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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-11-06
(45)【発行日】2023-11-14
(54)【発明の名称】インターフェロンを発現する腫瘍溶解性ウイルス及びその応用
(51)【国際特許分類】
C12N 7/01 20060101AFI20231107BHJP
A61K 35/761 20150101ALI20231107BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231107BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20231107BHJP
C12N 15/20 20060101ALN20231107BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20231107BHJP
C12N 15/34 20060101ALN20231107BHJP
【ＦＩ】
C12N7/01 ZNA
A61K35/761
A61P35/00
A61K48/00
C12N15/20
C12N15/113 Z
C12N15/34
【請求項の数】
16
(21)【出願番号】P 2021538122
(86)(22)【出願日】2019-12-24
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-24
(86)【国際出願番号】 CN2019127782
(87)【国際公開番号】W WO2020135390
(87)【国際公開日】2020-07-02
【審査請求日】2021-08-24
(31)【優先権主張番号】201811603052.2
(32)【優先日】2018-12-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
【微生物の受託番号】CCTCC CCTCC NO: V201871
【微生物の受託番号】CCTCC CCTCC NO: V201957
【微生物の受託番号】CCTCC CCTCC NO: V201958
(73)【特許権者】
【識別番号】521281933
【氏名又は名称】上海元宋生物技術有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】章 康健
(72)【発明者】
【氏名】方 先龍
(72)【発明者】
【氏名】顧 錦法
(72)【発明者】
【氏名】劉 新垣
【審査官】鈴木 崇之
(56)【参考文献】
【文献】特表２００７－５１３９６３（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許第０４６９５６２３（ＵＳ，Ａ）
【文献】米国特許第０４８９７４７１（ＵＳ，Ａ）
【文献】国際公開第２００５／１１５４７６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１１／１１８８１９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２００８－５３２９９５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００７－５０３８１２（ＪＰ，Ａ）
【文献】川村 希代子，消化器固形癌に対するキメラ型細胞融解性ウイルスとそのキャリアー細胞による治療，科学研究費助成事業（科学研究費補助金）研究成果報告書，2012年05月23日，pp. 1-5，インターネットURL<https://kaken.nii.ac.jp/ja/file/KAKENHI-PROJECT-21590879/21590879seika.pdf>, 検索日: 2022-07-28
【文献】中華実験外科雑誌（Chin J Exp Surg.），2011年，VOl. 28, No. 6，pp. 920-922
【文献】重慶医学（Chongqing Medicine），2012年，Vol. 41, No. 22，pp. 2233-2236
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ ７／００－７／０８
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
インターフェロンをコードする核酸配列を含む、腫瘍溶解性ウイルスであって、前記インターフェロンをコードする核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、３又は４で表される、腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項2】
前記ウイルスは、アデノウイルスである、請求項１に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項3】
前記ウイルスは、サービビン(ｓｕｒｖｉｖｉｎ)プロモーターにより駆動されるＥ１Ａ遺伝子を含み、ウイルスゲノムのＥ１Ａの内因性プロモーターがサービビン(ｓｕｒｖｉｖｉｎ)プロモーターで置換されてなる、請求項１又は２に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項4】
前記Ｅ１Ａ遺伝子の塩基配列は、Ｒｂタンパク質に結合するＥ１Ａタンパク質の活性を低下させる又は完全に欠失させるように修飾されてなる、請求項３に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項5】
前記Ｅ１Ａ遺伝子の塩基配列は、Ｅ１Ａ遺伝子のＥ１Ａタンパク質の１２２～１２９番目のアミノ酸をコードする塩基配列が削除されることにより修飾されてなる、請求項４に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項6】
前記核酸配列は、プロモーターに作動可能に連結されてなる、請求項１に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項7】
前記プロモーターは、ＣＭＶプロモーターである、請求項６に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項8】
前記腫瘍溶解性ウイルスは、中国典型培養物保蔵センターに寄託され、寄託番号がそれぞれＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｖ２０１８７１、ＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｖ２０１９５７又はＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｖ２０１９５８である、請求項１に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項9】
請求項１～８のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルスを薬学的有効量含有する、増殖性疾患を治療するための医薬組成物。
【請求項10】
前記増殖性疾患ががんである、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項11】
前記がんが前立腺がん、乳がん、直腸がん・結腸がん、肺がん、肝がん、メラノーマ、リンパ腫、胃がん、食道がん、卵巣がん、頭頸部扁平上皮がん、膀胱がん、神経膠腫、子宮頸がん又は腎がんである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項12】
前記医薬組成物は、静脈内、噴霧吸入、灌流又は腫瘍内経路によって投与されるように調製される、請求項９～１１の何れか１項に記載の医薬組成物。
【請求項13】
がん細胞の転移を予防又は阻害するために使用される、請求項１～８のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルスを含有する組成物。
【請求項14】
前記がん細胞のがんが、前立腺がん、乳がん、直腸がん・結腸がん、肺がん、肝がん、メラノーマ、リンパ腫、胃がん、食道がん、卵巣がん、頭頸部扁平上皮がん、膀胱がん、神経膠腫、子宮頸がん又は腎がんである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項15】
がんの再発を予防するために使用される、請求項１～８のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルスを含有する組成物。
【請求項16】
前記がんが、前立腺がん、乳がん、直腸がん・結腸がん、肺がん、肝がん、メラノーマ、リンパ腫、胃がん、食道がん、卵巣がん、頭頸部扁平上皮がん、膀胱がん、神経膠腫、子宮頸がん又は腎がんである、請求項１５に記載の組成物。【発明の詳細な説明】
【相互参照】
【0001】
本願は、２０１８年１２月２６日に中国特許庁へ提出された、出願番号２０１８１１６０３０５２．２、発明の名称が「インターフェロンを発現する腫瘍溶解性ウイルス及びその応用」である中国特許出願に基づき優先権を主張し、その全内容は、援用により本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【0002】
本発明は、腫瘍溶解性ウイルスを利用した腫瘍治療の技術分野に関し、具体的には、本発明は、インターフェロンを発現する腫瘍溶解性アデノウイルス、その調製方法及び応用に関する。
【背景技術】
【0003】
統計によると、世界中で毎年１２００万人以上が癌と診断されており、がんは人類の健康及び発達に深刻な影響を及ぼす。医学的および環境的条件の影響を受けて、中国の癌死亡率は世界平均よりも高い。従来の腫瘍療法は、有効性が低く、死亡率が高く、予後の再発率が高いなどの欠点があるため、がんの治療に大きな課題をもたらす。例えば、腫瘍発生のごく初期の段階で、微小転移巣が生成され、腫瘍の元の部位から遠く離れた組織に局在化している。従って、癌が診断されたとき、多くのがん患者はすでに微小転移を起こしている。
幅広い展望を有する新たな治療法として、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞内の細胞を複製および溶解し、それにより腫瘍細胞を継続的に殺すことができる。さらに、腫瘍溶解性ウイルスは、がん抑制遺伝子などを運ぶこともでき、ウイルスで細胞を溶解するとともに、遺伝子の腫瘍細胞を殺す能力を発揮するため、治療効果を向上させる。
現在、腫瘍溶解性ウイルスの有効性を高めることにより臨床的成功の可能性を高めるための新しい方法を入手することが依然として緊急に必要である。
幅広い展望を有する新たな治療法として、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞内の細胞を複製および溶解し、それにより腫瘍細胞を継続的に殺すことができる。さらに、腫瘍溶解性ウイルスは、がん抑制遺伝子などを運ぶこともでき、ウイルスで細胞を溶解するとともに、遺伝子の腫瘍細胞を殺す能力を発揮するため、治療効果を向上させる。
現在、腫瘍溶解性ウイルスの有効性を高めることにより臨床的成功の可能性を高めるための新しい方法を入手することが依然として緊急に必要である。
【発明の概要】
【0004】
本発明は、まず、腫瘍溶解性アデノウイルスゲノムの構造を改良することにより、ウイルスゲノムのＥ１Ａ遺伝子の野生型プロモーターをサービビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターで置換し、次いで、Ｅ１Ａ遺伝子のＥ１Ａタンパク質の１２２～１２９番目のアミノ酸をコードする２４つの塩基対（３６４～３８７ｂｐ）を削除し、Ｅ１ＡはＲｂタンパク質に結合できないため、Ｅ２Ｆが放出されず、宿主細胞が細胞周期に入るのを促進でき、上記の改良された腫瘍溶解性アデノウイルスは、Ｒｂの異常な腫瘍細胞でのみ選択的に複製することができる。
さらに、本発明は、インターフェロン（例えば、コンセンサスインターフェロン）をコードする核酸配列、特に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、３又は４で表される核酸配列をウイルスゲノムに導入する。その結果、このような腫瘍溶解性アデノウイルスはｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで優れた抗腫瘍効果を有することが発見している。本発明に係る腫瘍溶解性アデノウイルスは、注射部位から遠く離れた場所で腫瘍増殖をよく効果的に阻害でき、さらに腫瘍再発を効果的に防止できることは特に驚くべきことである。これは、臨床応用にとって計り知れない価値がある。以上の知見に基づいて、本発明が完了する。
本発明の第１の側面は、インターフェロンをコードする核酸配列を含む腫瘍溶解性ウイルスを提供する。
さらに、本発明は、インターフェロン（例えば、コンセンサスインターフェロン）をコードする核酸配列、特に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、３又は４で表される核酸配列をウイルスゲノムに導入する。その結果、このような腫瘍溶解性アデノウイルスはｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで優れた抗腫瘍効果を有することが発見している。本発明に係る腫瘍溶解性アデノウイルスは、注射部位から遠く離れた場所で腫瘍増殖をよく効果的に阻害でき、さらに腫瘍再発を効果的に防止できることは特に驚くべきことである。これは、臨床応用にとって計り知れない価値がある。以上の知見に基づいて、本発明が完了する。
本発明の第１の側面は、インターフェロンをコードする核酸配列を含む腫瘍溶解性ウイルスを提供する。
【0005】
一実施形態において、前記ウイルスは、アデノウイルスである。
他の一実施形態において、前記ウイルスは、サービビン(ｓｕｒｖｉｖｉｎ)プロモーターにより駆動されるＥ１Ａ遺伝子を含み、好ましくは、ウイルスゲノムのＥ１Ａの内因性プロモーターがサービビン(ｓｕｒｖｉｖｉｎ)プロモーターで置換され、及び／又は
Ｅ１Ａ遺伝子配列は、Ｒｂタンパク質に結合するＥ１Ａタンパク質の活性を低下させる又は完全に欠失させるように修飾され、好ましくは、前記修飾では、Ｅ１Ａ遺伝子においてＥ１Ａタンパク質の１２２～１２９番目のアミノ酸をコードする塩基配列を削除し、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で表される配列の３６４～３８７ｂｐの配列を削除し、
ＡＴＧＡＧＡＣＡＴＡＴＴＡＴＣＴＧＣＣＡＣＧＧＡＧＧＴＧＴＴＡＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＡＡＴＧＧＣＣＧＣＣＡＧＴＣＴＴＴＴＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＡＴＣＧＡＡＧＡＧＧＴＡＣＴＧＧＣＴＧＡＴＡＡＴＣＴＴＣＣＡＣＣＴＣＣＴＡＧＣＣＡＴＴＴＴＧＡＡＣＣＡＣＣＴＡＣＣＣＴＴＣＡＣＧＡＡＣＴＧＴＡＴＧＡＴＴＴＡＧＡＣＧＴＧＡＣＧＧＣＣＣＣＣＧＡＡＧＡＴＣＣＣＡＡＣＧＡＧＧＡＧＧＣＧＧＴＴＴＣＧＣＡＧＡＴＴＴＴＴＣＣＣＧＡＣＴＣＴＧＴＡＡＴＧＴＴＧＧＣＧＧＴＧＣＡＧＧＡＡＧＧＧＡＴＴＧＡＣＴＴＡＣＴＣＡＣＴＴＴＴＣＣＧＣＣＧＧＣＧＣＣＣＧＧＴＴＣＴＣＣＧＧＡＧＣＣＧＣＣＴＣＡＣＣＴＴＴＣＣＣＧＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＣＡＧＡＧＡＧＣＣＴＴＧＧＧＴＣＣＧＧＴＴＴＣＴＡＴＧＣＣＡＡＡＣＣＴＴＧＴＡＣＣＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＧＡＴＣＴＴＡＣＣＴＧＣＣＡＣＧＡＧＧＣＴＧＧＣＴＴＴＣＣＡＣＣＣＡＧＴＧＡＣＧＡＣＧＡＧＧＡＴＧＡＡＧＡＧＧＧＴＧＡＧＧＡＧＴＴＴＧＴＧＴＴＡＧＡＴＴＡＴＧＴＧＧＡＧＣＡＣＣＣＣＧＧＧＣＡＣＧＧＴＴＧＣＡＧＧＴＣＴＴＧＴＣＡＴＴＡＴＣＡＣＣＧＧＡＧＧＡＡＴＡＣＧＧＧＧＧＡＣＣＣＡＧＡＴＡＴＴＡＴＧＴＧＴＴＣＧＣＴＴＴＧＣＴＡＴＡＴＧＡＧＧＡＣＣＴＧＴＧＧＣＡＴＧＴＴＴＧＴＣＴＡＣＡＧＴＡＡＧＴＧＡＡＡＡＴＴＡＴＧＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＧＡＴＡＧＡＧＴＧＧＴＧＧＧＴＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＴＴＴＡＣＡＧＴＴＴＴＧＴＧＧＴＴＴＡＡＡＧＡＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴＧＴＧＡＴＴＴＴＴＴＴＡＡＡＡＧＧＴＣＣＴＧＴＧＴＣＴＧＡＡＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＣＣＧＡＧＣＣＡＧＡＡＣＣＧＧＡＧＣＣＴＧＣＡＡＧＡＣＣＴＡＣＣＣＧＣＣＧＴＣＣＴＡＡＡＡＴＧＧＣＧＣＣＴＧＣＴＡＴＣＣＴＧＡＧＡＣＧＣＣＣＧＡＣＡＴＣＡＣＣＴＧＴＧＴＣＴＡＧＡＧＡＡＴＧＣＡＡＴＡＧＴＡＧＴＡＣＧＧＡＴＡＧＣＴＧＴＧＡＣＴＣＣＧＧＴＣＣＴＴＣＴＡＡＣＡＣＡＣＣＴＣＣＴＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＣＧＧＴＧＧＴＣＣＣＧＣＴＧＴＧＣＣＣＣＡＴＴＡＡＡＣＣＡＧＴＴＧＣＣＧＴＧＡＧＡＧＴＴＧＧＴＧＧＧＣＧＴＣＧＣＣＡＧＧＣＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＡＴＣＧＡＧＧＡＣＴＴＧＣＴＴＡＡＣＧＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＡＣＣＴＴＴＧＧＡＣＴＴＧＡＧＣＴＧＴＡＡＡＣＧＣＣＣＣＡＧＧＣＣＡＴＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）。
他の一実施形態において、前記ウイルスは、サービビン(ｓｕｒｖｉｖｉｎ)プロモーターにより駆動されるＥ１Ａ遺伝子を含み、好ましくは、ウイルスゲノムのＥ１Ａの内因性プロモーターがサービビン(ｓｕｒｖｉｖｉｎ)プロモーターで置換され、及び／又は
Ｅ１Ａ遺伝子配列は、Ｒｂタンパク質に結合するＥ１Ａタンパク質の活性を低下させる又は完全に欠失させるように修飾され、好ましくは、前記修飾では、Ｅ１Ａ遺伝子においてＥ１Ａタンパク質の１２２～１２９番目のアミノ酸をコードする塩基配列を削除し、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で表される配列の３６４～３８７ｂｐの配列を削除し、
ＡＴＧＡＧＡＣＡＴＡＴＴＡＴＣＴＧＣＣＡＣＧＧＡＧＧＴＧＴＴＡＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＡＡＴＧＧＣＣＧＣＣＡＧＴＣＴＴＴＴＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＡＴＣＧＡＡＧＡＧＧＴＡＣＴＧＧＣＴＧＡＴＡＡＴＣＴＴＣＣＡＣＣＴＣＣＴＡＧＣＣＡＴＴＴＴＧＡＡＣＣＡＣＣＴＡＣＣＣＴＴＣＡＣＧＡＡＣＴＧＴＡＴＧＡＴＴＴＡＧＡＣＧＴＧＡＣＧＧＣＣＣＣＣＧＡＡＧＡＴＣＣＣＡＡＣＧＡＧＧＡＧＧＣＧＧＴＴＴＣＧＣＡＧＡＴＴＴＴＴＣＣＣＧＡＣＴＣＴＧＴＡＡＴＧＴＴＧＧＣＧＧＴＧＣＡＧＧＡＡＧＧＧＡＴＴＧＡＣＴＴＡＣＴＣＡＣＴＴＴＴＣＣＧＣＣＧＧＣＧＣＣＣＧＧＴＴＣＴＣＣＧＧＡＧＣＣＧＣＣＴＣＡＣＣＴＴＴＣＣＣＧＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＣＡＧＡＧＡＧＣＣＴＴＧＧＧＴＣＣＧＧＴＴＴＣＴＡＴＧＣＣＡＡＡＣＣＴＴＧＴＡＣＣＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＧＡＴＣＴＴＡＣＣＴＧＣＣＡＣＧＡＧＧＣＴＧＧＣＴＴＴＣＣＡＣＣＣＡＧＴＧＡＣＧＡＣＧＡＧＧＡＴＧＡＡＧＡＧＧＧＴＧＡＧＧＡＧＴＴＴＧＴＧＴＴＡＧＡＴＴＡＴＧＴＧＧＡＧＣＡＣＣＣＣＧＧＧＣＡＣＧＧＴＴＧＣＡＧＧＴＣＴＴＧＴＣＡＴＴＡＴＣＡＣＣＧＧＡＧＧＡＡＴＡＣＧＧＧＧＧＡＣＣＣＡＧＡＴＡＴＴＡＴＧＴＧＴＴＣＧＣＴＴＴＧＣＴＡＴＡＴＧＡＧＧＡＣＣＴＧＴＧＧＣＡＴＧＴＴＴＧＴＣＴＡＣＡＧＴＡＡＧＴＧＡＡＡＡＴＴＡＴＧＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＧＡＴＡＧＡＧＴＧＧＴＧＧＧＴＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＴＴＴＡＣＡＧＴＴＴＴＧＴＧＧＴＴＴＡＡＡＧＡＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴＧＴＧＡＴＴＴＴＴＴＴＡＡＡＡＧＧＴＣＣＴＧＴＧＴＣＴＧＡＡＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＣＣＧＡＧＣＣＡＧＡＡＣＣＧＧＡＧＣＣＴＧＣＡＡＧＡＣＣＴＡＣＣＣＧＣＣＧＴＣＣＴＡＡＡＡＴＧＧＣＧＣＣＴＧＣＴＡＴＣＣＴＧＡＧＡＣＧＣＣＣＧＡＣＡＴＣＡＣＣＴＧＴＧＴＣＴＡＧＡＧＡＡＴＧＣＡＡＴＡＧＴＡＧＴＡＣＧＧＡＴＡＧＣＴＧＴＧＡＣＴＣＣＧＧＴＣＣＴＴＣＴＡＡＣＡＣＡＣＣＴＣＣＴＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＣＧＧＴＧＧＴＣＣＣＧＣＴＧＴＧＣＣＣＣＡＴＴＡＡＡＣＣＡＧＴＴＧＣＣＧＴＧＡＧＡＧＴＴＧＧＴＧＧＧＣＧＴＣＧＣＣＡＧＧＣＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＡＴＣＧＡＧＧＡＣＴＴＧＣＴＴＡＡＣＧＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＡＣＣＴＴＴＧＧＡＣＴＴＧＡＧＣＴＧＴＡＡＡＣＧＣＣＣＣＡＧＧＣＣＡＴＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）。
【0006】
他の一実施形態において、インターフェロンは、αインターフェロン、βインターフェロン又はコンセンサスインターフェロン（例えば、インフェルゲン（ＩＮＦＥＲＧＥＮ））、好ましくは、前記インターフェロンをコードする核酸配は、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、３又は４で表される。
他の一実施形態において、前記核酸配列は、プロモーターに作動可能に連結され、好ましくは、前記プロモーターは、ＣＭＶプロモーターである。
他の一実施形態において、前記腫瘍溶解性ウイルスは、寄託番号がＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｖ２０１９５７の腫瘍溶解性ウイルスであり、その寄託情報は、寄託機関：中国典型培養物保蔵センター、場所：中国武漢、寄託日：２０１９年８月２７日、寄託名称：組換えヒト５型アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ、寄託番号：ＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｖ２０１９５７であり、又は
他の一実施形態において、前記核酸配列は、プロモーターに作動可能に連結され、好ましくは、前記プロモーターは、ＣＭＶプロモーターである。
他の一実施形態において、前記腫瘍溶解性ウイルスは、寄託番号がＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｖ２０１９５７の腫瘍溶解性ウイルスであり、その寄託情報は、寄託機関：中国典型培養物保蔵センター、場所：中国武漢、寄託日：２０１９年８月２７日、寄託名称：組換えヒト５型アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ、寄託番号：ＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｖ２０１９５７であり、又は
【0007】
前記腫瘍溶解性ウイルスは、寄託番号がＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｖ２０１９５８の腫瘍溶解性ウイルスであり、その寄託情報は、寄託機関：中国典型培養物保蔵センター、場所：中国武漢、寄託日：２０１９年８月２７日、寄託名称：組換えヒト５型アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－２－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ、寄託番号ＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｖ２０１９５８であるか、又は
前記腫瘍溶解性ウイルスは、寄託番号がＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｖ２０１８７１の腫瘍溶解性ウイルスであり、寄託情報は、寄託機関：中国典型培養物保蔵センター、場所：中国武漢、寄託日：２０１８年１２月１２日、寄託名称：組換えヒト５型アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ、寄託番号ＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｖ２０１８７１である。
本発明の第２の側面は、治療増殖性疾患を治療するための医薬品の調製における第１の側面に係る腫瘍溶解性ウイルスの使用を提供し、好ましくは、前記増殖性疾患は、がん、例えば、前立腺がん、乳がん、直腸がん・結腸がん、肺がん、肝がん、メラノーマ、リンパ腫、胃がん、食道がん、卵巣がん、頭頸部扁平上皮がん、膀胱がん、神経膠腫、子宮頸がん又は腎がんである。
前記腫瘍溶解性ウイルスは、寄託番号がＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｖ２０１８７１の腫瘍溶解性ウイルスであり、寄託情報は、寄託機関：中国典型培養物保蔵センター、場所：中国武漢、寄託日：２０１８年１２月１２日、寄託名称：組換えヒト５型アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ、寄託番号ＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｖ２０１８７１である。
本発明の第２の側面は、治療増殖性疾患を治療するための医薬品の調製における第１の側面に係る腫瘍溶解性ウイルスの使用を提供し、好ましくは、前記増殖性疾患は、がん、例えば、前立腺がん、乳がん、直腸がん・結腸がん、肺がん、肝がん、メラノーマ、リンパ腫、胃がん、食道がん、卵巣がん、頭頸部扁平上皮がん、膀胱がん、神経膠腫、子宮頸がん又は腎がんである。
【0008】
本発明に係る第３の側面は、薬学的有効量の第１の側面に係る腫瘍溶解性ウイルス、さらに、任意選択で薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
一実施形態では、前記医薬組成物は、静脈内、噴霧吸入、灌流又は腫瘍内経路によって投与されるように調製される。
他の一実施形態において、約１０８～１０１２ｖｐ（例えば、１．５×１０１０ｖｐ）の前記腫瘍溶解性ウイルスを含む。
一実施形態では、前記医薬組成物は、静脈内、噴霧吸入、灌流又は腫瘍内経路によって投与されるように調製される。
他の一実施形態において、約１０８～１０１２ｖｐ（例えば、１．５×１０１０ｖｐ）の前記腫瘍溶解性ウイルスを含む。
【0009】
本発明に係る第４の側面は、第１の側面に係る腫瘍溶解性ウイルス又は第３の側面に係る医薬組成物を、必要とする対象に投与することを含む増殖性疾患を治療する方法であって、前記対象は、例えば、哺乳動物、好ましくは、ヒトであり、より好ましくは、前記増殖性疾患は、がん、例えば、前立腺がん、乳がん、直腸がん・結腸がん、肺がん、肝がん、メラノーマ、リンパ腫、胃がん、食道がん、卵巣がん、頭頸部扁平上皮がん、膀胱がん、神経膠腫、子宮頸がん又は腎がんである、方法を提供する。
本発明に係る第５の側面は、請求項１～６のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス又は請求項８～１０のいずれか１項に記載の医薬組成物を、必要とする対象に投与することを含む、がん細胞の転移を予防又は阻害するための方法であって、前記対象は、例えば、哺乳動物、好ましくは、ヒトであり、前記がんは、例えば、前立腺がん、乳がん、直腸がん・結腸がん、肺がん、肝がん、メラノーマ、リンパ腫、胃がん、食道がん、卵巣がん、頭頸部扁平上皮がん、膀胱がん、神経膠腫、子宮頸がん又は腎がんである方法を提供する。
本発明に係る第６の側面は、請求項１～６のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス又は請求項８～１０のいずれか１項に記載の医薬組成物を、必要とする対象に投与することを含む、がんの再発を予防するための方法であって、前記対象は、例えば、哺乳動物、好ましくは、ヒトであり、前記がんは、例えば、前立腺がん、乳がん、直腸がん・結腸がん、肺がん、肝がん、メラノーマ、リンパ腫、胃がん、食道がん、卵巣がん、頭頸部扁平上皮がん、膀胱がん、神経膠腫、子宮頸がん又は腎がんである方法を提供する。
本発明に係る第５の側面は、請求項１～６のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス又は請求項８～１０のいずれか１項に記載の医薬組成物を、必要とする対象に投与することを含む、がん細胞の転移を予防又は阻害するための方法であって、前記対象は、例えば、哺乳動物、好ましくは、ヒトであり、前記がんは、例えば、前立腺がん、乳がん、直腸がん・結腸がん、肺がん、肝がん、メラノーマ、リンパ腫、胃がん、食道がん、卵巣がん、頭頸部扁平上皮がん、膀胱がん、神経膠腫、子宮頸がん又は腎がんである方法を提供する。
本発明に係る第６の側面は、請求項１～６のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス又は請求項８～１０のいずれか１項に記載の医薬組成物を、必要とする対象に投与することを含む、がんの再発を予防するための方法であって、前記対象は、例えば、哺乳動物、好ましくは、ヒトであり、前記がんは、例えば、前立腺がん、乳がん、直腸がん・結腸がん、肺がん、肝がん、メラノーマ、リンパ腫、胃がん、食道がん、卵巣がん、頭頸部扁平上皮がん、膀胱がん、神経膠腫、子宮頸がん又は腎がんである方法を提供する。
【0010】
中でも、上記第４～６の側面に係る幾つかの具体的な実施形態において、約１０８～１０１２ｖｐ（例えば、１．５×１０１０ｖｐ）の前記腫瘍溶解性ウイルスを静脈内、噴霧吸入、灌流又は腫瘍内経路によって前記対象に投与し、治療コースあたりの投与回数１～６回（例えば、１回、２回、３回、４回、５回又は６回）であり、前記投与は各１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日又はそれ以上ごとに行う、又は１日１回、２回、３回、４回、５回、６回又はそれ以上であり、前記対象に投与される薬物治療コースは、１～１２個（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個）である。
本発明で提供される組換え腫瘍溶解性ウイルスは、良好な安全性および優れた抗腫瘍効果を有し、抗腫瘍効果は、既存の臨床的に適用される医薬品であるソラフェニブ及びゲムシタビンよりも有意に優れている。インターフェロンタンパク質及び腫瘍溶解性ウイルスの空ベクターを独立して投与することよりも、本発明で提供される組換え腫瘍溶解性ウイルスは、予想外の相乗効果を達成する。さらに、本発明に係る腫瘍溶解性ウイルスは、さらに、腫瘍の転移および再発を阻害する能力を示すため、幅広い臨床応用の見通しを有する。
本発明で提供される組換え腫瘍溶解性ウイルスは、良好な安全性および優れた抗腫瘍効果を有し、抗腫瘍効果は、既存の臨床的に適用される医薬品であるソラフェニブ及びゲムシタビンよりも有意に優れている。インターフェロンタンパク質及び腫瘍溶解性ウイルスの空ベクターを独立して投与することよりも、本発明で提供される組換え腫瘍溶解性ウイルスは、予想外の相乗効果を達成する。さらに、本発明に係る腫瘍溶解性ウイルスは、さらに、腫瘍の転移および再発を阻害する能力を示すため、幅広い臨床応用の見通しを有する。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図5】図５は、腫瘍細胞に対する異なる構造を持つ組換え腫瘍溶解性アデノウイルスの阻害効果の比較を示し、ここで、図５Ａ及び５Ｂは、それぞれ、肝がん細胞株Ｈｕｈ－７及び大腸がん細胞株ＳＷ６２０に対する複製型及び非複製型組み換えアデノウイルスによる阻害効果の比較を示し、図５Ｃ及び５Ｄは、それぞれ、乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及び肺がん細胞株ＨＣＣ８２７に対するインターフェロン配列保有の有無の腫瘍溶解性ウイルスの阻害効果の比較を示し、図５Ｅは、正常肝線維芽細胞株ＨＬＦに対する組換え腫瘍溶解性アデノウイルスの殺傷効果を示す。
【図6】図６は、ヌードマウス異種移植腫瘍モデルの腫瘍増殖に対する組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂの阻害効果を示す。ここで、図６Ａは、ＳＷ６２０細胞株によるヌードマウス移植腫瘍のｉｎ ｖｉｖｏモデルの結果を示し、図６Ｂ及びＣは、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株によるヌードマウス移植腫瘍のｉｎ ｖｉｖｏモデルの結果を示し、図６Ｄ及びＥは、ＨＣＣ８２７細胞株によるヌードマウス移植腫瘍のｉｎ ｖｉｖｏモデルの結果を示す。
【図7】図７は、乳がん細胞株ＨＣＣ１８０６によるヌードマウス異種移植腫瘍モデルにおいて、本発明に係る組換え腫瘍溶解性アデノウイルスとブランク対照、ｒＩＦＮタンパク質のみ、空のウイルスベクターのみ、ｒＩＦＮタンパク質併用及び空のウイルスベクター併用との比較を示し、ここで、図７Ａは、投与案を示し、図Ｂは、各実験群及び対照群の移植腫瘍の体積を示す。
【図9】図９は、組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂによる腫瘍再発の予防効果を示す。図９Ａは、ＨＣＣ８２７ヌードマウス移植腫瘍のｉｎ ｖｉｖｏモデルでｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂを注射して退縮されたマウス体内へＨＣＣ８２７細胞を再移植した効果、対照（ＰＢＳ）群との比較を示す。図９Ｂは、実験群の異なるマウスの腫瘍変化データを示し、図５Ｃは、実験群と対照群のマウスの最終的腫瘍体積の統計的比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本願で使用される用語は、先行技術のものと同じ意味を有する。使用されている用語の意味を明確に示すために、本願での幾つかの用語の具体的な意味を以下に示す。本明細書の定義が該用語の従来の意味と矛盾する場合には、本条の定義が優先するものとする。
定義
特に断りがない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で言及されるすべての刊行物は、本発明で使用することができる刊行物で報告された細胞株、ベクター、および方法を説明および開示する目的で、参照により本明細書に組み込まれる。ここでは何も認められていると見なすことはできず、本発明は、以前の発明に基づいてそのような開示に先行する権利を有しない。
「腫瘍溶解性ウイルス」という用語とは、正常細胞にまったくまたはほとんど影響を与えずに、癌または過剰増殖を伴う細胞で選択的に複製し、それによってその増殖を遅らせたり、死に至らしめることができるウイルスを指す。例示的な腫瘍溶解性ウイルスは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、レオウイルス、麻疹ウイルス、レトロウイルス、インフルエンザウイルス、シンビスウイルス、ワクシニアウイルス及びアデノウイルスなどを含む。（例えば、Ｋｉｒｎ ｅｔ ａｌ.，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７：７８１）。 （２００１）、 Ｃｏｆｆｅｙ ｅｔ ａｌ.，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１３３２（１９９８）、 Ｌｏｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ.，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：６０１７（１９９４）、及びＰｅｎｇ ｅｔ ａｌ.，Ｂｌｏｏｄ ９８：２００２（２００１））を参照。」
定義
特に断りがない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で言及されるすべての刊行物は、本発明で使用することができる刊行物で報告された細胞株、ベクター、および方法を説明および開示する目的で、参照により本明細書に組み込まれる。ここでは何も認められていると見なすことはできず、本発明は、以前の発明に基づいてそのような開示に先行する権利を有しない。
「腫瘍溶解性ウイルス」という用語とは、正常細胞にまったくまたはほとんど影響を与えずに、癌または過剰増殖を伴う細胞で選択的に複製し、それによってその増殖を遅らせたり、死に至らしめることができるウイルスを指す。例示的な腫瘍溶解性ウイルスは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、レオウイルス、麻疹ウイルス、レトロウイルス、インフルエンザウイルス、シンビスウイルス、ワクシニアウイルス及びアデノウイルスなどを含む。（例えば、Ｋｉｒｎ ｅｔ ａｌ.，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７：７８１）。 （２００１）、 Ｃｏｆｆｅｙ ｅｔ ａｌ.，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１３３２（１９９８）、 Ｌｏｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ.，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：６０１７（１９９４）、及びＰｅｎｇ ｅｔ ａｌ.，Ｂｌｏｏｄ ９８：２００２（２００１））を参照。」
【0013】
「インターフェロン」という用語とは、複数の真核細胞がさまざまな環境刺激（ウイルス感染又はマイトジェンとの接触を含む。）への曝露後に産生した分泌型タンパク質のファミリーを指す。インターフェロンは、抗ウイルス作用に加えて、複数の細胞機能に影響を与えることが示されている。３つの主要なインターフェロンは、ＩＦＮ－ａ、ＩＦＮ－β及びＩＦＮ－γである。インターフェロンは、最初、その細胞由来源（白血球、線維芽細胞又はＴ細胞）によって分類されている。現在、白血球インターフェロンは、ＩＦＮ－αと呼ばれ、線維芽細胞インターフェロンは、ＩＦＮ－βと呼ばれ、Ｔ細胞インターフェロンは、ＩＦＮ－γと呼ばれる。
「コンセンサスインターフェロン（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）」という用語とは、アミノ酸配列が既知のヒトインターフェロンαの全サブタイプの大体の平均配列である合成インターフェロンを意味する。コンセンサスインターフェロンは天然のヒトＩＦＮ－αサブタイプよりも優れた（約５倍）抗ウイルス、抗増殖および激活ＮＫ細胞的活性を有することが報告されている。例示的なコンセンサスインターフェロンは、例えば、インフェルゲン（ＩＮＦＥＲＧＥＮ）があり、米国特許ＵＳ４６９５６２３及びＵＳ４８９７４７１に開示されている配列を参照する。
本開示は、先行技術で知られているインターフェロン配列を使用することができ、好ましい一実施形態において、本開示は、コンセンサスインターフェロンを使用している。
「コンセンサスインターフェロン（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）」という用語とは、アミノ酸配列が既知のヒトインターフェロンαの全サブタイプの大体の平均配列である合成インターフェロンを意味する。コンセンサスインターフェロンは天然のヒトＩＦＮ－αサブタイプよりも優れた（約５倍）抗ウイルス、抗増殖および激活ＮＫ細胞的活性を有することが報告されている。例示的なコンセンサスインターフェロンは、例えば、インフェルゲン（ＩＮＦＥＲＧＥＮ）があり、米国特許ＵＳ４６９５６２３及びＵＳ４８９７４７１に開示されている配列を参照する。
本開示は、先行技術で知られているインターフェロン配列を使用することができ、好ましい一実施形態において、本開示は、コンセンサスインターフェロンを使用している。
【0014】
出願者は、鋭意検討した結果、適切な核酸コード配列を選択すると、ｉｎ ｖｉｖｏでのインターフェロンタンパク質の治療効果に影響を与えることを発見した。同一のインターフェロンタンパク質、例えば、コンセンサスインターフェロンは、腫瘍溶解性ウイルスベクターが異なるインターフェロンの核酸コード配列を保有する場合に、ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍溶解性ウイルスの腫瘍溶解効果は、かなり異なる。しかも、出願者は、この効果の違いは、生物体のコドン使用選好性とは何の関係もないこと、即ち、ヒトの発現に最も適したコドンが使用されるかどうかによって引き起こされないことを発見した。一実施形態では、原核生物の発現に適したコドン（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４で示されるＩＦＮ－３配列）を使用すると、優れた技術的効果も得られ、予期しない技術的効果が得られる。
本開示で使用されるコンセンサスインターフェロンのコード配列は、以下の通りである。
ＩＦＮ－１：
ＡＴＧＧＣＣＣＴＧＴＣＣＴＴＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＴＧＧＣＣＧＴＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＧＣＴＡＣＡＡＧＴＣＣＡＴＣＴＧＣＴＣＣＣＴＧＧＧＣＡＴＧＴＧＴＧＡＴＣＴＧＣＣＴＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＣＣＣＴＧＧＧＣＡＡＴＡＧＡＡＧＧＧＣＣＣＴＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＧＣＣＣＡＧＡＴＧＡＧＡＡＧＧＡＴＣＡＧＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＴＧＣＣＴＧＡＡＧＧＡＴＡＧＡＣＡＣＧＡＴＴＴＴＧＧＣＴＴＣＣＣＴＣＡＧＧＡＧＧＡＧＴＴＣＧＡＣＧＧＣＡＡＴＣＡＧＴＴＴＣＡＧＡＡＧＧＣＣＣＡＧＧＣＣＡＴＣＴＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＣＧＡＧＡＴＧＡＴＣＣＡＧＣＡＧＡＣＣＴＴＴＡＡＣＣＴＧＴＴＣＴＣＣＡＣＡＡＡＧＧＡＣＴＣＣＡＧＣＧＣＣＧＣＣＴＧＧＧＡＣＧＡＧＴＣＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＴＴＴＴＡＣＡＣＡＧＡＧＣＴＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＣＧＡＴＣＴＧＧＡＧＧＣＣＴＧＣＧＴＧＡＴＣＣＡＧＧＡＧＧＴＧＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＣＣＣＣＣＣＴＧＡＴＧＡＡＴＧＴＧＧＡＴＴＣＣＡＴＣＣＴＧＧＣＣＧＴＧＡＡＧＡＡＧＴＡＣＴＴＴＣＡＧＡＧＡＡＴＣＡＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＡＣＣＧＡＧＡＡＧＡＡＧＴＡＣＡＧＣＣＣＴＴＧＴＧＣＣＴＧＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＡＴＣＡＴＧＡＧＡＴＣＣＴＴＴＴＣＣＣＴＧＡＧＣＡＣＡＡＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＧＧＡＡＧＧＡＧＴＧＡ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）、
ＩＦＮ－２：
ＡＴＧＧＣＣＣＴＧＴＣＣＴＴＣＴＣＣＣＴＧＣＴＧＡＴＧＧＣＣＧＴＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＧＣＴＡＣＡＡＧＴＣＣＡＴＣＴＧＣＴＣＣＣＴＧＧＧＣＡＴＧＴＧＣＧＡＣＣＴＧＣＣＴＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＣＣＣＴＧＧＧＣＡＡＴＡＧＧＡＧＡＧＣＣＣＴＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＧＣＣＣＡＧＡＴＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＴＣＣＣＣＴＴＴＴＡＧＣＴＧＣＣＴＧＡＡＧＧＡＴＡＧＡＣＡＣＧＡＴＴＴＣＧＧＣＴＴＣＣＣＴＣＡＧＧＡＧＧＡＧＴＴＣＧＡＴＧＧＣＡＡＴＣＡＧＴＴＣＣＡＧＡＡＧＧＣＣＣＡＧＧＣＣＡＴＣＡＧＣＧＴＧＣＴＧＣＡＣＧＡＧＡＴＧＡＴＣＣＡＧＣＡＧＡＣＣＴＴＣＡＡＴＣＴＧＴＴＴＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＴＣＣＡＧＣＧＣＣＧＣＣＴＧＧＧＡＣＧＡＧＴＣＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＴＴＣＴＡＣＡＣＣＧＡＧＣＴＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＣＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧＣＣＴＧＣＧＴＧＡＴＣＣＡＧＧＡＧＧＴＧＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＣＣＣＣＴＣＴＧＡＴＧＡＡＴＧＴＧＧＡＴＡＧＣＡＴＣＣＴＧＧＣＣＧＴＧＡＡＧＡＡＧＴＡＣＴＴＴＣＡＧＡＧＡＡＴＣＡＣＡＣＴＧＴＡＣＣＴＧＡＣＡＧＡＧＡＡＧＡＡＧＴＡＣＡＧＣＣＣＣＴＧＣＧＣＣＴＧＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＡＧＧＧＣＴＧＡＧＡＴＣＡＴＧＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＣＣＣＴＧＴＣＣＡＣＡＡＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＧＧＡＡＧＧＡＧＴＧＡ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）、
ＩＦＮ－３：
ＡＴＧＧＣＣＣＴＧＴＣＣＴＴＴＴＣＴＴＴＡＣＴＧＡＴＧＧＣＣＧＴＧＣＴＧＧＴＧＣＴＣＡＧＣＴＡＣＡＡＡＴＣＣＡＴＣＴＧＴＴＣＴＣＴＧＧＧＣＡＴＧＴＧＣＧＡＣＣＴＧＣＣＧＣＡＧＡＣＣＣＡＣＴＣＣＣＴＧＧＧＴＡＡＣＣＧＴＣＧＴＧＣＴＣＴＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＧＣＴＣＡＧＡＴＧＣＧＴＣＧＴＡＴＣＴＣＣＣＣＧＴＴＣＴＣＣＴＧＣＣＴＧＡＡＡＧＡＣＣＧＴＣＡＣＧＡＣＴＴＣＧＧＴＴＴＣＣＣＧＣＡＧＧＡＡＧＡＡＴＴＣＧＡＣＧＧＴＡＡＣＣＡＧＴＴＣＣＡＧＡＡＡＧＣＴＣＡＧＧＣＴＡＴＣＴＣＣＧＴＴＣＴＧＣＡＣＧＡＡＡＴＧＡＴＣＣＡＧＣＡＧＡＣＣＴＴＣＡＡＣＣＴＧＴＴＣＴＣＣＡＣＣＡＡＡＧＡＣＴＣＣＴＣＣＧＣＴＧＣＴＴＧＧＧＡＣＧＡＡＴＣＣＣＴＧＣＴＧＧＡＡＡＡＡＴＴＣＴＡＣＡＣＣＧＡＡＣＴＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＣＧＡＣＣＴＧＧＡＡＧＣＴＴＧＣＧＴＴＡＴＣＣＡＧＧＡＡＧＴＴＧＧＴＧＴＴＧＡＡＧＡＡＡＣＣＣＣＧＣＴＧＡＴＧＡＡＣＧＴＴＧＡＣＴＣＣＡＴＣＣＴＧＧＣＴＧＴＴＡＡＡＡＡＡＴＡＣＴＴＣＣＡＧＣＧＴＡＴＣＡＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＡＣＣＧＡＡＡＡＡＡＡＡＴＡＣＴＣＣＣＣＧＴＧＣＧＣＴＴＧＧＧＡＡＧＴＴＧＴＴＣＧＴＧＣＴＧＡＡＡＴＣＡＴＧＣＧＴＴＣＣＴＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＡＣＣＡＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＡＣＧＴＣＴＧＣＧＴＣＧＴＡＡＡＧＡＡＴＡＡ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）。
本開示で使用されるコンセンサスインターフェロンのコード配列は、以下の通りである。
ＩＦＮ－１：
ＡＴＧＧＣＣＣＴＧＴＣＣＴＴＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＴＧＧＣＣＧＴＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＧＣＴＡＣＡＡＧＴＣＣＡＴＣＴＧＣＴＣＣＣＴＧＧＧＣＡＴＧＴＧＴＧＡＴＣＴＧＣＣＴＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＣＣＣＴＧＧＧＣＡＡＴＡＧＡＡＧＧＧＣＣＣＴＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＧＣＣＣＡＧＡＴＧＡＧＡＡＧＧＡＴＣＡＧＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＴＧＣＣＴＧＡＡＧＧＡＴＡＧＡＣＡＣＧＡＴＴＴＴＧＧＣＴＴＣＣＣＴＣＡＧＧＡＧＧＡＧＴＴＣＧＡＣＧＧＣＡＡＴＣＡＧＴＴＴＣＡＧＡＡＧＧＣＣＣＡＧＧＣＣＡＴＣＴＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＣＧＡＧＡＴＧＡＴＣＣＡＧＣＡＧＡＣＣＴＴＴＡＡＣＣＴＧＴＴＣＴＣＣＡＣＡＡＡＧＧＡＣＴＣＣＡＧＣＧＣＣＧＣＣＴＧＧＧＡＣＧＡＧＴＣＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＴＴＴＴＡＣＡＣＡＧＡＧＣＴＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＣＧＡＴＣＴＧＧＡＧＧＣＣＴＧＣＧＴＧＡＴＣＣＡＧＧＡＧＧＴＧＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＣＣＣＣＣＣＴＧＡＴＧＡＡＴＧＴＧＧＡＴＴＣＣＡＴＣＣＴＧＧＣＣＧＴＧＡＡＧＡＡＧＴＡＣＴＴＴＣＡＧＡＧＡＡＴＣＡＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＡＣＣＧＡＧＡＡＧＡＡＧＴＡＣＡＧＣＣＣＴＴＧＴＧＣＣＴＧＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＡＴＣＡＴＧＡＧＡＴＣＣＴＴＴＴＣＣＣＴＧＡＧＣＡＣＡＡＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＧＧＡＡＧＧＡＧＴＧＡ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）、
ＩＦＮ－２：
ＡＴＧＧＣＣＣＴＧＴＣＣＴＴＣＴＣＣＣＴＧＣＴＧＡＴＧＧＣＣＧＴＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＧＣＴＡＣＡＡＧＴＣＣＡＴＣＴＧＣＴＣＣＣＴＧＧＧＣＡＴＧＴＧＣＧＡＣＣＴＧＣＣＴＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＣＣＣＴＧＧＧＣＡＡＴＡＧＧＡＧＡＧＣＣＣＴＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＧＣＣＣＡＧＡＴＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＴＣＣＣＣＴＴＴＴＡＧＣＴＧＣＣＴＧＡＡＧＧＡＴＡＧＡＣＡＣＧＡＴＴＴＣＧＧＣＴＴＣＣＣＴＣＡＧＧＡＧＧＡＧＴＴＣＧＡＴＧＧＣＡＡＴＣＡＧＴＴＣＣＡＧＡＡＧＧＣＣＣＡＧＧＣＣＡＴＣＡＧＣＧＴＧＣＴＧＣＡＣＧＡＧＡＴＧＡＴＣＣＡＧＣＡＧＡＣＣＴＴＣＡＡＴＣＴＧＴＴＴＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＴＣＣＡＧＣＧＣＣＧＣＣＴＧＧＧＡＣＧＡＧＴＣＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＴＴＣＴＡＣＡＣＣＧＡＧＣＴＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＣＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧＣＣＴＧＣＧＴＧＡＴＣＣＡＧＧＡＧＧＴＧＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＣＣＣＣＴＣＴＧＡＴＧＡＡＴＧＴＧＧＡＴＡＧＣＡＴＣＣＴＧＧＣＣＧＴＧＡＡＧＡＡＧＴＡＣＴＴＴＣＡＧＡＧＡＡＴＣＡＣＡＣＴＧＴＡＣＣＴＧＡＣＡＧＡＧＡＡＧＡＡＧＴＡＣＡＧＣＣＣＣＴＧＣＧＣＣＴＧＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＡＧＧＧＣＴＧＡＧＡＴＣＡＴＧＡＧＧＡＧＣＴＴＴＴＣＣＣＴＧＴＣＣＡＣＡＡＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＧＧＡＡＧＧＡＧＴＧＡ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）、
ＩＦＮ－３：
ＡＴＧＧＣＣＣＴＧＴＣＣＴＴＴＴＣＴＴＴＡＣＴＧＡＴＧＧＣＣＧＴＧＣＴＧＧＴＧＣＴＣＡＧＣＴＡＣＡＡＡＴＣＣＡＴＣＴＧＴＴＣＴＣＴＧＧＧＣＡＴＧＴＧＣＧＡＣＣＴＧＣＣＧＣＡＧＡＣＣＣＡＣＴＣＣＣＴＧＧＧＴＡＡＣＣＧＴＣＧＴＧＣＴＣＴＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＧＣＴＣＡＧＡＴＧＣＧＴＣＧＴＡＴＣＴＣＣＣＣＧＴＴＣＴＣＣＴＧＣＣＴＧＡＡＡＧＡＣＣＧＴＣＡＣＧＡＣＴＴＣＧＧＴＴＴＣＣＣＧＣＡＧＧＡＡＧＡＡＴＴＣＧＡＣＧＧＴＡＡＣＣＡＧＴＴＣＣＡＧＡＡＡＧＣＴＣＡＧＧＣＴＡＴＣＴＣＣＧＴＴＣＴＧＣＡＣＧＡＡＡＴＧＡＴＣＣＡＧＣＡＧＡＣＣＴＴＣＡＡＣＣＴＧＴＴＣＴＣＣＡＣＣＡＡＡＧＡＣＴＣＣＴＣＣＧＣＴＧＣＴＴＧＧＧＡＣＧＡＡＴＣＣＣＴＧＣＴＧＧＡＡＡＡＡＴＴＣＴＡＣＡＣＣＧＡＡＣＴＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＣＧＡＣＣＴＧＧＡＡＧＣＴＴＧＣＧＴＴＡＴＣＣＡＧＧＡＡＧＴＴＧＧＴＧＴＴＧＡＡＧＡＡＡＣＣＣＣＧＣＴＧＡＴＧＡＡＣＧＴＴＧＡＣＴＣＣＡＴＣＣＴＧＧＣＴＧＴＴＡＡＡＡＡＡＴＡＣＴＴＣＣＡＧＣＧＴＡＴＣＡＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＡＣＣＧＡＡＡＡＡＡＡＡＴＡＣＴＣＣＣＣＧＴＧＣＧＣＴＴＧＧＧＡＡＧＴＴＧＴＴＣＧＴＧＣＴＧＡＡＡＴＣＡＴＧＣＧＴＴＣＣＴＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＡＣＣＡＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＡＣＧＴＣＴＧＣＧＴＣＧＴＡＡＡＧＡＡＴＡＡ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）。
【0015】
本明細書で使用される「医薬組成物」という用語とは、特定の目的を達成するために一緒に組み合わされた少なくとも１つの薬物と任意選択で薬学的に許容される担体又は添加剤との組み合わせを指す。幾つかの実施形態において、前記医薬組成物は、本発明の目的を達成するために一緒に働くことができる限り、時間及び／又は空間で分けられた組み合わせを含む。例えば、前記医薬組成物に含まれる成分は、対象に全体として投与するか、又は、個別に投与することもできる。前記医薬組成物に含まれる成分が対象に別々に投与される場合、前記成分は、同時にまたは連続して対象に投与されることができる。好ましくは、前記薬学的に許容される担体は、水、緩衝水溶液、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）のような等張塩溶液、グルコース、マンニトール、デキストロース、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、炭酸マグネシウム、０．３％グリセリン、ヒアルロン酸、又はポリプロピレングリコールのようなポリアルキレングリコール、トリグリセリドなどを含む。使用される薬学的に許容される担体のタイプは、本発明による組成物が経口、経鼻、腫瘍内、灌流、皮内、皮下、筋肉内または静脈内投与用に処方されるかどうかに特に依存する。本発明による組成物は、添加剤として、潤滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝剤、着色物質、矯味剤及び／又は芳香物質などを含むことができる。
「投与」とは、薬理学的に使用可能な方法で医薬組成物などの物質を対象に提供することを意味する。
対象に提供される医薬組成物の用量とは、投与される対象に有益であることを示すのに十分な用量を指し、本明細書中に「薬学的有効量」又は「有効量」とも呼ばれる。投与される実際量、ならびに投与の速度および時間経過は、治療される患者の状態および重症度に依存する。治療の処方（例えば、用量の決定など）は、最終的には一般開業医や他の医師の責任であり、通常は治療する病気、個々の患者の状態、送達部位、投与方法以及医師にとって何であるか既知の他の要因を考慮する。
「投与」とは、薬理学的に使用可能な方法で医薬組成物などの物質を対象に提供することを意味する。
対象に提供される医薬組成物の用量とは、投与される対象に有益であることを示すのに十分な用量を指し、本明細書中に「薬学的有効量」又は「有効量」とも呼ばれる。投与される実際量、ならびに投与の速度および時間経過は、治療される患者の状態および重症度に依存する。治療の処方（例えば、用量の決定など）は、最終的には一般開業医や他の医師の責任であり、通常は治療する病気、個々の患者の状態、送達部位、投与方法以及医師にとって何であるか既知の他の要因を考慮する。
【0016】
本発明に係る一実施形態において、医薬組成物は、１０８～１０１２ｖｐの腫瘍溶解性ウイルスを含み、例えば、１×１０８、１．５×１０８、２×１０８、２．５×１０８、３×１０８、３．５×１０８、４×１０８、４．５×１０８、５×１０８、５．５×１０８、６×１０８、６．５×１０８、７×１０８、７．５×１０８、８×１０８、８．５×１０８、９×１０８、９．５×１０８、１×１０９、１．５×１０９、２×１０９、２．５×１０９、３×１０９、３．５×１０９、４×１０９、４．５×１０９、５×１０９、５．５×１０９、６×１０９、６．５×１０９、７×１０９、７．５×１０９、８×１０９、８．５×１０９、９×１０９、９．５×１０９、１×１０１０、１．５×１０１０、２×１０１０、２．５×１０１０、３×１０１０、３．５×１０１０、４×１０１０、４．５×１０１０、５×１０１０、５．５×１０１０、６×１０１０、６．５×１０１０、７×１０１０、７．５×１０１０、８×１０１０、８．５×１０１０、９×１０１０、９．５×１０１０、１×１０１１、１．５×１０１１、２×１０１１、２．５×１０１１、３×１０１１、３．５×１０１１、４×１０１１、４．５×１０１１、５×１０１１、５．５×１０１１、６×１０１１、６．５×１０１１、７×１０１１、７．５×１０１１、８×１０１１、８．５×１０１１、９×１０１１、９．５×１０１１又は１×１０１２ｖｐ、及び上記の２点の間の任意の用量である。
他の一実施形態において、対象に投与される腫瘍溶解性ウイルスの単回投与量は、１０８～１０１２ｖｐ、例えば、１×１０８、１．５×１０８、２×１０８、２．５×１０８、３×１０８、３．５×１０８、４×１０８、４．５×１０８、５×１０８、５．５×１０８、６×１０８、６．５×１０８、７×１０８、７．５×１０８、８×１０８、８．５×１０８、９×１０８、９．５×１０８、１×１０９、１．５×１０９、２×１０９、２．５×１０９、３×１０９、３．５×１０９、４×１０９、４．５×１０９、５×１０９、５．５×１０９、６×１０９、６．５×１０９、７×１０９、７．５×１０９、８×１０９、８．５×１０９、９×１０９、９．５×１０９、１×１０１０、１．５×１０１０、２×１０１０、２．５×１０１０、３×１０１０、３．５×１０１０、４×１０１０、４．５×１０１０、５×１０１０、５．５×１０１０、６×１０１０、６．５×１０１０、７×１０１０、７．５×１０１０、８×１０１０、８．５×１０１０、９×１０１０、９．５×１０１０、１×１０１１、１．５×１０１１、２×１０１１、２．５×１０１１、３×１０１１、３．５×１０１１、４×１０１１、４．５×１０１１、５×１０１１、５．５×１０１１、６×１０１１、６．５×１０１１、７×１０１１、７．５×１０１１、８×１０１１、８．５×１０１１、９×１０１１、９．５×１０１１又は１×１０１２ｖｐ、及び上記の２点の間の任意の用量である。治療コースあたりの投与回数は、１～６回、例えば、１回、２回、３回、４回、５回又は６回であり、２回の投与間隔は、１～７日、例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日又は７日である。
本発明において、ウイルス用量の単位は、ｖｐ（ウイルス粒子数，ｖｉｒａｌ ｐａｒｔｉｃｌｅ）であり、ウイルス溶液に含まれるウイルス粒子の数を表し、ウイルス粒子の力価である。
他の一実施形態において、対象に投与される腫瘍溶解性ウイルスの単回投与量は、１０８～１０１２ｖｐ、例えば、１×１０８、１．５×１０８、２×１０８、２．５×１０８、３×１０８、３．５×１０８、４×１０８、４．５×１０８、５×１０８、５．５×１０８、６×１０８、６．５×１０８、７×１０８、７．５×１０８、８×１０８、８．５×１０８、９×１０８、９．５×１０８、１×１０９、１．５×１０９、２×１０９、２．５×１０９、３×１０９、３．５×１０９、４×１０９、４．５×１０９、５×１０９、５．５×１０９、６×１０９、６．５×１０９、７×１０９、７．５×１０９、８×１０９、８．５×１０９、９×１０９、９．５×１０９、１×１０１０、１．５×１０１０、２×１０１０、２．５×１０１０、３×１０１０、３．５×１０１０、４×１０１０、４．５×１０１０、５×１０１０、５．５×１０１０、６×１０１０、６．５×１０１０、７×１０１０、７．５×１０１０、８×１０１０、８．５×１０１０、９×１０１０、９．５×１０１０、１×１０１１、１．５×１０１１、２×１０１１、２．５×１０１１、３×１０１１、３．５×１０１１、４×１０１１、４．５×１０１１、５×１０１１、５．５×１０１１、６×１０１１、６．５×１０１１、７×１０１１、７．５×１０１１、８×１０１１、８．５×１０１１、９×１０１１、９．５×１０１１又は１×１０１２ｖｐ、及び上記の２点の間の任意の用量である。治療コースあたりの投与回数は、１～６回、例えば、１回、２回、３回、４回、５回又は６回であり、２回の投与間隔は、１～７日、例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日又は７日である。
本発明において、ウイルス用量の単位は、ｖｐ（ウイルス粒子数，ｖｉｒａｌ ｐａｒｔｉｃｌｅ）であり、ウイルス溶液に含まれるウイルス粒子の数を表し、ウイルス粒子の力価である。
【0017】
本明細書で使用される「対象」という用語とは、、温血哺乳動物、例えば、ヒト及び霊長類動物；鳥類；飼いならされた家畜又はファーム家畜、例えば、猫、犬、羊、山羊、牛、馬及び豚；実験室動物、例えば、マウス、ラット及びモルモット；魚；爬虫類；動物園の動物及び野生動物などを含む動物を意味する。
本開示で特定の値に言及している場合、特に断りがない限り、少なくともその値が含まれることに注意する必要がある。数値が近似値を表す場合、特定の数値が別の実施形態を形成することを理解すべきである。「約Ｘ」（ここで、Ｘは、数値である。）とは、挙げられた値±１０％（両端を含む。）を意味する。存在する場合、すべての範囲が包括的で組み合わせ可能である。
本明細書で使用される用語、例えば、「含む」、「含み」、「含有」は、限定することを意図するものではない。なお、特に断りがない限り、「又は」、「或いは」とは、「及び／又は」を意味する。
本開示で特定の値に言及している場合、特に断りがない限り、少なくともその値が含まれることに注意する必要がある。数値が近似値を表す場合、特定の数値が別の実施形態を形成することを理解すべきである。「約Ｘ」（ここで、Ｘは、数値である。）とは、挙げられた値±１０％（両端を含む。）を意味する。存在する場合、すべての範囲が包括的で組み合わせ可能である。
本明細書で使用される用語、例えば、「含む」、「含み」、「含有」は、限定することを意図するものではない。なお、特に断りがない限り、「又は」、「或いは」とは、「及び／又は」を意味する。
【0018】
特に断りがない限り、本方法及び製品に関する実施形態で開示される任意の成分、要素、属性またはステップは、本明細書で開示される任意の他の方法および製品に適用することができる。
本開示における各特許、特許出願、引用された刊行物または説明は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、以下の実施例においてさらに定義される。これらの実施形態は、例としてのみ説明されており、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことを理解すべきである。上記の議論及びこれらの例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を決定することができ、その本質および範囲から逸脱することなく、さまざまな使用方法及び条件を適応させるために本発明に様々な変更および改良を加えることができる。
本開示における各特許、特許出願、引用された刊行物または説明は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、以下の実施例においてさらに定義される。これらの実施形態は、例としてのみ説明されており、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことを理解すべきである。上記の議論及びこれらの例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を決定することができ、その本質および範囲から逸脱することなく、さまざまな使用方法及び条件を適応させるために本発明に様々な変更および改良を加えることができる。
【0019】
材料及び方法
一、組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ、ｒＡｄ－ＩＦＮ－２－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ和ｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂの構築
上記の３つのウイルスの構築手順は、類似しており、それらの区別点が構築に使用されるコンセンサスインターフェロンのコード配列のみであり、ｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１は、ＳＥＱ ＩＮ ＮＯ：２で示されるコード配列を使用し、ｒＡｄ－ＩＦＮ－２－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示されるコード配列を使用し、ｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示されるコード配列を使用した。以下、ｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１の構築手順を例として、組換え腫瘍溶解性アデノウイルスの構築手順を詳しく説明するが、ｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１のコンセンサスインターフェロンのコード配列を他の２つの配列に置き換えられている限り、他の２つの腫瘍溶解性アデノウイルスの構築方法を得る。
一、組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ、ｒＡｄ－ＩＦＮ－２－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ和ｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂの構築
上記の３つのウイルスの構築手順は、類似しており、それらの区別点が構築に使用されるコンセンサスインターフェロンのコード配列のみであり、ｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１は、ＳＥＱ ＩＮ ＮＯ：２で示されるコード配列を使用し、ｒＡｄ－ＩＦＮ－２－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示されるコード配列を使用し、ｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示されるコード配列を使用した。以下、ｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１の構築手順を例として、組換え腫瘍溶解性アデノウイルスの構築手順を詳しく説明するが、ｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１のコンセンサスインターフェロンのコード配列を他の２つの配列に置き換えられている限り、他の２つの腫瘍溶解性アデノウイルスの構築方法を得る。
【0020】
１、組換えプラスミドｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂの構築
５’末端にＮｏｔＩ制限酵素部位及び３’末端にＸｂａＩ制限酵素部位を有するヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５で示される。）を合成することを遺伝子合成公司に委託し、ここで、コンセンサスインターフェロンは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４で示されるコード配列を使用する。
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５’末端にＮｏｔＩ制限酵素部位及び３’末端にＸｂａＩ制限酵素部位を有するヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５で示される。）を合成することを遺伝子合成公司に委託し、ここで、コンセンサスインターフェロンは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４で示されるコード配列を使用する。
ａｔａａｇａａｔｇｃｇｇｃｃｇｃｃｔｃｇａｃｔａａｔｔｃｃｃｔｇｇｃａｔｔａｔｇｃｃｃａｇｔａｃａｔｇａｃｃｔｔａｔｇｇｇａｃｔｔｔｃｃｔａｃｔｔｇｇｃａｇｔａｃａｔｃｔａｃｇｔａｔｔａｇｔｃａｔｃｇｃｔａｔｔａｃｃａｔｇｇｔｇａｔｇｃｇｇｔｔｔｔｇｇｃａｇｔａｃａｔｃａａｔｇｇｇｃｇｔｇｇａｔａｇｃｇｇｔｔｔｇａｃｔｃａｃｇｇｇｇａｔｔｔｃｃａａｇｔｃｔｃｃａｃｃｃｃａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔｇｇｇａｇｔｔｔｇｔｔｔｔｇｇｃａｃｃａａａａｔｃａａｃｇｇｇａｃｔｔｔｃｃａａａａｔｇｔｃｇｔａａｃａａｃｔｃｃｇｃｃｃｃａｔｔｇａｃｇｃａａａｔｇｇｇｃｇｇｔａｇｇｃｇｔｇｔａｃｇｇｔｇｇｇａｇｇｔｃｔａｔａｔａａｇｃａｇａｇｃｔｃｇｔｔｔａｇｔｇａａｃｃｇｔｃａｇａｔｃｇｃｃｔｇｇａｇａｃｇｃｃａｔｃｃａｃｇｃｔｇｔｔｔｔｇａｃｃｔｃｃａｔａｇａａｇａｃａｃｃｇｇｇａｃｃｇａｔｃｃａｇｃｃｔｇｇｇｇａｔｃｔｔｃｇａｇｔｃｇｔｃａａｇｃｔｔｇａａｔｔｃｇａｔｃｃｃｃｇｇｇｃｔｇｃａｇｇａａｔｔｃｃｃａａｔａｃｔａｔｇｇｃｃｃｔｇｔｃｃｔｔｔｔｃｔｔｔａｃｔｇａｔｇｇｃｃｇｔｇｃｔｇｇｔｇｃｔｃａｇｃｔａｃａａａｔｃｃａｔｃｔｇｔｔｃｔｃｔｇｇｇｃａｔｇｔｇｃｇａｃｃｔｇｃｃｇｃａｇａｃｃｃａｃｔｃｃｃｔｇｇｇｔａａｃｃｇｔｃｇｔｇｃｔｃｔｇａｔｃｃｔｇｃｔｇｇｃｔｃａｇａｔｇｃｇｔｃｇｔａｔｃｔｃｃｃｃｇｔｔｃｔｃｃｔｇｃｃｔｇａａａｇａｃｃｇｔｃａｃｇａｃｔｔｃｇｇｔｔｔｃｃｃｇｃａｇｇａａｇａａｔｔｃｇａｃｇｇｔａａｃｃａｇｔｔｃｃａｇａａａｇｃｔｃａｇｇｃｔａｔｃｔｃｃｇｔｔｃｔｇｃａｃｇａａａｔｇａｔｃｃａｇｃａｇａｃｃｔｔｃａａｃｃｔｇｔｔｃｔｃｃａｃｃａａａｇａｃｔｃｃｔｃｃｇｃｔｇｃｔｔｇｇｇａｃｇａａｔｃｃｃｔｇｃｔｇｇａａａａａｔｔｃｔａｃａｃｃｇａａｃｔｇｔａｃｃａｇｃａｇｃｔｇａａｃｇａｃｃｔｇｇａａｇｃｔｔｇｃｇｔｔａｔｃｃａｇｇａａｇｔｔｇｇｔｇｔｔｇａａｇａａａｃｃｃｃｇｃｔｇａｔｇａａｃｇｔｔｇａｃｔｃｃａｔｃｃｔｇｇｃｔｇｔｔａａａａａａｔａｃｔｔｃｃａｇｃｇｔａｔｃａｃｃｃｔｇｔａｃｃｔｇａｃｃｇａａａａａａａａｔａｃｔｃｃｃｃｇｔｇｃｇｃｔｔｇｇｇａａｇｔｔｇｔｔｃｇｔｇｃｔｇａａａｔｃａｔｇｃｇｔｔｃｃｔｔｃｔｃｃｃｔｇｔｃｃａｃｃａａｃｃｔｇｃａｇｇａａｃｇｔｃｔｇｃｇｔｃｇｔａａａｇａａｔａａｇｇａｔｃｃａｔｃｇａｇｃａａｃｔｔｇｔｔｔａｔｔｇｃａｇｃｔｔａｔａａｔｇｇｔｔａｃａａａｔａａａｇｃａａｔａｇｃａｔｃａｃａａａｔｔｔｃａｃａａａｔａａａｇｃａｔｔｔｔｔｔｔｃａｃｔｇｃａｔｔｃｔａｇｔｔｇｔｇｇｔｔｔｇｔｃｃａａａｃｔｃａｔｃａａｔｇｔａｔｃｔｔａｔｃａｔｇｔｃｔｇｇａｔｃｇｔｇｔｃｇａｇｃｇｃｇｔｔｃｔｔｔｇａａａｇｃａｇｔｃｇａｇｇｇｇｇｃｇｃｔａｇｇｔｇｔｇｇｇｃａｇｇｇａｃｇａｇｃｔｇｇｃｇｃｇｇｃｇｔｃｇｃｔｇｇｇｔｇｃａｃｃｇｃｇａｃｃａｃｇｇｇｃａｇａｇｃｃａｃｇｃｇｇｃｇｇｇａｇｇａｃｔａｃａａｃｔｃｃｃｇｇｃａｃａｃｃｃｃｇｃｇｃｃｇｃｃｃｃｇｃｃｔｃｔａｃｔｃｃｃａｇａａｇｇｃｃｇｃｇｇｇｇｇｇｔｇｇａｃｃｇｃｃｔａａｇａｇｇｇｃｇｔｇｃｇｃｔｃｃｃｇａｃａｔｇｃｃｃｃｇｃｇｇｃｇｃｇｃｃａｔｔａａｃｃｇｃｃａｇａｔｔｔｇａａｔｃｇｃｃｇｇａｃｃｃｇｔｔｇｇｃａｇａｇｇｔｇｇｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃａｔａｃｇｔａｃｔｇａａａａｔｇａｇａｃａｔａｔｔａｔｃｔｇｃｃａｃｇｇａｇｇｔｇｔｔａｔｔａｃｃｇａａｇａａａｔｇｇｃｃｇｃｃａｇｔｃｔｔｔｔｇｇａｃｃａｇｃｔｇａｔｃｇａａｇａｇｇｔａｃｔｇｇｃｔｇａｔａａｔｃｔｔｃｃａｃｃｔｃｃｔａｇｃｃａｔｔｔｔｇａａｃｃａｃｃｔａｃｃｃｔｔｃａｃｇａａｃｔｇｔａｔｇａｔｔｔａｇａｃｇｔｇａｃｇｇｃｃｃｃｃｇａａｇａｔｃｃｃａａｃｇａｇｇａｇｇｃｇｇｔｔｔｃｇｃａｇａｔｔｔｔｔｃｃｃｇａｃｔｃｔｇｔａａｔｇｔｔｇｇｃｇｇｔｇｃａｇｇａａｇｇｇａｔｔｇａｃｔｔａｃｔｃａｃｔｔｔｔｃｃｇｃｃｇｇｃｇｃｃｃｇｇｔｔｃｔｃｃｇｇａｇｃｃｇｃｃｔｃａｃｃｔｔｔｃｃｃｇｇｃａｇｃｃｃｇａｇｃａｇｃｃｇｇａｇｃａｇａｇａｇｃｃｔｔｇｇｇｔｃｃｇｇｔｔｔｃｔａｔｇｃｃａａａｃｃｔｔｇｔａｃｃｇｇａｇｇｔｇａｔｃｇａｔｃｃａｃｃｃａｇｔｇａｃｇａｃｇａｇｇａｔｇａａｇａｇｇｇｔｇａｇｇａｇｔｔｔｇｔｇｔｔａｇａｔｔａｔｇｔｇｇａｇｃａｃｃｃｃｇｇｇｃａｃｇｇｔｔｇｃａｇｇｔｃｔｔｇｔｃａｔｔａｔｃａｃｃｇｇａｇｇａａｔａｃｇｇｇｇｇａｃｃｃａｇａｔａｔｔａｔｇｔｇｔｔｃｇｃｔｔｔｇｃｔａｔａｔｇａｇｇａｃｃｔｇｔｇｇｃａｔｇｔｔｔｇｔｃｔａｃａｇｔａａｇｔｇａａａａｔｔａｔｇｇｇｃａｇｔｇｇｇｔｇａｔａｇａｇｔｇｇｔｇｇｇｔｔｔｇｇｔｇｔｇｇｔａａｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔａａｔｔｔｔｔａｃａｇｔｔｔｔｇｔｇｇｔｔｔａａａｇａａｔｔｔｔｇｔａｔｔｇｔｇａｔｔｔｔｔｔｔａａａａｇｇｔｃｃｔｇｔｇｔｃｔｇａａｃｃｔｇａｇｃｃｔｇａｇｃｃｃｇａｇｃｃａｇａａｃｃｇｇａｇｃｃｔｇｃａａｇａｃｃｔａｃｃｃｇｃｃｇｔｃｃｔａａａａｔｇｇｃｇｃｃｔｇｃｔａｔｃｃｔｇａｇａｃｇｃｃｃｇａｃａｔｃａｃｃｔｇｔｇｔｃｔａｇａｇｃ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
【0021】
ＮｏｔＩ-ＸｂａＩ制限酵素で二重消化し、消化した後に核酸フラグメントを回収し、酵素消化システムは、以下の通りである。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５で示される核酸フラグメント １０μＬ
ＮｏｔＩ ０．５μＬ
ＸｂａＩ ０．５μＬ
１０×Ｂｕｆｆｅｒ ２μＬ
ｄｄＨ ２ Ｏ ７μＬ
合計 ２０μＬ
３７℃の水浴に２時間置いた。
ｐＳｈｕｔｔｌｅ－Ｅ１Ａ－Ｅ１Ｂプラスミドの構築
ＸｈｏＩ－ＭｆｅＩ制限酵素二重消化プラスミドｐＳｈｕｔｔｌｅ（上海吉然生物科技有限公司）及びアデノウイルスベクタープラスミドｐＸＣ２（中国科学院上海生命科学研究院生物化学・細胞生物学研究所の劉新垣院士からの寄贈）を使用し、酵素消化システムは、以下の通りである。
ＸｈｏＩ－ＭｆｅＩ制限酵素二重消化プラスミドｐＳｈｕｔｔｌｅシステム：
ｐＳｈｕｔｔｌｅ １０μＬ
ＸｈｏＩ ０．５μＬ
ＭｆｅＩ ０．５μＬ
１０×Ｂｕｆｆｅｒ ２μＬ
ｄｄＨ ２ Ｏ ７μＬ
合計 ２０μＬ
ＸｈｏＩ－ＭｆｅＩ制限酵素二重消化プラスミドｐＸＣ２システム：
ｐＸＣ２ １０μＬ
ＸｈｏＩ ０．５μＬ
ＭｆｅＩ ０．５μＬ
１０×Ｂｕｆｆｅｒ ２μＬ
ｄｄＨ ２ Ｏ ７μＬ
合計 ２０μＬ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５で示される核酸フラグメント １０μＬ
ＮｏｔＩ ０．５μＬ
ＸｂａＩ ０．５μＬ
１０×Ｂｕｆｆｅｒ ２μＬ
ｄｄＨ ２ Ｏ ７μＬ
合計 ２０μＬ
３７℃の水浴に２時間置いた。
ｐＳｈｕｔｔｌｅ－Ｅ１Ａ－Ｅ１Ｂプラスミドの構築
ＸｈｏＩ－ＭｆｅＩ制限酵素二重消化プラスミドｐＳｈｕｔｔｌｅ（上海吉然生物科技有限公司）及びアデノウイルスベクタープラスミドｐＸＣ２（中国科学院上海生命科学研究院生物化学・細胞生物学研究所の劉新垣院士からの寄贈）を使用し、酵素消化システムは、以下の通りである。
ＸｈｏＩ－ＭｆｅＩ制限酵素二重消化プラスミドｐＳｈｕｔｔｌｅシステム：
ｐＳｈｕｔｔｌｅ １０μＬ
ＸｈｏＩ ０．５μＬ
ＭｆｅＩ ０．５μＬ
１０×Ｂｕｆｆｅｒ ２μＬ
ｄｄＨ ２ Ｏ ７μＬ
合計 ２０μＬ
ＸｈｏＩ－ＭｆｅＩ制限酵素二重消化プラスミドｐＸＣ２システム：
ｐＸＣ２ １０μＬ
ＸｈｏＩ ０．５μＬ
ＭｆｅＩ ０．５μＬ
１０×Ｂｕｆｆｅｒ ２μＬ
ｄｄＨ ２ Ｏ ７μＬ
合計 ２０μＬ
【0022】
上記反応系を３７℃の水浴に２ｈ置き、次いでアガロースゲル電気泳動にかけ、それぞれｐＳｈｕｔｔｌｅプラスミドが制限酵素で切断された大きな断片及びｐＸＣ２プラスミドが制限酵素で切断された小さな断片を回収した。その後、リガーゼを使用して上記回収産物を連結し、ｐＳｈｕｔｔｌｅ－Ｅ１Ａ－Ｅ１Ｂプラスミドとして構築し、中でも、連結反応系は、以下の通りである。
線状化プラスミドｐＳｈｕｔｔｌｅ ４μＬ
線状化プラスミドｐＸＣ２ ２μＬ
Ｌｉｇａｔｉｏｎｈｉｇｈ ４μＬ
Ｔｏｔａｌ １０μＬ
上記反応系を１６℃の水浴に入れて２時間反応させた。連結産物は、プラスミドｐＳｈｕｔｔｌｅ－Ｅ１Ａ－Ｅ１Ｂである。
ＮｏｔＩ－ＸｂａＩ制限酵素でｐＳｈｕｔｔｌｅ－Ｅ１Ａ－Ｅ１Ｂプラスミドを二重消化し、大きな断片（ベクターフラグメント）を回収した。その後、Ｌｉｇａｔｉｏｎｈｉｇｈリガーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）を使用して制限酵素で切断された核酸フラグメントとベクターフラグメントを連結し、連結システムは、以下の通りである。
制限酵素切断後のｐＳｈｕｔｔｌｅ－Ｅ１Ａ－Ｅ１Ｂプラスミド断片 ０．５μＬ
制限酵素切断後の核酸フラグメント ５．５μＬ
Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ ４μＬ
Ｔｏｔａｌ １０μＬ
１６℃の水浴に２時間置き、連結産物は、ｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂである。
線状化プラスミドｐＳｈｕｔｔｌｅ ４μＬ
線状化プラスミドｐＸＣ２ ２μＬ
Ｌｉｇａｔｉｏｎｈｉｇｈ ４μＬ
Ｔｏｔａｌ １０μＬ
上記反応系を１６℃の水浴に入れて２時間反応させた。連結産物は、プラスミドｐＳｈｕｔｔｌｅ－Ｅ１Ａ－Ｅ１Ｂである。
ＮｏｔＩ－ＸｂａＩ制限酵素でｐＳｈｕｔｔｌｅ－Ｅ１Ａ－Ｅ１Ｂプラスミドを二重消化し、大きな断片（ベクターフラグメント）を回収した。その後、Ｌｉｇａｔｉｏｎｈｉｇｈリガーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）を使用して制限酵素で切断された核酸フラグメントとベクターフラグメントを連結し、連結システムは、以下の通りである。
制限酵素切断後のｐＳｈｕｔｔｌｅ－Ｅ１Ａ－Ｅ１Ｂプラスミド断片 ０．５μＬ
制限酵素切断後の核酸フラグメント ５．５μＬ
Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ ４μＬ
Ｔｏｔａｌ １０μＬ
１６℃の水浴に２時間置き、連結産物は、ｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂである。
【0023】
２、組換えプラスミドｐＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂの構築
（１）ＰｍｅＩ酵素を使用してｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂを単一の制限酵素で切断して線状化し、反応系は、以下の通りである。
ｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ ８μＬ
ＰｍｅＩ １μＬ
１０×Ｂｕｆｆｅｒ ２μＬ
ｄｄＨ ２ Ｏ ９μＬ
合計 ２０μＬ
上記反応系を３７℃の水浴に置いて１時間反応させた後、次のステップの脱リン酸化を施した。
（２）ＦａｓｔＡｐを使用してステップ（１）で線状化されたｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＩＦＮ－３－ ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂプラスミドを脱リン酸化し、反応系は、以下の通りである。
線状化プラスミドｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ
８μＬ
ＦａｓｔＡｐ １μＬ
１０×Ｂｕｆｆｅｒ ２μＬ
ｄｄＨ ２ Ｏ ９μＬ
合計 ２０μＬ
上記反応系を３７℃の水浴に１時間置いた後、次の形質転換実験を行った。
（１）ＰｍｅＩ酵素を使用してｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂを単一の制限酵素で切断して線状化し、反応系は、以下の通りである。
ｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ ８μＬ
ＰｍｅＩ １μＬ
１０×Ｂｕｆｆｅｒ ２μＬ
ｄｄＨ ２ Ｏ ９μＬ
合計 ２０μＬ
上記反応系を３７℃の水浴に置いて１時間反応させた後、次のステップの脱リン酸化を施した。
（２）ＦａｓｔＡｐを使用してステップ（１）で線状化されたｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＩＦＮ－３－ ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂプラスミドを脱リン酸化し、反応系は、以下の通りである。
線状化プラスミドｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ
８μＬ
ＦａｓｔＡｐ １μＬ
１０×Ｂｕｆｆｅｒ ２μＬ
ｄｄＨ ２ Ｏ ９μＬ
合計 ２０μＬ
上記反応系を３７℃の水浴に１時間置いた後、次の形質転換実験を行った。
【0024】
（３）ＢＪ５１８３コンピテントセルにおいてアデノウイルスバックボーンプラスミドと線状化ｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂを組換えることにより、組換えプラスミドｐＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂが得られ、具体的な手順は、以下の通りである。
１）前の実験での線状化ｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂを取り、ＢＪ５１８３コンピテントセルを形質転換し、プレートに塗り広げ、バクテリアを選び、一晩振とうし、
２）少量プラスミド抽出用キットを使用して細菌培養液からプラスミドを抽出した。
ここで、ＢＪ５１８３コンピテントセルの調製方法は、中国特許出願ＣＮ２０１８１０６５１９１４．２を参照することができ、以下、簡単に説明した。
ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素でｐＢＨＧＥ３プラスミド（捷易生物から購入）を消化し、ＳｐｅＩ制限酵素でｐＡｄＥａｓｙ－１プラスミド（上海吉然生物科技有限公司から購入）を消化し、その後、上記の２つの制限酵素で切断されたプラスミドを大腸菌ＢＪ５１８３株に形質転換し、相同組換えを起こし、Ｅ３領域を保有する組換えアデノウイルスバックボーンプラスミドを得、次いで、その組換えアデノウイルスバックボーンプラスミドを大腸菌ＤＨ５αに形質転換して増幅し、増幅された組換えアデノウイルスバックボーンプラスミドを得、次に前記組換えアデノウイルスバックボーンプラスミドをコンピテントセル化大腸菌ＢＪ５１８３に形質転換し、組換えアデノウイルスバックボーンプラスミドを保有する大腸菌ＢＪ５１８３株を得、さらにその大腸菌をコンピテントセル化することにより、ステップ１）で使用されるＢＪ５１８３コンピテントセルを得た。
１）前の実験での線状化ｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂを取り、ＢＪ５１８３コンピテントセルを形質転換し、プレートに塗り広げ、バクテリアを選び、一晩振とうし、
２）少量プラスミド抽出用キットを使用して細菌培養液からプラスミドを抽出した。
ここで、ＢＪ５１８３コンピテントセルの調製方法は、中国特許出願ＣＮ２０１８１０６５１９１４．２を参照することができ、以下、簡単に説明した。
ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素でｐＢＨＧＥ３プラスミド（捷易生物から購入）を消化し、ＳｐｅＩ制限酵素でｐＡｄＥａｓｙ－１プラスミド（上海吉然生物科技有限公司から購入）を消化し、その後、上記の２つの制限酵素で切断されたプラスミドを大腸菌ＢＪ５１８３株に形質転換し、相同組換えを起こし、Ｅ３領域を保有する組換えアデノウイルスバックボーンプラスミドを得、次いで、その組換えアデノウイルスバックボーンプラスミドを大腸菌ＤＨ５αに形質転換して増幅し、増幅された組換えアデノウイルスバックボーンプラスミドを得、次に前記組換えアデノウイルスバックボーンプラスミドをコンピテントセル化大腸菌ＢＪ５１８３に形質転換し、組換えアデノウイルスバックボーンプラスミドを保有する大腸菌ＢＪ５１８３株を得、さらにその大腸菌をコンピテントセル化することにより、ステップ１）で使用されるＢＪ５１８３コンピテントセルを得た。
【0025】
（４）制限酵素断片の同定。組換えプラスミドｐＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂプラスミドをコンピテント化大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、プレートに塗り広げた後にモノクローナルコロニーを選び、振とうして培養した後、プラスミドを抽出し、制限酵素断片を同定した。制限酵素反応は、以下の通りである。
ｐＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ ８μＬ
ＭｌｕＩ １μＬ
１０×Ｂｕｆｆｅｒ ２μＬ
ｄｄＨ ２ Ｏ ９μＬ
合計 ２０μＬ
上記反応系を３７℃の水浴において３０ｍｉｎ反応させた後、電気泳動により同定した。
ｐＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ ８μＬ
ＭｌｕＩ １μＬ
１０×Ｂｕｆｆｅｒ ２μＬ
ｄｄＨ ２ Ｏ ９μＬ
合計 ２０μＬ
上記反応系を３７℃の水浴において３０ｍｉｎ反応させた後、電気泳動により同定した。
【0026】
３、組換えウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂのパッケージング
（１）細胞のプレーティング
ＨＥＫ－２９３細胞を６ウェルプレートで２日目に細胞密度が６０％～８０％になるように培養した。
（２）ＰａｃＩ制限酵素により組換えプラスミドｐＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂを消化して線状化し、反応系は、以下の通りである。
ｐＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ １μｇ
ＰａｃＩ １μＬ
１０×Ｂｕｆｆｅｒ ２μＬ
ｄｄＨ２Ｏ ２０μＬまで追加
（３）プラスミドトランスフェクション及びウイルスパッケージング
Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔトランスフェクションキットの取扱説明書に従って、ステップ（２）で線状化された組換えプラスミドｐＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂを１μｇ取り、ステップ（１）で得られた６ウェルプレートにプレーティングされたＨＥＫ－２９３細胞にトランスフェクトした。約７～１０日後、細胞に完全に病理学的変化が発生する際に、ウイルス溶液を収集し、－８０℃で保存して用意した。
（１）細胞のプレーティング
ＨＥＫ－２９３細胞を６ウェルプレートで２日目に細胞密度が６０％～８０％になるように培養した。
（２）ＰａｃＩ制限酵素により組換えプラスミドｐＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂを消化して線状化し、反応系は、以下の通りである。
ｐＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ １μｇ
ＰａｃＩ １μＬ
１０×Ｂｕｆｆｅｒ ２μＬ
ｄｄＨ２Ｏ ２０μＬまで追加
（３）プラスミドトランスフェクション及びウイルスパッケージング
Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔトランスフェクションキットの取扱説明書に従って、ステップ（２）で線状化された組換えプラスミドｐＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂを１μｇ取り、ステップ（１）で得られた６ウェルプレートにプレーティングされたＨＥＫ－２９３細胞にトランスフェクトした。約７～１０日後、細胞に完全に病理学的変化が発生する際に、ウイルス溶液を収集し、－８０℃で保存して用意した。
【0027】
４、組換えウイルスの力価測定
ウイルス力価測定の原理は、ヘキソン染色陽性の細胞数を免疫細胞化学法に基づいて統計学的に計算して感染性を示すウイルスの数量を判定し、アデノウイルス力価測定キットの取扱説明書に従って小幅な増幅及び精製後のアデノウイルスについて力価を測定した。
ウイルス力価測定の原理は、ヘキソン染色陽性の細胞数を免疫細胞化学法に基づいて統計学的に計算して感染性を示すウイルスの数量を判定し、アデノウイルス力価測定キットの取扱説明書に従って小幅な増幅及び精製後のアデノウイルスについて力価を測定した。
【0028】
二、組換え腫瘍溶解性アデノウイルスの機能的検出
１、標的タンパク質発現レベルのウェスタンブロッティング検出
（１）細胞感染及びサンプル収集
６ウェルプレートにＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞をウェルあたり５×１０５ｃｅｌｌｓで培養し、ＣＯ２インキュベーターで翌日まで培養した。空ベクターとしての対照ウイルスｒＡｄ－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ及び組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ、ｒＡｄ－ＩＦＮ－２－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ、ｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂを取り、それぞれ６ウェルプレートで培養したＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を１０ ＭＯＩの接種率で感染させ、各ウイルスあたり１ウェルに感染させ、ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養し続けた。その後、上清を捨て、ウェルあたり１００ ｕｌ ＲＩＰＡライセートで細胞をライセーションし、ライセートを収集して被験サンプルとした。
（２）タンパク質サンプルの前処理
ＢＣＡタンパク質定量キット（Ｔｈｅｒｍｏから購入）を使用してステップ（１）で収集された各サンプルのタンパク質の濃度を測定し、具体的な操作方法は、キットの取扱説明書を参照した。その後、測定結果に応じて、ＲＩＰＡライセートを使用してタンパク質の濃度が一致するように各サンプルの濃度を調整した。次に、各サンプルに最終濃度が１×になるように適切な体積の５×ＳＤＳタンパク質用ローディングバッファー（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入）を加えてよく混合し、１００℃の金属浴で１０ｍｉｎ加熱した。サンプルは、ウェスタンブロット解析に直接使用するか、又は－２０℃の冷蔵庫に保存した。
（３）ウェスタンブロット解析
前処理済みの各タンパク質サンプルを採取し、ウェルあたり２０ｕｇの総タンパク質のロード量でＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動を行い、次いで、ゲル内のサンプルをＢｉｏｒａｄエレクトロポレーターを介してＰＶＤＦメンブレンに転写した。５％スキムミルクで３０ｍｉｎブロックし、次いで、使用濃度まで希釈されたｒＩＦＮ抗体（作製を華安生物に委託する。）、β－ｔｕｂｕｌｉｎ抗体（康為世紀から購入）を加え、シェーカーで４℃で一晩インキュベートした。一次抗体を捨て、ＰＢＳＴバッファーで３回洗浄し、使用濃度に希釈された対応する二次抗体（碧雲日から購入）を加え、シェーカーで室温で２ｈインキュベートした。二次抗体を捨て、ＰＢＳＴバッファーで３回洗浄し、ＥＣＬ化学発光発色検出用キット（翌聖から購入）を使用して発色させ、具体的な操作は、キットの取扱説明書を参照した。
１、標的タンパク質発現レベルのウェスタンブロッティング検出
（１）細胞感染及びサンプル収集
６ウェルプレートにＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞をウェルあたり５×１０５ｃｅｌｌｓで培養し、ＣＯ２インキュベーターで翌日まで培養した。空ベクターとしての対照ウイルスｒＡｄ－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ及び組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ、ｒＡｄ－ＩＦＮ－２－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ、ｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂを取り、それぞれ６ウェルプレートで培養したＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を１０ ＭＯＩの接種率で感染させ、各ウイルスあたり１ウェルに感染させ、ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養し続けた。その後、上清を捨て、ウェルあたり１００ ｕｌ ＲＩＰＡライセートで細胞をライセーションし、ライセートを収集して被験サンプルとした。
（２）タンパク質サンプルの前処理
ＢＣＡタンパク質定量キット（Ｔｈｅｒｍｏから購入）を使用してステップ（１）で収集された各サンプルのタンパク質の濃度を測定し、具体的な操作方法は、キットの取扱説明書を参照した。その後、測定結果に応じて、ＲＩＰＡライセートを使用してタンパク質の濃度が一致するように各サンプルの濃度を調整した。次に、各サンプルに最終濃度が１×になるように適切な体積の５×ＳＤＳタンパク質用ローディングバッファー（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入）を加えてよく混合し、１００℃の金属浴で１０ｍｉｎ加熱した。サンプルは、ウェスタンブロット解析に直接使用するか、又は－２０℃の冷蔵庫に保存した。
（３）ウェスタンブロット解析
前処理済みの各タンパク質サンプルを採取し、ウェルあたり２０ｕｇの総タンパク質のロード量でＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動を行い、次いで、ゲル内のサンプルをＢｉｏｒａｄエレクトロポレーターを介してＰＶＤＦメンブレンに転写した。５％スキムミルクで３０ｍｉｎブロックし、次いで、使用濃度まで希釈されたｒＩＦＮ抗体（作製を華安生物に委託する。）、β－ｔｕｂｕｌｉｎ抗体（康為世紀から購入）を加え、シェーカーで４℃で一晩インキュベートした。一次抗体を捨て、ＰＢＳＴバッファーで３回洗浄し、使用濃度に希釈された対応する二次抗体（碧雲日から購入）を加え、シェーカーで室温で２ｈインキュベートした。二次抗体を捨て、ＰＢＳＴバッファーで３回洗浄し、ＥＣＬ化学発光発色検出用キット（翌聖から購入）を使用して発色させ、具体的な操作は、キットの取扱説明書を参照した。
【0029】
２、インターフェロンによるＭＨＣ Ｉ発現の調節
（１）細胞プレーティング及びウイルス接種
２４ウェルプレートにＳＷ７８０、ＭＣＦ－７細胞をウェルあたり１．５×１０５ｃｅｌｌｓで５００ｕｌ／ウェルの培養系を培養し、ＣＯ２インキュベーターで翌日まで培養した。空ベクターとしての対照ウイルスｒＡｄ－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ及び組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ、ｒＡｄ－ＩＦＮ－２－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ、ｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂを取り、それぞれ、１ ＭＯＩの接種率で上記２４ウェルプレートで培養したがん細胞を感染させ、接種体積は、１００ｕｌ／ウェルである。また、各種の細胞は、いずれもウイルスを加えないブランク対照群（ＰＢＳ群）が設けられ、細胞の処置後に均一に穏やかに振とうし、ＣＯ２インキュベーターで２４ｈ培養し続けた。
（２）サンプル処理及びフローサイトメトリー解析
上記２４ｈ処理された細胞を取り、上清を捨て、１＊ＰＢＳで１回洗浄した後、細胞剥離液ａｃｃｕｔａｓｅを２００ｕｌ／ウェルでサンプルウェルに加えた。すべての細胞が収縮して丸くなったら、穏やかに振とうして漂うようにした後、１＊ＰＢＳを８００ｕｌ加え、細胞の吹き飛ばしを５回繰り返し、細胞混合液を１．５ｍｌ ＥＰチューブに移した。１５００ｒ／ｍｉｎで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、１＊ＰＢＳを１ｍｌ加え、さらに１回洗浄して遠心分離した。次に、抗体ワーキング溶液（１ｕｌ抗体ストック溶液：２４０ｕｌ １＊ＰＢＳ）を６０ｕｌ／サンプルで上記洗浄遠心後の細胞に加え、均一に混合した後、室温、遮光下で３０ｍｉｎ染色し、同時に、未染色の細胞を陰性対照とした。染色終了後、１＊ＰＢＳで１回洗浄して遠心分離し、室温で２％ ＰＦＡにて１０ｍｉｎ固定した後、フローサイトメトリー解析（機器の操作手順に従って操作する。）を行い、ロード量は、体積として５０ｕｌ／サンプルである。
（１）細胞プレーティング及びウイルス接種
２４ウェルプレートにＳＷ７８０、ＭＣＦ－７細胞をウェルあたり１．５×１０５ｃｅｌｌｓで５００ｕｌ／ウェルの培養系を培養し、ＣＯ２インキュベーターで翌日まで培養した。空ベクターとしての対照ウイルスｒＡｄ－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ及び組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ、ｒＡｄ－ＩＦＮ－２－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ、ｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂを取り、それぞれ、１ ＭＯＩの接種率で上記２４ウェルプレートで培養したがん細胞を感染させ、接種体積は、１００ｕｌ／ウェルである。また、各種の細胞は、いずれもウイルスを加えないブランク対照群（ＰＢＳ群）が設けられ、細胞の処置後に均一に穏やかに振とうし、ＣＯ２インキュベーターで２４ｈ培養し続けた。
（２）サンプル処理及びフローサイトメトリー解析
上記２４ｈ処理された細胞を取り、上清を捨て、１＊ＰＢＳで１回洗浄した後、細胞剥離液ａｃｃｕｔａｓｅを２００ｕｌ／ウェルでサンプルウェルに加えた。すべての細胞が収縮して丸くなったら、穏やかに振とうして漂うようにした後、１＊ＰＢＳを８００ｕｌ加え、細胞の吹き飛ばしを５回繰り返し、細胞混合液を１．５ｍｌ ＥＰチューブに移した。１５００ｒ／ｍｉｎで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、１＊ＰＢＳを１ｍｌ加え、さらに１回洗浄して遠心分離した。次に、抗体ワーキング溶液（１ｕｌ抗体ストック溶液：２４０ｕｌ １＊ＰＢＳ）を６０ｕｌ／サンプルで上記洗浄遠心後の細胞に加え、均一に混合した後、室温、遮光下で３０ｍｉｎ染色し、同時に、未染色の細胞を陰性対照とした。染色終了後、１＊ＰＢＳで１回洗浄して遠心分離し、室温で２％ ＰＦＡにて１０ｍｉｎ固定した後、フローサイトメトリー解析（機器の操作手順に従って操作する。）を行い、ロード量は、体積として５０ｕｌ／サンプルである。
【0030】
３、比複製能の測定
（１）細胞プレーティング及びウイルス接種
６ウェルプレートに乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、正常乳腺細胞株ＭＣＦ－１０Ａを培養し、それぞれ１．２×１０６、８×１０５細胞／ウェルの密度でプレーティングし、２ｍｌ／ウェルの培養系を、ＣＯ２インキュベーターで翌日まで培養した。組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ、ｒＡｄ－ＩＦＮ－２－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ、ｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂをそれぞれ１ ＭＯＩの接種率で上記６ウェルプレートで培養した細胞を感染させ、各種のウイルスあたりｔｒｉｐｌｉｃａｔｅで感染させ、接種体積は１００ｕｌ／ウェルであり、細胞を処置した後、均一に穏やかに振とうし、ＣＯ２インキュベーターで７２ｈ培養し続けた。
（２）サンプルの収集、前処理及び小分け包装
上記７２ｈ処理した細胞を取り、６ウェルプレートの周りにパラフィルムで密封した後、－８０℃の冷蔵庫に保存した。室温から－８０℃まで３回凍結融解処理を繰り返し、３回目の融解後、ピペットで細胞を吹き飛ばし、培地とよく混合した。培養過程での液体の蒸発を考慮して、最終的に各ウェルのサンプルの総体積を培地で２ｍｌまで追加する必要があり、よく混合した後、３つの部分に分割し（１つの部分は、力価の検出に使用し、残りの２つの部分は、用意した。）、８０℃の冷蔵庫に保存した。
（１）細胞プレーティング及びウイルス接種
６ウェルプレートに乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、正常乳腺細胞株ＭＣＦ－１０Ａを培養し、それぞれ１．２×１０６、８×１０５細胞／ウェルの密度でプレーティングし、２ｍｌ／ウェルの培養系を、ＣＯ２インキュベーターで翌日まで培養した。組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ、ｒＡｄ－ＩＦＮ－２－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ、ｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂをそれぞれ１ ＭＯＩの接種率で上記６ウェルプレートで培養した細胞を感染させ、各種のウイルスあたりｔｒｉｐｌｉｃａｔｅで感染させ、接種体積は１００ｕｌ／ウェルであり、細胞を処置した後、均一に穏やかに振とうし、ＣＯ２インキュベーターで７２ｈ培養し続けた。
（２）サンプルの収集、前処理及び小分け包装
上記７２ｈ処理した細胞を取り、６ウェルプレートの周りにパラフィルムで密封した後、－８０℃の冷蔵庫に保存した。室温から－８０℃まで３回凍結融解処理を繰り返し、３回目の融解後、ピペットで細胞を吹き飛ばし、培地とよく混合した。培養過程での液体の蒸発を考慮して、最終的に各ウェルのサンプルの総体積を培地で２ｍｌまで追加する必要があり、よく混合した後、３つの部分に分割し（１つの部分は、力価の検出に使用し、残りの２つの部分は、用意した。）、８０℃の冷蔵庫に保存した。
【0031】
（３）サンプル力価の測定及び複製倍数の計算
Ｃｅｌｌ ｂｉｏｌａｂｓ社のＱｕｉｃｋＴｉｔｅｒＴＭ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｔｉｔｅｒ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｋｉｔを使用して上記小分け包装のサンプルの１つの部分を選択して力価の検出を行った。測定の原理は、ヘキソン染色陽性の細胞数を免疫細胞化学法に基づいて統計学的に計算して感染性を示すウイルスの数量を判定し、具体的な操作方法は、以下の通りである。
１）２９３Ａ細胞を２．５＊１０５ｃｅｌｌｓ／ウェルの密度で２４ウェルプレート（１ｍｌ／ウェル）に接種し、細胞が壁に付着した後（約２４ｈ）各ウェルに段階希釈された被験ウイルス１００ｕｌを加えた。ウイルスを加えないウェルをブランク対照として、各勾配ごとに細胞をｄｕｐｌｉｃａｔｅで、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で培養し続けた。
２）２日間培養後、２４ウェルプレートを取り出し、生物学的安全キャビネットで上清を吸引して捨て、－２０℃で予冷したメタノールを５００ｕｌ／ウェルの量で加え、－２０℃の冷蔵庫で２０ｍｉｎ放置した。
３）細胞を１＊ＰＢＳで３回穏やかに洗浄し、１％ ＢＳＡで１ｈブロックした。
４）１％ ＢＳＡを吸い出して捨て、予め希釈された一次抗体ａｎｔｉ－Ｈｅｘｏｎを２５０ｕｌ／ウェルの量で加えて室温で１ｈインキュベートした。
５）細胞を１＊ＰＢＳで３回穏やかに洗浄し、予め希釈された二次抗体（ＨＲＰ）を２５０ｕｌ／ウェルの量で加え、室温で１ｈインキュベートした。
Ｃｅｌｌ ｂｉｏｌａｂｓ社のＱｕｉｃｋＴｉｔｅｒＴＭ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｔｉｔｅｒ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｋｉｔを使用して上記小分け包装のサンプルの１つの部分を選択して力価の検出を行った。測定の原理は、ヘキソン染色陽性の細胞数を免疫細胞化学法に基づいて統計学的に計算して感染性を示すウイルスの数量を判定し、具体的な操作方法は、以下の通りである。
１）２９３Ａ細胞を２．５＊１０５ｃｅｌｌｓ／ウェルの密度で２４ウェルプレート（１ｍｌ／ウェル）に接種し、細胞が壁に付着した後（約２４ｈ）各ウェルに段階希釈された被験ウイルス１００ｕｌを加えた。ウイルスを加えないウェルをブランク対照として、各勾配ごとに細胞をｄｕｐｌｉｃａｔｅで、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で培養し続けた。
２）２日間培養後、２４ウェルプレートを取り出し、生物学的安全キャビネットで上清を吸引して捨て、－２０℃で予冷したメタノールを５００ｕｌ／ウェルの量で加え、－２０℃の冷蔵庫で２０ｍｉｎ放置した。
３）細胞を１＊ＰＢＳで３回穏やかに洗浄し、１％ ＢＳＡで１ｈブロックした。
４）１％ ＢＳＡを吸い出して捨て、予め希釈された一次抗体ａｎｔｉ－Ｈｅｘｏｎを２５０ｕｌ／ウェルの量で加えて室温で１ｈインキュベートした。
５）細胞を１＊ＰＢＳで３回穏やかに洗浄し、予め希釈された二次抗体（ＨＲＰ）を２５０ｕｌ／ウェルの量で加え、室温で１ｈインキュベートした。
【0032】
６）細胞を１＊ＰＢＳで３回穏やかに洗浄し、１＊ＤＡＢワーキング溶液を加え、室温で１５ｍｉｎ染色した。
７）細胞を１＊ＰＢＳで２回穏やかに洗浄し、最後に、さらに細胞が乾燥しないように１＊ＰＢＳを２００ｕｌ／ウェルの量で加えた。
８）顕微鏡で写真を撮り、１０倍の対物レンズ及び１０倍の接眼レンズを使用し、各ウェルごとに９つの箇所（上、下、左、右、左上、左下、右上、右下及び直中の位置）のそれぞれを選択して写真を撮った。
９）対応する希釈勾配の下で、各視野に存在するウイルスユニットの数をカウントし、各視野あたり５０個程度のウイルスユニットの勾配を、最良のカウント勾配とし、実際のカウントで得られた各視野の陽性点の平均数をＹとすると、ウイルスの力価（ｉｆｕ／ｍｌ）は、１３５．２×Ｙ×希釈倍数である。
各サンプルの力価にサンプルの全体積２ｍｌを掛けると、各サンプルウェルの総収量になった。最後に、複製倍数＝総収量／初期接種量により各サンプルの複製倍数を計算した。
４、クリスタルバイオレット法による腫瘍溶解性ウイルスの安全性の検出
細胞を２４ウェルプレートにプレーティングし、１日後に適切なＭＯＩの被験組換えアデノウイルスを細胞に感染させ、３７℃で４日間培養し続けた後、培地を捨て、各ウェルにクリスタルバイオレット染色液（２％クリスタルバイオレットを２０％メタノールに溶解させた溶液）５００μＬを加え、３０ｍｉｎ染色し、余分な染色液を純粋な水で洗浄し、乾燥させた後、写真を撮った。
７）細胞を１＊ＰＢＳで２回穏やかに洗浄し、最後に、さらに細胞が乾燥しないように１＊ＰＢＳを２００ｕｌ／ウェルの量で加えた。
８）顕微鏡で写真を撮り、１０倍の対物レンズ及び１０倍の接眼レンズを使用し、各ウェルごとに９つの箇所（上、下、左、右、左上、左下、右上、右下及び直中の位置）のそれぞれを選択して写真を撮った。
９）対応する希釈勾配の下で、各視野に存在するウイルスユニットの数をカウントし、各視野あたり５０個程度のウイルスユニットの勾配を、最良のカウント勾配とし、実際のカウントで得られた各視野の陽性点の平均数をＹとすると、ウイルスの力価（ｉｆｕ／ｍｌ）は、１３５．２×Ｙ×希釈倍数である。
各サンプルの力価にサンプルの全体積２ｍｌを掛けると、各サンプルウェルの総収量になった。最後に、複製倍数＝総収量／初期接種量により各サンプルの複製倍数を計算した。
４、クリスタルバイオレット法による腫瘍溶解性ウイルスの安全性の検出
細胞を２４ウェルプレートにプレーティングし、１日後に適切なＭＯＩの被験組換えアデノウイルスを細胞に感染させ、３７℃で４日間培養し続けた後、培地を捨て、各ウェルにクリスタルバイオレット染色液（２％クリスタルバイオレットを２０％メタノールに溶解させた溶液）５００μＬを加え、３０ｍｉｎ染色し、余分な染色液を純粋な水で洗浄し、乾燥させた後、写真を撮った。
【0033】
５、ｉｎ ｖｉｖｏ薬効試験
ＳＷ６２０細胞ヌードマウス異種移植腫瘍モデル
実験ヌードマウスが６週齢になると、ＳＷ６２０腫瘍細胞を１×１０６個注射して腫瘍形成実験を行い、測定後、腫瘍サイズが８０～１００ｍｍ３程度であり、身体的健康状態が良好であり、この場合、マウスをＰＢＳ群、ｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ群及びＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ群という３群にランダムに分け、すべてを、用量１．５×１０１０ｖｐ／匹／回、１日おきに１回、合計４回腫瘍内注射した。３日おきに腫瘍サイズを観察し測定した。
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞ヌードマウス異種移植腫瘍モデル
実験ヌードマウスが５週齢になると、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍細胞を２×１０６個注射して腫瘍形成実験を行い、測定後、腫瘍サイズが８０～１００ｍｍ３程度であり、身体的健康状態が良好であり、この場合、マウスをＰＢＳ群（腫瘍内投与、１日おきに１回、合計４回）、陽性薬Ｓｏｒａｆｅｎｉｂ群（胃内投与、単回用量３０ｍｇ／ｋｇ、１日１回、合計１４日）及びｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ群（腫瘍内投与、用量１．５×１０１０ｖｐ／匹／回、１日おきに１回、合計４回）という３群にランダムに分け、各群あたり８匹、３日おきに腫瘍サイズを観察し測定した。
ＨＣＣ８２７細胞ヌードマウス異種移植腫瘍モデル
実験ヌードマウスが５週齢になると、ＨＣＣ８２７腫瘍細胞を２×１０６個注射して腫瘍形成実験を行い、測定後、腫瘍サイズが８０～１００ｍｍ３程度であり、身体的健康状態が良好であり、この場合、マウスをＰＢＳ群（ｎ＝８、腫瘍内投与、１日おきに１回、合計４回）、陽性薬Ｓｏｒａｆｅｎｉｂ群（ｎ＝５、胃内投与、用量３０ｍｇ／ｋｇ、１日１回、合計１４日）、陽性薬Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ群（ｎ＝５、尾静脈注射、用量１２０ｍｇ／ｋｇ、４日１回、合計４回）ｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ群（ｎ＝５、腫瘍内投与、用量１．５×１０１０ｖｐ／匹／回、１日おきに１回、合計４回）という４群にランダムに分け、３日おきに腫瘍サイズを観察し測定した。
ＳＷ６２０細胞ヌードマウス異種移植腫瘍モデル
実験ヌードマウスが６週齢になると、ＳＷ６２０腫瘍細胞を１×１０６個注射して腫瘍形成実験を行い、測定後、腫瘍サイズが８０～１００ｍｍ３程度であり、身体的健康状態が良好であり、この場合、マウスをＰＢＳ群、ｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ群及びＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ群という３群にランダムに分け、すべてを、用量１．５×１０１０ｖｐ／匹／回、１日おきに１回、合計４回腫瘍内注射した。３日おきに腫瘍サイズを観察し測定した。
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞ヌードマウス異種移植腫瘍モデル
実験ヌードマウスが５週齢になると、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍細胞を２×１０６個注射して腫瘍形成実験を行い、測定後、腫瘍サイズが８０～１００ｍｍ３程度であり、身体的健康状態が良好であり、この場合、マウスをＰＢＳ群（腫瘍内投与、１日おきに１回、合計４回）、陽性薬Ｓｏｒａｆｅｎｉｂ群（胃内投与、単回用量３０ｍｇ／ｋｇ、１日１回、合計１４日）及びｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ群（腫瘍内投与、用量１．５×１０１０ｖｐ／匹／回、１日おきに１回、合計４回）という３群にランダムに分け、各群あたり８匹、３日おきに腫瘍サイズを観察し測定した。
ＨＣＣ８２７細胞ヌードマウス異種移植腫瘍モデル
実験ヌードマウスが５週齢になると、ＨＣＣ８２７腫瘍細胞を２×１０６個注射して腫瘍形成実験を行い、測定後、腫瘍サイズが８０～１００ｍｍ３程度であり、身体的健康状態が良好であり、この場合、マウスをＰＢＳ群（ｎ＝８、腫瘍内投与、１日おきに１回、合計４回）、陽性薬Ｓｏｒａｆｅｎｉｂ群（ｎ＝５、胃内投与、用量３０ｍｇ／ｋｇ、１日１回、合計１４日）、陽性薬Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ群（ｎ＝５、尾静脈注射、用量１２０ｍｇ／ｋｇ、４日１回、合計４回）ｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ群（ｎ＝５、腫瘍内投与、用量１．５×１０１０ｖｐ／匹／回、１日おきに１回、合計４回）という４群にランダムに分け、３日おきに腫瘍サイズを観察し測定した。
【0034】
ＨＣＣ１８０６細胞ヌードマウス異種移植腫瘍モデル
実験ヌードマウスが５週齢になると、ＨＣＣ１８０６腫瘍細胞を２×１０６個注射して腫瘍形成実験を行い、測定後、腫瘍サイズが８０～１００ｍｍ３程度であり、身体的健康状態が良好であり、この場合、マウスをウイルス保存液（Ｖｅｈｉｃｌｅ）群（ｎ＝５、腫瘍内投与、１日おきに１回、共５回）、組換えインターフェロンｒＩＦＮ（２０ｕｇ／匹／回）群（ｎ＝５、腹腔注射、１日おきに１回、共５回）、空ベクター腫瘍溶解性ウイルスｒＡｄ－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ群（ｎ＝５、腫瘍内投与、用量１．５×１０１０ｖｐ／匹／回、１日おきに１回、共５回）、空ベクターと組換えインターフェロンの併用投与ｒＩＦＮ＋ｒＡｄ－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ群（ｎ＝５、空のウイルスベクター腫瘍内投与、用量１．５×１０１０ｖｐ／匹／回、１日おきに１回、共５回、ｒＩＦＮ腹腔注射、１日おきに１回、共５回）、組換え腫瘍溶解性ウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ群（ｎ＝５、腫瘍内投与、用量１．５×１０１０ｖｐ／匹／回、１日おきに１回、共５回）という５群をランダムに分け、腫瘍溶解性ウイルスの初回投与は、群分けの当日であるが、組換えインターフェロンの初回投与は、群分けしの翌日であり、腫瘍溶解性ウイルスの投与後、３日ごとに１回腫瘍サイズを観察し測定した。
ＨＣＣ８２７細胞ヒト化免疫系マウス異種移植腫瘍モデル
このモデルの作成は、澎立生物医薬技術（上海）有限公司に委託された。澎立生物が作成したＣＤ３４＋ヒト化マウスは、この実験に使用され、実験開始時の動物は、特定の病原微生物がいない（ＳＰＦ）レベルであり、約２２～２３週齢であり、ヒト化免疫系の構築に成功する（ヒトＣＤ４５＋細胞の比率は、１５％を超える。）ことを確認した後、各マウスの左側及び右側にそれぞれＨＣＣ８２７腫瘍細胞を２×１０６個注射して腫瘍形成実験を行い、測定後、腫瘍サイズが８０～１００ｍｍ３程度であり、身体的健康状態が良好であり、この場合、マウスをＶｅｈｉｃｌｅ群（ウイルス凍結保存液、ｎ＝６、腫瘍内投与、１日おきに１回、合計５回）、陽性薬Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ群（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ(R)ゲムシタビン、ｎ＝６、尾静脉注射、用量１２０ｍｇ／ｋｇ、４日１回、合計４回）、陽性対照ＰＤ－１抗体群（礼進生物医薬科技（上海）有限公司から寄贈、ｎ＝６、腹腔注射、用量１０ｍｇ／ｋｇ、毎週２回、合計６回）及びｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ群（ｎ＝６、腫瘍内投与、用量１．５×１０１０ｖｐ／匹／回、１日おきに１回、合計５回）という４群にランダムに分け、両側に腫瘍が形成され、右側のみが投与された。腫瘍サイズを毎週２回観察し測定した。
ＰＤＸヌードマウス異種移植腫瘍モデル
このモデルの作成は、上海立迪生物技術股▼分▲有限公司に委託された。１例のトリプルネガティブ乳がん、１例の肺扁平上皮細胞がん及び１例の肺腺がんＰＤＸｉｎ ｖｉｖｏ移植腫瘍の腫瘍塊を約３ｍｍ×３ｍｍ×３ｍｍ（約５０～９０ｍｇ）の腫瘍組織に切出し、５週齢のヌードマウスに皮下接種した。接種後のマウスを観察し、腫瘍の成長をモニタリングし、担癌マウスの平均腫瘍体積が約１５０ｍｍ３に達すると、群分け及び投与観察を行った。各ＰＤＸモデルは、いずれも２群にランダムに分け、各群あたり３匹マウスがある。１群は、Ｖｅｈｉｃｌｅ群（ウイルス凍結保存液、腫瘍内投与、１日おきに１回、合計５回）であり、もう１群は、ｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ群（腫瘍内投与、用量１．５×１０１０ｖｐ／匹／回、１日おきに１回、合計５回）である。腫瘍サイズを毎週２回観察し測定した。
実験ヌードマウスが５週齢になると、ＨＣＣ１８０６腫瘍細胞を２×１０６個注射して腫瘍形成実験を行い、測定後、腫瘍サイズが８０～１００ｍｍ３程度であり、身体的健康状態が良好であり、この場合、マウスをウイルス保存液（Ｖｅｈｉｃｌｅ）群（ｎ＝５、腫瘍内投与、１日おきに１回、共５回）、組換えインターフェロンｒＩＦＮ（２０ｕｇ／匹／回）群（ｎ＝５、腹腔注射、１日おきに１回、共５回）、空ベクター腫瘍溶解性ウイルスｒＡｄ－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ群（ｎ＝５、腫瘍内投与、用量１．５×１０１０ｖｐ／匹／回、１日おきに１回、共５回）、空ベクターと組換えインターフェロンの併用投与ｒＩＦＮ＋ｒＡｄ－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ群（ｎ＝５、空のウイルスベクター腫瘍内投与、用量１．５×１０１０ｖｐ／匹／回、１日おきに１回、共５回、ｒＩＦＮ腹腔注射、１日おきに１回、共５回）、組換え腫瘍溶解性ウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ群（ｎ＝５、腫瘍内投与、用量１．５×１０１０ｖｐ／匹／回、１日おきに１回、共５回）という５群をランダムに分け、腫瘍溶解性ウイルスの初回投与は、群分けの当日であるが、組換えインターフェロンの初回投与は、群分けしの翌日であり、腫瘍溶解性ウイルスの投与後、３日ごとに１回腫瘍サイズを観察し測定した。
ＨＣＣ８２７細胞ヒト化免疫系マウス異種移植腫瘍モデル
このモデルの作成は、澎立生物医薬技術（上海）有限公司に委託された。澎立生物が作成したＣＤ３４＋ヒト化マウスは、この実験に使用され、実験開始時の動物は、特定の病原微生物がいない（ＳＰＦ）レベルであり、約２２～２３週齢であり、ヒト化免疫系の構築に成功する（ヒトＣＤ４５＋細胞の比率は、１５％を超える。）ことを確認した後、各マウスの左側及び右側にそれぞれＨＣＣ８２７腫瘍細胞を２×１０６個注射して腫瘍形成実験を行い、測定後、腫瘍サイズが８０～１００ｍｍ３程度であり、身体的健康状態が良好であり、この場合、マウスをＶｅｈｉｃｌｅ群（ウイルス凍結保存液、ｎ＝６、腫瘍内投与、１日おきに１回、合計５回）、陽性薬Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ群（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ(R)ゲムシタビン、ｎ＝６、尾静脉注射、用量１２０ｍｇ／ｋｇ、４日１回、合計４回）、陽性対照ＰＤ－１抗体群（礼進生物医薬科技（上海）有限公司から寄贈、ｎ＝６、腹腔注射、用量１０ｍｇ／ｋｇ、毎週２回、合計６回）及びｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ群（ｎ＝６、腫瘍内投与、用量１．５×１０１０ｖｐ／匹／回、１日おきに１回、合計５回）という４群にランダムに分け、両側に腫瘍が形成され、右側のみが投与された。腫瘍サイズを毎週２回観察し測定した。
ＰＤＸヌードマウス異種移植腫瘍モデル
このモデルの作成は、上海立迪生物技術股▼分▲有限公司に委託された。１例のトリプルネガティブ乳がん、１例の肺扁平上皮細胞がん及び１例の肺腺がんＰＤＸｉｎ ｖｉｖｏ移植腫瘍の腫瘍塊を約３ｍｍ×３ｍｍ×３ｍｍ（約５０～９０ｍｇ）の腫瘍組織に切出し、５週齢のヌードマウスに皮下接種した。接種後のマウスを観察し、腫瘍の成長をモニタリングし、担癌マウスの平均腫瘍体積が約１５０ｍｍ３に達すると、群分け及び投与観察を行った。各ＰＤＸモデルは、いずれも２群にランダムに分け、各群あたり３匹マウスがある。１群は、Ｖｅｈｉｃｌｅ群（ウイルス凍結保存液、腫瘍内投与、１日おきに１回、合計５回）であり、もう１群は、ｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ群（腫瘍内投与、用量１．５×１０１０ｖｐ／匹／回、１日おきに１回、合計５回）である。腫瘍サイズを毎週２回観察し測定した。
【0035】
三、パイロットスケールの細胞収率の測定
継代培養されたＨＥＫ－２９３細胞を取り、ＤＭＥＭ培地（１０％ ＦＢＳ含有）を使用して１７つのＴ１７５（コーニングから購入）培養フラスコに拡大培養し、各フラスコ内の細胞が均一に分布するように注意した。ウイルスの接種前に、１つのＴ１７５培養フラスコをランダムに取り、元の培地を捨て、トリプシン５ｍｌを加えて消化した後、細胞を収集し、適切に希釈し、次にセルカウンターを使用して細胞濃度を測定することにより、この時点で１つのＴ１７５培養フラスコ中の細胞数を計算した。その後、試験する組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ、ｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂを取りＶＰ検出（ＨＰＬＣ法）を行い、ウイルスシード濃度を得た。２つの試験する腫瘍溶解性アデノウイルスは、それぞれ４００：１、８００：１のウイルス／細胞比で４つのＴ１７５培養フラスコに接種し、群分けに記号を付けて、合計１６つのＴ１７５培養フラスコである。ＣＯ２インキュベーターで４２ｈ培養した後、各群は２つのＴ１７５培養フラスコを収穫し、５４ｈ培養した後、各群は残りの２つのＴ１７５培養フラスコを収穫した。収穫時に、まず、フラスコから元の培養液を上清サンプルとして収集して、次に、各フラスコにウイルス保存液５ｍｌを加え、全ての細胞を細胞サンプルとして１５ｍｌ遠心チューブにこすり落とした。室温から－８０℃まで３回凍結融解を繰り返し、遠心分離して上清２ｍｌを収集してＶＰ検出に適用した。上清サンプル及び細胞サンプルのＶＰ検出結果の合計から各群の総収量を求め、接種時の細胞数で割って各群の単細胞収量を得た。
継代培養されたＨＥＫ－２９３細胞を取り、ＤＭＥＭ培地（１０％ ＦＢＳ含有）を使用して１７つのＴ１７５（コーニングから購入）培養フラスコに拡大培養し、各フラスコ内の細胞が均一に分布するように注意した。ウイルスの接種前に、１つのＴ１７５培養フラスコをランダムに取り、元の培地を捨て、トリプシン５ｍｌを加えて消化した後、細胞を収集し、適切に希釈し、次にセルカウンターを使用して細胞濃度を測定することにより、この時点で１つのＴ１７５培養フラスコ中の細胞数を計算した。その後、試験する組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ、ｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂを取りＶＰ検出（ＨＰＬＣ法）を行い、ウイルスシード濃度を得た。２つの試験する腫瘍溶解性アデノウイルスは、それぞれ４００：１、８００：１のウイルス／細胞比で４つのＴ１７５培養フラスコに接種し、群分けに記号を付けて、合計１６つのＴ１７５培養フラスコである。ＣＯ２インキュベーターで４２ｈ培養した後、各群は２つのＴ１７５培養フラスコを収穫し、５４ｈ培養した後、各群は残りの２つのＴ１７５培養フラスコを収穫した。収穫時に、まず、フラスコから元の培養液を上清サンプルとして収集して、次に、各フラスコにウイルス保存液５ｍｌを加え、全ての細胞を細胞サンプルとして１５ｍｌ遠心チューブにこすり落とした。室温から－８０℃まで３回凍結融解を繰り返し、遠心分離して上清２ｍｌを収集してＶＰ検出に適用した。上清サンプル及び細胞サンプルのＶＰ検出結果の合計から各群の総収量を求め、接種時の細胞数で割って各群の単細胞収量を得た。
【0036】
実施例１ コンセンサスインターフェロン遺伝子を運ぶ組換え腫瘍溶解性アデノウイルスの構築
コンセンサスインターフェロン遺伝子を運ぶ組換え腫瘍溶解性アデノウイルスの構造及び構築方法は、野生型アデノウイルスに基づいて、Ｅ１Ａタンパク質コード遺伝子のＥ１Ａタンパク質の１２２～１２９番目のアミノ酸をコードする２４塩基対（３６４～３８７ｂｐ）を削除した。上記セグメントを削除した後、Ｅ１Ａタンパク質は、Ｒｂタンパク質に結合できないため、Ｅ２Ｆを放出できず、宿主細胞が細胞周期に入るのを促進でき、以上の改良されたウイルスは、Ｒｂの異常な腫瘍細胞でのみ選択的に複製することができる。Ｅ１Ａの野生型プロモーターの代わりに腫瘍特異的サービビン(Ｓｕｒｖｉｖｉｎ)プロモーターを使用し、さらにアデノウイルスの安全性及び標的化を増強させた。コンセンサスインターフェロン（ＩＮＦＥＲＧＥＮ）タンパク質の発現カセット配列（それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２、３及び４で示される。）を上記アデノウイルスベクターに挿入することにより、最終的にコンセンサスインターフェロン遺伝子を運ぶ組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示される発現カセットを含む。）、ｒＡｄ－ＩＦＮ－２－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示される発現カセットを含む。）及びｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示される発現カセットを含む。）を得た。
次いで、以上の３つのウイルスを寄託し、寄託機関は、中国典型培養物保蔵センター（中国武漢）であり、具体的な寄託情報は、以下の通りである。
１）寄託日：２０１８年１２月１２日、寄託名称：組換えヒト５型アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ、寄託番号がＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｖ２０１８７１、
２）寄託日：２０１９年０８月２６日、寄託名称：組換えヒト５型アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ、寄託番号がＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｖ２０１９５７、
３）寄託日：２０１９年０８月２６日、寄託名称：組換えヒト５型アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－２－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ、寄託番号がＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｖ２０１９５８。
さらに、対照として、ｒＩＦＮ発現カセットを含まない空のウイルスベクターｒＡｄ－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂを構築した。上記ウイルス構築体の構造は、図１に示した。
コンセンサスインターフェロン遺伝子を運ぶ組換え腫瘍溶解性アデノウイルスの構造及び構築方法は、野生型アデノウイルスに基づいて、Ｅ１Ａタンパク質コード遺伝子のＥ１Ａタンパク質の１２２～１２９番目のアミノ酸をコードする２４塩基対（３６４～３８７ｂｐ）を削除した。上記セグメントを削除した後、Ｅ１Ａタンパク質は、Ｒｂタンパク質に結合できないため、Ｅ２Ｆを放出できず、宿主細胞が細胞周期に入るのを促進でき、以上の改良されたウイルスは、Ｒｂの異常な腫瘍細胞でのみ選択的に複製することができる。Ｅ１Ａの野生型プロモーターの代わりに腫瘍特異的サービビン(Ｓｕｒｖｉｖｉｎ)プロモーターを使用し、さらにアデノウイルスの安全性及び標的化を増強させた。コンセンサスインターフェロン（ＩＮＦＥＲＧＥＮ）タンパク質の発現カセット配列（それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２、３及び４で示される。）を上記アデノウイルスベクターに挿入することにより、最終的にコンセンサスインターフェロン遺伝子を運ぶ組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示される発現カセットを含む。）、ｒＡｄ－ＩＦＮ－２－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示される発現カセットを含む。）及びｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示される発現カセットを含む。）を得た。
次いで、以上の３つのウイルスを寄託し、寄託機関は、中国典型培養物保蔵センター（中国武漢）であり、具体的な寄託情報は、以下の通りである。
１）寄託日：２０１８年１２月１２日、寄託名称：組換えヒト５型アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ、寄託番号がＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｖ２０１８７１、
２）寄託日：２０１９年０８月２６日、寄託名称：組換えヒト５型アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ、寄託番号がＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｖ２０１９５７、
３）寄託日：２０１９年０８月２６日、寄託名称：組換えヒト５型アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－２－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ、寄託番号がＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｖ２０１９５８。
さらに、対照として、ｒＩＦＮ発現カセットを含まない空のウイルスベクターｒＡｄ－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂを構築した。上記ウイルス構築体の構造は、図１に示した。
【0037】
実施例２ 組換え腫瘍溶解性アデノウイルスの標的タンパク質発現レベル及び標的タンパク質機能解析
実施例１で構築された異なるコンセンサスインターフェロン発現カセットを含む組換え腫瘍溶解性アデノウイルス外因性治療遺伝子の発現能力、即ち、コンセンサスインターフェロンｒＩＦＮタンパク質を発現する能力を比較し、それぞれ、ｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ、ｒＡｄ－ＩＦＮ－２－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ及びｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂを取り、１０ ＭＯＴでヒト乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１に感染させ、２４時間感染後に細胞を溶解してタンパク質サンプルを収集し、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ解析を行った。
結果は、図２に示し、全てのｒＩＦＮコード配列を運ぶ組換え腫瘍溶解性ウイルスは、いずれも標的タンパク質ｒＩＦＮを発現できるが、空のウイルスベクターには、検出可能なタンパク質バンドがなく、これは、実施例１で構築された組換え腫瘍溶解性ウイルスが細胞内で正常に機能できることを示した。さらに、図２から、組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂが外因性治療遺伝子ｒＩＦＮを発現するレベルが最も高く、次にｒＡｄ－ＩＦＮ－２－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂであり、ｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂが最低であることを示した。これは、標的タンパク質コード配列の違いが標的タンパク質の発現に影響を与えることを示した。
次いで、上記の発現するｒＩＦＮタンパク質が正常な機能を持っているかどうかを検出した。インターフェロンは、Ｉ型主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ Ｉ、ＨＬＡ－ＡＢＣとも呼ばれる。）の発現をアップレギュレートできるためである。従って、以下、ＭＨＣ Ｉの発現量の変化を基準として、各組換え腫瘍溶解性アデノウイルスの発現する外因性組換えインターフェロンｒＩＦＮの機能を比較した。
組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ、ｒＡｄ－ＩＦＮ－２－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ及びｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂを取り、それぞれ１ ＭＯＴでヒト膀胱がん細胞株ＳＷ７８０に感染させ、２４時間感染後に細胞を収集し、染色後にフローサイトメトリーで解析した。結果は、図３Ａに示し、ＭＨＣ Ｉの発現がＰＢＳ群及び空のウイルスベクターｒＡｄ－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ群ではほとんど検出できないが、全てのｒＩＦＮを発現できる組換え腫瘍溶解性アデノウイルスは、いずれもＭＨＣ Ｉの発現を有意にアップレギュレートすることができることが分かった。これは、組換え腫瘍溶解性アデノウイルスによって発現されたｒＩＦＮが正常な活性を有することを示した。中でも、ｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ及びｒＡｄ－ＩＦＮ－２－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂは、ｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１ＢよりもＭＨＣ Ｉの発現をさらに有意にアップレギュレートすることができることを示した。ヒト乳がん細胞株ＭＣＦ－７では、同様の結果（図３Ｂ）を得た。
実施例１で構築された異なるコンセンサスインターフェロン発現カセットを含む組換え腫瘍溶解性アデノウイルス外因性治療遺伝子の発現能力、即ち、コンセンサスインターフェロンｒＩＦＮタンパク質を発現する能力を比較し、それぞれ、ｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ、ｒＡｄ－ＩＦＮ－２－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ及びｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂを取り、１０ ＭＯＴでヒト乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１に感染させ、２４時間感染後に細胞を溶解してタンパク質サンプルを収集し、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ解析を行った。
結果は、図２に示し、全てのｒＩＦＮコード配列を運ぶ組換え腫瘍溶解性ウイルスは、いずれも標的タンパク質ｒＩＦＮを発現できるが、空のウイルスベクターには、検出可能なタンパク質バンドがなく、これは、実施例１で構築された組換え腫瘍溶解性ウイルスが細胞内で正常に機能できることを示した。さらに、図２から、組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂが外因性治療遺伝子ｒＩＦＮを発現するレベルが最も高く、次にｒＡｄ－ＩＦＮ－２－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂであり、ｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂが最低であることを示した。これは、標的タンパク質コード配列の違いが標的タンパク質の発現に影響を与えることを示した。
次いで、上記の発現するｒＩＦＮタンパク質が正常な機能を持っているかどうかを検出した。インターフェロンは、Ｉ型主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ Ｉ、ＨＬＡ－ＡＢＣとも呼ばれる。）の発現をアップレギュレートできるためである。従って、以下、ＭＨＣ Ｉの発現量の変化を基準として、各組換え腫瘍溶解性アデノウイルスの発現する外因性組換えインターフェロンｒＩＦＮの機能を比較した。
組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ、ｒＡｄ－ＩＦＮ－２－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ及びｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂを取り、それぞれ１ ＭＯＴでヒト膀胱がん細胞株ＳＷ７８０に感染させ、２４時間感染後に細胞を収集し、染色後にフローサイトメトリーで解析した。結果は、図３Ａに示し、ＭＨＣ Ｉの発現がＰＢＳ群及び空のウイルスベクターｒＡｄ－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ群ではほとんど検出できないが、全てのｒＩＦＮを発現できる組換え腫瘍溶解性アデノウイルスは、いずれもＭＨＣ Ｉの発現を有意にアップレギュレートすることができることが分かった。これは、組換え腫瘍溶解性アデノウイルスによって発現されたｒＩＦＮが正常な活性を有することを示した。中でも、ｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ及びｒＡｄ－ＩＦＮ－２－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂは、ｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１ＢよりもＭＨＣ Ｉの発現をさらに有意にアップレギュレートすることができることを示した。ヒト乳がん細胞株ＭＣＦ－７では、同様の結果（図３Ｂ）を得た。
【0038】
実施例３ 組換え腫瘍溶解性アデノウイルスの腫瘍標的化の測定
実施例１に記載されているように、３つの組換え腫瘍溶解性アデノウイルスは、いずれも複製の標的化の改造を受けているため、腫瘍細胞でのみ複製した。腫瘍細胞を効果的に標的として複製するかどうかは、腫瘍溶解性ウイルスの実際の臨床治療効果と密接に関連した。本実施例は、乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及び正常乳腺細胞ＭＣＦ－１０Ａの各組換え腫瘍溶解性アデノウイルスの複製能力を測定した。
本実施例において、ウイルスの複製能力は、「比複製能」及び「複製標的係数」として測定した。「比複製能」は、腫瘍溶解性アデノウイルスが宿主細胞に一定期間感染した後に産生した子孫ウイルスの数と元に感染されたウイルスの数の比であり、宿主細胞中での腫瘍溶解性アデノウイルスの複製能力を定量的に説明するために使用され、「複製標的係数」は、腫瘍溶解性アデノウイルスが腫瘍細胞における比複製能を正常細胞における比複製能で割ったものであり、腫瘍への腫瘍溶解性アデノウイルスの標的化複製を定量的に説明するために使用された。
具体的には、各組換え腫瘍溶解性アデノウイルスは、いずれも１ ＭＯＩで宿主細胞に感染し、７２時間感染後、子孫ウイルスを収集し、次に子孫ウイルスの力価を測定し、元の感染力価に対して比複製能を得た。さらに、複製標的係数の定義に従って、各ウイルスの腫瘍細胞での複製能および正常細胞での比率から複製標的係数を計算した。
結果は、表１及び図４に示すように、これらの３つの組換え腫瘍溶解性アデノウイルスは、いずれもがん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１でより多く複製することができ、比複製能がいずれも高く、ここで、ｒＡｄ－ＩＦＮ－２－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ及びｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂは、ｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂよりわずかに高いが、正常細胞株ＭＣＦ－１０Ａ中での比複製能がいずれも低く、中でも、ｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ的比複製能は、最も低くなる。以上の結果より、これらの３つの組換え腫瘍溶解性アデノウイルスが正常細胞中でより弱い複製能力を持っていることを示した。ｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂは、乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１中での比複製能がｒＡｄ－ＩＦＮ－２－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ及びｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂよりわずかに低いが、乳腺正常細胞ＭＣＦ－１０Ａで顕著に低い比複製能を持つため、ｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂは最も高い複製標的係数２３．３６を有し、他の２つの組換え腫瘍溶解性アデノウイルスよりもはるかに高い。つまり、ｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂの腫瘍細胞標的化が最も良く、最も高い安全性を有した。
実施例１に記載されているように、３つの組換え腫瘍溶解性アデノウイルスは、いずれも複製の標的化の改造を受けているため、腫瘍細胞でのみ複製した。腫瘍細胞を効果的に標的として複製するかどうかは、腫瘍溶解性ウイルスの実際の臨床治療効果と密接に関連した。本実施例は、乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及び正常乳腺細胞ＭＣＦ－１０Ａの各組換え腫瘍溶解性アデノウイルスの複製能力を測定した。
本実施例において、ウイルスの複製能力は、「比複製能」及び「複製標的係数」として測定した。「比複製能」は、腫瘍溶解性アデノウイルスが宿主細胞に一定期間感染した後に産生した子孫ウイルスの数と元に感染されたウイルスの数の比であり、宿主細胞中での腫瘍溶解性アデノウイルスの複製能力を定量的に説明するために使用され、「複製標的係数」は、腫瘍溶解性アデノウイルスが腫瘍細胞における比複製能を正常細胞における比複製能で割ったものであり、腫瘍への腫瘍溶解性アデノウイルスの標的化複製を定量的に説明するために使用された。
具体的には、各組換え腫瘍溶解性アデノウイルスは、いずれも１ ＭＯＩで宿主細胞に感染し、７２時間感染後、子孫ウイルスを収集し、次に子孫ウイルスの力価を測定し、元の感染力価に対して比複製能を得た。さらに、複製標的係数の定義に従って、各ウイルスの腫瘍細胞での複製能および正常細胞での比率から複製標的係数を計算した。
結果は、表１及び図４に示すように、これらの３つの組換え腫瘍溶解性アデノウイルスは、いずれもがん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１でより多く複製することができ、比複製能がいずれも高く、ここで、ｒＡｄ－ＩＦＮ－２－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ及びｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂは、ｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂよりわずかに高いが、正常細胞株ＭＣＦ－１０Ａ中での比複製能がいずれも低く、中でも、ｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ的比複製能は、最も低くなる。以上の結果より、これらの３つの組換え腫瘍溶解性アデノウイルスが正常細胞中でより弱い複製能力を持っていることを示した。ｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂは、乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１中での比複製能がｒＡｄ－ＩＦＮ－２－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ及びｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂよりわずかに低いが、乳腺正常細胞ＭＣＦ－１０Ａで顕著に低い比複製能を持つため、ｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂは最も高い複製標的係数２３．３６を有し、他の２つの組換え腫瘍溶解性アデノウイルスよりもはるかに高い。つまり、ｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂの腫瘍細胞標的化が最も良く、最も高い安全性を有した。
【表1】
【0039】
実施例４ 組換え腫瘍溶解性アデノウイルスによるがん細胞の特異的殺傷
本実施例は、実施例２で検証された中程度の複製標的係数を有する組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂを例として、本発明に係る組換え腫瘍溶解性アデノウイルスががん細胞及び通常の細胞に及ぼす影響を研究した。対照として、本実施例は、Ｅ１領域が削除された非複製型アデノウイルスをさらに構築し、同時に該ベクターにＩＦＮ－３発現カセットを挿入してＩＦＮ－３遺伝子を保有する非複製型組換えアデノウイルスＡｄ－ＩＦＮ－３を得た（図１を参照）。
まず、肝がん細胞株Ｈｕｈ－７に対するｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ及びＡｄ－ＩＦＮ－３のそれぞれの殺傷効果を研究した。図５Ａに示すように、肝がん細胞に対するｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂの殺傷能力は、非複製型ウイルスＡｄ－ＩＦＮ－３よりも有意に強く、ＭＯＩが１である場合には、ｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂは、Ｈｕｈ－７細胞の半分以上を殺傷することができ、ＭＯＩが１０である場合のＡｄ－ＩＦＮ－３よりも優れた。
次いで、結腸がん細胞株ＳＷ６２０において、複製型と非複製型腫瘍溶解性アデノウイルスの殺傷効果を比較した。図５Ｂに示すように、ｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂは、結腸がん細胞株ＳＷ６２０を殺傷する能力が非複製型ウイルスＡｄ－ＩＦＮ－３よりも有意に強い。ＭＯＩが０．１である場合には、ｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂは、ＳＷ６２０細胞の約半分を殺傷でき、ＭＯＩが１０である場合のＡｄ－ＩＦＮ－３よりも優れた。
次に、本実施例は、さらに、腫瘍溶解性アデノウイルスでのインターフェロン配列の運びの有無時に、がん細胞への殺傷効果を比較し、図５Ｃに示すように、ｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂは、乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１を殺傷する能力が空ベクターとしての対照ウイルスｒＡｄ－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂよりも有意に強い。ＭＯＩが０．５である場合には、ｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂは、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の約半分を殺傷でき、ＭＯＩが５である場合のｒＡｄ－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂと基本的に一致した。
肺がん細胞株ＨＣＣ８２７において、ｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂと空ベクターとしての対照ウイルスｒＡｄ－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂの殺傷効果を比較した。図５Ｄに示すように、結果は、ｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂは、肺がん細胞株ＨＣＣ８２７を殺傷する能力が空ベクターとしての対照ウイルスｒＡｄ－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂよりも有意に強イことを示した。ＭＯＩが５である場合には、ｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂは、ほぼ全てのＨＣＣ８２７細胞を殺傷でき、ＭＯＩが２０である場合のｒＡｄ－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂの効果よりも強いことを示した。
逆に、正常細胞ヒト肝線維芽細胞株ＨＬＦは、図５Ｅに示すように、組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ及びそれに対応する空ベクターとしての対照ウイルスは、いずれもＨＬＦ細胞を殺傷していないことを示した。
以上の結果は、本発明に係る組換え腫瘍溶解性アデノウイルスが腫瘍細胞を特異的に殺傷することができるが、正常細胞にはほとんど影響を及ぼさず、良好な安全性を有することを示した。
本実施例は、実施例２で検証された中程度の複製標的係数を有する組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂを例として、本発明に係る組換え腫瘍溶解性アデノウイルスががん細胞及び通常の細胞に及ぼす影響を研究した。対照として、本実施例は、Ｅ１領域が削除された非複製型アデノウイルスをさらに構築し、同時に該ベクターにＩＦＮ－３発現カセットを挿入してＩＦＮ－３遺伝子を保有する非複製型組換えアデノウイルスＡｄ－ＩＦＮ－３を得た（図１を参照）。
まず、肝がん細胞株Ｈｕｈ－７に対するｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ及びＡｄ－ＩＦＮ－３のそれぞれの殺傷効果を研究した。図５Ａに示すように、肝がん細胞に対するｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂの殺傷能力は、非複製型ウイルスＡｄ－ＩＦＮ－３よりも有意に強く、ＭＯＩが１である場合には、ｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂは、Ｈｕｈ－７細胞の半分以上を殺傷することができ、ＭＯＩが１０である場合のＡｄ－ＩＦＮ－３よりも優れた。
次いで、結腸がん細胞株ＳＷ６２０において、複製型と非複製型腫瘍溶解性アデノウイルスの殺傷効果を比較した。図５Ｂに示すように、ｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂは、結腸がん細胞株ＳＷ６２０を殺傷する能力が非複製型ウイルスＡｄ－ＩＦＮ－３よりも有意に強い。ＭＯＩが０．１である場合には、ｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂは、ＳＷ６２０細胞の約半分を殺傷でき、ＭＯＩが１０である場合のＡｄ－ＩＦＮ－３よりも優れた。
次に、本実施例は、さらに、腫瘍溶解性アデノウイルスでのインターフェロン配列の運びの有無時に、がん細胞への殺傷効果を比較し、図５Ｃに示すように、ｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂは、乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１を殺傷する能力が空ベクターとしての対照ウイルスｒＡｄ－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂよりも有意に強い。ＭＯＩが０．５である場合には、ｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂは、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の約半分を殺傷でき、ＭＯＩが５である場合のｒＡｄ－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂと基本的に一致した。
肺がん細胞株ＨＣＣ８２７において、ｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂと空ベクターとしての対照ウイルスｒＡｄ－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂの殺傷効果を比較した。図５Ｄに示すように、結果は、ｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂは、肺がん細胞株ＨＣＣ８２７を殺傷する能力が空ベクターとしての対照ウイルスｒＡｄ－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂよりも有意に強イことを示した。ＭＯＩが５である場合には、ｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂは、ほぼ全てのＨＣＣ８２７細胞を殺傷でき、ＭＯＩが２０である場合のｒＡｄ－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂの効果よりも強いことを示した。
逆に、正常細胞ヒト肝線維芽細胞株ＨＬＦは、図５Ｅに示すように、組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ及びそれに対応する空ベクターとしての対照ウイルスは、いずれもＨＬＦ細胞を殺傷していないことを示した。
以上の結果は、本発明に係る組換え腫瘍溶解性アデノウイルスが腫瘍細胞を特異的に殺傷することができるが、正常細胞にはほとんど影響を及ぼさず、良好な安全性を有することを示した。
【0040】
実施例５ 組換え腫瘍溶解性アデノウイルスによるヌードマウス移植腫瘍の増殖への有意な阻害
本実施例は、ＳＷ６２０ヌードマウス異種移植腫瘍モデルでのｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂの腫瘍阻害を測定し、結果は、図６Ａに示し、組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂは、ＳＷ６２０ヌードマウス移植腫瘍ｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいてＩＦＮ－３遺伝子を保有する非複製型アデノウイルスＡｄ－ＩＦＮ－３よりも有意に優れた薬効も示した。
さらに、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ヌードマウス移植腫瘍のｉｎ ｖｉｖｏモデルでの組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂの効果を測定し、図６Ｂ及びＣに示すように、該組換え腫瘍溶解性アデノウイルスは、特に優れた薬効を示し、移植された腫瘍のほとんどすべてが排除され、腫瘍阻害率は９６．４％と高かった。
次に、ＨＣＣ８２７ヌードマウス移植腫瘍のｉｎ ｖｉｖｏモデルでの組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂの効果を測定し、図６Ｄ及びＥに示すように、該腫瘍溶解性アデノウイルスは、特に優れた薬効を示し、陽性対照薬であるソラフェニブ及びゲムシタビンよりも有意に優れ、移植された腫瘍のすべてが排除され、腫瘍阻害率は１００％に達した。
本実施例は、ＳＷ６２０ヌードマウス異種移植腫瘍モデルでのｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂの腫瘍阻害を測定し、結果は、図６Ａに示し、組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂは、ＳＷ６２０ヌードマウス移植腫瘍ｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいてＩＦＮ－３遺伝子を保有する非複製型アデノウイルスＡｄ－ＩＦＮ－３よりも有意に優れた薬効も示した。
さらに、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ヌードマウス移植腫瘍のｉｎ ｖｉｖｏモデルでの組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂの効果を測定し、図６Ｂ及びＣに示すように、該組換え腫瘍溶解性アデノウイルスは、特に優れた薬効を示し、移植された腫瘍のほとんどすべてが排除され、腫瘍阻害率は９６．４％と高かった。
次に、ＨＣＣ８２７ヌードマウス移植腫瘍のｉｎ ｖｉｖｏモデルでの組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂの効果を測定し、図６Ｄ及びＥに示すように、該腫瘍溶解性アデノウイルスは、特に優れた薬効を示し、陽性対照薬であるソラフェニブ及びゲムシタビンよりも有意に優れ、移植された腫瘍のすべてが排除され、腫瘍阻害率は１００％に達した。
【0041】
実施例６ 腫瘍の阻害効果に対する組換え腫瘍溶解性アデノウイルスの相乗効果
本実施例は、本発明に係る組換え腫瘍溶解性アデノウイルス（ｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ）が、ｒＩＦＮタンパク質のみ、空ベクターとしての腫瘍溶解性ウイルスのみ、及びｒＩＦＮタンパク質と空ベクター腫瘍溶解性ウイルスの併用よりも良い効果を得られることを検証し、本発明の構造を有する組換え腫瘍溶解性ウイルスが予想外の相乗効果を達成できることを示した。
具体的には、免疫細胞浸潤の少ないトリプルネガティブ乳がんＨＣＣ１８０６ヌードマウス移植腫瘍を選択してｉｎ ｖｉｖｏ薬効試験を行った。各ヌードマウスに２×１０６個のＨＣＣ１８０６細胞を皮下注射して皮下腫瘍を形成し、腫瘍体積が約９０ｍｍ３に達したときランダムに群分けし、投与処置を開始した。投与スケジュールは、図７Ａに示し、Ｖｅｈｉｃｌｅ対照及び各組換え腫瘍溶解性アデノウイルスは、群分けの当日に投与を開始し、用量１．５×１０１０ｖｐ／回／匹（５０μＬ／回／匹）、１日おきに１回、合計５回腫瘍内注射した。組換えインターフェロンタンパク質は、群分けの翌日に投与を開始し、用量２０μｇ／回／匹、１日おきに１回、合計５回腹腔内注射した。腫瘍サイズを３日おきに１回測定した。
結果は、図７Ｂに示し、陰性対照Ｖｅｈｉｃｌｅよりも、組換えインターフェロンタンパク質の単独投与では明らかな抗腫瘍効果がなく、それと比較して、空ベクターとしての腫瘍溶解性アデノウイルスのみは、一定の抗腫瘍効果を生じることができるが、さらに組換えインターフェロンタンパク質と空ベクター腫瘍溶解性アデノウイルスとを併用すると、それらのいずれかの単独使用よりも強い抗腫瘍効果を得ることができる。しかしながら、本発明に係る組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂは、最適の抗腫瘍効果を有し、両方の併用と比較して統計的に有意な差を有した（＊＊）。以上の結果より、本発明で構築されたｒＩＦＮ治療遺伝子を保有する組換え腫瘍溶解性アデノウイルスが相乗効果を生み出すことを示した。
本実施例は、本発明に係る組換え腫瘍溶解性アデノウイルス（ｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ）が、ｒＩＦＮタンパク質のみ、空ベクターとしての腫瘍溶解性ウイルスのみ、及びｒＩＦＮタンパク質と空ベクター腫瘍溶解性ウイルスの併用よりも良い効果を得られることを検証し、本発明の構造を有する組換え腫瘍溶解性ウイルスが予想外の相乗効果を達成できることを示した。
具体的には、免疫細胞浸潤の少ないトリプルネガティブ乳がんＨＣＣ１８０６ヌードマウス移植腫瘍を選択してｉｎ ｖｉｖｏ薬効試験を行った。各ヌードマウスに２×１０６個のＨＣＣ１８０６細胞を皮下注射して皮下腫瘍を形成し、腫瘍体積が約９０ｍｍ３に達したときランダムに群分けし、投与処置を開始した。投与スケジュールは、図７Ａに示し、Ｖｅｈｉｃｌｅ対照及び各組換え腫瘍溶解性アデノウイルスは、群分けの当日に投与を開始し、用量１．５×１０１０ｖｐ／回／匹（５０μＬ／回／匹）、１日おきに１回、合計５回腫瘍内注射した。組換えインターフェロンタンパク質は、群分けの翌日に投与を開始し、用量２０μｇ／回／匹、１日おきに１回、合計５回腹腔内注射した。腫瘍サイズを３日おきに１回測定した。
結果は、図７Ｂに示し、陰性対照Ｖｅｈｉｃｌｅよりも、組換えインターフェロンタンパク質の単独投与では明らかな抗腫瘍効果がなく、それと比較して、空ベクターとしての腫瘍溶解性アデノウイルスのみは、一定の抗腫瘍効果を生じることができるが、さらに組換えインターフェロンタンパク質と空ベクター腫瘍溶解性アデノウイルスとを併用すると、それらのいずれかの単独使用よりも強い抗腫瘍効果を得ることができる。しかしながら、本発明に係る組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂは、最適の抗腫瘍効果を有し、両方の併用と比較して統計的に有意な差を有した（＊＊）。以上の結果より、本発明で構築されたｒＩＦＮ治療遺伝子を保有する組換え腫瘍溶解性アデノウイルスが相乗効果を生み出すことを示した。
【0042】
実施例７ 組換え腫瘍溶解性アデノウイルスによるｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍細胞への全体的な抑制効果
本実施例は、ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍細胞に対する組換え腫瘍溶解性アデノウイルスの阻害が注射部位に限らず、非投与部位で驚くべき腫瘍抑制効果を生み出すこともできることを検証した。
具体的には、トリプルネガティブ乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ヌードマウス異種移植腫瘍モデルを選択するとともに、さらに天然ＩＦＮ－βを保有する組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－β－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂを構築して対照とした。各ヌードマウスの左側及び右側に皮下腫瘍を形成し、両側に２×１０６個のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を注射し、左側の腫瘍体積が約９０ｍｍ３に成長すると、群分けし、投与処置を開始した。Ｖｅｈｉｃｌｅ対照及び各組換え腫瘍溶解性アデノウイルスは、いずれも群分けの当日に投与を開始し、左側の腫瘍内に用量１．５×１０１０ｖｐ／回／匹（５０μＬ／回／匹）、１日おきに１回、合計５回注射された。右側は投与せず、左右の腫瘍を３日ごとに１回測定した。
投与側（左側）では、図８Ａに示すように、実験終了までに、各インターフェロン遺伝子を保有する組換え腫瘍溶解性アデノウイルスはいずれも移植腫瘍をほぼ完全に排除でき、空ベクター腫瘍溶解性アデノウイルスも同様に移植腫瘍増殖への有意な阻害効果を示した。さらに、表２に示すように、投与後１１日目（即ち、図８Ａ及び表２の１９日目）、陰性対照Ｖｅｈｉｃｌｅ群、空ベクターとしての腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ群及び組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ群は、いずれも移植腫瘍が排除されていないが、組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－２－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ群及び天然ＩＦＮ－βを運ぶ組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－β－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ群は、いずれも４０％の移植腫瘍が排除され、組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ群のみは全ての移植腫瘍がいずれも排除された。実験の終わりに、組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ群およびｒＡｄ－ＩＦＮ－２－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ群のみは全ての移植腫瘍がいずれも排除された。以上より、これらの組換え腫瘍溶解性アデノウイルスでは、ｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂが最も効果が速く、且つ最適の腫瘍阻害効果を達成できることが分かった（ｒＡｄ－ＩＦＮ－２－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂを並べて、両方とも腫瘍細胞を完全に排除した。）。
非投与側（右側）は、図８Ｂに示すように、空ベクターとしての腫瘍溶解性アデノウイルスには腫瘍抑制効果がまったくなく、天然ＩＦＮ－βを保有する組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－β－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂは一定の抗腫瘍効果がある。ｒＡｄ－ＩＦＮ－β－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂよりも、本発明で構築された３つの組換え腫瘍溶解性ウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ、ｒＡｄ－ＩＦＮ－２－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ、ｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂは、有意に優れた抗腫瘍効果をもたらし、統計的に有意差（＊）を示した。上記の３つの組換え腫瘍溶解性アデノウイルスの間で薬効の有意差はない。
以上から、本発明に係る組換え腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞を全体的に殺傷でき、局所注射部位に限定されないが、がんの臨床的治療に計り知れない価値があり、例えば、腫瘍転移の治療に適用することが分かった。
本実施例は、ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍細胞に対する組換え腫瘍溶解性アデノウイルスの阻害が注射部位に限らず、非投与部位で驚くべき腫瘍抑制効果を生み出すこともできることを検証した。
具体的には、トリプルネガティブ乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ヌードマウス異種移植腫瘍モデルを選択するとともに、さらに天然ＩＦＮ－βを保有する組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－β－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂを構築して対照とした。各ヌードマウスの左側及び右側に皮下腫瘍を形成し、両側に２×１０６個のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を注射し、左側の腫瘍体積が約９０ｍｍ３に成長すると、群分けし、投与処置を開始した。Ｖｅｈｉｃｌｅ対照及び各組換え腫瘍溶解性アデノウイルスは、いずれも群分けの当日に投与を開始し、左側の腫瘍内に用量１．５×１０１０ｖｐ／回／匹（５０μＬ／回／匹）、１日おきに１回、合計５回注射された。右側は投与せず、左右の腫瘍を３日ごとに１回測定した。
投与側（左側）では、図８Ａに示すように、実験終了までに、各インターフェロン遺伝子を保有する組換え腫瘍溶解性アデノウイルスはいずれも移植腫瘍をほぼ完全に排除でき、空ベクター腫瘍溶解性アデノウイルスも同様に移植腫瘍増殖への有意な阻害効果を示した。さらに、表２に示すように、投与後１１日目（即ち、図８Ａ及び表２の１９日目）、陰性対照Ｖｅｈｉｃｌｅ群、空ベクターとしての腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ群及び組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ群は、いずれも移植腫瘍が排除されていないが、組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－２－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ群及び天然ＩＦＮ－βを運ぶ組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－β－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ群は、いずれも４０％の移植腫瘍が排除され、組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ群のみは全ての移植腫瘍がいずれも排除された。実験の終わりに、組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ群およびｒＡｄ－ＩＦＮ－２－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ群のみは全ての移植腫瘍がいずれも排除された。以上より、これらの組換え腫瘍溶解性アデノウイルスでは、ｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂが最も効果が速く、且つ最適の腫瘍阻害効果を達成できることが分かった（ｒＡｄ－ＩＦＮ－２－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂを並べて、両方とも腫瘍細胞を完全に排除した。）。
【表2】
以上から、本発明に係る組換え腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞を全体的に殺傷でき、局所注射部位に限定されないが、がんの臨床的治療に計り知れない価値があり、例えば、腫瘍転移の治療に適用することが分かった。
【0043】
実施例８ 組換え腫瘍溶解性アデノウイルスによる腫瘍再発の効果的な予防
本発明に係る腫瘍溶解性アデノウイルスの治療効果の持続期間を調査するために、実施例５でのｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（△２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂの腫瘍内注射により移植腫瘍が完全に退行したＨＣＣ８２７ヌードマウス異種移植腫瘍モデルマウスを選択して２×１０６個のＨＣＣ８２７腫瘍細胞を単側に再度注射して腫瘍形成実験を行った。対照群では、同じ週齢の未処置のヌードマウスに２×１０６個のＨＣＣ８２７腫瘍細胞を単側注射して腫瘍形成実験を行い、腫瘍形成後に、対照群及び実験群では、いずれも何の処置も施されなく、腫瘍体積を週に２回測定した。図９に示すように、結果は、対照群よりも、実験群での移植腫瘍の成長が有意に抑制され、平均体積が１００ｍｍ３未満にしか成長できず、その後、移植腫瘍が完全排除されるまで退行し始めることを示した。以上の結果は、ｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（△２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂで治療されたマウスに明らかな免疫記憶があり、後期に現れるのと同様の腫瘍細胞を素早く取り除くことができ、腫瘍の再発を防ぐ効果があることを示した。
本発明に係る腫瘍溶解性アデノウイルスの治療効果の持続期間を調査するために、実施例５でのｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（△２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂの腫瘍内注射により移植腫瘍が完全に退行したＨＣＣ８２７ヌードマウス異種移植腫瘍モデルマウスを選択して２×１０６個のＨＣＣ８２７腫瘍細胞を単側に再度注射して腫瘍形成実験を行った。対照群では、同じ週齢の未処置のヌードマウスに２×１０６個のＨＣＣ８２７腫瘍細胞を単側注射して腫瘍形成実験を行い、腫瘍形成後に、対照群及び実験群では、いずれも何の処置も施されなく、腫瘍体積を週に２回測定した。図９に示すように、結果は、対照群よりも、実験群での移植腫瘍の成長が有意に抑制され、平均体積が１００ｍｍ３未満にしか成長できず、その後、移植腫瘍が完全排除されるまで退行し始めることを示した。以上の結果は、ｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（△２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂで治療されたマウスに明らかな免疫記憶があり、後期に現れるのと同様の腫瘍細胞を素早く取り除くことができ、腫瘍の再発を防ぐ効果があることを示した。
【0044】
実施例９ 組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂによるヒト化マウスの移植腫瘍の増殖への有意な阻害
ヒト免疫系により近い環境下での組換え腫瘍溶解性アデノウイルスの抗腫瘍効果を測定するために、本実施例は、ヒト化免疫系のマウス異種移植腫瘍モデルで本発明に係る組換え腫瘍溶解性アデノウイルスの腫瘍阻害能力を測定した（本実施例は、ｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂを測定対象として選択する。）。ヒトＨＣＣ８２７細胞をヒト化免疫系のマウスの背部両側に皮下注射し、移植腫瘍を形成するが、右側の腫瘍のみに組換え腫瘍溶解性アデノウイルスを投与し、左側に何の処置も施されなかった。
結果は、図１０に示すように、被験群の右側（投与側）の移植腫瘍に組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂを腫瘍内注射した後、体積が徐々に縮小し始め、実験終了時に、腫瘍阻害率が９６．４％に達し、陽性対照薬としてのゲムシタビン及びＰＤ－１抗体タンパク質よりも有意に強く（図１０Ａ及びＢ）ことが分かった。実施例７の結果と類似して、被験群の左側（非投与側）の移植腫瘍は、右側に腫瘍内投与された後、体積も徐々に縮小し始め、実験終了時に、腫瘍阻害率が９２．５％に達し、同様に陽性対照薬としてのゲムシタビン及びＰＤ－１抗体タンパク質よりも有意に強く（図１０Ｃ及びＤ）、組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂは、人体に近い複雑な環境下でも、優れた腫瘍殺傷効果を示し、局所注射部位に限定されず、計り知れない臨床応用価値があることを示した。
ヒト免疫系により近い環境下での組換え腫瘍溶解性アデノウイルスの抗腫瘍効果を測定するために、本実施例は、ヒト化免疫系のマウス異種移植腫瘍モデルで本発明に係る組換え腫瘍溶解性アデノウイルスの腫瘍阻害能力を測定した（本実施例は、ｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂを測定対象として選択する。）。ヒトＨＣＣ８２７細胞をヒト化免疫系のマウスの背部両側に皮下注射し、移植腫瘍を形成するが、右側の腫瘍のみに組換え腫瘍溶解性アデノウイルスを投与し、左側に何の処置も施されなかった。
結果は、図１０に示すように、被験群の右側（投与側）の移植腫瘍に組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂを腫瘍内注射した後、体積が徐々に縮小し始め、実験終了時に、腫瘍阻害率が９６．４％に達し、陽性対照薬としてのゲムシタビン及びＰＤ－１抗体タンパク質よりも有意に強く（図１０Ａ及びＢ）ことが分かった。実施例７の結果と類似して、被験群の左側（非投与側）の移植腫瘍は、右側に腫瘍内投与された後、体積も徐々に縮小し始め、実験終了時に、腫瘍阻害率が９２．５％に達し、同様に陽性対照薬としてのゲムシタビン及びＰＤ－１抗体タンパク質よりも有意に強く（図１０Ｃ及びＤ）、組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂは、人体に近い複雑な環境下でも、優れた腫瘍殺傷効果を示し、局所注射部位に限定されず、計り知れない臨床応用価値があることを示した。
【0045】
実施例１０ 組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１ＢによるＰＤＸヌードマウス移植腫瘍の増殖への有意な阻害
臨床的状況により近い条件下（腫瘍には高異質性を有する。）での組換え腫瘍溶解性アデノウイルスの抗腫瘍効果をさらに調査するために、本実施例は、臨床的患者に由来する腫瘍移植（ＰＤＸ）ヌードマウス異種移植腫瘍モデルで本発明に係る組換え腫瘍溶解性アデノウイルスの腫瘍阻害能力を測定し（本実施例は、ｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂを測定対象として選択した。）、合計で肺腺がんＰＤＸ、肺扁平上皮細胞がんＰＤＸ及びトリプルネガティブ乳がんＰＤＸのそれぞれ１例を選択して測定した。
結果は、図１１に示すように、組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂが肺腺がんＰＤＸ（図１１ Ａ）、肺扁平上皮細胞がんＰＤＸ（図１１ Ｂ）及びトリプルネガティブ乳がんＰＤＸ（図１１ Ｃ）モデルのいずれにも優れた腫瘍殺傷効果を示し、実験終了時に、腫瘍阻害率がそれぞれ９８．７％、９７．０％及び９７．５％であることが分かった。組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂは、非常に不均一な臨床由来腫瘍の治療に使用されても、依然として優れた腫瘍殺傷効果を示すことが明らかになる。
臨床的状況により近い条件下（腫瘍には高異質性を有する。）での組換え腫瘍溶解性アデノウイルスの抗腫瘍効果をさらに調査するために、本実施例は、臨床的患者に由来する腫瘍移植（ＰＤＸ）ヌードマウス異種移植腫瘍モデルで本発明に係る組換え腫瘍溶解性アデノウイルスの腫瘍阻害能力を測定し（本実施例は、ｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂを測定対象として選択した。）、合計で肺腺がんＰＤＸ、肺扁平上皮細胞がんＰＤＸ及びトリプルネガティブ乳がんＰＤＸのそれぞれ１例を選択して測定した。
結果は、図１１に示すように、組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂが肺腺がんＰＤＸ（図１１ Ａ）、肺扁平上皮細胞がんＰＤＸ（図１１ Ｂ）及びトリプルネガティブ乳がんＰＤＸ（図１１ Ｃ）モデルのいずれにも優れた腫瘍殺傷効果を示し、実験終了時に、腫瘍阻害率がそれぞれ９８．７％、９７．０％及び９７．５％であることが分かった。組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂは、非常に不均一な臨床由来腫瘍の治療に使用されても、依然として優れた腫瘍殺傷効果を示すことが明らかになる。
【0046】
実施例１１ 組換え腫瘍溶解性アデノウイルスのパイロットスケールでの収率の測定
組換え腫瘍溶解性アデノウイルスは、医薬品として、大規模に生産できるようにするために発酵を必要とした。パイロットスケールの細胞収率は、発酵によって生産できるかどうかを判断するための基準であるだけでなく、薬剤経済学の重要な指標でもある。したがって、本実施例はパイロットスケールレベルで組換え腫瘍溶解性アデノウイルスの細胞収率を測定した。
細胞収率の測定で使用される工学的細胞株は、当分野で一般的に使用されるＡＴＣＣ由来のＨＥＫ－２９３細胞であり、被験ウイルスは、異なる接種比（ＶＰ／ｃｅｌｌ）で一定数量の工学的細胞株に接種され、その後、接種後４２、５４時間で細胞を溶解して子孫ウイルスを収集し、子孫ウイルスのＶＰ数を測定し、元に接種された細胞数で割って細胞収率を得た。
結果は、表３に示すように、測定された組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ及びｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂがいずれも工業規模の細胞収率を達成できることが分かった。ここで、組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂは、接種後４２時間の収率が最高値に達したが、接種後５４時間の細胞収率が逆に減少し、これは、該組換え腫瘍溶解性アデノウイルスの発酵速度がより速いことを示し、工業的生産に発酵をより短時間で完了できるため、コストを節約できることを意味し、それに対して、ｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂは、接種後５４時間の細胞収率がピークに達し、発酵速度がｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂよりも遅い。しかも、ｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂが４２時間目に到達した収率のピークがｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂが５６時間目に到達した収率のピークよりも高く、これは、ウイルスの生産効率も高いことを意味した。以上より、細胞収率は、組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂがさらに優位に占めることが分かった。
組換え腫瘍溶解性アデノウイルスは、医薬品として、大規模に生産できるようにするために発酵を必要とした。パイロットスケールの細胞収率は、発酵によって生産できるかどうかを判断するための基準であるだけでなく、薬剤経済学の重要な指標でもある。したがって、本実施例はパイロットスケールレベルで組換え腫瘍溶解性アデノウイルスの細胞収率を測定した。
細胞収率の測定で使用される工学的細胞株は、当分野で一般的に使用されるＡＴＣＣ由来のＨＥＫ－２９３細胞であり、被験ウイルスは、異なる接種比（ＶＰ／ｃｅｌｌ）で一定数量の工学的細胞株に接種され、その後、接種後４２、５４時間で細胞を溶解して子孫ウイルスを収集し、子孫ウイルスのＶＰ数を測定し、元に接種された細胞数で割って細胞収率を得た。
結果は、表３に示すように、測定された組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂ及びｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂがいずれも工業規模の細胞収率を達成できることが分かった。ここで、組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂは、接種後４２時間の収率が最高値に達したが、接種後５４時間の細胞収率が逆に減少し、これは、該組換え腫瘍溶解性アデノウイルスの発酵速度がより速いことを示し、工業的生産に発酵をより短時間で完了できるため、コストを節約できることを意味し、それに対して、ｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂは、接種後５４時間の細胞収率がピークに達し、発酵速度がｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂよりも遅い。しかも、ｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂが４２時間目に到達した収率のピークがｒＡｄ－ＩＦＮ－３－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂが５６時間目に到達した収率のピークよりも高く、これは、ウイルスの生産効率も高いことを意味した。以上より、細胞収率は、組換え腫瘍溶解性アデノウイルスｒＡｄ－ＩＦＮ－１－ＳＰ－Ｅ１Ａ（Δ２４ｂｐ）－Ｅ１Ｂがさらに優位に占めることが分かった。
【表3】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】