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▶ ルーメン バイオサイエンス， インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-11-02
(45)【発行日】2023-11-13
(54)【発明の名称】スピルリナにおける標的化された突然変異誘発
(51)【国際特許分類】
C12N 15/90 20060101AFI20231106BHJP
C12N 1/13 20060101ALI20231106BHJP
C12N 15/64 20060101ALI20231106BHJP
【ＦＩ】
C12N15/90 100Z
C12N1/13 ZNA
C12N15/64 Z
【請求項の数】
11
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2019105177
(22)【出願日】2019-06-05
(62)【分割の表示】P 2017511896の分割
【原出願日】2015-09-09
(65)【公開番号】P2019141106
(43)【公開日】2019-08-29
【審査請求日】2019-06-05
【審判番号】
【審判請求日】2022-03-07
(31)【優先権主張番号】62/047,811
(32)【優先日】2014-09-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】517208285
【氏名又は名称】ルーメン バイオサイエンス， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】武内 亮
(72)【発明者】
【氏名】ジェイムズ ロバーツ
【合議体】
【審判長】福井 悟
【審判官】加々美 一恵
【審判官】天野 貴子
(56)【参考文献】
【文献】特開平６－２５３８６３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００４－２４２３２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１７－５２６３７２（ＪＰ，Ａ）
【文献】ＡＬＧＡＥ ＡＮＤ ＴＨＥＩＲ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＰＯＴＥＮＴＩＡＬ、２００１、ｐ２６３～２６９、ＵＲＬ、ｈｔｔｐｓ：／／ｌｉｎｋ．ｓｐｒｉｎｇｅｒ．ｃｏｍ／ｃｈａｐｔｅｒ／１０．１００７％２Ｆ９７８－９４－０１５－９８３５－４＿２０
【文献】Ｍａｒｉｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００４年、６、ｐ３５５－３６３
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
C12N15/00-15/90
ＣＡＰＬＵＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰＬＵＳ／ＪＭＥＤＰＬＵＳ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
天然に存在しない安定な形質転換体スピルリナであって、前記形質転換体スピルリナは、あらかじめ決定されたゲノム位置においてスピルリナゲノムの中に組み込まれた、少なくとも１つの導入され標的化されたヌクレオチド突然変異を含み、
前記形質転換体スピルリナは、
ポリエーテル浸透圧安定剤とスピルリナを接触させること；
前記あらかじめ決定されたゲノム位置に隣接する領域と相同なヌクレオチド配列を含む２つのヌクレオチドホモロジーアームと前記ヌクレオチドホモロジ－アーム間のヌクレオチド突然変異を有するヌクレオチド配列を有するベクターと、前記スピルリナを接触させること；および、
前記スピルリナにおいて、エレクトロポレーションにより人工的コンピテンスを誘導すること；を含む、相同組換え方法で製造され、
ここで、前記少なくとも１つの導入され標的化されたヌクレオチド突然変異は、相同組換えのために使用される前記ベクター内に含まれる２つのヌクレオチドホモロジーアームと相同なヌクレオチドの領域に隣接し、
ここで、前記導入され標的化されたヌクレオチド突然変異が、少なくとも５０世代の間安定である、形質転換体スピルリナ。
【請求項2】
前記スピルリナがＡｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓまたはＡｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａである、請求項１に記載のスピルリナ。
【請求項3】
前記スピルリナがＡｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓのＮＩＥＳ－３９またはＡｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ． ＰＣＣ ８００５である、請求項２に記載のスピルリナ。
【請求項4】
前記少なくとも１つの導入され標的化されたヌクレオチド突然変異が、遺伝子の少なくとも一部分の欠失または破壊を含む、請求項１に記載のスピルリナ。
【請求項5】
前記少なくとも１つの導入され標的化されたヌクレオチド突然変異が内在性遺伝子の追加コピーの追加または外来性遺伝子の追加を含む、請求項１に記載のスピルリナ。
【請求項6】
前記少なくとも１つの導入され標的化されたヌクレオチド突然変異が遺伝子調節エレメントの追加を含む、請求項１に記載のスピルリナ。
【請求項7】
前記遺伝子調節エレメントが、プロモーター、調節タンパク質結合部位、ＲＮＡ結合部位、リボソーム結合部位、またはＲＮＡ安定性エレメントである、請求項６に記載のスピルリナ。
【請求項8】
前記少なくとも１つの導入され標的化されたヌクレオチド突然変異が外来性タンパク質ドメインの追加を含む、請求項１に記載のスピルリナ。
【請求項9】
前記外来性タンパク質ドメインが、リン酸化部位、安定性ドメイン、タンパク質標的化ドメイン、またはタンパク質－タンパク質相互作用ドメインである、請求項８に記載のスピルリナ。
【請求項10】
前記内在性遺伝子がフィコシアニンをコードし、野生型スピルリナと比較して増加した量のフィコシアニンを産生する、請求項５に記載のスピルリナ。
【請求項11】
前記少なくとも１つの導入され標的化されたヌクレオチド突然変異が、ヌクレオチド配列を挿入または欠失する相同組換えのために使用される２つのヌクレオチド領域に隣接する、請求項１に記載の天然に存在しない安定な形質転換体スピルリナ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
優先権の主張
本出願は、２０１４年９月９日に出願された米国仮特許出願第６２／０４７，８１１号の優先権を主張し、その全体は参照により本明細書に援用される。
本出願は、２０１４年９月９日に出願された米国仮特許出願第６２／０４７，８１１号の優先権を主張し、その全体は参照により本明細書に援用される。
【0002】
配列リスト
本出願に関連する配列リストは、紙コピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書の中に援用される。配列リストを含有するテキストファイルの名称はＭ０７７－００１７ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは約７３ＫＢであり、２０１５年９月９日に生成され、ＥＦＳウェブ経由で電子的に提出されている。
本出願に関連する配列リストは、紙コピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書の中に援用される。配列リストを含有するテキストファイルの名称はＭ０７７－００１７ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは約７３ＫＢであり、２０１５年９月９日に生成され、ＥＦＳウェブ経由で電子的に提出されている。
【背景技術】
【0003】
シアノバクテリア（藍藻類とも呼ばれる）は、クロロフィルＡ及び水を使用して、二酸化炭素を還元しエネルギー含有化合物を生成する光合成生物である。スピルリナは、種Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ及びＡｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａを含む、浮遊性の糸状シアノバクテリアである。これらの２つの種は、以前はＳｐｉｒｕｌｉｎａ属に分類されたが、現在、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ属に分類される。しかしながら、「スピルリナ」という用語の使用は残っている。
【0004】
シアノバクテリアは、一般的には遺伝子操作に適する。しかしながら、スピルリナのための遺伝子操作ツールは限定されている。遺伝子操作のための多くの技法は、細菌細胞の中へ外来性（異種）の遺伝物質を導入することに基づく。細胞は、周囲の環境から遺伝物質を取り込む「コンピテンス」の状態でなくてはならない。いくつかのタイプの細菌は、遺伝物質を天然で取り込むことができる。これらのタイプの細菌は「天然のコンピテンス」を有すると称される。より一般には、「人工的コンピテンス」は細胞を一時的に遺伝物質に対して透過性のあるようにすることによって誘導される。外側の細胞膜の透過性を増加させることによって人工的コンピテンスを導入するための技法には、化学溶液中でのインキュベーション、熱ショック、及び細胞を電場へさらすエレクトロポレーションが含まれる。外来性遺伝物質を取り込み、ゲノムの中への新しい遺伝物質を組み入れる、コンピテンスの状態である細胞は、「形質転換」を受ける予定であると言われる。
【0005】
スピルリナ染色体の中へのＤＮＡのランダムな組み込みによって形質転換することが困難であると、スピルリナは長らく認識されており、本出願人は、特異的なあらかじめ決定された染色体位置の中へのＤＮＡの標的化された導入によるスピルリナゲノムの改変を主張するいかなる報告も承知していない。クロラムフェニコール耐性についての遺伝子を導入するためにエレクトロポレーションを使用する試みは、特定のエレクトロポレーション条件下でクロラムフェニコール耐性をもたらしたが、形質転換は安定的ではなかった（すなわち、クロラムフェニコール耐性は持続的にならなかった）。強いプロモーターへカップルされたクロラムフェニコール耐性遺伝子でエレクトロポレーションの使用によってスピルリナを形質転換する、続いて行なわれた試みは、クロラムフェニコールの存在下において１２か月間細胞の増殖を達成したが、この方法は、クロラムフェニコール耐性遺伝子がスピルリナ染色体中でランダムな（標的化されてない）位置に位置することのみを可能にし、外来性ＤＮＡのこのランダムな組み込みでさえも確定的に実証されなかった。近年、ランダム突然変異誘発は、大気圧常温プラズマ（ＡＲＴＰ）を使用して、Ｓ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓ（Ａ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）中で達成された。しかしながら、ランダム突然変異誘発は外来性遺伝物質の導入を介してスピルリナ細胞を形質転換せず、むしろ、突然変異がゲノム中のランダムな部位で導入されてしまう。シアノバクテリア（特にスピルリナ）の中へ、あらかじめ決定された染色体位置で外来性ＤＮＡを安定的に導入するやり方についての理解の欠如から、他の生物体（Ｅ．ｃｏｌｉまたは酵母等）と比較して、シアノバクテリアで作業することは難題であると認識される。ランダム突然変異誘発によりある程度のレベルの成功があったが、本研究は、外来性遺伝子の導入及び発現によってＳ．ｐｌａｎｔｅｎｓｉｓを突然変異させるための効果的なシステムが持続的に欠如していることにもハイライトを当てた。さらに、上記の技法のどれも、スピルリナゲノムの特異的な前もって決定された領域への標的化された突然変異の導入を試みていない。
【0006】
スピルリナにおいて安定的な形質転換体を効率的に生成する技法についての必要性は依然として存在する。さらに、スピルリナゲノム中への突然変異の標的化された導入を可能にする技法についての必要性もある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0007】
本開示は、スピルリナのゲノムへの安定的な標的化された突然変異の導入のための技法を記載する。本開示は、安定的な標的化された突然変異を含有するように改変されたスピルリナも記載する。加えて、本開示は、１つまたは複数の安定的な標的化された突然変異を含むように改変されたスピルリナを使用して対象となる製品を製造するための技法を記載した。
【0008】
本開示は、浸透圧安定剤とスピルリナを接触させること、ホモロジーアームを有するベクターとスピルリナを接触させること、及びスピルリナにおいて人工的コンピテンスを誘導することによって、スピルリナにおいて標的化された突然変異を生成する方法を記載する。一実施形態において、スピルリナは、Ａｔｈｒｏｓｐｉｒｉａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓのＮＩＥＳ－３９またはＡｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ． ＰＣＣ ８００５であり得る。浸透圧安定剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール、グリセロール、ブドウ糖、ショ糖、またはその任意の組み合わせであり得るが、これらに限定されない。ベクターは、ＤＮＡベクター、直線状ベクター、環状ベクター、単一鎖ポリヌクレオチド、または二本鎖ポリヌクレオチドであり得る。一実施形態において、ベクターは例えばｐＡｐｌ－ｐｉｌＡ／ａａｄＡプラスミドであり得る。
【0009】
一実施形態において、ホモロジーアームは同じ長さであり得る。一実施形態において、ホモロジーアームは異なる長さであり得る。ホモロジーアームの１つまたは両方は、少なくとも約５００ｂｐ、少なくとも約１０００ｂｐ、少なくとも約１５００ｂｐ、または少なくとも約２０００ｂｐであり得る。
【0010】
一実施形態において、人工的コンピテンスは、原核生物細胞において人工的コンピテンスを導入するための任意の公知の技法（二価陽イオンを含有する溶液中でのインキュベーション、エレクトロポレーション、及び超音波が含まれる）によっても誘導され得る。
【0011】
一実施形態において、本方法はｐＨバランサーとスピルリナを接触させることも含み得る。スピルリナは、ベクターとスピルリナを接触させる前または後にｐＨバランサーに接触させることができる。一実施形態において、ｐＨバランサーとの接触後のスピルリナのｐＨは約７．０～約８．０である。
【0012】
本開示は、少なくとも１つの安定的な標的化された突然変異を含むスピルリナを記載する。一実施形態において、スピルリナは、Ａｔｈｒｏｓｐｉｒｉａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｔｈｒｏｓｐｉｒｉａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓのＮＩＥＳ－３９、またはＡｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａである。一実施形態において、安定的な標的化された突然変異は、少なくとも５世代、少なくとも１０世代、少なくとも２０世代、少なくとも３０世代、少なくとも４０世代、または少なくとも５０世代の間、遺伝的に継承される。突然変異は、任意のタイプのゲノムへの改変（遺伝子の少なくとも一部分の欠失若しくは破壊、内在性遺伝子の追加コピーの挿入、または外来性遺伝子の追加が含まれる）であり得る。一実施形態において、標的化された突然変異には、外来性のタンパク質ドメインの追加（翻訳後修飾部位、タンパク質安定化ドメイン、細胞局在シグナル、及びタンパク質－タンパク質相互作用ドメインが含まれる）が含まれ得る。一実施形態において、標的化された突然変異は、タンパク質へと翻訳されない核酸配列の追加を含み、それらには、非コーディングＲＮＡ分子、遺伝子調節エレメント、プロモーター、調節タンパク質結合部位、ＲＮＡ結合部位、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、またはＲＮＡ安定化エレメントが含まれるが、これらに限定されない。
【0013】
本開示は、少なくとも１つのタンパク質の遺伝子座の少なくとも一部分と相同な配列及び改変を含む少なくとも１つのＤＮＡコンストラクトによるスピルリナ細胞の形質転換ならびに前記遺伝子座での前記ＤＮＡコンストラクトの組み込みによって前記タンパク質の遺伝子座で前記改変を導入した結果として、少なくとも１つのタンパク質を欠くスピルリナ細胞であって、他の点ではその生来の様式で機能することが可能な該スピルリナ細胞も記載する。
本開示の特定の態様では、例えば以下の項目が提供される：
（項目１）
少なくとも１つの安定的な標的化された突然変異を含む、スピルリナ。
（項目２）
前記スピルリナがＡｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓまたはＡｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａである、項目１に記載のスピルリナ。
（項目３）
前記スピルリナがＡｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓのＮＩＥＳ－３９またはＡｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ． ＰＣＣ ８００５である、項目２に記載のスピルリナ。
（項目４）
前記安定的な標的化された突然変異が、少なくとも１０世代の間遺伝的に継承される、項目１に記載のスピルリナ。
（項目５）
前記安定的な標的化された突然変異が、前記スピルリナの染色体の中へ組み込まれる、項目１に記載のスピルリナ。
（項目６）
前記標的化された突然変異が、遺伝子の少なくとも一部分の欠失または破壊を含む、項目１に記載のスピルリナ。
（項目７）
前記標的化された突然変異が内在性遺伝子の追加コピーの追加または外来性遺伝子の追加を含む、項目１に記載のスピルリナ。
（項目８）
前記標的化された突然変異が遺伝子調節エレメントの追加を含む、項目１に記載のスピルリナ。
（項目９）
前記遺伝子調節エレメントが、プロモーター、調節タンパク質結合部位、ＲＮＡ結合部位、リボソーム結合部位、またはＲＮＡ安定性エレメントである、項目８に記載のスピルリナ。
（項目１０）
前記標的化された突然変異が外来性タンパク質ドメインの追加を含む、項目１に記載のスピルリナ。
（項目１１）
前記外来性タンパク質ドメインが、リン酸化部位、安定性ドメイン、タンパク質標的化ドメイン、またはタンパク質－タンパク質相互作用ドメインである、項目１０に記載のスピルリナ。
（項目１２）
スピルリナにおいて標的化された突然変異を生成する方法であって、浸透圧安定剤と前記スピルリナを接触させることと；ホモロジーアームを有するベクターと前記スピルリナを接触させることと；前記スピルリナにおいて人工的コンピテンスを誘導することとを含む、前記方法。
（項目１３）
前記スピルリナがＳｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓである、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記スピルリナがＡｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓのＮＩＥＳ－３９またはＡｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ． ＰＣＣ ８００５である、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
前記浸透圧安定剤がポリエチレングリコール、エチレングリコール、グリセロール、グルコース、またはショ糖のうちの少なくとも１つである、項目１２に記載の方法。
（項目１６）
前記ベクターが、ＤＮＡベクター、直線状ベクター、環状ベクター、一本鎖ポリヌクレオチド、または二本鎖ポリヌクレオチドである、項目１２に記載の方法。
（項目１７）
前記ベクターが、配列番号：１、配列番号：２または配列番号：４を有するベクターを含む、項目１２に記載の方法。
（項目１８）
前記ホモロジーアームのうちの少なくとも１つが少なくとも５００ｂｐである、項目１２に記載の方法。
（項目１９）
前記ホモロジーアームのうちの少なくとも１つが少なくとも１０００ｂｐである、項目１２に記載の方法。
（項目２０）
前記ホモロジーアームのうちの少なくとも１つが少なくとも２０００ｂｐである、項目１２に記載の方法。
（項目２１）
前記人工的コンピテンスがエレクトロポレーションによって誘導される、項目１２に記載の方法。
（項目２２）
ｐＨバランサーと前記スピルリナを接触させることを更に含む、項目１２に記載の方法。
（項目２３）
前記ｐＨバランサーと前記スピルリナを接触させることが、前記ベクターと前記スピルリナを接触させることの前である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記スピルリナ及び前記ｐＨバランサーを含有する培地のｐＨが、約７～約８である、項目２２に記載の方法。
（項目２５）
少なくとも１つのタンパク質の遺伝子座の少なくとも一部分と相同な配列及び改変を含む少なくとも１つのＤＮＡコンストラクトによるスピルリナの形質転換ならびに前記遺伝子座での前記ＤＮＡコンストラクトの組み込みによって前記タンパク質の遺伝子座で前記改変を導入した結果として、前記少なくとも１つのタンパク質を欠くスピルリナであって、他の点ではその生来の様式で機能することが可能な前記スピルリナ。
（項目２６）
標的化された遺伝子座の少なくとも一部分と相同な配列及びフィコシアニンをコードする外来性遺伝子を含む少なくとも１つのＤＮＡコンストラクトによるスピルリナの形質転換ならびに前記遺伝子座でのＤＮＡコンストラクトの組み込みによって前記標的化された遺伝子座で前記外来性遺伝子を導入した結果として、前記フィコシアニンをコードする外来性遺伝子を含むスピルリナであって、野生型スピルリナと比較して増加した量のフィコシアニンを産生し、複数の世代を通して形質転換を維持する前記スピルリナ。
本開示の特定の態様では、例えば以下の項目が提供される：
（項目１）
少なくとも１つの安定的な標的化された突然変異を含む、スピルリナ。
（項目２）
前記スピルリナがＡｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓまたはＡｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａである、項目１に記載のスピルリナ。
（項目３）
前記スピルリナがＡｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓのＮＩＥＳ－３９またはＡｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ． ＰＣＣ ８００５である、項目２に記載のスピルリナ。
（項目４）
前記安定的な標的化された突然変異が、少なくとも１０世代の間遺伝的に継承される、項目１に記載のスピルリナ。
（項目５）
前記安定的な標的化された突然変異が、前記スピルリナの染色体の中へ組み込まれる、項目１に記載のスピルリナ。
（項目６）
前記標的化された突然変異が、遺伝子の少なくとも一部分の欠失または破壊を含む、項目１に記載のスピルリナ。
（項目７）
前記標的化された突然変異が内在性遺伝子の追加コピーの追加または外来性遺伝子の追加を含む、項目１に記載のスピルリナ。
（項目８）
前記標的化された突然変異が遺伝子調節エレメントの追加を含む、項目１に記載のスピルリナ。
（項目９）
前記遺伝子調節エレメントが、プロモーター、調節タンパク質結合部位、ＲＮＡ結合部位、リボソーム結合部位、またはＲＮＡ安定性エレメントである、項目８に記載のスピルリナ。
（項目１０）
前記標的化された突然変異が外来性タンパク質ドメインの追加を含む、項目１に記載のスピルリナ。
（項目１１）
前記外来性タンパク質ドメインが、リン酸化部位、安定性ドメイン、タンパク質標的化ドメイン、またはタンパク質－タンパク質相互作用ドメインである、項目１０に記載のスピルリナ。
（項目１２）
スピルリナにおいて標的化された突然変異を生成する方法であって、浸透圧安定剤と前記スピルリナを接触させることと；ホモロジーアームを有するベクターと前記スピルリナを接触させることと；前記スピルリナにおいて人工的コンピテンスを誘導することとを含む、前記方法。
（項目１３）
前記スピルリナがＳｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓである、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記スピルリナがＡｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓのＮＩＥＳ－３９またはＡｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ． ＰＣＣ ８００５である、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
前記浸透圧安定剤がポリエチレングリコール、エチレングリコール、グリセロール、グルコース、またはショ糖のうちの少なくとも１つである、項目１２に記載の方法。
（項目１６）
前記ベクターが、ＤＮＡベクター、直線状ベクター、環状ベクター、一本鎖ポリヌクレオチド、または二本鎖ポリヌクレオチドである、項目１２に記載の方法。
（項目１７）
前記ベクターが、配列番号：１、配列番号：２または配列番号：４を有するベクターを含む、項目１２に記載の方法。
（項目１８）
前記ホモロジーアームのうちの少なくとも１つが少なくとも５００ｂｐである、項目１２に記載の方法。
（項目１９）
前記ホモロジーアームのうちの少なくとも１つが少なくとも１０００ｂｐである、項目１２に記載の方法。
（項目２０）
前記ホモロジーアームのうちの少なくとも１つが少なくとも２０００ｂｐである、項目１２に記載の方法。
（項目２１）
前記人工的コンピテンスがエレクトロポレーションによって誘導される、項目１２に記載の方法。
（項目２２）
ｐＨバランサーと前記スピルリナを接触させることを更に含む、項目１２に記載の方法。
（項目２３）
前記ｐＨバランサーと前記スピルリナを接触させることが、前記ベクターと前記スピルリナを接触させることの前である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記スピルリナ及び前記ｐＨバランサーを含有する培地のｐＨが、約７～約８である、項目２２に記載の方法。
（項目２５）
少なくとも１つのタンパク質の遺伝子座の少なくとも一部分と相同な配列及び改変を含む少なくとも１つのＤＮＡコンストラクトによるスピルリナの形質転換ならびに前記遺伝子座での前記ＤＮＡコンストラクトの組み込みによって前記タンパク質の遺伝子座で前記改変を導入した結果として、前記少なくとも１つのタンパク質を欠くスピルリナであって、他の点ではその生来の様式で機能することが可能な前記スピルリナ。
（項目２６）
標的化された遺伝子座の少なくとも一部分と相同な配列及びフィコシアニンをコードする外来性遺伝子を含む少なくとも１つのＤＮＡコンストラクトによるスピルリナの形質転換ならびに前記遺伝子座でのＤＮＡコンストラクトの組み込みによって前記標的化された遺伝子座で前記外来性遺伝子を導入した結果として、前記フィコシアニンをコードする外来性遺伝子を含むスピルリナであって、野生型スピルリナと比較して増加した量のフィコシアニンを産生し、複数の世代を通して形質転換を維持する前記スピルリナ。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】Ａ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓの株ＮＩＥＳ－３９においてｐｉｌＡ遺伝子座（ＮＩＥＳ３９＿Ｃ０３０３０）を標的化するようにデザインされた左ホモロジーアーム及び右ホモロジーアームを示す。
【図2】Ａ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓの株ＮＩＥＳ－３９における標的化された突然変異誘発のために使用されるｐＡｐｌ－ｐｉｌＡ／ａａｄＡプラスミドを示す。図２のプラスミドは配列番号：１のヌクレオチド配列を有する。
【図3A-3C】図３Ａは、アミノグリコシドアデニルトランスフェラーゼ遺伝子（ａａｄＡ）を含有する図２のプラスミドによる、Ａ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓの株ＮＩＥＳ－３９におけるｐｉｌＡ遺伝子座（ＮＩＥＳ３９＿Ｃ０３０３０）での相同組換えの概略図を示す。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧとラベルされた５つのＰＣＲプライマー部位も示す。図３Ｂは、野生型Ａ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓ及び図２のプラスミドによる形質転換後のＡ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓの両方についての、プライマーＣ／Ｅ、Ａ／Ｄ、及びＢ／ＣによるＰＣＲ増幅の結果を示す。図３Ｃは、野生型Ａ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓにおけるｐｉｌＡ遺伝子配列のプライマーＦ／ＧによるＰＣＲ増幅及びａａｄＡを含有するベクターによる形質転換に後続するＡ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓにおける増幅の欠如の結果を示す。
【図4】Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ． ＰＣＣ ８００５における標的化された突然変異誘発のために使用されたｐＡｐｌ－ｐｉｌＡ８００５／ａａｄＡプラスミドを示す。図４のプラスミドは配列番号：２のヌクレオチド配列を有する。
【図5A】アミノグリコシドアデニルトランスフェラーゼ遺伝子（ａａｄＡ）を含有する図４のプラスミドによる、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ． ＰＣＣ ８００５中のｐｉｌＡ遺伝子座での相同組換えの概略図を示す。Ｈ、Ｉ及びＪとラベルされた３つのＰＣＲプライマー部位も示す。
【図5B】野生型のＡｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ． ＰＣＣ ８００５及び図４のプラスミドによる形質転換後のＡｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ． ＰＣＣ ８００５の両方についての、プライマーＨ／Ｉ及びＨ／ＪによるＰＣＲ増幅の結果を示す。
【図6】Ａ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓの株ＮＩＥＳ－３９における標的化された突然変異誘発によって、ｃｒｔＷ及びｃｒｔＺの遺伝子を、Ａ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓがアスタキサンチンを合成することを可能にするように導入する試みに使用されるｐＡｐｌ－ＮＳ１／Ｐｒｓ－ｃｒｔＷ－ｃｒｔＺプラスミドを示す。図６のプラスミドは配列番号：３のヌクレオチド配列を有する。
【図7】Ａ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓの株ＮＩＥＳ－３９における標的化された突然変異誘発によって、ｃｐｃＡ及びｃｐｃＢの遺伝子を、これらの２つの遺伝子の追加のコピーをＡｔｈｒｏｓｐｉｒａへ追加するように導入するために使用されるｐＡｐｌ－ＮＳ１／ａａｄＡ－ｃｐｃＢＡプラスミドを示す。これは、Ｃ－フィコシアニンを過剰産生するＡｔｈｒｏｓｐｉｒａの株をもたらす。図７のプラスミドは配列番号：４のヌクレオチド配列を有する。
【図8D】形質転換されたＡ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓが野生型Ａ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓに類似する増殖率を有することを示す。
【図9A】Ｃ－フィコシアニンを過剰産生するように形質転換されたＡ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓの株ＮＩＥＳ－３９からのタンパク質抽出物の濃い青色及び野生型Ａ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓの株ＮＩＥＳ－３９からの薄い青色のタンパク質抽出物を示す。
【図9B】形質転換されたＡ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓの株ＮＩＥＳ－３９及び野生型Ａ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓの株ＮＩＥＳ－３９からのタンパク質抽出物の間の吸収差を示すグラフである。形質転換されたＡ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓの株ＮＩＥＳ－３９は、野生型株よりも高い６２０ｎｍでの吸収を有する。
【発明を実施するための形態】
【0015】
定義
特別に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実践または試験において、本明細書において記述されたものに類似または同等の任意の方法及び材料を使用することができるが、例示的な方法及び材料が記述される。本発明の目的のために、下記の用語は以下に定義される。
特別に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実践または試験において、本明細書において記述されたものに類似または同等の任意の方法及び材料を使用することができるが、例示的な方法及び材料が記述される。本発明の目的のために、下記の用語は以下に定義される。
【0016】
「ａ」及び「ａｎ」という冠詞は、本明細書において、１つまたは２つ以上（すなわち少なくとも１つ）の冠詞の文法的な対象物を指すように使用される。一例として、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または２つ以上の要素を意味する。
【0017】
本明細書の全体にわたって、文脈が特別に要求しない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語は、明示されたステップ若しくは要素またはステップ若しくは要素の群を包含するが、他のステップ若しくは要素またはステップ若しくは要素の群を排除しないことを示唆することが理解されるだろう。
【0018】
本明細書において使用される時、「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、及び「有する（ｈａｖｅ）」という用語は、上で提供される「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」と同じ非制限的な意味を有する。
【0019】
「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」によって、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という語句に後続するものすべてを含み、それらに限定されることが意味される。したがって、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という語句は、リストされた要素が要求されるかまたは必須であり、他の要素が存在しなくてもよいことを指摘する。
【0020】
「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」によって、語句後にリストされた任意の要素を含み、リストされた要素についての本開示における規定された活性または作用を妨害しないかまたはそれに貢献する他の要素に限定されることが意味される。したがって、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という語句は、リストされた要素が要求されるかまたは必須であるが、その他の要素は随意であり、それらがリストされた要素の活性または作用に影響するかどうかに依存して存在または非存在であり得ることを指摘する。
【0021】
「約」によって、参照される分量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さに対して、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％ほどで変動する、分量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さが意味される。
【0022】
本記載は、本発明に関する特定のパラメーターを定量化するために数値範囲を使用する。数値範囲が提供される場合、かかる範囲は、範囲の下限値のみを列挙する請求の限定に加えて、範囲の上限値のみを列挙する請求の限定について文字どおりの支持を提供するとして解釈されることを理解すべきである。例えば、１０～１００の開示された数値範囲は、「１０を超えるもの」（上限なしで）を列挙する請求及び「１００未満のもの」（下限なしで）を列挙する請求について文字どおりの支持を提供し、１０及び１００のエンドポイントについて文字どおりの支持を提供し、それらを含む。
【0023】
本記載は、具体的な数値が明示的に数値範囲の一部でない場合に、本発明に関する特定のパラメーターを定量化するために具体的な数値を使用する。本明細書において提供される各々の具体的な数値は、広い範囲、中間的な範囲、及び狭い範囲について文字どおりの支持を提供するとして解釈されることを理解すべきである。各々の具体的な数値と関連する広い範囲は、２桁の有効数字に丸めた、数値±数値の６０パーセントである。各々の具体的な数値と関連する中間的な範囲は、２桁の有効数字に丸めた、数値±数値の３０パーセントである。各々の具体的な数値と関連する狭い範囲は、２桁の有効数字に丸めた、数値±数値の１５パーセントである。これらの広い数値範囲、中間の数値範囲及び狭い数値範囲は具体的な値に適用されるべきだけではなく、これらの具体的な値の間の差にも適用されるべきである。
【0024】
「遺伝子」によって、染色体上の特異的な遺伝子座を占め、転写及び／若しくは翻訳の調節配列ならびに／またはコーディング領域ならびに／または非翻訳配列（すなわちイントロン、５’及び３’非翻訳配列）からなり、かかる調節配列がコーディング配列及び／または転写配列に隣接するかどうかにかかわらない、遺伝的に継承される単位が意味される。したがって、遺伝子には、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列（リボソーム結合部位及び内部リボソーム侵入部位等）、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、バウンダリーエレメント、複製起点、マトリックス結合部位、及び遺伝子座制御領域が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。
【0025】
「ポリヌクレオチド」または「核酸」の列挙は、本明細書において使用される時、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＤＮＡを指定する。この用語は、典型的には、少なくとも１０ベースの長さのリボヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチドのいずれかまたはヌクレオチドのいずれかのタイプの改変形状の、ヌクレオチドのポリマー性形状を指す。この用語には、ＤＮＡ及びＲＮＡの一本鎖及び二本鎖の形状が含まれる。
【0026】
本明細書において使用される時、「ＤＮＡ」という用語には、特定の種の全ゲノムＤＮＡのない単離されたＤＮＡ分子が含まれる。したがって、ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントは、１つまたは複数のコーディング配列を含有し、さらにＤＮＡセグメントが得られる種の全ゲノムＤＮＡからさらに実質的に単離されたか、またはそれなしに精製された、ＤＮＡセグメントを指す。「ＤＮＡセグメント」及び「ポリヌクレオチド」という用語内には、ＤＮＡセグメント及びかかるセグメントのより小さな断片、ならびにさらに組換えベクターが含まれ、それらには、例えばプラスミド、コスミド、ファージミド、ファージ、ウイルス、及び同種のものが含まれる。
【0027】
ポリヌクレオチドに関して、「外来性の」という用語は、野生型の細胞または生物体中に天然に存在しないが、典型的には分子生物学的技法によって細胞の中へ導入されるポリヌクレオチド配列を指す。外来性ポリヌクレオチドの例には、所望されるタンパク質をコードする、ベクター、プラスミド、及び／または人造の核酸コンストラクトが含まれる。ポリヌクレオチドに関して、「内在性の」または「生来の」という用語は、所与の野生型の細胞または生物体において見出され得る天然に存在するポリヌクレオチド配列を指す。非修飾ベクターなどのポリヌクレオチド配列と組み合わせて、内在性ポリヌクレオチド配列を含むベクター、プラスミド、または他の人造のコンストラクトは、全体として外来性ポリヌクレオチドであり、内在性ポリヌクレオチド配列を含む外来性ポリヌクレオチドと称され得る。また、第１の生物体から単離され、分子生物学的技法によって第２の生物体に移された特定のポリヌクレオチド配列は、第２の生物体に関して典型的には「外来性」ポリヌクレオチドと判断される。ポリヌクレオチドは生来の配列（例えば本明細書において記載されるタンパク質をコードする内在性配列）を含み得るか、またはバリアント若しくは断片、またはかかる配列の生物学的な機能的な等価物を含み得る。
【0028】
ポリヌクレオチドバリアントは、コードされたポリペプチドの酵素活性が非改変または参照のポリペプチドと比べて実質的に減少しないように、更に本明細書において記載されるような１つまたは複数の置換、追加、欠失及び／または挿入を好ましくは含有することができる。コードされたポリペプチドの酵素活性に関する効果は、一般的には本明細書において記載されるように査定され、当技術分野において公知であろう。
【0029】
当業者によって理解されるように、本開示のポリヌクレオチド配列には、ゲノム配列、ゲノム外のプラスミドにコードされた配列、ならびにタンパク質、ポリペプチド、ペプチド及び同種のものを発現するかまたは発現するように適合され得るより小さな操作された遺伝子セグメントが含まれ得る。かかるセグメントは、天然に単離されるか、または人手によって合成的に改変され得る。
【0030】
ポリヌクレオチドは、一本鎖（コーディングまたはアンチセンス）若しくは二本鎖であり得るか、またはＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡ、または合成）若しくはＲＮＡ分子であり得る。追加のコーディング配列または非コーディング配列は本発明のポリヌクレオチド内に存在してもよいが、必ずしも存在しなくてもよく、ポリヌクレオチドは他の分子及び／または支持材料へ連結されてもよいが、必ずしも連結されなくても良い。
【0031】
「コーディング配列」によって、遺伝子のポリペプチド産物についてのコードに寄与する任意の核酸配列が意味される。これとは対照的に、「非コーディング配列」という用語は、遺伝子のポリペプチド産物についてのコードに寄与しない任意の核酸配列を指す。
【0032】
「相補的な」及び「相補性」という用語は、塩基対合ルールによって関連づけられるポリヌクレオチド（すなわちヌクレオチドの配列）を指す。例えば、配列「Ａ－Ｇ－Ｔ」は配列「Ｔ－Ｃ－Ａ」に相補的である。相補性は「部分的」であり得、その場合核酸塩基のうちのいくつかのみが塩基対合ルールに従ってマッチする。または、核酸の間には「完全」または「全体」の相補性があり得る。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に対する有意な効果を有する。
【0033】
２つの配列（核酸配列またはアミノ酸配列であるかにかかわらず）のパーセント同一性は、２つのアライメントさせた配列間の正確な一致の数を短いほうの配列の長さによって割り、１００を掛けたものである。核酸配列のための近似アライメントはＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムによって提供される。Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを、公知のスコアリングマトリックス（例えばＤａｙｈｏｆｆによって開発されたスコアリングマトリックス）の使用によってアミノ酸配列へ適用し、任意の周知の技法（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ方法等）によって正規化することができる。配列のパーセント同一性を決定するこのアルゴリズムのうちの１つの実装は、「ＢｅｓｔＦｉｔ」ユーティリティアプリケーションにおいてＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）によって提供される。この方法のためのデフォルトパラメーターは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ、バージョン８（１９９５）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．から入手可能）中で記載される。他の配列間のパーセント同一性または類似性を計算するために適切なプログラムは、一般的には当技術分野において公知であり、例えば、Ｊｏｈｎ Ｆ．Ｃｏｌｌｉｎｓ及びＳｈａｎｅ Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋによって開発され、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈが著作権を所有し、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．）によって流通されるＭＰＳＲＣＨプログラムパッケージ、ならびにＢＬＡＳＴであり、デフォルトパラメーターと共に使用される。これらのプログラムの詳細は以下のインターネットアドレス：ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉで見出すことができる。
【0034】
「ポリペプチド」、「ポリペプチド断片」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、本明細書において、アミノ酸残基のポリマーならびにそのバリアント及び合成類似体を指すように互換的に使用される。したがって、これらの用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が合成の天然に存在しないアミノ酸（対応する天然に存在するアミノ酸の化学的類似体等）であるアミノ酸ポリマーに加えて、天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用される。特定の態様において、ポリペプチドには、酵素的ポリペプチド、または「酵素」が含まれてもよく、それは典型的には様々な化学反応を触媒する（すなわち、その速さを増加させる）ものである。本出願のタンパク質及び酵素をコードする例示的なヌクレオチド配列は、全長の参照ポリヌクレオチドに加えて、これらの遺伝子の全長または実質的に全長のヌクレオチド配列のうちの一部分、またはそれらの転写物若しくはこれらの転写物のＤＮＡコピーを包含する。ヌクレオチド配列の一部分は、参照ポリペプチドの生物学的な活性を保持するポリペプチドの一部分またはセグメントをコードし得る。
【0035】
「形質転換」は、宿主細胞ゲノムの中への外来性ヌクレオチドの取り込み及び組み入れからもたらされる細胞における安定的で遺伝可能な変更；またある生物体から別の生物体のゲノムの中への外来性遺伝子の移動を指す。外来性ヌクレオチドには、標的生物に対して異種の遺伝子、または野生型生物体中に存在するヌクレオチド配列の追加が含まれ得る。
【0036】
「標的化された突然変異」は、前もって決定された（指定された）ゲノム位置でのゲノムのＤＮＡ配列における変化を意味する。いくつかの事例において、標的化された突然変異には、前もって決定されたゲノム位置での前もって決定された（指定された）ＤＮＡ配列変更の導入が含まれるだろう。他の事例において、標的化された突然変異には、前もって決定されたゲノム位置でのランダムなＤＮＡ配列変更の導入が含まれるだろう。
【0037】
「安定的な」は、形質転換によって引き起こされた遺伝子改変の結果を記載する場合、１０以上世代、または改変された生物体についての平均世代時間の１０倍以上の時間の長さにわたって、細胞の集団の少なくとも一部分において維持される遺伝子改変を指す。
【0038】
「コンピテント」は、細胞が周囲の環境から細胞外ヌクレオチドを取り込む能力を指す。細胞は、「天然にコンピテント」または「人工的にコンピテント」であり得る。天然にコンピテントな細胞は天然の条件下でそれらの周囲の環境からヌクレオチドを取り込むことができる。人工的にコンピテントな細胞は、通常は天然に起こらない条件（二価陽イオンの溶液中でのインキュベーション、熱ショック、エレクトロポレーション、及び超音波が含まれる）への細胞の暴露によって、細胞外ヌクレオチドに対して受動的に透過性のあるようにされる。
【0039】
「野生型」または「天然に存在する」という用語は、天然に存在する源から単離された場合の生物体、遺伝子または遺伝子産物（例えばポリペプチド）の特徴を有する、その生物体、遺伝子または遺伝子産物を指すように互換的に使用される。野生型の生物体、遺伝子または遺伝子産物は集団中で最も頻繁に観察され、したがって便宜的に「正常」または「野生型」の形状と表記されるものである。
【0040】
本明細書において使用される時、「スピルリナ」は「Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ属」と同義である。Ａｒｔｈｒｏｓｐｒｉａ属は５７の種を含み、そのうちの２２は現在のところ分類学的に認められている。したがって、更なる表記なしの「スピルリナ」または「Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ属」への参照には、以下の種：Ａ．ａｍｅｔｈｙｓｔｉｎｅ、Ａ．ａｒｄｉｓｓｏｎｅｉ、Ａ．ａｒｇｅｎｔｉｎａ、Ａ．ｂａｌｋｒｉｓｈｎａｎｉｉ、Ａ．ｂａｒｙａｎａ、Ａ．ｂｏｒｙａｎａ、Ａ．ｂｒａｕｎｉｉ、Ａ．ｂｒｅｖｉａｒｔｉｃｕｌａｔａ、Ａ．ｂｒｅｖｉｓ、Ａ．ｃｕｒｔａ、Ａ．ｄｅｓｉｋａｃｈａｒｙｉｅｎｓｉｓ、Ａ．ｆｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ａ．ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ、Ａ．ｇｈａｎｎａｅ、Ａ．ｇｉｇａｎｔｅａｎ、Ａ．ｇｏｍｏｎｔｉａｎａ、Ａ．ｇｏｍｏｎｔｉａｎａ ｖａｒ．ｃｒａｓｓａ、Ａ．ｉｎｄｉｃａ、Ａ．ｊｅｎｎｅｒｉ ｖａｒ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａ．ｊｅｎｎｅｒｉ Ｓｔｉｚｅｎｂｅｒｇｅｒ、Ａ．ｊｅｎｎｅｒｉ ｆ．ｐｕｒｐｕｒｅａ、Ａ．ｊｏｓｈｉｉ、Ａ．ｋｈａｎｎａｅ、Ａ．ｌａｘａ、Ａ．ｌａｘｉｓｓｉｍａ、Ａ．ｌａｘｉｓｓｉｍａ、Ａ．ｌｅｏｐｏｌｉｅｎｓｉｓ、Ａ．ｍａｊｏｒ、Ａ．ｍａｒｇａｒｉｔａｅ、Ａ．ｍａｓｓａｒｔｉｉ、Ａ．ｍａｓｓａｒｔｉｉ ｖａｒ．ｉｎｄｉｃａ、Ａ．ｍａｘｉｍａ、Ａ．ｍｅｎｅｇｈｉｎｉａｎａ、Ａ．ｍｉｎｉａｔａ ｖａｒ．ｃｏｎｓｔｒｉｃｔａ、Ａ．ｍｉｎｉａｔａ、Ａ．ｍｉｎｉａｔａ ｆ．ａｃｕｔｉｓｓｉｍａ、Ａ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ａ．ｎｏｒｄｓｔｅｄｔｉｉ、Ａ．ｏｃｅａｎｉｃａ、Ａ．ｏｋｅｎｓｉｓ、Ａ．ｐｅｌｌｕｃｉｄａ、Ａ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓ ｖａｒ．ｎｏｎ－ｃｏｎｓｔｒｉｃｔａ、Ａ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓ ｆ．ｇｒａｎｕｌａｔｅ、Ａ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓ ｆ．ｍｉｎｏｒ、Ａ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓ ｖａｒ．ｔｅｎｕｉｓ、Ａ．ｓａｎｔａｎｎａｅ、Ａ．ｓｅｔｃｈｅｌｌｉｉ、Ａ．ｓｋｕｊａｅ、Ａ．ｓｐｉｒｕｌｉｎｏｉｄｅｓ ｆ．ｔｅｎｕｉｓ、Ａ．ｓｐｉｒｕｌｉｎｏｉｄｅｓ、Ａ．ｓｕｂｓａｌｓａ、Ａ．ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｉｍａ、Ａ．ｔｅｎｕｉｓ、Ａ．ｔｅｎｕｉｓｓｉｍａ、及びＡ．ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒのうちの任意のものへの参照が含まれる。
【0041】
本出願中で引用されるすべての文献及び類似の材料（特許、特許出願、論説、本、論文、及びインターネットウェブページが含まれる）は、任意の目的のためにそれらの全体が参照により明示的に援用される。援用された参照文献中の用語の定義が本出願中で提供される定義と異なるように思われる場合、本出願中で提供される定義が支配するものとする。
【0042】
スピルリナにおける標的化された突然変異
本発明の態様において、ホモロジーアームを有するベクターは、コンピテンスの状態のスピルリナ細胞によって取り込まれ、続いて細胞の１つまたは複数の染色体の中へ組み込まれる。ホモロジーアームの配列によって導かれる相同組換えは、ゲノムのもとの核酸配列とホモロジーアーム間のベクター領域の核酸配列との間の差に起因して細胞のゲノムを変化させる。
本発明の態様において、ホモロジーアームを有するベクターは、コンピテンスの状態のスピルリナ細胞によって取り込まれ、続いて細胞の１つまたは複数の染色体の中へ組み込まれる。ホモロジーアームの配列によって導かれる相同組換えは、ゲノムのもとの核酸配列とホモロジーアーム間のベクター領域の核酸配列との間の差に起因して細胞のゲノムを変化させる。
【0043】
本開示は、スピルリナにおけるコンピテンスの誘導について本発明者が精通する第１の技法を記載する。スピルリナは天然にコンピテントではなく、スピルリナの形質転換のための従来の技法が失敗した場合にも、本明細書において開示される技法は形質転換を達成する。スピルリナ中に存在する高レベルのエンドヌクレアーゼは形質転換を不可能にするとこれまで考えられていた。エレクトロポレーションは、エレクトロポレーションを行った場合に溶解するスピルリナ細胞の傾向に起因して、短期間の間のみでコンピテント細胞を生成することに限定されている。しかしながら、適切な浸透圧安定剤の存在下におけるエレクトロポレーションによる形質転換は、他の技法によって従来可能でなかった形質転換を達成する。
【0044】
形質転換の前に、スピルリナは培養され、浸透圧安定剤により洗浄され得る。スピルリナは、任意のシアノバクテリアの増殖のために適切な培地（ＳＯＴ培地等）中で培養され得る。ＳＯＴ培地は、１．６８ｇのＮａＨＣＯ３、５０ｍｇのＫ２ＨＰＯ４、２５０ｍｇのＮａＮＯ３、１００ｍｇのＫ２ＳＯ４、１００ｍｇのＮａＣｌ、２０ｍｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４ｍｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１ｍｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、８ｍｇのＮａ２ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏ、０．１ｍＬのＡ５溶液及び９９．９ｍＬの蒸留水を含む。Ａ５溶液は、２８６ｍｇのＨ３ＢＯ３、２１７ｍｇのＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、２２．２ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、７．９ｍｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、２．１ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ及び１００ｍＬの蒸留水を含む。培養は、室温より高い温度（例えば２５～３７℃）で、及び連続的な照明（例えば２０～２，０００、５０～５００、または１００～２００μｍｏｌ光子ｍ－２秒－１）下で、振盪（例えば１００～３００ｒｐｍ）しながら行うことができる。７５０ｎｍでの光学的密度があらかじめ決定された閾値（例えばＯＤ７５０が０．３～２．０、０．５～１．０または０．６～０．８）に到達する時に、増殖中の細胞を採取することができる。採取された細胞の体積を遠心分離によって濃縮し、次いでｐＨバランサー及び塩の溶液中で再懸濁することができる。ｐＨバランサーは、ｐＨ６～９の間、ｐＨ６．５～８．５の間、またはｐＨ７～８の間で培地のｐＨを維持しながらスピルリナの生存能力を維持する任意の適切なバッファーであり得る。適切なｐＨバランサーには、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ、リン酸ナトリウムバッファーまたはリン酸カリウムバッファー、及びＴＥＳが含まれる。塩溶液は、５０ｍＭ～５００ｍＭの間、１００ｍＭ～４００ｍＭの間、または２００ｍＭ～３００ｍＭの間の濃度のＮａＣｌであり得る。一実施形態において、１～５０ｍＬの間の１～１００ｍＭのｐＨバランスを使用して、ｐＨを中和することができる。
【0045】
遠心分離によって収集した細胞は、浸透圧安定剤及び随意に塩溶液（例えば１～５０ｍＬの０．１～１００ｍＭのＮａＣｌ）により洗浄することができる。任意の量の培養物を遠心分離によって濃縮することができる。一実施形態において、５～５００ｍＬの間の培養を遠心分離することができる。浸透圧安定剤は、エレクトロポレーションの間にスピルリナの細胞全体性を安定化する、任意のタイプの浸透圧バランサーであり得る。一実施形態において、浸透圧安定剤は、ブドウ糖またはショ糖等の糖（例えばｗ／ｖで０．１～２５％）であり得る。一実施形態において、浸透圧安定剤は単純ポリオール（例えばｖ／ｖで１～２５％）であり得、それらにはグリセリン（ｇｌｙｃｅｒｉｎｅ）、グリセリン（ｇｌｙｃｅｒｉｎ）、またはグリセロールが含まれる。一実施形態において、浸透圧安定剤はポリエーテル（例えばｗ／ｖで０．１～２０％）であり得、それらにはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（オキシエチレン）、またはポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）が含まれる。ＰＥＧまたはＰＥＯは、２００～１０，０００、１０００～６０００、または２０００～４０００の任意の分子量を有し得る。一実施形態において、ｐＨバランサーまたはバッファーは、浸透圧安定剤の代わりにまたは加えて使用することができる。
【0046】
本開示は、コンピテント細胞へのベクターの導入による相同組換えを介するスピルリナにおける標的化された突然変異の生成も記載する。人工的コンピテンシーは、スピルリナにおいてコンピテンシーを生成するための上記のエレクトロポレーション技法、または他の公知若しくは未来の技法によって生成され得る。スピルリナにおいて人工的コンピテンスを導入するための公知の技法には、エレクトロポレーション（浸透圧安定剤の有無及びｐＨバランサーの有無）、二価陽イオンを含有する溶液中でのインキュベーション及び超音波が含まれる。人工的コンピテンシーが誘導された時に、スピルリナ細胞をベクターに接触させる。例えば、ベクターをエレクトロポレーションの前にスピルリナ細胞の溶液と混合することができる。
【0047】
エレクトロポレーションは、０．６～１０ｋＶ／ｃｍの間、２．５～６．５ｋＶ／ｃｍの間、または４．０～５．０ｋＶ／ｃｍの間で；１～１００μＦの間、３０～７０μＦの間、または４５～５５μＦの間で；及び１０～５００ｍΩの間、５０～２５０ｍΩの間、または９０～１１０ｍΩの間で、０．１、０．２または０．４ｃｍのエレクトロポレーションキュベット中で遂行することができる。一実施形態において、エレクトロポレーションは、４．５ｋＶ／ｃｍ、５０μＦ及び１００ｍΩで遂行することができる。
【0048】
エレクトロポレーションに後続して、細胞を１つまたは複数の抗生物質の存在下において増殖させ、プラスミドによる形質転換の成功を介して付与される耐性に基づいて選択することができる。エレクトロポレーション後の培養は、照明レベルを低減させて（例えば５～５００、１０～１００、または３０～６０μｍｏｌ光子ｍ－２秒－１）で遂行することができる。培養は振盪（例えば１００～３００ｒｐｍ）しながら遂行することもできる。培地中の抗生物質のレベルは５～１００μｇ／ｍＬであり得る。エレクトロポレーション後の培養は、１～５日またはそれ以上の間継続され得る。抗生物質耐性によって同定された成功した形質転換体は、０．１～２．０μｇの適切な抗生物質を補足した、プレート上または５～１００ｍＬのＳＯＴ培地中で１週間～１か月間の時間経過にわたって選択することができる。
【0049】
「ベクター」によって、例えばポリヌクレオチドが挿入またはクローン化され得るプラスミド、バクテリオファージ、酵母、またはウイルスに由来する、ポリヌクレオチド分子、好ましくはＤＮＡ分子が意味される。ベクターは１つまたは複数の合成ヌクレオチドまたは核酸類似体を含有することができる。ベクターは１つまたは複数のユニークな制限部位を含有することができる。ベクターは、宿主細胞の中へ導入された場合に、ゲノムの中へ組み込まれ、それが組み込まれた染色体（複数可）と一緒に複製されるものであり得る。かかるベクターは、宿主染色体の特定の所望される部位の中への組換えを可能にする１つまたは複数の特異的な配列を含むことができる。これらの特異的な配列は野生型ゲノム中に存在する配列に相同であり得る。ベクターシステムは、単一のベクターまたはプラスミド、２つ以上のベクターまたはプラスミドを含むことができ、そのうちのいくつかは、標的化された突然変異誘発の効率、または転位を増加させる。ベクターの選択は、典型的にはベクターが導入される予定の宿主細胞とベクターの適合性に依存するだろう。ベクターはレポーター遺伝子（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等）を含むことができ、それはコードされたポリペプチドのうちの１つ若しくは複数へのインフレームでの融合または分離した発現のいずれかを行うことができる。ベクターは、正の選択マーカー（適切な形質転換体の選択のために使用することができる抗生物質耐性遺伝子等）も含むことができる。ベクターは、負の選択マーカー（ＩＩ型チオエステラーゼ（ｔｅｓＡ）遺伝子またはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ構造遺伝子（ｓａｃＢ）等）も含むことができる。レポーターまたはマーカーの使用は、ベクターにより成功して形質転換された細胞の同定を可能にする。
【0050】
一実施形態において、ベクターは、標的化された遺伝子座に隣接するスピルリナゲノムのＤＮＡ配列に相同な１つまたは２つのホモロジーアームを含む。ホモロジーアームの配列は、ホモロジーアームが相補的であるスピルリナゲノムの領域に同一であるかまたは類似し得る。「相同性」または「相同な」には、本明細書において使用される時、相同で同一の配列及び相同で同一でない配列の両方が含まれる。相同で同一でない配列は、第２の配列とある程度の配列同一性を共有するが、その配列が第２の配列のそれに同一でない第１の配列を指す。例えば、突然変異遺伝子の野生型配列を含むポリヌクレオチドは、突然変異遺伝子の配列に相同で同一でない。本明細書において使用される時、２つの相同で同一でない配列の間の相同性の程度は、正常な細胞メカニズムを利用して、その間で相同組換えを可能にするのに十分である。２つの相同で同一でない配列は任意の長さであり得、それらの非相同性の程度は単一のヌクレオチド程の小ささ（例えば、標的化された相同組換えが導入されるゲノム点突然変異について）または１０キロベース以上程の大きさ（例えば、染色体中のあらかじめ決定された遺伝子座での遺伝子の挿入について）であり得る。相同で同一でない配列を含む２つのポリヌクレオチドは同じ長さである必要がない。例えば、２０～１０，０００の間のヌクレオチドまたはヌクレオチド対の外来性ポリヌクレオチド（すなわちベクターポリヌクレオチド）を使用することができる。
【0051】
相同で同一の配列または相同で同一でない配列としての２つの配列の特徴評価は、２つの配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）の間のパーセント同一性の比較によって決定され得る。相同で同一の配列は１００％の配列同一性を有する。相同で同一でない配列は、８０％を超える、８５％を超える、９０％を超える、９１％を超える、９２％を超える、９３％を超える、９４％を超える、９５％を超える、９６％を超える、９７％を超える、９８％を超える、または９９％を超える配列同一性を有することができる。
【0052】
ホモロジーアームは部位特異的相同組換えを可能にする任意の長さであり得る。ホモロジーアームは、その間のすべての整数値を含む約２０００ｂｐ～５００ｂｐの間の任意の長さであり得る。例えば、ホモロジーアームは、約２０００ｂｐ、約１５００ｂｐ、約１０００ｂｐ、または約５００ｂｐであり得る。２つのホモロジーアームを有する実施形態において、ホモロジーアームは同じまたは異なる長さであり得る。したがって、２つのホモロジーアームの各々は、その間のすべての整数値を含む約２０００ｂｐ～５００ｂｐの間の任意の長さであり得る。例えば、２つのホモロジーアームの各々は、約２０００ｂｐ、約１５００ｂｐ、約１０００ｂｐ、または約５００ｂｐであり得る。
【0053】
１つのホモロジーアームまたは両方のホモロジーアーム（すなわちその間）に隣接するベクターの一部分は、相同組換えによってスピルリナゲノム中の標的化された遺伝子座を改変する。他の生物体における相同組換えのための技法は一般的には公知である（例えばＫｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０，Ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓを参照）。改変は標的化された遺伝子座の長さを変化させることができ、それらにはヌクレオチドの欠失またはヌクレオチドの追加が含まれる。追加または欠失は任意の長さであり得る。改変は、長さを変化させずに、標的化された遺伝子座におけるヌクレオチドの配列を変化させることもできる。標的化された遺伝子座は、スピルリナゲノムの任意の一部分（コーディング領域、非コーディング領域、及び調節配列が含まれる）であり得る。一実施形態において、突然変異により遺伝子を欠失させ、それによってノックアウト生物体を生成することができる。一実施形態において、突然変異により、レポーターまたはマーカー（例えばＧＦＰまたは抗生物質耐性）として機能する遺伝子を追加することができる。一実施形態において、突然変異により外来性遺伝子を追加することができる。一実施形態において、突然変異により、外来性プロモーター（例えば強いプロモーター及び誘導可能プロモーターなど）の制御下の内在性遺伝子を追加することができる。
【0054】
上記の標的化された突然変異誘発で使用されるベクターは、インサート配列とベクター骨格のアセンブルによって産生することができる。ベクターは、任意の公知のまたは後に開発される技法（制限酵素消化後のライゲーションまたはＧｉｂｓｏｎアセンブリーが含まれる）によって生成することができる。Ｇｉｂｓｏｎアセンブリーは、ベクター骨格の一部分になるＤＮＡ配列をエキソヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡリガーゼと組み合わせ、次いで５０℃で１時間インキュベーションすることによって行うことができる。ベクター骨格は標的生物との適合性について選択され得る。スピルリナについて、適切なベクター骨格にはＤＮＡプラスミドが含まれるが、これに限定されない。ベクター骨格は、適切な制限酵素による処理によって連続したループから直線状形状に転換することができる。ベクターが最初にインサートセグメントを組み入れずにＤＮＡリガーゼ反応において連続的なループを再形成しないように、それによって形成された末端を、アルカリホスファターゼにより処理して５’リン酸末端基を除去する。
【0055】
インサート配列は、１つまたは２つのホモロジーアーム、及び、インサートのヌクレオチド配列とスピルリナの野生型ゲノム配列との間の差に起因して、スピルリナの遺伝子座を改変する１つのヌクレオチド配列を含む。インサート配列は、スピルリナゲノムの領域に相同なホモロジーアームに対応する、対象となる遺伝子座へ隣接する１つまたは２つのフランキング領域、及びスピルリナゲノムとは異なる一部分を含む。スピルリナの野生型ヌクレオチド配列とは異なるインサート配列の一部分は、それらの差に起因してスピルリナゲノムの改変をもたらす。改変には、点突然変異、遺伝子の追加、調節エレメントの追加、コーディング領域の追加、非コーディング領域の追加、遺伝子の欠失、遺伝子の一部分の欠失、または調節エレメントの欠失が含まれ得るが、これらに限定されない。一般的に、強いＥ．ｃｏｌｉプロモーターがシアノバクテリア中で動作することは周知である。標的生物の配列が公知であるならば、公開された配列を使用してホモロジーアーム（複数可）を備えたインサート配列をデザインすることができる。スピルリナの複数の株（Ａｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｎｔｅｎｓｉｓのＮＩＥＳ－３９等）はシーケンスされている。配列が公知でないならば、対象となる遺伝子座を含有するゲノムの一部分をＰＣＲ及び適切なプライマーを使用して増幅することができる。当業者に公知の技法を使用して、続いてこの領域をシーケンスすることができる。一実施形態において、増幅されたゲノム領域を使用してオーバーラップ伸長ＰＣＲの実行し、欠失を生成することができる。一実施形態において、ゲノムの増幅された領域は、１つの場所でヌクレオチド配列を切断する制限酵素により消化され、適合性のある末端を備えて調製されているインサートヌクレオチド配列へライゲーションすることができる。
【0056】
インサート配列を１つまたは複数の制限酵素により消化してベクター骨格の末端と適合性のある末端を生成する。あるいは、ベクター骨格の末端領域に同一の短い配列（例えば１６～２５ｂｐ）をインサート配列の末端に追加し、これらの２つの断片をＧｉｂｓｏｎアセンブリー法によって環状化する。インサート配列の長さは、対象となる遺伝子座への改変の長さ及びフランキング領域の長さであるだろう。例えば、改変された配列の長さが５００ｂｐであり、２つのホモロジーアームが各々２０００ｂｐで所望されれば、配列の全長は４５００ｂｐであるだろう。本発明においてベクターとして使用されるポリヌクレオチド配列は、コーディング配列それ自体の長さにかかわらず、他の配列（プロモーター、転写ターミネーター、追加の制限酵素部位、マルチプルクローニング部位、他のコーディングセグメント、及び同種のもの等）と組み合わせることができ、従ってそれらの全長は大幅に変動し得る。したがって、ほとんど任意の長さのポリヌクレオチド断片を用いることができ、全長は、好ましくは、意図される組換えヌクレオチド手順における調製及び使用の容易性によってのみ限定されることが企図される。
【0057】
例示的な適用
中性脂肪（ワックスエステル及びトリグリセリド）の産生
一実施形態において、スピルリナは、中性脂肪（ワックスエステル及び／またはトリグリセリドが含まれる）の産生を、同じ条件下で増殖された野生型スピルリナによって産生されるレベルを超えて増加させるように改変することができる。トリグリセリド及びワックスエステルは、バイオ燃料及び／または様々な特殊化学品の産生における原料として使用することができる。例えば、トリグリセリド油（植物油、動物脂、リサイクル油脂中に含有されるもの等）とアルコールを反応させるエステル交換反応を、トリグリセリドに行って、バイオディーゼル（脂肪酸アルキルエステル等）を産生することができる。かかる反応は副産物としてグリセリンも産生し、それは医薬品産業及び化粧品産業における使用のために精製することができる。トリグリセリドまたはトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）は主として３つの脂肪酸によりエステル化されたグリセロールからなり、炭水化物またはタンパク質のいずれかよりも酸化に際してより多くのエネルギーをもたらす。トリグリセリドは、大部分の真核生物のためのエネルギー貯蔵の重要なメカニズムを提供する。哺乳類において、ＴＡＧは合成されて複数の細胞タイプ（脂肪細胞及び肝細胞が含まれる）中で貯蔵される。真核生物とは対照的に、原核生物におけるトリグリセリド産生の観察は、特定の放線菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｎｏｃａｒｄｉａ属、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属のメンバー等）に加えて、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属の特定のメンバーに限定されている。
中性脂肪（ワックスエステル及びトリグリセリド）の産生
一実施形態において、スピルリナは、中性脂肪（ワックスエステル及び／またはトリグリセリドが含まれる）の産生を、同じ条件下で増殖された野生型スピルリナによって産生されるレベルを超えて増加させるように改変することができる。トリグリセリド及びワックスエステルは、バイオ燃料及び／または様々な特殊化学品の産生における原料として使用することができる。例えば、トリグリセリド油（植物油、動物脂、リサイクル油脂中に含有されるもの等）とアルコールを反応させるエステル交換反応を、トリグリセリドに行って、バイオディーゼル（脂肪酸アルキルエステル等）を産生することができる。かかる反応は副産物としてグリセリンも産生し、それは医薬品産業及び化粧品産業における使用のために精製することができる。トリグリセリドまたはトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）は主として３つの脂肪酸によりエステル化されたグリセロールからなり、炭水化物またはタンパク質のいずれかよりも酸化に際してより多くのエネルギーをもたらす。トリグリセリドは、大部分の真核生物のためのエネルギー貯蔵の重要なメカニズムを提供する。哺乳類において、ＴＡＧは合成されて複数の細胞タイプ（脂肪細胞及び肝細胞が含まれる）中で貯蔵される。真核生物とは対照的に、原核生物におけるトリグリセリド産生の観察は、特定の放線菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｎｏｃａｒｄｉａ属、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属のメンバー等）に加えて、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属の特定のメンバーに限定されている。
【0058】
特定の生物体は、バイオ燃料の産生における中性脂肪源として利用することができる。例えば、真核性藻類はエネルギー貯蔵分子としてトリグリセリドを天然に産生し、現在特定のバイオ燃料関連技術では、バイオ燃料のための原料として藻類の使用に注目する。藻類は光合成生物であり、トリグリセリド産生生物体（藻類等）の使用は、日光、水、ＣＯ２、主要栄養素、及び微量養素からバイオディーゼルを産生する能力を提供する。
【0059】
藻類のような、スピルリナが含まれるシアノバクテリアの種は、ＣＯ２の還元にクロロフィルＡ及び水を利用して、光合成からエネルギーを得ることができる。しかしながら、スピルリナは中性脂肪合成に関与する必須酵素を欠く。シアノバクテリアへの外来性遺伝子の追加は脂質産生を増加させる。上記の技法を使用して、標的化された相同組換えを介してスピルリナに遺伝子を追加することができる。したがって、本開示中で記載される技法は、シアノバクテリアにおけるトリグリセリド及びワックスエステルの産生を増加させることが公知である遺伝子（ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）、ホスファチジン酸ホスファターゼ、アセチル－ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）、アルデヒド形成アシル－ＡＣＰレダクターゼ（ＡＡＲ）、アルコール形成脂肪酸アシル－ＣｏＡレダクターゼ、及びアルコール形成脂肪酸アシル－ＡＣＰレダクターゼ（ＦＡＲ）をコードする遺伝子等）を追加する手法を提供する。上記の技法を使用して、野生型のＤＧＡＴ、ホスファチジン酸ホスファターゼ、及び／またはＡＣＣａｓｅのポリヌクレオチド配列とは異なるが、ＤＧＡＴ酵素活性、ホスファチジン酸ホスファターゼ酵素活性、及び／またはＡＣＣａｓｅ酵素活性を依然として有する、ポリペプチド配列をコードする遺伝子またはポリヌクレオチドの配列の一部分も追加することができる。
【0060】
アシル－ＡＣＰレダクターゼ（ＡＡＲ）は、アシル－ＡＣＰを脂肪族アルデヒドとして公知のアシルアルデヒドへ還元することを触媒する。これらの酵素は脂肪酸アシルＡＣＰレダクターゼ（ＦＡＲ）としても公知である。脂肪族アルデヒドは、ＦＡＲまたは長鎖アルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）による脂肪族アルコールの生合成のための基質として供することができる。アシル－ＡＣＰレダクターゼの１つの例はＳ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓからのＰＣＣ７９４２＿ｏｒｆ１５９４である。シアノバクテリアにおけるＡＡＲの遺伝子のファミリー（またはＦＡＲ遺伝子）は、隠れマルコフモデルのタンパク質ファミリーパターンのＴＩＧＲ０４５０５８（アルデヒド形成長鎖脂肪酸アシルＡＣＰレダクターゼ）及びＴＩＧＲ０４０５９（長鎖脂肪族アルデヒドデカルボニラーゼ）を使用して、ＴＩＧＲＲＡＭデータベースから同定された。
【0061】
非限定的な一説によれば、特定の実施形態において、ＡＡＲをＦＡＲまたはＡＤＨと併用して使用して、脂肪族アルコールの合成を増加させることができ、次いで、それは主にＤＧＡＴを発現する（したがってワックスエステルを産生する）本明細書において記載される光合成微生物によって、ワックスエステルの中へ組み入れることができる。したがって、ＡＡＲは、本明細書において記載される実施形態の任意のもの（遊離脂肪族アルコールをワックスエステルに変えることが所望される場合に増加したレベルで遊離脂肪族アルコールを産生する等）において使用することができる。上で指摘されるように、次いで、これらの遊離脂肪族アルコールをＤＧＡＴによって脂肪酸（アシル－ＡＣＰの形状で）へエステル化して、ワックスエステルを生成することができる。
【0062】
特定の実施形態は、過剰発現させたＡＡＲを使用して、脂肪族アルコールの合成を増加させ、それによってワックスエステルを産生する株（例えばＤＧＡＴを発現する株）におけるワックスエステルの産生を増加させることに関する。例えば、特定の実施形態において、脂肪酸アシルレダクターゼ及びＤＧＡＴと組み合わせてＡＡＲを利用することができる。次いで、これらの実施形態において、ＡＣＰ、ＡＣＣａｓｅ、若しくは両方、ならびに／または本明細書において記載されるグリコーゲンの産生及び貯蔵若しくはグリコーゲン分解への修飾のうちの任意のものを更に利用することができる。
【0063】
脂肪酸アシルレダクターゼ（ＦＡＲ）は、アシル－ＡＣＰまたはアシル－ＣＯＡを脂肪族アルコールとして公知のアシルアルコールへ２ステップで還元することを触媒する。第１のステップはアシルアルデヒド中間体経由で進み、次いで、それを第２のステップにおいて脂肪族アルコールへ転換する。これらの同じ酵素は脂肪族アルデヒドを脂肪族アルコールへ直接還元することもできる（すなわちステップ２のみ）。この事例において、それらは場合によっては脂肪族アルデヒドレダクターゼと称される。脂肪族アルコールは、ＤＧＡＴによるワックスエステルの生合成のための基質として供することができる。多くの脂肪酸アシルレダクターゼは３つの保存配列エレメントによって特徴づけられる。ＮＡＤＰＨ結合モチーフ、ＮＡＤＰ利用酵素の触媒部位の特徴的なモチーフ、及び保存されたＣ末のドメイン（Ｍａｌｅ Ｓｔｅｒｉｌｅ ２ドメインと称され、それは未知の機能である）がある。
【0064】
非限定的な一説によれば、特定の実施形態において、脂肪酸アシルレダクターゼを使用して、脂肪族アルコールの合成を増加させることができ、次いで、それは主にＤＧＡＴを発現する（したがってワックスエステルを産生する）本明細書において記載される光合成微生物によって、ワックスエステルの中へ組み入れることができる。したがって、脂肪酸アシルレダクターゼは、本明細書において記載される実施形態の任意のもの（遊離脂肪族アルコールをワックスエステルに変えることが所望される場合に増加したレベルで遊離脂肪族アルコールを産生する等）において使用することができる。上で指摘されるように、次いで、これらの遊離脂肪族アルコールをＤＧＡＴによって脂肪酸（アシル－ＡＣＰの形状で）へエステル化して、ワックスエステルを生成することができる。
【0065】
特定の実施形態は、過剰発現された脂肪酸アシルレダクターゼを使用して、脂肪族アルコールの合成を増加させ、それによってワックスエステルを産生する株（例えばＤＧＡＴを発現する株）におけるワックスエステルの産生を増加させることに関する。例えば、特定の実施形態において、恐らくアシル－ＡＣＰレダクターゼ及びＤＧＡＴと組み合わせて脂肪酸アシルレダクターゼを利用することできる。次いで、これらの実施形態において、ＡＣＰ、ＡＣＣａｓｅ、若しくは両方、ならびに／または本明細書において記載されるグリコーゲンの産生及び貯蔵若しくはグリコーゲン分解への修飾のうちの任意のものを更に利用することができる。
【0066】
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）はＯ－アシルトランスフェラーゼスーパーファミリーのメンバーであり、それはオレオイル－ＣｏＡ依存的様式でステロールまたはジアシルグリセロールのいずれかをエステル化する。ＤＧＡＴは特にジアシルグリセロールをエステル化し、このエステル化は、植物、真菌、及び哺乳類におけるトリアシルグリセロールの産生の最終的な酵素ステップを表わす。具体的には、ＤＧＡＴは、アシル－補酵素Ａから１，２－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）のｓｎ－３位へアシル基を転移して、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）を形成することに関与する。ＤＧＡＴは、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｙｌｉｉのＡＤＰ１ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＡｔｆＡ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのＤＧＡＴ、Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ ＳｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓのＤＧＡＴ、またはＡｌｃａｎｉｖｏｒａｘ ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓのＤＧＡＴであり得る。したがって、一実施形態において、ＤＧＡＴタンパク質は、配列番号：５、６、または７のうちの任意の１つで示される配列を含む。配列番号：５はＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属のＤＧＡＴの配列である。配列番号：６はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのＤＧＡＴの配列である。配列番号：７はＡｌｃａｎｉｖｏｒａｘ ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓのＤＧＡＴの配列である。植物及び真菌において、ＤＧＡＴは膜及び脂肪体の画分に結び付いている。ＴＡＧの触媒において、ＤＧＡＴは、エネルギー予備として使用される炭素の貯蔵に主に寄与する。動物において、しかしながら、ＤＧＡＴの役割はより複雑である。ＤＧＡＴは、リポタンパク質のアセンブリー及び血漿トリアシルグリセロール濃度の調節における役割を果たすだけでなく、ジアシルグリセロールレベルの調節においても同様に関与する（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ １７１－２０３）。ＤＧＡＴタンパク質は、宿主細胞中で多様なアシル基質（脂肪酸アシル－ＣｏＡ分子及び脂肪酸アシル－ＡＣＰ分子が含まれる）を利用することができる。加えて、ＤＧＡＴ酵素が作用するアシル基質は炭素鎖の長さ及び飽和度の変動を有し得るが、ＤＧＡＴは特定の分子に向けた選択的活性を示し得る。
【0067】
「ホスファチジン酸ホスファターゼ」遺伝子には、本明細書において使用される時、任意の細胞源から得ることができ、ホスファチジン酸（ＰｔｄＯＨ）の脱リン酸化を触媒し、酵素反応性の条件下でジアシルグリセロール（ＤＡＧ）及び無機リン酸塩を得る能力を示す、アミノ酸（タンパク質、ポリペプチドまたはペプチド等）をコードする任意のポリヌクレオチド配列が含まれ、かかる能力を有するホスファチジン酸ホスファターゼ配列の任意の天然に存在するかまたは天然に存在しないバリアントが更に含まれる。例示的なホスファチジン酸ホスファターゼ遺伝子には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのホスファチジン酸ホスファターゼ（ｙＰａｈ１）が含まれる酵母のホスファチジン酸ホスファターゼが含まれるが、これらに限定されない。Ｐａｈ１にコードされたＰＡＰ１酵素は細胞の細胞質及び膜の画分において見出され、膜との結び付きは天然では周辺である。酵母から精製されたＰＡＰ１の複数の型から予想されるように、ｐａｈ１Δ変異体は依然としてＰＡＰ１活性を含有し、追加の遺伝子またはＰＡＰ１活性を有する酵素をコードする遺伝子の存在が指摘される。一実施形態において、ホスファチジン酸ホスファターゼ遺伝子（Ｐａｈ１）は、配列番号：８で示される配列を含む。
【0068】
本明細書において使用される時、「アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ」遺伝子には、任意の細胞源から得ることができ、アセチル－ＣｏＡのカルボキシル化を触媒して、酵素反応性の条件下でマロニル－ＣｏＡを産生する能力を示す、アミノ酸（タンパク質、ポリペプチドまたはペプチド等）をコードする任意のポリヌクレオチド配列が含まれ、かかる能力を有するアセチル－ＣｏＡカルボキシラーゼ配列の任意の天然に存在するかまたは天然に存在しないバリアントが更に含まれる。アセチル－ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）は、アセチル－ＣｏＡの不可逆的カルボキシル化を触媒して、その２つの触媒活性（ビオチンカルボキシラーゼ（ＢＣ）及びカルボキシルトランスフェラーゼ（ＣＴ））を介してマロニルＣｏＡを産生する、ビオチン依存性酵素である。ビオチンカルボキシラーゼ（ＢＣ）ドメインは、反応の第１のステップ：ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質（ＢＣＣＰ）ドメインへ共有結合で連結されるビオチン補欠分子族のカルボキシル化、を触媒する。反応の第２のステップにおいて、カルボキシルトランスフェラーゼ（ＣＴ）ドメインは、（カルボキシ）ビオチンからアセチル－ＣｏＡへのカルボキシル基の転移を触媒する。マロニル－ＣｏＡは脂肪酸への前駆体として供されること以外に代謝の役割を有していないので、アセチル－ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）によるマロニル－ＣｏＡの形成は脂肪酸合成のためのコミットメントステップを表わす。この理由のために、アセチル－ＣｏＡカルボキシラーゼは脂肪酸の合成における極めて重要な酵素を表わす。ＡＣＣａｓｅは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのアセチル－ＣｏＡカルボキシラーゼ（ｙＡＣＣ１）、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍのＡＣＣａｓｅ、またはＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＰＣＣ ７００２のＡＣＣＡｓｅであり得る。一実施形態において、ＡＣＣａｓｅ遺伝子は、配列番号：９で示される配列を含む。
【0069】
具体的には、ホスファチジン酸ホスファターゼ酵素はジアシルグリセロール分子（トリグリセリドへの直接前駆体）の産生を触媒し、ＤＧＡＴ酵素は、ジアシルグリセロール前駆体をトリグリセリドへ転換することによってトリグリセリド合成の最終的なステップを触媒する。ＡＣＣａｓｅ酵素は脂肪酸合成の「コミットメントステップ」を触媒するので、細胞内ＡＣＣａｓｅ活性の増加は、脂肪酸の産生の増加に寄与する。具体的には、ＡＣＣａｓｅは、脂肪酸合成前駆体分子（マロニル－ＣｏＡ）の産生を触媒する。
【0070】
所望される酵素活性を備えたポリペプチドをコードする遺伝子またはヌクレオチドは、スピルリナゲノムの特異的な遺伝子座を標的化するホモロジーアームの間に、ＤＧＡＴ、ホスファチジン酸ホスファターゼ、ＡＣＣａｓｅをコードするヌクレオチド配列、またはＤＧＡＴ酵素活性、ホスファチジン酸ホスファターゼ酵素活性若しくはＡＣＣａｓｅ酵素活性を有するポリヌクレオチド配列を備えたベクターによって、スピルリナゲノムへ導入することができる。ベクターは、スピルリナの形質転換のために適切な任意のベクター（上記のベクターが含まれる）であり得る。ベクターのポリヌクレオチドはスピルリナ中での発現のためにコドンを最適化することができる。ベクターは追加される遺伝子と関連するプロモーターを含むことができる。プロモーターは誘導可能プロモーターであり得る。当業者によって理解されるように、天然に存在しないコドンを保持する、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を生ずることは、いくつかの事例において有利かもしれない。例えば、特定の原核生物宿主または真核生物宿主に好ましいコドンは、タンパク質発現の率を増加させるように、または所望される特性（天然に存在する配列から生成された転写物よりも長い半減期等）を有する組換えＲＮＡ転写物を産生するように、選択することができる。かかるヌクレオチドは、典型的には「コドンが最適化された」と称される。
【0071】
一実施形態において、特異的な遺伝子座は、ベクターのヌクレオチド配列と置き換えられる遺伝子であり得る。調節エレメント（置き換えられる遺伝子と関連するプロモーター等）を使用して、ベクターからのヌクレオチド配列の転写を指令することができる。一実施形態において、特異的な遺伝子座はスピルリナゲノムの非コーディング領域であり得る。ホモロジーアームの間のベクターのヌクレオチド配列は、所望される酵素活性を備えたポリペプチドをコードする遺伝子またはヌクレオチドと一緒にスピルリナゲノムの中への導入される、調節エレメント（プロモーター等）を含むことができる。野生型スピルリナは典型的にはトリグリセリド合成のために必要な酵素をコードしないので、本開示において記載される技法は、脂質産生を増加させるために、ＤＧＡＴ活性、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性、及び／またはＡＣＣａｓｅ酵素活性を有する外来性遺伝子をスピルリナへ追加する手法を提供する。
【0072】
グリコーゲンの産生の低減
一実施形態において、スピルリナは、同じ条件下で増殖された野生型スピルリナと比較して、低減された量のグリコーゲンを蓄積するように改変され得る。産生されるグリコーゲンの量の低減によって、シアノバクテリアによって同化された炭素は、他の炭素ベースの産物（脂質及び／または脂肪酸等）の合成に向けられる。シアノバクテリアにおけるグリコーゲン生合成遺伝子の欠失はグリコーゲン蓄積を減少させる。
一実施形態において、スピルリナは、同じ条件下で増殖された野生型スピルリナと比較して、低減された量のグリコーゲンを蓄積するように改変され得る。産生されるグリコーゲンの量の低減によって、シアノバクテリアによって同化された炭素は、他の炭素ベースの産物（脂質及び／または脂肪酸等）の合成に向けられる。シアノバクテリアにおけるグリコーゲン生合成遺伝子の欠失はグリコーゲン蓄積を減少させる。
【0073】
シアノバクテリアにおける天然のグリコーゲンの合成及び貯蔵の経路を遮断、妨害、またはダウンレギュレートすることによって（例えば遺伝子の突然変異または欠失によって）、もたらされた光合成微生物株は他の生合成経路への炭素の流れを増加させる。他の生合成経路の例には、既存の経路（既存の脂質生合成経路等）または遺伝子操作を介して導入される経路（脂肪酸またはトリグリセリドの生合成経路等）が含まれる。グリコーゲン合成と関連する遺伝子を欠失する本改変を上記の改変と組み合わせて、トリグリセリド合成と関連する外来性遺伝子を追加することができる。上記の技法を使用して、スピルリナにおいてグリコーゲンの合成及び／または貯蔵の経路と関連する１つまたは複数の遺伝子（グルコース－１－ホスフェートアデニルトランスフェラーゼ（ｇｌｇＣ）遺伝子、ホスホグルコムターゼ（ｐｇｍ）遺伝子、またはグリコーゲンシンターゼ（ｇｌｇＡ）遺伝子が含まれる）のすべてまたは一部分を欠失させることができる。グルコース－１－ホスフェートアデニルトランスフェラーゼ（ｇｌｇＣ）遺伝子、ホスホグルコムターゼ（ｐｇｍ）遺伝子、またはグリコーゲンシンターゼ（ｇｌｇＡ）遺伝子の一部分を欠失させ、酵素活性のレベルの減少無しまたは有りでもたらされたポリペプチドを与えることも企図される。グリコーゲンの合成及び／または蓄積の減少は、ストレス条件（窒素の低減等）下で増殖するスピルリナにおいてより顕著であろう。
【0074】
グリコーゲンはブドウ糖の多糖であり、それは、大部分の細胞（動物細胞及び細菌細胞が含まれる）において、炭素及びエネルギーの貯蔵の手段として機能する。より具体的には、グリコーゲンは、約９０％のα－１，４－グルコシド結合及び１０％のα－１，６結合を含有する非常に大きな分岐したブドウ糖ホモポリマーである。特定の細菌について、α－１，４－ポリグルカンの形状のグリコーゲンの生合成及び貯蔵は、環境における一時的な飢餓条件と対処する重要な戦略を表わす。
【0075】
グリコーゲン生合成には複数の酵素の作用が関与する。例えば、細菌のグリコーゲン生合成は、一般的には以下の一般的なステップ：（１）ホスホグルコムターゼ（Ｐｇｍ）によって触媒される、グルコース－１－ホスフェートの形成、続いて（２）グルコース－１－ホスフェートアデニリルトランスフェラーゼ（ＧｌｇＣ）によって触媒される、ＡＴＰ及びグルコース－１－ホスフェートからのＡＤＰ－グルコースの合成、続いて（３）グリコーゲンシンターゼ（ＧｌｇＡ）によって触媒される、ＡＤＰ－グルコースからの既存のα－１，４グルカンプライマーへのグルコシル部分の転移、を介して生じる。グリコーゲン合成のこの後者のステップは、典型的にはα－１，４－グルコシド鎖の伸長のためのグルコシル供与体としてのＡＤＰ－グルコースの利用によって起こる。
【0076】
細菌において、グリコーゲン合成における主要な調節ステップは、ＡＤＰ－グルコース合成のレベル、または上記のステップ（２）ＡＤＰ－グルコースピロホスホリラーゼとしても公知のグルコース－１－ホスフェートアデニリルトランスフェラーゼ（ＧｌｇＣ）によって触媒される反応で、起こる。これとは対照的に、哺乳類のグリコーゲン合成における主要な調節ステップはグリコーゲンシンターゼのレベルで起こる。本明細書において示されるように、光合成微生物（シアノバクテリア等）のグリコーゲン合成経路における調節性の構成要素及び／または他の活性のある構成要素を改変し、それによってグリコーゲンの生合成及び貯蔵を低減することによって、そうでなければグリコーゲンとして貯蔵されていたであろう炭素は、他の炭素ベースの貯蔵分子（脂質、脂肪酸及びトリグリセリド等）を合成するために利用することができる。
【0077】
一実施形態において、スピルリナは低減された量のホスホグルコムターゼ遺伝子を発現する。特定の実施形態において、ホスホグルコムターゼ遺伝子（その調節エレメント（例えばプロモーター、エンハンサー、転写因子、正の調節タンパク質または負の調節タンパク質など）のうちの任意のものが含まれる）は、突然変異または欠失を含むことができる。遺伝子ｐｇｍによってコードされたホスホグルコムターゼ（Ｐｇｍ）は、典型的には、酵素結合中間体（グルコース１，６－ビホスフェート（ｂｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ））経由で、グルコース１－ホスフェートのグルコース６－ホスフェートへの可逆的転換を触媒する。この反応は可逆的であるが、グルコース－６－ホスフェートの形成が著しく優遇される。
【0078】
一実施形態において、改変されたスピルリナは、低減された量のグルコース－１－ホスフェートアデニリルトランスフェラーゼ（ｇｌｇＣ）遺伝子を発現する。ある特定の実施形態において、ｇｌｇＣ遺伝子（その調節エレメントのうちの任意のものが含まれる）は、突然変異または欠失を含むことができる。ｇｌｇＣ遺伝子によってコードされた酵素（例えばＥＣ ２．７．７．２７）は、一般的には、以下の化学反応（ＡＴＰ＋α－Ｄ－グルコース１－ホスフェート→二リン酸塩＋ＡＤＰ－グルコース）の触媒によって、デンプン、グリコーゲン及びショ糖の代謝に参加する。
【0079】
したがって、この酵素の２つの基質はＡＴＰ及びα－Ｄ－グルコース１－ホスフェートであるが、その２つの産物は二リン酸塩及びＡＤＰ－グルコースである。ｇｌｇＣにコードされた酵素は、植物のデンプン生合成及び細菌のグリコーゲン生合成において、最初の関与ステップ及び律速ステップを触媒する。植物及び細菌における貯蔵多糖の蓄積を調節するのは酵素部位であり、エネルギーの流れの代謝物質によってアロステリック的に活性化または阻害される。
【0080】
ｇｌｇＣ遺伝子によってコードされた酵素は、トランスフェラーゼ、具体的にはリン含有ヌクレオチド基を転移するトランスフェラーゼ（すなわちヌクレオチジルトランスフェラーゼ）のファミリーに属している。この酵素クラスの系統名は典型的にはＡＴＰ：α－Ｄ－グルコース－１－ホスフェートアデニリルトランスフェラーゼと称される。通常の使用における他の名称には、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ、グルコース１－ホスフェートアデニリルトランスフェラーゼ、アデノシン二リン酸グルコースピロホスホリラーゼ、アデノシンジホスホグルコースピロホスホリラーゼ、ＡＤＰ－グルコースピロホスホリラーゼ、ＡＤＰ－グルコースシンターゼ、ＡＤＰ－グルコースシンセターゼ、ＡＤＰＧピロホスホリラーゼ、及びＡＤＰ：α－Ｄ－グルコース－１－ホスフェートアデニリルトランスフェラーゼが含まれる。
【0081】
一実施形態において、スピルリナは低減された量のグリコーゲンシンターゼ遺伝子を発現する。特定の実施形態において、グリコーゲンシンターゼ遺伝子遺伝子（その調節エレメントのうちの任意のものが含まれる）は、欠失または突然変異を含むことができる。ＵＤＰ－グルコース－グリコーゲングルコシルトランスフェラーゼとして公知のグリコーゲンシンターゼ（ＧｌｇＡ）は、ＵＤＰ－グルコース及び（１，４－α－Ｄ－グルコシル）ｎの反応を触媒してＵＤＰ及び（１，４－α－Ｄ－グルコシル）ｎ＋１をもたらす、グリコシルトランスフェラーゼ酵素である。グリコーゲンシンターゼは、ＡＤＰ－グルコースを使用して成長するグリコーゲンポリマーの上へ追加のグルコースモノマーを組み入れる、α－保持型グルコシルトランスフェラーゼである。本質的に、ＧｌｇＡは、グリコーゲンとして貯蔵するために過剰なグルコース残基をポリマー鎖に一つずつ転換する最終的なステップを触媒する。
【0082】
古典的には、グリコーゲンシンターゼまたはα－１，４－グルカンシンターゼは、配列、糖供与体特異性及び調節機構の差に従って、２つのファミリー（動物／真菌のグリコーゲンシンターゼ及び細菌／植物のスターチシンターゼ）へと分類されている。しかしながら、詳細な配列分析、予測される二次構造比較及びスレッディング分析から、これらの２つのファミリーが構造的に関連し、動物／真菌のシンターゼのうちのいくつかのドメインがそれらの細胞タイプの特定の調節要求性を満たすように獲得されたことが示される。
【0083】
結晶構造は特定の細菌性グリコーゲンシンターゼについて確立されている。これらの構造から、報告されたグリコーゲンシンターゼは、グリコーゲンホスホリラーゼ及びグリコシルトランスフェラーゼスーパーファミリーの他のグリコシルトランスフェラーゼでのように組織化された２つのＲｏｓｓｍａｎｎフォールドドメインへと折り畳まれ、触媒中心を含む両ドメインの間の深い裂溝を備えていることが示される。このグリコーゲンシンターゼのＮ末のドメインのコアは、７つのα－ヘリックスが両側に隣接する、９つのストランドの平行が優位な中心β－シートからなる。Ｃ末のドメイン（残基２７１～４５６）は、６つのストランドの平行β－シート及び９つのα－ヘリックスを備えた同様のフォールドを示す。このドメインの最後のα－ヘリックスは位置４５７～４６０でねじれて、タンパク質の最後の１７残基（４６１～４７７）はＮ末のドメインへ交差し、α－ヘリックスとして継続する（グリコシルトランスフェラーゼ酵素の典型的な特色）。
【0084】
これらの構造は、グリコーゲンシンターゼの全体的なフォールドおよび活性部位の構成は、グリコーゲンホスホリラーゼ（これは炭水化物予備の可動化において中心的な役割を果たす）のものに顕著に類似することも示し、、共通の触媒メカニズム及び匹敵する基質結合特性が指摘される。しかしながら、グリコーゲンホスホリラーゼとは対照的に、グリコーゲンシンターゼははるかに幅広い触媒クレフトを有し、それは触媒サイクルの最中に重要なドメイン間の「閉鎖」運動を行うと予測される。
【0085】
結晶構造は特定のＧｌｇＡ酵素について確立されている。これらの試験から、ＧｌｇＡのＮ末の触媒ドメインはジヌクレオチド結合Ｒｏｓｓｍａｎｎフォールドに類似し、Ｃ末のドメインは、協同的アロステリック調節及びユニークなオリゴマー化に関与する左巻き平行βヘリックスを取り入れることが示される。また、調節因子結合部位と活性部位との間の伝達は、酵素の複数の別個の領域（Ｎ末、グルコース－１－ホスフェート結合部位、及びＡＴＰ結合部位が含まれる）が関与する。
【0086】
グルコース－１－ホスフェートアデニルトランスフェラーゼ（ｇｌｇＣ）遺伝子、ホスホグルコムターゼ（ｐｇｍ）遺伝子、および／またはグリコーゲンシンターゼ（ｇｌｇＡ）遺伝子は、所与の遺伝子の上流および下流のフランキング領域を標的化しスピルリナゲノムと組換えるホモロジーアームを備えたベクターを使用して、全体または部分的に欠失させて、ホモロジーアームの間の領域におけるヌクレオチドを除去するか、またはヌクレオチドを異なる配列（レポーターまたはマーカー遺伝子等）と置き換えることができる。ベクター配列中のレポーターまたはマーカー（薬物選択可能マーカー等）の存在を考慮すると、遺伝子欠失を含有しているスピルリナ細胞は容易に単離、同定、及び特徴づけることができる。一例として、選択及び単離には、当技術分野において公知の抗生物質耐性マーカー（例えばカナマイシン、スペクチノマイシン及びストレプトマイシン）の使用が含まれ得る。かかる選択可能ベクターに基づく組換え方法は、上流及び下流のフランキング領域への標的化に限定される必要はないが、その遺伝子が「機能を持たない」ようにされる限り、所与の遺伝子内の内部配列へも標的化することもできる。グリコーゲン合成に参加する遺伝子のすべてまたは一部の欠失は、スピルリナの増殖を損なわないが、グリコーゲンの産生を低減する。
【0087】
カロチノイドの産生の改変
カロチノイドは、シアノバクテリア（スピルリナが含まれる）によって、脂肪及び他の基本的な有機代謝性ビルディングブロックから産生することができる。カロチノイドは、光合成において酸化ストレスから光合成系の他の構成要素を保護するように機能する。カロチノイドは様々な黄色から赤色の色合いの色素形成も提供することができる。シアノバクテリアにおけるカロチノイド生合成は、特定の遺伝子の発現を低減すること、特定の遺伝子の発現を増加させること、及び／または外来性遺伝子を導入することによって改変することができる。
カロチノイドは、シアノバクテリア（スピルリナが含まれる）によって、脂肪及び他の基本的な有機代謝性ビルディングブロックから産生することができる。カロチノイドは、光合成において酸化ストレスから光合成系の他の構成要素を保護するように機能する。カロチノイドは様々な黄色から赤色の色合いの色素形成も提供することができる。シアノバクテリアにおけるカロチノイド生合成は、特定の遺伝子の発現を低減すること、特定の遺伝子の発現を増加させること、及び／または外来性遺伝子を導入することによって改変することができる。
【0088】
ｃｒｔＧ（２，２’－β－カロチンヒドロキシラーゼ）の欠失を含有するシアノバクテリアは典型的な指数増殖率を維持しながら、ゼアキサンチンの合成及び蓄積の増加をもたらす。加えて、ｃｒｔＲ（３，３’－β－カロチンヒドロキシラーゼ）またはｃｒｔＺ（カルトネノイド（ｃａｒｔｏｎｅｎｏｉｄ）－３，３’－ヒドロキシラーゼ）の発現は、Ｅ．ｃｏｌｉ株において、β－カロチン合成に関与する１シリーズの遺伝子ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ及びｃｒｔＹが導入される場合、ゼアキサンチンの産生をもたらすことが実証された。一実施形態において、ｃｒｔＲ遺伝子は、配列番号：１０で示される配列を含む。一実施形態において、ｃｒｔＺ遺伝子はＢｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｓｐ． ＳＤ２１２からであり、配列番号：１１で示される配列を含む。
【0089】
加えて、ｃｒｔＷ（β－カロチンオキシゲナーゼ）及びｃｒｔＺ（カルトネノイド（ｃａｒｔｏｎｅｎｏｉｄ）－３，３’－ヒドロキシラーゼ）の導入は、シアノバクテリアにおけるアスタキサンチン及びカンタキサンチンの合成及び蓄積をもたらす。一実施形態において、ｃｒｔＷ遺伝子はＢｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｓｐ． ＳＤ２１２からであり、配列番号：１２で示される配列を含む。
【0090】
本開示において記載される技法を使用して、ｃｒｔＧをノックアウトするか、または機能を持たないｃｒｔＧのスピルリナ遺伝子を与えることができる。加えて、本開示において記載される技法を使用して、生来のスピルリナプロモーターの制御下、または外来性プロモーター（強いプロモーター及び誘導可能／抑制可能なプロモーターが含まれる）の制御下で、スピルリナゲノムへ、ｃｒｔＲ遺伝子、ｃｒｔＺ遺伝子及びｃｒｔＷ遺伝子を追加することができる。一実施形態において、ｃｒｔＷ遺伝子及びｃｒｔＺ遺伝子の発現を調節するプロモーターは、誘導の非存在下において外来性遺伝子の発現がないかまたは本質的にないように、厳密に調節されるプロモーターであり得る。
【0091】
例えば、カロチノイドを産生するために、改変されたスピルリナは、過剰発現されたカロチノイドヒドロキシラーゼ（例えばβ－カロチンヒドロキシラーゼ）を含有し得る。これら及び関連する実施形態において、カロチノイド産生は、ストレス条件（窒素枯渇等であるが、これらに限定されない）へ改変された光合成微生物をさらすことによって、更に増加させることができる。１つの例示的なカロチノイドヒドロキシラーゼはＡ．ｐｌａｎｔｅｎｓｉｓのＮＩＥＳ３９＿Ｒ００４３０のｃｒｔＲによってコードされる。別の例示的なカロチノイドヒドロキシラーゼはＰａｎｔｏｅａ ａｎａｎａｔｉｓのｃｒｔＺによってコードされる。そのホモログまたはパラログ、その機能的な等価物、及びその断片またはバリアントも含まれる。機能的な等価物には、β－カロチンへヒドロキシル基を追加する能力を備えたカロチノイドヒドロキシラーゼが含まれる。これら及び関連する実施形態は、本明細書において記載される内在性グリコーゲン経路遺伝子（例えばＡ．ｐｌａｎｔｅｎｓｉｓにおけるｇｌｇＣ）の発現及び／または活性の低減と更に組み合わせて、炭素をグリコーゲン産生からカロチノイドへと切りかえることができる。
【0092】
フィコシアニン及び／またはフィコエリトリン産生の改変
一実施形態において、スピルリナは、フィコシアニン及び／またはフィコエリトリンの産生を、同じ条件下で増殖された野生型スピルリナによって産生されるレベルを超えて増加させるように改変することができる。ビリン発色団と結び付いたフィコシアニン及びフィコエリトリンはそれぞれ天然に存在する青色及び赤色の色素であり、それらは化粧品産業、食品産業、及び医療画像産業において使用される。これらの色素分子はシアノバクテリアから精製することができる。
一実施形態において、スピルリナは、フィコシアニン及び／またはフィコエリトリンの産生を、同じ条件下で増殖された野生型スピルリナによって産生されるレベルを超えて増加させるように改変することができる。ビリン発色団と結び付いたフィコシアニン及びフィコエリトリンはそれぞれ天然に存在する青色及び赤色の色素であり、それらは化粧品産業、食品産業、及び医療画像産業において使用される。これらの色素分子はシアノバクテリアから精製することができる。
【0093】
多くのシアノバクテリアの際立った１つの特色はフィコビリソームと呼ばれる大量の集光性構造である。フィコビリソーム（それはシアノバクテリアに色の多様性を与える）は、細胞のタンパク質の最大６０％を占める。これらの大量のタンパク質構造は、エネルギーを光化学のための光合成反応中心へ直接転移する。
【0094】
光化学のために光を吸収するフィコビリソーム中の色素分子は、ビリンと呼ばれる直線状のテトラピロール分子である。すべてのビリンは、システイン－チオエーテル結合を介してフィコビリタンパク質へ共有結合される。フィコビリソームには３つの主要なクラスのフィコビリタンパク質；アロフィコシアニン（ＡＰ）、フィコシアニン（ＰＣ）及びフィコエリトリン（ＰＥ）がある。各々のクラスはヘテロダイマーを形成するαサブユニット及びβサブユニットを含有する。ヘテロダイマーのαサブユニット及びβサブユニットの両方は、ビリン色素のうちの１つまたは複数を結合することができる。
【0095】
フィコビリソームを含む主要な構造成分は、２つの群；「コア」サブストラクチャー及び「ロッド」サブストラクチャーへと細分することができる。Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．の株において、コアサブストラクチャーは、少数のタイプのフィコビリタンパク質及びコアリンカータンパク質から作られる２つのシリンダーからなる。ロッドサブストラクチャーはＰＣα及びＰＣβのヘテロダイマーのヘキサマーから構成される。これらのヘテロヘキサマーのうちの平均３つが、リンカータンパク質経由で接続され、コアサブストラクチャー上に積み重ねられる。
【0096】
上記の技法を使用して、標的化された相同組換えを介してスピルリナに遺伝子を追加することができる。本開示における記載される技法は、フィコシアニンまたはフィコエリトリンをコードすることが公知である遺伝子を追加する手法を提供する。上記の技法を使用して、野生型のフィコシアニンまたはフィコエリトリンとは異なるが、ビリン発色団と結び付く能力を依然として有する、ポリペプチド配列をコードする遺伝子またはポリヌクレオチド配列の一部分を追加することができる。
【実施例】
【0097】
本開示の特定の実施形態は、ここで以下の実施例によって例証されるだろう。しかしながら、本開示は様々な形態で実施され、本明細書において説明される実施形態に限定されるものとして解釈されるべきでなく、むしろ、本開示が充分且つ完全であるようにこれらの実施形態は提供され、本開示の範囲を当業者へ全て伝えるだろう。
【0098】
実施例１
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ（日本）のＭｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得たＡｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｎｔｅｎｓｉｓのＮＩＥＳ－３９細胞を、連続的な照明下で振盪しながらＳＯＴ培地中で培養した。７５０ｎｍでの光学的密度が０．６～０．８に到達したときに、細胞を、６０ｍＬの培養物から１，５００×ｇで１０分間採取し、３０ｍＬのｐＨバランサー及び塩溶液中で再懸濁した。細胞を同じ条件下の遠心分離によって収集し、ポリエーテル浸透圧安定剤により３回洗浄した。細胞懸濁物を浸透圧安定剤中で２倍に希釈し、次いで１，５００×ｇで５分間遠心して沈殿させ、細胞懸濁物の全体積を２ｍＬに調整した。
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ（日本）のＭｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得たＡｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｎｔｅｎｓｉｓのＮＩＥＳ－３９細胞を、連続的な照明下で振盪しながらＳＯＴ培地中で培養した。７５０ｎｍでの光学的密度が０．６～０．８に到達したときに、細胞を、６０ｍＬの培養物から１，５００×ｇで１０分間採取し、３０ｍＬのｐＨバランサー及び塩溶液中で再懸濁した。細胞を同じ条件下の遠心分離によって収集し、ポリエーテル浸透圧安定剤により３回洗浄した。細胞懸濁物を浸透圧安定剤中で２倍に希釈し、次いで１，５００×ｇで５分間遠心して沈殿させ、細胞懸濁物の全体積を２ｍＬに調整した。
【0099】
図１はＡ．ｐｌａｎｔｅｎｓｉｓの標的化された遺伝子座を示す。遺伝子座はｐｉｌＡ遺伝子（線毛タンパク質をコードする）を含む。左ホモロジーアーム及び右のホモロジーアームに対応するＡ．ｐｌａｎｔｅｎｓｉｓゲノムの領域も示される。左ホモロジーアームは対象となる遺伝子座の「左」の末端（５’末端）に隣接し、右ホモロジーアームは対象となる遺伝子座の「右」の末端（３’末端）に隣接する。この実施例において、左ホモロジーアーム及び右ホモロジーアームは約２０００ｂｐ長である。
【0100】
図２は、Ｇｉｂｓｏｎのアセンブリー方法を使用して、ベクター骨格、左ホモロジーアーム、右ホモロジーアーム、及びアミノグリコシドアデンリイトランスフェラーゼ（ａｄｅｎｌｙｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子（ａａｄＡ）を含有する４つのＰＣＲ断片のアセンブルによって生成された、ｐＡｐｌ－ｐｉｌＡ／ａａｄＡプラスミドを示す。次いでこのプラスミドを使用してＡ．ｐｌａｎｔｅｎｓｉｓを形質転換した。ｐＡｐｌ－ｐｉｌＡ／ａａｄＡプラスミドはホモロジーアームの間に配置されたａａｄＡを含む。ａａｄＡは、スペクチノマイシン及びストレプトマイシンへの耐性を付与する。したがって、このプラスミドによる相同組換えは、ｐｉｌＡ遺伝子をａａｄＡ遺伝子で置き換える。プラスミドは、ＡｍｐＲプロモーターの制御下のＡｍｐＲ遺伝子（アンピシリン耐性）及びＥ．ｃｏｌｉにおける複製起点（ｏｒｉ）も含有する。２．５μｇのこのプラスミドを２００μＬの細胞懸濁物と混合した。プラスミドとの混合の直後に、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ（商標）Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、米国）を使用して、細胞をエレクトロポレーションした。
【0101】
エレクトロポレーションに後続して、細胞を、照明を低減して振盪せずに４８時間ＳＯＴ培地中で増殖させ、次いでストレプトマイシンを補足したＳＯＴ培地へ移した。培地中のストレプトマイシンの存在は形質転換された細胞のために選択された。ストレプトマイシンを含む培地を数日毎に交換して、抗生物質の有効性を維持した。ストレプトマイシン培地中で増殖させた後に、細胞を、ストレプトマイシン及びスペクチノマイシンを含有するＳＯＴ培地中で培養した。
【0102】
図３Ａは、ｐＡｐｌ－ｐｉｌＡ／ａａｄＡプラスミド中に含有されるアミノグリコシドアデニリルトランスフェラーゼ（ａａｄＡ）遺伝子による、Ａ．ｐｌａｎｔｅｎｓｉｓにおけるｐｉｌＡ遺伝子のオープンリーディングフレームの置換の概略図である。相同組換えの成功に後続して、ｐｉｌＡ遺伝子はａａｄＡ遺伝子により置き換えられた。ホモロジーアームは概略図中で太線として示される。Ａ．ｐｌａｎｔｅｎｓｉｓのゲノムへ結合する３つのプライマーＡ、Ｂ及びＣが同定され、プラスミド中のａａｄＡ遺伝子へ結合する２つのプライマーＤ及びＥが同定された。プライマーＡ及びＣは、ａａｄＡ含有プラスミド上に存在するホモロジーアームの外でＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡ合成を開始するようにデザインされた。したがって、プライマーＡ及びＣは、形質転換後に不変のままであるＡ．ｐｌａｎｔｅｎｓｉｓゲノムの領域へ結合する。プライマーＡは配列番号：１３を有する。プライマーＣは配列番号：１４を有する。プライマーＢはｐｉｌＡ遺伝子の上流のホモロジーアームへ結合する。プライマーＢは配列番号：１５を有する。プライマーＤ及びＥは、ａａｄＡ遺伝子の上流及び下流の端部へそれぞれ結合する。プライマーＤは配列番号：１６を有する。プライマーＥは配列番号：１７を有する。
【0103】
図３Ｂは、野生型Ａ．ｐｌａｎｔｅｎｓｉｓ（ＷＴ）及び上記のようにｐＡｐｌ－ｐｉｌＡ／ａａｄＡプラスミドにより形質転換した後のＡ．ｐｌａｎｔｅｎｓｉｓ（ΔｐｉｌＡ）を比較する異なるプライマーペアの組み合わせにより行った、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の結果を示す。ストレプトマイシン及びスペクチノマイシン中で増殖させた後に採取した細菌を煮沸したものの上清を、ＰＣＲ鋳型として使用した。ＰＣＲは以下の条件下で行った。プライマーＢ及びＣを含有する反応混合について、９８℃で１分間の初期変性、ならびに９８℃で３０秒の変性、７１℃で１５秒のアニーリング（１サイクルあたり－０．１℃）、及び７２℃で１．５分間の伸長を３５サイクル、続いて７２℃で２分間の最終的な伸長、次いで４℃への冷却；残りのプライマーを含有する反応混合について、９８℃で１分間の初期変性、続いて９８℃で３０秒の変性、６６℃で１５秒のアニーリング、及び７２℃で１分間の伸長を３５サイクル、続いて７２℃で２分間の最終的な伸長及び４℃への冷却。標的化された遺伝子座の中へのａａｄＡの組み込みは、２つのペアのプライマー（Ｃ／Ｅ及びＡ／Ｄ）を使用して確認した。ゲル上で泳動されたラダーは、５ｋｂ、１．５ｋｂ及び５００ｂｐで顕著なバンドを有する。Ｃ／Ｅプライマーペアを使用する増幅は野生型で検出されなかったが、ΔｐｉｌＡで２．２ｋｂの強いバンドをもたらした。Ａ／Ｄプライマーペアによる同様の増幅は野生型で検出されなかったが、ΔｐｉｌＡで２．１ｋｂの強いバンドをもたらした。プライマーＢ及びＣの使用は、ｐｉｌＡまたはａａｄＡのいずれかにわたるゲノム配列のＰＣＲ増幅を可能にする。野生型サンプル（ｐｉｌＡを含有する）の増幅は、形質転換されたサンプルΔｐｉｌＡ（ａａｄＡを含有する）の約３．４ｋｂの増幅よりもわずかに短い、約３．１ｋｂのＰＣＲ産物を生成した。ａａｄＡ配列がｐｉｌＡ配列よりも約３００ｂｐ長いので、このことから予想が確認される。ＰＣＲの結果は、内在性ｐｉｌＡ遺伝子がａａｄＡ遺伝子により置き換えられたことを実証する。
【0104】
図３Ｃは、ｐｉｌＡ遺伝子に相補的なプライマーＦ及びＧによるＰＣＲが、ストレプトマイシン及びスペクチノマイシンを補足したＳＯＴ培地中で増殖させた形質転換された細胞からの任意のＤＮＡの増幅に失敗したことを示し、抗生物質の存在下において増殖させた培養物中でｐｉｌＡ遺伝子のすべてのコピーが置き換えられたことを指摘する。しかしながら、プライマーＦ及びＧによる増幅は、抗生物質なしにＳＯＴ培地中で増殖させた野生型から３４０ｂｐの配列を増幅し、プライマーＦ及びＧがｐｉｌＡ遺伝子の増幅で効果的であることを確認した。プライマーＦは配列番号：１８を有する。プライマーＧは配列番号：１９を有する。このゲル上で泳動されたラダーは、５ｋｂ、１．５ｋｂ及び５００ｂｐで顕著なバンドを有する。
【0105】
実施例２
Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ． ＰＣＣ ８００５細胞は、Ｐａｓｔｅｕｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ（Ｐａｒｉｓ）のＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ中で維持されたシアノバクテリアのＰａｓｔｕｒｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＰＣＣ）から得られ、連続的な照明下で振盪しながらＳＯＴ培地中で３日間培養された。細胞を、３日の期間の間に新鮮なＳＯＴ培地中で３倍または４倍に希釈した。７５０ｎｍの光学的密度が所望されるレベルに到達するまで、細胞を上記の条件下で維持した。次いで細胞を培養物から３，２００×ｇで１０分間採取した。上清を除去し、細胞をｐＨバランサー及び塩溶液中で懸濁してｐＨを中和した。同じ条件下での遠心分離後に、細胞を０．１～１００ｍＭのＮａＣＬ及び１～５０ｍＬの浸透圧安定剤により３回洗浄し、次いで２つの１．５ｍＬポリプロピレン微量遠心機用チューブ（例えばＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標）チューブ）の中へ移した。１．５ｍＬ微量遠心機用チューブを３，２００×ｇで室温で５分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞懸濁物を３，２００×ｇで５分間再び遠心分離し、次いでＮａＣＬ及び浸透圧調節物質溶液中で２倍に希釈した。上清を除去し、細胞懸濁物の全体積を４５０μｌへ調整した。
Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ． ＰＣＣ ８００５細胞は、Ｐａｓｔｅｕｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ（Ｐａｒｉｓ）のＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ中で維持されたシアノバクテリアのＰａｓｔｕｒｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＰＣＣ）から得られ、連続的な照明下で振盪しながらＳＯＴ培地中で３日間培養された。細胞を、３日の期間の間に新鮮なＳＯＴ培地中で３倍または４倍に希釈した。７５０ｎｍの光学的密度が所望されるレベルに到達するまで、細胞を上記の条件下で維持した。次いで細胞を培養物から３，２００×ｇで１０分間採取した。上清を除去し、細胞をｐＨバランサー及び塩溶液中で懸濁してｐＨを中和した。同じ条件下での遠心分離後に、細胞を０．１～１００ｍＭのＮａＣＬ及び１～５０ｍＬの浸透圧安定剤により３回洗浄し、次いで２つの１．５ｍＬポリプロピレン微量遠心機用チューブ（例えばＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標）チューブ）の中へ移した。１．５ｍＬ微量遠心機用チューブを３，２００×ｇで室温で５分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞懸濁物を３，２００×ｇで５分間再び遠心分離し、次いでＮａＣＬ及び浸透圧調節物質溶液中で２倍に希釈した。上清を除去し、細胞懸濁物の全体積を４５０μｌへ調整した。
【0106】
図４は、Ｇｉｂｓｏｎのアセンブリー方法を使用することによって、ベクター骨格、左ホモロジーアーム、右ホモロジーアーム、及びアミノグリコシドアデンリイトランスフェラーゼ（ａｄｅｎｌｙｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）をコードするａａｄＡを含有する４つのＰＣＲ断片を繋いで生成された、ｐＡｐｌ－ｐｉｌＡ８００５／ａａｄＡプラスミド（配列番号：２）を示す。ｐＡｐｌ－ｐｉｌＡ８００５／ａａｄＡプラスミドにおいて、ａａｄＡは、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ． ＰＣＣ ８００５においてｐｉｌＡオープンリーディングフレームの上流及び下流に見出されるゲノム配列に同一の配列を含有する右ホモロジーアームと左ホモロジーアームとの間に位置する。左ホモロジーアームは２．０ｋｂであり、右ホモロジーアームは１．０ｋｂである。ａａｄＡは、スペクチノマイシン及びストレプトマイシンへの耐性を付与する。したがって、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ． ＰＣＣ ８００５とこのプラスミドとの間の相同組換えは、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ． ＰＣＣ ８００５のｐｉｌＡ遺伝子をａａｄＡ遺伝子で置き換える。ｐＡｐｌ－ｐｉｌＡ８００５／ａａｄＡプラスミドは、ＡｍｐＲプロモーターの制御下でアンピシリン耐性を付与するβ－ラクタマーゼをコードするオペロン（ＡｍｐＲ）及びＥ．ｃｏｌｉからの複製起点（ｏｒｉ）も含有する。
【0107】
４００μＬの懸濁細胞を０．１～２０μｇのｐＡｐｌ－ｐｉｌＡ８００５／ａａｄＡプラスミドと混合し、エレクトロポレーションキュベットの中へ移した。混合の直後に、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ（商標）Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、米国）エレクトロポレーションシステムを使用して、エレクトロポレーションを遂行した。
【0108】
エレクトロポレーションに後続して、１ｍＬのＳＯＴ培地をキュベットの中へ添加し、次いで、細胞及びＳＯＴ培地を、９ｍＬのＳＯＴ培地を含有する５０ｍＬポリプロピレン円錐管遠心分離チューブ（例えばファルコン（登録商標）チューブ）の中へ移した。細胞を３０℃で照明を低減してインキュベーションした。抗生物質耐性によって同定された成功した形質転換体を、ストレプトマイシン及びスペクチノマイシンの存在下において選択した。
【0109】
図５Ａは、ｐＡｐｌ－ｐｉｌＡ８００５／ａａｄＡプラスミド中に含有されるアミノグリコシドアデニリルトランスフェラーゼ（ａａｄＡ）遺伝子による、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ． ＰＣＣ ８００５におけるｐｉｌＡ遺伝子のオープンリーディングフレームの置換の概略図である。相同組換えの成功に後続して、ｐｉｌＡ遺伝子はａａｄＡ遺伝子により置き換えられた。ホモロジーアームは概略図において網掛けのボックスとして示される。Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ． ＰＣＣ ８００５のゲノムへ結合する２つのプライマーＨ及びＩが同定され、プラスミド中のａａｄＡ遺伝子へ結合する１つのプライマーＪが同定された。プライマーＨは、ｐＡｐｌ－ｐｉｌＡ８００５／ａａｄＡプラスミド上に存在するホモロジーアームの外でＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡ合成を開始する。したがって、プライマーＨは、形質転換後に不変のままであるＡｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ． ＰＣＣ ８００５のゲノムの領域へ結合する。プライマーＨは配列番号：２０を有する。プライマーＩはｐｉｌＡ遺伝子の上流のホモロジーアームへ結合する。プライマーＩは配列番号：２１を有する。プライマーＪは配列番号：２２を有する。
【0110】
図５Ｂは、抗生物質の存在下において培養した細胞から抽出されたＤＮＡで行われたＰＣＲの結果を示す。野生型Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ． ＰＣＣ ８００５（ＷＴ）及びｐｉｌＡの欠失をもたらすｐＡｐｌ－ｐｉｌＡ８００５／ａａｄＡプラスミドによる形質転換後のＡｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ． ＰＣＣ ８００５（ΔｐｉｌＡ）で、プライマーペアＨ／Ｉ及びＨ／ＪによりＰＣＲを遂行した。ＰＣＲは実施例１において上で記載された条件下で行われた。野生型Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ． ＰＣＣ ８００５においてプライマーＪのためのアニーリング部位がないので、Ｈ／Ｊプライマーペアは、形質転換した細胞から抽出されたＤＮＡを含有する反応混合物においてのみ増幅をもたらし、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ． ＰＣＣ ８００５のｐｉｌＡがａａｄＡにより置き換えられたことを指摘する。標的化された遺伝子座の中へのａａｄＡの組み込みは、２つのペアのプライマー（Ｈ／Ｉ及びＨ／Ｊ）を使用し、１％ｗ／ｖアガロースゲル上のＰＣＲ産物の泳動によって結果を比較して確認した。
【0111】
プライマーペアＨ／Ｉによる野生型Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ． のＰＣＣ ８００５から抽出されたＤＮＡの増幅は２．５ｋｂと３ｋｂとの間にバンドを示し、ｐｉｌＡ遺伝子の存在を指摘する。予想されるように、ａａｄＡは形質転換なしではＡｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ． ＰＣＣ ８００５のゲノム中に存在しないので、Ｈ／Ｊプライマーペアによる野生型Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ． ＰＣＣ ８００５の増幅は、任意のバンドをもたらさない。Ｈ／ＩプライマーペアまたはＨ／Ｊプライマーペアのいずれかにより増幅された場合に、形質転換された細胞から抽出されたＤＮＡはＰＣＲ産物をもたらした。形質転換された細胞からのＤＮＡでＨ／Ｉプライマーを使用する場合、野生型Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ． ＰＣＣ ８００５のＨ／Ｉプライマーペアによる増幅からもたらされるバンドよりもわずかに大きいおよそ３ｋｂに、バンドが存在する。これは、ａａｄＡがｐｉｌＡよりもおよそ３００ｂｐ長いので、ａａｄＡを含有する染色体が完全に分離されたことを実証する。形質転換された細胞は野生型細胞とは異なりＨ／Ｊプライマーペアでも増幅され、２ｋｂのわずかに上のバンドをもたらした。ＰＣＲ結果から、内在性ｐｉｌＡ遺伝子がａａｄＡ遺伝子により置き換えられ、ａａｄＡ遺伝子がすべての染色体コピー上で複製されたことが実証される。
【0112】
実施例３
Ａｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｎｔｅｎｓｉｓのＮＩＥＳ－３９を実施例２からの手順を使用して改変して、内在性のＮＩＥＳ３９＿Ｑ０１２２０遺伝子座の中へβ－カロチン３，３’－水酸化酵素（ＣｒｔＺ）及びβ－カロチン４，４’－ケトラーゼ（ＣｒｔＷ）をコードする外来性遺伝子を導入した。Ａ．ｐｌａｎｔｅｎｔｉｓはアスタキサンチンを天然に合成しないが、ｃｒｔＺ及びｃｒｔＷの導入は、この有益なカロチノイドの合成を可能にする生合成経路を提供する。ｃｒｔＺ遺伝子はＰａｎｔｏｅａ ａｎａｎａｔｉｓ（配列番号：２３）から得られ、ｃｒｔＷ遺伝子はＢｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｓｐ． ＳＤ２１２（配列番号：２４）から得られた。両方の遺伝子はＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓのＰＣＣ７９４２において機能することが確認されており、シアノバクテリアにおける発現のためにコドンを最適化した。
Ａｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｎｔｅｎｓｉｓのＮＩＥＳ－３９を実施例２からの手順を使用して改変して、内在性のＮＩＥＳ３９＿Ｑ０１２２０遺伝子座の中へβ－カロチン３，３’－水酸化酵素（ＣｒｔＺ）及びβ－カロチン４，４’－ケトラーゼ（ＣｒｔＷ）をコードする外来性遺伝子を導入した。Ａ．ｐｌａｎｔｅｎｔｉｓはアスタキサンチンを天然に合成しないが、ｃｒｔＺ及びｃｒｔＷの導入は、この有益なカロチノイドの合成を可能にする生合成経路を提供する。ｃｒｔＺ遺伝子はＰａｎｔｏｅａ ａｎａｎａｔｉｓ（配列番号：２３）から得られ、ｃｒｔＷ遺伝子はＢｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｓｐ． ＳＤ２１２（配列番号：２４）から得られた。両方の遺伝子はＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓのＰＣＣ７９４２において機能することが確認されており、シアノバクテリアにおける発現のためにコドンを最適化した。
【0113】
ｐＡｐｌ－ＮＳ１／Ｐｒｓ－ｃｒｔＷ－ｃｒｔＺプラスミドはＡ．ｐｌａｎｔｅｎｔｉｓの中へｃｒｔＺ及びｃｒｔＷを導入するように生成した。このプラスミドは、ａａｄＡ遺伝子ならびにリボスイッチへ接続された誘導可能なｔｒｃプロモーターの下流にｃｒｔＺ遺伝子及びｃｒｔＷ遺伝子を含む。図６は、ｐＡｐｌ－ＮＳ１／Ｐｒｓ－ｃｒｔＷ－ｃｒｔＺプラスミド（配列番号：３）のデザインを示す。このプラスミドは実施例１中で記載されるものと同じ技法によって生成した。
【0114】
エレクトロポレーション及び培養の技法を最初は実施例１中で記載されるように遂行したが、実施例１からのｐＡｐｌ－ｐｉｌＡ／ａａｄＡプラスミドの代わりにｐＡｐｌ－ＮＳ１／Ｐｒｓ－ｃｒｔＷ－ｃｒｔＺプラスミドを使用した。この変化の後に、形質転換は成功しなかった。理論により束縛されるものではないが、シアノバクテリアにおけるＣｒｔＷ及びＣｒｔＺの発現は光化学系を中断し、それは細胞増殖を阻害し得ると考えられる。選択されたプロモーターが、誘導なしで、ｃｒｔＺ及びｃｒｔＷの遺伝子の発現を十分に抑制しなかったのではないかという理論を立てられる。したがって、ＣｒｔＷ及びＣｒｔＺのタンパク質の存在は、任意の形質転換された細胞が増殖することを阻止し得る。増殖を阻害し得る遺伝子による形質転換は、遺伝子発現を非常に厳密に調節するプロモーターデザインに依存し得る。プロモーター間の相互作用、挿入される遺伝子、及び形質転換成功は、更なる研究領域である。
【0115】
実施例４
Ａｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｎｔｅｎｓｉｓのＮＩＥＳ－３９は、Ｃ－フィコシアニンのαサブユニット及びβサブユニットをコードするｃｐｃＡ遺伝子及びｃｐｃＢ遺伝子の追加コピーの追加によって改変される。野生型Ａｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｎｔｅｎｓｉｓのＮＩＥＳ－３９は、これらの遺伝子の単一のセットをのみ有する。これらの内在性遺伝子のコピー数の増加は青色のＣ－フィコシアニンの合成を増加させる。ｃｐｃＡ遺伝子（配列番号：２５）及びｃｐｃＢ遺伝子（配列番号：２６）を野生型Ａｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｎｔｅｎｓｉｓのＮＩＥＳ－３９から得た。
Ａｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｎｔｅｎｓｉｓのＮＩＥＳ－３９は、Ｃ－フィコシアニンのαサブユニット及びβサブユニットをコードするｃｐｃＡ遺伝子及びｃｐｃＢ遺伝子の追加コピーの追加によって改変される。野生型Ａｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｎｔｅｎｓｉｓのＮＩＥＳ－３９は、これらの遺伝子の単一のセットをのみ有する。これらの内在性遺伝子のコピー数の増加は青色のＣ－フィコシアニンの合成を増加させる。ｃｐｃＡ遺伝子（配列番号：２５）及びｃｐｃＢ遺伝子（配列番号：２６）を野生型Ａｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｎｔｅｎｓｉｓのＮＩＥＳ－３９から得た。
【0116】
Ａ．ｐｌａｎｔｅｎｔｉｓの中へｃｐｃＢ及びｃｐｃＡを導入するために使用されるプラスミドは、実施例１中で記載される技法によって生成した。図７は、ｐＡｐｌ－ＮＳ１／ａａｄＡ－ｃｐｃＢＡプラスミド（配列番号：４）の概略図を示す。このプラスミドは、低コピーｐ１５Ａ複製起点、遺伝子座ＮＩＥＳ３９＿Ｑ０１２２０の中央にｐｉｌＡプロモーター（ｐｉｌＡオープンリーディングフレームの上流の１６８ｂｐの配列）、ａａｄＡ、及びｃｐｃＢの上流の２７８ｂｐからｃｐｃＡの３’末端までの範囲のゲノム配列（配列番号：２７）を含有する。挿入部位の１．５ｋｂのフランキング領域は、標的化された遺伝子座の中へ外来性遺伝子オペロンを組み込む左ホモロジーアーム及び右ホモロジーアーム（すなわちＮＩＥＳ３９＿Ｑ０１２２０）である。
【0117】
Ａｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｎｔｅｎｓｉｓのＮＩＥＳ－３９を、実施例３中で記載される手順を使用して、ｐＡｐｌ－ＮＳ１／ａａｄＡ－ｃｐｃＢＡプラスミドで形質転換した。
【0118】
形質転換に後続して、ｃｐｃＢ及びｃｐｃＡの第２のコピーを保有する株を、その親株（すなわちＡｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓのＮＩＥＳ－３９）と同じ条件下で１６０ｍＬのＳＯＴ培地中で増殖させた。１２ｍＬの各々の培養物から細胞を１日おきに採取して、Ｃ－フィコシアニン及びアロフィコシアニンの量を定量化した。収集された細胞を、５ｍＬの１００ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）中に再懸濁し、３，２００×ｇで室温で５分間遠心分離した。ペレットを、２．５ｍＬの１００ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）中で懸濁し；７００μｌの懸濁細胞をあらかじめ計ったＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデンまたはポリ二フッ化ビニリデン）膜上に移した。細胞を膜上で水（１５～２０ｍＬ×２）により広く洗浄し、乾燥バイオマスの重量を計算するためにオーブン中で一晩乾燥した。１００ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）中で懸濁した残りの細胞を、－８０℃で貯蔵し、同じ１００ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー中でバッファー１ｍＬあたり２．０ｍｇの乾燥細胞重量へ希釈した。細胞を３０℃で一晩温和な撹拌によって溶解し、１６，０００×ｇで４℃で３０分間遠心分離した。上清を新しいチューブの中へ移し、同じ条件下で再び遠心分離した。上清を１００ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）中で希釈し、光学的密度を５ｎｍの間隔で４５０ｎｍ～７５０ｎｍの間で測定してクロロフィル及びカロチノイドが除かれたことを確認した。Ｃ－フィコシアニン（Ｃｐｃ）及びアロフィコシアニン（Ａｐｃ）の含有量を、６２０ｎｍ及び６５０ｎｍでの清澄細胞溶解物の光学的密度を使用して計算した。Ｃ－フィコシアニン及びアロフィコシアニンの濃度は、等式ＯＤλ＝ＣＣｐｃ×Ｅλ，Ｃｐｃ＋ＣＡｐｃ×Ｅλ，Ａｐｃ（式中、λ＝６２０ｎｍまたは６５０ｎｍであり、ＣＣｐｃはＣ－フィコシアニンの濃度（ｍｇ／ｍＬ）であり、Ｅλ，ＣｐｃはＣ－フィコシアニンの消光係数であり、ＣＡｐｃはアロフィコシアニンの濃度（ｍｇ／ｍＬ）であり、Ｅλ，Ａｐｃはアロフィコシアニンの消光係数であり、ＯＤ（光学的密度）は吸収である）を使用して計算した。この等式の使用はＹｏｓｈｉｋａｗａ ａｎｄ Ｂｅｌａｙ（２００８）Ｊ．ＡＯＡＣ Ｉｎｔ．中で記載される。
【0119】
図８Ａ～Ｄは、ｃｐｃＡ及びｃｐｃＢの各々の合計２つのコピーを含むように形質転換されたＡｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓのＮＩＥＳ－３９（点線）ならびに野生型Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓのＮＩＥＳ－３９（実線）のフィコシアニン産生及び増殖を比較するグラフである。すべてのグラフについてのエラーバーは、３つの独立した実験からの標準偏差を示す。細胞を１日おきに（すなわち２、４及び６日目に）上記のように培養から採取した。すべての図８Ａ～Ｄについてのデータは同じ条件下で増殖させた細胞から収集した。
【0120】
図８Ａは、乾燥バイオマスのパーセントとして測定されたＣｐｃ及びＡｐｃの産生を示す。形質転換された株（点線）は、Ｃｐｃとしてのバイオマスを、野生型株（実線）よりもおよそ３～５％多く有していた。両方の株について、Ｃｐｃのパーセンテージは４日目にピークに達し、次いで減少した。Ａｐｃのレベルは野生型株よりも形質転換された株において約１％低かった。
【0121】
表１は、純粋フィコシアニン及び粗製フィコシアニンとして更に分析された乾燥バイオマスのパーセンテージとしてのフィコシアニンレベルを示す。
【表1】
【0122】
純粋フィコシアニンは等式：
を使用して計算した。
粗製フィコシアニンはすべてのフィコビリタンパク質色素を表わし、等式：
を使用して計算した。
【数1】
粗製フィコシアニンはすべてのフィコビリタンパク質色素を表わし、等式：
【数2】
【0123】
図８Ｂは、全可溶性タンパク質のパーセントとして測定されたＣｐｃ及びＡｐｃの産生を示す。野生型株（実線）及び形質転換された株（点線）の両方について、Ｃｐｃのパーセントは時間と共に増加した。形質転換された株は、Ｃｐｃとしての全可溶性タンパク質を、野生型株よりもおよそ５％多く有していた。両方の株についてＡｐｃのレベルはより低く、比較的安定的であり、形質転換された株は、Ａｐｃとしての全可溶性タンパク質を、野生型株よりも約１％少なく有していた。
【0124】
図８Ｃは、１リットルの細胞培養物あたりのフィコシアニンのグラムでの、全Ｃｐｃ及びＡｐｃの産生を示す。形質転換された株（点線）の全Ｃｐｃ産生はすべてのタイムポイントで野生型株（実線）よりも多く、差は時間と共に増加した。Ａｐｃレベルも時間と共に増加したが、野生型株は形質転換された株よりも高いレベルのＡｐｃを産生した。Ｃｐｃ及びＡｐｃの含有量は増殖相に依存して変動したが、すべてのタイムポイントで及びすべての条件下で、形質転換された株は野生型株よりも５０～１００％高い量のＣｐｃ及びより少ないＡｐｃを蓄積した。
【0125】
図８Ｄは、野生型株及び形質転換された株の増殖を比較する。形質転換された株（点線）は、野生型株（実線）と同じ率で０～４日目に増殖し、６日目にわずかに遅れた。
【0126】
実施例５
野生型Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓのＮＩＥＳ－３９及び上記の形質転換された株からの抽出物を分析するために、両方の株をＳＯＴ培地の５０Ｌのフォトバイオリアクター中で培養してタンパク質抽出のために十分なバイオマスを得た。フィルターカートリッジを使用して培養物を濃縮し、次いで細胞を３，０００×ｇで１０分間の遠心分離によって採取した。次いで濃縮された細胞を凍結乾燥した。２つの株の各々からの２グラムの乾燥バイオマスを２０ｍＬの水中で懸濁し、３，２００×ｇで５分間遠心分離して膨潤バイオマスを収集した。上清を除去し、ペレットを２０ｍＬの水中で懸濁した。同じ条件下での遠心分離後に、次いでペレットを、反復ピペッティングによって８０ｍＬの２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）中で懸濁し、室温で３０分間穏やかに撹拌した。超音波処理は、ＱｓｏｎｉｃａソニケーターＱ７００を使用して、最大振幅の５０％で室温で３０秒間２回遂行した。超音波処理に後続して、懸濁細胞を室温で一晩継続的に撹拌した。細胞溶解物から水可溶性抽出物を回収するために、サンプルを、１０，０００×ｇで１回、次いで１６，０００×ｇで２回４℃で３０分間遠心分離した。各々の細胞溶解物からの７２ミリリットルの上清をガラスビーカーの中へ移し、２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）中の４５ｍＬの１００％飽和硫酸アンモニウムをビーカーの中へ徐々に滴下し、そこで清澄にした細胞抽出物を４℃で穏やかに撹拌した。細胞溶解物及び硫酸アンモニウムの混合物を１時間撹拌し、沈殿させたタンパク質を１６，０００×ｇで４℃で３０分間の遠心分離によって回収した。ペレットを２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）により懸濁して全体積を５０ｍｌへ調整し、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒカセットを使用して２Ｌの２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）に対して４℃で透析した。外側のバッファーを、３回（３時間、一晩、次いで４時間）交換した。サンプルを１６，０００×ｇで４℃で３０分間遠心分離し、回収された上清を同じ条件下で再び遠心分離した。
野生型Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓのＮＩＥＳ－３９及び上記の形質転換された株からの抽出物を分析するために、両方の株をＳＯＴ培地の５０Ｌのフォトバイオリアクター中で培養してタンパク質抽出のために十分なバイオマスを得た。フィルターカートリッジを使用して培養物を濃縮し、次いで細胞を３，０００×ｇで１０分間の遠心分離によって採取した。次いで濃縮された細胞を凍結乾燥した。２つの株の各々からの２グラムの乾燥バイオマスを２０ｍＬの水中で懸濁し、３，２００×ｇで５分間遠心分離して膨潤バイオマスを収集した。上清を除去し、ペレットを２０ｍＬの水中で懸濁した。同じ条件下での遠心分離後に、次いでペレットを、反復ピペッティングによって８０ｍＬの２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）中で懸濁し、室温で３０分間穏やかに撹拌した。超音波処理は、ＱｓｏｎｉｃａソニケーターＱ７００を使用して、最大振幅の５０％で室温で３０秒間２回遂行した。超音波処理に後続して、懸濁細胞を室温で一晩継続的に撹拌した。細胞溶解物から水可溶性抽出物を回収するために、サンプルを、１０，０００×ｇで１回、次いで１６，０００×ｇで２回４℃で３０分間遠心分離した。各々の細胞溶解物からの７２ミリリットルの上清をガラスビーカーの中へ移し、２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）中の４５ｍＬの１００％飽和硫酸アンモニウムをビーカーの中へ徐々に滴下し、そこで清澄にした細胞抽出物を４℃で穏やかに撹拌した。細胞溶解物及び硫酸アンモニウムの混合物を１時間撹拌し、沈殿させたタンパク質を１６，０００×ｇで４℃で３０分間の遠心分離によって回収した。ペレットを２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）により懸濁して全体積を５０ｍｌへ調整し、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒカセットを使用して２Ｌの２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）に対して４℃で透析した。外側のバッファーを、３回（３時間、一晩、次いで４時間）交換した。サンプルを１６，０００×ｇで４℃で３０分間遠心分離し、回収された上清を同じ条件下で再び遠心分離した。
【0127】
図９Ａは、２つの株の最終的な遠心分離から回収された上清が異なる強度の青色を有することを示す写真である。野生型Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓのＮＩＥＳ－３９を含有するチューブ９００はより薄い青色を有し；ｐＡｐｌ－ＮＳ１／ａａｄＡ－ｃｐｃＢＡプラスミドにより形質転換された株を含有するチューブ９０２はより濃い青色を有する。Ｃ－フィコシアニンは、６２０ｎｍの付近で単一の可視光吸収最大値を備えた強い青色を有する。したがって、Ｃ－フィコシアニン過剰産生する株の上清からより濃い青色が予想された。
【0128】
図９Ｂは、形質転換された株（実線）と野生型株（点線）との間の吸収差を示すグラフである。両方の株は６２０ｎｍの付近で吸収ピークを示した。形質転換された株についてのピーク吸収はおよそ０．６０ｃｍ－１であり、野生型株についてのピークはおよそ０．３５ｃｍ－１であった。これは、図９Ａ中で示される定性的な色の差を定量的に確認するものである。Ｃ－フィコシアニン抽出物の質は、６２０ｎｍでの光学的密度（ＯＤ６２０）対２８０ｎｍでの光学的密度（ＯＤ２８０）の比によって決定することができる。より高い比はＣ－フィコシアニンのより高い収率及び純度を指摘し、それは、低価格の使用（食品用色素等）ではなく高価格の使用（化粧品等）のために適切であり得る。図９Ｂ中のグラフは、形質転換された株についてのＯＤ６２０／ＯＤ２８０比が２．５であり、比較として野生型株については１．８であることを示す。これは、形質転換された株の回収された上清からのＣ－フィコシアニンが４０％高い濃度であることを指摘する。
【0129】
例示的な実施形態
実施形態１は、少なくとも１つの安定的な標的化された突然変異を含む、スピルリナである。
実施形態１は、少なくとも１つの安定的な標的化された突然変異を含む、スピルリナである。
【0130】
実施形態２は、前記スピルリナがＡｔｈｒｏｓｐｉｒｉａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓまたはＡｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａである、実施形態１、４～１１、または２５のいずれか１つに記載のスピルリナである。
【0131】
実施形態３は、前記スピルリナがＡｔｈｒｏｓｐｉｒｉａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓのＮＩＥＳ－３９またはＡｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ． ＰＣＣ ８００５である、実施形態１、２、４～１１、または２５のいずれか１つに記載のスピルリナである。
【0132】
実施形態４は、前記安定的な標的化された突然変異が、少なくとも１０世代の間遺伝的に継承される、実施形態１～３、５～１１、または２５のいずれか１つに記載のスピルリナである。
【0133】
実施形態５は、前記安定的な標的化された突然変異が、前記スピルリナの染色体の中へ組み込まれる、実施形態１～４、６～１１、または２５のいずれか１つに記載のスピルリナである。
【0134】
実施形態６は、前記標的化された突然変異が、遺伝子の少なくとも一部分の欠失または破壊を含む、実施形態１～５、７～１１、または２５のいずれか１つに記載のスピルリナである。
【0135】
実施形態７は、前記標的化された突然変異が内在性遺伝子の追加コピーの追加または外来性遺伝子の追加を含む、実施形態１～６または８～１１のいずれか１つに記載のスピルリナである。
【0136】
実施形態８は、前記標的化された突然変異が遺伝子調節エレメントの追加を含む、実施形態１～７、１０、または１１のいずれか１つに記載のスピルリナである。
【0137】
実施形態９は、前記遺伝子調節エレメントが、プロモーター、調節タンパク質結合部位、ＲＮＡ結合部位、リボソーム結合部位、またはＲＮＡ安定性エレメントである、実施形態８に記載のスピルリナである。
【0138】
実施形態１０は、前記標的化された突然変異が外来性または内因性のタンパク質ドメインの追加を含む、実施形態１～９または１１のいずれか１つに記載のスピルリナである。
【0139】
実施形態１１は、前記外来性タンパク質ドメインが、リン酸化部位、安定性ドメイン、タンパク質標的化ドメイン、またはタンパク質－タンパク質相互作用ドメインである、実施形態１０に記載のスピルリナである。
【0140】
実施形態１２は、スピルリナにおいて標的化された突然変異を生成する方法であって、浸透圧安定剤と前記スピルリナを接触させることと；ホモロジーアームを有するベクターと前記スピルリナを接触させることと；前記スピルリナにおいて人工的コンピテンスを誘導することとを含む、前記方法。
【0141】
実施形態１３は、前記スピルリナがＳｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓである、実施形態１２または１５～２４のいずれか１つに記載の方法である。
【0142】
実施形態１４は、前記スピルリナがＡｔｈｒｏｓｐｉｒｉａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓのＮＩＥＳ－３９またはＡｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ． ＰＣＣ ８００５である、実施形態１２または１５～２４のいずれか１つに記載の方法である。
【0143】
実施形態１５は、前記浸透圧安定剤が、ポリエチレングリコール、エチレングリコール、グリセロール、グルコース、またはショ糖のうちの少なくとも１つである、実施形態１２～２４のいずれか１つに記載の方法である。
【0144】
実施形態１６は、前記ベクターが、ＤＮＡベクター、直線状ベクター、環状ベクター、一本鎖ポリヌクレオチド、または二本鎖ポリヌクレオチドである、実施形態１２～２４のいずれか１つに記載の方法である。
【0145】
実施形態１７は、前記ベクターが、配列番号：１、配列番号：２、または配列番号：４を有するベクターを含む、実施形態１２～２４のいずれか１つに記載の方法である。
【0146】
実施形態１８は、前記ホモロジーアームのうちの少なくとも１つが少なくとも５００ｂｐである、実施形態１２～２４のいずれか１つに記載の方法である。
【0147】
実施形態１９は、前記ホモロジーアームのうちの少なくとも１つが少なくとも１０００ｂｐである、実施形態１２～２４のいずれか１つに記載の方法である。
【0148】
実施形態２０は、前記ホモロジーアームのうちの少なくとも１つが少なくとも２０００ｂｐである、実施形態１２～２４のいずれか１つに記載の方法である。
【0149】
実施形態２１は、前記人工的コンピテンスが、二価陽イオンを含有する溶液中でのインキュベーションによって、エレクトロポレーションによって、または超音波によって誘導される、実施形態１２～２０及び２２～２４のいずれか１つに記載の方法である。
【0150】
実施形態２２は、ｐＨバランサーと前記スピルリナを接触させることを更に含む、実施形態１２～２４のいずれか１つに記載の方法である。
【0151】
実施形態２３は、前記ｐＨバランサーと前記スピルリナを接触させることが、前記ベクターと前記スピルリナを接触させることの前である、実施形態２２または２４のいずれか１つに記載の方法である。
【0152】
実施形態２４は、前記スピルリナ及び前記ｐＨバランサーを含有する培地のｐＨが、約７～約８である、実施形態２２または２３のいずれか１つに記載の方法である。
【0153】
実施形態２５は、少なくとも１つのタンパク質の遺伝子座の少なくとも一部分と相同な配列及び改変を含む少なくとも１つのＤＮＡコンストラクトによるスピルリナの形質転換ならびに前記遺伝子座での前記ＤＮＡコンストラクトの組み込みによって前記タンパク質の遺伝子座で前記改変を導入した結果として、前記少なくとも１つのタンパク質を欠くスピルリナであって、他の点ではその生来の様式で機能することが可能な前記スピルリナである。
【0154】
実施形態２６は、標的化された遺伝子座の少なくとも一部分と相同な配列及びフィコシアニンをコードする外来性遺伝子を含む少なくとも１つのＤＮＡコンストラクトによるスピルリナの形質転換ならびに前記遺伝子座でのＤＮＡコンストラクトの組み込みによって前記標的化された遺伝子座で前記外来性遺伝子を導入した結果として、前記フィコシアニンをコードする外来性遺伝子を含むスピルリナであって、野生型スピルリナと比較して増加した量のフィコシアニンを産生し、複数の世代を通して形質転換を維持する前記スピルリナである。
【図1】
【図2】
【図3A-3C】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図9A】
【図9B】
【配列表】