な規則は、表２に示す。
【0231】
同様に、本明細書に実証されるように、配列番号４３に示すBacillus anthracisの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置７４６、７６４、７７１または７８５（または、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置７３７、７５５、７６２または７７６）に対応する、１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする遺伝子（したがって、ｒＲＮＡ分子自体）のヌクレオチド位置の多型は、哺乳動物（例えば、ヒト）病原体（セキュリティセンシティブな生体作用物質として知られる病原体を含む）を特に含む、試料中の細菌を同定するために使用することができる。
【0232】
一実施形態では、以下の中から選択される細菌を同定するための方法が提供される：Bacillus anthracis、Clostridium botulinumＡ型、Clostridium botulinumＢ型、Clostridium botulinumＣ型、Clostridium botulinumＤ型、Clostridium botulinumＧ型、Yersinia pestis、Francisella tularensis、Vibrio choleraeおよびBurkholderia pseudomallei。
【0233】
上記のＳＮＰを使用して試料中の上記の細菌種を同定するための一般的な規則は、表３および／または表６に示す。
【0234】
上記の細菌から、試料からの核酸を、配列番号４３の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（または、１６Ｓ ｒＲＮＡもしくはそのＤＮＡコピー）の中のＳＮＰについて分析することによって、細菌Bacillus anthracisを試料の中で同定することができ、ここで、７４６位のＴ、７６４位のＡ、７７１位のＣおよび７８５位のＧは、その細菌がBacillus anthracisであることを示す。
【0235】
上記の細菌から、試料からの核酸を、配列番号４３の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子（または、１６ＳｒＲＮＡもしくはそのＤＮＡコピー）の中のＳＮＰについて分析することによって、Clostridium botulinumＡ型またはClostridium botulinumＢ型から選択される細菌を試料の中で同定することができ、ここで、７４６位のＴ、７６４位のＧ、７７１位のＣおよび７８５位のＴは、その細菌がClostridium botulinumＡ型またはClostridium botulinumＢ型であることを示す。
【0236】
上記の細菌から、試料からの核酸を、配列番号４３の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（または、１６Ｓ ｒＲＮＡもしくはそのＤＮＡコピー）の中のＳＮＰについて分析することによって、細菌Clostridium botulinumＣ型を試料の中で同定することができ、ここで、７４６位のＴ、７６４位のＡ、７７１位のＴおよび７８５位のＴは、その細菌がClostridium botulinumＣ型であることを示す。
【0237】
上記の細菌から、試料からの核酸を、配列番号４３の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（または、１６Ｓ ｒＲＮＡもしくはそのＤＮＡコピー）の中のＳＮＰについて分析することによって、細菌Clostridium botulinumＤ型を試料の中で同定することができ、ここで、７４６位のＣ、７６４位のＡ、７７１位のＴおよび７８５位のＴは、その細菌がClostridium botulinumＤ型であることを示す。
【0238】
上記の細菌から、試料からの核酸を、配列番号４３の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（または、１６Ｓ ｒＲＮＡもしくはそのＤＮＡコピー）の中のＳＮＰについて分析することによって、細菌Clostridium botulinumＧ型を試料の中で同定することができ、ここで、７４６位のＴ、７６４位のＧ、７７１位のＣおよび７８５位のＧは、その細菌がClostridium botulinumＧ型であることを示す。
【0239】
上記の細菌から、試料からの核酸を、配列番号４３の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（または、１６Ｓ ｒＲＮＡもしくはそのＤＮＡコピー）の中のＳＮＰについて分析することによって、細菌Yersinia pestisを試料の中で同定することができ、ここで、７４６位のＣ、７６４位のＧ、７７１位のＴおよび７８５位のＧは、その細菌がYersinia pestisであることを示す。
【0240】
上記の細菌から、試料からの核酸を、配列番号４３の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（または、１６Ｓ ｒＲＮＡもしくはそのＤＮＡコピー）の中のＳＮＰについて分析することによって、細菌Francisella tularensisを試料の中で同定することができ、ここで、７４６位のＴ、７６４位のＡ、７７１位のＧおよび７８５位のＧは、その細菌がFrancisella tularensisであることを示す。
【0241】
上記の細菌から、試料からの核酸を、配列番号４３の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（または、１６Ｓ ｒＲＮＡもしくはそのＤＮＡコピー）の中のＳＮＰについて分析することによって、細菌Vibrio choleraeを試料の中で同定することができ、ここで、７４６位のＣ、７６４位のＡ、７７１位のＴおよび７８５位のＧは、その細菌がVibrio choleraeであることを示す。
【0242】
上記の細菌から、試料からの核酸を、配列番号４３の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（または、１６Ｓ ｒＲＮＡもしくはそのＤＮＡコピー）の中のＳＮＰについて分析することによって、細菌Burkholderia pseudomalleiを試料の中で同定することができ、ここで、７４６位のＣ、７６４位のＧ、７７１位のＣおよび７８５位のＧは、その細菌がBurkholderia pseudomalleiであることを示す。
【0243】
上に加えて、本発明の方法は、試料中のBacillus anthracis、Clostridium botulinumＡ型、Clostridium botulinumＢ型、Clostridium botulinumＣ型、Clostridium botulinumＤ型、Clostridium botulinumＧ型、Yersinia pestis、Francisella tularensis、Vibrio choleraeおよびBurkholderia pseudomalleiの各々を同定するために使用することもできる。本方法は、試料からの核酸を高分解能融解分析によってさらに分析することを含む（下の３．８を参照する）。
【0244】
同様に、本明細書に実証されるように、配列番号３７に示すCandida albicansの１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置３４３、３７１、３８８、４１６および４６７に対応する、１８Ｓ ｒＲＮＡをコードする遺伝子（したがって、ｒＲＮＡ分子自体）のヌクレオチド位置の多型は、哺乳動物（例えば、ヒト）病原体を特に含む、試料中の細菌を同定するために使用することができる。
【0245】
一実施形態では、以下の中から選択される酵母生物体または糸状菌を同定するための方法が提供される：Candida albicans、Candida tropicalis、Candida parapsilosis、Candida glabrata、Fusarium spp.、Aspergillus fumigatusおよびCryptococcus neoformans。
【0246】
上記のＳＮＰを使用して試料中の上記の細菌種を同定するための一般的な規則は、表４および／または表７に示す。
【0247】
上記の酵母生物体または糸状菌から、試料からの核酸を、配列番号３７の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（または、１８Ｓ ｒＲＮＡもしくはそのＤＮＡコピー）の中のＳＮＰについて分析することによって、酵母生物体Candida albicansを試料の中で同定することができ、ここで、３４３位のＣ、３７１位のＡ、３８８位のＴ、４１６位のＧおよび４６７位のＧは、その酵母生物体がCandida albicansであることを示す。
【0248】
上記の酵母生物体または糸状菌から、試料からの核酸を、配列番号３７の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（または、１８Ｓ ｒＲＮＡもしくはそのＤＮＡコピー）の中のＳＮＰについて分析することによって、酵母生物体Candida tropicalisを試料の中で同定することができ、ここで、３４３位のＣ、３７１位のＡ、３８８位のＣ、４１６位のＧおよび４６７位のＣは、その酵母生物体がCandida tropicalisであることを示す。
【0249】
上記の酵母生物体または糸状菌から、試料からの核酸を、配列番号３７の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（または、１８Ｓ ｒＲＮＡもしくはそのＤＮＡコピー）の中のＳＮＰについて分析することによって、酵母生物体Candida parapsilosisを試料の中で同定することができ、ここで、３４３位のＣ、３７１位のＡ、３８８位のＣ、４１６位のＧおよび４６７位のＧは、その酵母生物体がCandida parapsilosisであることを示す。
【0250】
上記の酵母生物体または糸状菌から、試料からの核酸を、配列番号３７の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（または、１８Ｓ ｒＲＮＡもしくはそのＤＮＡコピー）の中のＳＮＰについて分析することによって、酵母生物体Candida glabrataを試料の中で同定することができ、ここで、３４３位のＴ、３７１位のＡ、３８８位のＣ、４１６位のＧおよび４６７位のＧは、その酵母生物体がCandida glabrataであることを示す。
【0251】
上記の酵母生物体または糸状菌から、試料からの核酸を、配列番号３７の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（または、１８Ｓ ｒＲＮＡもしくはそのＤＮＡコピー）の中のＳＮＰについて分析することによって、酵母生物体Cryptococcus neoformansを試料の中で同定することができ、ここで、３４３位のＣ、３７１位のＡ、３８８位のＴ、４１６位のＴおよび４６７位のＧは、その酵母生物体がCryptococcus neoformansであることを示す。
【0252】
上記の酵母生物体または糸状菌から、試料からの核酸を、配列番号３７の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（または、１８Ｓ ｒＲＮＡもしくはそのＤＮＡコピー）の中のＳＮＰについて分析することによって、糸状菌Fusarium spp.を試料の中で同定することができ、ここで、３４３位のＣ、３７１位のＣ、３８８位のＴ、４１６位のＴおよび４６７位のＧは、その糸状菌がFusarium spp.であることを示す。
【0253】
上記の酵母生物体または糸状菌から、試料からの核酸を、配列番号３７の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（または、１８Ｓ ｒＲＮＡもしくはそのＤＮＡコピー）の中のＳＮＰについて分析することによって、糸状菌Aspergillus fumigatusを試料の中で同定することができ、ここで、３４３位のＣ、３７１位のＣ、３８８位のＴ、４１６位のＣおよび４６７位のＧは、その糸状菌がAspergillus fumigatusであることを示す。
【0254】
上に加えて、本発明の方法は、試料中のCandida albicans、Candida tropicalis、Candida parapsilosis、Candida glabrata、Fusarium spp.、Aspergillus fumigatusおよびCryptococcus neoformansの各々を同定するために使用することもできる。本方法は、試料からの核酸を高分解能融解分析によってさらに分析することを含む（下の３．８を参照する）。
【0255】
３．本発明により細菌、酵母生物体および糸状菌を同定および／または分類するための特異的多型のためのスクリーニング
対象からの生体試料の単離、生体試料の処理、ゲノムＤＮＡの抽出、ＲＮＡの抽出、ＤＮＡの検出および特徴付け、ＲＮＡの検出および特徴付け、ＤＮＡの配列決定、ＤＮＡ配列の分析、ＳＮＰの遺伝子タイピング研究、ＲＮＡの位置決めおよび同定、ＲＮＡプロファイリングおよびＲＮＡスクリーニング、ＲＮＡの配列決定、ＲＮＡ配列の分析の工程／技術は、任意の適する方法で実行することができる。
対象からの生体試料の単離、生体試料の処理、ゲノムＤＮＡの抽出、ＲＮＡの抽出、ＤＮＡの検出および特徴付け、ＲＮＡの検出および特徴付け、ＤＮＡの配列決定、ＤＮＡ配列の分析、ＳＮＰの遺伝子タイピング研究、ＲＮＡの位置決めおよび同定、ＲＮＡプロファイリングおよびＲＮＡスクリーニング、ＲＮＡの配列決定、ＲＮＡ配列の分析の工程／技術は、任意の適する方法で実行することができる。
【0256】
試料中の細菌種を分類および／または同定するために、１つまたは複数のＳＮＰを検出するための当技術分野で公知である任意の方法を本明細書に記載される方法において使用することができる。特定の実施形態では、本方法は、別のものではなく１細菌種（または、酵母生物体もしくは糸状菌種）を絞り込むことか、または一部の場合には確認することを促進する。試料中の一塩基多型に対応する特定の位置でのヌクレオチドの存在を判定するために、多数の方法が当技術分野で公知である。多型の検出のための様々なツールには、限定されずに、ＤＮＡ配列決定、スキャン技術、ハイブリダイゼーションベースの技術、伸長ベースの分析、高分解能溶融分析、組込みベースの技術、制限酵素ベースの分析およびライゲーションベースの技術が含まれる。
【0257】
本発明による方法は、１６Ｓ ｒＲＮＡもしくは１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の、１６Ｓ ｒＲＮＡもしくは１８Ｓ ｒＲＮＡ分子内の、またはそのＤＮＡコピーの中の本明細書に記載される多型を、いずれの鎖についても同定することができる。一部の例では、多型を検出する方法は増幅の第１の工程を利用し、増幅は、１６Ｓ ｒＲＮＡもしくは１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子から、または１６Ｓ ｒＲＮＡもしくは１８Ｓ ｒＲＮＡ分子のＤＮＡコピーからであってよい。
【0258】
核酸は、対象からの生体試料から、または環境試料、例えば空気、土もしくは水試料、濾液、食物または製造品、または表面から、例えば医療器具もしくは作業場所表面からのスワップからであってよい。対象は、ヒト対象または非ヒト対象、例えば哺乳動物対象、例えば霊長類、畜産動物（例えば、ヒツジ、雌ウシ、ウマ、ロバ、ブタ）、臨床試験動物（例えば、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター）、コンパニオン動物（例えば、ネコ、イヌ）および狩猟野生動物（例えば、コアラ、クマ、野生のネコ、野生のイヌ、オオカミ、ディンゴ、キツネなど）であってよい。対象からの生体試料は、体液、例えば血液、唾液、喀痰、尿、脳脊髄液、糞便、細胞、組織または生検を非限定的に含む、対象の体の任意の部分からであってよい。他の例では、核酸は、培養細胞から得られる。
【0259】
本発明の方法によって分析される核酸は、試料の中にある間に分析することができるか、または、分析の前に先ず試料から抽出、例えば試料から単離してもよい。試料から核酸を単離するための任意の方法を本発明の方法において使用することができ、そのような方法は当業者に周知である。抽出された核酸は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ（ｍＲＮＡまたはｒＲＮＡを含む）を含むことができる。一部の例では、分析の前に逆転写のさらなる工程が方法に含まれてもよい。したがって、分析される核酸は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、１６Ｓ ｒＲＮＡ、１８Ｓ ｒＲＮＡ、１６Ｓ ｒＲＮＡもしくは１８Ｓ ｒＲＮＡのＤＮＡコピー、またはその任意の組合せを含むことができる。核酸は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、１６Ｓ ｒＲＮＡ、１８Ｓ ｒＲＮＡ、または１６Ｓ ｒＲＮＡもしくは１８Ｓ ｒＲＮＡのＤＮＡコピーの部分を含有することもでき、ＳＮＰについて分析される核酸位置を含有する部分を提供する。
【0260】
一部の場合には、本方法は、核酸の増幅を含む。このような場合には、適する核酸増幅技術は当業者に周知であり、例えばAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc. 1994-1998)に記載されるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、例えば米国特許第５，４２２，２５２号に記載される鎖置換増幅（ＳＤＡ）、例えばLiu et al. (1996)ならびに国際公開第９２／０１８１３号および国際公開第９７／１９１９３号に記載されるローリングサークル複製（ＲＣＲ）、例えばSooknanan et al., (1994), ligase chain reaction (LCR)に記載される核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、単一配列反復分析（ＳＳＲ）、分枝状ＤＮＡ増幅アッセイ（ｂ－ＤＮＡ）、転写増幅および自律的配列複製、ならびに、例えばTyagi et al. (1996)に記載されるＱ－βレプリカーゼ増幅を含む。
【0261】
そのような方法は、例えば１つまたは複数のＳＮＰを含有する標的ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズする増幅プライマー対を含む、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを利用することができる。本発明の方法の実施において有益なオリゴヌクレオチドプローブは、例えば、ＳＮＰの位置を含む標的ポリヌクレオチドの一部に相補的でありそれにまたがるオリゴヌクレオチドを含むことができ、多型部位（すなわち、ＳＮＰ）の特異的ヌクレオチドの存在は、プローブの選択的ハイブリダイゼーションの存在の有無によって検出される。そのような方法は、標的ポリヌクレオチドおよびハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドをエンドヌクレアーゼと接触させること、および多型部位のヌクレオチドの存在がプローブの対応するヌクレオチドに相補的であるかどうかによってプローブの切断生成物の存在の有無を検出することをさらに含むことができる。
【0262】
プライマーは、任意の便利な合成方法を使用して製造することができる。そのような方法の例は、「Protocols for Oligonucleotides and Analogues; Synthesis and Properties」、Methods in Molecular Biology Series, Volume 20, Ed. Sudhir Agrawal, Humana ISBN: 0-89603-247-7, 1993に見出すことができる。検出を促進するために、プライマーを標識化することもできる。
【0263】
ＳＮＰの検出のために有益な任意の方法を本発明において使用することができ、ＳＮＰ遺伝子タイピングのための多くの異なる方法が当技術分野で公知である（レビューについては、Syvanen, A. C. (2001)；Kim, S. and Misra, A., (2007)、を参照する）。そのような方法は、「反応」（例えば、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、伸長および切断）および続く「分離」（例えば、固相マイクロタイタープレート、微粒子またはアレイ、ゲル電気泳動、溶液相均一または半均一）を含む、連続した３工程の使用からなることができる。全ての適用のために理想的なＳＮＰ遺伝子タイピング方法は１つもなく、様々なパラメータ、例えば分析するＳＮＰの試料サイズおよび数を考慮して最も適当な方法を決定することは当業者の技術の範囲内である。
【0264】
臨床使用に特に役立ち、少数のＳＮＰへの照会に依存する例示的技術は、迅速、高感度（試料中の核酸の増幅を通して）、一段階、リアルタイム測定出力、多重化および自動化可能、比較的安価、ならびに正確であり、例には、限定されずに、ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ（５’ヌクレアーゼアッセイ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、高分解能融解分析、ＬＵＸ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＳｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プローブ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）などの分子ビーコンプローブ、および鋳型による（template directed）色素組込み（ＴＤＩ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）が含まれる。
【0265】
例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）は、対立遺伝子特異的プローブとのハイブリダイゼーション、均一溶液相および蛍光共鳴エネルギー転移の組合せを使用する。ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイは、核酸を増幅するためのフォワードおよびリバースプライマーならびにＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼと共に、ＳＮＰ部位（複数可）にわたって結合するように設計された標識プローブを分解するためのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５’－ヌクレアーゼ活性に依存する。反応、分離および検出は全て同時に実行し、反応の進行に従って結果をリアルタイムに読み取ることができる。そのようなアプローチは多数のＳＮＰを同時に分析することに役立たないが、それは、少数のＳＮＰを相応な費用で速やかに、高感度におよび正確に照会するのに特に適する。
【0266】
一部の方法が他より適することがあるが、試料中の細菌および／または複数の細菌を分類および／または同定するために、１つまたは複数のＳＮＰを検出するための当技術分野で公知の任意の方法を本明細書に記載される方法において使用することができる。そのような方法の非限定例は、下に記載される。
【0267】
３．１ 核酸配列決定技術
一部の実施形態では、多型は、核酸配列決定技術によって同定される。具体的には、ＳＮＰ遺伝子座にわたる増幅生成物は、伝統的な配列決定方法（例えば、「サンガー法」（Sanger, F., et al. (1975)としても知られる「ジデオキシ媒介連鎖終止反応法」、および「マクサム－ギルバート法」（Maxam, A. M., et al., 1977）としても知られる「化学的分解方法」）を使用して配列決定をすることができ、両参考文献は、ＳＮＰ遺伝子座でのヌクレオチドの存在を判定するために参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、多型は、核酸配列決定技術によって同定される。具体的には、ＳＮＰ遺伝子座にわたる増幅生成物は、伝統的な配列決定方法（例えば、「サンガー法」（Sanger, F., et al. (1975)としても知られる「ジデオキシ媒介連鎖終止反応法」、および「マクサム－ギルバート法」（Maxam, A. M., et al., 1977）としても知られる「化学的分解方法」）を使用して配列決定をすることができ、両参考文献は、ＳＮＰ遺伝子座でのヌクレオチドの存在を判定するために参照により本明細書に組み込まれる。
【0268】
Ｂｏｙｃｅ－Ｊａｃｉｎｏら、米国特許第６，２９４，３３６号は、ＳＮＰがポリヌクレオチド標的に選択的に結合する最も３’のヌクレオチドとなる部位でポリヌクレオチド標的に選択的に結合するプライマーを利用することによって、核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の配列を決定するための固相配列決定方法を提供する。変性高圧液体クロマトグラフィーまたは質量分析などの他の配列決定技術を用いることもできる。
【0269】
他の例示的な例では、配列決定方法は、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（商標）として知られる技術を含む。ＤＮＡ重合の間にデオキシヌクレオチドが組み込まれるときはいつでも、このアプローチはピロリン酸の生成に基づく。ピロリン酸の生成はルシフェラーゼ触媒反応に連動し、加えた特定のデオキシヌクレオチドが組み込まれるならば発光をもたらし、定量的で特徴のあるパイログラムを与える。試料処理は、ビオチン化プライマーによるＰＣＲ増幅、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズ（または、他の固相）の上のビオチン化一本鎖アンプリコンの単離、および配列決定プライマーのアニーリングを含む。試料はＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｅ（商標）によって次に分析され、それは、スルフリラーゼおよびルシフェラーゼ、ならびに組み込まれていない分子の分解のためのピラーゼを含む、指示反応のために必要とされるいくつかの酵素および基質を加える。試料は、４つのデオキシヌクレオチドの付加によって次に調べられる。発光は電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラで検出することができ、組み込まれたヌクレオチドの数に比例する。
結果は、パターン認識によって自動的に割り当てられる。
結果は、パターン認識によって自動的に割り当てられる。
【0270】
あるいは、「ミクロシークエンシング」方法を使用して、本発明の方法は核酸の中の多型部位でのヌクレオチドの存在を同定することができる。ミクロシークエンシング方法は、「所定」部位における単一のヌクレオチドだけの同一性を判定する。そのような方法は、標的ポリヌクレオチドにおける多型の存在および同一性の判定において特に有用である。そのようなミクロシークエンシング方法、ならびに多型部位におけるヌクレオチドの存在を判定するための他の方法は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，２９４，３３６号に議論されている。
【0271】
ミクロシークエンシング方法には、国際公開第９２／１５７１２号に開示される、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｂｉｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ（商標）方法が含まれる。ＤＮＡの中の多型部位を検査するためのさらなるプライマー誘導ヌクレオチド組込み手順も、記載されている（Komher, J.S., et al., 1989；Sokolov, B.P., 1990；Syvanen, A.C., et al., 1990；Kuppuswamy, M.N., et al., 1991；Prezant, T.R., et al. 1992；Ugozzoli, L., et al., 1992；Nyren, P., et al. 1993；および国際公開第８９／１０４１４号）。これらの方法は、多型部位の塩基を区別するために標識デオキシヌクレオチドの組込みに全て頼るという点で、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｂｉｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ（商標）と異なる。そのようなフォーマットでは、シグナルが組み込まれるデオキシヌクレオチドの数に比例するので、同じヌクレオチドのランに存在する多型はランの長さに比例するシグナルをもたらすことができる（Syvanen, A.C., et al. 1993）。
【0272】
さらなるミクロシークエンシング方法が米国特許第４，６５６，１２７号および仏国特許第２，６５０，８４０号（国際公開第９１／０２０８７号）によって提供され、それらは、多型部位のヌクレオチドの同一性を判定するための溶液ベースの方法を含む。米国特許の方法におけるように、すなわち多型部位の直ぐ３’側の対立遺伝子配列に相補的であるプライマーが用いられる。
【0273】
他の例示的な例では、米国特許第５，００２，８６７号は、オリゴヌクレオチドプローブの複数の混合物とのハイブリダイゼーションを通して核酸配列を判定するための方法を例えば記載する。そのような方法により、標的ポリヌクレオチドの配列は、１つの位置に不変のヌクレオチドを、および他の位置に変異ヌクレオチドを有するプローブのセットと標的が逐次的にハイブリダイズすることを可能にすることによって判定される。本方法は、標的をプローブのセットとハイブリダイズさせ、次にセットの少なくとも１つのメンバーが標的にハイブリダイズすることが可能である部位の数（すなわち、一致の数）を判定することによって、標的のヌクレオチド配列を判定する。この手順は、一般的にプローブのセットの各メンバーが試験されるまで繰り返される。
【0274】
あるいは、蛍光偏光法検出（ＦＰ－ＴＤＩ）アッセイ（Chen et al. 1999）による鋳型による（template-directed）色素－ターミネーター組込みアッセイは、ミニシークエンシングまたは一塩基伸長アッセイとも呼ばれるプライマー伸長アッセイのバージョンである（Syvanen, A.C., et al., 1990）。プライマー伸長アッセイは、ＳＮＰを検出することが可能である。ＤＮＡ配列決定プロトコールは、多型部位から直ぐ上流の標的ＤＮＡにアニールされるＳＮＰ特異的配列決定プライマーの直ぐ３’側の１塩基の性質を確認する。ＤＮＡポリメラーゼおよび適当なジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）の存在下で、多型部位の標的ＤＮＡ配列によって決定づけられる通り、プライマーは特異的に１塩基伸長する。どのｄｄＮＴＰが組み込まれるか判定することによって、標的ＤＮＡに存在する対立遺伝子（複数可）を推測することができる。
【0275】
３．２ 多型ハイブリダイゼーションに基づく技術
ヌクレオチド配列の中の多型を検出するハイブリダイゼーション技術には、限定されずに、ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ドットブロット、逆ドットブロット、多重対立遺伝子特異的診断アッセイ（ＭＡＳＤＡ）、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ）（Jobs et al. 2003）、分子ビーコンおよびサザンブロットを含めることができる。
ヌクレオチド配列の中の多型を検出するハイブリダイゼーション技術には、限定されずに、ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ドットブロット、逆ドットブロット、多重対立遺伝子特異的診断アッセイ（ＭＡＳＤＡ）、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ）（Jobs et al. 2003）、分子ビーコンおよびサザンブロットを含めることができる。
【0276】
ヌクレオチド配列の中のＳＮＰを同定するためのＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ（５’ヌクレアーゼアッセイまたは５’消化アッセイとしても知られる）は、標的ＤＮＡにハイブリダイズしているオリゴヌクレオチドプローブを置換および切断して蛍光シグナルを生成する、Ｔａｑポリメラーゼのヌクレアーゼ活性に基づく。特定のＳＮＰに特異的であるＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブが必要とされ、各プローブは、５’末端に付着している異なる蛍光色素および３’末端に付着しているクエンチャーを有する。プローブが無傷であるとき、クエンチャーは蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）によって蛍光団と相互作用し、それらの蛍光をクエンチングする。ＰＣＴアニール工程の間、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは標的ＤＮＡにハイブリダイズする。伸長工程では、蛍光色素はＴａｑポリメラーゼのヌクレアーゼ活性によって切断され、レポーター色素による蛍光の増加につながる。ミスマッチプローブは、断片化なしで置換される。２つの異なる色素のシグナル強度を測定することによって、試料の遺伝子型が判定される。
【0277】
別の有益なＳＮＰ同定方法にはＤＡＳＨ（動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション）が含まれ、それは、多型を同定するために反応温度を着実に増加させるときの（ＰＣＲ生成物）ハイブリダイゼーションを標的にするためのプローブ（オリゴヌクレオチド）の動的追跡を包含する（Prince, J.A., et al. 2001）。
【0278】
一部の実施形態では、多数の試料（＞５００）の分析のために、多重対立遺伝子特異的診断アッセイ（ＭＡＳＤＡ）を使用することができる。ＭＡＳＤＡでは、ＤＮＡ配列を識別するために、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを利用する。多重ＤＮＡ試料を固体支持体の上に固定化し、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブのプールで単一のハイブリダイゼーションを実行する。所与の試料に存在する特異的多型に相補的であるいかなるプローブも、標的ＤＮＡによってプールから事実上親和性精製される。結合したＡＳＯ（複数可）の化学的または酵素的配列決定によって生成される、配列特異的バンドパターン（フィンガープリント）は、特異的突然変異（複数可）を容易に同定する。
【0279】
とりわけ分子ビーコンおよびＳｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プローブを含む、いくつかの代替のハイブリダイゼーションベースの技術がある（Tyagi, S. and Kramer, F.R. 1996；Thelwell et al., 2000）。分子ビーコンは、それらの５’および３’末端に蛍光性レポーターおよびクエンチャー色素を有するオリゴヌクレオチドで構成される。オリゴヌクレオチドの中心部分は標的配列にわたってハイブリダイズするが、５’および３’隣接領域はお互いに相補的である。それらの標的配列にハイブリダイズしていないとき、５’および３’隣接領域はハイブリダイズしてステムループ構造を形成し、レポーターおよびクエンチャー色素の近接性のために蛍光はほとんどない。しかし、それらの標的配列へのハイブリダイゼーションの後には、色素は分離して蛍光の大きな増加がある。ミスマッチのプローブ－標的ハイブリッドは、正確に相補的なハイブリッドより実質的に低い温度で解離する。「ビーコン」アプローチには、いくつかの変異形がある。Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プローブは類似しているが、プローブの一部としてＰＣＲプライマー配列を組み込む。より近年の「二重鎖」フォーマットも、開発されている。
【0280】
一部の実施形態では、ＳＮＰを同定するさらなる方法は、ＳＮＰ－ＩＴ（商標）方法（Ｏｒｃｈｉｄ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）を含む。一般に、ＳＮＰ－ＩＴ（商標）は、３工程のプライマー伸長反応である。第１の工程では、標的ポリヌクレオチドは捕捉プライマーとのハイブリダイゼーションによって試料から単離され、それは第１レベルの特異性を提供する。第２の工程では、捕捉プライマーは標的ＳＮＰ部位で終止ヌクレオチド三リン酸から伸長し、それは第２レベルの特異性を提供する。第３の工程では、伸長したヌクレオチド三リン酸は、以下を含む様々な公知のフォーマットを使用して検出することができる：直接蛍光、間接蛍光、間接比色アッセイ、質量分析、蛍光偏光法等。反応は、ＳＮＰｓｔｒｅａｍ（商標）機器（Ｏｒｃｈｉｄ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）を使用した自動化フォーマットの３８４ウェルフォーマットにおいて処理することができる。
【0281】
これらの実施形態では、増幅生成物は、放射性プローブの有る無しでサザンブロット分析によって検出することができる。そのような方法では、例えば、多型遺伝子座の非常に低いレベルの核酸配列を含有するＤＮＡの小さい試料が増幅され、サザンブロット技術により、または同様にドットブロット分析により分析される。非放射性プローブまたは標識の使用は、増幅された高レベルのシグナルで促進される。あるいは、増幅された生成物を検出するのに使用されるプローブは、例えば放射性同位体、蛍光性化合物、生物発光化合物、化学発光性化合物、金属キレータまたは酵素により直接的にまたは間接的に検出可能的に標識化することができる。
【0282】
ヌクレオチド配列をスクリーニングするために、ハイブリダイゼーション条件、例えば塩濃度および温度を調整することもできる。サザンブロットおよびハイブリダイゼーションプロトコールは、Current Protocols in Molecular Biology（Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience）、pages 2.9.1-2.9.10に記載される。プローブは、ランダムオリゴマーおよびＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片とのハイブリダイゼーションのために標識化することができる。製造業者のプロトコールに従ってＲｅａｄｙ－Ｔｏ－Ｇｏ ＤＮＡ標識化ビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）などの市販キットを使用して、非常に高い特異性活性のプローブを得ることができる。高い反復配列含有量を有する可能な競合プローブ、ならびにハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシーは、使用する各プローブのために個々に決定される。あるいは、候補配列の断片はＰＣＲによって生成することができ、特異性は、齧歯動物－ヒト体細胞ハイブリッドパネルを使用し、断片をサブクローニングして検証することができる。これは、配列決定およびプローブとしての使用のための大きなプレップを可能にする。所与の遺伝子断片が特徴付けられると、ＰＣＲ生成物のゲルまたはカラム精製によって、小さいプローブ調製物を達成することができる。
【0283】
ドットブロット、逆ドットブロット、多重およびＭＡＳＤＡフォーマットにおいて使用できる適した材料は、当技術分野で周知であり、例には、ナイロンおよびニトロセルロース膜が限定されずに含まれる。
【0284】
３．３ 多型スキャン技術
ヌクレオチド配列の中の多型を検出するための本発明によって企図されるスキャン技術には、限定されずに、化学的ミスマッチ切断（ＣＭＣ）（Saleeba, J. A et al., 1992）、ミスマッチ修復酵素切断（ＭＲＥＣ）（Lu, A.L. and Hsu, I.C, 1992）、化学的切断技術、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）（Wartell et al., 1990；Sheffield et al., 1989）、温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）（Salimullah, et al. 2005）、恒常変性剤ゲル電気泳動（ＣＤＧＥ）、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析（Kumar, D. et al., 2006）、ヘテロ二本鎖分析（ＨＡ）（Nagamine, C.M., et al., 1989）、マイクロサテライトマーカー分析および一本鎖多型アッセイ（ＳＳＰＡ）含めることができる。
ヌクレオチド配列の中の多型を検出するための本発明によって企図されるスキャン技術には、限定されずに、化学的ミスマッチ切断（ＣＭＣ）（Saleeba, J. A et al., 1992）、ミスマッチ修復酵素切断（ＭＲＥＣ）（Lu, A.L. and Hsu, I.C, 1992）、化学的切断技術、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）（Wartell et al., 1990；Sheffield et al., 1989）、温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）（Salimullah, et al. 2005）、恒常変性剤ゲル電気泳動（ＣＤＧＥ）、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析（Kumar, D. et al., 2006）、ヘテロ二本鎖分析（ＨＡ）（Nagamine, C.M., et al., 1989）、マイクロサテライトマーカー分析および一本鎖多型アッセイ（ＳＳＰＡ）含めることができる。
【0285】
一部の実施形態では、本発明のＳＮＰはＣＭＣを通して検出され、ここで、放射標識化されたＤＮＡ野生型配列（すなわち、プローブ）は、推定上の変更を含有する増幅された配列にハイブリダイズしてヘテロ二本鎖を形成する。ヘテロ二本鎖の中のミスマッチバブルを取り除くために、化学的改変および続くピペリジン切断が使用される。変性ヘテロ二本鎖のゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーは、切断生成物の可視化を可能にする。ミスマッチのシトシンのために誤対合したチミジンおよびヒドロキシルアミンの改変のために、四酸化オスミウムを使用する。さらに、プローブＤＮＡのアンチセンス鎖の標識は、アデノシンおよびグアノシンミスマッチの検出を可能にする。ミスマッチの化学的切断は、長いＤＮＡ断片における突然変異のほぼ１００％を検出するのに使用することができる。さらに、この方法は、試験断片の中の突然変異の精密な特徴付けおよび正確な位置付けを提供する。最近、この方法は、多重化も可能にし、それによって操作の数を低減する蛍光性プライマーを使用することによって、ＣＭＣを自動化のためにより好適にするように改善された。あるいは、ＰＣＲによって組み込まれる蛍光標識ｄＵＴＰは、標的およびプローブＤＮＡ鎖の両方の内部標識を、したがって各可能なハイブリッドの標識を可能にし、突然変異検出の可能性を２倍にし、事実上１００％の検出を保証する。
【0286】
他の実施形態では、本発明のＳＮＰを同定するためにミスマッチ修復酵素切断（ＭＲＥＣ）アッセイが使用される。ＭＲＥＣは、ミスマッチ含有ＤＮＡに特異的であるニッキング酵素系に依存する。目的の配列はＰＣＲによって増幅され、ホモおよびヘテロ二本鎖種は、増幅させた生成物を変性させ、再アニールさせることによってＰＣＲの末端に生成させることができる。これらのハイブリッドはミスマッチ修復酵素で処理され、次に変性ゲル電気泳動によって分析される。ＭＲＥＣアッセイは、３つのミスマッチ修復酵素を利用する。ＭｕｔＹエンドヌクレアーゼはミスマッチからアデニンを取り除き、Ａ／ＴおよびＣ／Ｇ塩基転換ならびにＧ／ＣおよびＴ／Ａ塩基転位の両方を検出するのに有益である。哺乳動物のチミングリコシラーゼはＴ／Ｇ、Ｔ／ＣおよびＴ／Ｔミスマッチからチミンを取り除き、Ｇ／ＣおよびＡ／Ｔ塩基転位ならびにＡ／ＴおよびＧ／ＣおよびＴ／ＡおよびＡ／Ｔ塩基転換を検出するのに有益である。ヒトまたは子ウシ胸腺からの全タイプのエンドヌクレアーゼまたはトポイソメラーゼＩは、全８つのミスマッチを認識することができ、任意のヌクレオチド置換を調べるために使用することができる。ＭＲＥＣは、両方のＤＮＡ鎖に組み込むことができる特異的標識を使用することができ、したがって、所与の部位における全ての４つの可能なヌクレオチド置換の同定を可能にする。
【0287】
一部の実施形態では、ヌクレオチド配列の中のＳＮＰを同定するために、米国特許第５，２１７，８６３号に記載される化学的切断分析が使用される。ヘテロ二本鎖分析と同様に、化学的切断は、ミスマッチ対立遺伝子配列がお互いにハイブリダイズするときにもたらされる、異なる特性を検出する。ゲルの上での変更された遊走速度としてこの差を検出する代わりに、この差は、例えばヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムを、その後ピペリジンを使用して、化学的切断へのハイブリッドの感受性の変化において検出される。
【0288】
本発明によって企図される切断方法の中で、ＲＮアーゼＡは、ヘテロ二本鎖ミスマッチ分析の原理に依存する。ＲＮアーゼ切断方法では、ＰＣＲ増幅によって得られる、放射標識化されたリボプローブとＤＮＡ間のＲＮＡ－ＤＮＡヘテロ二本鎖は、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドにおけるミスマッチの場所で一本鎖ＲＮＡを切断するＲＮアーゼＡの能力を活用することによって、ＲＮアーゼＡによって酵素的に切断される。これの後に、電気泳動およびオートラジオグラフィーが続く。突然変異の存在および位置は、所与のサイズの切断生成物によって示される（Meyers, R.M., et al., 1985；Gibbs, R.A. and Caskey, T., 1987）。
【0289】
酵素的または化学的切断を通して、ミスマッチを検出するのにＤＮＡプローブを使用することもできる；Cotton, et al., 1988；Shenk et al., 1975およびNovack et al., 1986を参照する。
【0290】
一部の実施形態では、本発明の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の多型について調べるために、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）アッセイ（Ｔｈｉｒｄ Ｗａｖｅ（商標）技術）を用いることができる。例えば、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）アッセイは、２つの重複するオリゴヌクレオチドが標的ＤＮＡに完全にハイブリダイズするときに形成される三次元構造の認識、およびＦｌａｐエンドヌクレアーゼによる切断の特異性に基づく（Lyamichev, V. et al., 1999）。
【0291】
あるいは、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）は、配列変異体を分離および同定する有益な技術である。ＤＧＧＥは恒常濃度ポリアクリルアミドゲルスラブにおいて一般的に実行され、線形に増加する量の変性剤（通常、ホルムアミドおよび尿素、カソードからアノードへ）の存在下でキャストされる。ＤＧＧＥの変異体は、遊走経路に沿って温度勾配を用い、ＴＧＧＥとして知られる。ＤＧＧＥまたはＴＧＧＥによる分離は、部分的に融解したＤＮＡ分子のゲル内の電気泳動移動度が未融解分子と比較して大いに低減されるという事実に基づく。
【0292】
一部の実施形態では、Smith-Sorenson et al., 1993に詳細に記載の通りに、恒常変性ゲル電気泳動（ＣＤＧＥ）は、ヌクレオチド配列の中のＳＮＰを検出するのに有益である。所与のＤＮＡ二重鎖は、恒常変性剤のゲルの中で所定の特徴的方法で融解する。突然変異は、この動きを変更する。特異的突然変異を決定するために、異常遊走断片は単離され、配列決定される。
【0293】
他の実施形態では、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析は、本発明のＳＮＰを検出するための方法を提供する。ＳＳＣＰは、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分離した一本鎖ＤＮＡ分子の移動度の変化に基づく方法である。電気泳動移動度は分子のサイズおよび形状の両方に依存し、一本鎖ＤＮＡ分子はそれ自身を折り畳んで二次構造体を生成し、それは、配列依存的に分子内相互作用によって決定される。単一ヌクレオチド置換は二次構造体を、およびその結果として、一本鎖の電気泳動移動度を変更することができ、オートラジオグラフの上でバンドシフトをもたらす。一本鎖の高次構造を変更する所与のヌクレオチド変異の能力は、十分な理論モデルに基づいて予測可能でなく、ループにまたは二次構造体の長い安定したステムに起こる塩基変化は、ＳＳＣＰによって検出することができないかもしれない。標準のＳＳＣＰは、１５０～２００ｂｐの断片における配列変更の検出において最大信頼度に到達する。放射能ベースのＳＳＣＰ分析のそれと等しい感度での突然変異の検出を可能にする、より高度なプロトコールが開発されている。これらの方法はＰＣＲにおいて蛍光標識プライマーを使用し、蛍光ベースの自動化配列決定機器によって生成物を分析する。多色蛍光ＳＳＣＰはあらゆるレーンに内部標準を含ませることも可能にし、それは、各レーンからのデータを互いに対して比較するために使用することができる。検出率を増加させる他の変異体には、ジデオキシフィンガープリント法（ｄｄＦ）および制限エンドヌクレアーゼフィンガープリント法（ＲＥＦ）に基づくジデオキシ配列決定アプローチが含まれる。
【0294】
ｄｄＦ方法はＳＳＣＰおよびサンガージデオキシ配列決定法の組合せであり、それは１つのジデオキシヌクレオチドによるサンガー配列決定反応の非変性ゲル電気泳動を含む。この方法では、例えば、ＳＮＰを同定するために２５０ｂｐの断片をスクリーニングすることができる。ＲＥＦは、１ｋｂを超える断片のスクリーニングを可能にする、ＳＳＣＰのより複雑な改変である。ＲＥＦのために、標的配列はＰＣＲで増幅され、５～６つの異なる制限エンドヌクレアーゼで独立して消化され、非変性ゲルの上でＳＳＣＰによって分析される。６つの制限酵素が使用される場合、配列の変異が６つの異なる制限断片に存在し、このように１２個の異なる一本鎖セグメントを生成する。これらの断片のいずれか１つにおける移動度シフトは、本発明のＳＮＰの存在を正確に指摘するのに十分である。得られる制限パターンは、調査領域中の変更の位置確認を可能にする。
【0295】
一部の実施形態では、ヘテロ二本鎖分析（ＨＡ）は、ＰＣＲ生成物またはヌクレオチド配列における一塩基置換を検出する。ＨＡは、放射性同位体も専門装置もなしで迅速に実行することができる。ＨＡ方法は、ＰＣＲ生成物の加熱および再変性による、１つまたは複数の位置に異なるヌクレオチドを有する配列の間でのヘテロ二本鎖の形成を利用する。ミスマッチ塩基を囲んでいるより開放的な二本鎖構成のために、ヘテロ二本鎖はそれらの対応するホモ二本鎖よりゆっくり移動し、続いて、低減した移動度のバンドとして検出される。ＨＡ方法によって検出される特定の一塩基置換の能力は、ミスマッチ塩基を知ることだけによって予測することはできないが、その理由は、隣接したヌクレオチドがミスマッチ領域の構成に実質的な影響を及ぼし、長さに基づく分離はヌクレオチド置換を明らかに見落とすからである。使用するアクリルアミドの温度、ゲル架橋および濃度の最適化、ならびにグリセロールおよびスクロースは、突然変異した試料の分解能を強化する。ＨＡ方法は放射性同位体も専門装置もなしで迅速に実行することができ、配列決定をした遺伝子の中の既知の突然変異および多型について多数の試料をスクリーニングする。ＨＡがＳＳＣＰと併用されるとき、ＤＮＡ断片の中の全ての変更の最高１００％を容易に検出することができる。
【0296】
一部の実施形態では、ヌクレオチドミスマッチを認識するタンパク質、例えばE. coliのｍｕｔＳタンパク質の使用は、本発明の１６Ｓ ｒＲＮＡの中の多型を検出するのに用いることができる（Modrich 1991）。ｍｕｔＳアッセイでは、タンパク質は、２つの配列の間のヘテロ二本鎖におけるヌクレオチドミスマッチを含有する配列だけに結合する。
【0297】
さらなる実施形態では、多型検出は、マイクロサテライトマーカー分析を用いて実行することができる。例えば約１０センチモルガン（ｃＭ）の平均ゲノム間隔を有するマイクロサテライトマーカーは、当技術分野で公知の標準のＤＮＡ単離方法を使用して用いることができる。
【0298】
上記のＳＳＰＡ分析および近い関係のあるヘテロ二本鎖分析方法は、一塩基多型についてのスクリーニングのために使用することができる（Orita, M. et al., 1989）。
【0299】
３．４ 多型分析のためのヌクレオチドアレイおよび遺伝子チップ
本発明は、多型位置に隣接している配列を含むオリゴヌクレオチド、例えば、少なくとも１２ｎｔ、少なくとも約１５ｎｔ、少なくとも約１８ｎｔ、少なくとも約２０ｎｔまたは少なくとも約２５ｎｔの、またはそれより長いオリゴヌクレオチドのアレイの使用を通してＳＮＰを同定する方法をさらに企図し、ここで、アレイの上の別個の位置は本発明のＳＮＰを含有する配列の１つまたは複数に相補的である。そのようなアレイは連続したオリゴヌクレオチドを含むことができ、それぞれは異なる多型に特異的にハイブリダイズすることができる。アレイの例については、Hacia et al., 1996およびDe Risi et al., 1996を参照する。
本発明は、多型位置に隣接している配列を含むオリゴヌクレオチド、例えば、少なくとも１２ｎｔ、少なくとも約１５ｎｔ、少なくとも約１８ｎｔ、少なくとも約２０ｎｔまたは少なくとも約２５ｎｔの、またはそれより長いオリゴヌクレオチドのアレイの使用を通してＳＮＰを同定する方法をさらに企図し、ここで、アレイの上の別個の位置は本発明のＳＮＰを含有する配列の１つまたは複数に相補的である。そのようなアレイは連続したオリゴヌクレオチドを含むことができ、それぞれは異なる多型に特異的にハイブリダイズすることができる。アレイの例については、Hacia et al., 1996およびDe Risi et al., 1996を参照する。
【0300】
ヌクレオチドアレイは、必要に応じて、本発明の多型の全てかそのサブセットを含むことができる。１つまたは複数の多型形態が、アレイに存在してもよい。アレイの上のオリゴヌクレオチド配列は、長さが一般的に少なくとも約１２ｎｔ、少なくとも約１５ｎｔ、少なくとも約１８ｎｔ、少なくとも約２０ｎｔまたは少なくとも約２５ｎｔであるか、またはそれより長く、例えば１００～２００ｎｔの長さである。アレイの例については、Ramsay 1998；Hacia et al., 1996；Lockhart et al., 1996およびDe Risi et al., 1996を参照する。
【0301】
ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用するＤＮＡ試料のアレイなどの生体試料のマイクロアレイを作製するために、いくつかの方法が利用可能である。そのようなアレイの例は、ＰＣＴ出願国際公開第９５／３５５０５号；米国特許出願番号第５，４４５，９３４号；およびDrmanac et al., 1993において詳細に議論される。Yershov et al. 1996は、オリゴヌクレオチドアレイの代替の構築を記載する。オリゴヌクレオチドアレイの構築および使用は、Ramsay (1998)、によってレビューされる。
【0302】
ヌクレオチド配列の中の多型を同定するために高密度オリゴヌクレオチドアレイを使用する方法は、当技術分野で公知である。例えば、Milosavljevic et al., 1996は、短いオリゴマーへのハイブリダイゼーションによるＤＮＡ配列認識を記載する（Drmanac et al., 1998およびDrmanac and Drmanac, 1999も参照する）。未知の突然変異の同定のためのアレイの使用が、Ginot 1997によって提案される。
【0303】
既知の突然変異の検出は、Hacia et al. 1996；Cronin et al., 1996；および他に記載される。遺伝子マッピングにおけるアレイの使用は、Chee et al., 1996；Sapolsky and Lishutz, 1996およびShoemaker et al., 1996において議論される。
【0304】
相補性ＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子発現パターンの定量的モニタリングは、Schena et al., 1995およびDeRisi et al., 1997に記載される。Wodicka et al., 1997は、S. cerevisiaeにおいてゲノムワイド発現モニタリングを実行する。
【0305】
オリゴヌクレオチドの高密度マイクロアレイは当技術分野で公知であり、市販されている。アレイの上のオリゴヌクレオチド配列は、既知の標的配列に対応する。アレイに存在するオリゴヌクレオチドの長さは、ハイブリダイゼーションがミスマッチの存在にどの程度感受性であるかの重要な因子である。通常、オリゴヌクレオチドは長さが少なくとも約１２ｎｔ、より普通には長さが少なくとも約１５ｎｔ、好ましくは長さが少なくとも約２０ｎｔ、より好ましくは長さが少なくとも約２５ｎｔであり、長さは約３５ｎｔより長くなく、長さは通常約３０ｎｔ未満である。
【0306】
オリゴヌクレオチドの大きなアレイの生成方法は、光誘導合成技術を用いた米国特許第５，１３４，８５４号および米国特許第５，４４５，９３４号に記載される。コンピュータ制御のシステムを使用することによって、いくつかの反応部位での同時カップリングを通して、単量体の不均一なアレイがポリマーの不均一なアレイに変換される。あるいは、例えば国際公開第９５／３５５０５号に記載の通りに、マイクロアレイは前合成されたオリゴヌクレオチドの固体基材の上への沈着によって生成される。
【0307】
標識ゲノム試料のハイブリダイゼーションを検出するために、マイクロアレイを調べることができる。蛍光マークされた標的を装置で検出するための方法および装置は、当技術分野で公知である。一般的に、そのような検出装置は、顕微鏡および基材に光を誘導するための光源を含む。ｘ－ｙ移動ステージが基材の位置を変更する間、光子計数管は基材からの蛍光を検出する。対象方法において使用することができる共焦検出装置は、米国特許第５，６３１，７３４号に記載される。走査型レーザー顕微鏡は、Shalon et al. 1996に記載される。適当な励起系を用いたスキャンが、使用する各蛍光団のために実行される。スキャンから生成されるデジタル画像は、以降の分析のために次に合わされる。任意の特定のアレイ要素のために、１つの核酸試料からの蛍光シグナルの比が他の核酸試料からの蛍光シグナルと比較され、相対シグナル強度が判定される。
【0308】
蛍光検出によって採集されるデータを分析するための方法は、当技術分野で公知である。データ分析は、採集されるデータから基材位置に対応する蛍光強度を判定する工程、外れ値、すなわち所定の統計的分布からそれているデータを取り除く工程、および残りのデータから標的の相対的な結合親和性を計算する工程を含む。生じるデータは画像として提示することができ、各領域の強度は標的とプローブの間の結合親和性によって異なる。
【0309】
マイクロチップ技術を通した核酸分析も、本発明に適用可能である。この技術では、数千の別個のオリゴヌクレオチドプローブをシリコンチップの上のアレイに適用することができる。分析する核酸は蛍光標識化され、チップの上のプローブにハイブリダイズされる。これらの核酸マイクロチップを使用して核酸－タンパク相互作用を研究することも可能である。この技術を使用することによって、突然変異の存在を判定すること、分析する核酸を配列決定すること、または目的の遺伝子の発現レベルを測定することができる。本方法は、多くの、さらに数千のプローブの一度の並行処理の１つであり、分析の速度を非常に増加させることができる。
【0310】
ｍＲＮＡ転写の変更は、当業者に公知である任意の技術によって検出することができる。これらには、ノーザンブロット分析、ＰＣＲ増幅およびＲＮアーゼ保護が含まれる。減少したｍＲＮＡ転写は、配列の変更を示す。
【0311】
アレイ／チップ技術の適用は、既に多くのケースで成功している。
【0312】
例えば、突然変異のスクリーニングは、ＢＲＣＡ１遺伝子、S. cerevisiaeの突然変異体株、およびＨＩＶ－１ウイルスのプロテアーゼ遺伝子において行われている（Hacia et al., 1996；Shoemaker et al., 1996；Kozal et al., 1996）。ＳＮＰの検出で使用するための様々なフォーマットのチップを、カスタマイゼーションにより生成することができる。
【0313】
ＳＮＰの検出に有益であるアレイベースのタイリング戦略は、欧州特許第７８５２８０号に記載される。簡潔には、多数の特異的多型のために、一般的にアレイを「タイリングする」ことができる。「タイリング」は、目的の標的配列に相補的である配列、ならびにその配列の予め選択された変異、例えば、単量体、すなわちヌクレオチドの基本セットの１つまたは複数のメンバーによる１つまたは複数の所与の位置の置換で構成されるオリゴヌクレオチドプローブの規定のセットの合成を指す。タイリング戦略は、ＰＣＴ出願国際公開第９５／１１９９５号にさらに記載される。一部の実施形態では、いくつかの特異的ＳＮＰのためにアレイが「タイリング」される。詳細には、アレイはいくつかの検出ブロックを含むようにタイリングされ、各検出ブロックは特異的ＳＮＰまたはＳＮＰのセットに特異的である。例えば、検出ブロックは、特異的ＳＮＰを含む配列セグメントにわたるいくつかのプローブを含むようにタイリングすることができる。各対立遺伝子に相補的であるプローブを確保するために、プローブはＳＮＰ位置が異なる組で合成される。ＳＮＰ位置が異なるプローブに加えて、検出ブロックの中で一置換プローブも一般的にタイリングされる。そのような方法は、本明細書に開示されるＳＮＰ情報に容易に適用することができる。
【0314】
これらの一置換プローブは、残りのヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｇ、ＣおよびＵから選択される）で置換される、多型からのいずれかの方向のある特定の数の塩基におよびその数までの塩基を有する。一般的に、タイリングされた検出ブロックの中のプローブは、ＳＮＰから５塩基離れているものおよびそこまでの配列位置の置換を含む。人工的なクロスハイブリダイゼーションから実際のハイブリダイゼーションを区別するために、一置換プローブは、タイリングされたアレイのための内部対照を提供する。標的配列とのハイブリダイゼーションおよびアレイの洗浄の終了後に、標的配列がハイブリダイズするアレイの位置を判定するためにアレイが調べられる。調べたアレイからのハイブリダイゼーションデータは、ＳＮＰのどの対立遺伝子または複数の対立遺伝子が試料中に存在するか確認するために次に分析される。ハイブリダイゼーションおよびスキャンは、ＰＣＴ出願国際公開第９２／１００９２号および国際公開第９５／１１９９５号および米国特許第５，４２４，１８６号に記載の通りに実行することができる。
【0315】
したがって、一部の実施形態では、チップは、長さが約１５ヌクレオチドの断片の核酸配列のアレイおよびそれに相補的である配列またはその断片を含むことができ、断片は、少なくとも約８つの連続したヌクレオチド、好ましくは１０、１５、２０、より好ましくは２５、３０、４０、４７または５０の連続したヌクレオチドを含み、多型塩基を含有する。一部の実施形態では、多型塩基は、ポリヌクレオチドの中心から５、４、３、２または１ヌクレオチドの範囲内にあり、より好ましくはポリヌクレオチドの中心にある。他の実施形態では、チップは、本発明の任意の数のポリヌクレオチドを含有するアレイを含むことができる。
【0316】
ＰＣＴ出願国際公開第９５／２５１１１６号に記載の通りに、化学的カップリング手順およびインクジェット塗布装置を使用してオリゴヌクレオチドを基材の表面に合成することができる。別の態様では、真空システム、熱、ＵＶ、機械的または化学的結合手順を使用して、ｃＤＮＡ断片またはオリゴヌクレオチドを基材の表面に配置し、連結するために、ドット（または、スロット）ブロットに類似した「グリッド」アレイを使用することができる。上記のそれらなどのアレイは、手動で、または利用可能な装置（スロットブロットまたはドットブロット装置）、材料（任意の適する固体支持体）および機械（ロボット機器を含む）を使用して生成することができ、８、２４、９６、３８４、１５３６、６１４４またはそれより多くのオリゴヌクレオチド、または市販機器の効率的使用に役立つ任意の他の数を含有することができる。
【0317】
そのようなアレイを使用して、本発明は、試料中の本発明のＳＮＰを同定する方法を提供する。そのような方法は、試験試料を、本発明の少なくとも１つのＳＮＰ位置に対応する１つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブを含むアレイとインキュベートすること、および試験試料からの核酸の、オリゴヌクレオチドプローブの１つまたは複数への結合について検査することを含む。そのようなアッセイは、多くのＳＮＰ位置および／またはそれらのＳＮＰ位置の対立遺伝子変異体に対応するオリゴヌクレオチドプローブを含むアレイを一般的に含み、その少なくとも１つは本発明のＳＮＰである。
【0318】
核酸分子を試験試料とインキュベートする条件は、変化する。インキュベーション条件は、アッセイで用いるフォーマット、用いる検出方法、およびアッセイで使用する核酸分子のタイプおよび性質に依存する。当業者は、一般的に利用可能なハイブリダイゼーション、増幅またはアレイアッセイフォーマットのいずれか１つを、本明細書に開示される新規ＳＮＰを用いるように容易に適合させることができることを認める。そのようなアッセイの例は、Chard, T, An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands (1986)；Bullock, G. R. et al., Techniques in Immunocytochemistry, Academic Press, Orlando, Fla. Vol. 1 (I 982), Vol. 2 (1983), Vol. 3 (1985)；Tijssen, P., Practice and Theory of Enzyme Immunoassays: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands (1985)に見出すことができる。
【0319】
ＳＮＰを分析するために、多成分統合化システムを使用することもできる。そのようなシステムは、ＰＣＲおよび毛細管電気泳動反応などのプロセスを、単一の機能的装置に小型化および区画化する。そのような技術の例は米国特許第５，５８９，１３６号に開示され、それはチップにおけるＰＣＲ増幅および毛細管電気泳動の統合を記載する。
【0320】
統合化システムは、主にマイクロ流動力学的システムが使用されるときに想定することができる。これらのシステムは、マイクロチップの上に含まれるガラス、シリコン、石英またはプラスチックウエハーの上に設計されるマイクロチャネルのパターンを含む。可動部分なしの機能的顕微鏡的バルブおよびポンプを作製するために、試料の動きは、マイクロチップの異なる領域にわたって加えられる電気的、電気浸透圧的または流体静力学的力によって制御される。電圧を変えることによって微加工チャネルの間の交点で液流量を制御し、マイクロチップの異なる部分にわたってポンプ輸送するための液流速を変化させる。
【0321】
ＳＮＰの遺伝子タイピングのために、マイクロ流動力学的システムは、例えば、核酸増幅、ミニシークエンシングプライマー伸長、毛細管電気泳動およびレーザー誘起蛍光検出などの検出方法を統合することができる。
【0322】
第１の工程では、ＤＮＡ試料は好ましくはＰＣＲによって増幅される。次に、増幅生成物は、ｄｄＮＴＰ（各ｄｄＮＴＰのための特異的蛍光）および標的化多型塩基の直ぐ上流にハイブリダイズする適当なオリゴヌクレオチドミニシークエンシングプライマーを使用した、自動化されたミニシークエンシング反応に付される。３’末端の伸長が完了すると、毛細管電気泳動によってプライマーは組み込まれていない蛍光性ｄｄＮＴＰから分離される。毛細管電気泳動において使用される分離媒体は、例えば、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコールまたはデキストランであってよい。単一ヌクレオチドプライマー伸長生成物の中に組み込まれたｄｄＮＴＰは、レーザー誘起蛍光検出によって同定される。このマイクロチップは、少なくとも９６～３８４個の試料またはそれより多くを並行して処理するために使用することができる。
【0323】
３．５ 多型の検出のための伸長ベースの技術
ヌクレオチド配列の中の多型を検出するための伸長ベースの技術には、欧州特許出願公開番号第０３３２４３５号およびNewton et al., 1989に開示される、増幅抵抗性突然変異システム（ＡＲＭＳ）としても知られる対立遺伝子特異的増幅、ならびにGibbs et al. 1989によって企図される多型のクローニング（ＣＯＰＳ）を限定されずに含めることができる。
ヌクレオチド配列の中の多型を検出するための伸長ベースの技術には、欧州特許出願公開番号第０３３２４３５号およびNewton et al., 1989に開示される、増幅抵抗性突然変異システム（ＡＲＭＳ）としても知られる対立遺伝子特異的増幅、ならびにGibbs et al. 1989によって企図される多型のクローニング（ＣＯＰＳ）を限定されずに含めることができる。
【0324】
伸長ベースの技術（ＡＲＭＳ）は、遺伝子タイピングのために対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）ＰＣＲプライマーを使用する。このアプローチでは、ＰＣＲのために使用する２つのオリゴヌクレオチドプライマーの１つは、多型部位に、最も一般的にはその部位を標的にするプライマーの３’末端に結合するように設計される。注意深く制御された条件（アニーリング温度、マグネシウム濃度等）の下では、ＰＣＲプライマーの３’末端のヌクレオチドが多型部位の塩基に相補的であり、ミスマッチが増幅に「抵抗性」である場合にだけ増幅は起こる。
【0325】
突然変異誘発分離ＰＣＲ（ＭＳ－ＰＣＲ）と命名されたＡＲＭＳアプローチの変異形は、異なる長さの２つのＡＲＭＳプライマーを含み、各々はある部位の異なる多型に特異的である。この方法は、異なる多型のために異なる長さのＰＣＲ生成物を与える。
【0326】
３．６ 多型を検出するためのライゲーションベースのアッセイ
ＳＮＰ検出の別の一般的な方法は、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイを包含する。いくつかのアプローチは、ＤＮＡ鋳型にハイブリダイズしている２つの隣接したオリゴヌクレオチドを連結することができる酵素であるＤＮＡリガーゼを利用する。このアプローチの特異性は、ライゲーション部位におけるハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドとＤＮＡ鋳型の間の完全な一致の必要条件から来る。オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）アッセイでは、突然変異部位を囲んでいる配列は先ず増幅され、１つの鎖は３つのライゲーションプローブのための鋳型の役目をし、これらのうちの２つは対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）であり、第３は共通プローブである。ライゲーション生成物の検出のために、多数のアプローチを使用することができる。例えば、２つのＡＳＯは蛍光またはハプテン標識で差別的に標識化することができ、ライゲーション生成物はそれぞれ蛍光または比色酵素結合免疫吸着検定法によって検出することができる。電気泳動ベースのシステムについては、蛍光検出と一緒の移動度調節剤タグまたはプローブ長の変動の使用は、単一のチューブにおけるいくつかの単一ヌクレオチド置換の多重遺伝子タイピングを可能にする。アレイの上で使用するとき、ＡＳＯはチップ上の特異的な場所またはアドレスで見つけることができる。ＰＣＲ増幅ＤＮＡを次に加えることができ、アレイ上の特異的アドレスでの標識オリゴヌクレオチドへのライゲーションを測定することができる。
ＳＮＰ検出の別の一般的な方法は、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイを包含する。いくつかのアプローチは、ＤＮＡ鋳型にハイブリダイズしている２つの隣接したオリゴヌクレオチドを連結することができる酵素であるＤＮＡリガーゼを利用する。このアプローチの特異性は、ライゲーション部位におけるハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドとＤＮＡ鋳型の間の完全な一致の必要条件から来る。オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）アッセイでは、突然変異部位を囲んでいる配列は先ず増幅され、１つの鎖は３つのライゲーションプローブのための鋳型の役目をし、これらのうちの２つは対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）であり、第３は共通プローブである。ライゲーション生成物の検出のために、多数のアプローチを使用することができる。例えば、２つのＡＳＯは蛍光またはハプテン標識で差別的に標識化することができ、ライゲーション生成物はそれぞれ蛍光または比色酵素結合免疫吸着検定法によって検出することができる。電気泳動ベースのシステムについては、蛍光検出と一緒の移動度調節剤タグまたはプローブ長の変動の使用は、単一のチューブにおけるいくつかの単一ヌクレオチド置換の多重遺伝子タイピングを可能にする。アレイの上で使用するとき、ＡＳＯはチップ上の特異的な場所またはアドレスで見つけることができる。ＰＣＲ増幅ＤＮＡを次に加えることができ、アレイ上の特異的アドレスでの標識オリゴヌクレオチドへのライゲーションを測定することができる。
【0327】
３．７ シグナル発生多型検出アッセイ
一部の実施形態では、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の多型を同定する方法であると考えられている。ＦＲＥＴは、２つの色素分子の電子励起状態の間での相互作用のために起こる。励起は、光子の放出なしで、１つの（ドナー）色素分子から他の（受容体）色素分子に移転する。これは距離依存性であり、すなわちドナーおよび受容体色素は近接していなければならない。ハイブリダイゼーションプローブシステムは、蛍光色素で標識化された２つのオリゴヌクレオチドからなる。ハイブリダイゼーションプローブ対は、標的ＤＮＡ上の隣接領域にハイブリダイズするように設計される。各プローブは、異なるマーカー色素で標識化される。２つの色素の相互作用は、両方ともそれらの標的に結合しているときだけに起こることができる。ドナープローブは３’末端、受容体プローブは５’末端が蛍光団で標識化される。ＰＣＲの間、２つの異なるオリゴヌクレオチドは標的ＤＮＡの隣接領域にハイブリダイズし、そのため、オリゴヌクレオチドに結合している蛍光団がハイブリッド構造体に近接する。ドナー蛍光団（Ｆ１）は外部光源によって励起され、次にその励起エネルギーの一部を隣接する受容体蛍光団（Ｆ２）に渡す。励起された受容体蛍光団（Ｆ２）は異なる波長で光を放射し、それは、次に分子近接性について検出および測定することができる。
一部の実施形態では、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の多型を同定する方法であると考えられている。ＦＲＥＴは、２つの色素分子の電子励起状態の間での相互作用のために起こる。励起は、光子の放出なしで、１つの（ドナー）色素分子から他の（受容体）色素分子に移転する。これは距離依存性であり、すなわちドナーおよび受容体色素は近接していなければならない。ハイブリダイゼーションプローブシステムは、蛍光色素で標識化された２つのオリゴヌクレオチドからなる。ハイブリダイゼーションプローブ対は、標的ＤＮＡ上の隣接領域にハイブリダイズするように設計される。各プローブは、異なるマーカー色素で標識化される。２つの色素の相互作用は、両方ともそれらの標的に結合しているときだけに起こることができる。ドナープローブは３’末端、受容体プローブは５’末端が蛍光団で標識化される。ＰＣＲの間、２つの異なるオリゴヌクレオチドは標的ＤＮＡの隣接領域にハイブリダイズし、そのため、オリゴヌクレオチドに結合している蛍光団がハイブリッド構造体に近接する。ドナー蛍光団（Ｆ１）は外部光源によって励起され、次にその励起エネルギーの一部を隣接する受容体蛍光団（Ｆ２）に渡す。励起された受容体蛍光団（Ｆ２）は異なる波長で光を放射し、それは、次に分子近接性について検出および測定することができる。
【0328】
他の実施形態では、一塩基伸長、磁気分離および化学発光に基づくＭａｇＳＮｉＰｅｒ方法は、ヌクレオチド配列の中のＳＮＰ同定のためのさらなる方法を提供する。一塩基ヌクレオチド伸長反応は、その３’末端がタグ標識ｄｄＮＴＰを有するＳＮＰ部位に連続しているビオチン化プライマーで実行される。次に、ストレプトアビジンを有する磁気コーティングビーズによってプライマーが捕捉され、組み込まれていない標識ｄｄＮＴＰは磁気分離によって取り除かれる。磁気ビーズは、アルカリ性ホスファターゼにコンジュゲートしている抗タグ抗体とインキュベートされる。磁気分離による過剰のコンジュゲートの除去後、化学発光を測定することによってＳＮＰタイピングが実行される。標識ｄｄＮＴＰの組込みは、アルカリ性ホスファターゼによって誘導される化学発光によってモニタリングされる。
【0329】
一部の実施形態では、蛍光偏光法は、ヌクレオチド配列の中の多型を同定するための方法を提供する。例えば、多型を含有する増幅されたＤＮＡが、対立遺伝子特異的色素標識ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸および市販されている改変Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、オリゴヌクレオチドプライマー（多型部位に隣接したＤＮＡ鋳型にハイブリダイズするように設計される）とインキュベートされる。プライマーは鋳型の上に存在する対立遺伝子に特異的である色素－ターミネーターによって伸長し、蛍光団の分子量を概ね１０倍増加させる。反応の終了時に、反応混合物の中の２つの色素－ターミネーターの蛍光偏光は、分離も精製もなしで直接的に分析される。この均一なＤＮＡ診断方法は高度に高感度および特異的であることが示され、多数の試料の自動化遺伝子タイピングのために適する。
【0330】
他の実施形態では、二本鎖ＤＮＡ断片における一塩基差を検出し、同定するための方法として、表面増強ラマン散乱を使用することができる（Chumanov, G 1999を参照する）。単一分子の検出のために、ＳＥＲＳも使用された（Kneipp, K, 1997）。ＳＥＲＳは、ナノメートルの大きさの金属構造に付着している分子からの非常に増加したラマンシグナルをもたらす。
【0331】
例示的な例には、検出が蛍光クエンチングによるプライマー伸長アッセイに基づく、Xiao and Kwok 2003によって議論される遺伝子タイピング方法が含まれる。蛍光クエンチング検出（ＦＱ－ＴＤＩ）アッセイによる鋳型による（template-directed）色素－ターミネーター組込みは、蛍光色素Ｒ１１０－およびＲ６Ｇ－標識アシクロターミネーターの強度は、それらがＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーに組み込まれると普遍的にクエンチされるとの観察に基づく。２つの対立遺伝子色素の蛍光クエンチングの速度をリアルタイムで比較することによって、ＤＮＡ試料中のＳＮＰの頻度を測定することができる。動的ＦＱ－ＴＤＩアッセイは、遺伝子タイピングおよび対立遺伝子頻度推定の両方において高度に正確で、再現可能である。
【0332】
３．８ 高分解能融解分析
特定の実施形態では、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の、１６Ｓ ｒＲＮＡ分子の中の、またはそのＤＮＡコピーの中の、本明細書に記載されるＳＮＰ（複数可）に基づいて試料中の１つまたは複数の細菌を分類および／または同定するために、本発明の方法は高分解能融解（ＨＲＭ）分析を利用する。
特定の実施形態では、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の、１６Ｓ ｒＲＮＡ分子の中の、またはそのＤＮＡコピーの中の、本明細書に記載されるＳＮＰ（複数可）に基づいて試料中の１つまたは複数の細菌を分類および／または同定するために、本発明の方法は高分解能融解（ＨＲＭ）分析を利用する。
【0333】
ＨＲＭは、挿入蛍光色素によって染色されたＰＣＲ生成物（すなわち、アンプリコン）がその融点（Ｔｍ）を通して加熱されるときの、蛍光変化の正確なモニタリングに基づく。伝統的な融解と対照的に、ＨＲＭ分析における情報は、計算されたＴｍだけでなく融解曲線の形で含有されるので、ＨＲＭは分光法の形と考えることができる。ＨＲＭ分析は単一工程の閉鎖的なチューブ方法であり、増幅および融解はリアルタイムＰＣＲ機器の上で単一のプロトコールとして実行することができる。
【0334】
本発明の実施形態では、この方法は、本明細書に記載されるＳＮＰの１つまたは複数を含有する標的ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズする増幅プライマー対を利用する。増幅反応混合物は蛍光色素を含有し、それは結果として生じるアンプリコンに組み込まれる。
【0335】
結果として生じるアンプリコンは、約５０℃から約９５℃の範囲内の温度の漸増（すなわち、０．０１～０．５℃）によるＨＲＭに次に付される。この過程の間のある時点で、アンプリコンの融点に到達し、ＤＮＡの２本の鎖は分離するかまたは別々に「融解」する。
【0336】
アンプリコンに組み込まれる蛍光色素を使用して、ＨＲＭはリアルタイムでモニタリングされる。色素の蛍光レベルは温度が上昇する間中モニタリングされ、二本鎖ＤＮＡの量が低減するに従って蛍光は低減する。蛍光および温度における変化は、融解曲線として知られるグラフにプロットすることができる。
【0337】
当業者が理解するように、２本のＤＮＡ鎖が分離するアンプリコンのＴｍは予測可能であり、アンプリコンを形成するヌクレオチド塩基の配列に依存する。したがって、融解曲線は異なって出現するので、多型（すなわち、１つまたは複数のＳＮＰ）を含有するアンプリコンを含むアンプリコンを区別することが可能である。実際、一部の実施形態では、周囲のＤＮＡ配列における差に基づいて、同じ多型を含有するアンプリコンを区別することが可能である。
【0338】
ＨＲＭ曲線は、多くの異なる戦略によってお互いから識別することができる。例えば、多くの場合、ＨＲＭ曲線は、曲線形状における明らかな差に基づいておよび／またはＴｍに基づいて識別することができ、０．２℃の差が有意であると考えられている。他の場合には、規定の曲線がベースラインとして使用され、他の正規化曲線がベースラインに対してプロットされる、差グラフ分析を使用することができる（Price, E.P. et al. 2007を参照する）。さらに他の場合には、全ての温度での蛍光のための平均±１．９６標準偏差から第３および第９７パーセンタイル値を導くことを含む、差グラフに基づく方法を使用することができる（Andersson, P. et al., 2009およびMerchant-Patel, S. et al. 2008を参照する）。
【0339】
４．ツール、試薬、プライマー、プローブ、キットおよび処理系
本明細書は、細菌、酵母生物体もしくは糸状菌を同定、部分的に同定もしくは分類するための、または、細菌、酵母生物体もしくは糸状菌による感染を診断するための「ツール」として様々なＳＮＰをどのように使用することができるかについて説明する。このＳＮＰの知見は、細菌、酵母生物体もしくは糸状菌を同定、部分的に同定もしくは分類するための、または、細菌、酵母生物体もしくは糸状菌による感染を診断するための、遺伝子／対立遺伝子ベースのおよび遺伝子生成物ベースのプローブ、ツール、試薬、方法およびアッセイを発明者が開発することを可能にする。
本明細書は、細菌、酵母生物体もしくは糸状菌を同定、部分的に同定もしくは分類するための、または、細菌、酵母生物体もしくは糸状菌による感染を診断するための「ツール」として様々なＳＮＰをどのように使用することができるかについて説明する。このＳＮＰの知見は、細菌、酵母生物体もしくは糸状菌を同定、部分的に同定もしくは分類するための、または、細菌、酵母生物体もしくは糸状菌による感染を診断するための、遺伝子／対立遺伝子ベースのおよび遺伝子生成物ベースのプローブ、ツール、試薬、方法およびアッセイを発明者が開発することを可能にする。
【0340】
当業技術者は、本明細書で、特に表１～９および１１で提供される情報に基づいて、広範囲の遺伝子／対立遺伝子ベースのおよび遺伝子生成物ベースのプローブ、ツール、試薬、方法およびアッセイを容易に設計、生成または製造することができる。
【0341】
一般的に、本明細書において概説されるＳＮＰに基づく、またはそれを考慮して開発されたそのようなプローブ、ツールまたは試薬は、例えば、遺伝子もしくはその遺伝子の一部、ＲＮＡ遺伝子生成物もしくはそのＲＮＡ遺伝子生成物の一部、または他の遺伝子生成物もしくはその一部に特異的に結合すること、それを検出、同定、特徴付けまたは定量化することができる。
【0342】
一般的に、そのようなプローブ、ツールまたは試薬は、例えばゲノムレベルまたは転写レベルでの多型の検出のためであってよい。
【0343】
一般的に、そのようなプローブ、ツールまたは試薬は、遺伝子または遺伝子生成物（ＲＮＡなど）を検出することが可能な抗体または他のタイプの分子もしくは化学実体であってもよい。
【0344】
より具体的には、プローブ、ツールおよび試薬には、限定されずに、以下を含めることができる：
１．１６Ｓ ｒＲＮＡ、１６Ｓ ｒＤＮＡ、１８Ｓ ｒＲＮＡまたは１８Ｓ ｒＤＮＡの単離、精製、合成または組み換えられた形態、または、目的のＳＮＰを含有する断片を含むその断片－一本鎖または二本鎖。
２．１６Ｓ ｒＲＮＡ、１６Ｓ ｒＤＮＡ、１８Ｓ ｒＲＮＡまたは１８Ｓ ｒＤＮＡの天然に存在しないポリヌクレオチド、組換えポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡの形態、または、目的のＳＮＰを含有する断片を含むその断片－一本鎖または二本鎖。
３．１または２の核酸またはポリヌクレオチドを含む発現ベクター、組換え細胞または生体試料。
１．１６Ｓ ｒＲＮＡ、１６Ｓ ｒＤＮＡ、１８Ｓ ｒＲＮＡまたは１８Ｓ ｒＤＮＡの単離、精製、合成または組み換えられた形態、または、目的のＳＮＰを含有する断片を含むその断片－一本鎖または二本鎖。
２．１６Ｓ ｒＲＮＡ、１６Ｓ ｒＤＮＡ、１８Ｓ ｒＲＮＡまたは１８Ｓ ｒＤＮＡの天然に存在しないポリヌクレオチド、組換えポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡの形態、または、目的のＳＮＰを含有する断片を含むその断片－一本鎖または二本鎖。
３．１または２の核酸またはポリヌクレオチドを含む発現ベクター、組換え細胞または生体試料。
【0345】
プローブ、ツールまたは試薬は、限定されずに、遺伝子または遺伝子生成物（ＲＮＡまたはポリペプチド）を検出することが可能な抗体または他のタイプの分子もしくは化学実体であってもよい。
【0346】
少なくとも１つのプローブ、ツールまたは試薬は、上記のものの任意の数または組合せであってよく、この数および組合せは、達成すべき所望の結果－例えば、ゲノムレベル（遺伝子タイピング）、ＲＮＡレベルでの多型の検出に依存する。
【0347】
本発明により１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子または１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の１つまたは複数のＳＮＰを検出するために必要とされる全ての必須の材料および試薬は、キットの中に一緒にまとめることができる。キットは、適当な標識検出用試薬、陽性および陰性対照、蛍光色素、洗浄溶液、ブロッティングメンブラン、マイクロタイタープレート、希釈緩衝液などを含んでもよい。例えば、多型の同定のための核酸ベースの検出キットは、以下の１つまたは複数を含むことができる：（ｉ）グラム陽性細胞および／またはグラム陰性細胞からの核酸（陽性対照として使用することができる）；および（ｉｉ）分析するＳＮＰ位置（複数可）を含有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子または１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の少なくとも一部分に特異的にハイブリダイズするプライマーおよび／またはプローブ、ならびに適宜、疑われるＳＮＰ部位の、またはその周囲の１つまたは複数の他のマーカー。増幅のために必要な反応混合物を提供するために、様々なポリメラーゼ（用いる核酸増幅技術によって、逆転写酵素、Ｔａｑ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）ＤＮＡリガーゼ等）を含む核酸増幅に適する酵素、デオキシヌクレオチドおよび緩衝液が含まれてもよい。そのようなキットは、適する手段の中に、各個々の試薬および酵素、ならびに各プライマーまたはプローブのための個別の容器も一般的に含む。キットは、本明細書に記載されるアッセイの１つを実行するための様々な装置および試薬；および／または本明細書に規定されるＳＮＰの存在を同定するためにキットを使用するための印刷された説明書を特徴として有することもできる。
【0348】
一部の実施形態では、本明細書に一般的に記載される方法は、少なくとも一部、適切にプログラムされたコンピュータシステムなどの処理システムによって実行される。上記の方法の実行を可能にするマイクロプロセッサー実行アプリケーションソフトを備えた、独立型コンピュータを使用することができる。あるいは、本方法は、少なくとも一部、分散型アーキテクチャの一部として動作する１つまたは複数の処理システムによって実行することができる。例えば、核酸分子へのプローブのハイブリダイゼーションを検出することによって、ある位置でＳＮＰの存在を検出するのに処理システムを使用することができる。１つまたは複数のＳＮＰの検出に基づいて細菌のグラム状態または同一性またはグループ分けを判定するために、処理システムを使用することもできる。一部の例では、ユーザーによって処理システムに入力されるコマンドは、これらの判定において処理システムを支援することができる。
【0349】
一例では、処理システムは、少なくとも１つのマイクロプロセッサー、メモリ、入力／出力装置、例えばキーボードおよび／または表示装置、ならびにバスを通して相互接続される外部インターフェースを含む。外部インターフェースは、処理システムを周辺装置、例えば通信ネットワーク、データベースまたは記憶装置に接続するために利用することができる。マイクロプロセッサーは、ＳＮＰ検出および／または微生物の同定もしくは分類処理の実行を可能にするために、ならびに任意の他の要求される処理、例えばコンピュータシステムとの通信を実行するために、メモリに格納されるアプリケーションソフトの形の命令を実行することができる。アプリケーションソフトは１つまたは複数のソフトウェアモジュールを含むことができ、適する実行環境、例えばオペレーティングシステム環境などの中で実行することができる。
【0350】
４．１ １６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子または１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のためのプライマー、プローブ、キットおよび処理システム
本発明は、試料中の１つまたは複数の細菌、酵母生物体または糸状菌を分類および／または同定するために、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子または１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の１つまたは複数の位置にあるＳＮＰを判定するために本明細書に記載される方法において使用することができる、プローブおよびプライマーを提供する。
本発明は、試料中の１つまたは複数の細菌、酵母生物体または糸状菌を分類および／または同定するために、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子または１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の１つまたは複数の位置にあるＳＮＰを判定するために本明細書に記載される方法において使用することができる、プローブおよびプライマーを提供する。
【0351】
本発明のプライマーおよびプローブは、ＳＮＰ位置（複数可）を含有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子または１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（または、１６Ｓ ｒＲＮＡ分子もしくはそのＤＮＡコピーまたは１８Ｓ ｒＲＮＡ分子もしくはそのＤＮＡコピー）の少なくとも一部分にハイブリダイズする。例えば、プライマーは１つまたは複数のＳＮＰに隣接している配列にハイブリダイズすることができ、プローブは１つまたは複数のＳＮＰを含む配列にハイブリダイズすることができる。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子または１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の公知の配列に基づいて、本発明の方法で使用するための適当なプライマーおよびプローブを設計することは、当業者の技術の適用範囲内である。
【0352】
細菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡの中の、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７および／または６５３に対応する位置にあるＳＮＰが分析される本発明の方法のために有益であるプライマーおよびプローブの非限定的な例には、実施例１に記載されるものが含まれる。
【0353】
例えば、２７３位のＳＮＰを検出するために、例示的なフォワードプライマーには、
CCTCTTGCCATCGGATGTG（配列番号１６）が含まれ、例示的なリバースプライマーには、CCAGTGTGGCTGGTCATCCT（配列番号１７）、CGATCCGAAAACCTTCTTCACT（配列番号２０）、CTATGCATCGTTGCCTTGGTAA（配列番号２２）、TGATGTACTATTAACACATCAACCTTCCT（配列番号２６）、AACGCTCGGATCTTCCGTATTA（配列番号２７）、CGCTCGCCACCTACGTATTAC（配列番号２８）、CGTAGTTAGCCGTCCCTTTCTG（配列番号３０）、GGAATTCTACCCCCCTCTACGA（配列番号３４）、およびGGAATTCTACCCCCCTCTACAAG（配列番号３５）が含まれる。
CCTCTTGCCATCGGATGTG（配列番号１６）が含まれ、例示的なリバースプライマーには、CCAGTGTGGCTGGTCATCCT（配列番号１７）、CGATCCGAAAACCTTCTTCACT（配列番号２０）、CTATGCATCGTTGCCTTGGTAA（配列番号２２）、TGATGTACTATTAACACATCAACCTTCCT（配列番号２６）、AACGCTCGGATCTTCCGTATTA（配列番号２７）、CGCTCGCCACCTACGTATTAC（配列番号２８）、CGTAGTTAGCCGTCCCTTTCTG（配列番号３０）、GGAATTCTACCCCCCTCTACGA（配列番号３４）、およびGGAATTCTACCCCCCTCTACAAG（配列番号３５）が含まれる。
【0354】
３７８位のＳＮＰを検出するために、例示的なフォワードプライマーには、CCTCTTGCCATCGGATGTG（配列番号１６）、CCTACGGGAGGCAGCAGTAG（配列番号１８）、およびGGGAGGCAGCAGTAGGGAAT（配列番号１９）；が含まれ、例示的なリバースプライマーには、CGATCCGAAAACCTTCTTCACT（配列番号２０）、CTATGCATCGTTGCCTTGGTAA（配列番号２２）、TGATGTACTATTAACACATCAACCTTCCT（配列番号２６）、AACGCTCGGATCTTCCGTATTA（配列番号２７）、CGCTCGCCACCTACGTATTAC（配列番号２８）、CGTAGTTAGCCGTCCCTTTCTG（配列番号３０）、GGAATTCTACCCCCCTCTACGA（配列番号３４）、およびGGAATTCTACCCCCCTCTACAAG（配列番号３５）が含まれる。
【0355】
４１２位のＳＮＰを検出するために、例示的なフォワードプライマーには、CCTCTTGCCATCGGATGTG（配列番号１６）、CCTACGGGAGGCAGCAGTAG（配列番号１８）、GGGAGGCAGCAGTAGGGAAT（配列番号１９）、およびAAGACGGTCTTGCTGTCACTTATAGA（配列番号２１）；が含まれ、例示的なリバースプライマーには、CTATGCATCGTTGCCTTGGTAA（配列番号２２）、TGATGTACTATTAACACATCAACCTTCCT（配列番号２６）、AACGCTCGGATCTTCCGTATTA（配列番号２７）、CGCTCGCCACCTACGTATTAC（配列番号２８）、CGTAGTTAGCCGTCCCTTTCTG（配列番号３０）、GGAATTCTACCCCCCTCTACGA（配列番号３４）、およびGGAATTCTACCCCCCTCTACAAG（配列番号３５）が含まれる。
【0356】
４４０位のＳＮＰを検出するために、例示的なフォワードプライマーには、CCTCTTGCCATCGGATGTG（配列番号１６）、CCTACGGGAGGCAGCAGTAG（配列番号１８）、GGGAGGCAGCAGTAGGGAAT（配列番号１９）、AAGACGGTCTTGCTGTCACTTATAGA（配列番号２１）、TGCCGCGTGAATGAAGAA（配列番号２３）、GCGTGAAGGATGAAGGCTCTA（配列番号２４）、およびTGATGAAGGTTTTCGGATCGT（配列番号２５）；が含まれ、例示的なリバースプライマーには、TGATGTACTATTAACACATCAACCTTCCT（配列番号２６）、AACGCTCGGATCTTCCGTATTA（配列番号２７）、CGCTCGCCACCTACGTATTAC（配列番号２８）、CGTAGTTAGCCGTCCCTTTCTG（配列番号３０）、GGAATTCTACCCCCCTCTACGA（配列番号３４）、およびGGAATTCTACCCCCCTCTACAAG（配列番号３５）が含まれる。
【0357】
４８８位のＳＮＰを検出するために、例示的なフォワードプライマーには、CCTCTTGCCATCGGATGTG（配列番号１６）、CCTACGGGAGGCAGCAGTAG（配列番号１８）、GGGAGGCAGCAGTAGGGAAT（配列番号１９）、AAGACGGTCTTGCTGTCACTTATAGA（配列番号２１）、TGCCGCGTGAATGAAGAA（配列番号２３）、GCGTGAAGGATGAAGGCTCTA（配列番号２４）、TGATGAAGGTTTTCGGATCGT（配列番号２５）、およびGTTGTAAGAGAAGAACGAGTGTGAGAGT（配列番号２９）；が含まれ、例示的なリバースプライマーには、CGTAGTTAGCCGTCCCTTTCTG（配列番号３０）、GGAATTCTACCCCCCTCTACGA（配列番号３４）、およびGGAATTCTACCCCCCTCTACAAG（配列番号３５）が含まれる。
【0358】
６４７位および／または６５３位のＳＮＰを検出するために、例示的なフォワードプライマーには、CCTCTTGCCATCGGATGTG（配列番号１６）、CCTACGGGAGGCAGCAGTAG（配列番号１８）、GGGAGGCAGCAGTAGGGAAT（配列番号１９）、AAGACGGTCTTGCTGTCACTTATAGA（配列番号２１）、TGCCGCGTGAATGAAGAA（配列番号２３）、GCGTGAAGGATGAAGGCTCTA（配列番号２４）、TGATGAAGGTTTTCGGATCGT（配列番号２５）、GTTGTAAGAGAAGAACGAGTGTGAGAGT（配列番号２９）、GCGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAA（配列番号３１）、GGTCTGTCAAGTCGGATGTGAA（配列番号３２）、およびTCAACCTGGGAACTCATTCGA（配列番号３３）；が含まれ、例示的なリバースプライマーには、GGAATTCTACCCCCCTCTACGA（配列番号３４）、およびGGAATTCTACCCCCCTCTACAAG（配列番号３５）が含まれる。
【0359】
同様に、細菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子または１６Ｓ ｒＲＮＡの中の、配列番号４３に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置７４６、７６４、７７１または７８５（または、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置７３７、７５５、７６２または７７６）に対応する位置にあるＳＮＰが分析される本発明の方法のために有益であるプライマーおよびプローブの非限定的な例には、表８に記載されるものが含まれる。
【0360】
同様に、細菌種の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子または１８Ｓ ｒＲＮＡの中の、配列番号３７に示す１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置３４３、３７１、３８８、４１６および４６７にあるＳＮＰが分析される本発明の方法のために有益であるプライマーおよびプローブの非限定的な例には、表９に記載されるものが含まれる。
【0361】
５．本発明の方法の適用
本発明の方法は、試料、例えば、対象からの試料、または環境試料、例えば土もしくは水の試料、または装置もしくは機器（例えば、医療または手術機器）もしくは作業台の表面からとられる試料の中の細菌、酵母生物体または糸状菌を分類および／または同定するために有益である。そのような分類または同定は、細菌、酵母生物体または糸状菌を取り除くか、根絶するかまたはその数を低減するための処置クールを決定するために次に使用することができる。本発明の方法の任意の２つ以上を組み合わせてもよい。例えば、試料からの核酸は、本発明の方法を使用して１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中のＳＮＰの存在について分析することができる。これは、グラム陽性細菌かまたはグラム陰性細菌が試料中に存在するか判定するために実行することができる。細菌はさらにグループ分けすることができるか、または細菌の素性を判定するかもしくは２、３の可能性のうちの１つに絞り込むこともできる。例えば、上の開示から明らかになるように、試料中の細菌を分類するかまたはさらに同定するために、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７および６５３に対応する位置にあるＳＮＰを調査することができる。
本発明の方法は、試料、例えば、対象からの試料、または環境試料、例えば土もしくは水の試料、または装置もしくは機器（例えば、医療または手術機器）もしくは作業台の表面からとられる試料の中の細菌、酵母生物体または糸状菌を分類および／または同定するために有益である。そのような分類または同定は、細菌、酵母生物体または糸状菌を取り除くか、根絶するかまたはその数を低減するための処置クールを決定するために次に使用することができる。本発明の方法の任意の２つ以上を組み合わせてもよい。例えば、試料からの核酸は、本発明の方法を使用して１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中のＳＮＰの存在について分析することができる。これは、グラム陽性細菌かまたはグラム陰性細菌が試料中に存在するか判定するために実行することができる。細菌はさらにグループ分けすることができるか、または細菌の素性を判定するかもしくは２、３の可能性のうちの１つに絞り込むこともできる。例えば、上の開示から明らかになるように、試料中の細菌を分類するかまたはさらに同定するために、配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７および６５３に対応する位置にあるＳＮＰを調査することができる。
【0362】
クリニック、救急室、一般病棟および集中治療室の臨床医のところに、感染症または疑わしい感染症を有する対象がしばしば診察に訪れる。そのような患者は、異常な体温、増加した心拍数および呼吸数、ならびに異常な白血球数の非診断的臨床徴候をしばしば有する。臨床医は、患者が感染を有するかどうか、感染の重症度、患者を病院に入院させるかどうか（まだ入院していない場合）、感染源、抗生物質を使用するかどうか、もしそうならば抗生物質の種類、経路および用量を決めなければならない。患者における感染の存在は、最も一般的には、患者から試料をとって培養液の中で生物体を増殖させることによって調査されている。生物体が増殖すると、それをグラム染色して同定することができる。しかし、多くの感染患者（＞５０）では、生物体を培養することが可能でない。同定された生物体がない場合、臨床医は臨床判断およびしばしば組み合わせられる広域抗生物質の使用に頼らなければならない。病原生物体の素性についても感受性についても知識がない広域抗生物質の無差別使用は、患者における抗生物質耐性の発達、抗生物質の濫用および潜在毒性の副作用につながる。血液培養は高感度な方法（１～１００ｃｆｕ／ｍＬ）であるが、それは採血試料が生存可能な生物体を含有するときだけであり、常にそうであるとは限らない。
【0363】
したがって、本発明の方法は、対象が感染を有するかどうか、もしそうならば、感染を引き起こしている細菌、酵母生物体または糸状菌の分類に基づいて適当な治療クールを臨床医が決定するのを助けるのに特に有益である。
【0364】
さらに、本発明の方法は、対象から全血をとってから数時間以内のグラム陽性およびグラム陰性生物体の識別を容易にする。本発明の方法は効率的な時間で実行することも可能であり、そのため、数日内ではなく数時間以内にその結果が臨床医に利用可能である。そのような属性は、臨床医が細菌、酵母生物体または糸状菌の存在を鋭敏に検出すること、および治療（例えば、グラム状態に特異的な抗生物質の使用、またはその細菌のさらなるグループ分けもしくは同定）についての情報に基づいた決定をすることを可能にする。これらの改善は、不必要に入院させられる患者数の低減、細菌、酵母生物体および糸状菌、負荷後に調査される感染の重症度（および他の因子）の高感度検出、広域抗生物質／医薬品の使用の低減、広域抗生物質の下の患者時間の低減、抗生物質／医薬品からの毒性の低減、医薬品への耐性（特に抗生物質耐性）の発達の低減をもたらすことができる。
【0365】
本発明は、対象における細菌、酵母生物体または糸状菌による感染の診断、および陽性診断後の感染の管理にも拡張する。本明細書に記載される、１６Ｓ ｒＲＮＡまたは１８Ｓ ｒＲＮＡの中の１つまたは複数のＳＮＰを分析する方法は、細菌、酵母生物体もしくは糸状菌感染を対象が有するかどうか判定するために、および／または試料中の細菌、酵母生物体もしくは糸状菌の群もしくは種を同定するために使用することができる。本明細書に記載される方法は、細菌をグラム陽性菌またはグラム陰性菌として分類するためにさらに使用することができる。
【0366】
５．１ 管理および療法
本発明の方法の結果に基づいて、必要な場合、対象を適切に管理し、療法を投与することができる。例えば、細菌感染症の管理は、例えば、治療的に有効な抗生物質のクールなどの治療剤の投与を含むことができる。
本発明の方法の結果に基づいて、必要な場合、対象を適切に管理し、療法を投与することができる。例えば、細菌感染症の管理は、例えば、治療的に有効な抗生物質のクールなどの治療剤の投与を含むことができる。
【0367】
一般的に、治療剤は、薬学的に許容される担体と一緒に医薬（または、対象が非ヒト対象である場合は獣医学的）組成物の形で、およびそれらの意図された目的を達成するのに有効な量で投与される。対象に投与される活性化合物の用量は、感染の症状の低減もしくは軽減および／または対象からの細菌の低減もしくは排泄などの有益な応答を対象において経時的に達成するのに十分であるべきである。投与すべき薬学的に活性な化合物（複数可）の量は、治療される対象、例えば、その年齢、性別、体重および一般健康状態に依存してもよい。この点に関しては、投与のための活性化合物（複数可）の正確な量は、開業医の判断に依存する。細菌感染症の治療または予防において投与される活性化合物（複数可）の有効量の決定では、開業医は、感染の重症度、ならびに、炎症、血圧異常、頻脈、呼吸促迫、発熱、悪寒、嘔吐、下痢、皮膚発疹、頭痛、錯乱、筋痛および発作を含む、感染に伴う任意の症状の重症度を評価することができる。いかなる事象においても、当業者は、治療剤および適する治療レジメンの適する投薬量を不相応な実験なしで容易に決定することができる。
【0368】
主要器官への酸素供給を増加させるため、主要器官への血流を増加させるためおよび／または炎症性応答を低減するために、治療剤は補助的（対症的）療法と協調して投与することができる。そのような補助的療法の例示的な例には、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、静脈内生理食塩水および酸素が含まれる。
【0369】
本発明の態様を下記項にさらに記載する：
［項１］
試料中の少なくとも１つの細菌、酵母生物体または糸状菌を同定、部分的に同定、または分類する方法であって、前記試料からの細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分、または、前記試料からの酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分を、少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）の存在の有無について分析することを含み、
前記細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の前記少なくとも一部分の中の前記少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号１に示す前記１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７、６５３、７３７、７５５、７６２および７７６の少なくとも１つに対応する位置にあり；
前記試料中の前記少なくとも１つの細菌、酵母生物体または糸状菌は、前記少なくとも１つのＳＮＰの存在の有無に基づいて同定、部分的に同定、または分類される方法。
［項２］
対象において細菌、酵母生物体または糸状菌の感染を同定、部分的に同定、分類または診断する方法であって、前記対象からの試料中の細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分、または、酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分における少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）の存在の有無を分析することを含み；
前記細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の前記少なくとも一部分の中の前記少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号１に示す前記１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７、６５３、７３７、７５５、７６２および７７６の少なくとも１つに対応する位置にあり；
前記１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の前記少なくとも一部分、または前記１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の前記少なくとも一部分における前記少なくとも１つのＳＮＰの存在の有無は、前記対象において前記細菌、酵母生物体または糸状菌の感染を同定、部分的に同定、分類または診断するために使用される方法。
［項３］
細菌、酵母生物体または糸状菌の感染を有する対象を処置する方法であって、
前記対象において前記細菌、酵母生物体または糸状菌の感染を同定、部分的に同定、分類または診断するために、上記項２に記載の方法によって前記対象において前記細菌、酵母生物体または糸状菌の感染を同定、部分的に同定、分類または診断すること；
前記対象において前記細菌、酵母生物体または糸状菌の感染を処置するための処置法または処置剤を前記対象に投与すること
を含む方法。
［項４］
前記試料が、喀痰、血液、脳脊髄液または尿を含む生体試料である、上記項１から３のいずれか１項に記載の方法。
［項５］
前記分析工程が、高分解能融解分析、５’ヌクレアーゼ消化、分子ビーコン、オリゴヌクレオチドライゲーション、マイクロアレイ、制限断片長多型、抗体検出方法、直接配列決定または任意のその組合せを使用して前記少なくとも１つのＳＮＰの存在の有無を判定することを含む、上記項１から４のいずれか１項に記載の方法。
［項６］
前記少なくとも１つの細菌、酵母生物体または糸状菌が処置剤に抵抗性であるかどうか判定する工程をさらに含む、上記項１から５のいずれか１項に記載の方法。
［項７］
試料中の少なくとも１つの細菌を同定する方法であって、前記試料からの核酸を、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の、配列番号１に示す前記１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７および６５３の少なくとも１つに対応する位置にある少なくとも１つのＳＮＰについて分析することを含み、前記少なくとも１つの細菌は前記少なくとも１つのＳＮＰの存在に基づいて同定される方法。
［項８］
前記細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の前記少なくとも一部分の中の前記少なくとも１つのＳＮＰが、配列番号１に示す前記１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置７３７、７５５、７６２および７７６の少なくとも１つに対応する位置にある、上記項１から６のいずれか１項に記載の方法。
［項９］
前記酵母生物体または糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子または遺伝子生成物の前記少なくとも一部分の中の前記少なくとも１つのＳＮＰが、配列番号３７に示す前記１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子または遺伝子生成物の位置３４３、３７１、３８８、４１６および４６７の少なくとも１つに対応する位置にある、上記項１から６のいずれか１項に記載の方法。
［項１０］
前記試料からの細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分、または、前記試料からの酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分を、
前記細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の前記少なくとも一部分の中の、配列番号１に示す前記１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７、６５３、７３７、７５５、７６２および７７６の少なくとも４つに対応する位置にある一塩基多型；または
前記酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の前記少なくとも一部分の中の、配列番号３７に示す前記１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置３４３、３７１、３８８、４１６および４６７に対応する位置にある一塩基多型
の存在の有無について分析することを含む、上記項１から６のいずれか１項に記載の方法。
［項１１］
前記細菌が、または前記細菌感染症が、Acinetobacter calcoaceticus；Enterobacter aerogenes；Enterobacter cloacae；Enterococcus faecalis；Enterococcus faecium；Escherichia coli；Klebsiella pneumoniae；Proteus mirabilis；Pseudomonas aeruginosa；Serratia marcescens；Staphylococcus aureus；Staphylococcus epidermidis；Streptococcus agalactiae；Streptococcus pneumoniae；Streptococcus pyogenes；Listeria monocytogenes；Clostridium perfringens；Corynebacterium jeikeium；Bacteroides fragilis；Neisseria meningitides；Haemophilus influenzae；Salmonella sp.およびStaphylococcus epidermidisからなる群から選択される少なくとも１つであるか、またはそれによって引き起こされる、上記項１から６のいずれか１項に記載の方法。
［項１２］
前記細菌が、または前記細菌感染症が、Bacillus anthracis、Clostridium botulinum、Yersinia pestis、Francisella tularensis、Vibrio choleraeおよびBurkholderia pseudomalleiからなる群から選択される少なくとも１つであるか、またはそれによって引き起こされる、上記項１から６のいずれか１項に記載の方法。
［項１３］
前記酵母生物体または糸状菌が、Candida albicans、Candida tropicalis、Candida parapsilosis、Candida glabrata、Fusarium sp.、Aspergillus fumigatusおよびCryptococcus neoformansからなる群から選択される少なくとも１つである、上記項１から６のいずれか１項に記載の方法。
［項１４］
対象において感染症を同定、部分的に同定、分類または診断する方法であって、前記感染症が細菌、酵母生物体または糸状菌の感染であり、前記方法が、前記対象から得た生体試料を、少なくとも１つの細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物もしくはその一部分、または少なくとも１つの酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物もしくはその一部分の特性について検査することを含み、前記検査が、前記少なくとも１つの細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物もしくはその一部分、または前記少なくとも１つの酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物もしくはその一部分の中の少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）を検出することを含み、
前記細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物もしくはその一部分の中の前記少なくとも１つのＳＮＰが、配列番号１に示す前記１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７、６５３、７３７、７５５、７６２および７７６の少なくとも１つに対応する位置にあり；
前記試料中の前記少なくとも１つの細菌、酵母生物体または糸状菌が、前記少なくとも１つのＳＮＰの存在の有無に基づいて同定、部分的に同定、分類または診断される方法。
［項１５］
試料中の少なくとも１つの細菌、酵母生物体または糸状菌を同定、部分的に同定、または分類することが可能である少なくとも１つの単離されたプローブ、ツールまたは試薬であって、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分、または、酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）を結合すること、検出することまたはその存在の有無を同定することが可能であり、
前記細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の前記少なくとも一部分の中の前記少なくとも１つのＳＮＰが、配列番号１に示す前記１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７、６５３、７３７、７５５、７６２および７７６の少なくとも１つに対応する位置にある、プローブ、ツールまたは試薬。
［項１６］
配列番号１６～３５および５３～５７の少なくとも１つに示すヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、上記項１５に記載の少なくとも１つの単離されたプローブ、ツールまたは試薬。
［項１７］
試料中の少なくとも１つの細菌、酵母生物体または糸状菌を同定、部分的に同定、または分類する方法であって、
上記項１５または上記項１６に記載の少なくとも１つの単離されたプローブ、ツールまたは試薬を前記試料と合わせること；および
細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分、または、酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）の存在の有無に基づいて、前記少なくとも１つの細菌、酵母生物体または糸状菌を同定、部分的に同定、または分類することを含み、
前記細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の前記少なくとも一部分の中の前記少なくとも１つのＳＮＰが、配列番号１に示す前記１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７、６５３、７３７、７５５、７６２および７７６の少なくとも１つに対応する位置にある、方法。
［項１８］
上記項１５または上記項１６に記載の１つを超える前記単離されたプローブ、ツールまたは試薬を含むアレイ。
［項１９］
固体基材および上記項１５または上記項１６に記載の少なくとも１つの単離されたプローブ、ツールまたは試薬を含むバイオチップ。
［項２０］
試料中の少なくとも１つの細菌または少なくとも１つの酵母生物体もしくは糸状菌を分類または同定するためのキットまたはアッセイであって、上記項１５もしくは上記項１６に記載の少なくとも１つのプローブ、ツールもしくは試薬；上記項１８に記載のアレイ；および／または上記項１９に記載のバイオチップを含むキットまたはアッセイ。
［項２１］
細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分、または、酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の、試料中の少なくとも１つの細菌、酵母生物体または糸状菌を分類、同定、または部分的に同定するための指標として使用するための少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）であって、
前記細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の前記少なくとも一部分の中の前記少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号１に示す前記１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７、６５３、７３７、７５５、７６２および７７６の少なくとも１つに対応する位置にある、一塩基多型（ＳＮＰ）。
［項２２］
上記項１に記載の、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分、または、酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）、または、上記項１５もしくは上記項１６に記載の少なくとも１つの単離されたプローブ、ツールもしくは試薬の、試料中の少なくとも１つの細菌、酵母生物体または糸状菌の同定、部分的同定、または分類における使用であって、前記少なくとも１つの細菌、酵母生物体または糸状菌が、前記試料からの前記１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分、または前記１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つのＳＮＰの存在の有無に基づいて同定、部分的に同定、または分類される使用。
この明細書全体で「一実施形態」または「実施形態」への言及は、その実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造または特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、この明細書全体の様々な場所における語句「一実施形態では」または「ある実施形態では」の出現は、同じ実施形態を必ずしも全て指しているとは限らない。さらに、特定の特徴、構造または特性は、１つまたは複数の組合せの中で任意の適する方法で組み合わせることができる。
［項１］
試料中の少なくとも１つの細菌、酵母生物体または糸状菌を同定、部分的に同定、または分類する方法であって、前記試料からの細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分、または、前記試料からの酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分を、少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）の存在の有無について分析することを含み、
前記細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の前記少なくとも一部分の中の前記少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号１に示す前記１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７、６５３、７３７、７５５、７６２および７７６の少なくとも１つに対応する位置にあり；
前記試料中の前記少なくとも１つの細菌、酵母生物体または糸状菌は、前記少なくとも１つのＳＮＰの存在の有無に基づいて同定、部分的に同定、または分類される方法。
［項２］
対象において細菌、酵母生物体または糸状菌の感染を同定、部分的に同定、分類または診断する方法であって、前記対象からの試料中の細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分、または、酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分における少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）の存在の有無を分析することを含み；
前記細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の前記少なくとも一部分の中の前記少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号１に示す前記１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７、６５３、７３７、７５５、７６２および７７６の少なくとも１つに対応する位置にあり；
前記１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の前記少なくとも一部分、または前記１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の前記少なくとも一部分における前記少なくとも１つのＳＮＰの存在の有無は、前記対象において前記細菌、酵母生物体または糸状菌の感染を同定、部分的に同定、分類または診断するために使用される方法。
［項３］
細菌、酵母生物体または糸状菌の感染を有する対象を処置する方法であって、
前記対象において前記細菌、酵母生物体または糸状菌の感染を同定、部分的に同定、分類または診断するために、上記項２に記載の方法によって前記対象において前記細菌、酵母生物体または糸状菌の感染を同定、部分的に同定、分類または診断すること；
前記対象において前記細菌、酵母生物体または糸状菌の感染を処置するための処置法または処置剤を前記対象に投与すること
を含む方法。
［項４］
前記試料が、喀痰、血液、脳脊髄液または尿を含む生体試料である、上記項１から３のいずれか１項に記載の方法。
［項５］
前記分析工程が、高分解能融解分析、５’ヌクレアーゼ消化、分子ビーコン、オリゴヌクレオチドライゲーション、マイクロアレイ、制限断片長多型、抗体検出方法、直接配列決定または任意のその組合せを使用して前記少なくとも１つのＳＮＰの存在の有無を判定することを含む、上記項１から４のいずれか１項に記載の方法。
［項６］
前記少なくとも１つの細菌、酵母生物体または糸状菌が処置剤に抵抗性であるかどうか判定する工程をさらに含む、上記項１から５のいずれか１項に記載の方法。
［項７］
試料中の少なくとも１つの細菌を同定する方法であって、前記試料からの核酸を、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の中の、配列番号１に示す前記１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７および６５３の少なくとも１つに対応する位置にある少なくとも１つのＳＮＰについて分析することを含み、前記少なくとも１つの細菌は前記少なくとも１つのＳＮＰの存在に基づいて同定される方法。
［項８］
前記細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の前記少なくとも一部分の中の前記少なくとも１つのＳＮＰが、配列番号１に示す前記１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置７３７、７５５、７６２および７７６の少なくとも１つに対応する位置にある、上記項１から６のいずれか１項に記載の方法。
［項９］
前記酵母生物体または糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子または遺伝子生成物の前記少なくとも一部分の中の前記少なくとも１つのＳＮＰが、配列番号３７に示す前記１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子または遺伝子生成物の位置３４３、３７１、３８８、４１６および４６７の少なくとも１つに対応する位置にある、上記項１から６のいずれか１項に記載の方法。
［項１０］
前記試料からの細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分、または、前記試料からの酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分を、
前記細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の前記少なくとも一部分の中の、配列番号１に示す前記１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７、６５３、７３７、７５５、７６２および７７６の少なくとも４つに対応する位置にある一塩基多型；または
前記酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の前記少なくとも一部分の中の、配列番号３７に示す前記１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置３４３、３７１、３８８、４１６および４６７に対応する位置にある一塩基多型
の存在の有無について分析することを含む、上記項１から６のいずれか１項に記載の方法。
［項１１］
前記細菌が、または前記細菌感染症が、Acinetobacter calcoaceticus；Enterobacter aerogenes；Enterobacter cloacae；Enterococcus faecalis；Enterococcus faecium；Escherichia coli；Klebsiella pneumoniae；Proteus mirabilis；Pseudomonas aeruginosa；Serratia marcescens；Staphylococcus aureus；Staphylococcus epidermidis；Streptococcus agalactiae；Streptococcus pneumoniae；Streptococcus pyogenes；Listeria monocytogenes；Clostridium perfringens；Corynebacterium jeikeium；Bacteroides fragilis；Neisseria meningitides；Haemophilus influenzae；Salmonella sp.およびStaphylococcus epidermidisからなる群から選択される少なくとも１つであるか、またはそれによって引き起こされる、上記項１から６のいずれか１項に記載の方法。
［項１２］
前記細菌が、または前記細菌感染症が、Bacillus anthracis、Clostridium botulinum、Yersinia pestis、Francisella tularensis、Vibrio choleraeおよびBurkholderia pseudomalleiからなる群から選択される少なくとも１つであるか、またはそれによって引き起こされる、上記項１から６のいずれか１項に記載の方法。
［項１３］
前記酵母生物体または糸状菌が、Candida albicans、Candida tropicalis、Candida parapsilosis、Candida glabrata、Fusarium sp.、Aspergillus fumigatusおよびCryptococcus neoformansからなる群から選択される少なくとも１つである、上記項１から６のいずれか１項に記載の方法。
［項１４］
対象において感染症を同定、部分的に同定、分類または診断する方法であって、前記感染症が細菌、酵母生物体または糸状菌の感染であり、前記方法が、前記対象から得た生体試料を、少なくとも１つの細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物もしくはその一部分、または少なくとも１つの酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物もしくはその一部分の特性について検査することを含み、前記検査が、前記少なくとも１つの細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物もしくはその一部分、または前記少なくとも１つの酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物もしくはその一部分の中の少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）を検出することを含み、
前記細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物もしくはその一部分の中の前記少なくとも１つのＳＮＰが、配列番号１に示す前記１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７、６５３、７３７、７５５、７６２および７７６の少なくとも１つに対応する位置にあり；
前記試料中の前記少なくとも１つの細菌、酵母生物体または糸状菌が、前記少なくとも１つのＳＮＰの存在の有無に基づいて同定、部分的に同定、分類または診断される方法。
［項１５］
試料中の少なくとも１つの細菌、酵母生物体または糸状菌を同定、部分的に同定、または分類することが可能である少なくとも１つの単離されたプローブ、ツールまたは試薬であって、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分、または、酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）を結合すること、検出することまたはその存在の有無を同定することが可能であり、
前記細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の前記少なくとも一部分の中の前記少なくとも１つのＳＮＰが、配列番号１に示す前記１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７、６５３、７３７、７５５、７６２および７７６の少なくとも１つに対応する位置にある、プローブ、ツールまたは試薬。
［項１６］
配列番号１６～３５および５３～５７の少なくとも１つに示すヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、上記項１５に記載の少なくとも１つの単離されたプローブ、ツールまたは試薬。
［項１７］
試料中の少なくとも１つの細菌、酵母生物体または糸状菌を同定、部分的に同定、または分類する方法であって、
上記項１５または上記項１６に記載の少なくとも１つの単離されたプローブ、ツールまたは試薬を前記試料と合わせること；および
細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分、または、酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）の存在の有無に基づいて、前記少なくとも１つの細菌、酵母生物体または糸状菌を同定、部分的に同定、または分類することを含み、
前記細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の前記少なくとも一部分の中の前記少なくとも１つのＳＮＰが、配列番号１に示す前記１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７、６５３、７３７、７５５、７６２および７７６の少なくとも１つに対応する位置にある、方法。
［項１８］
上記項１５または上記項１６に記載の１つを超える前記単離されたプローブ、ツールまたは試薬を含むアレイ。
［項１９］
固体基材および上記項１５または上記項１６に記載の少なくとも１つの単離されたプローブ、ツールまたは試薬を含むバイオチップ。
［項２０］
試料中の少なくとも１つの細菌または少なくとも１つの酵母生物体もしくは糸状菌を分類または同定するためのキットまたはアッセイであって、上記項１５もしくは上記項１６に記載の少なくとも１つのプローブ、ツールもしくは試薬；上記項１８に記載のアレイ；および／または上記項１９に記載のバイオチップを含むキットまたはアッセイ。
［項２１］
細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分、または、酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の、試料中の少なくとも１つの細菌、酵母生物体または糸状菌を分類、同定、または部分的に同定するための指標として使用するための少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）であって、
前記細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の前記少なくとも一部分の中の前記少なくとも１つのＳＮＰは、配列番号１に示す前記１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置２７３、３７８、４１２、４４０、４８８、６４７、６５３、７３７、７５５、７６２および７７６の少なくとも１つに対応する位置にある、一塩基多型（ＳＮＰ）。
［項２２］
上記項１に記載の、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分、または、酵母生物体もしくは糸状菌の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つの一塩基多型（ＳＮＰ）、または、上記項１５もしくは上記項１６に記載の少なくとも１つの単離されたプローブ、ツールもしくは試薬の、試料中の少なくとも１つの細菌、酵母生物体または糸状菌の同定、部分的同定、または分類における使用であって、前記少なくとも１つの細菌、酵母生物体または糸状菌が、前記試料からの前記１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分、または前記１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子もしくは遺伝子生成物の少なくとも一部分の中の少なくとも１つのＳＮＰの存在の有無に基づいて同定、部分的に同定、または分類される使用。
この明細書全体で「一実施形態」または「実施形態」への言及は、その実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造または特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、この明細書全体の様々な場所における語句「一実施形態では」または「ある実施形態では」の出現は、同じ実施形態を必ずしも全て指しているとは限らない。さらに、特定の特徴、構造または特性は、１つまたは複数の組合せの中で任意の適する方法で組み合わせることができる。
【0370】
法規に従って、本発明は、構造的または方法論的特徴に多かれ少なかれ特異的な言葉で記載された。本明細書に記載される手段が本発明の実行の好ましい形態を含むので、本発明は、示されるかまたは記載される特異的特徴に限定されないことを理解すべきである。したがって、本発明は、当業者によって適切に解釈される添付の請求項（あるならば）の正しい範囲の中のその形態または改変形のいずれかの形で請求される。
【0371】
本明細書で引用される全ての特許、特許出願および刊行物の開示は、ここに参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【0372】
本発明が容易に理解され、実際に実行されるように、特定の好ましい実施形態が以下の非限定的な実施例を通して記載される。
【実施例1】
【0373】
この実験の目的は、本発明の１６Ｓ ｒＲＮＡ ＳＮＰ－ＨＲＭアッセイを使用して敗血症と診断された患者から頻繁に単離される最も多発している細菌種のうちの１５種を区別することであった。
【0374】
実験手順
合計で、以下の１５細菌種を試験した：Acinetobacter calcoaceticus；Enterobacter aerogenes；Enterobacter cloacae；Enterococcus faecalis；Enterococcus faecium；Escherichia coli；Klebsiella pneumoniae；Proteus mirabilis；Pseudomonas aeruginosa；Serratia marcescens；Staphylococcus aureus；Staphylococcus epidermidis；Streptococcus agalactiae；Streptococcus pneumoniaeおよびStreptococcus pyogenes。
合計で、以下の１５細菌種を試験した：Acinetobacter calcoaceticus；Enterobacter aerogenes；Enterobacter cloacae；Enterococcus faecalis；Enterococcus faecium；Escherichia coli；Klebsiella pneumoniae；Proteus mirabilis；Pseudomonas aeruginosa；Serratia marcescens；Staphylococcus aureus；Staphylococcus epidermidis；Streptococcus agalactiae；Streptococcus pneumoniaeおよびStreptococcus pyogenes。
【0375】
これらの細菌種は３７℃で一晩、ブレインハート・インフュージョンブロスで培養し、その後、ＱＩＡｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ血液および組織キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を使用して、各分離株からゲノムＤＮＡを抽出した。
【0376】
１６Ｓ ｒＤＮＡ－ＳＮＰプライマー（配列番号１６～３５、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ、によって作製された）が、以下のように命名された７つのＳＮＰを包含する領域を増幅するように設計された：配列番号１に示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＳＮＰ２７３、ＳＮＰ３７８、ＳＮＰ４１２、ＳＮＰ４４０、ＳＮＰ４８８、ＳＮＰ６４７およびＳＮＰ６５３。ＰＣＲ生成物のサイズは、７９ｂｐから９６ｂｐの範囲内であった。
【0377】
１５細菌種を区別するために、リアルタイムＰＣＲおよびその後のＨＲＭ分析を使用した。リアルタイムＰＣＲ ＨＲＭ方法は、以下の通りであった：１μｌの抽出したＤＮＡ（１～３ｎｇ）を、１０μｌの２×ＳＹＢＲグリーンＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）および８ｐｍｏｌの各プライマーを含有する１９μｌの反応ｍａｓｔｅｒｍｉｘに加えた。これらの反応のための温度サイクルは、以下の通りであった：５０℃で２分間、９５℃で２分間、その後、９５℃で１５秒、５２℃で２０秒および７２℃で３５秒、７２℃で２分間の保持、５０℃で２０秒の保持のサイクルを４０サイクル、ＨＲＭ：０．０５℃ずつ上昇する６５℃から９５℃への傾斜（Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ ６０００、Ｑｉａｇｅｎ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）。
【0378】
ＨＲＭデータを複数の方法で分析するために、Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ ６０００ソフトウェア（バージョン１．７．３４または１．７．８７）を使用した。正規化された生の融解曲線は、蛍光の減少を温度上昇に対して示し、差曲線は、ユーザー定義の曲線をベースライン（すなわち、ｘ軸）として示すものであるが、他の正規化された曲線をそのベースラインに対して示す。差グラフを使用して融解曲線を「同じ」または「異なる」と呼ぶための判定基準が発明者および共同研究者によって以前に開発され、公開された（例えば、Stephens, A.J., et al. 2008；Merchant-Patel, S., et al. 2010を参照する）。
【0379】
ＨＲＭ曲線グラフで試料を区別することができる２つの方法がある。融解曲線の形状は曲線の形状の詳細を示し、曲線シフトは他の曲線からの曲線の熱（温度）オフセットを示す。
【0380】
上で一般的に記載されるように、このソフトウェアは、正規化された融解曲線としてまたは差曲線として使用するＨＲＭ融解曲線分析を可能にする。正規化曲線分析は、解釈および分析を助けるために、全てのＨＲＭ曲線の同じ開始および終了蛍光シグナルレベルでの比較を可能にする。差曲線分析は、各試料および所与の対照の融解曲線の間の差を示す。
【0381】
この実験では、試験した各細菌種のためにＨＲＭ曲線を識別するために、形状およびシフトの両アプローチを使用した。各それぞれの細菌種のために融点のシフトを判定するために、０．２℃の融点差を各細菌種の融解曲線間の有意差と考えた。
【0382】
細菌種の間の形状差を判定するために、差曲線分析を使用した。＞５の正規化された蛍光単位の幅の差は、異なる細菌種の融解曲線がコンパレーター種と異なることを示す。したがって、曲線形状のこれらの差は、各それぞれの細菌種のＤＮＡ配列における差を示す。
【0383】
結果
図２～１１は、この実施例で試験した１５細菌種を区別するために使用した、正規化されたおよび差の融解曲線グラフを示す。
図２～１１は、この実施例で試験した１５細菌種を区別するために使用した、正規化されたおよび差の融解曲線グラフを示す。
【0384】
１５細菌種の各々は、Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ ６０００ソフトウェア（バージョン１．７．３４または１．７．８７）のＨＲＭ分析設定において、種特異的遺伝子型で指定した。細菌種差曲線の比較のために、「キャリブレータ」または「参照」（図３に示すグラフのＹ軸の上で「０」で示す）としてEscherichia coliを使用した。図３に示すように、他の１４細菌種の全ては、Escherichia coliの「０」の線からかなり異なる曲線を示した。種差別化の別の例は図５に示し、ここで「キャリブレータ」または「参照」（Ｙ軸上の「０」の位置）としてStaphylococcus aureusが選択され、示すようにStaphylococcus epidermidisは完全に別個の曲線を有する。
【0385】
尿および血漿中の細菌の融解曲線特異性を、表１１に示す。
【0386】
【表11】
【0387】
考察
この実施例は、敗血症などの生命にかかわる疾患を引き起こすことが知られている１５の異なる細菌種を区別するために７つの高度識別性ＳＮＰだけを適用することの有用性を実証する。結果は、本発明の方法が高度に特異的で迅速なことも示し、その両方はＤＮＡ診断アッセイの重要な必要条件である。この方法は、高度識別性ＳＮＰを包含するＰＣＲ生成物のＤＮＡ融解曲線に基づいて、２つの分離株が同じであるかまたは異なるかを正確に判定する。これらの遺伝子標的を調べることは、このアプローチが「ラボオンチップ」装置および専用の完全自動化リアルタイムＰＣＲ機器などの新興技術への適合に特に馴化し易いことを意味する。マイクロ流体力学における急速に進歩する技術革新と組み合わせると、本発明の方法は、「ポイント・オブ・ケア」の診断に適する装置への転換に適する。
この実施例は、敗血症などの生命にかかわる疾患を引き起こすことが知られている１５の異なる細菌種を区別するために７つの高度識別性ＳＮＰだけを適用することの有用性を実証する。結果は、本発明の方法が高度に特異的で迅速なことも示し、その両方はＤＮＡ診断アッセイの重要な必要条件である。この方法は、高度識別性ＳＮＰを包含するＰＣＲ生成物のＤＮＡ融解曲線に基づいて、２つの分離株が同じであるかまたは異なるかを正確に判定する。これらの遺伝子標的を調べることは、このアプローチが「ラボオンチップ」装置および専用の完全自動化リアルタイムＰＣＲ機器などの新興技術への適合に特に馴化し易いことを意味する。マイクロ流体力学における急速に進歩する技術革新と組み合わせると、本発明の方法は、「ポイント・オブ・ケア」の診断に適する装置への転換に適する。
【実施例2】
【0388】
本発明の有用性を実証するために、２００個の血液培養陽性患者試料を、標準の臨床微生物学および本発明の方法の両方によって調査した。
【0389】
標準の臨床微生物学試験は、ＢａｃＴＡｌｅｒｔシステムを利用し、続いて細菌種同定のためのＭＡＬＤＩ生物型特定方法によって、ルーチンの血液培養手順によって実験室で実行した。これは、ＢａｃＴＡｌｅｒｔ血液培養ボトルを自動連続モニタリングインキュベーションに入れ、５～７日間インキュベートすることを含んだ。血液培養ボトルが陽性であることがわかると（最低１２時間のインキュベーション）、ボトルをＢａｃＴＡｌｅｒｔ機器から取り出し、増殖培地のアリコートを取り出して細菌培養寒天プレートの上に継代培養した。アガープレートを３７℃で少なくとも４時間、または可視的増殖が出現するまでインキュベートする。その後、単一の細菌コロニーを標的プレートの上に置き、マトリックス溶液を加える。プレートを生物型特定機器に挿入し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦスペクトルをソフトウェアによって生成させる。細菌の同定を提供するために、このスペクトルを参照ライブラリーと比べる。この方法のための合計時間は、およそ１６～１８時間である。標準の臨床微生物学試験は、Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄによって実行された。
【0390】
本発明によって使用する方法においては、ＢａｃＴＡｌｅｒｔ血液培養機での５日間のインキュベーションの後に１００個の血液培養陰性試料から血液培養液（１ｍＬ）を採集し、抽出まで４℃で保存した。血液培養液（１ｍＬ）は、Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ＱｕｅｅｎｓｌａｎｄのＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔのスタッフによって２００個の血液培養陽性試料からも採集され、ＤＮＡ抽出まで４℃で保存された。１ｍＬの試料からの宿主ＤＮＡの除去、病原体富化およびＤＮＡ抽出を可能にするＭｏｌＹｓｉｓ（商標）コンプリート５キット（Ｍｏｌｚｙｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、全ての試料（血液培養陰性および血液培養陽性）から微生物ＤＮＡを単離した。
【0391】
全部で３００個のＤＮＡ抽出物を、以下の通りにリアルタイムＰＣＲフォーマットを使用した試験に付した：１マイクロリットルの抽出したＤＮＡ（１～３ｎｇ）を、１０μｌの２×ＳＹＢＲグリーンＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）および８ｐｍｏｌの各プライマーを含有する１９μｌの反応ｍａｓｔｅｒｍｉｘに加えた。これらの反応のための温度サイクルは、以下の通りだった：５０℃で２分間、９５℃で２分間、その後、９５℃で１５秒、５２℃で２０秒および７２℃で３５秒、７２℃で２分間の保持、５０℃で２０秒の保持のサイクルを４０サイクル、ＨＲＭ：ＨＲＭ：０．０５℃ずつ上昇する６５℃から９５℃への傾斜（ＲｏｔｏｒＧｅｎｅＱ、Ｑｉａｇｅｎ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）。適切な対照（鋳型なし（ＮＴＣ）および試験した各細菌種のための細菌参照ＤＮＡからなる陽性対照）を含め、全ての試料は２反復で実行した。結果までの時間は、±３．５時間であると記録された。
【0392】
結果を表にして、試験の終わりにＰａｔｈｏｌｏｇｙ Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄから得た血液培養微生物学結果と関連付けた。
【0393】
結果
試験の結果を表１２に示す。
試験の結果を表１２に示す。
【0394】
【表12】
【0395】
好都合にも、本発明の方法は、臨床微生物学結果と比較したとき、９９％の特異性を得ることができた（しかし、臨床微生物学および本発明の方法が異なる結果を得た２つの試料については、どちらの方法が誤った結果をもたらしたか不明である）。本発明の方法は、約３．５時間以内に、かつ、患者試料の最小限の処理で結果を得ることができた。対照的に、臨床微生物学結果は患者試料のより多大な処理を必要とし、得るのに約１６～１８時間を要した。
【0396】
引用文献
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