特許 7379795 チェックポイント阻害薬に再発／耐性を示す腫瘍を治療するための抗Ｔｒｏｐ－２－ＳＮ－３８抗体薬物複合体の効果

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-11-07

(45)【発行日】2023-11-15

(54)【発明の名称】チェックポイント阻害薬に再発／耐性を示す腫瘍を治療するための抗Ｔｒｏｐ－２－ＳＮ－３８抗体薬物複合体の効果

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20231108BHJP

   A61K 31/4745 20060101ALI20231108BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20231108BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20231108BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20231108BHJP

   A61P 1/18 20060101ALI20231108BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20231108BHJP

   A61P 13/08 20060101ALI20231108BHJP

   A61P 13/10 20060101ALI20231108BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20231108BHJP

   A61P 15/00 20060101ALI20231108BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20231108BHJP

   A61P 35/04 20060101ALI20231108BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20231108BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20231108BHJP

【ＦＩ】

A61K39/395 L ZNA

A61K39/395 N

A61K39/395 T

A61K31/4745

A61K47/68

A61P1/00

A61P1/04

A61P1/18

A61P11/00

A61P13/08

A61P13/10

A61P13/12

A61P15/00

A61P35/00

A61P35/04

A61P43/00 121

C07K16/28

【請求項の数】 26

(21)【出願番号】P 2018556311

(86)(22)【出願日】2017-04-18

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2019-07-11

(86)【国際出願番号】 US2017028137

(87)【国際公開番号】W WO2017189279

(87)【国際公開日】2017-11-02

【審査請求日】2020-03-09

【審判番号】

【審判請求日】2021-12-27

(31)【優先権主張番号】62/328,289

(32)【優先日】2016-04-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】504149971

【氏名又は名称】イミューノメディクス、インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＩＭＭＵＮＯＭＥＤＩＣＳ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100123995

【弁理士】

【氏名又は名称】野田 雅一

(74)【代理人】

【識別番号】100126653

【弁理士】

【氏名又は名称】木元 克輔

(74)【代理人】

【識別番号】100165526

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 寛

(72)【発明者】

【氏名】ゴーヴィンダン， セレングラム ブイ．

(72)【発明者】

【氏名】ゴールデンバーグ， デイヴィッド エム．

【合議体】

【審判長】光本 美奈子

【審判官】齋藤 恵

【審判官】星 功介

(56)【参考文献】

【文献】Ｓｔａｒｏｄｕｂ， Ａ． Ｎ． ｅｔ ａｌ．，Ｆｉｒｓｔ－ｉｎ－Ｈｕｍａｎ Ｔｒｉａｌ ｏｆ ａ Ｎｏｖｅｌ Ａｎｔｉ－Ｔｒｏｐ－２ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ＳＮ－３８ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ， Ｓａｃｉｔｕｚｕｍａｂ Ｇｏｖｉｔｅｃａｎ， ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｉｖｅｒｓｅ Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１５年，Ｖｏｌ．２１， Ｎｏ．１７，ｐ．３８７０－３８７８，ｄｏｉ：１０．１１５８／１０７８－０４３２．ＣＣＲ－１４－３３２１

【文献】Ｂａｒｄｉａ， Ａ． ｅｔ ａｌ．，ＩＭＭＵ－１３２， ａ ｎｅｗ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ （ＡＤＣ） ａｇａｉｎｓｔ Ｔｒｏｐ－２， ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｆｏｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｒｅｌａｐｓｅｄ／ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ， ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ， ｔｒｉｐｌｅ－ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ （ＴＮＢＣ）： Ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ Ｐｈａｓｅ Ｉ／ＩＩ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ （ＮＣＴ０１６３１５５２），Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１５年 ５月，Ｖｏｌ．７５， Ｎｏ．９ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｐ５－１９－２７，［ｏｎｌｉｎｅ］， ［ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ ｏｎ ２０２１．０４．２８］， Ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎｅｔ： ＜ＵＲＬ： ｈｔｔｐｓ：／／ｃａｎｃｅｒｒｅｓ．ａａｃｒｊｏｕｒｎａｌｓ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／７５／９＿Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ／Ｐ５－１９－２７＞＜ＤＯＩ： １０．１１５８／１５３８－７４４５．ＳＡＢＣＳ１４－Ｐ５－１９－２７＞

【文献】Ｂａｒｄｉａ， Ａ． ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ／ｒｅｌａｐｓｅｄ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｔｒｉｐｌｅ－ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ （ＴＮＢＣ） ｗｉｔｈ ａｎ ａｎｔｉ－Ｔｒｏｐ－２－ＳＮ－３８ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ （ＡＤＣ）， ｓａｃｉｔｕｚｕｍａｂ ｇｏｖｉｔｅｃａｎ （ＩＭＭＵ－１３２）： Ｐｈａｓｅ Ｉ／ＩＩ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２０１５年 ５月２０日，Ｖｏｌ．３３， Ｎｏ．１５＿ｓｕｐｐｌ，Ａｂｓｔｒａｃｔ １０１６，［ｏｎｌｉｎｅ］， ［ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ ｏｎ ２０２１．０４．２８］， Ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎｅｔ： ＜ＵＲＬ： ｈｔｔｐｓ：／／ａｓｃｏｐｕｂｓ．ｏｒｇ／ｄｏｉ／１０．１２００／ｊｃｏ．２０１５．３３．１５＿ｓｕｐｐｌ．１０１６＞＜ ＤＯＩ： １０．１２００／ｊｃｏ．２０１５．３３．１５＿ｓｕｐｐｌ．１０１６＞

【文献】Ｈｏｍｅｔ Ｍｏｒｅｎｏ， Ｂ．， Ｒｉｂａｓ， Ａ． ，Ａｎｔｉ－ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ－１／ｌｉｇａｎｄ－１ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃａｎｃｅｒｓ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，２０１５年，Ｖｏｌ．１１２， Ｎｏ．９，ｐ．１４２１－１４２７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｂｊｃ．２０１５．１２４

【文献】Ｃｈａｗｌａ， Ａ． ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｓ： Ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｉｎ ｔｒｉｐｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ，ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１４年，Ｖｏｌ．３， Ｎｏ．３，ｅ２８３２５，ｄｏｉ：１０．４１６１／ｏｎｃｉ．２８３２５

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

A61K31/00-80

A61K45/00-08

A61K 9/00-72

A61K47/00-69

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｔｒｏｐ－２陽性がんを有するヒト患者において、Ｔｒｏｐ－２陽性がんを治療するための組成物であって、
前記組成物が、抗Ｔｒｏｐ－２抗体またはその抗原結合フラグメントに結合したリンカー部分にコンジュゲートしたＳＮ－３８を含むＡＤＣを含み、
前記患者は、チェックポイント阻害薬を用いた治療から再発した、または前記チェックポイント阻害薬を用いた前記治療に耐性を示す者であり、
前記チェックポイント阻害薬は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＣＴＬＡ－４の阻害薬である、組成物。

【請求項2】

前記チェックポイント阻害薬は、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、イピリムマブ、ピディリズマブ、ＭＤＸ－１１０５、デュルバルマブ、ＢＭＳ－９３６５５９及びトレメリムマブからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記チェックポイント阻害薬はＭＰＤＬ３２８０Ａである、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

前記抗Ｔｒｏｐ－２抗体は、軽鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＫＡＳＱＤＶＳＩＡＶＡ、配列番号：１）、ＣＤＲ２（ＳＡＳＹＲＹＴ、配列番号：２）及びＣＤＲ３（ＱＱＨＹＩＴＰＬＴ、配列番号：３）、ならびに、重鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＮＹＧＭＮ、配列番号：４）、ＣＤＲ２（ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＴＤＤＦＫＧ、配列番号：５）及びＣＤＲ３（ＧＧＦＧＳＳＹＷＹＦＤＶ、配列番号：６）を含むヒト化ＲＳ７抗体である、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項5】

前記抗Ｔｒｏｐ－２抗体は、軽鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＫＡＳＱＤＶＳＩＡＶＡ、配列番号：１）、ＣＤＲ２（ＳＡＳＹＲＹＴ、配列番号：２）及びＣＤＲ３（ＱＱＨＹＩＴＰＬＴ、配列番号：３）、ならびに、重鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＮＹＧＭＮ、配列番号：４）、ＣＤＲ２（ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＴＤＤＦＫＧ、配列番号：５）及びＣＤＲ３（ＧＧＦＧＳＳＹＷＹＦＤＶ、配列番号：６）を含む抗体と、Ｔｒｏｐ－２への結合性で競合する、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項6】

前記リンカーはＣＬ２Ａであり、前記ＡＤＣの構造は、ＭＡｂ－ＣＬ２Ａ－ＳＮ－３８

である、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項7】

前記がんは、結腸直腸癌、肺癌、胃癌、膀胱癌、腎臓癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、食道癌及び前立腺癌からなる群から選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項8】

前記がんはトリプルネガティブ乳癌である、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項9】

前記がんは、トリプルネガティブ乳癌、ＨＥＲ＋、ＥＲ＋、プロゲステロン＋乳癌、転移性非小細胞肺癌、転移性小細胞肺癌、転移性子宮内膜癌、転移性尿路上皮癌及び転移性膵臓癌からなる群から選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項10】

前記ＡＤＣを、３ｍｇ／ｋｇ～１８ｍｇ／ｋｇの用量で投与するためのものである、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項11】

前記用量は、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１６ｍｇ／ｋｇ及び１８ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される、請求項１０に記載の組成物。

【請求項12】

前記ＡＤＣを、８ｍｇ／ｋｇ～１２ｍｇ／ｋｇの用量で投与するためのものである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項13】

前記ＡＤＣを、８ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与するためのものである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項14】

前記ＡＤＣを、１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与するためのものである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項15】

前記治療は、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、または少なくとも４０％の腫瘍サイズの縮小をもたらすものである、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項16】

前記ＡＤＣは、前記抗体またはその抗原結合フラグメントにコンジュゲートした４分子またはそれ以上の分子のＳＮ－３８を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項17】

前記ＡＤＣは、前記抗体またはその抗原結合フラグメントにコンジュゲートした６～８分子のＳＮ－３８を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項18】

前記がんは転移性である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項19】

サイズを縮小させること、または転移部を除去することとともに用いられるための、請求項１～１８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項20】

外科手術、外部放射線、放射免疫治療、免疫療法、化学療法、アンチセンス療法、干渉ＲＮＡ療法、治療薬を用いた治療、及び遺伝子治療からなる群から選択される少なくとも１つのその他抗がん療法とともに用いられるためのものである、請求項１～１９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項21】

前記治療薬は、薬物、毒素、免疫調節薬、第二抗体、第二抗体の抗原結合フラグメント、プロアポトーシス薬、ＲＮａｓｅ、ホルモン、放射性核種、抗血管新生薬、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、化学療法剤、サイトカイン、ケモカイン、プロドラッグまたは酵素である、請求項２０に記載の組成物。

【請求項22】

前記薬物は、５－フルオロウラシル、アファチニブ、アプリジン、アザリビン、アナストロゾール、アントラサイクリン、アキシチニブ、ＡＶＬ－１０１、ＡＶＬ－２９１、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ボスチニブ、ブリオスタチン－１、ブスルファン、カリケアマイシン、カンプトテシン、カルボプラチン、１０－ヒドロキシカンプトテシン、カルムスチン、セレブレックス、クロラムブシル、シスプラチン、Ｃｏｘ－２阻害剤、イリノテカン（ＣＰＴ－１１）、ＳＮ－３８、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテカン、クリゾチニブ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダサチニブ、ジナシクリブ、ドセタキセル、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、２－ピロリノドキソルビシン（２Ｐ－ＤＯＸ）、シアノ－モルホリノドキソルビシン、ドキソルビシングルクロニド、エピルビシングルクロニド、エルロチニブ、エストラムスチン、エピドフィロトキシン、エルロチニブ、エンチノスタット、エストロゲン受容体結合剤、エトポシド（ＶＰ１６）、エトポシドグルクロニド、リン酸エトポシド、エキセメスタン、フィンゴリモド、フロクスウリジン（ＦＵｄＲ）、３’，５’－Ｏ－ジオレオイル－ＦｕｄＲ（ＦＵｄＲ－ｄＯ）、フルダラビン、フルタミド、ファルネシル－タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、フラボピリドール、フォスタマチニブ、ガネテスピブ、ＧＤＣ－０８３４、ＧＳ－１１０１、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イブルチニブ、イダルビシン、イデラリシブ、イホスファミド、イマチニブ、Ｌ－アスパラギナーゼ、ラパチニブ、レノリダミド、ロイコボリン、ＬＦＭ－Ａ１３、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、６－メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、ナベルビン、ネラチニブ、ニロチニブ、ニトロソウレア、オラパリブ、プリコマイシン、プロカルバジン、パクリタキセル、ＰＣＩ－３２７６５、ペントスタチン、ＰＳＩ－３４１、ラロキシフェン、セムスチン、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、ＳＵ１１２４８、スニチニブ、タモキシフェン、テマゾロミド（ＤＴＩＣの水溶性形態）、トランスプラチン、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、ウラシルマスタード、バタラニブ、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンカアルカロイド、及びＺＤ１８３９からなる群から選択される、請求項２１に記載の組成物。

【請求項23】

前記免疫調節薬は、サイトカイン、リンフォカイン、モノカイン、幹細胞増殖因子、リンフォトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、副甲状腺ホルモン、サイロキシン、インスリン、プロインスリン、リラキシン、プロリラキシン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、肝増殖因子、プロスタグランジン、線維芽細胞増殖因子、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、ＯＢタンパク質、トランスホーミング増殖因子（ＴＧＦ）、ＴＧＦ－α、ＴＧＦ－β、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、エリスロポエチン、トロンボポエチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、ミュラー阻害物質、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、インヒビン、アクチビン、血管内皮増殖因子、インテグリン、インターロイキン（ＩＬ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、インターフェロン－α、インターフェロン－β、インターフェロン－γ、Ｓ１因子、ＩＬ－１、ＩＬ－１ ｃｃ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－２５、ＬＩＦ、ｋｉｔ－リガンド、ＦＬＴ－３、アンジオスタチン、トロンボスポンジン及びエンドスタチンからなる群から選択される、請求項２１に記載の組成物。

【請求項24】

前記放射性核種は、^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏ、^３２Ｐ、^３３Ｐ、^４７Ｓｃ、^５１Ｃｒ、^５７Ｃｏ、^５８Ｃｏ、^５９Ｆｅ、^６２Ｃｕ、^６７Ｃｕ、^６７Ｇａ、^６７Ｇａ、^７５Ｂｒ、^７５Ｓｅ、^７５Ｓｅ、^７６Ｂｒ、^７７Ａｓ、^７７Ｂｒ、^８０ｍＢｒ、^８９Ｓｒ、^９０Ｙ、^９５Ｒｕ、^９７Ｒｕ、^９９Ｍｏ、^９９ｍＴｃ、^１０３ｍＲｈ、^１０３Ｒｕ、^１０５Ｒｈ、^１０５Ｒｕ、^１０７Ｈｇ、^１０９Ｐｄ、^１０９Ｐｔ、^１１１Ａｇ、^１１１Ｉｎ、^１１３ｍＩｎ、^１１９Ｓｂ、^１２１ｍＴｅ、^１２２ｍＴｅ、^１２５Ｉ、^１２５ｍＴｅ、^１２６Ｉ、^１３１Ｉ、^１３３Ｉ、^１４２Ｐｒ、^１４３Ｐｒ、^１４９Ｐｍ、^１５２Ｄｙ、^１５３Ｓｍ、^１６１Ｈｏ、^１６１Ｔｂ、^１６５Ｔｍ、^１６６Ｄｙ、^１６６Ｈｏ、^１６７Ｔｍ、^１６８Ｔｍ、^１６９Ｅｒ、^１６９Ｙｂ、^１７７Ｌｕ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１８９ｍＯｓ、^１８９Ｒｅ、^１９２Ｉｒ、^１９４Ｉｒ、^１９７Ｐｔ、^１９８Ａｕ、^１９９Ａｕ、^１９９Ａｕ、^２０１Ｔｌ、^２０３Ｈｇ、^２１１Ａｔ、^２１１Ｂｉ、^２１１Ｐｂ、^２１２Ｂｉ、^２１２Ｐｂ、^２１３Ｂｉ、^２１５Ｐｏ、^２１７Ａｔ、^２１９Ｒｎ、^２２１Ｆｒ、^２２３Ｒａ、^２２５Ａｃ、^２２７Ｔｈ及び^２５５Ｆｍからなる群から選択される、請求項２１に記載の組成物。

【請求項25】

前記毒素は、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、ＤＮａｓｅ Ｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌエンテロトキシン－Ａ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエキソトキシン、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエンドトキシンからなる群から選択される、請求項２１に記載の組成物。

【請求項26】

チェックポイント阻害抗体と組み合わせて投与するためのものであり、前記チェックポイント阻害抗体が、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１に対する抗体である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２０１６年４月２７日出願の米国仮特許出願６２／３２８，２８９に対する米国特許法１１９（ｅ）条の利益を主張するものであり、その全文は参照として本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを経由してＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、その全体は参照として本明細書に組み込まれる。上記ＡＳＣＩＩのコピー（２０１７年４月５日に作成）の名称は、ＩＭＭ３６６ＷＯ２＿ＳＬ．ｔｘｔ．であり、そのサイズは１３，００２バイトである。

【0003】

本発明は、ヒト対象内における様々ながん細胞に対する向上した標的能を有し、抗Ｔｒｏｐ－２抗体またはその抗原結合フラグメント、及びＳＮ－３８などのカンプトテシンを含む抗体薬物複合体（ＡＤＣ）の治療的使用に関する。好ましい実施形態では、抗体と治療薬部分は、治療効果を高める細胞内で開裂可能な結合部を介して結合する。より好ましい実施形態では、ＡＤＣは、治療効果を最適化する特定の用量及び／または特定の投与スケジュールで投与される。驚くべきことに、ＳＮ－３８コンジュゲート抗体（例えば、サシツズマブゴビテカンなど）における最適化された用量及び投与スケジュールは、動物モデル研究からは予測され得なかった予想外に優れた効果を示し、アテゾリズマブ、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、ピディリズマブ、デュルバルマブ、アテゾリズマブ、イピリムマブまたはトレメリムマブなどのチェックポイント阻害抗体に耐性を示すがんを効果的に治療することを可能としている。特定の実施形態では、ＡＤＣを、Ｔｒｏｐ－２陽性がんを有するヒト対象に、３～１８ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは４～１２ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは８～１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与してもよい。驚くべきことに、抗Ｔｒｏｐ－２－ＳＮ３８抗体薬物複合体（ＡＤＣ）は、チェックポイント阻害薬治療から再発した、またはチェックポイント阻害薬に耐性を示す患者内のＴｒｏｐ－２陽性がん（例えば、膵臓癌、トリプルネガティブ乳癌、小細胞肺癌、子宮内膜癌、尿路上皮癌及び非小細胞肺癌など）を治療するのに有効である。

【背景技術】

【0004】

特に標的薬物治療分野の科学者にとって、ヒトのがんに毒性薬物を特異的に送達するためにモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を使用することは、長年にわたる目標となっている。腫瘍関連ＭＡｂと好適な毒性薬物の複合体が開発されてはいるが、それらはヒトのがん治療における部分的な成功であり、事実上、その他の疾患、例えば、感染症及び自己免疫疾患などには使用されていない。毒性薬物は、最も一般的には、特にがんを治療するための化学療法剤（粒子放射性の放射性核種、または細菌毒素もしくは植物毒素もまたＭＡｂにコンジュゲートしているが）であり（Ｓｈａｒｋｅｙ ａｎｄ Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ．２００６ Ｊｕｌ－Ａｕｇ；５６（４）：２２６－２４３）、ごく最近では、特定の感染症を前臨床的に治療するための放射免疫複合体とコンジュゲートしている（Ｄａｄａｃｈｏｖａ ａｎｄ Ｃａｓａｄｅｖａｌｌ，Ｑ Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ Ｍｏｌ Ｉｍａｇｉｎｇ ２００６；５０（３）：１９３－２０４）。

【0005】

ＭＡｂ－化学療法剤複合体を用いる利点は、（ａ）化学療法剤そのものが構造的に明確であること、（ｂ）化学療法剤が、極めて明確なコンジュゲーション化学反応を用いて、ＭＡｂタンパク質と結合していること（多くの場合、ＭＡｂの抗原結合領域から離れた特定の部位において）、（ｃ）ＭＡｂ－化学療法剤複合体が、ＭＡｂ及び細菌毒素または植物毒素を含有する化学コンジュゲートと比較して、より再現性高く調製可能であり、一般的に免疫原性がより低いということから、商業開発及び規制認可の対象となっていること、及び、（ｄ）ＭＡｂ－化学療法剤複合体の全身毒性が、特に、放射線の影響を受けやすい骨髄において、放射性核種ＭＡｂ複合体と比較して数桁低いということである。

【0006】

カンプトテシン（ＣＰＴ）及びその誘導体は、強力な抗腫瘍薬の部類である。イリノテカン（ＣＰＴ－１１とも呼ばれる）及びトポテカンは、承認済みがん治療薬であるＣＰＴ類似体である（Ｉｙｅｒ ａｎｄ Ｒａｔａｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｍａｃｏｌ．４２：Ｓ３１－Ｓ４３（１９９８））。ＣＰＴは、トポイソメラーゼＩ酵素を阻害してトポイソメラーゼＩ－ＤＮＡ複合体を安定化させることにより作用する（Ｌｉｕ，ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｔｈｅ Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎｓ： Ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ Ｔｈｅｉｒ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ， Ｌｉｅｈｒ Ｊ．Ｇ．，Ｇｉｏｖａｎｅｌｌａ，Ｂ．Ｃ．ａｎｄ Ｖｅｒｓｃｈｒａｅｇｅｎ（ｅｄｓ），ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．，ＮＹ ９２２：１－１０（２０００））。ＣＰＴにおいては、複合体の調製における特定の問題が提起されている。第１の問題は、ほとんどのＣＰＴ誘導体が水性緩衝液中に溶けないことである。第２には、ＣＰＴが、巨大分子にコンジュゲートするための構造的修飾に特定の課題を有していることである。例えば、ＣＰＴそのものは、Ｅ環内にただ１つ三級ヒドロキシル基を含有している。ＣＰＴのヒドロキシル官能基は、続くタンパク質結合に好適なリンカーに結合する必要があり、強力なＣＰＴ誘導体、例えば、ＳＮ－３８（化学療法剤ＣＰＴ－１１の活性代謝物）などにおいて、またＣ１０ヒドロキシルを含有するその他の誘導体、例えば、トポテカン及び１０ヒドロキシＣＰＴにおいて、Ｃ１０位におけるフェノール性ヒドロキシルの存在は、必要なＣ２０ヒドロキシル誘導体化を複雑化している。第３に、カンプトテシンのＥ環のδ－ラクトン部分の生理学的条件下における不安定性により、抗腫瘍力価の著しい低下がもたらされる。それゆえ、コンジュゲーションプロトコルは、ラクトン開環を回避するために、７以下のｐＨで実施されるように行われる。しかしながら、アミン反応性基（例えば、活性エステルなど）を有する二官能性ＣＰＴのコンジュゲートには通常、８以上のｐＨが求められる。第４に、細胞内で開裂可能な部分は、ＣＰＴと抗体またはその他結合部分をつなぐリンカー／スペーサー内に組み込まれることが好ましい。

【0007】

抗体－ＣＰＴ複合体、例えば、抗Ｔｒｏｐ－２－ＳＮ－３８複合体（例えば、サシツズマブゴビテカン）などを調製及び投与するためのより効果的な方法が必要とされている。好ましくは、方法は、チェックポイント阻害抗体から再発した、またはチェックポイント阻害抗体に耐性を示すＴｒｏｐ－２陽性がんを有する患者に対して用いられ、効果を最大化し毒性を最小化させる、最適化された用量及び投与スケジュールを含む。

【発明の概要】

【0008】

[課題を解決するための手段]
本明細書で使用する場合、略語「ＣＰＴ」とは、特に明記しない限り、カンプトテシン、またはその誘導体のいずれか、例えば、ＳＮ－３８などのことを意味し得る。本発明は、ＣＰＴ－抗体ＡＤＣを調製及び投与するための向上した方法及び組成物を提供することにより、当該技術分野において未だ実現されていない要望を解決する。好ましくは、カンプトテシンはＳＮ－３８であり、抗体は抗Ｔｒｏｐ－２抗体（例えば、サシツズマブゴビテカン）である。開示する方法及び組成物は、その他の治療形態に耐性を示す、またはその他の治療形態にほとんど反応を示さない疾患、例えば、チェックポイント阻害抗体を用いた治療に耐性を示す、またはチェックポイント阻害抗体を用いた治療から再発したＴｒｏｐ－２＋がんなどを治療するために用いられる。

【0009】

ＡＤＣの抗体部分は、モノクローナル抗体、抗体フラグメント、二重特異性抗体もしくはその他の多価抗体、またはその他の抗体ベース分子もしくは抗体ベース化合物であることが好ましい。抗体は、様々なアイソタイプであってもよく、好ましくは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４であり、より好ましくは、ヒトＩｇＧ１ヒンジ配列及び定常領域配列を含む。抗体またはそのフラグメントは、ヒトとマウスのキメラ、ヒトと霊長類のキメラ、ヒト化（ヒトフレームワーク領域とマウス超可変（ＣＤＲ）領域）、または完全ヒト抗体に加えて、それらの変形形態、例えば、ｖａｎ ｄｅｒ Ｎｅｕｔ Ｋｏｌｆｓｃｈｏｔｅｎ ｅｔ ａｌ．が記載している（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００７；３１７：１５５４－１５５７）ような半ＩｇＧ４抗体（「ユニボディ」と呼ばれる）などであってもよい。より好ましくは、抗体またはそのフラグメントは、ヒト対象にＡＤＣを投与する際に免疫原性を低減させ得るヒト定常領域配列（特定のアロタイプに属する）を含むように設計または選択されてもよい。投与に好ましいアロタイプとしては、非Ｇ１ｍ１アロタイプ（ｎＧ１ｍ１）、例えば、Ｇ１ｍ３、Ｇ１ｍ３，１、Ｇ１ｍ３，２またはＧ１ｍ３，１，２などが挙げられる。より好ましくは、アロタイプは、ｎＧ１ｍ１、Ｇ１ｍ３、ｎＧ１ｍ１，２及びＫｍ３アロタイプからなる群から選択される。

【0010】

例示的な抗Ｔｒｏｐ－２抗体は、軽鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＫＡＳＱＤＶＳＩＡＶＡ、配列番号：１）、ＣＤＲ２（ＳＡＳＹＲＹＴ、配列番号：２）及びＣＤＲ３（ＱＱＨＹＩＴＰＬＴ、配列番号：３）、ならびに、重鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＮＹＧＭＮ、配列番号：４）、ＣＤＲ２（ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＴＤＤＦＫＧ、配列番号：５）及びＣＤＲ３（ＧＧＦＧＳＳＹＷＹＦＤＶ、配列番号：６）を含む、ヒト化ＲＳ７（ｈＲＳ７）抗体である。

【0011】

好ましい実施形態では、化学療法剤部分は、カンプトテシン（ＣＰＴ）ならびにその類似体及び誘導体から選択され、より好ましくは、ＳＮ－３８である。しかしながら、利用可能なその他の化学療法剤部分としては、タキサン（例えば、バッカチンＩＩＩ、タキソール）、エポチロン、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、エピルビシン、モルホリノドキソルビシン（モルホリノ－ＤＯＸ）、シアノモルホリノ－ドキソルビシン（シアノモルホリノ－ＤＯＸ）、２－ピロリノドキソルビシン（２－ＰＤＯＸ）、または２－ＰＤＯＸのプロドラッグ形態（プロ－２－ＰＤＯＸ）（例えば、Ｐｒｉｅｂｅ Ｗ（ｅｄ．），ＡＣＳ ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｓｅｒｉｅｓ ５７４，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，１９９５（３３２ｐｐ）、及び、Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：２４６４－２４６９，１９９６を参照のこと））、ゲルダナマイシンに例示されるベンゾキノイドアンサマイシン（ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ２３：４４２－４４７，１９７０；Ｎｅｃｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ １７：３６１－３７３，１９９９）などが挙げられる。好ましくは、抗体またはそのフラグメントは、少なくとも１つの化学療法剤部分に結合し、好ましくは、１～約５つの化学療法剤部分に結合し、より好ましくは、６またはそれ以上の化学療法剤部分に結合し、最も好ましくは、約６～約１２の化学療法剤部分に結合する。

【0012】

様々な実施形態は、食道癌、膵臓癌、肺癌、胃癌、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、腎臓癌、尿路上皮癌及び前立腺癌などのがんを含むがこれらに限定されない、ヒトＴｒｏｐ－２を発現するがんを治療するための本方法及び組成物の使用に関係していてもよい。

【0013】

がんの治療を含む特定の実施形態では、外科手術、放射線治療、化学療法、ｎａｋｅｄ抗体を用いた免疫療法、放射免疫治療、免疫調節薬、ワクチンなどと組み合わせて、薬物複合体を用いてもよい。これらの併用療法では、このような組み合わせで投与されるそれぞれの治療薬の用量を下げることができ、それにより、特定の重篤な副作用を抑えること、及び、場合によっては必要とされる治療期間を短縮することが可能となる。重複毒性がないまたは最低限である場合、それぞれの総量もまた投与してもよい。代替実施形態では、以下に記載するインターフェロン、チェックポイント阻害抗体、ブルトン型チロシンキナーゼ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤または微小管阻害剤と組み合わせて、ＡＤＣを投与してもよい。

【0014】

好ましい最適用量のＡＤＣとしては、３ｍｇ／ｋｇ～１８ｍｇ／ｋｇのｉ．ｖ．用量を挙げてもよく、週に１回、週に２回、または１週おきのいずれかで投与することが好ましい。最適な投与スケジュールとしては、２週間連続の治療の後に１、２、３または４週間の休薬という治療サイクル、１週おきの治療及び休薬という治療サイクル、１週間の治療の後に２、３または４週間の休薬という治療サイクル、３週間の治療の後に１、２、３または４週間の休薬という治療サイクル、４週間の治療の後に１、２、３または４週間の休薬という治療サイクル、もしくは、５週間の治療の後に１、２、３、４または５週間の休薬という治療サイクル、または、２週間に１回、３週間に１回もしくは１ヶ月間に１回の投与を挙げてもよい。任意のサイクル数、好ましくは少なくとも２サイクル、少なくとも４サイクル、少なくとも６サイクル、少なくとも８サイクル、少なくとも１０サイクル、少なくとも１２サイクル、少なくとも１４サイクル、または少なくとも１６サイクル、治療を延長してもよい。用いる例示的な用量としては、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１３ｍｇ／ｋｇ、１４ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１６ｍｇ／ｋｇ、１７ｍｇ／ｋｇ、及び、１８ｍｇ／ｋｇを挙げてもよい。好ましい用量は、４、６、８、９、１０または１２ｍｇ／ｋｇである。

【0015】

ＡＤＣを皮下投与する特定の代替実施形態では、サシツズマブゴビテカン（ＩＭＭＵ－１３２）などのＡＤＣの用量は、沈殿または凝集を生じることなくＡＤＣを濃縮する能力に加えて、皮下投与可能な投与容積（好ましくは、１、２もしくは３ｍｌまたはそれ以下）に制限され得る。したがって、皮下投与では、ＡＤＣの投与は、１．５～４ｍｇ／ｋｇで、１週間にわたり毎日（その後に休薬）、２週間にわたり週に３回（その後に休薬）、または、２週間にわたり週に２回（その後に休薬）であってもよい。ｓ．ｃ．注射に複数の部位を用いる場合、最大８ｍｇ／ｋｇの用量を用いてもよい。誘導後、維持量のＡＤＣを、２週間～３週間おきに、または毎月、ｉ．ｖ．またはｓ．ｃ．で投与してもよい。あるいは、２～４サイクルのｉ．ｖ．投与（８～１０ｍｇ／ｋｇ）（それぞれのサイクルでは、１日目及び８日目にＡＤＣを投与（２回の２１日間サイクルの間に１週間の休薬期間を設ける））で誘導を起こしてから、週に１回または複数回の活性用量として、または維持療法として、ｓ．ｃ．投与を行ってもよい。中間腫瘍スキャン及び／またはＴｒｏｐ－２陽性循環腫瘍細胞解析に基づいて、投与を調節してもよい。

【0016】

ＡＤＣの最適用量を選択する上で、年齢、全身健康、特定器官の機能または重量などの様々な因子に加えて、特定の器官系（例えば、骨髄）に対する前治療の影響を検討してもよいということ、及び、治療期間中の用量及び／または投与頻度を増加または減少させてもよいということについて、当業者は理解するであろう。わずか４～８回の投与後に認められた腫瘍縮小のエビデンスを元に、必要に応じて、投与を繰り返してもよい。本明細書で開示する最適化された用量及び投与スケジュールは、ヒト対象において、動物モデル研究からは予測され得なかった予想外に優れた効果及び毒性低下を示している。驚くべきことに、その優れた効果により、以前にチェックポイント阻害薬治療を含む１つまたは複数の標準的な抗がん療法に耐性を示すことが判明していた腫瘍の治療が可能となっている。

【0017】

本方法は、ＣＴ及び／またはＰＥＴ／ＣＴまたはＭＲＩを用いて、規則的な間隔で腫瘍の応答を測定することを含んでいてもよい。腫瘍マーカー、例えば、ＣＥＡ（がん胎児性抗原）、ＣＡ１９－９、ＡＦＰ、ＣＡ １５．３、または、ＰＳＡなどの血中濃度をまたモニターしてもよい。イメージング及び／またはマーカー血中濃度の結果に従って、必要に応じ、用量及び／または投与スケジュールを調節してもよい。

【0018】

本願請求項に記載の組成物及び方法による驚くべき結果は、高用量の抗体薬物複合体における予想外な忍容性である（反復注射したとしても、比較的低毒性の悪心及び嘔吐が認められるのみであるか、または、管理可能な好中球減少症を伴うのみ）。更なる驚くべき結果は、アルブミン、ＰＥＧまたはその他の担体にＳＮ－３８をコンジュゲートさせたその他の製品とは異なり、抗体薬物複合体が滞留性に欠けるという点である。滞留性に欠けるということは、反復投与または用量増加を行った後であっても、忍容性が向上すること、及び重篤な毒性が欠如することと関連している。これらの驚くべき結果により、予想外に高い効果及び低い毒性を伴う、用量及び送達スケジュールの最適化が可能となる。本願請求項に記載の方法は、以前より耐性を示すがんを有する個体の固形腫瘍サイズ（最大直径で測定）において、１５％またはそれ以上、好ましくは２０％またはそれ以上、好ましくは３０％またはそれ以上、より好ましくは４０％またはそれ以上の縮小をもたらす。当業者は、様々な異なる手法（例えば、総腫瘍容積、任意の寸法の最大腫瘍サイズ、またはいくつかの寸法のサイズ測定値の組み合わせなど）を用いて、腫瘍サイズを測定してもよいということを理解するであろう。これは、コンピュータ断層撮影法、超音波検査法及び／または陽電子放出断層撮影法などの標準的な放射線手法を用いて行ってもよい。サイズの測定手法は、ＡＤＣ治療による腫瘍サイズの縮小傾向（好ましくは、腫瘍の除去をもたらす）を観察することと比較して、あまり重要ではない。

【0019】

定期的なボーラス注入でＡＤＣを投与してもよい一方で、代替実施形態では、抗体薬物複合体の持続注入でＡＤＣを投与してもよい。Ｃｍａｘを上昇させるために、また血中におけるＡＤＣのＰＫを延長させるために、例えば、留置カテーテルを用いて、持続注入を行ってもよい。このような器具は当技術分野において周知であり、例えば、Ｈｉｃｋｍａｎ（登録商標）、Ｂｒｏｖｉａｃ（登録商標）またはＰｏｒｔ－Ａ－Ｃａｔｈ（登録商標）カテーテル（例えば、Ｓｋｏｌｎｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｍｏｎｉｔ ３２：７４１－４８，２０１０を参照のこと）、及び任意のこのような周知の留置カテーテルを使用してもよい。様々な持続注入用ポンプもまた当該技術分野において周知であり、任意のこのような周知の注入用ポンプを使用してもよい。持続注入の用量範囲は、１日あたり０．１～３．０ｍｇ／ｋｇであってもよい。より好ましくは、これらのＡＤＣを、２～５時間、より好ましくは、２～３時間の比較的短期間にわたり、静注で投与してもよい。

【0020】

特に好ましい実施形態では、ＡＤＣ及び投与スケジュールは、標準療法に耐性を示す患者において有効であってもよい。例えば、イリノテカン（ＳＮ－３８の親物質）を用いた前治療に反応していない患者に、抗Ｔｒｏｐ－２サシツズマブゴビテカンを投与してもよい。驚くべきことに、イリノテカンに耐性を示す患者は、サシツズマブゴビテカンにおいて、部分寛解または更に完全寛解を示し得る。腫瘍組織を特異的に標的とするＡＤＣの能力は、治療薬の向上した標的化及び高い送達性により、腫瘍の耐性を克服し得る。ＡＤＣは、チェックポイント阻害抗体などの代替的な標準治療薬と比較する際、同様に、効果の向上及び／または毒性低下を示し得る。

【0021】

特に好ましい対象は、転移性結腸直腸癌患者、転移性膵臓癌患者、トリプルネガティブ乳癌患者、ＨＥＲ＋、ＥＲ＋、プロゲステロン＋乳癌患者、転移性非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者、転移性小細胞肺癌患者、転移性胃癌患者、転移性腎臓癌患者、転移性尿路上皮癌患者、転移性膀胱癌患者、転移性卵巣癌患者、または、転移性子宮癌患者であってもよい。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】１０ｍｇ／ｋｇのサシツズマブゴビテカンで治療した、チェックポイント阻害薬に耐性を示す転移性ＴＮＢＣを有する患者のＣＴスキャン結果の要約を示す図である。

【図2】チェックポイント阻害薬に耐性を示す転移性ＴＮＢＣを有する患者のベースライン時のＣＴ画像（アキシャル像（上段）及びサジタル像（下段）を表示）を示す図である。腫瘍は矢印で示されている。

【図3】１０ｍｇ／ｋｇのサシツズマブゴビテカン（ＩＭＭＵ－１３２）を用いた治療前後における、標的病変１及び２のＣＴスキャンの比較を示す図である。ベースライン時の画像を上部に、またサシツズマブゴビテカン治療後の２回目の効果判定評価を下部に示す。ＩＭＭＵ－１３２による腫瘍の縮小が明白に認められた。

【図4】１０ｍｇ／ｋｇのサシツズマブゴビテカン（ＩＭＭＵ－１３２）を用いた治療前後における、標的病変３のＣＴスキャンの比較を示す図である。ベースライン時の画像を上部に、またサシツズマブゴビテカン治療後の２回目の効果判定評価を下部に示す。ＩＭＭＵ－１３２による腫瘍の縮小が明白に認められた。

【図5】ＩＭＭＵ－１３２で治療した、チェックポイント阻害薬に耐性を示す腫瘍を有する患者の結果の要約を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0023】

定義
以下に続く記載において、多数の用語を用い、本願請求項に記載の主題への理解を促進するため、以下の定義を提供する。本明細書で特に定義しない用語は、その明白かつ一般的な意味に従い用いられる。

【0024】

特に明記しない限り、「ａ」または「ａｎ」とは、「１つまたは複数」のことを意味する。

【0025】

本明細書で使用する場合、用語「約」とは、値の±１０％のことを意味する。例えば、「約１００」とは、９０～１１０の間の任意の数字のことを意味する。

【0026】

本明細書で使用する場合、「抗体」とは、全長（すなわち、天然、または標準的な免疫グロブリン遺伝子フラグメント組換えプロセスにより形成）免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ抗体）、または抗体フラグメントなどの免疫グロブリン分子の抗原結合部位のことを意味する。本願請求項に記載の主題の範囲内において、抗体または抗体フラグメントをコンジュゲートしてもよく、または別の方法で誘導体化してもよい。このような抗体としては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４（及びＩｇＧ４の派生型）に加え、ＩｇＡアイソタイプが挙げられるがこれらに限定されない。以下で使用する場合、略語「ＭＡｂ」は同じ意味で用いられてもよく、抗体、抗体フラグメント、モノクローナル抗体または多重特異性抗体のことを意味してもよい。

【0027】

「抗体フラグメント」は、上記ＩｇＧ４の半分子を含む、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆ（ａｂ）_２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）、単一ドメイン抗体（ＤＡＢまたはＶＨＨ）などの抗体の一部である（ｖａｎ ｄｅｒ Ｎｅｕｔ Ｋｏｌｆｓｃｈｏｔｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００７；３１７（１４ Ｓｅｐｔ）：１５５４－１５５７）。構造にかかわらず、使用する抗体フラグメントは、インタクト抗体が認識する同一抗原に結合する。用語「抗体フラグメント」としてはまた、特定の抗原に結合して複合体を形成することで抗体のように機能する、合成タンパク質または遺伝子組換えタンパク質が挙げられる。例えば、抗体フラグメントとしては、可変領域、例えば、重鎖及び軽鎖ならびに組換え単鎖ポリペプチド分子の可変領域（軽鎖可変領域と重鎖可変領域は、ペプチドリンカー（「ｓｃＦｖタンパク質」）により連結されている）からなる「Ｆｖ」フラグメントなどからなる独立したフラグメントが挙げられる。フラグメントを様々な方法で構築して、多価及び／または多重特異性の結合形態を得てもよい。

【0028】

「ｎａｋｅｄ抗体」は通常、治療薬にコンジュゲートしていない完全な抗体である。ｎａｋｅｄ抗体は、例えば、Ｆｃ依存性作用（補体結合（ＣＤＣ）及びＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）など）による、治療効果及び／または細胞傷害効果を示してもよい。しかしながら、その他の機構、例えば、アポトーシス、抗血管新生、抗転移活性、抗接着活性、ヘテロ接合またはホモ接合の阻害、及びシグナル伝達経路における干渉などもまた、治療効果をもたらし得る。ｎａｋｅｄ抗体としては、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体、天然抗体または組換え抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体及びそのフラグメントなどが挙げられる。一部の例においては、「ｎａｋｅｄ抗体」はまた、「ｎａｋｅｄ」抗体フラグメントのことを意味してもよい。本明細書で定義するとおり、「ｎａｋｅｄ」は、「非コンジュゲート」と同義であり、治療薬に結合またはコンジュゲートしていないことを意味する。

【0029】

「キメラ抗体」とは、抗体分子の定常ドメインはヒト抗体の定常ドメインに由来するが、１つの種に由来する抗体（好ましくはげっ歯類抗体、より好ましくはマウス抗体）の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、抗体の重鎖と軽鎖の両方の可変ドメインを含有する組換えタンパク質のことである。獣医学的用途において、キメラ抗体の定常ドメインは、他種、例えば、霊長類、ネコまたはイヌに由来していてもよい。

【0030】

「ヒト化抗体」とは、１種に由来する抗体（例えば、マウス抗体）のＣＤＲが、マウス抗体の可変重鎖及び可変軽鎖からヒトの重鎖及び軽鎖可変ドメイン（フレームワーク領域）へと移入された組換えタンパク質のことである。抗体分子の定常ドメインは、ヒト抗体の定常ドメインに由来する。一部の例においては、ヒト化抗体のフレームワーク領域における特定の残基、特に、ＣＤＲ配列に接したまたは接近した特定の残基は、修飾されてもよく、例えば、元のマウス抗体、げっ歯類抗体、類人猿抗体、またはその他の抗体における対応する残基で置換されてもよい。

【0031】

「ヒト抗体」とは、例えば、抗原誘発でヒト抗体を産生するように「遺伝子操作」されたトランスジェニックマウスから得た抗体のことである。この技術においては、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子座のエレメントを、内因性の特定重鎖及び軽鎖遺伝子座を破壊した胚性幹細胞株から誘導したマウスの株内に導入する。トランスジェニックマウスは、様々な抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、そのマウスを用いて、ヒト抗体を分泌するハイブリドーマを産生することができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得るための方法については、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，がＮａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．７：１３ （１９９４），Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６（１９９４）に、またＴａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，がＩｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９（１９９４）に記載している。完全ヒト抗体もまた、遺伝子または染色体のトランスフェクション法に加えて、ファージディスプレイ技術を用いて構築することができる（これらの全ては、当技術分野において周知である）。ヒト抗体及びそのフラグメントをインビトロで、免疫されていないドナー由来の免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子レパートリーから作製することについては、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５３（１９９０）を参照されたい。この技術においては、ヒト抗体可変ドメイン遺伝子を、繊維状バクテリオファージのメジャーコートタンパク質遺伝子またはマイナーコートタンパク質遺伝子のいずれかにインフレームでクローニングしてから、機能的抗体フラグメントとしてファージ粒子の表面上にディスプレイさせる。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含んでいるため、抗体の機能特性に基づいた選択はまた、それらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択にもつながる。この方法において、ファージは、Ｂ細胞の特性の一部を模倣する。ファージディスプレイは様々な方式で実施可能であり、それらの確認には、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：５５６４－５７１（１９９３）を参照されたい。ヒト抗体もまた、インビトロで活性化させたＢ細胞を用いて作製可能である。米国特許番号５，５６７，６１０及び５，２２９，２７５を参照されたい（それぞれの特許の実施例セクションは参照として本明細書に組み込まれる）。

【0032】

「治療薬」とは、疾患の治療に有用な原子、分子または化合物のことである。治療薬の例としては、抗体、抗体フラグメント、イムノコンジュゲート、薬物、細胞傷害薬、プロアポトーシス薬、毒素、ヌクレアーゼ（ＤＮＡｓｅ及びＲＮＡｓｅを含む）、ホルモン、免疫調節薬、キレート化剤、ホウ素化合物、光活性剤または染料、放射性核種、オリゴヌクレオチド、干渉ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、抗血管新生薬、化学療法剤、サイトカイン、ケモカイン、プロドラッグ、酵素、結合タンパク質または結合ペプチド、またはこれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。

【0033】

「イムノコンジュゲート」とは、治療薬にコンジュゲートした抗体、抗原結合抗体フラグメント、抗体複合体または抗体融合タンパク質のことである。コンジュゲートは、共有または非共有であってもよい。コンジュゲートは共有であることが好ましい。治療薬が薬物である場合、得られるイムノコンジュゲートは、抗体薬物複合体、すなわちＡＤＣである。

【0034】

本明細書で使用する場合、用語「抗体融合タンパク質」とは、天然抗体、一本鎖抗体または抗体フラグメントのうちの１つまたは複数を別の部分、例えば、タンパク質またはペプチド、毒素、サイトカイン、ホルモンなどに結合させて組換え調製した抗原結合分子のことである。特定の好ましい実施形態では、融合タンパク質は、互いに融合した同一のまたは異なる抗体、抗体フラグメントまたは一本鎖抗体のうち２つまたはそれ以上を含んでいてもよく、それら抗体は、同一の抗原または別々の抗原上における同一のエピトープ、別々のエピトープに結合してもよい。

【0035】

「免疫調節薬」とは、存在する場合に、体の免疫機構を変化、抑制または刺激する治療薬のことである。通常、免疫調節薬を使用すると、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞及び／またはＴ細胞などの免疫細胞が刺激されて、増殖するか、または、免疫応答カスケード内で活性化する。しかしながら、場合によっては、免疫調節薬が免疫細胞の増殖または活性化を抑制する場合がある。本明細書に記載の免疫調節薬の一例はサイトカインである。サイトカインは、特定抗原と接触した際に１つの細胞集団（例えば、初回抗原刺激を受けたＴリンパ球）が放出する、約５～２０ｋＤａの小さな可溶性タンパク質であり、細胞間において細胞間伝達物質として機能する。当事者は理解するであろうが、サイトカインの例としては、リンフォカイン、モノカイン、インターロイキン、ならびに、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）及びインターフェロンなどのいくつかの関連シグナル伝達分子が挙げられる。ケモカインは、サイトカインの一部である。特定のインターロイキン及びインターフェロンは、Ｔ細胞またはその他免疫細胞の増殖を刺激するサイトカインの例である。例示的なインターフェロンとしては、インターフェロン－α、インターフェロン－β、インターフェロン－γ及びインターフェロン－λが挙げられる。

【0036】

ＣＰＴとはカンプトテシンの略語であり、本願で使用する場合、ＣＰＴとは、カンプトテシンそのもの、またはカンプトテシンの類似体または誘導体（例えば、ＳＮ－３８など）のことを意味する。カンプトテシン及びその類似体の一部の構造を、以下のチャート１の式１に示す（ナンバリングを施し、環にＡ～Ｅの文字を付した）。

【0037】

【化1】

【0038】

抗Ｔｒｏｐ－２抗体
様々な実施形態は、Ｔｒｏｐ－２に結合する抗体またはそのフラグメントの使用に関する。特定の好ましい実施形態では、抗Ｔｒｏｐ－２抗体は、軽鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＫＡＳＱＤＶＳＩＡＶＡ、配列番号：１）、ＣＤＲ２（ＳＡＳＹＲＹＴ、配列番号：２）及びＣＤＲ３（ＱＱＨＹＩＴＰＬＴ、配列番号：３）、ならびに、重鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＮＹＧＭＮ、配列番号：４）、ＣＤＲ２（ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＴＤＤＦＫＧ、配列番号：５）及びＣＤＲ３（ＧＧＦＧＳＳＹＷＹＦＤＶ、配列番号：６）を含む、ヒト化ＲＳ７抗体であってもよい（例えば、米国特許番号７，２３８，７８５を参照のこと（その全体は本明細書に参照として組み込まれる））。

【0039】

ＲＳ７抗体は、ヒト原発性扁平上皮細胞肺癌の粗膜標品を用いて産生したマウスＩｇＧ_１であった（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０：１３３０，１９９０）。ＲＳ７抗体は、クラスター１３として同定されている４６～４８ｋＤａの糖タンパク質を認識する（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｐｐ．８：９８－１０２，１９９４）。その抗原はＥＧＰ－１（上皮糖タンパク質－１）と命名されたが、Ｔｒｏｐ－２とも呼ばれる。

【0040】

Ｔｒｏｐ－２はＩ型膜貫通タンパク質であり、ヒト細胞（Ｆｏｒｎａｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １９９５；６２：６１０－８）とマウス細胞（Ｓｅｗｅｄｙ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １９９８；７５：３２４－３０）の両方からクローニングされている。ヒトＴｒｏｐ－２のアミノ酸配列は、世間一般に知られている（例えば、ＮＣＢＩ受入番号Ｐ０９７５８．３を参照のこと）。腫瘍関連カルシウムシグナル伝達物質としてのその機能（Ｒｉｐａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １９９８；７６：６７１－６）に加えて、ヒトＴｒｏｐ－２の発現が、結腸癌細胞の腫瘍形成及び浸潤に必須であり、Ｔｒｏｐ－２の細胞外ドメインに対するポリクローナル抗体により効果的に抑制可能であることが判明している（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ２００８；７：２８０－５）。

【0041】

固形がんの治療標的としてのＴｒｏｐ－２に関心が高まっているが（Ｃｕｂａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ２００９；１７９６：３０９－１４）、乳癌（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００５；１１：４３５７－６４）、結腸直腸癌（Ｏｈｍａｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００６；１２：３０５７－６３；Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｄｉｓ ２００９；２４：８７５－８４）、及び口腔扁平上皮細胞癌（Ｆｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｄｅｒｎ Ｐａｔｈｏｌ ２００８；２１：１８６－９１）における過剰発現Ｔｒｏｐ－２の臨床的有意性について記載された更なる報告により、そのことが裏付けられている。高レベルのＴｒｏｐ－２を発現する前立腺基底細胞がインビトロ及びインビボで幹細胞様活性を増強させるという最新のエビデンスは特に注目に値する（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００８；１０５：２０８８２－７）。

【0042】

フローサイトメトリー及び免疫組織化学染色試験により、ＲＳ７ ＭＡｂが、正常ヒト組織への結合性を制限することにより、様々な腫瘍タイプ上の抗原を検出することが示されている（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。Ｔｒｏｐ－２は主に、肺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌及び前立腺癌などのがんにより発現されている。放射能標識マウスＲＳ７ ＭＡｂを用いた動物モデルの局在化及び治療研究は、腫瘍標的化及び治療効果を示している（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。

【0043】

肺、乳房、膀胱、卵巣、子宮、胃及び前立腺の腫瘍に強いＲＳ７染色が認められた（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５５：９３８，１９９３）。肺癌症例には、扁平上皮癌と腺癌の両方が含まれていた（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５５：９３８，１９９３）。両方の細胞型が強く染色されているということは、ＲＳ７抗体が、肺の非小細胞癌の組織学的分類を区別していないことを示している。

【0044】

ＲＳ７ ＭＡｂは、標的細胞へと速やかに内部移行する（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。ＲＳ７ ＭＡｂの内在化速度定数は、速やかに内部移行するその他２つのＭＡｂの内在化速度定数間の中間であり、ＡＤＣ産生に有用であることが示されている（Ｉｄ．）。ＡＤＣの内部移行が抗腫瘍活性に必要であることが十分に記載されている（Ｐａｓｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ４７：６４１，１９８６）。薬物ＡＤＣの内部移行が抗腫瘍効果をもたらす主要因子として記載されている（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：１１８９，１９８８）。それゆえ、ＲＳ７抗体は、治療適用において、いくつかの重要な特性を示す。

【0045】

ｈＲＳ７抗体が好ましいが、その他の抗Ｔｒｏｐ－２抗体は周知及び／または一般に利用可能であり、代替実施形態では、本ＡＤＣに利用可能である。低い免疫原性という点においてはヒト化抗体またはヒト抗体が好ましいが、代替実施形態では、キメラ抗体を用いてもよい。以下に記載するが、抗体をヒト化するための方法は当該技術分野において周知であり、それらの方法を利用して、市販のマウス抗体またはキメラ抗体をヒト化形態へと変換してもよい。

【0046】

抗Ｔｒｏｐ－２抗体は多数の供給業者から市販されており、ＬＳ－Ｃ１２６４１８、ＬＳ－Ｃ１７８７６５、ＬＳ－Ｃ１２６４１６、ＬＳ－Ｃ１２６４１７（ＬｉｆｅＳｐａｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）、１０４２８－ＭＭ０１、１０４２８－ＭＭ０２、１０４２８－Ｒ００１、１０４２８－Ｒ０３０（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．，Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）、ＭＲ５４（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ｓｃ－３７６１８１、ｓｃ－３７６７４６（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、ＭＭ０５８８－４９Ｄ６（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，ＣＯ）、ａｂ７９９７６及びａｂ８９９２８（ＡＢＣＡＭ（登録商標），Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）が挙げられる。

【0047】

その他の抗Ｔｒｏｐ－２抗体については、特許文献において開示されている。例えば、米国公開番号２０１３／００８９８７２は、抗Ｔｒｏｐ－２抗体Ｋ５－７０（受入番号ＦＥＲＭ ＢＰ－１１２５１）、Ｋ５－１０７（受入番号ＦＥＲＭ ＢＰ－１１２５２）、Ｋ５－１１６－２－１（受入番号ＦＥＲＭ ＢＰ－１１２５３）、Ｔ６－１６（受入番号ＦＥＲＭ ＢＰ－１１３４６）、及びＴ５－８６（受入番号ＦＥＲＭ ＢＰ－１１２５４）（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ｏｒｇａｎｉｓｍ Ｄｅｐｏｓｉｔａｒｙ，Ｔｓｕｋｕｂａ，Ｊａｐａｎに寄託）について開示している。米国特許番号５，８４０，８５４は、抗Ｔｒｏｐ－２モノクローナル抗体ＢＲ１１０（ＡＴＣＣ番号ＨＢ１１６９８）について開示している。米国特許番号７，４２０，０４０は、ハイブリドーマ細胞株ＡＲ４７Ａ６．４．２（受入番号１４１２０５－０５で、ＩＤＡＣ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ ｏｆ Ｃａｎａｄａ，Ｗｉｎｎｉｐｅｇ，Ｃａｎａｄａ）に寄託）により産生された抗Ｔｒｏｐ－２抗体について開示している。米国特許番号７，４２０，０４１は、ハイブリドーマ細胞株ＡＲ５２Ａ３０１．５（受入番号１４１２０５－０３で、ＩＤＡＣに寄託）により産生された抗Ｔｒｏｐ－２抗体について開示している。米国公開番号２０１３／０１２２０２０は、抗Ｔｒｏｐ－２抗体３Ｅ９、６Ｇ１１、７Ｅ６、１５Ｅ２、１８Ｂ１について開示している。代表的な抗体をコードするハイブリドーマ（受入番号ＰＴＡ－１２８７１及びＰＴＡ－１２８７２）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されていた。チューブリン阻害剤モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）に結合させた抗５Ｔ４（抗Ｔｒｏｐ－２）抗体を含むＡＤＣ ＰＦ ０６２６３５０７は、Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．（Ｇｒｏｔｏｎ，ＣＴ）から市販されている（例えば、Ｓａｐｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１３， Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １２：３８－４７を参照のこと）。米国特許番号８，７１５，６６２は、寄託番号ＰＤ ０８０１９、ＰＤ ０８０２０、及びＰＤ ０８０２１でＡＩＤ－ＩＣＬＣ（Ｇｅｎｏａ，Ｉｔａｌｙ）に寄託したハイブリドーマにより産生された抗Ｔｒｏｐ－２抗体について開示している。米国特許出願公開番号２０１２０２３７５１８は、抗Ｔｒｏｐ－２抗体７７２２０、ＫＭ４０９７及びＫＭ４５９０について開示している。米国特許番号８，３０９，０９４（Ｗｙｅｔｈ）は、配列表により識別される抗体Ａ１及びＡ３について開示している。本パラグラフ中で上記したそれぞれの特許または特許出願の実施例セクションは、参照として本明細書に組み込まれる。特許公報ではないが、Ｌｉｐｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８１，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，７８：５１４７－５０）は、抗Ｔｒｏｐ－２抗体１６２－２５．３及び１６２－４６．２について開示している。

【0048】

非常に多くの抗Ｔｒｏｐ－２抗体が、当技術分野において周知及び／または一般に利用可能である。以下に記載するが、周知の抗原に対する抗体を作製するための方法は、当該技術分野において定型化された手順である。ヒト化抗体、ヒト抗体またはキメラ抗体の作製方法もまた周知である。当該技術分野における一般的な知識に鑑みて本開示を読解すれば、当業者は、本ＡＤＣにおける抗Ｔｒｏｐ－２抗体種を調製及び使用することが可能になるであろう。

【0049】

Ｔｒｏｐ－２に関連する標的に対する抗体の使用は、ＡＤＣ以外の免疫療法用にも開示されている。マウス抗Ｔｒｏｐ－１ ＩｇＧ２ａ抗体エドレコロマブ（ＰＡＮＯＲＥＸ（登録商標））が結腸直腸癌の治療に使用されてきたが、マウス抗体は、ヒトへの臨床使用には適していない（Ｂａｅｕｅｒｌｅ ＆ Ｇｉｒｅｓ，２００７，Ｂｒ．Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ９６：４１７－４２３）。エドレコロマブの低用量皮下投与がワクチン抗原に対する体液性免疫反応を誘導することが報告されている（Ｂａｅｕｅｒｌｅ ＆ Ｇｉｒｅｓ，２００７）。アデカツムマブ（ＭＴ２０１）（完全ヒト抗Ｔｒｏｐ－１抗体）は転移性乳癌及び初期前立腺癌に使用されており、ＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性を介して作用すると報告されている（Ｂａｅｕｅｒｌｅ ＆ Ｇｉｒｅｓ，２００７）。ＭＴ１１０（一本鎖抗Ｔｒｏｐ－１／抗ＣＤ３二重特異性抗体構築物）は、卵巣癌に対する効果を有することが報告されている（Ｂａｅｕｅｒｌｅ ＆ Ｇｉｒｅｓ，２００７）。Ｐｒｏｘｉｎｉｕｍ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエキソトキシンに結合した抗Ｔｒｏｐ－１一本鎖抗体を含む免疫毒素）は、頭頸部癌及び膀胱癌において試験されている（Ｂａｅｕｅｒｌｅ ＆ Ｇｉｒｅｓ，２００７）。これら研究のいずれも、特に、チェックポイント阻害抗体を用いた治療に耐性を示す患者における抗Ｔｒｏｐ－２ ＡＤＣの使用に関する任意の開示を含んでいなかった。

【0050】

カンプトテシン複合体
抗体または抗原結合抗体フラグメントに結合したカンプトテシン治療薬を含むＡＤＣを調製するための限定されない方法及び組成物について、以下で説明する。好ましい実施形態では、所定のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分（すなわち、所定数のモノマー単位を含有するＰＥＧ）（所定のＰＥＧは低分子量ＰＥＧであり、好ましくは１～３０モノマー単位を含有し、より好ましくは１～１２モノマー単位含有する）を、薬物と抗体の間に配置することにより、薬物の溶解性が向上する。

【0051】

好ましくは、第１のリンカーは一方の端で薬物と結合し、もう一方の端においてアセチレン基またはアジド基を末端としていてもよい。この第１のリンカーは、一方の端にアジド基またはアセチレン基を有する所定のＰＥＧ部分を、もう一方の端に別の反応性基（例えば、カルボン酸基またはヒドロキシル基など）を含んでいてもよい。上記二官能性の所定のＰＥＧは、アミノアルコールのアミン基に結合していてもよく、また後者のヒドロキシル基は、カーボネート形態で薬物上のヒドロキシル基に結合していてもよい。あるいは、上記所定の二官能性ＰＥＧの非アジド（またはアセチレン）部分は任意選択的に、Ｌ－アミノ酸またはポリペプチドのＮ末端に結合し、Ｃ末端はアミノアルコールのアミノ基に結合し、後者のヒドロキシ基は、それぞれカーボネートまたはカルバメートの形態で薬物のヒドロキシル基に結合する。

【0052】

抗体結合基、及び第１のリンカーのアジド（またはアセチレン）基に対して相補的な反応性基（すなわち、アセチレン（またはアジド））を含む第２のリンカーは、アセチレン－アジド付加環化反応を介して薬物－（第１のリンカー）複合体と反応し、疾患標的化抗体にコンジュゲートするのに有用な最終の二官能性薬物生成物を得てもよい。抗体結合基は、チオールまたはチオール反応性基のいずれかであることが好ましい。

【0053】

ＣＰＴ類似体（ＳＮ－３８など）を含む薬物－リンカー前駆体の調製において、Ｃ－２０カーボネートの存在下、１０－ヒドロキシル基を選択的に再生するための方法について以下で説明する。薬物中の反応性ヒドロキシル基（ＳＮ－３８中のフェノール性ヒドロキシルなど）用のその他の保護基、例えば、ｔ－ブチルジメチルシリルまたはｔ－ブチルジフェニルシリルもまた使用してもよく、これらの保護基は、誘導体化薬物を抗体結合部分に結合させる前にフッ化テトラブチルアンモニウムで脱保護される。この保護基をあらかじめ脱保護することなく、二官能性ＣＰＴが抗体にコンジュゲートするように、ＣＰＴ類似体の１０－ヒドロキシル基を「ＢＯＣ」以外のエステルまたはカーボネートで代わりに保護する。バイオコンジュゲートの投与後、保護基は生理学的ｐＨ条件下で容易に脱保護される。

【0054】

アセチレン－アジド結合（「クリックケミストリー」と呼ばれる）において、アジド部分はＬ２上で、アセチレン部分はＬ３上であってもよい。あるいは、Ｌ２はアセチレンを含んでいてもよく、Ｌ３はアジドを含んでいてもよい。「クリックケミストリー」とは、銅（＋１）が触媒する、アセチレン部分とアジド部分の間における付加環化反応（Ｋｏｌｂ ＨＣ ａｎｄ Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ ＫＢ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ ２００３；８：１１２８－３７）のことを指す（別の形態のクリックケミストリーが周知であり使用可能であるが）。クリックケミストリーは中性ｐＨ条件付近の水溶液中で生じるため、薬物コンジュゲートに適している。クリックケミストリーの利点は、それが化学選択的なものであり、その他の周知のコンジュゲーション化学反応、例えば、チオール－マレイミド反応を補完することである。

【0055】

本出願は、標的化部分としての抗体または抗体フラグメントの使用に焦点を置いているが、当業者は、複合体が抗体または抗体フラグメントを含む場合、別のタイプの標的化部分、例えば、アプタマー、アビマー、アフィボディまたはペプチドリガンドなどで置換してもよいということを理解するであろう。

【0056】

例示的な好ましい実施形態は、一般式２
ＭＡｂ－［Ｌ２］－［Ｌ１］－［ＡＡ］_ｍ－［Ａ’］－薬物（２）
の、薬物誘導体と抗体の複合体に関し、
式中、ＭＡｂは疾患標的化抗体であり、Ｌ２は、抗体結合部分及び１個または複数個のアセチレン（またはアジド）基を含むクロスリンカーの構成要素であり、Ｌ１は、一方の端にアジド（またはアセチレン）を有する所定のＰＥＧ（Ｌ２のアセチレン（またはアジド）部分に対して相補的）、及びもう一方の端にカルボン酸基またはヒドロキシル基などの反応性基を含み、ＡＡはＬ－アミノ酸であり、ｍは０、１、２、３または４の値の整数であり、Ａ’は、エタノールアミン、４－ヒドロキシベンジルアルコール、４－アミノベンジルアルコール、または置換または非置換エチレンジアミンの群から選択される追加のスペーサーである。「ＡＡ」のＬ－アミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンから選択される。Ａ’基がヒドロキシルを含む場合、Ａ’基は、それぞれカーボネートまたはカルバメートの形態で薬物のヒドロキシル基またはアミノ基に結合する。

【0057】

式２の好ましい実施形態では、Ａ’はＬ－アミノ酸から誘導した置換エタノールアミンであり、アミノ酸のカルボン酸基はヒドロキシメチル部分で置換されている。Ａ’は、以下のＬ－アミノ酸、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンのいずれか１つから誘導してもよい。

【0058】

式２の好ましい実施形態における複合体の一例では、ｍは０であり、Ａ’はＬ－バリノールであり、薬物はＳＮ－３８で例示される。得られた構造を式３に示す。

【化2】

【0059】

式２の好ましい実施形態における複合体の別の例では、ｍは１であり誘導体化Ｌ－リジンで表され、Ａ’はＬ－バリノールであり、薬物はＳＮ－３８で例示される。構造を式４に示す。

【化3】

【0060】

この実施形態では、リジンアミノ基の直交保護基を使用して、リジンなどのアミノ酸のカルボン酸とバリノールのアミノ基の間にアミド結合が最初に形成される。リジン側鎖上の保護基はインタクトに維持しつつ、リジンＮ末端の保護基を除去してから、Ｎ末端を、もう一方の端にアジド（またはアセチレン）を有する所定ＰＥＧ上のカルボキシル基に結合させる。その後、バリノールのヒドロキシル基を、１０－ヒドロキシ保護ＳＮ－３８の２０－クロロホルメート誘導体に結合させてから、付加環化クリックケミストリーにより、この中間体を、抗体結合部分に加え相補的なアセチレン（またはアジド）基を有するＬ２構成要素に結合させる。最後に、リジン側鎖とＳＮ－３８の両方の保護基を除去して、式３に示すこの例の生成物を得る。

【0061】

理論に束縛されるものではないが、細胞内におけるタンパク質加水分解後に生成された低分子量のＳＮ－３８生成物（すなわち、バリノール－ＳＮ－３８カーボネート）は、バリノールのアミノ基及びカーボネートのカルボニルが関与する分子内環化を介した、インタクトＳＮ－３８の別の遊離経路を有する。

【0062】

別の好ましい実施形態では、一般式２のＡ’はＡ－ＯＨであり、それにより、Ａ－ＯＨは、４－アミノベンジルアルコールなどの崩壊性部分、またはベンジル位においてＣ_１－Ｃ_１０アルキル基で置換された置換４－アミノベンジルアルコールであり、後者は、アミノ基を介して、Ｌ－アミノ酸、または最大４つのＬ－アミノ酸部分を含むポリペプチドに結合し、式中、Ｎ末端は、抗体結合基で末端処理されたクロスリンカーに結合する。

【0063】

好ましい実施形態の一例を以下に示すが、一般式（２）のＡ’のＡ－ＯＨ実施形態は、置換４－アミノベンジルアルコールから誘導され、「ＡＡ」は、単一のＬ－アミノ酸（一般式（２）においてｍ＝１）を含み、薬物はＳＮ－３８で例示される。その構造を以下に示す（式５、ＭＡｂ－ＣＬＸ－ＳＮ－３８と呼ぶ）。ＡＡの単一アミノ酸は、以下のＬ－アミノ酸、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンのいずれか１つから選択される。４－アミノベンジルアルコール部分（Ａ’のＡ－ＯＨ実施形態）の置換基Ｒは、水素、またはＣ_１－Ｃ_１０アルキル基から選択されるアルキル基である。

【化4】

【0064】

式５のＭＡｂ－ＣＬＸ－ＳＮ－３８における特に好ましい実施形態において、式中、単一アミノ酸ＡＡはＬ－リジンであり、Ｒ＝Ｈであり、薬物はＳＮ－３８で例示される（式６、ＭＡｂ－ＣＬ２Ａ－ＳＮ－３８と呼ぶ）。その構造は、ＭＡｂ－ＣＬ２－ＳＮ－３８のリンカーとは、ＣＬ２リンカーにみられるＰｈｅ－Ｌｙｓジペプチドの単一リジン残基の置換の点で異なる。Ｐｈｅ－Ｌｙｓジペプチドは、リソソーム酵素用のカテプシンＢ開裂部位として設計され、結合薬物の細胞内放出において重要であると考えられてきた。驚くべきことに、カテプシン開裂部位がないにもかかわらず、ＣＬ２Ａリンカーを含むＡＤＣは、少なくとも有効であり、ＣＬ２リンカーを含むＡＤＣと比較して、インビボでより有効であり得る。

【化5】

【0065】

その他の実施形態は、１０－ヒドロキシ含有カンプトテシン（例えば、ＳＮ－３８など）の観点から可能である。薬物としてのＳＮ－３８の例において、薬物におけるより反応性の高い１０－ヒドロキシ基は、２０－ヒドロキシル基を変化させないまま誘導体化される。一般式２において、Ａ’は置換エチレンジアミンである。この実施形態の一例は、以下の式「７」で表され、式中、ＳＮ－３８のフェノール性ヒドロキシル基は置換エチレンジアミンでカルバメートとして誘導体化され、ジアミンのもう一方のアミンは４－アミノベンジルアルコールでカルバメートとして誘導体化され、後者のアミノ基はＰｈｅ－Ｌｙｓジペプチドに結合する。この構造（式７）において、Ｒ及びＲ’は独立して、水素またはメチルである。Ｒ＝Ｒ’＝メチルである場合、ＭＡｂ－ＣＬ１７－ＳＮ－３８またはＭＡｂ－ＣＬ２Ｅ－ＳＮ－３８と呼ばれる。

【化6】

【0066】

特定の実施形態では、ＡＡは、細胞内ペプチダーゼによって開裂可能なポリペプチド部分、好ましくは、ジ、トリまたはテトラペプチドを含む。例としては、Ａｌａ－Ｌｅｕ、Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ及びＡｌａ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ（配列番号：２０）が挙げられる（Ｔｒｏｕｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９８２）。別の例は、リソソームカテプシンによって開裂可能なＰｈｅ－Ｌｙｓ部分である。

【0067】

好ましい実施形態では、複合体のＬ１構成要素は、１～３０の繰り返しモノマー単位を有する所定のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）スペーサーを含む。更に好ましい実施形態では、ＰＥＧは、１～１２の繰り返しモノマー単位を有する所定のＰＥＧである。ＰＥＧの導入は、市販のヘテロ二官能性化ＰＥＧ誘導体の使用を伴っていてもよい。ヘテロ二官能性ＰＥＧは、アジド基またはアセチレン基を含んでいてもよい。「ＮＨＳ」がスクシンイミジルであり、８つの繰り返しモノマー単位を含むヘテロ二官能性の所定のＰＥＧの例を、以下の式８に示す。

【化7】

【0068】

好ましい実施形態では、Ｌ２は、２～４０、しかし好ましくは２～２０、より好ましくは２～５個の複数のアセチレン（またはアジド）基、及び単一の抗体結合部分を有する。

【0069】

複数の薬物分子及び単一の抗体結合部分を含む代表的な抗体ＳＮ－３８複合体を以下に示す。この構造の「Ｌ２」構成要素は２個のアセチレン基に結合し、２個のアジド結合ＳＮ－３８分子の結合をもたらす。ＭＡｂへの結合は、スクシンイミドで表される。

【化8】

【0070】

好ましい実施形態では、二官能性薬物が抗体結合基としてチオール反応性部分を含む場合、抗体上のチオールは、チオール化試薬を用いて、抗体のリジン基上に生成される。ＭＡｂのリジン基を修飾することでチオール基を抗体上に導入するための方法は、当該技術分野において周知である（Ｗｏｎｇ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｉｎｇ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９９１），ｐｐ ２０－２２）。あるいは、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）などの還元剤を用いて、抗体上の鎖間ジスルフィド結合を緩やかに還元することにより（Ｗｉｌｌｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．４：５２１－５２７（１９９３））、抗体上に７～１０のチオールを生成することができる。そしてそのことは、複数の薬物部分を抗原結合領域から離れたＭＡｂの鎖間領域に導入するという利点を有している。より好ましい実施形態では、還元ジスルフィドスルフヒドリル基にＳＮ－３８を結合させることにより、抗体分子毎に６つのＳＮ－３８部分が共有結合した抗体－ＳＮ－３８ ＡＤＣが形成される。薬物またはその他の治療薬を結合させるためにシステイン残基を提供するその他の方法は周知であり、例えば、システイン改変抗体の使用などである（米国特許番号７，５２１，５４１を参照のこと（その特許の実施例セクションは参照として本明細書に組み込まれる））。

【0071】

別の好ましい実施形態では、化学療法剤部分は、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、エピルビシン、モルホリノドキソルビシン（モルホリノ－ＤＯＸ）、シアノモルホリノ－ドキソルビシン（シアノモルホリノ－ＤＯＸ）、２－ピロリノドキソルビシン（２－ＰＤＯＸ）、Ｐｒｏ－２ＰＤＯＸ、ＣＰＴ、１０－ヒドロキシカンプトテシン、ＳＮ－３８、トポテカン、ラルトテカン、９－アミノカンプトテシン、９－ニトロカンプトテシン、タキサン、ゲルダナマイシン、アンサマイシン、及びエポチロンからなる群から選択される。より好ましい実施形態では、化学療法剤部分はＳＮ－３８である。好ましい実施形態の複合体では、好ましくは、抗体は少なくとも１つの化学療法剤部分に結合し、好ましくは１～約１２の化学療法剤部分に結合し、最も好ましくは約６～約１２の化学療法剤部分に結合する。

【0072】

更に、好ましい実施形態では、リンカー構成要素「Ｌ２」は、上記抗体の１個または複数個のリジン側鎖アミノ基に導入されたチオール反応性残基と反応するチオール基を含む。このようなケースでは、当該技術分野において十分説明されている手順を用いて、マレイミド、ビニルスルホン、ブロモアセトアミドまたはヨードアセトアミドなどのチオール反応性基で抗体をあらかじめ誘導体化する。

【0073】

この作業に関連し、驚くべきことに、ＣＰＴ薬物－リンカー（ＣＰＴは更に、１０－ヒドロキシル基を有する）を調製可能なプロセスが発見された。このプロセスは、限定するわけではないが、ｔ－ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）誘導体として１０－ヒドロキシル基を保護してから、薬物－リンカー複合体の最後から二番目の中間体を調製することを含む。一般的に、ＢＯＣ基を除去するためには、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）などの強酸による処理が必要とされる。これらの条件下では、除去する保護基を含むＣＰＴ ２０－Ｏ－リンカーカーボネートもまた開裂しやすく、その結果、未修飾ＣＰＴが増加することになる。事実、リンカー分子のリジン側鎖用の、緩やかに除去可能なメトキシトリチル（ＭＭＴ）保護基を用いる論理的根拠は、当該技術分野において明言されているが、この可能性を的確に回避することであった（Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２）。短期間、最適には３～５分間の反応を行うことにより、フェノール性ＢＯＣ保護基を選択的に除去することが可能であることが発見された。これらの条件下では、主な生成物は、１０－ヒドロキシル位の「ＢＯＣ」が除去される一方で「２０」位のカーボネートがインタクトである生成物であった。

【0074】

別のアプローチは、１０－ＯＨ保護基を脱保護する必要なしに、最終生成物を抗体にコンジュゲートする準備が整うように、ＣＰＴ類似体の１０－ヒドロキシ位を「ＢＯＣ」以外の基で保護することを含む。１０－ヒドロキシ保護基（１０－ＯＨをフェノール性カーボネートまたはフェノール性エステルに変換する）は、複合体のインビボ投与後、生理学的ｐＨ条件またはエステラーゼにより速やかに脱保護される。生理学的条件下における、１０－ヒドロキシカンプトテシンの、１０位のフェノール性カーボネート対２０位の三級カーボネートのより速やかな除去については、Ｈｅ ｅｔ ａｌ．が記載している（Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２：４００３－４００８（２００４））。ＳＮ－３８上の１０－ヒドロキシ保護基は、「ＣＯＲ」（式中、Ｒは「Ｎ（ＣＨ_３）_２－（ＣＨ_２）_ｎ－」などの置換アルキルであってもよく、式中、ｎは１～１０であり、式中、末端アミノ基は任意選択的に、水溶解性の高い四級塩形態である）、または単純なアルキル残基、例えば、「ＣＨ_３－（ＣＨ_２）_ｎ－」（式中、ｎは０～１０）であってもよく、アルコキシ部分、例えば、「ＣＨ_３－（ＣＨ_２）ｎ－Ｏ－」（式中、ｎは０～１０）、「Ｎ（ＣＨ_３）_２－（ＣＨ_２）_ｎ－Ｏ－」（式中、ｎは２～１０）、または「Ｒ_１Ｏ－（ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ）_ｎ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－」（式中、Ｒ_１はエチルまたはメチルであり、ｎは０～１０の値の整数）であってもよい。最終的な誘導体がカーボネートである場合、これらの１０－ヒドロキシ誘導体は、選択試薬のクロロホルメートで処理することで容易に調製される。通常、１０－ヒドロキシ含有カンプトテシン（例えば、ＳＮ－３８など）は、トリエチルアミンを塩基として用いて、ジメチルホルムアミド中のモル当量のクロロホルメートで処理される。これらの条件下では、２０－ＯＨ位は変化しない。１０－Ｏ－エステルを形成するために、選択試薬の酸塩化物を用いる。

【0075】

一般式２（式中、記述子Ｌ２、Ｌ１、ＡＡ及びＡ－Ｘは前のセクションに記載のとおり）の薬物誘導体と抗体の複合体を調製する好ましいプロセスでは、二官能性薬物部分、［Ｌ２］－［Ｌ１］－［ＡＡ］_ｍ－［Ａ－Ｘ］－薬物を最初に調製してから、その二官能性薬物部分を抗体（本明細書では「ＭＡｂ」を指し示す）にコンジュゲートする。

【0076】

一般式２（式中、記述子Ｌ２、Ｌ１、ＡＡ及びＡ－ＯＨは前のセクションに記載のとおり）の薬物誘導体と抗体の複合体を調製する好ましいプロセスでは、二官能性薬物部分は、最初にＡ－ＯＨをアミド結合でＡＡのＣ末端に結合させてから、ＡＡのアミン末端をＬ１のカルボン酸基に結合させることにより調製される。ＡＡが存在しない場合（すなわち、ｍ＝０）、Ａ－ＯＨをアミド結合で直接Ｌ１に結合させる。クリックケミストリーによるＬ１及びＬ２のアジド（またはアセチレン）基とアセチレン（またはアジド）基の間の反応を用いることにより、Ｌ１部分に結合させてから、クロスリンカー、［Ｌ１］－［ＡＡ］_ｍ－［Ａ－ＯＨ］を薬物のヒドロキシル基またはアミノ基に結合させる。

【0077】

一実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）である。その他の実施形態では、抗体は、多価ＭＡｂ及び／または多重特異性ＭＡｂであってもよい。抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒトモノクローナル抗体であってもよく、上記抗体は、インタクト、フラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）_２、Ｆ（ａｂ’）_２）またはサブフラグメント（一本鎖構造）形態、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡアイソタイプ、または、それらのサブ分子であってもよい。

【0078】

好ましい実施形態では、抗体は、がんまたは悪性細胞上に発現する抗原または抗原のエピトープ、最も好ましくはＴｒｏｐ－２に結合する。がん細胞は、造血腫瘍、がん、肉腫、黒色腫または神経膠腫瘍由来の細胞であることが好ましい。本発明に従い治療する好ましい悪性新生物は、悪性固形がんまたは造血腫瘍である。

【0079】

好ましい実施形態では、細胞内で開裂可能な部分は、ＭＡｂ－薬物複合体がその受容体に結合してから、細胞に内部移行した後に開裂してもよい。

【0080】

チェックポイント阻害抗体
がん治療にチェックポイント阻害抗体を用いた試験が、以前からがん治療に耐性を示すと考えられてきたがんにおいて、前例のない奏効率を示している（例えば、Ｏｔｔ ＆ Ｂｈａｒｄｗａｊ，２０１３，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４：３４６；Ｍｅｎｚｉｅｓ ＆ Ｌｏｎｇ，２０１３，Ｔｈｅｒ Ａｄｖ Ｍｅｄ Ｏｎｃｏｌ ５：２７８－８５；Ｐａｒｄｏｌｌ，２０１２，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ １２：２５２－２６４；Ｍａｖｉｌｉｏ ＆ Ｌｕｇｌｉを参照のこと）。ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１に対する拮抗的なチェックポイント阻害抗体を用いた治療は、がん及びその他の疾患に対する免疫療法における最も有望な新規方法の１つである。大部分の抗がん剤とは対照的に、チェックポイント阻害薬は、腫瘍細胞を直接の標的とはせずに、逆に、免疫機構の内因性抗腫瘍活性を高めるために、リンパ球受容体またはそのリガンドを標的としている（Ｐａｒｄｏｌｌ，２０１２，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ １２：２５２－２６４）。このような抗体が主に、疾患細胞、組織または病原体に対する免疫応答を調節する働きを有していることから、これらの抗体を抗体薬物複合体（ＡＤＣ）などその他治療様式と組み合わせて使用して、ＡＤＣの抗腫瘍効果を高めてもよい。

【0081】

プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１、ＣＤ２７９としても周知）は免疫グロブリンスーパーファミリーの細胞表面膜タンパク質をコードし、Ｂ細胞及びＮＫ細胞において発現している（Ｓｈｉｎｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２３：７０４－６；Ｂｌａｎｋ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５６：７３９－４５；Ｆｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅ １９７：１７７－８７；Ｐａｒｄｏｌｌ，２０１２，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ １２：２５２－２６４）。抗ＰＤ１抗体は、黒色腫、非小細胞肺癌、膀胱癌、前立腺癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、トリプルネガティブ乳癌、白血病、リンパ腫及び腎細胞癌の治療に使用されている（Ｔｏｐａｌｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６６：２４４３－５４；Ｌｉｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９：４６２－８；Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １４：３０４４－５１；Ｇｉｌｄｅｎｅｒ－Ｌｅａｐｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｏｒａｌ Ｏｎｃｏｌ ４９：１０８９－９６；Ｍｅｎｚｉｅｓ ＆ Ｌｏｎｇ，２０１３，Ｔｈｅｒ Ａｄｖ Ｍｅｄ Ｏｎｃｏｌ ５：２７８－８５）。

【0082】

例示的な抗ＰＤ１抗体としては、ペンブロリズマブ（ＭＫ－３４７５，ＭＥＲＣＫ）、ニボルマブ（ＢＭＳ－９３６５５８，ＢＲＩＳＴＯＬ－ＭＹＥＲＳ ＳＱＵＩＢＢ）及びピディリズマブ（ＣＴ－０１１，ＣＵＲＥＴＥＣＨ ＬＴＤ．）が挙げられる。抗ＰＤ１抗体は、例えば、ＡＢＣＡＭ（登録商標）（ＡＢ１３７１３２）、ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ（登録商標）（ＥＨ１２．２Ｈ７、ＲＭＰ１－１４）、及びＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ（Ｊ１０５、Ｊ１１６、ＭＩＨ４）から市販されている。

【0083】

プログラム細胞死１リガンド１（ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ２７４としても周知）は、活性化したＴ細胞、Ｂ細胞、骨髄細胞及びマクロファージにおいてみられるＰＤ－１のリガンドである。ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の複合体は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を抑制し、免疫応答を抑制する（Ｔｏｐａｌｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６６：２４４３－５４；Ｂｒａｈｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｎ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ ３６６：２４５５－６５）。抗ＰＤＬ１抗体は、非小細胞肺癌、黒色腫、結腸直腸癌、腎細胞癌、膵臓癌、胃癌、卵巣癌、乳癌及び血液悪性腫瘍の治療に使用されている（Ｂｒａｈｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ ３６６：２４５５－６５；Ｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９：５３００－９；Ｒａｄｖａｎｙｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９：５５４１；Ｍｅｎｚｉｅｓ ＆ Ｌｏｎｇ，２０１３，Ｔｈｅｒ Ａｄｖ Ｍｅｄ Ｏｎｃｏｌ ５：２７８－８５；Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １４：１３０４４－５１）。

【0084】

抗ＰＤＬ１抗体の例としては、ＭＤＸ－１１０５（ＭＥＤＡＲＥＸ）、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６、ＭＥＤＩＭＭＵＮＥ）、アテゾリズマブ（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（登録商標）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ）、及びＢＭＳ－９３６５５９（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）が挙げられる。抗ＰＤＬ１抗体はまた、例えば、ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ（ＭＩＨ１）から市販されている。

【0085】

細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４、ＣＤ１５２としても周知）はまた、Ｔ細胞上で排他的に発現する免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。ＣＴＬＡ－４はＴ細胞活性化を阻害するように作用するが、ヘルパーＴ細胞活性を阻害し制御性Ｔ細胞の免疫抑制活性を高めると報告されている（Ｐａｒｄｏｌｌ，２０１２，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ １２：２５２－２６４）。抗ＣＴＬ４Ａ抗体は、黒色腫、前立腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌を治療するための臨床試験に使用されてきた（Ｒｏｂｅｒｔ ＆ Ｇｈｉｒｉｎｇｈｅｌｌｉ，２００９，Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ １４：８４８－６１；Ｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９：５３００；Ｗｅｂｅｒ，２００７，Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ １２：８６４－７２；Ｗａｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｊ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ １１：８９）。

【0086】

例示的な抗ＣＴＬＡ４抗体としては、イピリムマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）及びトレメリムマブ（ＰＦＩＺＥＲ）が挙げられる。抗ＰＤ１抗体は、例えば、ＡＢＣＡＭ（登録商標）（ＡＢ１３４０９０）、ＳＩＮＯ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＩＮＣ．（１１１５９－Ｈ０３Ｈ、１１１５９－Ｈ０８Ｈ）、及びＴＨＥＲＭＯ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ ＰＩＥＲＣＥ（ＰＡ５－２９５７２、ＰＡ５－２３９６７、ＰＡ５－２６４６５、ＭＡ１－１２２０５、ＭＡ１－３５９１４）から市販されている。イピリムマブは最近、転移性黒色腫の治療用にＦＤＡの承認を受けた（Ｗａｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｊ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ １１：８９）。

【0087】

これら及びその他周知のチェックポイント阻害抗体を、ＩＭＭＵ－１３２と組み合わせて使用してもよい。好ましい実施形態では、ＩＭＭＵ－１３２（単剤でまたは組み合わせて）は、チェックポイント阻害抗体単剤に耐性を示すがんを有する患者を治療するのに有効である。

【0088】

一般的な抗体技術
事実上のあらゆる標的抗原に対するモノクローナル抗体を作製するための技術は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）、及びＣｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．１，ｐａｇｅｓ ２．５．１－２．６．７（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９１）を参照されたい。簡潔に説明すると、モノクローナル抗体は、抗原を含む組成物をマウスに注入し、脾臓を取り出しＢリンパ球を採取して、Ｂリンパ球を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを作製し、そのハイブリドーマをクローニングし、抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選抜し、抗原に対する抗体を産生するクローンを培養してから、ハイブリドーマ培養液から抗体を単離することによって得ることができる。当業者は、ヒト対象のどこに抗体を投与するか、抗体がヒト抗原のどこに結合するかを理解するであろう。

【0089】

様々な確立技術を用いて、ハイブリドーマ培養液からＭＡｂを単離及び精製してもよい。このような単離技術としては、プロテインＡセファロースまたはプロテインＧセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ ａｔ ｐａｇｅｓ ２．７．１－２．７．１２、及びｐａｇｅｓ ２．９．１－２．９．３を参照されたい。また、Ｂａｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ（ＩｇＧ）」 ｉｎ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．１０，ｐａｇｅｓ ７９－１０４（Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９２）を参照されたい。

【0090】

免疫原で抗体の初期産生を行った後、その抗体をシークエンスしてから、組換え技術により作成してもよい。マウス抗体及び抗体フラグメントのヒト化及びキメラ化については当業者に周知であり、以下で説明する。

【0091】

当業者は、本願請求項に記載の方法及び組成物が、当該技術分野において周知の多種多様なあらゆる抗体に利用可能であることを理解するであろう。使用する抗体は、多種多様な周知の供給業者から商業的に入手可能である。例えば、様々な抗体を分泌するハイブリドーマ株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手可能である。腫瘍関連抗原を含むがこれらに限定されない様々な疾患標的に対する多数の抗体がＡＴＣＣに寄託されている、及び／または、可変領域配列が公開されており、本願請求項に記載の方法及び組成物に用いることが可能である。例えば、米国特許番号７，３１２，３１８；７，２８２，５６７；７，１５１，１６４；７，０７４，４０３；７，０６０，８０２；７，０５６，５０９；７，０４９，０６０；７，０４５，１３２；７，０４１，８０３；７，０４１，８０２；７，０４１，２９３；７，０３８，０１８；７，０３７，４９８；７，０１２，１３３；７，００１，５９８；６，９９８，４６８；６，９９４，９７６；６，９９４，８５２；６，９８９，２４１；６，９７４，８６３；６，９６５，０１８；６，９６４，８５４；６，９６２，９８１；６，９６２，８１３；６，９５６，１０７；６，９５１，９２４；６，９４９，２４４；６，９４６，１２９；６，９４３，０２０；６，９３９，５４７；６，９２１，６４５；６，９２１，６４５；６，９２１，５３３；６，９１９，４３３；６，９１９，０７８；６，９１６，４７５；６，９０５，６８１；６，８９９，８７９；６，８９３，６２５；６，８８７，４６８；６，８８７，４６６；６，８８４，５９４；６，８８１，４０５；６，８７８，８１２；６，８７５，５８０；６，８７２，５６８；６，８６７，００６；６，８６４，０６２；６，８６１，５１１；６，８６１，２２７；６，８６１，２２６；６，８３８，２８２；６，８３５，５４９；６，８３５，３７０；６，８２４，７８０；６，８２４，７７８；６，８１２，２０６；６，７９３，９２４；６，７８３，７５８；６，７７０，４５０；６，７６７，７１１；６，７６４，６８８；６，７６４，６８１；６，７６４，６７９；６，７４３，８９８；６，７３３，９８１；６，７３０，３０７；６，７２０，１５５；６，７１６，９６６；６，７０９，６５３；６，６９３，１７６；６，６９２，９０８；６，６８９，６０７；６，６８９，３６２；６，６８９，３５５；６，６８２，７３７；６，６８２，７３６；６，６８２，７３４；６，６７３，３４４；６，６５３，１０４；６，６５２，８５２；６，６３５，４８２；６，６３０，１４４；６，６１０，８３３；６，６１０，２９４；６，６０５，４４１；６，６０５，２７９；６，５９６，８５２；６，５９２，８６８；６，５７６，７４５；６，５７２，８５６；６，５６６，０７６；６，５６２，６１８；６，５４５，１３０；６，５４４，７４９；６，５３４，０５８；６，５２８，６２５；６，５２８，２６９；６，５２１，２２７；６，５１８，４０４；６，５１１，６６５；６，４９１，９１５；６，４８８，９３０；６，４８２，５９８；６，４８２，４０８；６，４７９，２４７；６，４６８，５３１；６，４６８，５２９；６，４６５，１７３；６，４６１，８２３；６，４５８，３５６；６，４５５，０４４；６，４５５，０４０；６，４５１，３１０；６，４４４，２０６；６，４４１，１４３；６，４３２，４０４；６，４３２，４０２；６，４１９，９２８；６，４１３，７２６；６，４０６，６９４；６，４０３，７７０；６，４０３，０９１；６，３９５，２７６；６，３９５，２７４；６，３８７，３５０；６，３８３，７５９；６，３８３，４８４；６，３７６，６５４；６，３７２，２１５；６，３５９，１２６；６，３５５，４８１；６，３５５，４４４；６，３５５，２４５；６，３５５，２４４；６，３４６，２４６；６，３４４，１９８；６，３４０，５７１；６，３４０，４５９；６，３３１，１７５；６，３０６，３９３；６，２５４，８６８；６，１８７，２８７；６，１８３，７４４；６，１２９，９１４；６，１２０，７６７；６，０９６，２８９；６，０７７，４９９；５，９２２，３０２；５，８７４，５４０；５，８１４，４４０；５，７９８，２２９；５，７８９，５５４；５，７７６，４５６；５，７３６，１１９；５，７１６，５９５；５，６７７，１３６；５，５８７，４５９；５，４４３，９５３；５，５２５，３３８を参照されたい（それぞれの特許の実施例セクションは参照として本明細書に組み込まれる）。これらは例示に過ぎず、多種多様なその他の抗体及びそのハイブリドーマは当技術分野において周知である。当業者は、ＡＴＣＣ、ＮＣＢＩ及び／またはＵＳＰＴＯのデータベースにおいて、選択した疾患関連目的標的に対する抗体を単に検索することにより、ほぼあらゆる疾患関連抗原に対する抗体配列または抗体分泌ハイブリドーマを入手可能であることを理解するであろう。当該技術分野において周知の標準的な技術を使用して、クローン抗体の抗原結合ドメインを増幅、切断し、発現ベクターにライゲートし、適合宿主細胞にトランスフェクションしてから、タンパク質産生に用いてもよい。本明細書で開示する技術を使用して、単離した抗体を、カンプトテシンなどの治療薬にコンジュゲートしてもよい。

【0092】

キメラ抗体及びヒト化抗体
キメラ抗体とは、ヒト抗体の可変領域が、例えば、マウス抗体の可変領域（マウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む）で置換された組換えタンパク質のことである。キメラ抗体は、対象に投与する際、低い免疫原性及び高い安定性を示す。キメラ抗体の構築方法は当該技術分野において周知である（例えば、Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １３：４６９）。

【0093】

マウス免疫グロブリンの可変重鎖及び可変軽鎖由来のマウスＣＤＲを、ヒト抗体の対応する可変ドメインにトランスフェクションすることにより、キメラモノクローナル抗体をヒト化してもよい。キメラモノクローナル抗体のマウスフレームワーク領域（ＦＲ）もまた、ヒトＦＲ配列で置換する。ヒト化モノクローナルの安定性及び抗原特異性を保つために、１つまたは複数のヒトＦＲ残基を対応するマウス残基で置換してもよい。ヒト化モノクローナル抗体を対象の治療処置に使用してもよい。ヒト化モノクローナル抗体を作製するための技術は当該技術分野において周知である（例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８８，３３２：３２３；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５；Ｓａｎｄｈｕ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１９９２，１２：４３７；Ｔｅｍｐｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：２６６；Ｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．，１９９３，１５０：２８４４を参照のこと）。

【0094】

その他の実施形態は、非ヒト霊長類抗体に関係していてもよい。治療上有効な抗体をヒヒで産生するための一般的な技術については、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９１／１１４６５（１９９１）、及びｉｎ Ｌｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４６：３１０（１９９０）に見つけることができる。別の実施形態では、抗体は、ヒトモノクローナル抗体であってもよい。このような抗体は、以下に記載する抗原誘発で特定のヒト抗体を産生するように遺伝子操作されたトランスジェニックマウスから得ることができる。

【0095】

ヒト抗体
組み合わせアプローチ、またはヒト免疫グロブリン遺伝子座で形質転換したトランスジェニック動物のいずれかを用いて完全ヒト抗体を作製するための方法は、当技術分野において周知である（例えば、Ｍａｎｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｎｅｗ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２７：３１５－２８；Ｃｏｎｒａｄ ａｎｄ Ｓｃｈｅｌｌｅｒ，２００５，Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎ．８：１１７－２６；Ｂｒｅｋｋｅ ａｎｄ Ｌｏｓｅｔ，２００３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｍａｃｏｌ．３：５４４－５０）。このような完全ヒト抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体と比較して更に副作用が少なく、事実上の内因性ヒト抗体としてインビボで機能すると予想されている。特定の実施形態では、本願請求項に記載の方法及び手順を、このような技術により作製されたヒト抗体に利用してもよい。

【0096】

１つの代替実施形態では、ファージディスプレイ技術を用いてヒト抗体を作製してもよい（例えば、Ｄａｎｔａｓ－Ｂａｒｂｏｓａ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｇｅｎｅｔ．Ｍｏｌ．Ｒｅｓ．４：１２６－４０（参照として本明細書に組み込まれる））。正常なヒトから、または特定の疾患状態（例えば、がんなど）を示すヒトから、ヒト抗体を作製してもよい（Ｄａｎｔａｓ－Ｂａｒｂｏｓａ ｅｔ ａｌ．，２００５）。疾患個体からヒト抗体を構築する利点は、循環抗体レパートリーが、疾患関連抗原に対する抗体に偏り得ることである。

【0097】

この方法における１つの非限定例において、Ｄａｎｔａｓ－Ｂａｒｂｏｓａ ｅｔ ａｌ．（２００５）は、骨肉腫患者由来のヒトＦａｂ抗体フラグメントのファージディスプレイライブラリを構築した。一般的に、トータルＲＮＡは、循環血液中のリンパ球から得た（Ｉｄ．）。μ鎖、λ鎖及びκ鎖の抗体レパートリーから組換えＦａｂをクローニングして、ファージディスプレイライブラリに挿入した（Ｉｄ．）。ＲＮＡをｃＤＮＡに変換してから、重鎖及び軽鎖免疫グロブリン配列に特異的なプライマーを用いたＦａｂ ｃＤＮＡライブラリの作製に使用した（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－９７（参照として本明細書に組み込まれる））。ライブラリ構築は、Ａｎｄｒｉｓ－Ｗｉｄｈｏｐｆ ｅｔ ａｌ．（２０００，Ｉｎ：Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），１^ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ ｐｐ．９．１ ｔｏ ９．２２（参照として本明細書に組み込まれる））に従って実施した。最終Ｆａｂフラグメントを制限エンドヌクレアーゼで消化してから、バクテリオファージゲノムに挿入して、ファージディスプレイライブラリを作製した。標準的なファージディスプレイ法を用いて、このようなライブラリをスクリーニングしてもよい。当業者は、この技術は例示に過ぎず、ヒト抗体または抗体フラグメントをファージディスプレイで作製及びスクリーニングするための任意の周知の方法が利用可能であることを理解するであろう。

【0098】

別の代替実施形態では、ヒト抗体を産生するように遺伝子組換えされたトランスジェニック動物を用い、上記の標準的な免疫化プロトコルを使用して、事実上あらゆる免疫原性標的に対応する抗体を作製してもよい。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得るための方法については、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，がＮａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．７：１３ （１９９４）に、Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，がＮａｔｕｒｅ ３６８：８５６（１９９４）に、またＴａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，がＩｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９（１９９４）に記載している。このような方法の非限定例は、Ａｂｇｅｎｉｘ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）製のＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）（例えば、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：１１－２３（参照として本明細書に組み込まれる））であり、マウス抗体遺伝子を不活化して機能的ヒト抗体遺伝子で置換したもの（残りのマウス免疫機構はそのまま維持しつつ）である。

【0099】

トランスジェニックマウスを、ヒトＩｇＨ及びＩｇのκ遺伝子座の一部（大部分の可変領域配列に加え、アクセサリー遺伝子及び調節配列を含む）を含む、生殖細胞系を設計したＹＡＣ（酵母人工染色体）で形質転換した。ヒト可変領域レパートリーを用いて、Ｂ細胞を産生する抗体を作製してもよく、周知の技術を用いて、その抗体をハイブリドーマに導入してもよい。標的抗原で免疫したＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）は正常な免疫応答でヒト抗体を産生するが、上述した標準的な技術を用いて、そのヒト抗体を回収及び／または調製してもよい。遺伝子組換えマウスの様々な株が市販されており、そのそれぞれは、異なる種類の抗体を産生することができる。遺伝子組換えで作製されたヒト抗体は、正常ヒト抗体の薬物動態特性を維持しつつも、治療ポテンシャルを有することが示された（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。当業者は、本願請求項に記載の組成物及び方法がＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）系の使用に限定されず、ヒト抗体を産生するように遺伝子組換えされたあらゆるトランスジェニック動物が利用可能であることを理解するであろう。

【0100】

抗体フラグメントの作製
本願請求項に記載の方法及び／または組成物の一部の実施形態は、抗体フラグメントに関係していてもよい。このような抗体フラグメントは、例えば、通常の方法で完全抗体をペプシン消化またはパパイン消化することにより得ることができる。例えば、抗体をペプシンで酵素開裂させて抗体フラグメントを作製し、５Ｓフラグメント（Ｆ（ａｂ’）_２と表記する）を得てもよい。チオール還元剤、及び任意選択的に、ジスルフィド結合の開裂により生じたスルフヒドリル基用のブロック基を用いて、このフラグメントを更に開裂させて、３．５Ｓ Ｆａｂ’一価フラグメントを作製してもよい。あるいは、ペプシンを用いた酵素開裂により、２つの一価Ｆａｂフラグメント、及び１つのＦｃフラグメントを作製する。抗体フラグメントの例示的な作製方法は、米国特許番号４，０３６，９４５、米国特許番号４，３３１，６４７、Ｎｉｓｏｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９６０，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，８９：２３０；Ｐｏｒｔｅｒ，１９５９，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，７３：１１９；Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９６７，ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，ｐａｇｅ ４２２（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、及びＣｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），１９９１，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）に開示されている。

【0101】

インタクト抗体が認識する抗原にフラグメントが結合する限りにおいて、抗体を開裂させるためのその他の方法（例えば、重鎖を分離して一価の軽鎖－重鎖フラグメントを形成すること、フラグメントを更に開裂させること）、またはその他の酵素技術、化学技術または遺伝技術もまた使用してもよい。例えば、Ｆｖフラグメントは、Ｖ_Ｈ鎖とＶ_Ｌ鎖の連結部を含む。この連結部は、Ｉｎｂａｒ ｅｔ ａｌ．，１９７２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９：２６５９に記載のとおり、非共有結合であってもよい。あるいは、可変鎖同士は、分子間ジスルフィド結合で連結していてもよく、またはグルタルアルデヒドなどの化学物質で架橋していてもよい。Ｓａｎｄｈｕ，１９９２，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１２：４３７を参照のこと。

【0102】

Ｆｖフラグメントは、ペプチドリンカーで結合したＶ_Ｈ鎖及びＶ_Ｌ鎖を含んでいることが好ましい。これらの一本鎖抗原結合タンパク質（ｓｃＦｖ）は、オリゴヌクレオチドリンカー配列で連結したＶ_Ｈドメイン及びＶ_ＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することで作製される。構造遺伝子を発現ベクターに挿入してから、その発現ベクターをＥ．ｃｏｌｉなどの宿主細胞に導入する。組換え宿主細胞は、２つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドを有する１本のポリペプチド鎖を合成する。ｓｃＦｖの作製方法は、当該技術分野において周知である。Ｗｈｉｔｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２：９７；Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３；米国特許番号４，９４６，７７８；Ｐａｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１：１２７１、及びＳａｎｄｈｕ，１９９２，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１２：４３７を参照されたい。

【0103】

抗体フラグメントの別の形態は、一本鎖抗体と呼ばれることもある単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）である。単一ドメイン抗体を作製するための技術は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｃｏｓｓｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２００７，５１：２５３－５９；Ｓｈｕｎｔａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００６，４３：１９１２－１９；Ｔａｎｈａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１，２７６：２４７７４－７８０を参照のこと）。他の種類の抗体フラグメントは、１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでいてもよい。目的抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することにより、ＣＤＲペプチド（「最小認識ユニット」）を得ることができる。このような遺伝子は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成することにより作製する。Ｌａｒｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２：１０６；Ｒｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），１９９５，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ，ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＡＮＤ ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ，ｐａｇｅｓ １６６－１７９（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｂｉｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．），１９９５，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，ｐａｇｅｓ １３７－１８５（Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）を参照されたい。

【0104】

抗体バリエーション
特定の実施形態では、抗体の配列、例えば、抗体のＦｃ部分は、複合体の生理学的特性、例えば、血清中半減期などを最適化するために、変化させることができる。タンパク質のアミノ酸配列を置換するための方法、例えば、部位特異的突然変異誘発などは、当該技術分野において広く知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，２^ｎｄ Ｅｄ，１９８９）。好ましい実施形態では、バリエーションは、Ｆｃ配列内における１つまたは複数のグリコシル化部位の付加または除去を伴っていてもよい（例えば、米国特許番号６，２５４，８６８（その実施例セクションは参照として本明細書に組み込まれる））。その他の好ましい実施形態では、Ｆｃ配列内における特定のアミノ酸を置換してもよい（例えば、Ｈｏｒｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ ４１：３５５－６２；Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７６：３４６－５６；Ｐｅｔｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．２００６，Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８：１７５９－６９、米国特許番号７，２１７，７９７（それぞれは参照として本明細書に組み込まれる））。

【0105】

標的抗原及び例示的な抗体
好ましい実施形態では、標的細胞上に高レベルで発現する抗原、及び、正常組織と比較して疾患細胞上で圧倒的にまたは排他的に発現する抗原を認識する及び／またはそれら抗原に結合する抗体を使用する。より好ましくは、抗体は、結合後速やかに内部移行する。速やかに内部移行する例示的な抗体は、ＬＬ１（抗ＣＤ７４）抗体であり、その内在化速度は、約８ ｘ １０^６個の抗体分子／細胞／日である（例えば、Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３２０：２９３－３００）。それゆえ、「速やかに内部移行する」抗体は、約１ ｘ １０^６～約１ ｘ １０^７個の抗体分子／細胞／日の内在化速度を有する抗体であってもよい。本願請求項に記載の組成物及び方法に使用する抗体としては、上で列挙した特性を有するＭＡｂを挙げてもよい。例えば、がんの治療に使用する例示的な抗体としては、ＬＬ１（抗ＣＤ７４）、ＬＬ２またはＲＦＢ４（抗ＣＤ２２）、ベルツズマブ（ｈＡ２０、抗ＣＤ２０）、リツキシマブ（抗ＣＤ２０）、オビヌツズマブ（ＧＡ１０１、抗ＣＤ２０）、ランブロリズマブ（抗ＰＤ－１受容体）、ニボルマブ（抗ＰＤ－１受容体）、イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ－４）、ＲＳ７（抗上皮糖タンパク質－１（ＥＧＰ－１、Ｔｒｏｐ－２としても周知））、ＰＡＭ４またはＫＣ４（両方とも抗ムチン）、ＭＮ－１４（抗がん胎児性抗原（ＣＥＡ、ＣＤ６６ｅまたはＣＥＡＣＡＭ５としても周知））、ＭＮ－１５またはＭＮ－３（抗ＣＥＡＣＡＭ６）、Ｍｕ－９（抗結腸特異的抗原ｐ）、Ｉｍｍｕ ３１（抗α－フェトプロテイン）、Ｒ１（抗ＩＧＦ－１Ｒ）、Ａ１９（抗ＣＤ１９）、ＴＡＧ－７２（例えば、ＣＣ４９）、Ｔｎ、Ｊ５９１またはＨｕＪ５９１（抗ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原））、ＡＢ－ＰＧ１－ＸＧ１－０２６（抗ＰＳＭＡ二量体）、Ｄ２／Ｂ（抗ＰＳＭＡ）、Ｇ２５０（抗炭酸脱水酵素ＩＸ ＭＡｂ）、Ｌ２４３（抗ＨＬＡ－ＤＲ）、アレムツズマブ（抗ＣＤ５２）、ベバシズマブ（抗ＶＥＧＦ）、セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）、ゲムツズマブ（抗ＣＤ３３）、イブリツモマブチウキセタン（抗ＣＤ２０）、パニツムマブ（抗ＥＧＦＲ）、トシツモマブ（抗ＣＤ２０）、ＰＡＭ４（別名クリバツズマブ、抗ムチン）、及びトラスツズマブ（抗ＥｒｂＢ２）が挙げられるがこれらに限定されない。このような抗体は当技術分野において周知である（例えば、米国特許番号５，６８６，０７２、５，８７４，５４０、６，１０７，０９０、６，１８３，７４４、６，３０６，３９３、６，６５３，１０４、６，７３０．３００、６，８９９，８６４、６，９２６，８９３、６，９６２，７０２、７，０７４，４０３、７，２３０，０８４、７，２３８，７８５、７，２３８，７８６、７，２５６，００４、７，２８２，５６７、７，３００，６５５、７，３１２，３１８、７，５８５，４９１、７，６１２，１８０、７，６４２，２３９、及び、米国特許出願公開番号２００５０２７１６７１、２００６０１９３８６５、２００６０２１０４７５、２００７００８７００１（それぞれの実施例セクションは参照として本明細書に組み込まれる））。使用される特に周知の抗体としては、ｈＰＡＭ４（米国特許番号７，２８２，５６７）、ｈＡ２０（米国特許番号７，２５１，１６４）、ｈＡ１９（米国特許番号７，１０９，３０４）、ｈＩＭＭＵ－３１（米国特許番号７，３００，６５５）、ｈＬＬ１（米国特許番号７，３１２，３１８）、ｈＬＬ２（米国特許番号７，０７４，４０３）、ｈＭｕ－９（米国特許番号７，３８７，７７３）、ｈＬ２４３（米国特許番号７，６１２，１８０）、ｈＭＮ－１４（米国特許番号６，６７６，９２４）、ｈＭＮ－１５（米国特許番号７，５４１，４４０）、ｈＲ１（米国特許出願１２／７７２，６４５）、ｈＲＳ７（米国特許番号７，２３８，７８５）、ｈＭＮ－３（米国特許番号７，５４１，４４０）、ＡＢ－ＰＧ１－ＸＧ１－０２６（米国特許出願１１／９８３，３７２、ＡＴＣＣ ＰＴＡ－４４０５及びＰＴＡ－４４０６として寄託）、及びＤ２／Ｂ（ＷＯ２００９／１３０５７５）が挙げられる（列挙した特許または特許出願におけるそれぞれの本文（図面セクション及び実施例セクションに対応）は、参照として本明細書に組み込まれる）。特に好ましい実施形態では、抗体はｈＲＳ７である。当業者であれば、特定の実施形態において、その他ＴＡＡに対する抗体（Ｔｒｏｐ－２を除く）を抗Ｔｒｏｐ－２抗体と組み合わせて使用してもよいということを理解するであろう。

【0106】

標的となり得るその他の有用な抗原としては、炭酸脱水酵素ＩＸ、Ｂ７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＳＡｐ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＢｒＥ３、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０（例えば、Ｃ２Ｂ８、ｈＡ２０、１Ｆ５ ＭＡｂ）、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＴＬＡ－４、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＶＥＧＦ（例えば、ベバシズマブ、フィブロネクチンスプライスバリアント）、ＥＤ－Ｂフィブロネクチン（例えば、Ｌ１９）、ＥＧＰ－１（Ｔｒｏｐ－２）、ＥＧＰ－２（例えば、１７－１Ａ）、ＥＧＦ受容体（ＥｒｂＢ１）（例えば、セツキシマブ）、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、Ｈ因子、ＦＨＬ－１、Ｆｌｔ－３、葉酸受容体、Ｇａ ７３３、ＧＲＯ－β、ＨＭＧＢ－１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、ＨＭ１．２４、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、インスリン様成長因子（ＩＬＧＦ）、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－λ、ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－４Ｒ、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－１３Ｒ、ＩＬ－１５Ｒ、ＩＬ－１７Ｒ、ＩＬ－１８Ｒ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２５、ＩＰ－１０、ＩＧＦ－１Ｒ、Ｉａ、ＨＭ１．２４、ガングリオシド、ＨＣＧ、Ｌ２４３が結合するＨＬＡ－ＤＲ抗原、ＣＤ６６抗原、すなわち、ＣＤ６６ａ～ｄまたはこれらの組み合わせ、ＭＡＧＥ、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１Ａ、ＭＩＰ－１Ｂ、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ａｃ、胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）、ＰＳＭＡ、ＰＡＭ４抗原、ＰＤ－１受容体、ＮＣＡ－９５、ＮＣＡ－９０、Ａ３、Ａ３３、Ｅｐ－ＣＡＭ、ＫＳ－１、Ｌｅ（ｙ）、メソテリン、Ｓ１００、テネイシン、ＴＡＣ、Ｔｎ抗原、Ｔｈｏｍａｓ－Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、腫瘍血管新生抗原、ＴＮＦ－α、ＴＲＡＩＬ受容体（Ｒ１及びＲ２）、ＴＲＯＰ－２、ＶＥＧＦＲ、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、及びがん幹細胞抗原、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５、ならびにがん遺伝子産物が挙げられる。

【0107】

悪性造血細胞上の好適な抗原（Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ、すなわち、ＣＤ）標的の包括的解析（フローサイトメトリーにみられ、薬物複合体による免疫療法用の好適な抗体を選択する際のガイドとなり得る）については、Ｃｒａｉｇ ａｎｄ ＦｏｏｎのＢｌｏｏｄ（２００８年１月１５日にオンラインで先に公開）、ＤＯＬ １０．１１８２／ｂｌｏｏｄ－２００７－１１－１２０５３５に記載されている。

【0108】

ＣＤ６６抗原は、類似構造を有する５つの異なる糖タンパク質、ＣＤ６６ａ～ｅ（がん胎児性抗原（ＣＥＡ）遺伝子ファミリーメンバーのＢＣＧ、ＣＧＭ６、ＮＣＡ、ＣＧＭ１及びＣＥＡがそれぞれコードする）からなる。これらのＣＤ６６抗原（例えば、ＣＥＡＣＡＭ６）は主に、顆粒球、消化管の正常上皮細胞、及び様々な組織の腫瘍細胞において発現している。好適ながんの標的としてはまた、がん精巣抗原、例えば、ＮＹ－ＥＳＯ－１（Ｔｈｅｕｒｉｌｌａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２００７；１２０（１１）：２４１１－７）などに加え、骨髄性白血病におけるＣＤ７９ａ（Ｋｏｚｌｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔ．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．２００５；１６３（１）：６２－７）、また、Ｂ細胞疾患、及び非ホジキンリンパ腫におけるＣＤ７９ｂ（Ｐｏｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１０（２）：６１６－６２３）が挙げられる。上記抗原の多くは、２００２年１１月１５日出願、「Ｕｓｅ ｏｆ Ｍｕｌｔｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ，Ｎｏｎ－ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」と題された米国仮出願シリアル番号６０／４２６，３７９に開示されている。より治療に耐性を示す前駆体悪性細胞集団と考えられているがん幹細胞（Ｈｉｌｌ ａｎｄ Ｐｅｒｒｉｓ，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．２００７；９９：１４３５－４０）は、特定のがんタイプ、例えば、前立腺癌のＣＤ１３３（Ｍａｉｔｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｅｒｎｓｔ Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐｏｓ．Ｐｒｏｃ．２００６；５：１５５－７９）、非小細胞肺癌（Ｄｏｎｎｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ２００７；１２２（３）：３８５－９１）、膠芽腫（Ｂｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００７；６７（９）：４０１０－５）、結腸直腸癌のＣＤ４４（Ｄａｌｅｒｂａ ｅｒ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００７；１０４（２４）１０１５８－６３）、膵臓癌（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００７；６７（３）：１０３０－７）、及び頭頸部扁平上皮細胞癌（Ｐｒｉｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００７；１０４（３）９７３－８）などにおいて、標的となり得る抗原を有している。乳癌治療のための別の有用な標的は、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２００３；３７５：５１－９）が記載するＬＩＶ－１抗原である。ＣＤ４７抗原は、がん幹細胞における更に有用な標的である（例えば、Ｎａｕｊｏｋａｔ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ６：２９０－３０８；Ｇｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ５０：１８３６－４６；Ｕｎａｎｕｅ，２０１３，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１０：１０８８６－７を参照のこと）。

【0109】

多発性骨髄腫治療用の、それぞれの抗原に対する好適な標的化抗体は、例えば、ＣＤ３８及びＣＤ１３８（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｍｏｌ Ｍｅｄ ２００６；１２（１１－１２）：３４５－３４６；Ｔａｓｓｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２００４；１０４（１２）：３６８８－９６）、ＣＤ７４（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，ｉｂｉｄ．）、ＣＳ１（Ｔａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２００８；１１２（４）：１３２９－３７）、及びＣＤ４０（Ｔａｉ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６５（１３）：５８９８－５９０６）に記載されている。

【0110】

マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）は、自然免疫及び適応免疫ならびにアポトーシスの重要な調節因子である。ＣＤ７４がＭＩＦの内因性受容体であるという報告がある（Ｌｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９７：１４６７－７６）。ＭＩＦが介在する細胞内経路における拮抗的な抗ＣＤ７４抗体の治療効果は、広範囲の疾患状態、例えば、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、肺癌、結腸癌及び慢性リンパ性白血病（例えば、Ｍｅｙｅｒ－Ｓｉｅｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４，ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ １２：３４；Ｓｈａｃｈａｒ ＆ Ｈａｒａｎ，２０１１，Ｌｅｕｋ Ｌｙｍｐｈｏｍａ ５２：１４４６－５４）、関節リウマチ及び全身性エリテマトーデスなどの自己免疫疾患（Ｍｏｒａｎｄ ＆ Ｌｅｅｃｈ，２００５，Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ １０：１２－２２；Ｓｈａｃｈａｒ ＆ Ｈａｒａｎ，２０１１，Ｌｅｕｋ Ｌｙｍｐｈｏｍａ ５２：１４４６－５４）、腎臓同種移植片拒絶反応などの腎疾患（Ｌａｎ，２００８，Ｎｅｐｈｒｏｎ Ｅｘｐ Ｎｅｐｈｒｏｌ．１０９：ｅ７９－８３）、及び数多くの炎症性疾患（Ｍｅｙｅｒ－Ｓｉｅｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ Ｉｎｆｌａｍｍ ｅｐｕｂ Ｍａｒｃｈ ２２，２００９；Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｒｅｓｐｉｒ Ｒｅｓ １０：３３）などの治療に利用されてもよい。ミラツズマブ（ｈＬＬ１）は、ＭＩＦ介在性疾患を治療するために使用する例示的な治療用抗ＣＤ７４抗体である。

【0111】

抗ＴＮＦ－α抗体は当技術分野において周知であり、免疫疾患、例えば、自己免疫疾患、免疫機能障害（例えば、移植片対宿主拒絶反応、臓器移植拒絶反応）など、または糖尿病を治療するために使用されてもよい。ＴＮＦ－αに対する周知の抗体としては、ヒト抗体ＣＤＰ５７１（Ｏｆｅｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４５：８８１－８５）、マウス抗体ＭＴＮＦＡＩ、Ｍ２ＴＮＦＡＩ、Ｍ３ＴＮＦＡＩ、Ｍ３ＴＮＦＡＢＩ、Ｍ３０２Ｂ及びＭ３０３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、インフリキシマブ（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ）、セルトリズマブペゴル（ＵＣＢ，Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）、及びアダリムマブ（Ａｂｂｏｔｔ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）が挙げられる。これら及び多くのその他周知の抗ＴＮＦ－α抗体を、本願請求項に記載の方法及び組成物に使用してもよい。免疫調節不全疾患または自己免疫疾患の治療に使用するその他の抗体としては、抗Ｂ細胞抗体、例えば、ベルツズマブ、エプラツズマブ、ミラツズマブまたはｈＬ２４３、トシリズマブ（抗ＩＬ－６受容体）、バシリキシマブ（抗ＣＤ２５）、ダクリズマブ（抗ＣＤ２５）、エファリズマブ（抗ＣＤ１１ａ）、ムロモナブ－ＣＤ３（抗ＣＤ３受容体）、抗ＣＤ４０Ｌ（ＵＣＢ，Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）、ナタリズマブ（抗α４インテグリン）、及びオマリズマブ（抗ＩｇＥ）などが挙げられるがこれらに限定されない。

【0112】

別の好ましい実施形態では、速やかに内部移行してから再発現し、処理され、細胞表面に提示され、細胞による循環複合体の連続的な吸着及び付着を可能とする抗体を使用する。最も好ましい抗体／抗原ペアの一例は、ＬＬ１、抗ＣＤ７４ ＭＡｂ（不変鎖、クラスＩＩ特異的シャペロン、Ｉｉ）である（例えば、米国特許番号６，６５３，１０４、７，３１２，３１８を参照のこと（それぞれの実施例セクションは参照として本明細書に組み込まれる））。ＣＤ７４抗原は、Ｂ細胞リンパ腫（多発性骨髄腫を含む）及び白血病、特定のＴ細胞リンパ腫、黒色腫、結腸癌、肺癌及び腎臓癌、膠芽腫、ならびに特定のその他のがんにおいて高発現している（Ｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９８：２９６－３０２（１９９９））。がんにおけるＣＤ７４抗体使用のレビューは、Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００７ Ｓｅｐ １５；１３（１８ Ｐｔ ２）：５５５６ｓ－５５６３ｓ（参照として本明細書に組み込まれる）に含まれている。

【0113】

抗ＣＤ７４抗体を用いて治療することが好ましい疾患としては、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、黒色腫、肺癌、腎臓癌、結腸癌、多形膠芽腫、組織球腫、骨髄性白血病及び多発性骨髄腫が挙げられるがこれらに限定されない。標的細胞表面上におけるＣＤ７４抗原の短期間継続発現に続いて、抗原の内在化、抗原の再発現により、標的化ＬＬ１抗体が、自身が運ぶ任意の化学療法剤部分と共に内部移行することが可能となる。これにより、高濃度かつ治療濃度のＬＬ１－化学療法剤複合体がこのような細胞の内部に蓄積することが可能となる。内部移行したＬＬ１－化学療法剤複合体はリソソーム及びエンドソームを介して循環し、化学療法剤部分は標的細胞内部に活性状態で放出される。

【0114】

二重特異性抗体及び多重特異性抗体
二重特異性抗体は、多数の生物医学用途において有用である。例えば、腫瘍細胞表面抗原及びＴ細胞表面受容体に対する結合部位を有する二重特異性抗体は、Ｔ細胞による特定腫瘍細胞の溶解を誘導することができる。神経膠腫及びＴ細胞上のＣＤ３エピトープを認識する二重特異性抗体は、ヒト患者における脳腫瘍の治療に成功裏に用いられている（Ｎｉｔｔａ，ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ．１９９０；３５５：３６８－３７１）。好ましい二重特異性抗体は、抗ＣＤ３ Ｘ 抗ＣＤ１９抗体である。代替実施形態では、抗ＣＤ３抗体またはそのフラグメントを、別のＢ細胞関連抗原に対する抗体またはフラグメント、例えば、抗ＣＤ３ Ｘ 抗Ｔｒｏｐ－２、抗ＣＤ３ Ｘ 抗ＣＤ２０、抗ＣＤ３ Ｘ 抗ＣＤ２２、抗ＣＤ３ Ｘ 抗ＨＬＡ－ＤＲ、または抗ＣＤ３ Ｘ 抗ＣＤ７４などに結合してもよい。特定の実施形態では、本明細書で開示するＡＤＣ治療のための技術及び組成物を、二重特異性抗体または多重特異性抗体と組み合わせて使用してもよい。例えば、抗Ｔｒｏｐ－２ ｘ 抗ＣＤ３ ｂｓＡｂを、抗Ｔｒｏｐ－２ ＡＤＣの投与前に、それと同時に、またはその投与後に投与してもよい。

【0115】

二重特異性抗体または多重特異性抗体を作製するための数多くの方法が周知であり、例えば、米国特許番号７，４０５，３２０に開示されている（その実施例セクションは参照として本明細書に組み込まれる）。二重特異性抗体は、別々の抗原部位を認識するモノクローナル抗体をそれぞれが産生する２種類の異なるハイブリドーマを融合することを含む、クアドローマ法を用いて作製可能である（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ，１９８３；３０５：５３７－５４０）。

【0116】

二重特異性抗体を作製するための別の方法においては、２種類の異なるモノクローナル抗体を化学的につなぐためのヘテロ二官能性のクロスリンカーを使用する（Ｓｔａｅｒｚ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，１９８５；３１４：６２８－６３１；Ｐｅｒｅｚ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，１９８５；３１６：３５４－３５６）。二重特異性抗体はまた、２種類の親モノクローナル抗体のぞれぞれを対応する半分子へと還元してから、混合、再酸化してハイブリッド構造を得ることにより作製可能である（Ｓｔａｅｒｚ ａｎｄ Ｂｅｖａｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９８６；８３：１４５３－１４５７）。別の代替方法は、個々に精製した２種類または３種類のＦａｂ’フラグメントを、適切なリンカーを用いて化学的に架橋することを含む（例えば、欧州特許出願０４５３０８２を参照のこと）。

【0117】

その他の方法としては、レトロウイルス由来のシャトルベクターを対応する親ハイブリドーマに導入してから融合させることで異なる選択マーカーを遺伝子導入することにより、ハイブリッドハイブリドーマの作製効率を向上させること（ＤｅＭｏｎｔｅ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９９０，８７：２９４１－２９４５）、または、ハイブリドーマ細胞株に、別の抗体の重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子を含む発現プラスミドをトランスフェクションすることが挙げられる。

【0118】

同じ性質のＶ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインを、適切な組成及び長さ（通常は、１２超のアミノ酸残基からなる）のペプチドリンカーで結合させて、結合活性を有する一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を形成することができる。ｓｃＦｖの製造方法については、米国特許番号４，９４６，７７８及び米国特許番号５，１３２，４０５に開示されている（それぞれの特許の実施例セクションは参照として本明細書に組み込まれる）。ペプチドリンカー長を１２アミノ酸残基未満にまで短くすることで、同一鎖上におけるＶ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインのペアリングを防止して、別の鎖上に相補的なドメインを有するＶ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインのペアリングを強制することにより、機能的多量体を形成させる。３～１２アミノ酸残基のリンカーで結合したＶ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインのポリペプチド鎖は、主に二量体（ディアボディと呼ばれる）を形成する。０～２アミノ酸残基のリンカーを有する三量体（トリアボディと呼ばれる）及び四量体（テトラボディと呼ばれる）が好都合であるが、厳密なオリゴマー形成パターンは、組成、Ｖドメインの配向（Ｖ_Ｈ－リンカーＶ_Ｌ、またはＶ_Ｌ－リンカー－Ｖ_Ｈ）に加え、リンカー長によって決まるようである。

【0119】

多重特異性抗体または二重特異性抗体を作製するためのこれらの技術は、これら技術における低収率性、精製の必要性、低安定性、または労働集約性に関する様々な問題を呈している。ごく最近では、抗体と、抗体フラグメントとその他エフェクター分子の事実上のあらゆる所望の組み合わせを作製するために、「ｄｏｃｋ ａｎｄ ｌｏｃｋ」（ＤＮＬ）として周知の技術が利用されている（例えば、米国特許番号７，５２１，０５６、７，５２７，７８７、７，５３４，８６６、７，５５０，１４３、７，６６６，４００、７，８５８，０７０、７，８７１，６２２、７，９０６，１２１、７，９０６，１１８、８，１６３，２９１、７，９０１，６８０、７，９８１，３９８、８，００３，１１１及び８，０３４，３５２を参照のこと（それぞれの特許の実施例セクションは参照として本明細書に組み込まれる））。この技術は、アンカードメイン（ＡＤ）、及び二量化及びドッキングドメイン（ＤＤＤ）と呼ばれる相補的なタンパク質結合ドメインを利用しており、それらは、互いに結合して、二量体、三量体、四量体、五量体及び六量体の範囲の複合体構造がアセンブリされる。これらは、大規模な精製を必要とせずに高収率で安定した複合体を形成する。ＤＮＬ技術により、単特異性抗体、二重特異性抗体または多重特異性抗体のアセンブリが可能となる。本願請求項に記載の方法を実施するにあたり、二重特異性抗体または多重特異性抗体を作製するための当該技術分野において周知の技術のいずれかを利用してもよい。

【0120】

様々な実施形態において、本明細書で開示する複合体は、複合の多重特異性抗体の一部であってもよい。このような抗体は、異なる特異性を有する２つまたはそれ以上の異なる抗原結合部位を含んでいてもよい。多重特異性複合体は、同一抗原上の別々のエピトープに結合してもよく、あるいは、２つの異なる抗原に結合してもよい。

【0121】

ＤＯＣＫ－ＡＮＤ－ＬＯＣＫ（商標）（ＤＮＬ（登録商標））
好ましい実施形態では、二価抗体または多価抗体は、ＤＯＣＫ－ＡＮＤ－ＬＯＣＫ（登録商標）（ＤＮＬ（登録商標））複合体として形成される（例えば、米国特許番号７，５２１，０５６、７，５２７，７８７、７，５３４，８６６、７，５５０，１４３、７，６６６，４００、７，８５８，０７０、７，８７１，６２２、７，９０６，１２１、７，９０６，１１８、８，１６３，２９１、７，９０１，６８０、７，９８１，３９８、８，００３，１１１及び８，０３４，３５２を参照のこと（それぞれの特許の実施例セクションは参照として本明細書に組み込まれる））。一般的に、この技術は、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）の調節（Ｒ）サブユニットの二量化及びドッキングドメイン（ＤＤＤ）配列と、様々なＡＫＡＰタンパク質のいずれかに由来するアンカードメイン（ＡＤ）配列の間に生じる特異的かつ高親和性の結合相互作用を利用している（Ｂａｉｌｌｉｅ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ．２００５；５７９：３２６４．Ｗｏｎｇ ａｎｄ Ｓｃｏｔｔ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００４；５：９５９）。ＤＤＤペプチド及びＡＤペプチドを、任意のタンパク質、ペプチドまたはその他の分子に結合させてもよい。ＤＤＤ配列が自発的に二量化してＡＤ配列に結合するため、この技術は、ＤＤＤ配列またはＡＤ配列に結合し得る任意の選択分子間の複合体形成を可能とする。

【0122】

標準的なＤＮＬ（登録商標）複合体は、２つのＤＤＤ結合分子が１つのＡＤ結合分子に結合した三量体を含んでいるが、複合体構造のバリエーションとしては、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体及びその他多量体の形成が可能である。一部の実施形態では、ＤＮＬ（登録商標）複合体は、同一抗原決定基、または２つまたはそれ以上の異なる抗原に結合する、２つまたはそれ以上の抗体、抗体フラグメントまたは融合タンパク質を含んでいてもよい。ＤＮＬ（登録商標）複合体はまた、１つまたは複数のその他エフェクター、例えば、タンパク質、ペプチド、免疫調節薬、サイトカイン、インターロイキン、インターフェロン、結合タンパク質、ペプチドリガンド、キャリアタンパク質、毒素、リボヌクレアーゼ（オンコナーゼなど）、阻害性オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡなど）、抗原または異種抗原、ポリマー（ＰＥＧなど）、酵素、治療薬、ホルモン、細胞傷害薬、抗血管新生薬、プロアポトーシス薬、または任意のその他の分子または凝集体などを含んでいてもよい。

【0123】

ＰＫＡ（ＲサブユニットへのセカンドメッセンジャーｃＡＭＰの結合が誘発する、最も研究されたシグナル伝達経路の１つにおいて中心的な役割を果たす）は、１９６８年（Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９６８；２４３：３７６３）、ウサギ骨格筋から初めて単離された。ホロ酵素の構造は、Ｒサブユニットにより不活性化状態に維持された２つの触媒サブユニットから構成されている（Ｔａｙｌｏｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８９；２６４：８４４３）。ＰＫＡのアイソザイムは２タイプのＲサブユニット（ＲＩ及びＲＩＩ）を有していることが発見されており、それぞれのタイプは、αアイソフォーム及びβアイソフォームを有している（Ｓｃｏｔｔ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．１９９１；５０：１２３）。それゆえ、ＰＫＡ調節サブユニットの４つのアイソフォームは、ＲＩα、ＲＩβ、ＲＩＩα及びＲＩＩβである。Ｒサブユニットは安定二量体としてのみ単離されており、二量体化ドメインは、ＲＩＩαの最初の４４アミノ末端残基から構成されていることが示されている（Ｎｅｗｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１９９９；６：２２２）。以下で説明するが、その他の調節サブユニットにおけるアミノ酸配列の類似部分は、二量化及びドッキングに関与しており、類似部分のそれぞれは、調節サブユニットのＮ末端付近に位置している。ｃＡＭＰがＲサブユニットに結合することにより、広域スペクトルのセリン／スレオニンキナーゼ活性を有する活性触媒サブユニットが遊離するが、その活性触媒サブユニットは、ＰＫＡがＡＫＡＰとドッキングしてＰＫＡが区画化されることにより、選択基質側に向く（Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９０；２６５；２１５６１）。

【0124】

最初のＡＫＡＰ、微小管結合タンパク質２が１９８４年に特性決定されてから（Ｌｏｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９８４；８１：６７２３）、様々な細胞内部位（原形質膜、アクチン細胞骨格、核、ミトコンドリア及び小胞体を含む）に局在する５０超のＡＫＡＰが、酵母菌からヒトにわたる範囲の種における多種多様な構造において同定されている（Ｗｏｎｇ ａｎｄ Ｓｃｏｔｔ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００４；５：９５９）。ＡＫＡＰのＰＫＡ用ＡＤは、１４～１８残基の両親媒性ヘリックスである（Ｃａｒｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１；２６６：１４１８８）。ＡＤのアミノ酸配列は個々のＡＫＡＰで実に多様であり、ＲＩＩ二量体の結合親和性は２～９０ｎＭの範囲と報告されている（Ａｌｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００３；１００：４４４５）。ＡＫＡＰは、二量体Ｒサブユニットにのみ結合する。ヒトＲＩＩαにおいて、ＡＤは、２３アミノ末端残基で形成された疎水性表面に結合する（Ｃｏｌｌｅｄｇｅ ａｎｄ Ｓｃｏｔｔ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９９；６：２１６）。それゆえ、ヒトＲＩＩαの二量体化ドメイン及びＡＫＡＰ結合ドメインは両方とも、同一のＮ末端４４アミノ酸配列の内部に位置しており（Ｎｅｗｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１９９９；６：２２２；Ｎｅｗｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．２００１；２０：１６５１）、本明細書では、それをＤＤＤと呼ぶ。

【0125】

本発明者らは、ヒトＰＫＡ調節サブユニットのＤＤＤ及びＡＫＡＰのＡＤを、任意の２つの要素（以後、Ａ及びＢと呼ぶ）をドッキングさせて非共有結合複合体（その非共有結合複合体は、ＤＤＤとＡＤの両方における戦略的部位にシステイン残基を導入してジスルフィド結合の形成を促進させることにより、更にＤＮＬ（商標）複合体へとロック可能）とするための、優れた一対のリンカーモジュールとして利用したプラットフォーム技術を開発した。このアプローチの一般的な方法は以下のとおりである。ＤＤＤ配列をＡの前駆体に結合させることにより要素Ａを構築するが、要素Ａは第１の構成要素（以後、ａと呼ぶ）となる。ＤＤＤ配列が自発的な二量体形成に影響を与えるため、Ａはａ_２で構成されることになる。ＡＤ配列をＢの前駆体に結合させることにより要素Ｂを構築するが、要素Ｂは第２の構成要素（以後、ｂと呼ぶ）となる。ａ_２に含まれるＤＤＤの二量体モチーフは、ｂに含まれるＡＤ配列に結合するためのドッキング部位を生成するため、ａ_２とｂの速やかな会合を促進し、ａ_２ｂで構成される２成分の三量体複合体を形成する。この結合イベントは、２つの要素をジスルフィド架橋を介して共有結合で固定する後続反応を伴い不可逆的に起こる。この結合イベントは、有効局所濃度の原理に基づいて極めて効率的に生じる。なぜなら、初期の結合相互作用により、ＤＤＤとＡＤの両方に配置された反応性チオール基が近接して（Ｃｈｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００１；９８：８４８０）部位特異的にライゲートするはずであるからである。リンカー、アダプターモジュール及び前駆体の様々な組み合わせを使用して、化学量論的に異なる多種多様なＤＮＬ（商標）構造物を調製及び使用してもよい（例えば、米国番号７，５５０，１４３、７，５２１，０５６、７，５３４，８６６、７，５２７，７８７及び７，６６６，４００を参照のこと）。

【0126】

２つの前駆体の官能基から離れたＤＤＤとＡＤを結合させることにより、このような部位特異的ライゲーションにおいてもまた、２つの前駆体の元の活性を保持することが予想される。このアプローチは本質的にモジュール式であり、幅広い物質（ペプチド、タンパク質、抗体、抗体フラグメント、及びその他のエフェクター部分を含む）を、部位特異的及び共有結合で幅広い活性物質と結合させるのに適用可能である。ＡＤ及びＤＤＤがコンジュゲートしたエフェクターを構築する融合タンパク質法（以下の実施例に記載）を利用することにより、事実上のあらゆるタンパク質またはペプチドをＤＮＬ（登録商標）構築物に導入することができる。しかしながら、この技術に限定せず、その他のコンジュゲート方法を利用してもよい。

【0127】

目的の融合タンパク質をコードする合成二本鎖核酸を調製するための核酸合成、ハイブリダイゼーション及び／または増幅を含む、融合タンパク質を調製するための様々な方法が知られている。このような二本鎖核酸を、標準的な分子生物学的手法を用いて、融合タンパク質産生用の発現ベクターに挿入してもよい（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，２^ｎｄ Ｅｄ，１９８９を参照のこと）。このような好ましい実施形態では、ＡＤ部分及び／またはＤＤＤ部分を、エフェクタータンパク質またはエフェクターペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかに結合させてもよい。しかしながら、ＡＤ部分またはＤＤＤ部分のエフェクター部分への結合部位が、その生理学的活性に関与するエフェクター部分及びエフェクター部分の部位（複数可）の化学的性質に応じて変化し得るということを、当業者は理解するであろう。二価架橋試薬及び／またはその他の化学的コンジュゲート技術などの当該技術分野において周知の技術を使用して、様々なエフェクター部分の部位特異的結合を実施してもよい。

【0128】

様々な実施形態では、以下で詳細に記載するように、例えば、ＤＤＤ部分またはＡＤ部分を抗体重鎖のＣ末端に結合させることにより、抗体または抗体フラグメントをＤＮＬ（商標）複合体に導入してもよい。より好ましい実施形態では、ＤＤＤ部分またはＡＤ部分、より好ましくはＡＤ部分を、抗体軽鎖のＣ末端に結合してもよい（例えば、２０１３年５月２４日出願の米国特許出願シリアル番号１３／９０１，７３７を参照のこと（その実施例セクションは参照として本明細書に組み込まれる））。

【0129】

ＡＤ部分及びＤＤＤ部分における構造と機能の関係
異なるタイプのＤＮＬ（商標）構築物には、異なるＡＤ配列またはＤＤＤ配列を利用してもよい。例示的なＤＤＤ配列及びＡＤ配列を以下に示す。
ＤＤＤ１
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号：７）
ＤＤＤ２
ＣＧＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号：８）
ＡＤ１
ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号：９）
ＡＤ２
ＣＧＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡＧＣ（配列番号：１０）

【0130】

ＤＤＤ１及びＤＤＤ２がプロテインキナーゼＡのヒトＲＩＩαアイソフォームにおけるＤＤＤ配列をベースとしていることを、当業者は理解するであろう。しかしながら、代替実施形態では、ＤＤＤ部分及びＡＤ部分は、プロテインキナーゼＡのヒトＲＩαフォームにおけるＤＤＤ配列、及び以下でＤＤＤ３、ＤＤＤ３Ｃ及びＡＤ３と例示する対応するＡＫＡＰ配列をベースとしていてもよい。
ＤＤＤ３
ＳＬＲＥＣＥＬＹＶＱＫＨＮＩＱＡＬＬＫＤＳＩＶＱＬＣＴＡＲＰＥＲＰＭＡＦＬＲＥＹＦＥＲＬＥＫＥＥＡＫ（配列番号：１１）
ＤＤＤ３Ｃ
ＭＳＣＧＧＳＬＲＥＣＥＬＹＶＱＫＨＮＩＱＡＬＬＫＤＳＩＶＱＬＣＴＡＲＰＥＲＰＭＡＦＬＲＥＹＦＥＲＬＥＫＥＥＡＫ（配列番号：１２）
ＡＤ３
ＣＧＦＥＥＬＡＷＫＩＡＫＭＩＷＳＤＶＦＱＱＧＣ（配列番号：１３）

【0131】

その他の代替実施形態では、ＡＤ部分及び／またはＤＤＤ部分のその他の配列変異体をＤＮＬ（登録商標）複合体の構築に利用してもよい。例えば、ヒトＰＫＡ ＤＤＤ配列の４つの変異体のみが存在し、ＰＫＡ ＲＩα、ＲＩＩα、ＲＩβ及びＲＩＩβのＤＤＤ部分に対応している。ＲＩＩα ＤＤＤ配列は、上で開示したＤＤＤ１及びＤＤＤ２をベースとしている。４つのヒトＰＫＡ ＤＤＤ配列を以下に示す。ＤＤＤ配列は、ＲＩＩαの残基１～４４、ＲＩＩβの残基１～４４、ＲＩαの１２～６１残基、及びＲＩβの１３～６６残基を表している（ＤＤＤ１の配列が、ヒトＰＫＡ ＲＩＩα ＤＤＤ部分からわずかに修飾されていることに留意されたい）。
ＰＫＡ ＲＩα
ＳＬＲＥＣＥＬＹＶＱＫＨＮＩＱＡＬＬＫＤＶＳＩＶＱＬＣＴＡＲＰＥＲＰＭＡＦＬＲＥＹＦＥＫＬＥＫＥＥＡＫ（配列番号：１４）
ＰＫＡ ＲＩβ
ＳＬＫＧＣＥＬＹＶＱＬＨＧＩＱＱＶＬＫＤＣＩＶＨＬＣＩＳＫＰＥＲＰＭＫＦＬＲＥＨＦＥＫＬＥＫＥＥＮＲＱＩＬＡ（配列番号：１５）
ＰＫＡ ＲＩＩα
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＧＱＱＰＰＤＬＶＤＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＲＱ（配列番号：１６）
ＰＫＡ ＲＩＩβ
ＳＩＥＩＰＡＧＬＴＥＬＬＱＧＦＴＶＥＶＬＲＨＱＰＡＤＬＬＥＦＡＬＱＨＦＴＲＬＱＱＥＮＥＲ（配列番号：１７）

【0132】

ＡＤドメイン及びＤＤＤドメインにおける構造と機能の関係が調査の対象である（例えば、Ｂｕｒｎｓ－Ｈａｍｕｒｏ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ １４：２９８２－９２；Ｃａｒｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：１７３３２－３８；Ａｌｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １００：４４４５－５０；Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３９６：２９７－３０６；Ｓｔｏｋｋａ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ４００：４９３－９９；Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ２４：３８３－９５；Ｋｉｎｄｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ２４：３９７－４０８を参照のこと（それぞれの文献の全文は参照として本明細書に組み込まれる））。

【0133】

抗体アロタイプ
治療抗体の免疫原性は、インフュージョンリアクションリスクの増加、及び治療効果期間の短縮に関係している（Ｂａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４８：６０２－０８）。治療抗体が宿主内の免疫応答を誘導する程度は、抗体のアロタイプにより部分的に測定することができる（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １２：２１３－２１）。抗体アロタイプは、抗体の定常領域配列の特定位置におけるアミノ酸配列バリエーションに関係している。重鎖γ型定常領域を含むＩｇＧ抗体のアロタイプは、Ｇｍアロタイプとして設計された（１９７６，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１７：１０５６－５９）。

【0134】

一般的なＩｇＧ１ヒト抗体において、最も一般的なアロタイプはＧ１ｍ１である（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １２：２１３－２１）。しかしながら、Ｇ１ｍ３アロタイプはまた、白人において頻繁に発生している（Ｉｄ．）。非Ｇ１ｍ１（ｎＧ１ｍ１）レシピエント、例えば、Ｇ１ｍ３患者などに投与する際、Ｇ１ｍ１抗体が免疫応答を誘導する傾向のあるアロタイプ配列を含んでいることが報告されている（Ｉｄ．）。非Ｇ１ｍ１アロタイプ抗体は、Ｇ１ｍ１患者に投与する際、免疫原性とはならない（Ｉｄ．）。

【0135】

ヒトＧ１ｍ１アロタイプは、重鎖ＩｇＧ１のＣＨ３配列の３５６カバット位にアミノ酸のアスパラギン酸を、また３５８カバット位にロイシン含む。ｎＧ１ｍ１アロタイプは、３５６カバット位にアミノ酸のグルタミン酸を、また３５８カバット位にメチオニンを含む。Ｇ１ｍ１アロタイプとｎＧ１ｍ１アロタイプの両方は３５７カバット位にグルタミン酸残基を含み、それらアロタイプはＤＥＬアロタイプ及びＥＥＭアロタイプと呼ばれることもある。Ｇ１ｍ１アロタイプ抗体及びｎＧ１ｍ１アロタイプ抗体における重鎖定常領域配列の非限定例を、例示的な抗体リツキシマブ（配列番号：１８）及びベルツズマブ（配列番号：１９）で示す。
リツキシマブ重鎖可変領域配列（配列番号：１８）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＡＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ベルツズマブ重鎖可変領域（配列番号：１９）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

【0136】

Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ａｎｄ Ｌｅｆｒａｎｃ（２００９，ｍＡｂｓ １：１－７）は、ＩｇＧアロタイプの配列バリエーション特性、及び免疫原性に与える配列バリエーションの影響についてレビューしている。彼らは、Ｇ１ｍ１７アロタイプにおける２１４カバット位のリジン残基と比較して、Ｇ１ｍ３アロタイプが、２１４カバット位のアルギニン残基を特徴としていることを報告している。ｎＧ１ｍ１，２アロタイプは、３５６カバット位のグルタミン酸、３５８カバット位のメチオニン、及び４３１カバット位のアラニンを特徴としていた。Ｇ１ｍ１，２アロタイプは、３５６カバット位のアスパラギン酸、３５８カバット位のロイシン、及び４３１カバット位のグリシンを特徴としていた。重鎖定常領域配列変異体に加えて、Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ａｎｄ Ｌｅｆｒａｎｃ（２００９）は、１５３カバット位のバリン及び１９１カバット位のロイシンを特徴とするＫｍ１アロタイプ、１５３カバット位のアラニン及び１９１カバット位のロイシンを特徴とするＫｍ１，２アロタイプ、及び、１５３カバット位のアラニン及び１９１カバット位のバリンを特徴とするＫｍ３アロタイプ、を有するκ軽鎖定常領域のアロタイプ変異体について報告している。

【0137】

治療抗体に関して、ベルツズマブ及びリツキシマブはそれぞれ、多種多様な血液悪性腫瘍の治療に用いる、ＣＤ２０に対するヒト化ＩｇＧ１抗体及びキメラＩｇＧ１抗体である。表１では、リツキシマブ対ベルツズマブのアロタイプ配列を比較している。表１に示すように、リツキシマブ（Ｇ１ｍ１７，１）は、ベルツズマブのアルギニンに対してリツキシマブのリジンの２１４カバット位（重鎖ＣＨ１）に追加の配列バリエーションを有するＤＥＬアロタイプＩｇＧ１である。対象におけるベルツズマブの免疫原性がリツキシマブと比較して低いことが報告されている（効果は、ヒト化抗体とキメラ抗体の間の違いに起因している）（例えば、Ｍｏｒｃｈｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２７：３３４６－５３；Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｂｌｏｏｄ １１３：１０６２－７０；Ｒｏｂａｋ ＆ Ｒｏｂａｋ，２０１１，ＢｉｏＤｒｕｇｓ ２５：１３－２５を参照のこと）。しかしながら、ＥＥＭアロタイプとＤＥＬアロタイプの間におけるアロタイプの違いはまた、ベルツズマブのより低い免疫原性にも起因するようである。

【表1】

【0138】

ｎＧ１ｍ１遺伝子型の個体における治療抗体の免疫原性を低減させるためには、２１４カバット位のアルギニンを特徴とするＧ１ｍ３アロタイプ、及び、３５６カバット位のグルタミン酸、３５８カバット位のメチオニン及び４３１カバット位のアラニンを特徴とするｎＧ１ｍ１，２無アロタイプ、に相当する抗体のアロタイプを選択することが望ましい。驚くべきことに、長期間にわたるＧ１ｍ３抗体の反復皮下投与が著しい免疫応答とはならないことが見出された。代替実施形態では、Ｇ１ｍ３アロタイプと同様、ヒトＩｇＧ４重鎖は、２１４カバット位にアルギニン、３５６カバット位にグルタミン酸、３５９カバット位にメチオニン、及び４３１カバット位にアラニンを有している。免疫原性が少なくとも部分的に上記位置における残基に関係していると思われるため、ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域配列を治療抗体に使用することはまた好ましい実施形態である。Ｇ１ｍ３ ＩｇＧ１抗体とＩｇＧ４抗体の組み合わせをまた、治療薬投与に使用してもよい。

【0139】

アビマー
特定の実施形態では、本明細書に記載の結合部分は、１つまたは複数のアビマー配列を含んでいてもよい。アビマーとは、様々な標的分子に対するその親和性及び特異性がある程度抗体と類似している結合タンパク質の部類のことである。アビマーは、インビトロエキソンシャッフリング及びファージディスプレイを用いてヒト細胞外受容体ドメインから開発された（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１４９３－９４；Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：２２０）。得られたマルチドメインタンパク質は複数の独立した結合ドメインを含んでいてもよく、それら結合ドメインは、単一エピトープ結合タンパク質と比較して、優れた親和性（場合によってはサブナノモル）及び特異性を示していてもよい（Ｉｄ．）。様々な実施形態では、本願請求項に記載の方法及び組成物に使用するために、アビマーを、例えば、ＤＤＤ配列及び／またはＡＤ配列に結合させてもよい。アビマーの構築方法及び使用方法に関係する更なる詳細については、例えば、米国特許出願公開番号２００４０１７５７５６、２００５００４８５１２、２００５００５３９７３、２００５００８９９３２及び２００５０２２１３８４に開示されている（それぞれの特許の実施例セクションは参照として本明細書に組み込まれる）。

【0140】

ファージディスプレイ
本願請求項に記載の組成物及び／または方法の特定の実施形態は、様々な標的分子、細胞または組織の結合ペプチド及び／またはペプチド模倣薬に関係していてもよい。ファージディスプレイ技術を含むがこれらに限定されない当該技術分野において周知の任意の方法を用いて、結合ペプチドを同定してもよい。ファージディスプレイの様々な方法、及び多種多様なペプチド群を作製するための技術は、当技術分野において周知である。例えば、米国特許番号５，２２３，４０９、５，６２２，６９９及び６，０６８，８２９は、ファージライブラリを作製するための方法について開示している。ファージディスプレイ技術は、その表面上に低分子ペプチドを発現できるように遺伝子操作したバクテリオファージを含む（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｓｃｏｔｔ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１３１５－１３１７；Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｓｃｏｔｔ，１９９３，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１：２２８－２５７）。ペプチドに加えて、より大きなタンパク質ドメイン、例えば、一本鎖抗体などもまた、ファージ粒子の表面上に提示することができる（Ａｒａｐ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９：３７７－３８０）。

【0141】

任意の器官、組織、細胞型または標的分子に選択的な標的アミノ酸配列を、パニングで単離してもよい（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ ａｎｄ Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ ３８０：３６４－３６６；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ，１９９９，Ｔｈｅ Ｑｕａｒｔ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４３：１５９－１６２）。端的に言えば、推定上の標的ペプチドを含有するファージのライブラリを、インタクトな微生物、または、単離した器官、組織、細胞型もしくは標的分子に投与して、結合ファージを含有する試料を回収する。標的に結合したファージを標的器官、組織、細胞型または標的分子から溶出させてから、それらファージを宿主細菌内で成長させることで増殖させてもよい。

【0142】

特定の実施形態では、パニングラウンド中の宿主細菌内でファージを増殖させてもよい。ファージを溶出させる代わりに、特定のインサートを提示する複数のファージ複製を細菌に分泌させてもよい。必要であれば、増殖させたファージを再度、標的器官、組織、細胞型または標的分子に曝してから、更なるパニングラウンド用に回収する。選択的バインダーまたは特異的バインダーの集団が得られるまで、複数のパニングラウンドを実施してもよい。ファージゲノム内の標的ペプチドインサートに対応するＤＮＡをシークエンシングして、ペプチドのアミノ酸配列を同定してもよい。その後、標準的なタンパク質化学技術を用いて、同定した標的ペプチドを合成ペプチドとして作製してもよい（Ａｒａｐ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９８５）。

【0143】

一部の実施形態では、サブトラクションプロトコルを用いてバックグラウンドファージ結合を更に低減させてもよい。サブトラクションの目的は、目的の標的以外の標的に結合したファージをライブラリから除去することである。代替実施形態では、対照の細胞、組織または細胞に対して、ファージライブラリをプレスクリーニングしてもよい。例えば、対照の正常細胞株に対してライブラリをプレスクリーニングした後に、腫瘍結合ペプチドを同定してもよい。サブトラクション後、目的の分子、細胞、組織または器官に対してライブラリをスクリーニングしてもよい。サブトラクションプロトコルのその他の方法は周知であり、本願請求項に記載の方法を実施するために使用してもよく、例えば、米国特許番号５，８４０，８４１、５，７０５，６１０、５，６７０，３１２及び５，４９２，８０７に開示されている。

【0144】

アプタマー
特定の実施形態では、使用する標的化部分はアプタマーであってもよい。アプタマーの合成方法、及びアプタマーの結合特性を測定するための方法については、当該技術分野において周知である。例えば、このような技術については、米国特許番号５，５８２，９８１、５，５９５，８７７及び５，６３７，４５９に記載されている（それぞれの実施例セクションは参照として本明細書に組み込まれる）。特定の目的標的に結合するアプタマーを作製及びスクリーニングするための方法は周知であり、例えば、米国特許番号５，４７５，０９６及び米国特許番号５，２７０，１６３に記載されている（それぞれの実施例セクションは参照として本明細書に組み込まれる）。

【0145】

合成法、組換え法及び精製法を含む任意の周知の方法を用いてアプタマーを作製してもよく、アプタマーを単独で、または同一標的に特異的なその他のリガンドと組み合わせて使用してもよい。一般的に、特異的結合を達成するためには、最低約３ヌクレオチド、好ましくは少なくとも５ヌクレオチドが必要となる。１０、２０、３０または４０ヌクレオチドのアプタマーが好ましい場合があるが、１０塩基よりも短い配列のアプタマーでも実行可能である。

【0146】

通常のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子として、アプタマーを単離、シークエンス、及び／または増幅または合成してもよい。あるいは、目的のアプタマーは、修飾オリゴマーを含んでいてもよい。通常はアプタマー中に存在するヒドロキシル基のいずれかを、ホスホネート基、ホスフェート基で置換してもよく、標準的な保護基で保護してもよく、活性化させてその他のヌクレオチドへの別の結合部を作製してもよく、または、固体支持体にコンジュゲートさせてもよい。１つまたは複数のホスホジエステル結合を別の連結基、例えば、Ｐ（Ｏ）Ｏ、Ｐ（Ｏ）Ｓ、Ｐ（Ｏ）ＮＲ_２、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＮＲ_２など（式中、ＲはＨまたはアルキル（１～２０Ｃ）であり、Ｒ’はアルキル（１～２０Ｃ））で置換してもよく、更に、ＯまたはＳを介して、この基を隣接ヌクレオチドに結合させてもよい。オリゴマー中の全ての結合部が同一である必要はない。

【0147】

アフィボディ及びフィノマー
特定の代替実施形態では、抗体の代わりにアフィボディを利用してもよい。アフィボディは、Ａｆｆｉｂｏｄｙ ＡＢ（Ｓｏｌｎａ，Ｓｗｅｄｅｎ）から市販されている。アフィボディは、抗体模倣薬として機能し、標的分子への結合に使用される低分子タンパク質である。アフィボディは、αヘリックスタンパク質スキャフォールドのコンビナトリアルエンジニアリングによって開発された（Ｎｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ ８：６０１－８；Ｎｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １５：７７２－７７）。アフィボディの設計は、タンパク質ＡのＩｇＧ結合ドメインを含む３ヘリックスバンドル構造をベースとしている（Ｎｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５；１９９７）。細菌タンパク質ＡのＦｃ結合活性に関与する１３種類のアミノ酸を無作為化することにより、幅広い結合親和性を有するアフィボディを作製してもよい（Ｎｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５；１９９７）。無作為化後、変異体タンパク質のファージディスプレイによるスクリーニング用に、ＰＣＲ増幅ライブラリをファージミドベクターにクローニングした。標的抗原に対する１つまたは複数のアフィボディを同定するために、標準的なファージディスプレイスクリーニング技術（例えば、Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ ａｎｄ Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ ３８０：３６４－３６６；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ，１９９９，Ｑｕａｒｔ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４３：１５９－１６２）を使用し、任意の周知の抗原に対してファージディスプレイライブラリをスクリーニングしてもよい。

【0148】

ＨＥＲ２／ｎｅｕに特異的な^１７７Ｌｕ標識アフィボディが、インビボでＨＥＲ２発現異種移植片を標的とすることが実証されている（Ｔｏｌｍａｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６７：２７７３－８２）。当初、低分子量の放射能標識化合物の蓄積による腎毒性が問題となっていたが、アルブミンに対する可逆結合により腎蓄積が抑制され、標識アフィボディを用いた放射性核種ベースの治療が可能となった（Ｉｄ．）。

【0149】

インビボ腫瘍イメージングへの放射能標識アフィボディの使用可能性が最近実証されている（Ｔｏｌｍａｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ ２２：８９４－９０２）。マレイミド誘導体化ＮＯＴＡを抗ＨＥＲ２アフィボディにコンジュゲートして、^１１１Ｉｎで放射能標識した（Ｉｄ．）。ＨＥＲ２発現ＤＵ－１４５異種移植片を有するマウスに投与してから、ガンマカメライメージングを行い、異種移植片を可視化した（Ｉｄ．）。

【0150】

フィノマーもまた、抗体に対してほぼ同等の親和性及び特異性を有する標的抗原に結合可能である。フィノマーは、結合分子アセンブリ用スキャフォールドとしてのヒトＦｙｎ ＳＨ３ドメインをベースとしている。Ｆｙｎ ＳＨ３ドメインは、細菌内において高収率で産生可能な完全ヒト６３アミノ酸タンパク質である。フィノマー同士を互いに結合させて、２つまたはそれ以上の異なる抗原標的に親和性を有する多重特異性結合タンパク質を得てもよい。フィノマーは、ＣＯＶＡＧＥＮ ＡＧ（Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から市販されている。

【0151】

本願請求項に記載の方法及び組成物を実施する上で、アフィボディまたはフィノマーを標的化分子として使用可能であることを当業者は理解するであろう。

【0152】

イムノコンジュゲート
特定の実施形態では、細胞傷害性薬物、またはその他の治療薬もしくは診断薬を、抗体または抗体フラグメントに共有結合で結合させて、イムノコンジュゲートを形成してもよい。一部の実施形態では、薬物またはその他の薬剤を、担体部分を介して抗体またはそのフラグメントに結合させてもよい。担体部分を、例えば、還元ＳＨ基及び／または炭水化物側鎖に結合させてもよい。還元抗体構成要素のヒンジ領域において、ジスルフィド結合形成を介し担体部分を結合させることができる。あるいは、ヘテロ二官能性クロスリンカー、例えば、Ｎ－サクシニル ３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）などを使用して、このような薬剤を結合させることができる（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５６：２４４（１９９４））。このような結合を実施するための一般的な技術は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｗｏｎｇ，ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮ ＣＯＮＪＵＧＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＣＲＯＳＳ－ＬＩＮＫＩＮＧ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９９１）；Ｕｐｅｓｌａｃｉｓ ｅｔ ａｌ．，「Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ」ｉｎ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，Ｂｉｒｃｈ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ １８７－２３０（Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５）；Ｐｒｉｃｅ，「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」ｉｎ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ，ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＡＮＤ ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ，Ｒｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ ６０－８４（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５）を参照されたい。あるいは、抗体のＦｃ領域中の炭水化物部分を介して、担体部分を結合することができる。

【0153】

抗体炭水化物部分を介して官能基を抗体にコンジュゲートするための方法は、当業者に周知である。例えば、Ｓｈｉｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４１：８３２（１９８８）；Ｓｈｉｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４６：１１０１（１９９０）；及び、Ｓｈｉｈ ｅｔ ａｌ．，米国特許番号５，０５７，３１３を参照されたい（その実施例セクションは参照として本明細書に組み込まれる）。一般的な方法は、酸化した炭水化物部分を有する抗体を、少なくとも１個の遊離アミン基を有する担体ポリマーと反応させることを含む。この反応により最初にシッフ塩基（イミン）結合が生じ、二級アミンへと還元することにより安定化し、最終複合体を形成することができる。

【0154】

ＡＤＣの抗体構成要素が抗体フラグメントである場合、Ｆｃ領域は存在しなくてもよい。しかしながら、炭水化物部分を、全長抗体または抗体フラグメントの軽鎖可変領域に導入することは可能である。例えば、Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５９１９（１９９５）、米国特許番号５，４４３，９５３及び６，２５４，８６８を参照されたい（それらの実施例セクションは参照として本明細書に組み込まれる）。設計した炭水化物部分を用いて、治療薬または診断薬を結合させる。

【0155】

担体部分を標的化分子に結合させるための別の方法は、クリックケミストリー反応の使用を含む。クリックケミストリー法は元々、小さなサブユニットをモジュール式で互いに結合させることにより、複合体物質を急速に生成するための方法として構想された（例えば、Ｋｏｌｂ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ ４０：３００４－３１；Ｅｖａｎｓ，２００７，Ａｕｓｔ Ｊ Ｃｈｅｍ ６０：３８４－９５を参照のこと）。様々な形態のクリックケミストリー反応が当技術分野において周知であり、例えば、ヒュスゲン１，３－双極子付加環化銅触媒反応（Ｔｏｒｎｏｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍ ６７：３０５７－６４）などが挙げられ、多くの場合、「クリック反応」と呼ばれる。その他の代替実施形態では、付加環化反応、例えば、ディールスアルダー、求核置換反応（特に、エポキシ化合物及びアジリジン化合物のような小さな張力環に対する）、尿素化合物のカルボニル化学形成、及び、炭素－炭素二重結合を含む反応（例えば、チオール－エン反応におけるアルキンなど）などを含む。

【0156】

アジドアルキンヒュスゲン付加環化反応では、第１の分子に結合した末端アルキン基の反応を触媒するために、還元剤の存在下で銅触媒を用いる。アジド部分を含む第２の分子の存在下で、アジドは活性化アルキンと反応して、１，４－ジ置換１，２，３－トリアゾールを形成する。銅触媒反応は、室温で進行し、また反応生成物の精製を多くの場合必要としないほど十分に特異的である（Ｒｏｓｔｏｖｓｔｅｖ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ ４１：２５９６；Ｔｏｒｎｏｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ ６７：３０５７）。アジド官能基及びアルキン官能基は、水性媒体中の生体分子に対してほぼ不活性であるため、複合体溶液中において反応が進行する。形成されたトリアゾールは化学的に安定であり酵素開裂を受けないため、クリックケミストリー生成物は、生物学的機構において非常に安定なものになる。銅触媒は生細胞にとって有毒ではあるが、銅をベースとしたクリックケミストリー反応は、ＡＤＣ形成にインビトロで使用することができる。

【0157】

生体分子の共有結合修飾に銅フリークリック反応が提案されている（例えば、Ａｇａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １２６：１５０４６－４７を参照のこと）。銅フリー反応では、［３＋２］アジド－アルキン付加環化反応を促進するために、銅触媒の代わりに環ひずみを利用する（Ｉｄ．）。例えば、シクロオクチンは、内部アルキン結合を含む８炭素環構造である。閉環構造によりアセチレンの結合角にかなりの変形が引き起こされるが、それによりアジド基との反応性が高くなり、トリアゾールを形成することになる。それゆえ、シクロオクチン誘導体を銅フリークリック反応に使用することができる（Ｉｄ．）。

【0158】

別のタイプの銅フリークリック反応（ひずみ促進アルキン－ニトロン付加環化を伴う）は、Ｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１０，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ ４９：３０６５－６８）により報告された。元のシクロオクチンにおける反応速度の低さに対処するために、電子吸引基を三重結合の隣に結合させる（Ｉｄ．）。このような置換シクロオクチンの例としては、ジフッ素化シクロオクチン、４－ジベンゾシクロオクチノール、及びアザシクロオクチンが挙げられる（Ｉｄ．）。別の銅フリー反応は、Ｎ－アルキル化イソオキサゾリンを得るためのひずみ促進アルキン－ニトロン付加環化を伴っていた（Ｉｄ．）。その反応が並外れて速い反応動態を有していると報告され、ペプチド及びタンパク質の部位特異的修飾用のワンポット３ステッププロトコルに使用された（Ｉｄ．）。Ｎ－メチルヒドロキシルアミンで適切なアルデヒドを縮合させてニトロンを調製してから、アセトニトリルと水の混合液中で付加環化反応を行った（Ｉｄ．）。これら及びその他の周知のクリックケミストリー反応を用いて、インビトロで担体部分を抗体に結合させてもよい。

【0159】

Ａｇａｒｄ ｅｔ ａｌ．（２００４，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １２６：１５０４６－４７）は、ペルアセチル化Ｎ－アジドアセチルマンノサミンの存在下、ＣＨＯ細胞中で発現する組換え糖タンパク質が、糖タンパク質の炭水化物中における対応するＮ－アジドアセチルシアル酸の生体内取り込みをもたらすことを実証した。アジド誘導体化糖タンパク質は、特異的にビオチン化シクロオクチンと反応してビオチン化糖タンパク質を形成した（一方、アジド部分のない対照の糖タンパク質は、非標識のまま）（Ｉｄ．）。Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２０：６６４－６６７）は、同様の技術を使用して、ペルアセチル化Ｎ－アジドアセチルガラクトサミンでインキュベートしたゼブラフィッシュ胚内の細胞表面グリカンを代謝標識した。アジド誘導体化グリカンをジフッ素化シクロオクチン（ＤＩＦＯ）試薬と反応させて、インビボでグリカンを可視化させた。

【0160】

ディールスアルダー反応もまた、分子のインビボ標識に使用されてきた。Ｒｏｓｓｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ ４９：３３７５－７８）は、トランス－シクロオクテン（ＴＣＯ）反応性部分を担持する腫瘍局在化抗ＴＡＧ７２（ＣＣ４９）抗体と^１１１Ｉｎ標識テトラジンＤＯＴＡ誘導体の間において、インビボで５２％の収率があることを報告している。結腸癌異種移植片を有するマウスにＴＣＯ標識ＣＣ４９抗体を投与し、その１日後、^１１１Ｉｎ標識テトラジンプローブを注入した（Ｉｄ．）。放射能標識プローブと腫瘍局在化抗体が反応することにより、放射能標識プローブの注入後３時間時点における生マウスのＳＰＥＣＴイメージングを実施したところ、腫瘍内に放射能の著しい局在化が認められた（腫瘍：筋肉の比率は１３：１）（Ｉｄ．）。その結果は、ＴＣＯとテトラジン標識分子のインビボ化学反応を裏付けるものであった。

【0161】

標識部分の生体内取り込みを利用した抗体標識技術については、米国特許番号６，９５３，６７５に更に開示されている（その実施例セクションは参照として本明細書に組み込まれる）。このような「ランドスケープ」抗体は、グリコシル化部位に反応性ケトン基を有するように作製された。その方法は、糖または糖前駆体のケトン誘導体を含む培地内で、ＣＨ１ドメインまたはＶκドメイン内に１つまたは複数のＮ－グリコシル化部位を有する抗体をコードする発現ベクターをトランスフェクションした細胞を発現させることを含んでいた。ケトン誘導体化糖またはケトン誘導体化糖前駆体は、Ｎ－レブリノイルマンノサミン及びＮ－レブリノイルフコースに含まれていた。その後、ランドスケープ抗体を、ケトン反応性部分、例えば、ヒドラジド基、ヒドラジン基、ヒドロキシルアミノ基またはチオセミカルバジド基などを含む薬剤と反応させて、標識標的化分子を形成させた。ランドスケープ抗体に結合させた例示的な薬剤としては、キレート化剤様ＤＴＰＡ、ドキソルビシン－デキストランなどの大型薬物分子、及びアシル－ヒドラジド含有ペプチドが挙げられた。ランドスケープ技術はケトン部分を含む抗体を作製することに限定されず、代わりに、クリックケミストリー反応性基、例えば、ニトロン、アジドまたはシクロオクチンなどを、抗体またはその他の生体分子に導入するために使用されてもよい。

【0162】

クリックケミストリー反応による修飾は、インビトロまたはインビボでの使用に適している。反応性標的化分子は、化学的コンジュゲートまたは生体内取り込みのいずれかにより形成されてもよい。標的化分子、例えば、抗体または抗体フラグメントなどを、アジド部分、置換シクロオクチン基もしくはアルキン基、またはニトロン部分で活性化させてもよい。標的化分子がアジド基またはニトロン基を含む場合、対応する標的となり得る構築物は置換シクロオクチン基またはアルキン基を含み、逆の場合もまた同様である。このような活性化分子は、上述したとおり、生細胞内における代謝取り込みにより生成してもよい。

【0163】

あるいは、このような部分を生体分子に化学的にコンジュゲートするための方法は当該技術分野において周知であり、任意のこのような周知の方法を利用してもよい。一般的なＡＤＣ形成方法については、例えば、米国特許番号４，６９９，７８４、４，８２４，６５９、５，５２５，３３８、５，６７７，４２７、５，６９７，９０２、５，７１６，５９５、６，０７１，４９０、６，１８７，２８４、６，３０６，３９３、６，５４８，２７５、６，６５３，１０４、６，９６２，７０２、７，０３３，５７２、７，１４７，８５６、及び７，２５９，２４０に開示されている（それぞれの実施例セクションは参照として本明細書に組み込まれる）。

【0164】

好ましいコンジュゲーションプロトコルは、中性ｐＨまたは酸性ｐＨで容易に生じるチオール－マレイミド反応、チオール－ビニルスルホン反応、チオール－ブロモアセトアミド反応、またはチオール－ヨードアセトアミド反応をベースとしている。このことは、例えば、活性エステルを使用する際に必要となるような、コンジュゲートにおける高いｐＨ条件の必要性を除去する。例示的なコンジュゲーションプロトコルの更なる詳細については、以下の実施例セクションで説明する。

【0165】

治療薬
別の態様では、本発明は、対象に、治療有効量の本明細書に記載の抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、例えば、ＩＭＭＵ－１３２などを投与することを含む、対象を治療するための方法に関する。対象は、チェックポイント阻害抗体を用いた治療に耐性を示すＴｒｏｐ－２陽性がんを有していることが好ましい。疾患状態及び複合体の忍容性に応じて、ＡＤＣを一度または繰り返し投与してもよく、また任意選択的に、その他の治療様式、例えば、外科手術、外部放射線、放射免疫治療、免疫療法、化学療法、アンチセンス療法、干渉ＲＮＡ療法、遺伝子治療などと組み合わせてＡＤＣを使用してもよい。それぞれの組み合わせは、腫瘍タイプ、ステージ、患者の状態、及び前治療、ならびに、管理医師が検討するその他の因子に合わせられる。

【0166】

本明細書で使用する場合、用語「対象」とは、ヒトを含む哺乳動物を含むがこれらに限定されない任意の動物（すなわち、脊椎動物及び無脊椎動物）のことを意味する。この用語が特定の年齢または性別に限定されるということを意図するものではない。それゆえ、成人及び新生児の対象に加えて胎児（男性または女性にかかわらず）は、この用語に包含される。本明細書において示す用量はヒト用であるが、体重または平方メートルサイズに従い、その他の哺乳動物に加えて小児のサイズに調節することは可能である。

【0167】

好ましい実施形態では、米国特許番号７，２３８，７８５、７，５１７，９６４及び８，０８４，５８３に開示されるような抗Ｔｒｏｐ－２抗体、例えば、ｈＲＳ７ ＭＡｂなどを含む治療用複合体を用いて、がん、例えば、食道癌、膵臓癌、肺癌、胃癌、結腸癌及び直腸癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、腎臓癌、ならびに前立腺癌を治療することができる（その実施例セクションは参照として本明細書に組み込まれる）。ｈＲＳ７抗体は、軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）配列ＣＤＲ１（ＫＡＳＱＤＶＳＩＡＶＡ、配列番号：１）、ＣＤＲ２（ＳＡＳＹＲＹＴ、配列番号：２）及びＣＤＲ３（ＱＱＨＹＩＴＰＬＴ、配列番号：３）、ならびに、重鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＮＹＧＭＮ、配列番号：４）、ＣＤＲ２（ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＴＤＤＦＫＧ、配列番号：５）及びＣＤＲ３（ＧＧＦＧＳＳＹＷＹＦＤＶ、配列番号：６）を含むヒト化抗体である。

【0168】

マウス型及びキメラ型の抗体も使用可能ではあるが、好ましい実施形態では、ヒト疾患の治療に使用される抗体はヒト型またはヒト化（ＣＤＲ移植）型の抗体である。免疫応答を最小限とするには同一種のＩｇＧ分子（送達物質）が最も好ましい。反復治療を考慮する上で、このことは特に重要である。ヒトにおいて、ヒトＩｇＧ抗体またはヒト化ＩｇＧ抗体は、患者の抗ＩｇＧ免疫応答をより少なく生じさせるようである。ｈＬＬ１及びｈＬＬ２などの抗体は、標的細胞上の内在化抗原に結合後、速やかに内部移行する。そのことは、担持されている化学療法剤も同様に、細胞内へと速やかに内部移行することを意味する。しかしながら、より遅い内在化速度を有する抗体もまた、選択的治療を達成するのに使用され得る。

【0169】

好ましい実施形態では、多価抗体、多重特異性抗体または多価抗体、単特異性抗体を使用することにより、細胞へのより効果的な取り込みを達成することができる。このような二価抗体及び二重特異性抗体の例は、米国特許番号７，３８７，７７２、７，３００，６５５、７，２３８，７８５及び７，２８２，５６７に記載されている（それぞれの特許の実施例セクションは参照として本明細書に組み込まれる）。これらの多価抗体または多重特異性抗体は、複数の抗原標的及び更に同一抗原標的の複数のエピトープを発現するが、細胞または病原体上における単一抗原標的の発現または有用性が不十分であるため、多くの場合、免疫療法において抗体の標的化及び十分な結合を免れる、がん及び感染性微生物（病原体）を標的とするのに特に好ましい。複数の抗原またはエピトープを標的とすることにより、上記抗体は、標的に対する高い結合性及び滞留時間を示すことになる。その結果、本発明において標的化する薬物を長時間飽和させることができる。

【0170】

別の好ましい実施形態では、本発明のカンプトテシン複合体と組み合わせて使用する治療薬は、１種または複数種の同位体を含んでいてもよい。患部組織を治療するのに有用な放射性同位体としては、^１１１Ｉｎ、^１７７Ｌｕ、^２１２Ｂｉ、^２１３Ｂｉ、^２１１Ａｔ、^６２Ｃｕ、^６７Ｃｕ、^９０Ｙ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３２Ｐ、^３３Ｐ、^４７Ｓｃ、^１１１Ａｇ、^６７Ｇａ、^１４２Ｐｒ、^１５３Ｓｍ、^１６１Ｔｂ、^１６６Ｄｙ、^１６６Ｈｏ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１８９Ｒｅ、^２１２Ｐｂ、^２２３Ｒａ、^２２５Ａｃ、^５９Ｆｅ、^７５Ｓｅ、^７７Ａｓ、^８９Ｓｒ、^９９Ｍｏ、^１０５Ｒｈ、^１０９Ｐｄ、^１４３Ｐｒ、^１４９Ｐｍ、^１６９Ｅｒ、^１９４Ｉｒ、^１９８Ａｕ、^１９９Ａｕ、^２２７Ｔｈ及び^２１１Ｐｂが挙げられるがこれらに限定されない。治療用放射性核種は、２０～６，０００ｋｅＶの範囲の崩壊エネルギー、好ましくは、オージェ放出体において６０～２００ｋｅＶの範囲、β放出体において１００～２，５００ｋｅＶの範囲、及び、α放出体において４，０００～６，０００ｋｅＶの範囲の崩壊エネルギーを有していることが好ましい。有用なβ粒子放射性核種の最大崩壊エネルギーは、好ましくは２０～５，０００ｋｅＶ、より好ましくは１００～４，０００ｋｅＶ、最も好ましくは５００～２，５００ｋｅＶである。実質的にオージェ放射性粒子を伴って崩壊する放射性核種もまた好ましい。例えば、Ｃｏ－５８、Ｇａ－６７、Ｂｒ－８０ｍ、Ｔｃ－９９ｍ、Ｒｈ－１０３ｍ、Ｐｔ－１０９、Ｉｎ－１１１、Ｓｂ－１１９、Ｉ－１２５、Ｈｏ－１６１、Ｏｓ－１８９ｍ及びＩｒ－１９２である。有用なβ粒子放射性核種の崩壊エネルギーは、好ましくは＜１，０００ｋｅＶ、より好ましくは＜１００ｋｅＶ、最も好ましくは＜７０ｋｅＶである。実質的にα粒子を発生して崩壊する放射性核種もまた好ましい。このような放射性核種としては、Ｄｙ－１５２、Ａｔ－２１１、Ｂｉ－２１２、Ｒａ－２２３、Ｒｎ－２１９、Ｐｏ－２１５、Ｂｉ－２１１、Ａｃ－２２５、Ｆｒ－２２１、Ａｔ－２１７、Ｂｉ－２１３、Ｔｈ－２２７及びＦｍ－２５５が挙げられるがこれらに限定されない。有用なα粒子放射性の放射性核種における崩壊エネルギーは、好ましくは２，０００～１０，０００ｋｅＶ、より好ましくは３，０００～８，０００ｋｅＶ、最も好ましくは４，０００～７，０００ｋｅＶである。別の使用可能な放射性同位体としては、^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏ、^７５Ｂｒ、^１９８Ａｕ、^２２４Ａｃ、^１２６Ｉ、^１３３Ｉ、^７７Ｂｒ、^１１３ｍＩｎ、^９５Ｒｕ、^９７Ｒｕ、^１０３Ｒｕ、^１０５Ｒｕ、^１０７Ｈｇ、^２０３Ｈｇ、^１２１ｍＴｅ、^１２２ｍＴｅ、^１２５ｍＴｅ、^１６５Ｔｍ、^１６７Ｔｍ、^１６８Ｔｍ、^１９７Ｐｔ、^１０９Ｐｄ、^１０５Ｒｈ、^１４２Ｐｒ、^１４３Ｐｒ、^１６１Ｔｂ、^１６６Ｈｏ、^１９９Ａｕ、^５７Ｃｏ、^５８Ｃｏ、^５１Ｃｒ、^５９Ｆｅ、^７５Ｓｅ、^２０１Ｔｌ、^２２５Ａｃ、^７６Ｂｒ、^１６９Ｙｂなどが挙げられる。

【0171】

放射性核種及びその他の金属を、例えば、抗体または複合体に結合させたキレート基を使用して送達してもよい。ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ及びＴＥＴＡなどの大環状キレートを、様々な金属及び放射性金属と共に、最も特に、それぞれガリウム、イットリウム及び銅の放射性核種と共に使用する。このような金属－キレート複合体は、環サイズを目的の金属に合わせて調節することにより、極めて安定した状態で調製することができる。その他の環状キレート、例えば、^２２３Ｒａを錯化させるための大環状ポリエーテルなどを使用してもよい。

【0172】

本明細書に記載のカンプトテシン複合体と組み合わせて使用する治療薬としてはまた、例えば、化学療法剤、例えば、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、エピドフィロトキシン、タキサン、代謝拮抗薬、チロシンキナーゼ阻害剤、アルキル化剤、抗生物質、Ｃｏｘ－２阻害剤、抗有糸分裂薬、抗血管新生薬及びプロアポトーシス薬、特に、ドキソルビシン、メトトレキサート、タキソール、その他のカンプトテシン、ならびに、これら及びその他の部類の抗がん剤に由来するその他の治療薬などが挙げられる。その他のがん化学療法剤としては、ナイトロジェンマスタード、アルキルスルホネート、ニトロソウレア、トリアゼン、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、白金配位錯体、ホルモンなどが挙げられる。好適な化学療法剤については、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１９ｔｈ Ｅｄ．（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．１９９５）、及びＧＯＯＤＭＡＮ ＡＮＤ ＧＩＬＭＡＮ’Ｓ ＴＨＥ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ ＢＡＳＩＳ ＯＦ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ，７ｔｈ Ｅｄ．（ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．１９８５）、ならびに、これら刊行物の改訂版に記載されている。その他の適切な化学療法剤、例えば、実験用薬物などは、当業者に周知である。

【0173】

使用する例示的な薬物としては、５－フルオロウラシル、アファチニブ、アプリジン、アザリビン、アナストロゾール、アントラサイクリン、アキシチニブ、ＡＶＬ－１０１、ＡＶＬ－２９１、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ボスチニブ、ブリオスタチン－１、ブスルファン、カリケアマイシン、カンプトテシン、カルボプラチン、１０－ヒドロキシカンプトテシン、カルムスチン、セレコキシブ、クロラムブシル、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、Ｃｏｘ－２阻害剤、イリノテカン（ＣＰＴ－１１）、ＳＮ－３８、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテカン、クリゾチニブ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダサチニブ、ジナシクリブ、ドセタキセル、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、２－ピロリノドキソルビシン（２Ｐ－ＤＯＸ）、シアノ－モルホリノドキソルビシン、ドキソルビシングルクロニド、エピルビシングルクロニド、エルロチニブ、エストラムスチン、エピポドフィロトキシン、エルロチニブ、エンチノスタット、エストロゲン受容体結合剤、エトポシド（ＶＰ１６）、エトポシドグルクロニド、リン酸エトポシド、エキセメスタン、フィンゴリモド、フロクスウリジン（ＦＵｄＲ）、３’，５’－Ｏ－ジオレオイル－ＦｕｄＲ（ＦＵｄＲ－ｄＯ）、フルダラビン、フルタミド、ファルネシル－タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、フラボピリドール、フォスタマチニブ、ガネテスピブ、ＧＤＣ－０８３４、ＧＳ－１１０１、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イブルチニブ、イダルビシン、イデラリシブ、イホスファミド、イマチニブ、Ｌ－アスパラギナーゼ、ラパチニブ、レノリダミド、ロイコボリン、ＬＦＭ－Ａ１３、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、６－メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、ナベルビン、ネラチニブ、ニロチニブニトロソウレア、オラパリブ、プリコマイシン、プロカルバジン、パクリタキセル、ＰＣＩ－３２７６５、ペントスタチン、ＰＳＩ－３４１、ラロキシフェン、セムスチン、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、ＳＵ１１２４８、スニチニブ、タモキシフェン、テマゾロミド、トランスプラチン、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、ウラシルマスタード、バタラニブ、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンカアルカロイド、及びＺＤ１８３９が挙げられるがこれらに限定されない。このような薬剤は本明細書に記載の複合体の一部であってもよく、あるいは、本明細書に記載の複合体と組み合わせて、複合体の投与前に、それと同時に、またはその投与後のいずれかで投与されてもよい。

【0174】

カンプトテシン複合体と共に使用可能な治療薬はまた、標的化部分にコンジュゲートした毒素を含んでいてもよい。これに関連して使用可能な毒素としては、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、ＤＮａｓｅ Ｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌエンテロトキシン－Ａ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエキソトキシン、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエンドトキシンが挙げられる（例えば、Ｐａｓｔａｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９８６），４７：６４１、及びＳｈａｒｋｅｙ ａｎｄ Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ．２００６ Ｊｕｌ－Ａｕｇ；５６（４）：２２６－４３を参照のこと）。本明細書で用いるのに好適な別の毒素は当業者に周知であり、米国６，０７７，４９９に開示されている。

【0175】

更に別の部類の治療薬は、１種または複数種の免疫調節薬を含んでいてもよい。使用する免疫調節薬は、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンフォトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、エリスロポエチン、トロンボポエチン、及びこれらの組み合わせから選択してもよい。特に有用な免疫調節薬は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのリンフォトキシン、インターロイキン（ＩＬ）などの造血因子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子、インターフェロン－α、インターフェロン－β、インターフェロン－γまたはインターフェロン－λなどのインターフェロン、及び「Ｓ１因子」と呼ばれる幹細胞増殖因子などである。サイトカインに含まれるものは、ヒト成長ホルモン、Ｎ－メチオニルヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；サイロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）及び黄体形成ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質；肝増殖因子；プロスタグランジン、線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン、ＯＢタンパク質；腫瘍壊死因子α及び腫瘍壊死因子β；ミュラー阻害物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ－βなどの神経成長因子；血小板増殖因子；ＴＧＦ－α及びＴＧＦ－βなどのトランスホーミング増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子－Ｉ及びインスリン様成長因子－ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン－α、インターフェロン－β及びインターフェロン－γなどのインターフェロン；マクロファージ－ＣＳＦ（Ｍ－ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；ＩＬ－１、ＩＬ－１α、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２５などのインターロイキン（ＩＬ）、ＬＩＦ、ｋｉｔ－リガンドまたはＦＬＴ－３、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、腫瘍壊死因子及びリンフォトキシン（ＬＴ）である。本明細書で使用する場合、用語「サイトカイン」は、天然資源由来のタンパク質、または組換え細胞培養物由来のタンパク質、及び天然配列サイトカインの生物学的に活性な等価物を含む。

【0176】

使用するケモカインとしては、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＡＦ、ＭＩＰ１－α、ＭＩＰ１－β及びＩＰ－１０が挙げられる。

【0177】

特定の実施形態では、抗Ｔｒｏｐ－２ ＡＤＣと組み合わせて使用される治療薬は、微小管阻害剤、例えば、ビンカアルカロイド、タキサン、メイタンシノイドまたはアウリスタチンなどである。例示的な周知の微小管阻害剤としては、パクリタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メルタンシン、エポチロン、ドセタキセル、ディスコデルモライド、コンブレスタチン、ポドフィロトキシン、ＣＩ－９８０、フェニラヒスチン、ステガナシン、クラシン、２－メトキシエストラジオール、Ｅ７０１０、メトキシベンゼンスルホンアミド、ビノレルビン、ビンフルニン、ビンデシン、ドラスタチン、スポンジスタチン、リゾキシン、タシドチン、ハリコンドリン、ヘミアステリン、クリプトフィシン５２、ＭＭＡＥ、及びエリブリンメシラートが挙げられる。

【0178】

代替実施形態では、ＡＤＣと組み合わせて使用される治療薬は、ＰＡＲＰ阻害剤、例えば、オラパリブ、タラゾパリブ（ＢＭＮ－６７３）、ルカパリブ、ベリパリブ、ＣＥＰ９７２２、ＭＫ４８２７、ＢＧＢ－２９０、ＡＢＴ－８８８、ＡＧ０１４６９９、ＢＳＩ－２０１、ＣＥＰ－８９８３、または３－アミノベンズアミドである。

【0179】

別の代替実施形態では、ＡＤＣと組み合わせて使用する治療薬は、ブルトン型チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、イブルチニブ（ＰＣＩ－３２７６５）、ＰＣＩ－４５２９２、ＣＣ－２９２（ＡＶＬ－２９２）、ＯＮＯ－４０５９、ＧＤＣ－０８３４、ＬＦＭ－Ａ１３またはＲＮ４８６などである。

【0180】

更に別の代替実施形態では、ＡＤＣと組み合わせて使用する治療薬は、ＰＩ３Ｋ阻害剤、例えば、イデラリシブ、ウォルトマンニン、デメトキシビリジン、ペリフォシン、ＰＸ－８６６、ＩＰＩ－１４５（デュベリシブ）、ＢＡＹ８０－６９４６、ＢＥＺ２３５、ＲＰ６５３０、ＴＧＲ１２０２、ＳＦ１１２６、ＩＮＫ１１１７、ＧＤＣ－０９４１、ＢＫＭ１２０、ＸＬ１４７、ＸＬ７６５、パロミド５２９、ＧＳＫ１０５９６１５、ＺＳＴＫ４７４、ＰＷＴ３３５９７、ＩＣ８７１１４、ＴＧ１００－１１５、ＣＡＬ２６３、ＰＩ－１０３、ＧＮＥ４７７、ＣＵＤＣ－９０７、ＡＥＺＳ－１３６、またはＬＹ２９４００２である。

【0181】

本ＡＤＣ（抗体または抗体フラグメントにコンジュゲートしたカンプトテシン複合体を含む）を単独で、または１種または複数種のその他治療薬、例えば、第二抗体、第二抗体フラグメント、第二イムノコンジュゲート、放射性核種、毒素、薬物、化学療法剤、放射線治療、ケモカイン、サイトカイン、免疫調節薬、酵素、ホルモン、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡなどと組み合わせて使用してもよいということを、当業者は理解するであろう。このような別の治療薬を、本抗体薬物ＡＤＣとは別々に、それらと組み合わせて、またはそれらに結合させた状態で、投与してもよい。

【0182】

製剤及び投与
複合体の好適な投与経路としては、経口投与、非経口投与、皮下投与、直腸投与、経粘膜投与、腸内投与、筋肉内注射、髄内注射、硬膜内注射、直接心室内注射、静脈内注射、硝子体内注射、腹腔内注射、鼻腔内注射、または眼内注射が挙げられるがこれらに限定されない。好ましい投与経路は非経口である。あるいは、例えば、固形腫瘍に直接化合物を注入することにより、全身ではなく局所に化合物を投与してもよい。

【0183】

薬学的に有用な組成物を調製するための周知の方法に従いＡＤＣを製剤化してもよい（ＡＤＣを薬学的に好適な賦形剤と混合物中で混合する）。滅菌リン酸緩衝生理食塩水は、薬学的に好適な賦形剤の一例である。その他の好適な賦形剤は当業者に周知である。例えば、Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ，５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｌｅａ ＆ Ｆｅｂｉｇｅｒ １９９０）、及びＧｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ １９９０）、ならびにそれらの改訂版を参照されたい。

【0184】

好ましい実施形態では、ＡＤＣは、Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ－（２－アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、３－（Ｎ－モルホリニル）－２－ヒドロキシプロパンプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、及びピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）［Ｐｉｐｅｓ］からなる群から選択される緩衝液を使用して、グッド生化学用緩衝液（ｐＨ６～７）中で製剤化される。より好ましい緩衝液はＭＥＳまたはＭＯＰＳであり、好ましくは２０～１００ｍＭの濃度範囲、より好ましくは約２５ｍＭである。２５ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．５が最も好ましい。製剤は更に、添加剤として２５ｍＭのトレハロース及び０．０１％（体積／体積）のポリソルベート８０を含んでいてもよい（添加剤を加えた状態で、最終緩衝液濃度を２２．２５ｍＭに調節）。好ましい保管方法は、複合体の凍結乾燥製剤で、－２０℃～２℃の温度範囲で保管することであり、最も好ましくは、２℃～８℃で保管することである。

【0185】

例えば、ボーラス注入、低速注入または持続注入による静脈内投与用に、ＡＤＣを製剤化してもよい。本発明の抗体は、約４時間未満にわたって注入されることが好ましく、また、約３時間未満にわたって注入されることがより好ましい。例えば、最初の２５～５０ｍｇを３０分間以内、更に好ましくは１５分間以内に注入してから、残りをその先２～３時間にわたって注入してもよい。皮下投与が所望される場合、例えば、米国特許番号９，１８０，２０５に開示されているように、抗体を濃縮してもよい（その実施例セクションは参照として本明細書に組み込まれる）。皮下注射では、１、２または３ｍｌの注入量で投与してもよく、単一部位、または２ヶ所またはそれ以上の部位に注射してもよい。それぞれの注射は通常、１．５～４ｍｇ／ｋｇの濃縮ＡＤＣを含有している。

【0186】

防腐剤を添加した単位投与剤形（例えば、アンプル）または複数回用量の容器で、注射用製剤を提供してもよい。組成物を懸濁剤、液剤、または油性溶媒または水性溶媒中のエマルション剤などの剤形としてもよく、また懸濁化剤、安定化剤及び／または分散剤などの配合剤を含有していてもよい。あるいは、活性成分を、使用前に好適な溶媒、例えば、滅菌した発熱物質を含まない水で戻す粉末形態としてもよい。

【0187】

別の薬学的な方法を採用して、治療用複合体の作用持続時間をコントロールしてもよい。ＡＤＣと複合体となるまたはＡＤＣを吸着するポリマーを使用して、放出制御製剤を調製してもよい。例えば、生体適合性ポリマーとしては、ポリ（エチレン－ｃｏ－酢酸ビニル）のマトリックス、及びステアリン酸二量体とセバシン酸のポリ無水物コポリマーのマトリックスが挙げられる（Ｓｈｅｒｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１４４６（１９９２））。このようなマトリックスからのＡＤＣの放出速度は、ＡＤＣの分子量、マトリックス内におけるＡＤＣの量、及び分散粒子のサイズに依存する（Ｓａｌｔｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．５５：１６３（１９８９）；Ｓｈｅｒｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ）。その他の固体剤形については、Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ，５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｌｅａ ＆ Ｆｅｂｉｇｅｒ １９９０）、及びＧｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ １９９０）、ならびにそれらの改訂版に記載されている。

【0188】

一般的に、ヒトへのＡＤＣの投与量は、患者の年齢、体重、身長、性別、全身状態、及び以前の病歴などの因子に応じて変化する。約１ｍｇ／ｋｇ～２４ｍｇ／ｋｇの範囲の単回静注用量でＡＤＣをレシピエントに投与することが望ましい場合がある（状況に応じて、より少ないまたはより多い用量もまた投与可能ではあるが）。７０ｋｇの患者に対する１～２０ｍｇ／ｋｇの用量は、例えば、１．７ｍの患者に対する７０～１，４００ｍｇ、または４１～８２４ｍｇ／ｍ^２の用量である。必要に応じ、例えば、４～１０週間にわたり週に１回、８週間にわたり週に１回、または４週間にわたり週に１回などで、投薬を繰り返してもよい。また維持療法の必要に応じ、より少ない頻度で、例えば、数ヶ月間にわたり１週おき、または、何ヶ月にもわたり毎月または３ヶ月に１回などで投与してもよい。好ましい用量としては、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１３ｍｇ／ｋｇ、１４ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１６ｍｇ／ｋｇ、１７ｍｇ／ｋｇ、１８ｍｇ／ｋｇ、１９ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２２ｍｇ／ｋｇ及び２４ｍｇ／ｋｇを挙げることができるがこれらに限定されない。１～２４ｍｇ／ｋｇの範囲の任意の量を用いてもよい。この用量を、週に１回または週に２回、複数回投与することが好ましい。４週間の最短投与スケジュール、より好ましくは８週間、より好ましくは１６週間またはより長い投与スケジュールを用いてもよい。投与スケジュールは、（ｉ）週に１回、（ｉｉ）１週おき、（ｉｉｉ）１週間の治療に続いて２、３または４週間の休薬、（ｉｖ）２週間の治療に続いて１、２、３または４週間の休薬、（ｖ）３週間の治療に続いて１、２、３、４または５週間の休薬、（ｖｉ）４週間の治療に続いて１、２、３、４または５週間の休薬、（ｖｉｉ）５週間の治療に続いて１、２、３、４または５週間の休薬、及び（ｖｉｉｉ）毎月からなる群から選択されるサイクルで、週に１回または週に２回の投与を含んでいてもよい。このサイクルを、４、６、８、１０、１２、１６もしくは２０回、またはそれ以上の回数繰り返してもよい。

【0189】

あるいは、１週間おきまたは２週間おきに１回の投薬で、合計少なくとも３回の投薬となるように、繰り返しＡＤＣを投与してもよい。または、４～６週間にわたり週に２回投与してもよい。約２００～３００ｍｇ／ｍ^２（１．７ｍの患者に対して１回の投薬あたり３４０ｍｇ、または７０ｋｇの患者に対して４．９ｍｇ／ｋｇ）にまで投与量を下げる場合、４～１０週間にわたり週に１回または更に週に２回投与してもよい。あるいは、投与スケジュール頻度を少なく、すなわち、２～３ヶ月間にわたり１週間おきまたは２週間おきとしてもよい。しかしながら、更に高用量、例えば、週に１回または１～２週間おきに１回、１２ｍｇ／ｋｇを、反復投与サイクル、低速ｉ．ｖ．注入で投与可能であることも明らかとなっている。投与スケジュールをその他の間隔で任意選択的に繰り返してもよく、また、適切に調節した用量及びスケジュールで、様々な非経口経路を介して投与してもよい。

【0190】

好ましい実施形態では、ＡＤＣは、がんの治療に使用する。がんの例としては、がん、リンパ腫、膠芽腫、黒色腫、肉腫、白血病、骨髄腫またはリンパ性悪性腫瘍が挙げられるがこれらに限定されない。このようながんのより詳細な例としては、以下に記載するもの、例えば、扁平上皮細胞癌（例えば、上皮扁平細胞癌）、ユーイング肉腫、ウィルムス腫瘍、星状細胞腫、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、及び肺の扁平上皮癌を含む）、腹膜の癌、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）癌または胃（ｓｔｏｍａｃｈ）癌（胃腸癌を含む）、膵臓癌、多形膠芽腫、頸部癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｍａ）、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、神経内分泌腫瘍、髄様甲状腺癌、分化甲状腺癌、乳癌、卵巣癌、結腸癌、直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓（ｋｉｄｎｅｙ）癌または腎臓（ｒｅｎａｌ）癌、前立腺癌、外陰癌、肛門癌、陰茎癌に加えて、頭頸部癌が挙げられる。用語「がん」は、原発性の悪性細胞または悪性腫瘍（例えば、元の悪性新生物部位または腫瘍部位以外の対象の体内部位に細胞が遊走していない悪性細胞または悪性腫瘍）及び二次性の悪性細胞または悪性腫瘍（例えば、転移により生じた悪性細胞または悪性腫瘍、原始腫瘍部位とは異なる二次的な部位への悪性細胞または腫瘍細胞の遊走）を含む。

【0191】

がんまたは悪性腫瘍のその他の例としては、急性小児期リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、成人（原発性）肝細胞癌、成人（原発性）肝臓癌、成人急性リンパ性白血病、成人急性骨髄性白血病、成人ホジキンリンパ腫、成人リンパ性白血病、成人非ホジキンリンパ腫、成人原発性肝臓癌、成人軟部組織肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ＡＩＤＳ関連悪性腫瘍、肛門癌、星状細胞腫、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳癌、腎盂及び尿管の癌、中枢神経系（原発性）リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、頸部癌、小児期（原発性）肝細胞癌、小児期（原発性）肝臓癌、小児期急性リンパ芽球性白血病、小児期急性骨髄性白血病、小児期脳幹神経膠腫、小児期小脳星状細胞腫、小児期大脳星状細胞腫、小児期頭蓋外胚細胞腫瘍、小児期ホジキン病、小児期ホジキンリンパ腫、小児期視床下部及び視覚路神経膠腫、小児期リンパ芽球性白血病、小児期髄芽腫、小児期非ホジキンリンパ腫、小児期松果体及びテント上未分化神経外胚葉性腫瘍、小児期原発性肝臓癌、小児期横紋筋肉腫、小児期軟部組織肉腫、小児期視覚路及び視床下部神経膠腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、内分泌腺膵島細胞癌、子宮内膜癌、上衣腫、上皮癌、食道癌、ユーイング肉腫及び関連腫瘍、外分泌膵臓癌、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼球癌、女性乳癌、ゴーシェ病、胆嚢癌、胃癌、胃腸カルチノイド腫瘍、胃腸腫瘍、胚細胞腫瘍、妊娠栄養膜腫瘍、毛様細胞性白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、ホジキンリンパ腫、高ガンマグロブリン血症、下咽頭癌、腸癌、眼内黒色腫、島細胞癌、島細胞膵臓癌、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、唇及び口腔癌、肝臓癌、肺癌、リンパ増殖性疾患、マクログロブリン血症、男性乳癌、悪性中皮腫、悪性胸腺腫、髄芽腫、黒色腫、中皮腫、転移性潜在性原発性扁平頸部癌、転移性原発性扁平頸部癌、転移性扁平頸部癌、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病（Ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ Ｌｅｕｋｅｍｉａ）、骨髄性白血病（Ｍｙｅｌｏｉｄ Ｌｅｕｋｅｍｉａ）、骨髄増殖性疾患、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚癌、非小細胞肺癌、潜在性原発性転移性扁平頸部癌、口咽頭癌、骨／悪性線維性肉腫、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓癌、パラプロテイン血症、真性多血症、上皮小体癌、陰茎癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性肝臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎盂及び尿管癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、サルコイドーシス肉腫、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平頸部癌、胃癌、テント上原始神経外胚葉性及び松果体腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺腫、甲状腺癌、腎盂及び尿管の移行細胞癌、移行性腎盂及び尿管癌、栄養膜腫瘍、尿管及び腎盂細胞癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、腟癌、視覚路及び視床下部神経膠腫、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍、及び任意のその他過剰増殖性疾患（上記器官系に位置する腫瘍形成を除く）が挙げられるがこれらに限定されない。

【0192】

本明細書及び本願請求項に記載の方法及び組成物を用いて、上記の疾患を含むがこれらに限定されない悪性状態または前悪性状態を治療してもよく、新生物状態または悪性状態への進行を防止してもよい。このような使用は、腫瘍形成またはがんへの上記進行が分かっているまたは疑われる状態（特に、過形成、化生からなる非新生物細胞増殖、最も特に、異形成が生じている状態）であることを意味している（このような異常増殖状態について確認する場合、Ｒｏｂｂｉｎｓ ａｎｄ Ａｎｇｅｌｌ，Ｂａｓｉｃ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２ｄ Ｅｄ．，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ｐｐ．６８－７９（１９７６）を参照のこと）。

【0193】

異形成は多くの場合、がんの前兆であり、主に上皮で見つかっている。異形成は非新生物細胞増殖における最も無秩序な形態であり、個々の細胞の均一性低下及び細胞の構築配向性低下を伴う。異形成は特質上、慢性的な刺激または炎症が存在する場所に生じる。治療可能な異形成疾患としては、無汗症性外胚葉性異形成、前後異形成、窒息性胸郭異形成、心房指異形成、気管支肺異形成、大脳異形成、子宮頸部異形成、軟骨外胚葉性異形成、鎖骨頭蓋異形成、先天性外胚葉性異形成、頭蓋骨幹異形成、頭蓋骨手根骨足根骨異形成、頭蓋骨幹端異形成、象牙質異形成、骨幹異形成、外胚葉性異形成、エナメル質異形成、脳眼異形成、骨端半肢異形成、多発性骨端異形成（ｄｙｓｐｌａｓｉａ ｅｐｉｐｈｙｓｉａｌｉｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）、点状骨端異形成、上皮異形成、顔面指趾生殖器異形成、家族性線維性顎異形成、家族性白色襞性異形成、線維筋性異形成、骨の線維性異形成、開花性骨異形成、遺伝性腎網膜異形成、発汗性外胚葉性異形成、無汗性外胚葉性異形成、リンパ球減少性胸腺異形成、乳房異形成、下顎顔面異形成、骨幹端異形成、モンディーニ異形成、単発性線維性異形成、粘膜上皮異形成、多発性骨端異形成（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｅｐｉｐｈｙｓｉａｌ ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、眼耳脊椎異形成、眼歯指異形成、眼脊椎異形成、歯牙異形成症、眼下顎異形成（ｏｐｔｈａｌｍｏｍａｎｄｉｂｕｌｏｍｅｌｉｃ ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、根尖性セメント質異形成症、多骨性線維性骨異形成、偽軟骨発育不全脊椎骨端異形成、網膜異形成、中隔視神経異形成症、脊椎骨端異形成、及び心室橈骨異形成が挙げられるがこれらに限定されない。

【0194】

治療可能な別の新生物発生前疾患としては、良性増殖異常疾患（例えば、良性腫瘍、線維嚢胞症、組織肥大、腸ポリープまたは腺腫、及び食道異形成）、白斑症、角化症、ボーエン病、農夫皮膚、日光口唇炎、及び日光角化症が挙げられるがこれらに限定されない。

【0195】

好ましい実施形態では、本発明の方法を、がん（特に上で列挙したがん）の増殖、進行及び／または転移を阻害するために使用する。

【0196】

別の過剰増殖性疾患、障害及び／または症状としては、悪性腫瘍の進行及び／または転移、ならびに、関連疾患、例えば、白血病（急性白血病、例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病［骨髄芽球性白血病、前骨髄性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、及び赤白血病を含む］を含む）及び慢性白血病（例えば、慢性骨髄性［顆粒球性］白血病、及び慢性リンパ性白血病）、真性多血症、リンパ腫（例えば、ホジキン病及び非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、ならびに固形腫瘍（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、頸部癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、希突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、及び網膜芽細胞腫などの肉腫及びがんを含むがこれらに限定されない）などの進行及び／または転移が挙げられるがこれらに限定されない。

【0197】

ＡＤＣを用いて治療可能な自己免疫疾患としては、急性及び慢性の免疫血小板減少症、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、真性糖尿病、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、ＡＮＣＡ関連血管炎、アジソン病、関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、バージャー病、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発筋炎／皮膚筋炎、多発軟骨炎、水疱性類天疱瘡、尋常性天疱瘡、ヴェゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎／多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬、または線維性肺胞炎を挙げてもよい。

【0198】

キット
様々な実施形態は、患者の疾患組織を治療するのに好適な構成要素を含有するキットに関係していてもよい。例示的なキットは、本明細書に記載の少なくとも１種のＡＤＣまたはその他標的化部分を含有していてもよい。投与用の構成要素を含有する組成物が、経口送達などによる消化管を介した送達用に製剤化されていない場合、一部の別の経路でキット構成要素を送達可能なデバイスが含まれていてもよい。非経口送達などの用途に用いる１種のデバイスは、対象の体内に組成物を注射するのに用いる注射器である。吸入用デバイスを使用してもよい。

【0199】

キット構成要素は、共にパッケージ化されてもよく、または２つまたはそれ以上の容器に分けてパッケージ化されてもよい。一部の実施形態では、容器は、復元に好適な組成物の滅菌凍結乾燥製剤を含有するバイアル瓶であってもよい。キットはまた、その他の試薬の復元及び／または希釈に好適な１種または複数種の緩衝液を含有していてもよい。使用可能なその他の容器としては、ポーチ、トレー、ボックス、チューブなどが挙げられるがこれらに限定されない。キット構成要素は、パッケージ化されてもよく、また容器内において滅菌状態に維持されてもよい。含まれ得る別の構成要素は、キットを使用する個人に向けた、その使用に関する取扱説明書である。

【実施例】

【0200】

本発明の様々な実施形態について以下の実施例を用いて説明するが、その範囲を制限するものではない。

【0201】

実施例１．抗Ｔｒｏｐ－２－ＳＮ－３８抗体薬物複合体の調製及び使用
米国特許番号７，２３８，７８５に記載のとおり、ヒト化ＲＳ７（ｈＲＳ７）抗Ｔｒｏｐ－２抗体を作製した（その図面セクション及び実施例セクションは参照として本明細書に組み込まれる）。米国特許７，９９９，０８３に従い、ＣＬ２Ａリンカーに結合したＳＮ－３８を調製してから、ｈＲＳ７（抗Ｔｒｏｐ－２）抗体、ｈＰＡＭ４（ＭＵＣ５ａｃ）抗体、ｈＡ２０（抗ＣＤ２０）抗体またはｈＭＮ－１４（抗ＣＥＡＣＡＭ５）抗体にコンジュゲートした（その実施例１０及び実施例１２は参照として本明細書に組み込まれる）。コンジュゲーションプロトコルにより、抗体分子１つあたり結合したＳＮ－３８分子が約６つという比率となった。

【0202】

皮下ヒト膵臓または結腸腫瘍異種移植片を有する免疫不全無胸腺ヌードマウス（雌）を、特異的なＣＬ２Ａ－ＳＮ－３８複合体または対照複合体のいずれかで治療するか、または、治療せずに放置した。特異的な複合体に治療効果が認められた。Ｃａｐａｎ １膵臓腫瘍モデルにおいて、特異的な、ｈＲＳ７（抗Ｔｒｏｐ－２）抗体、ｈＰＡＭ４（抗ＭＵＣ－５ａｃ）抗体及びｈＭＮ－１４（抗ＣＥＡＣＡＭ５）抗体のＣＬ２Ａ－ＳＮ－３８複合体は、対照ｈＡ２０－ＣＬ２Ａ－ＳＮ－３８複合体（抗ＣＤ２０）及び未治療対照（データは省略）と比較して、より優れた効果を示した。ヒト膵臓癌のＢＸＰＣ３モデルと同様に、特異的なｈＲＳ７－ＣＬ２Ａ－ＳＮ－３８は、対照治療（データは省略）と比較して、より優れた治療効果を示した。

【0203】

実施例２．チェックポイント阻害薬治療に耐性を示す患者における抗Ｔｒｏｐ－２ ＡＤＣ（サシツズマブゴビテカン）の治療的使用
要約
ＩＭＭＵ－１３２（サシツズマブゴビテカン、別名、ｈＲＳ７－ＣＬ２Ａ－ＳＮ－３８）は、転移性トリプルネガティブ乳癌及びその他のがんを有する患者（多数の前治療暦があり（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ，ＮＣＴ０１６３１５５２）、高レベルのＴｒｏｐ－２を発現）の第ＩＩ相試験において、有望な治療結果を示した。この新規のＴｒｏｐ－２標的化ヒト化抗体は、上述したＣＬ２Ａリンカーで７．６モルのＳＮ－３８（イリノテカンの活性化形態）とコンジュゲートされており、イリノテカンと比較して、インビボでより少なくグルクロン酸抱合され、この薬剤で治療した患者における極めて低い下痢発症率に対する説明となる。

【0204】

驚くべきことに、ＩＭＭＵ－１３２は、以前より、多くの標準的な抗がん治療薬（親化合物イリノテカンを含む）から再発した、または多くの標準的な抗がん治療薬（親化合物イリノテカンを含む）に耐性を示す患者において非常に有効である。チェックポイント阻害薬として周知の新しい部類の抗がん剤としては、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）、プログラム細胞死タンパク質（ＰＤ－１）及びプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）に対する抗体またはその他阻害薬が挙げられる。本明細書に記載するとおり、ＩＭＭＵ－１３２は、チェックポイント阻害薬に加えその他抗がん剤に再発／耐性を示す腫瘍に対する驚くべき予想外な効果を示している。

【0205】

以下のデータは、ＰＤ－Ｌ１阻害薬に耐性を示した後にＩＭＭＵ－１３２による治療に反応した患者（２５５－０２９）における、例示的なケーススタディーの結果についてまとめている。
がん：ＴＮＢＣ（ＰＤ－Ｌ１治療後の患者において進行）
最良効果：部分寛解が確認された（５４％縮小）
ＩＭＭＵ－１３２開始用量：１０ｍｇ／ｋｇ
ＩＭＭＵ－１３２による治療回数：４０＋
無増悪期間：１２．４＋ヶ月間（到達せず）
試験の終了：治療継続

【0206】

病歴－患者は、２００７年１０月、右乳房に１．８ｃｍの腫瘤があると初めて診断された４７歳女性である。彼女はセンチネルリンパ節生検において右乳房切除を受けた（リンパ節に悪性新生物は認められなかった）。腫瘍は、ＥＲ、ＰＲ及びＨｅｒ－２に対して陰性である（すなわち、ＴＮＢＣ）と同定された。彼女は、４サイクルのＡＣ（ドキソルビシン及びシクロホスファミド）治療に進み、その後、週に１回低用量のパクリタキセル（ｘ１２）を投与された。２００８年１０月、ＣＴ検査により、以前には見つかっていない肺リンパ節及び肥大した乳房リンパ節が認められ、そのリンパ節はがんであった。彼女は、リンパ節を除去するための局所手術を受け、その後、２００９年３月までＸＲＴ（放射線治療）を受けた。２０１０年６月、ＣＴにより、再発性の肺浸潤及び骨浸潤が記録された。アバスチン（登録商標）（ベバシズマブ）、ＭＥＴＭＡＢ（登録商標）（オナルツズマブ、抗肝細胞増殖因子）、及びタキソール（登録商標）（パクリタキセル）を用いる臨床試験（彼女は２０１３年３月まで継続）に組み入れられた患者は、完全寛解となったが、最終的には、末梢肺リンパ節及びＡＰ（大動脈肺動脈）窓リンパ節に増悪がみられた。彼女は２０１４年９月に６サイクルのＰＤ－Ｌ１抗体（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）を開始したが、２０１５年１月に増悪した。その後、彼女はＩＭＭＵ－１３２試験に組み込まれた。

【0207】

ＩＭＭＵ－１３２治療－患者は、２０１５年２月６日に１０ｍｇ／ｋｇの用量で治療を開始し、計画スケジュールから減量または延期することなくこの投与量を継続しており、現在の投与回数は４０＋となっている。

【0208】

結果
患者には当初、直径の合計が６０ｍｍに及ぶ３つの標的病変（肺に１つ、胸部リンパ節が２つ）、及び別の非標的病変（胸部の別のリンパ節）が認められた（図２）。最初の評価時（２０１５年４月７日）において、患者の標的病変直径の合計は３３％減少しており、ＲＥＣＩＳＴ １．１における部分寛解と評価された。約５週間後（２０１５年５月１８日）に実施した確認用の追跡ＣＴでは、４８％の全体縮小を伴う効果改善が認められた（図３、図４）。２０１５年７月１９日時点におけるＣＴでは、患者の継続的な部分寛解（５０％の縮小を伴う）が認められた。２０１５年９月１３日時点におけるＣＴでは、５２％の縮小を伴う継続的なＰＲが認められ、また２０１５年１１月１５日時点におけるＣＴでは、５４％の縮小が認められた。２０１６年２月２５日に実施した最新のＣＴでは、４６％の縮小を伴う継続的なＰＲが認められた。

【0209】

ＣＴ結果の要約を図１に示す。ベースライン時のＣＴスキャンを図２に示す（上段にアキシャル像、下段にサジタル像、腫瘍は矢印で示されている）。標的病変の直接比較を図３及び図４に示す。図３は、同一平面で撮影した両方の標的病変１及び２を示している。ベースライン（２０１５年１月２９日）を上部に示す。下部に示す２回目の効果判定評価（２０１５年５月１９日）では、Ｌ１とＬ２の両方において著しい縮小が明白となった。図４は、標的病変３を撮影した同等の画像を示している（上部にベースライン、下部に２回目の効果判定評価）。以前チェックポイント阻害薬治療に失敗した後、患者は、ＩＭＭＵ－１３２による治療を続け部分寛解状態を継続している。

【0210】

患者の腫瘍におけるＴｒｏｐ－２発現の免疫組織化学解析では、染色レベル２＋の陽性発現が認められた（データは省略）。

【0211】

毒性－この報告の日時における、最も重篤な副作用はＧ３低リン血症（関連性なし）であり、関連毒性と考えられる副作用は、Ｇ２好中球減少症（２０１５年４月２日、投与６回目）、疲労（Ｇ１）、悪心（Ｇ１）、斑状丘疹状発疹（Ｇ１）、脱毛症（Ｇ２）及び鼻漏（Ｇ１）であった。

【0212】

これらの結果は、以前よりチェックポイント阻害薬治療から再発した、またはチェックポイント阻害薬に耐性を示している患者において、ＩＭＭＵ－１３２が極めて有効であることを示している。治療量のＩＭＭＵ－１３２では、患者は管理可能な毒性のみを示した。これらの結果は、Ｔｒｏｐ－２陽性がん、例えば、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）などに対するＩＭＭＵ－１３２の有効性を示している。

【0213】

実施例３．抗Ｔｒｏｐ－２ ＡＤＣのＡＤＣＣ活性
ｈＲＳ７ ＩｇＧとの比較で、様々なｈＲＳ７－ＡＤＣ複合体のＡＤＣＣ活性を測定した（データは省略）。Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙから購入した血液からＰＢＭＣを精製した。Ｔｒｏｐ－２陽性ヒト膵腺癌細胞株（ＢｘＰＣ－３）を標的細胞株として使用した（エフェクター：標的の比率、１００：１）。ｈＲＳ７ ＩｇＧが関与するＡＤＣＣを、ｈＲＳ７－Ｐｒｏ－２－ＰＤｏｘ、ｈＲＳ７－ＣＬ２Ａ－ＳＮ－３８、及び還元して末端保護したｈＲＳ７－ＮＥＭと比較した。全て３３．３ｎＭで用いた。

【0214】

全体活性は低いが有意であった（データは省略）。ｈＲＳ７－Ｐｒｏ－２－ＰＤｏｘと比較して有意差のなかったｈＲＳ７ ＩｇＧに、８．５％特異的溶解が認められた。それら両方は、ｈＬＬ２対照及びｈＲＳ７－ＮＥＭならびにサシツズマブゴビテカンと比較して有意に優れていた（Ｐ＜０．０２、両側ｔ検定）。ｈＲＳ７－ＮＥＭとサシツズマブゴビテカンの間に差異は認められなかった。

【0215】

実施例４．多種多様な上皮癌に対する抗Ｔｒｏｐ－２－ＳＮ－３８ ＡＤＣの効果（インビボ）
抄録
この試験の目的は、いくつかのヒト固形腫瘍タイプに対するＳＮ－３８抗Ｔｒｏｐ－２（ｈＲＳ７）ＡＤＣの効果を評価すること、及び、マウス及びサルにおけるＳＮ－３８抗Ｔｒｏｐ－２（ｈＲＳ７）ＡＤＣの忍容性（後者においては、ヒトに類似のｈＲＳ７に対する組織交差反応性が認められた）を評価することであった。２種のＳＮ－３８誘導体、ＣＬ２－ＳＮ－３８及びＣＬ２Ａ－ＳＮ－３８を、抗Ｔｒｏｐ－２ヒト化抗体、ｈＲＳ７にコンジュゲートさせた。それらＡＤＣを、安定性、結合性及び細胞傷害性について、インビトロでキャラクタライズした。Ｔｒｏｐ－２抗原を発現した５種の異なるヒト固形腫瘍異種移植モデルを用いて、効果を試験した。マウス及びカニクイザルを用いて毒性を評価した。

【0216】

２種のＳＮ－３８誘導体のｈＲＳ７複合体は、薬物置換（約６）、細胞結合性（Ｋ_ｄ、約１．２ｎｍｏｌ／Ｌ）、細胞傷害性（ＩＣ_５０、約２．２ｎｍｏｌ／Ｌ）及びインビトロ血清中安定性（ｔ／_１／２、約２０時間）において同等であった。細胞をＡＤＣに曝すとＰＡＲＰ切断をもたらすシグナル伝達経路が認められたが、遊離ＳＮ－３８と比較して、ｐ５３及びｐ２１の上方制御に差異が認められた。非標的化対照ＡＤＣと比較した際、Ｃａｌｕ－３腫瘍（Ｐ≦０．０５）、Ｃａｐａｎ－１腫瘍（Ｐ＜０．０１８）、ＢｘＰＣ－３腫瘍（Ｐ＜０．００５）、及びＣＯＬＯ ２０５腫瘍（Ｐ＜０．０３３）を有するマウスにおいて、非毒性用量のサシツズマブゴビテカンが有意な抗腫瘍効果をもたらした。マウスは、ＡＬＴ及びＡＳＴの肝酵素レベルを短期間上昇させただけで、２ ｘ １２ｍｇ／ｋｇ（ＳＮ－３８当量）の用量に耐性を示した。２ ｘ ０．９６ｍｇ／ｋｇを注入したカニクイザルは、単に一時的な血球数減少を示したが、重要なことに、その値は正常範囲未満には低下しなかった。

【0217】

要約すると、抗Ｔｒｏｐ－２ ｈＲＳ７－ＣＬ２Ａ－ＳＮ－３８ ＡＤＣは、ある種のヒト固形腫瘍タイプに対する有意かつ特異的な抗腫瘍効果をもたらした。ヒトと類似した組織Ｔｒｏｐ－２発現を有するサルは、臨床的に意義のある用量において、十分に耐性を示した。

【0218】

緒言
固形腫瘍を有する患者において奏効するイリノテカン治療は、大部分において、活性なＳＮ－３８代謝物へのＣＰＴ－１１プロドラッグの低変換率により、限定的なものであった。この変換の必要性をバイパスしてＳＮ－３８を受動的に腫瘍へと送達するための方法として、非標的化形態のＳＮ－３８が試験されている。本発明者らは、ＳＮ－３８を、ヒト化抗Ｔｒｏｐ－２抗体、ｈＲＳ７に共有結合でコンジュゲートさせた。この抗体薬物複合体は、ある種のｓ．ｃ．ヒトがん異種移植モデル（非小細胞肺癌、膵臓癌、結腸癌及び扁平上皮細胞肺癌を含む）に特異的な抗腫瘍効果（全て非毒性用量（例えば、≦３．２ｍｇ／ｋｇの累積ＳＮ－３８等用量）で）を有している。Ｔｒｏｐ－２は多くの上皮癌において広く発現しているが、一部の正常組織においても発現しているため、カニクイザルにおける用量漸増試験を実施してこの複合体の臨床的安全性を評価した。サルは、軽微で可逆的な毒性を示すだけで、２４ｍｇ ＳＮ－３８当量／ｋｇに耐性を示した。その腫瘍標的化プロファイル及び安全性プロファイルにより、サシツズマブゴビテカンは、イリノテカンに反応を示す固形腫瘍の管理において著しい改善をもたらしている。

【0219】

原料及び方法
細胞株、抗体及び化学療法剤－この試験に使用した全てのヒトがん細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入した。これらには、Ｃａｌｕ－３（非小細胞肺癌）、ＳＫ－ＭＥＳ－１（扁平上皮細胞肺癌）、ＣＯＬＯ ２０５（結腸腺癌）、Ｃａｐａｎ－１及びＢｘＰＣ－３（膵腺癌）、ならびにＰＣ－３（前立腺癌）が含まれる。Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．において、ヒト化ＲＳ７ ＩｇＧ抗体、ならびに、対照のヒト化抗ＣＤ２０（ｈＡ２０ ＩｇＧ、ベルツズマブ）抗体及び抗ＣＤ２２（ｈＬＬ２ ＩｇＧ、エプラツズマブ）抗体を作製した。イリノテカン（２０ｍｇ／ｍＬ）は、Ｈｏｓｐｉｒａ，Ｉｎｃ．から入手した。

【0220】

ＳＮ－３８ ＡＤＣ及びインビトロ態様－ＣＬ２－ＳＮ－３８の合成については上で記載している（Ｍｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ５１：６９１６－２６）。ｈＲＳ７ ＩｇＧへのそのコンジュゲート及び血清中安定性については、上記のとおり実施した（Ｍｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ５１：６９１６－２６；Ｇｏｖｉｎｄａｎ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ １５：６０５２－６１）。上記実施例に記載のとおり、ＣＬ２Ａ－ＳＮ－３８（Ｍ．Ｗ．１４８０）及びそのｈＲＳ７複合体の調製、安定性試験、結合性試験及び細胞傷害性試験を実施した。

【0221】

インビボ治療試験－全ての動物実験において、ＳＮ－３８ ＡＤＣ及びイリノテカンの用量は、ＳＮ－３８当量で示される。６の平均置換比率（ＳＮ－３８／ＩｇＧ）を基準とすると、２０ｇマウスへの５００μｇ ＡＤＣの用量（２５ｍｇ／ｋｇ）は、０．４ｍｇ／ｋｇのＳＮ－３８を含有している。イリノテカンの用量も同様に、ＳＮ－３８当量として示される（すなわち、４０ｍｇイリノテカン／ｋｇは、２４ｍｇ／ｋｇのＳＮ－３８と同等である）。

【0222】

ＮＣｒ雌無胸腺ヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウス（４～８週齢）及び雄Ｓｗｉｓｓ－Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（１０週齢）をＴａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ．から購入した。ＳＮＢＬ ＵＳＡ，Ｌｔｄ．において、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ、２．５～４ｋｇの雄及び雌）の忍容性試験を実施した。
異なるヒトがん細胞株を動物に皮下移植した。キャリパーを使用した２寸法測定法により、腫瘍容積（ＴＶ）を測定した（容積はＬ ｘ ｗ^２／２と定義され、式中、Ｌは腫瘍の最長寸法であり、ｗは腫瘍の最短寸法である）。治療開始時の腫瘍サイズは、０．１０～０．４７ｃｍ^３であった。それぞれの実験における治療レジメン、用量、及び、動物の数については、結果に記載している。凍結乾燥させたサシツズマブゴビテカン及び対照ＡＤＣを、必要に応じ、滅菌生理食塩水で戻して希釈した。イリノテカンを除く全ての試薬を腹腔内投与（０．１ｍＬ）した（イリノテカンは静脈内投与した）。投与レジメンは、本発明者らの先行研究（様々な期間長にわたり、３日おきまたは週に２回、ＡＤＣを投与）（Ｍｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ５１：６９１６－２６；Ｇｏｖｉｎｄａｎ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ １５：６０５２－６１）の影響を受けた。この投与頻度は複合体のインビトロ血清中半減期への配慮を反映しており、ＡＤＣへのより持続的な曝露を可能とした。

【0223】

統計－増殖曲線を、初期ＴＶからの経時的なパーセント変化として示す。腫瘍増殖の統計解析は、曲線下面積（ＡＵＣ）を基準とした。線形曲線モデリングにより、個々の腫瘍増殖プロファイルを得た。増殖曲線の統計解析前に群間の等分散性を検定するために、Ｆ検定を採用した。生理食塩水対照を除く様々な治療群及び対照群間の統計的有意性を評価するために両側ｔ検定を使用した一方で、片側ｔ検定を使用した（有意性、Ｐ≦０．０５）。増悪により群内の最初の動物を安楽死させる時点となるまで、ＡＵＣの統計比較を実施した。

【0224】

薬物動態及び体内分布－^１１１Ｉｎ放射能標識したサシツズマブゴビテカン及びｈＲＳ７ ＩｇＧを、ｓ．ｃ．ＳＫ－ＭＥＳ－１腫瘍（約０．３ｃｍ^３）を有するヌードマウスに注入した。１つの群に２０μＣｉ（２５０μｇのタンパク質）の^１１１Ｉｎサシツズマブゴビテカンを静注し、その一方で、別の群に２０μＣｉ（２５０μｇのタンパク質）の^１１１Ｉｎ ｈＲＳ７ ＩｇＧを投与した。様々な時点において、マウス（時点毎に５匹）に麻酔を行い、心臓内穿刺で採血してから、安楽死させた。腫瘍及び様々な組織を取り出してから、重さを量り、γシンチレーションでカウントして、組織１グラムあたりのパーセント注入量（％ＩＤ／ｇ）を求めた。第３の群に２５０μｇの非標識サシツズマブゴビテカンを注入した３日後に、^１１１Ｉｎサシツズマブゴビテカンを投与し、同様に剖検した。両側ｔ検定を使用して、Ｆ検定を用いた等分散性の検定後におけるサシツズマブゴビテカンとｈＲＳ７ ＩｇＧの取り込みを比較した。ＷｉｎＮｏｎＬｉｎソフトウェア（Ｐａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐ．）を使用して、血液クリアランスに関する薬物動態解析を実施した。

【0225】

Ｓｗｉｓｓ－Ｗｅｂｓｔｅｒマウス及びカニクイザルにおける忍容性－簡潔に説明すると、結果に記載するとおりに、マウスを４群に分類して、０日目及び３日目に、それぞれの群に、酢酸ナトリウム緩衝液対照または３つの異なる用量（４、８または１２ｍｇ／ｋｇのＳＮ－３８）のサシツズマブゴビテカンのいずれかで２ｍＬのｉ．ｐ．注入を行ってから、血液及び血清を採取した。カニクイザル（雄３匹及び雌３匹、２．５～４．０ｋｇ）に、２つの異なる用量のサシツズマブゴビテカンを投与した。用量、回数、及び、発生し得る血液毒性を評価するために採血したサルの数、ならびに、血清化学検査については、結果に記載している。

【0226】

結果
ｈＲＳ７－ＳＮ－３８の安定性及び力価－２種類の異なる結合部を用いて、ＳＮ－３８をｈＲＳ７ ＩｇＧにコンジュゲートさせた（図示せず）。第１の結合部はＣＬ２－ＳＮ－３８と呼ばれ、上に記載している（Ｍｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ５１：６９１６－２６；Ｇｏｖｉｎｄａｎ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ １５：６０５２－６１）。リンカー内部のフェニルアラニン部分を除去するＣＬ２合成の変化を利用して、ＣＬ２Ａリンカーを調製した。この変化により合成が簡略化されるが、コンジュゲート結果には影響を与えなかった（例えば、ＣＬ２－ＳＮ－３８とＣＬ２Ａ－ＳＮ－３８の両方には、ＩｇＧ分子毎に約６つのＳＮ－３８が導入された）。並列比較において、血清中安定性、抗原結合性またはインビトロ細胞傷害性に有意差は認められなかった。ＣＬ２内のフェニルアラニン残基が、リソソームプロテアーゼ用のカテプシンＢの設計開裂部位の一部であるため、この結果は驚くべきものであった。

【0227】

ＳＮ－３８リンカーがＣＬ２からＣＬ２Ａへと変化したことが、インビボ力価に影響を与えなかったことを確認するために、ＣＯＬＯ ２０５腫瘍（図示せず）またはＣａｐａｎ－１腫瘍（図示せず）を有するマウス（両方の試験開始時の腫瘍サイズは０．２５ｃｍ^３）において、０．４ｍｇ／ｋｇまたは０．２ｍｇ／ｋｇのＳＮ－３８をそれぞれ週に２回 ｘ ４週間使用して、サシツズマブゴビテカンとｈＲＳ７－ＣＬ２－ＳＮ－３８を比較した。サシツズマブゴビテカンとＣＬ２－ＳＮ－３８複合体の両方は、未治療（ＡＵＣ_１４日間 ＣＯＬＯ ２０５モデルにおいて生理食塩水と比較してＰ＜０．００２；ＡＵＣ_２１日間 Ｃａｐａｎ－１モデルにおいて生理食塩水と比較してＰ＜０．００１）、及び非標的化抗ＣＤ２０対照ＡＤＣ、ｈＡ２０－ＣＬ２Ａ－ＳＮ－３８（ＡＵＣ_１４日間 ＣＯＬＯ－２０５モデルにおいてＰ＜０．００３；ＡＵＣ_３５日間 Ｃａｐａｎ－１モデルにおいてＰ＜０．００２）と比較して、腫瘍増殖を有意に阻害した。Ｃａｐａｎ－１モデルの試験最終日（１４０日目）において、サシツズマブゴビテカンで治療したマウスの５０％及びｈＲＳ７－ＣＬ２－ＳＮ－３８マウスの４０％が腫瘍フリーとなった一方で、ｈＡ２０－ＡＤＣで治療した動物のわずか２０％が疾患の可視徴候を有さなかった。ＣＬ２Ａリンカーは、ＣＬ２（図示せず）と比較して、より高い効果をもたらした。

【0228】

作用機序－インビトロ細胞傷害性試験は、サシツズマブゴビテカンがいくつかの異なる固形腫瘍株に対するｎｍｏｌ／Ｌ範囲のＩＣ_５０値を有することを示した（表２）。遊離ＳＮ－３８のＩＣ_５０は、全ての細胞株において複合体よりも低かった。Ｔｒｏｐ－２発現とサシツズマブゴビテカンへの感受性の間に明らかな相関はなかったが、ＡＤＣ対遊離ＳＮ－３８のＩＣ_５０比はＴｒｏｐ－２高発現細胞においてより低く、より多くの抗原が存在する場合に薬物を内部移行させる機能が高いということを最も反映していると考えられた。

【0229】

ＳＮ－３８が細胞内におけるいくつかのシグナル伝達経路を活性化させてアポトーシスを誘導することが知られている（例えば、Ｃｕｓａｃｋ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６１：３５３５－４０；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．２００９，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ ２７４：４７－５３；Ｌａｇａｄｅｃ ｅｔ ａｌ．，２００８， Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ９８：３３５－４４）。本発明者らの初期の研究では、インビトロでの初期情報伝達現象（ｐ２１^{Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１}及びｐ５３）及び１つの後期アポトーシス現象［ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の切断］に関与する２種類のタンパク質の発現について試験を行った（データは省略）。ＢｘＰＣ－３において、ＳＮ－３８がｐ２１^{Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１}発現を２０倍増加させる（データは省略）一方で、サシツズマブゴビテカンではわずか１０倍の増加（データは省略）となっており、この発見は、この細胞株における遊離ＳＮ－３８の高い活性と一致する（表２）。しかしながら、サシツズマブゴビテカンは、Ｃａｌｕ－３において、遊離ＳＮ－３８と比較して２倍超、ｐ２１^{Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１}発現を増加させた（データは省略）。

【0230】

ｐ５３発現において、サシツズマブゴビテカン媒介性シグナル伝達現象と遊離ＳＮ－３８媒介性シグナル伝達現象の間に大きな相違が認められた（データは省略）。ＢｘＰＣ－３とＣａｌｕ－３の両方において、遊離ＳＮ－３８によるｐ５３の上方制御が４８時間時点まで明らかとはならなかった一方で、サシツズマブゴビテカンは２４時間以内にｐ５３を上方制御させた（データは省略）。加えて、ＡＤＣに曝された細胞内のｐ５３発現は、両方の細胞株において、ＳＮ－３８の場合と比較してより増加していた（データは省略）。興味深いことに、ｈＲＳ７ ＩｇＧはｐ２１^{Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１}発現に対して顕著な影響力を有していなかったにもかかわらず、ｈＲＳ７ ＩｇＧは、ＢｘＰＣ－３とＣａｌｕ－３の両方においてｐ５３の上方制御を誘導した（４８時間の曝露後に限られてはいるが）（データは省略）。後期アポトーシス現象に関して言及すると、ＳＮ－３８または複合体のいずれかでインキュベートした場合、ＰＡＲＰの切断は両方の細胞株において明らかであった（データは省略）。切断ＰＡＲＰの存在は、ＢｘＰＣ－３の２４時間時点においてより多く（データは省略）、そのことは、ｐ２１の高発現及びその低いＩＣ_５０と一致していた。ＡＤＣと比較した場合の遊離ＳＮ－３８によるより高い開裂度合いは、細胞傷害性所見と一致していた。

【0231】

ｈＲＳ７－ＳＮ－３８の効果－いくつかのヒトがんにおいてＴｒｏｐ－２が広く発現していることから、いくつかの異なるヒトがんモデルにおける試験（ｈＲＳ７－ＣＬ２－ＳＮ－３８結合部を使用して開始したが、後ほどＣＬ２Ａ結合部を有する複合体を使用した）を実施した。ｈＲＳ７－ＣＬ２－ＳＮ－３８を、３日おきに４回、０．０４ｍｇ ＳＮ－３８／ｋｇで投与したＣａｌｕ－３を有するヌードマウスには、当量の非標的化ｈＬＬ２－ＣＬ２－ＳＮ－３８を投与された動物と比較して、有意に優れた効果があった（それぞれ、ＴＶ ＝ ０．１４ ± ０．２２ｃｍ^３対０．８０ ± ０．９１ｃｍ^３；ＡＵＣ_４２日間 Ｐ＜０．０２６（データは省略））。０．４ｍｇ／ｋｇ ＳＮ－３８にまで用量を増加させた際に、用量反応が認められた（データは省略）。この高い投与濃度で特異的なｈＲＳ７複合体を投与した全てのマウスは、２８日以内に「治癒」されて、１４７日目の試験終了日まで腫瘍フリーを維持した一方で、関連性のないＡＤＣで治療した動物の腫瘍は再増殖した（特異的対関連性なしのＡＵＣ_９８日間：Ｐ＝０．０５）。ｈＲＳ７ ＩｇＧとＳＮ－３８の混合物を投与されたマウスでは、腫瘍は、５６日目までに＞４．５倍進行した（ＴＶ ＝ １．１０ ± ０．８８ｃｍ^３；ＡＵＣ_５６日間 ｈＲＳ７－ＣＬ２－ＳＮ－３８と比較してＰ＜０．００６）（データは省略）。

【0232】

ヒト結腸（ＣＯＬＯ ２０５）腫瘍異種移植片及び膵臓（Ｃａｐａｎ－１）腫瘍異種移植片に対する効果についても試験した。ＣＯＬＯ ２０５腫瘍を有する動物では（データは省略、ｈｔｔｐ：／／ｃｌｉｎｃａｎｃｅｒｒｅｓ．ａａｃｒｊｏｕｒｎａｌｓ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／１７／１０／３１５７．ｌｏｎｇ－Ｆ３）、ｈＲＳ７－ＣＬ２－ＳＮ－３８（０．４ｍｇ／ｋｇ、ｑ４ｄｘ８）は、対照抗ＣＤ２０ ＡＤＣ（ｈＡ２０－ＣＬ２－ＳＮ－３８）またはｈＲＳ７ ＩｇＧと比較して有意に小さな腫瘍容積（それぞれ、ＴＶ ＝ ０．１６ ± ０．０９ｃｍ^３、１．１９ ± ０．５９ｃｍ^３、及び１．７７ ± ０．９３ｃｍ^３；ＡＵＣ_２８日間 Ｐ＜０．０１６）で、２８日間の治療期間にわたり腫瘍の増殖を妨げた。

【表2】

【0233】

マウス血清が、ヒト血清と比較して、より効率的にイリノテカンをＳＮ－３８に変換できるため（Ｍｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６０：４２０６－１０）、イリノテカンのＭＴＤ（２４ｍｇ ＳＮ－３８／ｋｇ、ｑ２ｄｘ５）はＣＯＬＯ ２０５細胞において、ｈＲＳ７－ＣＬ２－ＳＮ－３８と同程度有効であったが、イリノテカン中のＳＮ－３８用量（２，４００μｇ累積）は、複合体（６４μｇ総量）の３７．５倍超であった。

【0234】

Ｃａｐａｎ－１を有する動物（データは省略）は、ｈＲＳ７－ＣＬ２－ＳＮ－３８複合体に相当する用量のＳＮ－３８を投与した際、イリノテカン単剤に対する有意な効果を示さなかった（例えば、３５日目時点の平均腫瘍サイズは、０．４ｍｇ ＳＮ－３８／ｋｇのｈＲＳ７－ＳＮ－３８を投与された動物で０．０４ ± ０．０５ｃｍ^３対０．４ｍｇ／ｋｇ ＳＮ－３８を投与されてイリノテカン治療を受けた動物で１．７８ ± ０．６２ｃｍ^３；ＡＵＣ_３５日間 Ｐ＜０．００１；データは省略）。イリノテカン用量を１０倍の４ｍｇ／ｋｇ ＳＮ－３８に増加させた際、効果は改善されたが、依然として、０．４ｍｇ／ｋｇ ＳＮ－３８投与濃度の複合体と同程度には有意とならなかった（ＴＶ ＝ ０．１７ ± ０．１８ｃｍ^３対１．６９ ± ０．４７ｃｍ^３、ＡＵＣ_４９日間 Ｐ＜０．００１）（データは省略）。等用量の非標的化ｈＡ２０－ＣＬ２－ＳＮ－３８もまた、イリノテカン治療動物と比較して有意な抗腫瘍効果をもたらしたが、特異的なｈＲＳ７複合体は、関連性のないＡＤＣと比較して有意に優れていた（ＴＶ ＝ ０．１７ ± ０．１８ｃｍ^３対０．８０ ± ０．６８ｃｍ^３、ＡＵＣ_４９日間 Ｐ＜０．０１８）（データは省略）。

【0235】

その後、サシツズマブゴビテカンＡＤＣを用いた試験を、２つの別のモデルのヒト上皮癌へと適用した。ＢｘＰＣ－３ヒト膵臓腫瘍を有するマウス（データは省略）では、サシツズマブゴビテカンは更に、生理食塩水もしくは当量の非標的化ｈＡ２０－ＣＬ２Ａ－ＳＮ－３８（それぞれ、ＴＶ ＝ ０．２４ ± ０．１１ｃｍ^３対１．１７ ± ０．４５ｃｍ^３、及び１．０５ ± ０．７３ｃｍ^３；ＡＵＣ_２１日間 Ｐ＜０．００１）、または、１０倍多いＳＮ－３８等用量でイリノテカン（それぞれ、ＴＶ ＝ ０．２７ ± ０．１８ｃｍ^３対０．９０ ± ０．６２ｃｍ^３；ＡＵＣ_２５日間 Ｐ＜０．００４）を用いて治療した対照マウスと比較して、腫瘍増殖を有意に阻害した（データは省略）。興味深いことに、０．４ｍｇ／ｋｇのＡＤＣで治療したＳＫ－ＭＥＳ－１ヒト扁平細胞肺腫瘍を有するマウス（データは省略）では、腫瘍増殖抑制は、生理食塩水または非コンジュゲートｈＲＳ７ ＩｇＧよりも優れていたが（それぞれ、ＴＶ ＝ ０．３６ ± ０．２５ｃｍ^３対１．０２ ± ０．７０ｃｍ^３、及び１．３０ ± １．０８ｃｍ^３；ＡＵＣ_２８日間 Ｐ＜０．０４３）、非標的化ｈＡ２０－ＣＬ２Ａ－ＳＮ－３８、またはイリノテカンのＭＴＤは、特異的なｈＲＳ７－ＳＮ－３８複合体（データは省略）と同等の抗腫瘍効果をもたらした。全てのマウス試験において、体重減少を基準とすると、ｈＲＳ７－ＳＮ－３８ ＡＤＣに対して十分に耐性を示した（データは省略）。

【0236】

サシツズマブゴビテカンの体内分布－対応する^１１１Ｉｎ標識基質を使用して、ＳＫ－ＭＥＳ－１ヒト扁平上皮細胞肺癌異種移植片を有するマウス（データは省略）におけるサシツズマブゴビテカンまたは非コンジュゲートｈＲＳ７ ＩｇＧの体内分布を比較した。薬物動態解析を実施して、非コンジュゲートｈＲＳ７と比較した、サシツズマブゴビテカンのクリアランスを測定した（データは省略）。ＡＤＣは、当量の非コンジュゲートｈＲＳ７よりも約４０％短い半減期及び平均滞留時間を示して、より早く消失した。それにもかかわらず、このことが腫瘍への取り込み率に与える影響は最小限であった（データは省略）。２４時間時点及び４８時間時点においては有意差があったが、７２時間（取り込みのピーク）付近では、腫瘍内における両方の薬剤量はほぼ同等であった。正常組織の中では、肝臓と脾臓の差異が最も顕著であった（データは省略）。注入後２４時間時点において、肝臓内には、ｈＲＳ７ ＩｇＧと比較して＞２倍のサシツズマブゴビテカンが存在していた（データは省略）。逆に、脾臓内には、サシツズマブゴビテカンと比較して３倍超の親ｈＲＳ７ ＩｇＧ（取り込みピークの４８時間時点に存在）が存在していた（データは省略）。その他の組織内における取り込み及びクリアランスは一般的に、血中濃度の差異を反映していた（データは省略）。

【0237】

治療では週に２回の投薬を行うため、最初に０．２ｍｇ／ｋｇ（２５０μｇのタンパク質）のｈＲＳ７ ＡＤＣの予備投薬を受けた３日後に^１１１Ｉｎ標識抗体を注入された動物群における腫瘍への取り込み率について試験した。予備投薬マウスにおける^１１１Ｉｎサシツズマブゴビテカンの腫瘍への取り込み率は、予備投薬を受けなかった動物と比較して、全ての時点において実質的に低下した（例えば、７２時間時点において、予備投薬を受けた腫瘍への取り込み率は１２．５％ ± ３．８％ ＩＤ／ｇ、それに対し、予備投薬を受けなかった動物では２５．４％ ±８．１％ ＩＤ／ｇ；Ｐ＝０．０１２３；データは省略、ｈｔｔｐ：／／ｃｌｉｎｃａｎｃｅｒｒｅｓ．ａａｃｒｊｏｕｒｎａｌｓ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／１７／１０／３１５７．ｌｏｎｇ－Ｆ４）。予備投薬は、血液クリアランスまたは組織への取り込み率に対して顕著な影響を与えなかった（データは省略）。これらの試験は、一部の腫瘍モデルにおいて、予備投薬（複数可）を行うことにより、特異的抗体の腫瘍への付着を抑制可能であることを示唆しており、このことが、治療効果の特異性がＡＤＣ用量の増加に伴って低下し得る理由、及び更なる用量漸増を必要としない理由の説明になると考えられる。

【0238】

Ｓｗｉｓｓ－Ｗｅｂｓｔｅｒマウス及びカニクイザルにおけるサシツズマブゴビテカンの忍容性－Ｓｗｉｓｓ－Ｗｅｂｓｔｅｒマウスは、最小限で一時的な体重減少を伴い、３日間にわたる２回の投薬（それぞれ４、８及び１２ｍｇ ＳＮ－３８／ｋｇのサシツズマブゴビテカン）に耐性を示した（データは省略）。造血毒性は生じず、血清化学検査は、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ、データは省略）及びアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ、データは省略）の上昇を明らかとしただけであった。治療後７日時点において、全３治療群（データは省略）におけるＡＳＴが通常濃度（＞２９８Ｕ／Ｌ）超に上昇した（最大比率のマウスは２ ｘ ８ｍｇ／ｋｇ群に含まれていた）。しかしながら、治療後１５日目までには、ほとんどの動物が正常範囲内に収まった。治療後７日以内におけるＡＬＴ濃度もまた正常範囲（＞７７Ｕ／Ｌ）超であり（データは省略）、１５日目までには正常値となることが明らかとなった。全てのこれらのマウスの肝臓は、組織損傷の組織学的エビデンスを示さなかった（データは省略）。腎機能に関して言及すると、治療群におけるグルコース濃度及び塩素濃度だけがやや上昇していた。２ ｘ ８ｍｇ／ｋｇで、７匹のマウスのうち５匹のグルコース濃度がわずかに上昇し（２７３～３２０ｍｇ／ｄＬの範囲、正常値の上限は２６３ｍｇ／ｄＬ）、注入後１５日目までに正常値に戻った。同様に、２つの最高用量群（２ ｘ ８ｍｇ／ｋｇ群のうち５７％のマウス、及び２ ｘ １２ｍｇ／ｋｇ群のうち１００％のマウス）の塩素濃度もわずかに上昇し（１１６～１２７ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、正常値の上限は１１５ｍｍｏｌ／Ｌ）、注入後１５日目まで上昇を維持していた。ほとんどの塩素が消化管による吸収で得られていることから、塩素濃度上昇はまた胃腸毒性の徴候である場合があったが、終了時において、検査した任意の器官系における組織損傷の組織学的エビデンスは認められなかった（データは省略）。

【0239】

マウスが正常組織内においてｈＲＳ７のＴｒｏｐ－２標的抗原を発現していないことから、臨床使用におけるｈＲＳ７複合体のポテンシャルを明らかにするためのより適切なモデルが必要となった。免疫組織学検査により、ヒトとカニクイザルの両方の複数の組織（乳房、眼、胃腸管、腎臓、肺、卵巣、卵管、膵臓、副甲状腺、前立腺、唾液腺、皮膚、胸腺、甲状腺、扁桃、尿管、膀胱及び子宮（データは省略））における結合性が明らかとなった。この交差反応性を基準として、サルにおける忍容性試験を実施した。

【0240】

２ ｘ ０．９６ｍｇ ＳＮ－３８／ｋｇのサシツズマブゴビテカンを投与された群は、注入後から試験終了時にかけて重大な臨床イベントを有していなかった。体重減少は７．３％を超えず、１５日目までに馴化体重に戻った。ほとんどの血球数データに一時的な低下が認められたが（データは省略）、その数値は正常範囲を下回らなかった。血清化学検査において異常値は認められなかった。１１日目（最後の注入後８日目）に剖検した動物の組織病理学では、造血器官（胸腺、下顎リンパ節及び腸間膜リンパ節、脾臓、ならびに骨髄）、胃腸器官（胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸及び直腸）、女性生殖器官（卵巣、子宮及び膣）、及び注入部位において微細変化が認められた。これらの変化は微小から中程度までの範囲であり、胸腺及び胃腸管を除く全組織において、回復期の最終日（３２日目）までに完全に回復した。胸腺及び胃腸管における変化が完全回復に向かったのは、この時点以降であった（データは省略）。

【0241】

２ ｘ １．９２ｍｇ ＳＮ－３８／ｋｇ投与濃度の複合体では、胃腸合併症及び骨髄抑制に起因して１匹が死亡し、この群のその他の動物には、類似してはいるが、２ ｘ ０．９６ｍｇ／ｋｇ群よりも重篤な有害事象が認められた（データは省略）。これらのデータは、複合体の用量制限毒性（すなわち、腸管毒性及び血液毒性）がイリノテカンの用量制限毒性と同一であることを示している。それゆえ、サシツズマブゴビテカンのＭＴＤは、２ ｘ ０．９６～１．９２ｍｇ ＳＮ－３８／ｋｇであり、これは、ヒト等用量の２ ｘ ０．３～０．６ｍｇ／ｋｇ ＳＮ－３８に相当する。

【0242】

考察
Ｔｒｏｐ－２とは、肺癌、乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、前立腺癌及び卵巣癌を含むほとんどの上皮性腫瘍上で発現するタンパク質のことであり、それゆえ、細胞傷害薬を送達するための潜在的に重要な標的とされている（Ｏｈｍａｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １２：３０５７－６３；Ｆｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ９９：１２９０－９５；Ｃｕｂａｓ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １７９６：３０９－１４）。ＲＳ７抗体はＴｒｏｐ－２に結合すると内部移行する（Ｓｈｉｈ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５：５８５７ｓ－６３ｓ）ため、細胞傷害性物質の直接細胞内送達が可能となる。

【0243】

ＳＮ－３８は、いくつかの細胞株においてナノモル範囲のＩＣ_５０値を示す強力なトポイソメラーゼＩ阻害剤である。ＳＮ－３８は、プロドラッグであるイリノテカンの活性化形態であり、イリノテカンは結腸直腸癌の治療に用いられ、また肺癌、乳癌及び脳癌に活性を示す。本発明者らは、ＡＤＣ形態の直接標的化ＳＮ－３８が、活性化ＳＮ－３８へのＣＰＴ－１１の生物学的変換率の低さ及び患者によるばらつきを克服することにより、ＣＰＴ－１１と比較して有意に優れた治療効果を有し得ると推理した（Ｍａｔｈｉｊｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７：２１８２－９４）。

【0244】

元のＣＬ２誘導体に挿入されたＰｈｅ－Ｌｙｓペプチドにより、カテプシンＢにより起こり得る開裂が可能となった。合成プロセスを簡単に説明するが、ＣＬ２Ａ中のフェニルアラニンを除去することによりカテプシンＢ開裂部位を除去した。興味深いことに、この生成物は、ＣＬ２により得られたブロードなプロファイルと比較して、より明確なクロマトグラフィープロファイルを有していた（データは省略）。しかしより重要なことに、この変化は複合体の結合性または安定性に影響を与えなかった。また驚くべきことに、この変化は、並列試験においてわずかな力価上昇をもたらした。

【0245】

ある種の固形腫瘍細胞株に対するｈＲＳ７ ＡＤＣのインビトロ細胞傷害性は一貫して、ｎｍｏｌ／Ｌ範囲のＩＣ_５０値を示していた。しかしながら、遊離ＳＮ－３８に曝された細胞は、ＡＤＣと比較して低いＩＣ_５０値を示した。遊離ＳＮ－３８とコンジュゲートＳＮ－３８の間のこの相違はまた、ＥＮＺ－２２０８（Ｓａｐｒａ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １４：１８８８－９６，Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ １９：８４９－５９）及びＮＫ０１２（Ｋｏｉｚｕｍｉ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６６：１００４８－５６）について報告されている。ＥＮＺ－２２０８では、ＰＥＧあたり約３．５～４分子のＳＮ－３８を結合させるための分枝鎖ＰＥＧを利用しており、一方、ＮＫ０１２は、２０重量％のＳＮ－３８を含有するミセルナノ粒子である。本発明者らのＡＤＣを用いると、腫瘍細胞内におけるＴｒｏｐ－２発現レベルが上昇するにつれて、この相違（すなわち、遊離ＳＮ－３８対コンジュゲートＳＮ－３８の力価比）が減少する。このことは、薬物の標的化送達における利点であることを示唆している。インビトロ血清中安定性に関して言及すると、ＣＬ２－ＳＮ－３８形態のｈＲＳ７－ＳＮ－３８とＣＬ２Ａ－ＳＮ－３８形態のｈＲＳ７－ＳＮ－３８の両方は、約２０時間のｔ／_１／２をもたらした。このことは、ＥＮＺ－２２０８について報告された１２．３分間の短いｔ／_１／２（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ １９：８４９－５９）とは対照的ではあるが、２４時間後における生理学的条件下でのＮＫ０１２からのＳＮ－３８の５７％放出（Ｋｏｉｚｕｍｉ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６６：１００４８－５６）とは類似している。
ｈＲＳ７－ＳＮ－３８（ＣＬ２－ＳＮ－３８またはＣＬ２Ａ－ＳＮ－３８のいずれか）を用いて腫瘍を有するマウスを治療することにより、５つの異なる腫瘍モデルにおいて腫瘍増殖が有意に阻害された。それら腫瘍モデルのうちの４つにおいては腫瘍退縮が認められ、Ｃａｌｕ－３について言えば、最高用量のｈＲＳ７－ＳＮ－３８を投与された全てのマウスは、試験の判定時において腫瘍フリーとなった。ヒトの場合とは異なり、マウスにおけるイリノテカンは、血漿エステラーゼによって極めて効率的にＳＮ－３８へと変換された（５０％超の変換率、ヒトよりもマウスにおいてより効果的に生成）（Ｍｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６０：４２０６－１０；Ｆｕｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １７：１８１５－２４）。イリノテカンを１０倍超のＳＮ－３８濃度または１０倍当量のＳＮ－３８濃度で投与する場合、ｈＲＳ７－ＳＮ－３８は腫瘍増殖を制御する上で有意に優れていた。イリノテカンをそのＭＴＤの２４ｍｇ／ｋｇ ｑ２ｄｘ５（３７．５倍超のＳＮ－３８）で投与する場合のみ、ｈＲＳ７－ＳＮ－３８の効果と同等となった。患者において、イリノテカンの生物学的変換が実質的に低いことから、本発明者らは、この利点がサシツズマブゴビテカンに更により有利であると期待した。

【0246】

本発明者らはまた、一部の抗原発現細胞株、例えば、ＳＫ－ＭＥＳ－１に対して抗原結合ＡＤＣを使用することは、非結合性で関連性のない複合体と比較して、より優れた治療効果を保証しないことを示した。これは異例または予想外な発見ではない。事実、イリノテカンと比較した場合、上で述べた非結合性ＳＮ－３８複合体は治療効果を高めるため、関連性のないＩｇＧ－ＳＮ－３８複合体は、一定の活性を有すると予想される。このことは、腫瘍が未熟で漏れやすい血管（正常組織と比較して巨大分子をより通す）を有するという事実に関係している（Ｊａｉｎ，１９９４，Ｓｃｉ Ａｍ ２７１：５８－６１）。本発明者らの複合体を用いると、ｐＨがリソソーム濃度を模倣するレベル（例えば、３７℃でｐＨ５．３；データは省略）にまで低下する場合、ＳＮ－３８の５０％が約１３時間以内に放出される。その一方、血清の中性ｐＨでは、放出速度はほぼ２倍低下する。関連性のない複合体が酸性の腫瘍微小環境に入る場合、一部のＳＮ－３８を局所的に放出することが予想される。その他の因子、例えば、腫瘍の生理機能、及び薬剤に対する腫瘍の固有感受性はまた、この「ベースライン」活性を決定する役割を果たしている。しかしながら、長い滞留時間を有する特異的な複合体は、特異的抗体を捕捉するための抗原が十分存在する限り、このベースライン応答にわたり高力価を有するはずである。ＳＫ－ＭＥＳ－１モデルにおける体内分布試験はまた、連続的な投薬の結果として腫瘍抗原が飽和状態となった場合、特異的複合体の腫瘍への取り込み率が低下することを示した。それにより、関連性のない複合体にみられる治療結果と同様の治療結果がもたらされる。

【0247】

本発明者らのＡＤＣと公開報告のその他ＳＮ－３８送達物質を直接比較することは困難ではあるが、ある程度全般的な観測は行うことができる。本発明者らの治療研究における個々の最高用量は０．４ｍｇ／ｋｇのＳＮ－３８であった。Ｃａｌｕ－３モデルでは、２０ｇのマウスに、１．６ｍｇ／ｋｇ ＳＮ－３８または３２μｇ ＳＮ－３８の総累積用量を、わずか４回の注入で投与した。ＥＮＺ－２２０８による複数の試験を、１０ｍｇ／ｋｇ ｘ ５のそのＭＴＤを使用して行った（Ｓａｐｒａ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １４：１８８８－９６；Ｐａｓｔｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １６：４８０９－２１）。またＮＫ０１２による前臨床試験は、３０ｍｇ／ｋｇ ｘ ３のそのＭＴＤを含んでいた（Ｋｏｉｚｕｍｉ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６６：１００４８－５６）。その結果、ＥＮＺ－２２０８及びＮＫ０１２のそれぞれの報告用量と比較して３０倍及び５５倍少ないＳＮ－３８当量のｈＲＳ７－ＳＮ－３８を使用して、有意な抗腫瘍効果が得られた。１０倍少ないｈＲＳ７ ＡＤＣ（０．０４ｍｇ／ｋｇ）であっても有意な抗腫瘍効果が観察された一方、低用量のＥＮＺ－２２０８では示されなかった。またＮＫ０１２の用量を４倍少ない７．５ｍｇ／ｋｇにまで減少させると効果は失われた（Ｋｏｉｚｕｍｉ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６６：１００４８－５６）。標準的なマウスは、１週間にわたる２４ｍｇ／ｋｇ ＳＮ－３８（１，５００ｍｇ／ｋｇの複合体）の累積用量では急性毒性を示しておらず、そのことは、ＭＴＤがより高いことを意味していた。その結果、腫瘍を有する動物は、７．５～１５倍少ない量のＳＮ－３８当量で効果的に治療された。

【0248】

体内分布試験により、サシツズマブゴビテカンは親ｈＲＳ７ ＩｇＧとほぼ同等の腫瘍への取り込み率を有しているが、２倍高い肝臓への取り込み率で実質的により早く消失する（ＳＮ－３８の疎水性に起因し得る）ことが明らかとなった。ＡＤＣが肝臓を通過して消失することから、肝毒性及び胃腸毒性は用量制限であると予想された。マウスは肝臓トランスアミナーゼ上昇のエビデンスを有していたが、胃腸毒性はせいぜい軽度であり、体重減少は単に一時的なものであり、また組織病理学的検査で異常は認められなかった。興味深いことに、血液毒性は認められなかった。しかしながら、サルは、イリノテカンで予想されたものと同一の毒性プロファイルを示した（胃腸毒性及び血液毒性は用量制限）。

【0249】

ｈＲＳ７が認識するＴｒｏｐ－２はマウスにおいて発現していないため、ヒトとほぼ同等のＴｒｏｐ－２組織発現を有するサルで毒性試験を実施することが重要であった。サルは、軽度な毒性及び可逆的な毒性を有しつつ０．９６ｍｇ／ｋｇ／用量（約１２ｍｇ／ｍ^２）に耐性を示したが、その用量は、ヒト用量の約０．３ｍｇ／ｋｇ／用量（約１１ｍｇ／ｍ^２）と推定される。ＮＫ０１２の第Ｉ相臨床試験において、固形腫瘍を有する患者は、グレード４の好中球減少症を発症しつつ、用量制限毒性（ＤＬＴ；Ｈａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １６：５０５８－６６）となる２週間おきの２８ｍｇ／ｍ^２のＳＮ－３８に耐性を示した。同様に、ＥＮＺ－２２０８を用いた第Ｉ相臨床試験では、用量制限の発熱性好中球減少症が明らかとなった（患者がＧ－ＣＳＦの投与を受ける場合、１０ｍｇ／ｍ^２を２週間おき、または１６ｍｇ／ｍ^２の投与を推奨）（Ｋｕｒｚｒｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，ＡＡＣＲ－ＮＣＩ－ＥＯＲＴＣ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔａｒｇｅｔｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ；２００９ Ｎｏｖ １５－１９；Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ；Ｐｏｓｔｅｒ Ｎｏ Ｃ２１６；Ｐａｔｎａｉｋ ｅｔ ａｌ．，ＡＡＣＲ－ＮＣＩ－ＥＯＲＴＣ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔａｒｇｅｔｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ；２００９ Ｎｏｖ １５－１９；Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ；Ｐｏｓｔｅｒ Ｎｏ Ｃ２２１）。サルが累積ヒト等用量の２２ｍｇ／ｍ^２に耐性を示したため、ｈＲＳ７が多数の正常組織に結合するものの、ｈＲＳ７ ＡＤＣ単剤治療のＭＴＤは、非標的化ＳＮ－３８薬剤のＭＴＤとほぼ同等であり得ると思われる。実際、抗Ｔｒｏｐ－２抗体の毒性プロファイルがイリノテカンの毒性プロファイルとほぼ同等であったため、抗Ｔｒｏｐ－２抗体の特異性はＤＬＴの決定に役割を果たさないと思われた。より重要なことだが、ヒト等用量のちょうど０．０３ｍｇ ＳＮ－３８当量／ｋｇ／用量に効果を示したマウスと同様の抗腫瘍活性がヒトにおいて達成可能であるならば、有意な抗腫瘍効果が臨床的に認識され得るだろう。

【0250】

結論として、マウスのインビボヒトがん異種移植モデルと組み合わせたサルの毒性試験は、Ｔｒｏｐ－２を標的とするこのＡＤＣが異なる上皮由来のいくつかの腫瘍に対する有効な治療薬であることを示している。

【0251】

実施例５．抗Ｔｒｏｐ－２抗体の細胞結合アッセイ
ヒトＴｒｏｐ－２に対する２種類の異なるマウスモノクローナル抗体を、ＡＤＣコンジュゲート用に得た。第１の１６２－４６．２を、ローラーボトル内で増殖させたハイブリドーマ（ＡＴＣＣ、ＨＢ－１８７）から精製した。第２の抗体であるＭＡＢ６５０は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から購入した。結合性を比較するために、Ｔｒｏｐ－２陽性ヒト胃癌であるＮＣＩ－Ｎ８７を標的として使用した。結合アッセイの前日に、細胞（１．５ ｘ １０^５／ウェル）を９６ウェルプレートに播種した。翌朝、１６２－４６．２、ＭＡＢ６５０及びマウスＲＳ７（０．０３～６６ｎＭ）を用いて、用量／反応曲線を作成した。これらの一次抗体を細胞と、４℃で１．５時間インキュベートした。ウェルを洗浄してから、抗マウスＨＲＰ二次抗体を全てのウェルに加え、４℃で１時間放置した。再度ウェルを洗浄してから、蛍光基質を加えた。Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダを用いてプレートを読み、相対蛍光単位の数値を記録した。

【0252】

全３種の抗体は、ほぼ同等のＫ_Ｄ値（ＲＳ７で０．５７ｎＭ、１６２－４６．２で０．５２ｎＭ、またＭＡＢ６５０で０．４９ｎＭ）を有していた。しかしながら、１６２－４６．２及びＭＡＢ６５０の最大結合量（Ｂ_ｍａｘ）をＲＳ７の最大結合量（Ｂ_ｍａｘ）と比較すると、それらはそれぞれ２５％、５０％減少しており（ＲＳ７でＢ_Ｍａｘ １１，２５０、１６２－４６．２でＢ_Ｍａｘ ８，４７１、またＭＡＢ６５０でＢ_Ｍａｘ ６，０１８）、ＲＳ７と比較して異なる結合特性を示していた。

【0253】

実施例６．抗Ｔｒｏｐ－２ ＡＤＣ（ＭＡＢ６５０－ＳＮ－３８）の細胞傷害性
ＳＮ－３８及びＭＡＢ６５０を使用して、６．８９の平均置換比率（薬物／抗体）を有する新規抗Ｔｒｏｐ－２ ＡＤＣを調製した。２種類の異なるヒト膵腺癌細胞株（ＢｘＰＣ－３及びＣａｐａｎ－１）及びヒトトリプルネガティブ乳癌細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ－４６８）を標的として用いて細胞傷害性アッセイを実施し、ＭＡＢ６５０－ＳＮ－３８とサシツズマブゴビテカンＡＤＣを比較した。

【0254】

ＡＤＣを加える１日前に、組織培養液から細胞を回収して９６ウェルプレートに播種した。翌日、３．８４ ｘ １０^－１２～２．５ ｘ １０^－７Ｍの薬物範囲で、細胞を、サシツズマブゴビテカン、ＭＡＢ６５０－ＳＮ－３８及び遊離ＳＮ－３８に曝した。ＭＡＢ６５０－ＳＮ－３８とタンパク質等用量の非コンジュゲートＭＡＢ６５０を対照として使用した。プレートを３７℃で９６時間インキュベートした。このインキュベート期間後、ＭＴＳ基質を全プレートに加え、未処理細胞が約１．０のＯＤ_{４９２ｎｍ}に達するまで、３０分間隔で色の発現を読んだ。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ及びＰｒｉｓｍソフトウェア（非線形回帰を用いて、ＩＣ_５０値を算出するシグモイド用量反応曲線を作成）を使用し、増殖抑制を、未処理細胞と比較した増殖パーセントとして測定した。

【0255】

サシツズマブゴビテカン及びＭＡＢ６５０－ＳＮ－３８は、これら細胞株におけるＳＮ－３８－ＡＤＣでは標準的な低ｎＭ範囲のＩＣ_５０値を有し、ほぼ同等の増殖抑制効果を有していた（データは省略）。ヒトＣａｐａｎ－１膵腺癌細胞株（データは省略）において、サシツズマブゴビテカンＡＤＣは、ＭＡＢ６５０－ＳＮ－３８ ＡＤＣの４．１ｎＭ、及び遊離ＳＮ－３８の１．０ｎＭと比較して、３．５ｎＭのＩＣ_５０を示した。ヒトＢｘＰＣ－３膵腺癌細胞株（データは省略）において、サシツズマブゴビテカンＡＤＣは、ＭＡＢ６５０－ＳＮ－３８ ＡＤＣの３．０ｎＭ、及び遊離ＳＮ－３８の１．０ｎＭと比較して、２．６ｎＭのＩＣ_５０を示した。ヒトＮＣＩ－Ｎ８７胃腺癌細胞株（データは省略）において、サシツズマブゴビテカンＡＤＣは、ＭＡＢ６５０－ＳＮ－３８ ＡＤＣの４．１ｎＭ、及び遊離ＳＮ－３８の４．３ｎＭと比較して、３．６ｎＭのＩＣ_５０を示した。

【0256】

要約すると、これらインビトロアッセイにおいて、２種類の抗Ｔｒｏｐ－２抗体（ｈＲＳ７及びＭＡＢ６５０）のＳＮ－３８複合体は、いくつかの腫瘍細胞株に対して同等の効果（遊離ＳＮ－３８の効果とほぼ同等）を示した。抗Ｔｒｏｐ－２抗体の標的化能が、インビトロと比較してインビボではるかに影響を及ぼす因子となることから、サシツズマブゴビテカンに関する上記実施例に示すとおり、データは、抗Ｔｒｏｐ－２－ＳＮ－３８ ＡＤＣの部類がインビボで極めて有効となることを裏付けている。

【0257】

実施例７．抗Ｔｒｏｐ－２ ＡＤＣ（１６２－４６．２－ＳＮ－３８）の細胞傷害性
ＳＮ－３８及び１６２－４６．２を使用して、６．１４の置換比率（薬物／抗体）を有する新規抗Ｔｒｏｐ－２ ＡＤＣを調製した。２種類の異なるＴｒｏｐ－２陽性細胞株（ＢｘＰＣ－３ヒト膵腺癌及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８ヒトトリプルネガティブ乳癌）を標的として用いて細胞傷害性アッセイを実施し、１６２－４６．２－ＳＮ－３８とｈＲＳ７－ＳＮ－３８ ＡＤＣを比較した。

【0258】

ＡＤＣを加える１日前に、組織培養液から細胞を回収して、ウェルあたり２０００細胞で９６ウェルプレートに播種した。翌日、３．８４ ｘ １０^－１２～２．５ ｘ １０^－７Ｍの薬物範囲で、細胞を、サシツズマブゴビテカン、１６２－４６．２－ＳＮ－３８または遊離ＳＮ－３８に曝した。それぞれ１６２－４６．２－ＳＮ－３８及びサシツズマブゴビテカンと同一タンパク質等用量の非コンジュゲート１６２－４６．２及び非コンジュゲートｈＲＳ７を対照として用いた。プレートを３７℃で９６時間インキュベートした。このインキュベート期間後、ＭＴＳ基質を全プレートに加え、未処理対照ウェルが約１．０のＯＤ_{４９２ｎｍ}測定値を示すまで、３０分間隔で色の発現を読んだ。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ及びＰｒｉｓｍソフトウェア（非線形回帰を用いて、ＩＣ_５０値を算出するシグモイド用量反応曲線を作成）を使用し、増殖抑制を、未処理細胞と比較した増殖パーセントとして測定した。

【0259】

１６２－４６．２－ＳＮ－３８ ＡＤＣは、サシツズマブゴビテカンと比較してほぼ同等のＩＣ_５０値を示した（データは省略）。ＢｘＰＣ－３ヒト膵腺癌細胞株（データは省略）に対して試験を行ったとき、サシツズマブゴビテカンは、１６２－４６．２－ＳＮ－３８の１０．６ｎＭ、及び遊離ＳＮ－３８の１．６ｎＭと比較して、５．８ｎＭのＩＣ_５０を示した。ＭＤＡ－ＭＢ－４６８ヒト乳腺癌細胞株（データは省略）に対して試験を行ったとき、サシツズマブゴビテカンは、１６２－４６．２－ＳＮ－３８の６．１ｎＭ、及び遊離ＳＮ－３８の０．８ｎＭと比較して、３．９ｎＭのＩＣ_５０を示した。遊離抗体単独では、Ｔｒｏｐ－２陽性癌細胞株のいずれかに対してほとんど細胞傷害性を示さなかった。

【0260】

要約すると、同一の細胞傷害性薬物にコンジュゲートした３種類の異なる抗Ｔｒｏｐ－２抗体のインビトロでの効果を比較した際、全３種のＡＤＣは、様々なＴｒｏｐ－２陽性がん細胞株に対して同等の細胞傷害効果を示した。これらのデータは、抗Ｔｒｏｐ－２抗体（薬物コンジュゲートＡＤＣ中に組み込まれる）の部類が、Ｔｒｏｐ－２発現固形腫瘍に有効な抗がん治療薬であることを裏付けている。

【0261】

実施例８．ＳＮ－３８にコンジュゲートしたｈＲＳ７抗体を含むＩＭＭＵ－１３２（サシツズマブゴビテカン）抗Ｔｒｏｐ－２ ＡＤＣを用いた臨床試験
要約
本実施例では、第Ｉ相臨床試験、及び、ＩＭＭＵ－１３２（ｐＨ感受性リンカーでＳＮ－３８にコンジュゲートした内部移行、ヒト化、ｈＲＳ７抗Ｔｒｏｐ－２抗体のＡＤＣ）（平均薬物－抗体比 ＝ ７．６）を用いた進行中の第ＩＩ相継続試験の結果について報告する。Ｔｒｏｐ－２とは、多くのヒトがんが高密度（約１ ｘ １０^５）で頻繁に特異的に発現する、カルシウムを変換するＩ型膜貫通タンパク質（正常組織における発現は限定的）のことである。Ｃａｐａｎ－１ヒト膵臓腫瘍異種移植片を有するヌードマウスでの前臨床試験では、ＩＭＭＵ－１３２が最大耐量のイリノテカン治療薬に由来する量と比較して１２０倍超ものＳＮ－３８を腫瘍に送達可能であること、が明らかとなった。

【0262】

本実施例では、複数の前治療（一部トポイソメラーゼＩ／ＩＩ阻害剤を含む）に失敗した２５名の患者に関する最初の第Ｉ相試験、及び、６９名の患者（結腸癌（ＣＲＣ）、小細胞肺癌及び非小細胞肺癌（それぞれＳＣＬＣ、ＮＳＣＬＣ）、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、膵臓癌（ＰＤＣ）、食道癌、及びその他のがんを含む）について現在報告中の、進行中の第ＩＩ相継続試験について報告する。

【0263】

以下で詳細に説明するとおり、Ｔｒｏｐ－２は、血清中には検出されなかったが、ほとんどの保管腫瘍で強く発現していた（≧２^＋ 免疫組織化学染色法）。３＋３試験デザインでは、反復２１日サイクルの１日目及び８日目にＩＭＭＵ－１３２を投与した（８ｍｇ／ｋｇ／用量で開始して、その後、用量制限の好中球減少症となる前に１２ｍｇ／ｋｇ及び１８ｍｇ／ｋｇ）。延期を最小化させつつ累積治療を最適化するために、第ＩＩ相では、８ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ（それぞれ、ｎ＝３０及び１４）に焦点を絞った。この時点で関連ＡＥと報告された４９名の患者のうち、２８％が≧グレード３の好中球減少症を発症した（グレード４は４％）。これらの患者に最初に現れた最も一般的な非血液毒性は、疲労（５５％；≧Ｇ３＝９％）、悪心（５３％；≧Ｇ３＝０％）、下痢（４７％；≧Ｇ３＝９％）、脱毛症（４０％）及び嘔吐（３２％；≧Ｇ３＝２％）であり、脱毛症はまた頻繁に発症した。ホモ接合性ＵＧＴ１Ａ１ ^＊２８／^＊２８が６名の患者に見つかり、うち２名がより重篤な血液毒性及びＧＩ毒性を有していた。

【0264】

第Ｉ相及び拡大相では、現在、ＲＥＣＩＳＴ／ＣＴで最良効果と評価される４８名の患者（ＰＤＣを除く）が存在している。患者のうち７名（１５％）は部分寛解（ＰＲ）を示し、患者の内訳は、ＣＲＣ（Ｎ＝１）、ＴＮＢＣ（Ｎ＝２）、ＳＣＬＣ（Ｎ＝２）、ＮＳＣＬＣ（Ｎ＝１）及び食道癌（Ｎ＝１）であった。また別の２７名の患者（５６％）は安定（ＳＤ）を示した。３８名の患者全員（７９％）には疾患応答が認められた。１３名のＣＴで評価可能なＰＤＣ患者のうち８名の患者（６２％）はＳＤを示し、患者らの前回の前治療における８．０週間と比較して、１２．７週間の平均無増悪期間（ＴＴＰ）を示した。残る４８名の患者におけるＴＴＰは、１２．６＋週間（６．０～５１．４週間の範囲）である。血漿中のＣＥＡ及びＣＡ１９－９は、血中におけるこれら抗原の力価が上昇した患者の反応と相関していた。何ヶ月にもわたって投薬を行ったにもかかわらず、抗ｈＲＳ７抗体または抗ＳＮ－３８抗体は検出されなかった。

【0265】

複合体は３日間以内に血清中から消失したが、このことは、インビボ動物試験と一致していた。インビボ動物試験において、ＳＮ－３８の５０％は毎日放出され、血清中のＳＮ－３８の＞９５％は非グルクロン酸抱合形態でＩｇＧに結合し、また、イリノテカンを投与された患者において報告されたＳＮ－３８と比較して、１００倍を超えるほどの濃度であった。これらの結果は、管理可能な下痢及び好中球減少症を有しつつも、サシツズマブゴビテカンが転移性固形がんにおいて治療的に有効であることを示している。

【0266】

薬物動態
２つのＥＬＩＳＡ法を用いて、ＩｇＧのクリアランス（抗ｈＲＳ７イディオタイプ抗体による補足）及びインタクト複合体のクリアランス（抗ｈＲＳ７イディオタイプ抗体を有する抗ＳＮ－３８ ＩｇＧ／プローブによる補足）を測定した。ＨＰＬＣを用いてＳＮ－３８を測定した。全ＩＭＭＵ－１３２部分（インタクト複合体）はＩｇＧよりも急速に消失した（データは省略）。このことは、周知である、複合体からのＳＮ－３８の徐放を反映している。ＳＮ－３８のＨＰＬＣ測定（非結合性及び全体）により、血清中における＞９５％のＳＮ－３８がＩｇＧに結合していることが示された。低濃度のＳＮ－３８Ｇは、ＩｇＧに結合したＳＮ－３８がグルクロン酸抱合から保護されていることを示唆している。複合体のＥＬＩＳＡとＳＮ－３８のＨＰＬＣを比較することにより、双方のオーバーラップが明らかとなった。このことは、ＥＬＩＳＡが、ＳＮ－３８のクリアランスをモニターするための代用法であることを示唆している。

【0267】

【表3】

【0268】

臨床試験ステータス
平均３種類の前治療暦があり多種多様な転移性がんを有する合計６９名の患者（第Ｉ相の２５名の患者を含む）について記録した。８名の患者に臨床増悪が認められ、ＣＴ評価前に中止した。１３名のＣＴで評価可能な膵臓癌患者については、個々に記録した。ＰＤＣ患者の平均ＴＴＰ（無増悪期間）は、最後の前治療による平均８週間のＴＴＰと比較して、１１．９週間（２～２１．４週間の範囲）であった。

【0269】

多種多様ながんを有する合計４８名の患者は、そこから最良効果（データは省略）及び無増悪期間（ＴＴＰ、データは省略）を判定する、少なくとも１回のＣＴ評価を受けた。ＴＮＢＣ（トリプルネガティブ乳癌）を有する８名の評価可能な患者における最良効果データを集計すると、２名がＰＲ（部分寛解）、４名がＳＤ（安定）、２名がＰＤ（進行）であり、効果判定［ＰＲ＋ＳＤ］の合計は６／８（７５％）であった。ＳＣＬＣ（小細胞肺癌）を有する４名の評価可能な患者においては、２名がＰＲ、ＳＤは該当せず、２名がＰＤであり、効果判定の合計は２／４（５０％）であった。ＣＲＣ（結腸直腸癌）を有する１８名の評価可能な患者においては、１名がＰＲ、１１名がＳＤ、６名がＰＤであり、効果判定の合計は１２／１８（６７％）であった。食道癌を有する４名の評価可能な患者においては、１名がＰＲ、２名がＳＤ、１名がＰＤであり、効果判定の合計は３／４（７５％）であった。ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）を有する５名の評価可能な患者においては、１名がＰＲ、３名がＳＤ、１名がＰＤであり、効果判定の合計は４／５（８０％）であった。治療した患者全体のうち４８名の評価可能な患者においては、７名がＰＲ、２７名がＳＤ、１４名がＰＤであり、効果判定の合計は３４／４８（７１％）であった。これらの結果は、抗Ｔｒｏｐ－２ ＡＤＣ（ｈＲＳ７－ＳＮ－３８）が、ヒト患者における広範囲の固形腫瘍に対して有意な臨床効果を示したことを実証している。

【0270】

記録した治療副作用（有害事象）を表４にまとめる。表４のデータから明白ではあるが、サシツズマブゴビテカンの治療効果は、許容できる低レベルの副作用を示すＡＤＣ用量により得られた。

【表4】

【0271】

表４に記録した試験は、登録患者２６１名で今日まで継続している。結果（データは省略）は通常、表４が示す基準に従っており、好中球減少症のみが、試験患者の１０％におけるグレード３またはそれ以上の有害事象の発症を示している。全てのその他有害事象について、グレード３またはそれ以上の反応の発症率は、１０％未満であった。このことが本ＡＤＣを大多数のＡＤＣから区別するものであり、特定の実施形態では、本願請求項に記載の方法及び組成物は、多種多様な固形腫瘍に効果を示す抗Ｔｒｏｐ－２ ＡＤＣ（好中球減少症以外の全ての有害事象において、グレード３またはそれ以上の有害事象の発症は患者の１０％未満）に関する。追跡調査では、ベースライン時の１２１名の患者由来の合計４２１の試料、及び入手可能な少なくとも１つの追跡試料について、治療サイクルを繰り返しているにもかかわらず、抗ｈＲＳ７抗体または抗ＳＮ－３８抗体による効果は検出されていない。

【0272】

抗Ｔｒｏｐ－２ ＡＤＣによる例示的な部分寛解は、ＣＴデータ（データは省略）により確認された。ＣＲＣにおける例示的なＰＲでは、ＣＲＣと初めて診断された６２歳の女性が原発性結腸癌の半切除術を受けた。４ヶ月後、彼女は肝転移による肝切除を受け、ＦＯＬＦＯＸによる治療を７ヶ月間、また５ＦＵによる治療を１ヵ月間受けた。彼女には、主に肝臓に複数の病変（免疫組織学検査により、３＋のＴｒｏｐ－２）が認められ、最初の診断から約１年後、８ｍｇ／ｋｇの開始用量でサシツズマブゴビテカン試験を始めた。彼女の最初のＣＴ評価ではＰＲが得られ、標的病変に３７％の縮小が認められた（データは省略）。当該患者は治療を継続し、１０ヶ月間の治療後に６５％縮小の最大縮小を達成し（７８１ｎｇ／ｍＬから２６．５ｎｇ／ｍＬにＣＥＡが減少）（データは省略）、その３ヶ月後に増悪した。

【0273】

ＮＳＣＬＣにおける例示的なＰＲでは、６５歳の男性がステージＩＩＩＢのＮＳＣＬＣ（扁平上皮細胞）と診断された。７０００ｃＧｙのＸＲＴと併用したカルボプラチン／エトポシドによる初期治療（３ヶ月間）により、１０ヶ月間継続する効果が得られた。その後、彼をタルセバによる維持療法を開始し、ＩＭＭＵ－１３２試験に加えて腰椎椎弓切除術を受けることを検討することになるまでその維持療法を継続した。彼は、タルセバの５ヶ月後に、初期用量のＩＭＭＵ－１３２を投与されたが、その時点において、右肺に大量の胸水を伴う５．６ｃｍの病変が認められた。彼は、最初のＣＴにおいて原発性標的病変が３．２ｃｍまで縮小したことが認められた（データは省略）２ヶ月後に、６回目の投薬を完了させたばかりであった。

【0274】

ＳＣＬＣにおける例示的なＰＲでは、６５歳の女性が低分化ＳＣＬＣと診断された。効果がなく２ヶ月後に終了したカルボプラチン／エトポシド（トポイソメラーゼＩＩ阻害剤）の投与後、これもまた効果がなく２ヶ月後に終了したトポテカン（トポイソメラーゼＩ阻害剤）に続き、彼女は１ヶ月後に終了した局所ＸＲＴ（３０００ｃＧｙ）を受けた。しかしながら、増悪は翌月まで継続した。患者は翌月ＩＭＭＵ－１３２（１２ｍｇ／ｋｇ；６．８ｍｇ／ｋｇに減量；Ｔｒｏｐ－２発現 ３＋）を開始し、ＩＭＭＵ－１３２の２ヶ月後、標的病変が３８％縮小（主要肺病変のかなりの縮小を含む）した（データは省略）。患者は、１２回の投薬を受けた３ヶ月後に増悪した。

【0275】

これらの結果は、抗Ｔｒｏｐ－２ ＡＤＣが、複数の前治療に失敗したまたはそれらの後に増悪した患者においてでさえ有効であったことを示すという点で意義深い。結論として、用いた用量における主な毒性は、グレード３程度の毒性を有する管理可能な好中球減少症であった。ＩＭＭＵ－１３２は、トリプルネガティブ乳癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、結腸直腸癌及び食道癌を有する再発／耐性を示す患者（以前のトポイソメラーゼＩ阻害剤治療からの再発暦を有する患者を含む）における活性のエビデンス（ＰＲ及び長続きするＳＤ）を示した。これらの結果は、現行療法に耐性を示す広範囲のがんにおける抗Ｔｒｏｐ－２ ＡＤＣの有効性を示している。

【0276】

実施例９．異なる抗Ｔｒｏｐ－２ ＡＤＣの効果比較
ヒト胃癌異種移植片（ＮＣＩ－Ｎ８７）を有するマウスを用いて、ＳＮ－３８をコンジュゲートさせたマウス抗Ｔｒｏｐ－２モノクローナル抗体（１６２－４６．２）の治療効果を、サシツズマブゴビテカン抗体薬物複合体（ＡＤＣ）と比較した。組織培養液中でＮＣＩ－Ｎ８７細胞を増殖させてから、トリプシン／ＥＤＴＡで回収した。１ ｘ １０^７個の細胞がそれぞれのマウスに投与されるように、マトリゲルと１：１で混合した２００μＬのＮＣＩ－Ｎ８７細胞懸濁液を雌無胸腺ヌードマウスにｓ．ｃ．注射した。腫瘍サイズが約０．２５ｃｍ^３に達した時点（６日後）で、動物を７つの異なる治療群（それぞれ９匹のマウス）へと分割した。２週間にわたり週に１回、５００μｇのＳＮ－３８ ＡＤＣをｉ．ｖ．注射でマウスに投与した。対照マウスには、同一の用量／スケジュールで、非腫瘍標的化ｈＡ２０－ＳＮ－３８ ＡＤＣを投与した。最後の群のマウスには生理食塩水だけを投与して未治療対照とした。週に２回、腫瘍を測定してマウスの体重を測った。マウスの腫瘍容積が１．０ｃｍ^３のサイズを超えた場合、増悪によりマウスを安楽死させた。

【0277】

ＳＮ－３８－ＡＤＣ治療マウスの平均腫瘍容積を測定した（データは省略）。曲線下面積（ＡＵＣ）を用いて確認したところ、サシツズマブゴビテカンと１６２－４６．２－ＳＮ－３８の両方は、生理食塩水対照マウス及びｈＡ２０－ＳＮ－３８対照マウスと比較して、腫瘍増殖を有意に阻害した（Ｐ＜０．００１）。サシツズマブゴビテカンを用いた治療では、９匹のマウス中７匹で安定を達成した（１８．４ ± ３．３日間の平均無増悪期間（ＴＴＰ））。１６２－４６．２－ＳＮ－３８を用いて治療したマウスでは、９匹のマウス中６匹で陽性反応を達成し、残りの３匹は安定を達成した。平均ＴＴＰは２４．２ ± ６．０日間であり、サシツズマブゴビテカン治療動物と比較して有意に長かった（Ｐ＝０．０３８２）。これらの結果は、ヒト胃癌の治療における、異なる抗Ｔｒｏｐ－２ ＡＤＣのインビボ効果を裏付けるものであった。

【0278】

実施例１０．抗Ｔｒｏｐ－２ ＡＤＣを用いた、進行した転移性膵臓癌を有する患者の治療
要約
ＩＭＭＵ－１３２（サシツズマブゴビテカン）は、ｐＨ感受性リンカーでＳＮ－３８（イリノテカンの活性代謝物）にコンジュゲートした、がん細胞に内部移行する、ヒト化抗Ｔｒｏｐ－２ ｈＲＳ７抗体を含む、抗Ｔｒｏｐ－２ ＡＤＣ（平均薬物－抗体比 ７．６）である。Ｔｒｏｐ－２とは、膵管腺癌を含む多くの上皮癌が高密度で頻繁に特異的に発現する、カルシウムを変換するＩ型膜貫通タンパク質（正常組織における発現は限定的）のことである。試験した全２９の膵臓腫瘍マイクロアレイ標本は、免疫組織化学試験によればＴｒｏｐ－２陽性であり、またヒト膵臓癌細胞株が１１５ｋ～８９１ｋのＴｒｏｐ－２複製を細胞膜上に発現することが見出された。

【0279】

本発明者らは、１３種類の異なる腫瘍タイプを有する患者を登録し３＋３デザインを使用したＩＭＭＵ－１３２第Ｉ相試験の結果について上記で報告した。第Ｉ相における用量制限毒性は好中球減少症であった。本試験における２４名の評価可能な患者のうち８０％超が長期の安定であり、また、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、小細胞肺癌及び非小細胞肺癌（ＳＣＬＣ、ＮＳＣＬＣ）、ならびに食道癌（ＥＡＣ）を有する患者に部分寛解（ＲＥＣＩＳＴ）が認められた。本実施例では、転移性ＰＤＣを有する患者のＩＭＭＵ－１３２第Ｉ／ＩＩ相試験コホートの結果について報告する。平均２つの前治療（１～５つの範囲）に失敗したＰＤＣを有する患者に、反復２１日サイクルの１日目及び８日目にＩＭＭＵ－１３２を投与した。

【0280】

ＰＤＣ患者のサブグループ（Ｎ＝１５）のうち１４名が、以前にゲムシタビンを含むレジメンを受けていた。９名の患者における初期の毒性データでは、好中球減少症［９名のうち３名が≧Ｇ３、３３％；Ｇ４の発熱性好中球減少症症例が１件］が認められ、投与延期または用量減少となった。２名の患者がグレード３の下痢を発症したが、グレード３～４の悪心または嘔吐を発症した患者はいなかった。９名の患者のうち５名が脱毛症（グレード１～２）を発症した。最良効果は１４名の患者のうち１３名で評価可能であり、８名が８～２１．４週間（平均１２．７週間；全１４名の患者では平均１１．９週間）の安定であった。治療継続中の１名の患者は、依然として患者における最初のＣＴ評価を受けていなかった。５名はＲＥＣＩＳＴにおける進行とされ、１名はただ１回の投与後に、臨床増悪によって、また評価不能とされて中止となった。血清中におけるＣＡ１９－９の力価は、安定患者のうち３名で２３％減少して７２％となった。複数回投与にもかかわらず、ＩＭＭＵ－１３２またはＳＮ－３８に対する抗体反応を起こした患者はいなかった。ピーク血清試料及びトラフ血清試料は、ＩＭＭＵ－１３２がＩｇＧよりも急速に消失したことを示した。そのことは、腫瘍細胞内におけるＳＮ－３８の周知の局所放出に基づいて予想されていた。１２ｍｇ／ｋｇのＩＭＭＵ－１３２を投与された１名の患者由来のピーク試料中におけるＩｇＧに結合したＳＮ－３８の濃度は、約４０００ｎｇ／ｍＬの濃度を示しており、それは、イリノテカン治療を受けた患者で報告されたＳＮ－３８力価と比較して４０倍高かった。

【0281】

本発明者らは、ＩＭＭＵ－１３２は、管理可能な好中球減少症及びわずかなＧＩ毒性を有しつつも、複数の前治療に失敗したＰＤＣ患者の６２％（８／１３）において活性（長期安定）であると結論付けた。８～１０ｍｇ／ｋｇのＩＭＭＵ－１３２を２１日サイクルの１日目及び８日目に投与する反復治療サイクル（＞６）を進行ＰＤＣ患者に実施してもよく、後の治療サイクルにおいて、若干の用量調節を行ってもよく、または好中球減少症の増殖因子支持薬を用いてもよい。これらの結果は、ＩＭＭＵ－１３２投与に対する部分寛解及び長期安定を示し、進行したＣＲＣ、ＴＮＢＣ、ＳＣＬＣ、ＮＳＣＬＣ、ＥＡＣを有する患者における所見と一致している。要約すると、ＩＭＭＵ－１３２による単剤治療は、ＰＤＣを有する患者（以前よりＰＤＣ用のその他治療レジメンに耐性を示す腫瘍を有する患者を含む）における、新規の有効な治療レジメンである。

【0282】

方法及び結果
Ｔｒｏｐ－２発現－ＱＵＡＮＴＢＲＩＴＥ（登録商標）ＰＥビーズを用いたフローサイトメトリーで、様々ながん細胞株表面上におけるＴｒｏｐ－２発現を測定した。異なる細胞株中に検出されたＴｒｏｐ－２分子の数の結果は、ＢｘＰＣ－３膵臓癌（８９１，０００）、ＮＣＩ－Ｎ８７胃癌（３８３，０００）、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８乳癌（３４１，０００）、ＳＫ－ＭＥＳ－１扁平細胞肺癌（２７，０００）、Ｃａｐａｎ－１膵臓癌（１１５，０００）、ＡＧＳ胃癌（７８，０００）、ＣＯＬＯ ２０５結腸癌（５２，０００）であった。Ｔｒｏｐ－２発現はまた、２９の膵腺癌組織マイクロアレイのうち２９（１００％）で認められた（データは省略）。

【0283】

ＳＮ－３８の滞留性－Ｃａｐａｎ－１ヒト膵臓癌異種移植片（約０．０６～０．２７ｇ）を有するヌードマウスにおけるＳＮ－３８の滞留性を測定した。イリノテカン４０ｍｇ／ｋｇ（７７３μｇ；総ＳＮ－３８当量 ＝ ４４８μｇ）をマウスにＩＶ注射した。この用量はマウスのＭＴＤである。ヒト等用量 ＝ ３．２５ｍｇ／ｋｇまたは約１２６ｍｇ／ｍ^２である。または、ＩＭＭＵ－１３２ １．０ｍｇ（ＳＮ－３８：抗体比 ＝ ７．６；ＳＮ－３８当量 ＝ ２０μｇ）をマウスにＩＶ注射した。この用量は十分にマウスのＭＴＤ未満である。ヒト等用量は、約４ｍｇ／ｋｇのＩＭＭＵ－１３２（約８０μｇ／ｋｇのＳＮ－３８当量）である。間隔毎（イリノテカン注射マウスでは、５分、１、２、６及び２４時間時点、またはＩＭＭＵ－１３２注射マウスでは、１、６、２４、４８及び７２時間時点）に、３匹の動物の剖検を実施した。組織を抽出してから、ＳＮ－３８、ＳＮ－３８Ｇ及びイリノテカン用に逆相ＨＰＬＣ分析による解析を行った。またＩＭＭＵ－１３２治療動物由来の抽出物を酸加水分解させて、複合体（すなわち、ＳＮ－３８［全体］）からＳＮ－３８を遊離させた。結果は、ＩＭＭＵ－１３２ ＡＤＣでは２２倍少ないＳＮ－３８当量を投与したにもかかわらず、ＩＭＭＵ－１３２ ＡＤＣが、イリノテカンと比較して１２０倍超のＳＮ－３８を腫瘍へと送達するポテンシャルを有していることを示している（データは省略）。

【0284】

【表5】

【0285】

上で要約したプロトコルに従い、患者にＩＭＭＵ－１３２を投与した。例示的なケーススタディーは、以下のとおりである。転移性膵臓癌（肝臓）と初めて診断された３４歳白人男性は、ＩＭＭＵ－１３２（２１日サイクルの１日目及び８日目に８ｍｇ／ｋｇ用量を投与）を開始する前に、ゲムシタビン／エルロチニブ／ＦＧ－３０１９、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ及びＧＴＸを含む複数の化学療法レジメンにおいて増悪していた。良好な症状耐性を有しつつ４ヶ月間にわたり薬物を投与された患者には、疼痛の改善、ＣＡ１９－９の７２％の最大低下（１５８８５Ｕ／ｍＬから４４１８Ｕ／ｍＬへ）、及びＣＴ ＲＥＣＩＳＴ基準による安定に加え、腫瘍壊死のエビデンスが認められた。肝膿瘍により治療を中止する必要があった。患者は、治療開始後６ヶ月となる約６週間後に死亡した。

【0286】

結論
前臨床試験は、イリノテカン投与時と比較して、ＩＭＭＵ－１３２が、１２０倍の量のＳＮ－３８をヒト膵臓腫瘍異種移植片へと送達することを示した。多種多様な転移性固形がんを有する患者を登録する大規模試験の一部では、第ＩＩ相のＩＭＭＵ－１３２用量を、主な副作用である管理可能な好中球減少症及び下痢を基準として、８～１０ｍｇ／ｋｇと決定した。治療サイクルを繰り返しているにもかかわらず、抗抗体または抗ＳＮ－３８抗体は今日まで検出されていない。

【0287】

平均２つの前治療の後に再発した１４名の進行ＰＤＣ患者の試験では、ＣＴで確認済みの抗腫瘍活性（安定患者の８／１３（６２％）からなる）が認められた。１３名のＣＴ評価可能な患者におけるＴＴＰの平均持続期間は、最後の前治療から概算された８．０週間と比較して、１２．７週間であった。このＡＤＣ、多くの上皮癌に広く認められるＴｒｏｐ－２を標的とする抗体に、腫瘍部位で開裂をもたらすリンカーでコンジュゲートしたナノモル毒性の周知の薬物は、ＡＤＣを用いた膵臓癌治療における新しく効果的な戦略を意味している。膵臓癌患者用の現行の標準治療と比較した、膵臓癌患者、特に複数の前治療に耐性を示す患者における無増悪期間の延長は、驚くべきものであり、予測することはできていなかった。

【0288】

実施例１１．抗体標的化放射線（放射免疫治療）と抗Ｔｒｏｐ－２－ＳＮ－３８ ＡＤＣを組み合わせることにより、膵臓癌治療を改善する
本発明者らは以前、ゲムシタビン（ＧＥＭ）と組み合わせると効果が高まる^９０Ｙ－ヒト化ＰＡＭ４ ＩｇＧ（ｈＰＡＭ４；^９０Ｙ－クリバツズマブテトラキセタン）を投与したヒト膵臓腫瘍を有するヌードマウスにおける有効な抗腫瘍活性について報告した（Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １０９：６１８－２６，２００４；Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ９：３９２９Ｓ－３７Ｓ，２００３）。これらの試験は、有望な客観的効果を示す、ＧＥＭと組み合わせた分割用量^９０Ｙ－ｈＰＡＭ４ ＩｇＧの臨床試験につながった。ＧＥＭはその放射線増感能で知られているが、単剤ではあまり有効な膵臓癌治療薬ではなく、その用量は血液毒性により制限される。^９０Ｙ－ｈＰＡＭ４ ＩｇＧもまた血液毒性により制限される。

【0289】

上記実施例で説明したが、ＳＮ－３８に結合したｈＲＳ７ ＩｇＧからなる抗Ｔｒｏｐ－２ ＡＤＣは、様々な固形腫瘍において抗腫瘍活性を示す。マウスはこのＡＤＣに十分耐性を示し（例えば、≧６０ｍｇ）、更にわずか４．０ｍｇ（０．５ｍｇ、週に２回 ｘ ４）だけで有意な治療効果がもたらされる。Ｔｒｏｐ－２はまた、ほとんどの膵臓癌で発現している。

【0290】

本試験では、０．３５ｃｍ^３の皮下異種移植片（ヒト膵臓癌細胞株、Ｃａｐａｎ－１）を有するヌードマウスを用いて、^９０Ｙ－ｈＰＡＭ４ ＩｇＧとサシツズマブゴビテカンの組み合わせについて試験した。^９０Ｙ－ｈＰＡＭ４ ＩｇＧ単剤（１３０μＣｉ、すなわち、最大耐量（ＭＴＤ）、または７５μＣｉ）による単回投与で、サシツズマブゴビテカン単剤（上記のとおり）による単回投与で、または２剤の組み合わせ（２つの^９０Ｙ－ｈＰＡＭ４投与濃度、最初のＡＤＣ注射は^９０Ｙ－ｈＰＡＭ４と同日に行う）で、マウス（ｎ＝１０）の治療を行った。≦１５％の体重減少を伴いつつも、全ての治療に耐性を示した。ほとんどの動物に客観的な効果が現れたが、それら効果は、それぞれの薬剤を単独で投与した群と比較して、併用群の両方においてより強力に現れた。０．１３ｍＣｉ ^９０Ｙ－ｈＰＡＭ４ ＩｇＧ ＋ サシツズマブゴビテカン群内の全ての動物は４週間にわたり腫瘍フリー状態を達成した。その一方で、その他の動物は持続性病変のエビデンスを示し続けた。これらの試験は、放射免疫治療をＡＤＣと組み合わせることにより、安全用量での効果が高まることを示す最初のエビデンスを提供する。

【0291】

進行中のＰＡＭ４臨床試験では、４週間の臨床治療サイクルを実施する。１週目には、ゲムシタビン投与の少なくとも２日後に、対象に^１１１Ｉｎ－ｈＰＡＭ４を１回投与する。２、３及び４週目には、ゲムシタビン（２００ｍｇ／ｍ^２）投与の少なくとも２日後に、対象に^９０Ｙ－ｈＰＡＭ４を１回投与する。３ ｘ ６．５ｍＣｉ／ｍ^２で漸増を開始した。フロントラインの膵臓癌患者における最大耐量は、３ ｘ １５ｍＣｉ／ｍ^２（血液毒性は用量制限）であった。２２名のＣＴ評価可能な患者のうち、病変制御率（ＣＲ＋ＰＲ＋ＳＤ）は６８％であり、ＲＥＣＩＳＴ基準による最良効果は、５名（２３％）が部分寛解、１０名（４５％）が安定となった。

【0292】

抗体薬物複合体（ＡＤＣ）の調製
ＳＮ－３８をコンジュゲートさせたｈＲＳ７抗体を、上記のとおりに、また上記のプロトコル（Ｍｏｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ２００８，５１：６９１６－６９２６；Ｇｏｖｉｎｄａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００９．１５：６０５２－６０６１）に従って調製した。ＳＮ－３８の反応性二官能性誘導体（ＣＬ２Ａ－ＳＮ－３８）を調製した。ＣＬ２Ａ－ＳＮ－３８の式は、マレイミド－［ｘ］－Ｌｙｓ－ＰＡＢＯＣＯ－２０－Ｏ－ＳＮ－３８（式中、ＰＡＢはｐ－アミノベンジルであり、「ｘ」は短いＰＥＧを含む）である。ＴＣＥＰで抗体中のジスルフィド結合を還元した後、ＣＬ２Ａ－ＳＮ－３８を還元抗体と反応させて、ＳＮ－３８をコンジュゲートさせたＲＳ７を調製した。

【0293】

上記（Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００３，９：３９２９Ｓ－３７Ｓ；Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２００４，１０９：６１８－２６）のとおり、^９０Ｙ－ｈＰＡＭ４を調製する。

【0294】

ＲＡＩＴ ＋ ＡＤＣの組み合わせ
Ｔｒｏｐ－２抗原は、ほとんどの上皮癌（肺、乳房、前立腺、卵巣、結腸直腸、膵臓）で発現しており、サシツズマブゴビテカン複合体は、様々なヒトがんマウス異種移植モデルで試験されている。^９０Ｙ－ｈＰＡＭ４ ＩｇＧに加えて放射線を増感する量のＧＥＭを用いた初期の臨床試験は有望であり、腫瘍縮小または安定のエビデンスがある。しかしながら、膵臓癌の治療は非常に難易度が高い。それゆえ、併用療法が優れた効果を誘導するかどうかを明らかにするために、併用療法に関する試験を行った。具体的には、有効でその上非毒性用量のサシツズマブゴビテカンの投与を、^９０Ｙ－ｈＰＡＭ４ ＩｇＧを用いたＲＡＩＴと組み合わせた。

【0295】

結果は、サシツズマブゴビテカンと^９０Ｙ－ｈＰＡＭ４の組み合わせが、単剤治療または個別治療の総和のいずれかと比較して、より効果的であることを示した。７５μＣｉ用量の^９０Ｙ－ｈＰＡＭ４では、１０匹のマウスのうち１匹だけが２０週間の治療後に腫瘍フリーとなり（データは省略）、同一の結果がサシツズマブゴビテカン単剤においても観察された（データは省略）。しかしながら、サシツズマブゴビテカンを^９０Ｙ－ｈＰＡＭ４と組み合わせると、１０匹のマウスのうち４匹が２０週間の治療後に腫瘍フリーとなり（データは省略）、残りの対象では、一方の治療単独の場合と比較して、腫瘍容積にかなりの減少が認められた（データは省略）。１３０μＣｉの^９０Ｙ－ｈＰＡＭ４では、違いは更により顕著であり、併用治療群では、ＲＡＩＴ単独群の１０匹中５匹と比較して、１０匹の動物のうち９匹が腫瘍フリーとなった（データは省略）。これらのデータは、サシツズマブゴビテカンと^９０Ｙ－ｈＰＡＭ４の組み合わせによる相乗効果を示している。ＲＡＩＴ ＋ ＡＤＣは無増悪期間を有意に改善させ、腫瘍フリー治療の頻度を上昇させた。^９０Ｙ－ｈＰＡＭ４を用いたＲＡＩＴのＭＴＤにＡＤＣとサシツズマブゴビテカンの組み合わせを加えても、治療に応じた動物の体重減少率が示す追加毒性は最小限であった（データは省略）。

【0296】

腫瘍生存に対する個別連続治療の効果は、ＲＡＩＴを最初に実施してからＡＤＣを投与すると最適効果が得られるということを示した（データは省略）。対照的に、ＡＤＣを最初に投与してからＲＡＩＴを実施すると、腫瘍フリー動物の出現率は減少する（データは省略）。単剤で投与した場合、非コンジュゲートｈＰＡＭ４もｈＲＳ７抗体も抗腫瘍活性を有していなかった（データは省略）。

【0297】

実施例１２．治療に耐性を示す転移性乳癌を治療するためのサシツズマブゴビテカン（ＩＭＭＵ－１３２）の使用
患者は、２００５年に初めて診断され、ステージＩＶのトリプルネガティブ乳癌（ＥＲ／ＰＲ陰性、ＨＥＲ－ｎｅｕ陰性）を有する５７歳の女性であった。彼女は、２００５年に自身の左乳房の乳腺腫瘍摘出術を受けた後、２００５年９月に、アジュバント設定Ｄｏｓｅ－Ｄｅｎｓｅ ＡＣＴを受けた。その後、彼女は放射線治療を受け始め、１１月に終了した。２０１２年の初期に患者が対側（右）乳房のしこりを触診した際、病変の局所再発が確認され、その後、ＣＭＦ（シクロホスファミド、メトトレキサート、５－フルオロウラシル）化学療法による治療を受けた。同年、彼女の疾患は、胸壁皮膚における転移性病変を伴って再発した。その後彼女は、カルボプラチン ＋ ＴＡＸＯＬ（登録商標）の化学療法レジメンを受け、その間、血小板減少症を発症した。彼女の病変は増悪し、彼女は週に１回のドキソルビシンを開始して、６回の投薬まで継続した。皮膚の病変もまた増悪していた。２０１２年９月２６日のＦＤＧ－ＰＥＴスキャンでは、胸壁及び肥大した固形の腋窩リンパ節における病変の増悪が認められた。患者は、疼痛コントロールのためオキシコドンを投与された。

【0298】

胸壁病変を切開摘出してから、彼女は、２０１２年１０月から２０１３年２月まで（４ヶ月間にわたって１週間おきに）、Ｉｘｅｍｐｒａ（登録商標）の投与を受けた。その後、彼女はゼローダ（登録商標）を投与されたが、彼女の手足の神経障害に加え便秘に起因して十分には耐性を示さなかった。皮膚病変が進行性であったため、インフォームドコンセントの実施後、彼女はＩＭＭＵ－１３２試験に組み入れられた。患者はまた、高リスクのＣＮＳ疾患を伴う（しかしながら、脳ＭＲＩではＣＮＳ疾患に対して陰性）、甲状腺機能亢進症及び視覚障害の病歴を有していた。この試験への登録時において、彼女の右乳房における皮膚病変（標的）の最大直径は、４．４ｃｍ及び２．０ｃｍであった。彼女は、右乳房に別の非標的病変、右腋窩及び左腋窩にそれぞれ１つの肥大リンパ節を有していた。

【0299】

最初のＩＭＭＵ－１３２注入（１２ｍｇ／ｋｇ）を２０１３年３月１２日に開始したが、十分に耐性を示した。彼女の２回目の注入は、注入計画日のグレード３絶対好中球数（ＡＮＣ）減少（０．９）により１週間後に延期された。１週間の延期及びニューラスタ（登録商標）の投与後、彼女の２回目のＩＭＭＵ－１３２投与を、用量を２５％減少させた９ｍｇ／ｋｇで実施した。その後、彼女は、プロトコルに従ったスケジュール（２週間にわたり週に１回、その後１週間の休薬）でＩＭＭＵ－１３２の投与を受けた。３回の治療サイクル後における２０１３年５月１７日の彼女の最初の効果判定評価では、標的病変の長径和に、ＲＥＣＩＳＴ基準による部分寛解となる４３％の減少が認められた。彼女は９ｍｇ／ｋｇ投与濃度で治療を継続している。彼女の総合的な健康状態及び臨床症状は、ＩＭＭＵ－１３２による治療を開始してから大幅に改善した。

【0300】

実施例１３．耐性を示す転移性小細胞肺癌を治療するためのサシツズマブゴビテカン（ＩＭＭＵ－１３２）の使用
この実施例は、左肺の縦隔リンパ節、及び、ＭＲＩによる左頭頂部脳葉への転移の形跡が認められる、小細胞肺癌と診断された６５歳女性に関する。前化学療法にはカルボプラチン、エトポシド及びトポテカンが含まれていたが、効果は認められなかった。放射線治療もまた、彼女の病変の制御に失敗している。その後、彼女は、１８ｍｇ／ｋｇのＩＭＭＵ－１３２を２週間おきに１回、合計５回の注入で投与された。２回目の投薬後、彼女は低血圧症及びグレード２の好中球減少症を起こしたが、次回の注入前に改善した。５回目の注入後のＣＴ検査では、彼女の標的左肺腫瘤に１３％の縮小が認められた。脳のＭＲＩでもまた、この転移部に１０％の縮小が認められた。彼女は、２週間おきのＩＭＭＵ－１３２投薬を更に３ヶ月間継続し、彼女の病状に客観的かつ主観的な改善（左肺腫瘤の２５％の縮小、及び脳転移部の２１％の縮小）が認められるまで継続した。

【0301】

実施例１４．ステージＩＶ転移性病変を有する胃癌患者のサシツズマブゴビテカン（ＩＭＭＵ－１３２）による治療
この患者は、喫煙履歴、及び４０年間にわたる過度のアルコール摂取期間を有する６０歳男性であった。彼は、体重減少、制酸薬では軽減しない摂食不快感及び疼痛、頻繁な腹痛、腰部痛、ならびに、直近では、両腋窩の触知可能なリンパ節を発症した。彼は医学的助言を求め、精密検査後、胃内視鏡による生検に基づいて、胃－食道接合部に若干の扁平部を含む腺癌の存在が認められた。放射線学的検査（ＣＴ及びＦＤＧ－ＰＥＴ）により、右腋窩及び左腋窩、縦隔領域、腰椎、ならびに肝臓（右葉に２つの腫瘍、左葉に１つの腫瘍、全て直径２～４ｃｍの大きさ）における転移性病変もまた明らかとなった。彼は、胃腫瘍の切除後、エピルビシン、シスプラチン及び５－フルオロウラシルによる化学療法のクールに入った。４ヶ月間、及び６週間の休薬期間の後、彼は、ドセタキセル化学療法に切り替えたが、転移性腫瘍のＣＴ測定で確認された増悪、及び一部の全身的な悪化に基づくと、この療法もまた彼の病変の制御に失敗した。

【0302】

それから、患者は、１０ｍｇ／ｋｇ用量のＩＭＭＵ－１３２（ｈＲＳ７－ＳＮ－３８）を、１週おきに合計６回の用量で注入する治療を受けた後、彼の病変状態を評価するためのＣＴ検査を受けた。これらの注入では、若干の軽度の悪心及び下痢（対症薬物療法で制御）を有しつつも、十分に耐性を示した。ＣＴ検査において、彼の指標転移性病変の合計が２８％縮小していることが明らかとなったため、彼はこの療法を更に５クール継続した。追跡ＣＴ検査により、彼の病変に、ＩＭＭＵ－１３２治療を行う前のベースライン測定値からＲＥＣＩＳＴ基準で３５％の縮小が維持されていることが示され、彼の全身状態も改善していると考えられる。患者は制御中の自身の病変に対する楽観的な態度を取り戻している。

【0303】

実施例１５．多種多様なＴｒｏｐ－２陽性がんにおけるＩＭＭＵ－１３２の臨床試験
抄録
サシツズマブゴビテカン（ＩＭＭＵ－１３２、ｈＲＳ７－ＣＬ２Ａ－ＳＮ－３８としても周知）とは、ＳＮ－３８（イリノテカンの活性代謝物）を送達するための、Ｔｒｏｐ－２（ほとんどの上皮性腫瘍上で発現している表面糖タンパク質）を標的とする抗体薬物複合体（ＡＤＣ）のことである。超毒性薬物及び安定したリンカーを使用するほとんどのＡＤＣとは異なり、ＩＭＭＵ－１３２は、ＳＮ－３８とリンカーの間の適度に安定したカーボネート結合を有する適度な毒性薬物を使用する。フローサイトメトリー及び免疫組織化学試験により、胃、膵臓、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、結腸、前立腺及び肺を含む広範囲の腫瘍タイプでＴｒｏｐ－２が発現していることが明らかとなった。細胞結合試験では、ＩＭＭＵ－１３２と親ｈＲＳ７抗体の間に有意差は認められなかったが、Ｔｒｏｐ－２ ＣＭ５チップを使用した表面プラズモン共鳴解析では、ｈＲＳ７と比較して、ＩＭＭＵ－１３２に有意な結合優位性が認められた。複合体は新生児受容体への結合を維持したが、ｈＲＳ７と比較して、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害活性の６０％超を失った。

【0304】

腫瘍細胞を遊離ＳＮ－３８またはＩＭＭＵ－１３２のいずれかに曝すと、同一シグナル伝達経路におけるｐＪＮＫ１／２及びｐ２１ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１に上方制御が認められ、その後、カスパーゼ９、７及び３による切断が起こり、最終的には、ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ切断及び二本鎖ＤＮＡの切断がもたらされる。マウスにおけるインタクトＡＤＣの薬物動態試験では、１５．４時間の平均滞留時間（ＭＲＴ）となる一方で、担体ｈＲＳ７抗体は非コンジュゲート抗体とほぼ同等の速度で消失する（ＭＲＴ ＝ 約３００時間）ことが明らかとなった。ヒト胃癌異種移植片を有するマウスのＩＭＭＵ－１３２治療（１７．５ｍｇ／ｋｇ；週に２回 ｘ ４週間）では、非特異的対照で治療したマウスと比較して、有意な抗腫瘍効果が得られた。臨床的に意義のあるＩＭＭＵ－１３２の投薬スキームで、ヒト膵臓癌またはヒト胃癌を有するマウスに、１週おき、週に１回、または週に２回のいずれかで投与した。

【0305】

本第Ｉ相試験では、このＡＤＣを、様々な転移性固形がんを有する前治療済み患者のための潜在的な治療薬と評価した。特定の実施形態では、使用する治療薬は、イリノテカン（ＳＮ－３８の親化合物）による治療を含むがこれらに限定されない標準的な抗がん治療に耐性を示すまたは再発することが以前に判明した患者を治療するためものである。これらの結果は驚くべきかつ予想外なものであり、予測することはできていなかった。

【0306】

２１日サイクルの１日目及び８日目にサシツズマブゴビテカンを投与し、用量制限毒性または増悪となるまでサイクルを繰り返した。用量漸増は４種類の計画投与濃度の標準的な３＋３スキームに従い、投与延期または用量減少は可能とした。２５名の患者（５２～６０歳、平均３つの前化学療法レジメン）を、８（Ｎ＝７）、１０（Ｎ＝６）、１２（Ｎ＝９）及び１８（Ｎ＝３）ｍｇ／ｋｇの投与濃度で治療した。好中球減少症は用量制限であった（１サイクルの最大耐量は１２ｍｇ／ｋｇであるが、サイクルを繰り返すと毒性が強すぎる）。疲労（Ｎ＝３）、好中球減少症（Ｎ＝２）、下痢（Ｎ＝１）及び白血球減少症（Ｎ＝１）に限定される治療に関連するグレード４毒性及びグレード３毒性がない場合、延長治療に低用量を許容した。ＣＴによるＲＥＣＩＳＴ １．１基準を用いると、３名の患者は最良効果として部分寛解（トリプルネガティブ乳癌、小細胞肺癌、結腸癌）を達成し、その他１５名は最良効果として安定を示した。これらの患者のうち１２名は、１６～３６週間の継続治療により病変制御を維持した。腫瘍Ｔｒｏｐ－２発現を基準とした患者の事前選択は実施しなかった。

【0307】

サシツズマブゴビテカンが、治療困難ながんを有する患者に許容可能な毒性及び有望な治療効果をもたらす、有望なＡＤＣ複合体であることが結論付けられた。８及び１０ｍｇ／ｋｇ用量を第ＩＩ相試験用に選択した。

【0308】

緒言
異なる超毒性（ピコモル力価）薬物を導入した２種類の新規抗体薬物複合体（ＡＤＣ）が承認されており、超毒性薬物の使用を含む同様の原理に基づいたその他ＡＤＣの更なる開発につながっている（Ｙｏｕｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ １１：１９－２０；Ｓｉｅｖｅｒｓ ＆ Ｓｅｎｔｅｒ，２０１３，Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｍｅｄ ６４：１５－２９；Ｋｒｏｐ ＆ Ｗｉｎｅｒ，２０１４，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０：１５－２０）。あるいは、Ｍｏｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００８，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ５１：６９１６－２６）及びＧｏｖｉｎｄａｎ ｅｔ ａｌ．（２００９，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １５：６０５２－６１）は、ＳＮ－３８（イリノテカンの活性代謝物であるトポイソメラーゼＩ阻害剤、周知だが複雑な薬物動態を有する承認薬）を選択した（Ｍａｔｈｉｊｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７：２１８２－９４）。ＳＮ－３８をコンジュゲートするためのいくつかのリンカーについて、様々な速度（数時間から数日間）の、ＩｇＧからの遊離を評価した（Ｍｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ５１：６９１６－２６；Ｇｏｖｉｎｄａｎ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １５：６０５２－６１；Ｃａｒｄｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １７：３１５７－６９）。血清中において中間的なコンジュゲート安定性を示す選択された最適なリンカー（ＣＬ２Ａと呼ばれる）を、ＳＮ－３８のラクトン環上のヒドロキシル基に結合させることにより、この環をリンカーに結合させつつも、この環が毒性の少ないカルボキシレート形態へと開環することから保護し、溶解性を高めるための短いポリエチレングリコール部分を導入した（Ｃａｒｄｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １７：３１５７－６９）。リンカーとＳＮ－３８の間のカーボネート結合が開裂する際に活性化形態のＳＮ－３８が遊離するが、このことは、リソソームに加え腫瘍微小環境でみられるように、あるいは、酵素分解を介してみられるように、低ｐＨで起こる。

【0309】

このＡＤＣ用に選択した抗体は、上記で内部移行することを示したヒト化ＲＳ７モノクローナル抗体（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ５５：９３８－４６）を利用して、腫瘍関連抗原、Ｔｒｏｐ－２（栄養膜細胞表面抗原）（Ｃａｒｄｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １７：３１５７－６９）を標的とした。Ｔｒｏｐ－２はＡＤＣにとって重要な腫瘍標的である。なぜなら、Ｔｒｏｐ－２は、ほとんどの上皮性腫瘍（特により活動的なタイプ）上で過剰発現しているからである（Ａｍｂｒｏｇｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ９：ｅ９６９９３；Ｃｕｂａｓ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔ １７９６：３０９－１４；Ｔｒｅｒｏｔｏｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ３２：２２２－３３）。Ｔｒｏｐ－２は多数の正常組織上にも存在しているが、その抗原を発現するサルの前臨床試験において、この新規ＡＤＣでは用量制限の好中球減少症及び下痢のみが観察され、Ｔｒｏｐ－２発現正常組織への顕著な毒性のエビデンスは認められなかった（Ｃａｒｄｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １７：３１５７－６９）。それゆえ、いくつかのヒト腫瘍異種移植片モデルにおいて活性を示し、広い治療窓を示す前臨床データ（Ｃａｒｄｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １７：３１５７－６９）を用いて、再発／耐性を示す多種多様な転移性上皮性腫瘍を有し、多数の前治療暦を有する患者におけるこの新規ＡＤＣの最大耐量及び最適用量を決定するために、第Ｉ相臨床試験を開始した。この試験をＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖに登録した（ＮＣＴ０１６３１５５２）。

【0310】

原料及び方法
登録基準－主な目的は、単一薬剤としてのサシツズマブゴビテカン（ＩＭＭＵ－１３２）の安全性及び忍容性を確認することであった。試験を標準的な３＋３第Ｉ相デザインとして設計し、注射あたり８ｍｇ／ｋｇ用量で開始して、３週間の治療サイクルで２週間にわたり週に１回投与した。

【0311】

１３種類の異なるタイプの上皮性腫瘍のうちの１つと診断された場合、年齢≧１８歳の男性及び妊娠しておらず授乳中ではない女性を適格とした。Ｔｒｏｐ－２発現を基準とした事前選択は必須ではなかったが、これらの腫瘍は、保管標本の免疫組織学検査に基づいて、＞７５％の症例でＴｒｏｐ－２発現を示すと予想された。患者は測定可能な転移性病変を有している必要があり（≧５ｃｍの単一病変はない）、その指標における少なくとも１つの承認済み標準化学療法レジメンから再発したまたはそれらに耐性を示した。その他の主要な基準には、相応（グレード≦１）の血液毒性、肝機能毒性及び腎機能毒性、及び、イリノテカンに対するアナフィラキシー反応の履歴がないこと、または、イリノテカン前治療またはトポイソメラーゼＩ前治療に対するグレード≧３の胃腸毒性の履歴がないこと、が含まれていた。患者がこのような多種多様な病態を有し得たため、前イリノテカン治療は必要条件ではなかった。ジルベール病を有する患者、以前に投与されたイリノテカンに耐性を示さなかった患者、または周知のＣＮＳ転移性疾患を有する患者は、除外された。

【0312】

試験デザイン－治療開始前の４週間以内に、血球数、血清化学、バイタルサイン、及び任意の有害事象の定期モニタリングを行い、ベースライン評価を実施した。ベースライン時及びその後の全偶数治療サイクルの開始前時点に採取した試料を用いて、抗抗体反応及び抗ＳＮ－３８抗体反応をＥＬＩＳＡで測定した。治療開始後６～８週間時点で最初のＣＴ検査を実施し、その後、増悪するまで８～１２週間の間隔でＣＴ検査を継続した。任意の進行中の治療関連毒性をモニターするためだけに、追加の経過観察を実施した。ＮＣＩ ＣＴＣＡＥ ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０を使用して毒性をグレーディングし、ＲＥＣＩＳＴ １．１により効果を評価した。

【0313】

血清中のＴｒｏｐ－２を検出するために、２ｎｇ／ｍＬの感度を有するＥＬＩＳＡを開発したが、１２名の患者に対する試験後にも循環Ｔｒｏｐ－２のエビデンスが発見されなかったため、更なるスクリーニングについては実施しなかった。適格性基準というわけではないが、ＡＤＣの抗体、ｈＲＳ７が認識するエピトープが、ホルマリン固定パラフィン包埋切片内に保持されていないため、以前に保管した腫瘍の標本については、ヤギポリクローナル抗体抗ヒトＴｒｏｐ－２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を使用した免疫組織学検査によるＴｒｏｐ－２測定が必要となった（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ５５：９３８－４６）。以下に記載するとおり染色を実施した。

【0314】

治療レジメン－凍結乾燥サシツズマブゴビテカンを生理食塩水で戻し、２～３時間にわたり注入した（約１．６ｍｇのＳＮ－３８を含有する１００ｍｇの抗体、７．６：１の平均薬物：抗体比［ＤＡＲ］）。ほとんどの患者は、それぞれの注入を開始する前に、アセトアミノフェン、抗ヒスタミン剤（Ｈ１遮断薬及びＨ２遮断薬）、及びデキサメタゾンの投与を受けた。制吐薬または下痢止め薬の予防的使用は禁止された。連続２回の投与からなる治療を、許容できない毒性または増悪が生じない限りにおいて、最大８サイクル（すなわち、１６回の治療）にわたって患者に治療を継続させるつもりで、３週間治療サイクルの１日目及び８日目に行った。８サイクル後に病変の安定化または病変に対する効果を示す患者は、治療継続可能とした。

【0315】

用量制限毒性（ＤＬＴ）は、任意の持続期間のグレード≧３ 発熱性好中球減少症、かなりの出血を伴うグレード３ 血小板減少症または≧５日間のグレード４ 血小板減少症、最適な内科治療にもかかわらず＞４８時間持続する任意のグレード３ 悪心、嘔吐または下痢、もしくは、任意の持続期間のグレード４（命にかかわる） 悪心、嘔吐または下痢、または、少なくとも試験薬に起因する可能性がある任意のその他グレード≧３ 非血液毒性、それに加え、任意のグレード３ 注入関連反応の発症とみなされた。

【0316】

最大耐量（ＭＴＤ）は、最初の治療サイクルに対する患者の耐性に基づいて判定した。計画治療の日にグレード≧２ 治療関連毒性（脱毛症を除く）を有する任意の患者の治療は、最大２週間（１週間単位で増やす）にわたり延期した。毒性がグレード≦１に回復したところで、治療を再開した。プロトコルではまた、当初、全ての続く治療用量を減量させる（１週間以内に回復した場合は２５％、２週間以内に回復した場合は５０％）必要があったが、最初のサイクル後の支持療法を可能とするためにプロトコルを修正した際、試験の後期でこの条件を緩和した。しかしながら、毒性が３週間以内に回復しなかったまたは悪化した場合については、治療を終了した。重要なことに、減量を伴う投与延期ではＤＬＴとならなかったため、治療の継続が可能となった（低用量ではあるが）。それゆえ、治療の継続が可能となった投与延期／用量減少を必要とする患者は、ＤＬＴと評価可能であるとはみなされず、その後交代した。

【0317】

ＤＬＴ事象が全ての更なる治療を終了させるため、第２の目的は、投与遅延または用量減少が最小限である複数サイクルの治療にわたり耐性を示し得る投与濃度を評価することであった。この投与濃度は最大許容量と呼ばれ、第１サイクル中及び第２サイクルの開始に至るまでに延期または減少を伴うことなく、第１サイクルにおける任意の投与濃度に患者が耐性を示すことを必要とする。

【0318】

薬物動態及び免疫原性－注入の終盤（例えば、ピーク）から約３０分以内に血液試料を採取してから、それぞれの続く注入（例えば、トラフ）を行った。ＥＬＩＳＡを用いて総ＩｇＧ濃度及び総サシツズマブゴビテカン濃度を測定するために、試料を分離して血清を凍結させた。７名の患者由来の血清試料についても、全体（ＩｇＧに結合したＳＮ－３８を意味する）と遊離ＳＮ－３８（すなわち、非結合ＳＮ－３８）の両方で、ＳＮ－３８含有量の定量を行った。

【0319】

結果
患者背景－２５名の患者を登録した（表６）。平均年齢は５２～６０歳の範囲であり、７６％がＥＣＯＧ １パフォーマンスステータスであり、残りがＥＣＯＧ ０であった。ほとんどの患者は、転移性膵臓癌（ＰＤＣ）（Ｎ＝７）、続いて、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）（Ｎ＝４）、結腸直腸癌（ＣＲＣ）（Ｎ＝３）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）（Ｎ＝２）、及び胃癌（ＧＣ）（Ｎ＝２）を有しており、食道腺癌（ＥＡＣ）、ホルモン不応性前立腺癌（ＨＲＰＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、上皮性卵巣癌（ＥＯＣ）、腎臓癌、扁桃癌、及び膀胱癌（ＵＢＣ）の症例がそれぞれ１件であった。

【0320】

１７名の患者に由来する保管組織の免疫組織学検査を実施したところ、１３点（７６．４％）が標本内の＞１０％の腫瘍細胞上に２＋～３＋の膜染色及び細胞質染色を示し、３点（１７．６％）が陰性であった。いくつかの代表的な症例について以下で開示する。

【0321】

全ての患者は、それぞれの原発性がんに典型的な部位に転移性病変を有する状態で試験に入った。ベースライン時の検査において、ＣＴにより、全患者における最大腫瘍径合計の平均が９．７ｃｍ（２．９～２９．８ｃｍの範囲）であることが求められ、１４名の患者が３つまたはそれ以上の標的病変（全患者にわたる平均 ＝ ４つ、１～１０の範囲の病変）を有し、平均２つの非標的病変（範囲 ＝ ０～７つの病変）が確認された。前全身療法数の平均は３であり、７名の患者（ＰＤＣ及びＧＣがそれぞれ２名、ＣＲＣ、ＴＮＢＣ、扁桃がそれぞれ１名）が１つの前治療を有し、７名の患者が５つまたはそれ以上の前治療を有し、１１名の患者が前放射線治療を有していた。９名の患者（ＣＲＣ患者２／３名、ＰＤＣ患者４／７名、イリノテカンを投与されているＥＡＣ患者１名、及びトポテカンを投与されているＳＣＬＣ患者２／２名）に前トポイソメラーゼＩ治療を行ったが、それら患者のうちの３名（ＳＣＬＣ患者２名、及びＣＲＣ患者１名）は、抗トポイソメラーゼＩ治療に反応しなかった。更に、２３名の患者のうち７名（２名は未確定）は、３ヶ月間の平均持続期間（１～１１ヶ月間の範囲）、それら患者の最後の前治療に反応した。

【0322】

ＣＴでＲＥＣＩＳＴ １．１による決定的な増悪のエビデンスが現れるまでに、ほぼ全員の患者が複数回のサシツズマブゴビテカン治療（平均１０回の投与）を受けた。１名の患者は全身悪化により中止となり、１名の患者は、新規病変が認められた最初の経過観察時に標的病変が測定されなかった。

【表6】

【0323】

用量評価－８．０ｍｇ／ｋｇの開始用量で登録された３名の患者（ＣＲＣ １名、ＰＤＣ ２名）においては、投与延期または用量減少もＤＬＴ事象も認められなかった。第２の用量の投与にプロトコル規定の延期が生じたため、次の投与濃度の１２ｍｇ／ｋｇには９名の患者を登録した。５名の患者が第１サイクル中に延期された（４名は１週間延期され、２名は骨髄増殖因子支持薬を投与され、１名は第２の用量を投与される前に２週間延期された）。これら患者のうち１名を除く全員は、第２の用量として１２ｍｇ／ｋｇの投与を受けた。１２ｍｇ／ｋｇ投与濃度における９名の患者のうち４名では、第２サイクルで開始した第３の用量を９ｍｇ／ｋｇに減少し、３名の患者では、第２サイクルを更に１週間延期した。これらプロトコル規定の延期／減少にもかかわらず、９名の患者のだれも第１サイクル中に用量制限事象を示さなかった（例えば、１名の患者は第１の用量後に疾患関連グレード３ヘモグロビン症を示し、第１の用量後のグレード３好中球減少症を有する２名の患者は骨髄増殖因子を投与され、支持薬なしで回復した１名は第１の用量後にグレード３好中球減少症を示し、２名は第２の用量後にグレード３好中球減少症を示し、２名の患者は第１の用量または第２の用量の後にグレード２好中球減少症を示し、また１名の患者は有害事象を示さなかった）。その結果、１８ｍｇ／ｋｇの投与濃度に増加することが可能となった。ここで、全３名の患者は第１の治療後に投与延期を示し、１名の患者だけが１８ｍｇ／ｋｇで第２の治療を受けた。２名の患者は用量制限のグレード４好中球減少症を示し（１名の患者は第１の用量後に、もう一方の患者は第２の１８ｍｇ／ｋｇ用量後に）、この後者の患者はまた、この用量後にグレード２下痢を示した。その結果、１２ｍｇ／ｋｇの第１サイクルでＤＬＴを示す患者は０／９であり、この濃度がＭＴＤであることが明言された。

【0324】

治療／サイクル間の最小限の延期で複数サイクルを実施可能な投与濃度を割りだすために、更なる用量探索試験を継続した。そのため、更に４名の患者を８ｍｇ／ｋｇの投与濃度で登録し、新しい中間濃度の１０ｍｇ／ｋｇを開設した。８ｍｇ／ｋｇで登録された最初の３名の患者のうち、２名のＣＲＣ患者が８ｍｇ／ｋｇで治療を継続した（合計３１回及び１１回の治療）一方で、ＰＤＣ患者は、８ｍｇ／ｋｇ用量を３回受けた後、４回目の用量でグレード２好中球減少症を示したことから６ｍｇ／ｋｇに用量を減少し、それから、この濃度で更に３回の治療を完了した後、増悪により中止となった。別の４名の患者は、８ｍｇ／ｋｇの用量を３～９回受けた後、増悪により中止となった。これら患者のうち２名は、投与を１回だけ受けた後、グレード２発疹及びグレード２好中球減少症により、プロトコル規定で６ｍｇ／ｋｇへと減量した。

【0325】

１０ｍｇ／ｋｇで登録された６名の患者のうち５名は、減量なしで６～３０回の投与を受けた後、増悪により中止となった。１名のＧＣ患者（＃９）は、１回の投与を受けた後に、グレード３発熱性好中球減少症に加えグレード４ヘモグロビン症を発症した。第１の用量直後に発熱性好中球減少症が発症したことから、発熱性好中球減少症は治療に関連している可能性があると考えられたが、胃内膜における穿孔がグレード４ヘモグロビン症に起因する可能性があることが判明し、グレード４ヘモグロビン症は無関係であると考えられた。最終的に、患者は急速に悪化し、第１の用量から４週間で死亡した。

【0326】

このように、総合的な結果としては１２ｍｇ／ｋｇをＭＴＤとして支持したが、８～１０ｍｇ／ｋｇが第１サイクルにおいてより耐性を示し、最小限の毒性で反復サイクルを可能としたことから、第ＩＩ相臨床試験は、これら２つの投与濃度を評価するために進行している。

【0327】

有害事象－２～３時間にわたるサシツズマブゴビテカンの注入を２９７回実施した（ほとんどの研究者はそれぞれの注入に先立ち前投薬を選択する）。注入関連有害事象は認められなかった。患者の半数超が、少なくともサシツズマブゴビテカン治療に関連している可能性があると考えられた、疲労、悪心、脱毛症、下痢及び好中球減少症を発症したが、これらの症状はほとんどの場合、グレード１及びグレード２であった（データは省略）。最も報告されたグレード３またはグレード４の毒性は好中球減少症（Ｎ＝８）であったが、これら患者のうち６名は、最初に１２ｍｇ／ｋｇ及び１８ｍｇ／ｋｇで治療された。発熱性好中球減少症は２名の患者で発症した（一方は、１０ｍｇ／ｋｇ用量を１回だけ投与された、既に述べたＧＣ患者＃９であり、２番目は１２ｍｇ／ｋｇ用量を４回投与されたＰＤＣ患者（＃１９））。下痢はほとんどの患者において軽度であり、３名（１２％）だけがグレード３を発症した。２名は１２ｍｇ／ｋｇの投与濃度で発症し、１名は４回目の投与後に発症し、その他の患者は第１の用量後に発症した（この患者は１２ｍｇ／ｋｇで更に６回の投与を受けたが、せいぜいグレード２の下痢と報告された）。その後、両方の患者は、一般の下痢止め薬を処方されて治療を継続した。サシツズマブゴビテカンに関連したその他の有意な毒性は認められなかったが、２名の患者がグレード２発疹を有し、３名の患者がグレード１掻痒症を有することが報告された。

【0328】

効果－標的病変の変化、及び治療後に標的病変のＣＴ測定を少なくとも１回受けた患者の無増悪期間のデータを用いて、最良効果を判定した（データは省略）。増悪を示した４名の患者については、追跡ＣＴ評価を実施しなかった（Ｎ＝１）ことから、または新規病変を有さず、それにより標的病変状態に関係なく増悪した（Ｎ＝３）ことから、グラフに記載していない。総合的には、３名の患者の標的病変に３０％超の縮小が認められた（部分寛解、ＰＲ）。これら患者のうち２名（＃３及び＃１５）に対して確認用の追跡ＣＴを実施した一方で、３番目の患者（＃２２）は、１２週間後に実施した次回のＣＴで増悪した。ＲＥＣＩＳＴ １．１による最良効果として、１５名の患者は安定（ＳＤ）を、また７名の患者は進行（ＰＤ）を示した。２４名の患者における治療開始時からの平均無増悪期間（治療を１回だけ受けて中止となった１名の患者を除く）は、３．６ヶ月間［範囲、１～１２．８ヶ月間］であり、ＳＤまたはＰＲの全患者（Ｎ＝１８）では、４．１ヶ月間［範囲、２．６～１２．８ヶ月間］であった。トポイソメラーゼＩ阻害剤を含む前治療を受けた９名の患者のうち、２名が標的病変の有意な縮小（２８％及び３８％）を示し、５名が安定（持続期間の２名（それぞれ、４．１ヶ月間及び６．９ヶ月間）を含む）を示した一方で、２名は最初の評価で増悪した。

【0329】

これらの患者におけるＴＴＰと生存率の比較は、１６名の患者（ＰＲ（１５名の患者（ＴＮＢＣ）、３名の患者（ＣＲＣ）、及びその他４名のＳＤ患者（２名がＣＲＣ、１名がＨＲＰＣ、１名がＴＮＢＣ））の２名を含む）が、治療開始から１５～２０ヶ月間生存したことを示した（データは省略）。放射線効果には、標的病変が＞３０％縮小した（ＰＲ）２名の患者が含まれていた（データは省略）。

【0330】

最良効果がＰＲである３名の患者に加え、長期的に安定したいくつかの注目に値する症例が認められた。ＴＮＢＣを有する５０歳の患者（患者１８；免疫組織学的Ｔｒｏｐ－２発現＝３＋）は、わずか３回目の投薬後に１３％の縮小を示し、４つの標的病変に１９％の縮小（ＳＬＤが７．５から６．１ｃｍに減少）が認められた１６回目の投薬後に最高点に達し、その後、治療開始から２６回目の投薬を受けた４５週間後に増悪した。７つの前治療暦（別クールの３つのイリノテカン含有レジメンを含む）があり、ＣＲＣを有する６３歳の女性（患者１０；免疫組織学検査２＋）は、１０ｍｇ／ｋｇのサシツズマブゴビテカンを５回投与された後、５つの標的病変全体に２３％の縮小が認められ、最大２８％の縮小が認められた１８回目の投薬後に最高点に達した。彼女の血漿中ＣＥＡは、ベースライン濃度の３８．５ｎｇ／ｍＬから１．６ｎｇ／ｍＬに減少した。２５回目の投薬を受けた後（２７週間後）、彼女は、ＳＬＤのｎａｄｉｒから２０％増加しＰＤを示した。興味深いことに、治療終了時の血漿中ＣＥＡはわずか４．５ｎｇ／ｍＬであった。ＨＲＰＣを有する６８歳の患者（患者２０；免疫組織染色 なし）には、５つの標的病変（１３．３ｃｍ）及び５つの非標的病変（３つの骨転移部）が認められた。彼は増悪となるまで１２．７ヶ月間にわたり３４の治療を受けたが、この期間中、ＰＳＡ濃度は徐々に上昇した。別の注目に値する症例は、６つの前治療（３番目の治療クールである６ヶ月間のＦＯＬＦＩＲＩを含む）を受けた食道癌を有する５２歳の男性（患者２５；免疫組織学検査３＋）であった。１８ｍｇ／ｋｇのサシツズマブゴビテカンで治療を開始したが、好中球減少症により１３．５ｍｇ／ｋｇに減量した。彼は３０週間にわたりＳＤを示し、増悪するまでに１５回の投薬を受けた。肝転移を伴うＰＤＣを有する６０歳の女性（＃１１）を１０ｍｇ／ｋｇで治療した。彼女のベースライン時の血清中におけるＣＡ１９－９力価は、８回の投薬後に、５８８０ユニット／ｍＬから２８４０ユニット／ｍＬに減少し、新規病変が発見される前において、１５週間（１１回の投薬）の間、病変の安定化（最良効果、１２％縮小）が認められた。それにもかかわらず、ＣＡ１９－９が減少したまま（２８１４ユニット／ｍＬ）であったため、患者は、標的病変の増悪によって試験から外れる前に、１０ｍｇ／ｋｇで更なる８回の治療（３ヶ月間）を受けることになった。

【0331】

多種多様ながんを有する１６名の患者におけるこの小規模サンプリングの保管試料で試験するＴｒｏｐ－２発現の、この時点における潜在的な有用性は、主にほとんどが高発現を示すために、決定的な評価を可能とするには不十分である。

【0332】

ＰＫ及び免疫原性－３０分血清試料中におけるサシツズマブゴビテカン及びＩｇＧの濃度を表７に記載する（用量が増加するにつれて数値が上昇する一般的な傾向を示している）。代表的な症例において、ＴＮＢＣを有する患者（＃１５）は、１２ｍｇ／ｋｇで開始して、治療クールにわたりその後の用量を減少させつつ複数回の投薬を受けた。ＥＬＩＳＡによる、複数回の投薬にわたる３０分血清中におけるＩｇＧ及びサシツズマブゴビテカンの濃度は、用量を減少させた際は低く調節して、経時的にほぼ同等であった（データは省略）。次回の投薬直前に排出される残留ＩｇＧが血清中で検出可能（トラフ試料）であった一方で、サシツズマブゴビテカンは検出できなかった（データは省略）。

【0333】

患者１５の３０分血清試料中における総ＳＮ－３８濃度は、サイクル１の第１の用量（Ｃ１Ｄ１）後において３，９３０ｎｇ／ｍＬであったが、第１サイクルの第２の用量（Ｃ１Ｄ２）でサシツズマブゴビテカン治療を９．０ｍｇ／ｋｇに減量すると、濃度は２，９４７ｎｇ／ｍＬに低下した（データは省略）。第６サイクルで用量を６．０ｍｇ／ｋｇに減量すると、２，３８１ｎｇ／ｍＬへの更なる低下が認められた。これら試料中における遊離ＳＮ－３８の量は、８８～１０２ｎｇ／ｍＬの範囲（２．４％～３．６％の総ＳＮ－３８）であり、これらピーク試料中における血清中ＳＮ－３８の＞９６％がＩｇＧに結合していることが実証された。７名の患者に由来する２８点の３０分血清試料をＨＰＬＣで解析したところ、これら試料中における総ＳＮ－３８のうち平均２．９１ ± ０．９１％が遊離ＳＮ－３８であった。４名の患者で測定した遊離ＳＮ－３８Ｇ濃度はＳＮ－３８濃度を超えることはなく、通常、数倍低い濃度であった。例えば、患者＃２５は、８サイクルの治療にわたる１２回の注入で３０分試料を評価することにより測定された。１８ｍｇ／ｋｇの開始用量において、彼は、酸加水分解試料中５，０８９ｎｇ／ｍＬのＳＮ－３８（総ＳＮ－３８）、及び非加水分解試料中わずか１５５．２ｎｇ／ｍＬのＳＮ－３８（遊離ＳＮ－３８、３．０％）を示した。この試料中における遊離ＳＮ－３８Ｇ（グルクロン酸抱合形態）は２６．２ｎｇ／ｍＬであり、すなわち、試料中において、総非結合ＳＮ－３８＋ＳＮ－３８Ｇの１４．４％に過ぎなかった。患者は１３．５ｍｇ／ｋｇで治療を継続したが、１１点の残留ピーク酸加水分解試料中における平均３３０９．８ ± ６０１．８ ｎｇ／ｍＬのＳＮ－３８を示す一方で、遊離ＳＮ－３８は平均１０５．４ ± ４７．７ ｎｇ／ｍＬ（すなわち、９６．８％がＩｇＧに結合）であり、遊離ＳＮ－３８Ｇの平均は１３．９ ± ４．１ｎｇ／ｍＬ（総ＳＮ－３８ ＋ ＳＮ－３８Ｇの１１．６％）であった。重要なことに、ほぼ全ての患者において、酸加水分解試料中のＳＮ－３８Ｇ濃度と非加水分解試料中のＳＮ－３８Ｇ濃度はほぼ同等であり、複合体に結合したＳＮ－３８が全くグルクロン酸抱合されていないことが実証された。

【表7】

【0334】

これらの患者は誰も、治療クールにわたり、正のベースライン濃度（すなわち、＞５０ｎｇ／ｍＬ）を示さず、または、ＩｇＧまたはＳＮ－３８のいずれかに対する陽性抗体反応を示さなかった。

【0335】

考察
Ｔｒｏｐ－２はほとんどの上皮性腫瘍において大量に発現しており、特に、予後マーカー及びいくつかのがんタイプにおけるがん遺伝子であると考えられている（Ｃａｒｄｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １７：３１５７－６９；Ａｍｂｒｏｇｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ９：ｅ９６９９３；Ｃｕｂａｓ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １７９６：３０９－１４；Ｔｒｅｒｏｔｏｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ３２：２２２－３３）ため、標的化療法において関心のある抗原となっている（Ｃｕｂａｓ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １７９６：３０９－１４）。正常組織におけるＴｒｏｐ－２の発現、及び研究が進んだ別の腫瘍関連抗原であるＥｐＣａｍとの関係が、Ｔｒｏｐ－２に対する免疫療法の開発安全性に関する冒頭の一部の注意文言（Ｔｒｅｒｏｔｏｌａ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １８０５：１１９－２０）をもたらしたが、ヒトとほぼ同等の組織でＴｒｏｐ－２を発現するカニクイザルにおける本発明者らの研究は、ヒト等用量の約４０ｍｇ／ｋｇのサシツズマブゴビテカンに極めて十分な耐性を示すこと（Ｃａｒｄｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １７：３１５７－６９）を示した。高用量において、動物は好中球減少症及び下痢（イリノテカン治療に由来するＳＮ－３８関連の周知の副作用）を発症したが、Ｔｒｏｐ－２発現正常組織における有意な組織病理学的変化のエビデンスは未だ欠如していた（Ｃａｒｄｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １７：３１５７－６９）。その他の前臨床試験所見において、サシツズマブゴビテカンは、低ナノモル濃度で効果があり、また非毒性用量で様々なヒト上皮性腫瘍異種移植片に有効であったため、１つまたは複数の転移性上皮性腫瘍用の標準療法に失敗した患者で第Ｉ相試験を実施した。

【0336】

この試験における主な発見は、超毒性（ピコモル範囲で活性な薬物、その一方、ＳＮ－３８は低ナノモル範囲で力価を有する）とみなされない従来の薬物をより多く使用しているにもかかわらず、サシツズマブゴビテカン抗Ｔｒｏｐ－２－ＳＮ－３８複合体が、中程度で管理可能な毒性を示す用量で広範囲の固形がんにおいて治療的に有効であり、その結果として、高い治療指数を示すことを臨床的に証明したことであった。合計２９７回のサシツズマブゴビテカンをインシデントを伴わずに２５名の患者に投与した（４名の患者は＞２５回の注射を受けた）。重要なことに、複数サイクルの治療を最大１２ヶ月間にわたって受けた患者においてでさえ、ｈＲＳ７ ＩｇＧまたはＳＮ－３８に対する抗体反応は検出されなかった。Ｔｒｏｐ－２は様々な正常組織において低量で発現しているが（Ｃａｒｄｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １７：３１５７－６９）、好中球減少症はせいぜい用量制限毒性であるため、≧１２ｍｇ／ｋｇのサシツズマブゴビテカンを投与された２名の患者に回復を促進するための骨髄増殖因子支持薬を使用し、別の療法の選択肢を使い果たした患者における治療継続を可能とした。ＭＴＤを１２ｍｇ／ｋｇと明言したが、更なる拡大には８．０ｍｇ／ｋｇ及び１０．０ｍｇ／ｋｇの投与濃度を選択した。なぜなら、患者が、これら濃度の追加サイクル（最小限の支持療法を伴う）に耐性を示す傾向があり、これら濃度で効果が認められたからである。１３名の患者のうち２名（１５．４％）だけが、これら投与濃度でグレード３好中球減少症を発症した。フロントラインセッティングまたはセカンドラインセッティングで週に１回または２週間おきに１回で行ったイリノテカン単剤治療におけるグレード３及びグレード４の好中球減少症の発症率は１４～２６％であった（カンプトサル－塩酸イリノテカン注射用液剤（処方情報、添付文書）Ｐｆｉｚｅｒ，２０１２）。サシツズマブゴビテカンに関しては、１０ｍｇ／ｋｇ投与濃度の１名の患者のみがグレード３下痢を発症した。この発症率は、イリノテカンを週に１回 ｘ ４回で投与された患者におけるグレード３及びグレード４の遅発性下痢の発症率３１％よりも低い（カンプトサル－塩酸イリノテカン注射用液剤（処方情報、添付文書）Ｐｆｉｚｅｒ，２０１２）。サシツズマブゴビテカンに起因するその他の一般的な毒性としては、疲労、悪心及び嘔吐（ほとんどはグレード１及びグレード２）に加え、脱毛症が挙げられる。発熱性好中球減少症の２件のインシデント、及びグレード３深部静脈血栓症の１件のインシデントもまた、１０ｍｇ／ｋｇ及び１２ｍｇ／ｋｇの投与濃度で発生した。投薬後の診査が完了するまでＵＧＴ１Ａ１モニタリングは開始されなかったため、毒性へのＵＧＴ１Ａ１の寄与の評価についてはこの時点では報告できなかった。

【0337】

多種多様ながん（例えば、前立腺癌、乳癌、膵臓癌、結腸直腸癌及び肺癌など）の組織マイクロアレイに関する免疫組織学的評価が、標本の＞９０％に抗原が存在していることを示していたことを主な理由として、この試験に登録した患者については、Ｔｒｏｐ－２発現による事前選択を実施しなかった（データは省略）。加えて、多種多様な転移性がんを有する１２名の患者の血清中にはＴｒｏｐ－２は見つかっておらず、血清アッセイが患者の選択に有用ではないことが更に示唆された。本発明者らは試験に登録した患者由来の腫瘍における保管標本の収集を試みているが、免疫組織学的染色法に基づいた患者選択が抗腫瘍活性と相関していることを示唆するこの時点におけるエビデンスは不十分であり、Ｔｒｏｐ－２発現に基づいた患者の絞り込みは実施されていない。

【0338】

単剤治療の場合、サシツズマブゴビテカンは、多種多様な転移性で再発／耐性を示す上皮性腫瘍を有する患者において、良好な抗腫瘍活性を示し、ＣＴによる標的病変の顕著な縮小（ＲＥＣＩＳＴ １．１基準を用い、持続的な病変の安定化を含む）が認められた。２５名の患者のうち３名（１２％）（ＳＣＬＣ［トポテカンで増悪後］、ＴＮＢＣ及び結腸癌がそれぞれ１名）は、治療開始からそれぞれ増悪する前の２．９ヶ月間、４．３ヶ月間及び７．１ヶ月間、標的病変に＞３０％の縮小が認められた。１５名の患者（６０％）はＳＤを示し、これら患者のうち９名は治療開始から４ヶ月後に増悪した。トポイソメラーゼＩ阻害剤を含有する薬物またはレジメンによる前治療を受けた９名の患者のうち７名に、効果または病変の安定化が認められた。これら患者のうち３名は、前トポイソメラーゼＩ阻害剤治療（イリノテカンまたはトポテカン）に反応しなかったが、３名のうち２名（結腸癌を有する患者の１３％、及びＳＣＬＣを有する患者の３８％）については、サシツズマブゴビテカンが腫瘍縮小を誘導可能とすることになっていた。それゆえ、サシツズマブゴビテカンが、前トポイソメラーゼＩ含有レジメンに失敗したまたは再発した患者において治療的に有効であり得、第ＩＩ相拡大試験で更に試験する必要があった。

【0339】

この試験に登録した患者の大多数は進行した膵管癌（Ｎ＝７、平均無増悪期間 ２．９ヶ月間、範囲、１．０～４．０ヶ月間）を有していたが、この治療困難な疾患においてでさえ、活性を示唆する、標的病変の有望な縮小、及びＣＡ１９－９の血清中濃度の有望な低下が認められている（Ｐｉｃｏｚｚｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４，ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ａｔ ｔｈｅ ＡＡＣＲ Ｓｐｅｃｉａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ 「Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｃａｎｃｅｒ」：Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ，ＬＡ ＵＳＡ，ｐ．Ｂ９９）。しかしながら、ＴＮＢＣ及びＳＣＬＣを有する患者における効果には特に利点があり、これらの適応症における標的化療法には一定の必要性がある。実際に、この試験の進行中の拡大相で認められたＴＮＢＣ（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４，ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ａｔ ｔｈｅ ＡＡＣＲ Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ Ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ，ＴＸ）及びＳＣＬＣ（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ）を有する患者における更なる部分寛解は、これらのがんに対する更なる重要視を示唆しているが、ＮＳＣＬＣ、ＥＡＣ、ＵＢＣ及びＣＲＣにおける有望な効果もまたこれに続く。実際に、今日まで１７名のＴＮＢＣ患者について試験している進行中のサシツズマブゴビテカン試験に関する最近の最新情報では、２９％の全体奏効率（ＰＲ）、４６％の臨床奏効率（ＰＲ＋ＳＤ ≧６ヶ月間）が認められている。試験患者のほぼ２５％（６／２５）に長期生存（１５～２０ヶ月間）が認められ、ＰＲの２名及びＳＤの４名を含み、ＴＮＢＣ（Ｎ＝２）、ＣＲＣ（Ｎ＝３）及びＨＲＰＣ（Ｎ＝１）を有する患者を含んでいた。

【0340】

注入終盤後３０分の血清試料の解析では、＞９６％のＳＮ－３８がＩｇＧに結合したことが示された。より詳細な薬物動態については、試験の第ＩＩ相部分完了後に利用可能となるであろう。またＨＰＬＣ分析では、わずか微量の遊離ＳＮ－３８Ｇを血清中に検出した一方、イリノテカン治療では、より活性の少ないＳＮ－３８ＧのＡＵＣは、ＳＮ－３８と比較して＞４．５倍増加していた（Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２０：３２９３－３０１）。サシツズマブゴビテカン及びイリノテカンを投与した腫瘍を有する動物におけるＳＮ－３８送達の比較は、ＩｇＧに結合したＳＮ－３８がグルクロン酸抱合されていない一方で、イリノテカンを投与された動物において、血清中総ＳＮ－３８の＞５０％がグルクロン酸抱合されていることを示している（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ３２：Ａｂｓｔｒａｃｔ ３１０７）。より重要なことに、ＳＮ－３８濃度の解析では、サシツズマブゴビテカンを投与したＣａｐａｎ－１ヒト膵臓癌異種移植片において、イリノテカンの場合と比較して約１３５倍高い濃度が認められた（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ）。それゆえ、サシツズマブゴビテカンは、トポイソメラーゼＩ阻害剤の非標的化形態と比較していくつかの異なる利点を有しており、それらは、（ｉ）複合体を選択的に腫瘍内に維持する機構（抗Ｔｒｏｐ－２結合）、及び（ｉｉ）複合体が直接内部移行する、または、腫瘍に結合した複合体が腫瘍微小環境内にＳＮ－３８を遊離してＳＮ－３８を最も効力のある形態にする、のいずれかによって任意のＳＮ－３８が腫瘍細胞に融合するように、標的化ＳＮ－３８はまた完全に保護されると思われること（すなわち、グルクロン酸抱合されず、ラクトン形態ともならない）である。これらの結果は、適度に有毒性であるがよく知られた細胞傷害薬であるＳＮ－３８が、サシツズマブゴビテカンなどの腫瘍標的化ＡＤＣの一部として有効となり得ることを示唆している。しかし、適度に有毒な薬物を高薬物：抗体比（７．６：１）でコンジュゲートさせたＡＤＣを投与することによって、イリノテカンから遊離する場合と比較してサシツズマブゴビテカンにより向上した濃度のＳＮ－３８が達成されると示唆されているように、高濃度のＳＮ－３８を標的とするがんへと送達することが可能となる。

【0341】

結論として、この第Ｉ相の知見は、Ｔｒｏｐ－２を含有することが知られている正常組織に対する損傷のエビデンスなく、全てＳＮ－３８の活性に関係する適度で管理可能な毒性で、サシツズマブゴビテカンに耐性を示したことを示している。重要なことに、サシツズマブゴビテカンは、トポイソメラーゼＩ阻害剤による前治療に失敗した後であっても、多種多様な転移性固形腫瘍を有する患者に対して有効であった。それゆえ、サシツズマブゴビテカンが、ＳＣＬＣ及びＴＮＢＣなどトポイソメラーゼＩ阻害剤に反応することが知られていない腫瘍を有する患者においてでさえ高い治療指数を有することが、この最初の知見から明らかとなっている。この臨床試験は、ＴＮＢＣ、ＳＣＬＣ及びその他Ｔｒｏｐ－２^＋がんを有する患者に対する８ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの開始用量に焦点を置いて継続中である。

【0342】

実施例１６．トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）におけるＩＭＭＵ－１３２の使用
Ｔｒｏｐ－２／ＴＡＣＳＴＤ２遺伝子をクローニングすると（Ｆｏｒｎａｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ６２：６１０－１８）、細胞遊走及び足場非依存性増殖に機能的に関与し、正常組織と比較して乳癌、肺癌、胃癌、結腸直腸癌、膵臓癌、前立腺癌、頸部癌、頭頸部癌及び卵巣癌を含む様々なヒト上皮癌で高発現する膜貫通Ｃａ^＋＋シグナル伝達因子（Ｂａｓｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ６２：４７２－７２；Ｒｉｐａｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ７６：６７１－７６）をコードすることが明らかとなった（Ｃａｒｄｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １７：３１５７－６９；Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｐｐｌ ８：９８－１０２；Ｃｕｂａｓ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １９６：３０９－１４；Ｔｒｅｒｏｔｏｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ３２：２２２－３３）。バイシストロニックサイクリンＤ１－Ｔｒｏｐ－２ ｍＲＮＡキメラががん遺伝子である一方で（Ｇｕｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６８：８１１３－２１）、Ｔｒｏｐ－２の高発現が、がん増殖を促進するために必要かつ十分であると報告されている（Ｔｒｅｒｏｔｏｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ３２：２２２－３３）。重要なことに、高発現は、乳癌（Ａｍｂｒｏｇｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ９：ｅ９６９９３；Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｅｘｐ Ｍｏｌ Ｐａｔｈｏｌ ９４：７３－８）を含むいくつかのがんタイプにおいてより活動的な病変及び予後不良と関連付けられている（Ｃｕｂａｓ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １９６：３０９－１４；Ｇｕｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６８：８１１３－２１；Ｂｉｇｎｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０， Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ４６：９４４－５３；Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｉｎｔ Ｊ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｄｉｓ ２４：８７５－８４；Ｍｕｈｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ ６２：１５２－５８）。Ｔｒｏｐ－２ ｍＲＮＡの上昇は、浸潤性乳管癌を有する患者における低生存率及びリンパ節転移の有力な予測因子であり、またカプランマイヤー生存曲線は、Ｔｒｏｐ－２発現が高い乳癌患者の生存率が著しく低いことを示した（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｅｘｐ Ｍｏｌ Ｐａｔｈｏｌ ９４：７３－８）。

【0343】

方法
ＨＩＣによるＤＡＲの算出－ブチル－ＮＰＲ ＨＰＬＣカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｋｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ）を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）により、ＩＭＭＵ－１３２の臨床ロットを分析した。１５分間直線グラジエント（２５ｍＭ リン酸ナトリウム中２．２５～１．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、流速１ｍＬ／分、室温）で、ＩＭＭＵ－１３２導入液（１００μｇ）を分離した。

【0344】

ＬＣ－ＭＳによるＤＡＲの算出－鎖間ジスルフィドを還元して得られたスルフヒドリル基を薬物のコンジュゲート用（またはブロック用）に利用するため、ＬＣ－ＭＳ分析中に還元剤を加えることなく重鎖及び軽鎖を分離してから、個別に分析した。ＩＭＭＵ－１３２の別々のロットを、Ａｅｒｉｓ Ｗｉｄｅｐｏｒｅ Ｃ４逆相ＨＰＬＣカラム（３．６μＭ、５０ ｘ ２．１ｍｍ）を使用してＡｇｉｌｅｎｔ １２００ ｓｅｒｉｅｓ ＨＰＬＣに導入し、１４分間直線グラジエント（０．１％ギ酸中３０～８０％アセトニトリル）の逆相ＨＰＬＣで分離した。Ｖｃａｐ、フラグメンター及びスキマーをそれぞれ、５０００Ｖ、３００Ｖ及び８０Ｖに設定したインラインＡｇｉｌｅｎｔ ６２１０ ＥＳＩ－ＴＯＦ質量分析計を用いて、エレクトロスプレーイオン化飛行時間（ＥＳＩ－ＴＯＦ）型質量分析を実施した。全てのκ種または重鎖種を表す全ＲＰ－ＨＰＬＣピークを用いて、デコンボリューションマススペクトルを作成した。

【0345】

細胞株－この試験に使用した全てのヒトがん細胞株は、特に記載する場合を除き、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入した（全て、ＡＴＣＣによる短鎖縦列反復配列（ＳＴＲ）アッセイを用いて確認した）。

【0346】

様々なヒト乳癌細胞株上におけるＴｒｏｐ－２表面発現－細胞表面上におけるＴｒｏｐ－２の発現はフローサイトメトリーに基づいている。簡潔に説明すると、Ａｃｃｕｔａｓｅ Ｃｅｌｌ Ｄｅｔａｃｈｍｅｎｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ＢＤ）；Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ；Ｃａｔ．Ｎｏ．５６１５２７）を用いて細胞を採取してから、製造業者の取扱説明書に従いＱｕａｎｔｉＢＲＩＴＥ ＰＥビーズ（ＢＤ Ｃａｔ．Ｎｏ．３４０４９５）及びＰＥコンジュゲート抗Ｔｒｏｐ－２抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１２－６０２４）を使用して、Ｔｒｏｐ－２発現のアッセイを行った。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｐｒｏソフトウェアを搭載したＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ）上でデータを取得してから、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ；Ａｓｈｌａｎｄ ＯＲ）を使用して解析を行った。

【0347】

インビトロ細胞傷害性試験－３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－５－（３－カルボキシメトキシフェニル）－２－（４－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム色素還元アッセイ（ＭＴＳ色素還元アッセイ；Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、ＳＮ－３８への感受性を測定した。簡潔に説明すると、上記のとおり、９６ウェル透明平底プレートに細胞を播種した。ＤＭＳＯ中に溶解させたＳＮ－３８を、０．００４～２５０ｎＭの終濃度となるように培養液で希釈した。プレートを加湿チャンバ内、３７℃／５％ ＣＯ_２下、９６時間インキュベートしてから、ＭＴＳ色素を加え、インキュベータ内に戻し、未処理対照細胞の吸光度が１．０超となるまで定置した。増殖抑制を、未処理細胞と比較した増殖パーセントとして測定した。３回の測定の平均から用量反応曲線を作成し、Ｐｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用してＩＣ_５０値を算出した。

【0348】

γＨ２ＡＸ染色細胞を用いたフローサイトメトリーによるインビトロ特異性試験－薬物活性試験のために、ＨＣＣ１８０６及びＨＣＣ１３９５のＴＮＢＣ細胞株細胞を、５ ｘ １０^５個の細胞／ウェルで６ウェルプレートに播種してから、３７℃で一晩保持した。細胞を氷上で１０分間冷却した後、細胞を、約２０μｇ／ｍｌのＩＭＭＵ－１３２またはｈＡ２０ 抗ＣＤ２０－ＳＮ３８のいずれかと共に（両方の薬剤において等しいＳＮ３８／ウェル）、氷上で３０分間インキュベートしてから、新鮮な培地で３回洗浄し、その後、３７℃に戻して一晩静置した。細胞を短い間トリプシン処理してから、遠心分離でペレット状とし、４％ホルマリン中で１５分間固定した。その後、洗浄してから、ＰＢＳ中０．１５％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００で更に１５分間透過処理を行った。１％ウシ血清アルブミン－ＰＢＳで２回洗浄後、マウス抗γＨ２ＡＸ－ＡＦ４８８（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）と共に細胞を４℃で４５分間インキュベートした。ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して、フローサイトメトリーでγＨ２ＡＸのシグナル強度を測定した。

【0349】

腫瘍マイクロアレイ及び患者標本を用いたＴｒｏｐ－２のＩＨＣ－組織及びマイクロアレイ切片の標準的なＩＨＣ法を含む。スコアリングは、標本内の＞１０％の腫瘍細胞における染色の強度を基準とし、陰性、１＋（弱）、２＋（中）、及び３＋（強）を含んでいた。

【0350】

異種移植片モデルによるインビボ治療試験－２０グラムマウスに対する２５０μｇのＡＤＣ用量中のＳＮ－３８当量（１２．５ｍｇ／ｋｇ）は、０．２ｍｇ ＳＮ－３８／ｋｇに相当する。イリノテカン（イリノテカン－ＨＣｌ注射液；ＡＲＥＶＡ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｌｉｚａｂｅｔｈｔｏｗｎ，ＫＹ）では、１０ｍｇ イリノテカン／ｋｇは、重量に基づいて５．８ｍｇ ＳＮ－３８／ｋｇに変換される。

【0351】

免疫ブロット法－細胞（２ ｘ １０^６）を６ウェルプレートに播種してから、一晩静置した。翌日、ＳＮ－３８またはＩＭＭＵ－１３２（０．４μｇ／ｍＬ（１μＭ）のＳＮ－３８濃度当量）のいずれかを用いて、細胞を２４時間及び４８時間処理した。親ｈＲＳ７をＡＤＣの対照として用いた。

【0352】

ヒト腫瘍異種移植片を有するマウスにおけるＳＮ－３８の定量－２つの群（それぞれの群にはヒト膵臓癌細胞株の皮下移植片を有する動物が１５匹）に、イリノテカンまたはＩＭＭＵ－１３２のいずれかを投与した。５つの異なる間隔で、群あたり３匹の動物を安楽死させた。Ｃａｐａｎ－１腫瘍（０．１３１ ± ０．０５４ｇ；Ｎ＝３０）を取り出し、脱イオン水（ＤＩ）中でホモジナイズ（１部の組織＋１０部のＤＩ水）してから、血清を等しい量のＤＩ水で希釈した。血清と組織のホモジネートを抽出してから、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）による解析を行った。イリノテカン治療動物から生成物を検出するには抽出試料は十分であったが、ＩＭＭＵ－１３２を投与された動物由来の試料は２つの部分に分割された。そのうちの一方は、ＩｇＧに結合したＳＮ－３８の全てを遊離させるための酸加水分解工程に供された（そうしなければ、抽出試料中において検出されない）。

【0353】

統計－Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）のＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ５．００（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡ）を使用して、統計解析を実施した。実施した特定の試験は、それぞれの試験と関連付いている。

【0354】

結果
ＳＮ－３８の構造及び特性－ＩＭＭＵ－１３２は、結腸直腸癌、肺癌、頸部癌及び卵巣癌の治療的に有効な、トポイソメラーゼＩ阻害剤であるＳＮ－３８、抗がん剤カンプトテシンの水溶性代謝物であるイリノテカン（７－エチル－１０－［４－（１－ピペリジノ）－１－ピペリジノ］カルボニルオキシカンプトテシン）を利用している（Ｇａｒｃｉａ－Ｃａｒｂｏｎｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ８：６４１０６１）。ＳＮ－３８を選択する重要な利点は、薬物のインビボ薬物動態が周知であることである。イリノテカンをエステラーゼで開裂させてＳＮ－３８を生成する必要があり、ＳＮ－３８は、イリノテカンと比較して２～３桁より強力であり、低ナノモル範囲で活性を有する（Ｋａｗａｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５１：４１８７－９１）。生理学的ｐＨにおいて、カンプトテシンは、より効果のあるラクトン形態、及びより効果の少ない（１０％力価）開環カルボン酸形態を含む平衡状態で存在する（Ｂｕｒｋｅ ＆ Ｍｉ，１９９４，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ３７：４０－４６）。

【0355】

ＩＭＭＵ－１３２、ＣＬ２Ａ－ＳＮ－３８に使用するＳＮ－３８誘導体の設計に関しては、この薬物をＡＤＣ方式で使用する上で複数の課題に取り組んでおり、以下の特徴、（ｉ）短いポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分をクロスリンカー内に配置してこの極めて不溶性の薬物に水溶解性を付与すること、（ｉｉ）カーボネート結合部を結合させる環境において、高収率のマレイミド導入を可能とする特別に設計した合成方法を用いて、迅速なチオール－マレイミド結合でマレイミド基を穏やかに還元した抗体に導入すること、（ｉｉｉ）ベンジルカーボネート部位がｐＨ介在性開裂部位をもたらしてリンカーから薬物を遊離させること、及び（ｉｖ）重要なことに、クロスリンカーをＳＮ－３８の２０－ヒドロキシ位に結合させること（それにより薬物のラクトン環が、生理学的条件下で開環してより活性の少ないカルボン酸形態となることを防ぐ）を含んでいる（Ｇｉｏｖａｎｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９２２：２７－３５）。ＳＮ－３８誘導体の合成、及びＣＬ２Ａ－ＳＮ－３８を穏やかに還元したｈＲＳ７ ＩｇＧにコンジュゲートすることについては、上に記載している。限定的な還元方法では、ドメイン内ジスルフィド架橋ではなく、重鎖－重鎖間及び重鎖－軽鎖間の鎖間ジスルフィド架橋のみを切断し、抗体分子あたり８つの部位特異的チオールを生成する。それからＣＬ２Ａ－ＳＮ－３８にコンジュゲートし、ダイアフィルトレーションで精製し、保存用に凍結乾燥した。製造中の条件は、ＩＭＭＵ－１３２からのＳＮ－３８のあらゆるロスを最小とするように調節され、最終の凍結乾燥製品は、戻す際に常に＜１％の遊離ＳＮ－３８となるように製造される。しかしながら、血清中に入り３７℃に保たれると、ＳＮ－３８は複合体から放出され、その半減期は約１日となる（データは省略）。

【0356】

ＳＮ－３８の遊離はＩＭＭＵ－１３２の重要な特性であると思われ、このタイプのリンカーは、ＳＮ－３８放出速度が異なる様々なリンカーにコンジュゲートしたＳＮ－３８について試験する有効性試験に基づいて選択されるが、約１０時間の放出半減期は極めて安定とみなされる（Ｍｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００８）（３０，３１）。血清中における約２日間の中間放出速度を有する複合体に最適治療効果が認められた。本発明者らは、その後、フェニルアラニン残基を除去してから（Ｃａｒｄｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １７：３１５７－６４）、再度その効果を、リソソーム条件下（すなわち、カテプシンＢの存在下及びｐＨ５．０）でのみＳＮ－３８を放出するように設計された別の安定結合抗Ｔｒｏｐ－２複合体（ＣＬ２）の効果と比較することで、ＣＬ２Ａと呼ばれるこのタイプのリンカーの製造プロセスを改善した。動物モデルにおいて、ＣＬ２Ａリンカーを含むように調製した抗Ｔｒｏｐ－２複合体は、ＳＮ－３８を安定結合した場合と比較してより優れた治療効果を生んだ。そのことは、ＳＮ－３８が約１日間の半減期で血清中に放出された際、速やかに内部移行した抗体に更に利点があることを示している（Ｇｏｖｉｄａｎ ｅｔ ａｌ．２０１３，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １２：９６８－７８）。放射能標識抗体を用いた臨床試験により、抗体が数時間以内に腫瘍内へと局在化して１日以内にピーク濃度に達することが判明したため（Ｓｈａｒｋｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５：５９３５ｓ－４５ｓ）、選択的に高めた濃度のＳＮ－３８は、インタクト複合体の内部移行を介して、遊離薬物の細胞外放出を介して、またはそれら両方の機構の連携を介して、腫瘍内へと局所的に送達される。

【0357】

薬物－抗体比（ＤＡＲ）の算出。疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）を使用して５点のＩＭＭＵ－１３２臨床ロットを評価したところ、６、７及び８のＤＡＲを有する化学種を表す３つのピークに分かれ、最も多い画分はＤＡＲ＝８を含んでいた（データは省略）。常にこの製造工程を用いてＩＭＭＵ－１３２を製造したところ、５点の臨床ロットにわたる全体ＤＡＲ（ＤＡＲ_平均）は７．６０ ± ０．０３となった（データは省略）。液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）を用いて、ＨＩＣ－ＨＰＬＣ結果を確認した（データは省略）。分析により、８個の利用可能なスルフヒドリル基の＞９９％がＣＬ２Ａリンカーに結合している（ＳＮ－３８を含有または非含有のいずれかで）ことが示された。非置換（またはＮ－エチルマレイミド末端保護）の重鎖または軽鎖は検出されなかった。したがって、化学種にわたるＤＡＲの差異は、製造中におけるリンカーからのＳＮ－３８遊離によるものであり、最初の低置換比によるものではなかった。一旦調製して凍結乾燥すると、ＩＭＭＵ－１３２は数年間安定していた。

【0358】

マウスにおける薬物動態及び抗腫瘍効果に対するＤＡＲの影響。Ｔｒｏｐ－２^＋ヒト胃癌異種移植片（ＮＣＩ－Ｎ８７）を有するマウスに、それぞれが等しいタンパク質（０．５ｍｇ）用量のＩＭＭＵ－１３２を有し、ＤＡＲが６．８９、３．２８または１．６４である２回の治療を、７日の間隔をあけて実施した（データは省略）。６．８９のＤＡＲを有するＡＤＣで治療した動物は、３．３８または１．６４のＤＡＲのいずれかを有するＡＤＣを投与されたマウスと比較して、有意に改善した平均生存期間（ＭＳＴ）を示した（ＭＳＴ＝３９日間対、それぞれ２５日間及び２１日間；Ｐ＜０．００１４）。ＤＡＲが３．２８または１．６４の複合体で治療した群と生理食塩水対照で治療した群における群間差異は認められなかった。

【0359】

高ＤＡＲの重要性を更に明らかにするために、ＮＣＩ－Ｎ８７胃腫瘍を有するマウスに、ＤＡＲが６．８９である０．５ｍｇのＩＭＭＵ－１３２を２週間にわたり週に２回投与した（データは省略）。別の群には、ＤＡＲが３．２８であるタンパク質（１ｍｇ）用量のＩＭＭＵ－１３２複合体を２回投与した。両群はそれぞれの投薬スキームで同一総量のＳＮ－３８（３６μｇ）を投与されたが、６．８９ ＤＡＲの複合体で治療を受けた群は、３．２８ ＤＡＲの複合体で治療を受けた腫瘍を有する動物と比較して、腫瘍増殖を有意に阻害した（Ｐ＝０．０２２７；ＡＵＣ）。加えて、低ＤＡＲで治療した群は、未治療対照と比較して有意差がなかった。まとめると、これらの試験は、低ＤＡＲが効果を低下させることを示している。

【0360】

これら異なる比率で調製した複合体の薬物動態学的挙動試験を、０．２ｍｇのそれぞれの複合体、非コンジュゲートｈＲＳ７ ＩｇＧまたはｈＲＳ７ ＩｇＧ（還元後、Ｎ－エチルマレイミドで末端保護）を投与した腫瘍を有さないマウスで実施した。０．５～１６８時間の間隔で５回血清を採取して、ｈＲＳ７ ＩｇＧをＥＬＩＳＡでアッセイした。非コンジュゲートＩｇＧと比較して、これら複合体のクリアランスに有意差は認められなかった（データは省略）。それゆえ、置換レベルは複合体の薬物動態に影響を与えなかった。また同じく重要なことに、鎖間ジスルフィド結合の減少は抗体を不安定化させないと考えられた。

【0361】

ＴＮＢＣにおけるＴｒｏｐ－２発現及びＳＮ－３８への感受性。免疫組織化学試験（ＩＨＣ）により、ヒト腫瘍標本のいくつかの組織マイクロアレイにおけるＴｒｏｐ－２発現を測定した。３１点のＴＮＢＣ標本に加え、１５点のホルモン受容体陽性またはＨＥＲ－２陽性乳癌標本を含有する１つのマイクロアレイでは、９５％超の腫瘍に陽性染色が認められ、症例の６５％に３＋染色が認められた。

【0362】

表８に、４種類のＴＮＢＣを含む６種類のヒト乳癌細胞株を列挙し、それらのＴｒｏｐ－２表面発現及びＳＮ－３８への感受性を記載している。６種類の細胞株のうち５種類におけるＴｒｏｐ－２表面発現は、細胞あたり９０，０００複製を超えた。ＳＮ－３８の力価は、６種類の細胞株のうち５種類において２～６ｎＭの範囲であり、ＭＣＦ－７は最も低い感受性、３３ｎＭを有していた。ＩＭＭＵ－１３２のインビトロ力価については記載していない。その理由としては、ＩＭＭＵ－１３２に結合したＳＮ－３８のほぼ全てが、４日間のインキュベート期間中に培養液中へと遊離し、その結果、ＩＭＭＵ－１３２の力価がＳＮ－３８の力価と同様となったからである。そのため、ＳＮ－３８を送達する機構としての抗体標的化の重要性を示すためには、異なる戦略が求められた。

【表8】

【0363】

抗原陽性（ＨＣＣ１８０６）または抗原陰性（ＨＣＣ１３９５）のＴＮＢＣ細胞株を、ＩＭＭＵ－１３２または非結合抗ＣＤ２０ ＳＮ－３８複合体のいずれかと共に、４℃で３０分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄して非結合複合体を除去してから、３７℃で一晩インキュベートした。細胞を固定して透過処理を行ってから、蛍光性の抗リン酸ヒストンＨ２Ａ．Ｘ抗体で染色し、フローサイトメトリーでｄｓＤＮＡの切断を検出した（Ｂｏｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ８：９５７－６７）（表９）。ＩＭＭＵ－１３２と共にインキュベートした際、Ｔｒｏｐ－２^＋乳癌細胞株であるＨＣＣ１８０６の平均蛍光強度（ＭＦＩ）が１６８（未処理ベースライン）から５４６に上昇して、ｄｓＤＮＡ切断率の上昇を示した一方で、非結合複合体と共にインキュベートした細胞のＭＦＩはベースラインレベルを維持していた。対照的に、Ｔｒｏｐ－２抗原陰性細胞株であるＨＣＣ１３９５のＭＦＩは、ＩＭＭＵ－１３２または非結合対照複合体のいずれかと共に処理した後、ベースラインレベルを維持していた。その結果、抗Ｔｒｏｐ－２結合複合体と共にインキュベートしたＴｒｏｐ－２発現細胞でのみｄｓＤＮＡ切断のエビデンスが認められたことにより、最終的に、関連性のないＡＤＣと比較したＩＭＭＵ－１３２の特異性が明らかとなった。

【表9】

【0364】

ＴＮＢＣ異種移植片におけるサシツズマブゴビテカンのインビボ効果。ＭＤＡ－ＭＢ－４６８ ＴＮＢＣ腫瘍を有するヌードマウスを用いて、ＩＭＭＵ－１３２の効果を評価した（データは省略）。０．１２または０．２０ｍｇ／ｋｇ ＳＮ－３８当量の用量のＩＭＭＵ－１３２（０．１５及び０．２５ｍｇ ＩＭＭＵ－１３２／用量）は、同一の２つの投与濃度で投与された生理食塩水、イリノテカン（１０ｍｇ／ｋｇ；約５．８ｍｇ／ｋｇ ＳＮ－３８重量当量）、または対照の抗ＣＤ２０ ＡＤＣ、ｈＡ２０－ＣＬ２Ａ－ＳＮ－３８と比較して、有意な腫瘍退縮を誘導した（Ｐ＜０．００１７、曲線下面積、ＡＵＣ）。マウスが、ヒトと比較して、より効率的にイリノテカンをＳＮ－３８に変換するため（３８）（本発明者らの試験では約２５％、以下を参照のこと）、このイリノテカン用量で、約１４５～１７４μｇのＳＮ－３８が生成される一方で、投与用量のＩＭＭＵ－１３２に含まれる量はわずか９．６μｇである。それでもなお、ＩＭＭＵ－１３２がＳＮ－３８を選択的に腫瘍へと向けるため、より効果的であった。これらの結果は、ＩＭＭＵ－１３２が少量のＳＮ－３８を特異的に腫瘍へと向けることが、はるかに多い用量のイリノテカン、またはより詳しく言えば、ｈＲＳ７ ＩｇＧと当量の遊離ＳＮ－３８の混合物と比較して、はるかにより効果的であることを示す、その他の固形腫瘍モデルにおける所見（Ｃａｒｄｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １７：３１５７－６９）を裏付けるものである（Ｃａｒｄｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １７：３１５７－６９）。非コンジュゲートＲＳ７抗体では、動物あたり反復用量の１ｍｇでさえ、何ら抗腫瘍効果を示さなかった（Ｃａｒｄｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １７：３１５７－６９）。しかしながら、Ｔｒｏｐ－２を発現する婦人科がんに関するインビトロ試験は、ＲＳ７ ｍＡｂの抗体依存性細胞傷害による細胞死滅を示している（Ｂｉｇｎｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ４６：９４４－５３；Ｒａｊｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｊ Ｅｘｐ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ３０：１０６；Ｖａｒｕｇｈｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ １２２：１７１－７；Ｖａｒｕｇｈｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｏｌ ２０５：５６７）。同様に、別の抗Ｔｒｏｐ－２抗体の一価Ｆａｂは、インビトロ試験及び動物試験において治療的に有効であると報告されている。

【0365】

治療５６日目時点で、０．１２ｍｇ／ｋｇのｈＡ２０－ＣＬ２Ａ－ＳＮ－３８対照ＡＤＣを投与したマウスにおける７つの腫瘍のうち４つが、既にエンドポイントの１．０ｃｍ^３まで増悪していた（データは省略）。この時点で、これらの非常に大きな腫瘍の増悪に影響を及ぼすために高用量の０．２ｍｇ／ｋｇの使用を選択して、これらの動物をＩＭＭＵ－１３２で治療した。数匹の動物におけるかなりのサイズの腫瘍にもかかわらず、全てのマウスに治療効果が認められ、５週間後の腫瘍サイズは有意に縮小していた（それぞれ、総容積［ＴＶ］＝０．１４ ± ０．１４ｃｍ^３対０．７４ ± ０．４１ｃｍ^３；Ｐ＝０．００３１、両側ｔ検定）。同様に、本発明者らは、イリノテカン治療群から、約０．７ｃｍ^３まで増悪した腫瘍を有する２匹の動物を選択して、一方をイリノテカンで、またもう一方をＩＭＭＵ－１３２で再治療した（データは省略）。治療終了までの２週間以内に、イリノテカン治療動物の腫瘍は２３％縮小してから増悪し始めた一方で、ＩＭＭＵ－１３２で治療した腫瘍は、腫瘍サイズが６０％縮小した状態で安定化した。これらの結果は、非特異的ＡＤＣを介したＳＮ－３８に曝された後に増殖し続けた腫瘍であったとしても、Ｔｒｏｐ－２特異的ＩＭＭＵ－１３２で治療したとき、有意に高い治療効果が達成され得ることを示している。しかしながら、ＩＭＭＵ－１３２による特異的な治療効果はＭＤＡ－ＭＢ－２３１においては達成されなかった（データは省略）。この細胞株は、最も低いＴｒｏｐ－２レベルを有しており、更にＳＮ－３８の影響を最も受けにくかった。

【0366】

ＴＮＢＣにおけるＩＭＭＵ－１３２の作用機序－ＡＤＣがその内部に組み込んだＳＮ－３８に基づいて機能していることを確認するために、ＩＭＭＵ－１３２が利用するアポトーシス経路について、ＴＮＢＣ細胞株であるＭＤＡ－ＭＢ－４６８、及びＨＥＲ２^＋ＳＫ－ＢＲ－３細胞株で試験した（データは省略）。ＳＮ－３８単独及びＩＭＭＵ－１３２は、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８において、ｐ２１^{ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１}の＞２倍の上方制御を２４時間以内に媒介し、また４８時間時点付近において、これら細胞内におけるｐ２１^{ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１}の量は減少し始めた（ＳＮ－３８またはＩＭＭＵ－１３２において、それぞれ３１％及び４３％）。興味深いことに、ＨＥＲ２^＋ＳＫ－ＢＲ－３腫瘍株において、ＳＮ－３８もＩＭＭＵ－１３２も、最初の２４時間に、構成レベルを超えるｐ２１^{ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１}の上方制御を媒介しなかったが、ＳＮ－３８またはＩＭＭＵ－１３２に４８時間曝露した後のＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞においては、ｐ２１^{ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１}の量に＞５７％の減少が認められた。ＳＮ－３８とＩＭＭＵ－１３２の両方は、２４時間以内にプロカスパーゼ３を切断してその活性フラグメントをもたらしたが、より多くの活性フラグメントが観察されたのは４８時間の曝露後であった。留意されたいが、ＩＭＭＵ－１３２は両方の細胞株において、ＳＮ－３８に曝露した細胞と比較して、４８時間後に観察された最高レベルで、より多くのプロカスパーゼ３切断を媒介した。最終的に、ＳＮ－３８とＩＭＭＵ－１３２の両方はポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）切断を媒介した（２４時間時点に始まり４８時間後にほぼ切断を完了）。まとめると、これらの結果は、インビトロで投与した場合、ＩＭＭＵ－１３２が、遊離ＳＮ－３８の作用機序とほぼ同等の作用機序を有することを裏付けるものである。

【0367】

ヒト腫瘍異種移植片モデルにおけるＩＭＭＵ－１３２対イリノテカンによるＳＮ－３８の送達－イリノテカン（７７３μｇ；ＳＮ－３８当量＝４４８μｇ）及びＩＭＭＵ－１３２（１．０ｍｇ；ＳＮ－３８当量＝１６μｇ）を投与した、ヒト膵臓癌異種移植片（Ｃａｐａｎ－１）ｓ．ｃ．移植マウスの血清及び腫瘍内における、イリノテカンまたはＩＭＭＵ－１３２から誘導された構成生成物を測定した。

【0368】

イリノテカンは血清中から極めて速やかに消失し、ＳＮ－３８及びＳＮ－３８Ｇへの変換は５分以内に観察された。２４時間時点においては、どの生成物も検出されなかった。６時間超のＡＵＣは、イリノテカン、ＳＮ－３８及びＳＮ－３８Ｇでそれぞれ、２１．０、２．５及び２．８μｇ／ｍＬ・ｈであった（マウスにおけるＳＮ－３８変換 ＝ ［（２．５＋２．８）／２１ ＝ ２５．２％］）。ＩＭＭＵ－１３２を投与した動物の血清中遊離ＳＮ－３８濃度は非常に低かったが、４８時間にわたって検出された（データは省略）。遊離ＳＮ－３８Ｇは１時間時点及び６時間時点でのみ検出され、遊離ＳＮ－３８と比較して３～７倍低かった。

【0369】

イリノテカン治療動物から切除したＣａｐａｎ－１腫瘍内におけるイリノテカン濃度は６時間にわたり高かったが、２４時間時点では検出不能であった（ＡＵＣ_{５分間～６時間} ＝ ４８．４μｇ／ｇ・ｈ）。ＳＮ－３８は非常に低くわずか２時間にわたり検出され（すなわち、ＡＵＣ_{５分間～２時間} ＝ ０．４μｇ／ｇ・ｈ）、ＳＮ－３８Ｇの値はほぼ３倍の高さであった（ＡＵＣ ＝ １．１μｇ／ｇ・ｈ）（データは省略）。ＩＭＭＵ－１３２投与動物から採取した腫瘍は検出可能な遊離ＳＮ－３８またはＳＮ－３８Ｇを何ら有していなかったが、その代わりに、腫瘍内の全てのＳＮ－３８はＩＭＭＵ－１３２に結合していた。重要なことに、腫瘍内にＳＮ－３８Ｇが検出されなかったことは、ＩＭＭＵ－１３２に結合したＳＮ－３８がグルクロン酸抱合されていないことを示唆している。イリノテカンを投与したマウスが、ＩＭＭＵ－１３２を投与した場合と比較して２８倍超のＳＮ－３８当量を受けている（すなわち、それぞれ４４８μｇ対１６μｇのＳＮ－３８当量）にもかかわらず、これら腫瘍内におけるＩＭＭＵ－１３２に結合したＳＮ－３８のＡＵＣは５４．３μｇ／ｇ・ｈであった。この量は、ＳＮ－３８が検出可能となる期間の２時間にわたりイリノテカンで治療した動物の腫瘍内におけるＳＮ－３８の量と比較して１３５倍高い。

【0370】

考察
本発明者らは、Ｔｒｏｐ－２を標的とする新規のＡＤＣ、及び、当該ＡＤＣがＴＮＢＣに加えその他Ｔｒｏｐ－２^＋がんを有する患者に耐性を示し有効であることを示唆する初期の臨床結果について説明する（Ｂａｒｄｉａ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，Ｐ５－１９－２７）。ＩＭＭＵ－１３２はその独特な性質により、第２世代ＡＤＣの代表例となっている。通常、ＡＤＣには、最適な効果を持たせるための４つの広範な特性、（ｉ）選択的な標的化／活性化、（ｉｉ）ＡＤＣに用いる抗体の結合性、親和性、内部移行性及び免疫原性、（ｉｉｉ）薬物、その力価、代謝及び薬理学的性質、及び（ｉｖ）薬物の抗体への結合方式、が求められる。標的選択性は、治療指数（腫瘍対正常細胞の毒性比率）を定義する上で重要な役割を果たすことから、全てのＡＤＣにおける最も一般的な必要条件である。Ｔｒｏｐ－２は、多数の上皮癌において非常に広く存在しているが、いくつかの正常組織においても発現しているため（Ｃｕｂａｓ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １７９６：３０９－１４；Ｔｒｅｒｏｔｏｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ３２：２２２－３３；Ｓｔｅｐａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１，５９：７０１－１０）、特異性に影響を及ぼし得ると考えられている。しかしながら、正常組織における発現はがんにおける発現よりも低いと考えられており（Ｂｉｇｎｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ４６：９４４－５３）、抗体への接近を制限する正常組織構造によりＴｒｏｐ－２が遮蔽される一方で、がんにおいては、浸潤腫瘍がこれらの組織障壁を損傷していると考えられている。上記の証拠はサルにおける初期の毒性学的試験から明白であった。その試験においては、イリノテカン様の好中球減少症及び下痢をまねく濃度にまでＩＭＭＵ－１３２の用量を上げたにもかかわらず、Ｔｒｏｐ－２発現正常組織に対する組織病理学的損傷は生じなかった（Ｃａｒｄｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １７：３１５７－６９）。これらの結果は臨床的に確認されていると思われ、患者における特異的な器官毒性は、親化合物のイリノテカンによる周知の毒性（ＩＭＭＵ－１３２を用いれば、より管理可能）を除いて、これまでのところ認められていない（Ｂａｒｄｉａ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，Ｐ５－１９－２７）。

【0371】

ＡＤＣ治療薬において一般に認められている重要な基準は、抗体を内部移行させてその化学療法剤を細胞内部に送達することである（化学療法剤は通常、リソソーム内で代謝される）。ＩＭＭＵ－１３２の内部移行にもかかわらず、本発明者らは、がん細胞に対するバイスタンダー効果を誘導し得ると考えられるＳＮ－３８の局所放出を可能とするこのＡＤＣのリンカーが、このプラットフォームを超毒性薬物の使用と区別する、別の特徴であると信じている。事実、超毒性薬物をＩｇＧに安定結合させることは、それらのタイプの化合物に有用な治療窓を維持させ得る唯一の形態である。しかしながら、より適度に有毒な薬物を使用することは、一旦循環すると薬物を早く放出し過ぎることになるリンカーの使用に幅を与えない。本発明者らのグループは、約１０時間から極めて安定したリンカーの範囲の異なる半減期で、複合体からＳＮ－３８を血清中に放出するリンカーを探索したが、それは、ヒト腫瘍異種移植片マウスモデルにおいて最良の治療効果をもたらした、中間的な安定性を有するリンカーであった（Ｍｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ５１：６９１６－２６；Ｇｏｖｉｎｄａｎ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ １５：６０５２－６１）。そのため、この初期の研究において、本発明者らは、ＳＮ－３８の極めて安定な連結部の効果が、血清中でより中間的な安定性を有するＣＬ２Ａリンカーと比較して極端に弱いことを示した（Ｇｏｖｉｎｄａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １２：９６８－７８）。

【0372】

ＡＤＣ設計に関して現在通用している別の主義は、抗体の腫瘍への低付着度合い（通常、グラムあたりの注入量の０．００３～０．０８％）を相殺するために超細胞傷害性薬物を使用することである（Ｓｈａｒｋｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５：５９３５ｓ－４５ｓ）。現行世代の超毒性薬物複合体においては、高比率であることが複合体の薬物動態に悪影響を与え、二次的な毒性が治療指数を低下させるため、≦４：１の薬物：抗体置換が最適であることが判明している（Ｈａｍｂｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １０：７０６３－７０）。この第２世代ＡＤＣプラットフォームにおいて、本発明者らは、ＩｇＧを緩やかに還元することによって薬物を部位特異的に鎖間ジスルフィドに結合させるＩｇＧ結合法（８つの結合部位を曝露する）を使用することを選択した。本発明者らは、ＣＬ２Ａ－ＳＮ－３８リンカーを使用することで７．６：１のＤＡＲを達成した。ＬＣ－ＭＳデータは、８つの結合部位のそれぞれがＣＬ２Ａリンカーを有していることを示していたが、製造工程中に一部のＳＮ－３８が明らかに失われていた。それでもなお、９５％のＣＬ２Ａリンカーは７～８個のＳＮ－３８分子を有している。本発明者らは引き続き、（ａ）これらの部位への結合が抗体を不安定化させないこと、及び（ｂ）これらの部位を高レベルで置換することで調製した複合体が抗体結合を損なわず薬物動態特性に影響を及ぼさないこと、を見出した。実際に、本発明者らは、最高置換レベルで調製した複合体が、ヒト腫瘍異種移植片マウスモデルにおいて最良の治療効果を示したことを実証した。

【0373】

忍容性の観点からより注目に値するＩＭＭＵ－１３２の特徴の１つは、ＩｇＧに結合したＳＮ－３８がグルクロン酸抱合（イリノテカンの無毒化において重要な工程）されていないことである。イリノテカン治療において、生成されたＳＮ－３８のほとんどは、肝臓内で速やかに不活性なＳＮ－３８Ｇ形態に変換される。ＳＮ－３８Ｇの概算ＡＵＣは、多くの場合、ＳＮ－３８と比較して４．５～３２倍の増加を示している（Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５４：３７２３－２５；Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２０：３２９３－３０１）。ＳＮ－３８Ｇが胆汁へと分泌され、その後、ＳＮ－３８の腸肝再循環に強く関与する腸内細菌叢が産生するβ－グルクロニダーゼにより分解されて、イリノテカンによる遅発性の重篤な下痢が認められた（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｔｈｅｒ Ａｄｖ Ｍｅｄ Ｏｎｃｏｌ ２：５１－６３）。ＩＭＭＵ－１３２の投与後におけるＳＮ－３８Ｇの濃度は、本発明者らの動物試験及び臨床試験において極めて低く（例えば、ＩＭＭＵ－１３２を投与された患者の血清中においては、遊離ＳＮ－３８濃度のわずか２０～４０％がＳＮ－３８Ｇの形態）、ＳＮ－３８の１０－ヒドロキシ位が利用可能であるにもかかわらず、ＩｇＧに結合したＳＮ－３８の大部分がグルクロン酸抱合から保護されているという強力なエビデンスを提供している。本発明者らは、ＩＭＭＵ－１３２によって生成された低濃度のＳＮ－３８Ｇが、イリノテカン治療薬と比較して、このＡＤＣを投与された患者における下痢の発症率及び強さの低下に寄与していることを推測している。

【0374】

抗体に結合したＳＮ－３８のグルクロン酸抱合を防止することはまた、腫瘍に送達されたＳＮ－３８による治療効果の向上に寄与し得る。イリノテカンを投与された動物由来の抽出物には、高濃度のイリノテカン、１０倍低い濃度のＳＮ－３８及びＳＮ－３８Ｇが認められた。対照的に、ＩＭＭＵ－１３２（ＩｇＧに結合したＳＮ－３８）を投与された動物の腫瘍には、ＳＮ－３８のみが認められた。本発明者らは、腫瘍内に維持された複合体が最終的に内部移行することによってそのＳＮ－３８ペイロードを放出するか、または腫瘍細胞の外側にＳＮ－３８が放出され得る、という仮説を立てた。しかしながら、ＳＮ－３８Ｇへと変換される（主に肝臓内で生じる）可能性は低く、その完全な活性化形態で放出され得る。リンカーをＳＮ－３８の２０－ヒドロキシ位に結合することにより、ＳＮ－３８を効果のあるラクトン形態に維持することを強調することもまた重要である（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ ６５：４６０１－６）。まとめると、これらの結果は、ＩＭＭＵ－１３２が、非標的化イリノテカンに由来するＳＮ－３８と比較して、選択的な様式でＳＮ－３８をＴｒｏｐ－２^＋腫瘍に送達及び集中可能であることを示唆しており、ＩＭＭＵ－１３２により送達されたＳＮ－３８は、腫瘍内に完全に活性化した、非グルクロン酸抱合のラクトン形態で放出されると考えられる。

【0375】

イリノテカンは、通常は乳癌患者を治療するためには使用されない。しかしながら、ＴＮＢＣ細胞株を用いて本明細書で示した試験は、より多量のＳＮ－３８を腫瘍内に集中させると、ＳＮ－３８の効果が高まることを示している。ＭＤＡ－ＭＢ－４６８ ＴＮＢＣとＨＥＲ２^＋ＳＫ－ＢＲ－３の両方の腫瘍株において、ＩＭＭＵ－１３２は、プロカスパーゼのその活性フラグメントへの切断及びＰＡＲＰ切断を伴い、内因性アポトーシス経路の活性化を媒介した。関連性のないＳＮ－３８ ＡＤＣと比較して、ＩＭＭＵ－１３２で治療したがん細胞の二本鎖ＤＮＡ切断を実施することにより（Ｂａｒｄｉａ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，Ｐ５－１９－２７）、ＳＮ－３８の標的細胞への選択的な送達が確認された。最も重要なことに、これらの検査所見は、多数の前治療暦を有する転移性ＴＮＢＣ患者の治療により確認され、その治療では長続きする客観的な効果が認められた（Ｂａｒｄｉａ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，Ｐ５－１９－２７）。ＩＭＭＵ－１３２はまた、その他のがんを有する患者、及びトポイソメラーゼＩ阻害剤を含む前治療レジメンに失敗した患者に効果を有すると考えられる（Ｓｔａｒｏｄｕｂ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２１：３８７０－７８）。

【0376】

結論として、適度に安定したリンカーを用い極めて高い薬物－抗体比でコンジュゲートしたＳＮ－３８の使用は第２世代ＡＤＣプラットフォームの一部をなし、動物モデル及び更に臨床においても有効である。本発明者らの研究結果は、Ｔｒｏｐ－２が、Ｔｒｏｐ－２^＋固形腫瘍、特にＴＮＢＣにおける臨床的に意義のある新規標的であることを示している。

【0377】

実施例１７．ＩＭＭＵ－１３２の作用機序に関する試験
サシツズマブゴビテカン（ＩＭＭＵ－１３２、ｈＲＳ７－ＣＬ２Ａ－ＳＮ－３８としても周知）とは、ＳＮ－３８（イリノテカンの活性代謝物）を送達するための、Ｔｒｏｐ－２（ほとんどの上皮性腫瘍上で発現している表面糖タンパク質）を標的とする抗体薬物複合体（ＡＤＣ）のことである。超毒性薬物及び安定したリンカーを使用するほとんどのＡＤＣとは異なり、ＩＭＭＵ－１３２は、ＳＮ－３８とリンカーの間の適度に安定したカーボネート結合を有する適度な毒性薬物を使用する。フローサイトメトリー及び免疫組織化学試験により、胃、膵臓、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、結腸、前立腺及び肺を含む広範囲の腫瘍タイプでＴｒｏｐ－２が発現していることが明らかとなった。細胞結合試験では、ＩＭＭＵ－１３２と親ｈＲＳ７抗体の間に有意差は認められなかったが、Ｔｒｏｐ－２ ＣＭ５チップを使用した表面プラズモン共鳴解析では、ｈＲＳ７と比較して、ＩＭＭＵ－１３２に有意な結合優位性が認められた。複合体は新生児受容体への結合を維持したが、ｈＲＳ７と比較して、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害活性の６０％超を失った。

【0378】

腫瘍細胞を遊離ＳＮ－３８またはＩＭＭＵ－１３２のいずれかに曝すと、同一シグナル伝達経路におけるｐＪＮＫ１／２及びｐ２１ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１に上方制御が認められ、その後、カスパーゼ９、７及び３による切断が起こり、最終的には、ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ切断及び二本鎖ＤＮＡの切断がもたらされる。

【0379】

マウスにおけるインタクトＡＤＣの薬物動態試験では、１５．４時間の平均滞留時間（ＭＲＴ）となる一方で、担体ｈＲＳ７抗体は非コンジュゲート抗体とほぼ同等の速度で消失する（ＭＲＴ ＝ 約３００時間）ことが明らかとなった。ヒト胃癌異種移植片を有するマウスのＩＭＭＵ－１３２治療（１７．５ｍｇ／ｋｇ；週に２回 ｘ ４週間）では、非特異的対照で治療したマウスと比較して、有意な抗腫瘍効果が得られた。ヒト膵臓癌異種移植片またはヒト胃癌異種移植片を有するマウスに、１週おき、週に１回、または週に２回のいずれかで実施した臨床的に意義のあるＩＭＭＵ－１３２の投薬スキームは、両方のモデルにおいてほぼ同等の有意な抗腫瘍効果を示した。目下の第Ｉ／ＩＩ相臨床試験（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ，ＮＣＴ０１６３１５５２）は、Ｔｒｏｐ－２を発現するがん（胃癌患者及び膵臓癌患者を含む）におけるＩＭＭＵ－１３２の抗がん活性を裏付けている。

【0380】

緒言
米国において今年胃癌と診断された新たな症例は２２，２２０件に上ると推定されており、更に、１０，９９０件の死亡がこの疾患に起因した（Ｓｉｅｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１４，ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ ６４：９－２９）。５年生存率は上昇傾向ではあるが（現時点で２９％）、結腸癌、乳癌及び前立腺癌（それぞれ６５％、９０％及び１００％）を含むその他大多数と比較すると、依然としてかなり低いままである。事実、ヒトがん全体でみると、食道癌、肝臓癌、肺癌及び膵臓癌だけが胃癌の５年生存率を下回っている。膵臓癌は依然として米国における全がん死亡原因の第４位であり、その５年生存率はわずか６％である（Ｓｉｅｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１４，ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ ６４：９－２９）。胃癌及び膵臓癌のこのような厳しい統計値から、新しい治療手法が必要とされているのは明らかである。

【0381】

Ｔｒｏｐ－２は、ＴＡＣＳＴＤ遺伝子ファミリー、特にＴＡＣＳＴＤ２２に属する４５ｋＤａの糖タンパク質である。多くの異なる上皮癌におけるこの膜貫通型タンパク質の過剰発現は、全般的な予後不良と関連している。Ｔｒｏｐ－２は、足場非依存性細胞増殖及び腫瘍形成に不可欠である（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ７：２８０－８５；Ｔｒｅｒｏｔｏｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ３２：２２２－３３）。Ｔｒｏｐ－２は、プロテインキナーゼＣ１２～１４によりリン酸化されたインタクトな細胞質尾部を必要とするカルシウムシグナル伝達物質として機能する。Ｔｒｏｐ－２に結合する増殖前シグナル伝達物質（Ｐｒｏ－ｇｒｏｗｔｈ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）としては、ＮＦ－κＢ、サイクリンＤ１及びＥＲＫが挙げられる（Ｇｕｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ３２：１５９４－１６００；Ｃｕｂａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ ９：２５３）。

【0382】

膵臓癌では、試験した患者の５５％にＴｒｏｐ－２過剰発現が認められ、治療目的で外科手術を受けた患者の転移、腫瘍グレード、及び短い無増悪生存期間と正の相関があった（Ｆｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ９９：１２９０－９５）。同様に、胃癌では、５６％の患者が自身の腫瘍にＴｒｏｐ－２過剰発現を示し、この場合もまた、Ｔｒｏｐ－２陽性腫瘍細胞のリンパ節浸潤を有する患者における短い無病生存期間及び予後不良と相関していた（Ｍｕｈｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ ６３：１５２－５８）。これらの特徴、及びＴｒｏｐ－２が非常に多くの難治性がんに関係するという事実を考慮すると、Ｔｒｏｐ－２は、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を用いて治療介入するための魅力的な標的である。

【0383】

薬物を腫瘍へと向ける抗体を使用するための一般的なパラダイムとしては、（ａ）正常組織と比較して腫瘍で優先的に発現する抗原標的、（ｂ）良好な親和性を有し腫瘍細胞に内部移行する抗体、及び（ｃ）抗体と安定的に結合した超毒性薬物を含む、いくつかの重要な特徴が挙げられる（Ｐａｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４，ｍＡｂｓ ６：３４－４５）。これらの体系に沿って、本発明者らは、ＲＳ７－３Ｇ１１（ＲＳ７）と呼ばれる抗体を開発した。この抗体は、ナノモルの親和性（Ｃａｒｄｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１ｋ，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １７：３１５７－６９）で、多数の固形腫瘍のＴｒｏｐ－２（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ５５：９３８－４６；Ｂａｓｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ６２：４７２－７９）に結合し、一旦Ｔｒｏｐ－２に結合すると、細胞に内部移行する（Ｓｈｉｈ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５：５８５７ｓ－６３ｓ）。

【0384】

免疫組織化学試験では、新生物組織と比較して一般的にはるかに低い強度ではあるが、一部の正常組織においてＴｒｏｐ－２の発現がみられ、またＴｒｏｐ－２は多くの場合、血管の進入が制限された組織領域に存在している（Ｔｒｅｒｏｔｏｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ３２：２２２－３３）。これらの特徴を基準として、ＲＳ７をヒト化してから、イリノテカンの活性代謝物である７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン（ＳＮ－３８）にコンジュゲートした。多数の細胞株におけるインビトロ細胞傷害性試験では、現在ＡＤＣに使用されている多くの超毒性薬物がピコモル範囲のＩＣ_５０値を示すことと比較して、ＳＮ－３８が一桁ナノモル範囲のＩＣ_５０値を示すことが判明している（Ｃａｒｄｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １７：３１５７－６９）。アウリスタチンまたはマイタンシンなどの超毒性薬物の使用が優勢な意見ではあるが、抗体あたりわずか２～４つの薬物を抗体に安定結合させたＡＤＣを調製すると、このような薬剤の治療窓は狭くなり、結果として、ＡＤＣを再設計してその治療指数を向上させるという新たな手間がかかることになる（Ｊｕｎｕｔｕｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １６：４７６９－７８）。

【0385】

この慣習から離れる１つのアプローチとして、本発明者らは、ヒト血清中において約１日間の半減期でＳＮ－３８を放出するリンカーを使用して抗体あたり７～８個のＳＮ－３８分子をコンジュゲートした。安定性に欠けるリンカーを使用することにより、ＡＤＣが細胞に向かった後に腫瘍部位でＳＮ－３８が放出されて、ＡＤＣが直接標的とする細胞だけではなく周囲の腫瘍細胞にも薬物が接触可能となるという仮説を立てる。得られたＡＤＣ、ｈＲＳ７－ＣＬ２Ａ－ＳＮ－３８（サシツズマブゴビテカン、すなわち、ＩＭＭＵ－１３２）は、広範囲の腫瘍タイプに対して抗腫瘍活性を示した（Ｃａｒｄｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １７：３１５７－６９）。ごく最近では、ＩＭＭＵ－１３２は、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）の前臨床モデルに対して顕著な抗腫瘍活性を示した（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｐｏｓｔｅｒ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ａｔ Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉａ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ９－１３，Ａｂｓｔｒ．Ｐ５－１９－０８）。最も重要なことに、目下の第Ｉ／ＩＩ相臨床試験において、ＩＭＭＵ－１３２は、ＴＮＢＣ患者に効果を示した（Ｂａｒｄｉａ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｐｏｓｔｅｒ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ａｔ Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉａ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ９－１３，Ａｂｓｔｒ．Ｐ５－１９－２）。その結果、効果を得るのにＡＤＣの内部移行に完全依存する代わりに、毒性の低い薬物及びＳＮ－３８を徐放するリンカーを使用することにより、ＡＤＣ化学におけるこのパラダイムシフトが検証された。

【0386】

ＳＮ－３８は、細胞のＤＮＡに著しい損傷を引き起こす周知のトポイソメラーゼＩ阻害剤である。ＳＮ－３８は、初期プロアポトーシスタンパク質、ｐ５３及びｐ２１ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１の上方制御を媒介して、カスパーゼの活性化及びポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の切断をもたらす。ｐ２１ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１の発現は、細胞周期のＧ１停止と関連していることから、内因性アポトーシス経路の特徴となっている。本発明者らは以前、ＩＭＭＵ－１３２が同様に、初期プロアポトーシスシグナル伝達現象（ｐ５３及びｐ２１ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１）の上方制御を媒介することにより、内因性プロアポトーシスシグナル伝達経路に沿った、ＮＳＣＬＣ（Ｃａｌｕ－３）細胞株及び膵臓（ＢｘＰＣ－３）細胞株におけるＰＡＲＰ切断をもたらし得ることを実証した（Ｃａｒｄｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １７：３１５７－６９）。

【0387】

本発明者らは本明細書において更に、固形がん、特に、ヒト胃腫瘍及びヒト膵臓腫瘍の治療に特に注意を向けて、ＩＭＭＵ－１３２を特徴付けた。ある種の固形腫瘍タイプ全体にわたるＴｒｏｐ－２表面発現について試験を行ったところ、腫瘍異種移植片におけるインビボ発現に相関が認められた。機構検査を行うことにより、ＩＭＭＵ－１３２が媒介する内因性プロアポトーシスシグナル伝達現象（二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の切断率上昇及びその後のカスパーゼ活性化上昇のエビデンスを含む）を更に明らかにした。最後に、臨床的に意義があり非毒性の投薬スキームを胃癌及び膵臓癌の疾患モデルで比較して、週に２回、週に１回及び１週おきのスケジュールで試験を行って、どの治療サイクルが効果を失わずに臨床現場に最もうまく適合し得るかを確認した。

【0388】

実験方法
細胞株及び化学療法剤－使用した全てのヒトがん細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入した。それぞれをＡＴＣＣの推奨に従い維持し、定期的にマイコプラズマ試験を行い、ＡＴＣＣによる短鎖縦列反復配列（ＳＴＲ）アッセイを用いて全ての鑑定を行った。ＩＭＭＵ－１３２（ｈＲＳ７－ＳＮ－３８）及び対照ＡＤＣ（抗ＣＤ２０ ｈＡ２０－ＳＮ－３８及び抗ＣＤ２２ ｈＬＬ２－ＳＮ－３８）を上記のとおりに調製し、－２０℃で保管した（Ｃａｒｄｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １７：３１５７－６９）。ＳＮ－３８を購入し（Ｂｉｄｄｌｅ Ｓａｗｙｅｒ Ｐｈａｒｍａ，ＬＬＣ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）、ＤＭＳＯ中１ｍＭのアリコートを－２０℃で保管した。

【0389】

Ｔｒｏｐ－２ ＥＬＩＳＡ－Ｈｉｓタグ付き組換えヒトＴｒｏｐ－２（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ；Ｃａｔ＃１０４２８－Ｈ０９Ｈ）及びＨｉｓタグ付き組換えマウスＴｒｏｐ－２（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．，Ｃａｔ＃５０９２２－Ｍ０８Ｈ）を、Ｎｉ－ＮＴＡ Ｈｉｓｓｏｒｂ ｓｔｒｉｐｓ（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ Ｃａｔ＃３５０２３）上に１μｇ播種し、室温で１時間静置した。ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）洗浄緩衝液でプレートを４回洗浄した。１％ＢＳＡ－ＰＢＳ希釈緩衝液中で試験範囲の０．１ｎｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬとなるように、ｈＲＳ７の系列希釈を行った。その後、プレートを室温で２時間インキュベートしてから４回洗浄し、続いてペルオキシダーゼをコンジュゲートした二次抗体（ヤギ抗ヒトＦｃフラグメント特異的；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃａｔ＃１０９－０３６－０９８）を加えた。４５分間のインキュベーション後、プレートを洗浄してから、基質溶液（ｏ－フェニレンジアミンジヒドロクロリド（ＯＰＤ）；Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ＃Ｐ８２８）を全てのウェルに加えた。プレートを暗黒下で１５分間インキュベートしてから、４Ｎ硫酸で反応を停止させた。Ｂｉｏｔｅｋ ＥＬＸ８０８プレートリーダを用いて、４５０ｎｍでプレートを読んだ。データを解析し、Ｐｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ４．０３）（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．；Ｅｎｃｉｎｉｔａｓ，ＣＡ）を使用してグラフを作成した。

【0390】

インビトロ細胞結合－ＬｕｍｉＧＬＯ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ，ＭＤ）を使用して、細胞に結合した抗体を検出した。簡潔に説明すると、９６黒色ウェル平底透明プレートに細胞を播種してから一晩静置した。抗体を１：２に系列希釈して３回加え、０．０３～６６．７ｎＭの濃度範囲を得た。４℃で１時間インキュベートした後、培養液を除去してから、新鮮な冷培養液で細胞を洗浄し、続いて、１：２０，０００希釈のヤギ抗ヒト西洋わさびペルオキシダーゼをコンジュゲートした二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を加え、４℃で１時間静置した。プレートを再度洗浄してから、ＬｕｍｉＧＬＯ試薬を加えた。Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ ＭＡ）を使用して、プレートの蛍光を読んだ。非線形回帰でデータを解析し、平衡解離定数（ＫＤ）を算出した。データのベストフィットカーブに関するＦ検定を使用したＰｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ４．０３）（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．；Ｅｎｃｉｎｉｔａｓ，ＣＡ）で、ＫＤ値の統計比較を実施した。有意性をＰ＜０．０５に設定した。

【0391】

抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）－４時間ＬＤＨ放出アッセイを実施して、ＩＭＭＵ－１３２、ｈＲＳ７ ＩｇＧ、ｈＬＬ２－ＳＮ－３８及びｈＬＬ２ ＩｇＧ（ｈＬＬ２は、固形腫瘍細胞株用の非結合抗ＣＤ２２複合体）が誘導したＡＤＣＣ活性を評価した。簡潔に説明すると、標的細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ－３、またはＢｘＰＣ－３）を、１ｘ１０^４個の細胞／ウェルで９６ウェル黒色平底プレートに播種し、一晩インキュベートした。翌日、末梢血単核エフェクター細胞（ＰＢＭＣ）を新たにドナーから分離して、反応用プレート上の割り当てたウェルに、５０：１のＥ：Ｔ比で加えた。ヒトＰＢＭＣの収集は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ（Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）の承認の下で行った。試験用試薬を、割り当てたウェルに、３３．３ｎＭの終濃度で加えた。バックグラウンド対照として１セットのウェルにＡＤＣＣアッセイ培養液単独を加え、最大細胞溶解物対照として別のセットのウェルに細胞単独に加えＴｒｉｔｏｎＸ１００を加えた。プレートを３７℃で４時間インキュベートした。４時間後、均一蛍光定量ＬＤＨ放出アッセイ（Ｃｙｔｏ Ｔｏｘ－Ｏｎｅ Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ Ａｓｓａｙ；Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ．Ｇ７８９１）を用いて、標的細胞溶解物を評価した。

【0392】

Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＬＡＳ，Ｉｎｃ．；Ｓｈｅｌｔｏｎ，ＣＴ）を用いてプレートを読んだ（５４４ｎｍ～５９０ｎｍ）。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌでデータを解析した。パーセント特異的溶解については、以下のとおり計算した。

【化9】

式中、
試験：エフェクター＋標的細胞＋抗体
エフェクター＋標的対照：エフェクター＋標的細胞
最大溶解物：標的細胞＋Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００
標的対照：標的細胞のみ

【0393】

表面プラズモン共鳴結合（ＢＩＡＣＯＲＥ）－簡潔に説明すると、（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｐｏｓ ３９：１４６９－７７）に記載されているように調製されたｒｈＴｒｏｐ－２／ＴＡＣＳＴＤ２（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）または組換えヒト新生児受容体（ＦｃＲｎ）を、低密度チップ用の製造業者の取扱説明書に従い、アミンカップリングキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＲ－１０００－５０）で、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；Ｃａｔ．＃ＢＲ－１０００－１２）上に固定化した。泳動緩衝液を使用して、ｈＲＳ７ ＩｇＧ及びＩＭＭＵ－１３２の独立した３セットの希釈溶液を調製した（４００ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ及び２５ｎＭ）。それぞれのセットは、ＢＩＡＣＯＲＥ（ＢＩＡＣＯＲＥ－Ｘ；Ｂｉａｃｏｒｅ Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）内に流す独立した泳動液を構成し、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｉｎｃ．，ｖ４．１）を使用してデータを解析した。それぞれの試料における全５濃度の泳動液を使用して、１：１（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｍｏｄｅｌ ａｎｄ Ｆｉｔによる解析を実施し、ベストフィット（最小Ｘ^２値）を算出した。式 ＫＤ ＝ ｋｄ１／ｋａ１（式中、ｋｄ１は解離速度定数であり、ｋａ１は会合速度定数）を使用して、ＫＤ値を算出した。

【0394】

ホルマリン固定パラフィン包埋組織内Ｔｒｏｐ－２分布の免疫組織学的評価－マウスから腫瘍異種移植片を取り出して、１０％緩衝ホルマリンに固定後パラフィン包埋した。脱パラフィン後、トリス／ＥＤＴＡ緩衝液（ＤａＫｏ Ｔａｒｇｅｔ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ｐＨ９．０；Ｄａｋｏ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて、５μｇ切片を、ＮｘＧｅｎ Ｄｅｃｌｏａｋｉｎｇ Ｃｈａｍｂｅｒ（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｃｏｎｃｏｒｄ，ＣＡ）内、９５℃で３０分間インキュベートした。１０μｇ／ｍＬのヤギポリクローナル抗ヒトＴｒｏｐ－２抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）でＴｒｏｐ－２を検出し、Ｖｅｃｔｏｒ ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で染色した。標準的なヤギ抗体を陰性対照として使用した（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）。組織をヘマトキシリンで６秒間対比染色した。

【0395】

ヒトがん細胞株上におけるＴｒｏｐ－２表面発現－細胞表面上におけるＴｒｏｐ－２の発現はフローサイトメトリーに基づいている。簡潔に説明すると、Ａｃｃｕｔａｓｅ Ｃｅｌｌ Ｄｅｔａｃｈｍｅｎｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ＢＤ）；Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ；Ｃａｔ．Ｎｏ．５６１５２７）を用いて細胞を採取してから、製造業者の取扱説明書に従いＱｕａｎｔｉＢＲＩＴＥ ＰＥビーズ（ＢＤ Ｃａｔ．Ｎｏ．３４０４９５）及びＰＥコンジュゲート抗Ｔｒｏｐ－２抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１２－６０２４）を使用して、Ｔｒｏｐ－２発現のアッセイを行った。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｐｒｏソフトウェアを搭載したＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ）上でデータを取得した。Ｆｌｏｗｊｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ ＯＲ）を使用して染色を解析を行った。

【0396】

薬物動態－８～１０週齢の未処理雌ＮＣｒヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウスをＴａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）から購入した。マウス（Ｎ＝５）に２００μｇのＩＭＭＵ－１３２、親ｈＲＳ７、または修飾ｈＲＳ７－ＮＥＭ（ＴＣＥＰで処理してＮ－エチルマレイミドをコンジュゲートしたｈＲＳ７）をｉ．ｖ．注射した。注射後３０分、４時間、２４時間、７２時間及び１６８時間の時点で、動物の後眼窩叢から採血した。ＥＬＩＳＡを利用し、抗ｈＲＳ７ ＩｇＧイディオタイプ抗体に対する結合性において、ｈＲＳ７の西洋わさびペルオキシダーゼ複合体と競合させることにより、総ｈＲＳ７ ＩｇＧの血清中濃度を測定した。補足用の抗ＳＮ－３８抗体、及び検出用の西洋わさびペルオキシダーゼをコンジュゲートした抗ｈＲＳ７ ＩｇＧ抗体を使用して、インタクトＩＭＭＵ－１３２の血清中濃度を測定した。Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎ ６．３；Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用した非コンパートメント解析により、薬物動態（ＰＫ）パラメータを算出した。

【0397】

二本鎖ＤＮＡ切断のインビトロ評価－薬物活性試験用に、ＢｘＰＣ－３細胞を、５ ｘ １０^５個の細胞／ウェルで６ウェルプレートに播種してから、３７℃で一晩保持した。氷上で１０分間冷却した後、細胞を、終濃度２０μｇ／ｍｌのＩＭＭＵ－１３２、ｈＡ２０－ＳＮ－３８またはｈＲＳ７－ＩｇＧと共に、氷上で３０分間インキュベートしてから、新鮮な培地で３回洗浄し、その後、３７℃に戻して一晩培養を続けた。翌朝、細胞を短い間トリプシン処理してから遠心沈殿し、Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｓｔａｉｎ ４５０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で染色した。その後、１％ＢＳＡ－ＰＢＳで洗浄してから、４％ホルマリン中で１５分間固定した。再度洗浄を行ってから、ＰＢＳ中０．１５％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００で更に１５分間透過処理を行った。１％ＢＳＡ－ＰＢＳで２回洗浄後、マウス抗γＨ２ＡＸ－ＡＦ４８８（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）と共に細胞を４℃で４５分間インキュベートした。ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して、フローサイトメトリーでγＨ２ＡＸのシグナル強度を測定した。

【0398】

インビボ治療試験－４～８週齢のＮＣｒ雌無胸腺ヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウスをＴａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）から購入した。組織培養液から細胞を回収してマトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）と１：１にした最終細胞懸濁液を調製することにより、ＮＣＩ－Ｎ８７胃腫瘍異種移植片を樹立して、それぞれのマウスの右脇腹に合計１ ｘ １０^７個の細胞をｓ．ｃ．注射した。ＢｘＰＣ－３用に１ｇの異種移植片を回収し、ＨＢＳＳを用いて４０％腫瘍（重量／体積）の濃度となるように腫瘍懸濁液を調製した。この懸濁液を、２０％（重量／体積）の腫瘍懸濁液となるようにマトリゲルと１：１で混合した。それから、マウスに３００μＬでｓ．ｃ．注射した。キャリパーを使用した２寸法測定法により、腫瘍容積（ＴＶ）を測定した（容積はＬ ｘ ｗ^２／２と定義され、式中、Ｌは腫瘍の最長寸法であり、ｗは腫瘍の最短寸法である）。ＩＨＣ用に、約０．５ｃｍ^３まで腫瘍を増殖させてからマウスを安楽死させ、腫瘍を取り出して、ホルマリン固定及びパラフィン包埋を行った。治療試験のためにマウスを治療群に無作為化し、腫瘍容積が約０．２５ｃｍ^３となったところで治療を開始した。それぞれの実験における治療レジメン、用量、及び、動物の数については、結果及び凡例に記載している。凍結乾燥させたＩＭＭＵ－１３２及び対照ＡＤＣ（ｈＡ２０－ＳＮ－３８）を、必要に応じ、滅菌生理食塩水で戻して希釈した。

【0399】

腫瘍サイズが１．０ｃｍ^３より大きく成長したら、マウスを安楽死させて病死とみなした。治療に対する最良効果を、部分寛解、開始時のサイズから＞３０％の縮小；安定、最大２９％の腫瘍容積縮小、または初期サイズからの２０％以下の拡大；増悪、開始時のサイズまたはｎａｄｉｒのいずれかからの≧２０％の腫瘍拡大と定義した。無増悪期間（ＴＴＰ）を、腫瘍サイズがｎａｄｉｒから２０％超拡大する治療後開始までの期間と定義した。

【0400】

腫瘍増殖の統計解析は、曲線下面積（ＡＵＣ）を基準とした。線形曲線モデリングにより、個々の腫瘍増殖プロファイルを得た。増殖曲線の統計解析前に群間の等分散性を検定するために、Ｆ検定を採用した。生理食塩水対照を除く様々な治療群及び対照群間の統計的有意性を評価するために両側ｔ検定を使用した一方で、片側ｔ検定を使用した（有意性、Ｐ≦０．０５）。Ｐｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ４．０３）ソフトウェアパッケージ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｅｎｃｉｎｉｔａｓ，ＣＡ）を使用し、カプランマイヤープロット（ログランク解析）を用いて生存率試験について解析した。

【0401】

免疫ブロット法－細胞（２ ｘ １０^６）を６ウェルプレートに播種してから、一晩静置した。翌日、遊離ＳＮ－３８（ＤＭＳＯ中に溶解）またはＩＭＭＵ－１３２（０．４μｇ／ｍＬ（１μＭ）のＳＮ－３８濃度当量）のいずれかを用いて、細胞を処理した。親ｈＲＳ７をＡＤＣの対照として用いた。１０ｍＭ トリス、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、プロテアーゼ阻害薬及びホスファターゼ阻害剤（２ｍＭ Ｎａ_２ＰＯ_４、１０ｍＭ ＮａＦ）を含有する緩衝液中に、細胞を溶解した。合計２０μｇのタンパク質を４～２０％ ＳＤＳポリアクリルアミドゲル中に分散させてからニトロセルロース膜上に転写し、１ ｘ ＴＢＳ－Ｔ（トリス緩衝生理食塩水、０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０）中の５％脱脂乳を用いて、室温で１時間ブロッキングした。一次抗体を用いて４℃で一晩膜をプローブした後、抗ウサギ二次抗体（１：２５００）を用いて室温で１時間インキュベートした。化学発光キット（Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用してシグナルを検出し、Ｋｏｄａｋ Ｉｍａｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ ４００００Ｒを用いて膜を可視化した。一次抗体ｐ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１（Ｃａｔ．Ｎｏ．２９４７）、カスパーゼ３（Ｃａｔ．Ｎｏ．９６６５）、カスパーゼ７（Ｃａｔ．Ｎｏ．９４９２）、カスパーゼ９（Ｃａｔ．Ｎｏ．９５０２）、ＰＡＲＰ（Ｃａｔ．Ｎｏ．９５４２）、β－アクチン（Ｃａｔ．Ｎｏ．４９６７）、ｐＪＮＫ１／２（Ｃａｔ．Ｎｏ．４６６８）、ＪＮＫ（Ｃａｔ．Ｎｏ．９２５８）、及びヤギ抗ウサギＨＲＰ二次抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．７０７４）は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）から入手した。

【0402】

結果
複数の固形腫瘍細胞株におけるＴｒｏｐ－２発現レベル－Ｔｒｏｐ－２の表面発現は、胃癌、膵臓癌、乳癌、結腸癌及び肺癌を含む様々なヒト固形腫瘍株（表１０）において明白である。任意のその他の腫瘍タイプを上回って高発現した腫瘍タイプは１つではなく、任意の腫瘍細胞タイプ内においてばらつきが認められた。例えば、胃腺癌全体のＴｒｏｐ－２レベルは、細胞あたりの表面分子で、非常に少ない４９４ ± １９（Ｈｓ ７４６Ｔ）から多い２４６，８５７ ± ６４，６５１（ＮＣＩ－Ｎ８７）の範囲であった。

【0403】

Ｔｒｏｐ－２発現用に染色した胃腸腫瘍異種移植片は、細胞質染色及び膜染色の両方を示した（データは省略）。染色強度は、ＦＡＣＳ解析で測定した表面Ｔｒｏｐ－２発現の結果とかなり一致した。膵腺癌においては、３種全てが均一な染色を示し、ＢｘＰＣ－３は２＋～３＋の染色を示した。ＮＣＩ－Ｎ８７胃腺癌は、より均一な染色パターンを示し、腺の先端内膜に３＋染色がみられ、周囲の腫瘍細胞に著しい染色はあまりみられなかった。ＣＯＬＯ ２０５が極めて局所的な１＋～２＋の染色を示した一方で、ＨＴ－２９は、ほんの少しの細胞における極めて希少な１＋の染色を示した。

【0404】

表１０．ＦＡＣＳ解析による様々な固形腫瘍株におけるＴｒｏｐ－２表面発現レベル。ａ
細胞あたりの表面Ｔｒｏｐ－２分子数
細胞株 平均±ＳＤ
胃
ＮＣＩ－Ｎ８７ ２４６，８５７ ± ６４，６５１
ＡＧＳ ５３，７５６ ± ２３，５２７
Ｈｓ ７４６Ｔ ４９４ ± １９
膵臓
ＢｘＰＣ－３ ４９３，７７３ ± ９７，７７９
ＣＦＰＡＣ－１ １６２，８７１ ± ２８，１６１
Ｃａｐａｎ－１ １５７，３７６ ± ３６，９７６
ＨＰＡＦ－ＩＩ １１５，５３３ ± ２８，６２７
乳房（ＴＮ）
ＭＤＡ－ＭＢ－４６８ ３０１，６０３ ± ２９，４７０
ＨＣＣ３８ １８１，４８８ ± ６９，３５１
ＨＣＣ１８０６ ９１，４０３ ± ２０，８１７
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ ３２，３８０ ± ５，４６０
乳房
ＳＫ－ＢＲ－３（ＨＥＲ２^＋） ３２８，２８１ ± ４７，９９６
ＭＣＦ－７（ＥＲ２^＋） １１０，６４６ ± １７，２３３
結腸
ＣＯＬＯ ２０５ ５８，１７９ ± ６，９０９
ＨＴ－２９ ６８ ± １７
ＮＳＣＬＣ
Ｃａｌｕ－３ １２８，２０１ ± ５０，７０８
扁平上皮細胞肺
ＳＫ－ＭＥＳ－１ ２９，４８８ ± ５，８２４
急性Ｔ細胞性白血病
ジャーカット ０
ａ３つの独立したアッセイを実施し、平均及び標準偏差で示した。

【0405】

ＩＭＭＵ－１３２の結合特性－ｈＲＳ７がマウスＴｒｏｐ－２と交差反応しないことを更に示すために、組換えマウスＴｒｏｐ－２またはヒトＴｒｏｐ－２のいずれかでコーティングしたプレートに対してＥＬＩＳＡを実施した（データは省略）。ヒト化ＲＳ７はヒトＴｒｏｐ－２だけに特異的に結合し（ＫＤ＝０．３ｎＭ）、マウスＴｒｏｐ－２との交差反応は認められなかった。対照のポリクローナルウサギ抗マウスＴｒｏｐ－２抗体及び抗ヒトＴｒｏｐ－２抗体は、両形態のＴｒｏｐ－２と交差反応してそれらと結合した（データは省略）。

【0406】

親ｈＲＳ７に加え、修飾ｈＲＳ７、修飾ｈＲＳ７－ＮＥＭ（ＴＣＥＰで処理してＮ－エチルマレイミドをコンジュゲートしたｈＲＳ７）と比較して、複数の細胞株に結合したＩＭＭＵ－１３２について試験を行った（データは省略）。全てのケースにおいて、算出したＫＤ値はサブナノモル範囲であり、任意の細胞株内におけるｈＲＳ７と、ＩＭＭＵ－１３２と、ｈＲＳ７－ＮＥＭの間に有意差は認められなかった。

【0407】

ＩＭＭＵ－１３２とｈＲＳ７における結合性の比較について、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡＣＯＲＥ）解析を使用して、更に調査を行った（データは省略）。低密度Ｔｒｏｐ－２バイオセンサーチップ（密度＝１１１０ＲＵ）を、組換えヒトＴｒｏｐ－２に利用した。３回の独立した結合泳動は、ＩＭＭＵ－１３２が、ＳＮ－３８のコンジュゲーションプロセスによって悪影響を受けないことを示しただけではなく、ｈＲＳ７と比較してＴｒｏｐ－２に対する結合親和性がより高いことを示した（それぞれ、０．２６ ± ０．１４ｎＭ対０．５１ ± ０．０４ｎＭ；Ｐ＝０．０３９８）。

【0408】

作用機序：ＡＤＣＣ及び内因性アポトーシスシグナル伝達経路－３種類の異なる細胞株、ＴＮＢＣ（ＭＤＡＭＢ－４６８）、卵巣（ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ－３）及び膵臓（ＢｘＰＣ－３）におけるＩＭＭＵ－１３２のＡＤＣＣ活性をｈＲＳ７と比較した（データは省略）。３種類全てにおいて、ｈＲＳ７は、ＩＭＭＵ－１３２を含む全てのその他治療薬と比較して、細胞溶解を有意に媒介した（Ｐ＜０．００５４）。ＩＭＭＵ－１３２を使用して細胞を標的とすると、ｈＲＳ７の場合と比較して、ＡＤＣＣが６０％超低下した。例えば、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８においてｈＲＳ７が媒介する特異的溶解は、ＩＭＭＵ－１３２の場合の８．６ ± ２．６％と比較して、２９．８ ± ２．６％であった（データは省略；Ｐ＜０．０００１）。ほぼ同等のＡＤＣＣ活性低下が、ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ－３及びＢｘＰＣ－３で同様に認められた（データは省略；それぞれ、Ｐ＜０．０００１及びＰ＜０．００５４）。この低下したＡＤＣＣ活性は、コンジュゲーションプロセス中の抗体に生じた変化の結果であると考えられる。なぜなら、特異的細胞溶解におけるこの同一の低下は、ＣＬ２Ａ－ＳＮ－３８リンカーを欠き、Ｎ－エチルマレイミドの代わりにシステインをブロックしているｈＲＳ７－ＮＥＭにおいて明白であるからである（データは省略）。ｈＲＳ７またはＩＭＭＵ－１３２と関連したＣＤＣ活性は認められなかった（データは省略）。

【0409】

以前より、ＩＭＭＵ－１３２が、初期プロアポトーシスシグナル伝達現象（ｐ５３及びｐ２１ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１）の上方制御を媒介し、最終的にＰＡＲＰ２０の切断をもたらしていることが判明している。ＩＭＭＵ－１３２が利用するアポトーシス経路をより適切に同定するために、ＮＣＩ－Ｎ８７ヒト胃癌細胞株及びＢｘＰＣ－３膵腺癌細胞株を、１μＭの遊離ＳＮ－３８または当量のＩＭＭＵ－１３２に曝した（データは省略）。遊離ＳＮ－３８とＩＭＭＵ－１３２の両方は、ｐ２１ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１の上方制御を媒介する。遊離ＳＮ－３８に曝したＮＣＩ－Ｎ８７細胞とＩＭＭＵ－１３２に曝したＮＣＩ－Ｎ８７細胞の間の上方制御が、４８時間経過して初めて同一となった（データは省略）一方で、ＢｘＰＣ－３における最大の上方制御は２４時間以内に明白となった（データは省略）。遊離ＳＮ－３８とＩＭＭＵ－１３２の両方は、曝露後４８時間以内に、プロカスパーゼ９及びプロカスパーゼ７の切断を示す。両方の細胞株でプロカスパーゼ３は切断され、その最高切断率は４８時間後に認められた。遊離ＳＮ－３８とＩＭＭＵ－１３２の両方は最終的に、ＰＡＲＰの切断を媒介した。このことは２４時間時点で初めて明白となり、４８時間時点で切断の増加が認められた。まとめると、これらのデータは、ＩＭＭＵ－１３２内に含まれるＳＮ－３８が遊離ＳＮ－３８と同一の活性を有していることを裏付けている。

【0410】

これらの後期アポトーシスシグナル伝達現象に加え、この経路に関わる初期の現象、すなわち、ＪＮＫのリン酸化（ｐＪＮＫ）はまた、遊離ＳＮ－３８またはＩＭＭＵ－１３２のいずれかに短時間曝露されたＢｘＰＣ－３細胞において明白であるが、ｎａｋｅｄ ｈＲＳ７では明白ではない（データは省略）。ｐＪＮＫの増量は４時間時点付近で明白であり、６時間時点において顕著な変化は認められなかった。ＩＭＭＵ－１３２の場合と比較して、遊離ＳＮ－３８に曝した細胞内では、より高強度のリン酸化が認められたが、対照と比較すると両方ともかなり高かった。ＩＭＭＵ－１３２の作用機序のエンドポイントとして、ＢｘＰＣ－３細胞内におけるｄｓＤＮＡ切断の測定を実施した。ＢｘＰＣ－３をＩＭＭＵ－１３２に３０分間だけ曝すと、非標的化対照ＡＤＣの場合と比較して、２倍超のγＨ２ＡＸ誘導がもたらされた（表１１）。約７０％の細胞がγＨ２ＡＸ染色に対して陽性であるのに対し、ｎａｋｅｄ ｈＲＳ７、関連性のないｈＡ２０－ＳＮ－３８ ＡＤＣ、及び未処理対照は、＜２０％であった（Ｐ＜０．０００２）。

【0411】

表１１．ＢｘＰＣ－３においてＩＭＭＵ－１３２が媒介するｄｓＤＮＡの切断：γＨ２ＡＸ誘導。^ａ
処理 平均蛍光強度 パーセント陽性
未処理 ２５１６ ± １９１ １８．８ ± ６．３
ｈＲＳ７ ２２９７ ± １８ １３．０ ± ０．６
ｈＡ２０－ＳＮ－３８ ２２４６ ± ５８ １２．７ ± ２．４
ＩＭＭＵ－１３２ ５３４９ ± ２３４ ６９．０ ± ４．１
ａＩＭＭＵ－１３２対全３対照治療、Ｐ＜０．０００２（片側ｔ検定；Ｎ＝３）。

【0412】

ＩＭＭＵ－１３２の薬物動態－ヒト新生児受容体（ＦｃＲｎ）への結合性をＢＩＡＣＯＲＥ解析により測定した（データは省略）。低密度ＦｃＲｎバイオセンサーチップ（密度＝１３０２ＲＵ）を使用して、５つの異なる濃度（４００～２５ｎＭ）で３回の独立した結合泳動をそれぞれの薬剤で実施した。総合的に言えば、ｈＲＳ７とＩＭＭＵ－１３２の両方はナノモル範囲のＫＤ値（それぞれ、９２．４ ± ５．７ｎＭ及び１９１．９ ± ４７．６ｎＭ）を示し、２つの間に有意差は認められなかった。マウスにＩＭＭＵ－１３２を注射してから、２つのＥＬＩＳＡを使用して、親ｈＲＳ７と比較したＩＭＭＵ－１３２対ｈＲＳ７ ＩｇＧのクリアランスを測定した（データは省略）。ｈＲＳ７を注射したマウスは、ＩＭＭＵ－１３２のｈＲＳ７標的化部分に認められたパターン（データは省略）に類似した二相性のクリアランスパターン（それぞれ、約３時間及び２００時間のα半減期及びβ半減期）（データは省略）を示した。対照的に、インタクトＩＭＭＵ－１３２では、１１時間の半減期及び１５．４時間の平均滞留時間（ＭＲＴ）の急速なクリアランスが認められた（データは省略）。

【0413】

鎖間ジスルフィド結合の分断が標的化抗体のＰＫを変化させないということを更に確認するために、親ｈＲＳ７のＰＫを修飾ｈＲＳ７（ｈＲＳ７－ＮＥＭ）の場合と比較した。半減期、Ｃｍａｘ、ＡＵＣ、クリアランスまたはＭＲＴに関して、２薬剤間に有意差は認められなかった（データは省略）。

【0414】

ヒト胃癌異種移植片におけるＩＭＭＵ－１３２の効果－以前より、非小細胞肺癌、結腸癌、ＴＮＢＣ及び膵臓癌の異種移植片モデルにおけるＩＭＭＵ－１３２の効果が実証されている（Ｃａｒｄｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １７：３１５７－６９；Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｓｔｅｒ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ａｔ Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ９－１３，Ａｂｓｔｒ Ｐ５－１９－０８）。これらの研究結果を、その他の胃腸癌へと更に広げるために、ヒト胃癌異種移植片のＮＣＩ－Ｎ８７を有するマウスを用いて、ＩＭＭＵ－１３２の試験を行った（データは省略）。ＩＭＭＵ－１３２による治療は、生理食塩水及び非標的化ｈＡ２０（抗ＣＤ２０）－ＳＮ－３８ ＡＤＣ対照と比較して、著しい腫瘍退縮を実現した（データは省略；Ｐ＜０．００１）。動物に最後の治療投与を行った後に１８日間超継続した部分的な効果を示したのは、ＩＭＭＵ－１３２群内の７匹のマウスのうち６匹であった。この試験は、対照ＡＤＣ群内の効果のなかったマウスの４．１ ± ２．０日間と比較して、４１．７ ± ４．２日間の平均無増悪期間（ＴＴＰ）という結果となった（Ｐ＜０．０００１）。総合的に言えば、ＩＭＭＵ－１３２治療マウスの平均生存期間（ＭＳＴ）は、対照ＡＤＣでは２４日間、生理食塩水対照動物では１４日間であったのに対し、６６日間であった（データは省略；Ｐ＜０．０００１）。

【0415】

臨床的に意義のある投薬スキーム－現時点で臨床的に試験されているＩＭＭＵ－１３２の反復最大耐量は、２１日サイクルの１日目及び８日目における８ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの投与である。ヒト用量の８ｍｇ／ｋｇは、マウス用量の９８．４ｍｇ／ｋｇ（すなわち、２０ｇのマウスに対する約２ｍｇ）に変換される。ヒト膵腺癌異種移植片モデル（ＢｘＰＣ－３）を用いて、分割した２ｍｇのＩＭＭＵ－１３２による３つの異なる投薬スケジュールについて試験を行った。３つの異なる投与スケジュール：１つの群は１ｍｇのＩＭＭＵ－１３２投与を２回（１日目及び１５日目に治療）受け、１つの群は０．５ｍｇの投与を４回（１日目、８日目、２２日目及び２９日目に治療）受け、最後の群は０．２５ｍｇの投与を８回（１日目、４日目、８日目、１１日目、２２日目、２５日目、２９日目及び３２日目に治療）受ける、を使用してこの総用量を分割した。３つ全ての投薬スキームは、未治療対照動物と比較して、腫瘍増殖抑制と全生存期間の両方の点において、有意な抗腫瘍効果をもたらした（それぞれ、Ｐ＜０．０００９及びＰ＜０．０００１）。３つの異なる治療群間のＴＴＰに有意差はなく、１ｍｇ投薬群の２２．４ ± １０．１日間から、０．２５ｍｇ投薬群の３１．７ ± １４．５日間（未治療対照群のＴＴＰ＝５．０ ± ２．３日間）の範囲であった。

【0416】

ＮＣＩ－Ｎ８７ヒト胃腫瘍異種移植片を有するマウスを用いて、同様の投薬スケジュール試験を実施した（データは省略）。３つ全ての投薬スケジュールは、未治療対照マウスと比較して有意な抗腫瘍効果をもたらしたが、互いの差は認められなかった（ＡＵＣ；Ｐ＜０．０００１）。同様に、全生存期間の点から言うと、３つ全ての投薬スケジュールは、未治療対照と比較して有意な生存効果をもたらした（Ｐ＜０．０００１）が、これら３つの異なるスケジュールのいずれかの間に差は認められなかった。

【0417】

適切な投薬スキームを更に区別するために、ＮＣＩ－Ｎ８７腫瘍を有するマウスを、０．５ｍｇのＩＭＭＵ－１３２を２週間にわたり週に１回マウスに注射してから１週間休薬し、その後別のサイクル（データは省略）を開始する（現行の臨床試験スケジュールにみられるような）という、長期的なＩＭＭＵ－１３２投与に供した。合計で４つの治療サイクルにわたり動物に投与を行った。

【0418】

この投薬スケジュールは腫瘍増殖を遅延させ、対照ＡＤＣ治療マウスにおける４．７ ± ２．２日間と比較して、１５．７ ± １１．１日間のＴＴＰをもたらした（Ｐ＝０．０１２２）。総合的に言えば、長期的な投薬により、１９匹の平均生存率は、対照ＡＤＣ治療マウスの２１日間からＩＭＭＵ－１３２投与動物の６３日間へと３倍高まった（Ｐ＝０．０００１）。重要なことに、これら全ての異なる投薬スキーム評価において、有意な体重減少を示さないマウスにおける治療関連毒性は認められなかった（データは省略）。

【0419】

考察
目下の第Ｉ／ＩＩ相臨床試験（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ，ＮＣＴ０１６３１５５２）において、ＩＭＭＵ－１３２（サシツズマブゴビテカン）は、広範囲の固形腫瘍を発症している患者に対して客観的な効果を示している（Ｓｔａｒｏｄｕｂ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２１：３８７０－７８）。この第Ｉ／ＩＩ相臨床試験を継続する上で、ＩＭＭＵ－１３２の効果を更に、拡大リストのＴｒｏｐ－２陽性がんへと広げる必要がある。加えて、超毒性薬物を利用したその他臨床的に意義のあるＡＤＣとは対照的に、ＩＭＭＵ－１３２の独自性を、本発明者らが臨床開発を前進させるにつれて更に明らかにする必要がある。

【0420】

本明細書で提供する研究はＩＭＭＵ－１３２の特性を更に明らかにするものであり、胃癌及び膵腺癌に対するＩＭＭＵ－１３２の効果を臨床的に意義のある投薬スキームで実証するものである。奏効するＡＤＣの優勢な見方では、正常組織と比較して腫瘍における発現レベルが高い抗原を認識する抗体、及び腫瘍細胞に結合する際に好ましく内部移行する抗体、を使用することが当然となっている（Ｐａｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４，ｍＡｂｓ ６：３４－４５）。現時点で承認済みのＡＤＣの全ては、非常に安定したリンカーで抗体に結合した低置換率（抗体あたり２～４つの薬物）の超毒性薬物（ｐＭ ＩＣ５０）を使用している。ＩＭＭＵ－１３２はこのパラダイムから離れて３つの主な態様、（ｉ）ＳＮ－３８（適度に細胞傷害性の薬物（ｎＭ ＩＣ_５０））は化学療法剤として使用される、（ｉｉ）ＳＮ－３８は抗体の８つの鎖間チオールに部位特異的にコンジュゲートして、抗体あたり７．６の薬物置換となる、及び（ｉｉｉ）カーボネートリンカーは、低ｐＨで開裂可能だが、また２４時間の血清中半減期で薬物を放出するものを使用する、を有する（Ｃａｒｄｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １７：３１５７－６９）。ＩＭＭＵ－１３２は抗体で構成され、当該抗体は、本発明者らが説明したとおりエピトープに結合後に内部移行して、多くの異なるタイプの上皮性腫瘍で高発現し更にその対応する正常組織において低濃度で存在するヒトＴｒｏｐ－２に特異的である（Ｓｈｉｈ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５：５８５７ｓ－６３ｓ）。正常組織内に存在するにもかかわらず、同様の組織でＴｒｏｐ－２をまた発現するサルを用いた先行研究は、用量制限の好中球減少症及び下痢を発症するほど極めて高い用量でさえ、比較的軽度で可逆的な組織病理学的変化を示した。このことは、正常組織内の抗原が何らかの方法で隔離されたか、またはより少ない毒性の薬物を使用したことによりこれら正常組織を重大な損傷から守ったということを示唆している（Ｃａｒｄｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １７：３１５７－６９）。

【0421】

本明細書において、本発明者らは、以前より報告されている方法と比較してより定量的な方法で、しかしまた重要なことに、均一（例えば、ＮＣＩＮ８７）から極めて局所的（例えば、ＣＯＬＯ ２０５）の範囲のＴｒｏｐ－２発現を示す異種移植片を用いて、インビトロ発現を試験することにより、複数のヒト固形腫瘍株におけるＴｒｏｐ－２発現の評価を拡大した。総合的に言えば、インビトロで測定されたＴｒｏｐ－２の表面発現レベルは、異種移植片のＩＨＣ解析後における染色強度と相関している。Ｔｒｏｐ－２発現細胞の局所的なポケットのみの存在が免疫組織学試験により明らかとなったＣＯＬＯ ２０５のような腫瘍においてでさえ、ＩＭＭＵ－１３２が依然として特定腫瘍の退縮を誘導可能であったことが特に興味深く、このことは、抗原提示細胞に結合した複合体からＳＮ－３８が放出された結果としてバイスタンダー効果が生じ得ることを示唆している（Ｃａｒｄｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １７：３１５７－６９）。実際に、ＳＮ－３８は細胞膜を容易に貫通し、また腫瘍微小環境内へのＳＮ－３８の局所放出は、インタクト複合体の内部移行を必要とせずに細胞内部にＳＮ－３８を侵入させるための別の機構をもたらす。重要なことに、複合体に結合したＳＮ－３８は完全な活性化状態を維持するが、それはすなわち、グルクロン酸抱合されないこと、及び放出時にラクトン環形態となり得ることを意味する（Ｓｈａｒｋｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２１：５１３１－８）。この特性は独特であり、今日まで研究されてきたその他の徐放性ＳＮ－３８製剤またはイリノテカン製剤のいずれかと比較してより選択的な方法で完全な活性化形態のＳＮ－３８を局在化させるという、ＩＭＭＵ－１３２の機能を特徴付けるものである。

【0422】

ＩＭＭＵ－１３２を用いた第Ｉ相臨床試験では、第ＩＩ相における更なる研究のため、２１日サイクルにおける２週間にわたり週に１回の８～１０ｍｇ／ｋｇの投与について確認した（Ｓｔａｒｏｄｕｂ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２１：３８７０－７８）。膵臓癌及び胃癌を含む広範囲の転移性固形腫瘍を有する患者に、複数の前治療からの再発後における長期間の病変安定化が認められた（Ｓｔａｒｏｄｕｂ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２１：３８７０－７８；Ｓｔａｒｏｄｕｂ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ３２：５ｓ（Ｓｕｐｐｌ Ａｂｓｔｒ ３０３２））。異なる投薬スケジュールがより効果的となり得るかを確認するために、異種移植片モデルを用いた更なる試験を実施した。この目的のために、ヒト用量の８ｍｇ／ｋｇ（マウス用量の９８．４ｍｇ／ｋｇ）当量を、２１日サイクルにおける１週おき、週に１回、または週に２回を含む３つの異なる投薬スケジュールに分割した。膵臓腫瘍モデル及び胃腫瘍モデルでは、３つのスケジュール全てにおける治療効果に有意差は認められず、治療の中止後に初めて腫瘍が増悪した。それゆえ、これらのデータは、週に１回の投与レジメンの継続使用が、現時点で臨床的に求められていることを裏付けている。

【0423】

８～１０ｍｇ／ｋｇのそれぞれの治療用量のＩＭＭＵ－１３２を推奨する臨床試験では（Ｓｔａｒｏｄｕｂ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２１：３８７０－７８）、抗体単独がＩＭＭＵ－１３２の効果に寄与し得るかどうかを確認することが重要であった。ヒト異種移植片ヌードマウスモデルを用いた以前の試験には、非コンジュゲートｈＲＳ７ ＩｇＧ単独（反復用量の２５～５０ｍｇ／ｋｇ）が含まれていたが、治療効果のエビデンスは認められなかった（Ｃａｒｄｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １７：３１５７－６９）。しかしながら、マウスを用いた試験では、免疫学的機能を常に予測することは不可能である。ｈＲＳ７のインビトロＡＤＣＣ活性は、Ｔｒｏｐ－２陽性の卵巣癌及び子宮癌において報告されている（Ｒａｊｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｊ Ｅｘｐ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ３０：１０６；Ｂｉｇｎｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｉｎｔ Ｊ Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｃｎａｃｅｒ ２１：１６１３－２１；Ｖａｒｕｇｈｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ ２０５：５６７；Ｖａｒｕｇｈｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｃａｎｃｅｒ １１７：３１６３－７２）。本発明者らは、３種類の異なる細胞株における非コンジュゲートｈＲＳ７のＡＤＣＣ活性を確認したが、ＩＭＭＵ－１３２がそのエフェクター機能の６０～７０％を失っていることが判明した。還元／ＮＥＭブロックＩｇＧが同様にＡＤＣＣ活性を失っていることから、ＣＬ２Ａ－ＳＮ－３８構成要素の結合部はそれ自体、原因ではないと考えられる。

【0424】

抗体はまた、様々なアポトーシスシグナル伝達経路に作用することにより、細胞死を誘導することができる。しかしながら、本発明者らは、多数のアポトーシスシグナル伝達経路における非コンジュゲート抗体の効果を何ら観察しなかった。その代わりに、ＩＭＭＵ－１３２がＳＮ－３８の場合と同様の内因性アポトーシス現象を誘導したことを確認した。初期の現象には、ＪＮＫ１／２のリン酸化に加え、カスパーゼ９、７及び３の活性化をもたらすｐ２１ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１の上方制御が含まれ、最終的には、リン酸化ヒストンＨ２ＡＸ（γＨ２ＡＸ）４１の増量により判定される、ＰＡＲＰ切断及び有意なレベルのｄｓＤＮＡ切断がもたらされる。これらのデータは、ＩＭＭＵ－１３２の主な作用機序がＳＮ－３８と関連していることを示唆している。

【0425】

表面プラズモン共鳴（ＢＩＡＣＯＲＥ）解析では、ＩＭＭＵ－１３２の平均結合レベルが約２倍低いにもかかわらず、ＩＭＭＵ－１３２のヒト新生児受容体（ＦｃＲｎ）への結合性に有意差は検出されなかった。ＦｃＲｎへの結合性がＩｇＧ血清中半減期の長期化と関連しているとされてきたが（Ｊｕｎｇｈａｎｓ ＆ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，１９９６，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３：５５１２－１６）、ＦｃＲｎに対する抗体のインビトロ親和性がインビボクリアランス速度と一致し得ないことから（Ｄａｔｔａ－Ｍａｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８２：１７０９－１７）、この研究結果の総合的な重要性は未知である。腫瘍を有するマウスによる^１１１Ｉｎ－ＤＴＰＡ－ＩＭＭＵ－１３２を用いた以前の実験では、両者の腫瘍への取り込み率がほぼ同等であるにもかかわらず、^１１１Ｉｎ－ＤＴＰＡ－ｈＲＳ７の場合と比較して若干速い速度で、複合体が血清中から消失することが明らかとなった（Ｃａｒｄｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １７：３１５７－６９）。目下の研究において、ＥＬＩＳＡアッセイを使用してＩｇＧ構成要素のクリアランスを更に測定することにより、ＩＭＭＵ－１３２及び還元してＮＥＭブロックしたＩｇＧが非コンジュゲートｈＲＳ７とほぼ同等の速度で消失したことが判明した。このことは、鎖間ジスルフィドへの結合性が抗体を不安定化させないことを示唆している。予想したとおり、ＥＬＩＳＡを使用してインタクト複合体のクリアランスをモニタリングすると（抗ＳＮ－３８抗体を用いて補足し、抗イディオタイプ抗体でプローブ）、そのクリアランス速度は、ＩｇＧ構成要素のみをモニタリングした際よりも速かった。この違いは、約１日間の半減期で複合体からＳＮ－３８が放出されていることを簡潔に反映している。本発明者らはまた、ＥＬＩＳＡを使用して、異なる置換レベルで調製したサシツズマブゴビテカン複合体のクリアランス速度を調査し、それらのクリアランス速度に顕著な差異が認められないことを再度見出した（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ８：２２４９６－５１２）。総合的に言えば、これらのデータは、抗体を緩やかに還元してから鎖間ジスルフィドの一部または全てに部位特異的修飾を施すことが、ＩｇＧの血清中クリアランスに影響を及ぼすとしても最小限の影響となることを示唆しているが、ＩＭＭＵ－１３２の全体的なクリアランス速度は主に、リンカーからＳＮ－３８が放出される速度によって決まる。

【0426】

加えて、大規模な細胞結合試験により、ＩＭＭＵ－１３２、非コンジュゲート抗体またはＮＥＭ修飾抗体の結合性に有意差がないことが実証されたが、このことは、鎖間ジスルフィドへの部位特異的結合が抗体の抗原結合特性を保護していることを示唆している。興味深いことに、オンレート及びオフレートに加えて全体的な親和性をより精度高く測定するＢＩＡＣＯＲＥを使用して解析を行うと、ＩＭＭＵ－１３２には、ｎａｋｅｄ ｈＲＳ７の場合と比較して、Ｔｒｏｐ－２結合に関する算出ＫＤ値に大幅な２倍の改善が認められた。

【0427】

本発明者らは、この改善が、ＳＮ－３８を抗体にコンジュゲートする際に付加された疎水性によるものであり得ると推測している。疎水性残基に加えてタンパク質結合部位の隔離領域の疎水性が、エピトープに対するより強い親和性を付与していることが示された（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １８：１９４－９８；Ｂｅｒｅｚｏｖ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ４４：２５６５－７４；Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０４：８０８０１３）。これらの領域は、タンパク質－タンパク質界面に存在する必要はなく、よりエネルギーの少ない接触残基に囲まれて存在していてもよい（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １３：２９７－３０７）。ＳＮ－３８結合部位はｈＲＳ７の相補性決定領域（ＣＤＲ）内に存在していないが、抗体上のＳＮ－３８がエピトープ周囲の水分子の一部を置換することで、ｎａｋｅｄ ｈＲＳ７の場合と比較してＩＭＭＵ－１３２にみられる結合親和性に無視できない改善をもたらし得ることが予想される。

【0428】

ＡＤＣ開発におけるほとんどの試みは、安定したリンカー及び超毒性薬物の使用に向けられており、前臨床試験は、それら複合体に求められる特定の最適条件を示している（Ｐａｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４，ｍＡｂｓ ６：３４－４５；Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６８：９２８０－９０）。例えば、Ｔ－ＤＭ１を別の安定性に欠ける誘導体、Ｔ－ＳＳＰＤＭ１と比較することにより、インタクトＴ－ＳＳＰ－ＤＭ１が、腫瘍を有さないマウス内のＴ－ＤＭ－１と比較して、約２倍速い速度で消失し（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６８：９２８０－９０；Ｅｒｉｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １１：１１３３－４２）、腫瘍内のＴ－ＤＭ１濃度がＴ－ＳＳＰＤＭ１と比較して１．５倍高くなっていることが明らかとなった。予想外で最も興味深かったことは、標的腫瘍内における遊離活性メイタンシノイド異化代謝産物の量が２種類のＡＤＣ間で極めて類似していることを発見したことであった（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １１：１１３３－４２）。

【0429】

言い換えると、Ｔ－ＳＳＰ－ＤＭ１により、より安定なＴ－ＤＭ１と比較して安定性が低いほどより効率的に薬物を腫瘍に放出するという事実に起因するリンカーの安定性不足を克服することが可能となった。当然のことではあるが、腫瘍内活性薬物異化代謝産物の２種ＡＤＣ間におけるこの同等性は、腫瘍を有する動物においてほぼ同等の抗腫瘍効果をもたらした。最終的には、超毒性薬物及び安定性に欠けるリンカーを使用する際に生じる毒性問題を基準として、Ｔ－ＤＭ１を選択した（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６８：９２８０－９０）。ＳＮ－３８がこれらマイタンシンと比較して少なくとも対数倍低毒性であるため、ＡＤＣから放出されるＳＮ－３８の毒性はより低いことが予想される。しかしながら、血清中に放出されているにもかかわらず、ヒト胃腫瘍異種移植片またはヒト膵臓腫瘍異種移植片内に局在化したＳＮ－３８の量は、２０倍多いＳＮ－３８当量を含むイリノテカン用量を注射された腫瘍を有するマウスの場合と比較して、最大１３６倍多かった（Ｓｈａｒｋｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２１：５１３１－８）。本発明者らはＩＭＭＵ－１３２の開発にあたり、より安定したリンカーを試験してきたが、それらリンカーは、ＩＭＭＵ－１３２と比較して、腫瘍異種移植片モデルにおいて著しく効果が低かった（Ｇｏｖｉｎｄａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １２：９６８－７８）。

【0430】

同様に、ＳＮ－３８をより速やかに放出するリンカー（例えば、約１０時間の血清中半減期）も異種移植片モデルにおいて効果が低く（Ｍｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ５１：６９１６－２６；Ｇｏｖｉｎｄａｎ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ １５：６０５２－６１）、ＳＮ－３８の放出が効果の向上をもたらす最適窓が存在することを示唆している。それゆえ、現在のデータは、ＩＭＭＵ－１３２が、イリノテカンと比較して、より効率的な方法で薬物を腫瘍へと向かわせて放出していることを示している。

【0431】

初期の臨床試験が様々な固形腫瘍における有望で客観的な効果を示しており、重要なことに、イリノテカン治療約と比較して、下痢の発症率を低下させつつ、より良好な安全性プロファイルを示している（Ｓｔａｒｏｄｕｂ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２１：３８７０－７８）。

【0432】

要約すると、ＩＭＭＵ－１３２（サシツズマブゴビテカン）はＡＤＣ開発におけるパラダイムシフトである。ＩＭＭＵ－１３２は、より忍容性の高い、イリノテカンの活性代謝物であるＳＮ－３８の７～８個の分子を抗Ｔｒｏｐ－２抗体に結合するための適度に安定したリンカーを使用している。これらは超毒性ＡＤＣに相対する反直観的な特性と思われるにもかかわらず、非臨床試験では、ＩＭＭＵ－１３２が、有意な効果を示し顕著な毒性を伴わずに、極めて効率的にＴｒｏｐ－２発現腫瘍を標的とすることが実証されている。膵臓癌、胃癌、ＴＮＢＣ、小細胞肺癌及び非小細胞肺癌を含む広範囲の固形腫瘍に対する初期の第Ｉ／ＩＩ相臨床試験では、ＩＭＭＵ－１３２は同様に、これらの患者に管理可能な毒性を示しつつ、ＩｇＧまたはＳＮ－３８のいずれかに対する免疫応答が検出されることなく、何ヶ月もの投薬を行った後であっても、抗腫瘍効果を示した（Ｓｔａｒｏｄｕｂ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２１：３８７０－７８）。このような多種多様な固形腫瘍においてＴｒｏｐ－２の高発現がみられるため、ＩＭＭＵ－１３２を用いた臨床試験は、特に、ほとんどの現行療法手法に耐性を示す進行癌において継続している。

【0433】

実施例１８．第Ｉ／ＩＩ相臨床試験の更なる結果
トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）
上記実施例で説明した第Ｉ／ＩＩ相臨床試験（ＮＣＴ０１６３１５５２）を、１０ｍｇ／ｋｇで治療した５６名のＴＮＢＣ患者を集めて継続している。患者集団はこれまで、ＩＭＭＵ－１３２治療を開始する前に、タキサン治療を含む少なくとも２種類の前治療により広く治療を受けてきた。前治療としては、シクロホスファミド、ドキソルビシン、カルボプラチン、ゲムシタビン、カペシタビン、エリブリン、シスプラチン、アナストロゾール、ビノレルビン、ベバシズマブ及びタモキシフェンが挙げられる。この広い治療暦にもかかわらず、ＴＮＢＣ患者は、ＩＭＭＵ－１３２に対して十分な反応を示し、２名の完全寛解（ＣＲ）が確認され、１３名が部分寛解（ＰＲ）、また２５名が安定（ＳＤ）となり、客観的奏効率は２９％（１５／５２）であった（データは省略）。ＣＲとＰＲとＳＤの症例を足し合わせると、ＴＮＢＣの治療は、ＩＭＭＵ－１３２治療患者において７１％の好ましい奏効率となった（データは省略）。多数の前治療暦を有するこのＴＮＢＣ患者集団の平均無増悪期間は、これまでのところ９．４ヶ月間（２．９～１４．２ヶ月間の範囲）であった。しかしながら、試験における患者の７２％はなおも治療継続中であった。

【0434】

転移性ＮＳＣＬＣ
臨床試験はまた、転移性非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有する患者で継続中であり、これまでのところ２９名の評価可能な患者を集め、８ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのＩＭＭＵ－１３２で治療を行った。ＲＥＳＩＳＴ １．１基準による最良効果を判定した（データは省略）。２９名の患者のうち、８名がＰＲで１３名がＳＤであった。ＮＳＣＬＣ患者の無増悪期間は、ＮＳＣＬＣ患者の２１／３３（６４％）がＰＲまたはＳＤであることを示した（データは省略）。平均無増悪期間は９／４ヶ月間（１．８～１５．５＋ヶ月間の範囲）であり、患者の４７％はなおも治療を受けている。８ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのＩＭＭＵ－１３２で治療したＮＳＣＬＣ患者の無増悪生存期間を測定した（データは省略）。平均ＰＦＳは、８ｍｇ／ｋｇで３．４ヶ月間であり、１０ｍｇ／ｋｇで３．８ヶ月間であった。しかしながら、試験はなおも継続中であり、平均無増悪生存期間の数字は改善する可能性がある。

【0435】

転移性ＳＣＬＣ
転移性ＳＣＬＣ患者において同等の結果が認められた（データは省略）。無増悪期間（データは省略）は、平均４．９ヶ月間（１．８～１５．７＋ヶ月間の範囲）を示し、７名の患者はなおもＩＭＭＵ－１３２による治療を受けている。無増悪生存期間（データは省略）は、８ｍｇ／ｋｇで２．０ヶ月間の平均ＰＦＳ、１０ｍｇ／ｋｇで３．６ヶ月間の平均ＰＦＳを示した。平均ＯＳは、８ｍｇ／ｋｇで８．１ヶ月間であり、これまでのところ１０ｍｇ／ｋｇでは測定できていない。

【0436】

尿路上皮癌
８ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのＩＭＭＵ－１３２で治療した尿路上皮癌患者で同様の結果が得られた。１１名の評価可能な患者の最良効果データは、６名のＰＲ及び２名のＳＤを示した（データは省略）。無増悪期間（データは省略）は、平均８．１ヶ月間（３．６～９．７＋ヶ月間の範囲）を示した。

【0437】

要約すると、継続中の第Ｉ／ＩＩ相臨床試験は、列挙した用量でＡＤＣを投与すると、少なくともＴＮＢＣ、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ及び尿路上皮癌に対するＩＭＭＵ－１３２の優れた効果を示している。これら多数の前治療を施され耐性を示す転移性がんに対する優れた治療効果は、臨床使用を妨げ得る重篤な毒性を誘導することなく発揮された。ＩＭＭＵ－１３２は、多種多様な固形がんを有し多数の前治療暦（平均２～５つの前治療）のある患者において許容可能な安全性プロファイル示した。グレード３またはそれ以上の有害反応を示す好中球減少症のみが、患者集団の２０％超で発症した。試験は更に、干渉する宿主の抗ＩＭＭＵ－１３２抗体を誘発することなく、反復用量のＩＭＭＵ－１３２を治療量でヒト患者に投与可能であることを実証している。これらの結果は、ヒト患者における多種多様なＴｒｏｐ－２陽性がんを治療するためのＩＭＭＵ－１３２の安全性及び有効性を実証している。

【0438】

上記の記載内容から、当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に見極めることができ、また、本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく本発明の様々な変更及び修正を行い、過度な実験をすることなく様々な用法及び条件に適合させることができる。本明細書に引用した全ての特許、特許出願及び刊行物は、参照として本明細書に組み込まれる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

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