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特許7378088ｈＥＲＧ１およびｈＥＲＧ１／インテグリンβ１に結合する単一特異性および二重特異性抗体
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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-11-02
(45)【発行日】2023-11-13
(54)【発明の名称】ｈＥＲＧ１およびｈＥＲＧ１／インテグリンβ１に結合する単一特異性および二重特異性抗体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20231106BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20231106BHJP
C07K 16/30 20060101ALI20231106BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20231106BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20231106BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20231106BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20231106BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20231106BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231106BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20231106BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20231106BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231106BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13 ZNA
C07K16/46
C07K16/30
C07K16/28
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/08
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61P35/00
【請求項の数】
19
(21)【出願番号】P 2020524672
(86)(22)【出願日】2018-06-29
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-11-26
(86)【国際出願番号】 EP2018067641
(87)【国際公開番号】W WO2019015936
(87)【国際公開日】2019-01-24
【審査請求日】2021-06-24
(31)【優先権主張番号】102017000083637
(32)【優先日】2017-07-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】IT
(73)【特許権者】
【識別番号】505303934
【氏名又は名称】ユニヴァーシタ’デグリ ステュディ ディ フィレンツェ
(73)【特許権者】
【識別番号】520023558
【氏名又は名称】ディ．ヴィ．エー．エル． トスカーナ エス．アール．エル．
(74)【代理人】
【識別番号】100166338
【弁理士】
【氏名又は名称】関口 正夫
(72)【発明者】
【氏名】アルカンゲリ アンナローザ
(72)【発明者】
【氏名】ドゥランティ クラウディア
(72)【発明者】
【氏名】カッラレシ ローラ
(72)【発明者】
【氏名】クレスチオーリ シルヴィア
【審査官】鈴木 崇之
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１６／０２０４８３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１７－５０１１８５（ＪＰ，Ａ）
【文献】β1integrin/hERG1 complex as a novel molecular target for antineoplastic therapy，ABCD CONGRESS 2011 RAVENNA，2011年09月08日，p. 58, P1.51
【文献】The Journal of Biological Chemistry，1994年02月25日，Vol. 269, No. 8，pp. 6124-6132
【文献】The complex between the beta1 integrin and hERG1 potassium channels as a new molecular target in antineoplastic therapy，European Journal of Cancer Supplements，Vol. 8, No. 5，p. 59, 225
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １６／００－１６／４６
Ｃ１２Ｐ ２１／０８
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗ｈＥＲｇ１及び抗β１インテグリン二重特異性抗体（Ａｂ）であって、ｈＥＲＧ１の細胞外Ｓ５－Ｐドメインに結合する抗ｈＥＲＧ１ Ａｂの重鎖可変（ＶＨ）ドメインおよび軽鎖可変（ＶＬ）ドメインと、β１インテグリンの細胞外ドメインに結合する抗β１インテグリンＡｂの重鎖可変（ＶＨ）ドメインおよび軽鎖可変（ＶＬ）ドメインとを含み、前記抗ｈＥＲＧ１ Ａｂの重鎖可変（ＶＨ）ドメインは、９５位の残基がＣｙｓである配列番号８を有し、前記抗ｈＥＲＧ１ Ａｂの軽鎖可変（ＶＬ）ドメインは、配列番号４を有し、前記抗β１インテグリンＡｂの重鎖可変（ＶＨ）ドメインは、配列番号２６または配列番号４６を有し、抗β１インテグリンＡｂの軽鎖可変（ＶＬ）ドメインは、配列番号２４または配列番号４８を有する二重特異性抗体（Ａｂ）。
【請求項2】
タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディフォーマット、一本鎖ダイアボディ、タンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ）および二重親和性再標的化分子（ＤＡＲＴ）からなる群において選択されるフォーマットを有する請求項１に記載の二重特異性Ａｂ。
【請求項3】
９５位の残基がＣｙｓである配列番号８を有する第１の重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、配列番号４を有する第１のＶＬドメイン、配列番号２６を有する第２のＶＨドメイン、および配列番号２４を有する第２のＶＬドメインを含む請求項２に記載の二重特異性Ａｂ。
【請求項4】
ドメインが、抗ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ ＶＬドメインに第３のリンカーによって連結されている抗β１－インテグリンＶＨドメインに第２のリンカーによって連結されている抗β１－インテグリンＶＬドメインに第１のリンカーによって連結されている抗ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ ＶＨドメインの順序で組み立てられている請求項３に記載の二重特異性Ａｂ。
【請求項5】
９５位の残基がＣｙｓである配列番号８を有する重鎖可変（ＶＨ）ドメインと、配列番号４を有する軽鎖可変（ＶＬ）ドメインとを含み、細胞外Ｓ５－Ｐ ｈＥＲＧ１ドメインに対して特異性を有する抗ｈＥＲＧ１抗体（Ａｂ）分子。
【請求項6】
完全にヒト化された組換えＡｂ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ダイアボディ、トリアボディ、バイスペシフィック、ミニボディまたはファージディスプレイ抗体である請求項５に記載の抗ｈＥＲＧ１抗体（Ａｂ）分子。
【請求項7】
ＶＨおよびＶＬがペプチドリンカーによって連結されている請求項６に記載の抗ｈＥＲＧ１抗体（Ａｂ）分子。
【請求項8】
リンカーが（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３モチーフである請求項４に記載の二重特異性Ａｂまたは請求項７に記載の抗ｈＥＲＧ１抗体（Ａｂ）分子。
【請求項9】
配列番号１０を有する請求項５から請求項８のいずれか一項に記載の抗ｈＥＲＧ１抗体（Ａｂ）分子。
【請求項10】
フルオロフォアまたは放射性核種で標識されている請求項５から請求項９のいずれか一項に記載の抗ｈＥＲＧ１抗体（Ａｂ）分子。
【請求項11】
医薬として、または治療のツールとして使用するための請求項１から請求項４及び請求項８のいずれか一項に記載の二重特異性Ａｂまたは請求項５から請求項１０のいずれか一項に記載の抗体（Ａｂ）分子。
【請求項12】
ｈＥＲＧ１タンパク質の過剰発現または誤発現によって特徴づけられる全ての病理の治療または診断において使用するための請求項１１に記載の使用のための二重特異性ＡｂまたはＡｂ分子。
【請求項13】
ｈＥＲＧ１タンパク質の過剰発現または誤発現によって特徴づけられる前記病理が腫瘍、神経疾患、内分泌疾患及び神経内分泌疾患よりなる群から選択される、請求項１２に記載の二重特異性ＡｂまたはＡｂ分子。
【請求項14】
請求項１から請求項４及び請求項８のいずれか一項に記載の二重特異性Ａｂまたは請求項５から請求項１０のいずれか一項に記載の抗ｈＥＲＧ１抗体（Ａｂ）分子と、少なくとも別の薬学的に許容される成分とを含む医薬組成物。
【請求項15】
請求項１から請求項４及び請求項８のいずれか一項に記載の二重特異性Ａｂまたは請求項５から請求項１０のいずれか一項に記載のＡｂ分子をコードするヌクレオチド配列を有するヌクレオチド。
【請求項16】
請求項１５に記載のヌクレオチドの配列を含む発現ベクターまたはプラスミド。
【請求項17】
請求項１６に記載の発現ベクターまたはプラスミドを含む遺伝子改変微生物または細胞。
【請求項18】
同時、別々、または連続使用のための部品のインビトロ診断キットであって、前記キットは、ｈＥＲＧ１タンパク質の過剰発現または誤発現によって特徴づけられる病理の診断用であり、
請求項５から請求項１０のいずれか一項に記載の抗ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ Ａｂ分子を含有する容器、または
請求項１から請求項４及び請求項８のいずれか一項に記載の二重特異性Ａｂを含有する容器
を含むインビトロ診断キット。
【請求項19】
参照対照として、インタクトなモノクローナル抗ｈＥＲＧ１ Ａｂを含有する容器を更に含む請求項１８に記載のインビトロ診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗体の分野、ならびに腫瘍学および医学の他の分野における診断および治療目的のためのそれらの適用に関する。特に、本発明は、ｈＥＲＧ１およびβ１インテグリンの両方を標的とする二重特異性抗体を含む、抗ｈＥＲＧ１分子およびそれらの操作された誘導体に関する。
【背景技術】
【0002】
過去２０年間にわたり、抗体の製造技術は、抗体工学によって著しく改善されてきた。分子工学の分野における新しい技術の出現は、Ｆａｂ型のフラグメント、単鎖（ｓｉｍｐｌｅ ｃｈａｉｎ）のＦｖ形態ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、バイスペシフィック（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）、ミニボディ、ナノボディ、ファージ抗体のような多種多様な遺伝子工学的に操作された抗体の製造を導いた。実際に、Ｆｃ媒介効果の関連する毒性効果、およびそのＦｃが非ヒト供給源に由来する場合、抗体効力を中和することができる免疫反応を誘発するそれらの能力のため、Ｆｃ媒介効果が必要とされず、さらには望ましくない適用範囲が存在する。
【0003】
操作された抗体フラグメントの中で、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、最も一般的であり、抗原結合活性機能を有し、免疫学的適用のために容易に管理可能である特性を有する最小の組換えフォーマットの１つである。
【0004】
ｓｃＦｖは、重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域からなり、これらは、ＶＨ－ＶＬ対合部位および抗原結合部位の忠実度を損なうことなく、可撓性ペプチドリンカーによって一緒に連結される。リンカーの選択は、ｓｃＦｖの溶解度、発現および正しいフォールディングに影響を及ぼすことができる。ペプチドリンカーは、１０～２５アミノ酸長で変化し得、そして典型的には、グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）等の親水性アミノ酸から構成される。親水性配列は、タンパク質フォールディング全体を通して、可変ドメイン内または可変ドメイン間のペプチドのインターカレーションを妨げる。使用される最も一般的なリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３モチーフであり、これは、その柔軟性、中性電荷および溶解性のためである。診断および治療におけるｓｃＦｖの使用は、特に固形腫瘍の治療において、抗体全体に勝るいくつかの利点を提供する。実際、完全な分子に対するフラグメントによる浸透の速度は、最も顕著な利点である。１９８８年に、ＩｇＧの完全な分子が固形腫瘍に１ｍｍ浸透するのに５４時間かかったが、Ｆａｂ断片は１６時間で同じ距離を対処したことが明らかにされた。さらに、ｓｃＦｖ、ならびに全ての他の抗体フラグメントフォーマットは、多価および多重特異性試薬に形作られ得るか、または放射性核種、毒素もしくはナノ粒子として治療ツールに容易に連結され得、そしてそれらの診断用効力および治療効力を改善するように操作され得る。
【0005】
これらの操作された分子は、細菌系または酵母系において容易に産生され、さらに、より効率的に溢出し、そして全長Ｉｇよりも高い組織浸透能力を有する。これらの分子の唯一の限界は、それらの小さいサイズのための短い半減期である。薬物動態を改善するために多くの戦略が開発されており、その例としては、トリアボディ（約９０ｋＤａ）およびテトラボディ（約１２０ｋＤａ）を形成するためのｓｃＦｖの多量体化（それらのリンカー配列を短縮する）、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（Ｎａｔａｒａｊａｎら、２００５）またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの大分子への抗体の結合などがある。
【0006】
二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）は、下記のいくつかの利点を提供するので、有望な癌治療剤として最近多くの注目を集めている。
－ ｂｓＡｂは特異的免疫細胞を腫瘍細胞に向け直すことができ、その結果、癌死滅を増進させることができる、
－ ｂｓＡｂは、病原性においてユニークな、または重複する機能を遂行する異なる経路で、２つの異なる標的を同時にブロックすることができる、
－ ｂｓＡｂは、１つではなく２つの異なる細胞表面抗原と相互作用することにより、潜在的に結合特異性を増加させることができる。
－ ｂｓＡｂは特異的免疫細胞を腫瘍細胞に向け直すことができ、その結果、癌死滅を増進させることができる、
－ ｂｓＡｂは、病原性においてユニークな、または重複する機能を遂行する異なる経路で、２つの異なる標的を同時にブロックすることができる、
－ ｂｓＡｂは、１つではなく２つの異なる細胞表面抗原と相互作用することにより、潜在的に結合特異性を増加させることができる。
【0007】
二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）の開発は、主に製造上の問題、不十分な収率、不安定性および免疫原性に起因して、多くの困難を経験している（Ｓｐｉｅｓｓ Ｃ．ら、２０１５）。
【0008】
ｂｓＡｂの製造方法について、ｂｓＡｂは主に以下の３つの方法で作成されている。
－ ２つの異なるハイブリドーマ細胞株の体細胞融合に基づくクアドローマ技術、
－ 化学的架橋剤の使用による化学的結合、
－ 組換えＤＮＡ技術を利用した遺伝子的アプローチ。
－ ２つの異なるハイブリドーマ細胞株の体細胞融合に基づくクアドローマ技術、
－ 化学的架橋剤の使用による化学的結合、
－ 組換えＤＮＡ技術を利用した遺伝子的アプローチ。
【0009】
二重特異性抗体は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）様分子および非ＩｇＧ様分子の２つの主要なサブグループに大別することができ、これまでに、臨床開発中の３０を超えるｂｓＡｂが存在し、２つ、カツマキソマブおよびブリナツモマブ、が市場で既に承認されている。
【0010】
非ＩｇＧ様には、主にｓｃＦｖベースのｂｓＡｂおよびナノボディが含まれる。ｓｃＦｖは、リンカー長、抗体配列および他の因子に依存して、二量体、三量体、または四量体になり得ることが知られている（Ｌｅ Ｇａｌｌ Ｆ．ら、１９９９）。このようなフォーマットが好まれており、多くの可能な臨床応用がある。ｓｃＦｖベースのｂｓＡｂフォーマットの中には、以下のものがある。
－ タンデムｓｃＦｖは、タンデム配向のグリシン－セリン反復モチーフなどの柔軟なペプチドリンカーによって連結された２つのｓｃＦｖからなる。有名な二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）技術は、このフォーマットに基づく（Ｃｈａｍｅｓ Ｐ．ら、２００９）。
－ ２つの異なる抗体の可変ドメインが２つのリンカーによって連結されているダイアボディフォーマット。これらは、ダイアボディの安定性を増大させる機能を有する。
－ 一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）。上記ダイアボディフォーマットは、鎖間に追加の連結リンカーを付加することによって一本鎖ダイアボディに変換することができる。
－ タンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ）は、単一のポリペプチド鎖に連結された二対のＶＬおよびＶＨドメインによって形成され、４価のＴａｎｄＡｂを形成する。
－ 二重親和性再標的化分子（ＤＡＲＴ）。ＤＡＲＴは、第２鎖上のＶＬに連結された第１可変領域のＶＨと、第１鎖上のＶＬに連結された第２可変領域のＶＨとの、ＶＬＡ－ＶＨＢ＋ＶＬＢ－ＶＨＡ構成の会合によって作製される。それらの小さいサイズのために、ＤＡＲＴは排出される傾向がある（Ｍｏｏｒｅ Ｐ．Ａ．ら、２０１１）。
－ タンデムｓｃＦｖは、タンデム配向のグリシン－セリン反復モチーフなどの柔軟なペプチドリンカーによって連結された２つのｓｃＦｖからなる。有名な二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）技術は、このフォーマットに基づく（Ｃｈａｍｅｓ Ｐ．ら、２００９）。
－ ２つの異なる抗体の可変ドメインが２つのリンカーによって連結されているダイアボディフォーマット。これらは、ダイアボディの安定性を増大させる機能を有する。
－ 一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）。上記ダイアボディフォーマットは、鎖間に追加の連結リンカーを付加することによって一本鎖ダイアボディに変換することができる。
－ タンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ）は、単一のポリペプチド鎖に連結された二対のＶＬおよびＶＨドメインによって形成され、４価のＴａｎｄＡｂを形成する。
－ 二重親和性再標的化分子（ＤＡＲＴ）。ＤＡＲＴは、第２鎖上のＶＬに連結された第１可変領域のＶＨと、第１鎖上のＶＬに連結された第２可変領域のＶＨとの、ＶＬＡ－ＶＨＢ＋ＶＬＢ－ＶＨＡ構成の会合によって作製される。それらの小さいサイズのために、ＤＡＲＴは排出される傾向がある（Ｍｏｏｒｅ Ｐ．Ａ．ら、２０１１）。
【0011】
ダイアボディおよびｓｃＤｂはまた、２つの異なる抗原に結合することができ、したがって細胞を架橋する（例えば、免疫系エフェクター細胞を再標的化する）、エフェクター分子（毒素、薬物、サイトカイン、放射性同位体、または補体系など）を補充する、キャリア系（遺伝子治療のためのウイルスベクターなど）を再標的化する（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ２００５）、腫瘍進行に関与する高分子複合体を標的化および阻害するのに有用な、二重特異性抗体フラグメントを生成する最も有効な方法である。
【0012】
抗体工学はまた、結合力（例えば、抗体フラグメントの多量体化）、親和性（例えば、全Ｉｇまたは抗体フラグメントの可変領域における変異）、およびエフェクター機能（例えば、全Ｉｇの定常領域における変異、または組換えＦｃ、毒素、薬物、サイトカイン、デスリガンド、放射性同位体、ナノ粒子または補体系分子との抗体フラグメントの結合）を増大させるための方法を提供した。
【0013】
過去３０年間にわたり、ヒトｅｔｈｅｒ－ａ－ｇｏ－ｇｏ関連遺伝子１（ｈＥＲＧ１）カリウムチャネル（ヒト遅延整流性カリウムイオンチャネル遺伝子１）は、腫瘍学および他のヒト疾患における標的となっている。しかし、治療目的のためのその利用は、それらの一次作用または副作用としてｈＥＲＧ１遮断を引き起こすほとんどの薬物が心毒性（心電図ＱＴ間隔の延長および心室性不整脈の発症）を引き起こし得るという事実によって妨げられてきた。心臓において発現されるｈＥＲＧ１を癌細胞および他の疾患特徴細胞において発現されるｈＥＲＧ１と区別する生物物理学的および生体分子的特徴の探索において、ｈＥＲＧ１は、癌細胞の原形質膜上で、他の原形質膜タンパク質、特にインテグリン受容体のβ１サブユニットと複合体を形成することが見出された。このような複合体は、心筋細胞においては生じない（Ｂｅｃｃｈｅｔｔｉ Ａ．ら、Ｓｃｉ．Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，１０（４７３）．ｐｉｉ：ｅａａｆ３２３６．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｓｉｇｎａｌ．ａａｆ３２３６．ＰＭＩＤ：２８３７７４０５，２０１７）。したがって、ｈＥＲＧ１／β１インテグリン複合体は、腫瘍中のｈＥＲＧ１を心臓で発現されるチャネルから識別するという事実により、発癌性ユニットとして形質転換細胞に特有のものを構成する。この発見は、ｈＥＲＧ１／β１インテグリン複合体を標的とする任意の分子（小分子薬物、または低分子ではなくタンパク質）が、心毒性を欠く診断および治療目的のために使用され得ることを意味する。現在、ｈＥＲＧ１／β１インテグリン複合体を標的とすることができる分子は知られていない。
【0014】
伊国特許第１３６７８６１号明細書には、ｈＥＲＧ１のＳ５細孔細胞外部分に対して特異的な抗ｈＥＲＧ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を分泌することができる、Ａ７と命名されたハイブリドーマ細胞系クローンが記載されている。
【0015】
国際公開第２０１６０２０４８３（Ａ１）号パンフレットは、ｍＡｂ抗ｈＥＲＧ１ ＶＨおよびＶＬの単離後に得られる、インタクトなマウスモノクローナル抗ｈＥＲＧ１分子の詳細な構造および対応する抗ｈＥＲＧ１ ｓｃＦｖ抗体の産生を記載する。このようなｓｃＦｖは、対応する全抗体と同じ特異性を有し、したがって、腫瘍および他の疾患において異常に発現される同じ抗ｈＥＲＧ１タンパク質を認識することができる。ＶＨ（配列番号２）およびＶＬ（配列番号４）をそれぞれコードするヌクレオチド配列、配列番号１および配列番号３が、配列番号６を有するｓｃＦＶをコードするヌクレオチド配列、配列番号５と共に開示された。
【0016】
当技術分野では、研究目的のために、例えば、抗β１インテグリンｍＡｂが、とりわけ、ＴＳ２／１６（Ａｒｒｏｙｏら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９２，１１７（３），６５９－６７０）およびＢＶ７（Ｍａｒｔｉｎ－Ｐａｄｕｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９４，２６９（８），６１２４－６１３２）が公知である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0017】
【文献】伊国特許第１３６７８６１号明細書
【文献】国際公開第２０１６０２０４８３（Ａ１）号パンフレット
【非特許文献】
【0018】
【文献】Ｂｅｃｃｈｅｔｔｉ Ａ．ら、Ｓｃｉ．Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，１０（４７３）．ｐｉｉ：ｅａａｆ３２３６．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｓｉｇｎａｌ．ａａｆ３２３６．ＰＭＩＤ：２８３７７４０５，２０１７
【文献】Ａｒｒｏｙｏら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９２，１１７（３），６５９－６７０
【文献】Ｍａｒｔｉｎ－Ｐａｄｕｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９４，２６９（８），６１２４－６１３２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0019】
本発明の目的は、癌細胞の原形質膜上に複合体化されたｈＥＲＧ１およびβ１インテグリンタンパク質の両方を同時に標的とする二重特異性抗体を提供することである。本発明のさらなる目的は、ｈＥＲＧ１に対する改善された、または少なくとも代替の抗体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0020】
本発明の主題は、ｈＥＲＧ１の細胞外ドメインＳ５－Ｐに結合する抗ｈＥＲＧ１ Ａｂの重鎖可変（ＶＨ）ドメインおよび軽鎖可変（ＶＬ）ドメインと、β１インテグリンの細胞外ドメインに結合する抗β１インテグリンＡｂの重鎖可変（ＶＨ）ドメインおよび軽鎖可変（ＶＬ）ドメインとを含む二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）である。
【0021】
驚くべきことに、本発明によるｂｓＡｂは、腫瘍細胞にのみ存在する複合体ｈＥＲＧ１＋β１－インテグリンに選択的に結合することができることが見出された。特に、本発明によるｂｓＡｂは、インビトロで、新生物細胞系のパネル上で細胞増殖および遊走性、転移促進活性を阻害する能力を示した。
【0022】
一態様では、本発明はまた、９５位の残基がＣｙｓである配列番号８と少なくとも８５％の同一性を有する重鎖可変（ＶＨ）ドメインと、配列番号４と少なくとも８５％の同一性を有する軽鎖可変（ＶＬ）ドメインとを含む抗ｈＥＲＧ１分子に関し、上記分子はｈＥＲＧ１ Ｓ５細孔細胞外部分に対して特異性を有する。
【0023】
驚くべきことに、本発明による抗ｈＥＲＧ１分子（抗ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ）であって、ＶＨドメイン（配列番号８）の９５位にＣｙｓを有する抗ｈＥＲＧ１分子は、ＶＨドメイン（配列番号２）の９５位にＰｈｅを有する当技術分野で公知の分子と比較して、固定化抗原に対してより良好な親和性を示すことが見出された。特に、本発明によるｓｃＦｖ分子は、腫瘍性細胞系のパネル上で細胞増殖をインビトロで阻害する能力を示した。
【図面の簡単な説明】
【0024】
【図1】ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１構築物上で行われた突然変異誘発後の４つのコロニーのＤＮＡ配列決定から得られたエレクトロフェログラムであり、ＰｈｅからＣｙｓへの適切な突然変異を示す。
【図2】（Ａ）：ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１の酵母発現。２４時間、４８時間および７２時間でのｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｇ３ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ）クローンの誘導から収集した上清上のスロットブロット。クローンＣ７、Ｃ１２、Ｄ９、Ｅ８、Ｇ３、Ｇ７および非形質転換ピキア株ＧＳ１１５の陰性対照をすべて分析した。染色はＤＡＢクロモゲンを用いて行った。Ｇ３は、最良に発現するものであることが示されている。（Ｂ）：６つのクローンの精製試料に対して行われたウェスタンブロット。Ｇ３は最も高い発現レベルを示したが、Ｇ７クローンではほとんど発現は検出されなかった。（Ｃ）ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓピキア・パストリスクローンの誘導から２４時間、４８時間および７２時間で回収した上清上のスロットブロット。クローンＢ１１、Ｃ３、Ｄ８、Ｄ９、Ｇ４、Ｇ１０および非形質転換ピキア株ＧＳ１１５の陰性対照をすべて分析した。染色はＤＡＢクロモゲンを用いて行った。Ｄ８は、最良に発現するものであることが示されている。（Ｄ）：６つのクローンの精製試料に対して行われたウェスタンブロット。Ｄ８は、最も高い発現レベルを示したものであり、一方、より低い発現がＣ３クローンについて検出された。
【図3】（Ａ）精製されたｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｇ３およびｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓ溶出分画（Ｆｒ）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ、（Ｂ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ＨＲ １０／３０を用いた両方の精製された抗体のゲル濾過クロマトグラフィー。（Ｃ）ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓ抗体安定性試験。ＳＤＳ－Ｐａｇｅ、続いてクーマシーブリリアントブルー染色を、異なる時点（タンパク質精製後０ヶ月、６ヶ月、１２ヶ月および１８ヶ月）で写真に報告する。
【図4】（Ａ）非標識ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｇ３抗体（Ｉ．ＩＦ）および標識ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｇ３抗体（Ｄ．ＩＦ）の両方を用いて、固定および生のＨＥＫ２９３ＭｏｃｋおよびＨＥＫ２９３－ｈＥＲＧ１細胞に対して行った免疫蛍光。２０倍の倍率で撮影した代表的な画像であり、核染色を青色蛍光で表し、膜染色を緑色染色（Ａｌｅｘａ４８８）で表す。（Ｂ）非標識ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８－Ｃｙｓ抗体（Ｉ．ＩＦ）および標識ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８－Ｃｙｓ抗体（Ｄ．ＩＦ）の両方を用いて、固定および生のＨＥＫ２９３－ＭｏｃｋおよびＨＥＫ２９３－ｈＥＲＧ１細胞に対して行った免疫蛍光法。２０倍の倍率で撮影した代表的な画像であり、核染色は青色蛍光によって表され、膜染色は緑色染色（Ａｌｅｘａ４８８）によって表される。（Ｃ）Ｉｍａｇｅ Ｊ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＩｍａｇｅＪ １．３８、Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）を用いて計算したＩＦ強度（Ａ．Ｕ．）を示すグラフ。各画像について、３つの異なる領域の蛍光強度の平均を、青色チャネル値（核染色を指す）の減算後に計算した。全ての実験において、ＨＥＫ２９３－ｈＥＲＧ１についての結果は、ＨＥＫ２９３－Ｍｏｃｋについて得られた結果と比較して有意に高かった。Ｓｈａｐｉｒｏ－Ｗｉｌｋ検定を適用して、データの正常性およびホモスケダスチシティ（等分散性）の仮定を評価する統計分析を実施し、一方、分散をＡｎｏｖａを通して分析した。対（ペアワイズ）有意性は、ｔ検定またはＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定を適用して推定した（＊ ｐ＜０．０５）。
【図5】図５は、抗ｈＥＲＧ１モノクローナル抗体（１００μｇ／ｍｌ）およびｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓ（１０；２０μｇ／ｍｌ）を用いて、ＨＣＴ－１１６、ＭＤＡ ＭＢ－２３１、ＭＩＡ ＰＡＣＡ２、ＨＥＫ２９３ ＨＥＲＧ１、ＨＥＫ－ＭＯＣＫ、ＦＬＧ２９．１、ＰＡＮＣ－１、ＢｘＰＣ－３で行ったトリパンブルー生存率アッセイ。すべての実験を３回行った。
【図6】パネルＡ：ＨＥＫ２９３ ＨＥＲＧ１スフェロイド１０、２０および４０μｇ／ｍｌ ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓを試験した。２０μｇ／ｍｌおよび４０μｇ／ｍｌのｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓで処理したスフェロイドの体積は、各時点において対照（実線）と比較して小さい（それぞれ点線および一点鎖線を参照）。代わりに、パネルＢは、ＨＥＫ－ＭＯＣＫ（ｈＥＲＧ１を発現しない）スフェロイドの成長曲線を示し、対照と比較して、試験した３つの濃度のｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓの全てにおいて、処理したスフェロイドについて差異は見出されなかった。パネルＡおよびＢはまた、７２時間の培養後に出現した対照ＨＥＫ２９３－ｈＥＲＧ１およびＨＥＫ－ＭＯＣＫスフェロイドの代表的な明視野画像をそれぞれ示す。パネルＣ。膵管腺癌スフェロイド。パネルＣは、膵管腺癌Ｍｉａ Ｐａｃａ２細胞に対して得られた効果を示す。２０μｇ／ｍｌおよび４０μｇ／ｍｌのｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓで処理した細胞の両方について、スフェロイドの体積の減少が観察され、各時点で、対照と比較して試験した最高濃度（一点鎖線）でより顕著な効果が得られた。また、パネルの右側に報告される７２時間後に撮られた写真は、対照（左画像を参照のこと）と比較して、４０μｇ／ｍｌのｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓ抗体で処理された細胞（右画像を参照のこと）についてのスフェロイド体積の実質的な減少を示す。パネルＤ：乳癌細胞、ＭＤＡ－ＭＢ２３１スフェロイド：対照と比較して、試験したｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓの３つの濃度（１０、２０、４０μｇ／ｍｌ）の全てについて、体積減少の顕著な効果が観察される。体積減少は、図の右側に報告されたＭＤＡ－ＭＢ２３１スフェロイドの写真からも推測することができる。
【図7】７２時間後にスフェロイドについて行ったカルセインＡＭ細胞生存率アッセイ。緑色染色は生細胞を表し、赤色染色は死細胞を表す。左側の画像（パネルＡ）は、各細胞株についての対照の画像であり、一方、右側の画像（パネルＢ）は、４０μｇ／ｍｌのｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓで処理されたスフェロイドの写真である。画像から、上記抗体で処理されたスフェロイド、特にＭｉａ Ｐａｃａ２、ＭＤＡ ＭＢ－２３１およびＰＡＮＣ－１スフェロイドについての体積減少、さらに、特にｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓで処理されたＭＤＡ ＭＢ－２３１およびＰＡＮＣ－１スフェロイドについての死細胞数の増加に注目することが可能である。
【図8A】抗ｂ１－インテグリン（ＴＳ２／１６）ＶＬドメインおよびＶＨドメインのヌクレオチド配列（配列番号２３および配列番号２５）は、自動ＤＮＡ配列決定サービス（ＰＲＩＭＭ）によって得られた。斜体で下線を引いたものは、ＶＬ配列、斜体ＶＨ配列を示す。
【図8B】抗ｂ１－インテグリン（ＢＶ７）ＶＬドメインおよびＶＨドメインのヌクレオチド配列（配列番号４５および配列番号４７）。単一ドメインを単離するために使用されるプライマーが太字で報告され、一方、未知であるが、正しいフレームのために必要となるＶＨ配列の領域が灰色で強調されて報告されている。
【図9】上部パネル：２つの一本鎖抗体、抗ｈＥＲＧ１および抗ＴＳ２／１６の概略構造。下のパネル：ｓｃＤｂ－ｈＥＲＧ１－β１の概略構造。
【図10】ＶＬ－リンカー－ＶＨの順序で、抗ｂ１－インテグリンｓｃＦｖアセンブリのＳＯＥ－ＰＣＲ法を表すスキーム。
【図11】パネルＡは、抗ｈＥＲＧ１－Ｐｈｅ－β１－ｓｃＤｂ構築物での形質転換後に増殖させた６つのクローンの小スケール誘導に由来する精製上清のクーマシー染色を示す。１つのバンドは、約６０ＫＤａの分子量を有するクローンＧ５に対応して検出可能であり、予想されたものと一致する。パネルＢは、Ｇ５クローンの高スケール発現に由来する上清の精製後に生成されたクロマトグラムを示す。１つの単一ピークが可視であり、青色領域の基礎となる溶出物が分析され、クーマシー染色がパネルＣに報告され、試験したすべての溶出物において適切な分子量を有するバンドを示す。
【図12】パネルＡ。異なる量の抗ｈＥＲＧ１－Ｐｈｅ－β１－ｓｃＤｂ二重特異性抗体を使用して、ＨＥＫ２９３ ＨＥＲＧ１細胞で行った細胞ＥＬＩＳＡからの結果。
【図13(1)】異なる基質、ＢＳＡおよびフィブロネクチン（ＦＢ）上に播種された細胞上で行われた間接ＩＦ。ＩＦは、ＢＳＡ上にコーティングされた細胞について得られたシグナルと比較して、ＦＢ上にコーティングされたＨＥＫ２９３ ＨＥＲＧ１細胞についてより強いシグナルを示す。
【図14(1)】ＨＥＫ２９３ ＨＥＲＧ１細胞（パネルＡおよびＢ）で実施した間接ＩＦ。過剰のＳ５ＰＯＲＯペプチドの投与後の細胞の染色をパネルＤおよびＥに示す。パネルＣは、二次抗体のみで染色された対照細胞を報告する。
【図15】ｓｃＤｂ－ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ－β１の発現および精製。パネルＡ。ピキア・パストリス上清の精製から得られたクロマトグラム。パネルＢ。クロマトグラムの青色ピークの基礎となるｓｃＤｂ－ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ－β１精製からの溶出物の分析を示すクーマシー染色。
【図16】ｓｃＤｂ－ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ－β１－Ａｌｅｘａ４８８による直接ＩＦ。これらの特定の実験において、細胞を、Ａｌｅｘａ４８８フルオロフォアと直接結合したｓｃＤｂ抗体と共にインキュベートした。Ａｌｅｘａ４８８フルオロフォアで直接標識したｓｃＤｂ－ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ－β１抗体と共にインキュベートしたＧＤ２５ＷＴ細胞（ｈＥＲＧ１およびβ１インテグリン発現の両方について陰性）。シグナルは存在しない。パネルＢ。フィブロネクチン（ＦＮ）およびＢＳＡに播種され、ｓｃＤｂ－ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ－β１－Ａｌｅｘａ４８８で染色されたＨＥＫ２９３ ＨＥＲＧ１細胞。棒グラフに示すように、シグナルは、ＢＳＡに播種した細胞（～１０Ａ．Ｕ．）と比較して、ＦＮに播種した細胞ではより高い（～１７Ａ．Ｕ．）。パネルＣ。ＨＥＫ２９３ＷＴ細胞をＦＮおよびＢＳＡに播種し、ｓｃＤｂ－ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ－β１－Ａｌｅｘａ４８８とインキュベートした細胞。シグナルは、ＦＮに播種した細胞（～１２Ａ．Ｕ．）と比較して、ＢＳＡに播種した細胞（～７Ａ．Ｕ．）でより低い。パネルＢおよびＣから推論され得るように、蛍光値は、ＦＮ上に播種されたＨＥＫ２９３ＷＴ細胞（～１２Ａ．Ｕ．）と比較して、ＦＮ上のＨＥＫ２９３ ＨＥＲＧ１細胞（～１７Ａ．Ｕ．）についてより低い。
【図17】ＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞およびＰＡＮＣ－１細胞のＩＣ５０決定。細胞生存率に及ぼす影響は、ＰＡＮＣ－１細胞では２４μｇ／ｍｌ、ＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞では４２μｇ／ｍｌで明らかであった。
【図18】ＨＣＴ１１６細胞、ＭＤＡ－ＭＢ２３１ ＨＥＲＧ１細胞、ＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞およびＰＡＮＣ－１細胞に関する側方運動性実験。対照細胞と比較して、ｓｃＤｂ－ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ－β１で処理した細胞において、ＭＩ（運動性指数）の明らかな減少が示される。ＭＤＡ－ＭＢ２３１ ＨＥＲＧ１に関しては、ＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞と比較してより顕著な効果が報告されており、これは、細胞運動性に対するｈＥＲＧ１関連効果を示唆している。ＰＡＮＣ－１細胞で行った側方運動性実験は、対照と比較して、処理細胞でより低いＭＩを示した。ＨＣＴ１１６細胞で行われた側方運動性実験は、対照と比較して、処理細胞でより低いＭＩを示した。
【図19】（Ａ）静脈内投与によるマウスにおけるｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓの薬物動態（ｎ＝２）。抗体濃度は、ｓｃＦｖ注射の５分、１５分、３０分後および１時間、２時間、６時間、２４時間および４８時間後に採取したマウス血液試料の血漿濃度を投与して、ＥＬＩＳＡによって決定した。ｔ１／２＝３．５時間の値は、２つの測定値の平均±標準偏差である。（Ｂ）ＥＣＧ、心電図記録。ＥＣＧ計測は、生理学的溶液、ＰＢＳを注射された対照マウスについて左パネルに報告され、ＱＴ間隔の調整値は８６ｍｓである。右パネルは、ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓの投与後に得られたＥＣＧグラフを示し、対照と比較して有意な変化を示さず、ＱＴ間隔の調整値は９０ｍｓであった。（Ｃ）インビボ分析。各パネルは、ＰＢＳ溶液で処理した対照マウスと比較して、Ａｌｅｘａ７５０と結合したｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓ抗体で処理した代表的なマウスにおける蛍光シグナルを報告する。検出された最大シグナルは注射後１０分にあり、静脈内投与から２４時間後に蛍光シグナルは検出されなかった。（Ｄ）ＰＤＡのＭＩＡＰａＣａ－２－ｎｕ／ｎｕマウスモデルにおけるｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓ－Ａｌｅｘａ７５０の取り込みと保持。マウスは、６．５μｇのｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓ－Ａｌｅｘａ７５０抗体を尾静脈注射により投与された。標識抗体を静脈内注射したマウスの代表的な写真（左）を対照マウス（右）と比較した。腫瘍に近位の部位である腹部における蛍光強度を分析した。蛍光発光スペクトルは、Ｐｈｏｔｏｎ ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏｓｐａｃｅ Ｌａｂ）を用いて測定し、画像は、異なる時点で、５分毎に、注射後５分から注射後６０分まで取得した。
【図20】（Ａ）静脈内投与によるマウスにおけるｓｃＤｂ－ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ－βの薬物動態（ｎ＝２）。抗体濃度は、ｓｃＤｂ注射の５分、１５分、３０分後および１時間、２時間、６時間、２４時間および４８時間後に採取したマウス血液試料の血漿濃度を投与して、ＥＬＩＳＡによって決定した。ｔ１／２～１２時間の値は、２つの測定値の平均値±標準偏差である。（Ｂ）ＥＣＧ、心電図記録。ｓｃＤｂ－ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ－β１抗体の投与後に得られたＥＣＧグラフは、図２０Ｂに報告された対照グラフと比較して有意な変化を示さず、対照に匹敵する８３ｍｓのＱＴ間隔の調整値を有する。（Ｃ）ｓｃＤｂ－ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ－β１抗体で処置したおよび未処置のＭＩＡＰａＣａ－２－ｎｕ／ｎｕ腫瘍保有マウスの膵臓体積（ｍｍ３）を示す表。転移性拡散、スライド中の壊死領域の％および血管数も報告する。（Ｄ）検死解剖後の膵臓の画像：１、未治療；２、３用量のｓｃＤｂ－ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ－β１抗体で処理；３、６用量のｓｃＤｂ－ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ－β１抗体で処理。
【発明を実施するための形態】
【0025】
好ましくは、本発明のｂｓＡｂは、抗ｈＥＲＧ１ Ａｂの重鎖可変（ＶＨ）ドメインが配列番号８または配列番号２と８５％の同一性を有し、抗ｈＥＲＧ１ Ａｂの軽鎖可変（ＶＬ）ドメインが配列番号４と８５％の同一性を有し、抗β１インテグリンＡｂの重鎖可変（ＶＨ）ドメインおよび軽鎖可変（ＶＬ）ドメインがＴＳ２／１６（配列番号２６および配列番号２４）またはＢＶ７（配列番号４６および配列番号４８）のＶＨおよびＶＬと少なくとも８５％の同一性を有するものである。
【0026】
好ましくは、本発明のｂｓＡｂは、非ＩｇＧ様ｂｓＡｂ、好ましくはｓｃＦｖベースのｂｓＡｂである。本発明によれば、ｓｃＦＶベースのｂｓＡｂは、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディフォーマット、一本鎖ダイアボディ、タンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ）および二重親和性再標的化分子（ＤＡＲＴ）、好ましくはｓｃＤｂからなる群において選択されるフォーマットを有する。
【0027】
好ましくは、抗β１インテグリンＡｂのＶＨドメインは、配列番号２６または配列番号４６、より好ましくは配列番号２６と９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を有する。
【0028】
好ましくは、抗β１インテグリンＡｂのＶＬドメインは、配列番号２４または配列番号４８、より好ましくは配列番号２４と９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を有する。
【0029】
好ましくは、抗ｈＥＲＧ１ ＡｂのＶＨドメインは、依然として９５位にアミノ酸Ｃｙｓを保持し、配列番号８と９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を有する。
【0030】
好ましくは、抗ｈＥＲＧ１ ＡｂのＶＨドメインは、配列番号２と９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を有する。
【0031】
好ましくは、抗ｈＥＲＧ１ ＡｂのＶＬドメインは、配列番号４と９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を有する。
【0032】
本発明による抗ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ ＡｂのＶＨドメインは、好ましくは、配列番号７と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の相同性を有するヌクレオチドの配列によってコードされ、ここで、残基２８３～２８５のトリプレットは、ＴＧＴまたはＴＧＣであり得る。
【0033】
本発明による抗ｈＥＲＧ１ ＡｂのＶＨドメインは、好ましくは、配列番号１と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の相同性を有するヌクレオチドの配列によってコードされる。
【0034】
本発明による抗ｈＥＲＧ１ ＡｂのＶＬドメインは、好ましくは、配列番号３と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の相同性を有するヌクレオチドの配列によってコードされる。
【0035】
本発明による分子は、完全にヒト化された組換えＡｂであり得る。
【0036】
本発明による分子は、ｓｃＦｖまたは任意の他の操作された抗体、例えば、Ｆａｂ、単鎖のＦｖ形態ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、バイスペシフィック、ミニボディ、ファージ抗体であり得て、好ましいものはｓｃＦｖおよびダイアボディ（ｓｃＤｂ）である。
【0037】
好ましいリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３モチーフである。
【0038】
ＶＨおよびＶＬがペプチドリンカーによって連結されている抗ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ ｓｃＦｖが特に好ましく、配列番号１０を有する抗ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ ｓｃＦｖがより好ましい。
【0039】
特に好ましいのは、抗ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ ｓｃＦｖおよび抗β１－インテグリンｓｃＦｖを含み、したがって腫瘍細胞にのみ存在する複合体ｈＥＲＧ１＋β１－インテグリンに対して選択的に作用する一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）であるｂｓＡｂである。
【0040】
従って、好ましい態様について、本発明は、９５位の残基がＣｙｓである配列番号８と少なくとも８５％の同一性を有する第１の重鎖可変（ＶＨ）ドメインと、配列番号４と少なくとも８５％の同一性を有する第１のＶＬドメインと、配列番号２６または配列番号４６と少なくとも８５％の同一性を有する第２のＶＨドメインと、配列番号２４または配列番号４８と少なくとも８５％の同一性を有する第２のＶＬドメインとを含むｂｓＡｂ一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）に関し、この二重特異性Ａｂは、ｈＥＲＧ１ Ｓ５細孔細胞外部分およびβ１－インテグリンに対して特異性を有する。
【0041】
本発明によるｂｓＡｂまたは抗ｈＥＲＧ１分子は、診断または治療のツールとして有用である。
【0042】
本発明による診断ツールは、インビトロｈＥＲＧ１検出（例えば、外科的サンプルまたは生検における）のためのものであり、標識されていないかまたはフルオロフォア、好ましくはフルオロフォアＡｌｅｘａ４８８に連結されている抗ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ ｓｃＦｖおよび／または本発明による二重特異性Ａｂ（好ましくはｓｃＤｂとして）を含む。
【0043】
したがって、本発明の主題はまた、同時、別々、または連続使用のための部品のインビトロ診断（ＩＶＤ）キットであり、このＩＶＤキットは、
上記の抗ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ ｓｃＦｖを含有する容器、および／または
上記の二重特異性Ａｂを含有する容器
を含む。
上記の抗ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ ｓｃＦｖを含有する容器、および／または
上記の二重特異性Ａｂを含有する容器
を含む。
【0044】
好ましくは、このＩＶＤキットは、参照対照として、国際公開第２０１６０２０４８３号パンフレットに記載されるようなインタクトなモノクローナル抗体を含有する容器をさらに含む。
【0045】
上記ＩＶＤキットは、免疫組織化学技術（結果は２～３週間で入手可能）のための固定組織試料上、または免疫蛍光技術（結果は１日で入手可能）と共に使用される新しい生検組織（例えば、内視鏡検査または手術によって得られる）上のいずれかで使用され得る。
【0046】
上記の抗ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ ｓｃＦｖは、フルオロフォア（例えば、および好ましくはＡｌｅｘ７５０）または放射性核種（例えば、および好ましくはＴｃ９９）で標識されており、抗ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ ｓｃＦｖによって表されるｈＥＲＧ１陽性癌のインビボ（ヒト）での早期診断に使用するための分子である。本発明による抗ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ ｓｃ－ＦＶ抗体は、癌組織への迅速な浸透、ｈＥＲＧ１バイオマーカーへの迅速な結合、および迅速な排出を可能にする特異的分子構造を有し、これにより、この抗ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ ｓｃ－ＦＶ抗体は、放射性核種に連結される場合、ｈＥＲＧ１陽性癌の早期のインビボ（ヒト）診断を得るための理想的な分子になる。１回の単回投与での使用、および８ｍｇ／ｋｇで静脈内注射した場合に全身毒性がなく、ＥＣＧでの変化がない（図１９を参照のこと）この分子の速い半減期３．５時間は、心臓細胞との相互作用を有さないことを可能にする。最後に、抗ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ ｓｃＦｖは、膵臓に異種移植膵臓癌を保有するマウスに１ｍｇ／ｋｇで静脈内注射した場合、非常に良好な腫瘍／組織比を有することが判明した。
【0047】
治療ツール：治療目的のために癌ｈＥＲＧ１／β１インテグリン分子複合体を阻害するように特に設計された、本発明による二重特異性抗体分子は、癌細胞上でβ１インテグリンと一緒に発現された場合に、心臓との相互作用なしに選択的にｈＥＲＧ１に結合することができる一本鎖二重特異性抗体（一本鎖ダイアボディ、ｓｃＤｂ）である。本発明によるｓｃＤｂは、化学療法、照射、標的療法、および免疫腫瘍学療法に加えられる、単剤ならびに併用療法剤の両方として、早期および進行／転移段階の両方で治療能力を有する、心臓安全性の懸念のない、ｈＥＲＧ１陽性癌を有する患者における反復（慢性）投与のために使用される理想的な分子を表す。併用療法の理論的根拠は、ｈＥＲＧ１／β１インテグリン分子複合体の過剰発現によって癌細胞において構成的に活性化される経路が、利用可能な薬物によって現在標的化されている経路と相補的かつ統合的であることである。さらに、ｈＥＲＧ１／β１インテグリン癌経路は、現在利用可能な治療に関して腫瘍エスケープのメカニズムを表し得る。抗ｈＥＲＧ１／β１インテグリンｓｃＤｂは、約１２時間の半減期を有し、８ｍｇ／ｋｇで静脈内注射された場合、全身毒性を有さず、そしてＥＣＧで変化を有さないことが判明した（図２０を参照のこと）。最後に、抗ｈＥＲＧ１／β１インテグリンｓｃＤｂは、膵臓に異種移植膵臓癌を保有するマウスに週２回、１ｍｇ／Ｋｇで６回注射した場合、非常に良好な治療効果を有することが判明した。
【0048】
本発明によるｂｓＡｂまたは分子を用いて診断または治療することができる病理は、ｈＥＲＧ１タンパク質の過剰発現または誤発現によって特徴づけられる全ての病理である。この病理の中には、腫瘍、神経疾患、内分泌疾患および神経内分泌疾患を挙げることができる。
【0049】
本発明によるｂｓＡｂまたは分子、特に抗ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ ｓｃＦＶまたはｓｃＤｂはまた、医薬送達ベクターとして使用され得、したがって、例えば、それは、放射性核種、酵素、薬物または毒素に共有結合され得るか、または結合され得ない。
【0050】
したがって、本発明のさらなる主題はまた、本発明によるｂｓＡｂまたは分子と、少なくとも別の薬学的に許容される成分とを含む医薬組成物である。
【0051】
本発明のさらなる主題はまた、本発明による二重特異性Ａｂまたは抗ｈＥＲＧ１分子をコードするヌクレオチドの配列である。本発明による分子を得ることを可能にするコード配列との適切なグレードの相同性（例えば、少なくとも８５％）が含まれることが意図される。
【0052】
本発明による分子は、好ましくは、それぞれＶＨ（配列番号８）およびＶＬ（配列番号４）をコードするヌクレオチド配列、配列番号７および配列番号２を使用することによって調製することができる。
【0053】
本発明によれば、本発明による抗ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ ｓｃＦｖを調製するための方法であって、配列番号１０を有する抗ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ ｓｃＦＶをコードするヌクレオチド配列配列、配列番号９の使用を含む方法が特に好ましい。
【0054】
本発明によるｓｃＤｂ－ｈＥＲＧ１－β１は、好ましくは、それぞれ抗ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ ＶＨ（配列番号８）、抗ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ ＶＬ（配列番号４）、抗β１－インテグリンＶＬ（配列番号２４または配列番号４８）、および抗β１－インテグリンＶＨ（配列番号２６または配列番号４６）をコードするヌクレオチド配列、配列番号７、配列番号２、配列番号２３または配列番号４７、および配列番号２５または配列番号４５を用いて調製される。好ましくは、上記ドメインは、以下の順序で組み立てられる：抗ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ ＶＨ（配列番号８）、抗β１－インテグリンＶＬ（配列番号２４または配列番号４８）、抗β１－インテグリンＶＨ（配列番号２６または配列番号４６）および抗ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ ＶＬ（配列番号４）。
【0055】
本発明によれば、本発明によるｓｃＤｂ－ｈＥＲＧ１－β１を調製するための方法が特に好ましく、この方法は、配列番号３０を有する抗ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ ｓｃＦＶをコードする配列番号２９のヌクレオチド配列の使用を含む。
【0056】
本発明による方法は、組換え技術を意味する。
【0057】
したがって、本発明の主題はまた、本発明による二重特異性Ａｂまたは分子をコードするヌクレオチドの配列を含む、好ましくは配列番号７および配列番号２を含む発現ベクターまたはプラスミド、ならびに本発明による発現ベクターを含む遺伝子改変微生物または細胞である。上記の発現ベクターまたはプラスミドはまた、配列番号２３または配列番号４７および配列番号２５または配列番号４５を含み得る。
【0058】
本発明は、以下の実験の項に照らしてより良く理解され得る。
【実施例】
【0059】
実験項
１．ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１突然変異誘発
国際公開第２０１６０２０４８３（Ａ１）号パンフレットに記載されているｓｃＦｖ ｈＥＲＧ１分子のアミノ酸配列は、ＶＨドメインの９５位にアミノ酸Ｐｈｅを提示する。配列番号１のヌクレオチド配列は、ＶＨドメインの２８３位におけるＴ（ｃ２８３Ｔ）の存在を解明した。本発明によれば、ＶＨドメインの２８３位のＴの代わりにＧの置換を導入し（ｃ２８３Ｔ＞Ｇ）、９５位のＰｈｅ（ＴＴＴ）をＣｙｓ（ＴＧＴ）で切り替えた。この突然変異は、フレームワーク３とＣＤＲ３との間の位置に１つのアミノ酸（Ｃｙｓ）の導入をもたらし、これは驚くべきことに、免疫グロブリン可変ドメインにおけるジスルフィド結合の形成の基礎をもたらした。Ｃｙｓを元の構築物に導入し、突然変異誘発プロトコルを設定した（材料および方法を参照のこと）。４つの突然変異誘発ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１コロニーから得られたｃＤＮＡを配列決定し、配列決定結果（図１）は、ｃ２８３Ｔ＞Ｇの位置におけるＴＴＴからＴＧＴへの適切な突然変異を示し、ＰｈｅからＣｙｓへの所望の突然変異を示した。
１．ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１突然変異誘発
国際公開第２０１６０２０４８３（Ａ１）号パンフレットに記載されているｓｃＦｖ ｈＥＲＧ１分子のアミノ酸配列は、ＶＨドメインの９５位にアミノ酸Ｐｈｅを提示する。配列番号１のヌクレオチド配列は、ＶＨドメインの２８３位におけるＴ（ｃ２８３Ｔ）の存在を解明した。本発明によれば、ＶＨドメインの２８３位のＴの代わりにＧの置換を導入し（ｃ２８３Ｔ＞Ｇ）、９５位のＰｈｅ（ＴＴＴ）をＣｙｓ（ＴＧＴ）で切り替えた。この突然変異は、フレームワーク３とＣＤＲ３との間の位置に１つのアミノ酸（Ｃｙｓ）の導入をもたらし、これは驚くべきことに、免疫グロブリン可変ドメインにおけるジスルフィド結合の形成の基礎をもたらした。Ｃｙｓを元の構築物に導入し、突然変異誘発プロトコルを設定した（材料および方法を参照のこと）。４つの突然変異誘発ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１コロニーから得られたｃＤＮＡを配列決定し、配列決定結果（図１）は、ｃ２８３Ｔ＞Ｇの位置におけるＴＴＴからＴＧＴへの適切な突然変異を示し、ＰｈｅからＣｙｓへの所望の突然変異を示した。
【0060】
２．発現およびタンパク質精製
いずれかのプラスミド、ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１および突然変異誘発ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１（したがってｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓと命名）を、スフェロプラスティング技術を用いてＧＳ１１５ピキア・パストリス宿主株に形質転換した。ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１形質転換体中の６個のクローン（Ｃ７、Ｃ１２、Ｄ９、Ｅ８、Ｇ３、Ｇ７）およびｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓからの６個のクローン（Ｂ１１、Ｃ３、Ｄ８、Ｄ９、Ｇ４、Ｇ１０）を分析した。小スケール発現の結果を、ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１については図２のパネルＡおよびパネルＢに、ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｃｙについては図２のパネルＣおよびパネルＤに示す。全てのクローンは、スロットブロットで示されるように、７２時間の誘導後にタンパク質発現を明らかにした（上のパネル）。
いずれかのプラスミド、ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１および突然変異誘発ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１（したがってｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓと命名）を、スフェロプラスティング技術を用いてＧＳ１１５ピキア・パストリス宿主株に形質転換した。ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１形質転換体中の６個のクローン（Ｃ７、Ｃ１２、Ｄ９、Ｅ８、Ｇ３、Ｇ７）およびｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓからの６個のクローン（Ｂ１１、Ｃ３、Ｄ８、Ｄ９、Ｇ４、Ｇ１０）を分析した。小スケール発現の結果を、ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１については図２のパネルＡおよびパネルＢに、ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｃｙについては図２のパネルＣおよびパネルＤに示す。全てのクローンは、スロットブロットで示されるように、７２時間の誘導後にタンパク質発現を明らかにした（上のパネル）。
【0061】
精製後、タンパク質の存在をウェスタンブロットによって評価した（パネルＢおよびパネルＤ）。
【0062】
ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１のＧ３（以下、ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｇ３と命名）とｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－ＣｙｓのＤ８（ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８－Ｃｙｓと命名）という、上記２つの抗体についての２つの最良の発現クローンを選択した。
【0063】
より大スケールな発現分析を図３に示す。タンパク質の存在をＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびクーマシーブリリアントブルー染色によって評価した。画分１１、１２、１３（Ａ、左パネル）はｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｇ３に対応し、画分１２、１３、１４（Ｂ、右パネル）はｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓに対応する。両方の抗体の分子サイズ（約３０ＫＤａ）に対応するバンドが見える。２つのタンパク質、ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｇ３およびｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓの収率を比較すると、有意差が見られた：ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｇ３濃度は０．０５０μｇ／μｌであり、ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓ濃度は０．４４４μｇ／μｌである。
【0064】
【表1】
【0065】
３．ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｇ３とｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓの抗原親和性の比較
図３（パネルＢ）に報告されるクロマトグラムは、ゲル濾過から得られた結果を示す。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を行って、２つの抗体の結合能に影響を及ぼす可能性のある凝集体の存在を調べた。いくつかの凝集体は、ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｇ３に言及するＢ（左パネル）で報告された分析から検出可能であり、代わりにｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓ（Ｂ、右パネル）は単量体形態で現れる。
図３（パネルＢ）に報告されるクロマトグラムは、ゲル濾過から得られた結果を示す。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を行って、２つの抗体の結合能に影響を及ぼす可能性のある凝集体の存在を調べた。いくつかの凝集体は、ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｇ３に言及するＢ（左パネル）で報告された分析から検出可能であり、代わりにｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓ（Ｂ、右パネル）は単量体形態で現れる。
【0066】
４．ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓ抗体安定性試験
ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓ抗体の安定性を、精製後の異なる時点（６ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月）でのＳＤＳ－Ｐａｇｅクーマシーブリリアントブルー染色によってタンパク質を分析して直接評価した。図３Ｃのデータは、全ての時点で１つの純粋な単一バンドのみが可視であることを示し、従って、このタンパク質は、分解の徴候を示さずにその安定性を維持することを示す。
ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓ抗体の安定性を、精製後の異なる時点（６ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月）でのＳＤＳ－Ｐａｇｅクーマシーブリリアントブルー染色によってタンパク質を分析して直接評価した。図３Ｃのデータは、全ての時点で１つの純粋な単一バンドのみが可視であることを示し、従って、このタンパク質は、分解の徴候を示さずにその安定性を維持することを示す。
【0067】
５．ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｇ３およびｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓの免疫反応性の評価
次に、固定細胞上でｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｇ３およびｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓを用いて免疫蛍光分析を行い、２つの抗体の免疫反応性を決定した。細胞モデルとして、ｈＥＲＧ１ ｃＤＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３（ＨＥＫ－ｈＥＲＧ１）を、および対照として、ｈＥＲＧ１タンパク質を発現しないＨＥＫ－ＭＯＣＫを使用した。ＨＥＫ－ＭＯＣＫ細胞は両方の抗体でシグナルを示さなかったか、または弱いシグナルを示したが、ＨＥＫ２９３ ｈＥＲＧ１はｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｇ３で良好な標識を示し、ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓでさらに良好であった（図４、ＡおよびＢ）。ＩｍａｇｅＪ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて得られたデータ分析はパネルＣに報告されているグラフに報告されている。ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓ染色から得られた値は、ＨＥＫ－ＭＯＣＫ細胞で得られた対照の値と比較した場合、ｈＥＲＧ１を過剰発現している細胞で有意に高い。
次に、固定細胞上でｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｇ３およびｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓを用いて免疫蛍光分析を行い、２つの抗体の免疫反応性を決定した。細胞モデルとして、ｈＥＲＧ１ ｃＤＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３（ＨＥＫ－ｈＥＲＧ１）を、および対照として、ｈＥＲＧ１タンパク質を発現しないＨＥＫ－ＭＯＣＫを使用した。ＨＥＫ－ＭＯＣＫ細胞は両方の抗体でシグナルを示さなかったか、または弱いシグナルを示したが、ＨＥＫ２９３ ｈＥＲＧ１はｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｇ３で良好な標識を示し、ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓでさらに良好であった（図４、ＡおよびＢ）。ＩｍａｇｅＪ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて得られたデータ分析はパネルＣに報告されているグラフに報告されている。ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓ染色から得られた値は、ＨＥＫ－ＭＯＣＫ細胞で得られた対照の値と比較した場合、ｈＥＲＧ１を過剰発現している細胞で有意に高い。
【0068】
蛍光分子Ａｌｅｘａ４８８で直接標識した後の上記２つの抗体の免疫反応性も試験した。ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｇ３－Ａｌｅｘａ４８８およびｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓ－Ａｌｅｘａ４８８抗体を固定細胞上でＩＦで試験したところ（図４、ＡおよびＢ）、フルオロフォアとの結合後でさえも、天然のコンホメーションで抗原を認識する能力が維持されていることが示された。ＩＦ染色をＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて測定し、結果をパネルＣに報告するグラフに報告する。ＨＥＫ２９３ ＨＥＲＧ１細胞で得られたシグナルは、ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｇ３－Ａｌｅｘａ４８８およびｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓ－Ａｌｅｘａ４８８の両方について、対照ＨＥＫ－ＭＯＣＫ細胞と比較してより強い。
【0069】
分子ツールとしてのｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｇ３－Ａｌｅｘａ４８８およびｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓ－Ａｌｅｘａ４８８のインビボでの使用可能性を評価および比較するために、両方の抗体を生細胞でのＩＦで使用した（図４Ａおよび図４Ｂ）。
【0070】
実験は、固定細胞上での染色で得られた結果を確認した。ＨＥＫ２９３ ｈＥＲＧ１細胞は、陰性対照ＨＥＫ２９３ ＭＯＣＫ細胞と比較した場合、より強いシグナルを有するようである。ＨＥＫ２９３ ｈＥＲＧ１細胞は、より特異的な定斑点状細胞標識を有するようであり、一方、ＨＥＫ－ＭＯＣＫ細胞は、非特異的な拡散したバックグラウンドを有する。このため、同一セクションの明視野画像が報告されている。
【0071】
６．ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓ抗体生存率阻害およびスフェロイド試験
この段階で、新生物細胞系のパネル上での細胞増殖を阻害するｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓの潜在的能力をさらに探索した。図５に報告されているように、ＨＣＴ－１１６、ＭＤＡ－ＭＢ２３１、Ｍｉａ Ｐａｃａ－２、ＨＥＫ２９３ ＨＥＲＧ１、ＰＡＮＣ－１およびＢｘＰｃ３について、細胞増殖の有意な用量依存的阻害が観察された。細胞を、抗ｈＥＲＧ１モノクローナル抗体（１００μｇ／ｍｌ）およびｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓ（１０；２０μｇ／ｍｌ）を用いて処理した。予想どおり、ｈＥＲＧ１を発現しないＨＥＫ－ＭＯＣＫ細胞においては、細胞生存能力の有意な低下は見られなかった。
この段階で、新生物細胞系のパネル上での細胞増殖を阻害するｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓの潜在的能力をさらに探索した。図５に報告されているように、ＨＣＴ－１１６、ＭＤＡ－ＭＢ２３１、Ｍｉａ Ｐａｃａ－２、ＨＥＫ２９３ ＨＥＲＧ１、ＰＡＮＣ－１およびＢｘＰｃ３について、細胞増殖の有意な用量依存的阻害が観察された。細胞を、抗ｈＥＲＧ１モノクローナル抗体（１００μｇ／ｍｌ）およびｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓ（１０；２０μｇ／ｍｌ）を用いて処理した。予想どおり、ｈＥＲＧ１を発現しないＨＥＫ－ＭＯＣＫ細胞においては、細胞生存能力の有意な低下は見られなかった。
【0072】
３Ｄ細胞モデルに対するｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓの効果を調べるために、本発明者らは、スフェロイドに対するｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓの３つの異なる濃度（１０μｇ／ｍｌ；２０μｇ／ｍｌ；４０μｇ／ｍｌ）を試験した。
【0073】
図６は、スフェロイドの体積（ｍｍ３）をＹ軸上に報告するグラフを示し、一方、Ｘ軸上には、様々な時点（２４時間、４８時間および７２時間）を報告する。
【0074】
図６では、パネルＡは、ＨＥＫ２９３－ｈＥＲＧ１から生成されたスフェロイドについて得られたグラフを報告する。２０μｇ／ｍｌおよび４０μｇ／ｍｌのｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓで処理したスフェロイドの体積は、各時点で対照と比較して小さい。代わりに、パネルＢはＨＥＫ－ＭＯＣＫスフェロイドの成長曲線を示し、そこでは対照と比較して、試験した３つの濃度のｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓのすべてにおいて処理されたスフェロイドに差異が見られなかった。パネルＡおよびＢはまた、７２時間の培養後に出現した対照ＨＥＫ２９３－ｈＥＲＧ１およびＨＥＫ－ＭＯＣＫスフェロイドの代表的な明視野画像をそれぞれ示す。
【0075】
パネルＣは、膵管腺癌Ｍｉａ Ｐａｃａ２細胞に対して得られた効果を示す。２０μｇ／ｍｌおよび４０μｇ／ｍｌのｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓで処理した細胞の両方について、スフェロイドの体積の減少が観察され、各時点で、対照と比較して試験した最高濃度でより顕著な効果が得られた。図の右側に報告される７２時間で撮影された画像は、４倍の倍率で撮影されたＭｉａ Ｐａｃａ２の対照スフェロイドの画像を示し、一方、右側の画像は、１０倍の倍率で撮影された４０μｇ／ｍｌのｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓで処理されたＭｉａ Ｐａｃａ２スフェロイドの画像を示す。実際、体積が拡大されすぎて適切な焦点合わせができなかったため、７２時間後に１０倍の倍率で対照Ｍｉａ Ｐａｃａ２スフェロイドの画像を取得することは不可能であった。一方、ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓで処理した７２時間後のＭｉａ Ｐａｃａ２スフェロイドは、対照と比較して、それらの体積が大きく減少したため、１０倍の倍率を用いて可視化することができる。
【0076】
パネルＤは、ＭＤＡ－ＭＢ２３１スフェロイドを示す。対照と比較して、試験したｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓの３つの濃度（１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ）すべてについて、体積減少の顕著な効果が観察される。体積減少は、図の右側に報告されたＭＤＡ－ＭＢ２３１スフェロイドの画像からも推測することができる。
【0077】
図７は、７２時間後にスフェロイドに対して行われたカルセインＡＭ細胞生存率アッセイから得られた結果を示す。緑色染色は生細胞を表し、赤色染色は死細胞を表す。左側の画像（パネルＡ）は、各細胞株についての対照の画像であり、一方、右側の画像（パネルＢ）は、４０μｇ／ｍｌのｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓで処理されたスフェロイドの画像である。画像から、抗体で処理されたスフェロイド、特にＭｉａ Ｐａｃａ２、ＭＤＡ ＭＢ－２３１およびＰＡＮＣ－１スフェロイドについての体積減少、さらに、特にｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓで処理されたＭＤＡ ＭＢ－２３１およびＰＡＮＣ－１スフェロイドについての死細胞数の増加に注目することが可能である。
【0078】
７．ｓｃＤｂ－ｈＥＲＧ１－β１
β１－インテグリンに対する一本鎖抗体（ｓｃＦｖ－ＴＳ２／１６）およびｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－ＣｙｓまたはｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１（上記）を含む二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）が開発された。
β１－インテグリンに対する一本鎖抗体（ｓｃＦｖ－ＴＳ２／１６）およびｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－ＣｙｓまたはｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１（上記）を含む二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）が開発された。
【0079】
ＴＳ２／１６のＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列は配列番号２３であり、ＴＳ２／１６のＶＨドメインをコードするヌクレオチド配列は配列番号２５であり（図８参照）、ＴＳ２／１６のＶＬアミノ酸配列は配列番号２４であり、ＴＳ２／１６のＶＨアミノ酸配列は配列番号２６である。
【0080】
二重特異性抗体フォーマットは、図９に示すように、ペプチドリンカーによって連結された２つの抗体の可変ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）を含む一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）である。図の上のパネルは、２つの一本鎖抗体、抗ｈＥＲＧ１ ｓｃＦｖおよび抗β１－インテグリンＴＳ２／１６、ｓｃＦｖ抗体を報告する。
【0081】
下のパネルは、以下の順序で２つの抗体の可変ドメインを使用して組み立てられた二重特異性抗体抗ｈＥＲＧ１－β１－インテグリンの最終構造を図式化する：ＶＨ ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１抗体（配列番号８または配列番号２）、ＶＬ ｓｃＦｖ－ＴＳ２／１６抗体（配列番号２４）、ＶＨ ｓｃＦｖ－ＴＳ２／１６抗体（配列番号２６）、ＶＬ ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１抗体（配列番号４）。
【0082】
ＶＬ ｓｃＦｖ－ＴＳ２／１６抗体（配列番号２４）およびＶＨ ｓｃＦｖ－ＴＳ２／１６抗体（配列番号２６）は、ペプチドリンカーによって連結される。
【0083】
ＶＨ ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１抗体（配列番号２または配列番号８）およびＶＬ ｓｃＦｖ－ＴＳ２／１６抗体（配列番号２４）は、ペプチドリンカーによって連結される。
【0084】
ＶＨ ｓｃＦｖ－ＴＳ２／１６抗体（配列番号２６）およびＶＬ ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１抗体（配列番号４）は、ペプチドリンカーによって連結される。
【0085】
５’および３’末端にＦｓｐＩおよびＡｖｒＩＩ制限部位を挿入した（下記で下線を引いて報告）。
【0086】
ＶＬＦｓｐＩ：
ＡＡＡＡＴＧＣＧＣＡＧＡＣＴＡＣＡＡＡＧＡＴＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧＡＣ（配列番号２７）
ＶＨＡｖｒＩＩ：
ＧＧＧＧＣＣＴＡＧＧＡＴＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＴＣＧＣＧＡＣＡＣＣＣＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＡＴ（配列番号２８）。
ＡＡＡＡＴＧＣＧＣＡＧＡＣＴＡＣＡＡＡＧＡＴＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧＡＣ（配列番号２７）
ＶＨＡｖｒＩＩ：
ＧＧＧＧＣＣＴＡＧＧＡＴＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＴＣＧＣＧＡＣＡＣＣＣＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＡＴ（配列番号２８）。
【0087】
以下の配列（配列番号２９）は、ｓｃＤｂ－ｈＥＲＧ１－β１（配列番号３０）をコードする完全なヌクレオチド配列である。ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ ＶＨ配列は灰色で強調して報告され、ｓｃＦｖ－ＴＳ２／１６のＶＬ配列は下線の斜体で報告され、Ａ、Ｍ、Ｂリンカー配列は太字で報告され、ｓｃＦｖ－ＴＳ２／１６抗体のＶＨ配列は下線の太字の斜体で報告され、ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－ＣｙｓのＶＬ配列は下線付きで灰色で強調されて報告される。
【0088】
Ｍｙｃタグは斜体の太字で、Ｈｉｓタグは下線の太字で報告される。制限部位を下線で報告する。
【0089】
【化1】
【0090】
上記の制限部位を用いて、配列を市販のベクターｐＰＩＣ９Ｋ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にクローニングした。
【0091】
８．ｓｃＤｂ－ｈＥＲＧ１－Ｐｈｅ－β１：発現と特徴づけ
抗ｈＥＲＧ１－Ｐｈｅ－β１－ｓｃＤｂ抗体を発現する構築物を、ピキア・パストリス酵母細胞における発現に適したベクターであるｐＰＩＣ９Ｋ発現ベクターにクローニングした。
抗ｈＥＲＧ１－Ｐｈｅ－β１－ｓｃＤｂ抗体を発現する構築物を、ピキア・パストリス酵母細胞における発現に適したベクターであるｐＰＩＣ９Ｋ発現ベクターにクローニングした。
【0092】
ＧＳ１１５ピキア・パストリス株を、スフェロプラスティングプロトコルに従って形質転換し、そして９６のクローンを、選択のためにＧ４１８を含むＹＰＤ寒天プレート上でスクリーニングした。次いで、６つのクローンを小スケールで誘導し、ｐＰＩＣ９Ｋベクターで導入したヒスチジンタグを利用して、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｎｉビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。クーマシー染色を図１１のパネルＡに報告し、それは、クローンＧ５に対応する、抗ｈＥＲＧ１－Ｐｈｅ－β１－ｓｃＤｂ抗体について予想されるものと一致する分子量（約６０ＫＤａ）を有する、矢印によって強調された１つのバンドを示す。
【0093】
次いで、Ｇ５抗ｈＥＲＧ１－Ｐｈｅ－β１－ｓｃＤｂクローンの大スケール発現を開始し、より大きな培養体積に誘導プロトコルを適合させた。
【0094】
１Ｌのピキア・パストリス細胞培養物から得られた上清を、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。結果を図１１に報告し、この図には、抗体精製から得られたクロマトグラム（パネルＢ）、および青色領域の基礎となる溶出物を分析したクーマシー染色（パネルＣ）の両方が示されている。予想されたものと一致して、精製された抗ｈＥＲＧ１－Ｐｈｅ－β１－ｓｃＤｂに対応する単一のバンドが、各溶出物について検出された。
【0095】
抗ＨＥＲＧ１－β１－ｓｃＤｂ分画８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０をまとめ、ＰＢＳ １Ｘに対して透析した。このようにして、抗体の詳細な特徴づけを開始した。
【0096】
重要なステップの１つは、抗ｈＥＲＧ１－Ｐｈｅ－β１－ｓｃＤｂ抗体を試験するための適切なモデルの選択であった。以下の表は、特徴づけ実験のために選択された、細胞株のｈＥＲＧ１およびβ１インテグリンに関連する発現プロファイルを要約する。
【0097】
【表2】
【0098】
最初に、ｈＥＲＧ１およびβ１抗原の両方を発現するＨＥＫ２９３ ｈＥＲＧ１細胞上でｂｓＡｂを分析した。細胞ＥＬＩＳＡを実施し、結果を図１２に報告するが、細胞ＥＬＩＳＡは、予想通り、ｈＥＲＧ１およびβ１抗原の両方を発現する細胞について、より高いＯＤ４５０で、天然抗原との結合について特定の用量依存的比例性を示した。
【0099】
さらに、抗ｈＥＲＧ１－β１－ｓｃＤｂ二重特異性抗体は、細胞によって内因的に発現される抗原についてのように、天然条件において抗原に結合する能力を示した。抗ｈＥＲＧ１－Ｐｈｅ－β１－ｓｃＤｂ二重特異性抗体の結合特異性はまた、同量（０．５μｇ）の抗ｈＥＲＧ１－Ｐｈｅ－β１－ｓｃＤｂと、上記二重特異性抗体を形成する２つの一本鎖抗体の１つである抗ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｐｈｅとの間の比較によって確証される。実際、抗ｈＥＲＧ１－Ｐｈｅ－β１－ｓｃＤｂとインキュベートした後に得られるシグナルは、抗ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｐｈｅを用いて得られるシグナルよりも高い。このような結果は、抗ｈＥＲＧ１－Ｐｈｅ－β１－ｓｃＤｂで得られるシグナルは、両方の抗原、ｈＥＲＧ１およびβ１への結合から生じるが、ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１を用いて得られるシグナルは、ｈＥＲＧ１抗原のみへの結合から生じるので、予想されたものと一致する。
【0100】
また、ＢＳＡ基質（図１３、パネルＡおよびＢ）およびフィブロネクチン（ＦＮ）基質（図１３、パネルＣおよびＤ）上で増殖させた細胞に対する、ＩＦによる抗ｈＥＲＧ１－Ｐｈｅ－β１－ｓｃＤｂ抗体の免疫反応性を評価した。実際、β１複合体形成は、ＦＮ依存的なインテグリン活性化によって増強されることが示されている。図１３から分かるように、パネルＣおよびＤは、厳密な複合体形成のために、フィブロネクチン上に播種された細胞ＨＥＫ２９３－ｈＥＲＧ１において強力な膜シグナルを示す。シグナルをＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて分析し、結果をグラフに報告する。
【0101】
これまでの実験から得られた証拠をさらに確認するために、抗体インキュベーションの前に、ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１抗体が向けられるペプチドである過剰のペプチドＳ５ＰＯＲＯを投与して、ＨＥＫ２９３－ｈＥＲＧ１細胞に対する抗ｈＥＲＧ１－Ｐｈｅ－β１－ｓｃＤｂの結合を評価した。図１４、パネルＡおよびＢから推測され得るように、抗ｈＥＲＧ１－Ｐｈｅ－β１－ｓｃＤｂと共にインキュベートされたＨＥＫ２９３－ｈＥＲＧ１細胞上のシグナルが、ｈＥＲＧ１およびβ１インテグリンの両方への結合に起因して、確認される。パネルＣは陰性対照を示し、パネルＤおよびＥは、Ｓ５ＰＯＲＯペプチドとのインキュベーション後に得られた結果を示す。シグナルの減少があることが明らかに目に見え、これは予想されるものと一致する。実際、両方の抗原に対して陽性であるＨＥＫ２９３－ｈＥＲＧ１細胞は、上記ペプチドとのインキュベーション後、おそらくｈＥＲＧ１抗原結合部位の飽和に起因して、染色強度の減少を示す。したがって、可視のシグナルは、β１抗原への結合のみに由来するものである。このような結果は、ＩｍａｇｅＪ蛍光強度定量から得られたグラフに要約されている。
【0102】
９．ｓｃＤｂ－ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ－β１：発現と特徴づけ
ピキア・パストリス酵母細胞における発現に適したベクターであるｐＰＩＣ９Ｋ発現ベクターにクローニングされたｓｃＤｂ－ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ－β１抗体を発現する構築物を、ＧＳ１１５酵母細胞に形質転換した。
ピキア・パストリス酵母細胞における発現に適したベクターであるｐＰＩＣ９Ｋ発現ベクターにクローニングされたｓｃＤｂ－ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ－β１抗体を発現する構築物を、ＧＳ１１５酵母細胞に形質転換した。
【0103】
ｓｃＤｂ－ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ－β１形質転換に由来するクローンを、ｓｃＤｂ－ｈＥＲＧ１－Ｐｈｅ－β１抗体について以前に記載されたプロトコルに従ってスクリーニングした。
【0104】
１Ｌのピキア・パストリス細胞培養物から得られた上清を、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。結果を図１５に報告し、抗体精製から得られたクロマトグラム（パネルＡ）およびクーマシー染色（パネルＢ）の両方を示す。青色領域の基礎となる溶出物を分析し、予想通りに、精製ｓｃＤｂ－ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ－β１に対応する約６０ＫＤａの分子量を有する単一バンドを各溶出物について検出した。
【0105】
タンパク質精製が成功した後、抗体をＡｌｅｘａ４８８との直接結合後に直接免疫蛍光（ＩＦ）で試験した。結果を、ＧＤ２５ＷＴ、ＨＥＫ２９３およびＨＥＫ２９３－ｈＥＲＧ１細胞について図１６に報告する。画像は、ＧＤ２５ＷＴ細胞、パネルＡ（ｈＥＲＧ１およびβ１インテグリンの発現の両方について陰性）が、ｓｃＤｂ－ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ－β１抗体とのインキュベーション後に有意な染色を示さないことを示し、一方、パネルＢは、対照として使用されるＢＳＡ上に播種された細胞（～１０Ａ．Ｕ．）と比較して、より高い蛍光シグナル値（～１７Ａ．Ｕ．）で、ｈＥＲＧ１－β１複合体形成を増強する作用を有するフィブロネクチン（ＦＮ）上に播種されたＨＥＫ２９３－ｈＥＲＧ１細胞（両方の抗原を発現する）についての明確な膜染色を示す。パネルＣは、ＨＥＫ２９３ＷＴ細胞（β１インテグリンのみを発現する）上で得られた蛍光染色を示し、ＢＳＡ上に播種された細胞（～７Ａ．Ｕ．）と比較して、ＦＮ上に播種された細胞（～１２Ａ．Ｕ．）についてより高い蛍光シグナル値を示す。ＩＣ５０は、図１７のパネルＡおよびＢに示されるように、両方の細胞株について決定された。細胞生存率に対する効果は、ＰＡＮＣ－１細胞については２４μｇ／ｍｌで、ＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞については４２μｇ／ｍｌで明らかであった。そのような発見は、ＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞と比較してＰＡＮＣ－１細胞で圧倒的に発現されるｈＥＲＧ１発現のパターンと整合的である。
【0106】
このように、側方運動性アッセイによる癌細胞遊走挙動に対するｓｃＤｂ－ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ－β１の効果を試験した。実験は、ＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞、ＭＤＡ－ＭＢ２３１－ｈＥＲＧ１細胞、ＰＡＮＣ－１細胞およびＨＣＴ１１６細胞について行った。結果を図１８のグラフに報告する。対照と比較して、処理細胞における運動指数（ＭＩ）の明らかな減少がある。このような効果は、ＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞と比較して、ＭＤＡ ＭＢ２３１－ｈＥＲＧ１に対してより顕著であり、細胞遊走に対する抗体のｈＥＲＧ１依存的効果を示唆する。
【0107】
ＰＡＮＣ－１細胞およびＨＣＴ１１６細胞についても有望な結果が得られており、対照と比較して処理細胞における運動性挙動が減少している。
【0108】
材料および方法
１０．ｈＥＲＧ１抗体の重鎖および軽鎖のクローニング。
ｈＥＲＧ１に対するモノクローナル抗体（ｈＥＲＧ１－ｍＡｂ）の重鎖および軽鎖を、ｈＥＲＧ１－ｍＡｂを分泌するハイブリドーマから精製したｍＲＮＡから得たｃＤＮＡから単離した。ＶＨ領域およびＶＬ領域の増幅のために、各鎖の可変ドメインのフレームワーク１（ＦＲ１）にアニールする５’プライマー（順方向プライマー）および各鎖の可変ドメイン付近の定常領域にアニールするプライマー（逆方向プライマー）を選択した。ＶＬについては、カッパ軽鎖にアニールする縮重プライマーが設計されたが、それは、これがマウスにおいてより発現される免疫グロブリン表現型であるからである（ＨｏｎｊｏおよびＡｌｔ、１９９５）。抗体の重鎖（ＶＨ）を、以下のプライマーのセット：ｄｅｇＶＨ順方向、５’ＧＡＧＧＴＣＣＡＲＣＴＧＣＡＡＣＡＲＴＣ ３’（配列番号１１）およびＩｇＧ２逆方向、５’ＡＧＧＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＴＧＡＴＧＧ ３’（配列番号１２）（Ｗａｎｇ、２０００）を使用するＰＣＲによって増幅した。以下のプライマーのセットを用いて、抗体の軽鎖（ＶＬ）をＰＣＲ増幅した：ｄｅｇＶＬ（Ｋ）、５’ ＧＡＹＡＴＴＧＴＧＭＴＳＡＣＭＣＡＲＷＣＴＭＣＡ ３’（配列番号１３）およびＫ逆方向、５’ＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＣＡＴＣ ３’（配列番号１４）（Ｗａｎｇ、２０００）。ｃＤＮＡを、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ Ｒｅａｇｅｎｔｓ）を使用して増幅した。サイクル条件は、９４℃で２分間の初期融解、続いて３工程プログラム（９４℃、３０秒；５６℃（ＶＨ）；４８℃（ＶＬ）、１分間；および７２℃、１分間）の２５サイクルであった。次いで、反応物を７２℃で１０分間保持し、４℃に冷却した。
１０．ｈＥＲＧ１抗体の重鎖および軽鎖のクローニング。
ｈＥＲＧ１に対するモノクローナル抗体（ｈＥＲＧ１－ｍＡｂ）の重鎖および軽鎖を、ｈＥＲＧ１－ｍＡｂを分泌するハイブリドーマから精製したｍＲＮＡから得たｃＤＮＡから単離した。ＶＨ領域およびＶＬ領域の増幅のために、各鎖の可変ドメインのフレームワーク１（ＦＲ１）にアニールする５’プライマー（順方向プライマー）および各鎖の可変ドメイン付近の定常領域にアニールするプライマー（逆方向プライマー）を選択した。ＶＬについては、カッパ軽鎖にアニールする縮重プライマーが設計されたが、それは、これがマウスにおいてより発現される免疫グロブリン表現型であるからである（ＨｏｎｊｏおよびＡｌｔ、１９９５）。抗体の重鎖（ＶＨ）を、以下のプライマーのセット：ｄｅｇＶＨ順方向、５’ＧＡＧＧＴＣＣＡＲＣＴＧＣＡＡＣＡＲＴＣ ３’（配列番号１１）およびＩｇＧ２逆方向、５’ＡＧＧＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＴＧＡＴＧＧ ３’（配列番号１２）（Ｗａｎｇ、２０００）を使用するＰＣＲによって増幅した。以下のプライマーのセットを用いて、抗体の軽鎖（ＶＬ）をＰＣＲ増幅した：ｄｅｇＶＬ（Ｋ）、５’ ＧＡＹＡＴＴＧＴＧＭＴＳＡＣＭＣＡＲＷＣＴＭＣＡ ３’（配列番号１３）およびＫ逆方向、５’ＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＣＡＴＣ ３’（配列番号１４）（Ｗａｎｇ、２０００）。ｃＤＮＡを、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ Ｒｅａｇｅｎｔｓ）を使用して増幅した。サイクル条件は、９４℃で２分間の初期融解、続いて３工程プログラム（９４℃、３０秒；５６℃（ＶＨ）；４８℃（ＶＬ）、１分間；および７２℃、１分間）の２５サイクルであった。次いで、反応物を７２℃で１０分間保持し、４℃に冷却した。
【0109】
アガロースゲル電気泳動から単離された抗体フラグメント（ＶＨおよびＶＬ）を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して精製し、次いで、製造業者の説明書に従ってｐＣＲ（商標）－Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。組換えプラスミドを、自動化ＤＮＡ配列決定サービス（ＰＲＩＭＭ）を通して配列決定した。
【0110】
次いで、ＶＨおよびＶＬフラグメントを、２つの異なるクローニング部位の間にリンカー配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含むｐＨＥＮＩＸ発現ベクターにクローニングした。抗体断片をｐＨｅｎＩＸベクターにクローニングするための適切な制限部位を有するプライマーを設計した。ＶＬプライマー：順方向ＶＬ－ＡｐａＬＩ、５’ａｃｇｃｇｔｇｃａｃｔｇＧＡＴＡＴＴＧＴＧＣＴＧＡＣＡＣＡＡＴＣＴＣＣＡ ３’（配列番号１５）；逆方向ＶＬ－ＮｏｔＩ、５’ａｔａａｇａａｔｇｃｇｇｃｃｇｃＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＣＡＴＣ ３’（配列番号１６）。ＶＨプライマー：順方向ＶＨ－Ｓａｌｋ、５’ａｃｇｃｇｔｃｇａｃＧＡＧＧＴＣＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＡＧＴＣ ３’（配列番号１７）；逆方向ＶＨ－ＸｈｏＩ、５’ｃｃｇｃｔｃｇａｇｃｃＡＧＧＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＴＧＡＴＧＧ ３’（配列番号１８）。ＰＣＲ産物を、ＡｐａＬＩおよびＮｏｔＩ（ＶＨのための）またはＳａｌＩおよびＸｈｏＩ（ＶＬのための）制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）で消化し、適合性クローニング部位においてｐＨＥＮＩＸベクターに連結した。消化は３７℃で２時間行った。適合性末端の再連結を避けるために、仔牛小腸由来ホスファターゼ（ＣＩＰ）を使用して、以下のプロトコル：ｐＨＥＮＩＸベクター（５０ｎｇ／μｌ）、Ｂｕｆｆｅｒ ３（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）１ＸおよびＣＩＰ（０．５ｕ／μｇのベクター）に従って、ベクターの５’末端から５’リン酸基を除去した。脱リン酸化反応を３７℃で１時間インキュベートした。リン酸化ベクターをＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。
【0111】
ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１フラグメントとｐＨＥＮＩＸとの間の連結を、Ｂｕｆｆｅｒ ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）とＴ４リガーゼとの混合物中で行った。１：３および１：１０のベクター：ｓｃＦｖ比をライゲーション混合物中に設定し、インキュベーションを２５℃で１５分間行った。
【0112】
２μｌの連結混合物を大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’およびＨＢ２１５１細胞にエレクトロポレーションした（２５００ｍＶパルス）。エレクトロポレーションした細胞を、４５０μＬのＳＯＣ培地（１ｍＭ ＭｇＳＯ４、１ｍＭ ＭｇＣｌ２を補充したＳＯＢ培地）で回収し、振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。細菌を、抗生物質を含有する予備加温ＬＢ－寒天プレートに播種し、蓋側を下にして３７℃で一晩インキュベートした。
【0113】
１１．ｐＰＩＣ９Ｋ発現ベクターにおけるｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｇ３のクローニング
ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１発現カセットを、６ｘＨｉｓタグを含む形質転換されたｐＰＩＣ９Ｋベクター（親切にも、Ｐｒｏｆ．Ｅｒｍａｎｎｏ Ｇｈｅｒａｒｄｉ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐａｖｉａから贈られたもの）にクローニングした。ｓｃＦｖ構築物を、配列の３’および５’末端でそれぞれＦｓｐＩおよびＡｖｒＩＩ制限部位の付加を可能にするプライマー（順方向ＶＨ－ＦｓｐＩ、ＡＡＡＡＴＧＣＧＣＡＧＡＧＧＴＣＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＡＧＴＣ（配列番号１９）；逆方向ＶＬ－ＡｖｒＩＩ、ＧＧＧＧＣＣＴＡＧＧＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＣＡＴＣ（配列番号２０））を用いるＰＣＲによってｐＨＥＮＩＸベクターから単離および増幅した。
ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１発現カセットを、６ｘＨｉｓタグを含む形質転換されたｐＰＩＣ９Ｋベクター（親切にも、Ｐｒｏｆ．Ｅｒｍａｎｎｏ Ｇｈｅｒａｒｄｉ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐａｖｉａから贈られたもの）にクローニングした。ｓｃＦｖ構築物を、配列の３’および５’末端でそれぞれＦｓｐＩおよびＡｖｒＩＩ制限部位の付加を可能にするプライマー（順方向ＶＨ－ＦｓｐＩ、ＡＡＡＡＴＧＣＧＣＡＧＡＧＧＴＣＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＡＧＴＣ（配列番号１９）；逆方向ＶＬ－ＡｖｒＩＩ、ＧＧＧＧＣＣＴＡＧＧＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＣＡＴＣ（配列番号２０））を用いるＰＣＲによってｐＨＥＮＩＸベクターから単離および増幅した。
【0114】
ベクターｐＰＩＣ９は、ＡＯＸ１プロモーター、３’ＡＯＸ１転写ターミネーター（ＴＴ）、および外来遺伝子が挿入されるマルチクローニングサイトから構成される。
【0115】
発現カセットをＦｓｐＩおよびＡｖｒＩＩで切断し、Ｅｃｏ５３ＫＩおよびＡｖｒＩＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）で切断したｐＰＩＣ９Ｋにクローニングした。
【0116】
１２．ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１突然変異誘発
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）ＸＬ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ｐＰＩＣ９ＫにクローニングされたｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１発現カセット上で突然変異誘発を行った。Ｃｙｓアミノ酸の導入に適したプライマーは、製造業者の説明書に従って設計され、Ｐｒｉｍｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ、レフトプライマー：ＧＧＡＴＴＣＴＧＣＡＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＣＡＧＧＴＴＧＧＧＧＡＣＣＴＧ（配列番号２１）；ライトプライマー：ＣＡＧＧＴＣＣＣＣＡＡＣＣＴＧＴＴＧＣＡＣＡＧＴＡＡＴＡＧＡＣＴＧＣＡＧＡＡＴＣＣ（配列番号２２）によって設計された。
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）ＸＬ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ｐＰＩＣ９ＫにクローニングされたｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１発現カセット上で突然変異誘発を行った。Ｃｙｓアミノ酸の導入に適したプライマーは、製造業者の説明書に従って設計され、Ｐｒｉｍｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ、レフトプライマー：ＧＧＡＴＴＣＴＧＣＡＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＣＡＧＧＴＴＧＧＧＧＡＣＣＴＧ（配列番号２１）；ライトプライマー：ＣＡＧＧＴＣＣＣＣＡＡＣＣＴＧＴＴＧＣＡＣＡＧＴＡＡＴＡＧＡＣＴＧＣＡＧＡＡＴＣＣ（配列番号２２）によって設計された。
【0117】
試料反応液は以下のように調製した：５μｌの１０Ｘ反応緩衝液；１μｌのｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１ ｄｓＤＮＡテンプレート（１３ｎｇ／μｌ）；１．８４μｌ（１２５ｎｇ）レフトプライマー；１．８４μｌ（１２５ｎｇ）ライトプライマー；１μｌのｄＮＴＰ混合物；３μｌのＱｕｉｃｋＳｏｌｕｔｉｏｎ；３６．３２μｌのｄｄＨ２Ｏ。次いで１μｌのＰｆｕＴｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ／μｌ）を添加した。サイクル条件を調整した：初期融解を９５℃で１分間行い、続いて３工程プログラム（９５℃、５０秒；６０℃、５０秒および６８℃、４分）を１８サイクル行った。次いで、反応物を６８℃で７分間保持し、４℃に冷却した。
【0118】
増幅反応後、１μｌのＤｎｐＩ制限酵素（１０Ｕ／μｌ）を反応混合物に直接添加し、これを、直後から３７℃で１時間インキュベートして親を消化した。
【0119】
この時点で、細菌ＤＨ５α超コンピテント細胞はヒートショックを通して形質転換された。細胞を氷上で穏やかに解凍し、２μｌのＤｐＩ処理ＤＮＡを、２００μｌの超コンピテント細胞の別個のアリコートに移した。反応物を氷上で３０分間インキュベートした。次いで、チューブを乾燥浴中４２℃で４５秒間加熱パルスした。チューブを氷上で２分間インキュベートした。細胞を４５０μｌのＳＯＣ培地（１ｍＭ ＭｇＳＯ４、１ｍＭ ＭｇＣｌ２を補充したＳＯＢ培地）で回収し、振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。細菌を、アンピシリン抗生物質（５０μｇ／ｍｌ）を含有する予備加温ＬＢ－寒天プレートに播種し、蓋側を下にして３７℃で一晩インキュベートした。
【0120】
翌日、いくつかのコロニーを増殖させ、それらのいくつかを採取し、ＤＮＡを抽出し、配列決定して、所望の突然変異の存在を確認した。得られた構築物をｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓと標識した。
【0121】
１３．ピキア・パストリスにおけるｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｇ３およびｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓの発現
直鎖化したｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１およびｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓの両方をＳａｌＩで消化し、スフェロプラスティングによってピキア・パストリス株ＧＳ１１５に形質転換し、Ｍｕｔ＋形質転換体を作製した。形質転換については、Ｐｉｃｈｉａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の指示を参照した。
直鎖化したｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１およびｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓの両方をＳａｌＩで消化し、スフェロプラスティングによってピキア・パストリス株ＧＳ１１５に形質転換し、Ｍｕｔ＋形質転換体を作製した。形質転換については、Ｐｉｃｈｉａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の指示を参照した。
【0122】
形質転換から５日後、単一のコロニーが肉眼で見え、９２個のクローニングおよび４個の陰性対照を採取し、異なる濃度のＧ４１８：Ｇ４１８なし、５ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌの３つの異なる９６ウェルプレートに移した。ｐＰＩＣ９ＫがピキアにおいてＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）に対する耐性を付与する細菌カナマイシン遺伝子を含有するという特徴を利用して、Ｇ４１８選択を行った。Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）耐性のレベルは、組み込まれたカナマイシン遺伝子の数にほぼ依存する。ピキアゲノムに組み込まれたｐＰＩＣ９Ｋの単一コピーは、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）に対する耐性を約０．２５ｍｇ／ｍｌのレベルに付与する。ｐＰＩＣ９Ｋの複数の組み込まれたコピーは、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）耐性レベルを０．５ｍｇ／ｍｌ（１～２コピー）から４ｍｇ／ｍｌ（７～１２コピー）まで増加させることができる。カナマイシン遺伝子と発現カセット（両方ともＰＯＡＸ１プロモーター下）との間の遺伝的連鎖のために、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）耐性クローンが、目的の遺伝子の複数のコピーを含むと推測することができる。この同じ理由のために、分泌タンパク質発現は、遺伝子投薬効果のために増加し得る。したがって、ｐＰＩＣ９Ｋの存在をツールとして用いて、目的の遺伝子ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１およびｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓの複数のコピーを有するｐＰＩＣ９Ｋ形質転換体を明らかにした。
【0123】
３０℃で２日間増殖させた後、１５ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８プレートから６つの最良に増殖したクローンを採取し、Ｐｉｃｈｉａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔプロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って、小スケール液体培養物を設定して、目的のタンパク質を発現する能力について評価した。
【0124】
各クローンの培養物からの試料を、異なる時点：２４時間、４８時間、７２時間で収集した。０．５％最終濃度の１００％メタノールで３日間誘導した後、上清を収集し、スロットブロットを通して試験した。
【0125】
１４．スロットブロット分析
酵母上清を収集し、そしてスロットブロットを通してタンパク質発現について試験した。２００μｌの各上清を、３ＭＭワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）紙の２つの正方形の間のスロットブロットデバイス中で組み立てられたＰＶＤＦ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に適用した。試料を１５分間インキュベートした後、真空度を適用して試料を乾燥させた。膜を回収し、Ｔ－ＰＢＳで洗浄した。ブロッキングを、Ｔ－ＰＢＳ ５％ＢＳＡを用いて４５分間行い、次いで、Ｔ－ＰＢＳで１０分間洗浄した。膜を、１５ｍｌのＴ－ＰＢＳ ５％ＢＳＡ中で１：２０００に希釈した抗６ｘＨｉｓ－ＨＲＰ結合抗体（Ｓｉｇｍａ）と共に１時間インキュベートした。
酵母上清を収集し、そしてスロットブロットを通してタンパク質発現について試験した。２００μｌの各上清を、３ＭＭワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）紙の２つの正方形の間のスロットブロットデバイス中で組み立てられたＰＶＤＦ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に適用した。試料を１５分間インキュベートした後、真空度を適用して試料を乾燥させた。膜を回収し、Ｔ－ＰＢＳで洗浄した。ブロッキングを、Ｔ－ＰＢＳ ５％ＢＳＡを用いて４５分間行い、次いで、Ｔ－ＰＢＳで１０分間洗浄した。膜を、１５ｍｌのＴ－ＰＢＳ ５％ＢＳＡ中で１：２０００に希釈した抗６ｘＨｉｓ－ＨＲＰ結合抗体（Ｓｉｇｍａ）と共に１時間インキュベートした。
【0126】
１５．Ｎｉセファロース精製
酵母形質転換後のクローンのスクリーニングから得られた上清を、製造業者の説明書に従って、Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ｇｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてローリング中で一晩インキュベートした。その後、５００μｌの洗浄緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３）を用いて２回の洗浄工程を行い、２５０μｌの溶出緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．３）を用いて溶出を行った。
酵母形質転換後のクローンのスクリーニングから得られた上清を、製造業者の説明書に従って、Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ｇｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてローリング中で一晩インキュベートした。その後、５００μｌの洗浄緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３）を用いて２回の洗浄工程を行い、２５０μｌの溶出緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．３）を用いて溶出を行った。
【0127】
１６．ＡＫＴＡ精製
それぞれｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｇ３およびｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓの１リットル酵母上清の精製を、ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ １ｍＬカラムを備えたＡＫＴＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって行った。洗浄工程および平衡化は、製造業者の説明書に従って、洗浄緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３）を使用して実施した。溶出は、溶出緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．３）の直線勾配を使用して実施した。分析は、ＵＮＩＣＯＲＮ ７．０ソフトウェアを用いて行った。
それぞれｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｇ３およびｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓの１リットル酵母上清の精製を、ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ １ｍＬカラムを備えたＡＫＴＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって行った。洗浄工程および平衡化は、製造業者の説明書に従って、洗浄緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３）を使用して実施した。溶出は、溶出緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．３）の直線勾配を使用して実施した。分析は、ＵＮＩＣＯＲＮ ７．０ソフトウェアを用いて行った。
【0128】
１７．ゲル濾過
両方の抗体の精製から得られた試料を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ＨＲ １０／３０（Ｇｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてゲル濾過した。洗浄緩衝液組成物（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３）を、プロトコル条件を最適化するように調整した。溶出物はＳＤＳ－Ｐａｇｅを通して分析した。
両方の抗体の精製から得られた試料を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ＨＲ １０／３０（Ｇｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてゲル濾過した。洗浄緩衝液組成物（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．３）を、プロトコル条件を最適化するように調整した。溶出物はＳＤＳ－Ｐａｇｅを通して分析した。
【0129】
１８．ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）
それぞれの試料を同量の１５μｌでスタッキングゲル（４００μｌのアクリルアミド（４０％）－ビスアクリルアミド（０．８％）、１ｍｌの０．５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ６．８、４０μｌの１０％ＳＤＳ、２０μｌの１０％過硫酸アンモニウム、４μｌのＴＥＭＥＤ、２．５４ｍｌのＨ２Ｏ）に適用した。スタッキングゲルを分割ゲル（２．６ｍｌのアクリルアミド（４０％）－ビスアクリルアミド（０．８％）、１．７５ｍｌの１．５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．８、７０μｌの１０％ＳＤＳ、３５μｌの１０％過硫酸アンモニウム、３．５μｌのＴＥＭＥＤ、２．５５ｍｌのＨ２Ｏ）に添加した。１５０ Ｖで電気泳動を行った。ゲルをクーマシーブリリアントブルーで染色するか、またはタンパク質（約３０ＫＤａ）の存在を評価するためにウェスタンブロット分析のためにＰＶＤＦ膜に移した。
それぞれの試料を同量の１５μｌでスタッキングゲル（４００μｌのアクリルアミド（４０％）－ビスアクリルアミド（０．８％）、１ｍｌの０．５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ６．８、４０μｌの１０％ＳＤＳ、２０μｌの１０％過硫酸アンモニウム、４μｌのＴＥＭＥＤ、２．５４ｍｌのＨ２Ｏ）に適用した。スタッキングゲルを分割ゲル（２．６ｍｌのアクリルアミド（４０％）－ビスアクリルアミド（０．８％）、１．７５ｍｌの１．５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．８、７０μｌの１０％ＳＤＳ、３５μｌの１０％過硫酸アンモニウム、３．５μｌのＴＥＭＥＤ、２．５５ｍｌのＨ２Ｏ）に添加した。１５０ Ｖで電気泳動を行った。ゲルをクーマシーブリリアントブルーで染色するか、またはタンパク質（約３０ＫＤａ）の存在を評価するためにウェスタンブロット分析のためにＰＶＤＦ膜に移した。
【0130】
１９．ウェスタンブロット法
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ後、ゲルを、移送緩衝液（１４．４ｇ、３．０３ｇのＴｒｉｓ ＨＣｌ、２００ｍｌのメタノール、８００ｍｌのＨ２Ｏ）中、１００Ｖで１時間、ＰＶＤＦ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移した。膜をＴ－ＰＢＳ（ＰＢＳ ０．１％Ｔｗｅｅｎ）中で洗浄し、次いでＴ－ＰＢＳ ５％ＢＳＡで一晩ブロックした。膜を、Ｔ－ＰＢＳ ５％ＢＳＡ中に希釈したペルオキシダーゼ結合一次抗体（Ｓｉｇｍａ）に室温で１時間暴露した。膜を１０分間３回洗浄した後、ＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてシグナルを可視化した。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ後、ゲルを、移送緩衝液（１４．４ｇ、３．０３ｇのＴｒｉｓ ＨＣｌ、２００ｍｌのメタノール、８００ｍｌのＨ２Ｏ）中、１００Ｖで１時間、ＰＶＤＦ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移した。膜をＴ－ＰＢＳ（ＰＢＳ ０．１％Ｔｗｅｅｎ）中で洗浄し、次いでＴ－ＰＢＳ ５％ＢＳＡで一晩ブロックした。膜を、Ｔ－ＰＢＳ ５％ＢＳＡ中に希釈したペルオキシダーゼ結合一次抗体（Ｓｉｇｍａ）に室温で１時間暴露した。膜を１０分間３回洗浄した後、ＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてシグナルを可視化した。
【0131】
ＷＢは、以下の抗体：抗ｍｙｃ（１：１０００）および抗６ｘＨｉｓ－ＨＲＰ結合抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いて行った。
【0132】
２０．ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｇ３およびｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓ定量、ＥＬＩＳＡアッセイおよびＢｉａｃｏｒｅ分析
ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｇ３およびｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓを一緒に収集し、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ（商標）Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いてＰＢＳ １Ｘに対して透析した。２８０ｎｍでのタンパク質吸光度を測定し、Ｌａｍｂｅｒｔ－Ｂｅｅｒの式を適用した。
ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｇ３およびｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓを一緒に収集し、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ（商標）Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いてＰＢＳ １Ｘに対して透析した。２８０ｎｍでのタンパク質吸光度を測定し、Ｌａｍｂｅｒｔ－Ｂｅｅｒの式を適用した。
【0133】
２つの操作された抗体、ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｇ３およびｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓが、抗原に結合する能力を依然として有するかどうかを評価するために、そしてその後、２つの抗体の異なる親和性を調べるために、Ｓ５細孔ペプチド（配列：ＥＱＰＨＭＤＳＲＩＧＷＬＨＮ）でコーティングされたプレートを用いてＥＬＩＳＡアッセイを実施し、それに向けて抗体を方向付けた。このペプチドは、本発明者らが抗ｈＥＲＧ１ Ａ７抗体をスクリーニングするために使用したものと同じである。
【0134】
２１．Ａｌｅｘａ４８８による抗体標識
ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｇ３およびｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓを、プロトコル指示に従って、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ Ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と結合させた。
ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｇ３およびｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓを、プロトコル指示に従って、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ Ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と結合させた。
【0135】
２２．固定細胞の免疫蛍光
ＨＥＫ２９３ ｈＥＲＧ１（ｐｃＤＮＡ３．１－ｈＥＲＧ１ ｃＤＮＡ構築物で安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３）およびＨＥＫ－ＭＯＣＫ（ｐｃＤＮＡ３．１ ｃＤＮＡで安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３）を、５％ＣＯ２の３７℃インキュベーター中で１０％ＦＢＳ ＥＵ血清を含むＤＭＥＭ培地中で成長させた。細胞をガラスカバースリップ上に一晩播種し、次いでＰＢＳで１回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで２０分間室温で固定した。ブロッキングは、１０％ＢＳＡを用いて室温で２時間行った。抗体インキュベーションは、ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｇ３、ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓを用いて行い、ブロッキング溶液中で１：２０に希釈し、２時間半インキュベートし、続いてブロッキング溶液中で抗Ｈｉｓ（１：２５０；Ａｂｃａｍ）と一晩インキュベーションを行った。翌日、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、抗マウスＡｌｅｘａ４８８抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に１時間インキュベートした。
ＨＥＫ２９３ ｈＥＲＧ１（ｐｃＤＮＡ３．１－ｈＥＲＧ１ ｃＤＮＡ構築物で安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３）およびＨＥＫ－ＭＯＣＫ（ｐｃＤＮＡ３．１ ｃＤＮＡで安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３）を、５％ＣＯ２の３７℃インキュベーター中で１０％ＦＢＳ ＥＵ血清を含むＤＭＥＭ培地中で成長させた。細胞をガラスカバースリップ上に一晩播種し、次いでＰＢＳで１回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで２０分間室温で固定した。ブロッキングは、１０％ＢＳＡを用いて室温で２時間行った。抗体インキュベーションは、ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｇ３、ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓを用いて行い、ブロッキング溶液中で１：２０に希釈し、２時間半インキュベートし、続いてブロッキング溶液中で抗Ｈｉｓ（１：２５０；Ａｂｃａｍ）と一晩インキュベーションを行った。翌日、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、抗マウスＡｌｅｘａ４８８抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に１時間インキュベートした。
【0136】
一方、ブロッキング溶液で１：２０に希釈したｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｇ３－Ａｌｅｘａ４８８およびｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓ－Ａｌｅｘａ４８８を、４℃で一晩インキュベートした。
【0137】
顕色のために、細胞をＨｏｅｃｈｓｔ（１：１０００）と共に３０分間インキュベートし、次いで没食子酸プロピルでマウントした。細胞を共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、Ｃ１）で可視化した。
【0138】
ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて免疫蛍光定量を行った。各画像について、３つの異なる領域の測定を行い、平均を計算した。
【0139】
２３．生細胞の免疫蛍光
細胞を単離し、インキュベーションに必要な試薬の容量を最小限にするために、アガロース（１５ｇ／Ｌ）リングを使用して、６０ｍｍプレート（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）上で細胞を一晩成長させた。細胞を、５％ＣＯ２を含む３７℃インキュベーター中の完全培養培地中で１：２０に希釈したｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｇ３－Ａｌｅｘａ４８８およびｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓ－Ａｌｅｘａ４８８と共に４時間インキュベートした。上に記載したように、Ｈｏｅｃｈｓｔを用いて顕色を行った。細胞を倒立光学顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ３００）で可視化した。
細胞を単離し、インキュベーションに必要な試薬の容量を最小限にするために、アガロース（１５ｇ／Ｌ）リングを使用して、６０ｍｍプレート（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）上で細胞を一晩成長させた。細胞を、５％ＣＯ２を含む３７℃インキュベーター中の完全培養培地中で１：２０に希釈したｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｇ３－Ａｌｅｘａ４８８およびｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓ－Ａｌｅｘａ４８８と共に４時間インキュベートした。上に記載したように、Ｈｏｅｃｈｓｔを用いて顕色を行った。細胞を倒立光学顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ３００）で可視化した。
【0140】
２４．細胞生存率
トリパンブルーアッセイを実施し、細胞生存率を評価した。簡潔には、ＨＣＴ－１１６細胞、ＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞、ＭＩＡ ＰＡＣＡ２細胞、ＨＥＫ２９３ ｈＥＲＧ１細胞、ＨＥＫ－ＭＯＣＫ細胞、ＦＬＧ２９．１細胞、ＰＡＮＣ－１、ＢＸＰＣ３細胞を５×１０３細胞／ウェルの密度で、９６ウェルプレートに播種した。２４時間後、培地を、異なる濃度のｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓ抗体（１０μｇ／ｍｌおよび２０μｇ／ｍｌ）を含有する１００μｌの新鮮な培地と交換した。完全免疫グロブリン、抗ｈＥＲＧ１モノクローナル抗体を１００μｇ／ｍｌの濃度で試験した。細胞を、３７℃および５％ＣＯ２の加湿インキュベーター中で２４時間培養した。処理後、細胞を分離し、生存細胞を計数した。実験は３回実施した。
トリパンブルーアッセイを実施し、細胞生存率を評価した。簡潔には、ＨＣＴ－１１６細胞、ＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞、ＭＩＡ ＰＡＣＡ２細胞、ＨＥＫ２９３ ｈＥＲＧ１細胞、ＨＥＫ－ＭＯＣＫ細胞、ＦＬＧ２９．１細胞、ＰＡＮＣ－１、ＢＸＰＣ３細胞を５×１０３細胞／ウェルの密度で、９６ウェルプレートに播種した。２４時間後、培地を、異なる濃度のｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓ抗体（１０μｇ／ｍｌおよび２０μｇ／ｍｌ）を含有する１００μｌの新鮮な培地と交換した。完全免疫グロブリン、抗ｈＥＲＧ１モノクローナル抗体を１００μｇ／ｍｌの濃度で試験した。細胞を、３７℃および５％ＣＯ２の加湿インキュベーター中で２４時間培養した。処理後、細胞を分離し、生存細胞を計数した。実験は３回実施した。
【0141】
２５．スフェロイド３Ｄ培養およびスフェロイドに対するｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１試験
ＨＥＫ－２９３ ｈＥＲＧ１、ＨＥＫ－ＭＯＣＫ、ＭＤＡ－ＭＢ２３１、ＭＩＡ ＰＡＣＡ２およびＰＡＮＣ－１を、１．５％アガロースベース層上の各ウェルについて１０３細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種した。新しい培地１００μＬを各ウェルに添加し、細胞を５％ＣＯ２の３７℃のインキュベーター中で７２時間増殖させた。７２時間後、スフェロイドを可視化し、培地を、異なる濃度のｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓ抗体（１０μｇ／ｍｌおよび２０μｇ／ｍｌおよび４０μｇ／ｍｌ）を含有する新しい培地１００μｌで置き換えた。
ＨＥＫ－２９３ ｈＥＲＧ１、ＨＥＫ－ＭＯＣＫ、ＭＤＡ－ＭＢ２３１、ＭＩＡ ＰＡＣＡ２およびＰＡＮＣ－１を、１．５％アガロースベース層上の各ウェルについて１０３細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種した。新しい培地１００μＬを各ウェルに添加し、細胞を５％ＣＯ２の３７℃のインキュベーター中で７２時間増殖させた。７２時間後、スフェロイドを可視化し、培地を、異なる濃度のｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓ抗体（１０μｇ／ｍｌおよび２０μｇ／ｍｌおよび４０μｇ／ｍｌ）を含有する新しい培地１００μｌで置き換えた。
【0142】
写真を、Ｎｉｋｏｎ、Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ３００を用いて、カルセインＡＭ細胞生存率アッセイを行った７２時間まで２４時間毎に撮った。
【0143】
ＭＡＴＬＡＢ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて、２４時間、４８時間、７２時間に撮影した写真を分析して、スフェロイドの体積を評価した。
【0144】
実験は３回行った。
【0145】
２６．β１インテグリンｍＡｂ：ＲＮＡ逆転写
ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の指示に従って使用して、４０μｌの総容量で、ＴＳ２／１６およびＢＶ７ ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。
ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の指示に従って使用して、４０μｌの総容量で、ＴＳ２／１６およびＢＶ７ ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。
【0146】
【表3】
【0147】
混合物をサーモサイクラー中で６５℃で５分間インキュベートし、次いで氷上で迅速に冷却し、以下の成分を添加した。
【0148】
【表4】
【0149】
次いで、混合物を４２℃で２分間加熱し、次いで酵素を添加した。
【0150】
【表5】
【0151】
次いで、混合物（４０μｌ）を４２℃で５０分間インキュベートし、次いで反応物を７０℃で１５分間不活化した。
【0152】
２７．β１インテグリンｍＡｂ：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による可変ドメインの単離
抗体可変ドメイン（ＶＬおよびＶＨ）を単離するために、Ｗａｎｇら（２０００）に報告されたプライマーを用いて、変形例を用いてＰＣＲを行った（表２）。
抗体可変ドメイン（ＶＬおよびＶＨ）を単離するために、Ｗａｎｇら（２０００）に報告されたプライマーを用いて、変形例を用いてＰＣＲを行った（表２）。
【0153】
【表6】
【0154】
軽鎖には２つのクラス、κおよびλ、があるが、マウス抗体の９５％がκ軽鎖を有するので（ＨｏｎｊｏおよびＡｌｔ，１９９５）、λ型を無視してκ軽鎖に特異的なプライマーを選択した。順方向プライマーは、各鎖可変領域のフレームワーク１（ＦＲＷ１）のタンパク質配列アラインメントを用いて設計した。各鎖（κ軽鎖またはＩｇＧ１重鎖）の可変ドメインの末端に隣接する定常領域（ＣＨ１）に対して逆方向プライマーを設計した。κ軽鎖については１つのプライマー対のみを使用し、一方、重鎖については、５つのフォワードプライマーと組み合わせてＩｇＧ１ｒｅｖによって構成される５つのプライマー対を使用した。
【0155】
ＴＳ２／１６およびＢＶ７の両方のＶＨ単離のために、ＩｇＧ１ｒｅｖ－ｄｅｇＨ４ｄｉｒプライマー対を選択した。
【0156】
ＤＮＡポリメラーゼによる突然変異を防止するために、プルーフリーディング活性を有する高忠実度ＤＮＡポリメラーゼを使用した：ＫＯＤ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、以下のプロトコルを使用して使用した。
【0157】
【表7】
【0158】
混合物を、以下のプロトコルでサーモサイクラー中でインキュベートした。
【0159】
【表8】
【0160】
ステップ２～４を３０回繰り返した。
【0161】
２８．β１インテグリンｍＡｂ：制限酵素を使用しない可変ドメインのクローニング
ＶＨおよびＶＬ可変ドメインを配列決定するために、ＤＮＡ配列決定に適したベクター中に制限酵素を使用せずにクローニングした。メーカーの説明書に従い、ＴＡ－Ｃｌｏｎｉｎｇ ＫｉｔまたはＺｅｒｏ－Ｂｌｕｎｔ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。
ＶＨおよびＶＬ可変ドメインを配列決定するために、ＤＮＡ配列決定に適したベクター中に制限酵素を使用せずにクローニングした。メーカーの説明書に従い、ＴＡ－Ｃｌｏｎｉｎｇ ＫｉｔまたはＺｅｒｏ－Ｂｌｕｎｔ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。
【0162】
ＤＮＡ電気泳動およびアガロースゲルからの精製
ＤＮＡ電気泳動は、電場を使用して、アガロースゲルマトリックスを通して、負に荷電したＤＮＡを正電極に向かって移動させる。ＰＣＲ産物および制限酵素消化ＤＮＡを、異なるサイズのフラグメントを分離するために、２ｌｏｇ ＤＮＡラダー（ＮＥＢ）と一緒に、臭化エチジウムで染色したアガロースゲル（ＴＡＥ（Ｔｒｉｓ、酢酸、ＥＤＴＡ）緩衝液中１．５％アガロース）上で泳動した。電気泳動は１００Ｖで行った。従って、目的のバンドを、清潔なメスを用いてゲルから切り出し、そしてＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、製造者の説明書に従って精製した。精製したＤＮＡを３０μｌのＰＣＲ等級のＨ２Ｏで溶出した。
ＤＮＡ電気泳動は、電場を使用して、アガロースゲルマトリックスを通して、負に荷電したＤＮＡを正電極に向かって移動させる。ＰＣＲ産物および制限酵素消化ＤＮＡを、異なるサイズのフラグメントを分離するために、２ｌｏｇ ＤＮＡラダー（ＮＥＢ）と一緒に、臭化エチジウムで染色したアガロースゲル（ＴＡＥ（Ｔｒｉｓ、酢酸、ＥＤＴＡ）緩衝液中１．５％アガロース）上で泳動した。電気泳動は１００Ｖで行った。従って、目的のバンドを、清潔なメスを用いてゲルから切り出し、そしてＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、製造者の説明書に従って精製した。精製したＤＮＡを３０μｌのＰＣＲ等級のＨ２Ｏで溶出した。
【0163】
オーバーラップエクステンションＰＣＲ（Ｏｖｅｒｌａｐ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ：ＳＯＥ－ＰＣＲ）によるスプライシング
ＳｃＦｖ構築物は、（Ｗａｎｇら、２０００）に記載されたプライマーを変更して用いて、オーバーラップエクステンションＰＣＲ（ＳＯＥ－ＰＣＲ）により、ＶＬ－リンカー－ＶＨという順序でスプライシングによって組立てられた（表３）。可変ドメインを連結するポリペプチドリンカーを、４つのＧＧＧＧＳ反復として設計した。
ＳｃＦｖ構築物は、（Ｗａｎｇら、２０００）に記載されたプライマーを変更して用いて、オーバーラップエクステンションＰＣＲ（ＳＯＥ－ＰＣＲ）により、ＶＬ－リンカー－ＶＨという順序でスプライシングによって組立てられた（表３）。可変ドメインを連結するポリペプチドリンカーを、４つのＧＧＧＧＳ反復として設計した。
【0164】
【表9】
【0165】
プロトコルは、図１０に示す２つのステップからなる。最初のステップでは、ＶＬの３’末端にリンカーの最初の３つのＧＧＧＧＳ反復配列をコードする配列を付加し、ＶＨの５’末端にリンカーの最後の２つのＧＧＧＧＳ反復配列をコードする配列を付加することができる。このステップの間、ＶＬの５’末端およびＶＨの３’末端に、発現ベクターにおけるＶＬ－リンカー－ＶＨ構築物のクローニングに使用される制限部位も取り付けられる。第２のステップは、ＶＬの３’末端およびＶＨの５’末端での重複配列（１５ｂｐ）によって、２つのＰＣＲ産物を結合することを可能にする。
【0166】
第１のステップでは、２つの平行なＰＣＲを行った。一方はＶＬＦＯＲＳＦＩ－ＶＬＲＥＶＳＯＥプライマー対およびｐＣＲＩＩ－ＶＬテンプレートを用い、他方はＶＨＦＯＲＳＯＥ－ＶＨＲＥＶＮＯＴプライマー対およびｐＣＲＩＩ－ＶＨテンプレートを用いた。ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用するＰＣＲプロトコルを、これまでに記載されたように行った。
【0167】
第２のステップでは、第１のステップで実施した各ＰＣＲ反応物１μｌとＶＬＦＯＲＳＦＩ－ＶＨＲＥＶＮＯＴプライマー対を鋳型として使用して、以下のプロトコルに従ってＳＯＥ－ＰＣＲを行った。
【0168】
【表10】
【0169】
混合物（５０μｌ）を、以下のプロトコルに従ってサーモサイクラー中でインキュベートした。
【0170】
【表11】
【0171】
ステップ２～４を３０回繰り返した。
【0172】
２９．抗ｈＥＲＧ１－β１一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）－ｓｃＤｂ－ｈＥＲＧ１－β１抗体の産生と特徴づけ
構築物ｈＥＲＧ１－β１－ｓｃＤｂを、これまでに記載されたスフェロプラスティング技術に従ってＧＳ１１５ピキア・パストリス株に形質転換し、タンパク質を、ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１およびｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ抗体についてこれまでに記載された発現および精製プロトコルを適用して発現および精製した。
構築物ｈＥＲＧ１－β１－ｓｃＤｂを、これまでに記載されたスフェロプラスティング技術に従ってＧＳ１１５ピキア・パストリス株に形質転換し、タンパク質を、ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１およびｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ抗体についてこれまでに記載された発現および精製プロトコルを適用して発現および精製した。
【0173】
細胞ＥＬＩＳＡ
生細胞に対する細胞ＥＬＩＳＡを、Ｓｅｔｔｅら（２０１３）に従って行った。ＨＥＫ２９３ＷＴ（ｈＥＲＧ１－／β１＋）およびＨＥＫ２９３－ｈＥＲＧ１（ｈＥＲＧ１＋／β１＋）細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を加えたＤＭＥＭ中で９６ウェルプレートに半密集状態で播種し、３７℃および５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、抗ｈＥＲＧ１－β１－ｓｃＤｂを異なる濃度で培養培地に希釈し、室温で２時間細胞に添加した。以下のステップは上記と同様である。
生細胞に対する細胞ＥＬＩＳＡを、Ｓｅｔｔｅら（２０１３）に従って行った。ＨＥＫ２９３ＷＴ（ｈＥＲＧ１－／β１＋）およびＨＥＫ２９３－ｈＥＲＧ１（ｈＥＲＧ１＋／β１＋）細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を加えたＤＭＥＭ中で９６ウェルプレートに半密集状態で播種し、３７℃および５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、抗ｈＥＲＧ１－β１－ｓｃＤｂを異なる濃度で培養培地に希釈し、室温で２時間細胞に添加した。以下のステップは上記と同様である。
【0174】
免疫蛍光（ＩＦ）
ＩＦは、これまでに記載されたプロトコルに従って行った。カバースリップをＢＳＡおよびフィブロネクチンで２時間コーティングした。ＩＦは、ＨＥＫ２９３ＷＴ（ｈＥＲＧ１－／β１＋）、ＨＥＫ２９３－ｈＥＲＧ１（ｈＥＲＧ１＋／β１＋）およびＧＤ２５ＷＴ細胞（ｈＥＲＧ１－／β１－）で行った。
ＩＦは、これまでに記載されたプロトコルに従って行った。カバースリップをＢＳＡおよびフィブロネクチンで２時間コーティングした。ＩＦは、ＨＥＫ２９３ＷＴ（ｈＥＲＧ１－／β１＋）、ＨＥＫ２９３－ｈＥＲＧ１（ｈＥＲＧ１＋／β１＋）およびＧＤ２５ＷＴ細胞（ｈＥＲＧ１－／β１－）で行った。
【0175】
３０．抗ｈＥＲＧ１－β１一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）－ｓｃＤｂ－ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ－β１抗体の産生と予備的特性化
ｓｃＤｂ－ｈＥＲＧ１－β１突然変異誘発
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）ＸＬ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ｐＰＩＣ９ＫにクローニングしたｓｃＤｂ－ｈＥＲＧ１－β１発現カセット上で突然変異誘発を行った。Ｃｙｓアミノ酸の導入に適したプライマーは、製造業者の説明書に従って設計され、Ｐｒｉｍｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ、レフトプライマー：ＧＧＡＴＴＣＴＧＣＡＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＣＡＧＧＴＴＧＧＧＧＡＣＣＴＧ（配列番号２１）；ライトプライマー：ＣＡＧＧＴＣＣＣＣＡＡＣＣＴＧＴＴＧＣＡＣＡＧＴＡＡＴＡＧＡＣＴＧＣＡＧＡＡＴＣＣ（配列番号２２））によって設計された。
ｓｃＤｂ－ｈＥＲＧ１－β１突然変異誘発
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）ＸＬ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ｐＰＩＣ９ＫにクローニングしたｓｃＤｂ－ｈＥＲＧ１－β１発現カセット上で突然変異誘発を行った。Ｃｙｓアミノ酸の導入に適したプライマーは、製造業者の説明書に従って設計され、Ｐｒｉｍｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ、レフトプライマー：ＧＧＡＴＴＣＴＧＣＡＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＣＡＧＧＴＴＧＧＧＧＡＣＣＴＧ（配列番号２１）；ライトプライマー：ＣＡＧＧＴＣＣＣＣＡＡＣＣＴＧＴＴＧＣＡＣＡＧＴＡＡＴＡＧＡＣＴＧＣＡＧＡＡＴＣＣ（配列番号２２））によって設計された。
【0176】
試料反応液は以下のように調製した。５μｌの１０Ｘ反応緩衝液、１μｌのｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１ ｄｓＤＮＡテンプレート（１３ｎｇ／μｌ）、１．８４μｌ（１２５ｎｇ）レフトプライマー、１．８４μｌ（１２５ｎｇ）ライトプライマー、１μｌのｄＮＴＰ混合物、３μｌのＱｕｉｃｋＳｏｌｕｔｉｏｎ、３６．３２μｌのｄｄＨ２Ｏ。次いで１μｌのＰｆｕＴｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ／μｌ）を添加した。サイクル条件を次のように調整した。初期融解を９５℃で１分間行い、続いて３工程プログラム（９５℃、５０秒、６０℃、５０秒および６８℃、４分）を１８サイクル行った。次いで、反応物を６８℃で７分間保持し、４℃に冷却した。
【0177】
増幅反応後、１μｌのＤｎｐＩ制限酵素（１０Ｕ／μｌ）を反応混合物に直接添加し、直後に３７℃で１時間インキュベートして親を消化した。この時点で、細菌ＤＨ５α超コンピテント細胞はヒートショックを通して形質転換された。細胞を氷上で穏やかに解凍し、２μｌのＤｐＩ処理ＤＮＡを、２００μｌの超コンピテント細胞の別個のアリコートに移した。反応物を氷上で３０分間インキュベートした。次いで、チューブを乾燥浴中４２℃で４５秒間加熱パルスした。チューブを氷上で２分間インキュベートした。細胞を４５０μｌのＳＯＣ培地（１ｍＭ ＭｇＳＯ４、１ｍＭ ＭｇＣｌ２を補充したＳＯＢ培地）で回収し、振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。細菌を、アンピシリン抗生物質（５０μｇ／ｍｌ）を含有する予備加温ＬＢ－寒天プレートに播種し、蓋側を下にして３７℃で一晩インキュベートした。
【0178】
翌日、いくつかのコロニーを増殖させ、それらのいくつかを採取し、ＤＮＡを抽出し、配列決定して、所望の突然変異の存在を確認した。得られた構築物をｓｃＤｂ－ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ－β１と標識した。
【0179】
ｓｃＤｂ－ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ－β１抗体の発現および精製
ｓｃＤｂ－ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ－β１を、これまでに記載されたスフェロプラスティング技術に従ってＧＳ１１５ピキア・パストリス酵母株において形質転換し、タンパク質を、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ（Ｇｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１およびｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ抗体についてこれまでに記載された発現および精製プロトコルを適用して発現および精製した。クロマトグラムは、Ｕｎｉｃｏｒｎ ７．０ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて分析した。
ｓｃＤｂ－ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ－β１を、これまでに記載されたスフェロプラスティング技術に従ってＧＳ１１５ピキア・パストリス酵母株において形質転換し、タンパク質を、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ（Ｇｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１およびｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ抗体についてこれまでに記載された発現および精製プロトコルを適用して発現および精製した。クロマトグラムは、Ｕｎｉｃｏｒｎ ７．０ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて分析した。
【0180】
免疫蛍光（ＩＦ）
ＩＦは、これまでに記載したプロトコルに従って行った。カバースリップをＢＳＡおよびフィブロネクチンで２時間コーティングした。ＩＦは、ＧＤ２５ＷＴ細胞（ｈＥＲＧ１－／β１－）、ＨＥＫ２９３ＷＴ（ｈＥＲＧ１－／β１＋）、ＨＥＫ２９３－ｈＥＲＧ１（ｈＥＲＧ１＋／β１＋）に対して、先に記載したプロトコルに従って行った。ＩＦは、Ａｌｅｘａ４８８フルオロフォアと結合したｓｃＤｂ－ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ－β１を用いて行った。
ＩＦは、これまでに記載したプロトコルに従って行った。カバースリップをＢＳＡおよびフィブロネクチンで２時間コーティングした。ＩＦは、ＧＤ２５ＷＴ細胞（ｈＥＲＧ１－／β１－）、ＨＥＫ２９３ＷＴ（ｈＥＲＧ１－／β１＋）、ＨＥＫ２９３－ｈＥＲＧ１（ｈＥＲＧ１＋／β１＋）に対して、先に記載したプロトコルに従って行った。ＩＦは、Ａｌｅｘａ４８８フルオロフォアと結合したｓｃＤｂ－ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ－β１を用いて行った。
【0181】
生存率アッセイ
９６ウェルプレートでＰＡＮＣ－１（膵管腺癌）細胞およびＭＤＡ－ＭＢ２３１（乳癌）細胞を５×１０５で播種し、一晩成長させた。翌日、細胞を異なる希釈（０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ）でｓｃＤｂ－ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ－β１で処理し、抗体と共に２４時間インキュベートした。各条件を３連で行った。
９６ウェルプレートでＰＡＮＣ－１（膵管腺癌）細胞およびＭＤＡ－ＭＢ２３１（乳癌）細胞を５×１０５で播種し、一晩成長させた。翌日、細胞を異なる希釈（０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ）でｓｃＤｂ－ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ－β１で処理し、抗体と共に２４時間インキュベートした。各条件を３連で行った。
【0182】
インキュベーション後、細胞を分離し、計数し、ＩＣ５０の決定のために、Ｏｒｉｇｉｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅを適用した。
【0183】
３Ｄスフェロイド培養
１０３のＰＡＮＣ－１およびＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞を９６ウェルプレートのアガロース基層（１．５ｇ／ｌ）上に播種し、３７℃および５％ＣＯ２の加湿インキュベーター中で７２時間増殖させた。次いで、ｓｃＤｂ－ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ－β１を投与し（４０μｇ／ｍｌ）、培養培地で希釈し、一方、抗体を含まない新鮮な培地を、陰性対照として処理した細胞を含むウェルに添加した。Ｎｉｋｏｎ、Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ３００顕微鏡を用いて細胞増殖をモニターするために、２４時間で写真を撮った。
１０３のＰＡＮＣ－１およびＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞を９６ウェルプレートのアガロース基層（１．５ｇ／ｌ）上に播種し、３７℃および５％ＣＯ２の加湿インキュベーター中で７２時間増殖させた。次いで、ｓｃＤｂ－ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ－β１を投与し（４０μｇ／ｍｌ）、培養培地で希釈し、一方、抗体を含まない新鮮な培地を、陰性対照として処理した細胞を含むウェルに添加した。Ｎｉｋｏｎ、Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ３００顕微鏡を用いて細胞増殖をモニターするために、２４時間で写真を撮った。
【0184】
側方運動性アッセイ
細胞を最初の濃度５×１０５で３５ｍｍペトリ皿にプレートし、２４時間静置した。
細胞を最初の濃度５×１０５で３５ｍｍペトリ皿にプレートし、２４時間静置した。
【0185】
側方運動性（ｌａｔｅｒａｌ ｍｏｔｉｌｉｔｙ）は、単層創傷アッセイ（Ｓｉｌｌｅｔｔｉら、１９９５；ＰｅｃｋおよびＩｓａｃｋｅ、１９９６）によって評価した。その後直ちに（０時間）、創傷の幅を、４５の固定点で創傷の幅を測定することによって決定した。
【0186】
細胞運動性を、以下のように定義される「運動性指数」（ＭＩ）として定量した。
ＭＩ＝１－（Ｗｔ／Ｗｏ）
ＭＩ＝０は細胞の移動がないことを示し、ＭＩ＝１の値は完全な創傷閉鎖を示した。
ＭＩ＝１－（Ｗｔ／Ｗｏ）
ＭＩ＝０は細胞の移動がないことを示し、ＭＩ＝１の値は完全な創傷閉鎖を示した。
【0187】
ｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８ＣｙｓおよびｓｃＤｂ－ｈＥＲＧ１－Ｃｙｓ－β１抗体の生体内分布
１６０μｇの各抗体を２匹のＢａｌｂ／ｃマウスに静脈内注射した。血液試料を、静脈内投与後の異なる時点、注射後５分、１０分、３０分、１時間、２時間、６時間、２４時間、で各マウスから採取した。血液試料を処理し、血漿を単離した。血漿試料についてのＥＬＩＳＡ試験は、このセクションにおいてこれまでに記載されたプロトコルに従って行った。Ｐｒｅｃｉｓｅ ＰＫ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ Ｓｏｆｔｗａｒｅを適用してｔ１／２を算出した。
１６０μｇの各抗体を２匹のＢａｌｂ／ｃマウスに静脈内注射した。血液試料を、静脈内投与後の異なる時点、注射後５分、１０分、３０分、１時間、２時間、６時間、２４時間、で各マウスから採取した。血液試料を処理し、血漿を単離した。血漿試料についてのＥＬＩＳＡ試験は、このセクションにおいてこれまでに記載されたプロトコルに従って行った。Ｐｒｅｃｉｓｅ ＰＫ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ Ｓｏｆｔｗａｒｅを適用してｔ１／２を算出した。
【0188】
ＥＣＧ測定
ＥＣＧ測定は、抗体投与の前、および抗体の静脈内注射の１５分後に連続的に行った。
ＥＣＧ測定は、抗体投与の前、および抗体の静脈内注射の１５分後に連続的に行った。
【0189】
インビボ実験
インビボ分析
Ａｌｅｘａ７５０によるｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓの標識：ＰＢＳ溶液中２ｍｇ／ｍｌの濃度の１５０μｇのｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓおよび０．１Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）を、１２μｌのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７５０ ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒ（スクシンイミジルエステル）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と撹拌しながら２２℃で１時間インキュベートし、１０ｍｇ／ｍｌでＤＭＳＯに再懸濁した。反応物を氷中で５分間ブロックし、標識タンパク質を、ＰＢＳで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５（Ｓｉｇｍａ）カラム上でのサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。
インビボ分析
Ａｌｅｘａ７５０によるｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓの標識：ＰＢＳ溶液中２ｍｇ／ｍｌの濃度の１５０μｇのｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓおよび０．１Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）を、１２μｌのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７５０ ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒ（スクシンイミジルエステル）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と撹拌しながら２２℃で１時間インキュベートし、１０ｍｇ／ｍｌでＤＭＳＯに再懸濁した。反応物を氷中で５分間ブロックし、標識タンパク質を、ＰＢＳで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５（Ｓｉｇｍａ）カラム上でのサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。
【0190】
インビボイメージング。３匹の６週齢の雌性免疫不全無胸腺ヌードＦｏｘｎ１ ｎｕ／ｎｕマウスに、フルオロフォアＡｌｅｘａ７５０で標識したｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓ５０μｌ（１ｎｍ色素／マウス）を静脈内注射し、抗体注射の５分、１０分、６０分および２４時間後に蛍光を測定した。１匹の対照マウスを無菌ＰＢＳ溶液で処理した。全ての蛍光発光スペクトルは、Ｐｈｏｔｏｎ ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏｓｐａｃｅ Ｌａｂ）を用いて測定した。このイメージャーは、蛍光励起のためのレーザー源（λ＝６７９ｎｍ）、蛍光検出のための発光フィルター（λ＝７０２ｎｍ）、およびデータ分析のためのコンピューターを有した。
【0191】
マウスモデル：ＭＩＡＰａＣａ－２細胞株を、Ｌａｓｔｒａｉｏｌｉら、２０１５に記載されるように、腫瘍細胞移植のために使用した。細胞を、Ｌ－グルタミン（４ｍＭ）、１０％ウシ胎児血清およびＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｇ４１８）（２．４ｍｇ／ｍｌ）（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＤＭＥＭ中、３７℃で、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中で培養した。ＭＩＡＰａＣａ－２－ｌｕｃ細胞をｎｕ／ｎｕマウスの膵臓に注射し、この動物を細胞接種後（［１７］に記載されるように）および４５日目にモニターし、マウスにｓｃＦｖ－ｈＥＲＧ１－Ｄ８Ｃｙｓ－Ａｌｅｘａ７５０抗体を投与した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13(1)】
【図13(2)】
【図14(1)】
【図14(2)】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【配列表】