特許 7380670 ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物及びＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物を用いた神経病症治療

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-11-07

(45)【発行日】2023-11-15

(54)【発明の名称】ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物及びＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物を用いた神経病症治療

(51)【国際特許分類】

   A61K 48/00 20060101AFI20231108BHJP

   A61K 38/18 20060101ALI20231108BHJP

   A61K 38/30 20060101ALI20231108BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20231108BHJP

   C07K 14/62 20060101ALI20231108BHJP

   C12N 15/17 20060101ALI20231108BHJP

   C12N 15/85 20060101ALI20231108BHJP

   C12N 5/10 20060101ALN20231108BHJP

   C12P 21/02 20060101ALN20231108BHJP

【ＦＩ】

A61K48/00

A61K38/18 ZNA

A61K38/30

A61P25/00

C07K14/62

C12N15/17

C12N15/85 Z

C12N5/10

C12P21/02 C

【請求項の数】 2

(21)【出願番号】P 2021502742

(86)(22)【出願日】2019-07-16

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-01-04

(86)【国際出願番号】 IB2019001399

(87)【国際公開番号】W WO2020079489

(87)【国際公開日】2020-04-23

【審査請求日】2021-07-05

(31)【優先権主張番号】62/699,667

(32)【優先日】2018-07-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】518069438

【氏名又は名称】ヘリックスミス カンパニー， リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100084995

【弁理士】

【氏名又は名称】加藤 和詳

(72)【発明者】

【氏名】イ、チュンフン

(72)【発明者】

【氏名】イ、ネヨン

(72)【発明者】

【氏名】コ、キョン、リャン

【審査官】新留 素子

(56)【参考文献】

【文献】特表２００３－５２０７８４（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１４／０２９６１４２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１６／０３９１６３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１５／０３５３９３７（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特表２０１７－５３２０６８（ＪＰ，Ａ）

【文献】The FASEB Journal，2018年04月16日，Vol.32, No.9，pp.5119-5131

【文献】Annals of Clinical and Translational Neurology，2015年，Vol.2, No.5，pp.465-478

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ａ６１Ｋ ３８／３０

Ａ６１Ｋ ３８／１８

Ａ６１Ｐ ２５／００

Ｃ１２Ｎ １５／１７

Ｃ１２Ｎ １５／８５

Ｃ０７Ｋ １４／６２

Ｃ１２Ｐ ２１／０２

Ｃ１２Ｎ ５／１０

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１３のポリヌクレオチド；及び
（ｉ）配列番号１０のポリヌクレオチド、又は（ｉｉ）配列番号１５のポリヌクレオチド及び配列番号１７のポリヌクレオチド
を含む、神経病症を治療するための薬学組成物。

【請求項2】

配列番号３３のポリヌクレオチド、及び配列番号１０又は配列番号３９のポリヌクレオチドを含む、神経病症を治療するための薬学組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

［関連出願の交差参照］
本出願は、２０１８年７月１７日に出願された米国仮出願番号６２／６９９，６６７の優先権を主張し、これは、参照することによってその全体として本明細書に組み込まれる。

【0002】

［配列目録］
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを通じて提出された配列目録を含み、これは、参照するによってその全体として組み込まれる。前記ＡＳＣＩＩコピー本は２０１９年７月１日に生成され、３７５３６ＵＳ＿ＣＲＦ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと命名されており、そのサイズは１３０，１６３バイトである。

【背景技術】

【0003】

神経病症は、神経損傷に由来する慢性の病理的状態である。神経病症は、糖尿の共通的結果であり、糖尿患者における神経病症を、特に、糖尿性神経病症と呼ぶ。神経病症はまた、感染（例えば、ヘルペス、感染後に起きる関連した神経病症は、帯状疱疹後神経痛と知られている；ＨＩＶ／ＡＩＤＳ；ライム病：ハンヘン病；梅毒；及び帯状疱疹）；自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ、全身性ループス、及びギラン－バレー症候群 ）；遺伝子又は遺伝性疾患（例えば、フリードライヒ運動失調症（Ｆｒｉｅｄｒｅｉｃｈ’ｓ ａｔａｘｉａ）及びシャルコ－マリー－トゥース病（Ｃｈａｒｃｏｔ－Ｍａｒｉｅ－Ｔｏｏｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ））；アミロイドーシス；尿毒症；毒素、毒薬、又は 薬物への曝露；外傷；又は傷害によって生じた神経損傷によっても起こることがある。特定の場合、前記原因は未知である場合もあり、この場合、その神経病症を特発性神経病症と呼ぶ。

【0004】

原因にかかわらず、神経病症は特徴的症状と関連し、それは部分的に、疼痛（神経性疼痛）、他の感覚欠損（例えば、感覚の部分的又は全体欠損を含む無感覚症；及び無感覚（ｎｕｍｂｎｅｓｓ）、しびれ（ｔｉｎｇｌｉｎｇ）などを始めとする感覚異常）、運動欠陥（例えば、無力、反射消失（ｌｏｓｓ ｏｆ ｒｅｆｌｅｘｅｓ）、筋肉消失（ｌｏｓｓ ｏｆ ｍｕｓｃｌｅ ｍａｓｓ）、痙攣、機敏さの鈍化（ｌｏｓｓ ｏｆ ｄｅｘｔｅｒｉｔｙ）など）、及び自律神経失調症（例えば、吐き気、嘔吐、勃起不全、めまい、便泌、下痢など）のように、神経損傷の解剖学的位置に依存する（例えば、末梢神経病症、頭蓋骨神経病症、自律神経病症、局所（ｆｏｃａｌ）神経病症）。

【0005】

神経病症は、日常的には、関連症状を対処する方式で治療し、病因が知られている場合は、神経病症の根本的原因を治療することによって治療する。例えば、疼痛薬物、又は糖尿病、自己免疫疾患、感染若しくはビタミン不足に対しては医学的治療を用いてきた。しかし、これらの方法は、神経損傷自体を治療するものではない。

【0006】

したがって、神経病症と関連した神経損傷を防止して修復できる効果的な治療方法が必要である。

【0007】

様々な成長因子が神経病症を治療する可能な製剤として提示され、ケスラー（Ｋｅｓｓｌｅｒ）らは、近年、糖尿性末梢神経病症において肝細胞成長因子（ＨＧＦ）の成功的な二重盲検、偽薬調節第２相ヒト臨床を報告した。Ｋｅｓｓｌｅｒ等、Ａｎｎａｌｓ Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ２（５）：４６５－４７８（２０１５）。また、米国特許第９，９６３，４９３号を参照するが、これは、参照によってその全体がここに組み込まれる。

【0008】

ＨＧＦ発現ＤＮＡ作製物によって糖尿性末梢神経病症を治療するのに臨床的に成功したにもかかわらず、神経病症を引き起こす広範な原因及び広範な神経病症臨床症状があるため、ＨＧＦと他の治療剤を用いる治療法を始めとして更なる治療法が必要である。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明は、ヒトＩＧＦ－１異型体を発現できるＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物及びヒトＨＧＦ異型体を発現できるＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物を組み合わせて投与すれば、神経病症と関連した症状を治療するのに効果的であるという新しい発見に基づく。前記２つのＤＮＡ作製物の組合せ物の治療効果は、ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物自体の治療効果よりも大きいということが証明された（例えば、ＶＭ２０２又はｐＣＫ－ＨＧＦ７２８）。本発明はまた、併用療法に使用可能な、ＩＧＦ－１異型体又はＨＧＦ異型体を暗号化する様々なＤＮＡ作製物を提供する。また、生体内で、神経病症と関連した症状を治療するのに効果的であると証明された、ＤＮＡ作製物を投与する方法が提供される。

【0010】

したがって、本発明は、ＩＧＦ－１及びＨＧＦ異型体を用いて神経病症を治療する新規な併用療法を提供する。

【0011】

詳細には、一観点において、本発明は、神経病症を治療する方法であって、（１）神経病症を持つ対象体にヒトＩＧＦ－１異型体を発現可能な第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物の治療的有効量を投与する段階；及び（２）前記対象体にヒトＨＧＦ異型体を発現可能な第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物の治療的有効量を投与する段階を含む方法を提供する。

【0012】

一具体例において、前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号１４のポリペプチドを含むクラス（Ｃｌａｓｓ）Ｉ ＩＧＦ－１Ｅａタンパク質又は配列番号１６のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｃタンパク質を発現させることができる。一具体例において、前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号１８のポリペプチドを含むクラスＩＩ ＩＧＦ－１Ｅａタンパク質及び配列番号２０のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｂタンパク質の両方を全て発現させることができるわけではない。

【0013】

一具体例において、前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号１５のポリヌクレオチドを含む。一具体例において、前記方法は、前記対象体に第２ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階をさらに含み、前記第２ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号１７のポリヌクレオチドを含む。

【0014】

一具体例において、前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号１７のポリヌクレオチドを含む。一具体例において、前記方法は、前記対象体に第２ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階をさらに含み、前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号１５のポリヌクレオチドを含む。

【0015】

一具体例において、前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階及び前記第２ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階は、同時に行われる。一具体例において、前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階及び前記第２ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階は、順次に行われる。

【0016】

一具体例において、前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、１つより多いヒトＩＧＦ－１異型体を暗号化する。一具体例において、１つより多いヒトＩＧＦ－１異型体は、配列番号１４のポリペプチド及び配列番号１６のポリペプチドを含む。

【0017】

一具体例において、前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は：配列番号１の第１ＩＧＦポリヌクレオチド（エクソン１、３、及び４）又はその縮退物；配列番号２の第２ＩＧＦポリヌクレオチド（イントロン４）又はその断片物；配列番号３の第３ＩＧＦポリヌクレオチド（エクソン５及び６－１）又はその縮退物；配列番号４の第４ＩＧＦポリヌクレオチド（イントロン５）又はその断片物；及び配列番号５の第５ＩＧＦポリヌクレオチド（エクソン６－２）又はその縮退物を含み、前記第１ポリヌクレオチド、前記第２ポリヌクレオチド、前記第３ポリヌクレオチド、前記第４ポリヌクレオチド、及び前記第５ポリヌクレオチドは、順次に５’から３’の順に連結される。

【0018】

一具体例において、前記第２ＩＧＦポリヌクレオチドは、配列番号６のポリヌクレオチドである。一具体例において、前記第２ＩＧＦポリヌクレオチドは、配列番号７のポリヌクレオチドである。一具体例において、前記第４ＩＧＦポリヌクレオチドは、配列番号８のポリヌクレオチドである。

【0019】

一具体例において、前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、プラスミドベクターを含む。一具体例において、前記プラスミドベクターは、ｐＣＫである。一具体例において、前記プラスミドベクターは、ｐＴｘである。

【0020】

一具体例において、前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号１０のポリヌクレオチドを含む。一具体例において、前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号９のポリヌクレオチドを含む。

【0021】

一具体例において、前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物及び前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、対象体において疼痛を減少させるのに十分な量で投与される。一具体例において、前記対象体は、糖尿性神経病症を有する。

【0022】

一具体例において、前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物及び前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、複数の筋肉内注射で投与される。

【0023】

一具体例において、前記ヒトＨＧＦ異型体は、配列番号１１のｆｌＨＧＦ又は配列番号１２のｄＨＧＦである。

【0024】

一具体例において、前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、１つより多いヒトＨＧＦ異型体を暗号化する。一具体例において、前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、２つのヒトＨＧＦ異型体を暗号化し、前記２つのヒトＨＧＦ異型体は、配列番号１１のｆｌＨＧＦ及び配列番号１２のｄＨＧＦである。

【0025】

一具体例において、前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、プラスミドベクターを含み、選択的に、前記プラスミドベクターは、ｐＣＫベクター又はｐＴｘベクターである。

【0026】

一具体例において、前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は：配列番号２２のエクソン１－４の第１ＨＧＦポリヌクレオチド又はその縮退物；配列番号２５のイントロン４の第２ＨＧＦポリヌクレオチド又はその機能的断片物；及び配列番号２３のエクソン５－１８の第３ＨＧＦポリヌクレオチド又はその縮退物を含み、前記第２ＨＧＦポリヌクレオチドは、前記第１ＨＧＦポリヌクレオチド及び前記第３ＨＧＦポリヌクレオチドの間に位置し、及び前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、２つのヒトＨＧＦ異型体を暗号化する。

【0027】

一具体例において、前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号１３のポリヌクレオチドを含む。

【0028】

一具体例において、前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物及び前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、併用投与される。一具体例において、前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物及び前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、筋肉内注射で併用投与される。

【0029】

一具体例において、前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階及び前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階は、別々に行われる。一具体例において、前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階及び前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階は、少なくとも３週の間隔で行われる。

【0030】

一具体例において、前記方法は、配列番号１１のｆｌＨＧＦ及び配列番号１２のｄＨＧＦから選ばれるヒトＨＧＦ異型体を発現可能な第２ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物を前記対象体に投与する段階をさらに含む。

【0031】

一具体例において、前記方法は、神経病症を有する対象体に、配列番号１３のポリヌクレオチドを含むＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階；及び前記対象体に、配列番号１０のポリヌクレオチド又は配列番号９のポリヌクレオチドを含むＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階を含み、前記ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階及び前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階は、少なくとも３週の間隔で行われる。

【0032】

一具体例において、前記方法は、神経病症を有する対象体に、配列番号３３のポリヌクレオチドを含むＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階；及び前記対象体に、配列番号１０のポリヌクレオチド又は配列番号９のポリヌクレオチドを含むＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階を含み、前記ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階及び前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階は、少なくとも３週の間隔で行われる。

【0033】

一具体例において、前記方法は、神経病症を有する対象体に、配列番号１３のポリヌクレオチドを含むＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階；及び前記対象体に、配列番号１５のポリヌクレオチドを暗号化する第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物及び配列番号１７のポリヌクレオチドを暗号化する第２ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階を含み、前記ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階及び前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物及び前記第２ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階は、少なくとも３週の間隔で行われる。

【0034】

他の観点において、本発明は：少なくとも１つのヒトＩＧＦ－１異型体を発現可能なＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物；少なくとも１つのヒトＨＧＦ異型体を発現可能なＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物、及び薬学的に許容可能な賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。

【0035】

一具体例において、前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号１４のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅａタンパク質又は配列番号１６のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｃタンパク質を暗号化する。

【0036】

一具体例において、前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、１つより多いヒトＩＧＦ－１異型体を暗号化する。一具体例において、前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、２つのヒトＩＧＦ－１異型体を暗号化し、前記２つのヒトＩＧＦ－１異型体は、配列番号１４のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅａタンパク質及び配列番号１６のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｃタンパク質である。

【0037】

一具体例において、前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は：配列番号１の第１ＩＧＦポリヌクレオチド（エクソン１、３、及び４）又はその縮退物；配列番号２の第２ＩＧＦポリヌクレオチド（イントロン４）又はその断片物；配列番号３の第３ＩＧＦポリヌクレオチド（エクソン５及び６－１）又はその縮退物；配列番号４の第４ＩＧＦポリヌクレオチド（イントロン５）又はその断片物；及び配列番号５の第５ＩＧＦポリヌクレオチド（エクソン６－２）又はその縮退物を含み、前記第１ポリヌクレオチド、前記第２ポリヌクレオチド、前記第３ポリヌクレオチド、前記第４ポリヌクレオチド、及び前記第５ポリヌクレオチドは順次に、５’から３’の方向に連結されている。

【0038】

一具体例において、前記第２ＩＧＦポリヌクレオチドは、配列番号６のポリヌクレオチドである。一具体例において、前記第２ＩＧＦポリヌクレオチドは、配列番号７のポリヌクレオチドである。一具体例において、前記第４ＩＧＦポリヌクレオチドは、配列番号８のポリヌクレオチドである。

【0039】

一具体例において、前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、プラスミドベクターをさらに含む。一具体例において、前記プラスミドベクターは、ｐＣＫである。一具体例において、前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ６及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０からなる群から選ばれる。一具体例において、前記プラスミドベクターは、ｐＴｘである。一具体例において、前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、ｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ６及びｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ１０からなる群から選ばれる。

【0040】

一具体例において、前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号９のポリヌクレオチドを含む。一具体例において、前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号１０のポリヌクレオチドを含む。

【0041】

一具体例において、前記少なくとも１つのヒトＨＧＦ異型体は、配列番号１１のｆｌＨＧＦ又は配列番号１２のｄＨＧＦである。一具体例において、前記ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号１１のｆｌＨＧＦ及び配列番号１２のｄＨＧＦの両方を発現させることができる。

【0042】

一具体例において、前記ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は：配列番号２２の第１ＨＧＦポリヌクレオチド（エクソン１－４）又はその縮退物；配列番号２５の第２ＨＧＦポリヌクレオチド（イントロン４）又はその機能的断片物；及び配列番号２３の第３ＨＧＦポリヌクレオチド（エクソン５－１８）又はその縮退物を含み、前記第２ＨＧＦポリヌクレオチドは、前記第１ＨＧＦポリヌクレオチドと前記第３ＨＧＦポリヌクレオチドの間に位置し、及び前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、２つのヒトＨＧＦ異型体を暗号化する。

【0043】

一具体例において、前記ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号２６－３２及び１３のうち任意のポリヌクレオチドを含む。一具体例において、前記ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号１３のポリヌクレオチド含む。

【0044】

一具体例において、前記薬学組成物は、配列番号１３のポリヌクレオチド；及び配列番号９のポリヌクレオチドを含む。一具体例において、前記薬学組成物は配列番号１３のポリヌクレオチド；及び配列番号１０のポリヌクレオチドを含む。一具体例において、前記薬学組成物は、配列番号１３のポリヌクレオチド；配列番号１５のポリヌクレオチド又は配列番号１７のポリヌクレオチドを含む。一具体例において、前記薬学組成物は、配列番号１３のポリヌクレオチド；配列番号１５のポリヌクレオチド及び配列番号１７のポリヌクレオチドを含む。

【0045】

一具体例において、前記薬学組成物は、配列番号３３のポリヌクレオチド及び配列番号９、配列番号１０、配列番号１５、又は配列番号１７のポリヌクレオチドを含む。

【0046】

他の観点において、本発明は、神経病症を治療するキットを提供し、前記キットは：少なくとも１つのヒトＩＧＦ－１異型体を発現可能なＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物、及び第１薬学的に許容可能な賦形剤を含む第１薬学組成物；及び少なくとも１つのヒトＨＧＦ異型体を発現可能なＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物、及び第２薬学的に許容可能な賦形剤を含む第２薬学組成物を含む。

【0047】

一具体例において、前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号１４のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅａタンパク質又は配列番号１６のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｃタンパク質を暗号化する。一具体例において、前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、１つより多いヒトＩＧＦ－１異型体を含む。一具体例において、前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、２つのヒトＩＧＦ－１異型体を含み、前記２つのヒトＩＧＦ－１異型体は、配列番号１４のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅａタンパク質及び配列番号１６のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｃタンパク質である。

【0048】

一具体例において、前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は：配列番号１の第１ＩＧＦポリヌクレオチド（エクソン１、３、４）又はその縮退物；配列番号２の第２ＩＧＦポリヌクレオチド（イントロン４）又はその断片物；配列番号３の第３ＩＧＦポリヌクレオチド（エクソン５及び６－１）又はその縮退物；配列番号４の第４ＩＧＦポリヌクレオチド（イントロン５）又はその断片物；及び配列番号５の第５ＩＧＦポリヌクレオチド（エクソン６－２）又はその縮退物を含み、前記第１ポリヌクレオチド、前記第２ポリヌクレオチド、前記第３ポリヌクレオチド、前記第４ポリヌクレオチド、及び前記第５ポリヌクレオチドは順次に、５’から３’の順に連結されている。

【0049】

一具体例において、前記第２ＩＧＦポリヌクレオチドは、配列番号６のポリヌクレオチドである。一具体例において、前記第２ＩＧＦポリヌクレオチドは、配列番号７のポリヌクレオチドである。一具体例において、前記第４ＩＧＦポリヌクレオチドは、配列番号８のポリヌクレオチドである。

【0050】

一具体例において、前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、プラスミドベクターをさらに含む。一具体例において、前記プラスミドベクターは、ｐＣＫである。一具体例において、前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ６又はｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０を含む。一具体例において、前記プラスミドベクターは、ｐＴｘである。一具体例において、前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、ｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ６又はｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ１０を含む。

【0051】

一具体例において、前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号９のポリヌクレオチドを含む。一具体例において、前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号１０のポリヌクレオチドを含む。

【0052】

一具体例において、前記少なくとも１つのヒトＨＧＦ異型体は、配列番号１１のｆｌＨＧＦ又は配列番号１２のｄＨＧＦである。一具体例において、前記ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号１１のｆｌＨＧＦ及び配列番号１２のｄＨＧＦの両方を発現させることができる。

【0053】

一具体例において、前記ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は：配列番号２２の第１ＨＧＦポリヌクレオチド（エクソン１－４）又はその縮退物；配列番号２５の第２ＨＧＦポリヌクレオチド（イントロン４）又はその機能的断片物；及び配列番号２３の第３ＨＧＦポリヌクレオチド（エクソン５－１８）又はその縮退物を含み、前記第２ＨＧＦポリヌクレオチドは、前記第１ＨＧＦポリヌクレオチドと前記第３ＨＧＦポリヌクレオチドの間に位置し、及び前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、２つのヒトＨＧＦ異型体を暗号化する。

【0054】

一具体例において、前記ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号２６－３２及び１３のうち任意のポリヌクレオチドを含む。一具体例において、前記ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号１３のポリヌクレオチドを含む。

【0055】

一具体例において、前記第１薬学組成物は、配列番号９のポリヌクレオチドを含み；及び前記第２薬学組成物は、配列番号１３のポリヌクレオチドを含む。

【0056】

一具体例において、前記第１薬学組成物は、配列番号１０のポリヌクレオチドを含み；及び前記第２薬学組成物は、配列番号１３のポリヌクレオチドを含む。

【0057】

一具体例において、前記第１薬学組成物は、配列番号１５のポリヌクレオチド及び配列番号１７のポリヌクレオチドを含み；及び前記第２薬学組成物は、配列番号１３のポリヌクレオチドを含む。

【0058】

一具体例において、前記第１薬学組成物は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１５、又は配列番号１７のポリヌクレオチドを含み、及び前記第２薬学組成物は、配列番号３３のポリヌクレオチドを含む。

【0059】

他の観点において、本開示は、神経病症を有する対象体に、前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物の治療的有効量を投与する段階、及び前記対象体に、ヒトＨＧＦ異型体を発現可能な第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物の治療的有効量を投与する段階を含む、神経病症を治療する医学的方法に用いるための、ヒトＩＧＦ－１異型体を発現可能な第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を提供する。

【0060】

一具体例において、前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号１４のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅａタンパク質又は配列番号１６のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｃタンパク質を発現させることができる。一具体例において、前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号１８のポリペプチドを含むクラスＩＩ ＩＧＦ－１Ｅａタンパク質及び配列番号２０のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｂタンパク質の両方を全て発現させることができるわけではない。

【0061】

一具体例において、前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号１５のポリヌクレオチドを含む。一具体例において、前記医学的方法は、前記対象体に第２ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する方法をさらに含み、前記第２ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号１７のポリヌクレオチドを含む。

【0062】

一具体例において、前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号１７のポリヌクレオチドを含む。一具体例において、前記医学的方法は、前記対象体に第２ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する方法をさらに含み、前記第２ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号１５のポリヌクレオチドを含む。

【0063】

一具体例において、前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階及び前記第２ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階は、同時に行われる。一具体例において、前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階及び前記第２ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階は、順次に行われる。

【0064】

一具体例において、前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、１つより多いヒトＩＧＦ－１異型体を暗号化する。一具体例において、前記１つより多いヒトＩＧＦ－１異型体は、配列番号１４のポリペプチド及び配列番号１６のポリペプチドを含む。

【0065】

一具体例において、前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は：配列番号１の第１ＩＧＦポリヌクレオチド（エクソン１、３、４）又はその縮退物；配列番号２の第２ＩＧＦポリヌクレオチド（イントロン４）又はその断片物；配列番号３の第３ＩＧＦポリヌクレオチド（エクソン５及び６－１）又はその縮退物；配列番号４の第４ＩＧＦポリヌクレオチド（イントロン５）又はその断片物；及び配列番号５の第５ＩＧＦポリヌクレオチド（エクソン６－２）又はその縮退物を含み、前記第１ポリヌクレオチド、前記第２ポリヌクレオチド、前記第３ポリヌクレオチド、前記第４ポリヌクレオチド、及び前記第５ポリヌクレオチドは順次に、５’から３’の順に連結されている。

【0066】

一具体例において、前記第２ＩＧＦポリヌクレオチドは、配列番号６のポリヌクレオチドである。一具体例において、前記第２ＩＧＦポリヌクレオチドは、配列番号７のポリヌクレオチドである。一具体例において、前記第４ＩＧＦポリヌクレオチドは、配列番号８のポリヌクレオチドである。

【0067】

一具体例において、前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、プラスミドベクターを含む。一具体例において、前記プラスミドベクターは、ｐＣＫである。一具体例において、前記プラスミドベクターは、ｐＴｘである。

【0068】

一具体例において、前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号１０のポリヌクレオチドを含む。一具体例において、前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号９のポリヌクレオチドを含む。

【0069】

一具体例において、前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物及び前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、前記対象体において疼痛を減少させるのに十分な量で投与される。一具体例において、前記対象体は、糖尿性神経病症を有する。一具体例において、前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物及び前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、多重の筋肉内注射で投与される。

【0070】

一具体例において、前記ヒトＨＧＦ異型体は、配列番号１１のｆｌＨＧＦ又は配列番号１２のｄＨＧＦである。一具体例において、前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、１つより多いヒトＨＧＦ異型体を暗号化する。一具体例において、前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、２つのヒトＨＧＦ異型体を暗号化し、前記２つのヒトＨＧＦ異型体は、配列番号１１のｆｌＨＧＦ及び配列番号１２のｄＨＧＦである。

【0071】

一具体例において、前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、プラスミドベクターを含み、選択的に、前記プラスミドベクターは、ｐＣＫベクター又はｐＴｘベクターである。一具体例において、前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は：配列番号２２の第１ＨＧＦポリヌクレオチド（エクソン１－４）又はその縮退物；配列番号２５の第２ＨＧＦポリヌクレオチド（イントロン４）又はその機能的断片物；及び配列番号２３の第３ＨＧＦポリヌクレオチド（エクソン５－１８）又はその縮退物を含み、前記第２ＨＧＦポリヌクレオチドは、前記第１ＨＧＦポリヌクレオチド及び前記第３ＨＧＦポリヌクレオチドの間に位置し、及び前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、２つのヒトＨＧＦ異型体を暗号化する。

【0072】

一具体例において、前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号１３のポリヌクレオチドを含む。

【0073】

一具体例において、前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物及び前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、併用投与される。一具体例において、前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物及び前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、筋肉内注射で投与される。一具体例において、前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階及び前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階は、別々に行われる。一具体例において、前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階及び前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階は、少なくとも３週の間隔で行われる。

【0074】

一具体例において、前記医学的方法は、前記対象体に、配列番号１１のｆｌＨＧＦ及び配列番号１２のｄＨＧＦから選ばれるヒトＨＧＦ異型体を発現可能な第２ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階をさらに含む。

【0075】

他の観点において、本開示は、神経病症を有する対象体に、前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物の治療的有効量を投与する段階、及び前記対象体に、ヒトＩＧＦ－１異型体を発現可能なＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物の治療的有効量を投与する段階を含む、神経病症を治療する方法に用いるための、ヒトＨＧＦ異型体を発現可能な第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物をさらに提供する。

【図面の簡単な説明】

【0076】

【図1】転写開始部位及び選択的スプライシング部位を含むヒトＩＧＦ－１遺伝子を図式的に示す。前記ＩＧＦ－１遺伝子から自然的に生成されたＩＧＦ－１異型体は、クラスＩ Ｅｃ（異型体＃１）；クラスＩＩ Ｅａ（異型体＃２）；クラスＩ Ｅｂ（異型体＃３）；及びクラスＩ Ｅａ（異型体＃４）を含む。

【図2A】ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物（ＶＭ２０２）及び単一ＩＧＦ－１異型体を暗号化するＤＮＡ作製物を慢性収縮性損傷（ｃｈｒｏｎｉｃ ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ（ＣＣＩ））モデルに同時に投与する治療効能を試験する実験方式を概括的に示す。

【図2B】図２Ａに説明の実験において、ＣＣＩマウスから又はシャムマウスから測定された足引っ込みの頻度（％）を示すグラフである。前記ＣＣＩマウスに、ＤＮＡ作製物－（ｉ）ｐＣＫベクター（“ｐＣＫ”）、（ｉｉ）ＶＭ２０２（“ＶＭ２０２”）、又は（ｉｉｉ）ＶＭ２０２プラス（＋）ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物－ＶＭ２０２及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃１（“１”）、ＶＭ２０２及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃２（“２”）、ＶＭ２０２及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃３（“３”）、又はＶＭ２０２及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃４（“４”）を注射した。

【図3A】慢性収縮性損傷（ＣＣＩ）モデルにおいて、ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物（ＶＭ２０２）及び単一ＩＧＦ－１異型体を暗号化する１つ又は２つのＤＮＡ作製物の同時投与に対する治療効能を試験する実験方式を概括的に示す。

【図3B】図３Ａに説明の実験において、ＣＣＩマウスから又はシャムマウスから測定された足引っ込みの頻度（％）を示すグラフである。前記ＣＣＩマウスにＤＮＡ作製物－（ｉ）ｐＣＫベクター（“ｐＣＫ”）、（ｉｉ）ＶＭ２０２（“ＶＭ２０２”）、又は（ｉｉｉ）ＶＭ２０２及びＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物－ＶＭ２０２及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃ｌ（“１”）、ＶＭ２０２及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃４（“４”）、又はＶＭ２０２、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃ｌ及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃４（“１＋４”）を注射した。

【図4A】慢性収縮性損傷（ＣＣＩ）モデルにおいて、ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物（ＶＭ２０２）及び２つのＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃ｌ及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃４の順次投与に対する治療効能を試験する実験方式を概括的に示す。

【図4B】図４Ａに説明の実験において、ＣＣＩマウスから測定された足引っ込みの頻度（％）を示すグラフである。前記ＣＣＩマウスに１つ以上のＤＮＡ作製物－（ｉ）第１注射でｐＣＫベクター及び第２注射でｐＣＫベクター（“ｐＣＫ”）、（ｉｉ）第１注射でｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃ｌ及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃４並びに第２注射でｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃ｌ及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃４（“ＩＧＦ－１－＞ＩＧＦ－１”）、（ｉｉｉ）第１注射でＶＭ２０２及び第２注射でｐＣＫベクター（“ＶＭ２０２－＞ｐＣＫ”）、（ｉｖ）第１注射でｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃ｌ及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃４並びに第２注射でｐＣＫベクター（“ＩＧＦ－１－＞ｐＣＫ”）、（ｖ）第１注射でｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃ｌ及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃４並びに第２注射でＶＭ２０２（“ＩＧＦ－１－＞ＶＭ２０２”）、（ｖｉ）第１注射でＶＭ２０２及び第２注射でＶＭ２０２（“ＶＭ２０２－＞ＶＭ２０２”）、又は（ｖｉｉ）第１注射でＶＭ２０２並びに第２注射でｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃ｌ及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃４（“ＶＭ２０２－＞ＩＧＦ－１異型体”）を２回注射した。

【図5A】様々なＤＮＡ作製物からＩＧＦ－１異型体の生体内発現を評価するために実施例３に用いられた実験方式を概括的に示す。

【図5B】下記を暗号化するＤＮＡ作製物を注射した後に発現した総ヒトＩＧＦ－１異型体の量を測定したＥＬＩＳＡの結果を示す：（ベクター単独、“ｐＣＫ”）；ｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃ｌ（“１”）；ｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃４（“４”）；ｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃１及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃４（“１＋４”）；及び二重発現作製物ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ６（“Ｘ６”）及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０（“Ｘ１０”）。

【図6A】ＩＧＦ－１異型体＃１（クラスＩ Ｅｃ異型体）及び＃４（クラスＩ Ｅａ異型体）の発現を区別するためにＲＴ－ＰＣＲにおいて用いられた順方向（“Ｆ”）及び逆方向（“Ｒ”）プライマーの位置を示す。

【図6B】ＲＴ－ＰＣＲ生成物のアガロースゲル電気泳動を示すものであり、二重発現作製物ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ６及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０から異型体＃１及び＃４の発現を示す。ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ６及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０の両方とも、両タンパク質の発現を高レベルで誘導した。

【図7A】２９３Ｔ細胞においてＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物からタンパク質発現を試験管内で評価する実施例３に用いられた方式を概括的に説明する。

【図7B】（ｉ）ｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃１（“１”）、（ｉｉ）ｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃４（“４”）、（ｉｉｉ）２つの単一発現作製物、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃１及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃４（“１＋４”）、（ｉｖ）二重発現作製物ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ６（“Ｘ６”）、又は（ｖ）二重発現作製物ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０（“Ｘ１０”）を試験管内形質感染させた後、ＩＧＦ－１異型体＃１及び／又は＃４の発現を証明するウェスタンブロッティング結果を示す。

【図8A】ＣＣＩ動物モデルにおいて機械的異質痛を減少させるとき、ＨＧＦ－暗号化作製物、ＶＭ２０２、及び様々なＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物の同時投与に対する効能を試験するために実施例４に用いられた実験方式を概括的に示す。

【図8B】図８Ａに説明の実験において、シャムマウス又はＣＣＩマウスから測定された足引っ込みの頻度を示すグラフである。前記ＣＣＩマウスに１つ以上のＤＮＡ作製物－（ｉ）ｐＣＫベクター（“ｐＣＫ”）、（ｉｉ）ＶＭ２０２（“ＶＭ２０２”）、（ｉｉｉ）ＶＭ２０２、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃１及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃４（“ＩＧＦ－１＃１＋ ＃４”）、（ｉｖ）ＶＭ２０２及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ６（“ＩＧＦ－１Ｘ６”）及び（ｖ）ＶＭ２０２及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０（“ＩＧＦ－１Ｘ１０”）を注射した。

【図9A】ＣＣＩ動物モデルにおいて機械的異質痛を減少させるとき、ＨＧＦ７２８を発現させる作製物及び様々なＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物の同時投与に対する効能を試験するために実施例５に用いられた実験方式を概括的に示す。

【図9B】図９Ａに説明の実験において、シャムマウス又はＣＣＩマウスから測定された足引っ込みの頻度を示すグラフである。

【図9C】図９Ａに説明の実験において、シャムマウス又はＣＣＩマウスから測定された足引っ込みの閾値を示すグラフである。前記ＣＣＩマウスに１つ以上の下記ＤＮＡ作製物を注射した－ベクター単独（“ＣＣＩ－ｐＣＫ”）、又は（ｉ）ｐＣＫ－ＨＧＦ７２８（“ＣＣＩ－ＨＧＦ７２８”）、（ｉｉ）ｐＣＫ－ＨＧＦ７２８及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃１（“ＣＣＩ－ＨＧＦ７２８＋ＩＧＦ－１＃ｌ”）、（ｉｉｉ）ｐＣＫ－ＨＧＦ７２８及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃４（“ＣＣＩ－ＨＧＦ７２８＋ＩＧＦ－１＃４”）、又は（ｉｖ）ｐＣＫ－ＨＧＦ７２８及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０（“ＣＣＩ－ＨＧＦ７２８＋ＩＧＦ－１Ｘ１０”）。

【発明を実施するための形態】

【0077】

図面は、本発明の様々な具体例を説明するための目的でのみ示されている。当該分野における技術者は、本明細書で説明された構造と方法に関する具体例が、明細書で説明された発明の原理から逸脱することなく利用可能であるということが、下記の議論から容易に認識できよう。

【0078】

１． 定義
別に断らない限り、本明細書で使われた全ての技術的及び学術的用語は、本発明の属する分野における技術者に共通に理解される意味を有する。本明細書で使われるように、下記用語は、下記のようにそれらに与えられた意味を有する。

【0079】

本明細書で使われるように、用語“ＩＧＦ－１の異型体”、“ヒトＩＧＦ－１異型体”又は“ＩＧＦ－１異型体”は、ヒトの自然発生プレ－プロ－ＩＧＦ－１ポリペプチド、又はその同型変異体、スプライス変異体、又は欠損変異体のうち１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％同じアミノ酸配列を有するポリペプチドのことを指し、相互に同じ意味で使われる。前記自然発生プレ－プロ－ＩＧＦ－１ポリペプチドは、クラスＩ，Ｅｃ（配列番号１６）；クラスＩＩ，Ｅａ（配列番号１８）；クラスＩ，Ｅｂ（配列番号２０）；及びクラスＩ，Ｅａ異型体（配列番号１４）を含む。

【0080】

用語“異型体＃１”、“クラスＩ，Ｅｃ異型体”、“クラスＩ，ＩＧＦ－１Ｅｃ異型体”又は“クラスＩ，ＩＧＦ－１Ｅｃ”は、本明細書において配列番号１６のポリペプチドのことを指し、相互に同じ意味で使われる。

【0081】

用語“異型体＃２”、“クラスＩＩ，Ｅａ異型体”、“クラスＩＩ，ＩＧＦ－１Ｅａ異型体”又は“クラスＩＩ，ＩＧＦ－１Ｅａ”は、本明細書において配列番号１８のポリペプチドのことを指し、相互に同じ意味で使われる。

【0082】

用語“異型体＃３”、“クラスＩ，Ｅｂ異型体”、“クラスＩ，ＩＧＦ－１Ｅｂ異型体”又は“クラスＩ，ＩＧＦ－１Ｅｂ”は、本明細書において配列番号２０のポリペプチドのことを指し、相互に同じ意味で使われる。

【0083】

用語“異型体＃４”、“クラスＩ，Ｅａ異型体”、“クラスＩ，ＩＧＦ－１Ｅａ異型体”又は“クラスＩ，ＩＧＦ－１Ｅａ”は、本明細書において配列番号１４のポリペプチドのことを指し、相互に同じ意味で使われる。

【0084】

用語“治療”とは、本明細書で使われるように、（ａ）神経病症症状の抑制；（ｂ）神経病症症状の改善；及び（ｃ）神経病症症状の除去、という全ての行為を指す。一具体例において、本発明の組成物は、神経細胞を成長させること又は神経細胞死滅を抑制することによって神経病症を治療することができる。

【0085】

用語“ＶＭ２０２”は、本明細書で使われるように、ｐＣＫ－ＨＧＦ－Ｘ７にも命名されるプラスミドＤＮＡをのこと指し、これは、ｐＣＫベクター（配列番号２４）及び前記ｐＣＫベクターにクローンされたＨＧＦ－Ｘ７（配列番号１３）を含む。ＶＭ２０２は、ブダペスト条約下で、韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）にＫＣＣＭ－１０３６１の受託番号として２００２年３月１２日に寄託された。

【0086】

用語“ＨＧＦの異型体”は、本明細書で使われるように、人を含む動物において自然発生的ＨＧＦポリペプチドのアミノ酸配列に少なくとも８０％同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。前記用語は、任意の全長野生型ＨＧＦポリペプチドに少なくとも８０％一致するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、及び自然発生的ＨＧＦ対立変異体（ｖａｒｉａｎｔ）、スプライス変異体、又は結実変異体に少なくとも８０％一致するアミノ酸配列を有するポリペプチド。本発明に好ましく用いられるＨＧＦの異型体は、全長ＨＧＦ（ｆｌＨＧＦ）（ｆＨＧＦと同意使用）、欠損された変異ＨＧＦ（ｄＨＧＦ）、ＮＫ１、ＮＫ２、及びＮＫ４からなる群から選ばれる２つ以上の異型体を含む。本発明のより好ましい具体例によって、本明細書で説明された前記方法に用いられるＨＧＦの異型体は、ｆｌＨＧＦ（配列番号１１）及びｄＨＧＦ（配列番号１２）を含む。

【0087】

用語“ヒトｆｌＨＧＦ”、“ｆｌＨＧＦ”及び“ｆＨＧＦ”は、本明細書において、ヒトＨＧＦタンパク質のアミノ酸１－７２８で構成されるタンパク質のことを指し、相互に同じ意味で使用可能である。ｆｌＨＧＦの配列は、配列番号１１で提供される。

【0088】

用語“ヒトｄＨＧＦ”及び“ｄＨＧＦ”は、本明細書においてヒトＨＧＦ遺伝子の選択的スプライシング（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ）によって生成されたＨＧＦタンパク質の欠損変異体のことを指し、相互に同じ意味で使われる。詳細には、“ヒトｄＨＧＦ”又は“ｄＨＧＦ”は、前記全長ＨＧＦ配列におけるアルファ鎖の第１クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸（Ｆ、Ｌ、Ｐ、Ｓ、及びＳ）の欠損を持つヒトＨＧＦタンパク質のことを指す。ヒトｄＨＧＦは、７２３個アミノ酸長である。ヒトｄＨＧＦのアミノ酸配列は、配列番号１２で提供される。

【0089】

用語“治療的有効投与量”又は“有効量”は、本明細書で使われるように、投与時に所望の効果を生成させる投与量又は量のことを指す。本方法の脈絡において、治療的有効量は、神経病症の症状を治療するのに有効な量である。前記量は、それ単独又は他の治療剤との組合せで神経病症の症状を治療するのに有効な量でよい。

【0090】

用語“十分な量”は、本明細書で使われるように、所望の効果を発生させるのに十分な量を指す。前記量は、それ単独で又は他の治療剤との組合せで所望の効果を生成するのに十分な量でよい。

【0091】

用語“縮退配列”は、本明細書で使われるように、参照核酸配列から翻訳された配列と同じアミノ酸配列を提供するように翻訳され得る核酸配列のことを指す。

【0092】

２． その他解釈上の規例
本明細書で引用される範囲は、引用された終結点を始めとする、その範囲内の全ての値に対する略称と理解される。例えば、１～５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、及び５０からなる群からの任意の数、数字の組合せ、又は副次範囲を含むものと理解される。

【0093】

３． 神経病症を治療する方法
第１観点において、神経病症を治療する方法が提供される。前記方法は、神経病症を有する対象体にヒトＩＧＦ－１異型体を発現可能な第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物の治療的有効量；及びヒトＨＧＦ異型体を発現可能な第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物の治療的有効量を投与することを含む。

【0094】

３．１． ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物
本明細書で提供される方法において、ヒトＩＧＦ－１の少なくとも１つの異型体を発現させることができるＤＮＡ作製物を用いる。

【0095】

図１に示すように、前記ヒトＩＧＦ－１遺伝子は、約９０ｋｂのゲノム性ＤＮＡに亘っている６個エクソン（エクソン１、２、３、４、５、及び６（６－１及び６－２））を含む。エクソン１及び２は、相互排他的リーダーエクソンであり、それぞれ様々に用いられる多重プロモーターを有する。また、前記ＩＧＦ－１遺伝子は異なるようにスプライシングされ、多重の転写体変異体を生成できる。各転写体変異体は、可変的信号ペプチドリーダー配列を保有する異なるプレ－プロ－ＩＧＦ－１タンパク質（“ＩＧＦ－１異型体”）を暗号化する。全ての前記転写体異型体は、プロセシング後に、同じ受容体を用いる同じ成熟した７０個のアミノ酸ＩＧＦ－１ペプチドを生じさせる。

【0096】

前記プレ－プロ－ＩＧＦ－１ペプチドは、それらのリーダー、又は信号、配列及びカルボキシ（Ｃ）末端において異なる。エクソン１又はエクソン２の結合は相互排他的であり、これらのいずれか一方は、前記プレ－プロ－ＩＧＦ－１ペプチドのリーダー配列として作用する；前記異なるリーダーエクソンは、異なる５’－ＵＴＲを産生する。前記プレ－プロ－ＩＧＦ－１ポリペプチドは、転写後にタンパク質分解切断されて、前記リーダー及び前記Ｅ－ペプチドカルボキシ末端を除去し、成熟した７０個のアミノ酸ＩＧＦ－１を生成する。

【0097】

エクソン１を含む転写体は、クラス１転写体と呼ばれ（例えば、図１において、クラスＩ，Ｅｃ；クラスＩ，Ｅｂ；及びクラスＩ，Ｅａ）、且つエクソン２を含む転写体はクラス２転写体と呼ばれる（例えば、図１において、クラスＩＩ，Ｅａ）。ほぼ全てのプレ－プロペプチドは、エクソン３に由来した信号ペプチドにおける２７個のアミノ酸を含み、残りの信号配列は、エクソン１又は２を含むことから由来する。少数の転写体は、２２個アミノ酸のより短い信号ペプチドを生成するエクソン３における異なる転写開始部位を用いる。エクソン３及び４は不変であり、及び成熟したＩＧＦ－１ペプチドのＢ、Ｃ、Ａ、及びＤドメインを暗号化し；エクソン４は、前記ＩＧＦ－１ペプチドの３分の２を暗号化する。前記ヒトＥｂペプチドは、エクソン４及び５だけで構成されるが、Ｅｃは、エクソン４、５、及び６を含む（図１）。

【0098】

転写の選択的スプライシング及び相互排他的開始は、異なるプレ－プロ－ＩＧＦ－１ポリペプチドの生成結果（すなわち、ＩＧＦ－１異型体）である図１に説明される。詳細には、少なくともエクソン１、３／４、５、及び６の断片物を含む、クラスＩ，Ｅｃ ＩＧＦ－１異型体（配列番号１６）は、配列番号１７の配列を含む転写体から生成される。少なくともエクソン２、３／４、及び６を含む、クラスＩＩ，Ｅａ ＩＧＦ－１異型体（配列番号１８）は、配列番号１９の配列を含む転写体から生成される。少なくともエクソン１、３／４、及び５の断片物を含むクラスＩ，Ｅｂ ＩＧＦ－１異型体（配列番号２０）は、配列番号２ｌの配列を含む転写体から生成される。少なくともエクソン１、３／４、及び６の断片物を含む、クラスＩ，Ｅａ ＩＧＦ－１異型体（配列番号１４）は、配列番号１５の配列を含む転写体から生成される。

【0099】

たとえ前記様々な転写体から由来した成熟した前記ＩＧＦ－１タンパク質が異ならないが、前記様々な転写体異型体が異なる調節役割を有することと提示されている。これらの変異体形態は、異なる安定性、結合パートナー、及び前記異型体に対する中枢的な調節役割を担う活性を保有する。たとえ、エクソン１を有するクラスＩ異型体は自己分泌／側分泌の形態で、エクソン２を有するクラスＩＩ異型体は、分泌された内分泌の形態であるという仮設があるが、前記異型体の生物学的意味は依然として不明である。これは、クラスＩＩ転写体が効率的分泌と関連した典型的な信号ペプチドモチーフを含むのに対し、クラスＩ転写体は、分泌を妨害する可能性があるより長い信号ペプチドを有するという発見に基づく。

【0100】

たとえ肝は２つの形態を全て利用し、肝クラスＩＩ転写体は発達中に優先して向上されるとしても、大部分の組織はクラスＩ転写体を使用するとされている。発達中に、前記ＩＧＦ－１転写体の産物量（ａｂｕｎｄａｎｃｅ）に多くの変化がある。クラス１，Ｅａは、活動的成長期間において最も豊富であり、及びクラス１，Ｅｂは、たとえ低いレベルであるが、初期成長期において成長プレート全体にわたって均一に発現することが発見された。

【0101】

ヒトＩＧＦ－１の少なくとも１つの異型体を発現させることができるＤＮＡ作製物が提供される。このような単一発現作製物は、ＩＧＦ－１異型体＃１に対するコーディング配列を含むｐＣＫベクターであるｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃ｌ；ＩＧＦ－１異型体＃２に対するコーディング配列を含むｐＣＫベクターであるｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃２；ＩＧＦ－１異型体＃３に対するコーディング配列を含むｐＣＫベクターであるｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃３；及びＩＧＦ－１異型体＃４に対するコーディング配列を含むｐＣＫベクターであるｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃４を含むが、これに限定されない。一具体例において、それぞれ異なるＩＧＦ－１異型体を暗号化する１つより多いＤＮＡ作製物を使用する。例えば、クラスＩ，Ｅｃ異型体（異型体＃１）を暗号化する第１作製物及びクラスＩ，Ｅａ異型体（異型体＃４）を暗号化する第２作製物を共に使用する。例えば、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃ｌ及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃４を共に使用することができる。

【0102】

このような単一発現作製物は、ＩＧＦ－１異型体＃１に対するコーディング配列を含むｐＴｘベクターであるｐＴｘ－ＩＧＦ－１＃ｌ；ＩＧＦ－１異型体＃２に対するコーディング配列を含むｐＴｘベクターであるｐＴｘ－ＩＧＦ－１＃２；ＩＧＦ－１異型体＃３に対するコーディング配列を含むｐＴｘベクターであるｐＴｘ－ＩＧＦ－１＃３；及びＩＧＦ－１異型体＃４に対するコーディング配列を含むｐＴｘベクターであるｐＴｘ－ＩＧＦ－１＃４をさらに含むが、これに制限されない。一具体例において、それぞれ異なるＩＧＦ－１異型体を暗号化する、１つより多いＤＮＡ作製物を使用する。例えば、クラスＩ，Ｅｃ異型体（異型体＃１）を暗号化する第１作製物及びクラスＩ，Ｅａ異型体（異型体＃４）を暗号化する第２作製物を共に使用する。例えば、ｐＴｘ－ＩＧＦ－１＃１及びｐＴｘ－ＩＧＦ－１＃４を共に使用することができる。

【0103】

一具体例において、２つ以上の異型体を発現させるＤＮＡ作製物（すなわち、“二重発現作製物”）を使用する。例えば、クラスＩ，Ｅｃ異型体及びクラスＩ，Ｅａ異型体の両方を暗号化する単一ＤＮＡ作製物を使用することができる。

【0104】

一具体例において、前記ＤＮＡ作製物は、前記ＩＧＦ－１異型体のうち１つのコーディング配列を含む。例えば、前記ＤＮＡ作製物は、クラスＩ，Ｅａ（異型体＃４）（配列番号１５）；クラスＩ，Ｅｂ（異型体＃３）（配列番号２ｌ）；クラスＩ，Ｅｃ（異型体＃１）（配列番号１７）；又はクラスＩＩ，Ｅａ（異型体＃２）（配列番号１９）を暗号化する配列を含むことができる。

【0105】

一具体例において、前記ＤＮＡ作製物は、各異型体コーディング配列（ＣＤＳ）に対する発現調節配列を含むことによって、１つより多いＩＧＦ－１異型体を発現できるＤＮＡ作製物である二重発現作製物である。一具体例において、前記作製物は、２つのコーディング配列の間に内部リボソーム結合部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ，ＩＲＥＳ）、例えば、（１）発現調節配列－（２）第１異型体のコーディング配列－（３）ＩＲＥＳ－（４）第２異型体のコーディング配列－（５）転写終結配列の順に含む。ＩＲＥＳは、ＩＲＥＳ配列から翻訳が始まるようにし、これで、単一転写体から２つのタンパク質生成物を発現可能にする。他の具体例において、それぞれＩＧＦ－１の単一異型体を暗号化する、複数の作製物を共に使用し、投与された対象体においてＩＧＦ－１の１つより多い異型体の発現を誘導する。

【0106】

好ましい具体例において、前記ＤＮＡ作製物は、選択的スプライシング部位を含むことによって、２つ以上のＩＧＦ－１異型体－例えば、（ｉ）クラスＩ，Ｅｃ異型体（異型体＃１）及びクラスＩＩ，Ｅａ異型体（異型体＃２）；（ｉｉ）クラスＩ，Ｅｃ異型体（異型体＃１）及びクラスＩ，Ｅｂ異型体（異型体＃３）；（ｉｉｉ）クラスＩ，Ｅｃ異型体（異型体＃１）及びクラスＩ，Ｅａ異型体（異型体＃４）；（ｉｖ）クラスＩＩ，Ｅａ異型体（異型体＃２）及びクラスＩ，Ｅｂ異型体（異型体＃３）；（ｖ）クラスＩＩ，Ｅａ異型体（異型体＃２）及びクラスＩ，Ｅａ異型体（異型体＃４）；（ｖｉ）クラスＩ，Ｅｂ異型体（異型体＃３）及びクラスＩ，Ｅａ異型体（異型体＃４）－を同時に発現させることができる。

【0107】

例えば、前記ＤＮＡ作製物は、（ｉ）ヒトＩＧＦ－１遺伝子のエクソン１、３、及び４を含む第１配列（配列番号１）又は前記第１配列の縮退配列；（ｉｉ）前記ヒトＩＧＦ－１遺伝子のイントロンを含む第２配列（配列番号２）又は前記第２配列の断片物；（ｉｉｉ）前記ヒトＩＧＦ－１遺伝子のエクソン５及び６－１を含む第３配列（配列番号３）又は前記第３配列の縮退配列；（ｉｖ）前記ヒトＩＧＦ－１遺伝子のイントロンを含む第４配列（配列番号４）又は前記第２配列の断片物；及び（ｖ）前記ヒトＩＧＦ－１遺伝子のエクソン６－２を含む第５配列（配列番号５）又は前記第５配列の縮退配列を含むことができる。イントロン４及び５は選択的にスプライスされ、ＩＧＦ－１の２つの異型体（例えば、クラスＩ，Ｅｃ及びクラスＩ，Ｅａ）を生成する結果につなかる。

【0108】

一具体例において、前記ＤＮＡ作製物は試験管内で試験し及び／又は生体内で１つ以上のＩＧＦ－１異型体を発現できる能力に関する。好ましい具体例において、クラスＩ，Ｅｃ及びクラスＩ，Ｅａ ＩＧＦ－１異型体の両方を発現できるＤＮＡ作製物を選択する。

【0109】

一具体例において、前記作製物は、イントロン４の全配列（配列番号２）又はその断片を含む。好ましい具体例において、前記作製物は、配列番号６又は配列番号７の配列を有するイントロン４の断片を含む。

【0110】

一具体例において、前記作製物は、イントロン５の全配列（配列番号４）、又はその断片を含む。好ましい具体例において、前記作製物は、配列番号８の配列を有するイントロンの断片を含む。

【0111】

（ｉ）前記ヒトＩＧＦ－１遺伝子のエクソン１－６、及び（ｉｉ）前記ヒトＩＧＦ－１遺伝子のイントロン４及び５、又はイントロン４及び５の様々な断片に相応する配列を含む様々なＤＮＡ作製物を、特定数字が末尾につく“ＩＧＦ－１Ｘ”と命名する。本出願人によって試験されたＩＧＦ－１Ｘ作製物は、ＩＧＦ－１Ｘ１、ＩＧＦ－１Ｘ２、ＩＧＦ－１Ｘ３、ＩＧＦ－１Ｘ４、ＩＧＦ－１Ｘ５、ＩＧＦ－１Ｘ６、ＩＧＦ－１Ｘ７、ＩＧＦ－１Ｘ８、ＩＧＦ－１Ｘ９及びＩＧＦ－１Ｘ１０を含むが、これに制限されない。ｐＣＫベクターにクローンされた前記ＩＧＦ－１Ｘ作製物は、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘｌ、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ２、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ３、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ４、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ５、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ６、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ７、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ８、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ９及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０とそれぞれ命名する。前記試験された作製物のうち、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ６及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘｌ０は、クラスＩ，Ｅｃ及びクラスＩ，Ｅａ ＩＧＦ－１異型体の両方を発現させることが確認された。ｐＴｘベクターにクローンされたＩＧＦ－１Ｘ作製物は、それぞれ、ｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘｌ、ｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ２、ｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ３、ｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ４、ｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ５、ｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ６、ｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ７、ｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ８、ｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ９及びｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ１０と命名される。ｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ６及びｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘｌ０は、クラスＩ，Ｅｃ及びクラスＩ，Ｅａ ＩＧＦ－１異型体の両方を発現する。

【0112】

好ましい具体例において、ＩＧＦ－１Ｘ６（配列番号９）又はＩＧＦ－１Ｘ１０（配列番号１０）を使用する。ｐＣＫベクターにクローンされたＩＧＦ－１Ｘ６（配列番号９）及びＩＧＦ－１Ｘ１０（配列番号１０）は、それぞれ、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ６及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０と命名される。ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ６で形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（“ＤＨ５ａ＿ｐＣＫ－ＩＧＦ ｌ Ｘ６”）をブダペスト条約に基づいて韓国生命工学研究院生物資源センター（ＫＣＴＣ、５６２１２、大韓民国チョルラプク－ト、チョンウブ－シ、イブシンギル１８１韓国生命工学研究院（ＫＲＩＢＢ）に受託番号ＫＣＴＣ １３５３９ＢＰとして２０１８年５月３０日に寄託した。ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０で形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（“ＤＨ５ａ＿ｐＣＫ－ＩＧＦ ｌ Ｘ１０”）をブダペスト条約に基づいて韓国生命工学研究院生物資源センター（ＫＣＴＣ，５６２１２、大韓民国チョルラプク－ト、チョンウブ－シ、イブシンギル１８１韓国生命工学研究院（ＫＲＩＢＢ）に受託番号ＫＣＴＣ １３５４０ＢＰとして２０１８年５月３０日に寄託した。

【0113】

他の好ましい具体例において、ｐＴｘベクター（配列番号３８）にクローンされたＩＧＦ－１Ｘ６（配列番号９）及びＩＧＦ－１Ｘ１０（配列番号１０）を使用する。前記ＩＧＦ作製物はそれぞれ、ｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ６及びｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ１０（配列番号３９）と命名される。

【0114】

本明細書で説明されたＩＧＦ－１異型体又はＩＧＦ－１異型体を暗号化するＤＮＡ作製物は、野生型ヒトＩＧＦ－１異型体から変形を含むことができる。前記変形された配列を野生型ヒトＩＧＦ－１異型体配列と最大の方式で整列するとき、前記変形された配列は、少なくとも８０％相同性、より好ましくは少なくとも９０％相同性、及び最も好ましくは少なくとも９５％相同性を有する配列を含む。比較するための配列整列方法は当該分野に公知されている。詳細には、相同性百分率を決定するために、米国国立生物情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、メリーランド州、ベセスダ）のＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）ウェブサイトに開示されており、及び配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｍ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘと連係して用いられる整列アルゴリズムを用いることができる。

【0115】

３．２． ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物
本明細書で提供される方法において、ヒトＨＧＦの少なくとも１つの異型体を発現できるＤＮＡ作製物を使用する。

【0116】

肝細胞成長因子（ＨＧＦ）は、散乱因子又はヘパトポイエチン－Ａとも知られたヘパリン結合糖タンパク質である。ＨＧＦは、様々な細胞類型の体細胞有糸分裂誘導（ｍｉｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）、細胞移動性促進（ｍｏｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）、及び形態形成（ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ）のような多重生物学的効果を有する。ＨＧＦは、染色体７ｑ２ｌ．ｌに位置した、１８個のエクソン及び１７個のイントロンを含む遺伝子によって暗号化される。

【0117】

前記ＨＧＦ遺伝子は、エクソン４及びエクソン５間に選択的スプライシングによってＨＧＦの２つの異型体を暗号化する－前記２つの異型体は：（１）下記ドメインを有する、７２８個アミノ酸（配列番号１１）を含む全長ポリペプチドＨＧＦ前駆体（“ｆｌＨＧＦ”）：Ｎ末端ヘアピンループ－クリングルｌ－クリングル２－クリングル３－クリングル４－不活性化セリンタンパク質加水分解酵素、及び（２）アルファ鎖の第１クリングルドメインにおける５個アミノ酸（すなわち、Ｆ、Ｌ、Ｐ、Ｓ及びＳ）が欠損された、７２３個アミノ酸（配列番号１２）を含む欠損された変異体ＨＧＦ（“ｄＨＧＦ”）を含む。ｆｌＨＧＦ及びｄＨＧＦは、いくつかの生物学的機能を共有するが、免疫学的特性及びいくつかの生物学的特性において異なる。ＨＧＦのこのような２つの異型体は、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる米国公開特許２０１４０２９６１４２に開示されているように、糖尿性神経病症を治療するのに効果的であることが証明された。

【0118】

本発明の特定の具体例は、ＨＧＦの１つ以上の異形体を暗号化する作製物を投与する方法を提供する。一具体例において、ｆｌＨＧＦ及びｄＨＧＦの両方を暗号化する作製物が用いられる。一具体例において、ｆｌＨＧＦ又はｄＨＧＦを暗号化する作製物が用いられる。具体的に、配列番号３３のポリヌクレオチドを含む作製物を用いることができる。前記作製物は、ｆｌＨＧＦ、ｄＨＧＦ、又は両方を暗号化するコーディング配列に作動的に連結されている１つ以上の調節配列（例えば、プロモーター又はエンハンサー）を有するベクターを含むことができる。前記調節配列は、前記ＨＧＦ異型体の発現を調節することができる。

【0119】

一具体例において、作製物は、各異型体のコーディング配列（ＣＤＳ）に対する発現調節配列を含むことによって、ＨＧＦの２つ以上の異型体を暗号化することができる。代案的に、前記作製物は、２つのコーディング配列の間において内部リボソーム結合部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ，ＩＲＥＳ）、例えば、（１）発現調節配列－（２）第１異型体のコーディング配列－（３）ＩＲＥＳ－（４）第２異型体のコーディング配列－（５）転写終結配列の順に含む。ＩＲＥＳは、ＩＲＥＳ配列から翻訳が始まるようにし、これによって、単一作製物から２つのタンパク質生成物を発現できるようにする。代案的に、それぞれＨＧＦの単一異型体を暗号化する、する１つより多い作製物を共に用いて、ターゲットにおいてＨＧＦの１つより多い異型体の発現を誘導する。

【0120】

好ましい具体例において、作製物は、選択的スプライシング部位を含むことによって、ＨＧＦの２つ以上の異なる異型体－すなわち、ｆｌＨＧＦ及びｄＨＧＦ－を同時に発現する作製物を使用する。ＨＧＦの２つの異型体（ｆｌＨＧＦ及びｄＨＧＦ）を暗号化する作製物がＨＧＦの１つの異型体（ｆｌＨＧＦ又はｄＨＧＦ）を暗号化する作製物に比べて遥かに高い（ほぼ２５０倍高い）発現効率を有するということが、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる米国特許７，８１２，１４６号に既に証明されている。

【0121】

前記作製物は、ヒトＨＧＦのエクソン１－１８及びヒトＨＧＦ遺伝子のイントロン４又はその断片に相応するｃＤＮＡを含むことができ、前記イントロンは、前記ｃＤＮＡのエクソン４及びエクソン５に挿入されている。このような作製物から、ＨＧＦの２つの異型体（ｆｌＨＧＦ及びｄＨＧＦ）はエクソン４及びエクソン５間の選択的スプライシングによって生成されてよい。一具体例において、前記作製物は、イントロン４の全長配列（配列番号２５）を含む。一具体例において、前記作製物は、イントロン４の断片を含む。

【0122】

ヒトＨＧＦのエクソン１－１８及びヒトＨＧＦ遺伝子のイントロン４又はその断片に相応するｃＤＮＡを含む作製物は、イントロン４又はその断片における選択的スプライシングによってＨＧＦの２つの異型体を暗号化できる。具体的に、前記作製物は、配列番号１３及び配列番号２６～配列番号３２からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むことができる。配列番号２６のヌクレオチド配列は、７１１３ｂｐであり、イントロン４の全長配列を含む作製物に相応する。配列番号１３及び２７～３２のヌクレオチド配列は、イントロン４の様々な断片を含む作製物に相応する。

【0123】

ヒトＨＧＦのエクソン１－１８及びヒトＨＧＦ遺伝子のイントロン４又はその作製物に相応するｃＤＮＡを含む様々なＤＮＡ作製物は、“ＨＧＦ－Ｘ”と命名され、後ろに特定番号を付ける。本発明の様々な具体例に利用可能なＨＧＦ－Ｘは、ＨＧＦ－Ｘ１（配列番号２６）、ＨＧＦ－Ｘ２（配列番号２７）、ＨＧＦ－Ｘ３（配列番号２８）、ＨＧＦ－Ｘ４（配列番号２９）、ＨＧＦ－Ｘ５（配列番号３０）、ＨＧＦ－Ｘ６（配列番号３１）、ＨＧＦ－Ｘ７（配列番号１３；ＶＭ２０２におけるＨＧＦコーディング配列）、及びＨＧＦ－Ｘ８（配列番号３２）を含むが、これに制限されない。

【0124】

ｐＣＫ－ＨＧＦ－Ｘ７（すなわち、ＶＭ２０２）は、米国特許７，８１２，１４６に開示されているように、最高の発現効率を有することが証明された。したがって、ＨＧＦ－Ｘ７を含むＤＮＡ作製物を本発明の好ましい具体例で用いることができる。

【0125】

本発明で用いられる作製物は、野生型ヒトＨＧＦ異型体の配列と実質的に同じヌクレオチド配列を含むことができる。実質的相同性は、野生型ヒトＨＧＦ異型体のアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を一配列と最大限に整列した配列比較アルゴリズムの一つを用いて測定するとき、少なくとも８０％相同性、より好ましくは少なくとも９０％相同性、及び最も好ましくは少なくとも９５％相同性を含む。比較するための配列の整列方法は、当分野に公知されている。様々なプログラムと整列アルゴリズムが次に説明されている：Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．４８：４４３（１９７０）；Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７－３１（１９８８）；Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ ７３：１５２３７－４４（１９８８）；Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１－３（１９８９）Ｃｏｒｐｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：１０８８１－９０（１９８８）；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐ．Ａｐｐｌ．ＢｉｏＳｃｉ．８：１５５－６５（１９９２）；ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７－３１（１９９４）。ＢＬＡＳＴ（Ｔｈｅ ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）［Ａｌｔｓｃｈｕｌ ２０ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０（１９９０）］は、米国国立生物情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、メリーランド州、ベセスダ）を始めとするいくつかのソースから及びインターネット上で入手可能であり、配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｍ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘと連係して用いることができる。

【0126】

３．３． ベクター
本明細書に説明の方法において用いられるＩＧＦ－１異型体又はＨＧＦ異型体を暗号化するＤＮＡ作製物は、一般に、前記発現された配列に作動的に連結された１つ以上の調節配列（例えば、プロモーター又はエンハンサー）を有するベクターを含む。前記調節配列は、ＩＧＦ－１の異型体又はＨＧＦの異型体の発現を調節する。

【0127】

１つ以上のＩＧＦ－１異型体又はＨＧＦ異型体を暗号化するポリヌクレオチドは、発現作製物においてプロモーターと作動的に連結されていることが好ましい。用語“作動的に連結”は、核酸発現調節配列（プロモーター、信号配列、又は一連の転写因子結合部位のような）及び第２核酸配列間の機能的連結のことを指し、ここで、前記発現調節配列は、前記第２配列に相応する核酸の転写及び／又は翻訳に影響を及ぼす。

【0128】

一具体例において、前記ポリヌクレオチドに連結されたプロモーターは、好ましくは、動物、より好ましくは、哺乳動物細胞において作動可能であってポリヌクレオチドの転写を調節し、哺乳動物細胞のゲノムから由来したプロモーター又は哺乳動物ウイルス、例えば、ＣＭＶ（巨大細胞ウイルス）プロモーター、アデノウイルス後期（ｌａｔｅ）プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶ ｔｋプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ１アルファプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ベータ－アクチンプロモーター、ヒトＩＬ－２遺伝子プロモーター、ヒトＩＦＮ遺伝子プロモーター、ヒトＩＬ－４遺伝子プロモーター、ヒトリンパ毒素遺伝子プロモーター、及びヒトＧＭ－ＣＳＦ遺伝子プロモーターを含むが、これに限定されない。より好ましくは、本発明において有用なプロモーターは、ヒトＣＭＶ（ｈＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ ｅａｒｌｙ）遺伝子から由来したプロモーター又はＥＦ１アルファプロモーターであり、最も好ましくは、ｈＣＭＶ ＩＥ遺伝子由来のプロモーターー／エンハンサー及びエクソン１の全長配列及びＡＴＧ開始コドン直前の配列に亘っているエクソン２配列を含む５’－ＵＴＲ（非番駅部位）である。

【0129】

本発明において用いられる発現カセットは、ポリアデニル化配列、例えば、ウシの成長ホルモン終結子（ｂｏｖｉｎｅ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）（Ｇｉｍｍｉ，Ｅ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：６９８３－６９９８（１９８９））、ＳＶ４０由来ポリアデニル化配列（Ｓｃｈｅｋ，Ｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２：５３８６－５３９３（１９９２））、ＨＩＶ－ｌ ｐｏｌｙＡ（Ｋｌａｓｅｎｓ，Ｂ．Ｉ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：１８７０－１８７６（１９９８））、ｂ－ｇｌｏｂｉｎ ｐｏｌｙＡ（Ｇｉｌ，Ａ．，ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ４９：３９９－４０６（１９８７））、ＨＳＶ ＴＫ ｐｏｌｙＡ（Ｃｏｌｅ，Ｃ．Ｎ．ａｎｄ Ｔ．Ｐ．Ｓｔａｃｙ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．５Ｂｉｏｌ．５：２１０４－２１１３（１９８５））、又はポリオマ（ｐｏｌｙｏｍａ）ウイルスｐｏｌｙＡ（Ｂａｔｔ，Ｄ．Ｂａｎｄ Ｇ．Ｇ．Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：４７８３－４７９０（１９９５））を含むが、これに制限されない。

【0130】

３．３．１． 非ウイルス性ベクター
一具体例において、ヒトＩＧＦ－１異型体を発現可能なＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物及び／又はヒトＨＧＦ異型体を発現可能なＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、ＩＧＦ－１異型体又は１つ以上のＨＧＦ異型体を発現できる非ウイルス性ベクターである。

【0131】

一具体例において、前記非ウイルス性ベクターは、プラスミドである。現在、好ましい具体例において、前記プラスミドは、ｐＣＫ、ｐＣＰ、ｐＶＡＸｌ、ｐＴｘ又はｐＣＹである。特に好ましい具体例において、前記プラスミドはｐＣＫであり、その詳細内容は、ＷＯ２０００／０４０７３７及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２７２：２３０－２３５（２０００）に記載されており、これらは、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。ｐＣＫ（ＴｏｐｌＯ－ｐＣＫ）で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉをブダペスト条約下で、韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に２００３年３月２１日に寄託した（受託番号：ＫＣＣＭ－１０４７６）。ｐＣＫ－ＶＥＧＦｌ６５（すなわち、ＶＥＧＦコーディング配列を持つｐＣＫベクター－Ｔｏｐｌ０－ｐＣＫ／ＶＥＧＦｌ６５’）を用いて形質転換されたＥ．ｃｏｌｉを、ブダペスト条約下で、韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に１９９９年１２月２７日に寄託した（受託番号：ＫＣＣＭ－１０１７９）。

【0132】

Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７２：２３０（２０００）；及びＷＯ２０００／０４０７３７で詳細に開示されているように、前記ｐＣＫベクターは、遺伝子、例えば、ＩＧＦ－１遺伝子又はＨＧＦ遺伝子の発現がヒト巨大分子ウイルス（ＨＣＭＶ）のエンハンサー／プロモーター下で制御されるように作製され、前記参照文献は参照することによって組み込まれる。ｐＣＫベクターは、人体に臨床試験しており、その安定性及び効率が確認された（Ｈｅｎｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１８：７８８（２０１１））。

【0133】

好ましい具体例において、前記ｐＣＫプラスミドは、クラスＩ，Ｅｃ ＩＧＦ－１異型体及び／又はクラスＩ，Ｅａ ＩＧＦ－１異型体に対するコーディング配列を含む。特に好ましい具体例において、前記ｐＣＫプラスミドは、ＩＧＦ－１Ｘ６（すなわち、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ６）又はＩＧＦ－１Ｘ１０（すなわち、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０）を含む。

【0134】

好ましい具体例において、前記ｐＣＫプラスミドは、ｆｌＨＧＦ及び／又はｄＨＧＦ異型体に対するコーディング配列を含む。特に好ましい具体例において、前記ｐＣＫプラスミドは、ＨＧＦ－Ｘ７（すなわち、ｐＣＫ－ＨＧＦ－Ｘ７又はＶＭ２０２）を含む。

【0135】

他の好ましい具体例において、前記プラスミドは、ｐＣＫから由来したプラスミドベクターであるｐＴｘ（配列番号３８）である。ｐＴｘは、ｐＣＫを２回連続突然変異誘発することによって生成される。前記第１欠損突然変異誘発を行ってｐＣＫのカナマイシン耐性遺伝子及びＣｏｌＥｌ間の不要な配列を除去した。具体的に、第１プライマー対（配列番号３４及び３５）を用いて欠損突然変異誘発ＰＣＲを行った。前記プラスミドをシーケンシングすることによってカナマイシン耐性及びＣｏｌＥｌ間の２２８個塩基対を確認した。次に、第２プライマー対（配列番号３６及び３７）を用いて前記第２欠損突然変異誘発ＰＣＲを行って、ＨＣＭＶイントロン配列のサイズを最適化した。ＩＥ１エクソン１及びエクソン２間のＨＣＭＶイントロン配列（４２１個塩基対）を欠損させ、該欠損をシーケンシングによって確認した。

【0136】

特定の具体例において、前記ｐＴｘプラスミドは、ＩＧＦ－１Ｘ６（すなわち、ｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ６）又はＩＧＦ－１Ｘ１０（すなわち、ｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ１０）を含む。例えば、ＣｌａＩ酵素で５’において及びＳａｌ１酵素で３’において切断したｐＴｘにＩＧＦ－１Ｘ１０を結紮することによってｐＴｘ－１Ｘ１０（配列番号３９）を生成した。

【0137】

３．３．２． ウイルス性ベクター
他の具体例において、当該分野に公知の様々なウイルス性ベクターを用いて本発明の１つ以上のＩＧＦ－１異型体及び／又は１つ以上のＨＧＦ異型体を伝達し発現させることができる。例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、又はアデノ関連ウイルスを用いて開発されたベクターを、本発明の特定の具体例において用いた。

【0138】

（ａ）レトロウイルス
相対的に大きい外因性遺伝子を伝達できるレトロウイルスは、それらのゲノムを宿主ゲノムに統合させるという点で、ウイルス性遺伝子伝達ベクターとして用いられており、広範な宿主範囲を有する。

【0139】

レトロウイルス性ベクターを作るために、本発明のポリヌクレオチド（例えば、１つ以上のＩＧＦ－１異型体のコーディング配列）を特定ウイルス性配列の代わりにウイルス性ゲノムに挿入して複製欠陥ウイルスを生成する。ウイルス粒子（ｖｉｒｉｏｎ）を生成するために、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を含むが、ＬＴＲ（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）及びＷ成分を持たないパッケージング細胞株を作製した（Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３３：１５３－１５９（１９８３））。本発明のポリヌクレオチド、ＬＴＲ及びＷを含む組換えプラスミドが前記細胞株に導入されるとき、前記Ｗ配列は、前記組換えプラスミドのＲＮＡ転写体がウイルス粒子内にパッケージングされ得るようにし、その後、前記粒子を培養培地内に分泌させる（Ｎｉｃｏｌａｓ ａｎｄ Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ “Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ”、Ｉｎ：Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅｓ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ａｎｄ Ｄｅｎｈａｒｄｔ（ｅｄｓ．）、Ｓｔｏｎｅｈａｍ：Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，４９４－５１３（１９８８））。前記組換えレトロウイルスを含む培地を収穫し、選択的に濃縮し、及び遺伝子伝達のために用いた。

【0140】

第２世代レトロウイルス性ベクターを用いた成功的な遺伝子伝達が報告されている。Ｋａｓａｈａｒａ等（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６：１３７３－１３７６（１９９４））は、モロニーマウス白血病（ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ）ウイルスの変異体を製造し、ここで、ＥＰＯ（エリスロポエチン）配列が外皮部位に挿入され、結果的に、新しい結合特性を有するキメラタンパク質を生成する。同様に、本遺伝子伝達システムを、第２世代レトロウイルス性ベクターに対する製造戦略によって製造することができる。

【0141】

（ｂ）レンチウイルス
レンチウイルスも本発明の一具体例に用いることができる。レンチウイルスは、レトロウイルスのサブクラスである。しかし、レンチウイルスは分裂せずにいる細胞のゲノムに統合されてもよいが、レトロウイルスは、分裂する細胞にのみ感染される。

【0142】

レンチウイルス性ベクターは、通常、いくつかのプラスミドで形質転換されたパッケージング細胞株、一般にＨＥＫ２９３から生成される。前記プラスミドは（１）カプシド及び逆転写酵素のようなビリオンタンパク質を暗号化するパッケージングプラスミド、及び（２）ターゲットに伝達される外因性遺伝子（例えば、１つ以上のＩＧＦ－１異型体又は１つ以上のＨＧＦ異型体のコーディング配列）を含むプラスミドを含む。

【0143】

ウイルスが細胞に仕込まれると、ＲＮＡ形態のウイルスゲノムが逆転写されてＤＮＡを生成し、これは、その後、ウイルス統合酵素（ｉｎｔｅｇｒａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ）によってゲノムに挿入される。したがって、前記ウイルス性ベクターで伝達された外因性ＤＮＡは、前記ゲノム中に残ることができ、細胞が分裂する際に細胞の子孫に伝達される。

【0144】

（ｃ）アデノウイルス
アデノウイルスは、中間サイズのゲノム、操作の容易性、高力価性、広いターゲット細胞範囲、及び高感染能の点で、遺伝子伝達システムに通常用いられてきた。前記ウイルスゲノムの量末端は、１００～２００ｂｐ ＩＴＲｓ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔｓ）を含み、それらは、ウイルスＤＮＡ複製及びパッケージングに必要なシス要素（ｃｉｓ－ｅｌｅｍｅｎｔ）である。Ｅｌ部位（Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ）は、ウイルス性ゲノム及びいくつかの細胞性遺伝子の転写を調節するために必要なタンパク質を暗号化する。Ｅ２部位（Ｅ２Ａ及びＥ２Ｂ）が発現して、ウイルス性ＤＮＡ複製のためのタンパク質を合成する。

【0145】

今まで開発されたアデノウイルス性ベクターのうち、欠損したＥ１部位を有する複製不能アデノウイルスを通常用いる。ウイルス性ベクターにおける欠損したＥ３部位は、転移遺伝子に挿入位置を提供できる（Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３１：５４３－５５１（１９８２）；ａｎｄ Ｒｉｏｒｄａｎ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４５：１０６６－１０７３（１９８９））。したがって、デコリン（ｄｅｃｏｒｉｎ）－暗号化ヌクレオチド配列を前記欠損したＥｌ部位（Ｅ１Ａ部位及び／又はＥ１Ｂ ５部位、好ましくは、Ｅ１Ｂ部位）又は前記欠損したＥ３部位内に挿入することが好ましい。本発明のポリヌクレオチドを前記欠損したＥ４部位に挿入することができる。ウイルスゲノム配列と関連して用語“欠損”は、全体欠損及び部分欠損を含む。自然的に、アデノウイルスは、野生型ゲノムの約１０５％をパッケージングでき、約２ｋｂのＤＮＡに対する剰余収容力（ｅｘｔｒａ ｃａｐａｃｉｔｙ）を提供する（Ｇｈｏｓｈ－Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．６：１７３３－１７３９（１９８７））。これと関連して、アデノウイルスに挿入された上述の外部配列をアデノウイルス野生型ゲノムにさらに挿入できる。

【0146】

前記アデノウイルスは、公知の血清型又はサブグループＡ～Ｆのうち任意のものでよい。サブグループＣのアデノウイルス類型５は、本発明のアデノウイルス遺伝子伝達システムを製造するための最も好ましい出発物質である。アデノウイルス類型５に対する多くの生化学的及び遺伝的情報が公知されている。アデノウイルス性遺伝子伝達システムによって伝達された外部遺伝子は、宿主細胞に対してエピソーム性（ｅｐｉｓｏｍａｌ）、及び遺伝毒素性である。したがって、アデノウイルス遺伝子伝達システムを用いる遺伝子療法は非常に安全である。

【0147】

（ｄ）アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）
アデノ関連ウイルスは非分裂細胞及び様々な類型の細胞を感染させることができ、よって、これらは本発明の遺伝子伝達システムを製造するのに有用である。ＡＡＶベクターの使用と製造に関する詳細な説明が米国特許第１０，３０８，９５８号；第１０，３０１，６５０号；第１０，３０１，６４８号；第１０，２６６，８４６号；第１０，２６５，４１７号；第１０，２０８，１０７号；第１０，１６７，４５４号；第１０，１５５，９３１号；第１０，１４９，８７３号；第１０，１４４，７７０号；第１０，１３８，２９５号；第１０，１３７，１７６号；第１０，１１３，１８２号；第１０，０４１，０９０号；第９，８９０，３６５号；第９，７９０，４７２号；第９，７７０，０１１号；第９，７３８，６８８号；第９，７３７，６１８号；第９，７１９，１０６号；第９，６７７，０８９号；第９，６１７，５６１号；第９，５９７，３６３号；第９，５９３，３４６号；第９，５８７，２５０号；第９，５６７，６０７号；第９，４９３，７８８号；第９，３８２，５５１号；第９，３５９，６１８号；第９，２１７，１５９号；第９，２０６，２３８号；第９，１６３，２６０号；第９，１３３，４８３号；第８，９６２，３３２に開始されており、その内容は、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれ、及び米国特許第５，１３９，９４１号及び第４，７９７，３６８号に開示され、その内容は参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。

【0148】

遺伝子伝達システムとしてＡＡＶに対する研究結果がＬａＦａｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｏｌｏｇｙ，１６２：４８３４８６（１９８８）、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．（ＮＹ），２１：９２８－９３３（１９９３）、Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９４：１４４０－１４４８（１９９４）ａｎｄ Ｆｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２：２９－３７（１９９５）に開示されている。一般に、組換えＡＡＶウイルスは、２つのＡＡＶ末端反復体（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８９）が側面に付いている目的遺伝子（すなわち、伝達される目的ヌクレオチド配列、例えば、ＩＧＦ－１異型体のコーディング配列）を含むプラスミド及び末端反復体のない野生型ＡＡＶコーディング配列を含む発現プラスミド（ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒａｌ．，６５：２９３６－２９４５（１９９１））を併用感染させることによって作られる。

【0149】

（ｅ）その他ウイルス性ベクター
その他ウイルス性ベクターを本発明の遺伝子伝達システムとして用いることができる。ワクシニアウイルス（Ｐｕｈｌｍａｎｎ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：６４９－６５７（１９９９）；Ｒｉｄｇｅｗａｙ，“Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ”，Ｉｎ：Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅｓ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ａｎｄ Ｄｅｎｈａｒｄｔ，ｅｄｓ．Ｓｔｏｎｅｈａｍ：Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，４６７－４９２（１９８８）；Ｂａｉｃｈｗａｌ ａｎｄ Ｓｕｇｄｅｎ，“Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ａｎｉｍａｌ ＤＮＡ ｖｉｒｕｓｅｓ：Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ａｎｄ ｓｔａｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｇｅｎｅｓ”，Ｉｎ：Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ Ｒ，ｅｄ．ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１１７－１４８（１９８６）ａｎｄ Ｃｏｕｐａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，６８：１－１０（１９８８））、レンチウイルス（Ｗａｎｇ Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０４（１１）：ＲＳ５－６２（１９９９）及び単純疱疹ウイルス（Ｃｈａｍｂｅｒ Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．１０１５ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２：１４１１－１４１５（１９９５））のようなウイルスから由来したベクターを、本発明のポリヌクレオチドを細胞に伝達する伝達システムに用いることができる。

【0150】

３．４． 投与方法
様々な方法を用いて前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物及び前記ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物を投与できる。

【0151】

３．４．１．１． 注射
一具体例において、前記ＤＮＡ作製物は、液体薬学組成物を注射することによって投与される。一具体例において、前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物及び前記ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は１回注射で共に投与される。一具体例において、前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物及び前記ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は多重注射によって共に投与される。一具体例において、前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物及び前記ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、多回注射によって個別に投与される。

【0152】

好ましい具体例において、前記ＤＮＡ作製物は、筋肉内注射で投与される。一般に、前記ＤＮＡ作製物は、神経損傷部位、疼痛部位や疼痛の患者認識部位、又は神経病症疾患と関連した他の症状の部位の近くに筋肉内注射で投与される。一具体例において、前記ＤＮＡ作製物は、前記対象体の手、足、脚、又は腕の筋肉に投与される。

【0153】

一具体例において、前記作製物は、皮下内又は皮膚内注射される。一具体例において、前記ＤＮＡ作製物を血管内伝達で投与する。特定の具体例において、前記作製物を逆行性静脈内注射で注射する。

【0154】

３．４．１．２． 電気穿孔法
プラスミドＤＮＡの細胞への形質転換効率は、特定の場合には、注射後に電気穿孔法で向上させることができる。したがって、一具体例において、前記ＤＮＡ作製物は、注射後に電気穿孔することによって投与される。特定の具体例において、ＴｒｉＧｒｉｄ（登録商標）伝達システム（Ｉｃｈｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）を用いて電気穿孔する。

【0155】

３．４．１．３． 超音波穿孔法
一具体例において、超音波穿孔法を用いて本発明のＤＮＡ作製物の形質転換効率を向上させる。超音波穿孔法は、超音波を用いて細胞膜を一時的に透過性にしてＤＮＡを細胞に流入させる。ＤＮＡ作製物を微細バブルに含めて体循環に投与した後、超音波を外部適用する。前記超音波はターゲット組織内で前記微細バブルの空洞現象を誘導して作製物を排出し形質注入する。

【0156】

３．４．１．４． 磁性形質感染法（Ｍａｇｎｅｔｏｆｅｃｔｉｏｎ）
一具体例において、磁性形質感染法を用いて本発明のＤＮＡ作製物の形質転換効率を向上させる。前記作製物を磁性粒子に結合した後に投与する。高い勾配の外部磁場を適用すれば、前記複合体を捕獲し、ターゲットに閉じ込めておく。前記ＤＮＡ作製物は架橋分子を、酵素的切断、電荷相互作用したり、又は前記マトリックスを崩壊することによって排出することができる。

【0157】

３．４．１．５． リポソーム
一具体例において、本発明のＤＮＡ作製物はリポソームによって伝達されてよい。リン脂質を過量の水性媒質に懸濁させればポソームは自然的に形成される。リポソーム媒介ＤＮＡ伝達は、Ｄｏｓ Ｓａｎｔｏｓ Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．５６６：７１７－７３０（２０１９）；Ｒａｓｏｕｌｉａｎｂｏｒｏｕｊｅｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｔｅｒ Ｓｃｉ Ｅｎｇ Ｃ Ｍａｔｅｒ Ｂｉｏｌ Ａｐｐｌ．７５：１９１－１９７（２０１７）；Ｘｉｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｚｉｅ ６６（３）：ｌ５８－ｌ６４（２０１１）；Ｎｉｃｏｌａｕ ａｎｄ Ｓｅｎｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２１：１８５－１９０（１９８２） ａｎｄ Ｎｉｃｏｌａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１４９：１５７－１７６（１９８７）に説明されている通り成功的であった。リポソームを用いて動物細胞を形質感染させるための商業的な試薬の例は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を含む。本発明のＤＮＡ作製物を捕集しているリポソームは 細胞内取込み（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）、吸着、及び融合のような機序によって細胞と相互作用し、その後、前記配列を細胞内に伝達する。

【0158】

３．４．１．６． 形質感染法
ウイルス性ベクターを用いてＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物又はＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物を伝達するとき、当該分野に公知の様々なウイルス性感染方法で前記作製物を伝達することができる。ウイルス性ベクターを用いて宿主細胞を感染させることが当分野に公知されている。

【0159】

本発明の薬学組成物を非経口的に投与できる。非経口投与の場合、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、又は局所注射を用いることができる。例えば、前記薬学組成物を逆行性静脈内注射で注射できる。

【0160】

好ましくは、本発明の薬学組成物を筋肉に投与できる。一具体例において、神経病症（例えば、神経性疼痛又は他の症状）に影響を受ける筋肉を標的化して投与する。

【0161】

３．５． 投与量
前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物及び前記ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物を治療的有効量で投与する。本明細書で説明された方法において、ＤＮＡ作製物の治療的有効量、又は投与量は、単独で、ＤＮＡ作製物との組合せで、又は他の治療剤との組合せで、前記対象体に神経病症を治療するのに効果的な投与量である。

【0162】

本明細書で説明された方法の一具体例において、前記ＤＮＡ作製物（ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物及びＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物）のそれぞれは、１μｇ～２００ｍｇ、１ｍｇ～２００ｍｇ、１ｍｇ～ｌ００ｍｇ、１ｍｇ～５０ｍｇ、１ｍｇ～２０ｍｇ、２ｍｇ～１０ｍｇ、１６ｍｇ、８ｍｇ、４ｍｇ又は２ｍｇの総投与量で投与されてよい。

【0163】

一具体例において、対象体に投与されるＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物の総投与量及びＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物の総投与量は、同一である。特定の具体例において、ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物の総投与量及びＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物の総投与量は、異なる。一具体例において、ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物の総投与量は、ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物の総投与量によって調節される。一具体例において、ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物の総投与量は、ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物の総投与量によって調節される。

【0164】

一具体例において、各ＤＮＡ作製物の総投与量は、多重の個別注射量に分割される。一具体例において、前記総投与量は、同じ注射量で複数に分割される。一具体例において、前記総投与量は不均等注射量に分割される。

【0165】

様々な分割された投与量において、各ＤＮＡ作製物の総投与量は、４、８、１６、２４、３２又は６４ヵ所の異なる注射部位に投与される。

【0166】

一具体例において、注射当たり各ＤＮＡ作製物の注射量は、０．１～２０ｍｇ、１～１０ｍｇ、２～８ｍｇ、又は３～８ｍｇの範囲に属する。特定の具体例において、注射当たり各ＤＮＡ作製物の投与量は、０．１ｍｇ、０．１５ｍｇ、０．２ｍｇ、０．２５ｍｇ、０．３ｍｇ、０．３５ｍｇ、０．４ｍｇ、０．４５ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、４ｍｇ、８ｍｇ、１６ｍｇ、又は３２ｍｇである。

【0167】

一具体例において、ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物及びＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、共に投与される。この場合、組み合わせられた２つのＤＮＡ作製物の投与量は、注射当たり０．１～２０ｍｇ、１～１０ｍｇ、２～８ｍｇ、又は３～８ｍｇの範囲に属する。特定の具体例において、組み合わせられた２つのＤＮＡ作製物の投与量は、注射当たり０．１ｍｇ、０．１５ｍｇ、０．２ｍｇ、０．２５ｍｇ、０．３ｍｇ、０．３５ｍｇ、０．４ｍｇ、０．４５ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、４ｍｇ、８ｍｇ、１６ｍｇ、又は３２ｍｇである。

【0168】

各ＤＮＡ作製物、又は組み合わせられたＤＮＡ作製物の総投与量は、１回訪問又は２回以上の訪問で投与されてよい。

【0169】

一般の分割投与量の具体例において、多回注射量の全ては、相互に１時間内に投与されてよい。一具体例において、多回注射量の全ては、相互に１．５、２、２．５又は３時間内に投与されてよい。

【0170】

前記方法の様々な具体例において、各ＤＮＡ作製物の総投与量又は組み合わせられた２つのＤＮＡ作製物の総投与量は、単一の一元化した投入量にする場合も複数の注射量に分ける場合も、前記対象体に１回だけ投与される。

【0171】

一具体例において、各ＤＮＡ作製物又は組み合わせられた２つのＤＮＡ作製物の総投与量を、１回、２回、３回、又は４回の訪問にわたって複数の注入部位に投与することを、単一周期とすることができる。例えば、６４ｍｇ、３２ｍｇ、１６ｍｇ、８ｍｇ、４ｍｇ又は２ｍｇの各ＤＮＡ作製物を２回の訪問にわたって複数の注射部位に投与することが単一周期であり得る。前記２回の訪問は、３、５、７、１４、２１又は２８日間隔にすることができる。

【0172】

一具体例において、１回、２回、３回、又は４回の訪問にわたってＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物及びＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物を複数の注射部位に投与することが単一周期であってもよい。例えば、２回の訪問にわたって、６４ｍｇ、３２ｍｇ、１６ｍｇ、８ｍｇ、４ｍｇ又は２ｍｇのＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を複数の注射部位に投与すること、及び６４ｍｇ、３２ｍｇ、１６ｍｇ、８ｍｇ、４ｍｇ又は２ｍｇのＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物を複数の注射部位に投与することが単一周期であってもよい。前記２回の訪問は、３、５、７、１４、２１又は２８日間隔であってもよい。

【0173】

一具体例において、前記周期は反復されてもよい。前記周期は、２回、３回、４回、５回、６回、又はそれ以上であり得る。

【0174】

一具体例において、前記周期は、先行周期施行後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヵ月、又はそれ以上反復されてよい。

【0175】

一具体例において、後続周期における総投与量は、以前周期における総投与量と同一である。一具体例において、後続周期における総投与量は、以前周期における総投与量と異なる。

【0176】

好ましい具体例において、前記ＤＮＡ作製物（ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物又はＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物）は、患肢当たり８ｍｇの投与量で、同等に分けられた複数の筋肉内注射及び複数の訪問で、投与され、ここで、任意の単一訪問での前記複数の注射それぞれを個別の注射部位で行う。特定の具体例において、前記ＤＮＡ作製物（ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物又はＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物）を患肢当たり８ｍｇの投与量で、当日（第０日）に肢体当たり４ｍｇの第１投与量で、第１４日に肢体当たり４ｍｇの第２投与量で均等に分けて投与し、ここで、第１及び第２投与量をそれぞれ複数の注射量に均等分割する。

【0177】

一具体例において、ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物及びＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物を同時に又は個別に、患肢当たり（ｐｅｒ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｌｉｍｂ）１６ｍｇの総投与量で、複数の筋肉内注射及び複数の訪問に均等分割して投与し、任意の単一訪問における複数の注射はそれぞれ、個別の注射部位で行われる。一具体例において、ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を患肢当たり８ｍｇの投与量投与及びＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物を患肢当たり８ｍｇの投与量投与が１周期を構成する。前記周期は、１回、２回、３回又はそれ以上反復されてよい。

【0178】

実投与量、速度、及び投与の時間過程は、治療される神経病症の特性及び重症度に依存する。一具体例において、１つ以上のＤＮＡ作製物が神経病症、例えば、神経性疼痛の症状を低減するのに有効な量で投与される。一具体例において、前記量は、投与１週内に神経病症の症状を減少させるのに有効である。一具体例において、前記量は、投与後２週、３週、又は４週内に神経病症の症状を減少させるのに有効である。

【0179】

一具体例において、２つの異なる類型のＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物又は２つの異なる類型のＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物を共に投与する。一具体例において、二重発現作製物を伝達して、２つのＩＧＦ－１の異型体又はＨＧＦの発現を誘導する。

【0180】

当該分野における技術者に公知の通常の技術によって、前記薬学組成物を、前述したように薬学的許容担体及び／又は賦形剤と共に剤形化し、最終的にいくつかの形態、単位投与形態及び多重投与形態を提供する。前記剤形の非制限的な例は、溶液、油性又は水性媒質中の懸濁液又は乳濁液、抽出液、エリキシル、粉末、顆粒、錠剤及びカプセルを含むが、これに制限されなく、また、分散剤又は安定化剤をさらに含んでもよい。

【0181】

生体内及び／又は試験管内分析法を用いて最適投与範囲を確認することに役立ってもよい。前記剤形に用いられる精密な投与量はまた、投与経路及び状態の深刻度にも依存し、及び主治医の判断と対象体の状態によって決定される必要がある。有効量は、試験管内又は動物モデル試験システムから由来した投与量反応曲線から外挿されてよい。

【0182】

前記ＤＮＡ作製物を単独で又は他の治療と組み合わせて、同時に又は順次に投与できる。

【0183】

３．６． 神経病症患者
本明細書で説明された方法において、治療に対して選択された患者は神経病症を有する。前記患者は、末梢神経病症、頭蓋骨神経病症、自己分泌神経病症又は局所神経病症を持つことがある。前記神経病症は、疾患、傷害、感染、又はビタミン欠乏状態に起因し得る。例えば、前記神経病症は、糖尿病、ビタミン欠乏症、自己免疫疾患、遺伝子又は遺伝性疾患、アミロイド症、尿毒症、毒素や毒薬、外傷や傷害、腫瘍によって生じることがあり、又は特発性であり得る。一具体例において、前記患者は糖尿性末梢神経病症を有する。

【0184】

前記患者は疼痛（神経性疼痛）、他の感覚欠損（例えば、感覚の欠損、無感覚（ｎｕｍｂｎｅｓｓ）、しびれ（ｔｉｎｇｌｉｎｇ）など）、運動欠陥（例えば、無力、反射消失（ｌｏｓｓ ｏｆ ｒｅｆｌｅｘｅｓ）、筋肉消失（ｌｏｓｓ ｏｆ ｍｕｓｃｌｅ ｍａｓｓ）、痙攣、機敏さの鈍化（ｌｏｓｓ ｏｆ ｄｅｘｔｅｒｉｔｙ）等）、及び自律神経失調症（例えば、吐き気、嘔吐、勃起不全、めまい、便泌、下痢など）のような、神経病症と関連した１つ以上の症状を有し得る。

【0185】

前記患者は、本明細書で提供された治療方法に加えて、当該分野に公知の１つ以上の治療方法によって治療されてもよい。

【0186】

本発明の治療方法を用いて神経病症を持つヒト患者又は動物を治療することができる。

【0187】

３．７． 投与順序
本明細書に説明の方法は、ヒトＩＧＦ－１異型体を発現可能な第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物の治療的有効量を投与し、及びヒトＨＧＦ異型体を発現可能な第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物の治療的有効量を投与する段階を含む。前記治療的有効量は、前記疾病を組み合わせて又は個別的に治療するのに有効な量である。

【0188】

第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階及び第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階は、同時に又は順次に行われてよい。一具体例において、第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物の投与及び第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物の投与は個別的に、少なくとも数分間隔、数時間間隔、１日間隔、２日間隔、３日間隔、１週間隔、２週間隔、３週間隔、１ヶ月間隔、２ヶ月間隔、３ヶ月間隔、又は６ヶ月間隔で行われる。一具体例において、第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階は、第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物の段階前に行われる。一具体例において、第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階は、第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階前に行われる。

【0189】

一具体例において、第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階、第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階、又はこれら両方が反復される。一具体例において、前記段階は、２回、又は３回以上反復される。

【0190】

前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、本明細書で提供される前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物又はその変形物のうち任意のものでよい。これは、１つ以上のＩＧＦ－１異型体を発現させることができる。これは、１つのＩＧＦ－１異型体、クラスＩ，Ｅｃ（配列番号１６）；クラスＩＩ，Ｅａ（配列番号１８）；クラスＩ，Ｅｂ（配列番号２０）；又はクラスＩ，Ｅａ異型体（配列番号１４）を暗号化するＤＮＡ作製物でよい。これは、２つのＩＧＦ－１異型体を暗号化する二重発現ＤＮＡ作製物でよい。一具体例において、前記ＤＮＡ作製物は、クラスＩ，Ｅｃ（配列番号１６）及びクラスＩ，Ｅａ異型体（配列番号１４）を暗号化できる。

【0191】

前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、本明細書で提供されたＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物又はその変形物のうち任意のものでよい。これは、１つ以上のＨＧＦ異型体を発現できる。これは、１つのＨＧＦ異型体、ｆｌＨＧＦ（配列番号１１）又はｄＨＧＦ（配列番号１２）を暗号化するＤＮＡ作製物でよい。これは、２つのＨＧＦ異型体を暗号化する二重発現ＤＮＡ作製物でよい。好ましい具体例において、前記ＤＮＡ作製物は、配列番号１３のポリヌクレオチドを含む。これはＶＭ２０２でよい。

【0192】

前記方法は、第２ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階をさらに含むことができる。前記第２ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物と同一でもよく異なってもよい。前記第２ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、本明細書で提供されたＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物又はその変形物のうち任意のものでよい。第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階及び第２ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階は、同時に又は順次に行われてよい。特定の具体例において、クラスＩ，Ｅｃ（配列番号１６）を発現できる第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物及びクラスＩ，Ｅａ異型体（配列番号１４）を発現できる第２ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を同時に投与する。一具体例において、第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物の投与及び第２ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物の投与は個別に、少なくとも数分間隔、数時間間隔、１日間隔、２日間隔、３日間隔、１週間隔、２週間隔、３週間隔、１ヶ月間隔、２ヶ月間隔、３ヶ月間隔、又は６ヶ月間隔で行われる。

【0193】

前記方法は、第２ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階をさらに含むことができる。前記第２ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物と同一でも異なってもよい。前記第２ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、本明細書で提供されたＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物又はその変形物のうち任意のものでよい。第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階及び第２ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階は、同時に又は順次に行われてよい。例えば、ｆｌＨＧＦ（配列番号１１）を発現できる第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物及びｄＨＧＦ（配列番号１２）を発現できる第２ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は同時に投与されてよい。一具体例において、第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物の投与及び第２ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物の投与は個別に、少なくとも数分間隔、数時間間隔、１日間隔、２日間隔、３日間隔、１週間隔、２週間隔、３週間隔、１ヶ月間隔、２ヶ月間隔、３ヶ月間隔、又は６ヶ月間隔で行われる。

【0194】

一具体例において、前記方法は、ＶＭ２０２をｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ６又はｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０と共に投与することを含む。一具体例において、前記方法は、他のＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物（例えば、配列番号３３のポリヌクレオチドを含む作製物）をｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ６又はｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０と共に投与することを含む。

【0195】

一具体例において、前記方法は、ＶＭ２０２をｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ６又はｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ１０と共に投与することを含む。一具体例において、前記方法は、他のＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物（例えば、配列番号３３のポリヌクレオチドを含む作製物）をｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ６又はｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ１０と共に投与することを含む。

【0196】

一具体例において、前記方法は、ＶＭ２０２を投与した後、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ６又はｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０を投与することを含む。一具体例において、前記方法は、他のＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物（例えば、配列番号３３のポリヌクレオチドを含む作製物であるｐＣＫ－ＨＧＦ７２８）を投与した後、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ６又はｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０を投与することを含む。一具体例において、前記方法は、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ６又はｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０の投与後、ＶＭ２０２又は他のＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物（例えば、ｐＣＫ－ＨＧＦ７２８）を投与することを含む。

【0197】

一具体例において、前記方法は、ＶＭ２０２の投与後、ｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ６又はｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ１０を投与することを含む。一具体例において、前記方法は、他のＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物（例えば、配列番号３３のポリヌクレオチドを含む作製物であるｐＣＫ－ＨＧＦ７２８）の投与後、ｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ６又はｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ１０を投与することを含む。一具体例において、前記方法は、ｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ６又はｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ１０の投与後、ＶＭ２０２又は他のＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物（例えば、ｐＣＫ－ＨＧＦ７２８）を投与することを含む。

【0198】

４． ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物及びＨＧＦ－１暗号化ＤＮＡ作製物を含む薬学組成物

【0199】

他の観点において、ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物及びＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物を含む薬学組成物が提供される。

【0200】

４．１． 薬学組成物及び注射用単位投薬剤形
静脈内、筋肉内、皮膚内、又は皮下注射用に使用するために、前記ＤＮＡ作製物は、非経口的に許容された、発熱因子がなく、適度のｐＨ、等張性、及び安定性を有する水溶液の形態でよい。当該分野における関連者らは、塩化ナトリウム注射液、リンゲル液、乳酸化点滴注射液のように、等張性賦形剤を使用する適切な溶液も製造できる。防腐剤、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤及び／又は他の添加剤を必要時に使用することができる。

【0201】

一具体例において、前記薬学組成物は、一つのＩＧＦ－１異型体を暗号化するＤＮＡ作製物を含む。例えば、前記ＤＮＡ作製物は、クラスＩ，Ｅｃ異型体（異型体＃１）；クラスＩＩ，Ｅａ異型体（異型体＃２）；クラスＩ，Ｅｂ異型体（異型体＃３）；又はクラスＩ，Ｅａ異型体（異型体＃４）を発現させることができる。前記ＤＮＡ作製物は、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃ｌ、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃２、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃３、又はｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃４でよい。一具体例において、前記ＤＮＡ作製物は、ｐＴｘ－ＩＧＦ－１＃ｌ、ｐＴｘ－ＩＧＦ－１＃２、ｐＴｘ－ＩＧＦ－１＃３、又はｐＴｘ－ＩＧＦ－１＃４でよい。

【0202】

一具体例において、前記薬学組成物は、それぞれ、ＩＧＦ－１異型体を暗号化する１つより多いＤＮＡ作製物を含む。例えば、前記薬学組成物は、（ｉ）クラスＩ，Ｅｃ異型体（異型体＃１）を暗号化する第１ＤＮＡ作製物及びクラスＩＩ，Ｅａ異型体（異型体＃２）を暗号化する第２ＤＮＡ作製物；（ｉｉ）クラスＩ，Ｅｃ異型体（異型体＃１）を暗号化する第１ＤＮＡ作製物及びクラスＩ，Ｅｂ異型体（異型体＃３）を暗号化する第２ＤＮＡ作製物；（ｉｉｉ）クラスＩ，Ｅｃ異型体（異型体＃１）を暗号化する第１ＤＮＡ作製物及びクラスＩ，Ｅａ異型体（異型体＃４）を暗号化する第２ＤＮＡ作製物；（ｉｖ）クラスＩＩ，Ｅａ異型体（異型体＃２）を暗号化する第１ＤＮＡ作製物及びクラスＩ，Ｅｂ異型体（異型体＃３）を暗号化する第２ＤＮＡ作製物；（ｖ）クラスＩＩ，Ｅａ異型体（異型体＃２）を暗号化する第１ＤＮＡ作製物及びクラスＩ，Ｅａ異型体（異型体＃４）を暗号化する第２ＤＮＡ作製物；（ｖｉ）クラスＩ，Ｅｂ異型体（異型体＃３）を暗号化する第１ＤＮＡ作製物及びクラスＩ，Ｅａ異型体（異型体＃４）を暗号化する第２ＤＮＡ作製物を含むことができる。

【0203】

一具体例において、前記薬学組成物は、１つより多いＩＧＦ－１異型体を発現できるＤＮＡ作製物である二重発現作製物を含む。例えば、前記薬学組成物は、（ｉ）クラスＩ，Ｅｃ異型体（異型体＃１）及びクラスＩＩ，Ｅａ異型体（異型体＃２）；（ｉｉ）クラスＩ，Ｅｃ異型体（異型体＃１）及びクラスＩ，Ｅｂ異型体（異型体＃３）；（ｉｉｉ）クラスＩ，Ｅｃ異型体（異型体＃１）及びクラスＩ，Ｅａ異型体（異型体＃４）；（ｉｖ）クラスＩＩ，Ｅａ異型体（異型体＃２）及びクラスＩ，Ｅｂ異型体（異型体＃３）；（ｖ）クラスＩＩ，Ｅａ異型体（異型体＃２）及びクラスＩ，Ｅａ異型体（異型体＃４）；（ｖｉ）クラスＩ，Ｅｂ異型体（異型体＃３）及びクラスＩ，Ｅａ異型体（異型体＃４）を発現させることができる二重発現作製物を含む。

【0204】

一具体例において、前記薬学組成物は、二重発現作製物である、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ６又はｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０を含む。一具体例において、前記薬学組成物は、二重発現作製物であるｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ６又はｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ１０を含む。一具体例において、前記薬学組成物は、例えば、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ６及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０の両方を含む２つの二重発現作製物を含む一具体例において、前記薬学組成物は、例えば、ｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ６及びｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ１０の両方を含む２つ二重発現作製物を含む。

【0205】

一具体例において、前記薬学組成物は、１つのＨＧＦ異型体を暗号化するＤＮＡ作製物をさらに含む。例えば、前記ＤＮＡ作製物は、ｆｌＨＧＦ又はｄＨＧＦを発現させることができる。一具体例において、前記薬学組成物はそれぞれ、一つのＨＧＦ異型体を暗号化する、１つより多いＤＮＡ作製物を含む。例えば、前記薬学組成物は、ｆｌＨＧＦを暗号化する第１ＤＮＡ作製物及びｄＨＧＦを暗号化する第２ＤＮＡ作製物を含むことができる。

【0206】

一具体例において、前記薬学組成物は、１つより多いＨＧＦ異型体を発現できるＤＮＡ作製物である二重発現作製物を含む。例えば、前記薬学組成物は、ｆｌＨＧＦ及びｄＨＧＦの両方を発現できる二重発現作製物を含むことができる。

【0207】

好ましい具体例において、前記薬学組成物は、二重発現作製物であるｐＣＫ－ＨＧＦ－Ｘ７（ＶＭ２０２）を含む。一具体例において、前記薬学組成物はそれぞれ、ｆｌＨＧＦ又はｄＨＧＦを暗号化する２つＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物を含む。一具体例において、前記薬学組成物は、ｆｌＨＧＦ（ｐＣＫ－ＨＧＦ７２８）を発現できる１つのＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物を含む。

【0208】

一具体例において、前記薬学組成物は、他の治療剤をさらに含む。例えば、前記薬学組成物は、神経病症を治療するのに効果的な他の治療剤をさらに含むことができる。

【0209】

他の様々な具体例において、１つ以上のＤＮＡ作製物は個別又は組み合わせとして０．０１ｍｇ／ｍｌ、０．０５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．２５ｍｇ／ｍｌ、０．４５ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、又は１ｍｇ／ｍｌの濃度の液体組成物に存在する。一具体例において、前記単位投薬剤形は、１つ以上のＤＮＡ作製物を個別又は組合せとして０．０１ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、又は１ｍｇ／ｍｌの濃度で有する前記薬学組成物の２ｍｌを含有するバイアルである。一具体例において、前記単位投薬剤形は、１つ以上のＤＮＡ作製物を個別又は組合せとして０．０１ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、又は１ｍｇ／ｍｌの濃度で有する薬学組成物の１ｍｌを含むバイアルである。一具体例において、前記単位投薬剤形は、１つ以上のＤＮＡ作製物を個別又は組合せとして０．０１ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、又は１ｍｇ／ｍｌの濃度で有する前記薬学組成物の１ｍｌ未満を含むバイアルである。

【0210】

一具体例において、前記単位投薬剤形は、バイアル、アンプル、瓶、又はプレフィルド注射器である。一具体例において、前記単位投薬剤形は、本発明の１つ以上のＤＮＡ作製物の０．０１ｍｇ、０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．２５ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ、２．５ｍｇ、５ｍｇ、８ｍｇ、１０ｍｇ、１２．５ｍｇ、１６ｍｇ、２４ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、７５ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、又は２００ｍｇを含有する。

【0211】

一具体例において、単位投薬剤形中の前記薬学組成物は、液体形態である。様々な具体例において、前記単位投薬剤形は、前記薬学組成物を０．１ｍｌ～５０ｍｌ含む。一具体例において、前記単位投薬剤形は、薬学組成物を０．２５ｍｌ、０．５ｍｌ、１ｍｌ、２．５ｍｌ、５ｍｌ、７．５ｍｌ、１０ｍｌ、２５ｍｌ、又は５０ｍｌ含有する。

【0212】

特定の具体例において、前記単位投薬剤形は、前記薬学組成物を単位投薬剤形で０．５ｍｌ、１ｍｌ、１．５ｍｌ又は２ｍｌを含有するバイアルである。皮下、皮膚内、又は筋肉内投与に適した具体例は、予め充填された注射器、自動注入器、及び自動注入ペンを含み、それぞれは、前述した前記薬学組成物の既に設定された量を含有する。

【0213】

様々な具体例において、前記単位投薬剤形は、注射器及び前記薬学組成物の既に設定された量を含む、予め充填された（ｐｒｅｌｏａｄｅｄ）注射器である。特定の予め充填された注射器の具体例において、前記注射器は、皮下投与に適応されたものである。特定の具体例において、前記注射器は、自己投与に適する。特定の具体例において、前記予め充填された注射器は、使い捨て注射器である。

【0214】

様々な具体例において、前記予め充填された注射器は、前記薬学組成物を約０．１ｍＬ～約０．５ｍＬ含有する。特定の具体例において、前記注射器は、薬学組成物を約０．５ｍＬ含有する。特定の具体例において、前記注射器は、前記薬学組成物を１．０ｍＬ含有する。特定の具体例において、前記注射器は、前記薬学組成物を約２．０ｍＬ含有する。

【0215】

特定の具体例において、前記単位投薬剤形は、自動注入ペンである。前記自動注入ペンは、明細書で用いられるように、薬学組成物を含有する自動注入ペンを含む。一具体例において、前記自動注入ペンは、あらかじめ設定された体積の薬学組成物を伝達する。他の具体例において、前記自動注入ペンは、ユーザによって設定された一定体積の薬学組成物を伝達するように構成される。

【0216】

様々な具体例において、前記自動注入ペンは、前記薬学組成物を約０．１ｍＬ～約５．０ｍＬ含有する。特定の具体例において、前記自動注入ペンは、前記薬学組成物を約０．５ｍＬ含有する。特定の具体例において、前記自動注入ペンは、前記薬学組成物を約１．０ｍＬ含有する。他の具体例において、前記自動注入ペンは、前記薬学組成物を約５．０ｍＬ含有する。

【0217】

４．２． 凍結乾燥したＤＮＡ剤形
一具体例において、本発明のＤＮＡ作製物は、凍結乾燥した組成物として剤形化される。特定の具体例において、ＤＮＡ作製物は、米国特許８，３８９，４９２に開示されているように凍結乾燥し、前記特許は参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。

【0218】

一具体例において、ＤＮＡ作製物は、特定の賦形剤、例えば、炭水化物及び塩を用いて剤形化され、その後凍結乾燥する。診断的又は治療的製剤として利用される前記ＤＮＡ作製物の安定性は、凍結乾燥前に、安定化量の炭水化物を含む水溶液を用いて前記ＤＮＡ作製物を剤形化することによって増大させることができる。

【0219】

前記炭水化物は、スクロース、グルコース、ラクトース、トレハロース、アラビノース、ペントース、リボース、キシロース、ガラクトース、ヘキソース、イドース、マンノース、タロース、ヘプトース、フルクトース、グルコン酸、ソルビトール、マンニトール、メチルａ－グルコピラノシド、マルトース、イソアスコルビン酸、アスコルビン酸、ラクトン、ソルボース、グルカル酸、エリトロース、トレオース、アロース、アルトロース、グロース、エリトルロース、リブロース、キシルロース、プシコース、タガトース、グルクロン酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸、グルコサミン、ガラクトサミン、ノイラミン酸、アラビナン類、フルクタン類、フカン類、ガラクタン類、ガラクツロナン類、グルカン類、マンナン類、キシラン類、レバン、フコイダン、カラギーナン、ガラクトカロロース、ペクチン類、ペクチン酸類、アミロース、プルラン、グリコーゲン、アミロペクチン、セルロース、デキストラン、シクロデキストリン、プスツラン、キチン、アガロース、ケラチン、コンドロイチン、デルマタン、ヒアルロン酸、アルギン酸、キサンタンガム、又は澱粉のような単糖類、オリゴ糖又は多糖類でよい。

【0220】

一連の具体例において、前記炭水化物はマンニトール又はスクロースである。

【0221】

凍結乾燥前の炭水化物溶液は、水中の炭水化物に該当したり、又は緩衝液が含まれてよい。このような緩衝液の例は、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＳ又はＴＲＩＳ／ＥＤＴＡを含む。一般に、前記炭水化物溶液は、前記ＤＮＡ作製物と約０．０５％～約３０％スクロース、通常０．１％～約１５％スクロース、例えば０．２％～約５％、１０％又は１５％スクロース、好ましくは約０．５％～１０％スクロース、１％～５％スクロース、１％～３％スクロース、及び最も好ましくは約１．１％スクロースの最終濃度まで組み合わせた。

【0222】

本発明のＤＮＡ剤形はまた、塩、例えば、ＮａＣｌ又はＫＣｌを含む。一具体例において、前記塩は、ＮａＣｌである。一具体例において、ＤＮＡ剤形の塩は、約０．００１％～約１０％、約０．１％～５％、約０．１％～４％、約０．５％～２％、約０．８％～１．５％、約０．８％～１．２％ ｗ／ｖからなる群から選ばれる量でよい。特定の具体例において、ＤＮＡ剤形の塩は、約０．９％ ｗ／ｖの量である。

【0223】

凍結乾燥した剤形から再構成された液体組成物中の１つ以上のＤＮＡ作製物の最終濃度は、約１ｎｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬでよい。例えば、前記最終濃度は、個別に又は組合せで、約１ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ、約５０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ、約５００μｇ／ｍＬ、約６００μｇ／ｍＬ、約８００μｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ、約２ｍｇ／ｍＬ、約２．５ｍｇ／ｍＬ、約３ｍｇ／ｍＬ、約３．５ｍｇ／ｍＬ、約４ｍｇ／ｍＬ、約４．５ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ、約５．５ｍｇ／ｍＬ、約６ｍｇ／ｍＬ、約７ｍｇ／ｍＬ、約８ｍｇ／ｍＬ、約９ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ、又は約３０ｍｇ／ｍＬでよい。本発明の特定の具体例において、１つ以上のＤＮＡ作製物の最終濃度は、個別に又は組合せで、約１００μｇ／ｍＬ～約２．５ｍｇ／ｍＬである。本発明の特定の具体例において、１つ以上のＤＮＡ作製物の最終濃度は個別に又は組合せで約０．５ｍｇ／ｍＬ～１ｍｇ／ｍＬである。

【0224】

本発明のＤＮＡ剤形は、当該分野に公知の標準条件下で凍結乾燥する。本発明のＤＮＡ剤形を凍結乾燥させる方法は、（ａ）容器（例えば、バイアル）に、ＤＮＡ剤形（例えば、本発明の１つ以上のＤＮＡ作製物を含むＤＮＡ剤形）、塩及び炭水化物を積載し、凍結乾燥器に入れることであって、前記凍結乾燥器は約５℃～約－５℃の出発温度を有すること；（ｂ）前記ＤＮＡ剤形を０℃以下の温度（例えば、－１０℃～－５０℃）に冷却させること；及び（ｃ）前記ＤＮＡ剤形を実質的に乾燥させること、を含むことができる。本発明のＤＮＡ剤形の凍結乾燥に対する条件、例えば、温度及び期間は、当該分野における熟練者が、凍結乾燥変数、例えば、使用する凍結乾燥機械の類型、使用されたＤＮＡの量、及び使用された容器の大きさを考慮して調節できる。

【0225】

その後、前記凍結乾燥したＤＮＡ剤形を保持する前記容器をシールした後、様々な温度（例えば、室温～約－１８０℃、好ましくは約２～８℃～約－８０℃、より好ましくは約－２０℃～約－８０℃、及び最も好ましくは約－２０℃）で一定期間保管した。特定の観点において、前記凍結乾燥したＤＮＡ剤形は、好ましくは約２～８℃～約－８０℃の範囲内で少なくとも６ヶ月の期間において有意な活性の損失なく安定である。安定した保管プラスミドＤＮＡ剤形はまた、研究又はプラスミドベース療法のような使用前に、長期間に安定した形態でプラスミドＤＮＡを保管することに相応する。保管時間は、数ヵ月、１年、５年、１０年、１５年、又は２０年まであり得る。好ましくは、前記製造物は少なくとも約３年間安定である。

【0226】

５． 併用療法用キット
他の観点において、本発明は、ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物及びＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物を使用する併用療法用キットを提供する。

【0227】

前記キットは、ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を含む第１薬学組成物及びＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物を含む第２薬学組成物を含むことができる。一具体例において、前記第１薬学組成物及び前記第２薬学組成物は、単一容器に入っている同一薬学組成物である。一具体例において、前記第１薬学組成物及び前記第２薬学組成物は、２つ以上の別個の容器に入っている別の薬学組成物である。

【0228】

前記第１薬学組成物は、本明細書で提供された前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物のうち任意のものを含むことができる。例えば、前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、１つのＩＧＦ－１異型体を発現させることができる単一発現ＤＮＡ作製物、又は２つのＩＧＦ－１異型体を発現させる二重発現ＤＮＡ作製物でよい。前記第２薬学組成物は、本明細書で提供されたＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物のうち任意のものを含むことができる。例えば、前記ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、１つのＨＧＦ異型体を発現させることができる単一発現ＤＮＡ作製物、又は２つのＨＧＦ異型体を発現させる二重発現ＤＮＡ作製物でよい。

【0229】

前記キットは、ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物、ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物又は両方のいずれか一つ以上の単位投薬量を含むことができる。

【0230】

前記キットは、前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物、ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物又は両方を投与する方法を説明する指針書をさらに含むことができる。前記方法は、本明細書で提供される投与方法のうち任意のものでよい。

【実施例】

【0231】

下記実施例は、通常の技術者に、本発明をどのように作って利用するかに関する完全な開示及び説明を提供するために設定されたものであり、本発明者らがその発明として見なす範囲を制限することを意図せず、また、下記実験が、実行された全ての実験である又はその実験しかないいうことを表すことを意図しない。使用された数値（例えば、量、温度など）に対して正確性を担保するための努力をしてきたが、特定の実験的誤差と偏差は考慮されるべきである。別に断らない限り、部は重量部で、分子量は重量平均分子量で、温度は摂氏で、及び圧力は気圧である。標準略語、例えば、ｂｐ、塩基対；ｋｂ、キロベース；ｐｌ、ピコリットル；ｓ又はｓｅｃ、秒；ｍｉｎ、分；ｈ又はｈｒ、時間；ａａ、アミノ酸；ｎｔ、ヌクレオチド；などを用いることができる。

【0232】

本発明の実施は、別に断らない限り、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術及び薬学を、当該分野における技術内で用いることができる。

【0233】

実施例１：ネズミＣＣＩ神経病症モデルにおいて、ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物及びＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物の併用投与の治療効能
ＩＧＦ－１－暗号化作製物及びＨＧＦ－暗号化作製物の併用投与の治療的効果を、神経病症の研究において広く認定されたモデルであるマウスの慢性収縮性損傷モデル（ＣＣＩ）において試験した。ＣＣＩマウスモデルは、末梢で慢性神経損傷を招くいくつかの過程を開始するものと知られた坐骨神経の慢性収縮性損傷によって生成した。また、ＣＣＩマウスは神経性疼痛を有するものと知られている。

【0234】

詳細には、生後４週雄ＩＣＲマウス（体重２４～２６ｇ）を購入してＣＣＩモデルを作り、及び前記効果を試験するために用いた。全ての外科的及び試験的過程は、ソウル大学校動物実験倫理委員会の承認を得た。マウスでＣＣＩを行うために、約１ｃｍ長で鈍的剥離（ｂｌｕｎｔ ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）し、通常、殿筋及び大腿二頭筋の間にある、右坐骨神経を露出させた。一旦、３分岐の部位に隣接した坐骨神経が露出されると、これを６－０シルク（Ｅｔｈｉｃｏｎ）縫合糸を用いて０．５ｍｍ間隔で３回緩く結紮した。右後足が顕著に痙攣するまで前記結紮部位を若干引き締めた。シャム手術（Ｓｈａｍ－ｏｐｅｒａｔｅｄ）マウスには、右大腿に同様の剥離を施すが、坐骨神経における結紮はしなかった。

【0235】

総２００μｇのＤＮＡ作製物をＣＣＩ当日に筋肉内注射し、及び機械的刺激による疼痛敏感度をフォンフレイフィラメント（Ｖｏｎ Ｆｒｅｙ’ｓ ｆｉｌａｍｅｎｔ）で測定した。各群に注射されたＤＮＡ作製物の類型と量を、下表１に整理した。

【0236】

【表1】

【0237】

表１で、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃１、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃２、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃３、及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃４は、ｐＣＫベクターにクローンされた個別ヒトＩＧＦ－１異型体を暗号化するＤＮＡ作製物である。前記ＤＮＡ作製物は、標準分子クローニング技術を用いてｐＣＫベクターで作製された。詳細には、４個ポリヌクレオチド（配列番号１５、１７、１９及び２１）を、Ｂｉｏｎｅｅｒ（韓国）から供給されたカスタマイズＤＮＡ合成工程から得た。このようなポリヌクレオチドを、５’リンカー、Ｃｌａ Ｉ及び３’リンカー、Ｓａｌ Ｉを有するものとして合成した。ｐＣＫベクター及び前記ポリヌクレオチドをＣｌａ Ｉ及びＳａｌ Ｉで処理した。クラスＩ，Ｅｃ異型体のコーディング配列であり、及びＩＧＦ－１遺伝子のエクソン１、３／４、５及び６の少なくとも一部を含む配列番号１７のポリヌクレオチドを、ｐＣＫベクターのクローニング部位に挿入することによって、クラスＩ，Ｅｃ（異型体＃１）を暗号化するＩＧＦ－１＃１を生成した。クラスＩＩ，Ｅａ異型体のコーディング配列であり、及びＩＧＦ－１遺伝子のエクソン２、３／４及び６の少なくとも一部を含む配列番号１９のポリヌクレオチドをｐＣＫベクターのクローニング部位に挿入することによって、クラスＩＩ，Ｅａ（異型体＃２）を暗号化するＩＧＦ－１＃２を生成した。クラスＩ，Ｅｂ異型体のコーディング配列であり、及びＩＧＦ－１遺伝子のエクソン１、３／４及び５の少なくとも一部を含む配列番号２１のポリヌクレオチドをｐＣＫベクターのクローニング部位に挿入することによって、クラスＩ，Ｅｂ（異型体＃３）を暗号化するＩＧＦ－１＃３を生成した。クラスＩ，Ｅａ異型体のコーディング配列であり、及びＩＧＦ－１遺伝子のエクソン１、３／４及び６の少なくとも一部を含む配列番号１５のポリヌクレオチドをｐＣＫベクターのクローニング部位に挿入することによって、クラスＩ，Ｅａ（異型体＃４）を暗号化するＩＧＦ－１＃４を生成した。各プラスミドから各ＩＧＦ－１異型体の発現を試験管内及び生体内の両方で試験して確認した。

【0238】

ＣＣＩ手術及び前記ＤＮＡ作製物投与一週後に、フォンフレイフィラメントを用いて機械的異質痛の発達を評価し、及び疼痛症状を毎週測定して図２Ａに示した。フォンフレイフィラメント試験を行ってマウスの機械的敏感度を測定した。簡略に、金属網の床上にあるシリンダー内に入れて適応させた。一定の厚さのフィラメント（０．１６ｇ）を用いて後足を刺激することによってマウスの機械的敏感度の頻度を測定した。

【0239】

図２Ｂは、図２Ａで説明されたＣＣＩ実験で測定された足引っ込み頻度（％）を要約したグラフである。図２Ｂの頻度（％）はねＣＣＩ手術後１週～４週で測定された数値の平均である。前記結果は、ＶＭ２０２単独、又はＶＭ２０２と様々なＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物との組合せを注射した場合が、ベクター（ｐＣＫ）だけを注射した場合に比較して、足引っ込み頻度において有意に減少したことを証明している。また、ＶＭ２０２をｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃ｌ又はｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃４（すなわち、ＩＧＦ－１異型体＃１又はＩＧＦ－１異型体＃４を発現できるＤＮＡ作製物）と組み合わせて注射すると、ＶＭ２０２単独又はＶＭ２０２とＩＧＦ－１＃２又はＩＧＦ－１＃３との組合せ注射に比べてより有意に減少した。このようなデータは、ＩＧＦ異型体＃１（クラスＩ，Ｅｃ）及びＩＧＦ異型体＃４（クラスＩ，Ｅａ）がＶＭ２０２と共に投与されるとき、神経病症を治療するのに特に効果的であることを提示する。

【0240】

図２Ｂに提供されたデータにおいて最も効果的なものと示されるＩＧＦ－１＃ｌ及びＩＧＦ－１＃４に対して、これらの効果が併用投与時に向上するかどうかを試験した。詳細には、５０μｇのＩＧＦ－１＃１及び５０μｇのＩＧＦ－１＃４をＶＭ２０２と共にＣＣＩマウスに投与し、及び足引っ込み頻度数を、図３Ａで要約したように測定した。図３Ｂに提供された結果（１週～４週間の平均）は、ＶＭ２０２をｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃ｌ及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃４両方と共に注射すると、ＶＭ２０２とｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃１の組合せ又はＶＭ２０２とｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃４の組合せに比べて、足引っ込み頻度において遥かに有意な減少を示すことを証明している。このようなデータは、ＩＧＦ異型体＃１（クラスＩ，Ｅｃ）及びＩＧＦ異型体＃４（クラスＩ，Ｅａ）の組合せをＶＭ２０２と共に投与時に、より大きい治療効能を有するということを提示する。

【0241】

実施例２：マウスＣＣＩ神経病症モデルにおいて、ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物及びＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物の順次投与の治療効能
ＣＣＩ神経病症マウスは、実施例１と同様にして生成し、それを表２のように７群に分割した。総２００μｇのＤＮＡ作製物をＣＣＩ手術当日に、ＣＣＩマウスに筋肉内注射し（第１注射）、及び３週後に再び注射した（第２注射）。各群に対して第１注射及び第２注射で投与されたＤＮＡ作製物を、下記表２に要約した。各群は、６匹のマウスで構成され、２回以上の独立的実験を行った（平均±ＳＥＭ；＊，ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．０１；＊＊＊，ｐ＜０．００１）。

【0242】

【表2】

【0243】

実験から、フォンフレイフィラメント試験による週間ベースで機械的異質痛を測定することによって、前記注射物の治療的効果を試験した。実験過程は、図４Ａに要約されている。簡略に、金属網の床上にあるシリンダー内に動物を個別に入れて適応させた。一定の厚さのフィラメント（０．１６ｇ）を用いて後足を刺激することによってマウスの機械的敏感度の頻度を評価した。この後、試験を毎週反復した。

【0244】

結果が図４Ｂに要約されており、週間基準で各群から測定された足引っ込み頻度（％）を示す。この結果は、ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物（すなわち、ＩＧＦ－１＃１及びＩＧＦ－１＃４）の注射又はＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物（すなわち、ＶＭ２０２）の注射は、ベクター（ｐＣＫ）に比べて足引っ込み頻度が有意に減少することを裏付けている。また、ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物（すなわち、ＶＭ２０２）を注射した後、ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物（すなわち、ＩＧＦ－１＃１及びＩＧＦ－１＃４）を注射すると（ＶＭ２０２－＞ＩＧＦ－異型体）足引っ込み頻度がより減少することが証明された。このような第２注射による追加的な減少は、ＩＧＦ－１＃ｌ及びＩＧＦ－１＃４がＶＭ２０２の第２注射前に注射された（ＩＧＦ－１異型体－＞ＶＭ２０２）又はＶＭ２０２がＶＭ２０２の第２注射前に注射された（ＶＭ２０２－＞ＶＭ２０２）群では観測されなかった。したがって、ＶＭ２０２注射後にＩＧＦ－１＃ｌ及びＩＧＦ－１＃４を注射すると（ＶＭ２０２－＞ＩＧＦ－１異型体）足引っ込み頻度が最も有意に減少した。

【0245】

実施例３：ＩＧＦ－１異型体＃１（クラスＩ Ｅｃ）及び異型体＃４（クラスＩ Ｅａ）の両方を発現可能なＤＮＡ作製物
ＩＧＦ－１クラスＩ Ｅｃを発現させる第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物（ＩＧＦ－１＃１）及びクラスＩ Ｅａを暗号化する第２ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物（ＩＧＦ－１＃４）は併用時に、前記説明された行動実験において機械的異質痛を減少させるのに統計的に有意により大きい能力を有するので、本発明者らは、ＲＮＡ転写体の選択的スプライシングを用いてＩＧＦ－１クラスＩ Ｅｃ（異型体＃１）及びクラスＩ Ｅａ（異型体＃４）の２つの異型体を同時に発現するように設計されたいくつかのプラスミドを作製した。特に、ＩＧＦ－１遺伝子のエクソン１、３／４、５及び６及びイントロンの配列又はそれらの断片を含むＤＮＡ作製物を生成した。異なる変異を含むいくつかのＤＮＡ作製物を作り、ＩＧＦ－１クラスＩ Ｅｃ異型体（異型体＃１）及びクラスＩ Ｅａ異型体（異型体＃４）両方を発現させる能力を試験した。

【0246】

各プラスミドは、ｐＣＫをプラスミドベースでｐＣＫ発現調節配列に作動可能に連結された挿入体を含むように作製した。前記挿入体は、（１）ヒトＩＧＦ－１エクソン１、３、及び４を暗号化する第１ポリヌクレオチド（配列番号１）；（２）第２ポリヌクレオチドとして、ＩＧＦ－１イントロン４（配列番号２）又はその断片物；（３）エクソン５及び６－１を暗号化する第３ポリヌクレオチド（配列番号３）；（４）第４ポリヌクレオチドとして、イントロン５（配列番号４）又はその断片物；及び（５）エクソン６－２を暗号化する第５ポリヌクレオチド（配列番号５）を連鎖連結させ、前記第１ポリヌクレオチド、前記第２ポリヌクレオチド、前記第３ポリヌクレオチド、前記第４ポリヌクレオチド及び前記第５ポリヌクレオチドを順次に、５’から３’の方向に連結させることによって生成された。これらのプラスミドは、イントロン４及び／又はイントロン５の断片サイズにおいて異なる。特に、配列番号６は、ベクターｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ６に用いられたイントロン４断片のヌクレオチド配列を提供し、及び配列番号７は、ベクターｐＣＫ－ＩＧＦ－１－Ｘｌ０に用いられたイントロン４断片のヌクレオチド配列を提供する。配列番号８は、ベクターｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ６及びｐＣＫ－ＩＧＦｌＸｌ０に用いられたイントロン５断片のヌクレオチド配列を提供する。

【0247】

様々な作製物からの異型体＃１（クラスＩ，Ｅｃ）及び異型体＃４（クラスＩ，Ｅａ）の生体内発現を試験するために、９週齢雄Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスに、５０μｇプラスミドをＴ．Ａ．筋（ｔｉｂｉａｌｉｓ ａｎｔｅｒｉｏｒ、前脛骨筋）に注射した。注射５日後に、Ｔ．Ａ．骨格筋を得た。次に、タンパク質分解酵素阻害体、ホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｌｔｄ．）、及びＰＭＳＦ（Ｓｉｇｍａ）を含有する溶解緩衝液中で、ポリプロピレン乳棒（Ｂｅｌ－Ａｒｔ Ｓｃｉｅｎｃｅｗａｒｅ）を用いて骨格筋を均質化した。サンプルを１２，０００ｒｐｍで１５分間４゜Ｃで遠心分離し、及びヒトＩＧＦ－１ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）をメーカー方式の通りに設定し、総タンパク質を含有する上澄液を分析した。検出されたＩＧＦ－１レベルはＢＣＡタンパク質分析キット（Ｔｈｅｒｍｏ，ＩＬ，ＵＳＡ）で測定し、組織から得たタンパク質抽出物の総量に正規化した。実験過程は図５Ａに要約されている。

【0248】

図５Ｂに示すように、マウスＴ．Ａ．筋におけるヒトＩＧＦ－１タンパク質の総発現量をＥＬＩＳＡで決定した。前記マウスが単一異型体（“１”（クラスＩ，Ｅｃ）又は“４”（クラスＩ，Ｅａ））を発現させる作製物５０μｇ、異型体＃１（クラスＩ，Ｅｃ）を発現させる第１作製物２５μｇ＋異型体＃４（クラスＩ，Ｅａ）を発現させる第２作製物２５μｇ（“１＋４”）、又は両異型体を発現させる作製物、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ６（“Ｘ６”）又はｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０（“Ｘ１０”）５０μｇを収容したか否かに関係なく、ヒトＩＧＦ－１タンパク質の総発現量は類似であった。

【0249】

本発明者らは、ＲＴ－ＰＣＲを用いて前記作製物が異型体＃１及び異型体＃４両方に対する成熟した転写体を同時に発現したかとうかを決定した。ＲＴ－ＰＣＲ反応は、エクソン３／４と結合する順方向プライマー（Ｆ）及びエクソン６と結合する逆方向プライマー（Ｒ）を用いて行われた。図６Ａでさらに説明された通り、異型体＃１（クラスＩ，Ｅｃ）に対する転写体をＲＴ－ＰＣＲすれば、２つの増幅体（ａｍｐｌｉｃｏｎ）－１７８ｂｐ増幅体及び２５９ｂｐ増幅体を生成するが、異型体＃４（クラスＩ，Ｅａ）に対する転写体をＲＴ－ＰＣＲすれば、１２９ｂｐの単一増幅体を生成する。

【0250】

ＲＴ－ＰＣＲのために、骨格筋を収集し、ポリプロピレン乳棒（Ｂｅｌ－Ａｒｔ Ｓｃｉｅｎｃｅｗａｒｅ）を用いて機械的に均質化し、及びＲＮＡｉｓｏ ｐｌｕｓ（Ｔａｋａｒａ）で抽出した。ナノドロップ（ｎａｎｏｄｒｏｐ）機器を用いてＲＮＡを定量した。逆転写酵素ＸＬ（ＡＭＶ）（Ｔａｋａｒａ）を用いて同一量のＲＮＡでｃＤＮＡを合成し、及び図６Ａに示された順方向（ＴＧＡ ＴＣＴ ＡＡＧ ＧＡＧ ＧＣＴ ＧＧＡ）（配列番号４０）及び逆方向（ＣＴＡ ＣＴＴ ＧＣＧ ＴＴＣ ＴＴＣ ＡＡＡ ＴＧ）（ＳＥＱ ＩＤ．ＮＯ：４１）プライマーを用いてＰＣＴを行った。

【0251】

図６Ｂに説明された通り、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ６及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０は、異型体＃１（ｌ７８ｂｐ及び２５９ｂｐバンド）及び異型体＃４（ｌ２９ｂｐバンド）のいずれに対しても成熟した転写体を発現した。異型体＃１及び異型体＃４に対する成熟した転写体の発現は、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ６及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０以外の作製物からは検出されず、そのデータは本明細書で提供されない。

【0252】

前記２つの異型体転写体ともタンパク質に効果的に翻訳されることを確認するために、本発明者らは、図７Ａに説明された通り、２９３Ｔ細胞にｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ６又はｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０を形質感染させた。免疫ブロッティングのために、プラスミドＤＮＡを形質感染２日（４８時間）後に、細胞を収集し、タンパク質分解酵素及びホスファターゼ阻害体カクテル（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｌｔｄ．）を含有したＲＩＰＡ緩衝液を用いて溶解した。同量のタンパク質を１０％ ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル上で分離し、及びウェスタン膜（ＰＶＤＦ）に移した。該膜を、ＢＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－Ｇｉｂｃｏ）を含有したＴＢＳＴ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ ７．４、０．９％ ＮａＣｌ、及び０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）で１時間ブロッキングし、及びブロッキング溶液に希釈された一次抗体で４℃で一晩探針処理した。ＩＧＦ－１異型体１及び異型体４のレベルを調べるために用いられた一次抗体は、Ａｂｃｌｏｎ（韓国）から提供され、及びＩＧＦ－１及びβ－アクチンに対する抗体はＡｂｃａｍ（ＵＫ）及びＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ＵＳ）から購入した。ＴＢＳＴで洗浄後、膜をＨＲＰ接合ヤギ抗マウス又はウサギＩｇＧ二次抗体（Ｓｉｇｍａ）で室温で１時間処理した。次に、ブロットをＴＢＳＴで３回洗浄し、及び前記タンパク質バンドを、向上した化学発光システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて視覚化させた。β－アクチンをローディング対照群として用いた。

【0253】

図７Ｂに見られるウェスタンブロッティングデータから、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ６及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０プラスミドがＩＧＦ－１の異型体の両方をタンパク質レベルで発現するということが確認される。

【0254】

実施例４：マウスＣＣＩ神経病症モデルにおいて、ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物（ＶＭ２０２）とＩＧＦ－１異型体＃１（クラスＩ Ｅｃ）及び異型体＃４（クラスＩ Ｅａ）の両方を発現させるＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物との併用投与による治療効能
前記実施例１及び２で論議された通り、ＶＭ２０２及びＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物－ｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃ｌ及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１＃４（すなわち、ＩＧＦ－１異型体＃１又はＩＧＦ－１異型体＃４を発現可能なＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物）－を同時又は順次に投与すれば、神経病症のマウスＣＣＩモデルにおいて機械的異質痛が有意に減少する。

【0255】

本発明者らは、実施例３で製造した、ＩＧＦ－１異型体＃１及びＩＧＦ－１異型体＃４の両方を発現できる二重発現ＤＮＡ作製物を用いて同じ効果が提供できるかどうかを試験した。具体的に、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ６及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０をＶＭ２０２と共に神経病症のマウスＣＣＩモデルにおいて試験した。

【0256】

【表3】

【0257】

ＣＣＩマウスを５個群に分け、及びＣＣＩ当日に総２００μｇのＤＮＡ作製物（表３に提供）を筋肉内注射で投与した。機械的刺激に対する疼痛敏感度をフォンフレイフィラメントを用いて適切な時間に測定した。各群は、６匹のマウスで構成され、及び２回以上の独立的実験を行った（平均±ＳＥＭ；＊，ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．０１；＊＊＊，ｐ＜０．００１）。ＣＣＩ手術１週後に、機械的異質痛の発達をフォンフレイフィラメントを用いて評価し、及び疼痛症状を毎週評価した。実験過程が図８Ａに要約されている。

【0258】

ＣＣＩ手術後一週間測定した足引っ込み頻度は、図８Ｂに提供されている。このデータは、ＶＭ２０２及びＩＧＦ－１異型体＃１及び＃４を暗号化する作製物（すなわち、ＩＧＦ－１＃１及びＩＧＦ－１＃４；ＩＧＦ－１Ｘ６及びＩＧＦ－１Ｘ１０）を同時に筋肉内注射した後、機械的異質痛が統計的に有意に減少するということを証明する。特に、前記マウスにそれぞれ、ＩＧＦ－１異型体＃１又は＃４を暗号化する２つのＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物と、又は前記二重発現作製物ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０と同時に投与するとき、機械的異質痛に対する効果がより良好であった。このような効果は、ＣＣＩ手術４週後の最後の測定時まで一貫して観測された。

【0259】

実施例５：マウスＣＣＩ神経病症モデルにおいて、ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物（ＨＧＦ７２８）とＩＧＦ－１異型体＃１（クラスＩ Ｅｃ）及び異型体＃４（クラスＩ Ｅａ）の両方を発現させるＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物との併用投与の治療的効能
前記実施例１～４で論議された通り、ＶＭ２０２及びＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を同時又は順次に投与すると、神経病症のマウスＣＣＩモデルにおいて機械的異質痛が有意に減少する。ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物と組み合わせられた他のＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物、ＨＧＦ７２８の治療効果をさらに試験した。

【0260】

詳細に、ＣＣＩ神経病症マウスを実施例１と同様にして生成し、５つの群に分けた。図９Ａに図式されているように、総２００μｇのプラスミドＤＮＡをＣＣＩ手術当日に筋肉内注射した。各群に投与されたＤＮＡ作製物が表４に要約されている。

【0261】

【表4】

【0262】

ＣＣＩ手術１週間後、機械的異質痛の発達をフォンフレイフィラメント試験法を用いて評価した。簡略に、動物を金属網の床上にあるシリンダー内に個別に入れて適応させた。一定の厚さのフィラメント（０．１６ｇ）を用いて後足を刺激することによってマウスの機械的敏感度の頻度を測定した。機械的閾値に対して、マウスを様々な厚さのフィラメント（０．０４～２．０ｇ）で刺激した。その後、試験を毎週反復した。

【0263】

ＣＣＩ手術１週後に測定された足引っ込み頻度及び機械的閾値が、図９Ｂ－９Ｃに提供されており、図９Ｂは頻度（％）を、図９Ｃは足引っ込みの閾値を示す。全ての数値は、３回の独立した実験値から得た平均±平均標準誤差（ＳＥＭ）で表示される。数値間の差は、１元分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）後、事後検定分析（Ｔｕｋｅｙ’ｓ ｐｏｓｔ－ｈｏｃ ｔｅｓｔ）又は多重比較（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ’ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｅｓｔ）で決定した。

【0264】

このようなデータによれば、ｐＣＫ－ＨＧＦ７２８を注射すると足引っ込み頻度及び足引っ込み閾値を有意に減少させるということがわかる。動物がｐＣＫ－ＨＧＦ７２８及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０で処理されるとき、足引っ込み頻度がより大きく減少し、機械的敏感度の閾値がより大きく増加したことが観察され、これは統計的に有意味であった。このような結果は、ｐＣＫ－ＨＧＦ７２８の治療効果がさらにｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０の併用投与によって向上し得ることを示す。これらの効果は、ＣＣＩ手術２週後の最後の測定時まで一貫して観察された。

【0265】

[参照による援用]
本出願に引用された全ての出版物、特許、特許出願、及び他の文書は、各個別の出版物、特許、特許出願、又は他の文書が個別に全ての目的に対して参照して組み込まれると示されるのと同じ程度に、参照だけすることによって全ての目的に対してそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0266】

［等価物］
様々な特定の具体例が実証され説明されてきたが、前記明細書は制限的ではない。様々な変化が本発明の思想及び範囲から逸脱することなく可能であることが理解できよう。多くの変形が本明細書を検討する上で当分野における技術者にとって明らかであろう。
本発明の態様は以下を含む。
［付記１］
神経病症を治療する方法であって、前記方法は：
神経病症を持つ対象体に、ヒトＩＧＦ－１異型体を発現可能な第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物の治療的有効量を投与する段階；及び
前記対象体に、ヒトＨＧＦ異型体を発現可能な第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物の治療的有効量を投与する段階を含む、神経病症を治療する方法。
［付記２］
前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号１４のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅａタンパク質又は配列番号１６のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｃタンパク質を発現可能である、付記１に記載の神経病症を治療する方法。
［付記３］
前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号１８のポリペプチドを含むクラスＩＩ ＩＧＦ－１Ｅａタンパク質及び配列番号２０のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｂタンパク質の両方を全て発現可能なわけではない、付記１又は２に記載の神経病症を治療する方法。
［付記４］
前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号１５のポリヌクレオチドを含む、付記１～３のいずれかに記載の神経病症を治療する方法。
［付記５］
前記対象体に第２ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階をさらに含み、前記第２ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号１７のポリヌクレオチドを含む、付記４に記載の神経病症を治療する方法。
［付記６］
前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号１７のポリヌクレオチドを含む、付記１～３のいずれかに記載の神経病症を治療する方法。
［付記７］
前記対象体に第２ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階をさらに含み、前記第２ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号１５のポリヌクレオチドを含む、付記６に記載の神経病症を治療する方法。
［付記８］
前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階及び前記第２ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階は、同時に行われる、付記５又は７に記載の神経病症を治療する方法。
［付記９］
前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階及び前記第２ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階は、順次に行われる、付記５又は７に記載の神経病症を治療する方法。
［付記１０］
前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、１つより多いヒトＩＧＦ－１異型体を暗号化する、付記１～９のいずれかに記載の神経病症を治療する方法。
［付記１１］
前記１つより多いヒトＩＧＦ－１異型体は、配列番号１４のポリペプチド及び配列番号１６のポリペプチドを含む、付記１０に記載の神経病症を治療する方法。
［付記１２］
前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は：
配列番号１の第１ＩＧＦポリヌクレオチド（エクソン１、３、４）又はその縮退物；
配列番号２の第２ＩＧＦポリヌクレオチド（イントロン４）又はその断片物；
配列番号３の第３ＩＧＦポリヌクレオチド（エクソン５及び６－１）又はその縮退物；
配列番号４の第４ＩＧＦポリヌクレオチド（イントロン５）又はその断片物；及び
配列番号５の第５ＩＧＦポリヌクレオチド（エクソン６－２）又はその縮退物を含み、
前記第１ポリヌクレオチド、前記第２ポリヌクレオチド、前記第３ポリヌクレオチド、前記第４ポリヌクレオチド及び前記第５ポリヌクレオチドは順次に、５’から３’の順に連結されている、付記１０に記載の神経病症を治療する方法。
［付記１３］
前記第２ＩＧＦポリヌクレオチドは、配列番号６のポリヌクレオチドである、付記１２に記載の神経病症を治療する方法。
［付記１４］
前記第２ＩＧＦポリヌクレオチドは、配列番号７のポリヌクレオチドである、付記１２に記載の神経病症を治療する方法。
［付記１５］
前記第４ＩＧＦポリヌクレオチドは、配列番号８のポリヌクレオチドである、付記１２に記載の神経病症を治療する方法。
［付記１６］
前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、プラスミドベクターを含む、付記１～５のいずれかに記載の神経病症を治療する方法。
［付記１７］
前記プラスミドベクターは、ｐＣＫである、付記１６に記載の神経病症を治療する方法。
［付記１８］
前記プラスミドベクターは、ｐＴｘである、付記１６に記載の神経病症を治療する方法。
［付記１９］
前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号１０のポリヌクレオチドを含む、付記１２～１８のいずれかに記載の神経病症を治療する方法。
［付記２０］
前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号９のポリヌクレオチドを含む、付記１２～１８のいずれかに記載の神経病症を治療する方法。
［付記２１］
前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物及び前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物を、前記対象体において疼痛を減少させるのに十分な量で投与する、付記１～２０のいずれかに記載の神経病症を治療する方法。
［付記２２］
前記対象体は、糖尿性神経病症を有する、付記１～２１のいずれかに記載の神経病症を治療する方法。
［付記２３］
前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物及び前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物を多重の筋肉内注射によって投与する、付記１～２２のいずれかに記載の神経病症を治療する方法。
［付記２４］
前記ヒトＨＧＦ異型体は、配列番号１１のｆｌＨＧＦ又は配列番号１２のＤｈｇｆである、付記１～２３のいずれかに記載の神経病症を治療する方法。
［付記２５］
前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、１つ以上のヒトＨＧＦ異型体を暗号化する、付記２４に記載の神経病症を治療する方法。
［付記２６］
前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、２つのヒトＨＧＦ異型体を暗号化し、前記２つのヒトＨＧＦ異型体は、配列番号１１のｆｌＨＧＦ及び配列番号１２のｄＨＧＦである、付記２５に記載の神経病症を治療する方法。
［付記２７］
前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、プラスミドベクターを含み、選択的に前記プラスミドベクターは、ｐＣＫベクター又はｐＴｘベクターである、付記１～２６のいずれかに記載の神経病症を治療する方法。
［付記２８］
前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は：
配列番号２２の第１ＨＧＦポリヌクレオチド（エクソン１－４）又はその縮退物；
配列番号２５の第２ＨＧＦポリヌクレオチド（イントロン４）又はその機能的断片物；及び
配列番号２３の第３ＨＧＦポリヌクレオチド（エクソン５－１８）又はその縮退物を含み、前記第２ＨＧＦポリヌクレオチドは、前記第１ＨＧＦポリヌクレオチド及び前記第３ＨＧＦポリヌクレオチドの間に位置し、及び前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、２つのヒトＨＧＦ異型体を暗号化する、付記１～２７のいずれかに記載の神経病症を治療する方法。
［付記２９］
前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号１３のポリヌクレオチドを含む、付記２８に記載の神経病症を治療する方法。
［付記３０］
前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物及び前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、併用投与される、付記１～２９のいずれかに記載の神経病症を治療する方法。
［付記３１］
前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物及び前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、筋肉内注射で併用投与される、付記３０に記載の神経病症を治療する方法。
［付記３２］
前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階及び前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階は、別々に行われる、付記１～２９のいずれかに記載の神経病症を治療する方法。
［付記３３］
前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する方法及び前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階は、少なくとも３週の間隔で行われる、付記３２に記載の神経病症を治療する方法。
［付記３４］
前記対象体に、配列番号１１のｆｌＨＧＦ及び配列番号１２のｄＨＧＦから選ばれるヒトＨＧＦ異型体を発現可能な第２ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階をさらに含む、付記１～３３のいずれかに記載の神経病症を治療する方法。
［付記３５］
神経病症を治療する方法であって、前記方法は：
神経病症を有する対象体に、配列番号１３のポリヌクレオチドを含むＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階；及び
前記対象体に、配列番号１０のポリヌクレオチド又は配列番号９のポリヌクレオチドを含むＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階を含み、
前記ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階及び前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階は、少なくとも３週の間隔で行われる、神経病症治療方法。
［付記３６］
神経病症を治療する方法であって、前記方法は：
神経病症を有する対象体に、配列番号３３のポリヌクレオチドを含むＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階；及び
前記対象体に、配列番号１０のポリヌクレオチド又は配列番号９のポリヌクレオチドを含むＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階を含み、
前記ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階及び前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階は、少なくとも３週の間隔で行われる、神経病症治療方法。
［付記３７］
神経病症を治療する方法であって、前記方法は：
神経病症を有する対象体に、配列番号１３のポリヌクレオチドを含むＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階；及び
前記対象体に、配列番号１５のポリヌクレオチドを暗号化する第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物及び配列番号１７のポリヌクレオチドを暗号化する第２ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階を含み、
前記ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階及び前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物及び前記第２ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階は、少なくとも３週の間隔で行われる、神経病症治療方法。
［付記３８］
次を含む薬学組成物：
少なくとも１つのヒトＩＧＦ－１異型体を発現可能なＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物；
少なくとも１つのヒトＨＧＦ異型体を発現可能なＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物、及び
薬学的許容可能な賦形剤を含む、薬学組成物。
［付記３９］
前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号１４のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅａタンパク質又は配列番号１６のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｃタンパク質を暗号化する、付記３８に記載の薬学組成物。
［付記４０］
前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、１つ以上のヒトＩＧＦ－１異型体を暗号化する、付記３８又は３９に記載の薬学組成物。
［付記４１］
前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、２つのヒトＩＧＦ－１異型体を暗号化し、前記２つのヒトＩＧＦ－１異型体は、配列番号１４のポリペプチド及び配列番号１６のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｃタンパク質である、付記４０に記載の薬学組成物。
［付記４２］
前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は：
配列番号１の第１ＩＧＦポリヌクレオチド（エクソン１、３、４）又はその縮退物；
配列番号２の第２ＩＧＦポリヌクレオチド（イントロン４）又はその断片物；
配列番号３の第３ＩＧＦポリヌクレオチド（エクソン５及び６－１）又はその縮退物；
配列番号４の第４ＩＧＦポリヌクレオチド（イントロン５）又はその断片物；及び
配列番号５の第５ＩＧＦポリヌクレオチド（エクソン６－２）又はその縮退物を含み、
前記第１ポリヌクレオチド、前記第２ポリヌクレオチド、前記第３ポリヌクレオチド、前記第４ポリヌクレオチド及び前記第５ポリヌクレオチドは順次に、５’から３’の順に連結されている、付記４１に記載の薬学組成物。
［付記４３］
前記第２ＩＧＦポリヌクレオチドは、配列番号６のポリヌクレオチドである、付記４２に記載の薬学組成物。
［付記４４］
前記第２ＩＧＦポリヌクレオチドは、配列番号７のポリヌクレオチドである、付記４２に記載の薬学組成物。
［付記４５］
前記第４ＩＧＦポリヌクレオチドは、配列番号８のポリヌクレオチドである、付記４２に記載の薬学組成物。
［付記４６］
前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、プラスミドベクターをさらに含む、付記４２に記載の薬学組成物。
［付記４７］
前記プラスミドベクターは、ｐＣＫである、付記４６に記載の薬学組成物。
［付記４８］
前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、ｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ６及びｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０からなる群から選ばれる、付記４７に記載の薬学組成物。
［付記４９］
前記プラスミドベクターは、ｐＴｘである、付記４６に記載の薬学組成物。
［付記５０］
前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、ｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ６及びｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ１０からなる群から選ばれる、付記４９に記載の薬学組成物。
［付記５１］
前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号９のポリヌクレオチドを含む、付記４８又は５０に記載の薬学組成物。
［付記５２］
前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号１０のポリヌクレオチドを含む、付記４８又は５０に記載の薬学組成物。
［付記５３］
前記少なくとも１つのヒトＨＧＦ異型体は、配列番号１１のｆｌＨＧＦ又は配列番号１２のｄＨＧＦである、付記３８～５２のいずれかに記載の薬学組成物。
［付記５４］
前記ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号１１のｆｌＨＧＦ及び配列番号１２のｄＨＧＦの両方を発現可能である、付記５３に記載の薬学組成物。
［付記５５］
前記ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は：
配列番号２２の第１ＨＧＦポリヌクレオチド（エクソン１－４）又はその縮退物；
配列番号２５の第２ＨＧＦポリヌクレオチド（イントロン４）又はその機能的断片物；及び
配列番号２３の第３ＨＧＦポリヌクレオチド（エクソン５－１８）又はその縮退物を含み、
前記第２ＨＧＦポリヌクレオチドは、前記第１ＨＧＦポリヌクレオチド及び前記第３ＨＧＦポリヌクレオチドの間に位置し、及び前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、２つのヒトＨＧＦ異型体を暗号化する、付記５４に記載の薬学組成物。
［付記５６］
前記ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号２６－３２及び１３のうち任意の配列番号のポリヌクレオチドを含む、付記３８～５５のいずれかに記載の薬学組成物。
［付記５７］
前記ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号１３のポリヌクレオチドを含む、付記５６に記載の薬学組成物。
［付記５８］
配列番号１３のポリヌクレオチド；及び配列番号９のポリヌクレオチドを含む、薬学組成物。
［付記５９］
配列番号１３のポリヌクレオチド；及び配列番号１０のポリヌクレオチドを含む、薬学組成物。
［付記６０］
配列番号１３のポリヌクレオチド；及び配列番号１５のポリヌクレオチド又は配列番号１７のポリヌクレオチドを含む、薬学組成物。
［付記６１］
配列番号１３のポリヌクレオチド；配列番号１５のポリヌクレオチド及び配列番号１７のポリヌクレオチドを含む、薬学組成物。
［付記６２］
配列番号３３のポリヌクレオチド及び配列番号９、配列番号１０、配列番号１５、配列番号１７、又は配列番号３９のポリヌクレオチドを含む、薬学組成物。
［付記６３］
神経病症治療用キットであって、前記キットは：
少なくとも１つのヒトＩＧＦ－１異型体を発現可能なＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物、及び第１薬学的に許容可能な賦形剤を含む第１薬学組成物；及び
少なくとも１つのヒトＨＧＦ異型体を発現可能なＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物、及び第２薬学的に許容可能な賦形剤を含む第２薬学組成物を含む、神経病症治療用キット。
［付記６４］
前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号１４のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅａタンパク質又は配列番号１６のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｃタンパク質を暗号化する、付記６３に記載の神経病症治療用キット。
［付記６５］
前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、１つより多いヒトＩＧＦ－１異型体を暗号化する、付記６３又は６４に記載の神経病症治療用キット。
［付記６６］
前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、２つのヒトＩＧＦ－１異型体を暗号化し、前記２つのヒトＩＧＦ－１異型体は、配列番号１４のポリペプチド及び配列番号１６のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｃタンパク質である、付記６５に記載の神経病症治療用キット。
［付記６７］
前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は：
配列番号１の第１ＩＧＦポリヌクレオチド（エクソン１、３、４）又はその縮退物；
配列番号２の第２ＩＧＦポリヌクレオチド（イントロン４）又はその断片物；
配列番号３の第３ＩＧＦポリヌクレオチド（エクソン５及び６－１）又はその縮退物；
配列番号４の第４ＩＧＦポリヌクレオチド（イントロン５）又はその断片物；及び
配列番号５の第５ＩＧＦポリヌクレオチド（エクソン６－２）又はその縮退物を含み、
前記第１ポリヌクレオチド、前記第２ポリヌクレオチド、前記第３ポリヌクレオチド、前記第４ポリヌクレオチド及び前記第５ポリヌクレオチドは順次に、５’から３’の順に連結されている、付記６６に記載の神経病症治療用キット。
［付記６８］
前記第２ＩＧＦポリヌクレオチドは、配列番号６のポリヌクレオチドである、付記６７に記載の神経病症治療用キット。
［付記６９］
前記第２ＩＧＦポリヌクレオチドは、配列番号７のポリヌクレオチドである、付記６７に記載の神経病症治療用キット。
［付記７０］
前記第４ＩＧＦポリヌクレオチドは、配列番号８のポリヌクレオチドである、付記６７に記載の神経病症治療用キット。
［付記７１］
前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、プラスミドベクターをさらに含む、付記６３～７０のいずれかに記載の神経病症治療用キット。
［付記７２］
前記プラスミドベクターは、ｐＣＫである、付記７１に記載の神経病症治療用キット。
［付記７３］
前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、ｐＣＫ－ＩＧＦ－Ｘ６又はｐＣＫ－ＩＧＦ－１Ｘ１０を含む、付記７２に記載の神経病症治療用キット。
［付記７４］
前記プラスミドベクターは、ｐＴｘである、付記７１に記載の神経病症治療用キット。
［付記７５］
前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、ｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ６又はｐＴｘ－ＩＧＦ－１Ｘ１０を含む、付記７４に記載の神経病症治療用キット。
［付記７６］
前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号９のポリヌクレオチドを含む、付記７３又は７５に記載の神経病症治療用キット。
［付記７７］
前記ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号１０のポリヌクレオチドを含む、付記７３又は７５に記載の神経病症治療用キット。
［付記７８］
前記少なくとも１つのヒトＨＧＦ異型体は、配列番号１１のｆｌＨＧＦ又は配列番号１２のｄＨＧＦである、付記６３～７７のいずれかに記載の神経病症治療用キット。
［付記７９］
前記ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号１１のｆｌＨＧＦ及び配列番号１２のｄＨＧＦの両方を発現可能である、付記７８に記載の神経病症治療用キット。
［付記８０］
前記ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は：
配列番号２２の第１ＨＧＦポリヌクレオチド（エクソン１－４）又はその縮退物；
配列番号２５の第２ＨＧＦポリヌクレオチド（イントロン４）又はその機能的断片物；及び
配列番号２３の第３ＨＧＦポリヌクレオチド（エクソン５－１８）又はその縮退物を含み、
前記第２ＨＧＦポリヌクレオチドは、前記第１ＨＧＦポリヌクレオチド及び前記第３ＨＧＦポリヌクレオチドの間に位置し、及び前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、２つのヒトＨＧＦ異型体を暗号化する、付記７９に記載の神経病症治療用キット。
［付記８１］
前記ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号２６～３２及び１３のうち任意のポリヌクレオチドを含む、付記６３～７９のいずれかに記載の神経病症治療用キット。
［付記８２］
前記ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号１３のポリヌクレオチドを含む、付記８１に記載の神経病症治療用キット。
［付記８３］
前記第１薬学組成物は、配列番号９のポリヌクレオチドを含み；及び前記第２薬学組成物は、配列番号１３のポリヌクレオチドを含む、付記６３に記載の神経病症治療用キット。
［付記８４］
前記第１薬学組成物は、配列番号１０のポリヌクレオチドを含み；及び前記第２薬学組成物は、配列番号１３のポリヌクレオチドを含む、付記６３に記載の神経病症治療用キット。
［付記８５］
前記第１薬学組成物は、配列番号１５のポリヌクレオチド及び配列番号１７のポリヌクレオチドを含み；及び前記第２薬学組成物は、配列番号１３のポリヌクレオチドを含む、付記６３に記載の神経病症治療用キット。
［付記８６］
前記第１薬学組成物は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１５、又は配列番号１７のポリヌクレオチドを含み、及び前記第２薬学組成物は、配列番号３３のポリヌクレオチドを含む、付記６３に記載の神経病症治療用キット。
［付記８７］
神経病症を治療する医療方法の用途に用いるための、ヒトＩＧＦ－１異型体を発現可能な第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物であって、前記医療方法は：
神経病症を有する対象体に、前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物の治療的有効量を投与する段階、及び
前記対象体に、ヒトＨＧＦ異型体を発現可能な第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物の治療的有効量を投与する段階を含む、第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物。
［付記８８］
前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号１４のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅａタンパク質又は配列番号１６のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｃタンパク質を発現可能である、付記８７に記載の第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物。
［付記８９］
前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号１８のポリペプチドを含むクラスＩＩ ＩＧＦ－１Ｅａタンパク質及び配列番号２０のポリペプチドを含むクラスＩ ＩＧＦ－１Ｅｂタンパク質の両方を全て発現可能なわけではない、付記８７又は８８に記載の第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物。
［付記９０］
前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号１５のポリヌクレオチドを含む、付記８７～８９のいずれかに記載の第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物。
［付記９１］
前記医療方法は：
前記対象体に第２ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階をさらに含み、前記第２ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号１７のポリヌクレオチドを含む、付記９０に記載の第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物。
［付記９２］
前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号１７のポリヌクレオチドを含む、付記８７～８９のいずれかに記載の第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物。
［付記９３］
前記医療方法は：
前記対象体に第２ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階をさらに含み、前記第２ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号１５のポリヌクレオチドを含む、付記９２に記載の第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物。
［付記９４］
前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階及び前記第２ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階は、同時に行われる、付記９１又は９３に記載の第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物。
［付記９５］
前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階及び前記第２ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階は、順次に行われる、付記９１又は９３に記載の第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物。
［付記９６］
前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、１以上のヒトＩＧＦ－１異型体を暗号化する、付記８７～９５のいずれかに記載の第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物。
［付記９７］
前記１以上のヒトＩＧＦ－１異型体は、配列番号１４のポリペプチド及び配列番号１６のポリペプチドを含む、付記９６に記載の第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物。
［付記９８］
前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は：
配列番号１の第１ＩＧＦポリヌクレオチド（エクソン１、３、４）又はその縮退物；
配列番号２の第２ＩＧＦポリヌクレオチド（イントロン４）又はその断片物；
配列番号３の第３ＩＧＦポリヌクレオチド（エクソン５及び６－１）又はその縮退物；
配列番号４の第４ＩＧＦポリヌクレオチド（イントロン５）又はその断片物；及び
配列番号５の第５ＩＧＦポリヌクレオチド（エクソン６－２）又はその縮退物を含み、
前記第１ポリヌクレオチド、前記第２ポリヌクレオチド、前記第３ポリヌクレオチド、前記第４ポリヌクレオチド及び前記第５ポリヌクレオチドは順次に、５’から３’の順に連結されている、付記９６に記載の第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物。
［付記９９］
前記第２ＩＧＦポリヌクレオチドは、配列番号６のポリヌクレオチドである、付記９８に記載の第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物。
［付記１００］
前記第２ＩＧＦポリヌクレオチドは、配列番号７のポリヌクレオチドである、付記９８に記載の第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物。
［付記１０１］
前記第４ＩＧＦポリヌクレオチドは、配列番号８のポリヌクレオチドである、付記９８に記載の第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物。
［付記１０２］
前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、プラスミドベクターを含む、付記８７～１０１のいずれかに記載の第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物。
［付記１０３］
前記プラスミドベクターは、ｐＣＫである、付記１０２に記載の第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物。
［付記１０４］
前記プラスミドベクターは、ｐＴｘである、付記１０２に記載の第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物。
［付記１０５］
前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号１０のポリヌクレオチドを含む、付記８７～１０４のいずれかに記載の第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物。
［付記１０６］
前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号９のポリヌクレオチドを含む、付記８７～１０４のいずれかに記載の第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物。
［付記１０７］
前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物及び前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、前記対象体において疼痛を減少させるのに十分な量で投与される、付記８７～１０６のいずれかに記載の第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物。
［付記１０８］
前記対象体は、糖尿性神経病症を有する、付記８７～１０７のいずれかに記載の第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物。
［付記１０９］
前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物及び前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、複数回の筋肉内注射で投与される、付記８７～１０８のいずれかに記載の第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物。
［付記１１０］
前記ヒトＨＧＦ異型体は、配列番号１１のｆｌＨＧＦ又は配列番号１２のｄＨＧＦである、付記８７～１０９のいずれかに記載の第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物。
［付記１１１］
前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、１つ以上のヒトＨＧＦ異型体を暗号化する、付記１１０に記載の第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物。
［付記１１２］
前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、２つのヒトＨＧＦ異型体を暗号化し、前記２つのヒトＨＧＦ異型体は、配列番号１１のｆｌＨＧＦ及び配列番号１２のｄＨＧＦである、付記１１１に記載の第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物。
［付記１１３］
前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、プラスミドベクターを含み、選択的に前記プラスミドベクターは、ｐＣＫベクター又はｐＴｘベクターである、付記８７～１１２のいずれかに記載の第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物。
［付記１１４］
前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は：
配列番号２２の第１ＨＧＦポリヌクレオチド（エクソン１－４）又はその縮退物；
配列番号２５の第２ＨＧＦポリヌクレオチド（イントロン４）又はその機能的断片物；及び
配列番号２３の第３ＨＧＦポリヌクレオチド（エクソン５－１８）又はその縮退物を含み、
前記第２ＨＧＦポリヌクレオチドは前記第１ＨＧＦポリヌクレオチド及び前記第３ＨＧＦポリヌクレオチドの間に位置し、及び前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、２つのヒトＨＧＦ異型体を暗号化する、付記８７～１１３のいずれかに記載の第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物。
［付記１１５］
前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、配列番号１３のポリヌクレオチドを含む、付記１１４に記載の第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物。
［付記１１６］
前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物及び前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、併用投与される、付記８７～１１５のいずれかに記載の第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物。
［付記１１７］
前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物及び前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物は、筋肉内注射で併用投与される、付記１１６に記載の第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物。
［付記１１８］
前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階及び前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階は、別々に行われる、付記８７～１１５のいずれかに記載の第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物。
［付記１１９］
前記第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階及び前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階は、少なくとも３週の間隔で行われる、付記１１８に記載の第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物。
［付記１２０］
前記医療方法は、前記対象体に、配列番号１１のｆｌＨＧＦ及び配列番号１２のｄＨＧＦから選ばれたヒトＨＧＦ異型体を発現可能な第２ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物を投与する段階をさらに含む、付記８７～１１９のいずれかに記載の第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物。
［付記１２１］
神経病症を治療する医療方法の用途に用いるための、ヒトＨＧＦ異型体を発現可能な第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物であって、前記医療方法は：
神経病症を有する対象体に、前記第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物の治療的有効量を投与する段階、及び
前記対象体に、ヒトＨＧＦ異型体を発現可能な第１ＩＧＦ－１－暗号化ＤＮＡ作製物の治療的有効量を投与する段階を含む、第１ＨＧＦ－暗号化ＤＮＡ作製物。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【配列表】

0007380670000001.app