特許 7378152 ＳＳＥＡ４に結合するキメラ抗原受容体及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-11-02

(45)【発行日】2023-11-13

(54)【発明の名称】ＳＳＥＡ４に結合するキメラ抗原受容体及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20231106BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20231106BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20231106BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20231106BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20231106BHJP

   C07K 16/32 20060101ALI20231106BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20231106BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20231106BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20231106BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20231106BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z

C12N15/13 ZNA

C12N15/12

C12N15/86 Z

C07K14/705

C07K16/32

C07K19/00

C12N5/10

A61K35/17

A61P35/00

【請求項の数】 19

(21)【出願番号】P 2020520005

(86)(22)【出願日】2019-03-19

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-07-26

(86)【国際出願番号】 US2019022861

(87)【国際公開番号】W WO2019183025

(87)【国際公開日】2019-09-26

【審査請求日】2022-02-14

(31)【優先権主張番号】15/926,382

(32)【優先日】2018-03-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】520372537

【氏名又は名称】チョウ ファーマ ユーエスエー インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】チェン、ラン ボ

【審査官】飯濱 翔太郎

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１７－５２５３６１（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１７／１７２９９０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１８／０２３１２１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１８／０３９２７４（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００

Ｃ０７Ｋ １４／７０５

Ｃ０７Ｋ １６／００

Ｃ０７Ｋ １９／００

Ｃ１２Ｎ ５／１０

Ａ６１Ｋ ３５／１７

Ａ６１Ｐ ３５／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号３のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。

【請求項2】

前記ヌクレオチド配列は、配列番号１である、請求項１に記載の単離された核酸。

【請求項3】

配列番号２のポリペプチドを発現する、請求項２に記載の単離された核酸を含む組み換え細胞。

【請求項4】

前記細胞はＴ細胞である、請求項３に記載の組み換え細胞。

【請求項5】

ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項１に記載の単離された核酸を含むウイルスベクター。

【請求項6】

前記ヌクレオチド配列は配列番号１である、請求項５に記載のウイルスベクター。

【請求項7】

ステージ特異的胎児性抗原４に特異的に結合する、配列番号３の配列を含む単離されたポリペプチド。

【請求項8】

ステージ特異的胎児性抗原４に特異的に結合する一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）と、ＣＤ３ζ又はＦｃεＲＩγ由来の第１のエンドドメインとを含み、前記ｓｃＦｖが配列番号３の配列を有する、キメラ抗原受容体。

【請求項9】

ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ４、ＯＸ４０又はＩＣＯＳ由来の第２のエンドドメインを更に含み、前記ｓｃＦｖは、前記第２のエンドドメインに融合され、前記第２のエンドドメインは、前記第１のエンドドメインに融合される、請求項８に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項10】

前記キメラ抗原受容体は、配列番号４の配列を有する、請求項９に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項11】

被験体における腫瘍を治療するためのＴ細胞を含む組成物であって、
前記Ｔ細胞が腫瘍を有する被験体から取得されたＴ細胞であり、
前記Ｔ細胞がステージ特異的胎児性抗原４（ＳＳＥＡ４）を特異的に認識するｓｃＦｖを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含み、
前記Ｔ細胞が前記ＣＡＲを発現し、
前記ｓｃＦｖは、配列番号３のアミノ酸配列を有し、前記腫瘍内の細胞は、ＳＳＥＡ４を発現し、
前記組成物が前記腫瘍を有する被験体へと注入され、それにより、抗腫瘍Ｔ細胞応答が惹起される、組成物。

【請求項12】

前記ＣＡＲは、配列番号４のアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載の組成物。

【請求項13】

前記腫瘍は、乳房腫瘍、結腸腫瘍、胃腸腫瘍、腎臓腫瘍、肺腫瘍、肝臓腫瘍、卵巣腫瘍、膵臓腫瘍、直腸腫瘍、胃腫瘍、精巣腫瘍、胸腺腫瘍、子宮頸部腫瘍、前立腺腫瘍、膀胱腫瘍、皮膚腫瘍、鼻咽頭腫瘍、食道腫瘍、口腔腫瘍、頭頸部腫瘍、骨腫瘍、軟骨腫瘍、筋肉腫瘍、リンパ節腫瘍、骨髄腫瘍又は脳腫瘍である、請求項１２に記載の組成物。

【請求項14】

前記Ｔ細胞は、配列番号５のポリペプチドを更に発現し、それにより、前記Ｔ細胞は、抗上皮成長因子受容体抗体によりｉｎ ｖｉｖｏで消失され得る、請求項１１に記載の組成物。

【請求項15】

前記ＣＡＲは、配列番号４のアミノ酸配列を有する、請求項１４に記載の組成物。

【請求項16】

前記核酸は、配列番号１の配列を有する、請求項１５に記載の組成物。

【請求項17】

前記腫瘍は、乳房腫瘍、結腸腫瘍、胃腸腫瘍、腎臓腫瘍、肺腫瘍、肝臓腫瘍、卵巣腫瘍、膵臓腫瘍、直腸腫瘍、胃腫瘍、精巣腫瘍、胸腺腫瘍、子宮頸部腫瘍、前立腺腫瘍、膀胱腫瘍、皮膚腫瘍、鼻咽頭腫瘍、食道腫瘍、口腔腫瘍、頭頸部腫瘍、骨腫瘍、軟骨腫瘍、筋肉腫瘍、リンパ節腫瘍、骨髄腫瘍又は脳腫瘍である、請求項１４に記載の組成物。

【請求項18】

前記腫瘍は、乳房腫瘍、結腸腫瘍、胃腸腫瘍、腎臓腫瘍、肺腫瘍、肝臓腫瘍、卵巣腫瘍、膵臓腫瘍、直腸腫瘍、胃腫瘍、精巣腫瘍、胸腺腫瘍、子宮頸部腫瘍、前立腺腫瘍、膀胱腫瘍、皮膚腫瘍、鼻咽頭腫瘍、食道腫瘍、口腔腫瘍、頭頸部腫瘍、骨腫瘍、軟骨腫瘍、筋肉腫瘍、リンパ節腫瘍、骨髄腫瘍又は脳腫瘍である、請求項１５に記載の組成物。

【請求項19】

前記腫瘍は、乳房腫瘍、結腸腫瘍、胃腸腫瘍、腎臓腫瘍、肺腫瘍、肝臓腫瘍、卵巣腫瘍、膵臓腫瘍、直腸腫瘍、胃腫瘍、精巣腫瘍、胸腺腫瘍、子宮頸部腫瘍、前立腺腫瘍、膀胱腫瘍、皮膚腫瘍、鼻咽頭腫瘍、食道腫瘍、口腔腫瘍、頭頸部腫瘍、骨腫瘍、軟骨腫瘍、筋肉腫瘍、リンパ節腫瘍、骨髄腫瘍又は脳腫瘍である、請求項１６に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

標的を絞った癌免疫療法は、化学療法と比較して、短期的にも長期的にもより良い効力が期待されるだけでなく、副作用がより少ないことも期待される。

【0002】

例えば、腫瘍特異的糖質抗原、例えばＧｌｏｂｏ Ｈ、ステージ特異的胎児性抗原３（「ＳＳＥＡ３」）及びステージ特異的胎児性抗原４（「ＳＳＥＡ４」）を標的とする抗癌ワクチンは患者の自己免疫系を刺激して、これらの抗原に対する抗体を発生させ、抗体依存性細胞障害作用、抗体依存性食作用、補体依存性細胞溶解並びに直接細胞静止作用及び／又は細胞傷害性作用を引き起こすように開発された。

【0003】

そのようなアプローチは、しばしば腫瘍における阻害環境の結果として、時間の経過とともに有効性を失う。阻害環境は、抗体、ＮＫ細胞、マクロファージ及び補体のいずれか又は全てが腫瘍に侵入するのを阻止する。

【0004】

最近、上述の不利点を回避するために、キメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）が開発された。ＣＡＲは、（ｉ）腫瘍抗原に結合する細胞外ドメインと、（ｉｉ）Ｔ細胞に一次シグナル及び共刺激シグナルの両方を与える１つ以上の細胞内ドメインとを含む。選ばれた細胞外ドメインを有するＣＡＲを発現するように、Ｔ細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏで操作され得る。

【0005】

ＣＡＲのアプローチは有効であることが実証されているが、重篤な副作用を有しないわけではない。例えば、ＣＡＲを発現する多数のＴ細胞の活性化はサイトカイン放出症候群を引き起こす。高熱、低血圧症及び低酸素症を特徴とするこの症候群は多臓器不全どころか、死さえ招くこともある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

現在使用されているものよりも安全かつ有効なＣＡＲベースの腫瘍療法を開発することが求められている。

【課題を解決するための手段】

【0007】

上記の要求を満たすために、配列番号３のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸が開示される。配列番号３のポリペプチドは、ステージ特異的胎児性抗原４（ＳＳＥＡ４）に特異的に結合する。

【0008】

上記の単離された核酸を含む、配列番号２のポリペプチドを発現する組み換え細胞も開示される。

【0009】

さらに、上記単離された核酸を含むウイルスベクターは本発明の範囲内である。ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルスベクターである。

【0010】

さらに、単離されたポリペプチドは配列番号３の配列を含み、さらにまた、その単離されたポリペプチドはＳＳＥＡ４に特異的に結合する。

【0011】

同様に、配列番号３の配列を有し、ＳＳＥＡ４に特異的に結合する一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）と、ＣＤ３ζ又はＦｃεＲＩγ由来の第１のエンドドメインとを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）も提供される。

【0012】

最後に、被験体における腫瘍を治療する方法であって、（ｉ）腫瘍を有する被験体からＴ細胞を取得する工程と、（ｉｉ）ＳＳＥＡ－４を特異的に認識するｓｃＦｖを含むＣＡＲをコードする核酸を含むベクターでＴ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで形質導入し、それにより、形質導入されたＴ細胞がＣＡＲを発現する工程と、（ｉｉｉ）形質導入されたＴ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させる工程と、（ｉｖ）腫瘍を有する被験体へと増殖された形質導入されたＴ細胞を注入し、それにより、抗腫瘍Ｔ細胞応答が惹起される工程とを含む、方法が開示される。ｓｃＦｖは配列番号３のアミノ酸配列を有し、腫瘍内の細胞はＳＳＥＡ４を発現する。

【0013】

１つ以上の本発明の実施形態の詳細が以下の説明及び図面に示されている。本発明の他の特徴、課題及び利点は、本明細書及び特許請求の範囲から明らかであろう。

【0014】

以下の説明は、添付の図面について言及する。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】種々のエフェクター対標的の比率での、指摘されるエフェクターＴ細胞による標的細胞の溶解のパーセントの棒グラフである。

【図2A】種々のエフェクター対標的の比率での、指摘されるエフェクターＴ細胞を標的ＭＣＦ－７細胞と一緒に共培養した後のそのエフェクターＴ細胞により放出されたＩＬ－２の量を示す棒グラフである。

【図2B】種々のエフェクター対標的の比率での、指摘されるエフェクターＴ細胞を標的ＭＣＦ－７細胞と一緒に共培養した後のそのエフェクターＴ細胞により放出されたＩＦＮ－γの量を示す棒グラフである。

【発明を実施するための形態】

【0016】

上述のように、ＣＡＲベースの腫瘍療法を開発するという要求を満たすために、配列番号３のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸が提供される。配列番号３のポリペプチドは、ＳＳＥＡ４に特異的に結合するｓｃＦｖである。具体的な例では、単離された核酸は、配列番号１のヌクレオチド配列を有する。

【0017】

配列番号１のヌクレオチド配列を有する単離された核酸を含む組み換え細胞も本発明の範囲内である。組み換え細胞は、配列番号２のポリペプチド、すなわち配列番号３のｓｃＦｖを含むＣＡＲコンストラクトを発現する。組み換え細胞は、Ｔ細胞、例えばＣＤ４^＋Ｔ細胞又はＣＤ８^＋Ｔ細胞であり得る。使用することができる他の細胞には、ＮＫ、ｉＮＫＴ、単球、マクロファージ、ミクログリア、樹状細胞及び好中球が含まれる。

【0018】

配列番号３のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸、例えばＣＡＲコンストラクトがウイルスベクター内に含まれ得る。

【0019】

例示的なウイルスベクターには、レンチウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターが含まれる。レンチウイルス又はガンマレトロウイルスをベースとするウイルスベクターは、Dai et al. 2016, J. Natl. Cancer Inst. 108:1-14（「Dai et al.」）、Jin et al. 2016, EMBO Mol. Med. 8:702-711、Liechtenstein et al. 2013, Cancers 5:815-837、及びSchonfeld et al. 2015, Mol. Therapy 23:330-338に示されている。そのようなウイルスベクターは、ＣＡＲの安定的発現をもたらすためにＴ細胞のゲノムＤＮＡ中にＣＡＲをコードする核酸を組み込むために使用される。

【0020】

具体的な例では、ウイルスベクターは、配列番号１のヌクレオチド配列を含むレンチウイルスベクターである。

【0021】

代替的には、ＣＡＲコンストラクトは、ＣＡＲをコードする核酸、例えば配列番号１のトランスポゾンに媒介されるＴ細胞へのゲノム組み込みを促す配列を含むベクター中に含まれ得る。これらの発現ベクターの例は、いわゆる「ＰｉｇｇｙＢａｃ」発現ベクター及び「Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ」発現ベクターである。Nakazawa et al. 2011, Mol. Ther. 19:2133-2143及びMaiti et al. 2013, J. Immunotherapy 36:112-123を参照のこと。

【0022】

更に別の代替態様では、ＣＡＲコンストラクトを含むベクターはまた、クラスターを形成し規則正しい間隔を持つ短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）に媒介されるＣＡＲコンストラクトのＴ細胞のゲノムへの挿入を可能にするＣＡＲコンストラクトに隣接するゲノム核酸配列を含む。ＣＡＲをゲノムへと挿入するためのＣＲＩＳＰＲコンストラクトの例は、例えばMiura et al. 2018, Nature Protocols 13:195-215及びHe et al. 2016, Nucl. Acids Res. 44:1-14に見出すことができる。

【0023】

さらに、配列番号３の配列を含む単離されたポリペプチドが開示される。単離されたポリペプチド、つまりｓｃＦｖはＳＳＥＡ－４に特異的に結合する。

【0024】

さらに、ステージ特異的胎児性抗原４に特異的に結合するｓｃＦｖを含むＣＡＲが提供される。ｓｃＦｖは配列番号３の配列を有し得る。ＣＡＲはＣＤ３ζ又はＦｃεＲＩγ由来の第１のエンドドメインを更に含む。例示的なＣＡＲでは、第１のエンドドメインはＣＤ３ζ由来である。

【0025】

ＣＡＲはまた、第２のエンドドメインを含み得る。第２のエンドドメインは、限定されるものではないが、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ４、ＯＸ４０及びＩＣＯＳ由来のエンドドメインであり得る。ＣＡＲに第２のエンドドメインが存在する場合に、ｓｃＦｖは第２のエンドドメインに融合され、第２のエンドドメインは第１のエンドドメインに融合される。ＣＡＲの特定の例は、ＣＤ１３７由来の第２のエンドドメインを有する。別の具体的な例では、ＣＡＲは、配列番号４のアミノ酸配列を有する。

【0026】

上述のように、とりわけ、腫瘍を有する被験体からＴ細胞を取得する工程と、ＳＳＥＡ４を特異的に認識するｓｃＦｖを含むＣＡＲをコードする核酸を含むベクターでＴ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで形質導入する工程とを含む腫瘍治療方法が提供される。

【0027】

Ｔ細胞を取得する手順は当該技術分野において知られている。例えば、Kaiser et al. 2015, Cancer Gene Therapy 22:72-78（「Kaiser et al.」）を参照のこと。Ｔ細胞は、ＣＤ４^＋細胞、ＣＤ８^＋細胞又はＮＫ細胞であり得る。例示的な方法では、ＣＤ８^＋細胞は被験体から取得される。

【0028】

Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで上記のＣＡＲベクターにより形質導入される。Ｔ細胞の形質導入は、使用されるＣＡＲベクターの種類に応じて、エレクトロポレーション、リポフェクション、レンチウイルス感染、ガンマレトロウイルス感染又はアデノ随伴ウイルス感染により行うことができる。

【0029】

より具体的には、ＣＡＲベクターがＰｉｇｇｙＢａｃ、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ又はＣＲＩＳＰＲベースの発現ベクターである場合に、その発現ベクターは、エレクトロポレーション又はリポフェクションを介してＴ細胞へと形質導入され得る。ＣＲＩＳＰＲベースの発現ベクターは、Ｔ細胞における目的のゲノム挿入部位のプロトスペーサー隣接モチーフに隣接する配列に相補的なガイドＲＮＡを発現するベクターと一緒に同時トランスフェクションされる。

【0030】

ＣＡＲベクターがウイルスベースである場合には、ウイルス粒子が調製され、Ｔ細胞の感染に使用される。

【0031】

腫瘍治療方法はまた、形質導入されたＴ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させる工程と、腫瘍を有する被験体へと増殖された形質導入されたＴ細胞を注入する工程とを含む。

【0032】

形質導入されたＴ細胞は、当該技術分野において知られる方法を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖される。Kaiser et al.を参照のこと。次いで、増殖されたＴ細胞は、腫瘍を有する被験体へと１バッチで又は２バッチ以上で注入される。

【0033】

腫瘍治療方法の具体的な代替形態では、この方法は、今しがた言及した注入工程の前に行われるプレコンディショニング工程を更に含む。プレコンディショニング工程は、リンパ枯渇を誘発する薬物で被験体を処理することにより行われる。これらの薬物の例には、シクロホスファミド及びフルダラビンが含まれる。追加の薬物の例は、Dai et al.及びHan et al. 2013, J. Hematol. Oncol. 6:47-53に見出すことができる。

【0034】

腫瘍治療方法では、形質導入されたＴ細胞は、ＣＡＲに加えて、配列番号５のポリペプチド、すなわち上皮成長因子受容体（epidermal growth factor receptor t）ドメインＩＩＩ－ＩＶ（ＥＧＦＲｔ）を更に発現し得る。こうして、注入された増殖されたＴ細胞は、ＥＧＦＲｔに結合する抗上皮成長因子受容体抗体によりｉｎ ｖｉｖｏで消失され得る。例えば、注入されたＴ細胞をｉｎ ｖｉｖｏで死滅させるために、被験体にセツキシマブが投与される。ＥＧＦＲｔと一緒にＣＡＲをコードする例示的な核酸は、配列番号１の核酸配列を有する。

【0035】

上記の方法は、ＳＳＥＡ４を発現する細胞を含む腫瘍を治療するために使用することができる。治療することができる腫瘍には、限定されるものではないが、乳房腫瘍、結腸腫瘍、胃腸腫瘍、腎臓腫瘍、肺腫瘍、肝臓腫瘍、卵巣腫瘍、膵臓腫瘍、直腸腫瘍、胃腫瘍、精巣腫瘍、胸腺腫瘍、子宮頸部腫瘍、前立腺腫瘍、膀胱腫瘍、皮膚腫瘍、鼻咽頭腫瘍、食道腫瘍、口腔腫瘍、頭頸部腫瘍、骨腫瘍、軟骨腫瘍、筋肉腫瘍、リンパ節腫瘍、骨髄腫瘍及び脳腫瘍が含まれる。

【0036】

更に詳述することなしに、当業者であれば、本明細書の開示に基づき、本開示を最大限に利用することができると考えられる。したがって、以下の具体的な実施例は、単に説明的なものであって、決して本開示の残りの部分を限定するものではないと解釈されるべきである。本明細書で引用される全ての出版物及び特許文献は、引用することによりその全体が本明細書の一部をなす。

【実施例】

【0037】

実施例１：抗ＳＳＥＡ４ ＣＡＲコンストラクトを含むレンチウイルスの産生
抗ＳＳＥＡ４ ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターの構築
レンチウイルスコンストラクトを、大腸菌において標準的な組み換えＤＮＡ技術を使用して調製し、ＤＮＡシーケンシングにより検証した。より具体的には、配列番号３の配列を有するｓｃＦｖをコードする核酸を、レンチウイルスプラスミドベクター中にＥＦ－１αプロモーター及びシグナルペプチドをコードする配列の下流でＣＤ８ヒンジをコードする配列の上流にクローニングして、ＣＡＲカセットを作製した。そのＣＡＲカセットはまた、ＣＤ８膜貫通ドメインと、ＣＤ１３７細胞内シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζエンドドメインと、トセア・アシグナ（Thosea asigna）の自己開裂性ペプチドＴ２Ａと、ＥＧＦＲｔドメインＩＩＩ－ＩＶとをコードする。このＣＡＲカセットは、配列番号１の核酸配列を有する。レンチウイルスプラスミドベクターは、レンチウイルス粒子の産生を促す追加の配列を含む。

【0038】

レンチウイルスのパッケージング及び産生
レンチウイルスのパッケージング及び産生は、確立された技術を使用して実施した。パッケージング用細胞、すなわち２９３Ｔ細胞を、１０ｃｍ培養皿中で１０ｍＬの完全培養培地において５×１０^６個の細胞で播種した。それらの細胞を５％のＣＯ_２中、３７℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ中でトランスフェクション試薬と、上記レンチウイルスベクターと、パッケージングベクターと、エンベロープベクターとを混ぜ合わせることにより、トランスフェクション複合体を調製した。そのトランスフェクション複合体を、パッケージング用細胞を含む培養皿に加え、細胞を５％のＣＯ_２中、３７℃で６時間～８時間インキュベートした。培地を取り替え、細胞を２４時間インキュベートした。培養培地を収集し、新鮮な培地と置き換えた。この２４時間のインキュベート及び培地収集を２回繰り返した。全ての収集された培地を一緒にして、０．４５μｍフィルターに通した。濾液を５００００×ｇで２時間遠心分離することで、レンチウイルス粒子をペレット化した。レンチウイルスストックをＰＢＳ中で懸濁し、－８０℃で貯蔵した。

【0039】

レンチウイルス力価測定
感染された細胞のゲノム中に組み込まれたレンチウイルスＤＮＡの量を測定することにより、レンチウイルス力価を決定した。２９３Ｔ細胞を２４ウェルプレートにおいて１ウェル当たり５００００個の細胞の密度で播種し、一晩インキュベートした。高濃度のレンチウイルスストックをポリブレンと一緒に各ウェルに加えて６μｇ／ｍＬの濃度にした。そのプレートを軽く遠心分離した後に、５％のＣＯ_２を有する３７℃のインキュベーター中に７２時間置いた。レンチウイルスで形質導入された細胞からゲノムＤＮＡを市販のキットで抽出した。

【0040】

リアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ－ＱＰＣＲ）を使用して、抽出されたゲノムＤＮＡ中に存在するレンチウイルスＤＮＡのコピー数を決定した。結果の正規化のために、アルブミン遺伝子も測定した。ＲＴ－ＱＰＣＲのために使用されたプライマー及びプローブを以下の表１に示す。

【0041】

【表1】

【0042】

上記のＲＴ－ＱＰＣＲプライマーを使用してアルブミン遺伝子配列又はＬＴＲ遺伝子配列を有する既知量のプラスミドＤＮＡを増幅することにより、標準曲線を作成した。ゲノムＤＮＡ中のレンチウイルスＤＮＡのコピー数は、ＬＴＲ配列の量をアルブミン配列の量で割った比率として計算された。

【0043】

次いで、レンチウイルス力価を、以下の式：
レンチウイルス力価＝播種された細胞数×１細胞当たりのレンチウイルスのコピー数／加えられたレンチウイルスストックの容量
を使用して計算した。

【0044】

例示的なレンチウイルス調製物は、１ｍＬ当たり２．６×１０^８個の形質導入単位を含んでいた。

【0045】

実施例２：抗ＳＳＥＡ４ ＣＡＲ Ｔ細胞の調製
確立された技術を使用して抗ＳＳＥＡ４ ＣＡＲを発現するＴ細胞を作製した。まず、全血から標準的な血液分離管を用いて末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離し、それらの細胞を完全培養培地中に再懸濁した。ＰＢＭＣから標準的な磁気ビーズ分離技術を使用してＴ細胞を分離した。

【0046】

分離されたＴ細胞を組織培養プレートへと分注し、２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ２、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ７、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ１５及び５ｎｇ／ｍＬのＩＬ２１を補充した増殖培地を、細胞密度が１ｍＬ当たり０．５×１０^６個～１×１０^６個の細胞になるまで加えた。そのプレートを５％のＣＯ_２中、３７℃で３日間インキュベートした。実施例１で上記のように産生されたレンチウイルス調製物をＴ細胞に加え、ポリブレンも加えることで、６μｇ／ｍｌの最終濃度にした。プレートを室温で８００×ｇで１時間遠心分離した後に、５％のＣＯ_２中、３７℃で５日間インキュベートした。５日間インキュベートしている間に、Ｔ細胞を１ｍＬ当たり０．５×１０^６個の細胞の細胞密度に維持した。抗ＳＳＥＡ４ ＣＡＲを発現するＴ細胞のパーセンテージを、ＥＧＦＲのドメインＩＩＩ－ＩＶに対する抗体を使用して蛍光活性化セルソーティングにより決定した。

【0047】

例示的な調製物では、Ｔ細胞の４５．７％が抗ＳＳＥＡ４ ＣＡＲを発現した。

【0048】

実施例３：抗ＳＳＥＡ４ ＣＡＲ Ｔエフェクター細胞によるＭＣＦ－７標的細胞の溶解
抗ＳＳＥＡ４ ＣＡＲ Ｔ細胞が標的細胞を溶解する能力を共培養アッセイにより評価した。ＳＳＥＡ－４を発現するＭＣＦ－７乳癌細胞を標的細胞として使用した。１ｍＬ当たり５×１０^５個の細胞の１００μＬのＭＣＦ－７標的細胞を９６ウェルプレートの各ウェルへと移し、５％のＣＯ_２中、３７℃で一晩培養した。エフェクター細胞、すなわち抗ＳＳＥＡ４ ＣＡＲ Ｔ細胞、形質導入されていないＴ細胞及びネガティブコントロールレンチウイルスで形質導入されたＴ細胞をそれぞれ無血清ＲＰＭＩ１６４０培地中で懸濁した。９６ウェルプレートから培養培地を取り出し、標的細胞をＰＢＳで１回洗浄した。Ｔ細胞を１：１、２：１、５：１及び１０：１のエフェクター対標的（Ｅ／Ｔ）の比率で別個のウェルへと加えた。各ウェル中の培地の最終容量を、ＲＰＭＩ１６４０を使用して１００μＬ／ウェルに調節した。共培養物を５％のＣＯ_２中、３７℃で６時間インキュベートした。

【0049】

市販のキット（ＣｙｔｏＴｏｘ ９６（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ；Promega社、米国、ウィスコンシン州）を使用して、溶解時にこれらの細胞から放出された乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）のレベルを決定することにより、標的ＭＣＦ－７細胞の溶解を測定した。共培養後に、９６ウェルプレートを室温で１２００×ｇで５分間遠心分離し、各ウェルから５０μＬの上清を新たな９６ウェルプレートに移した。各上清中のＬＤＨレベルを製造業者の指示に従って決定した。標的細胞のみを含む或る特定のウェルを遠心分離工程の前に溶解バッファーで処理した。これらのウェルからの上清を使用して、ＭＣＦ－７細胞により放出されたＬＤＨの最大量を決定した。それらの結果は、図１に示されている。

【0050】

データは、抗ＳＳＥＡ４ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、形質導入されていないＴ細胞及び空のレンチウイルスで形質導入されたＴ細胞と比較して、有意により多くの標的ＭＣＦ－７細胞を、全てのＥ／Ｔ比率で溶解したことを示している。

【0051】

実施例４：抗ＳＳＥＡ４ ＣＡＲ－Ｔ細胞によるサイトカイン放出
上記のＣＡＲ－Ｔ細胞を、９６ウェルプレートにおいて種々のＥ／Ｔ比率で、１０％のＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で５％のＣＯ_２、３７℃で標的細胞系統ＭＣＦ７と一緒に２４時間共培養した。培養培地を採取して、ＣＡＲ－Ｔ細胞によるサイトカイン放出を測定した。簡潔には、９６ウェルプレートを室温で１２００×ｇで５分間遠心分離し、その後に各ウェルからの５０μＬの上清を新たな９６ウェルプレートへと移した。市販のＥＬＩＳＡキットを使用して製造業者の使用説明書に従って、サイトカインＩＬ－２及びＩＦＮ－γの濃度を決定した。それらの結果は、図２Ａ及び図２Ｂに示されている。データは、ＳＳＥＡ４特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞が、標的腫瘍細胞に結合した後にＩＬ－２及びＩＦＮ－γの両方を頑健に分泌し、この分泌レベルが、形質導入されていないＴ細胞又はＣＡＲコンストラクトを有しないレンチウイルスで形質導入されたＴ細胞のどちらよりも有意に大きかったことを示している。

【0052】

その他の実施形態
本明細書に開示されるあらゆる特徴は、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書に開示されるそれぞれの特徴は、同じ目的、同等の目的又は同様の目的を担う代替的な特徴により置き換えることができる。特段の定めがない限り、開示されるそれぞれの特徴は、包括的な一連の同等の特徴又は同様の特徴の１つの例であるにすぎない。

【0053】

上記説明から、当業者は本発明の必須の特性を容易に把握することができ、その趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明に様々な変化及び変更を加えることで、本発明を様々な用途及び条件に適合させることができる。したがって、その他の実施形態も添付の特許請求の範囲の範囲内である。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【配列表】

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