特許 7378425 肺サーファクタントおよびＢＰＤの予防のためのステロイドを含む治療的組合せ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-11-02

(45)【発行日】2023-11-13

(54)【発明の名称】肺サーファクタントおよびＢＰＤの予防のためのステロイドを含む治療的組合せ

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/58 20060101AFI20231106BHJP

   A61K 35/42 20150101ALI20231106BHJP

   A61K 9/10 20060101ALI20231106BHJP

   A61K 9/72 20060101ALI20231106BHJP

   A61K 47/46 20060101ALI20231106BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20231106BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20231106BHJP

【ＦＩ】

A61K31/58

A61K35/42

A61K9/10

A61K9/72

A61K47/46

A61P11/00

A61P43/00 121

【請求項の数】 11

(21)【出願番号】P 2020560195

(86)(22)【出願日】2019-04-16

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-08-30

(86)【国際出願番号】 EP2019059742

(87)【国際公開番号】W WO2019206731

(87)【国際公開日】2019-10-31

【審査請求日】2022-04-14

(31)【優先権主張番号】62/661,245

(32)【優先日】2018-04-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/751,830

(32)【優先日】2018-10-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】304037234

【氏名又は名称】シエシー ファルマセウティチィ ソシエタ ペル アチオニ

(73)【特許権者】

【識別番号】509111098

【氏名又は名称】チルドレンズ ホスピタル メディカル センター

【氏名又は名称原語表記】ＣＨＩＬＤＲＥＮ’Ｓ ＨＯＳＰＩＴＡＬ ＭＥＤＩＣＡＬ ＣＥＮＴＥＲ

【住所又は居所原語表記】３３３３ Ｂｕｒｎｅｔ Ａｖｅｎｕｅ，ＭＬＶ ７０３２，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ ４５２２９－３０３９，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ

(74)【代理人】

【識別番号】100123788

【弁理士】

【氏名又は名称】宮崎 昭夫

(74)【代理人】

【識別番号】100127454

【弁理士】

【氏名又は名称】緒方 雅昭

(72)【発明者】

【氏名】ジョベ、 アラン

(72)【発明者】

【氏名】シュミット、 アウグスト サントス

(72)【発明者】

【氏名】ヒルマン、 ノア

(72)【発明者】

【氏名】ケンプ、 マシュー

【審査官】榎本 佳予子

(56)【参考文献】

【文献】特開２００７－２６２０６４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１５－５１４４８１（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１３／１６０１２９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】Pediatric Research，2017年，Vol.82, No.6，p.1056-1063

【文献】American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology，2016年，Vol.55, No.5，p.623-632

【文献】Study NCT02907593 on Date: October 17, 2017 (v4)，History of Changes for Study: NCT02907593，ClinicalTrials.gov archive [online]，2017年10月17日，ＵＲＬ，https://clinicaltrials.gov/ct2/history/NCT02907593?V_4=View#StudyPageTop

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３１／００－３３／４４

Ａ６１Ｋ ９／００－ ９／７２

Ａ６１Ｋ ４７／００－４７／６９

Ａ６１Ｐ １／００－４３／００

Ａ６１Ｋ ３５／００－３５／７６８

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

早産新生児における気管支肺異形成症（ＢＰＤ）の予防に使用するための組成物であって、
(ａ)前記早産新生児の２００ｍｇ／ｋｇ体重の投与量のポラクタントアルファと
(ｂ)早産新生児の０．１ｍｇ／ｋｇ体重の投与量のブデソニド
との組み合わせであり、
前記早産新生児の生後１～４日の間に、１度または２度投与される組成物。

【請求項2】

薬学的に許容される担体を含む水性懸濁液の形態である、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

早産新生児における気管支肺異形成症（ＢＰＤ）の予防に使用するためのキットであって、前記早産新生児の生後１～４日の間に、１度または２度使用されるキットであり、
(ａ)早産新生児の２００ｍｇ／ｋｇ体重の用量のポラクタントアルファ、および第１の単位剤形中の薬学的に許容される担体または希釈剤、
(ｂ)早産新生児の０．１ｍｇ／ｋｇ体重の用量のブデソニド、および第２の単位剤形中の薬学的に許容される担体または希釈剤、および
(ｃ)前記第１および第２の剤形を収容するための容器、
を含む、キット。

【請求項4】

早産新生児における気管支肺異形成症（ＢＰＤ）の予防のための組成物であって、
２００ｍｇ／ｋｇ体重の用量のポラクタントアルファと、０．１ｍｇ／ｋｇ体重の用量のブデソニドを含み、
早産新生児の生後１～４日の間に、１度または２度投与される組成物。

【請求項5】

前記早産新生児が非侵入的換気処置下に維持される、請求項４に記載の組成物。

【請求項6】

前記非侵入的換気処置が鼻ＣＰＡＰである、請求項５に記載の組成物。

【請求項7】

ポラクタントアルファとブデソニドが同時に投与される、請求項４～６のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項8】

ポラクタントアルファおよびブデソニドが連続的に投与される、請求項４～６のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項9】

ポラクタントアルファおよびブデソニドが別々に投与される、請求項４～６のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項10】

ポラクタントアルファおよびブデソニドが、吸入または気管内経路によって投与される、請求項４～６のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項11】

前記ポラクタントアルファおよびブデソニドが、薬学的に許容される担体を含む水性懸濁液の形態で投与される、請求項１０に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、未熟児疾患の予防のための組成物に関する。本発明はまた、未熟児疾患の予防のための方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ヒトの肺は、肺胞と呼ばれる多数の小さな空気の袋から構成されている。肺胞では血液と肺の空気の空間の間でガスが交換される。健康な個体では、この交換が呼気の終わりに肺が潰れるのを防ぐタンパク質含有界面活性剤複合体の存在によって媒介される。

【0003】

肺サーファクタント複合体は、主として脂質から構成され、少量の種々のタンパク質を含有する。この複合体が適切なレベルで欠如すると、肺の機能不全が起こる。この症候群は急性呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）と呼ばれ、早産新生児によく起こる。

【0004】

ＲＤＳの治療の主力は、改変天然界面活性剤として知られる、動物の肺から抽出された外来性肺サーファクタント調製物による補充療法である。例えば、診療において使用される改変天然界面活性剤は、ブタ肺由来のポラクタントアルファでありCurosurf（登録商標）の商標で販売され、beractant（Surfacten（登録商標）またはSurvanta（登録商標））、bovactant(Alveofact（登録商標））は両方ともウシ肺由来であり、および子牛肺由来のcalfactant（Infasurf（登録商標））である。

【0005】

外来性肺サーファクタントは、現在、酸素による機械的換気下に保たれた挿管された早産新生児に、生理食塩水溶液中の懸濁液として気管内点滴注入によって投与されている。

【0006】

この治療は出生後の生存率を大幅に増加させているが、ＲＤＳを生き延びた小児は、重大な死亡率、罹病率および医療資源利用と関連する、未熟児の一般的で重篤な合併症である気管支肺異形成症（ＢＰＤ）を発症する高いリスクを有する。出生前および新生児ケアの両方の進歩にもかかわらず、この状態の発生率は増加し続けている。ＢＰＤの管理およびそれに関連する問題は、新生児科医および小児科医にとって依然として大きな課題である。ＢＰＤを予防および治療するために複数の介入が提案されているが、多くは依然としてエビデンスに基づくものではない。現在の治療法はＢＰＤの重症度を低下させたと思われるが、その発生率にはほとんど影響を及ぼさなかった。ＢＰＤは肺損傷の進展過程であり、その病態生理は疾患の異なる段階で変化する。従って、その管理は、単一の介入の形態である可能性は低いが、むしろ、疾患の異なる因子および／または段階を標的とするために使用される異なる戦略との組合せたアプローチである。

【0007】

このため、全体的な管理計画を設計する際に、ＢＰＤの介入を３つの後続段階に分類することが有用である。これらは、i）ＢＰＤの予防；ii)進化するＢＰＤの治療；およびiii）確立されたＢＰＤの治療(Bowen Pら、 Pediatrics and Child Health 2013，24：1,27-31を参照）である。

【0008】

ＲＤＳに罹患した新生児におけるＢＰＤの予防は、出生前または出生後数時間以内にコルチコステロイドの全身投与により管理されている。しかし、出生後のコルチコステロイド投与の有効性は、高血圧、高血糖、消化管合併症、神経発達障害などの全身への有害作用の可能性によって相殺される。

【0009】

全身投与の代替として、吸入または気管内注入によるコルチコステロイドの送達が、ＢＰＤの予防のために提案されている。

【0010】

例えば、米国特許出願公開第２０１０／０３１７６３６号は、呼吸困難症候群に罹患している乳児におけるＢＰＤの予防のための方法を開示しており、これは、高い局所から全身への抗炎症活性を有するコルチコステロイドと肺サーファクタントとの組合せを乳児に投与することによる。

【0011】

Yehら（Pediatrics 2008, 121（5）, e1310-e1318）は、担体として肺サーファクタントSurvanta（登録商標）を使用するブデソニドの気管内注入を提案し、一方、Daniら(Pediatr Pulmonol 2,009, 44, 159-1167）は、Curosurf（登録商標）と組合せたベクロメタゾンジプロピオン酸塩の気管内注入を提案している。

【0012】

しかし、これらのアプローチによっても、早産新生児の大集団がコルチコステロイドに暴露されることになり、そわなければＢＰＤを発症しない場合には、多くの利益がない(Bancalari EAm J Respir Crit Care Med 2016, 193：1, 12参照）。

【0013】

出生後のコルチコステロイドは、このようにしてＢＰＤを必要とする患者に投与され、ＢＰＤの予防における治療におけるその位置付けを見出すことができる。

【0014】

しかしながら、観察された副作用あるいは有効性の明確な徴候の欠如のために、デキサメタゾンおよびヒドロコルチゾンの出生後の全身投与は、現在のところ常には推奨されていない。

【0015】

上記の考察を考慮すると、未熟児におけるＢＰＤの予防のためのより適合したコルチコステロイドベースの薬剤を開発し、有害な副作用のリスクを軽減する必要性が依然として存在する。

【0016】

さらに、吸入または気管内点滴注入のいずれかによって局所的に投与され得る薬剤を提供することが有利である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0017】

従って、本発明の１つの目的は、未熟児疾患の予防のための新規組成物を提供することである。

【0018】

本発明の別の目的は、未熟児疾患を予防するための新規な方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0019】

以下の詳細な説明の間に明らかになるのであろうこれらおよび他の目的は、ブデソニドと組合せた肺サーファクタントの投与が早産新生児における気管支肺異形成症（ＢＰＤ）の予防に有用であるという本発明者らの発見によって達成された。

【0020】

従って、本発明は、早産新生児における気管支肺異形成症の予防のための使用のための、肺サーファクタントとステロイドとの組合せを提供する。

【0021】

したがって、一実施形態では、本発明が早産新生児における気管支肺異形成症（ＢＰＤ）の予防に使用するための、約０．０１～約０．１ｍｇ／ｋｇ体重の用量のブデソニドと組合せた肺サーファクタントに関する。

【0022】

有利には、前記組合せは出生（生後１日以内）から生後４日まで投与される。

【0023】

本発明はまた、早産新生児における重篤な慢性肺不全の未熟児の治療に使用するための、約０．０１～約０．１ｍｇ／ｋｇ体重の用量のブデソニドと組合せた肺サーファクタントに関する。

【0024】

本発明はまた、早産新生児における気管支肺異形成症（ＢＰＤ）の予防のための医薬の製造における、約０．０１～約０．１ｍｇ／ｋｇ体重の用量のブデソニドと組合せた肺サーファクタントの使用に関する。

【0025】

有利には、前記組合せは出生（生後１日以内）から生後４日まで投与される。

【0026】

本発明はまた、早産新生児における重篤な慢性肺不全の未熟さの治療のための医薬の製造における、約０．０１～約０．１ｍｇ／ｋｇ体重の用量のブデソニドと組合せた肺サーファクタントの使用に関する。

【0027】

本発明の薬剤は同時に、連続して、または別々に、好ましくは固定された組合せとしての同時投与のために投与され得る。

【0028】

特定の実施形態では、前記薬剤が前記固定された組合せを含む吸入または気管内投与のための医薬組成物の形態である。

【0029】

別の実施形態では、気管支肺異形成症の予防または早産の重篤な慢性肺不全の治療のための方法であって、そのような予防を必要とする早産新生児に、約０．０１～約０．１ｍｇ／ｋｇ体重の用量でブデソニドと組合せて肺サーファクタントを投与することを含み、前記組合せが生後（生後１日以内）から生後４日までに投与される、方法を対象とする。

【0030】

さらなる実施形態において、本発明は、本発明の組成物の投与を含む、早産新生児における肺機能を改善する方法に関する。

【0031】

なおさらなる実施形態において、本発明は、機械的換気で治療された早期新生児における肺炎症を減少させる方法であって、前記早期新生児への本発明の組成物の投与を含む方法であって、前記投与を前記機械的換気の間、前、または後に行う、方法を対象とする。

【0032】

本発明によって提供される利点は、以下の詳細な説明および図面から明らかになるのであろう。

【図面の簡単な説明】

【0033】

【図1】実施例５の結果を示す図である。

【図2】実施例６の平均気道圧（ＭＡＰ）および４０ｃｍＨ_２Ｏでの体積（Ｖ４０／ｋｇ）の結果を示す図である。

【図3】実施例６の損傷に対する肺ｍＲＮＡ評価の結果を示す図である。

【図4】実施例６の機械的換気に対する肝臓ｍＲＮＡ応答の結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0034】

用語「気管支肺異形成症（ＢＰＤ）」は、慢性肺疾患（ＣＬＤ）としても知られる慢性肺障害を意味し、未解決または異常に修復された肺損傷の結果である。ＢＰＤは未熟児の重症慢性肺不全にも言及されることがある。

【0035】

ＢＰＤは典型的には、生後早期に人工呼吸による酸素毒性および圧外傷の結果として肺損傷を受けた超低出生体重児（ＶＬＢＷ）に生じる。ＢＰＤの定義および分類は、Northwayらによる１９６７年の最初の記載から変化している。国立小児保健・人間開発研究所（ＮＩＣＨＤ）は、２００１年のコンセンサス声明でＢＰＤを定義した。この定義では、２８日間の酸素補給の必要を使用して、その後、３６週月経後齢（ＰＭＡ）、または妊娠３２週未満で生まれた人または生後５６日もしくは妊娠３２週以上で生まれた人の退院時のいずれかで必要とされる呼吸補助によって、３段階の重症度のグレードを規定する。

【0036】

２００１年に、Jobe Aら(Am J Respir Crit Care Med; 163（7） 1723-1729）は、「軽度」、「中等度」および「重度」ＢＰＤの特定の基準を含む新しい定義を提案した。

【0037】

軽度のＢＰＤは、酸素補給を２８日以上必要とし、３６週ＰＭＡ時／または退院時（出生時に３２週未満の乳児の場合）または５６日時または退院時（出生時に３２週以上の乳児の場合）に室内気下である疾患と定義される。

【0038】

中等度のＢＰＤは、酸素補給を２８日以上必要とし、酸素補給の必要性が３６週ＰＭＡ時／退院（３２週未満の乳児）または５６日時／退院時（３２週以上の乳児）に３０％未満である疾患と定義される。

【0039】

重症ＢＰＤは、酸素補給を２８日以上必要とし、酸素補給の必要性が３０％以上ある疾患、または３６週ＰＭＡ時／退院時（３２週未満）または５６日／退院時（３２週以上）に経鼻ＣＰＡＰまたは機械的換気を受けている疾患と定義される。

【0040】

早期ＢＰＤとして知られることもある「進化型ＢＰＤ」という用語は、確立されたＢＰＤにつながる慢性過程の最初の段階を指し、生後７日から１４日までの酸素依存性および／または人工呼吸器依存性を特徴とする疾病を示す（Walsh MCら、Pediatrics 2006,117, Ｓ52-S5）。

【0041】

最近、進化型ＢＰＤは、また、未熟児の慢性肺不全と呼ばれている(Steinhorn Rら、 J Peds 2017,8 15-21を参照)。

【0042】

「改変天然界面活性剤」という用語は、細かく切り刻んだ哺乳動物肺の脂質抽出物を指す。製造プロセスで使用される脂質抽出プロセスのために、親水性タンパク質ＳＰ－ＡおよびＳＰ－Ｄは失われる。これらの調製物は可変量の２つの疎水性界面活性剤関連タンパク質ＳＰ－ＢおよびＳＰ－Ｃを有し、抽出方法に応じて、非界面活性剤脂質、タンパク質または他の成分を含有する可能性がある。

【0043】

「ポラクタントアルファ」という用語は、実質的に極性脂質、主にリン脂質およびタンパク質、ＳＰ－ＢおよびＳＰ－Ｃからなる、ブタ肺から抽出された改変天然界面活性剤を指す。ポラクタントアルファは、商標Curosurf(登録商標)で入手できる。

【0044】

「人造肺サーファクタント」という用語は、合成化合物、主としてリン脂質および天然肺サーファクタントの脂質組成および挙動を模倣するように製剤化された他の脂質の混合物を指す。それらは肺サーファクタント蛋白質を欠いている。

【0045】

「再構成された肺サーファクタント」という用語は、動物から単離された肺サーファクタントタンパク質／ペプチド、またはＷＯ ９５／３２９９２に記載されているものなどの組換え技術によって製造されたタンパク質／ペプチド、またはＷＯ ８９／０６６５７、ＷＯ ９２／２２３１５およびＷＯ ００／４７６２３に記載されているものなどの合成肺サーファクタントタンパク質アナログが添加されている人造肺サーファクタントを指す。

【0046】

「非侵入的換気（ＮＩＶ）処置」という用語は、経鼻的持続陽圧呼吸(nasal CPAP)などの挿管を必要とせずに呼吸を補助する換気モダリティを定義する。その他の非侵入的換気処置は、経鼻間欠的陽圧換気（ＮＩＰＰＶ）、高流量鼻カニュラ（ＨＦＮＣ）、バイレベル気道陽圧(BiPAP)である。

【0047】

「呼吸補助」という用語は、呼吸器疾患を治療する任意の介入を含み、例えば、酸素補給、人工呼吸、および鼻ＣＰＡＰの投与を含む。

【0048】

「治療」という用語は、例えば患者におけるＢＰＤのための、疾患または状態の治癒、症状緩和、症状軽減のための使用を指す。

【0049】

「予防」という用語は、例えば患者におけるＢＰＤについての、進行を遅らせる、発症を遅らせる、および／または疾患または状態に罹患するリスクを低下させることを意味する。

【0050】

「早産新生児」という用語、すなわち早産幼児は、在胎週数２４～３５週の極低出生体重（ＥＬＢＷ）、超低出生体重（ＶＬＢＷ）、および低出生体重（ＬＢＷ）新生児を含む。

【0051】

「固定された組合せ」という用語は、活性物質が固定された定量的比率である組合せを意味する。

【0052】

「薬学的に許容される」とは、乳児に投与された場合にアレルギーまたは同様の不都合な反応を生じない媒体を指す本明細書で使用される用語である。

【0053】

界面活性剤調製のための「界面活性剤活性」は、表面張力を低下させる能力として定義される。

【0054】

外来性界面活性剤調製物のインビトロ効力は、一般に、ヴィルヘルムはかり、Pulsating Bubble表面張力計、Captive Bubble表面張力計およびキャピラリー表面張力計などの適切な装置を使用して、表面張力を低下させるそれらの能力を測定することによって試験される。

【0055】

外来性界面活性剤調製物のインビボ効力は、公知の方法に従って、早産動物モデルにおいて肺力学を測定することによって試験する。

【0056】

本明細書の文脈において、「相乗的」とは肺サーファクタントの活性にブデソニドの活性を加えたものが、サーファクタントまたはブデソニド単独のものによって予想されるよりも大きいことを意味する。

【0057】

「ポラクタントアルファの生体類似体」という用語は、同じ安全性プロフィールを有し、治療的に等価であり、少なくとも８０％の準量的組成の類似性を有し（特にリン脂質および界面活性剤タンパク質ＳＰ－ＢおよびＳＰ－Ｃに関して）、８０ｍｇ／ｍｌの濃度で水溶液中に懸濁される場合、室温で１５ｍＰａｓ(ｃＰ)以下の粘度を有する、改変された天然の肺サーファクタントをいう。粘度は、公知の方法に従って決定することができる。

【0058】

本発明は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約０．１ｍｇ／ｋｇ体重の用量のブデソニドが気管支肺異形成症（ＢＰＤ）を防ぐために、界面活性剤の表面活性を変化させることなく、ポラクタントアルファのような肺サーファクタントと組み合わされ得るという予期しない知見に部分的に基づいている。

【0059】

肺サーファクタントをブデソニドのクレームされた用量と組合せる利点は、以下の知見から明らかになるのであろう。

【0060】

実際、驚くべきことに、ＢＰＤを模倣するための高酸素症に暴露された早産ウサギモデルにおける研究において、例えばYehら、２００８年において使用された用量と比較して、より低い用量のブデソニドと組合せたポラクタントアルファのような肺サーファクタントが、実質的に同等の肺柔軟性を生じることが見出された。ブデソニドは高度に親油性のコルチコステロイドであるので、これは無視できる全身吸収で、リン脂質細胞膜を横切るその粘膜吸収および取り込みに有利であり得、この組合せが、早産新生児における治療的使用を安全にする。

【0061】

さらに、新生子羊モデルでの研究では、０．０４および０．１ｍｇ／ｋｇのブデソニドと組合せたポラクタントアルファで処置された動物が、２００８年のYehらで使用されたブデソニド投与量と組合せて界面活性剤を受けた動物よりも、４０ｃｍＨ_２Ｏでより高い体積を示した。

【0062】

ブデソニドのＡＤＭＥ特性に年齢差がある可能性があるため、低用量でも依然として有効であると予測することはできなかったものであろう。

【0063】

４０ｃｍＨ_２Ｏでの体積は、肺に放出される蛋白質または炎症が浮腫を引き起こし、界面活性剤を不活性化し、両方ともＢＰＤの発症に有利に働くので、肺損傷のマーカーである。

【0064】

他方、肺サーファクタントはマランゴニ効果によるコルチコステロイドの拡散に有利であり、その分布に有利であり、従って、全ての関心のある肺領域に到達する。

【0065】

現在使用されているか、または呼吸困難症候群および他の肺状態での使用のために後に開発される任意の肺サーファクタントは、本発明での使用に適切であり得る。これらには、改変された天然、人造および再構成された肺サーファクタントが含まれる。

【0066】

現在の改変された天然肺サーファクタントとしては、ウシ脂質肺サーファクタント（BLES(商標)、BLES Biochemicals, Inc. London,Ont.）、カルファクタント（Infasurf(商標)、Forest Pharmaceuticals, St.Louis，Mo．）、ボバクタント（Alveofact(商標)、Thomae、ドイツ）、ウシ肺サーファクタント（肺サーファクタントＴＡ(商標)、東京田辺、日本）、ポラクタントアルファ（Curosurf(商標)、Chiesi Farmaceutici SpA、Paruma、イタリア）、およびベラクタント（Ｓｕｒｖａｎｔａ(商標)、Abbott Laboratories,Inc., Abbott Park、111）が挙げられる。

【0067】

再構成された界面活性剤の例としては、ＥＰ ２ １５２ ２８８、ＷＯ ２００８／０１１５５９、ＷＯ ２０１３／１２００５８に開示された組成物、製品ルシナクタント（Surfaxin（商標）、Windtree-Discovery Laboratories Inc, Warrington, Pa）、およびＷＯ ２０１０／１３９４４２の実施例２の表２に開示された組成を有する製品が挙げられ、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、それは
ＳＰ－Ｃ３３(ｌｅｕ)アセテート １．５％；
Ｍｉｎｉ－Ｂ（ｌｅｕ）アセテート ０．２％；および
ＤＰＰＣ：ＰＯＰＧが５０：５０重量比である。
上記再構成された界面活性剤は、以下、ＣＧＦ ５６３３として引用される。

【0068】

本発明の薬剤に使用するために選択される肺サーファクタントは、ＲＤＳに利用される肺サーファクタントと同じであっても異なっていてもよい。好ましい実施形態では、同じ肺サーファクタントが使用される。

【0069】

好ましい実施形態では、肺サーファクタントが改変天然肺サーファクタントである。

【0070】

より好ましくは、肺サーファクタントが非常に低い粘度を付与されているので、ポラクタントアルファ（Curosurf（商標））であり、したがって、少量の水性担体を使用して高濃度で投与することができる。

【0071】

別の実施形態では、肺サーファクタントがＷＯ ２０１０／１３９４４２の実施例２の表２に開示される組成を有する再構成界面活性剤である。

【0072】

投与される肺サーファクタントの用量は、早産新生児の体重および妊娠期間、ならびに新生児の状態の重症度によって変化するのであろう。当業者は、これらの因子を容易に決定し得、そしてそれに応じて投薬量を調節し得る。

【0073】

有利には、肺サーファクタントの用量が約１００～約２００ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。

【0074】

本発明の好ましい実施形態では、約１００～約２００ｍｇ／ｋｇ体重の用量のポラクタントアルファを使用することができる。

【0075】

好ましい実施形態では用量は約１００ｍｇ／ｋｇ体重とすることができ、別の好ましい実施形態では用量は約２００ｍｇ／ｋｇ体重とすることができる。

【0076】

有利には、ブデソニドの用量が約０．０１～約０．１ｍｇ／ｋｇ体重である。ブデソニドの用量の下限は、約０．０２ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０３ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０４ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．０５ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。ブデソニドの用量の上限は、約０．０９ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０８ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．０７ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。

【0077】

ＢＰＤの予防には、肺サーファクタントおよびブデソニドを、（ａ）出生まで可能な限り近い時期、または生後の始まりから（ｂ）生後４日目の任意の時期までの間に、早産新生児にいつでも投与する。上記の時間隔内で、投与が所望の効果を達成するために適切であると、医師または他の医療従事者によって見なされる期間にわたって継続され得る。

【0078】

別の実施形態では、肺サーファクタントおよびブデソニドが生後３日間の任意の時点で早産新生児に投与される。別の実施形態では、肺サーファクタントおよびブデソニドが生後２日間の任意の時点で早産新生児に投与される。別の実施形態では、肺サーファクタントおよびブデソニドが生後１日の間の任意の時点で早産新生児に投与される。別の実施形態では、肺サーファクタントおよびブデソニドが生後最初の８時間の間の任意の時点で早産新生児に投与される。別の実施形態では、肺サーファクタントおよびブデソニドが生後４時間の間の任意の時点で早産新生児に投与される。

【0079】

投与の頻度は、新生児の状態の重篤度および投与経路と同様に、早産新生児の大きさおよび妊娠期間によって変化するのであろう。当業者は、それを容易に決定することができるのであろう。例えば、本発明の薬剤は、１回または２回投与することができる。

【0080】

投与の頻度は新生児の状態の重篤度および投与経路と同様に、早産新生児の大きさおよび妊娠期間によって変化するのであろう。例えば、本発明の薬剤は、１回または２回投与することができる。

【0081】

ＢＰＤの予防には、肺サーファクタントおよびブデソニドを、好ましくは２８～３２週の妊娠週齢、２６～３５週の妊娠週齢の早産新生児に投与する。

【0082】

好ましくは、本発明の組合せは非侵入的換気処置の下で維持された、より好ましくは鼻ＣＰＡＰの下で維持された、さらにより好ましくは鼻装置を用いた、１～１２ｃｍ水圧で、早産新生児に投与される。

【0083】

特許請求された用量での肺サーファクタントおよびブデソニドの組合せの活性物質は、連続的に、別々に、または一緒に投与され得る。有利には、２つの活性物質が一緒に投与される場合、それらは固定された組合せとして投与される。

【0084】

したがって、本発明はまた、ＢＰＤを予防するための医薬の製造における固定された組合せとしての本発明の組合せの使用を提供する。薬剤は、医薬組成物の形態であってもよい。

【0085】

前記製剤は、溶液、分散液、懸濁液または乾燥粉末の様式で投与することができる。好ましくは、前記組成物が適当な生理学的に許容される溶媒中に懸濁された特許請求される組合せを含む。

【0086】

より好ましくは、製剤が水溶液、好ましくは無菌を含み、これはまた、ｐＨ緩衝剤、および湿潤剤としてのポリソルベート２０、ポリソルベート８０またはソルビタンモノラウレート、および等張剤としての塩化ナトリウムなどの他の薬学的に許容される賦形剤を含み得る。

【0087】

製剤は、単位用量または複数用量容器、例えば密封アンプルおよびガラス瓶に分配されてもよく、または使用直前に滅菌液体担体の添加のみを必要とする凍結または凍結乾燥（凍結乾燥）条件で保存されてもよい。

【0088】

好ましくは、製剤が単回使用ガラス瓶中の緩衝生理食塩水（０．９％ w/v塩化ナトリウム）水溶液中の滅菌懸濁液として供給される。

【0089】

特許請求された製剤の投与は、公知の方法に従って、例えば、気管内点滴、噴霧投与、またはジェット超音波による噴霧、または市販されているメッシュ振動ネブライザーによって行うことができる。

【0090】

気管内注入により製剤を投与する場合は、呼吸困難症候群の重症度に応じて、異なる方法が適切である。例えば、特許請求された製剤は、機械的換気下に保たれた早産新生児に、気管内チューブを通して投与されてもよい。

【0091】

あるいは処方物が気管内に配置された細いカテーテルの使用によって投与されてよく、そして新生児呼吸は、ＷＯ ２００８／１４８４６９に記載される手順に従って、経鼻持続陽圧呼吸法（ｎＣＰＡＰ）として知られる公知の方法論に従って、マスク、プロングまたはチューブのような特別に設計された鼻装置を通して支援される。

【0092】

後者のアプローチは低粘度を有するポラクタントアルファのような外来性界面活性剤でのみ可能である。なぜなら、高粘度は、細いカテーテルを通る界面活性剤の通過をより困難にするからである。

【0093】

２つの組合せられた活性物質が懸濁される水溶液の体積は、所望の濃度に依存する。

【0094】

有利には、製剤の体積が約５．０ｍｌ以下であるべきである、好ましくは約４．５～約２．０ｍｌ、より好ましくは約３．５～約２．５ ｍｌである。

【0095】

他の実施形態において、肺サーファクタントおよびブデソニドが別々に投与される場合、個々の活性物質は別々に処方され得る。この場合、２つの個々の活性物質は、無条件に同時に摂取される必要はない。

【0096】

別個の投与の場合、２つの個々の活性物質の製剤はキットを提供するために、適切な容器に同時に包装することができる。

【0097】

したがって、本発明は、気管支肺異形成症の予防のためのキットにも関し、前記キットは、ａ）約１００～約２００ｍｇ／ｋｇの用量の肺サーファクタントと、第１の単位剤形中の薬学的に許容される担体または希釈剤と、ｂ）約０．０１～約０．１ｍｇ／ｋｇの用量のブデソニドと、第２の単位剤形中の薬学的に許容される担体または希釈剤と、ｃ）前記第１および第２の剤形を収容するための容器手段とを含む。

【0098】

早産新生児に影響を及ぼす可能性のある軽度、中等度、重度のＢＰＤのいずれの形態も、本発明の組合せの手段によって予防することができた。

【0099】

本発明の薬剤を必要とする早産新生児は、呼吸困難症候群（ＲＤＳ）を示してもしなくてもよい。１つの実施形態において、本発明の薬剤の投与は肺サーファクタントでのこのような症候群の処置の後に、または別の手段（例えば、換気）もしくはそれらの組合せによって、ＲＤＳを示す新生児において開始される。

【0100】

特定の実施形態では本発明の薬剤で治療される新生児が呼吸補助を必要とするが、必ずしも呼吸困難症候群を示さない。これらの乳児は、ＲＤＳと診断されていないか、またはＲＤＳのための肺サーファクタントで治療されていない。

【0101】

妊娠２４～３５週齢の超低出生体重（ＥＬＢＷ）、超低出生体重（ＶＬＢＷ）、および低出生体重（ＬＢＷ）新生児を含む、全ての早産新生児は、本発明の薬剤の投与に適格であり得る。好ましくは、薬剤がＢＰＤのより高い発生率を有する重篤なＲＤＳを有するＶＬＢＷ新生児に投与される。

【0102】

一般的に、ＢＰＤの管理は単一の介入の形ではなく、むしろ複合的なアプローチの形である可能性が低いため、医師は早産新生児が呼吸補助および／またはビタミンＡおよび抗生物質などの他の適切な薬物の併用も必要とするかどうかを評価する。

【0103】

肺サーファクタントおよびブデソニドの用量、ならびに上記で論じた投与すべき製剤の体積、ならびに投与を受ける早期新生児の典型的な重量を考慮すると、溶液または懸濁製剤は、典型的には約０．００５～約０．０５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．０１～約０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度のブデソニド、および約２０～約１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約４０～約８０ｍｇ／ｍｌの濃度の肺サーファクタントを含有する。

【0104】

本発明の他の特徴は、本発明の例示のために与えられる例示的な実施形態の以下の説明の過程で明らかになるのであろう。

【実施例】

【0105】

実施例１ 毛細管界面活性計によるブデソニド存在下でのポラクタントアルファの表面活性のin Vitro評価
ポラクタントアルファ（ブデソニドの存在下、２ｍｌ、１．０ｍｇ）の表面活性を、Calmia Medical, Inc., USA から市販されているキャピラリー界面活性計によって、ポラクタントアルファ単独と比較して評価した。

【0106】

２つのサンプルを調製した：一方はガラス瓶中のポラクタントアルファの（１．５ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ）から生理食塩水でリン脂質中に１ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈することによって調製し、他方は、ガラス瓶中のポラクタントアルファ（１．５ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ）とガラス瓶中のブデソニド（２ｍｌ、１．０ｍｇ）とを混合し、生理食塩水で同じ濃度（１ｍｇ／ｍｌリン脂質）に希釈して調製した。次に、両方の溶液の０．５ｍｌサンプルをキャピラリー界面活性計で評価した。

【0107】

毛細管界面活性計の原理は、ヒト気道末端をシミュレートすることであった。サンプルを、ヒト気道末端と同様に、内径が０．２５ｍｍであるガラスキャピラリーの狭い部分に導入した。キャピラリーの一端をベローズおよび圧力変換器に接続した。ベローズをゆっくりと圧縮すると、圧力が上がり、記録される。圧力が増加すると、毛細管の狭い部分から試料が押し出された。空気が通過することにつれて、圧力は急激に低下した。サンプルが良好に機能する肺サーファクタントを含んでいた場合、サンプル液は狭い部分に戻らなかった。ベローズの連続圧縮で得た定常気流は抵抗に遇わずに、記録した圧力はゼロであった。他方、サンプルが良好に機能する肺サーファクタントを含まない場合、サンプル液は繰り返し戻った。

【0108】

ブデソニド存在下でのポラクタントアルファの挙動はポラクタントアルファ単独のそれと統計学的に区別できないことが判明し、ブデソニドが界面活性剤の表面活性に影響しないことを示した。

【0109】

実施例２ 本発明による水性懸濁液の形態の製剤
成分 数量
製薬用単位
ポラクタントアルファ １６０ ｍｇ
微粉末ブデソニド ０．１ ｍｇ
ポリソルベート（Ｔｗｅｅｎ）２０ ２．０ ｍｇ
モノラウリン酸ソルビタン ０．４ ｍｇ
塩化ナトリウム １８ ｍｇ
注射用水ｑｓｆｏｒ ２．０ ｍｌ。

【0110】

実施例３ 本発明による水性懸濁液の形態の製剤
成分 数量
製薬用単位
ポラクタントアルファ １６０ ｍｇ
微粉末ブデソニド ０．０４ ｍｇ
ポリソルベート（Ｔｗｅｅｎ）２０ ２．０ ｍｇ
モノラウリン酸ソルビタン ０．４ ｍｇ。

【0111】

実施例４ 本発明による水性懸濁液の形態の製剤
成分 数量
製薬用単位
ＣＨＦ ５６３３ １６０ ｍｇ
微粉末ブデソニド ０．０４ ｍｇ
ポリソルベート（Ｔｗｅｅｎ）２０ ２．０ ｍｇ
モノラウリン酸ソルビタン ０．４ ｍｇ。

【0112】

実施例５ ウサギモデルにおけるin vivo効果
高酸素に曝露された気管支肺異形成症（ＢＰＤ）早産ウサギモデルをこの実験に用いた。このモデルは、他の場所で詳細に説明されている(Richter J.ら（２０１４）、ウサギにおける早産後の高酸素誘発肺障害の機能評価、Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol ３０６: L２７７－２８３； Jimenez J、ら（２０１６） 高酸素に暴露した早産ウサギの気管支肺異形成症モデルにおける進行性の血管機能的および構造的損傷、Int J Mol Sci １７：Ｅ１７７６；およびSalaets Tら（２０１５）、高酸素曝露７日後の早産ウサギ肺のトランスクリプトーム解析、PLoS One １０：ｅ０１３６５６９参照）。簡潔に言うと、早産のウサギは、妊娠２８日（初期嚢状肺発達期）で帝王切開により出産した（満期＝３１日）。分娩直後、仔をインキュベーター（３２℃）に入れ、５～６匹／群の３群に無作為に分けた（下記参照）。早産のウサギを４日間高酸素状態（酸素９５％）に保ち、経口胃管を介して調乳とともに１日２回給餌し、予防的抗生物質およびビタミンＫを投与した。３日目に、各動物にサーファクタント単独１００ｍｇ／ｋｇ体重（第１群）、またはサーファクタント１００ｍｇ／ｋｇ＋ブデソニド０．０５ｍｇ／ｋｇ体重（第２群）、または界面活性剤１００ｍｇ／ｋｇ＋ブデソニド０．２５ｍｇ／ｋｇ体重（第３群）を単回気管内注射した。０．２５ｍｇ／ｋｇの用量はＹｅｈら、２００８において最適であると報告されている。

【0113】

２４時間後、出生後４日目に、早産ウサギを深く麻酔し、排管を各動物の気管に配置し、侵入性肺機能試験を、先に記載されたようにFlexiventシステム（FlexiVent ５．２; SCIREQ)を使用して行った(Richter Jら（２０１４)過酸素症で誘発された早産ウサギの肺損傷機能評価、Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 306:L277-283；Jimenez Jら (２０１６）高酸素に暴露した早産ウサギの気管支肺異形成症モデルにおける進行性の血管機能的および構造的損傷、Int J Mol Sci 17：E1776；およびSalaets Tら（２０１５）高酸素曝露７日後の早産ウサギ肺のトランスクリプトーム解析、PLoS One 10：e0136569、参照）。圧力体積摂動（ＰＶｒ－Ｖ）を用いて、静的柔軟性（所与の肺体積での肺の弾性反跳圧力）を測定した。仔１匹当たり３つの測定値が得られた（測定係数＞０．９５）。３つの測定値の平均値を体重で正規化し、分析に使用した。その後、仔を安楽死させた。

【0114】

高酸素に４日間曝露し、サーファクタント±ブデソニド気管内投与の２４時間後に、動物を深く麻酔した。肺静的柔軟性を、方法に記載したようにして測定した。

【0115】

結果を表１および図１に示した。平均±標準偏差を図１にプロットし、表１に示す（黒丸は界面活性剤単独１００ｍｇ／ｋｇを表し、黒四角は界面活性剤１００ｍｇ／ｋｇ＋ブデソニド０．０５ｍｇ／ｋｇを表し、黒三角は界面活性剤１００ｍｇ／ｋｇ＋ブデソニド０．２５ｍｇ／ｋｇを表した）。データは、一方向ＡＮＯＶＡおよびテューキーの多重比較試験(# p ＝０．０００４； * p ＝０．０３、界面活性剤単独群を界面活性剤＋ブデソニド群と比較した場合）で分析した。

【0116】

【表1】

【0117】

表１から分かるように、Ｙｅｈら、２００８で使用されたブデソニド用量と比較して、実質的に同様の効果が達成される。

【0118】

実施例６ 子羊モデルにおけるin vivo効果
本検討の目的は、子羊モデルを用いて、ポラクタントアルファ中の低用量ブデソニドが全身作用が少なく、炎症の生理学および指標の改善に同等に有効であるという仮説を検証することであった。

【0119】

実験手順
雌ヒツジは、係合され約５０日目に妊娠確認した。雌ヒツジは、手術による胎児の娩出前に操縦されなかった。ヒツジはケタミン静注で鎮静し、脊椎麻酔を行った。胎児の頭頸部を露出させ、胎児にケタミン１０ｍｇ／ｋｇを筋注投与したところ、補足的鎮静および気管上の皮膚へのリドカイン浸透として胎児体重が推定された。４．５ｍｍの気管内チューブを気管内に固定し、続いて５０ｍｌシリンジでＥＴチューブを通して胎児肺液を吸引し、穏やかに吸引した。肺における界面活性剤／ブデソニドの均一な分布を補助するために、子羊を送達し、表層的に乾燥させ、秤量し、最初の身体位置決め期間を伴う機械的換気に置いた。
新生子羊を２つの処置に無作為に割り付けた：
キュロサーフ２００ｍｇ/ｋｇ(２．５ｍｌ/ｋｇ)+ブデソニド０．１ｍｇ/ｋｇ(０．５ｍｌ／ｋｇ）
キュロサーフ２００ｍｇ/ｋｇ(２．５ｍｌ/ｋｇ)+ブデソニド０．０４ｍｇ/ｋｇ(０．５ｍｌ／ｋｇ）
比較のために、キュロサーフ２００ｍｇ／ｋｇ＋ブデソニド０．２５ｍｇ／ｋｇを使用した。

【0120】

界面活性剤（３ｋｇの推定重量に基づいて７．５ｍｌ）を１０ｍｌシリンジで吸い上げ、続いてブデソニドまたは生理食塩水で合計９ｍｌにした。混合物を手動で複数回回転させて、成分を混合させた。界面活性剤と治療薬との組合せを、投与前に再び回転させた。サーファクタントの分布を助けるために、機械的人工換気の開始直前に、子羊に胸の位置を決めて気管注入により治療した。

【0121】

各子羊を乳児加温床に置いた。換気は、４０％の加熱加湿酸素を、最初のピーク吸気圧が３０ｃｍＨ_２Ｏ、呼気終末陽圧が５ｃｍＨ_２Ｏ、呼吸数が５０呼吸／分、吸気時間が０．５秒で送るように設定されたファビアの乳児換気装置を用いた。ＰＣＯ_２が５０ｍｍＨｇを超えない限り、最高呼吸圧を８ｍｌ／ｋｇを超えないように調整することによって、１回換気量を制御した。子羊にはケタミンを投与し、完全に鎮静させ、自発呼吸を行わなかった。血液ガス測定は、１５分、３０分および１時間間隔で６時間行った。必要に応じて。出生直後、子羊には、血圧を維持し、血液サンプリングを可能にするために、胎盤血液を１０ｍｌ／ｋｇ輸血した。子羊の温度、心拍数および血圧を連続的にモニターした。

【0122】

組織サンプリングのために、子羊を６時間でＩＶペントバルビタールで安楽死させた。

【0123】

ブデソニド酸エステルの分析のためのブデソニドの高感度ＬＣ－ＭＳアッセイおよび加水分解法が用いられる。対照子羊の他の器官由来の組織をベースラインｍＲＮＡ分析のために用いた。２０１８年の動物群では、ブデソニドの血漿中濃度について、１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、６時間の血液を採取した。６時間目に組織をサンプリングされた動物は、左側の肺胞洗浄で測定されたブデソニド、および左側における残留ブデソニドを有した。適応があれば他の臓器でもブデソニドを測定した。我々は以前は、血漿、肺、ＢＡＬＦのみでブデソニド濃度を測定していた。

【0124】

ヒツジ血漿から血漿試料およびベタメタゾン標準品を以下のように抽出した。試料または標準品２０μＬを、内標準物質５０μＬ（ブデソニド－ｄ８、５０ｎｇ／ｍＬ）が入った１０ｍＬのガラス試験管の中に加えた。チューブを密封し、１０秒間ボルテックスし、次いで室温で５分間インキュベートし、次いで、１ｍＬの酢酸エチルを各サンプルに添加する。サンプルを２分間ボルテックスし、次いで遠心分離する（５分間、３０００ｒｐｍ、２４℃）。７００ μＬの上清をガラス製の１．５ｍＬオートサンプラーガラス瓶に移し、真空下（３０分、３０００ｒｐｍ、３７℃）で乾燥させた。次いで、サンプルを７０μＬの１：１メタノールおよび水溶液に再懸濁した後、穏やかに振盪しながら５０℃で１０分間インキュベートする。

【0125】

ブデソニドに暴露した肺試料を以下のように抽出した：２ｍＬの組織浸軟管に添加した１００ｍｇの試料に５０μＬの内部標準（ブデソニド－ｄ８、５０ｎｇ／ｍＬ）を添加し、次いで１ｍＬの酢酸エチルを各試料に添加した。サンプルを、６，５００ｒｐｍ×２分の２サイクルを用いて浸軟した。次いで、サンプルを５０℃で１時間インキュベートし、遠心分離し（５分、３０００ｒｐｍ、２４℃）、濾過する。清澄化した上清７００μＬをガラス製の１．５ｍＬオートサンプラーガラス瓶に移し、真空下（３０分、３０００ｒｐｍ、３７℃）で乾燥させた。次いで、サンプルを７０μＬの１：１メタノールおよび水の溶液中に再懸濁した後、穏やかに振盪しながらインキュベートする（５０℃で１０分間）。ブデソニド未投与動物から採取した胎児肺組織１００ｍｇに内部標準５０μＬ及び血漿標準２０μＬを添加したこと以外は、同一の方法を用いて肺分析の標準物質を抽出した。肺組織の加水分解を、０．０１２５ｍｇ／ｍｌの濃度で、０．１M Ｋ_２ＨＰＯ_４緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解したウシ膵臓コレステロールエステラーゼを用いて、１０ｍＭタウロコール酸塩と共に、摘出前に１５分間行った。

【0126】

分析は、Agilent Technologies 1290 Infinityポンプおよび６４００シリーズTriple Quadrupole LC/MSシステムを用いて、正イオンモードの電子スプレーイオン化源を用いて行った。サンプルの２０μＬをＭＳに注入し、Agilent Poroshell２．１×５０mm C１８、２．６μＭカラムおよびPhenomenex Biphenyl３×１５０ｍｍ、２．６μＭカラムを使用して、分析物をクロマトグラフィー分離する。２溶媒勾配溶出のための移動相は、（Ａ１）水＋０．１％ギ酸、次いで（Ｂ１）メタノール＋０．１％ギ酸からなり、０．５ｍＬ／分の流速で送達され、１０分間で５０％Ｂから９８％の勾配を有し、その後、２分間再平衡化し、その後、注入した。ＭＳは、それぞれ４３１．５および３２３．０の質量を有する前駆体および生成物ブデソニドイオン（取得時間３．９分）、ならびにそれぞれ４３９．５および４２１．５の質量を有するブデソニド－ｄ８イオン（取得時間３．８３分）を検出するように設定された。カットオフとして１０：１のシグナル：ノイズ比を使用して、ブデソニド濃度は、０．０１ｎｇ／ｍＬ程度の低い濃度まで確実に測定することができる。

【0127】

静的肺柔軟性について、肺の圧力－体積曲線を測定した。左肺を肺胞洗浄および残留ブデソニドの測定に使用した。

【0128】

右上葉を組織病理学のためにホルマリンで膨張固定し、右中葉をｍＲＮＡ分析のためにサンプリングした。ブデソニドが細胞分裂、細胞死、炎症および初期傷害マーカーのためのタンパク質の発現を変化させるかどうかを試験するために、ｍＲＮＡ－ＳｅｑによるｍＲＮＡ発現の分析のために、脳、腸、および肝組織を選択的に採取した。このアプローチは、組織中のブデソニド濃度を測定するよりも感度が高く、決定的であった。動物群は肺の炎症を分析し、他の臓器に対するブデソニドの影響を評価するためのものである。

【0129】

本検討では、機械的人工換気誘発肺および全身損傷に対する低用量のブデソニドの効果を評価した。これまでの結果に基づき、損傷マーカーおよび生理学的作用に対するブデソニドへの最大効果を得るために６時間時点を選択した。動物には有害および非有害換気の両方を使用した。２０１７年に先に完了していた動物群を、いくつかの重複群との比較のために使用した。生理学的変数と損傷のマーカーを、群と前年の間で比較した。結果は、平均±SEMとして示され、対照値を１に設定して、対照に対する増加倍数として報告された。換気効率指数(ＶＥＩ)[３８００/(ＰＩＰ×比×ＰａＣＯ_２)]および酸素化指数(ＯＩ)[ＦｉＯ_２×平均気道圧]/ＰａCO２]を計算した（Notter、R.H.ら、「ウシ肺洗浄から抽出した脂肪を伴う肺サーファクタント置換：線量、分散技術、およびジェスチャ年齢の影響」、Pediatr Res,1985,19（6）: p.569‐77およびPolglase,G.R.ら、「持続的陽気道圧または従来の換気に対する早産子羊における肺および全身性炎症」、Pediatr Res、2009.65（1）: p. 67‐71 )。統計は、適宜、Studentのｔ検定、Mann－Whitneyノンパラメトリック、またはＡＮＯＶＡ検定を用いて、Ｐｒｉｓｍ ６（Graphpad）を用いて分析した。有意性はｐ＜０．０５とした。

【0130】

さらに、右中葉の末梢肺組織、および肝臓から、メッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)をＴＲＩｚｏｌ(Invitrogen)で抽出した。ｃＤＮＡを、Verso cDNAキット（Thermoscientific）を使用して１μｇのｍＲＮＡから産生した。上皮性ナトリウムチャネル（ＥＮａＣ）、エピレギュリン（ＥＲＥＧ）、インターロイキン１s（ＩＬ－１s）、ＩＬ－６、ＩＬ－８、モノサイトケモアトラクタントプロテイン－１（ＭＣＰ－１）、血清アミロイドＡ３（ＳＡＡ３）、肺サーファクタントたんぱく質Ｂ(ＳＦＴＰＢ)、およびＴＮＦ－αに対して、羊の配列に対するカスタムＴａｑｍａｎ遺伝子プライマー（ライフテクノロジー）を用いた。定量的ＲＴ－ＰＣＲは、CFX Connectマシンおよびソフトウェア（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上で１５μＬの反応中でiTaq Universal mix(Bio-Rad)を用いて実施した。１８Ｓプライマー (Life Technologies)を内部負荷対照として使用した。

【0131】

結果
平均気道圧（ＭＡＰ）および４０ｃｍＨ_２Ｏ(Ｖ４０／ｋｇ）での体積を図２に報告し、圧力－体積曲線からのＶ４０／Ｋｇの外挿を公知の方法に従って行った。

【0132】

気管支肺異形成症（ＢＰＤ）の病因の中心は、出生後の人工呼吸および酸素毒性による大量の肺炎症反応の誘発である。炎症誘発性反応の程度およびさらなる肺胞の成長および血管新生の障害は、実際、最初の２４時間における肺機能および換気管理によって特徴づけることができる。

【0133】

この点に関して、肺損傷の貴重な統合マーカー（肺または炎症に放出される蛋白質は浮腫を引き起こし、無気肺、ボルトラウマ、および高酸素濃度曝露が促進される悪循環を引き起こす界面活性剤を不活性化する）として、６時間での圧力－体積カーブから４０ｃｍのＨ２Ｏの体積は、ＢＰＤ発症の危険性の実験的な重大な代理物を構成する。

【0134】

その結果、Ｖ４０／ｋｇは、ブデソニド０．１ｍｇ／ｋｇおよび０．０４ｍｇ／ｋｇの方が界面活性剤のみの動物よりも有意に高かった。

【0135】

さらに、０．２５ｍｇ／ｋｇまたは０．１ｍｇ／ｋｇを投与した動物では、平均気道内圧必要量が減少した。しかし、正の傾向はあるもの、０．０４ｍｇ／ｋｇを投与した群については、その値は有意な変動には達しなかった。損傷に対する肺ｍＲＮＡ評価の結果を図３に報告する。

【0136】

損傷性人工換気は、非損傷性換気よりも、炎症誘発性サイトカインＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＭＣＰ－１のｍＲＮＡの大幅な増加を引き起こす（図３）。ブデソニド０．２５ｍｇ／ｋｇは、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＭＣＰ－１のｍＲＮＡを減少させた。ブデソニド０．１ｍｇ／ｋｇはＩＬ－６ ｍＲＮＡを減少させ、ＭＣＰ－１を減少させる強い傾向を示した（ｐ＝０．０６）。反応には大きなばらつきがあったが、０．０４ｍｇ／ｋｇ投与群でもわずかな減少傾向が認められた。

【0137】

ENaC mRNAは、すべての用量のブデソニドについて、機械的人工換気に伴って増加するサーファクタントのみを超えてさらに増加した。いずれの用量においても、ＳＦＴＰＢまたはＳＡＡ３には、サーファクタントのみの動物と比較して変化は認められなかった。人工呼吸に対する肝臓のｍＲＮＡ応答の結果を図４に報告する。

【0138】

機械的換気は肝臓のＳＡＡ３、ＭＣＰ－１、ＩＬ－６ｍＲＮＡを増加させた。肝臓におけるｍＲＮＡ増加の大きな変動は、非有害な機械的換気および有害な機械的換気で見出された（図４）。ブデソニド０．１ｍｇ／ｋｇは肝臓ＳＡＡ３ ｍＲＮＡを減少させた。ブデソニド０．２５ｍｇ／ｋｇおよび０．１ｍｇ／ｋｇは非損傷換気で肝臓ＭＣＰ－１ ｍＲＮＡを減少させたが、損傷を伴うＭＣＰ－１を減少させたのは０．２５ｍｇ／ｋｇのみであった（損傷動物における大きな変動による）。

【0139】

数値の限界または範囲を参照する場合、端点、ならびに前記範囲内に入るすべての値および部分範囲は、具体的に含まれ、開示される。

【0140】

本明細書で使用されるように、用語「ａ」および「ａｎ」は、「１つまたは複数」を意味するものとして解釈されるべきである。

【0141】

全ての引用された先行技術文献は、参照により本明細書に完全に組み込まれる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】