▶ エイジエックス・セラピューティクス・インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-11-06
(45)【発行日】2023-11-14
(54)【発明の名称】ＨＬＡ Ｇ改変された細胞および方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20231107BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231107BHJP
C12N 5/0735 20100101ALI20231107BHJP
C12N 5/074 20100101ALI20231107BHJP
C12N 5/077 20100101ALI20231107BHJP
C12N 5/0775 20100101ALI20231107BHJP
C12N 5/0789 20100101ALI20231107BHJP
C12N 5/079 20100101ALI20231107BHJP
C12N 5/0793 20100101ALI20231107BHJP
C12N 5/0797 20100101ALI20231107BHJP
C12N 15/85 20060101ALI20231107BHJP
C07K 14/74 20060101ALN20231107BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12 ZNA
C12N5/10
C12N5/0735
C12N5/074
C12N5/077
C12N5/0775
C12N5/0789
C12N5/079
C12N5/0793
C12N5/0797
C12N15/85 Z
C07K14/74
【請求項の数】
54
(21)【出願番号】P 2021068195
(22)【出願日】2021-04-14
(62)【分割の表示】P 2019052699の分割
【原出願日】2013-07-30
(65)【公開番号】P2021106601
(43)【公開日】2021-07-29
【審査請求日】2021-05-13
(31)【優先権主張番号】61/677,739
(32)【優先日】2012-07-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】520020764
【氏名又は名称】エイジエックス・セラピューティクス・インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＡｇｅＸ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100138911
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻井 陽子
(74)【代理人】
【識別番号】100165892
【弁理士】
【氏名又は名称】坂田 啓司
(72)【発明者】
【氏名】バジル・エム・ハンタッシュ
【審査官】小金井 悟
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２００８／１２１８９４（ＷＯ，Ａ２）
【文献】特表２００８－５１８６１３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１９－０８８３３４（ＪＰ，Ａ）
【文献】Immunity，2001年08月，Vol.15, No.2，pp.213-224
【文献】Hum. Immunol.，2003年11月，Vol.64, No.11，p.1005-1010
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｎ １／００－ ７／０８
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
遺伝子改変を有さない哺乳動物細胞と比較して、低減された免疫原性および／または改善された免疫抑制を有する、前記遺伝子改変がされた哺乳動物細胞であって、（ｉ）前記遺伝子改変がされた哺乳動物細胞は、
（ａ）配列番号：２のアミノ酸配列との配列同一性が少なくとも９５％であるアミノ酸配列を含むヒト白血球抗原－Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）タンパク質をコードする核酸配列；ここで、ＨＬＡ－Ｇタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号：２のアミノ酸配列のアミノ酸位置３３４に対応する位置においてアラニンを、アミノ酸位置３３５に対応する位置においてアラニンをコードする；および
（ｂ）配列番号：３の核酸配列を含む３’非翻訳領域（ＵＴＲ）
を含む、外因性核酸を含み、
（ｉｉ）コードされたＨＬＡ－Ｇタンパク質は、前記遺伝子改変がされた哺乳動物細胞により発現される、遺伝子改変がされた哺乳動物細胞。
【請求項2】
前記コードされたＨＬＡ－Ｇタンパク質は、配列番号：２のアミノ酸配列との配列同一性が少なくとも９７％であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の遺伝子改変がされた哺乳動物細胞。
【請求項3】
前記ＨＬＡ－Ｇタンパク質は、少なくとも７週間発現される、請求項１または２に記載の遺伝子改変がされた哺乳動物細胞。
【請求項4】
前記ＨＬＡ－Ｇタンパク質は、少なくとも２０週間発現される、請求項３に記載の遺伝子改変がされた哺乳動物細胞。
【請求項5】
前記ＨＬＡ－Ｇタンパク質は、少なくとも５０週間発現される、請求項４に記載の遺伝子改変がされた哺乳動物細胞。
【請求項6】
前記ＵＴＲは、配列番号：４を含まない、請求項１または２に記載の遺伝子改変がされた哺乳動物細胞。
【請求項7】
延長因子－１アルファ（ＥＦ－１α）プロモーターをさらに含み、前記ＨＬＡ－Ｇタンパク質をコードする前記核酸配列は、作用可能に前記ＥＦ－１αプロモーターに結合する、請求項１または２に記載の遺伝子改変がされた哺乳動物細胞。
【請求項8】
前記ＥＦ－１αプロモーターは、配列番号：６の配列を含む、請求項７に記載の遺伝子改変がされた哺乳動物細胞。
【請求項9】
前記発現されたＨＬＡ－Ｇが、前記遺伝子改変がされた哺乳動物細胞の細胞表面上に存在する、請求項１または２に記載の遺伝子改変がされた細胞。
【請求項10】
前記改変がされた哺乳動物細胞は、ヒト細胞である、請求項１または２に記載の遺伝子改変がされた哺乳動物細胞。
【請求項11】
前記遺伝子改変がされた細胞は、幹細胞、前駆細胞、前記幹細胞もしくは前記前駆細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化により得られる細胞、完全に分化した細胞、表皮前駆細胞、膵臓前駆細胞、造血幹細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、肝細胞、間葉系幹細胞、心筋細胞、神経幹細胞、ニューロン、または星状膠細胞である、請求項１または２に記載の遺伝子改変がされた哺乳動物細胞。
【請求項12】
前記遺伝子改変がされた細胞は、ヒト胚性幹細胞、ヒト間葉系幹細胞、ヒト胚性表皮前駆細胞、またはヒト皮膚線維芽細胞である、請求項１または２に記載の遺伝子改変がされた哺乳動物細胞。
【請求項13】
請求項１２に記載の遺伝子改変がされた哺乳動物細胞を含む、皮膚移植、修復、または再生組成物。
【請求項14】
前記遺伝子改変を有さない前記哺乳動物細胞と比較して、前記遺伝子改変がされた細胞の前記低減された免疫原性および／または改善された免疫抑制が、（１）前記遺伝子改変を有さない前記哺乳動物細胞と比較した、前記遺伝子改変がされた細胞に対するＮＫ－９２細胞毒性の低減、（２）前記遺伝子改変を有さない前記哺乳動物細胞と比較した、前記遺伝子改変がされた細胞によるｉｎ ｖｉｔｒｏ末梢血単核細胞増殖の低減、または（３）ヒト化NOD scid gamma（ＮＳＧ）マウスにおける、前記遺伝子改変を有さない前記哺乳動物細胞と比較した、前記遺伝子改変がされた細胞による腫瘍形成のサイズおよび重量の増加、のいずれかにより決定される、請求項１または２に記載の遺伝子改変がされた細胞。
【請求項15】
請求項１または２に記載の遺伝子改変がされた哺乳動物細胞を含む人工組織。
【請求項16】
前記外因性核酸は、発現ベクターである、請求項１または２に記載の遺伝子改変がされた哺乳動物細胞。
【請求項17】
前記哺乳動物発現ベクターは、トランスポゾンベクターである、請求項１６に記載の遺伝子改変がされた哺乳動物細胞。
【請求項18】
前記ベクターは、レポータータンパク質をコードする核酸配列をさらに含む、請求項１６に記載の遺伝子改変がされた哺乳動物細胞。
【請求項19】
必要とする対象に投与される、請求項１または２に記載の遺伝子改変がされた細胞の集団を含む細胞または組織組成物であって、前記対象に注入され、埋め込まれ、または移植され、前記対象は、前記遺伝子改変がされた細胞の集団と比較して、少なくとも１つのミスマッチ古典的ＨＬＡクラスＩまたはＨＬＡクラスＩＩ分子を有し、前記遺伝子改変がされた細胞の集団は、前記遺伝子改変を有さない同じ型の細胞と比較して、低減された免疫原性および／または改善された免疫抑制を示す、組成物。
【請求項20】
前記少なくとも１つのミスマッチ古典的ＨＬＡクラスＩまたはＨＬＡクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱ、およびＨＬＡ－ＤＲからなる群から選択される、請求項１９に記載の組成物。
【請求項21】
前記対象は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱ、およびＨＬＡ－ＤＲに関して、前記遺伝子改変がされた細胞とのマッチを有さない、請求項１９に記載の組成物。
【請求項22】
前記低減された免疫原性および／または改善された免疫抑制は、ＮＫ－９２細胞毒性アッセイ、ヒト化ＮＳＧ腫瘍成長アッセイ、および／または末梢血単核細胞増殖アッセイにより決定される、請求項１９に記載の組成物。
【請求項23】
前記遺伝子改変がされた細胞の集団は、ヒト皮膚線維芽細胞の集団、ヒト表皮前駆細胞の集団、ヒト胚性幹細胞の集団、またはヒト間葉系幹細胞の集団を含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項24】
前記遺伝子改変がされた細胞の集団は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した遺伝子改変がされたヒト胚性幹細胞を含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項25】
前記遺伝子改変がされた細胞の集団は、少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２４、３６、４８、または５２週間、前記対象の免疫系により拒絶されない、請求項１９に記載の組成物。
【請求項26】
（ｉ）配列番号：２のアミノ酸配列との配列同一性が少なくとも９５％であるアミノ酸配列を含むＨＬＡ－Ｇタンパク質をコードする第１の核酸配列；ここで、ＨＬＡ－Ｇタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号：２のアミノ酸配列のアミノ酸位置３３４に対応する位置においてアラニンを、アミノ酸位置３３５に対応する位置においてアラニンをコードする；および（ｉｉ）配列番号：３の核酸配列を含む３’ＵＴＲを含む第２の核酸配列
を含む、単離された核酸。
【請求項27】
前記コードされたＨＬＡ－Ｇタンパク質は、配列番号：２のアミノ酸配列との配列同一性が少なくとも９７％であるアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載の単離された核酸。
【請求項28】
前記第２の核酸配列は、配列番号：４を含まない、請求項２６または２７に記載の単離された核酸。
【請求項29】
請求項２６または２７に記載の単離された核酸および前記第１の核酸配列に作用可能に結合したプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターであって、前記プロモーターは、幹細胞内、または前記幹細胞の分化により生成された細胞内でサイレンシングされていない、哺乳動物発現ベクター。
【請求項30】
前記プロモーターは、チャイニーズハムスターＥＦ－１αプロモーターの核酸配列を含む、請求項２９に記載の哺乳動物発現ベクター。
【請求項31】
レポータータンパク質をコードする第３の核酸配列をさらに含む、請求項２９に記載の哺乳動物発現ベクター。
【請求項32】
前記哺乳動物発現ベクターは、トランスポゾンベクターである、請求項２９に記載の哺乳動物発現ベクター。
【請求項33】
（ａ）チャイニーズハムスターＥＦ－１αプロモーター；（ｂ）前記プロモーターに作用可能に結合し、配列番号：２のアミノ酸配列との配列同一性が少なくとも９５％であるアミノ酸配列を含むＨＬＡ－Ｇタンパク質をコードする核酸配列；ここで、ＨＬＡ－Ｇタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号：２のアミノ酸配列のアミノ酸位置３３４に対応する位置においてアラニンを、アミノ酸位置３３５に対応する位置においてアラニンをコードする；および
（ｃ）配列番号：３の核酸配列を含む３’ＵＴＲを含む核酸配列
を含む、哺乳動物発現ベクター。
【請求項34】
前記コードされたＨＬＡ－Ｇタンパク質は、配列番号：２のアミノ酸配列との配列同一性が少なくとも９７％であるアミノ酸配列を含む、請求項３３に記載の哺乳動物発現ベクター。
【請求項35】
請求項３３または３４に記載の哺乳動物発現ベクターを含む、遺伝子改変がされた哺乳動物細胞。
【請求項36】
遺伝子改変を有さない哺乳動物細胞と比較して、低減された免疫原性および／または改善された免疫抑制を有する、前記遺伝子改変がされた哺乳動物細胞を製造する方法であって、（ａ）配列番号：２のアミノ酸配列との配列同一性が少なくとも９５％であるアミノ酸配列を含むＨＬＡ－Ｇタンパク質をコードする核酸配列；ここで、ＨＬＡ－Ｇタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号：２のアミノ酸配列のアミノ酸位置３３４に対応する位置においてアラニンを、アミノ酸位置３３５に対応する位置においてアラニンをコードする；および
（ｂ）配列番号：３の核酸配列を含む３’ＵＴＲ
を含む外因性核酸で哺乳動物細胞を遺伝子改変することを含み、
ここで、前記遺伝子改変がされた細胞の前記低減された免疫原性および／または改善された免疫抑制が、
（１）前記遺伝子改変を有さない前記哺乳動物細胞と比較した、前記遺伝子改変がされた細胞に対するＮＫ－９２細胞毒性の低減、
（２）前記遺伝子改変を有さない前記哺乳動物細胞と比較した、前記遺伝子改変がされた細胞によるｉｎ ｖｉｔｒｏ末梢血単核細胞増殖の低減、または
（３）ヒト化ＮＳＧマウスにおける、前記遺伝子改変を有さない前記哺乳動物細胞と比較した、前記遺伝子改変がされた細胞による腫瘍形成のサイズおよび重量の増加
のいずれかにより決定される、方法。
【請求項37】
前記コードされたＨＬＡ－Ｇタンパク質は、配列番号：２のアミノ酸配列との配列同一性が少なくとも９７％であるアミノ酸配列を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
前記遺伝子改変がされた哺乳動物細胞が、ＨＬＡ－Ｇタンパク質を少なくとも７週間発現する、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項39】
前記遺伝子改変がされた哺乳動物細胞が、ＨＬＡ－Ｇタンパク質を少なくとも２０週間発現する、請求項３８に記載の方法。
【請求項40】
前記遺伝子改変がされた哺乳動物細胞が、ＨＬＡ－Ｇタンパク質を少なくとも５０週間発現する、請求項３９に記載の方法。
【請求項41】
前記ＵＴＲは、配列番号：４を含まない、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項42】
前記遺伝子改変がされた哺乳動物細胞が、ＨＬＡ－Ｇタンパク質を、前記遺伝子改変がされた哺乳動物細胞の細胞表面上に発現する、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項43】
前記遺伝子改変がされた哺乳動物細胞が、ヒト細胞である、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項44】
前記遺伝子改変がされた細胞が、幹細胞、前駆細胞、前記幹細胞または前記前駆細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化により得られる細胞、完全に分化した細胞、表皮前駆細胞、膵臓前駆細胞、造血幹細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、肝細胞、間葉系幹細胞、心筋細胞、神経幹細胞、ニューロン、および星状膠細胞からなる群から選択される、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項45】
前記遺伝子改変がされた細胞が、ヒト胚性幹細胞、ヒト間葉系幹細胞、ヒト胚性表皮前駆細胞、およびヒト皮膚線維芽細胞からなる群から選択される、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項46】
前記ＨＬＡ－Ｇタンパク質をコードする前記核酸配列を含む核酸が、ＥＦ－１αプロモーターをさらに含み、前記ＨＬＡ－Ｇタンパク質をコードする前記核酸配列が、作用可能に前記ＥＦ－１αプロモーターに結合する、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項47】
前記ＥＦ－１αプロモーターが、配列番号：６の配列を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項48】
前記外因性核酸が、発現ベクターである、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項49】
前記発現ベクターが、トランスポゾンベクターである、請求項４８に記載の方法。
【請求項50】
前記発現ベクターが、レポータータンパク質をコードする核酸配列をさらに含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項51】
請求項３６または３７に記載の方法により製造される遺伝子改変がされた哺乳動物細胞を含む、人工組織、皮膚移植、皮膚修復または皮膚再生組成物を製造する方法。
【請求項52】
外因性核酸で哺乳動物細胞を遺伝子改変することが、外因性核酸で哺乳動物細胞を一過性にトランスフェクトすることすることを含む、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項53】
外因性核酸で哺乳動物細胞を遺伝子改変することが、外因性核酸で哺乳動物細胞を安定にトランスフェクトすることすることを含む、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項54】
前記遺伝子改変がされた哺乳動物細胞を、抗生物質耐性および／またはフローサイトメトリーを用いて選択する、請求項３６または３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０１２年７月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／６７７，７３９号に対する優先権を主張するものであり、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
細胞移植の形態での再生医療は、糖尿病、心臓疾患、および神経変性疾患等の難治性の医学的状態の処置のための最も有望な治療アプローチの１つである。しかしながら、臨床における細胞移植の実施に対する大きな障害は、特にドナー細胞が外部ホストから得られる場合の、ドナー細胞の免疫拒絶である。免疫抑制剤を投与することにより、部分的に免疫拒絶に対処することは可能であるが、これらは重篤な副作用を伴う。従って、細胞移植療法のための改善された技術を開発することが、依然として必要である。
【発明の概要】
【0003】
ドナー細胞を必要とする対象に移植されるそのようなドナー細胞における、少なくとも外因性ＨＬＡ－Ｇタンパク質の長期強制発現に基く細胞移植治療のための、細胞ベースの組成物よび方法が、本明細書において開示される。本発明は、本明細書に記載の様式で外因性ＨＬＡ－Ｇを発現するように改変された細胞（多能性であるか分化しているかに関わらず）が、低減された免疫原性および／または増加した免疫抑制を有することを示すデータを提供する。ＨＬＡ－Ｇ遺伝子改変により提供される低減された免疫原性および／または増加した抑制能力は安定であり、分化のプロセスの間を含む長期間にわたって持続する。これは、本発明のＨＬＡ－Ｇ改変された細胞は、様々な損傷、疾患または障害に対する普遍的なドナー細胞または組織として役立ち得る（すなわち、ドナー細胞と受容者との間で古典的ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩおよびクラスＩＩ分子の種類を一致させる必要を低減または排除する）ことを意味する。
【0004】
したがって、一態様において、遺伝子改変を有さない哺乳動物細胞と比較して、低減された免疫原性を有し、および／または同種異系受容者において増加した免疫抑制を提供することができる、当該遺伝子改変された哺乳動物細胞（ＨＬＡ－Ｇ改変された細胞）であって、（ｉ）遺伝子改変された哺乳動物細胞は、（ａ）ヒトＨＬＡ－Ｇと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を有し、小胞体－ゴルジ再循環経路においてＨＬＡ－Ｇの保持を低減する１つ以上のアミノ酸突然変異を含むＨＬＡ－Ｇタンパク質をコードする核酸配列を含む外因性核酸（例えば、発現ベクター）、および／または、（ｂ）配列番号：３等のｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位を含有しない３’ＵＴＲ（非翻訳領域）配列、もしくは配列番号：４を含まない配列を含み、（ｉｉ）コードされたＨＬＡ－Ｇタンパク質は、少なくとも７週間（例えば、少なくとも２０週または少なくとも５０週間）、遺伝子改変された哺乳動物細胞により発現される、遺伝子改変された哺乳動物細胞が、本明細書に記載される。
【0005】
他の実施形態において、本発明は、遺伝子改変を有さない哺乳動物細胞と比較して、低減された免疫原性および／または改善された免疫抑制を有する当該遺伝子改変された哺乳動物細胞であって、（ｉ）遺伝子改変された哺乳動物細胞は、（ａ）コンセンサス野生型ヒトＨＬＡ－Ｇ（例えば配列番号：１）と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有し、小胞体－ゴルジ再循環経路においてＨＬＡ－Ｇの保持を低減する１つ以上のアミノ酸突然変異を含むＨＬＡ－Ｇタンパク質をコードする、核酸配列（例えば配列番号：２）と、（ｂ）コンセンサス野生型ヒトＨＬＡ－Ｇ遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）配列と少なくとも８５％同一であり、配列番号４を含まない３’非翻訳領域（例えば配列番号：３）とを含む、外因性核酸を含み、（ｉｉ）コードされたＨＬＡ－Ｇタンパク質は、少なくとも７週間、遺伝子改変された哺乳動物細胞により発現される、遺伝子改変された哺乳動物細胞を提供する。
【0006】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変された細胞は、（１）当該遺伝子改変を有さない哺乳動物細胞と比較した、遺伝子改変された細胞のＮＫ－９２細胞毒性の低減、（２）当該遺伝子改変を有さない哺乳動物細胞と比較した、遺伝子改変された細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ末梢血単核細胞増殖の低減、ならびに／または（３）ヒト化ＮＳＧマウスにおける、当該遺伝子改変を有さない哺乳動物細胞と比較した、遺伝子改変された細胞による腫瘍形成のサイズおよび重量の増加を示す場合、低減された免疫原性および／または改善された免疫抑制を有する。
【0007】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変された哺乳動物細胞は、同種異系受容者と比較して、１つ以上のＨＬＡ抗原においてマッチ（すなわち、同じ対立遺伝子（複数を含む））を有さず、ＨＬＡ抗原は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱ、およびＨＬＡ－ＤＲからなる群から選択される。ある特定の実施形態において、遺伝子改変された哺乳動物細胞は、同種異系受容者と比較して、１つ以上のＨＬＡ抗原において１、２、３、４、または５つのマッチのみを有し、ＨＬＡ抗原は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱ、およびＨＬＡ－ＤＲからなる群から選択される。一実施形態において、遺伝子改変された哺乳動物細胞は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱ、およびＨＬＡ－ＤＲに関して、同種異系受容者とのマッチを有さない。
【0008】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変された細胞は、小胞体－ゴルジ再循環経路においてＨＬＡ－Ｇの保持を低減する１つ以上のアミノ酸突然変異（すなわち、配列番号：１等のＨＬＡ－Ｇ野生型コンセンサス配列）を有さないＨＬＡ－Ｇ導入遺伝子を含むが、配列番号：３等のｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位を含有しない３’ＵＴＲ（非翻訳領域）配列、または配列番号：４を含まない配列を含むＨＬＡ－Ｇ導入遺伝子を有する。
【0009】
いくつかの実施形態において、小胞体－ゴルジ再循環経路においてＨＬＡ－Ｇの保持を低減する１つ以上の突然変異は、ジ－リシン（ＫＫ）モチーフ突然変異を含む。いくつかの実施形態において、ＫＫモチーフ突然変異は、Ｋ３３４Ａ突然変異、Ｋ３３５Ａ突然変異、または両方の突然変異を含む。
【0010】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変された細胞において発現される外因性核酸は、配列番号４を含有しない３’ＵＴＲ配列を含む。一実施形態において、外因性核酸の３’ＵＴＲ配列が配列番号：４を含まない場合、核酸配列は配列番号：３を含有する。
【0011】
いくつかの実施形態において、発現されたＨＬＡ－Ｇは、遺伝子改変された哺乳動物細胞の細胞表面上に存在する。
【0012】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変された哺乳動物細胞は、ヒト細胞、マウス細胞、ラット細胞、サル細胞、またはブタ細胞である。
【0013】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変された哺乳動物細胞は、幹細胞、前駆細胞、または、幹細胞もしくは前駆細胞の誘導分化により得られる細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変された哺乳動物細胞は、外因性ＨＬＡ－Ｇ導入遺伝子の導入前にすでに分化した細胞（自然発生的かまたはｉｎ ｖｉｔｒｏかに関わらず）である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変された哺乳動物細胞は、幹細胞（例えば、多能性幹細胞）である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変された哺乳動物細胞が幹細胞である場合、幹細胞は、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、または分化全能性幹細胞である。一実施形態において、遺伝子改変された哺乳動物細胞は、胚性幹細胞である。別の実施形態において、遺伝子改変された哺乳動物細胞は、誘導多能性幹細胞である。さらなる実施形態において、遺伝子改変された哺乳動物細胞は、免疫系細胞型ではない。別の実施形態において、遺伝子改変された哺乳動物細胞は、幹細胞または前駆細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化により得られる細胞であり、幹細胞または前駆細胞は、遺伝子改変され、次いでｉｎ ｖｉｔｒｏで分化される。
【0014】
他の実施形態において、遺伝子改変された細胞は、完全に分化した細胞、表皮前駆細胞、膵臓前駆細胞、造血幹細胞、多能性幹細胞の分化により得られる細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、間葉系幹細胞、心筋細胞、神経幹細胞、ニューロン、星状膠細胞、または膵臓β細胞前駆細胞である。
【0015】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変された哺乳動物細胞における外因性核酸が発現ベクターである場合、発現ベクターは、トランスポゾンベクターまたはレトロウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、外因性核酸が発現ベクターである場合、発現ベクターは、標的化ベクターであり、遺伝子改変された哺乳動物細胞は、標的化ベクターの相同的組み換えにより得られた。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等のレポータータンパク質をコードする核酸配列をさらに含んでもよい。
【0016】
いくつかの実施形態において、外因性核酸はまた、（ｉ）ヒトＨＬＡ－Ｇ遺伝子の３’非翻訳領域配列と少なくとも８５％同一である、および（ｉｉ）その３’非翻訳領域内に突然変異結合部位を含むｍＲＮＡ内の突然変異部位への同族ｍｉｃｒｏＲＮＡの結合を阻害する、少なくとも１つの突然変異を含む、核酸配列を含む。一実施形態において、そのような核酸配列は、配列番号：３を含む。
【0017】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変された細胞を含有する人工組織が提供される。
【0018】
別の態様において、単離された核酸であって、（ｉ）ヒトＨＬＡ－Ｇと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列をコードする第１の核酸配列と、（ｉｉ）ヒトＨＬＡ－Ｇ遺伝子の３’非翻訳領域配列と少なくとも８５％同一であり、第１の核酸配列に作用可能に結合した、第２の核酸配列とを含み、アミノ酸配列は、小胞体－ゴルジ再循環経路においてＨＬＡ－Ｇの保持を低減する突然変異を含み、第２の核酸配列は、その３’非翻訳領域内に突然変異結合部位を含むｍＲＮＡへの同族ｍｉｃｒｏＲＮＡの結合を阻害する、少なくとも１つの突然変異を含む、単離された核酸が、本明細書において提供される。
【0019】
いくつかの実施形態において、単離された核酸の３’非翻訳領域配列は、配列番号：４を含まない。一実施形態において、３’非翻訳領域配列が配列番号：４を含まない場合、３’非翻訳領域配列は、配列番号：３を含む。
【0020】
いくつかの実施形態において、単離された核酸、および第１の核酸配列に作用可能に結合したプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターであって、プロモーターは、幹細胞においてサイレンシングされていない、哺乳動物発現ベクターが提供される。いくつかの実施形態において、プロモーターは、チャイニーズハムスターＥＦ－１α（ＣＨＥＦ－１α）プロモーターまたはヒトＥＦ－１αプロモーターの核酸配列を含有する。一実施形態において、ＣＨＥＦ－１αプロモーターは、配列番号：７を含む。他の実施形態において、ＨＬＡ－Ｇ導入遺伝子の発現を駆動するために使用されるプロモーターは、組織または細胞型選択的プロモーターである。いくつかの実施形態において、哺乳動物発現ベクターは、レポータータンパク質をコードする第３の核酸配列の包含を含む。いくつかの実施形態において、哺乳動物発現ベクターは、トランスポゾンベクターである。いくつかの実施形態において、哺乳動物発現ベクターを含有する遺伝子改変された哺乳動物細胞が提供される。
【0021】
いくつかの実施形態において、単離された核酸であって、（ｉ）ヒトＨＬＡ－Ｇと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列をコードする第１の核酸配列であって、アミノ酸配列は、小胞体－ゴルジ再循環経路においてＨＬＡ－Ｇの保持を低減する突然変異を含む、第１の核酸配列と、（ｉｉ）ヒトＨＬＡ－Ｇ遺伝子の３’非翻訳領域配列と少なくとも９５％同一であり、当該第１の核酸配列と作用可能に結合した第２の核酸配列であって、その３’非翻訳領域内に突然変異結合部位を含むｍＲＮＡへの同族ｍｉｃｒｏＲＮＡの結合を阻害する少なくとも１つの突然変異を含む、第２の核酸配列とを含む、単離された核酸が提供される。一実施形態において、第１の核酸配列は、配列番号：２のアミノ酸配列をコードする。別の実施形態において、第２の核酸配列は、配列番号：４を含まない。一実施形態において、第２の核酸配列は、配列番号：３を含む。別の実施形態において、当該第１および第２の核酸配列を含み、第１の核酸配列に作用可能に結合したプロモーターをさらに含む、哺乳動物発現ベクターであって、プロモーターは、幹細胞内、または幹細胞の分化により生成された細胞内でサイレンシングされていない、哺乳動物発現ベクターが提供される。そのようなプロモーターは、チャイニーズハムスターＥＦ－１αプロモーターの核酸配列を含むことができる。別の実施形態において、哺乳動物発現ベクターは、レポータータンパク質をコードする核酸配列をさらに含む。別の実施形態において、哺乳動物発現ベクターは、トランスポゾンベクターである。別の実施形態において、哺乳動物発現ベクターは、図１に示される要素の全てを含む。
【0022】
一実施形態において、（ａ）チャイニーズハムスターＥＦ－１αプロモーター、（ｂ）プロモーターに作用可能に結合し、配列番号：２のアミノ酸配列を有するヒトＨＬＡ－Ｇをコードする核酸配列、および（ｃ）配列番号：３を含む３’ＵＴＲ配列を含む、哺乳動物発現ベクターが提供される。いくつかの実施形態において、そのような発現ベクターを含む遺伝子改変された哺乳動物細胞が提供される。
【0023】
様々な実施形態において、ＨＬＡ－Ｇ改変された哺乳動物細胞（例えば、ヒトＨＬＡ－Ｇ改変細胞）は、心血管疾患、眼疾患（例えば、黄斑変性症）、聴覚疾患（例えば、難聴）、糖尿病、神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、骨粗しょう症、肝疾患、腎疾患、自己免疫疾患、関節炎、歯周病、歯の状態、または増殖性疾患（例えば、癌）を含むがこれらに限定されない複数の状態のいずれかに罹患した対象に投与される。他の場合において、対象は、急性の健康状態、例えば、脳卒中、脊髄損傷、火傷、または創傷に罹患している、または罹患するリスクが高い。他の場合において、対象は、皮下脂肪萎縮症または加齢関連のコラーゲンの損失等の組織の損失に罹患している。他の場合において、対象は、非治癒性潰瘍に罹患している、または尿道下裂や尿道上裂などの欠陥の閉鎖を補助するための薬剤を必要としている。他の場合において、対象は、創傷治癒または皮膚代用品のための永久的または一時的皮膚移植片を必要としている。
【0024】
いくつかの実施形態において、本発明は、細胞または組織修復または再生を必要とする対象へのその普遍的方法であって、ｅＨＬＡ－Ｇ改質された細胞の集団を含む細胞または組織組成物を対象に注入する、または移植することを含み、対象は、ｅＨＬＡ－Ｇ改質された細胞の集団と比較して、少なくとも１つのミスマッチ古典的ＨＬＡクラスＩまたはＨＬＡクラスＩＩ分子を有し、ｅＨＬＡ－Ｇ改変された細胞の集団は、ｅＨＬＡ－Ｇ改変を有さない同じ型の細胞と比較して、低減された免疫原性および／または改善された免疫抑制を示す、普遍的方法を提供する。低減された免疫原性および／または改善された免疫抑制は、例えば、ＮＫ－９２細胞毒性アッセイ、ヒト化ＮＳＧ腫瘍成長アッセイ、および／またはＰＢＭＣ増殖アッセイにおいて、ｅＨＬＡ－Ｇ改質された細胞を、ｅＨＬＡ－Ｇ改質を有さない同じ型の対照細胞と比較することにより決定され得る。一実施形態において、遺伝子改変された細胞の集団は、ｅＨＬＡ－Ｇ遺伝子改変されたヒト皮膚線維芽細胞の集団を含む。別の実施形態において、遺伝子改変された細胞の集団は、ｅＨＬＡ－Ｇ遺伝子改変されたヒト表皮前駆細胞の集団を含む。別の実施形態において、遺伝子改変された細胞の集団は、ｅＨＬＡ－Ｇ遺伝子改変されたヒト間葉系幹細胞の集団を含む。別の実施形態において、遺伝子改変された細胞の集団は、ｅＨＬＡ－Ｇ遺伝子改変されたヒト胚性幹細胞の集団を含む。別の実施形態において、遺伝子改変された細胞の集団は、ｅＨＬＡ－Ｇ遺伝子改変されたヒト胚性幹細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団を含む。他の実施形態において、遺伝子改変された細胞の集団は、少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２４、３６、４８、または５２週間、対象の免疫系により拒絶されない。
【0025】
別の実施形態において、本発明は、皮膚再生を必要とする対象へのそのための方法であって、ｅＨＬＡ－Ｇ改変された皮膚線維芽細胞および／またはｅＨＬＡ－Ｇ改変された胚性表皮前駆細胞の集団を、対象における皮膚損傷の部位に注入することを含み、対象は、ｅＨＬＡ－Ｇ改変された皮膚線維芽細胞および／またはｅＨＬＡ－Ｇ改変された胚性表皮前駆細胞の集団と比較して、少なくとも１つのミスマッチ古典的ＨＬＡクラスＩまたはＨＬＡクラスＩＩ分子を有する方法を提供する。
【0026】
別の実施形態において、本発明の外因性ヒトβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）分子およびｅＨＬＡ－Ｇ導入遺伝子を含む遺伝子改変された哺乳動物細胞の集団を、細胞治療方法を必要とする対象に投与することを含む、細胞治療方法が提供される。
本発明の実施形態を、以下にさらに記載する：
［項１］
遺伝子改変を有さない哺乳動物細胞と比較して、低減された免疫原性および／または改善された免疫抑制を有する、前記遺伝子改変された哺乳動物細胞であって、
（ｉ）前記遺伝子改変された哺乳動物細胞は、（ａ）コンセンサス野生型ヒトＨＬＡ－Ｇと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有し、小胞体－ゴルジ再循環経路においてＨＬＡ－Ｇの保持を低減する１つ以上のアミノ酸突然変異を含むＨＬＡ－Ｇタンパク質をコードする、核酸配列と、（ｂ）コンセンサス野生型ヒトＨＬＡ－Ｇ遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）配列と少なくとも８５％同一であり、配列番号４を含まない３’非翻訳領域とを含む、外因性核酸を含み、
（ｉｉ）コードされたＨＬＡ－Ｇタンパク質は、少なくとも７週間、前記遺伝子改変された哺乳動物細胞により発現される、遺伝子改変された哺乳動物細胞。
［項２］
前記ＨＬＡ－Ｇタンパク質は、少なくとも２０週間発現される、上記項１の遺伝子改変された哺乳動物細胞。
［項３］
前記ＨＬＡ－Ｇタンパク質は、少なくとも５０週間発現される、上記項２に記載の遺伝子改変された哺乳動物細胞。
［項４］
小胞体－ゴルジ再循環経路においてＨＬＡ－Ｇの保持を低減する前記１つ以上のアミノ酸突然変異は、Ｋ３３４Ａ突然変異、Ｋ３３５Ａ突然変異、または両方の突然変異を含む、上記項１に記載の遺伝子改変された細胞。
［項５］
前記核酸配列は、配列番号：２のアミノ酸配列を有するＨＬＡ－Ｇタンパク質をコードする、上記項１に記載の遺伝子改変された哺乳動物細胞。
［項６］
延長因子－１アルファ（ＥＦ－１α）プロモーターをさらに含み、前記ＨＬＡ－Ｇタンパク質をコードする前記核酸配列は、作用可能に前記ＥＦ－１αプロモーターに結合する、上記項１に記載の遺伝子改変された哺乳動物細胞。
［項７］
前記ＥＦ－１αプロモーターは、配列番号：７の配列を含む、上記項６に記載の遺伝子改変された哺乳動物細胞。
［項８］
前記３’ＵＴＲは、配列番号：３を含む、上記項１に記載の遺伝子改変された哺乳動物細胞。
［項９］
前記核酸配列は、配列番号：２のアミノ酸配列を有するＨＬＡ－Ｇタンパク質をコードし、前記３’ＵＴＲが、配列番号：３を含み、前記ＨＬＡ－Ｇタンパク質をコードする前記核酸に作用可能に結合した配列番号：７を含むＥＦ－１αプロモーターをさらに含む、上記項１に記載の遺伝子改変された哺乳動物細胞。
［項１０］
前記発現されたＨＬＡ－Ｇが、前記遺伝子改変された哺乳動物細胞の細胞表面上に存在する、上記項１に記載の遺伝子改変された細胞。
［項１１］
前記改変された哺乳動物細胞は、ヒト細胞である、上記項１に記載の遺伝子改変された哺乳動物細胞。
［項１２］
前記遺伝子改変された細胞は、幹細胞、前駆細胞、前記幹細胞もしくは前記前駆細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化により得られる細胞、完全に分化した細胞、表皮前駆細胞、膵臓前駆細胞、造血幹細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、幹細胞、間葉系幹細胞、心筋細胞、神経幹細胞、ニューロン、または星状膠細胞である、上記項１に記載の遺伝子改変された哺乳動物細胞。
［項１３］
前記遺伝子改変された細胞は、ヒト胚性幹細胞、ヒト間葉系幹細胞、またはヒト胚性表皮前駆細胞である、上記項１に記載の遺伝子改変された哺乳動物細胞。
［項１４］
前記遺伝子改変された細胞は、ヒト皮膚線維芽細胞である、上記項１に記載の遺伝子改変された哺乳動物細胞。
［項１５］
前記遺伝子改変を有さない前記哺乳動物細胞と比較して、前記遺伝子改変された細胞の前記低減された免疫原性および／または改善された免疫抑制が、（１）前記遺伝子改変を有さない前記哺乳動物細胞と比較した、前記遺伝子改変された細胞のＮＫ－９２細胞毒性の低減、（２）前記遺伝子改変を有さない前記哺乳動物細胞と比較した、前記遺伝子改変された細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ末梢血単核細胞増殖の低減、ならびに（３）ヒト化ＮＳＧマウスにおける、前記遺伝子改変を有さない前記哺乳動物細胞と比較した、前記遺伝子改変された細胞による腫瘍形成のサイズおよび重量の増加により決定される、上記項１に記載の遺伝子改変された細胞。
［項１６］
上記項１に記載の遺伝子改変された哺乳動物細胞を含む人工組織。
［項１７］
上記項１３または上記項１４に記載の遺伝子改変された哺乳動物細胞を含む皮膚移植、修復、または再生組成物。
［項１８］
前記外因性核酸は、発現ベクターである、上記項１に記載の遺伝子改変された哺乳動物細胞。
［項１９］
前記哺乳動物発現ベクターは、トランスポゾンベクターである、上記項１８に記載の遺伝子改変された哺乳動物細胞。
［項２０］
前記ベクターは、レポータータンパク質をコードする核酸配列をさらに含む、上記項１８に記載の遺伝子改変された哺乳動物細胞。
［項２１］
単離された核酸であって、
（ｉ）ヒトＨＬＡ－Ｇと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列をコードする第１の核酸配列であって、前記アミノ酸配列は、小胞体－ゴルジ再循環経路においてＨＬＡ－Ｇの保持を低減する突然変異を含む、第１の核酸配列と、
（ｉｉ）前記ヒトＨＬＡ－Ｇ遺伝子の３’非翻訳領域配列と少なくとも９５％同一であり、前記第１の核酸配列に作用可能に結合した第２の核酸配列であって、その３’非翻訳領域内に突然変異結合部位を含むｍＲＮＡへの同族ｍｉｃｒｏＲＮＡの結合を阻害する少なくとも１つの突然変異を含む、第２の核酸配列とを含む、単離された核酸。
［項２２］
前記第１の核酸配列は、配列番号：２のアミノ酸配列をコードする、上記項２１に記載の単離された核酸。
［項２３］
前記第２の核酸配列は、配列番号：４を含まない、上記項２１に記載の単離された核酸。
［項２４］
前記第２の核酸配列は、配列番号：３を含む、上記項２１に記載の単離された核酸。
［項２５］
上記項２１に記載の単離された核酸および前記第１の核酸配列に作用可能に結合したプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターであって、前記プロモーターは、幹細胞内、または前記幹細胞の分化により生成された細胞内でサイレンシングされていない、哺乳動物発現ベクター。
［項２６］
前記プロモーターは、チャイニーズハムスターＥＦ－１αプロモーターの核酸配列を含む、上記項２５に記載の哺乳動物発現ベクター。
［項２７］
レポータータンパク質をコードする第３の核酸配列をさらに含む、上記項２５に記載の哺乳動物発現ベクター。
［項２８］
前記哺乳動物発現ベクターは、トランスポゾンベクターである、上記項２５に記載の哺乳動物発現ベクター。
［項２９］
（ａ）チャイニーズハムスターＥＦ－１αプロモーター、（ｂ）前記プロモーターに作用可能に結合し、配列番号：２のアミノ酸配列を有するヒトＨＬＡ－Ｇをコードする核酸配列、および（ｃ）配列番号：３を含む３’ＵＴＲ配列を含む、哺乳動物発現ベクター。
［項３０］
上記項２９に記載の哺乳動物発現ベクターを含む、遺伝子改変された哺乳動物細胞。
［項３１］
細胞または組織修復または再生を必要とする対象へのその普遍的方法であって、上記項１に記載の遺伝子改変された細胞の集団を含む細胞または組織組成物を前記対象に注入する、埋め込む、または移植することを含み、前記対象は、前記遺伝子改変された細胞の集団と比較して、少なくとも１つのミスマッチ古典的ＨＬＡクラスＩまたはＨＬＡクラスＩＩ分子を有し、前記遺伝子改変された細胞の集団は、前記遺伝子改変を有さない同じ型の細胞と比較して、低減された免疫原性および／または改善された免疫抑制を示す、普遍的方法。
［項３２］
前記少なくとも１つのミスマッチ古典的ＨＬＡクラスＩまたはＨＬＡクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱ、およびＨＬＡ－ＤＲからなる群から選択される、上記項３１に記載の方法。
［項３３］
前記対象は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱ、およびＨＬＡ－ＤＲに関して、前記遺伝子改変された細胞とのマッチを有さない、上記項３１に記載の方法。
［項３４］
前記低減された免疫原性および／または改善された免疫抑制は、ＮＫ－９２細胞毒性アッセイ、ヒト化ＮＳＧ腫瘍成長アッセイ、および／または末梢血単核細胞増殖アッセイにより決定される、上記項３１に記載の方法。
［項３５］
前記遺伝子改変された細胞の集団は、ヒト皮膚線維芽細胞の集団を含む、上記項３１に記載の方法。
［項３６］
前記遺伝子改変された細胞の集団は、ヒト表皮前駆細胞の集団を含む、上記項３１に記載の方法。
［項３７］
前記遺伝子改変された細胞の集団は、ヒト胚性幹細胞の集団を含む、上記項３１に記載の方法。
［項３８］
前記遺伝子改変された細胞の集団は、ヒト間葉系幹細胞の集団を含む、上記項３１に記載の方法。
［項３９］
前記遺伝子改変された細胞の集団は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した遺伝子改変されたヒト胚性幹細胞を含む、上記項３１に記載の方法。
［項４０］
前記遺伝子改変された細胞の集団は、少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２４、３６、４８、または５２週間、前記対象の免疫系により拒絶されない、上記項３１に記載の方法。
本発明の実施形態を、以下にさらに記載する：
［項１］
遺伝子改変を有さない哺乳動物細胞と比較して、低減された免疫原性および／または改善された免疫抑制を有する、前記遺伝子改変された哺乳動物細胞であって、
（ｉ）前記遺伝子改変された哺乳動物細胞は、（ａ）コンセンサス野生型ヒトＨＬＡ－Ｇと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有し、小胞体－ゴルジ再循環経路においてＨＬＡ－Ｇの保持を低減する１つ以上のアミノ酸突然変異を含むＨＬＡ－Ｇタンパク質をコードする、核酸配列と、（ｂ）コンセンサス野生型ヒトＨＬＡ－Ｇ遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）配列と少なくとも８５％同一であり、配列番号４を含まない３’非翻訳領域とを含む、外因性核酸を含み、
（ｉｉ）コードされたＨＬＡ－Ｇタンパク質は、少なくとも７週間、前記遺伝子改変された哺乳動物細胞により発現される、遺伝子改変された哺乳動物細胞。
［項２］
前記ＨＬＡ－Ｇタンパク質は、少なくとも２０週間発現される、上記項１の遺伝子改変された哺乳動物細胞。
［項３］
前記ＨＬＡ－Ｇタンパク質は、少なくとも５０週間発現される、上記項２に記載の遺伝子改変された哺乳動物細胞。
［項４］
小胞体－ゴルジ再循環経路においてＨＬＡ－Ｇの保持を低減する前記１つ以上のアミノ酸突然変異は、Ｋ３３４Ａ突然変異、Ｋ３３５Ａ突然変異、または両方の突然変異を含む、上記項１に記載の遺伝子改変された細胞。
［項５］
前記核酸配列は、配列番号：２のアミノ酸配列を有するＨＬＡ－Ｇタンパク質をコードする、上記項１に記載の遺伝子改変された哺乳動物細胞。
［項６］
延長因子－１アルファ（ＥＦ－１α）プロモーターをさらに含み、前記ＨＬＡ－Ｇタンパク質をコードする前記核酸配列は、作用可能に前記ＥＦ－１αプロモーターに結合する、上記項１に記載の遺伝子改変された哺乳動物細胞。
［項７］
前記ＥＦ－１αプロモーターは、配列番号：７の配列を含む、上記項６に記載の遺伝子改変された哺乳動物細胞。
［項８］
前記３’ＵＴＲは、配列番号：３を含む、上記項１に記載の遺伝子改変された哺乳動物細胞。
［項９］
前記核酸配列は、配列番号：２のアミノ酸配列を有するＨＬＡ－Ｇタンパク質をコードし、前記３’ＵＴＲが、配列番号：３を含み、前記ＨＬＡ－Ｇタンパク質をコードする前記核酸に作用可能に結合した配列番号：７を含むＥＦ－１αプロモーターをさらに含む、上記項１に記載の遺伝子改変された哺乳動物細胞。
［項１０］
前記発現されたＨＬＡ－Ｇが、前記遺伝子改変された哺乳動物細胞の細胞表面上に存在する、上記項１に記載の遺伝子改変された細胞。
［項１１］
前記改変された哺乳動物細胞は、ヒト細胞である、上記項１に記載の遺伝子改変された哺乳動物細胞。
［項１２］
前記遺伝子改変された細胞は、幹細胞、前駆細胞、前記幹細胞もしくは前記前駆細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化により得られる細胞、完全に分化した細胞、表皮前駆細胞、膵臓前駆細胞、造血幹細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、幹細胞、間葉系幹細胞、心筋細胞、神経幹細胞、ニューロン、または星状膠細胞である、上記項１に記載の遺伝子改変された哺乳動物細胞。
［項１３］
前記遺伝子改変された細胞は、ヒト胚性幹細胞、ヒト間葉系幹細胞、またはヒト胚性表皮前駆細胞である、上記項１に記載の遺伝子改変された哺乳動物細胞。
［項１４］
前記遺伝子改変された細胞は、ヒト皮膚線維芽細胞である、上記項１に記載の遺伝子改変された哺乳動物細胞。
［項１５］
前記遺伝子改変を有さない前記哺乳動物細胞と比較して、前記遺伝子改変された細胞の前記低減された免疫原性および／または改善された免疫抑制が、（１）前記遺伝子改変を有さない前記哺乳動物細胞と比較した、前記遺伝子改変された細胞のＮＫ－９２細胞毒性の低減、（２）前記遺伝子改変を有さない前記哺乳動物細胞と比較した、前記遺伝子改変された細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ末梢血単核細胞増殖の低減、ならびに（３）ヒト化ＮＳＧマウスにおける、前記遺伝子改変を有さない前記哺乳動物細胞と比較した、前記遺伝子改変された細胞による腫瘍形成のサイズおよび重量の増加により決定される、上記項１に記載の遺伝子改変された細胞。
［項１６］
上記項１に記載の遺伝子改変された哺乳動物細胞を含む人工組織。
［項１７］
上記項１３または上記項１４に記載の遺伝子改変された哺乳動物細胞を含む皮膚移植、修復、または再生組成物。
［項１８］
前記外因性核酸は、発現ベクターである、上記項１に記載の遺伝子改変された哺乳動物細胞。
［項１９］
前記哺乳動物発現ベクターは、トランスポゾンベクターである、上記項１８に記載の遺伝子改変された哺乳動物細胞。
［項２０］
前記ベクターは、レポータータンパク質をコードする核酸配列をさらに含む、上記項１８に記載の遺伝子改変された哺乳動物細胞。
［項２１］
単離された核酸であって、
（ｉ）ヒトＨＬＡ－Ｇと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列をコードする第１の核酸配列であって、前記アミノ酸配列は、小胞体－ゴルジ再循環経路においてＨＬＡ－Ｇの保持を低減する突然変異を含む、第１の核酸配列と、
（ｉｉ）前記ヒトＨＬＡ－Ｇ遺伝子の３’非翻訳領域配列と少なくとも９５％同一であり、前記第１の核酸配列に作用可能に結合した第２の核酸配列であって、その３’非翻訳領域内に突然変異結合部位を含むｍＲＮＡへの同族ｍｉｃｒｏＲＮＡの結合を阻害する少なくとも１つの突然変異を含む、第２の核酸配列とを含む、単離された核酸。
［項２２］
前記第１の核酸配列は、配列番号：２のアミノ酸配列をコードする、上記項２１に記載の単離された核酸。
［項２３］
前記第２の核酸配列は、配列番号：４を含まない、上記項２１に記載の単離された核酸。
［項２４］
前記第２の核酸配列は、配列番号：３を含む、上記項２１に記載の単離された核酸。
［項２５］
上記項２１に記載の単離された核酸および前記第１の核酸配列に作用可能に結合したプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターであって、前記プロモーターは、幹細胞内、または前記幹細胞の分化により生成された細胞内でサイレンシングされていない、哺乳動物発現ベクター。
［項２６］
前記プロモーターは、チャイニーズハムスターＥＦ－１αプロモーターの核酸配列を含む、上記項２５に記載の哺乳動物発現ベクター。
［項２７］
レポータータンパク質をコードする第３の核酸配列をさらに含む、上記項２５に記載の哺乳動物発現ベクター。
［項２８］
前記哺乳動物発現ベクターは、トランスポゾンベクターである、上記項２５に記載の哺乳動物発現ベクター。
［項２９］
（ａ）チャイニーズハムスターＥＦ－１αプロモーター、（ｂ）前記プロモーターに作用可能に結合し、配列番号：２のアミノ酸配列を有するヒトＨＬＡ－Ｇをコードする核酸配列、および（ｃ）配列番号：３を含む３’ＵＴＲ配列を含む、哺乳動物発現ベクター。
［項３０］
上記項２９に記載の哺乳動物発現ベクターを含む、遺伝子改変された哺乳動物細胞。
［項３１］
細胞または組織修復または再生を必要とする対象へのその普遍的方法であって、上記項１に記載の遺伝子改変された細胞の集団を含む細胞または組織組成物を前記対象に注入する、埋め込む、または移植することを含み、前記対象は、前記遺伝子改変された細胞の集団と比較して、少なくとも１つのミスマッチ古典的ＨＬＡクラスＩまたはＨＬＡクラスＩＩ分子を有し、前記遺伝子改変された細胞の集団は、前記遺伝子改変を有さない同じ型の細胞と比較して、低減された免疫原性および／または改善された免疫抑制を示す、普遍的方法。
［項３２］
前記少なくとも１つのミスマッチ古典的ＨＬＡクラスＩまたはＨＬＡクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱ、およびＨＬＡ－ＤＲからなる群から選択される、上記項３１に記載の方法。
［項３３］
前記対象は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱ、およびＨＬＡ－ＤＲに関して、前記遺伝子改変された細胞とのマッチを有さない、上記項３１に記載の方法。
［項３４］
前記低減された免疫原性および／または改善された免疫抑制は、ＮＫ－９２細胞毒性アッセイ、ヒト化ＮＳＧ腫瘍成長アッセイ、および／または末梢血単核細胞増殖アッセイにより決定される、上記項３１に記載の方法。
［項３５］
前記遺伝子改変された細胞の集団は、ヒト皮膚線維芽細胞の集団を含む、上記項３１に記載の方法。
［項３６］
前記遺伝子改変された細胞の集団は、ヒト表皮前駆細胞の集団を含む、上記項３１に記載の方法。
［項３７］
前記遺伝子改変された細胞の集団は、ヒト胚性幹細胞の集団を含む、上記項３１に記載の方法。
［項３８］
前記遺伝子改変された細胞の集団は、ヒト間葉系幹細胞の集団を含む、上記項３１に記載の方法。
［項３９］
前記遺伝子改変された細胞の集団は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した遺伝子改変されたヒト胚性幹細胞を含む、上記項３１に記載の方法。
［項４０］
前記遺伝子改変された細胞の集団は、少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２４、３６、４８、または５２週間、前記対象の免疫系により拒絶されない、上記項３１に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【0027】
【図1】ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターにより駆動される選択マーカー（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）；「ＩＮＳ」隣接インシュレータ要素；ｅＨＬＡ－ＧのチャイニーズハムスターＥＦ－１αプロモーター駆動発現；ＥＧＦＰのＰＧＫプロモーター駆動発現；および５’末端反復（ＴＲ）転位要素を含有する、強化されたＨＬＡ－Ｇ（ｅＨＬＡ－Ｇ）導入遺伝子発現トランスポゾンベクターの限定されない実施形態の概略図を示す。ｅＨＬＡ－Ｇ導入遺伝子は、ＨＬＡ－Ｇタンパク質の発現、特に細胞表面発現を強化する、突然変異および／または非コード化要素（例えば、プロモーターまたは改変された３’ＵＴＲ）の組み合わせを含有する。本明細書に記載の実験において、ｅＨＬＡ－Ｇ導入遺伝子は、上記要素、より具体的にはＨＬＡ－ＧのＥＲ回収モチーフ（Ｋ３３４Ａ／Ｋ３３５Ａ）の突然変異を有する、配列番号：２に列挙されるようなヒトＨＬＡ－Ｇコード配列；ならびに、２）ＨＬＡ－Ｇの３’ＵＴＲ ｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位の突然変異を含んでいたが、この改変された３’ＵＴＲは、配列番号：３に列挙されるような配列を有していた。さらなる説明については、実施例３を参照されたい。
【図2】同時トランスフェクトされたトランスポゾン発現ベクターのゲノム組み込みを駆動するために使用された、トランスポザーセ発現ヘルパーベクターの限定されない実施形態の概略図である。
【図3】ｅＨＬＡ－ＧおよびＥＧＦＰのトランスポゾン発現ベクター駆動発現による安定なトランスフェクション後の様々な時点での、ヒトＥＳ細胞コロニーの蛍光顕微鏡写真である。
【図4】（上のパネル）ＥＧＦＰ含有発現ベクターでトランスフェクトされたｈＥＳ細胞の開始時の数と、トランスフェクションから１０日後に細胞集団内で検出されたＥＧＦＰ＋細胞の割合との間の関係を示す棒グラフである。ｘ軸上の数字は、５×１０５細胞当たりのＧＦＰ＋コロニーの数である。ｙ軸上の数字は、細胞数である。（下のパネル）様々なトランスポゾンベクター（異なるプロモーターを使用）と、細胞集団内で検出されたＥＧＦＰ＋細胞の割合との間の関係を示す棒グラフである。ｘ軸上の数字は、５×１０５細胞当たりのＧＦＰ＋コロニーの数である。下のパネルにおいて、左から右に、対照（ｃｏｎ）、ＧＦＰ－ｐｕｒｏ（トランスフェクトされたベクターのサイズは７．３ｋｂである）；ｅＨＬＡ－Ｇ（ＭＳＣＶ）－ＧＦＰ－ｐｕｒｏ（トランスフェクトされたベクターのサイズは８．６ｋｂである）；およびｅＨＬＡ－Ｇ（ＥＦ－１α）－ＧＦＰ－ｐｕｒｏ（トランスフェクトされたベクターのサイズは９．２ｋｂである）である。追加のｅＨＬＡ－Ｇ（ＥＦ－１α）－ＧＦＰ－ｐｕｒｏトランスフェクション効率実験（図示せず）を行ったが、これは、トランスフェクションから１０日後に、ピューロマイシンで１０日間の選択後の溶液ＶおよびプログラムＢ１６において最も高い効率（５×１０５細胞当たり約５００のＧＦＰ＋コロニー）が得られることを示した。
【図5】ＨＬＡ－Ｇ発現およびＤＡＰＩ染色（上の画像）、Ｏｃｔ ３／４およびＤＡＰＩ（中央の画像）、ならびにＳＳＥＡ－４およびＤＡＰＩ（下の画像）の、ＨＬＡ－Ｇ改変されたヒトＥＳ細胞における発現を示す一連の免疫蛍光顕微鏡写真である。
【図6】（上のパネル）ｅＨＬＡ－Ｇ改変ｈＥＳ細胞の集団におけるＳＳＥＡ－４＋／ＧＦＰ＋二重陽性細胞の分布を示すフローサイトメトリー散布図である。（下のパネル）ｅＨＬＡ－Ｇ改変されたｈＥＳ細胞の集団におけるＯｃｔ ３／４＋細胞の分布を示す図である。ＳＳＥＡ－４およびＯｃｔ ３／４は、多能性マーカーである。図５と共に、このデータは、ｅＨＬＡ－Ｇ改変されたｈＥＳ細胞がその特徴的な自己再生多能性マーカーを維持したことを示している。さらに、ｅＨＬＡ－Ｇ（ＥＦ－１α）－ＧＦＰ－ｈＥＳＣは、ｉｎ ｖｉｖｏでその多能性および通常の核型を維持した。ヒト化ＮＳＧマウスに、ｅＨＬＡ－Ｇ（ＥＦ－１α）－ＧＦＰ－ｈＥＳＣが皮下注射され、奇形腫形成が観察されたが、これは、ｈＥＳＣが低減された免疫原性および／または増加した免疫抑制を示したために、注射／移植された細胞が拒絶されなかったことを示している。奇形腫細胞の核型は正常であった。
【図7】（上のパネル）１５日目における、野生型（左の写真）およびｅＨＬＡ－Ｇ改変されたｈＥＳＣで生成された（右の写真）胚様体（ＥＢ）の位相差顕微鏡写真である。（下のパネル）上のパネルで示されたＥＢの蛍光顕微鏡写真である。野生型ｈＥＳＣ ＥＢにおいては、ＧＦＰシグナルは検出されず、一方、ｅＨＬＡ－Ｇ改変されたｈＥＳＣ ＥＢの両方において強いＧＦＰ発現が検出された。このデータは、ｅＨＬＡ－Ｇ＋ｈＥＳＣがＥＢ形成を維持することを示している。
【図8】ｅＨＬＡ－Ｇ＋ｈＥＳＣがサイレンシング抵抗性であることを示す図である。（上のパネル）ｅＨＬＡ－Ｇ改変されたｈＥＳＣ株におけるＧＦＰの発現のフローサイトメトリー分布ヒストグラムであり、これは、６および１６継代後に同様のＧＦＰの強い発現を示した。（下のパネル）同じｈＥＳＣ株におけるＨＬＡ－Ｇの発現のフローサイトメトリー分布ヒストグラムであり、これもまた、６および１６継代の両方において、ｅＨＬＡ－Ｇ導入遺伝子の持続的発現を示す。
【図9A】（上のパネル）野生型（左のヒストグラム）、ＧＦＰ改変（中央のヒストグラム）、およびｅＨＬＡ－Ｇ（ＥＦ－１α）－ＧＦＰ改変されたｈＥＳＣ（右のヒストグラム）における、全（細胞内）発現ＨＬＡ－Ｇのフローサイトメトリー分布ヒストグラムである。（下のパネル）野生型（左のヒストグラム）、ＧＦＰ改変（中央のヒストグラム）、およびｅＨＬＡ－Ｇ（ＥＦ－１α）－ＧＦＰ改変ｈＥＳＣ（右のヒストグラム）における、表面発現ＨＬＡ－Ｇのフローサイトメトリー分布ヒストグラムである。
【図9B】（上のパネル）ｅＨＬＡ－Ｇ（ＭＳＣＶ）－ＧＦＰ改変ｈＥＳＣにおける全発現ＨＬＡ－Ｇのフローサイトメトリー分布ヒストグラムである。（下のパネル）表面ＨＬＡ－Ｇ発現ｅＨＬＡ－Ｇ（ＭＳＣＶ）－ＧＦＰ改変ｈＥＳＣを示す図である。これらのデータは、導入遺伝子がＭＳＣＶプロモーターの制御下にある場合の最小限の発現とは対照的に、導入遺伝子がＥＦ－１αプロモーターに作用可能に結合した場合、ＨＬＡ－Ｇが高度に発現されることを示している。ＨＬＡ－Ｇ導入遺伝子発現がプロモーター活性により大きく影響されることを示す追加のデータに関しては、図１５もまた参照されたい。
【図10】ＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩの発現が、野生型およびｅＨＬＡ－Ｇ＋ ｈＥＳＣにおいて類似していることを示す表である。この表は、野生型対ＨＬＡ－Ｇ改変されたｈＥＳＣにおける様々なＨＬＡ変異およびβ２ミクログロブリンの発現レベルを比較している。
【図11】ＮＫ９２細胞毒性効果がｅＨＬＡ－Ｇ＋ｈＥＳＣにより大きく抑制されることを示すグラフである。（さらなる説明については、実施例６を参照されたい。）図は、ＮＫ９２細胞の細胞毒性アッセイの結果を示す棒グラフを示す。１：１０および１：３０の値は、標的細胞（ＧＦＰ導入遺伝子単独対照野生型細胞またはｅＨＬＡ－Ｇ－ＧＦＰ導入遺伝子改変細胞）に対するエフェクター（ＮＫ９２）の比を示す。これは、野生型ｈＥＳＣ（灰色のバー；ＧＦＰ）と比較したｅＨＬＡ－Ｇ改変されたｈＥＳＣ（黒いバー；ｅＨＬＡ－Ｇ－ＧＦＰ）の免疫原性を決定するための、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイである。ｅＨＬＡ－Ｇ改変されたｈＥＳＣは、野生型ｈＥＳＣの場合と比較して、ＮＫ９２細胞の存在下で実質的に低減された細胞毒性を示す。ＮＫ９２細胞の存在下での低減された細胞毒性は、そのような遺伝子改変された細胞が、低減された免疫原性および／または改善された免疫抑制を有することを示すため、このデータは、外因性ＨＬＡ－Ｇ発現が、そのような遺伝子改変された細胞の改善されたドナー能力を提供し得ることを示している。結果は、４回の実験の平均である。さらなる説明については、実施例６を参照されたい。
【図12】ｈＥＳＣのｉｎ ｖｉｔｒｏでの胚性表皮前駆細胞（ＥＥＰ）への誘導分化の間の、いくつかの多能性マーカーおよび表皮前駆細胞マーカーの遺伝子発現レベルの経時変化を示す一連の棒グラフである。ｙ軸の値は、半定量的ＲＴ－ＰＣＲにより決定されるような相対的ｍＲＮＡ発現レベルである。ｘ軸の値は、発現が評価された日である。さらなる説明については、実施例２を参照されたい。図１２のデータは、表皮分化マーカーＫ１４、Ｔａｐ６３、およびΔＮｐ６３が、分化の間に徐々に強化されたことを示す。ここには示されていないデータにおいて、Ｋ１４ならびに追加の表皮マーカーｐ６３、ＣＤ２９、およびＣＤ４９ｆの免疫蛍光試験が行われた。分化したｅＨＬＡ－Ｇ（ＥＦ－１ａ）－ＧＦＰ ｈＥＥＰは、免疫蛍光により示されるように、Ｋ１４、ｐ６３、ＣＤ２９、およびＣＤ４９ｆタンパク質発現に関して陽性であった。
【図13】（上のパネル）ｅＨＬＡ－ＧのＥＦ－１αプロモーター駆動発現により安定にトランスフェクトされたｈＥＳＣ株における、ｅＨＬＡ－Ｇ導入遺伝子発現の経時変化を示す図である。（下のパネル）ＧＦＰ改変されたｈＥＳＣ株（陰性対照）、ＭＳＣＶ－プロモーター駆動ｅＨＬＡ－Ｇ ｈＥＳＣ株、およびＥＦ－１α駆動ｅＨＬＡ－Ｇ ｈＥＳＣ株におけるＨＬＡ－Ｇ（ｍＲＮＡ）発現の経時変化（黒いバーは０日目を示し、水平のストライプのバーは７日目を示し、灰色のバーは１４日目を示す）を示すグラフである。ＥＦ－１αプロモーターにより駆動されるｅＨＬＡ－Ｇ発現のより高い、およびより持続的なレベルに留意されたい。
【図14】（ＮＫ細胞の細胞毒性活性に対するＫ５６２－ＨＬＡ－Ｇ１ １４塩基対（ｂｐ）挿入／欠失多型の効果。）図は、野生型Ｋ５６２細胞（灰色のバー）、３’ＵＴＲに１４ｂｐ挿入を有するＨＬＡ－Ｇ変異を発現するＫ５６２細胞（Ｉｎｓ１４ｂｐ）（黒いバー）、および３’ＵＴＲに１４ｂｐ欠失を有するＨＬＡ－Ｇ変異を発現するＫ５６２細胞（Ｄｅｌ１４ｂｐ）（灰色のバー）に対する、ＮＫ細胞媒介細胞毒性（特異的溶解％）を比較する棒グラフを示す。異なるエフェクター（ＮＫ細胞）対標的細胞（Ｋ５６２細胞）比での４つのデータセットがある。
【図15】ＨＬＡ－Ｇ導入遺伝子発現がプロモーター活性により大きく影響されることを示すデータである。ＲＴ－ＰＣＲは、ＧＦＰおよびＨＬＡ－Ｇ転写産物の両方が、ｅＨＬＡ－Ｇ（ＥＦ－１α）－ＧＦＰ－ｈＥＳＣ細胞株において高度に発現されたことを示している。免疫蛍光もまた、ＧＦＰおよびＨＬＡ－Ｇタンパク質の両方が、ＨＬＡ－Ｇ（ＥＦ－１α）－ＧＦＰ－ｈＥＳＣ細胞株において高度に発現されたことを示している（ここでは示されていない）。しかしながら、ＲＴ－ＰＣＲまたは免疫蛍光によるかに関わらず、ＨＬＡ－Ｇ転写産物またはタンパク質は、これらの細胞においてＧＦＰ発現が高かったにもかかわらず、ＨＬＡ－Ｇ（ｐＭＳＣＶ）－ＧＦＰ－ｈＥＳＣ細胞株においてはほとんど検出されなかった。（ここにはデータは示されていない。）したがって、ＥＦ－１αプロモーターは、ＨＬＡ－Ｇ導入遺伝子発現のある特定の実施形態において好ましい。
【図16】位相差顕微鏡法により示されるように、精製されたｈＥＥＰは、同種ケラチノサイトの形態を示した。ｅＨＬＡ－Ｇ－ＧＦＰ－ｈＥＥＰクローン１８および２１は、実施例２において説明されるように、改変されたｅＨＬＡ－Ｇ（ＥＦ－１α）－ＧＦＰ－ｈＥＳＣから分化した。
【図17】分化したｈＥＥＰにおけるＨＬＡ－Ｇ導入遺伝子の安定性は、フローサイトメトリーにより確認された。ＨＬＡ－Ｇ全発現（上のパネル）および表面発現（下のパネル）は両方とも、外因性ＨＬＡ－Ｇを有さない対照細胞（ＧＦＰのみのｈＥＥＰ）および野生型ｈＥＥＰと比較して、分化したｅＨＬＡ－Ｇ（ＥＦ－１ａ）－ＧＦＰ－ｈＥＥＰに対して堅牢であった（細胞の９０％超）。
【図18】図１１の結果が繰り返され、追加のＮＫ細胞毒性実験で確認された。示されるように、ｅＨＬＡ－Ｇ（ＥＦ－１α）－ＧＦＰ－ｈＥＳＣの死滅は、ＧＦＰ導入遺伝子のみを含有する（ＨＬＡ－Ｇ導入遺伝子を含有しない）対照ｈＥＳＣと比較して、１００％超低減された。（注：本明細書において使用される場合、「ｍＨＬＡ－Ｇ（ＥＦ－１α）－ＧＦＰ」導入遺伝子は、「ｅＨＬＡ－Ｇ（ＥＦ－１α）－ＧＦＰ」と同義である。）このデータは、ＨＬＡ－Ｇ導入遺伝子発現が、ｈＥＳＣにおける免疫抑制および／または低減された免疫原性の特性を付与することを示している。さらなる説明については、実施例６を参照されたい。
【図19】ＮＫ細胞毒性実験は、ｈＥＳＣから分化したｈＥＥＰに対して行った。示されるように、ｅＨＬＡ（ＥＦ－１α）－ＧＦＰ－ｈＥＥＰの死滅は、対照ｈＥＥＰと比較して、１００％超（約３倍）十分に低減された。このデータは、ＨＬＡ－Ｇ導入遺伝子発現が、分化した細胞における免疫抑制および／または低減された免疫原性の特性を付与することを示し、これはまた、ｅＨＬＡ－Ｇ導入遺伝子を介したＨＬＡ－Ｇ発現のこれらの強化された機能的免疫回避特性が、誘導分化プロセスに耐えたことを示している。さらなる説明については、実施例６を参照されたい。
【図20】ヒト化マウスにおけるｈＥＳＣ同種移植の結果を示す図である。「Ｇ０」ｈＥＳＣは、ｅＨＬＡ－Ｇ導入遺伝子を含有せず、ＧＦＰのみを含有する対照野生型ｈＥＳＣであった。「ｍＧ１（＃１）」および「ｍＧ１（＃２）」は、２つの異なるｅＨＬＡ－Ｇ（ＥＦ－１α）－ＧＦＰヌクレオフェクトされたｈＥＳＣクローンを指す。示されるようなＧ０、ｍＧ１（＃１）、およびｍＧ１（＃２）腫瘍が、測定および秤量された。Ｇ０ ｈＥＳＣは、１２６．９立方ミリメートルの体積および３２ミリグラムの重量を有する腫瘍を形成した。ｍＧ１（＃１）ｈＥＳＣは、７４８．４立方ミリメートルの体積および３１８ミリグラムの重量を有する腫瘍を形成した。ｍＧ１（＃２）ｈＥＳＣは、１１１６．７立方ミリメートルの体積および６７５ミリグラムの重量を有する腫瘍を形成した。さらなる説明については、実施例７を参照されたい。
【図21】５匹のヒト化ＮＳＧマウスへのｈＥＳＣ同種移植からの腫瘍の平均した結果を示すグラフである。上のパネルは、腫瘍重量（ｍｇ）の結果を示す。下のパネルは、腫瘍体積（立方ミリメートル）の結果を示す。データは、ＨＬＡ－ＧヌクレオフェクトされたｈＥＳＣ（「ｍＧ１」）が、ヒト化ＮＳＧマウスに移植された野生型ｈＥＳＣ（「Ｇ０」）よりもはるかに大きく（体積で３倍を超える）重い（重量で２倍を超える）腫瘍を形成したことを示している。これは、ＨＬＡ－Ｇ導入遺伝子発現が、同種移植ヒト環境（すなわち、ＮＳＧヒト化マウス）において、低減された免疫原性および／または増加した免疫抑制を提供し得ることを示している。このデータは、ＮＫ９２細胞毒性試験と共に、任意の所望の細胞型を、治療、移植、組織修復、細胞および組織の置換等のために普遍的または優れた同種ドナーに改変するための、本明細書に記載のｅＨＬＡ－Ｇ導入遺伝子コンストラクトの一般的応用を支持している。さらなる説明については、実施例７を参照されたい。
【図22】ｅＨＬＡ－Ｇ（ＥＦ－１α）－ＧＦＰ導入遺伝子で安定にトランスフェクトされたヒト皮膚線維芽細胞（「ＨＦＤ－ｍ１－ＧＦＰ」細胞）またはＧＦＰ単独対照コンストラクト（「ＨＦＤ－Ｇ０－ＧＦＰ」細胞）を、ＰＢＭＣ増殖を阻害するそれらの能力について評価した。示されるように、ＨＦＤ－ｍＧ１－ＧＦＰクローン「ｍＧ１－Ｒ１」は、対照および他のクローンよりも大きくＰＢＭＣ増殖を抑制したが、これは、外因性ＨＬＡ－Ｇ発現が、線維芽細胞等の分化細胞に対する免疫抑制を提供し得ることを示している。さらなる説明については、ＨＦＤ－ｍ１－ＧＦＰおよび対照によるＮＫ－９２細胞毒性試験の概要を含む実施例９を参照されたいが、これは、ヒト皮膚線維芽細胞へのｅＨＬＡ－Ｇ改変が、それらの免疫原性を低減したことを示している。したがって、これらのデータはさらに、任意の所望の細胞型を、多能性、多分化能、または完全分化であるかに関わらず、治療、移植、組織修復、細胞および組織の置換等のために普遍的または優れた同種ドナーに改変するための、本明細書に記載のｅＨＬＡ－Ｇ導入遺伝子コンストラクトの使用を支持している。
【発明を実施するための形態】
【0028】
本開示は、外因性ＨＬＡ－Ｇを持続的に発現する遺伝子改変された哺乳動物細胞（ＨＬＡ－Ｇ改変された細胞）、およびそのような改変された哺乳動物細胞を生成するための核酸組成物を特徴とする。本明細書に記載のｅＨＬＡ－Ｇ遺伝子改変は、細胞が、移植、細胞および組織再生または再構成、ならびに他の治療のための普遍的または改善されたドナー細胞である有望性を有するように、低減された免疫原性および／または改善された免疫抑制の特性を有するそれらの細胞を提供する。
【0029】
Ｉ．組成物：
Ａ．外因性ＨＬＡ－Ｇを発現する遺伝子改変された哺乳動物細胞
本明細書において説明されるように、外因性ＨＬＡ－Ｇを発現する広範な哺乳動物細胞型（ＨＬＡ－Ｇ改変された細胞）が生成され得る。そのような細胞型は、分化全能性細胞、胚性幹細胞（例えば、ヒト胚性幹細胞）、誘導多能性幹細胞（例えば、ヒト誘導多能性幹細胞）、多分化能幹細胞、表皮前駆細胞、間葉系幹細胞、膵臓β細胞前駆細胞、膵臓β細胞、心臓前駆細胞、心筋細胞、肝前駆細胞、肝細胞、筋細胞前駆細胞、筋細胞、腎細胞、骨芽細胞、造血前駆細胞、歯小嚢細胞、毛包細胞、網膜色素上皮細胞、神経幹細胞、ニューロン、星状膠細胞、乏突起膠細胞、内耳細胞、および線維芽細胞（ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＦＤ）を含む）を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ｇ改変された細胞は、免疫系細胞型を有する細胞ではない。そのような哺乳動物細胞は、例えばヒト、マウス、ラット、サル、またはブタを含むいくつかの種の１つから得ることができる。本質的に、任意の細胞型が、本明細書に記載のコンストラクトでトランスフェクトされ、次いでＨＬＡ－Ｇ発現について、およびそのような発現が低減された免疫原性および／または改善された免疫抑制をどのように改変された細胞に付与し得るかについて試験されてもよい。
Ａ．外因性ＨＬＡ－Ｇを発現する遺伝子改変された哺乳動物細胞
本明細書において説明されるように、外因性ＨＬＡ－Ｇを発現する広範な哺乳動物細胞型（ＨＬＡ－Ｇ改変された細胞）が生成され得る。そのような細胞型は、分化全能性細胞、胚性幹細胞（例えば、ヒト胚性幹細胞）、誘導多能性幹細胞（例えば、ヒト誘導多能性幹細胞）、多分化能幹細胞、表皮前駆細胞、間葉系幹細胞、膵臓β細胞前駆細胞、膵臓β細胞、心臓前駆細胞、心筋細胞、肝前駆細胞、肝細胞、筋細胞前駆細胞、筋細胞、腎細胞、骨芽細胞、造血前駆細胞、歯小嚢細胞、毛包細胞、網膜色素上皮細胞、神経幹細胞、ニューロン、星状膠細胞、乏突起膠細胞、内耳細胞、および線維芽細胞（ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＦＤ）を含む）を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ｇ改変された細胞は、免疫系細胞型を有する細胞ではない。そのような哺乳動物細胞は、例えばヒト、マウス、ラット、サル、またはブタを含むいくつかの種の１つから得ることができる。本質的に、任意の細胞型が、本明細書に記載のコンストラクトでトランスフェクトされ、次いでＨＬＡ－Ｇ発現について、およびそのような発現が低減された免疫原性および／または改善された免疫抑制をどのように改変された細胞に付与し得るかについて試験されてもよい。
【0030】
いくつかの実施形態において、所望の細胞型のＨＬＡ－Ｇ改変された細胞の実質的に濃縮された集団を得るために、ＨＬＡ－Ｇを発現する、遺伝子改変された多能性幹細胞株、例えばヒト胚性幹細胞株、またはヒト誘導多能性幹細胞株、または間葉系幹細胞および免疫系前駆細胞を含む多分化能形質を有する任意の細胞株が生成され、次いで、ＨＬＡ－Ｇを発現する、所望の細胞型について実質的に濃縮された細胞集団を得るために、誘導分化に供される。いくつかの実施形態において、実質的に濃縮された細胞集団は、少なくとも約２％から約１００％の所望の細胞型、例えば、少なくとも約３％、４％、５％、７％、８％、１０％、２０％、２２％、２５％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、または少なくとも約２％から約１００％の別のパーセンテージの所望の細胞型を含む。所望の細胞型の細胞を濃縮するための方法は、当該技術分野において知られている。例えば、米国特許出願第１２／５３２，５１２号を参照されたい。
【0031】
ヒト胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞を得るための方法は、米国特許第６，２００，８０６号および米国特許第７，２１７，５６９号（ヒト胚性幹細胞誘導に関する）、ならびに米国特許第８，０４８，９９９号、米国特許第８，０５８，０６５号、および米国特許第８，０４８，６７５号（ヒト誘導多能性幹細胞の生成に関する）に記載されるように、当該技術分野において知られている。
【0032】
本明細書に記載の核酸の１つによりコードされたＨＬＡ－Ｇタンパク質を安定に発現する、遺伝子改変された哺乳動物多能性または多分化能幹細胞株、例えば、ヒト胚性幹細胞またはヒト誘導多能性幹細胞等、および完全に分化した遺伝子改変された哺乳動物は、当該技術分野において知られている複数の方法のいずれかにより生成される。いくつかの実施形態において、細胞株は、本明細書に記載のようなＨＬＡ－Ｇタンパク質、選択マーカー、および任意選択でレポータータンパク質の発現のための発現カセットを含む、１つ以上の核酸発現ベクター（例えば、プラスミドベクターまたはミニサークルベクター）による安定なトランスフェクションにより遺伝子改変される。そのようなベクターによりコードされる好適な選択マーカーの例は、選択薬剤に抵抗性を付与するタンパク質を含む。そのようなタンパク質およびその対応する選択薬剤は、限定されることなく、ピューロマイシンＮ－アセチルトランスフェラーゼ（ピューロマイシン）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ハイグロマイシン）、ブラストサイジン－Ｓ－デアミナーゼ（ブラストサイジン）、およびネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ネオマイシン）を含む。適切な選択薬剤による選択は、耐性コロニーが出現するまでの少なくとも約３日から約１４日、例えば、約４、５、６、７、８、９、１０、１２、１３日、または約３日から約１４日の別の期間続いてもよい。
【0033】
好適な蛍光レポータータンパク質の例は、ＥＧＦＰおよびその変異体、例えばＹＦＰ、Ｃｙａｎ、およびｄＥＧＦＰ；ＤＳ－Ｒｅｄ、モノマーＯｒａｎｇｅ、遠赤色蛍光タンパク質「Ｋａｔｕｓｈｋａ」（Ｓｈｃｈｅｒｂｏ ｅｔ ａｌ （２００７），Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，４：７４１－７４６）、または前述のもののいずれかの変異体を含むが、これらに限定されない。他の実施形態において、レポーターは、プロセスにおいて、蛍光性または発光性基質の存在下でそれぞれ検出可能なシグナル、例えば蛍光または発光シグナルを生成する基質を変換する酵素である。例えば、いくつかの実施形態において、選択マーカー酵素は、ルシフェラーゼ、例えば蛍ルシフェラーゼ、コメツキムシルシフェラーゼ、またはウミシイタケルシフェラーゼのアミノ酸配列を含む。ルシフェラーゼ活性は、適切な発光基質、例えば、蛍ルシフェラーゼの場合蛍ルシフェリン、またはウミシイタケルシフェラーゼの場合セレンテラジンを提供することにより、検出され得る。適切な基質の存在下でのルシフェラーゼ活性は、培養皿のウェル中の全細胞集団の総ルシフェラーゼ活性をアッセイするための発光測定によって定量化することができ、または、代替として、個々の細胞もしくはコロニーのルシフェラーゼ活性は、光子計数カメラと組み合わせて顕微鏡を使用することにより検出され得る。ハイスループット法を含むルシフェラーゼアッセイの詳細は、例えば、米国特許第５，６５０，１３５号、米国特許第５，７４４，３２０号、および米国特許第６，９８２，４３１号に開示されている。他の実施形態において、レポーター酵素は、改変されたベータ－ラクタマーゼのアミノ酸配列を含み、その発現は、例えば米国特許第５，７４１，６５７号、米国特許第６，０３１，０９４号、および米国特許公開第２００７０１８４５１３号に記載のように、蛍光ベータ－ラクタム基質の破壊についてのレシオメトリック蛍光アッセイにより、生細胞において検出および定量化され得る。概説については、Ｑｕｒｅｓｈｉ（２００７），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，４２（１）：９１－９６も参照されたい。他の適切なレポーター酵素は、Ｈａｌｏ－Ｔａｇ（登録商標）加水分解酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ、例えば米国特許第７，２３８，８４２号ならびに米国特許公開第２００８００２６４０７号および米国特許公開第２００８０１４５８８２号に記載されるように）およびβ－ガラクトシダーゼを含むが、これらに限定されない。
【0034】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変された哺乳動物細胞はまた、ヒトβ２ミクログロブリン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１８７６８７．１）を発現するように遺伝子改変されている。理論に束縛されることを望まないが、ヒトβ２ミクログロブリンの発現は、遺伝子改変された哺乳動物細胞において、トランスジェニックＨＬＡ－Ｇの表面発現を強化すると考えられる。
【0035】
いくつかの実施形態において、核酸発現ベクターは、例えば、米国特許出願第１２／７２８，９４３号に記載のように、同族トランスポザーセ（例えば、ｐｉｇｇｙＢＡＣトランスポザーセ）の存在下で宿主細胞内に導入された際の宿主ゲノム内へのトランスポゾンベクターの転位の統合を促進する転位要素を含むトランスポゾンベクターである。トランスポゾン発現ベクター（例えば、ＰｉｇｇｙＢａｃベクター）、およびトランスポザーセ発現ベクターは、例えば、Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）から市販されている。いくつかの実施形態において、トランスポゾンベクターが使用される場合、安定にトランスフェクトされた、ＨＬＡ－Ｇ改変された細胞株を生成するために、選択マーカーまたはレポータータンパク質発現カセットは必要ではないが、これは、そのようなベクターによるトランスフェクションの効率が、選択マーカーの必要性を取り除くのに十分であるためである。代替として、発現ベクターは、宿主細胞ゲノムにおけるｅＨＬＡ－Ｇ導入遺伝子の部位特異的統合を可能にする標的化ベクターであってもよい。標的化ベクターの設計および使用は、米国特許第５，４６４，７６４号により例示されるように、当該技術分野において慣例的である。
【0036】
トランスフェクショングレードの核酸発現ベクターの調製のための方法、およびトランスフェクション方法は、十分に確立されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１），「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，」３ｒｄ ｅｄ，（ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ）；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（２００５），９．１－９．１４を参照されたい。高効率トランスフェクション効率の方法の例は、例えば、Ｔｒｏｍｐｅｔｅｒ（２００３），Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２７４（１－２）：２４５－２５６、ならびに米国特許第７，３３２，３３２号、米国特許第８，００３，３８９号、米国特許第８，０３９，２５９号、および米国特許第８，１９２，９９０ ９号に記載のような「ヌクレオフェクション」、すなわち、Ｆｕｇｅｎｅ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ）、ＤＯＴＡＰ、およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）等の脂質系トランスフェクション試薬を使用したトランスフェクションを含む。
【0037】
他の実施形態において、遺伝子改変された細胞、例えば、分化した、多分化能、多能性、または分化全能性幹細胞株は、組み換えウイルスでの形質導入により生成される。好適な組み換えウイルスの例は、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスを含むが、これらに限定されない。多くの場合、組み換えレトロウイルスは、マウスモロニー白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）であるが、トリ白血病ウイルス、ウシ白血病ウイルス、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ミンク細胞フォーカス誘発ウイルス、マウス肉腫ウイルス、細網内皮症ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、メイソンファイザー猿ウイルス、またはラウス肉腫ウイルス等の他の組み換えレトロウイルスが使用されてもよく、例えば、米国特許第６，３３３，１９５号を参照されたい。
【0038】
他の場合において、組み換えレトロウイルスは、レンチウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス－１（ＨＩＶ－１）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、またはネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ））であり、例えば、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９９），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７３（６）：４９９１－５０００（ＦＩＶ）、Ｎｅｇｒｅ ｅｔ ａｌ．，（２００２），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２６１：５３－７４（ＳＩＶ）、Ｎａｌｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９６），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２：２６３－２６７（ＨＩＶ）を参照されたい。
【0039】
組み換えレトロウイルスは、標的細胞への侵入を助けるために、ウイルス性ポリペプチド（例えば、レトロウイルスｅｎｖ）を含んでもよい。そのようなウイルス性ポリペプチドは、当該技術分野において十分に確立されており、例えば、米国特許第５，４４９，６１４号を参照されたい。ウイルス性ポリペプチドは、本来の宿主種以外の細胞を含む複数の種に由来する細胞への侵入を助ける、両種ウイルス性ポリペプチド、例えば、両種ｅｎｖであってもよい。例えば、同文献を参照されたい。ウイルス性ポリペプチドは、元の宿主種以外の細胞への侵入を助ける異種指向性ウイルス性ポリペプチドであってもよい。例えば、同文献を参照されたい。いくつかの実施形態において、ウイルス性ポリペプチドは、元の宿主種の細胞への侵入を助ける、エコトロピックウイルス性ポリペプチド、例えば、エコトロピックｅｎｖである。例えば、同文献を参照されたい。
【0040】
細胞のウイルス形質導入は、当該技術分野において知られている任意の方法、例えば、Ｐａｌｓｓｏｎ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９５）、国際公開第９５／１０６１９号、Ｍｏｒｌｉｎｇ，Ｆ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（１９９５），Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２：５０４－５０８、Ｇｏｐｐ ｅｔ ａｌ．，（２００６），Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，４２０：６４－８１により達成することができる。例えば、感染は、細胞へのウイルスの添加直後の期間の間に細胞を遠心分離に供することを含む、スピン感染または「スピノキュレーション」の方法により達成することができる。いくつかの場合において、ウイルスは、感染前に、例えば超遠心分離により濃縮されてもよい。
【0041】
遺伝子改変される細胞を形質導入するために使用される感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）は、約１ｍ．ｏ．ｉ．から約５０ｍ．ｏ．ｉ．、例えば約１ｍ．ｏ．ｉ．、約５ｍ．ｏ．ｉ．、約７．５ｍ．ｏ．ｉ．、約１０ｍ．ｏ．ｉ．、約１５ｍ．ｏ．ｉ．、約２０ｍ．ｏ．ｉ．、約３０ｍ．ｏ．ｉ．、約４０ｍ．ｏ．ｉ．、または約５０ｍ．ｏ．ｉ．の範囲であってもよい。
【0042】
多能性幹細胞（例えば、ヒト胚性幹細胞またはヒト誘導多能性幹細胞）から誘導分化により様々な細胞型を生成するための方法は、例えば、米国特許第７，９５５，８４９号、米国特許第７，７６３，４６６号、米国特許第７，２６４，９６８号、米国特許出願第１２／１７９，４６２号および米国特許出願第１２／１８７，５４３号に記載のように、当該技術分野において知られている。
【0043】
１つの例示的実施形態において、ヒト胚性表皮前駆細胞（ｈＥＥＰ）は、ヒト多能性幹細胞株、例えばヒト胚性幹細胞またはヒト誘導多能性幹細胞から、以下のようにして得られる。
【0044】
多能性幹細胞を、２０％ノックアウト血清代替物、０．１ｍＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸、１ｍＭ ＧｌｕｔａＭａｘ、０．１ｍＭ β－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）を含有する胚性幹細胞（ＥＳＣ）成長培地中に維持する。有糸分裂不活性化されたマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）（ＣＦ－１、ＡＴＣＣ）を、５×１０４細胞／ｃｍ２の密度で播種し、１８～２４時間インキュベートすることにより、ＥＳＣ成長培地を調整する。調整後、４ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦを添加し、完全調整培地を滅菌濾過する。ｈＥＳＣを、５～６日毎に（１：３または１：４分割で）、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）被覆プレート上で、細胞コロニーを除去するために１ｍｇ／ｍｌディスパーゼを使用して継代培養する。まず多能性幹細胞を６ウェルプレートで４日間、ＥＳＣ成長培地中で培養し、次いで、１μＭオールトランス型レチノイン酸（Ｓｉｇｍａ）および２５ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４を含有する非調整ｈＥＳＣ成長培地を含む２ｍｌ／ウェルの分化培地に変更することによる、多能性幹細胞のＫ１４＋／ｐ６３＋ｈＥＥＰへのｈＥＥＰ分化。７日間の毎日の培地交換後、細胞をディスパーゼで処理し、遠心分離し、ケラチノサイト合成無血清培地（ＤＳＦＭ）中に再懸濁させ、ゼラチン被覆プレート上に１：３の分割比で播種する。ＤＳＦＭは、３～４週間、１日おきに交換する。次いで、トリプシン処理を使用して細胞を継代培養し、遠心分離し、洗浄し、ｃｍ２当たり１０，０００細胞で、ＤＳＦＭ中のゼラチン被覆組織培養プレート上に播種する。上皮単層が９０％以上の純度であり、Ｋ１４を発現することを検証するために、Ｍｅｔａｌｌｏ ｅｔ ａｌ（２０１０），Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ５８５：８３－９２の方法に従い、細胞をフローサイトメトリーに供する。単離されたｈＥＥＰの純度を高めるために、細胞を、ＣＤ２９抗体で磁気活性化細胞ソーティング（ＭＡＳＣ）を用いて選別した。ｅＨＬＡ－Ｇ（ＥＦ－１α）－ＧＦＰ改変されたｈＥＳＣから分化した、ＣＤ２９ ＭＡＳＣ選別されたｈＥＥＰ細胞培地細胞の約９２パーセントが、Ｋ１４、すなわち特異的ケラチノサイトマーカーに対して陽性であった。
【0045】
本明細書に記載のようなトランスジェニックｅＨＬＡ－Ｇを発現する遺伝子改変された哺乳動物細胞は、ＨＬＡ－Ｇを発現しない対応する哺乳動物細胞と比べて低減された免疫原性を有する。例えば、免疫原性は、外因性ＨＬＡ－Ｇを発現しない対応する細胞型と比べて、少なくとも約５％から約９５％低減され得、例えば、外因性ＨＬＡ－Ｇを発現しない同じ細胞型の細胞と比べて、約６％、７％、１０％、１２％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６５％、７０％、８０％、８５％、９０％、または別のパーセントだけ低減された免疫原性である。
【0046】
細胞の免疫原性を決定するための方法は、当該技術分野において知られている。例えば、いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ｇ改変された哺乳動物細胞（例えば、ヒト胚性幹細胞、もしくはＨＬＡ－Ｇ改変された胚性幹細胞から分化した細胞、もしくは改変前にすでに完全に分化した細胞等）または非改変哺乳動物細胞が、同種異系ナチュラルキラー細胞株（例えば、ＮＫ－９２）の存在下で培養され、次いで、ＮＫ－９２細胞により誘導されたＨＬＡ－Ｇ改変された細胞対非改変細胞に対する毒性が、複数の標準的細胞生存率アッセイのいずれかにより決定される。
【0047】
強化されたＨＬＡ－Ｇ（ｅＨＬＡ－Ｇ）導入遺伝子を含有する核酸
本明細書に記載のようなＨＬＡ改変された哺乳動物細胞を生成するために使用される単離された核酸（例えば、哺乳動物プラスミド発現ベクター）は、野生型ＨＬＡ－Ｇ導入遺伝子により駆動される細胞表面発現と比べて増加した細胞表面発現および／またはＨＬＡ－Ｇの分泌を駆動する、強化されたＨＬＡ－Ｇ「ｅＨＬＡ－Ｇ」導入遺伝子を含有する。そのような導入遺伝子は、典型的には、少なくとも３つの別個の成分、すなわちプロモーターおよび５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）配列、コード配列、ならびに３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）配列を含む。
本明細書に記載のようなＨＬＡ改変された哺乳動物細胞を生成するために使用される単離された核酸（例えば、哺乳動物プラスミド発現ベクター）は、野生型ＨＬＡ－Ｇ導入遺伝子により駆動される細胞表面発現と比べて増加した細胞表面発現および／またはＨＬＡ－Ｇの分泌を駆動する、強化されたＨＬＡ－Ｇ「ｅＨＬＡ－Ｇ」導入遺伝子を含有する。そのような導入遺伝子は、典型的には、少なくとも３つの別個の成分、すなわちプロモーターおよび５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）配列、コード配列、ならびに３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）配列を含む。
【0048】
いくつかの実施形態において、ｅＨＬＡ－Ｇ導入遺伝子発現を駆動するために使用されるプロモーターは、少なくとも約７週間から約５０週間、例えば８週間、９週間、１０週間、１２週間、１５週間、２０週間、２５週間、３０週間、３５週間、４０週間、４２週間、４５週間、４７週間、４８週間、または少なくとも約７週間から約５０週間の別の期間、目的の細胞型におけるｅＨＬＡ－Ｇ導入遺伝子の発現を駆動することができるものである。そのような長期間発現を駆動することができるプロモーターは、例えば、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、または間葉系幹細胞等の幹細胞を含む複数の細胞型において生じるサイレンシングを回避する上で効果的である。
【0049】
好適なサイレンシング耐性プロモーターは、チャイニーズハムスター延長因子－１アルファ（ＣＨＥＦ－１α）プロモーター（Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｄｅｅｒ ｅｔ ａｌ（２００４），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，２０：８８０－８８９、およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ１８８３９３．１を参照されたい）、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）プロモーターのＭ－Ｕ３／Ｒ－変異体プロモーター（Ｓｗｉｎｄｌｅ ｅｔ ａｌ（２００４），Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７９：３４－４１に記載のようなもの）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ヒトβ－アクチンプロモーター、ならびにユビキチンＣプロモーターを含むが、これらに限定されない。
【0050】
いくつかの実施形態において、ｅＨＬＡ－Ｇ導入遺伝子の発現を駆動するために使用されるプロモーターは、他の細胞型の場合よりも高いレベルで、１つ以上の所望の細胞型において発現される。当業者には、例えば、ＨＬＡ－Ｇ改変された幹細胞が特定の細胞型に分化する場合、その特定の細胞型内において活性である、またはさらにはそれに対して選択的であるプロモーターを選択することが有利となり得ることが理解されるであろう。例えば、所与の組織または細胞型選択的プロモーターに関して、発現レベルは、所望の細胞型において、別の細胞型と比較して約２倍から１００倍高くてもよく、例えば、所望の細胞型において、別の細胞型と比較して約３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、７０倍、８０倍、９０倍、または別の倍数だけ高いレベルの発現であってもよい。組織および／または細胞型選択的プロモーターの例は、ニューロン特異的エノラーゼ（ニューロン）、シナプシン（ニューロン）、ＣａＭＫＩＩ（前脳ニューロン）、ＨＢ９（運動ニューロン）、およびドーパミントランスポーター（ドーパミン作動性ニューロン）；グリア線維性酸性タンパク質（星状膠細胞）；アルブミン（肝臓）；α－ミオシン重鎖（αＭＨＣ－心筋細胞）；ニューロゲニン３および膵臓十二指腸ホメオボックス１（膵臓）；ケラチン１４（皮膚）；ならびにベストロフィン１（網膜色素上皮）のプロモーターを含むが、これらに限定されない。
【0051】
典型的には、ｅＨＬＡ－Ｇ導入遺伝子配列は、ヒト（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ＿００２１１８．１）またはチンパンジーコンセンサス配列と比べて少なくとも１個から約１０個の点突然変異、例えば、上述のＨＬＡ－Ｇタンパク質コンセンサス配列と比べて２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の点突然変異を含有するＨＬＡ－Ｇタンパク質をコードする。
【0052】
ヒトコンセンサス野生型配列（配列番号：１）を、以下に示す。
ＭＶＶＭＡＰＲＴＬＦＬＬＬＳＧＡＬＴＬＴＥＴＷＡＧＳＨＳＭＲＹＦＳＡＡＶＳＲＰＧＲＧＥＰＲＦＩＡＭＧＹＶＤＤＴＱＦＶＲＦＤＳＤＳＡＣＰＲＭＥＰＲＡＰＷＶＥＱＥＧＰＥＹＷＥＥＥＴＲＮＴＫＡＨＡＱＴＤＲＭＮＬＱＴＬＲＧＹＹＮＱＳＥＡＳＳＨＴＬＱＷＭＩＧＣＤＬＧＳＤＧＲＬＬＲＧＹＥＱＹＡＹＤＧＫＤＹＬＡＬＮＥＤＬＲＳＷＴＡＡＤＴＡＡＱＩＳＫＲＫＣＥＡＡＮＶＡＥＱＲＲＡＹＬＥＧＴＣＶＥＷＬＨＲＹＬＥＮＧＫＥＭＬＱＲＡＤＰＰＫＴＨＶＴＨＨＰＶＦＤＹＥＡＴＬＲＣＷＡＬＧＦＹＰＡＥＩＩＬＴＷＱＲＤＧＥＤＱＴＱＤＶＥＬＶＥＴＲＰＡＧＤＧＴＦＱＫＷＡＡＶＶＶＰＳＧＥＥＱＲＹＴＣＨＶＱＨＥＧＬＰＥＰＬＭＬＲＷＫＱＳＳＬＰＴＩＰＩＭＧＩＶＡＧＬＶＶＬＡＡＶＶＴＧＡＡＶＡＡＶＬＷＲＫＫＳＳＤ
ＭＶＶＭＡＰＲＴＬＦＬＬＬＳＧＡＬＴＬＴＥＴＷＡＧＳＨＳＭＲＹＦＳＡＡＶＳＲＰＧＲＧＥＰＲＦＩＡＭＧＹＶＤＤＴＱＦＶＲＦＤＳＤＳＡＣＰＲＭＥＰＲＡＰＷＶＥＱＥＧＰＥＹＷＥＥＥＴＲＮＴＫＡＨＡＱＴＤＲＭＮＬＱＴＬＲＧＹＹＮＱＳＥＡＳＳＨＴＬＱＷＭＩＧＣＤＬＧＳＤＧＲＬＬＲＧＹＥＱＹＡＹＤＧＫＤＹＬＡＬＮＥＤＬＲＳＷＴＡＡＤＴＡＡＱＩＳＫＲＫＣＥＡＡＮＶＡＥＱＲＲＡＹＬＥＧＴＣＶＥＷＬＨＲＹＬＥＮＧＫＥＭＬＱＲＡＤＰＰＫＴＨＶＴＨＨＰＶＦＤＹＥＡＴＬＲＣＷＡＬＧＦＹＰＡＥＩＩＬＴＷＱＲＤＧＥＤＱＴＱＤＶＥＬＶＥＴＲＰＡＧＤＧＴＦＱＫＷＡＡＶＶＶＰＳＧＥＥＱＲＹＴＣＨＶＱＨＥＧＬＰＥＰＬＭＬＲＷＫＱＳＳＬＰＴＩＰＩＭＧＩＶＡＧＬＶＶＬＡＡＶＶＴＧＡＡＶＡＡＶＬＷＲＫＫＳＳＤ
【0053】
いくつかの実施形態において、少なくとも１個から約１０個の点突然変異は、タンパク質の処理および成熟化の間、小胞体におけるＨＬＡ－Ｇの保持を低減することにより、発現宿主細胞の細胞表面上のＨＬＡ－Ｇタンパク質の発現のレベルを増加させる。そのような突然変異は、例えば、ＨＬＡ－Ｇ「ＫＫ」モチーフ突然変異を含む。例えば、Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ（２００１），Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１５：２１３－２２４を参照されたい。いくつかの場合において、ＫＫモチーフ突然変異は、Ｋ３３４Ａ突然変異、Ｋ３３５Ａ突然変異、または両方の突然変異を含む。他の場合において、置換は、異なる脂肪族アミノ（例えばロイシン）酸、または非塩基性である別の種類の種類のアミノ酸でなされてもよい。
【0054】
一例において、コードされたＨＬＡ－Ｇタンパク質は、（配列番号：２）のアミノ酸配列を有し、野生型配列と比べて、Ｋ３３４ＡおよびＫ３３５Ａ置換が導入されている（下線）。
ＭＶＶＭＡＰＲＴＬＦＬＬＬＳＧＡＬＴＬＴＥＴＷＡＧＳＨＳＭＲＹＦＳＡＡＶＳＲＰＧＲＧＥＰＲＦＩＡＭＧＹＶＤＤＴＱＦＶＲＦＤＳＤＳＡＣＰＲＭＥＰＲＡＰＷＶＥＱＥＧＰＥＹＷＥＥＥＴＲＮＴＫＡＨＡＱＴＤＲＭＮＬＱＴＬＲＧＹＹＮＱＳＥＡＳＳＨＴＬＱＷＭＩＧＣＤＬＧＳＤＧＲＬＬＲＧＹＥＱＹＡＹＤＧＫＤＹＬＡＬＮＥＤＬＲＳＷＴＡＡＤＴＡＡＱＩＳＫＲＫＣＥＡＡＮＶＡＥＱＲＲＡＹＬＥＧＴＣＶＥＷＬＨＲＹＬＥＮＧＫＥＭＬＱＲＡＤＰＰＫＴＨＶＴＨＨＰＶＦＤＹＥＡＴＬＲＣＷＡＬＧＦＹＰＡＥＩＩＬＴＷＱＲＤＧＥＤＱＴＱＤＶＥＬＶＥＴＲＰＡＧＤＧＴＦＱＫＷＡＡＶＶＶＰＳＧＥＥＱＲＹＴＣＨＶＱＨＥＧＬＰＥＰＬＭＬＲＷＫＱＳＳＬＰＴＩＰＩＭＧＩＶＡＧＬＶＶＬＡＡＶＶＴＧＡＡＶＡＡＶＬＷＲＡＡＳＳＤ
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【0055】
いくつかの実施形態において、ｅＨＬＡ－Ｇ導入遺伝子は、ＨＬＡ－Ｇタンパク質をコードし、そのアミノ酸配列は、配列番号：２のアミノ酸配列と少なくとも７５％から１００％同一であり、例えば、配列番号：２のアミノ酸配列と７７％、８０％、８２％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または別のパーセントだけ同一である。
【0056】
本明細書において開示されるｅＨＬＡ－Ｇ導入遺伝子はまた、ＨＬＡ－Ｇ転写産物の発現／翻訳効率に影響する複数の調節要素を含有する、３’非翻訳（３’ＵＴＲ）領域を含む。いくつかの実施形態において、ｅＨＬＡ－Ｇ導入遺伝子３’ＵＴＲ配列は、（配列番号：３）の配列と少なくとも７５％同一である、例えば、ＨＬＡ－Ｇ ３’ＵＴＲ（配列番号：３）の配列と少なくとも７７％、８０％、８２％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、または別のパーセントだけ同一である核酸配列を含む核酸配列である。
ＴＧＴＧＡＡＡＣＡＧＣＴＧＣＣＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＣＴＧＡＧＴＧＧＣＡＡＧＴＣＣＣＴＴＴＧＴＧＡＣＴＴＣＡＡＧＡＡＣＣＣＴＧＡＣＴＴＣＴＣＴＴＴＧＴＧＣＡＧＡＧＡＣＣＡＧＣＣＣＡＡＣＣＣＴＧＴＧＣＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＣＴＣＴＴＣＣＴＣＡＴＧＣＴＧＡＡＣＴＧＣＡＴＴＣＣＴＴＣＣＣＣＡＡＴＣＡＣＣＴＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＡＧＡＡＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＧＡＴＧＴＣＴＣＣＧＴＣＴＣＴＧＴＣＴＣＡＡＡＴＴＴＧＴＧＧＴＣＣＡＣＴＧＡＧＣＴＡＴＡＡＣＴＴＡＣＴＴＣＴＧＴＡＴＴＡＡＡＡＴＴＡＧＡＡＴＣＴＧＡＧＴＧ
ＴＧＴＧＡＡＡＣＡＧＣＴＧＣＣＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＣＴＧＡＧＴＧＧＣＡＡＧＴＣＣＣＴＴＴＧＴＧＡＣＴＴＣＡＡＧＡＡＣＣＣＴＧＡＣＴＴＣＴＣＴＴＴＧＴＧＣＡＧＡＧＡＣＣＡＧＣＣＣＡＡＣＣＣＴＧＴＧＣＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＣＴＣＴＴＣＣＴＣＡＴＧＣＴＧＡＡＣＴＧＣＡＴＴＣＣＴＴＣＣＣＣＡＡＴＣＡＣＣＴＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＡＧＡＡＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＧＡＴＧＴＣＴＣＣＧＴＣＴＣＴＧＴＣＴＣＡＡＡＴＴＴＧＴＧＧＴＣＣＡＣＴＧＡＧＣＴＡＴＡＡＣＴＴＡＣＴＴＣＴＧＴＡＴＴＡＡＡＡＴＴＡＧＡＡＴＣＴＧＡＧＴＧ
【0057】
そのような配列は、導入遺伝子コード化ＨＬＡ－Ｇの増加した発現をもたらす２つのｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位の結合を減少させる突然変異（下線）を含有する。これらの配列は、いくつかのＨＬＡ－Ｇ対立遺伝子のエクソン８に存在する１４塩基対配列の欠失を含む。この１４塩基対配列を、配列番号：４として以下に示す。
配列番号：４ ＨＬＡ ３’ＵＴＲにおける１４－ｂｐ挿入配列
ＡＴＴＴＧＴＴＣＡＴＧＣＣＴ
配列番号：４ ＨＬＡ ３’ＵＴＲにおける１４－ｂｐ挿入配列
ＡＴＴＴＧＴＴＣＡＴＧＣＣＴ
【0058】
以下に示される配列番号：５は、この１４塩基対配列（小文字）の挿入を有する配列番号：３に対応する。
配列番号：５（＋１４ ＢＰ ＨＬＡ－Ｇ ３’ＵＴＲ変異体）
ＴＧＴＧＡＡＡＣＡＧＣＴＧＣＣＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＣＴＧＡＧＴＧＧＣＡＡＧａｔｔｔｇｔｔｃａｔｇｃｃｔＴＣＣＣＴＴＴＧＴＧＡＣＴＴＣＡＡＧＡＡＣＣＣＴＧＡＣＴＴＣＴＣＴＴＴＧＴＧＣＡＧＡＧＡＣＣＡＧＣＣＣＡＡＣＣＣＴＧＴＧＣＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＣＴＣＴＴＣＣＴＣＡＴＧＣＴＧＡＡＣＴＧＣＡＴＴＣＣＴＴＣＣＣＣＡＡＴＣＡＣＣＴＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＡＧＡＡＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＧＡＴＧＴＣＴＣＣＧＴＣＴＣＴＧＴＣＴＣＡＡＡＴＴＴＧＴＧＧＴＣＣＡＣＴＧＡＧＣＴＡＴＡＡＣＴＴＡＣＴＴＣＴＧＴＡＴＴＡＡＡＡＴＴＡＧＡＡＴＣＴＧＡＧＴＧ
配列番号：５（＋１４ ＢＰ ＨＬＡ－Ｇ ３’ＵＴＲ変異体）
ＴＧＴＧＡＡＡＣＡＧＣＴＧＣＣＣＴＧＴＧＴＧＧＧＡＣＴＧＡＧＴＧＧＣＡＡＧａｔｔｔｇｔｔｃａｔｇｃｃｔＴＣＣＣＴＴＴＧＴＧＡＣＴＴＣＡＡＧＡＡＣＣＣＴＧＡＣＴＴＣＴＣＴＴＴＧＴＧＣＡＧＡＧＡＣＣＡＧＣＣＣＡＡＣＣＣＴＧＴＧＣＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＣＴＣＴＴＣＣＴＣＡＴＧＣＴＧＡＡＣＴＧＣＡＴＴＣＣＴＴＣＣＣＣＡＡＴＣＡＣＣＴＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＡＧＡＡＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＧＡＴＧＴＣＴＣＣＧＴＣＴＣＴＧＴＣＴＣＡＡＡＴＴＴＧＴＧＧＴＣＣＡＣＴＧＡＧＣＴＡＴＡＡＣＴＴＡＣＴＴＣＴＧＴＡＴＴＡＡＡＡＴＴＡＧＡＡＴＣＴＧＡＧＴＧ
【0059】
３’ＵＴＲを有するＨＬＡ－Ｇ対立遺伝子は、上述の１４塩基挿入（配列番号：４を参照されたい）を含み、より安定なＨＬＡ－Ｇ ｍＲＮＡ転写産物を生成することが報告されている。Ｒｏｕｓｅａｕ ｅｔ ａｌ（２００３），Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６４：１００５－１０１０を参照されたい。驚くべきことに、本開示のいくつかの実施形態の１つの基礎として、１４塩基対欠失（配列番号：３に示される）を有する対立遺伝子の発現が、１４対挿入を含む対立遺伝子よりも免疫防御性であると思われることが、予想外にも判明した。図１３を参照されたい。理論に束縛されることを望まないが、ＨＬＡ－Ｇの発現レベルに対する１４ｂｐ欠失の効果は、細胞型特異的となり得ると考えられ、例えば、１４ｂｐ欠失は、少なくともｈＥＳＣ、ｈＥＥＰ、およびヒト皮膚線維芽細胞を含むヒト細胞におけるｅＨＬＡ－Ｇの発現を明らかに強化する。
【0060】
いくつかの実施形態において、ｅＨＬＡ－Ｇ導入遺伝子を含有する核酸配列はまた、ｅＨＬＡ－Ｇ発現カセットに隣接するインシュレータ配列を含む。インシュレータ配列は、統合外因性発現カセットの発現に誤って影響し得るゲノム位置の影響を軽減する。いくつかの実施形態において、使用されるインシュレータ配列は、ニワトリβ－グロビンＨＳ４コアインシュレータ配列を含有する。
【0061】
いくつかの実施形態において、ｅＨＬＡ－Ｇ導入遺伝子を含有する核酸はまた、本明細書に記載のような選択マーカーを含む。任意選択で、ｅＨＬＡ－Ｇ導入遺伝子を含有する単離された核酸は、本明細書に記載のようなレポータータンパク質をさらに含有してもよい。
【0062】
いくつかの実施形態において、ｅＨＬＡ－Ｇ改変された細胞株の生成は、ｅＨＬＡ－Ｇ発現カセットを含むが、選択マーカーまたはレポータータンパク質に対する発現カセットを含有しないトランスポゾンベクターの使用により生成される。ベクターは、トランスポザーセ発現ベクターと共に、改変される細胞に導入され、続いて限界希釈クローニングが行われる。トランスフェクトされる細胞の集団が非常に効率的に改変されるため、選択マーカーまたはレポータータンパク質を使用する必要性が回避され得る。これは、特にヒト患者における細胞療法に関して使用される細胞について、重要な考慮事項である。トランスポゾンに基く安定なトランスフェクション方法により成功裏に改変される細胞のパーセンテージは、約０．５％から約５０％の範囲、例えば、１％、２％、３％、５％、７％、８％、１５％、２０％、２２％、３０％、４０％、または約０．５％から約５０％の別のパーセンテージのトランスフェクトされた細胞であってもよい。
【0063】
いくつかの実施形態において、２つ以上のタンパク質をコードする核酸によりコードされるタンパク質の発現は、別個のプロモーターにより駆動される。他の実施形態において、ポリシストロニック発現カセットは、ポリシストロニック発現カセット内に組み込まれたオープンリーディングフレームの間に１つ以上の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列を組み込んでもよい。ＩＲＥＳ配列およびその使用は、例えば、Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｓａｌａｓ（１９９９），Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１０（５）：４５８－４６４に例示されるように、当該技術分野において知られている。代替として、複数のオープンリーディングフレームが、口蹄疫ウイルス（Ｆ２Ａ）または他のウイルスからの２Ａ様配列の介在２Ａペプチド配列によって互いに連結されていてもよい。例えば、Ｈａｓｅｇａｗａ ｅｔ ａｌ（２００７），Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２５：１７０７－１７１２およびＳｙｍｃｚａｋ ｅｔ ａｌ（２００４），Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，５８９－５９４を参照されたい。２Ａペプチド配列の含有は、ｅＨＬＡ－Ｇおよび他の配列（例えば、レポータータンパク質配列または選択マーカータンパク質配列）を含有する連続ポリペプチドの、別個のタンパク質への翻訳後切断を可能にする。
【0064】
比較的短いアミノ酸または核酸配列間の同一性は、目視検査によって容易に決定することができるが、より長い配列間の同一性を決定するには、一般に、典型的にはコンピュータソフトウェアにより促進される適切なアルゴリズムを用いた分析が使用される。配列比較アルゴリズムを用いる場合、典型的には、試験配列および参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じてサブ配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列（複数を含む）のパーセント配列同一性を計算する。迅速に最適なアラインメントを取得し、２つ以上の配列間の同一性を計算するためのいくつかの数学的アルゴリズムが知られており、いくつかの利用可能なソフトウェアプログラムに組み込まれている。そのようなプログラムの例は、アミノ酸配列分析のためのＭＡＴＣＨ－ＢＯＸ、ＭＵＬＴＡＩＮ、ＧＣＧ、ＦＡＳＴＡ、およびＲＯＢＵＳＴプログラム、ならびにヌクレオチド配列のためのＳＩＭ、ＧＡＰ、ＮＡＰ、ＬＡＰ２、ＧＡＰ２、およびＰＩＰＭＡＫＥＲプログラムを含む。アミノ酸およびポリヌクレオチド配列分析の両方の好ましいソフトウェア分析プログラムは、ＡＬＩＧＮ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ（例えば、バージョン１．６およびそれ以降のバージョン）、ならびにＢＬＡＳＴプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ ２．１、ＢＬ２ＳＥＱおよびそれ以降のバージョン）を含む。
【0065】
アミノ酸またはヌクレオチド配列に関する「同一性」（本明細書においてさらに説明される「局所的同一性」と対比させて「全体的同一性」と呼ばれることもある）は、それぞれ、２つのアミノ酸配列または２つのヌクレオチド配列が互いに最適にアラインされる場合に、２つのそのようなアミノ酸またはヌクレオチド配列において同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチド塩基のパーセンテージを指す。最適なアラインメントにおいて、第１の配列における位置が、第２の対応するアミノ酸またはヌクレオチド配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチド残基により占有される場合、配列は、その残基位置に対して同一性を示す。２つの配列の間の同一性（または「パーセント配列同一性」）のレベルは、分析される配列のサイズに関して、配列により共有される同一の位置の数の比として測定される（すなわち、パーセント配列同一性＝（同一の位置の数／位置の総数）×１００）。
【0066】
また、低、中、または高ストリンジェンシー条件下で、配列番号：２のアミノ酸配列をコードする核酸からの少なくとも１００ヌクレオチドのプローブに、または、配列番号：３もしくは５の核酸配列に特異的にハイブリダイズする核酸が、本開示に包含される。
【0067】
低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、本明細書において使用される場合、例えば、２Ｘ ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で、４２℃で約４０％から約７０％のＧＣ含量の１００ヌクレオチドプローブでのハイブリダイゼーションを含む。中ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、例えば、０．５Ｘ ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で５０℃を含む。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、例えば、０．２Ｘ ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で６５℃での上述のプローブでのハイブリダイゼーションを含む。これらの条件下において、ハイブリダイゼーション温度が上昇すると、より高い配列相同性を有する核酸が得られる。
【0068】
ｅＨＬＡ－Ｇ遺伝子改変された細胞を含む組成物
本明細書において、１種以上のＨＬＡ－Ｇ改変された哺乳動物細胞型を含む、またはそれを使用して生成された薬学的組成物、局所用組成物、細胞移植片、および人工組織が包含される。本明細書において示されるように、ｅＨＬＡ－Ｇ改変されたｈＥＳＣは、ｈＥＥＰへの誘導分化にもかかわらず、安定で持続的なＨＬＡ－Ｇ発現を示した。さらに、安定で持続的なＨＬＡ－Ｇ発現は、低減された免疫原性および／または改善された免疫抑制を有する遺伝子改変された細胞を提供した。さらに、本明細書において、完全に分化した細胞であるｅＨＬＡ－Ｇ改変されたヒト皮膚線維芽細胞もまた、低減された免疫原性および／または改善された免疫抑制を提供する安定で持続的なＨＬＡ－Ｇ発現を有することが示される。したがって、本明細書に記載のｅＨＬＡ－Ｇコンストラクトは、遺伝子改変された多能性もしくは多分化能細胞の誘導分化によるか、または完全に分化した細胞の遺伝子改変によるかに関わらず、任意の型の普遍的なドナー細胞を生成するために使用され得る。
本明細書において、１種以上のＨＬＡ－Ｇ改変された哺乳動物細胞型を含む、またはそれを使用して生成された薬学的組成物、局所用組成物、細胞移植片、および人工組織が包含される。本明細書において示されるように、ｅＨＬＡ－Ｇ改変されたｈＥＳＣは、ｈＥＥＰへの誘導分化にもかかわらず、安定で持続的なＨＬＡ－Ｇ発現を示した。さらに、安定で持続的なＨＬＡ－Ｇ発現は、低減された免疫原性および／または改善された免疫抑制を有する遺伝子改変された細胞を提供した。さらに、本明細書において、完全に分化した細胞であるｅＨＬＡ－Ｇ改変されたヒト皮膚線維芽細胞もまた、低減された免疫原性および／または改善された免疫抑制を提供する安定で持続的なＨＬＡ－Ｇ発現を有することが示される。したがって、本明細書に記載のｅＨＬＡ－Ｇコンストラクトは、遺伝子改変された多能性もしくは多分化能細胞の誘導分化によるか、または完全に分化した細胞の遺伝子改変によるかに関わらず、任意の型の普遍的なドナー細胞を生成するために使用され得る。
【0069】
一態様において、本明細書に記載のようなｅＨＬＡ－Ｇ導入遺伝子を含む遺伝子改変された皮膚線維芽細胞を含む、皮膚再生または修復のための局所用組成物が提供される。別の態様において、本明細書に記載のようなｅＨＬＡ－Ｇ導入遺伝子を含む遺伝子改変された皮膚線維芽細胞を含む、注射用の薬学的組成物が提供される。別の態様において、本明細書に記載のようなｅＨＬＡ－Ｇ導入遺伝子を含む遺伝子改変された皮膚線維芽細胞を含む、皮膚移植組成物が提供される。別の態様において、本明細書に記載のようなｅＨＬＡ－Ｇ導入遺伝子を含む遺伝子改変された胚性上皮前駆細胞を含む、永久皮膚移植組成物が提供される。
【0070】
別の態様において、人工組織用の生体適合性合成骨格、およびその生成のための方法が、当該技術分野において説明され、本明細書に記載のＨＬＡ－Ｇ改変された細胞と共に使用して、外因性ＨＬＡ－Ｇを発現しない細胞を含有する組織と比較して低減された免疫原性および／または改善された免疫抑制を有する人工組織を生成することができる。例えば、米国特許第７，９６０，１６６号、名称「Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｆｏｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｉｓｓｕｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｅｌｌ ｔｙｐｅｓ」を参照されたい。
【0071】
ＩＩ．方法
細胞治療処置
本明細書に記載の様式で外因性ＨＬＡ－Ｇを安定に発現するように改変された細胞は、低減された免疫原性および／または増加した免疫抑制を有するため、これらの形質により、改質された細胞は、普遍的または改善されたドナー細胞または組織として機能することができる。これは、細胞に提供される、ＨＬＡ－Ｇが媒介した免疫原性の低減および／または免疫抑制の改善が、多くの損傷、疾患、または障害において、ドナー細胞と受容者との間の古典的ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩおよびクラスＩＩ分子の種類を一致させる必要性を低減または排除し得るためである。
細胞治療処置
本明細書に記載の様式で外因性ＨＬＡ－Ｇを安定に発現するように改変された細胞は、低減された免疫原性および／または増加した免疫抑制を有するため、これらの形質により、改質された細胞は、普遍的または改善されたドナー細胞または組織として機能することができる。これは、細胞に提供される、ＨＬＡ－Ｇが媒介した免疫原性の低減および／または免疫抑制の改善が、多くの損傷、疾患、または障害において、ドナー細胞と受容者との間の古典的ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩおよびクラスＩＩ分子の種類を一致させる必要性を低減または排除し得るためである。
【0072】
したがって、ｅＨＬＡ－Ｇ（および任意選択で追加的に、外因性ヒトβ２ミクログロブリン）を安定して発現するＨＬＡ－Ｇ改変された細胞は、本明細書に記載のように、治療のために使用され得る。治療は、疾患の原因を処置することを目的としてもよく、または、代替として、治療は、疾患もしくは状態の作用を処置するためのものであってもよい。遺伝子改変された細胞は、対象における損傷部位に、もしくはその近くに移されてもよく、または、細胞は、細胞が損傷部位に移動もしくは戻ることができる様式で、対象に導入されてもよい。移された細胞は、有利には、ダメージを受けたまたは損傷した細胞を置換し、対象の全体的な状態の改善を可能にすることができる。いくつかの例において、移された細胞は、皮膚再生または皮膚修復を含む、組織の再生または修復を刺激することができる。
【0073】
様々な実施形態において、ＨＬＡ－Ｇ改変された哺乳動物細胞（例えば、ヒトＨＬＡ－Ｇ改変細胞）は、心血管疾患、眼疾患（例えば、黄斑変性症）、聴覚疾患（例えば、難聴）、糖尿病、神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、骨粗しょう症、肝疾患、腎疾患、自己免疫疾患、関節炎、歯周病、歯の状態、または増殖性疾患（例えば、癌）を含むがこれらに限定されない複数の状態のいずれかに罹患した対象に投与される。他の場合において、対象は、急性の健康状態、例えば、脳卒中、脊髄損傷、火傷、または創傷に罹患している、または罹患するリスクが高い。他の場合において、対象は、皮下脂肪萎縮症または加齢関連のコラーゲンの損失等の組織の損失に罹患している。他の場合において、対象は、非治癒性潰瘍に罹患している、または尿道下裂や尿道上裂などの欠陥の閉鎖を補助するための薬剤を必要としている。他の場合において、対象は、創傷治癒または皮膚代用品のための永久的または一時的皮膚移植片を必要としている。
【0074】
一態様において、本発明は、細胞または組織移植を必要とする対象へのその普遍的方法であって、ｅＨＬＡ－Ｇ改質された細胞の集団を含む細胞または組織組成物を対象に注入する、または移植することを含み、対象は、ｅＨＬＡ－Ｇ改質された細胞の集団と比較して、少なくとも１つのミスマッチ古典的ＨＬＡクラスＩまたはＨＬＡクラスＩＩ分子を有し、ｅＨＬＡ－Ｇ改変された細胞の集団は、ｅＨＬＡ－Ｇ改変を有さない同じ型の細胞と比較して、低減された免疫原性および／または改善された免疫抑制を示す、普遍的方法を提供する。低減された免疫原性および／または改善された免疫抑制は、例えば、ＮＫ－９２細胞毒性アッセイ、ヒト化ＮＳＧ腫瘍成長アッセイ、および／またはＰＢＭＣ増殖アッセイにおいて、ｅＨＬＡ－Ｇ改質された細胞を、ｅＨＬＡ－Ｇ改質を有さない同じ型の対照細胞と比較することにより決定され得る。
【0075】
別の態様において、本発明は、皮膚再生を必要とする対象へのそのための方法であって、ｅＨＬＡ－Ｇ改変された皮膚線維芽細胞および／またはｅＨＬＡ－Ｇ改変された胚性表皮前駆細胞の集団を、対象における皮膚損傷の部位に注入することを含み、対象は、ｅＨＬＡ－Ｇ改変された皮膚線維芽細胞および／またはｅＨＬＡ－Ｇ改変された胚性表皮前駆細胞の集団と比較して、少なくとも１つのミスマッチ古典的ＨＬＡクラスＩまたはＨＬＡクラスＩＩ分子を有する方法を提供する。
【0076】
ＨＬＡ－Ｇ改変された細胞型を必要とする対象に投与されるＨＬＡ－Ｇ改変された細胞型は、表皮前駆細胞、間葉系幹細胞、膵臓β細胞前駆細胞、膵臓β細胞、心臓前駆細胞、心筋細胞、肝前駆細胞、肝細胞、筋細胞前駆細胞、筋細胞、腎細胞、骨芽細胞、造血前駆細胞、歯小嚢細胞、毛包細胞、網膜色素上皮細胞、神経幹細胞、ニューロン、星状膠細胞、乏突起膠細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない。そのような哺乳動物細胞は、例えばヒト、マウス、ラット、サル、またはブタを含むいくつかの種の１つから得ることができる。
【0077】
治療は、疾患の原因を処置することを目的としてもよく、または、代替として、治療は、疾患もしくは状態の効果を処置するためのものであってもよい。ＨＬＡ－Ｇ改変された細胞は、対象における損傷部位に、もしくはその近くに移されてもよく、または、細胞は、細胞が損傷部位に移動もしくは戻ることができる様式で、対象に導入されてもよい。移された細胞は、有利には、ダメージを受けたまたは損傷した細胞を置換し、対象の全体的な状態の改善を可能にすることができる。いくつかの例において、移された細胞は、組織再生または修復を刺激することができる。
【0078】
移された細胞は、ＨＬＡ－Ｇ改変された多能性（または分化全能性）幹細胞から分化した細胞であってもよい。移された細胞はまた、多能性のＨＬＡ－Ｇ改変された細胞から分化した多分化能幹細胞であってもよい。
【0079】
対象への治療剤の投与回数は変動し得る。対象へのＨＬＡ－Ｇ改変された、および／または分化した細胞の導入は、１回限りの事であってもよいが、ある特定の状況下において、そのような処置は、限られた期間の改善を誘発し、継続的な一連の反復処置を必要とし得る。他の状況において、効果が観察される前に、細胞の複数回投与が必要とされ得る。当業者により理解されるように、正確な処置プロトコルは、疾患または状態、および疾患の段階、ならびに処置される個々の対象のパラメータに依存する。
【0080】
ＨＬＡ－Ｇ改変された細胞は、非経口、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、皮内、気管内、腹腔内、または髄液内の経路のいずれかにより、対象に導入され得る。
【0081】
ＨＬＡ－Ｇ改変された細胞は、細胞に分化され、次いで様々な疾患または障害に罹患している対象に移されてもよい。
【0082】
膵島細胞（またはランゲルハンス島の一次細胞）は、糖尿病（例えば、糖尿病１型）に罹患している対象に移植することができ、例えば、Ｂｕｒｎｓ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｃｕｒｒ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．Ｔｈｅｒ．，２：２５５－２６６を参照されたい。したがって、いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ｇ改変された細胞から得られた膵臓ベータ細胞が、糖尿病（例えば、糖尿病１型）に罹患している対象に移植される。
【0083】
他の例において、ＨＬＡ－Ｇ改変された細胞から得られた肝細胞または肝幹細胞が、肝臓疾患、例えば肝炎、肝硬変または肝不全に罹患している対象に移植される。
【0084】
虚血性心筋症、伝導疾患、および先天性欠陥等の退行性心疾患は、幹細胞治療から恩恵を受けることができる。例えば、Ｊａｎｓｓｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，（２００６），Ｌａｎｃｅｔ，３６７：１１３－１２１を参照されたい。
【0085】
ＨＬＡ－Ｇ改変された細胞から得られた造血細胞または造血幹細胞（ＨＳＣ）は、血液の癌、または他の血液もしくは免疫性障害に罹患している対象に移植され得る。造血細胞又はＨＳＣにより処置され得る血液の癌の例は、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄芽球性白血病、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ホジキン病、多発性骨髄腫、および非ホジキンリンパ腫を含む。多くの場合、そのような疾患に罹患している対象は、急速に分裂する血液細胞を死滅させるために、放射線および／または化学治療処置を受けなければならない。ＨＬＡ－Ｇ改変された細胞から得られたＨＳＣのこれらの対象への導入は、枯渇した蓄積細胞の再生成を助けることができる。
【0086】
神経学的疾患または障害に罹患している対象は、血液脳関門が侵害された可能性がある場合は特に、ＨＬＡ－Ｇ改変された細胞による治療から特に恩恵を受けることができる。いくつかのアプローチにおいて、ＨＬＡ－Ｇ改変された細胞は、神経学的状態、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、脳梗塞、脊髄損傷、または他の中枢神経系障害を処置するために、神経幹細胞またはニューロンに分化され、次いで損傷部位に移植されてもよく、例えば、Ｍｏｒｉｚａｎｅ ｅｔ ａｌ．，（２００８），Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ．，３３１（１）：３２３－３２６、Ｃｏｕｔｔｓ ａｎｄ Ｋｅｉｒｓｔｅａｄ（２００８），Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，２０９（２）：３６８－３７７、Ｇｏｓｗａｍｉ ａｎｄ Ｒａｏ（２００７），Ｄｒｕｇｓ，１０（１０）：７１３－７１９を参照されたい。
【0087】
パーキンソン病の処置のためには、ＨＬＡ－Ｇ改変された細胞は、ドーパミン作動性ニューロンに分化され、次いでパーキンソン病に罹患した対象の線条体に移植され得る。多発性硬化症の処置のためには、神経幹細胞は、乏突起膠細胞または乏突起膠細胞の前駆細胞に分化され、次いでこれがＭＳに罹患している対象に移される。
【0088】
任意の神経学的疾患または障害の処置のためには、成功するアプローチは、対象に神経幹細胞を導入することであり得る。例えば、アルツハイマー病、脳梗塞または脊髄損傷を処置するために、ＨＬＡ－Ｇ改変された細胞は、神経幹細胞に分化され、続いて損傷部位に移植されてもよい。ＨＬＡ－Ｇ改変された細胞はまた、脳および脊髄修復のためのその移動を病変へ標的化し得る合図に反応するように操作されてもよく、例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２００７），Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｖ．，３（４）：２８０－２８８を参照されたい。
【0089】
任意選択で、細胞治療方法にあるべきＨＬＡ－Ｇ改変された細胞はまた、本明細書に記載のようなレポータータンパク質を発現する。いくつかの実施形態において、使用されるレポータータンパク質は、導入された細胞のｉｎ ｖｉｖｏ検出（例えば、画像化）を促進するものである。例えば、細胞は、遠赤色発光蛍光タンパク質、例えば、長い励起および発光波長が組織内の画像化に十分適しているＫａｔｕｓｈｋａを発現してもよい。Ｋａｔｕｓｈｋａは、「ＴｕｒｂｏＦＰ６３５」（Ｅｖｒｏｇｅｎ、Ｍｏｓｃｏｗ、Ｒｕｓｓｉａ）の商品名で市販されている。
【実施例】
【0090】
以下の具体的な実施例は、単に例示であり、いかなる様式においても本開示の残りの部分を限定するものではないと解釈されるべきである。さらなる詳細を伴わずに、当業者は、本明細書における説明に基いて、本発明を最大限に利用することができると考えられる。本明細書において引用される全ての出版物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＵＲＬまたは他のそのような識別子もしくはアドレスに対して言及がなされる場合、そのような識別子は変更される可能性があり、インターネット上の具体的な情報は移り変わる可能性があるが、同等の情報は、インターネットを検索することにより発見することができると理解される。それに対する参照は、そのような情報の利用可能性および公開普及を証明する。
【0091】
実施例１ 癌細胞の免疫寛容に関連する遺伝子発現パターンの同定
ヒト軟組織癌アレイを、まず、おそらくは免疫監視機構の回避により、転移状態への癌の進行と共に増加する発現を示す候補免疫寛容遺伝子を求めてスクリーニングした。データは、正常な転移と、以前に免疫寛容に関与したいくつかの遺伝子の発現レベルとの間の強い正の相関を明らかにした。ＭＳＣが免疫寛容および同種移植片受容を誘導し得るかどうかを評価するために、ＭＳＣをＲＴ－ＰＣＲによりクロススクリーニングし、これらの候補遺伝子およびいくつかの抗原ＨＬＡの発現レベルを検査した。表１は、継代１のＭＳＣが、ＣＤ２００、ＣＤ４７、およびインドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の他に、ＨＬＡクラスＩａ、ＨＬＡ－ＧおよびＩＩマーカーを発現したことを示している。ＭＳＣの集団は、攻撃的転移能を有する癌株であるＪＥＧ－３に見られるものよりも少ないものの、中程度のレベルでＨＬＡ－Ｇを発現することが見出された。
ヒト軟組織癌アレイを、まず、おそらくは免疫監視機構の回避により、転移状態への癌の進行と共に増加する発現を示す候補免疫寛容遺伝子を求めてスクリーニングした。データは、正常な転移と、以前に免疫寛容に関与したいくつかの遺伝子の発現レベルとの間の強い正の相関を明らかにした。ＭＳＣが免疫寛容および同種移植片受容を誘導し得るかどうかを評価するために、ＭＳＣをＲＴ－ＰＣＲによりクロススクリーニングし、これらの候補遺伝子およびいくつかの抗原ＨＬＡの発現レベルを検査した。表１は、継代１のＭＳＣが、ＣＤ２００、ＣＤ４７、およびインドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の他に、ＨＬＡクラスＩａ、ＨＬＡ－ＧおよびＩＩマーカーを発現したことを示している。ＭＳＣの集団は、攻撃的転移能を有する癌株であるＪＥＧ－３に見られるものよりも少ないものの、中程度のレベルでＨＬＡ－Ｇを発現することが見出された。
【表1】
【0092】
ｉｎ ｖｉｖｏでのＭＳＣの免疫抑制効果は一過性であると思われるため、ＭＳＣを連続的に継代し、選択された遺伝子の発現レベルの変化を監視した。継代３までには、天然ＨＬＡ－Ｇ発現はＭＳＣにおいて見られなかったが、他の候補マーカーは不変のままであった。Ｊｅｇ－３細胞においては、ＨＬＡ－Ｇ発現は変化しなかった。次いで、ＦＡＣＳを使用した細胞表面ＨＬＡ－Ｇの発現に基いてＭＳＣを単離すると、０．５～３％の間のＭＳＣが細胞表面でＨＬＡ－Ｇを発現することが判明した。ＨＬＡ－Ｇ＋ＭＳＣのｉｎ ｖｉｖｏでドナー拒絶を免れる能力を評価するために、１～３×１０５細胞を、免疫応答性マウスの尾静脈内に注射した。血液サンプル（２００μｌ）を眼窩叢から回収し、抗ヒトＨＬＡクラスＩ特異的ｍＡｂを用いてＦＡＣＳ選別した。表２は、移植から１週間後、ＨＬＡ－Ｇ＋ＭＳＣ（およびＪｅｇ－３細胞）が、ＨＳＣおよびＪｕｒｋａｔ細胞（両方ともＨＬＡ－Ｇ－）に勝る、それぞれ２４倍および２７０倍の延命効果を示したことを示している。２週間までに、ＨＬＡ－Ｇ＋ＭＳＣの効果は、２７倍および３１１倍に増加した。ＨＬＡ－Ｇ－ＭＳＣは、ＨＳＣと同じ割合で生存したが、これは、ＭＳＣのＨＬＡ－Ｇ＋亜集団が、ｉｎ ｖｉｖｏ設定において、非選別ＭＳＣに比べて強化された寛容化の効果を示し得ることを示唆している。実際に、事後分析では、Ｊｅｇ－３細胞を用いた移植から１２週間後の免疫応答性マウスの肺において明らかな腫瘍が認められたが、Ｇ＋ＭＳＣでは認められなかった（データは示さず）。
【表2】
【0093】
次に、改変されたＨＬＡ－Ｇコンストラクトを、ＨＦ（ヒト線維芽細胞）およびＫ５６２細胞において過剰発現させ、ヒトＮＫ細胞による溶解に対する保護について試験した（表３）。ＮＫ媒介性の細胞毒性は、ＨＬＡ－Ｇ＋ＨＦにおいて７５％減少し、ＨＬＡ－Ｇ＋Ｋ５６２細胞で事実上排除された。これは、アイソタイプ対象ではなく中和抗ＨＬＡ－Ｇ（８７Ｇ）抗体でのインキュベーションにより逆転した、ＨＬＡ－Ｇ＋Ｊｅｇ－３の観察された保護と一致している。これらのデータは、ＮＫ殺傷からの保護が、ＨＬＡ－Ｇ－依存的であったことを示唆している。
【表3】
【0094】
以前の研究では、突然変異ＭＳＣＶプロモーター、Ｍ－Ｕ３／Ｒが、１０週間の培養を通してサイレンシングの圧力を回避することが示された。我々の研究は、Ｍ－Ｕ３／Ｒが、１年の連続培養後にサイレンシングに耐え、４～６週間の培養によりサイレンシングされた野生型プロモーターよりも優れることを示した。さらに、３’ＵＴＲの突然変異または欠失は、ＥＲ回収モチーフの突然変異が行ったように、ＨＬＡ－Ｇ表面発現を強化した。より高いＨＬＡ－Ｇ表面発現は、細胞毒性溶解と不の相関を有し、最適な遺伝子送達コンストラクトを使用することの重要性を高めた。
【0095】
実施例２ ヒト胚性幹細胞のヒト表皮前駆細胞（ｈＥＥＰ）への培養および分化
別段の指定がない限り、全ての組織培養試薬は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのものであった。ＥＳＣ成長培地は、２０％ノックアウト血清代替物、０．１ｍＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸、１ｍＭ ＧｌｕｔａＭａｘ、０．１ｍＭ β－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）を含有する。有糸分裂不活性化されたマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）（ＣＦ－１、ＡＴＣＣ）を、５×１０４細胞／ｃｍ２の密度で播種し、１８～２４時間インキュベートすることにより、ＥＳＣ成長培地を調整した。調整後、４ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦを添加し、完全調整培地を滅菌濾過した。ｈＥＳＣを、５～６日毎に（１：３または１：４分割で）、Ｍａｔｒｉｇｅｌ被覆プレート上で、細胞コロニーを除去するために１ｍｇ／ｍｌディスパーゼを使用して継代培養した。Ｋ１４＋／ｐ６３＋ｈＥＥＰを、Ｍｅｔａｌｌｏ ｅｔ ａｌ（上記参照）の方法に従って生成した。簡単に述べると、ｈＥＳＣを６ウェルプレートで４日間培養し、次いで、１μＭのオールトランス型レチノイン酸（Ｓｉｇｍａ）および２５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４を含有する無条件のｈＥＳＣ成長培地を含む、２ｍｌ／ウェルの分化培地で処理した。７日間の毎日の培地交換後、細胞をディスパーゼで処理し、遠心分離し、ケラチノサイト合成無血清培地（ＤＳＦＭ）中に再懸濁させ、ゼラチン被覆プレート上に１：３の分割比で播種した。ＤＳＦＭは、３～４週間、一日おきに交換する。次いで、トリプシン処理により細胞を継代培養し、遠心分離し、洗浄し、ｃｍ２当たり１０，０００細胞で、ＤＳＦＭ中のゼラチン被覆組織培養プレート上に播種した。ケラチノサイト合成無血清培地中で１４日後、表皮シート構造の形成を特徴とするような表皮分化の初期の兆候が、顕微鏡法により観察された。４週間の培養後、表皮シート内の細胞は、立方体形態を有する典型的な表皮分化表現型を示した。
別段の指定がない限り、全ての組織培養試薬は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのものであった。ＥＳＣ成長培地は、２０％ノックアウト血清代替物、０．１ｍＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸、１ｍＭ ＧｌｕｔａＭａｘ、０．１ｍＭ β－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）を含有する。有糸分裂不活性化されたマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）（ＣＦ－１、ＡＴＣＣ）を、５×１０４細胞／ｃｍ２の密度で播種し、１８～２４時間インキュベートすることにより、ＥＳＣ成長培地を調整した。調整後、４ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦを添加し、完全調整培地を滅菌濾過した。ｈＥＳＣを、５～６日毎に（１：３または１：４分割で）、Ｍａｔｒｉｇｅｌ被覆プレート上で、細胞コロニーを除去するために１ｍｇ／ｍｌディスパーゼを使用して継代培養した。Ｋ１４＋／ｐ６３＋ｈＥＥＰを、Ｍｅｔａｌｌｏ ｅｔ ａｌ（上記参照）の方法に従って生成した。簡単に述べると、ｈＥＳＣを６ウェルプレートで４日間培養し、次いで、１μＭのオールトランス型レチノイン酸（Ｓｉｇｍａ）および２５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４を含有する無条件のｈＥＳＣ成長培地を含む、２ｍｌ／ウェルの分化培地で処理した。７日間の毎日の培地交換後、細胞をディスパーゼで処理し、遠心分離し、ケラチノサイト合成無血清培地（ＤＳＦＭ）中に再懸濁させ、ゼラチン被覆プレート上に１：３の分割比で播種した。ＤＳＦＭは、３～４週間、一日おきに交換する。次いで、トリプシン処理により細胞を継代培養し、遠心分離し、洗浄し、ｃｍ２当たり１０，０００細胞で、ＤＳＦＭ中のゼラチン被覆組織培養プレート上に播種した。ケラチノサイト合成無血清培地中で１４日後、表皮シート構造の形成を特徴とするような表皮分化の初期の兆候が、顕微鏡法により観察された。４週間の培養後、表皮シート内の細胞は、立方体形態を有する典型的な表皮分化表現型を示した。
【0096】
細胞からの全ＲＮＡの単離および逆転写酵素反応は、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ（２０１０），Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ Ｐａｒｔ Ａ，１６（２）：７２５－７３３において以前に説明されている。図１２に示すように、目的の遺伝子の特異的プライマーを使用して、Ｈｙｂａｉｄ Ｏｍｎｉｇｅｎｅサーマルサイクラー（Ｂｉｏ－ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）において特異的ＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ条件は、９４℃で３０秒間、６５℃で１分間、および７２℃で１分間の３５サイクルからなり、７２℃で１０分間の最終伸長を行った。１０μｌの各ＰＣＲ産物が、エチジウムブロマイドゲル電気泳動により検出された。図１２のデータは、表皮分化マーカーＫ１４、Ｔａｐ６３、およびΔＮｐ６３が、分化中に徐々に強化されたことを示している。ここには示されていないデータにおいて、Ｋ１４ならびに追加の表皮マーカーｐ６３、ＣＤ２９、およびＣＤ４９ｆの免疫蛍光試験が行われた。分化したｅＨＬＡ－Ｇ（ＥＦ－１ａ）－ＧＦＰ ｈＥＥＰは、免疫蛍光により示されるように、Ｋ１４、ｐ６３、ＣＤ２９、およびＣＤ４９ｆタンパク質発現に関して陽性であった。
【0097】
上皮単層が９０％以上の純度であり、Ｋ１４を発現することを検証するために、Ｍｅｔａｌｌｏ ｅｔ ａｌ（上記参照）の方法に従って細胞をフローサイトメトリーに供し、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩで分析した。ＥＰ（表皮前駆細胞）へのｈＥＳＣ分化に対するｅＨＬＡ－Ｇ導入遺伝子発現（ｅＨＬＡ－Ｇ（ＥＦ１－α）－ＧＦＰ－ｈＥＳＣ）の影響を、野生型、Ｇ－、およびＧ＋－ｈＥＥＰのＫ１４陽性の程度を比較することにより評価した。単離されたｈＥＥＰの純度を高めるために、細胞を、ＣＤ２９抗体で磁気活性化細胞ソーティング（ＭＡＳＣ）を用いて選別した。ｅＨＬＡ－Ｇ（ＥＦ－１α）－ＧＦＰ改変されたｈＥＳＣから分化した、ＣＤ２９ ＭＡＳＣ選別されたｈＥＥＰ細胞培地細胞の約９２パーセントが、Ｋ１４、すなわち特異的ケラチノサイトマーカーに対して陽性であった。精製されたｈＥＥＰは、位相差顕微鏡法により示されるように、相同的なケラチノサイト形態を示した（図１６を参照されたい）。
【0098】
分化したｈＥＥＰにおけるＨＬＡ－Ｇ導入遺伝子の安定性は、フローサイトメトリーにより確認された。ＨＬＡ－Ｇ全発現および表面発現は両方とも、外因性ＨＬＡ－Ｇを有さない対照細胞（ＧＦＰのみのｈＥＥＰ）および野生型ｈＥＥＰと比較して、分化したｅＨＬＡ－Ｇ（ＥＦ－１ａ）－ＧＦＰ－ｈＥＥＰに対して堅牢であった（細胞の９０％超）（図１７を参照されたい）。野生型細胞と同様の分化能を生成するクローンのみを、さらなる試験に選択した。
【0099】
実施例３ ｅＨＬＡ－Ｇコンストラクト設計およびｈＥＳＣにおける安定な発現
１）ＨＬＡ－ＧのＥＲ回収モチーフの突然変異（Ｋ３３４Ａ／Ｋ３３５Ａ）、および２）ＨＬＡ－Ｇの３’ＵＴＲ ｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位の突然変異の複数の改変を組み合わせることにより、新規ＨＬＡ－Ｇコンストラクトを設計した。ウイルス遺伝子送達系は、依然として深刻な規制の課題であるため、最近Ｈ１ ｈＥＳＣにおいて９０％のトランスフェクション効率を達成することが示された（Ｌａｃｏｓｔｅ ｅｔ ａｌ（２００９），Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，５：３３２－３４２．）トランスポゾンベースの非ウイルスアプローチである、ＰｉｇｇｙＢａｃシステムを使用した。このシステムは、トランスポゾンを含有するドナープラスミド（図１Ａ）およびトランスポザーセを発現するヘルパープラスミド（図２）を必要とする。ヘルパープラスミドを生成するために、ｅＰｉｇｇｙＢａｃコドンヒト化トランスポザーセｃＤＮＡをカスタム合成し（ＧｅｎｅＡｒｔ）、次いでＰＧＫプロモーターの下流側およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列（ｐＡ）の上流側をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）でクローニングした。ｅＨＬＡ－Ｇ発現カセットのために、Ｍ－Ｕ３／Ｒプロモーター、ＭＳＣＶプロモーター、およびチャイニーズハムスターＥＦ１α（ＣＨＥＦ－１α）プロモーターを含む複数のプロモーターを比較したが、その配列を配列番号：６として以下に示す。
（配列番号：６）－ＣＨＥＦ－１αプロモーターの一実施形態
ＧＧＡＴＧＧＣＧＧＧＧＣＴＧＡＣＧＴＣＧＧＧＡＧＧＴＧＧＣＣＴＣＣＡＣＧＧＧＡＡＧＧＧＡＣＡＣＣＣＧＧＡＴＣＴＣＧＡＣＡＣＡＧＣＣＴＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴＣＡＧＧＡＡＧＧＧＴＡＧＧＡＣＡＧＡＴＴＣＴＧＧＡＣＧＣＣＣＴＣＴＴＧＧＣＣＡＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＧＡＴＧＧＡＧＣＣＧＡＧＡＧＴＡＡＴＴＣＡＴＡＣＡＡＡＡＧＧＡＧＧＧＡＴＣＧＣＣＴＴＣＧＣＣＣＣＴＧＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＧＧＡＣＣＧＴＣＧＣＴＡＡＡＴＴＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＡＡＣＣＧＣＴＧＴＧＣＣＣＧＣＣＣＡＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＣＴＧＣＧＣＣＴＡＧＧＧＣＧＧＡＴＣＧＣＧＧＧＴＣＧＧＣＧＧＧＡＧＡＧＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＣＡＧＴＣＣＣＣＧＧＣＧＧＴＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＣＧＣＧＣＴＧＡＧＣＧＧＧＧＧＣＣＣＧＧＧＡＧＣＣＡＧＣＧＣＧＧＧＧＣＡＡＡＣＴＧＧＧＡＡＡＧＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＴＧＣＴＧＧＣＴＣＣＧＣＣＣＴＣＴＴＣＣＣＧＡＧＧＧＴＧＧＧＧＧＡＧＡＡＣＧＧＴＡＴＡＡＡＡＧＴＧＣＧＧＴＡＧＴＣＧＣＧＴＴＧＧＡＣＧＴＴＣＴＴＴＴＴＣＧＣＡＡＣＧＧＧＴＴＴＧＣＣＧＴＣＡＧＡＡＣＧＣＡＧＧＴＧＡＧＴＧＧＣＧＧＧＴＧＴＧＧＣＣＴＣＣＧＣＧＧＧＣＣＣＧＧＧＣＴＣＣＣＴＣＣＴＴＴＧＡＧＣＧＧＧＧＴＣＧＧＡＣＣＧＣＣＧＴＧＣＧＧＧＴＧＴＣＧＴＣＧＧＣＣＧＧＧＣＴＴＣＴＣＴＧＣＧＡＧＣＧＴＴＣＣＣＧＣＣＣＴＧＧＡＴＧＧＣＧＧＧＣＴＧＴＧＣＧＧＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＧＧＧＧＧＡＧＧＣＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＣＧＧＡＧＣＣＴＣＧＣＣＴＣＧＴＧＴＣＧＧＧＣＧＴＧＡＧＧＣＣＴＡＧＣＧＴＧＧＣＴＴＣＣＧＣＣＣＣＧＣＣＧＣＧＴＧＣＣＡＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＴＴＴＧＣＴＧＴＣＴＧＣＣＣＧＧＣＴＧＣＣＣＴＣＧＡＴＴＧＣＣＴＧＣＣＣＧＣＧＧＣＣＣＧＧＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＧＡＧＧＧＣＧＴＧＧＡＧＣＴＧＧＣＴＧＧＴＡＧＧＧＡＧＣＣＣＣＧＴＡＧＴＣＣＧＣＡＴＧＴＣＧＧＧＣＡＧＧＧＡＧＡＧＣＧＧＣＡＧＣＡＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＧＧＣＣＣＧＣＣＣＧＴＣＣＣＧＣＡＧＣＡＣＡＴＧＴＣＣＧＡＣＧＣＣＧＣＣＴＧＧＡＣＧＧＧＴＡＧＣＧＧＣＣＴＧＴＧＴＣＣＴＧＡＴＡＡＧＧＣＧＧＣＣＧＧＧＣＧＧＴＧＧＧＴＴＴＴＡＧＡＴＧＣＣＧＧＧＴＴＣＡＧＧＴＧＧＣＣＣＣＧＧＧＴＣＣＣＧＧＣＣＣＧＧＴＣＴＧＧＣＣＡＧＴＡＣＣＣＣＧＴＡＧＴＧＧＣＴＴＡＧＣＴＣＣＧＡＧＧＡＧＧＧＣＧＡＧＣＣＣＧＣＣＣＧＣＣＣＧＧＣＡＣＣＡＧＴＴＧＣＧＴＧＣＧＣＧＧＡＡＡＧＡＴＧＧＣＣＧＣＴＣＣＣＧＧＧＣＣＣＴＧＴＡＧＣＡＡＧＧＡＧＣＴＣＡＡＡＡＴＧＧＡＧＧＡＣＧＣＧＧＣＡＧＣＣＣＧＧＣＧＧＡＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＴＧＡＧＴＣＡＣＣＣＡＣＡＣＡＡＡＧＧＡＡＧＡＧＧＧＣＣＴＴＧＣＣＣＣＴＣＧＣＣＧＧＣＣＧＣＴＧＣＴＴＣＣＴＧＴＧＡＣＣＣＣＧＴＧＧＴＧＴＡＣＣＧＧＣＣＧＣＡＣＴＴＣＡＧＴＣＡＣＣＣＣＧＧＧＣＧＣＴＣＴＴＴＣＧＧＡＧＣＡＣＣＧＣＴＧＧＣＣＴＣＣＧＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＴＣＴＧＴＣＴＡＡＴＧＧＣＧＴＴＧＧＡＧＴＴＴＧＣＴＣＡＣＡＴＴＴＧＧＴＧＧＧＴＧＧＡＧＡＣＴＧＴＡＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＧＣＣＡＴＧＧＡＡＧＴＡＡＴＴＣＴＴＧＧＡＡＴＴＴＧＣＣＣＡＴＴＴＴＧＡＧＴＴＴＧＧＡＧＣＧＡＡＧＣＴＧＡＴＴＧＡＣＡＡＡＧＣＴＧＣＴＴＡＧＣＣＧＴＴＣＡＡＡＧＧＴＡＴＴＣＴＴＣＧＡＡＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＧＧＴＧＴＴＧＴＧＡＡＡＡＣＣＡＣＣＧ
１）ＨＬＡ－ＧのＥＲ回収モチーフの突然変異（Ｋ３３４Ａ／Ｋ３３５Ａ）、および２）ＨＬＡ－Ｇの３’ＵＴＲ ｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位の突然変異の複数の改変を組み合わせることにより、新規ＨＬＡ－Ｇコンストラクトを設計した。ウイルス遺伝子送達系は、依然として深刻な規制の課題であるため、最近Ｈ１ ｈＥＳＣにおいて９０％のトランスフェクション効率を達成することが示された（Ｌａｃｏｓｔｅ ｅｔ ａｌ（２００９），Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，５：３３２－３４２．）トランスポゾンベースの非ウイルスアプローチである、ＰｉｇｇｙＢａｃシステムを使用した。このシステムは、トランスポゾンを含有するドナープラスミド（図１Ａ）およびトランスポザーセを発現するヘルパープラスミド（図２）を必要とする。ヘルパープラスミドを生成するために、ｅＰｉｇｇｙＢａｃコドンヒト化トランスポザーセｃＤＮＡをカスタム合成し（ＧｅｎｅＡｒｔ）、次いでＰＧＫプロモーターの下流側およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列（ｐＡ）の上流側をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）でクローニングした。ｅＨＬＡ－Ｇ発現カセットのために、Ｍ－Ｕ３／Ｒプロモーター、ＭＳＣＶプロモーター、およびチャイニーズハムスターＥＦ１α（ＣＨＥＦ－１α）プロモーターを含む複数のプロモーターを比較したが、その配列を配列番号：６として以下に示す。
（配列番号：６）－ＣＨＥＦ－１αプロモーターの一実施形態
ＧＧＡＴＧＧＣＧＧＧＧＣＴＧＡＣＧＴＣＧＧＧＡＧＧＴＧＧＣＣＴＣＣＡＣＧＧＧＡＡＧＧＧＡＣＡＣＣＣＧＧＡＴＣＴＣＧＡＣＡＣＡＧＣＣＴＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴＣＡＧＧＡＡＧＧＧＴＡＧＧＡＣＡＧＡＴＴＣＴＧＧＡＣＧＣＣＣＴＣＴＴＧＧＣＣＡＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＧＡＴＧＧＡＧＣＣＧＡＧＡＧＴＡＡＴＴＣＡＴＡＣＡＡＡＡＧＧＡＧＧＧＡＴＣＧＣＣＴＴＣＧＣＣＣＣＴＧＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＧＧＡＣＣＧＴＣＧＣＴＡＡＡＴＴＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＧＧＡＡＣＣＧＣＴＧＴＧＣＣＣＧＣＣＣＡＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＣＴＧＣＧＣＣＴＡＧＧＧＣＧＧＡＴＣＧＣＧＧＧＴＣＧＧＣＧＧＧＡＧＡＧＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＣＡＧＴＣＣＣＣＧＧＣＧＧＴＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＣＧＣＧＣＴＧＡＧＣＧＧＧＧＧＣＣＣＧＧＧＡＧＣＣＡＧＣＧＣＧＧＧＧＣＡＡＡＣＴＧＧＧＡＡＡＧＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＴＧＣＴＧＧＣＴＣＣＧＣＣＣＴＣＴＴＣＣＣＧＡＧＧＧＴＧＧＧＧＧＡＧＡＡＣＧＧＴＡＴＡＡＡＡＧＴＧＣＧＧＴＡＧＴＣＧＣＧＴＴＧＧＡＣＧＴＴＣＴＴＴＴＴＣＧＣＡＡＣＧＧＧＴＴＴＧＣＣＧＴＣＡＧＡＡＣＧＣＡＧＧＴＧＡＧＴＧＧＣＧＧＧＴＧＴＧＧＣＣＴＣＣＧＣＧＧＧＣＣＣＧＧＧＣＴＣＣＣＴＣＣＴＴＴＧＡＧＣＧＧＧＧＴＣＧＧＡＣＣＧＣＣＧＴＧＣＧＧＧＴＧＴＣＧＴＣＧＧＣＣＧＧＧＣＴＴＣＴＣＴＧＣＧＡＧＣＧＴＴＣＣＣＧＣＣＣＴＧＧＡＴＧＧＣＧＧＧＣＴＧＴＧＣＧＧＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＧＧＧＧＧＡＧＧＣＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＣＧＧＡＧＣＣＴＣＧＣＣＴＣＧＴＧＴＣＧＧＧＣＧＴＧＡＧＧＣＣＴＡＧＣＧＴＧＧＣＴＴＣＣＧＣＣＣＣＧＣＣＧＣＧＴＧＣＣＡＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＴＴＴＧＣＴＧＴＣＴＧＣＣＣＧＧＣＴＧＣＣＣＴＣＧＡＴＴＧＣＣＴＧＣＣＣＧＣＧＧＣＣＣＧＧＧＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＧＡＧＧＧＣＧＴＧＧＡＧＣＴＧＧＣＴＧＧＴＡＧＧＧＡＧＣＣＣＣＧＴＡＧＴＣＣＧＣＡＴＧＴＣＧＧＧＣＡＧＧＧＡＧＡＧＣＧＧＣＡＧＣＡＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＧＧＣＣＣＧＣＣＣＧＴＣＣＣＧＣＡＧＣＡＣＡＴＧＴＣＣＧＡＣＧＣＣＧＣＣＴＧＧＡＣＧＧＧＴＡＧＣＧＧＣＣＴＧＴＧＴＣＣＴＧＡＴＡＡＧＧＣＧＧＣＣＧＧＧＣＧＧＴＧＧＧＴＴＴＴＡＧＡＴＧＣＣＧＧＧＴＴＣＡＧＧＴＧＧＣＣＣＣＧＧＧＴＣＣＣＧＧＣＣＣＧＧＴＣＴＧＧＣＣＡＧＴＡＣＣＣＣＧＴＡＧＴＧＧＣＴＴＡＧＣＴＣＣＧＡＧＧＡＧＧＧＣＧＡＧＣＣＣＧＣＣＣＧＣＣＣＧＧＣＡＣＣＡＧＴＴＧＣＧＴＧＣＧＣＧＧＡＡＡＧＡＴＧＧＣＣＧＣＴＣＣＣＧＧＧＣＣＣＴＧＴＡＧＣＡＡＧＧＡＧＣＴＣＡＡＡＡＴＧＧＡＧＧＡＣＧＣＧＧＣＡＧＣＣＣＧＧＣＧＧＡＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＴＧＡＧＴＣＡＣＣＣＡＣＡＣＡＡＡＧＧＡＡＧＡＧＧＧＣＣＴＴＧＣＣＣＣＴＣＧＣＣＧＧＣＣＧＣＴＧＣＴＴＣＣＴＧＴＧＡＣＣＣＣＧＴＧＧＴＧＴＡＣＣＧＧＣＣＧＣＡＣＴＴＣＡＧＴＣＡＣＣＣＣＧＧＧＣＧＣＴＣＴＴＴＣＧＧＡＧＣＡＣＣＧＣＴＧＧＣＣＴＣＣＧＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＴＣＴＧＴＣＴＡＡＴＧＧＣＧＴＴＧＧＡＧＴＴＴＧＣＴＣＡＣＡＴＴＴＧＧＴＧＧＧＴＧＧＡＧＡＣＴＧＴＡＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＧＣＣＡＴＧＧＡＡＧＴＡＡＴＴＣＴＴＧＧＡＡＴＴＴＧＣＣＣＡＴＴＴＴＧＡＧＴＴＴＧＧＡＧＣＧＡＡＧＣＴＧＡＴＴＧＡＣＡＡＡＧＣＴＧＣＴＴＡＧＣＣＧＴＴＣＡＡＡＧＧＴＡＴＴＣＴＴＣＧＡＡＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＧＧＴＧＴＴＧＴＧＡＡＡＡＣＣＡＣＣＧ
【0100】
ドナープラスミドを生成するために、３１３ｂｐのＴ５３Ｃ／Ｃ１３６Ｔ突然変異５’末端反復（ＴＲ）および２３５ｂｐの３’ＴＲ（Ｌａｃｏｓｔｅ（上記参照）に記載のように）をカスタム合成し、以下の発現カセットのそれぞれ上流側および下流側をクローニングした：ｅＨＬＡ－Ｇ、２５０ｂｐニワトリβ－グロビンＨＳ４コアインシュレータ（Ｒｅｃｉｌｌａｓ－Ｔａｒｇａ ｅｔ ａｌ（２００２），ＰＮＡＳ ＵＳＡ，９９：６８８３－６８８８）、ＥＧＦＰ、およびｐＡ。抑圧的クロマチンの統合コンストラクトへの広がりを防止するために、ＨＳ４を使用した。ＥＧＦＰ発現は、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター（図１Ａを参照されたい）により駆動された。ＨＳ４要素の配列を、配列番号：７として以下に示す。
（配列番号：７）ＨＳＦ要素の一実施形態
ＧＡＧＣＴＣＡＣＧＧＧＧＡＣＡＧＣＣＣＣＣＣＣＣＣＡＡＡＧＣＣＣＣＣＡＧＧＧＡＴＧＴＡＡＴＴＡＣＧＴＣＣＣＴＣＣＣＣＣＧＣＴＡＧＧＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＧＡＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＧＣＴＣＣＧＣＴＣＣＧＧＴＣＣＧＧＣＧＣＴＣＣＣＣＣＣＧＣＡＴＣＣＣＣＧＡＧＣＣＧＧＣＡＧＣＧＴＧＣＧＧＧＧＡＣＡＧＣＣＣＧＧＧＣＡＣＧＧＧＧＡＡＧＧＴＧＧＣＡＣＧＧＧＡＴＣＧＣＴＴＴＣＣＴＣＴＧＡＡＣＧＣＴＴＣＴＣＧＣＴＧＣＴＣＴＴＴＧＡＧＣＣＴＧＣＡＧＡＣＡＣＣＴＧＧＧＧＧＡＴＡＣＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＣＴＴ
（配列番号：７）ＨＳＦ要素の一実施形態
ＧＡＧＣＴＣＡＣＧＧＧＧＡＣＡＧＣＣＣＣＣＣＣＣＣＡＡＡＧＣＣＣＣＣＡＧＧＧＡＴＧＴＡＡＴＴＡＣＧＴＣＣＣＴＣＣＣＣＣＧＣＴＡＧＧＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＧＡＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＧＣＴＣＣＧＣＴＣＣＧＧＴＣＣＧＧＣＧＣＴＣＣＣＣＣＣＧＣＡＴＣＣＣＣＧＡＧＣＣＧＧＣＡＧＣＧＴＧＣＧＧＧＧＡＣＡＧＣＣＣＧＧＧＣＡＣＧＧＧＧＡＡＧＧＴＧＧＣＡＣＧＧＧＡＴＣＧＣＴＴＴＣＣＴＣＴＧＡＡＣＧＣＴＴＣＴＣＧＣＴＧＣＴＣＴＴＴＧＡＧＣＣＴＧＣＡＧＡＣＡＣＣＴＧＧＧＧＧＡＴＡＣＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＣＴＴ
【0101】
空のベクタードナープラスミド（ＨＬＡ－Ｇ－）は、ｅＨＬＡ－Ｇコンストラクトが除外されることを除いてｅＨＬＡ－Ｇドナープラスミドと同一であった（図１Ｂ）。遺伝子導入の前に、ｈＥＳＣを、実質的に解離誘導性アポトーシスを低減し、クローニング効率を増加させることが示されている（Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ（２００７），Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２５：６８１－６８６）ＲＯＣＫ阻害剤である、１０μＭのＹ－２７６３２で１時間処理した。ｈＥＳＣを、０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ中、３７℃で５分間解離させ、調整されたｍＴｅＳＲ培地およびＹ－２７６３２中で洗浄し、ヌクレオフェクション溶液Ｌ（Ａｍａｘａ）中に再懸濁させた。１．５×１０５細胞当たり３μｇのヘルパープラスミドおよび６μｇのトランスポゾンドナープラスミドを添加し、プログラム設定Ｂ－０１６でヌクレオフェクションを行った。次いで、クローン選択のために、ｈＥＳＣを、ＣＭおよびＹ－２７６３２中、６ｃｍの皿当たり２×１０５細胞で播種した。２４時間後、培養培地をＣＭのみに変更し、次いでその後毎日変更した。導入遺伝子サイレンシングは、ｈＥＳＣにおいて頻繁であり、単一トランスジェニック細胞の一部のみがマークされた細胞株を生成するため（Ｂｒａａｍ ｅｔ ａｌ（２００８），Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，５：３８９－３９２）、最も高いｔｄＴ／ｅＨＬＡ－Ｇの二重発現を有するクローンを、抗生物質耐性またはフローサイトメトリーではなく蛍光顕微鏡を使用して選択した。
【0102】
実施例４ ｅＰｉｇｇｙＢａｃ遺伝子送達系の評価
トランスフェクトされた細胞を、ＣＭおよびＹ－２７６３２中、６ｃｍ皿当たり２×１０３細胞で２４時間播種し、次いでＣＭのみに変更することにより、ｅＨＬＡ－Ｇトランスフェクション効率を決定した。次いで、培地を７日間毎日交換し、実施例５で説明されるように、コロニーを生細胞染色および免疫蛍光顕微鏡法により評価した。各クローンに対して、３つの高倍率視野を計数し、レポータータンパク質＋／ｅＨＬＡ－Ｇ＋ｈＥＳＣのパーセンテージを計算した。この実験の結果を、図３～４に示す。Ｌａｃｏｓｔｅ ｅｔ ａｌ（上記参照）に記載のように、プラスミドレスキュー戦略を使用してｅＨＬＡ－Ｇ挿入部位を決定した。簡単に説明すると、ゲノムＤＮＡを、トランスジェニックｈＥＳＣクローンから単離し、ＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩ／ＮｏｔＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで、１６℃で一晩、低濃度で自己連結させ、１００％イソプロパノールで沈殿させ、７０％エタノールで洗浄してから、ＤＨ１０Ｂ大腸菌中で転換し、アンピシリン上で選択した。ＳｐｌｉｎｋＴＡ ＰＣＲを使用して、ｅＨＬＡ－Ｇコピー数を決定した。核型安定性を評価するために、標準的なＧバンド法を２０継代毎に行った。ｅＨＬＡ－Ｇおよびレポータータンパク質遺伝子サイレンシングを、フローサイトメトリーを使用して１０継代毎に評価した。解離および分析の前に、ｈＥＳＣを１０μＭ Ｙ－２７６３２で１時間処理した。次いで、細胞を、０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡで、３７℃で５分間解離させ、ＣＭおよびＹ－２７６３２中で洗浄し、０．１％ＢＳＡおよび０．５ｍＭ ＥＤＴＡを含有する氷冷ＰＢＳ中に再懸濁させ、次いでＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して分析した。図８および９に示されるように、継代１６において、本質的にＥＧＦＰまたはｅＨＬＡ－Ｇ発現のサイレンシングは観察されなかった。以下の免疫細胞化学的検出により、２０継代毎に多能性を評価した：１）多能性マーカーＯｃｔ３／４、ＳＳＥＡ－４、Ｓｏｘ２およびＮａｎｏｇ（図５および６）、２）レポータータンパク質＋／ｅＨＬＡ－Ｇ＋胚様体形成（図７）、ならびに３）分化したトランスジェニックｈＥＳＣの内胚葉マーカーＧａｔａ ６、中胚葉マーカー筋アクチン、および外胚葉マーカーニューロフィラメント重鎖（データは示さず）（全てＬｅｉｃａ ＣＴＲ６５００蛍光顕微鏡を使用）。特に指定がない限り、すべての抗体は、Ａｂｃａｍからのものであった。
トランスフェクトされた細胞を、ＣＭおよびＹ－２７６３２中、６ｃｍ皿当たり２×１０３細胞で２４時間播種し、次いでＣＭのみに変更することにより、ｅＨＬＡ－Ｇトランスフェクション効率を決定した。次いで、培地を７日間毎日交換し、実施例５で説明されるように、コロニーを生細胞染色および免疫蛍光顕微鏡法により評価した。各クローンに対して、３つの高倍率視野を計数し、レポータータンパク質＋／ｅＨＬＡ－Ｇ＋ｈＥＳＣのパーセンテージを計算した。この実験の結果を、図３～４に示す。Ｌａｃｏｓｔｅ ｅｔ ａｌ（上記参照）に記載のように、プラスミドレスキュー戦略を使用してｅＨＬＡ－Ｇ挿入部位を決定した。簡単に説明すると、ゲノムＤＮＡを、トランスジェニックｈＥＳＣクローンから単離し、ＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩ／ＮｏｔＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで、１６℃で一晩、低濃度で自己連結させ、１００％イソプロパノールで沈殿させ、７０％エタノールで洗浄してから、ＤＨ１０Ｂ大腸菌中で転換し、アンピシリン上で選択した。ＳｐｌｉｎｋＴＡ ＰＣＲを使用して、ｅＨＬＡ－Ｇコピー数を決定した。核型安定性を評価するために、標準的なＧバンド法を２０継代毎に行った。ｅＨＬＡ－Ｇおよびレポータータンパク質遺伝子サイレンシングを、フローサイトメトリーを使用して１０継代毎に評価した。解離および分析の前に、ｈＥＳＣを１０μＭ Ｙ－２７６３２で１時間処理した。次いで、細胞を、０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡで、３７℃で５分間解離させ、ＣＭおよびＹ－２７６３２中で洗浄し、０．１％ＢＳＡおよび０．５ｍＭ ＥＤＴＡを含有する氷冷ＰＢＳ中に再懸濁させ、次いでＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して分析した。図８および９に示されるように、継代１６において、本質的にＥＧＦＰまたはｅＨＬＡ－Ｇ発現のサイレンシングは観察されなかった。以下の免疫細胞化学的検出により、２０継代毎に多能性を評価した：１）多能性マーカーＯｃｔ３／４、ＳＳＥＡ－４、Ｓｏｘ２およびＮａｎｏｇ（図５および６）、２）レポータータンパク質＋／ｅＨＬＡ－Ｇ＋胚様体形成（図７）、ならびに３）分化したトランスジェニックｈＥＳＣの内胚葉マーカーＧａｔａ ６、中胚葉マーカー筋アクチン、および外胚葉マーカーニューロフィラメント重鎖（データは示さず）（全てＬｅｉｃａ ＣＴＲ６５００蛍光顕微鏡を使用）。特に指定がない限り、すべての抗体は、Ａｂｃａｍからのものであった。
【0103】
実施例５ ｅＨＬＡ－Ｇおよび他のＨＬＡタンパク質の細胞表面局在化
生細胞染色を使用して、トランスジェニックウイルス野生型ｈＥＳＣおよびｈＥＥＰにおける細胞表面ＨＬＡクラスＩａ、ＨＬＡ－Ｅ、ｅＨＬＡ－Ｇ、およびＨＬＡクラスＩＩ発現を検出した。簡単に述べると、細胞を回収して冷ＰＢＳ中で洗浄し、１０％ヤギ血清および３％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中で、４℃で６０分間、対応する１度のｍＡｂで染色し、洗浄し、１％パラホルムアルデヒドで１０分間固定し、続いて４℃で３０分間、ＦＩＴＣと複合体化したヤギ抗マウスＩｇＧで染色した。対照アリコートをアイソタイプ適合ＩｇＧで染色し、標的細胞への非特異的結合を評価した。特異的結合のみを達成するための最適条件を決定するために、各抗体（ＨＬＡ－Ｇの場合ＭＥＭＧ／９、ＨＬＡ－Ｅの場合ＭＥＭ－Ｅ／０８、ＨＬＡクラスＩａの場合Ｂｕ８、およびＨＬＡクラスＩＩの場合ＨＫＢ１（Ａｂｂｉｏｔｅｃ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ））を、まずいくつかの希釈で試験した。染色後、細胞をスライドガラス上に塗抹し、空気乾燥させ、次いでＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含有する抗退色媒体を載せた。Ｌｅｉｃａ ＣＴＲ６５００蛍光顕微鏡下で速やかにスライドを観察した。図５および１０に示されるように、ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ；ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ、およびβ－ミクログロブリンの発現は、野生型およびｅＨＬＡ－Ｇ改変されたヒトＥＳ細胞において同様であり、一方、約７倍高いレベルのＨＬＡ－Ｇ発現が、ｅＨＬＡ－Ｇ改変されたヒトＥＳ細胞において観察された。
生細胞染色を使用して、トランスジェニックウイルス野生型ｈＥＳＣおよびｈＥＥＰにおける細胞表面ＨＬＡクラスＩａ、ＨＬＡ－Ｅ、ｅＨＬＡ－Ｇ、およびＨＬＡクラスＩＩ発現を検出した。簡単に述べると、細胞を回収して冷ＰＢＳ中で洗浄し、１０％ヤギ血清および３％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中で、４℃で６０分間、対応する１度のｍＡｂで染色し、洗浄し、１％パラホルムアルデヒドで１０分間固定し、続いて４℃で３０分間、ＦＩＴＣと複合体化したヤギ抗マウスＩｇＧで染色した。対照アリコートをアイソタイプ適合ＩｇＧで染色し、標的細胞への非特異的結合を評価した。特異的結合のみを達成するための最適条件を決定するために、各抗体（ＨＬＡ－Ｇの場合ＭＥＭＧ／９、ＨＬＡ－Ｅの場合ＭＥＭ－Ｅ／０８、ＨＬＡクラスＩａの場合Ｂｕ８、およびＨＬＡクラスＩＩの場合ＨＫＢ１（Ａｂｂｉｏｔｅｃ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ））を、まずいくつかの希釈で試験した。染色後、細胞をスライドガラス上に塗抹し、空気乾燥させ、次いでＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含有する抗退色媒体を載せた。Ｌｅｉｃａ ＣＴＲ６５００蛍光顕微鏡下で速やかにスライドを観察した。図５および１０に示されるように、ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ；ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ、およびβ－ミクログロブリンの発現は、野生型およびｅＨＬＡ－Ｇ改変されたヒトＥＳ細胞において同様であり、一方、約７倍高いレベルのＨＬＡ－Ｇ発現が、ｅＨＬＡ－Ｇ改変されたヒトＥＳ細胞において観察された。
【0104】
実施例６ ＮＫ－９２細胞誘導細胞毒性に対するｅＨＬＡ－Ｇ発現の評価
ｅＨＬＡ－Ｇを発現するｈＥＳＣを培養し、実施例２に記載のようにｈＥＥＰに分化させた。ＮＫ－９２細胞（ＣＲＬ－２４０７、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を、１２．５％ＦＢＳ、１２．５％ウマ血清、０．２ｍＭイノシトール、０．１ｍＭ β－メルカプトエタノール、０．０２ｍＭ葉酸および１００ＩＵ／ｍｌ組み換えＩＬ－２（Ｓｉｇｍａ）を添加した最小必須培地アルファ培地（α－ＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、３７℃で、５％ＣＯ２加湿インキュベータ内で培養した。
ｅＨＬＡ－Ｇを発現するｈＥＳＣを培養し、実施例２に記載のようにｈＥＥＰに分化させた。ＮＫ－９２細胞（ＣＲＬ－２４０７、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を、１２．５％ＦＢＳ、１２．５％ウマ血清、０．２ｍＭイノシトール、０．１ｍＭ β－メルカプトエタノール、０．０２ｍＭ葉酸および１００ＩＵ／ｍｌ組み換えＩＬ－２（Ｓｉｇｍａ）を添加した最小必須培地アルファ培地（α－ＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、３７℃で、５％ＣＯ２加湿インキュベータ内で培養した。
【0105】
細胞毒性は、プロトコルの指示に従い、ＣｙｔｏＴｏｘ９６ Ｎｏｎ－Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して行った。簡単に述べると、Ｕ底９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）内で、エフェクター細胞を、５×１０３標的細胞と、様々なＮＫ－９２（エフェクターもしくは「Ｅ」）対ｈＥＳＣまたはｈＥＥＰ（標的もしくは「Ｔ」）のＥ：Ｔ細胞比で混合した。加湿５％ＣＯ２インキュベータ内で、３７℃で４時間後、５０μｌの上清を回収し、ＬＤＨ放出を測定した。ＬＤＨの標的細胞自然放出および最大放出、ならびにＬＤＨのエフェクター細胞自然放出を、これらの細胞を培地のみでインキュベートすることにより測定した。各アッセイは、３回行い、結果を溶解％のパーセンテージとして表した。特定の溶解のパーセンテージは、以下のように決定した：（実験放出－エフェクター自然放出－標的自然放出／標的最大放出－標的自然放出）×１００。全ての実験において、自然放出は最大放出の１０％未満であった。
【0106】
図１１に示されるように、１：１０のＥ：Ｔ比において、ｅＨＬＡ－Ｇを発現するｈＥＳＣの死滅は、ＧＦＰのみを発現する野生型細胞と比べて５０％超低減された。１：３０のＥ：Ｔにおいて、ｈＥＳＣを発現するｅＨＬＡ－Ｇの死滅は、約７５％低減された。野生型ｈＥＳＣは、両方のＥ：Ｔ比（ＧＦＰ単独）において示されるように、妥当な割合で死滅する。さらに、Ｋ５６２細胞における３’ＵＴＲ（Ｄｅｌ １４ ｂｐ）ＨＬＡ－Ｇ対立遺伝子の発現は、（Ｉｎｓ １４ｂｐ）ＨＬＡ－Ｇ対立遺伝子を発現するＫ５６２細胞、および改変されていないＫ５６２細胞において観察されるものに比べて、減少したＮＫ細胞誘導細胞毒性をもたらすことが示された。図１３を参照されたい。
【0107】
図１１の結果が繰り返され、追加のＮＫ細胞毒性実験で確認された。図１８に示されるように、ｅＨＬＡ－Ｇ（ＥＦ－１ａ）－ＧＦＰ－ｈＥＳＣの死滅は、ＧＦＰ導入遺伝子のみを含有する対照ｈＥＳＣ（ＨＬＡ－Ｇ導入遺伝子を有さない）と比較して、１００％超低減された。このデータは、ＨＬＡ－Ｇ導入遺伝子発現が、ｈＥＳＣにおける免疫抑制および／または低減された免疫原性の特性を付与することを示す。
【0108】
また、ＮＫ細胞毒性実験を、ｈＥＳＣから分化したｈＥＥＰに対して行った。図１９に示されるように、ｅＨＬＡ（ＥＦ－１α）－ＧＦＰ－ｈＥＳＣから分化したｅＨＬＡ（ＥＦ－１α）－ＧＦＰ－ｈＥＥＰの死滅は、対照ｈＥＥＰと比較して、１００％超（約３倍）十分に低減された。このデータは、ｅＨＬＡ（ＥＦ－１α）－ＧＦＰ導入遺伝子が分化のプロセスを通して安定で持続的であり、ＨＬＡ－Ｇ発現が、分化した細胞において免疫抑制および／または低減された免疫原性の特性を付与することができることを示している。
【0109】
実施例７ ヒト化マウスにおける同種移植による、ｅ－ＨＬＡ－Ｇ
＋
細胞のＩｎ Ｖｉｖｏでの免疫原性の決定
最近、ヒト末梢血リンパ球（Ｈｕ－ＰＢＬ－ＮＳＧ）を有するが、野生型免疫不全ＮＳＧマウスではないヒト化マウスモデルが、移植後１～２週間以内にミスマッチヒト膵島を拒絶することが示された（Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ（２００８），Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１２６：３０３－３１４）。移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）は４～５週で開始するが、安楽死の基準が満たされるまで移植片の生存を監視する。より低レベルのＧＶＨＤのみが存在する場合、我々は観察枠を拡張することができる。ＮＳＧマウス（６週齢の雌）を、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ＣｏｍｍｉｔｔｅｅのガイドラインおよびＧｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）における推奨に従って取り扱う。機能性ヒト化ＮＳＧマウスを、約２０×１０６ヒトＰＢＭＣのＮＳＧマウスへの静脈内注射により生成した（Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ（２００８），Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｃｈ．１５：Ｕｎｉｔ１５．２１、およびＫｉｎｇ ｅｔ ａｌ（上記参照）に従う）。約４週目で、ＥＤＴＡ被覆毛細管（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＥＤＴＡ処理された１．５ｍｌ管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を使用して、麻酔されたマウスの後眼窩静脈叢から血液を採取することにより、生着を検証した。次いで、ヒトＣＤ４５陽性のために、Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ（上記参照）に従い、ＦＡＣＳ分析により細胞を処理した。４週目に血液中０．１％に達するヒトＣＤ４５＋細胞のレベルは、生着の成功とみなされ、同種移植拒絶試験を可能とする。
最近、ヒト末梢血リンパ球（Ｈｕ－ＰＢＬ－ＮＳＧ）を有するが、野生型免疫不全ＮＳＧマウスではないヒト化マウスモデルが、移植後１～２週間以内にミスマッチヒト膵島を拒絶することが示された（Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ（２００８），Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１２６：３０３－３１４）。移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）は４～５週で開始するが、安楽死の基準が満たされるまで移植片の生存を監視する。より低レベルのＧＶＨＤのみが存在する場合、我々は観察枠を拡張することができる。ＮＳＧマウス（６週齢の雌）を、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ＣｏｍｍｉｔｔｅｅのガイドラインおよびＧｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）における推奨に従って取り扱う。機能性ヒト化ＮＳＧマウスを、約２０×１０６ヒトＰＢＭＣのＮＳＧマウスへの静脈内注射により生成した（Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ（２００８），Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｃｈ．１５：Ｕｎｉｔ１５．２１、およびＫｉｎｇ ｅｔ ａｌ（上記参照）に従う）。約４週目で、ＥＤＴＡ被覆毛細管（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＥＤＴＡ処理された１．５ｍｌ管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を使用して、麻酔されたマウスの後眼窩静脈叢から血液を採取することにより、生着を検証した。次いで、ヒトＣＤ４５陽性のために、Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ（上記参照）に従い、ＦＡＣＳ分析により細胞を処理した。４週目に血液中０．１％に達するヒトＣＤ４５＋細胞のレベルは、生着の成功とみなされ、同種移植拒絶試験を可能とする。
【0110】
典型的に使用されるｈＥＳＣおよびｈＥＥＰ培養系は、細胞を、シアル酸Ｎｅｕ５Ｇｃ等の免疫原性動物誘導体に暴露する（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ（２００５），Ｎａｔ Ｍｅｄ，１１：２２８－２３２）。したがって、最近Ｎｅｕ５Ｇｃレベルを大幅に低減することが示された（Ｈｅｉｓｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ（２００７），Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２５：１９７－２０２）汚染除去ステップが追加されてもよい。ｈＥＳＣは、１）Ｌｕｄｗｉｇ ｅｔ ａｌ（２００６），Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２４：１８５－１８７の方法に従う、ヒトマトリックス被覆プレート上での、ｂＦＧＦ、ＬｉＣｌ、ＧＡＢＡ、およびピペコリン酸を添加したＴｅＳＲ１培地中での培養、ならびに２）熱不活性化血液型ＡＢ Ｒｈ－ヒト血清（Ｈｅｉｓｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ（２００７），Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２５：１９７－２０２）によるＫＳＲ置換の、２つのアプローチを使用してＮｅｕ５Ｇｃを除染することができる。両方の方法で培養されたｈＥＳＣは、抗Ｎｅｕ５Ｇｃ ｍＡｂによるインキュベーションにより評価することができ、またフローサイトメトリーにより分析することができる。Ｌｕｄｗｉｇ ｅｔ ａｌの方法は、ｈＥＳＣの適応を必要とし得るため、第２のアプローチが採用され得る。ｈＥＥＰは、その製造者に従い動物誘導体を含まないＤＦＳＭ中で培養される。
【0111】
ＨＬＡ－Ｇ改変された細胞による同種移植を行う目的は、ＨＬＡ－Ｇ発現が、腫瘍サイズの増加により示されるように免疫原性を低減するかどうかを評価することである。移植前に、意図される注射部位を、臨床観察を容易にするために剃毛した。常に、麻酔の適切な使用を含む動物ガイドラインに従った。５×１０６のトランスジェニックｅＨＬＡ－Ｇ＋およびＨＬＡ－Ｇ－ｈＥＳＣを、注射部位をマークするために墨汁を含有する１００μｌの適切な培地中に再懸濁させた。これは、観察される蛍光が不十分である場合に、組織学的評価を容易化する。細胞を、５匹の３カ月齢Ｈｕ－ＰＢＬ－ＮＳＧマウスの胸部乳房脂肪パッドに皮下注射した。これらの同種移植片の結果を、図２０および２１に示す。「Ｇ０」ｈＥＳＣは、ｅＨＬＡ－Ｇ導入遺伝子を含有せず、ＧＦＰのみを含有する対照ＥＳＣである。「ｍＧ１（＃１）」および「ｍＧ１（＃２）」は、２つの異なるｅＨＬＡ－Ｇ（ＥＦ－１α）－ＧＦＰヌクレオフェクトされたｈＥＳＣクローンを指す。図２０に示されるように、Ｇ０、ｍＧ１（＃１）、およびｍＧ１（＃２）腫瘍を測定および秤量した。Ｇ０ ｈＥＳＣは、１２６．９立方ミリメートルの体積および３２ミリグラムの重量を有する腫瘍を形成した。ｍＧ１（＃１）ｈＥＳＣは、７４８．４立方ミリメートルの体積および３１８ミリグラムの重量を有する腫瘍を形成した。ｍＧ１（＃２）ｈＥＳＣは、１１１６．７立方ミリメートルの体積および６７５ミリグラムの重量を有する腫瘍を形成した。
【0112】
図２１は、５匹のヒト化ＮＳＧマウスへのｈＥＳＣ同種移植からの腫瘍の平均した結果を示す。データは、ＨＬＡ－ＧヌクレオフェクトされたｈＥＳＣ（「ｍＧ１」）が、ヒト化ＮＳＧマウスに移植された野生型ｈＥＳＣ（「Ｇ０」）よりもはるかに大きく（体積で３倍を超える）重い（重量で２倍を超える）腫瘍を形成したことを示している。したがって、データは、ｅＨＬＡ－Ｇ導入遺伝子発現が、低減された免疫原性および／または増加した免疫抑制を提供することができることを示している。これは、任意の所望の細胞型を、治療、移植、組織修復、細胞および組織の置換等のために普遍的または優れた同種ドナーに改変するための、本明細書に記載のｅＨＬＡ－Ｇ導入遺伝子コンストラクトの一般的応用を支持している。
【0113】
ヒト化ＮＳＧマウスによる上述の同種移植実験は、能動的に増殖する、または増殖するように誘導され得る任意のｅＨＬＡ－Ｇ改変された細胞型を用いて行うことができる。
【0114】
さらに、ヒト化マウスにおける同種移植は、６２０ｎｍ発光フィルタおよび２．５秒の露光時間を用いたＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｌｉｐｅｒ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用して監視され得る。６２０ｎｍナノメートル以上の波長では、ＧＦＰでおこる自己蛍光が除去され、シグナルは、皮膚の表面下２．５ｃｍまで深く検出され得る（Ｓｈａｎｅｒ ｅｔ ａｌ（２００４），Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２２：１５６７－１５７２）。マウスは、縦方向に画像化され、週単位で秤量された。４週間の期間中にシグナルが観察されない場合、マウスを致死させ、使用された蛍光レポータータンパク質を検出するために蛍光顕微鏡を使用して、注射された胸部乳房脂肪パッドを組織学的に評価する。全ての場合において、マウスを致死させた後、テラトーマ形成および免疫拒絶を評価するためにヘマトキシリンおよびエオシンで組織を染色する。免疫組織化学はまた、同種移植の免疫細胞浸潤の補足的尺度として役立つ、ヒトβ２ミクログロブリン（ＰＢＭＣ、ｈＥＳＣ、ｈＥＥＰ）およびＣＤ４５（ＰＢＭＣ）を検出するために実行される。スライドは、実験条件を知らされていない専門病理学者によって読み取られる。
【0115】
実施例８ ｅＨＬＡ－Ｇ＋－およびＨＬＡ－Ｇ
－
－ｈＥＥＰの腫瘍形成の評価
細胞が非ヒト化ＮＳＧマウスに移植されることを除いて実施例８で説明されたのと同様のプロトコルを使用して、ｈＥＥＰ腫瘍形成に対するｅＨＬＡ－Ｇ効果の影響を、トランスジェニックＧ＋および非トランスジェニックＧ－－ｈＥＥＰを注射することにより評価する。９ヶ月または安楽死基準の適合のいずれか早い方までの、月単位での生きた動物の縦方向の蛍光画像化および体重評価を使用して、全部で１４匹のマウスを監視する。次いで、マウスを致死させ、注射された胸部乳腺を、４％中性緩衝ホルムアルデヒド中に回収する。固定組織を７０％エタノールに移し、パラフィン中に包埋する。切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、蛍光レポータータンパク質顕微鏡観察用に処理する。組織切片は、レポータータンパク質陰性であることが判明した場合は、注射部位における非ＰＢＭＣの存在を確認するために役立つ、ヒトβ２ミクログロブリンおよびＣＤ４５に特異的なｍＡｂを用いて染色される。
細胞が非ヒト化ＮＳＧマウスに移植されることを除いて実施例８で説明されたのと同様のプロトコルを使用して、ｈＥＥＰ腫瘍形成に対するｅＨＬＡ－Ｇ効果の影響を、トランスジェニックＧ＋および非トランスジェニックＧ－－ｈＥＥＰを注射することにより評価する。９ヶ月または安楽死基準の適合のいずれか早い方までの、月単位での生きた動物の縦方向の蛍光画像化および体重評価を使用して、全部で１４匹のマウスを監視する。次いで、マウスを致死させ、注射された胸部乳腺を、４％中性緩衝ホルムアルデヒド中に回収する。固定組織を７０％エタノールに移し、パラフィン中に包埋する。切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、蛍光レポータータンパク質顕微鏡観察用に処理する。組織切片は、レポータータンパク質陰性であることが判明した場合は、注射部位における非ＰＢＭＣの存在を確認するために役立つ、ヒトβ２ミクログロブリンおよびＣＤ４５に特異的なｍＡｂを用いて染色される。
【0116】
独立した平均の統計的有意性は、０．０５未満のｐ値に対して想定される。２つの試料の平均の比較は、スチューデントのｔ検定を用いて決定される。３つ以上の平均の比較は、一元または二元分散分析、およびボンフェローニの事後検定を用いて行われる。全ての分散度は、平均の標準誤差として示される。線形回帰は、ｉｎ ｖｉｔｒｏデータとｉｎ ｖｉｖｏデータとの間の関係を比較して、ｉｎ ｖｉｔｒｏのデータが、本試験において使用されるＰＢＬ－ＮＳＧマウスモデルにおいてヒト同種移植拒絶に対する予測値を有するかどうかを決定するために行われる。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの同種増殖のパーセント増加は、ｉｎ ｖｉｖｏ相において使用されたＰＢＭＣマッチ対に対して回帰される（出力は、移植から４週間後のレポータータンパク質蛍光のレベルである）。ここで、成功した結果は、ｅＨＬＡ－Ｇ発現が生着の増加をもたらすことを示唆する高いＲ２値および負の傾き係数である。そのような解釈は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ試験における使用に選択されたクローンにおける、ｅＨＬＡ－Ｇ発現とレポータータンパク質陽性との間の高い関連性に依存する。
【0117】
実施例９ 完全に分化した線維芽細胞に安定にトランスフェクトされたｅＨＬＡ－Ｇの、免疫抑制および免疫原性評価
ヌクレオフェクションを使用して、ｅＨＬＡ－Ｇ（ＥＦ－１α）－ＧＦＰ導入遺伝子および対照コンストラクトを、ヒト新生児皮膚線維芽細胞（すでに完全に分化している細胞型）にトランスフェクトした。ヒト新生児皮膚線維芽細胞（ＨＦＤ）は、ＡＴＣＣから購入し、１０％ＦＢＳおよび１％ＰＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（ＡＴＣＣ）中で培養した。細胞が８０％のコンフルエンスに達した時に、０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、３７℃で３分間インキュベートすることにより細胞を回収した。細胞を計数し、０．５×１０６を遠心分離して、ヒト皮膚線維芽細胞ヌクレオフェクション溶液（カタログ番号ＶＰＤ－１００１、Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）中に再懸濁させた。ヘルパーおよびトランスポゾンプラスミドを細胞懸濁液に添加し、製造者のプロトコル（Ｌｏｎｚａ）に従い、プログラム設定Ｕ－０２０でヌクレオフェクションを行った。次いで、細胞を６ウェルプレート内に播種し、加湿３７℃／５％ＣＯ２中で２４時間インキュベートした。２４時間後、安定にトランスフェクトされた細胞を、１μｇ／ｍｌピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ）で７日間選択した。安定なＧＦＰ陽性細胞を、５００ｎｇ／ｍｌピューロマイシン中に維持し、ＨＬＡ－ＧおよびＧＦＰ発現をフローサイトメトリーで検出した。安定なトランスフェクタントを、後述のような末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）増殖アッセイおよびＮＫ－９２細胞毒性アッセイにおける使用のために、培養物中に維持した。
ヌクレオフェクションを使用して、ｅＨＬＡ－Ｇ（ＥＦ－１α）－ＧＦＰ導入遺伝子および対照コンストラクトを、ヒト新生児皮膚線維芽細胞（すでに完全に分化している細胞型）にトランスフェクトした。ヒト新生児皮膚線維芽細胞（ＨＦＤ）は、ＡＴＣＣから購入し、１０％ＦＢＳおよび１％ＰＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（ＡＴＣＣ）中で培養した。細胞が８０％のコンフルエンスに達した時に、０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、３７℃で３分間インキュベートすることにより細胞を回収した。細胞を計数し、０．５×１０６を遠心分離して、ヒト皮膚線維芽細胞ヌクレオフェクション溶液（カタログ番号ＶＰＤ－１００１、Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）中に再懸濁させた。ヘルパーおよびトランスポゾンプラスミドを細胞懸濁液に添加し、製造者のプロトコル（Ｌｏｎｚａ）に従い、プログラム設定Ｕ－０２０でヌクレオフェクションを行った。次いで、細胞を６ウェルプレート内に播種し、加湿３７℃／５％ＣＯ２中で２４時間インキュベートした。２４時間後、安定にトランスフェクトされた細胞を、１μｇ／ｍｌピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ）で７日間選択した。安定なＧＦＰ陽性細胞を、５００ｎｇ／ｍｌピューロマイシン中に維持し、ＨＬＡ－ＧおよびＧＦＰ発現をフローサイトメトリーで検出した。安定なトランスフェクタントを、後述のような末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）増殖アッセイおよびＮＫ－９２細胞毒性アッセイにおける使用のために、培養物中に維持した。
【0118】
ＰＢＭＣ増殖アッセイ。ｅＨＬＡ－Ｇ（ＥＦ－１α）－ＧＦＰ導入遺伝子で安定にトランスフェクトされたヒト皮膚線維芽細胞（「ＨＦＤ－ｍ１－ＧＦＰ」細胞）またはＧＦＰ単独対照コンストラクト（「ＨＦＤ－Ｇ０－ＧＦＰ」細胞）を、ＰＢＭＣ増殖を阻害するそれらの能力について評価した。ＨＦＤ－Ｇ０－ＧＦＰおよび－ｍＧ１－ＧＦＰ細胞をマイトマイシンＣ（１０μｇ／ｍｌで２．５時間）で不活性化し、９６ウェルプレート内に３．０×１０３／ウェルで播種し、２４時間接着させた。６μｇ／ｍｌ ＰＨＡの存在下で１×１０５のＰＢＭＣを、対応するＨＦＤ細胞に３回添加した。ＨＦＤ－Ｇ０－ＧＦＰおよび－ｍＧ１－ＧＦＰ細胞単独を、ＭＴＴ－ＯＤ補正のために含めた。（「ＭＴＴ」は、生細胞により切断されて暗青色のホルマザン産物を生成する、淡黄色の基質試薬である。このプロセスは、活性ミトコンドリアを必要とし、死滅した直後の細胞でも、大量のＭＴＴを切断しない。したがって、ＭＴＴは、増殖または細胞毒性アッセイのために使用され得る比色アッセイを提供する。）ＰＨＡを有さないＰＢＭＣおよび６μｇ／ｍｌのＰＨＡを有するＰＢＭＣを、対照として含めた。共培養物を３日間インキュベートし、ＰＢＭＣ増殖を、以下の式を使用し、ＭＴＴ試薬を用いて推定した：％ＰＢＭＣ増殖＝［（ＨＦＤ／ＰＢＭＣ／ＰＨＡのＯＤ５７０－ＨＦＤのＯＤ５７０）／（ＰＢＭＣ／ＰＨＡのＯＤ５７０）］×１０。図２２に示されるように、ＨＦＤ－ｍＧ１－ＧＦＰクローン「ｍＧ１－Ｒ１」は、対照および他のクローンよりも大きくＰＢＭＣを抑制したが、これは、外因性ＨＬＡ－Ｇ発現が、線維芽細胞等の分化細胞に対して、免疫抑制および／または低減された免疫原性を提供し得ることを示している。
【0119】
ＮＫ－９２細胞毒性アッセイ。実質的に前述したようにアッセイを行った。簡単に説明すると、２．５×１０３標的細胞（すなわち、ＨＦＤ－ｍ１－ＧＦＰ細胞またはＨＦＤ－Ｇ０－ＧＦＰ細胞）を、ＮＫ－９２細胞と共に、３：１、１０：１、３０：１のＥ：Ｔ比で、ＣＴＬ培地中で７時間インキュベートした。Ｋ５６２－ＷＴ細胞を、ＮＫ－９２細胞毒性の陽性対照として含めた。ＣｙｔｏＴｏｘ９６細胞毒性アッセイキットを用いて、細胞毒性を決定した。特異的溶解のパーセンテージを、以下のように決定した：％特異的溶解＝［（実験ＬＤＨ放出－エフェクター自然放出－標的自然放出）／（標的最大放出－標的自然放出）］×１００。以下の表４に示されるように、ＨＦＤ－ｍＧ１－ＧＦＰクローン「ｍＧ１－Ｒ１」および「ｍＧ１－＃１」は、対照および他のクローンよりも大きくＮＫ－９２細胞毒性を抑制したが、これは、外因性ＨＬＡ－Ｇ発現が、線維芽細胞等の分化細胞に対して、免疫抑制および／または減少した免疫原性を提供し得ることを示している。
【0120】
【表4】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【配列表】