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特許7378712異種移植用材料の病原体感染を検査する方法、検査キット及び病原体感染が評価された異種移植用材料製品の作成方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-11-06
(45)【発行日】2023-11-14
(54)【発明の名称】異種移植用材料の病原体感染を検査する方法、検査キット及び病原体感染が評価された異種移植用材料製品の作成方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/686 20180101AFI20231107BHJP
C12Q 1/6893 20180101ALI20231107BHJP
C12Q 1/689 20180101ALI20231107BHJP
C12Q 1/70 20060101ALI20231107BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20231107BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20231107BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/686 Z ZNA
C12Q1/6893 Z
C12Q1/689 Z
C12Q1/70
C12M1/00 A
C12N15/09 Z
【請求項の数】
16
(21)【出願番号】P 2019145840
(22)【出願日】2019-08-07
(65)【公開番号】P2021023243
(43)【公開日】2021-02-22
【審査請求日】2022-06-10
(73)【特許権者】
【識別番号】503420833
【氏名又は名称】学校法人常翔学園
(73)【特許権者】
【識別番号】518232087
【氏名又は名称】株式会社ポル・メド・テック
(74)【代理人】
【識別番号】100131705
【弁理士】
【氏名又は名称】新山 雄一
(74)【代理人】
【識別番号】100114292
【弁理士】
【氏名又は名称】来間 清志
(72)【発明者】
【氏名】井上 亮
(72)【発明者】
【氏名】諸岡 晃
【審査官】山本 晋也
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１１／００７６６７３（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特開２０１９－０５８１６８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１０－０５７４９５（ＪＰ，Ａ）
【文献】Satoko NAKANO et al.，“Establishment of Multiplex Solid-Phase Strip PCR Test for Detectionof 24 Ocular Infectious Disease Pathogens”，InvestigativeOpthalmology & Visual Science，2017年03月10日，Vol. 58, No. 3，p.1553，DOI:10.1167/iovs.16-20556
【文献】Shaun WYNYARD et al.，“Microbiological safety of the first clinical pig isletxenotransplantation trial in New Zealand”，Xenotransplantation，2014年05月07日，Vol. 21, No. 4，p.309-323，DOI: 10.1111/xen.12102
【文献】John RACHLIN et al.，“Computational tradeoffs in multiplex PCR assay design for SNPgenotyping”，BMC Genomics，Vol. 6，No. 1，p. 1-11，DOI: 10.1186/1471-2164-6-102
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ
Ｃ１２Ｎ
Ｃ１２Ｍ
Ｇ０１Ｎ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
２種類以上の細菌と、ウイルス又は原虫とを含む病原体の感染を遺伝子検査する工程を含み、前記２種類以上の細菌の遺伝子検査において、少なくとも２種類の細菌間の共通塩基配列に対するプライマーを用いて細菌の種の特定は行わずに細菌の存否の検出を行う、異種移植用材料の病原体感染を検査する方法。
【請求項2】
前記共通塩基配列は、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡの保存領域に含まれる配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記保存領域が、レプトスピラ属菌、マイコプラズマ属菌、カンピロバクター属菌、エルシニア属菌、大腸菌属菌及びサルモネラ属菌の各々の１６Ｓ ｒＲＮＡに少なくとも共通する保存領域である、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記保存領域が、可変領域としてＶ３及びＶ４可変領域のみを含む領域、又は、可変領域としてＶ３及びＶ４可変領域のみを挟み込む複数の保存領域である、請求項２に記載の方法。
【請求項5】
前記ウイルス又は原虫による感染の遺伝子検査が、前記ウイルス又は原虫の核酸に選択的に結合するプライマーを用いて、前記感染に係る前記ウイルス又は原虫の種の特定を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記保存領域がＶ３及びＶ４領域を含む領域である、請求項２に記載の方法。
【請求項7】
前記２種類以上の細菌の遺伝子検査で用いるプライマー対は１対である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
前記２種類以上の細菌の感染の遺伝子検査と、前記ウイルス又は原虫の感染の遺伝子検査とを、同一のサーマルサイクル条件のＰＣＲ法により行い、かつ使用する全プライマーの融解温度差が１５℃以下である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
前記病原体感染が、人獣共通感染症の原因となる感染である、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
ウイルスによる感染を遺伝子検査する前記工程が、５種類以上のウイルスによる感染を、各々のウイルスの核酸に選択的に結合するプライマー対を用いてＰＣＲ法により検査する工程であり、又は原虫による感染を遺伝子検査する前記工程が、２種類以上の原虫による感染を、各々の原虫の核酸に選択的に結合するプライマー対を用いてＰＣＲ法により検査する工程である、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
前記異種移植用材料が、ブタ由来の異種移植用材料である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
前記ウイルスが、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス、ブタサーコウイルス２型、ブタインフルエンザウイルスＨ１Ｎ１型、ブタリンパ球向性ヘルペスウイルス、ブタサイトメガロウイルス及びＥ型肝炎ウイルスを含み、又は前記原虫がトキソプラズマを含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
少なくとも２種類の細菌間の共通塩基配列に対するプライマーと、少なくとも１種類のウイルス又は原虫の核酸に選択的に結合するプライマーとを含む、異種移植用材料の病原体感染を検査するためのキットであって、前記少なくとも２種類の細菌の遺伝子検査については細菌の種の特定は行わずに細菌の存否の検出を行うための、前記キット。
【請求項14】
少なくとも２種類の細菌間の共通塩基配列に対するプライマーと、少なくとも１種類のウイルス又は原虫の核酸に選択的に結合するプライマーとを含む検査キットであって、
前記共通塩基配列は、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡの保存領域に含まれる配列であり、
前記保存領域が、レプトスピラ属菌、マイコプラズマ属菌、カンピロバクター属菌、エルシニア属菌、大腸菌属菌及びサルモネラ属菌の各々の１６Ｓ ｒＲＮＡに少なくとも共通する保存領域であり、前記少なくとも２種類の細菌の遺伝子検査については細菌の種の特定は行わずに細菌の存否の検出を行うための、前記検査キット。
【請求項15】
少なくとも２種類の細菌間の共通塩基配列に対するプライマーと、少なくとも１種類のウイルス又は原虫の核酸に選択的に結合するプライマーとを含む検査キットであって、
前記共通塩基配列は、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡの保存領域に含まれる配列であり、
前記保存領域が、可変領域としてＶ３及びＶ４可変領域のみを含む領域、又は、可変領域としてＶ３及びＶ４可変領域のみを挟み込む複数の保存領域であり、前記少なくとも２種類の細菌の遺伝子検査については細菌の種の特定は行わずに細菌の存否の検出を行うための、前記検査キット。
【請求項16】
請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法を実施する工程を含む、病原体感染が評価された異種移植用材料製品の作成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、複数種の病原体検査を簡便に行うことができる異種移植用材料の病原体感染を検査する方法、検査キット及び病原体感染が評価された異種移植用材料製品の作成方法に関する。
【背景技術】
【0002】
異種移植の動物種としては、ヒト以外の哺乳類（例えば、ブタ、ウシ、霊長類等）が挙げられるが感染症リスクが伴う。異種移植ドナーとして最も研究が進んでいる動物種はブタであるが、ブタは感染症に罹患しやすい。例えば、ブタサーコウイルス関連疾患（ＰＣＶＡＤ）、ブタ生殖器・呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）、ブタ流行性下痢（ＰＥＤ）、ブタコレラなどの感染症は世界中のブタの個体数に深刻な影響を及ぼすほどである。
【0003】
異種移植ドナーとして最も研究が進んでいるブタに関し、異種移植のドナーとなるのはＤＰＦ（Ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｆｒｅｅ）ブタと呼ばれる、閉鎖系のよく管理された環境において、医療用として飼育された感染症、特に人獣共通感染症のリスクを排除したブタが多い。
ニュージーランド、アメリカ等では既にＤＰＦブタが確立され、企業ベースで運用されている（例えば、非特許文献１及び２）。
例えば、ニュージーランドでのＤＰＦブタの検査対象病原体数は２７種類であり、１０種の病原菌、１５種のウイルス、１種の原虫の病原体検査が定期的（対象病原体により１年に１回又は４回）に行われており、同国において、上記病原体検出方法はＥＬＩＳＡ、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応；ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲを含む）が中心である。
ニュージーランド、アメリカ等では既にＤＰＦブタが確立され、企業ベースで運用されている（例えば、非特許文献１及び２）。
例えば、ニュージーランドでのＤＰＦブタの検査対象病原体数は２７種類であり、１０種の病原菌、１５種のウイルス、１種の原虫の病原体検査が定期的（対象病原体により１年に１回又は４回）に行われており、同国において、上記病原体検出方法はＥＬＩＳＡ、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応；ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲを含む）が中心である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【文献】Ｗｙｎｙａｒｄ Ｓ，Ｎａｔｈｕ Ｄ，Ｇａｒｋａｖｅｎｋｏ Ｏ， ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｉｇ ｉｓｌｅｔ ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｔｒｉａｌ ｉｎ Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ． Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ２０１４；２１：３０９‐３２３．
【文献】Ｆｉｓｈｍａｎ ＪＡ． Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｉｓｋｓ ｉｎ ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ａｍ Ｊ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２０１８；１８：１８５７－１８６４．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
上述のような異種移植用動物（例えば、ブタ、ウシ、霊長類等）に関する複数種類の病原体（例えば、複数種類の細菌、ウイルス、原虫）感染を検査するに際し、個々の病原体毎にＰＣＲ等により検査するのでは、手間、時間及び費用を要し検査の実用性としては現実的ではなく、複数種類の病原体感染を、できるだけ少ない回数で検査し得る手法が求められる。
【0006】
例えば、ＰＣＲ法により複数種類の病原体感染を、できるだけ少ない回数で検査する場合、同一のＰＣＲ反応に使う各プライマーの融解温度（Ｔｍ値）が、ＰＣＲにおけるアニーリング工程との相関性の観点から所定の差に収まるように設計すること等が要求される。
しかし、上述のように、検査対象の病原体の種類が増えるほど、同一のＰＣＲ反応に使う各プライマーの融解温度（Ｔｍ値）が所定の差に収まるように設計することは困難になってくる。
しかし、上述のように、検査対象の病原体の種類が増えるほど、同一のＰＣＲ反応に使う各プライマーの融解温度（Ｔｍ値）が所定の差に収まるように設計することは困難になってくる。
【0007】
本発明は、このような従来技術の実情に鑑みてなされたものであり、複数種類の病原体検査を簡便に行うことができる異種移植用材料の病原体感染を検査する方法、検査キット及び病原体感染が評価された異種移植用材料製品の作成方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
異種移植用材料の病原体感染検査において、ウイルスや原虫は検出される種が重要なのに対し、細菌は種類いかんを問わず感染した時点で、その異種移植用材料は移植材料としては忌避すべきことに、本発明者らは着目した。
そこで、本発明者らは、少なくとも２種類の細菌間の共通塩基配列に対するプライマーを用い、細菌の種の特定ではなく存否の検出にフォーカスすることにより、検査を簡便化し得ることを見出した。本発明は、上記知見に基づき完成されるに至ったものである。
すなわち本発明は以下の通りである。
そこで、本発明者らは、少なくとも２種類の細菌間の共通塩基配列に対するプライマーを用い、細菌の種の特定ではなく存否の検出にフォーカスすることにより、検査を簡便化し得ることを見出した。本発明は、上記知見に基づき完成されるに至ったものである。
すなわち本発明は以下の通りである。
【0009】
＜１＞２種類以上の細菌と、ウイルス又は原虫とを含む病原体の感染を遺伝子検査する工程を含み、前記２種類以上の細菌の遺伝子検査において、少なくとも２種類の細菌間の共通塩基配列に対するプライマーを用いる、異種移植用材料の病原体感染を検査する方法。
＜２＞前記共通塩基配列は、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡの保存領域に含まれる配列である、＜１＞に記載の方法。
＜３＞前記保存領域が、レプトスピラ属菌、マイコプラズマ属菌、カンピロバクター属菌、エルシニア属菌、大腸菌属菌及びサルモネラ属菌の各々の１６Ｓ ｒＲＮＡに少なくとも共通する保存領域である、＜２＞に記載の方法。
＜４＞前記保存領域がＶ３及びＶ４領域を含む領域である、＜２＞に記載の方法。
＜５＞前記２種類以上の細菌の遺伝子検査で用いるプライマー対は１対である、＜１＞～＜４＞のいずれか１項に記載の方法。
＜６＞前記２種類以上の細菌の感染の遺伝子検査と、前記ウイルス又は原虫の感染の遺伝子検査とを、同一のサーマルサイクル条件のＰＣＲ法により行い、かつ使用する全プライマーの融解温度差が１５℃以下である、＜１＞～＜５＞のいずれか１項に記載の方法。
＜７＞前記病原体感染が、人獣共通感染症の原因となる感染である、＜１＞～＜６＞のいずれか１項に記載の方法。
＜８＞ウイルスによる感染を遺伝子検査する前記工程が、５種類以上のウイルスによる感染を、各々のウイルスの核酸に選択的に結合するプライマー対を用いてＰＣＲ法により検査する工程であり、又は
原虫による感染を遺伝子検査する前記工程が、２種類以上の原虫による感染を、各々の原虫の核酸に選択的に結合するプライマー対を用いてＰＣＲ法により検査する工程である、＜１＞～＜７＞のいずれか１項に記載の方法。
＜９＞
前記異種移植用材料が、ブタ由来の異種移植用材料である、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
＜１０＞前記ウイルスが、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス、ブタサーコウイルス２型、ブタインフルエンザウイルスＨ１Ｎ１型、ブタリンパ球向性ヘルペスウイルス、ブタサイトメガロウイルス及びＥ型肝炎ウイルスを含み、又は前記原虫がトキソプラズマを含む、＜１＞～＜９＞のいずれか１項に記載の方法。
＜１１＞少なくとも２種類の細菌間の共通塩基配列に対するプライマーと、少なくとも１種類のウイルス又は原虫の核酸に選択的に結合するプライマーとを含む検査キット。
＜１２＞上記＜１＞～＜１０＞のいずれか１項に記載の方法を実施する工程を含む、病原体感染が評価された異種移植用材料製品の作成方法。
＜２＞前記共通塩基配列は、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡの保存領域に含まれる配列である、＜１＞に記載の方法。
＜３＞前記保存領域が、レプトスピラ属菌、マイコプラズマ属菌、カンピロバクター属菌、エルシニア属菌、大腸菌属菌及びサルモネラ属菌の各々の１６Ｓ ｒＲＮＡに少なくとも共通する保存領域である、＜２＞に記載の方法。
＜４＞前記保存領域がＶ３及びＶ４領域を含む領域である、＜２＞に記載の方法。
＜５＞前記２種類以上の細菌の遺伝子検査で用いるプライマー対は１対である、＜１＞～＜４＞のいずれか１項に記載の方法。
＜６＞前記２種類以上の細菌の感染の遺伝子検査と、前記ウイルス又は原虫の感染の遺伝子検査とを、同一のサーマルサイクル条件のＰＣＲ法により行い、かつ使用する全プライマーの融解温度差が１５℃以下である、＜１＞～＜５＞のいずれか１項に記載の方法。
＜７＞前記病原体感染が、人獣共通感染症の原因となる感染である、＜１＞～＜６＞のいずれか１項に記載の方法。
＜８＞ウイルスによる感染を遺伝子検査する前記工程が、５種類以上のウイルスによる感染を、各々のウイルスの核酸に選択的に結合するプライマー対を用いてＰＣＲ法により検査する工程であり、又は
原虫による感染を遺伝子検査する前記工程が、２種類以上の原虫による感染を、各々の原虫の核酸に選択的に結合するプライマー対を用いてＰＣＲ法により検査する工程である、＜１＞～＜７＞のいずれか１項に記載の方法。
＜９＞
前記異種移植用材料が、ブタ由来の異種移植用材料である、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
＜１０＞前記ウイルスが、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス、ブタサーコウイルス２型、ブタインフルエンザウイルスＨ１Ｎ１型、ブタリンパ球向性ヘルペスウイルス、ブタサイトメガロウイルス及びＥ型肝炎ウイルスを含み、又は前記原虫がトキソプラズマを含む、＜１＞～＜９＞のいずれか１項に記載の方法。
＜１１＞少なくとも２種類の細菌間の共通塩基配列に対するプライマーと、少なくとも１種類のウイルス又は原虫の核酸に選択的に結合するプライマーとを含む検査キット。
＜１２＞上記＜１＞～＜１０＞のいずれか１項に記載の方法を実施する工程を含む、病原体感染が評価された異種移植用材料製品の作成方法。
【発明の効果】
【0010】
本発明によれば、複数種の病原体検査を簡便に行うことができる異種移植用材料の病原体感染を検査する方法、検査キット及び病原体感染が評価された異種移植用材料製品の作成方法を提供し得る。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【発明を実施するための形態】
【0012】
以下、本発明の実施態様について詳細に説明するが、本発明は、以下の実施態様に何ら限定されるものではなく、本発明の目的の範囲内において、適宜変更を加えて実施することができる。
【0013】
≪異種移植用材料の病原体感染を検査する方法≫
本発明の第１の態様は、２種類以上の細菌と、ウイルス又は原虫とを含む病原体の感染を遺伝子検査する工程を含み、上記２種類以上の細菌の遺伝子検査において、少なくとも２種類の細菌間の共通塩基配列に対するプライマーを用いる、異種移植用材料の病原体感染を検査する方法である。
第１の態様は、個々の病原体毎に異なるプライマーセット（以下、「プライマー対」ともいう。；Ｆｏｒｗａｒｄプライマー（Ｆプライマー）及びＲｅｖｅｒｓｅプライマー（Ｒプライマー）の対）を用いて同様の検査作業を行う重複的な作業を、少なくとも２種類の細菌間の共通塩基配列に対するプライマーを用いることにより少なくとも低減し得る。
上記２種類以上の細菌の遺伝子検査する工程、及び上記ウイルス又は原虫の遺伝子検査する工程はいずれもＰＣＲ法により検査する工程であることが好ましい。
本発明の第１の態様は、２種類以上の細菌と、ウイルス又は原虫とを含む病原体の感染を遺伝子検査する工程を含み、上記２種類以上の細菌の遺伝子検査において、少なくとも２種類の細菌間の共通塩基配列に対するプライマーを用いる、異種移植用材料の病原体感染を検査する方法である。
第１の態様は、個々の病原体毎に異なるプライマーセット（以下、「プライマー対」ともいう。；Ｆｏｒｗａｒｄプライマー（Ｆプライマー）及びＲｅｖｅｒｓｅプライマー（Ｒプライマー）の対）を用いて同様の検査作業を行う重複的な作業を、少なくとも２種類の細菌間の共通塩基配列に対するプライマーを用いることにより少なくとも低減し得る。
上記２種類以上の細菌の遺伝子検査する工程、及び上記ウイルス又は原虫の遺伝子検査する工程はいずれもＰＣＲ法により検査する工程であることが好ましい。
【0014】
本発明において、ＰＣＲ法は、標準的なＰＣＲ法（ｓｔａｎｄａｒｄＰＣＲ）であってもなくてもよく、ＲＮＡウイルス（インフルエンザウイルス等）を検出する観点から、ＲＮＡを鋳型とし、逆転写酵素によって、一旦、相補的なｃＤＮＡ合成してからＰＣＲを行う、いわゆるＲＴ－ＰＣＲ法であってもなくてもよい。
また、ＰＣＲ法は、定量性を高める観点から、リアルタイムＰＣＲ法（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ）であってもなくてもよい。
更に、ＰＣＲ法は、特異性及び収率を向上させる等の観点からネステッドＰＣＲ法（ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）等の変法であってもなくてもよい。
また、ＰＣＲ法は、定量性を高める観点から、リアルタイムＰＣＲ法（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ）であってもなくてもよい。
更に、ＰＣＲ法は、特異性及び収率を向上させる等の観点からネステッドＰＣＲ法（ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）等の変法であってもなくてもよい。
【0015】
検査対象である異種移植用材料としては、任意の異種移植用動物由来の材料が挙げられ、異種移植用動物としては、ブタ、ウシ、ヒツジ、霊長類（例えば、チンパンジー、サル）等が挙げられ、ブタが好ましい。
上記異種移植用材料としては、例えば、臓器（肝臓、腎臓、膵臓、心臓等）、血液、尿、汗等が挙げられ、臓器又は血液が好ましい。
上記異種移植用動物としては特に制限はなく、野生型であっても、閉鎖系のよく管理された環境において、医療用として飼育された感染症、特に人獣共通感染症のリスクを排除した動物（例えば、ブタの場合ＤＰＦブタ）であってもよい。上記ＤＰＦブタとしては、ＵｉＲ法にて飼育されたブタが挙げられる。
上記異種移植用材料としては、例えば、臓器（肝臓、腎臓、膵臓、心臓等）、血液、尿、汗等が挙げられ、臓器又は血液が好ましい。
上記異種移植用動物としては特に制限はなく、野生型であっても、閉鎖系のよく管理された環境において、医療用として飼育された感染症、特に人獣共通感染症のリスクを排除した動物（例えば、ブタの場合ＤＰＦブタ）であってもよい。上記ＤＰＦブタとしては、ＵｉＲ法にて飼育されたブタが挙げられる。
【0016】
第１の態様において、遺伝子検査される細菌の種類としては、２種類以上である限り特に制限はなく、５種類以上が好ましく、１０種類以上がより好ましく、１５種類以上が更に好ましい。
遺伝子検査される細菌の種類の上限値としては特に制限はないが、例えば、細菌１００種類以下、細菌８０種類以下である。
上記遺伝子検査される細菌全種類のうち、上記少なくとも２種類の細菌間の共通塩基配列に対するプライマーを用いて遺伝子検査される細菌の種類が５０％以上を占めることが好ましく、７０％以上を占めることがより好ましく、９０％以上を占めることが更に好ましい。
上記２種類以上の細菌の遺伝子検査で用いるプライマーは少なくとも２種類の細菌間の共通塩基配列に対する配列を含む限り特に制限されず、例えば、上記配列に加えて任意の他の配列を含むものであり得る。上記プライマーの塩基長としても、少なくとも２種類の細菌間の共通塩基配列と選択的に結合し得るというプライマーとしての機能を発揮する程度の長さであれば特に制限されず、例えば、１０～５０塩基の長さが挙げられ、１２～４０塩基の長さが好ましく、１５～３０塩基の長さがより好ましい。
上記２種類以上の細菌の遺伝子検査で用いるプライマーは、２対以上（例えば、２対、３対、４対、・・・・・１０対）のプライマー対であってもよいが、検査の煩雑性を回避する観点から、１対のプライマー対であることが好ましい。
上記２種類以上の細菌の遺伝子検査で用いるプライマーとしては、少なくとも２種類の細菌間の共通塩基配列に対するプライマーの他に、他の細菌（例えば、上記共通塩基配列を有さない細菌）を検出するために、上記他の細菌の核酸に選択的に結合するプライマーを併用してもしなくてもよい。
遺伝子検査される細菌の種類の上限値としては特に制限はないが、例えば、細菌１００種類以下、細菌８０種類以下である。
上記遺伝子検査される細菌全種類のうち、上記少なくとも２種類の細菌間の共通塩基配列に対するプライマーを用いて遺伝子検査される細菌の種類が５０％以上を占めることが好ましく、７０％以上を占めることがより好ましく、９０％以上を占めることが更に好ましい。
上記２種類以上の細菌の遺伝子検査で用いるプライマーは少なくとも２種類の細菌間の共通塩基配列に対する配列を含む限り特に制限されず、例えば、上記配列に加えて任意の他の配列を含むものであり得る。上記プライマーの塩基長としても、少なくとも２種類の細菌間の共通塩基配列と選択的に結合し得るというプライマーとしての機能を発揮する程度の長さであれば特に制限されず、例えば、１０～５０塩基の長さが挙げられ、１２～４０塩基の長さが好ましく、１５～３０塩基の長さがより好ましい。
上記２種類以上の細菌の遺伝子検査で用いるプライマーは、２対以上（例えば、２対、３対、４対、・・・・・１０対）のプライマー対であってもよいが、検査の煩雑性を回避する観点から、１対のプライマー対であることが好ましい。
上記２種類以上の細菌の遺伝子検査で用いるプライマーとしては、少なくとも２種類の細菌間の共通塩基配列に対するプライマーの他に、他の細菌（例えば、上記共通塩基配列を有さない細菌）を検出するために、上記他の細菌の核酸に選択的に結合するプライマーを併用してもしなくてもよい。
【0017】
上記２種類以上の細菌の遺伝子検査で用いるプライマーのＴｍ値としては、ゲノム遺伝子（例えば、ブタゲノム遺伝子）等との非特異的アニーリングを回避する観点から、５０℃以上であることが好ましく、５５℃以上であることがより好ましい。
また、プライマーのＴｍ値の上限値としては特に制限はないが、例えば、８０℃以下であり、好ましくは７５℃以下である。
上記少なくとも２種類の細菌間の共通塩基配列に対するプライマーは、３種類以上の細菌間の共通塩基配列に対するプライマーが好ましく、５種類以上の細菌間の共通塩基配列に対するプライマーがより好ましく、１０種類以上の細菌間の共通塩基配列に対するプライマーが更に好ましく、１５種類以上の細菌間の共通塩基配列に対するプライマーが特に好ましく、２０種類以上の細菌間の共通塩基配列に対するプライマーが最も好ましい。
上限値としては特に制限はないが、例えば、細菌１００種類以下、細菌８０種類以下である。
また、プライマーのＴｍ値の上限値としては特に制限はないが、例えば、８０℃以下であり、好ましくは７５℃以下である。
上記少なくとも２種類の細菌間の共通塩基配列に対するプライマーは、３種類以上の細菌間の共通塩基配列に対するプライマーが好ましく、５種類以上の細菌間の共通塩基配列に対するプライマーがより好ましく、１０種類以上の細菌間の共通塩基配列に対するプライマーが更に好ましく、１５種類以上の細菌間の共通塩基配列に対するプライマーが特に好ましく、２０種類以上の細菌間の共通塩基配列に対するプライマーが最も好ましい。
上限値としては特に制限はないが、例えば、細菌１００種類以下、細菌８０種類以下である。
【0018】
１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）は全ての細菌が共有し得る。１６ＳｒＲＮＡは細菌種を超えて保存性が高い領域（例えば、保存領域Ｃ１～Ｃ９）を有する。
上記共通塩基配列は、本発明の効果をより確実に達成する観点から細菌１６Ｓ ｒＲＮＡの保存領域に含まれる配列が好ましい。
複数の細菌間で保存性が高い観点から、上記保存領域がＶ３及びＶ４可変領域を含む領域（又は挟み込む複数の領域）であることが好ましい。
Ｖ３及びＶ４可変領域を含む領域に対するプライマー対として下記を例示するが本発明におけるプライマー対としてはこれらに限定されない。
３４１Ｆ：５’－ＣＣＴＡＣＧＧＧＮＧＧＣＷＧＣＡＧ－３’（配列番号１）
８０５Ｒ：５’－ＧＡＣＴＡＣＨＶＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣ－３’（配列番号２）
上記共通塩基配列は、本発明の効果をより確実に達成する観点から細菌１６Ｓ ｒＲＮＡの保存領域に含まれる配列が好ましい。
複数の細菌間で保存性が高い観点から、上記保存領域がＶ３及びＶ４可変領域を含む領域（又は挟み込む複数の領域）であることが好ましい。
Ｖ３及びＶ４可変領域を含む領域に対するプライマー対として下記を例示するが本発明におけるプライマー対としてはこれらに限定されない。
３４１Ｆ：５’－ＣＣＴＡＣＧＧＧＮＧＧＣＷＧＣＡＧ－３’（配列番号１）
８０５Ｒ：５’－ＧＡＣＴＡＣＨＶＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣ－３’（配列番号２）
【0019】
２種類以上の細菌と、ウイルス又は原虫とを含む病原体である検査対象は、２種類以上の細菌と、ウイルス及び原虫の両方とを含む病原体が好ましい。
また、検査対象として、トリコフィトン属他皮膚糸状菌等の真菌類も含んでいてもいなくてもよい。
検査対象となる細菌、ウイルス、及び原虫としては、人獣共通感染症、動物感染症（例えば、ブタ感染症）又はヒト感染症の原因となる細菌、ウイルス、及び原虫が挙げられ、人獣共通感染症の原因となる細菌、ウイルス、及び原虫が好ましい。
検査対象となる上記少なくとも２種類の細菌の例としては、下記具体例から選択される少なくとも２種類の細菌が挙げられる。
具体例：エルシニア菌、気管支敗血症菌、クロストリジウム、結核（ヒト型、ウシ型、鳥型）、サルモネラ、大腸菌、炭疽菌、ブタ丹毒菌、パスツレラ菌、ブタ赤痢菌、ヘモフィルス菌、ブドウ球菌、ブルセラ菌、ヘモパルトネラ、マイコプラズマ、リステリア菌、アクチノバチルス菌、連鎖球菌、緑膿菌、ブタアクチノミセス、キャンピロバクター属、アクチノバチルス属、クラミジア、コクシエラ、ローソニア、レプトスピラ（レプトピラ）、ブタペロスロゾーン。
また、検査対象として、トリコフィトン属他皮膚糸状菌等の真菌類も含んでいてもいなくてもよい。
検査対象となる細菌、ウイルス、及び原虫としては、人獣共通感染症、動物感染症（例えば、ブタ感染症）又はヒト感染症の原因となる細菌、ウイルス、及び原虫が挙げられ、人獣共通感染症の原因となる細菌、ウイルス、及び原虫が好ましい。
検査対象となる上記少なくとも２種類の細菌の例としては、下記具体例から選択される少なくとも２種類の細菌が挙げられる。
具体例：エルシニア菌、気管支敗血症菌、クロストリジウム、結核（ヒト型、ウシ型、鳥型）、サルモネラ、大腸菌、炭疽菌、ブタ丹毒菌、パスツレラ菌、ブタ赤痢菌、ヘモフィルス菌、ブドウ球菌、ブルセラ菌、ヘモパルトネラ、マイコプラズマ、リステリア菌、アクチノバチルス菌、連鎖球菌、緑膿菌、ブタアクチノミセス、キャンピロバクター属、アクチノバチルス属、クラミジア、コクシエラ、ローソニア、レプトスピラ（レプトピラ）、ブタペロスロゾーン。
【0020】
上記少なくとも２種類の細菌としては、レプトスピラ属菌、マイコプラズマ属菌、カンピロバクター属菌、エルシニア属菌、大腸菌属菌及びサルモネラ属菌よりなる群から選択される少なくとも２種類が好ましく、上記保存領域が、レプトスピラ属菌、マイコプラズマ属菌、カンピロバクター属菌、エルシニア属菌、大腸菌属菌及びサルモネラ属菌の各々の１６ＳｒＲＮＡに少なくとも共通する保存領域が好ましい。
【0021】
検査対象となるウイルスとして、具体的には、ブタサーコウイルス１型、ブタサーコウイルス２型、ブタリンパ球向性ヘルペスウイルス１型、ブタリンパ球向性ヘルペスウイルス２型、ブタサイトメガロウイルス、脳心筋炎ウイルス、ブタパルボウイルス、ブタロタウイルスＡ、ブタロタウイルスＢアメリカ型、ブタロタウイルスＢベトナム型、ブタロタウイルスＣ、哺乳類レオウイルス、ブタエンテロウイルス、ブタ赤血球凝集性脳脊髄炎ウイルス、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス、ブタインフルエンザウイルスＨ１Ｎ１型、ブタインフルエンザウイルスＨ３Ｎ２型、ブタ呼吸器コロナウイルス、ブタコレラウイルス、ブタポックスウイルス、アフリカトンコレラウイルス、オーエスキー病ウイルス、ゲタウイルス、日本脳炎ウイルス、ブタ流行性下痢ウイルス、ブタ水疱病ウイルス、ブタ水疱疹ウイルス、水疱性口炎ウイルスｎｅｗ ｊｅｒｓｅｙ、水疱性口炎ウイルスｉｎｄｉａｎａ、口蹄疫ウイルス、狂犬病ウイルス１、狂犬病ウイルス２、狂犬病ウイルス３、狂犬病ウイルス４、狂犬病ウイルス５、狂犬病ウイルス６、狂犬病ウイルス７、ブタアデノウイルス、ブタアストロウイルス１、ブタアストロウイルス２、ブタアストロウイルス３、ブタアストロウイルス４、ブタアストロウイルス５、メナングルウイルス、ニパウイルス、ハンタウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス１、東部ウマ脳炎ウイルス２、東部ウマ脳炎ウイルス３、東部ウマ脳炎ウイルス４、西部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ボルナウイルス、アポイウイルス、ポリオーマウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス１型、ウシウイルス性下痢ウイルス２型、ウシウイルス性下痢ウイルス３型、ウシ伝染性鼻気管支炎ウイルス、ブタトルクテノウイルス１型、ブタトルクテノウイルス２型、サポウイルス３型、サポウイルス６型、サポウイルス７ａ型、サポウイルス７ｂ型、サポウイルス７ｃ型、サポウイルス８型、サポウイルス９型、サポウイルス１０型、ノロウイルスＡ型、ノロウイルスＢ型、ブタルブラウイルス、カリシウイルス、スピューマウイルス、ブタγヘルペスウイルス、ブタ内在性レトロウルスが挙げられるが、病原性が低い観点から、ブタ内在性レトロウルスは検査対象に含んでいなくてもよい。
検査対象となるウイルスとして、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス、ブタサーコウイルス２型、ブタインフルエンザウイルスＨ１Ｎ１型、ブタリンパ球向性ヘルペスウイルス、ブタサイトメガロウイルス及びＥ型肝炎ウイルスを少なくとも含むことが好ましい。
検査対象となるウイルスとして、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス、ブタサーコウイルス２型、ブタインフルエンザウイルスＨ１Ｎ１型、ブタリンパ球向性ヘルペスウイルス、ブタサイトメガロウイルス及びＥ型肝炎ウイルスを少なくとも含むことが好ましい。
【0022】
検査対象となる原虫として、具体的には、トキソプラズマ、コクシジウム、パランチジウム、クリプトスポリジウム、サルコシスティス、バベシア、トリパノソーマ属、ブタ回虫、トキソカラ、エキノコッカス、紅色毛様線虫、蛭状鉤頭虫、肺虫、糞線虫、有鉤条虫、繊毛虫、毛様線虫、ブタ鞭虫、その他外部寄生虫が挙げられ、検査対象となる原虫としてトキソプラズマを少なくとも含むことが好ましい。
【0023】
上記ウイルス又は原虫の遺伝子検査する工程は、少なくとも１種類のウイルス又は原虫各々の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）に選択的に（好ましくは特異的に）結合するプライマー対を用いてＰＣＲ法により検査する工程であることが好ましい。
上記少なくとも１種類のウイルス又は原虫各々の核酸に選択的に結合するプライマーは特に制限されず、例えば、上記選択的に結合する配列に加えて任意の他の配列を含むものであり得る。上記プライマーの塩基長としても、上記少なくとも１種類のウイルス又は原虫各々の核酸に選択的に結合し得るというプライマーとしての機能を発揮する程度の長さであれば特に制限されず、例えば、１０～５０塩基の長さが挙げられ、１２～４０塩基の長さが好ましく、１５～３０塩基の長さがより好ましい。
上記プライマーのＴｍ値としては、ゲノム遺伝子（例えば、ブタゲノム遺伝子）等との非特異的アニーリングを回避する観点から、５０℃以上であることが好ましく、５５℃以上であることがより好ましい。
また、プライマーのＴｍ値の上限値としては特に制限はないが、例えば、８０℃以下であり、好ましくは７５℃以下である。
また、上記細菌の感染の検査及び上記ウイルス又は原虫の感染の検査に使用する使用する全プライマーの融解温度差が２５℃以下（より好ましくは２０℃以下、更に好ましくは１５℃以下、特に好ましくは１２℃以下）であることが好ましい。
全プライマーの融解温度差は小さければ小さいほど好ましく、融解温度差の下限値としては特に制限はないが、例えば、１０℃以上、８℃以上、６℃以上、５℃以上、３℃以上、１℃以上等が挙げられ、理想的には０℃である。
上記少なくとも１種類のウイルス又は原虫各々の核酸に選択的に結合するプライマーは特に制限されず、例えば、上記選択的に結合する配列に加えて任意の他の配列を含むものであり得る。上記プライマーの塩基長としても、上記少なくとも１種類のウイルス又は原虫各々の核酸に選択的に結合し得るというプライマーとしての機能を発揮する程度の長さであれば特に制限されず、例えば、１０～５０塩基の長さが挙げられ、１２～４０塩基の長さが好ましく、１５～３０塩基の長さがより好ましい。
上記プライマーのＴｍ値としては、ゲノム遺伝子（例えば、ブタゲノム遺伝子）等との非特異的アニーリングを回避する観点から、５０℃以上であることが好ましく、５５℃以上であることがより好ましい。
また、プライマーのＴｍ値の上限値としては特に制限はないが、例えば、８０℃以下であり、好ましくは７５℃以下である。
また、上記細菌の感染の検査及び上記ウイルス又は原虫の感染の検査に使用する使用する全プライマーの融解温度差が２５℃以下（より好ましくは２０℃以下、更に好ましくは１５℃以下、特に好ましくは１２℃以下）であることが好ましい。
全プライマーの融解温度差は小さければ小さいほど好ましく、融解温度差の下限値としては特に制限はないが、例えば、１０℃以上、８℃以上、６℃以上、５℃以上、３℃以上、１℃以上等が挙げられ、理想的には０℃である。
【0024】
少なくとも１種類以上のウイルスによる感染を遺伝子検査する前記工程が、５種類以上（好ましくは１０種類以上、より好ましくは２０種類以上、更に好ましくは２５種類以上）のウイルスによる感染を、各々のウイルスの核酸に選択的に結合するプライマー対を用いてＰＣＲ法により検査する工程であることが好ましい。
ウイルスの種類の上限値としては特に制限はないが、例えば、１００種類以下、５０種類以下である。
また、少なくとも１種類以上の原虫による感染を遺伝子検査する前記工程が、２種類以上（好ましくは３種類以上）の原虫による感染を、各々の原虫の核酸に選択的に結合するプライマー対を用いてＰＣＲ法により検査する工程であることが好ましい。
原虫の種類の上限値としては特に制限はないが、例えば、１０種類以下、５種類以下である。
ウイルスの種類の上限値としては特に制限はないが、例えば、１００種類以下、５０種類以下である。
また、少なくとも１種類以上の原虫による感染を遺伝子検査する前記工程が、２種類以上（好ましくは３種類以上）の原虫による感染を、各々の原虫の核酸に選択的に結合するプライマー対を用いてＰＣＲ法により検査する工程であることが好ましい。
原虫の種類の上限値としては特に制限はないが、例えば、１０種類以下、５種類以下である。
【0025】
ウイルスの核酸に選択的に結合するプライマー対として下記を例示するが本発明におけるプライマー対としてはこれらに限定されない。
（ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルスに対するプライマー対）
Ｆ：５’－ＣＡＣＴＧＴＧＧＡＧＴＴＴＡＧＴＴＴＧＣ－３’（配列番号３）
Ｒ：５’－ＣＡＣＡＣＧＧＴＣＧＣＣＣＴＡＡＴＴＧＡＡＴＡ－３’（配列番号４）
（ブタサーコウイルス（２型）に対するプライマー対）
Ｆ：５’－ＣＣＡＧＧＡＧＧＧＣＧＴＴＧＴＧＡＣＴ－３’（配列番号５）
Ｒ：５’－ＣＧＣＴＡＣＣＧＴＴＧＧＡＧＡＡＧＧＡＡ－３’（配列番号６）
（ブタインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１型）に対するプライマー対）
Ｆ：５’－ＡＧＧＡＴＴＴＧＴＧＴＴＣＡＣＧＣＴＣＡ－３’（配列番号７）
Ｒ：５’－ＧＣＡＴＴＴＴＧＧＡＣＡＡＡＧＣＧＴＣＴ－３’（配列番号８）
（ブタリンパ球向性ヘルペスウイルス（１，２型）に対するプライマー対）
Ｆ：５’－ＡＧＧＡＣＣＴＧＣＡＴＡＡＧＴＡＴＣＣＴＣＡＡ－３’（配列番号９）
Ｒ：５’－ＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＴＡＡＴＣＡＡＡＡ－３’（配列番号１０）
（ブタサイトメガロウイルスに対するプライマー対）
Ｆ：５’－ＡＡＴＧＣＧＴＴＴＴＡＣＧＧＣＴＴＣＡＣ－３’（配列番号１１）
Ｒ：５’－ＡＣＧＣＣＧＣＴＡＧＡＧＧＧＡＧＡＣ－３’（配列番号１２）
（Ｅ型肝炎ウイルス（ＯＲＦ１）に対するプライマー対（非特許文献１参照））
Ｆ：５’－ＣＴＧＧＣＡＴＹＡＣＴＡＣＴＧＣＹＡＴＴＧＡＧＣ－３’（配列番号１３）
Ｒ：５’－ＣＣＡＴＣＲＡＲＲＣＡＧＴＡＡＧＴＧＣＧＧＴＣ－３’（配列番号１４）
（ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルスに対するプライマー対）
Ｆ：５’－ＣＡＣＴＧＴＧＧＡＧＴＴＴＡＧＴＴＴＧＣ－３’（配列番号３）
Ｒ：５’－ＣＡＣＡＣＧＧＴＣＧＣＣＣＴＡＡＴＴＧＡＡＴＡ－３’（配列番号４）
（ブタサーコウイルス（２型）に対するプライマー対）
Ｆ：５’－ＣＣＡＧＧＡＧＧＧＣＧＴＴＧＴＧＡＣＴ－３’（配列番号５）
Ｒ：５’－ＣＧＣＴＡＣＣＧＴＴＧＧＡＧＡＡＧＧＡＡ－３’（配列番号６）
（ブタインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１型）に対するプライマー対）
Ｆ：５’－ＡＧＧＡＴＴＴＧＴＧＴＴＣＡＣＧＣＴＣＡ－３’（配列番号７）
Ｒ：５’－ＧＣＡＴＴＴＴＧＧＡＣＡＡＡＧＣＧＴＣＴ－３’（配列番号８）
（ブタリンパ球向性ヘルペスウイルス（１，２型）に対するプライマー対）
Ｆ：５’－ＡＧＧＡＣＣＴＧＣＡＴＡＡＧＴＡＴＣＣＴＣＡＡ－３’（配列番号９）
Ｒ：５’－ＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＴＡＡＴＣＡＡＡＡ－３’（配列番号１０）
（ブタサイトメガロウイルスに対するプライマー対）
Ｆ：５’－ＡＡＴＧＣＧＴＴＴＴＡＣＧＧＣＴＴＣＡＣ－３’（配列番号１１）
Ｒ：５’－ＡＣＧＣＣＧＣＴＡＧＡＧＧＧＡＧＡＣ－３’（配列番号１２）
（Ｅ型肝炎ウイルス（ＯＲＦ１）に対するプライマー対（非特許文献１参照））
Ｆ：５’－ＣＴＧＧＣＡＴＹＡＣＴＡＣＴＧＣＹＡＴＴＧＡＧＣ－３’（配列番号１３）
Ｒ：５’－ＣＣＡＴＣＲＡＲＲＣＡＧＴＡＡＧＴＧＣＧＧＴＣ－３’（配列番号１４）
【0026】
原虫の核酸に選択的に結合するプライマー対として下記を例示するが本発明におけるプライマー対としてはこれらに限定されない。
（トキソプラズマ ゴンデイに対するプライマー対）
Ｆ：５’－ＣＴＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＴＡＣＴＧＣＡＡ－３’（配列番号１５）
Ｒ：５’－ＣＴＧＣＴＧＧＡＴＣＴＣＴＴＣＣＣＴＴＧ－３’（配列番号１６）
（トキソプラズマ ゴンデイに対するプライマー対）
Ｆ：５’－ＣＴＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＴＡＣＴＧＣＡＡ－３’（配列番号１５）
Ｒ：５’－ＣＴＧＣＴＧＧＡＴＣＴＣＴＴＣＣＣＴＴＧ－３’（配列番号１６）
【0027】
上記２種類以上の細菌の遺伝子検査する工程、及び上記ウイルス又は原虫の遺伝子検査する工程において、上記２種類以上の細菌による感染の検出、ウイルス又は原虫による感染の検出としては上記２種類以上の細菌の核酸、ウイルス又は原虫の核酸が統計的に有意に検出されれば特に制限はない。例えば、対照と対比して、上記核酸が１．１倍以上検出されることが挙げられ、１．２倍以上検出されることが好ましく、１．５倍以上検出されることがより好ましい。
上記核酸の検出の上限値としては特に制限はないが、例えば、１０倍以下が挙げられる。
上記対照としては、ウイルス感染前の動物（例えば、ブタ）から得られた測定値であっても、予め健常動物（例えば、健常ブタ）の検体群から収集して得られた統計的な値ないし範囲であってもよい。
上記核酸の検出の上限値としては特に制限はないが、例えば、１０倍以下が挙げられる。
上記対照としては、ウイルス感染前の動物（例えば、ブタ）から得られた測定値であっても、予め健常動物（例えば、健常ブタ）の検体群から収集して得られた統計的な値ないし範囲であってもよい。
【0028】
上記感染の検出は、標識物質（例えば、標識抗体）における測定される標識の強度（例えば、吸光度、酵素標識強度、蛍光強度、紫外線強度、放射線強度等）に基づいていてもいなくてもよい。
【0029】
上記２種類以上の細菌の遺伝子検査する工程、及び上記ウイルス又は原虫の遺伝子検査する工程において、ＰＣＲのサーマルサイクル条件（例えば、温度、時間、サイクル数等）としては特に制限されず、当業界における技術常識を勘案して、二本鎖核酸を一本鎖化する変性反応、アニーリング反応及びＤＮＡポリメラーゼなどの核酸合成酵素による核酸伸長反応が生じる温度及び時間を適宜設定し、これらの反応を数十サイクル繰り返すことにより実施することができる。
変性反応条件としては特に制限されず、例えば、標的核酸を９０℃～１００℃で数十秒～数分間に加熱する反応が挙げられる。
プライマーと標的核酸とがハイブリダイズするような条件下でプライマー及び標的核酸をおく反応であるアニーリング反応としても特に制限されないが、例えば、変性反応の後、例えば、急速に冷却して５０℃～７０℃（好ましくは、５２℃～６５℃）に数十秒間～数分間おく反応であることができる。
変性反応条件としては特に制限されず、例えば、標的核酸を９０℃～１００℃で数十秒～数分間に加熱する反応が挙げられる。
プライマーと標的核酸とがハイブリダイズするような条件下でプライマー及び標的核酸をおく反応であるアニーリング反応としても特に制限されないが、例えば、変性反応の後、例えば、急速に冷却して５０℃～７０℃（好ましくは、５２℃～６５℃）に数十秒間～数分間おく反応であることができる。
【0030】
核酸伸長反応としても特に制限されず、例えば、ＤＮＡポリメラーゼなどの核酸合成酵素を用い、該核酸合成酵素の酵素活性に適した温度で実施する反応をいうことができる。
【0031】
上記２種類以上の細菌の遺伝子検査する工程、及び上記ウイルス又は原虫の遺伝子検査する工程はできるだけ少ない回数で検査を行う観点から同時に行うことが好ましい。
できるだけ少ない回数で検査を行う観点から、上記２種類以上の細菌の感染の遺伝子検査と、上記ウイルス又は原虫の感染の遺伝子検査とを、同一のサーマルサイクル条件のＰＣＲ法により行うことが好ましい。また、上記細菌の感染の検査及び上記ウイルス又は原虫の感染の検査に使用する使用する全プライマーの融解温度差が２５℃以下（より好ましくは２０℃以下、更に好ましくは１５℃以下、特に好ましくは１２℃以下）であることが好ましい。
全プライマーの融解温度差は小さければ小さいほど好ましく、融解温度差の下限値としては特に制限はないが、例えば、１０℃以上、８℃以上、６℃以上、５℃以上、３℃以上、１℃以上等が挙げられ、理想的には０℃である。
第１の態様に係る検査方法を実施する時期、及び頻度等としては特に制限はない。
できるだけ少ない回数で検査を行う観点から、上記２種類以上の細菌の感染の遺伝子検査と、上記ウイルス又は原虫の感染の遺伝子検査とを、同一のサーマルサイクル条件のＰＣＲ法により行うことが好ましい。また、上記細菌の感染の検査及び上記ウイルス又は原虫の感染の検査に使用する使用する全プライマーの融解温度差が２５℃以下（より好ましくは２０℃以下、更に好ましくは１５℃以下、特に好ましくは１２℃以下）であることが好ましい。
全プライマーの融解温度差は小さければ小さいほど好ましく、融解温度差の下限値としては特に制限はないが、例えば、１０℃以上、８℃以上、６℃以上、５℃以上、３℃以上、１℃以上等が挙げられ、理想的には０℃である。
第１の態様に係る検査方法を実施する時期、及び頻度等としては特に制限はない。
【0032】
≪検査キット≫
本発明の第２の態様は、少なくとも２種類の細菌間の共通塩基配列に対するプライマーと、少なくとも１種類のウイルス又は原虫の核酸に選択的に結合するプライマーとを含む検査キットである。
上記少なくとも２種類の細菌間の共通塩基配列に対するプライマーの具体例、及び好ましい例としては、第１の態様において前述したプライマーと同様のものが挙げられる。
少なくとも１種類のウイルス又は原虫の核酸に選択的に結合するプライマーの具体例、及び好ましい例としては、第１の態様において前述したプライマーと同様のものが挙げられる。
第２の態様に係る検査キットは、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＰＣＲ反応用緩衝液等のＰＣＲを行うための任意の成分を含んでいてもいなくてもよい。
また、第２の態様に係る検査キットは、上記各成分を含み得るような容器も含み得る。
第２の態様に係る検査キットにおいて、上記少なくとも２種類の細菌間の共通塩基配列に対するプライマーと、上記少なくとも１種類のウイルス又は原虫の核酸に選択的に結合するプライマーとが任意の基板（例えば、プラスチック基板）上に（好ましくはアレイ状に）固定されたキットであってもなくてもよい。
本発明の第２の態様は、少なくとも２種類の細菌間の共通塩基配列に対するプライマーと、少なくとも１種類のウイルス又は原虫の核酸に選択的に結合するプライマーとを含む検査キットである。
上記少なくとも２種類の細菌間の共通塩基配列に対するプライマーの具体例、及び好ましい例としては、第１の態様において前述したプライマーと同様のものが挙げられる。
少なくとも１種類のウイルス又は原虫の核酸に選択的に結合するプライマーの具体例、及び好ましい例としては、第１の態様において前述したプライマーと同様のものが挙げられる。
第２の態様に係る検査キットは、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＰＣＲ反応用緩衝液等のＰＣＲを行うための任意の成分を含んでいてもいなくてもよい。
また、第２の態様に係る検査キットは、上記各成分を含み得るような容器も含み得る。
第２の態様に係る検査キットにおいて、上記少なくとも２種類の細菌間の共通塩基配列に対するプライマーと、上記少なくとも１種類のウイルス又は原虫の核酸に選択的に結合するプライマーとが任意の基板（例えば、プラスチック基板）上に（好ましくはアレイ状に）固定されたキットであってもなくてもよい。
【0033】
≪病原体感染が評価された異種移植用材料製品の作成方法≫
本発明の第３の態様は、第１の態様に係る検査方法を実施する工程を含む、病原体感染が評価された異種移植用材料製品の作成方法である。
上記工程により、細菌、ウイルス又は原虫を含む病原体の感染が検出された材料は、異種移植用材料製品として使用できないと評価し、上記工程により、細菌、ウイルス又は原虫を含む病原体の感染が検出されなかった材料を、異種移植用材料製品として使用し得ると評価し得る。
異種移植用材料製品としては、臓器（肝臓、腎臓、膵臓、心臓等）製品、血液製品、尿製品、汗製品等が挙げられ、臓器製品又は血液製品が好ましい。
第２の態様により得られた異種移植用材料製品は、病原体感染のリスクが低減されており、異種移植に好適に使用し得る。
本発明の第３の態様は、第１の態様に係る検査方法を実施する工程を含む、病原体感染が評価された異種移植用材料製品の作成方法である。
上記工程により、細菌、ウイルス又は原虫を含む病原体の感染が検出された材料は、異種移植用材料製品として使用できないと評価し、上記工程により、細菌、ウイルス又は原虫を含む病原体の感染が検出されなかった材料を、異種移植用材料製品として使用し得ると評価し得る。
異種移植用材料製品としては、臓器（肝臓、腎臓、膵臓、心臓等）製品、血液製品、尿製品、汗製品等が挙げられ、臓器製品又は血液製品が好ましい。
第２の態様により得られた異種移植用材料製品は、病原体感染のリスクが低減されており、異種移植に好適に使用し得る。
【実施例】
【0034】
以下に本発明の実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で種々の応用が可能である。
【0035】
＜１．ＰＣＲによる病原体の検出系の確立＞
（１．１．プライマー）
（１．１．プライマー）
【表1-1】
【表1-2】
【0036】
ウイルス及び原虫については上記表１に示す各病原体に特異的なプライマーを使用した。上記各プライマーのＴｍ値は６０～７５℃の範囲に含まれる。
上記表中、「使用するＰＣＲの反応組成及び条件」は、後記の表２及び３に対応する。
上記表中、特異性及び収率を向上させるためのネステッドＰＣＲにおける２ｎｄＰＣＲに使用したＦ及びＲプライマーは、それぞれ、ｎｅｓｔｅｄ Ｆ及びＲとして表記した。
上記表中の「陽性対照」については以下の通りである。
Ａ：標的とする病原体から抽出した核酸
Ｂ：日生研ＰＥＤ生ワクチン（日生研株式会社製）から抽出した核酸
Ｃ：豚死産３種混合生ワクチン（株式会社微生物科学研究所製）から抽出した核酸
Ｄ：人工合成ＤＮＡ
上記表中、「使用するＰＣＲの反応組成及び条件」は、後記の表２及び３に対応する。
上記表中、特異性及び収率を向上させるためのネステッドＰＣＲにおける２ｎｄＰＣＲに使用したＦ及びＲプライマーは、それぞれ、ｎｅｓｔｅｄ Ｆ及びＲとして表記した。
上記表中の「陽性対照」については以下の通りである。
Ａ：標的とする病原体から抽出した核酸
Ｂ：日生研ＰＥＤ生ワクチン（日生研株式会社製）から抽出した核酸
Ｃ：豚死産３種混合生ワクチン（株式会社微生物科学研究所製）から抽出した核酸
Ｄ：人工合成ＤＮＡ
【0037】
細菌については１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の保存領域を対象としたユニバーサルプライマー（配列番号１及び２）を使用することで全ての細菌を対象とした。
本実施例で使用する上記特異的プライマーは、以下の２つを満たすことを採用の条件とした。
条件１：目的の病原体の単独株ではなく、複数の株を広くカバーすること
Ｇｅｎｂａｎｋから標的病原体の全ゲノム及びプライマーの標的となる遺伝子を５０配列前後取得し、アライメントをＣＬＣ Ｍａｉｎ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて行った後、プライマーが全ての配列に対して最大でも３塩基以内のミスマッチに収まることを確認した。
なお、Ｇｅｎｂａｎｋへの登録数が５０以下の病原体に関しては全ての登録データを取得した。
条件２：目的の病原体に対する特異性が高いこと
Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ（登録商標））（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ製）を用い、プライマーが目的の病原体以外の遺伝子及びブタの遺伝子には相同性を示さないことを確認した。
特異的プライマーは、原則として既報のものを優先して採用し、上記の２つの条件を満たさない場合には、上記のアラインメントの中で株間の保存性が高い領域のコンセンサス配列を選抜し、ウェブベースのプライマー作成ソフトであるＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅ Ｌｉｂｒａｒｙ Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ社製）に導入して設計した。
本実施例で使用する上記特異的プライマーは、以下の２つを満たすことを採用の条件とした。
条件１：目的の病原体の単独株ではなく、複数の株を広くカバーすること
Ｇｅｎｂａｎｋから標的病原体の全ゲノム及びプライマーの標的となる遺伝子を５０配列前後取得し、アライメントをＣＬＣ Ｍａｉｎ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて行った後、プライマーが全ての配列に対して最大でも３塩基以内のミスマッチに収まることを確認した。
なお、Ｇｅｎｂａｎｋへの登録数が５０以下の病原体に関しては全ての登録データを取得した。
条件２：目的の病原体に対する特異性が高いこと
Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ（登録商標））（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ製）を用い、プライマーが目的の病原体以外の遺伝子及びブタの遺伝子には相同性を示さないことを確認した。
特異的プライマーは、原則として既報のものを優先して採用し、上記の２つの条件を満たさない場合には、上記のアラインメントの中で株間の保存性が高い領域のコンセンサス配列を選抜し、ウェブベースのプライマー作成ソフトであるＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅ Ｌｉｂｒａｒｙ Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ社製）に導入して設計した。
【0038】
（１．２．ＰＣＲの陽性対照）
上記表１に示す陽性対照としては、下記優先度にていずれかを使用した。
（１）標的とする病原体から抽出した核酸
（２）標的とする病原体に対する市販生ワクチンから抽出した核酸
（３）人工合成ＤＮＡ
上記表１に示す陽性対照としては、下記優先度にていずれかを使用した。
（１）標的とする病原体から抽出した核酸
（２）標的とする病原体に対する市販生ワクチンから抽出した核酸
（３）人工合成ＤＮＡ
【0039】
標的とする病原体の核酸を陽性対照として用いたウイルスは、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス、ブタサーコウイルス（２型）、ブタインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１型）であり、いずれもＲＮＡウイルスである。
陽性対照として使用するため、一般農場にて獣医師が当該病原体陽性感染の可能性ありと判断したブタの血漿からＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、キット付属のプロトコルに準拠してＲＮＡを抽出した。ただし、ＲＮＡ抽出時にキャリアＲＮＡは使用しなかった。
陽性対照として使用するため、一般農場にて獣医師が当該病原体陽性感染の可能性ありと判断したブタの血漿からＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、キット付属のプロトコルに準拠してＲＮＡを抽出した。ただし、ＲＮＡ抽出時にキャリアＲＮＡは使用しなかった。
【0040】
ｃＤＮＡはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて合成した。Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）１．５μｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ４μｌ、ＲＮＡ（２５０ｎｇ／μｌ）１μｌ、Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ（ＮＦＷ）５．５μｌを添加した１２μｌの反応液を作製した。６５℃で５分間静置し、すぐ氷上に移動させた。その後の操作は、キット付属のプロトコルに準拠して行った。このｃＤＮＡを用いて、既報に示す方法でＰＣＲ増幅を行い（Ｉｎｏｕｅ Ｒ，Ｔｓｕｋａｈａｒａ Ｔ，Ｓｕｎａｂａ Ｃ，ｅｔ ａｌ．：２００７，Ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｖｉｒｕｓ ｆｒｏｍ ｐｉｇ ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ ｕｓｉｎｇ ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １４１：１０２‐１０６．、Ｏｌｖｅｒａ Ａ，Ｓｉｂｉｌａ Ｍ，Ｃａｌｓａｍｉｇｌｉａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．：２００４，Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ｌｏａｄ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ｑｕａｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ａ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｉｎ ｐｏｓｔｗｅａｎｉｎｇ ｍｕｌｔｉｓｙｓｔｅｍｉｃ ｗａｓｔｉｎｇ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ａｎｄ ｐｏｒｃｉｎｅ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ ａｎｄ ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｐｉｇｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １１７：７５‐８０．）、シーケンス解析で塩基配列を確認後、このｃＤＮＡを陽性対照として使用した。
なお、ブタインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１型）では、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ Ｐｒｏｂｅｓ Ｍａｓｔｅｒ５μｌ、プローブ＃１０４（Ｒｏｃｈｅ社製）０．１μｌ、１０μＭの上記表１に示す特異的プライマーセット各０．４μｌ、ＮＦＷ３．１μｌ、鋳型核酸１μｌの計１０μｌの反応液を混合し、その他は上記に示した他の病原体と同様に行った。
なお、ブタインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１型）では、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ Ｐｒｏｂｅｓ Ｍａｓｔｅｒ５μｌ、プローブ＃１０４（Ｒｏｃｈｅ社製）０．１μｌ、１０μＭの上記表１に示す特異的プライマーセット各０．４μｌ、ＮＦＷ３．１μｌ、鋳型核酸１μｌの計１０μｌの反応液を混合し、その他は上記に示した他の病原体と同様に行った。
【0041】
細菌については、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｑｕｉｃｋ ＤＨ５α（Ｇｒｅｅｎ Ｃａｐ）（ＴＯＹＯＢＯ社製）から、Ｑｕｉｃｋ Ｇｅｎｅ ＤＮＡ ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ Ｓ （ＫＵＲＡＢＯ社製）を用いて抽出したＤＮＡを用いた。
市販生ワクチンからのＲＮＡ抽出及びｃＤＮＡ作製は、上記と同様の方法で行った。
市販生ワクチンからのＲＮＡ抽出及びｃＤＮＡ作製は、上記と同様の方法で行った。
【0042】
人工合成ＤＮＡ作製は、上記（１．１．プライマー）項で述べたコンセンサス配列のプライマーの対象領域に上下約３０ｂｐを加えた配列を、ｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ（ＩＮＴＥＧＲＡＴＥＤ ＤＮＡ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）として合成した。各病原体（アポイウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス（ＯＲＦ１）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＯＲＦ２）、ウシウイルス性下痢ウイルス（１型）、ウシウイルス性下痢ウイルス（２型）、ウシウイルス性下痢ウイルス（３型）、狂犬病ウイルス（４型）、狂犬病ウイルス（５型）、狂犬病ウイルス（６型）、狂犬病ウイルス（７型）、口蹄疫ウイルス、呼吸器コロナウイルス、サポウイルス（３型）、サポウイルス（６型）、サポウイルス（７Ａ型）、サポウイルス（７Ｂ型）、サポウイルス（７Ｃ型）、サポウイルス（８型）、サポウイルス（９型）、サポウイルス（１０型）、水疱性口炎ウイルス（ニュージャージー型）、西部ウマ脳炎ウイルス、赤血球凝集性脳脊髄炎ウイルス、トンコレラウイルス、ニパウイルス、脳心筋炎ウイルス、ノロウイルス（Ａ型）、ノロウイルス（Ｂ型）、ブタアストロウイルス（１型）、ブタアストロウイルス（３型）、ブタアストロウイルス（５型）、ブタインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１型）、ブタインフルエンザウイルス（Ｈ３Ｎ２型）、ブタエンテロウイルス（Ｂ型）、ブタ水疱疹ウイルス、ブタ水疱病ウイルス、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス、ブタトルクテノウイルス（１型）、ブタトルクテノウイルス（２型）、ルブラウイルス、ブタロタウイルス（Ａ型）、ブタロタウイルス（Ｂアメリカ型）、ブタロタウイルス（Ｂベトナム型）、ブタロタウイルス（Ｃ型）、哺乳類レオウイルス、ボルナウイルス、メナングルウイルス、アフリカトンコレラウイルス、ウシ伝染性鼻気管炎ウイルス、オーエスキー病ウイルス、ブタアデノウイルス、ブタサイトメガロウイルス、ブタサーコウイルス（１型）、ブタパルボウイルス、ブタポックスウイルス、ブタリンパ球向性ヘルペスウイルス（１，２型）、トキソプラズマ ゴンデイ）に対応する人工合成ＤＮＡがコードするタンパク質領域は、各病原体の遺伝子中の特定の領域とした。
【0043】
（１．３．検出系の確立の流れ）
検出系の評価として、下記条件１～３を満たすことを確認した。
条件１：ＮＦＷに懸濁した陽性対照遺伝子を陽性対照、ＮＦＷを陰性対照としてＰＣＲを行い、陽性対照のみで目的産物が増幅されること、陰性対照で非特異産物が増幅されないこと。
条件２：１０種類前後の病原体の陽性対照遺伝子を等量ずつ混合した陽性対照混合液（ｉｎ ＮＦＷ）でも、目的の遺伝子のみを増幅すること。
条件３：事前に目的遺伝子が増幅されないことを確認したブタ膵臓由来ｃＤＮＡに陽性対照遺伝子を混合し、ブタ由来の核酸によりＰＣＲが阻害されないこと。
検出系の評価として、下記条件１～３を満たすことを確認した。
条件１：ＮＦＷに懸濁した陽性対照遺伝子を陽性対照、ＮＦＷを陰性対照としてＰＣＲを行い、陽性対照のみで目的産物が増幅されること、陰性対照で非特異産物が増幅されないこと。
条件２：１０種類前後の病原体の陽性対照遺伝子を等量ずつ混合した陽性対照混合液（ｉｎ ＮＦＷ）でも、目的の遺伝子のみを増幅すること。
条件３：事前に目的遺伝子が増幅されないことを確認したブタ膵臓由来ｃＤＮＡに陽性対照遺伝子を混合し、ブタ由来の核酸によりＰＣＲが阻害されないこと。
【0044】
（１．４．Ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲによるウイルスの検出）
ＬｉｆｅＥＣＯ（日本ジェネティクス社製）を用いて、ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲによる病原体の検出を行った。本研究で使用した２種類のＰＣＲ反応組成を下記表２に、６種類の反応条件を下記表３に記載した。増幅後は、トリス－ホウ酸－ＥＤＴＡ緩衝原液（ナカライテスク社製）を用い、１．５％アガロースゲルで電気泳動を行い、目的サイズと一致することを確認した。
ＬｉｆｅＥＣＯ（日本ジェネティクス社製）を用いて、ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲによる病原体の検出を行った。本研究で使用した２種類のＰＣＲ反応組成を下記表２に、６種類の反応条件を下記表３に記載した。増幅後は、トリス－ホウ酸－ＥＤＴＡ緩衝原液（ナカライテスク社製）を用い、１．５％アガロースゲルで電気泳動を行い、目的サイズと一致することを確認した。
【0045】
【表2】
【表3】
【0046】
（１．５．Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲによるウイルスの検出）
上記（１．４．Ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲによるウイルスの検出）項と同様にＬｉｆｅＥＣＯを用いた。反応組成は１ｓｔＰＣＲ、２ｎｄＰＣＲとも同じ上記表２に示す組成で行った。２ｎｄＰＣＲの鋳型核酸としては、１ｓｔＰＣＲ産物を希釈及び精製等を行わずにそのまま使用した。反応条件は１ｓｔＰＣＲ、２ｎｄＰＣＲともに同じであり、上記表３に示す条件で行った。
増幅産物の電気泳動による確認は、上記（１．４．Ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲによるウイルスの検出）項と同様に実施した。
上記（１．４．Ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲによるウイルスの検出）項と同様にＬｉｆｅＥＣＯを用いた。反応組成は１ｓｔＰＣＲ、２ｎｄＰＣＲとも同じ上記表２に示す組成で行った。２ｎｄＰＣＲの鋳型核酸としては、１ｓｔＰＣＲ産物を希釈及び精製等を行わずにそのまま使用した。反応条件は１ｓｔＰＣＲ、２ｎｄＰＣＲともに同じであり、上記表３に示す条件で行った。
増幅産物の電気泳動による確認は、上記（１．４．Ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲによるウイルスの検出）項と同様に実施した。
【0047】
（１．６．ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲによるウイルス及び原虫の検出）
Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いた。ＳＹＢＲ（登録商標）Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＩＩ（Ｔｌｉ ＲＮａｓｅ Ｐｌｕｓ）（ＴＡＫＡＲＡ社製）５μｌ、１０μＭプライマーセット各０．２μｌ、ＮＦＷ３．６μｌ、鋳型核酸１μｌの計１０μｌの反応液を混合した。反応は２連で行った。病原体毎の反応条件を上記表３に示す。
融解曲線分析を行った後、ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル（トリス－ホウ酸－ＥＤＴＡ）を用いて電気泳動し、目的サイズと一致することを確認した。
Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いた。ＳＹＢＲ（登録商標）Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＩＩ（Ｔｌｉ ＲＮａｓｅ Ｐｌｕｓ）（ＴＡＫＡＲＡ社製）５μｌ、１０μＭプライマーセット各０．２μｌ、ＮＦＷ３．６μｌ、鋳型核酸１μｌの計１０μｌの反応液を混合した。反応は２連で行った。病原体毎の反応条件を上記表３に示す。
融解曲線分析を行った後、ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル（トリス－ホウ酸－ＥＤＴＡ）を用いて電気泳動し、目的サイズと一致することを確認した。
【0048】
（１．７．細菌検出）
細菌の検出では、１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（ｖ３－ｖ４領域）の保存性の高い領域を対象としたプライマーとして３４１Ｆ：５’－ＣＣＴＡＣＧＧＧＮＧＧＣＷＧＣＡＧ－３’（Ｔｍ値６８℃；配列番号１）、８０５Ｒ：５’－ＧＡＣＴＡＣＨＶＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣ－３’（Ｔｍ値５６．５℃；配列番号２）を用いた（Ｋｌｉｎｄｗｏｒｔｈ Ａ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。
ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ（日本ジェネティクス社製）１２．５μｌ、０．２μＭプライマーセット各５μｌ、ＤＮＡ２．５μｌの計２５μｌの反応液でＰＣＲを行った。９５℃で３分間の初期変性後、９５℃で３０秒間の熱変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の伸長反応を３５サイクル行った。その後、７２℃で５分間の最後の伸長反応を行った。
電気泳動による増幅産物の確認は上記（１．４．Ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲによるウイルスの検出）項と同様の方法で行った。
細菌の検出では、１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（ｖ３－ｖ４領域）の保存性の高い領域を対象としたプライマーとして３４１Ｆ：５’－ＣＣＴＡＣＧＧＧＮＧＧＣＷＧＣＡＧ－３’（Ｔｍ値６８℃；配列番号１）、８０５Ｒ：５’－ＧＡＣＴＡＣＨＶＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣ－３’（Ｔｍ値５６．５℃；配列番号２）を用いた（Ｋｌｉｎｄｗｏｒｔｈ Ａ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。
ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ（日本ジェネティクス社製）１２．５μｌ、０．２μＭプライマーセット各５μｌ、ＤＮＡ２．５μｌの計２５μｌの反応液でＰＣＲを行った。９５℃で３分間の初期変性後、９５℃で３０秒間の熱変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の伸長反応を３５サイクル行った。その後、７２℃で５分間の最後の伸長反応を行った。
電気泳動による増幅産物の確認は上記（１．４．Ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲによるウイルスの検出）項と同様の方法で行った。
【0049】
（１．８．検出限界コピー数の測定）
（（陽性対照用のプラスミドの作製））
陽性対照として、標的とする病原体、もしくは標的とする病原体に対する市販生ワクチンから抽出した核酸を使用している検出系に関しては、陽性対照となるＤＮＡの正確なコピー数を把握するために、これを含むプラスミドを以下の方法で取得した。
上述の方法で得たＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて精製した。
ＰＣＲ産物に等量のＭｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを混合し、Ｅｃｏｎｏ Ｓｐｉｎ（登録商標） ｆｏｒ ＤＮＡ（Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）に全量添加した。室温で１分間静置した後、室温、１６，０００×ｇで１分間遠心分離した。ろ液を除去し、Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｗａｓｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ４００μｌを添加して、前回と同様の条件で遠心分離した。再度、ろ液を除去し、Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｗａｓｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ４００μｌを添加し、室温、１６，０００×ｇで５分間遠心分離した。カラムに別のチューブをセットし、ＮＦＷ３０μｌを添加して、室温で１分間静置した。室温、１６，０００×ｇで１分間遠心分離した。
その後、ＴＯＰＯ ＴＡ（登録商標）Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いてキット付属のクローニングベクターに組み込んだ。ベクター２μｌを、熱ショック法でＣｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｑｕｉｃｋ ＤＨ５α（Ｇｒｅｅｎ Ｃａｐ）（ＴＯＹＯＢＯ社製）に形質転換し、ＬＢ培地に播種した。
生育したコロニーのコロニーＰＣＲを行い、インサートが挿入されたベクターを選抜した。コロニーＰＣＲにはＧｏＴａｑ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用い、Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ１２．５μｌ、ＴＯＰＯ ＴＡ（登録商標）Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）付属のＭ１３ Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ及びＭ１３ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ）各０．５μｌ、ＮＦＷ１１．５μｌの計２５μｌの反応液を作製した。１０μｌ用ピペットチップでコロニーに軽く触れ、その先を反応液に添加した。９４℃で２分間の初期変性後、９８℃で１０秒間の熱変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の伸長反応を３０サイクル行った。上記（１．４．Ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲによるウイルスの検出）項と同様の方法で電気泳動を行った。
目的サイズのバンドが確認できたコロニーを５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ液体培地６ｍｌに播種し、３７℃で１晩培養した。
Ｍｉｎｉ Ｐｌｕｓ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＶＩＯＧＥＮＥ社製）を用いて、キット付属のプロトコルに準拠してプラスミド抽出を行った。プラスミドの濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）１０００Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で濃度測定を行い、コピー数を算出した。
（（陽性対照用のプラスミドの作製））
陽性対照として、標的とする病原体、もしくは標的とする病原体に対する市販生ワクチンから抽出した核酸を使用している検出系に関しては、陽性対照となるＤＮＡの正確なコピー数を把握するために、これを含むプラスミドを以下の方法で取得した。
上述の方法で得たＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて精製した。
ＰＣＲ産物に等量のＭｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを混合し、Ｅｃｏｎｏ Ｓｐｉｎ（登録商標） ｆｏｒ ＤＮＡ（Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）に全量添加した。室温で１分間静置した後、室温、１６，０００×ｇで１分間遠心分離した。ろ液を除去し、Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｗａｓｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ４００μｌを添加して、前回と同様の条件で遠心分離した。再度、ろ液を除去し、Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｗａｓｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ４００μｌを添加し、室温、１６，０００×ｇで５分間遠心分離した。カラムに別のチューブをセットし、ＮＦＷ３０μｌを添加して、室温で１分間静置した。室温、１６，０００×ｇで１分間遠心分離した。
その後、ＴＯＰＯ ＴＡ（登録商標）Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いてキット付属のクローニングベクターに組み込んだ。ベクター２μｌを、熱ショック法でＣｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｑｕｉｃｋ ＤＨ５α（Ｇｒｅｅｎ Ｃａｐ）（ＴＯＹＯＢＯ社製）に形質転換し、ＬＢ培地に播種した。
生育したコロニーのコロニーＰＣＲを行い、インサートが挿入されたベクターを選抜した。コロニーＰＣＲにはＧｏＴａｑ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用い、Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ１２．５μｌ、ＴＯＰＯ ＴＡ（登録商標）Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）付属のＭ１３ Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ及びＭ１３ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ）各０．５μｌ、ＮＦＷ１１．５μｌの計２５μｌの反応液を作製した。１０μｌ用ピペットチップでコロニーに軽く触れ、その先を反応液に添加した。９４℃で２分間の初期変性後、９８℃で１０秒間の熱変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の伸長反応を３０サイクル行った。上記（１．４．Ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲによるウイルスの検出）項と同様の方法で電気泳動を行った。
目的サイズのバンドが確認できたコロニーを５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ液体培地６ｍｌに播種し、３７℃で１晩培養した。
Ｍｉｎｉ Ｐｌｕｓ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＶＩＯＧＥＮＥ社製）を用いて、キット付属のプロトコルに準拠してプラスミド抽出を行った。プラスミドの濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）１０００Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で濃度測定を行い、コピー数を算出した。
【0050】
（（検出限界コピー数の測定））
国内に存在するもしくは存在する可能性がある選抜したウイルスについてのみ検出限界コピー数を測定した。
最大濃度を１～９×１０５ｃｏｐｉｅｓ／μｌ、最少濃度を１～９ｃｏｐｉｅｓ／μｌ程度となるよう１０倍希釈系列で６段階の検体を作製し、これを上記（１．４．Ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲによるウイルスの検出）項～上記（１．６．ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲによるウイルス及び原虫の検出）項に示すそれぞれの病原体の条件でＰＣＲした。
リアルタイムＰＣＲのみ２連で反応を行ったが、検出限界の判断では限界となる希釈段階において、２連の内１つで目的産物の増幅が確認できた場合は陽性と判断した。
ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲについては以下の式を用いてＰＣＲ効率を算出した。なお、以下の式に含まれるｓｌｏｐｅとは、縦軸をサイクル数、横軸をＬｏｇ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒとしたグラフの傾きを指す。
国内に存在するもしくは存在する可能性がある選抜したウイルスについてのみ検出限界コピー数を測定した。
最大濃度を１～９×１０５ｃｏｐｉｅｓ／μｌ、最少濃度を１～９ｃｏｐｉｅｓ／μｌ程度となるよう１０倍希釈系列で６段階の検体を作製し、これを上記（１．４．Ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲによるウイルスの検出）項～上記（１．６．ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲによるウイルス及び原虫の検出）項に示すそれぞれの病原体の条件でＰＣＲした。
リアルタイムＰＣＲのみ２連で反応を行ったが、検出限界の判断では限界となる希釈段階において、２連の内１つで目的産物の増幅が確認できた場合は陽性と判断した。
ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲについては以下の式を用いてＰＣＲ効率を算出した。なお、以下の式に含まれるｓｌｏｐｅとは、縦軸をサイクル数、横軸をＬｏｇ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒとしたグラフの傾きを指す。
【数1】
【0051】
＜２．臨床検体を使ったＰＣＲ検査系の評価＞
（２．１．臨床検体）
臨床検体として、清浄度が高いと考えられる検体（Ｃｌｅａｎサンプル）と、清浄度が低い、すなわち病原体に感染している可能性が高い検体（Ｉｎｆｅｃｔｅｄサンプル）を用意した。Ｃｌｅａｎサンプルとして、ＤＰＦ候補ブタとしてＵ－ｉＲ法で飼育された２１日齢仔豚の肝臓、腎臓、膵臓及び血液を２頭分（Ｃｌｅａｎサンプル１、２）使用した。Ｉｎｆｅｃｔｅｄサンプルとしては、一般農場で感染症の疑いで獣医師が検査解剖したブタの肝臓、腎臓、肺、リンパ節を用いた。
（２．１．臨床検体）
臨床検体として、清浄度が高いと考えられる検体（Ｃｌｅａｎサンプル）と、清浄度が低い、すなわち病原体に感染している可能性が高い検体（Ｉｎｆｅｃｔｅｄサンプル）を用意した。Ｃｌｅａｎサンプルとして、ＤＰＦ候補ブタとしてＵ－ｉＲ法で飼育された２１日齢仔豚の肝臓、腎臓、膵臓及び血液を２頭分（Ｃｌｅａｎサンプル１、２）使用した。Ｉｎｆｅｃｔｅｄサンプルとしては、一般農場で感染症の疑いで獣医師が検査解剖したブタの肝臓、腎臓、肺、リンパ節を用いた。
【0052】
（２．２．臓器からのＲＮＡ抽出）
臓器５０ｍｇを眼科用はさみで細断し、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）ＬＳ Ｒｅａｇｅｎｔ（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を１ｍｌ添加した後、Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｕｐｔｏｒ ＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いホモジナイズした。クロロホルム（Ｗａｋｏ社製）２００μｌを添加し、１５秒間ボルテックスした後、室温で２分インキュベートした。室温、１２，０００×ｇで１５分間遠心分離し、遠心後の透明な上層（水層）３５０μｌを別のチューブに回収した。ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、回収した上層からＲＮＡを精製した。
臓器５０ｍｇを眼科用はさみで細断し、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）ＬＳ Ｒｅａｇｅｎｔ（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を１ｍｌ添加した後、Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｕｐｔｏｒ ＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いホモジナイズした。クロロホルム（Ｗａｋｏ社製）２００μｌを添加し、１５秒間ボルテックスした後、室温で２分インキュベートした。室温、１２，０００×ｇで１５分間遠心分離し、遠心後の透明な上層（水層）３５０μｌを別のチューブに回収した。ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、回収した上層からＲＮＡを精製した。
【0053】
回収した上層と等量の７０％（ｖ／ｖ）エタノールを添加して転倒混和した後、キット付属のカラムに混合液の全量をアプライした。室温、８，０００×ｇで１５秒間遠心分離し、ろ液を廃棄した。カラムに３５０μｌのＢｕｆｆｅｒ ＲＷ１を添加し、前回と同様の条件で遠心分離を行い、ろ液を廃棄した。ＤＮａｓｅ処理にはＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｓｅｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いた。キット付属のＤＮａｓｅＩ及びＢｕｆｆｅｒ ＲＤＤを１：７になるよう懸濁した溶液を７５μｌ添加し、室温で８分静置した。
３５０μｌのＲＷ１を添加し、前回と同様の条件で遠心分離し、ろ液を廃棄した。５００μｌのＢｕｆｆｅｒ ＲＰＥを添加し、前回と同様の条件で遠心分離し、ろ液を廃棄した。５００μｌのＢｕｆｆｅｒ ＲＰＥを再度添加し、室温、８，０００×ｇで２分間遠心分離し、ろ液を廃棄した。カラムに何も添加せず室温、２０，０００×ｇで１分間遠心分離した。カラムに別のチューブをセットし、ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ５０μｌを添加し、１分間静置した後、室温、２０，０００×ｇで１分間遠心分離した。
３５０μｌのＲＷ１を添加し、前回と同様の条件で遠心分離し、ろ液を廃棄した。５００μｌのＢｕｆｆｅｒ ＲＰＥを添加し、前回と同様の条件で遠心分離し、ろ液を廃棄した。５００μｌのＢｕｆｆｅｒ ＲＰＥを再度添加し、室温、８，０００×ｇで２分間遠心分離し、ろ液を廃棄した。カラムに何も添加せず室温、２０，０００×ｇで１分間遠心分離した。カラムに別のチューブをセットし、ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ５０μｌを添加し、１分間静置した後、室温、２０，０００×ｇで１分間遠心分離した。
【0054】
（２．３．血液からのＲＮＡ抽出）
ヘパリン血２５０μｌにＴＲＩｚｏｌ（登録商標）ＬＳ Ｒｅａｇｅｎｔ（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）７５０μｌを添加後ボルテッスし、室温で５分間静置した。以降の操作は、次の部分を除き上記（２．２．臓器からのＲＮＡ抽出）項と同様に行った。
血液からのＲＮＡ抽出では、クロロホルムを添加し、遠心分離した後の上層（水層）は５６０μｌを回収し、ＤＮａｓｅ処理は行わず、Ｂｕｆｆｅｒ ＲＰＥの２回目の洗浄の変わりに、８０％（ｖ／ｖ）エタノール５００μｌによる洗浄を行った。また、溶出の前のカラムに何も添加せず遠心分離する際の条件は、室温、２０，０００×ｇで５分間とし、溶出はＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ３０μｌで行った。
ヘパリン血２５０μｌにＴＲＩｚｏｌ（登録商標）ＬＳ Ｒｅａｇｅｎｔ（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）７５０μｌを添加後ボルテッスし、室温で５分間静置した。以降の操作は、次の部分を除き上記（２．２．臓器からのＲＮＡ抽出）項と同様に行った。
血液からのＲＮＡ抽出では、クロロホルムを添加し、遠心分離した後の上層（水層）は５６０μｌを回収し、ＤＮａｓｅ処理は行わず、Ｂｕｆｆｅｒ ＲＰＥの２回目の洗浄の変わりに、８０％（ｖ／ｖ）エタノール５００μｌによる洗浄を行った。また、溶出の前のカラムに何も添加せず遠心分離する際の条件は、室温、２０，０００×ｇで５分間とし、溶出はＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ３０μｌで行った。
【0055】
（２．４．臓器及び血液からのＤＮＡ抽出）
臓器からのＤＮＡ抽出は上記（１．２．ＰＣＲの陽性対照）項と同様にＱｕｉｃｋ Ｇｅｎｅ ＤＮＡ ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ Ｓ （ＫＵＲＡＢＯ社製）を用いて行った。
ヘパリン血からのＤＮＡ抽出には、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、キット付属のプロトコルに準拠して行った。
臓器からのＤＮＡ抽出は上記（１．２．ＰＣＲの陽性対照）項と同様にＱｕｉｃｋ Ｇｅｎｅ ＤＮＡ ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ Ｓ （ＫＵＲＡＢＯ社製）を用いて行った。
ヘパリン血からのＤＮＡ抽出には、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、キット付属のプロトコルに準拠して行った。
【0056】
（２．５．ＰＣＲ）
ＲＮＡウイルスの検出に際し、上記（１．２．ＰＣＲの陽性対照）項と同様の方法でｃＤＮＡを作製した。また、逆転写の際のプライマーとしてＯｌｉｇｏ ｄＴ２０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を使用したｃＤＮＡも併せて作製した。
ＲＮＡウイルスの検出にはこれら２種類のプライマーで逆転写したｃＤＮＡを、ＤＮＡウイルスの検出にはＤＮＡを用い、上記（１．４．Ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲによるウイルスの検出）項～上記（１．７．細菌検出）項と同様の方法で行った。
なお、Ｉｎｆｅｃｔｅｄサンプルについては、各臓器のｃＤＮＡ又はＤＮＡを同量ずつ混合したものを鋳型とした。
ＲＮＡウイルスの検出に際し、上記（１．２．ＰＣＲの陽性対照）項と同様の方法でｃＤＮＡを作製した。また、逆転写の際のプライマーとしてＯｌｉｇｏ ｄＴ２０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を使用したｃＤＮＡも併せて作製した。
ＲＮＡウイルスの検出にはこれら２種類のプライマーで逆転写したｃＤＮＡを、ＤＮＡウイルスの検出にはＤＮＡを用い、上記（１．４．Ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲによるウイルスの検出）項～上記（１．７．細菌検出）項と同様の方法で行った。
なお、Ｉｎｆｅｃｔｅｄサンプルについては、各臓器のｃＤＮＡ又はＤＮＡを同量ずつ混合したものを鋳型とした。
【0057】
＜３．結果＞
（３．１．ＰＣＲによる病原体の検出）
表１－１及び１－２に示すウイルス６３種及び原虫１種に対して、上記（１．３．検出系の確立の流れ）に示した条件１～３を満たすことを確認した。ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲ、ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲによる検出対象の１５種のウイルスのＰＣＲ産物電気泳動結果を図１に示す。
（３．１．ＰＣＲによる病原体の検出）
表１－１及び１－２に示すウイルス６３種及び原虫１種に対して、上記（１．３．検出系の確立の流れ）に示した条件１～３を満たすことを確認した。ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲ、ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲによる検出対象の１５種のウイルスのＰＣＲ産物電気泳動結果を図１に示す。
【0058】
図１（Ａ）は、ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲによる検出結果としてＰＣＲ産物の電気泳動結果を示す図である。図中のＰは陽性対照を示し、事前に目的遺伝子が増幅されないことを確認したブタ膵臓由来ｃＤＮＡに陽性対照遺伝子を混合したものを用いた。Ｎは陰性対照を示し、上記と同様のｃＤＮＡを用いた。左端から１００ｂｐラダーマーカー（Ｍ）、以降は２ウェルずつゲタウイルス、サポウイルス（３型）、（７Ａ型）、（７Ｂ型）、（７Ｃ型）、ブタ水疱疹ウイルス、ブタ内在性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）（ｇａｇ）、（ｐｏｌ）、（ｅｎｖＡ）、（ｅｎｖＢ）、（ｅｎｖＣ）、ブタ流行性下痢ウイルスである。それぞれの目的サイズは、３８０ｂｐ、３３０ｂｐ、３３０ｂｐ、３３０ｂｐ、３３０ｂｐ、３５０ｂｐ、３３７ｂｐ、８１０ｂｐ、３５９ｂｐ、２６３ｂｐ、２８１ｂｐ、３７７ｂｐである。
図１（Ｂ）は、ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲによる検出結果として２ｎｄＰＣＲ産物の電気泳動結果を示す図である。図中のＰ及びＮは図１（Ａ）と同様のものを用いた。左端から１００ｂｐラダーマーカー（Ｍ）、以降は２ウェルずつＥ型肝炎ウイルス（ＯＲＦ１）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＯＲＦ２）、狂犬病ウイルス（７型）、赤血球凝集性脳脊髄炎ウイルス、ブタエンテロウイルス、ブタロタウイルス（Ａ型）、哺乳類レオウイルスの結果である。それぞれの目的サイズは、２８７ｂｐ、１４５ｂｐ、２５９ｂｐ、４７２ｂｐ、３０６ｂｐ、１２１ｂｐ、３４４ｂｐである。
図１（Ｂ）は、ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲによる検出結果として２ｎｄＰＣＲ産物の電気泳動結果を示す図である。図中のＰ及びＮは図１（Ａ）と同様のものを用いた。左端から１００ｂｐラダーマーカー（Ｍ）、以降は２ウェルずつＥ型肝炎ウイルス（ＯＲＦ１）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＯＲＦ２）、狂犬病ウイルス（７型）、赤血球凝集性脳脊髄炎ウイルス、ブタエンテロウイルス、ブタロタウイルス（Ａ型）、哺乳類レオウイルスの結果である。それぞれの目的サイズは、２８７ｂｐ、１４５ｂｐ、２５９ｂｐ、４７２ｂｐ、３０６ｂｐ、１２１ｂｐ、３４４ｂｐである。
【0059】
また、ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲによる検出対象の４８種のウイルス（アフリカトンコレラウイルス、アポイウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス１型、ウシウイルス性下痢ウイルス２型、ウシウイルス性下痢ウイルス３型、ウシ伝染性鼻気管支炎ウイルス、オーエスキー病ウイルス、狂犬病ウイルス４、狂犬病ウイルス５、狂犬病ウイルス６、口蹄疫ウイルス、ブタ呼吸器コロナウイルス、サポウイルス６型、サポウイルス８型、サポウイルス９型、サポウイルス１０型、水疱性口炎ウイルス（ｎｅｗ ｊｅｒｓｅｙ型）、西部ウマ脳炎ウイルス、トンコレラウイルス、ニパウイルス、脳心筋炎ウイルス、ノロウイルスＡ型、ノロウイルスＢ型、ブタアストロウイルス１型、ブタアストロウイルス３型、ブタアストロウイルス５型、ブタアデノウイルス、ブタインフルエンザウイルスＨ１Ｎ１型、ブタインフルエンザウイルスＨ３Ｎ２型、ブタサイトメガロウイルス、ブタサーコウイルス１型、ブタサーコウイルス２型、ブタ水疱病ウイルス、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス、ブタトルクテノウイルス１型、ブタトルクテノウイルス２型、ブタ内在性レトロウルス（ｐｏｌ遺伝子）、ブタパルボウイルス、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス、ブタポックスウイルス、ブタリンパ球向性ヘルペスウイルス１型、ブタリンパ球向性ヘルペスウイルス２型、ブタルブラウイルス、ブタロタウイルスＢアメリカ型、ブタロタウイルスＢベトナム型、ブタロタウイルスＣ、ボルナウイルス、トキソプラズマ ゴンデイ、メナングルウイルス等）の融解曲線を得た。図示は省略する。
陰性対照には事前に目的遺伝子が増幅されないことを確認したブタ膵臓由来ｃＤＮＡを、陽性対照にはそのｃＤＮＡに陽性対照遺伝子を混合したものを用いた。なお、ブタ内在性レトロウイルス（ｐｏｌ遺伝子）に関しては陰性対照としてＮＦＷを用いた。
陰性対照には事前に目的遺伝子が増幅されないことを確認したブタ膵臓由来ｃＤＮＡを、陽性対照にはそのｃＤＮＡに陽性対照遺伝子を混合したものを用いた。なお、ブタ内在性レトロウイルス（ｐｏｌ遺伝子）に関しては陰性対照としてＮＦＷを用いた。
【0060】
（３．２．検出限界コピー数）
ＰＣＲの検出限界コピー数を有効数字１桁で下記表４に示す。ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲによる検出限界の測定は７種のウイルスで行い、ブタ流行性下痢ウイルスが２００ｃｏｐｉｅｓ／μｌ、ブタロタウイルス（Ａ型）が３００ｃｏｐｉｅｓ／μｌ、ゲタウイルス、サポウイルス（７Ａ型，７Ｂ型）、日本脳炎ウイルスが２，０００ｃｏｐｉｅｓ／μｌ、サポウイルス（３型，７Ｃ型）が２０，０００ｃｏｐｉｅｓ／μｌであった。ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲでは６種のウイルスに対して測定を行い、そのうちＥ型肝炎ウイルス（ＯＲＦ１）、哺乳類レオウイルスの２種で５０ｃｏｐｉｅｓ／μｌ以下、残り３種の検出限界は１，０００～２，０００ｃｏｐｉｅｓ／μｌであった。一方、ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲでは、ウシ伝染性鼻気管支炎ウイルスが４，０００ｃｏｐｉｅｓ／μｌと他の病原体と比較して１桁検出限界が高く、その他の病原体の検出限界は２０～７００ｃｏｐｉｅｓ／μｌであった。
ＰＣＲ効率はトルクテノウイルス（１型）が５８％、トンコレラウイルスが５５％、ノロウイルス（Ａ型）が５４％、Ｂ型が５６％とその他の病原体と比較しＰＣＲ効率が低く、その他の病原体では６３～８７％となった。
＊：ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲは２連で反応を行ったが、限界となる希釈段階において２連の内１つのみで目的産物の増幅が確認できた。
ＰＣＲの検出限界コピー数を有効数字１桁で下記表４に示す。ｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲによる検出限界の測定は７種のウイルスで行い、ブタ流行性下痢ウイルスが２００ｃｏｐｉｅｓ／μｌ、ブタロタウイルス（Ａ型）が３００ｃｏｐｉｅｓ／μｌ、ゲタウイルス、サポウイルス（７Ａ型，７Ｂ型）、日本脳炎ウイルスが２，０００ｃｏｐｉｅｓ／μｌ、サポウイルス（３型，７Ｃ型）が２０，０００ｃｏｐｉｅｓ／μｌであった。ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲでは６種のウイルスに対して測定を行い、そのうちＥ型肝炎ウイルス（ＯＲＦ１）、哺乳類レオウイルスの２種で５０ｃｏｐｉｅｓ／μｌ以下、残り３種の検出限界は１，０００～２，０００ｃｏｐｉｅｓ／μｌであった。一方、ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲでは、ウシ伝染性鼻気管支炎ウイルスが４，０００ｃｏｐｉｅｓ／μｌと他の病原体と比較して１桁検出限界が高く、その他の病原体の検出限界は２０～７００ｃｏｐｉｅｓ／μｌであった。
ＰＣＲ効率はトルクテノウイルス（１型）が５８％、トンコレラウイルスが５５％、ノロウイルス（Ａ型）が５４％、Ｂ型が５６％とその他の病原体と比較しＰＣＲ効率が低く、その他の病原体では６３～８７％となった。
【表4】
＊：ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲは２連で反応を行ったが、限界となる希釈段階において２連の内１つのみで目的産物の増幅が確認できた。
【0061】
病原体の検出感度については、ＰＣＲサイクル数がｓｔａｎｄａｒｄ ＰＣＲより２５程度多いｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲでは検出感度がより高かった。一方、ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲでは、ほとんどの病原体において上述した２つのＰＣＲ法と比較して検出感度が１桁程度高いことが確認できた。その為、全ての検出方法をｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲに統一することが好ましいといえる。
【0062】
（３．３．臨床検体を用いたＰＣＲの評価）
図２は、臨床検体を使ったＰＣＲ検査系の評価による病原体検出結果を示す図であり、（Ａ）は、ブタリンパ球向性ヘルペスウイルスの検出結果として融解曲線を示し、２連で行ったＩｎｆｅｃｔｅｄサンプル（Ｉｎｆ．）及び陰性対照（Ｎ）を示す。
（Ｂ）は、細菌の検出結果としてＰＣＲ産物の電気泳動写真を示し左から１００ｂｐラダーマーカー（Ｍ）、陽性対照遺伝子（Ｐ）、ＮＦＷを用いた陰性対照（Ｎ）、Ｉｎｆｅｃｔｅｄサンプル（Ｉｎｆ．）。目的サイズは４６４ｂｐである。
（Ｃ）は、ブタサイトメガロウイルスの検出結果として融解曲線を示し、２連で行ったＩｎｆｅｃｔｅｄサンプル（Ｉｎｆ．）及び陰性対照（Ｎ）を示す。
（Ｄ）は、ゲタウイルスの検出結果としてＰＣＲ産物の電気泳動写真を示し、左から１００ｂｐラダーマーカー（Ｍ）、陽性対照遺伝子（Ｐ）、ＮＦＷを用いた陰性対照（Ｎ）、Ｃｌｅａｎサンプル１の肝臓（Ｌｉｖ．）、腎臓（Ｋｉｄ．）。目的サイズは３３０ｂｐである。表４で示した３５サイクルではバンドが確認しづらかった為、ここで示した結果はサイクル数を４０に増加した結果である。
図２は、臨床検体を使ったＰＣＲ検査系の評価による病原体検出結果を示す図であり、（Ａ）は、ブタリンパ球向性ヘルペスウイルスの検出結果として融解曲線を示し、２連で行ったＩｎｆｅｃｔｅｄサンプル（Ｉｎｆ．）及び陰性対照（Ｎ）を示す。
（Ｂ）は、細菌の検出結果としてＰＣＲ産物の電気泳動写真を示し左から１００ｂｐラダーマーカー（Ｍ）、陽性対照遺伝子（Ｐ）、ＮＦＷを用いた陰性対照（Ｎ）、Ｉｎｆｅｃｔｅｄサンプル（Ｉｎｆ．）。目的サイズは４６４ｂｐである。
（Ｃ）は、ブタサイトメガロウイルスの検出結果として融解曲線を示し、２連で行ったＩｎｆｅｃｔｅｄサンプル（Ｉｎｆ．）及び陰性対照（Ｎ）を示す。
（Ｄ）は、ゲタウイルスの検出結果としてＰＣＲ産物の電気泳動写真を示し、左から１００ｂｐラダーマーカー（Ｍ）、陽性対照遺伝子（Ｐ）、ＮＦＷを用いた陰性対照（Ｎ）、Ｃｌｅａｎサンプル１の肝臓（Ｌｉｖ．）、腎臓（Ｋｉｄ．）。目的サイズは３３０ｂｐである。表４で示した３５サイクルではバンドが確認しづらかった為、ここで示した結果はサイクル数を４０に増加した結果である。
【0063】
Ｉｎｆｅｃｔｅｄサンプル及び２頭のＣｌｅａｎサンプルの全ての臓器からブタ内在性レトロウイルスが検出された。
また、図２に示したように、Ｉｎｆｅｃｔｅｄサンプルでは、他にブタリンパ球向性ヘルペスウイルス及び細菌、ブタサイトメガロウイルスも検出された。
Ｃｌｅａｎサンプル１の肝臓、腎臓からは逆転写酵素としてＯｌｉｇｏ ｄＴ２０プライマーを用いた場合にのみゲタウイルスが検出され（図２）、ＰＣＲ産物をダイレクトシーケンスで確認したところ、ゲタウイルスと相同性を示した。
また、Ｅ型肝炎ウイルス（ＯＲＦ２）及び狂犬病ウイルス（７型）、ブタ水疱疹ウイルスの検出で、非特異的なバンドがみられた為、ＰＣＲ産物をダイレクトシーケンスで確認したところＰＣＲアーティファクトであり、当該病原体ではないことを確認した。
また、図２に示したように、Ｉｎｆｅｃｔｅｄサンプルでは、他にブタリンパ球向性ヘルペスウイルス及び細菌、ブタサイトメガロウイルスも検出された。
Ｃｌｅａｎサンプル１の肝臓、腎臓からは逆転写酵素としてＯｌｉｇｏ ｄＴ２０プライマーを用いた場合にのみゲタウイルスが検出され（図２）、ＰＣＲ産物をダイレクトシーケンスで確認したところ、ゲタウイルスと相同性を示した。
また、Ｅ型肝炎ウイルス（ＯＲＦ２）及び狂犬病ウイルス（７型）、ブタ水疱疹ウイルスの検出で、非特異的なバンドがみられた為、ＰＣＲ産物をダイレクトシーケンスで確認したところＰＣＲアーティファクトであり、当該病原体ではないことを確認した。
【0064】
ブタサイトメガロウイルスについては確認の為、Hamel, A. L., L. Lin, C. Sachvie, E. Grudeski, and G. P. Nayer. 1999. PCR assay for detecting porcine cytomegalovirus. J. Clin. Microbiol. 37:3767‐3768.で報告されているプライマーでも検出を行った。
図３は、上記報告されているプライマーを用いたサイトメガロウイルスのＰＣＲ産物電気泳動結果を示す図であり、左から１００ｂｐラダーマーカー（Ｍ）、陽性対照遺伝子（Ｐ）、ＮＦＷを用いた陰性対照（Ｎ）、Ｉｎｆｅｃｔｅｄサンプル（Ｉｎｆ．）。目的サイズは４１３ｂｐであり、目的サイズのバンドが確認された。
図３は、上記報告されているプライマーを用いたサイトメガロウイルスのＰＣＲ産物電気泳動結果を示す図であり、左から１００ｂｐラダーマーカー（Ｍ）、陽性対照遺伝子（Ｐ）、ＮＦＷを用いた陰性対照（Ｎ）、Ｉｎｆｅｃｔｅｄサンプル（Ｉｎｆ．）。目的サイズは４１３ｂｐであり、目的サイズのバンドが確認された。
【0065】
（３．４．考察）
臨床検体を用いた検体では、本発明の検査方法により、ブタ内在性レトロウイルスの他に、Ｉｎｆｅｃｔｅｄサンプルではブタリンパ球向性ヘルペスウイルス及び細菌、ブタサイトメガロウイルスが検出された。
ブタリンパ球向性ヘルペスウイルス及びブタサイトメガロウイルスは健康なブタの群れで広く流行しており、通常では症状は現れないことから、本試験でＩｎｆｅｃｔｅｄサンプルとして用いたブタに下痢や腹部膨張といった臨床症状をもたらした病原体は上記ウイルスによるものではなく、本発明により検出された細菌によるものと特定し得る。
両ウイルスともに不顕性感染ウイルスである為、通常の養豚業では特に問題視されていないが、ブタリンパ球向性ヘルペスウイルスはブタでの同種移植後のリンパ球増殖性の疾病に関わることが示唆されている。また、ブタサイトメガロウイルスは本ウイルスに対する免疫を保有しない場合には繁殖障害がみられる。ブタリンパ球向性ヘルペスウイルスでは可能性は低いが母子感染のリスクが示唆されており、ブタサイトメガロウイルスでは母子感染がしばしば生じ、妊娠期に実験感染させた母ブタから生まれた仔ブタの６５％から本ウイルスが単離されたという報告もある。以上のように、本発明の検査方法によれば、細菌感染の検出とともに、臨床検体から複数種のウイルス感染を検出することができる。
臨床検体を用いた検体では、本発明の検査方法により、ブタ内在性レトロウイルスの他に、Ｉｎｆｅｃｔｅｄサンプルではブタリンパ球向性ヘルペスウイルス及び細菌、ブタサイトメガロウイルスが検出された。
ブタリンパ球向性ヘルペスウイルス及びブタサイトメガロウイルスは健康なブタの群れで広く流行しており、通常では症状は現れないことから、本試験でＩｎｆｅｃｔｅｄサンプルとして用いたブタに下痢や腹部膨張といった臨床症状をもたらした病原体は上記ウイルスによるものではなく、本発明により検出された細菌によるものと特定し得る。
両ウイルスともに不顕性感染ウイルスである為、通常の養豚業では特に問題視されていないが、ブタリンパ球向性ヘルペスウイルスはブタでの同種移植後のリンパ球増殖性の疾病に関わることが示唆されている。また、ブタサイトメガロウイルスは本ウイルスに対する免疫を保有しない場合には繁殖障害がみられる。ブタリンパ球向性ヘルペスウイルスでは可能性は低いが母子感染のリスクが示唆されており、ブタサイトメガロウイルスでは母子感染がしばしば生じ、妊娠期に実験感染させた母ブタから生まれた仔ブタの６５％から本ウイルスが単離されたという報告もある。以上のように、本発明の検査方法によれば、細菌感染の検出とともに、臨床検体から複数種のウイルス感染を検出することができる。
【0066】
上記＜１．ＰＣＲによる病原体の検出系の確立＞にて確立したＰＣＲによる検出系により、Ｉｎｆｅｃｔｅｄサンプルでは各種病原体感染が検出されるのに対し、上記Ｃｌｅａｎサンプルでは、病原体感染が有意に少ないことを検査することができ、病原体感染が少ない異種移植用材料を提供することができる。
特に、本発明の検査方法によれば、細菌については、共通プライマーを用いることにより、厚生労働省の指針に含まれる２５種の原則全ての病原体をカバーした。
特に、本発明の検査方法によれば、細菌については、共通プライマーを用いることにより、厚生労働省の指針に含まれる２５種の原則全ての病原体をカバーした。
【図1】
【図2】
【図3】
【配列表】