(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-11-07
(45)【発行日】2023-11-15
(54)【発明の名称】ＭＡＮＡボディおよび使用方法
(51)【国際特許分類】
C07K 16/30 20060101AFI20231108BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20231108BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20231108BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231108BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20231108BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20231108BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20231108BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231108BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20231108BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20231108BHJP
【ＦＩ】
C07K16/30
A61K35/17
A61K39/395 M
A61K39/395 T
A61K39/395 U
A61P35/00
C07K16/46
C07K19/00
C12N5/0783
C12N5/10
C12N15/13
C12N15/62
【請求項の数】
23
(21)【出願番号】P 2019563546
(86)(22)【出願日】2018-05-16
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-07-16
(86)【国際出願番号】 US2018032996
(87)【国際公開番号】W WO2018213467
(87)【国際公開日】2018-11-22
【審査請求日】2021-05-14
(31)【優先権主張番号】62/506,674
(32)【優先日】2017-05-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】501335771
【氏名又は名称】ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティ
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(74)【代理人】
【識別番号】230118913
【弁護士】
【氏名又は名称】杉村 光嗣
(74)【代理人】
【識別番号】100196298
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 高雄
(72)【発明者】
【氏名】バート フォーゲルシュタイン
(72)【発明者】
【氏名】ケネス ダブリュ キンズラー
(72)【発明者】
【氏名】シビン ジョウ
(72)【発明者】
【氏名】ジャクリーン ダグラス
(72)【発明者】
【氏名】マイケル エス ファン
(72)【発明者】
【氏名】ニコラス パパドプーロス
(72)【発明者】
【氏名】エミリー ハン－チュン シュエ
(72)【発明者】
【氏名】チン ワン
【審査官】山▲崎▼ 真奈
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１６／１５４２４６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１６／１９９１４１（ＷＯ，Ａ２）
【文献】国際公開第２０１６／１８７５０８（ＷＯ，Ａ２）
【文献】国際公開第２０１６／０８５９０４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１７／０４８５９３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１６／１５４０４７（ＷＯ，Ａ２）
【文献】国際公開第２０１６／２０１１２４（ＷＯ，Ａ２）
【文献】国際公開第２０１７／０２１５２７（ＷＯ，Ａ２）
【文献】米国特許出願公開第２００５／００４２２１８（ＵＳ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ペプチド－ＨＬＡ－ベータ－２ミクログロブリン複合体に結合することができる抗原結合ドメインを含む分子であって、前記ペプチドがｐ５３ポリペプチドに由来する修飾ペプチドを含み、前記ＨＬＡがクラスＩ ＨＬＡであり、前記抗原結合ドメインが前記修飾ペプチドの野生型バージョンを含む複合体には結合せず、前記抗原結合ドメインが抗体又はその抗原結合フラグメントを含み、
以下（ｉ）又は（ｉｉ）を満たす、分子。
（ｉ）
前記修飾ｐ５３ペプチドが配列番号１５のアミノ酸配列を含み、前記抗原結合ドメインが配列番号３３１、配列番号３３３、配列番号３３６、および配列番号３３７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
（ｉｉ）
前記修飾ｐ５３ペプチドが配列番号１６のアミノ酸配列を含み、前記抗原結合ドメインが配列番号３３２、配列番号３３４、配列番号３３５、配列番号３３６、および配列番号３３７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【請求項2】
ペプチド－ＨＬＡ－ベータ－２ミクログロブリン複合体に結合することができる抗原結合ドメインを含む分子であって、前記ペプチドが配列番号１５又は配列番号１６の修飾ｐ５３ペプチドを含み、前記抗原結合ドメインが以下に示すＣＤＲのセットの少なくとも一つを含む、抗体又はその抗原結合フラグメントを含む、分子。
（ｉ）ＣＤＲ－ＶＬ１：配列番号３３、ＣＤＲ－ＶＬ２：ＳＡＳ、ＣＤＲ－ＶＬ３：配列番号８２、ＣＤＲ－ＶＨ１：配列番号８９、ＣＤＲ－ＶＨ２：配列番号９６、ＣＤＲ－ＶＨ３：配列番号１０３
（ｉｉ）ＣＤＲ－ＶＬ１：配列番号３３、ＣＤＲ－ＶＬ２：ＳＡＳ、ＣＤＲ－ＶＬ３：配列番号８３、ＣＤＲ－ＶＨ１：配列番号９０、ＣＤＲ－ＶＨ２：配列番号９７、ＣＤＲ－ＶＨ３：配列番号１０４
（ｉｉｉ）ＣＤＲ－ＶＬ１：配列番号３３、ＣＤＲ－ＶＬ２：ＳＡＳ、ＣＤＲ－ＶＬ３：配列番号８４、ＣＤＲ－ＶＨ１：配列番号９１、ＣＤＲ－ＶＨ２：配列番号９８、ＣＤＲ－ＶＨ３：配列番号１０５
（ｉｖ）ＣＤＲ－ＶＬ１：配列番号３３、ＣＤＲ－ＶＬ２：ＳＡＳ、ＣＤＲ－ＶＬ３：配列番号８５、ＣＤＲ－ＶＨ１：配列番号９２、ＣＤＲ－ＶＨ２：配列番号９９、ＣＤＲ－ＶＨ３：配列番号１０６
（ｖ）ＣＤＲ－ＶＬ１：配列番号３３、ＣＤＲ－ＶＬ２：ＳＡＳ、ＣＤＲ－ＶＬ３：配列番号８６、ＣＤＲ－ＶＨ１：配列番号９３、ＣＤＲ－ＶＨ２：配列番号１００、ＣＤＲ－ＶＨ３：配列番号１０７
（ｖｉ）ＣＤＲ－ＶＬ１：配列番号３３、ＣＤＲ－ＶＬ２：ＳＡＳ、ＣＤＲ－ＶＬ３：配列番号８７、ＣＤＲ－ＶＨ１：配列番号９４、ＣＤＲ－ＶＨ２：配列番号１０１、ＣＤＲ－ＶＨ３：配列番号１０８
（ｖｉｉ）ＣＤＲ－ＶＬ１：配列番号３３、ＣＤＲ－ＶＬ２：ＳＡＳ、ＣＤＲ－ＶＬ３：配列番号８８、ＣＤＲ－ＶＨ１：配列番号９５、ＣＤＲ－ＶＨ２：配列番号１０２、ＣＤＲ－ＶＨ３：配列番号１０９
【請求項3】
前記修飾ペプチドが１０～１５アミノ酸を含む、請求項１又は２に記載の分子。
【請求項4】
前記修飾ペプチドが１０アミノ酸を含む、請求項３に記載の分子。
【請求項5】
前記分子が、抗体、抗体フラグメント、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、タンデムｓｃＦｖ、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、ダイアボディ、一本鎖ダイアボディ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、及び二重特異性抗体からなる群より選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の分子。
【請求項6】
前記分子が一本鎖ダイアボディである、請求項１～５のいずれか一項に記載の分子。
【請求項7】
前記分子が、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、およびＣＤ２７からなる群より選択されるエフェクター細胞受容体に結合することができる抗原結合ドメインをさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の分子。
【請求項8】
エフェクター細胞受容体に結合することができる前記抗原結合ドメインがＣＤ３に結合することができ、前記抗原結合ドメインが配列番号４０４、配列番号４０５、配列番号４０６、配列番号４０７、配列番号４０８、配列番号４０９、配列番号４１０、配列番号４１１、配列番号４１２、配列番号４１３、配列番号４１４、配列番号４１５、配列番号４１６、および配列番号４１７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の分子。
【請求項9】
エフェクター細胞受容体に結合することができる前記抗原結合ドメインがＣＤ１６ａに結合することができる、請求項７に記載の分子。
【請求項10】
エフェクター細胞受容体に結合することができる前記抗原結合ドメインがＮＫＧ２Ｄに結合することができる、請求項７に記載の分子。
【請求項11】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗原結合ドメインを含む細胞外ドメインと；
膜貫通ドメインと；
細胞内ドメイン
とを含む、ＣＡＲ。
【請求項12】
前記膜貫通ドメインがＣＤ４、ＣＤ８、またはＣＤ２８の膜貫通ドメインを含む、請求項１１に記載のＣＡＲ。
【請求項13】
前記細胞内ドメインが、ＣＤ２８、ＤＡＰ１０、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、および／または４－１ＢＢからの１つまたは複数の共刺激ドメインを含む、請求項１１または請求項１２に記載のＣＡＲ。
【請求項14】
前記細胞内ドメインがＣＤ３－ゼータからのシグナル伝達ドメインを含む、請求項１１～１３のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項15】
請求項１１～１４のいずれか一項に記載のＣＡＲを発現するＴ細胞。
【請求項16】
がんを有する哺乳動物を治療する用の医薬組成物であって、前記組成物は請求項１～１０のいずれか一項に記載の分子を含み、前記がんが前記修飾ペプチドを発現するがん細胞を含む、組成物。
【請求項17】
がんを有する哺乳動物を治療する用の医薬組成物であって、前記組成物は請求項１１～１４のいずれか一項に記載のＣＡＲを発現するＴ細胞を含み、前記がんが前記修飾ペプチドを発現するがん細胞を含む、組成物。
【請求項18】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１６または１７に記載の医薬組成物。
【請求項19】
前記がんが、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、肺がん、膵臓がん、胃がん、大腸がん、卵巣がん、子宮内膜がん、胆道がん、肝臓がん、骨髄腫、乳がん、前立腺がん、食道がん、胃がん、腎臓がん、骨がん、軟部組織がん、頭頸部がん、多形性膠芽腫、および星状細胞腫からなる群より選択される、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項20】
がんを有する哺乳動物を治療する用の医薬の製造における請求項１～１０のいずれか一項に記載の分子の使用であって、前記がんが前記修飾ペプチドを発現するがん細胞を含む、使用。
【請求項21】
がんを有する哺乳動物を治療する用の医薬の製造における請求項１１～１４のいずれか一項に記載のＣＡＲを発現するＴ細胞の使用であって、前記がんが前記修飾ペプチドを発現するがん細胞を含む、使用。
【請求項22】
前記哺乳動物がヒトである、請求項２０または２１に記載の使用。
【請求項23】
前記がんが、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、肺がん、膵臓がん、胃がん、大腸がん、卵巣がん、子宮内膜がん、胆道がん、肝臓がん、骨髄腫、乳がん、前立腺がん、食道がん、胃がん、腎臓がん、骨がん、軟部組織がん、頭頸部がん、多形性膠芽腫、および星状細胞腫からなる群より選択される、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【0001】
本出願は、２０１７年５月１６日に出願された米国特許出願第６２／５０６，６７４号の利益を主張する。先行出願の開示は、本出願の開示の一部であると見なされる（そして参照により本出願の開示に組み込まれる）。
【0002】
（連邦政府資金に関する声明）
本発明は、国立衛生研究所からの助成金番号ＣＡ６２９２４の下で、米国政府の支援を受けてなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所からの助成金番号ＣＡ６２９２４の下で、米国政府の支援を受けてなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【技術分野】
【0003】
（１．技術分野）
本文書は、がんを有するまたはがんを有すると疑われる哺乳動物を評価するための、および／またはがんを有する哺乳動物を治療するための方法および材料に関する。例えば、本文書は、修飾ペプチド（例えば、腫瘍抗原）に結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメイン（例えば、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ））を含む分子を使用してがんを有する哺乳動物を治療する方法および材料を提供する。
本文書は、がんを有するまたはがんを有すると疑われる哺乳動物を評価するための、および／またはがんを有する哺乳動物を治療するための方法および材料に関する。例えば、本文書は、修飾ペプチド（例えば、腫瘍抗原）に結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメイン（例えば、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ））を含む分子を使用してがんを有する哺乳動物を治療する方法および材料を提供する。
【背景技術】
【0004】
（２．背景情報）
がんの体細胞変異は、正常細胞ではなく腫瘍細胞でのみ特異的に発現するため、がん治療の理想的な標的である。特に、ドライバー遺伝子タンパク質（がん遺伝子タンパク質と腫瘍抑制タンパク質に広く細分されている）を標的とすることには利点がある。第一に、腫瘍の発がん性付与能力への依存により、抵抗が起こりにくくなる。第二に、これらの変異は通常、腫瘍の成長の初期に発生するため、本質的に全ての娘がん細胞に変異が含まれることになる。最後に、ドライバー遺伝子タンパク質は、多くの患者間で共有されるホットスポット変異を持っている傾向があるため、単一の変異を標的とする治療法を幅広い患者集団に適用することができる。
がんの体細胞変異は、正常細胞ではなく腫瘍細胞でのみ特異的に発現するため、がん治療の理想的な標的である。特に、ドライバー遺伝子タンパク質（がん遺伝子タンパク質と腫瘍抑制タンパク質に広く細分されている）を標的とすることには利点がある。第一に、腫瘍の発がん性付与能力への依存により、抵抗が起こりにくくなる。第二に、これらの変異は通常、腫瘍の成長の初期に発生するため、本質的に全ての娘がん細胞に変異が含まれることになる。最後に、ドライバー遺伝子タンパク質は、多くの患者間で共有されるホットスポット変異を持っている傾向があるため、単一の変異を標的とする治療法を幅広い患者集団に適用することができる。
【0005】
ほとんどの変異タンパク質は、ほとんどの変異ドライバー遺伝子タンパク質を含めて、細胞内にある。小分子は細胞内タンパク質を標的とすることができるが、その野生型（ｗｔ）の対応物ではなく変異ドライバー遺伝子の活性を特異的に阻害できる小分子の開発は、そのようなドライバー遺伝子タンパク質の大部分では手が届かないままであった。単一のアミノ酸変異を区別する能力を持つことができる抗体は、典型的には、細胞外エピトープのみを標的にすることができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
免疫系は、抗原の処理と提示を通じて、細胞の細胞内含有物をサンプリングする。タンパク質分解に続き、得られたペプチドの一部はヒト白血球抗原（ＨＬＡ）にロードされ、細胞表面に送られ、そこでそれらは、Ｔ細胞が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して、自己ペプチドと非自己ペプチドとを区別するように機能する。例えば、ウイルスに感染した細胞は、そのＨＬＡにウイルスペプチドを提示し、Ｔ細胞にその細胞を殺させる。同様に、がんでは、変異ペプチドは、がん細胞表面のＨＬＡに提示され、これは、変異関連ネオ抗原（Ｍｕｔａｔｉｏｎ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｎｅｏ－Ａｎｔｉｇｅｎ）の略でＭＡＮＡと呼ばれる。場合によっては、程度の差はあれ、患者はこれらの変異ペプチド－ＨＬＡネオ抗原に対する抗がんＴ細胞応答を開始する可能性があり、チェックポイント遮断抗体はこの応答をさらに増強する。しかしながら、多くの患者、特に突然変異量が低い患者は、十分な抗がんＴ細胞応答を開始することができない。したがって、ＭＡＮＡを特異的に標的とする治療法または診断法は、真に腫瘍特異的な方法を提供してがんを診断または治療し得る。
【0007】
ＨＬＡクラスＩタンパク質は、全ての有核細胞に存在する。３つの古典的なＨＬＡクラスＩ遺伝子、Ａ、Ｂ、およびＣがあり、それぞれが高度に多型である。各ＨＬＡ対立遺伝子には特定のペプチド結合モチーフがあり、その結果、特定のペプチドのみが特定のＨＬＡ対立遺伝子に結合することになる。
【0008】
当該技術分野では、がんを診断、モニター、および効果的に治療するための新しい方法を開発する必要性が継続して存在する。
【0009】
本文書は、がんを有する哺乳動物を治療するための方法および材料を提供する。例えば、本文書は、修飾ペプチド（例えば、ペプチド－ＨＬＡ－ｂ２Ｍ複合体に存在する修飾ペプチド）に結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つまたは複数の分子を使用する方法および材料を提供し、がん（例えば、修飾ペプチドを発現しているがん）を有する哺乳動物を治療する。場合によっては、修飾ペプチド（例えば、ペプチド－ＨＬＡ－ｂ２Ｍ複合体に存在する修飾ペプチド）に結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つまたは複数の分子を、がん（例えば、修飾ペプチドを発現するがん）を有する哺乳動物に投与し、哺乳動物を治療することができる。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本明細書で実証されるように、多くの急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）症例におけるペプチド－ＨＬＡ－ｂ２Ｍ複合体に存在する多数の変異関連ネオ抗原（ＭＡＮＡ）を標的とする（例えば、結合する）ｓｃＦｖが同定された。また、本明細書で実証されているように、ｓｃＦｖを使用して、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞（ＣＡＲＴ；ＣＡＲ ＴまたはＣＡＲ－Ｔとも略される）と、ＭＡＮＡを発現する細胞を認識および殺すことができる二重特異性抗体との両方を設計した。ＭＡＮＡを特異的に標的とする能力は、がんを診断および／または治療するための腫瘍特異的方法を提供する。例えば、ＭＡＮＡを特異的に標的とするｓｃＦｖを、全長抗体またはそのフラグメント、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、抗体放射性核種複合体、ＣＡＲＴ、または二重特異性抗体に使用して、がんを有する哺乳動物を診断および／または治療することができる。
【0011】
一般に、本文書の１つの態様は、ペプチド－ＨＬＡ－ベータ－２ミクログロブリン複合体に結合することができる抗原結合ドメインを含む分子であり、そこでペプチドは修飾ペプチドを含み、ＨＬＡはクラスＩ ＨＬＡであり、抗原結合ドメインは修飾ペプチドの野生型バージョンを含む複合体には結合しない。修飾ペプチドは、７アミノ酸～１５アミノ酸（例えば、１０アミノ酸）を含み得る。修飾ペプチドは、修飾ＩＤＨ２ポリペプチド、修飾ＥＧＦＲポリペプチド、修飾ｐ５３ポリペプチド、修飾ＫＲＡＳポリペプチド、修飾ＨＲＡＳポリペプチド、修飾ＮＲＡＳポリペプチド、または修飾ＣＴＮＮＢポリペプチドに由来し得る。修飾ペプチドは、配列番号１、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、または配列番号３２で示されるアミノ酸配列を含み得る。修飾ペプチドが配列番号１を含む場合、クラスＩ ＨＬＡはＨＬＡ－Ｂ７であり得、抗原結合フラグメントは配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、または配列番号８で示されるアミノ酸配列を含み得る。修飾ペプチドが配列番号１１を含む場合、クラスＩ ＨＬＡはＨＬＡ－Ｂ７であり得、抗原結合フラグメントは配列番号３８０、配列番号３９０、配列番号３９１、配列番号３９２、または配列番号３９３で示されるアミノ酸配列を含み得る。修飾ペプチドが配列番号１３を含む場合、クラスＩ ＨＬＡはＨＬＡ－Ａ２であり得、抗原結合フラグメントは配列番号３２４、配列番号３２５、配列番号３２６、配列番号３２７、配列番号３２８、配列番号３２９、または配列番号３３０で示されるアミノ酸配列を含み得る。修飾ペプチドが配列番号１５を含む場合、クラスＩ ＨＬＡはＨＬＡ－Ａ２であり得、抗原結合フラグメントは配列番号３３１、配列番号３３３、配列番号３３６、または配列番号３３７で示されるアミノ酸配列を含み得る。修飾ペプチドが配列番号１６を含む場合、クラスＩ ＨＬＡはＨＬＡ－Ａ２であり得、抗原結合フラグメントは配列番号３３２、配列番号３３４、配列番号３３５、配列番号３３６、または配列番号３３７で示されるアミノ酸配列を含み得る。修飾ペプチドが配列番号１８を含む場合、クラスＩ ＨＬＡはＨＬＡ－Ａ２であり得、抗原結合フラグメントは配列番号３３８、配列番号３３９、または配列番号３４０で示されるアミノ酸配列を含み得る。修飾ペプチドが配列番号２０を含む場合、クラスＩ ＨＬＡはＨＬＡ－Ａ３であり得、抗原結合フラグメントは配列番号３４１、配列番号３４２、または配列番号３４３で示されるアミノ酸配列を含み得る。修飾ペプチドが配列番号２１を含む場合、クラスＩ ＨＬＡはＨＬＡ－Ａ３であり得、抗原結合フラグメントは配列番号３４２、配列番号３４３、配列番号３４９、配列番号３５０、配列番号３５１、配列番号３５２、配列番号３５３、配列番号３５４、配列番号３５５、配列番号３５６、または配列番号３５７で示されるアミノ酸配列を含み得る。修飾ペプチドが配列番号２２を含む場合、クラスＩ ＨＬＡはＨＬＡ－Ａ３であり得、抗原結合フラグメントは配列番号３３８、配列番号３３９、配列番号３４０、配列番号３４１、配列番号３４２、配列番号３４３、配列番号３４４、配列番号３４５、配列番号３４６、配列番号３４７、配列番号３４８、配列番号３６９、配列番号３７０、配列番号３７１、配列番号３７２、配列番号３７３、または配列番号３７４で示されるアミノ酸配列を含み得る。修飾ペプチドが配列番号２４を含む場合、クラスＩ ＨＬＡはＨＬＡ－Ａ１１であり得、抗原結合フラグメントは配列番号３５８、配列番号３５９、配列番号３６０、配列番号３６１、配列番号３６２、配列番号３６３、配列番号３６４、配列番号３６５、配列番号３６６、配列番号３６７、または配列番号３６８で示されるアミノ酸配列を含み得る。修飾ペプチドが配列番号２６を含む場合、クラスＩ ＨＬＡはＨＬＡ－Ａ３であり得、抗原結合フラグメントは配列番号３７５、配列番号３７６、配列番号３７７、配列番号３７８、または配列番号３７９で示されるアミノ酸配列を含み得る。修飾ペプチドが配列番号２８を含む場合、クラスＩ ＨＬＡはＨＬＡ－Ａ１であり得、抗原結合フラグメントは配列番号３９４で示されるアミノ酸配列を含み得る。修飾ペプチドが配列番号３０を含む場合、クラスＩ ＨＬＡはＨＬＡ－Ａ１であり得、抗原結合フラグメントは配列番号３９５で示されるアミノ酸配列を含み得る。修飾ペプチドが配列番号３１を含む場合、クラスＩ ＨＬＡはＨＬＡ－Ａ１であり得、抗原結合フラグメントは配列番号３９６で示されるアミノ酸配列を含み得る。修飾ペプチドが配列番号３２を含む場合、クラスＩ ＨＬＡはＨＬＡ－Ａ１であり得、抗原結合フラグメントは配列番号３９７、配列番号３９８、配列番号３９９、配列番号４００、または配列番号４０１で示されるアミノ酸配列を含み得る。分子は、抗体、抗体フラグメント、ｓｃＦｖ、ＣＡＲ、ＴＣＲ、ＴＣＲ模倣体、タンデムｓｃＦｖ、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、ダイアボディ、一本鎖ダイアボディ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、二重特異性抗体、または二重親和性再標的化抗体（ＤＡＲＴ）であり得る。例えば、分子は一本鎖ダイアボディであり得る。分子は、エフェクター細胞受容体（例えば、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、またはＣＤ２７）に結合することができる抗原結合ドメインも含み得る。エフェクター細胞に結合することができる抗原結合ドメインがＣＤ３に結合することができる場合、抗原結合ドメインは配列番号４０４、配列番号４０５、配列番号４０６、配列番号４０７、配列番号４０８、配列番号４０９、配列番号４１０、配列番号４１１、配列番号４１２、配列番号４１３、配列番号４１４、配列番号４１５、配列番号４１６、または配列番号４１７で示されるアミノ酸配列を含み得る。
【0012】
別の態様では、本文書はＣＡＲを特徴とする。ＣＡＲは、本明細書に記載の任意の抗原結合ドメイン（例えば、ペプチド－ＨＬＡ－ベータ－２ミクログロブリン複合体に結合することができる抗原結合ドメインであって、そこでペプチドは修飾ペプチドを含み、ＨＬＡはクラスＩ ＨＬＡであり、抗原結合ドメインは修飾ペプチドの野生型バージョンを含む複合体には結合しない抗原結合ドメイン）を含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含み得る。膜貫通ドメインは、ＣＤ４、ＣＤ８、またはＣＤ２８の膜貫通ドメインを含み得る。細胞内ドメインは、ＣＤ２８、ＤＡＰ１０、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、および／または４－１ＢＢからの１つまたは複数の共刺激ドメインを含み得る。細胞内ドメインは、ＣＤ３－ゼータからのシグナル伝達ドメインを含み得る。
【0013】
別の態様では、本文書は、本明細書に記載の任意のＣＡＲ（例えば、本明細書に記載の任意の抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含むＣＡＲ）を発現するＴ細胞を特徴とする。Ｔ細胞は、ペプチド－ＨＬＡ－ベータ－２ミクログロブリン複合体に結合することができる抗原結合ドメインを含む細胞外ドメインであって、そこでペプチドは修飾ペプチドを含み、ＨＬＡはクラスＩ ＨＬＡであり、抗原結合ドメインは修飾ペプチドの野生型バージョンを含む複合体には結合しない細胞外ドメイン）、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含むＣＡＲを発現し得る。
【0014】
別の態様では、本文書は、がんを有する哺乳動物を治療する方法を特徴とする。本方法は、本明細書に記載の任意の抗原結合ドメイン（例えば、ペプチド－ＨＬＡ－ベータ－２ミクログロブリン複合体に結合することができる抗原結合ドメインであって、そこでペプチドは修飾ペプチドを含み、ＨＬＡはクラスＩ ＨＬＡであり、抗原結合ドメインは修飾ペプチドの野生型バージョンを含む複合体には結合しない抗原結合ドメイン）を含む１つまたは複数の分子を哺乳動物に投与する工程を含み得るか、または本質的にそれからなり得、ここで、がんには、修飾ペプチドを発現するがん細胞が含まれる。哺乳動物は人間であり得る。がんは、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ＡＭＬ、肺がん、膵臓がん、胃がん、大腸がん、卵巣がん、子宮内膜がん、胆道がん、肝臓がん、骨髄腫、乳がん、前立腺がん、食道がん、胃がん、腎臓がん、骨がん、軟部組織がん、頭頸部がん、多形性膠芽腫、または星状細胞腫であり得る。
【0015】
別の態様では、本文書は、がんを有する哺乳動物を治療する方法を特徴とする。本方法は、本明細書に記載のＣＡＲ（例えば、本明細書に記載の任意の抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含むＣＡＲ）のいずれか１つを発現する１つまたは複数のＴ細胞を哺乳動物に投与する工程を含み得るか、または本質的にそれからなり得、ここで、がんには、修飾ペプチドを発現するがん細胞が含まれる。哺乳動物は人間であり得る。がんは、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ＡＭＬ、肺がん、膵臓がん、胃がん、大腸がん、卵巣がん、子宮内膜がん、胆道がん、肝臓がん、骨髄腫、乳がん、前立腺がん、食道がん、胃がん、腎臓がん、骨がん、軟部組織がん、頭頸部がん、多形性膠芽腫、または星状細胞腫であり得る。
【0016】
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が関連する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料を使用して本発明を実施することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及される全ての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。矛盾する場合、本明細書が、定義を含めて優位になる。さらに、材料、方法、および実施例は説明のみを目的としており、限定することを意図したものではない。
【0017】
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の説明に記載されている。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】ＩＤＨ２ Ｒ１４０Ｑ ＨＬＡ－Ｂ７ ｓｃＦｖの特異性を示すＥＬＩＳＡ結果が含まれている。ペプチド－ＨＬＡビオチン化モノマーをストレプトアビジンプレートにコーティングし、これには、ＩＤＨ２ペプチドの野生型（ｗｔ）バージョン（ＳＰＮＧＴＩＲＮＩＬ；配列番号２）、Ｒ１４０Ｑ変異を含むＩＤＨ２ペプチド（ＳＰＮＧＴＩＱＮＩＬ；配列番号１）、および以下の対照ペプチドを含む４つの対照ＨＬＡ－Ｂ７モノマーが含まれる：対照１ペプチドはＳＰＧＡＡＮＫＲＰＩ（人工配列；配列番号４１８）であり、対照２ペプチドはＲＰＩＰＩＫＹＫＡＭ（変異体ＭｙＤ８８ Ｌ２６５Ｐから；配列番号９）であり、対照３ペプチドはＫＰＩＴＩＧＲＨＡＨ（ｗｔ ＩＤＨ２からの異なるペプチドから；配列番号１０）であり、対照４ペプチドはＡＶＧＶＧＫＳＡＬ（変異体ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖから；配列番号１１）である。パニングで同定した５つのクローンを、特定の希釈度でウェル内でインキュベートし、続いてウサギ抗ファージ抗体、次に抗ウサギＨＲＰ抗体でインキュベートした。
【図2】ペプチドパルスＡ２＋細胞のフローサイトメトリーを示すグラフが含まれている。Ｔ２細胞を一晩３７℃で無血清培地において、β－２ミクログロブリン（ｂ２Ｍ）タンパク質のみで、またはｂ２ＭとＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ（７８９－７９７）ペプチド（ＩＭＱＬＭＰＦＧＣ；配列番号１３）とでペプチドパルスした。ＥＧＦＲ ｗｔ（７８９－７９７）ペプチド（ＩＴＱＬＭＰＦＧＣ；配列番号１４）は、ＨＬＡ－Ａ２に結合しなかった。細胞を、細胞１００μＬあたり１０μＬの沈殿ファージで染色し、ウサギ抗Ｍ１３抗体で洗浄および染色し、その後抗ウサギＰＥ抗体で洗浄および染色した。細胞を、生／死近赤外色素で染色し、洗浄し、ＬＳＲＩＩフローサイトメーターで分析した。
【図3】ペプチドパルスＢ７＋細胞のフローサイトメトリーを示すグラフが含まれている。ＲＰＭＩ－６６６６細胞を一晩３７℃で無血清培地において、ｂ２Ｍタンパク質のみで、ｂ２Ｍタンパク質とＩＤＨ２変異Ｒ１４０Ｑペプチド（ＳＰＮＧＴＩＱＮＩＬ；配列番号１）とで、またはｂ２ＭとＩＤＨ２ ｗｔペプチド（ＳＰＮＧＴＩＲＮＩＬ；配列番号２）とでペプチドパルスした。細胞を、細胞１００μＬあたり１０μＬの沈殿ファージで染色し、ウサギ抗Ｍ１３抗体で洗浄および染色し、その後抗ウサギＰＥ抗体で洗浄および染色した。細胞を、生／死近赤外色素で染色し、洗浄し、ＬＳＲＩＩフローサイトメーターで分析した。
【図4】ペプチドパルスＡ２＋細胞のフローサイトメトリーを示すグラフが含まれている。Ｔ２細胞を一晩３７℃で無血清培地において、ｂ２Ｍのみで、ｂ２Ｍとｐ５３変異Ｒ２４８Ｑ（２４５－２５４）ペプチド（ＧＭＮＱＲＰＩＬＴＩ；配列番号１５）とで、ｂ２Ｍとｐ５３変異Ｒ２４８Ｗ（２４５－２５４）ペプチド（ＧＭＮＷＲＰＩＬＴＩ；配列番号１６）とで、ｂ２Ｍとｐ５３ ｗｔ（２４５－２５４）ペプチド（ＧＭＮＲＲＰＩＬＴＩ；配列番号１７）とで、またはｂ２ＭとＨＬＡ－Ａ２制御ペプチドＥＬＡ（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ；配列番号４０３）とでペプチドパルスした。細胞を、細胞１００μＬあたり１０μＬの沈殿ファージで染色し、ウサギ抗Ｍ１３抗体で洗浄および染色し、その後抗ウサギＰＥ抗体で洗浄および染色した。細胞を、生／死近赤外色素で染色し、洗浄し、ＬＳＲＩＩフローサイトメーターで分析した。
【図5】ペプチドパルスＡ２＋細胞のフローサイトメトリーを示すグラフが含まれている。Ｔ２細胞を一晩３７℃で無血清培地において、ｂ２Ｍのみで、ｂ２ＭとＫＲＡＳ変異Ｇ１２Ｖ（６－１４）ペプチド（ＬＶＶＶＧＡＶＧＶ；配列番号１８）、またはｂ２ＭとＫＲＡＳ ｗｔ（６－１４）ペプチド（ＬＶＶＶＧＡＧＧＶ；配列番号１９）とでペプチドパルスした。細胞を、細胞１００μＬあたり１０μＬの沈殿ファージで染色し、ウサギ抗Ｍ１３抗体で洗浄および染色し、その後抗ウサギＰＥ抗体で洗浄および染色した。細胞を、生／死近赤外色素で染色し、洗浄し、ＬＳＲＩＩフローサイトメーターで分析した。
【図6】ペプチドパルスＡ３＋細胞のフローサイトメトリーを示すグラフが含まれている。Ｔ２Ａ３細胞を一晩３７℃で無血清培地において、ｂ２Ｍのみで、ｂ２ＭとＫＲＡＳ変異Ｇ１２Ｃ（８－１６）ペプチド（ＶＶＧＡＣＧＶＧＫ；配列番号４１９）とで、ｂ２ＭとＫＲＡＳ変異Ｇ１２Ｄ（８－１６）ペプチド（ＶＶＧＡＤＧＶＧＫ；配列番号４２０）とで、ｂ２ＭとＫＲＡＳ変異Ｇ１２Ｖ（８－１６）ペプチド（ＶＶＧＡＶＧＶＧＫ；配列番号２２）とで、ｂ２ＭとＫＲＡＳ変異Ｇ１２Ｃ（７－１６）ペプチド（ＶＶＶＧＡＣＧＶＧＫ；配列番号２０）とで、ｂ２ＭとＫＲＡＳ変異Ｇ１２Ｄ（７－１６）ペプチド（ＶＶＶＧＡＤＧＶＧＫ；配列番号２１）とで、ｂ２ＭとＫＲＡＳ変異Ｇ１２Ｖ（７－１６）ペプチド（ＶＶＶＧＡＶＧＶＧＫ；配列番号２２）とで、ｂ２ＭとＫＲＡＳ ｗｔ（８－１６）ペプチド（ＶＶＧＡＧＧＶＧＫ；配列番号２５）とで、ｂ２ＭとＫＲＡＳ ｗｔ（７－１６）ペプチド（ＶＶＶＧＡＧＧＶＧＫ；配列番号２３）とで、またはＣＴＮＮＢ Ｓ４５Ｆ（４１－４９）ペプチド（ＴＴＡＰＦＬＳＧＫ；配列番号２６）とでペプチドパルスした。細胞を、細胞１００μＬあたり１０μＬの沈殿ファージで染色し、ウサギ抗Ｍ１３抗体で洗浄および染色し、その後抗ウサギＰＥ抗体で洗浄および染色した。細胞を、生／死近赤外色素で染色し、洗浄し、ＬＳＲＩＩフローサイトメーターで分析した。
【図7】ペプチドパルスＡ３＋細胞のフローサイトメトリーを示すグラフが含まれている。Ｔ２Ａ３細胞を一晩３７℃で無血清培地において、ｂ２Ｍのみで、ｂ２ＭとＫＲＡＳ変異Ｇ１２Ｖ（７－１６）ペプチド（ＶＶＶＧＡＶＧＶＧＫ；配列番号２２）とで、またはｂ２ＭとＫＲＡＳ ｗｔ（７－１６）ペプチド（ＶＶＶＧＡＧＧＶＧＫ；配列番号２３）とでペプチドパルスした。細胞を、細胞１００μＬあたり１０μＬの沈殿ファージで染色し、ウサギ抗Ｍ１３抗体で洗浄および染色し、その後抗ウサギＰＥ抗体で洗浄および染色した。細胞を、生／死近赤外色素で染色し、洗浄し、ＬＳＲＩＩフローサイトメーターで分析した。
【図8】ペプチドパルスＡ３＋細胞のフローサイトメトリーを示すグラフが含まれている。Ｔ２Ａ３細胞を一晩３７℃で無血清培地において、ｂ２Ｍのみで、ｂ２ＭとＫＲＡＳ変異Ｇ１２Ｃ（７－１６）ペプチド（ＶＶＶＧＡＣＧＶＧＫ；配列番号２０）とで、ｂ２ＭとＫＲＡＳ変異Ｇ１２Ｄ（７－１６）ペプチド（ＶＶＶＧＡＤＧＶＧＫ；配列番号２１）とで、ｂ２ＭとＫＲＡＳ変異Ｇ１２Ｖ（７－１６）ペプチド（ＶＶＶＧＡＶＧＶＧＫ；配列番号２２）とで、またはｂ２ＭとＫＲＡＳ ｗｔ（７－１６）ペプチド（ＶＶＶＧＡＧＧＶＧＫ；配列番号２３）とでペプチドパルスした。細胞を、細胞１００μＬあたり１０μＬの沈殿ファージで染色し、ウサギ抗Ｍ１３抗体で洗浄および染色し、その後抗ウサギＰＥ抗体で洗浄および染色した。細胞を、生／死近赤外色素で染色し、洗浄し、ＬＳＲＩＩフローサイトメーターで分析した。
【図9】ペプチドパルスＡ１１＋細胞のフローサイトメトリーを示すグラフが含まれている。Ｈｓ６１１．Ｔ細胞を一晩３７℃で無血清培地において、ｂ２Ｍのみで、ｂ２ＭとＫＲＡＳ変異Ｇ１２Ｃ（７－１６）ペプチド（ＶＶＶＧＡＣＧＶＧＫ；配列番号２０）とで、ｂ２ＭとＫＲＡＳ変異Ｇ１２Ｄ（７－１６）ペプチド（ＶＶＶＧＡＤＧＶＧＫ；配列番号２１）とで、ｂ２ＭとＫＲＡＳ変異Ｇ１２Ｖ（７－１６）ペプチド（ＶＶＶＧＡＶＧＶＧＫ；配列番号２２）とで、またはｂ２ＭとＫＲＡＳ ｗｔ（７－１６）ペプチド（ＶＶＶＧＡＧＧＶＧＫ；配列番号２３）とでペプチドパルスした。細胞を、細胞１００μＬあたり１０μＬの沈殿ファージで染色し、ウサギ抗Ｍ１３抗体で洗浄および染色し、その後抗ウサギＰＥ抗体で洗浄および染色した。細胞を、生／死近赤外色素で染色し、洗浄し、ＬＳＲＩＩフローサイトメーターで分析した。
【図10】ペプチドパルスＡ１１＋細胞のフローサイトメトリーを示すグラフが含まれている。ＭＩＮＯ細胞を一晩３７℃で無血清培地において、ｂ２Ｍのみで、ｂ２ＭとＫＲＡＳ変異Ｇ１２Ｄ（８－１６）ペプチド（ＶＶＧＡＤＧＶＧＫ；配列番号２４）とで、またはｂ２ＭとＫＲＡＳ ｗｔ（８－１６）ペプチド（ＶＶＧＡＧＧＶＧＫ；配列番号２５）とでペプチドパルスした。細胞を、細胞１００μＬあたり１０μＬの沈殿ファージで染色し、ウサギ抗Ｍ１３抗体で洗浄および染色し、その後抗ウサギＰＥ抗体で洗浄および染色した。細胞を、生／死近赤外色素で染色し、洗浄し、ＬＳＲＩＩフローサイトメーターで分析した。
【図11】ペプチドパルスＡ１１＋細胞のフローサイトメトリーを示すグラフが含まれている。Ｈｓ６１１．Ｔ細胞を一晩３７℃で無血清培地において、ｂ２Ｍのみで、ｂ２ＭとＫＲＡＳ変異Ｇ１２Ｃ（７－１６）ペプチド（ＶＶＶＧＡＣＧＶＧＫ；配列番号２０）とで、ｂ２ＭとＫＲＡＳ変異Ｇ１２Ｄ（７－１６）ペプチド（ＶＶＶＧＡＤＧＶＧＫ；配列番号２１）とで、ｂ２ＭとＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ（７－１６）ペプチド（ＶＶＶＧＡＶＧＶＧＫ；配列番号２２）とで、またはｂ２ＭとＫＲＡＳ ｗｔ（７－１６）ペプチド（ＶＶＶＧＡＧＧＶＧＫ；配列番号２３）とでペプチドパルスした。細胞を、細胞１００μＬあたり１０μＬの沈殿ファージで染色し、ウサギ抗Ｍ１３抗体で洗浄および染色し、その後抗ウサギＰＥ抗体で洗浄および染色した。細胞を、生／死近赤外色素で染色し、洗浄し、ＬＳＲＩＩフローサイトメーターで分析した。
【図12】ペプチドパルスＡ３＋細胞のフローサイトメトリーを示すグラフが含まれている。Ｔ２Ａ３細胞を一晩３７℃で無血清培地において、ｂ２Ｍのみで、ｂ２ＭとＣＴＮＮＢ変異Ｓ４５Ｆ（４１－４９）ペプチド（ＴＴＡＰＦＬＳＧＫ；配列番号２６）とで、またはｂ２ＭとＣＴＮＮＢ ｗｔ（４１－４９）ペプチド（ＴＴＡＰＳＬＳＧＫ；配列番号２７）とでペプチドパルスした。細胞を、細胞１００μＬあたり１０μＬの沈殿ファージで染色し、ウサギ抗Ｍ１３抗体で洗浄および染色し、その後抗ウサギＰＥ抗体で洗浄および染色した。細胞を、生／死近赤外色素で染色し、洗浄し、ＬＳＲＩＩフローサイトメーターで分析した。
【図13】ペプチドパルスＢ７＋細胞のフローサイトメトリーを示すグラフが含まれている。ＲＰＭＩ－６６６６細胞を一晩３７℃で無血清培地において、ペプチドパルスし、ｂ２Ｍのみで、ｂ２ＭとＫＲＡＳ変異Ｇ１２Ｖ（１１－１９）ペプチド（ＡＶＧＶＧＫＳＡＬ；配列番号１１）とでパルスした細胞を示す。ＫＲＡＳ ｗｔ（１１－１９）ペプチド（ＡＧＧＶＧＫＳＡＬ；配列番号１２）は、ＨＬＡ－Ｂ７に結合しなかった。細胞を、細胞１００μＬあたり１０μＬの沈殿ファージで染色し、ウサギ抗Ｍ１３抗体で洗浄および染色し、その後抗ウサギＰＥ抗体で洗浄および染色した。細胞を、生／死近赤外色素で染色し、洗浄し、ＬＳＲＩＩフローサイトメーターで分析した。
【図14】ペプチドパルスＡ１＋細胞のフローサイトメトリーを示すグラフが含まれている。ＳｉｇＭ５細胞を一晩３７℃で無血清培地においてペプチドパルスし、ｂ２Ｍのみで、ｂ２ＭとＨ／Ｋ／Ｎ ＲＡＳ変異Ｑ６１Ｈ（５５－６４）ペプチド（ＩＬＤＴＡＧＨＥＥＹ；配列番号２８）とで、ｂ２ＭとＨ／Ｋ／Ｎ ＲＡＳ変異Ｑ６１Ｋ（５５－６４）ペプチド（ＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ；配列番号３０）とで、ｂ２ＭとＨ／Ｋ／Ｎ ＲＡＳ変異Ｑ６１Ｌ（５５－６４）ペプチド（ＩＬＤＴＡＧＬＥＥＹ；配列番号３１）とで、ｂ２ＭとＨ／Ｋ／Ｎ ＲＡＳ変異Ｑ６１Ｒ（５５－６４）ペプチド（ＩＬＤＴＡＧＲＥＥＹ；配列番号３２）とで、またはｂ２ＭとＨ／Ｋ／Ｎ ＲＡＳ ｗｔ（５５－６４）ペプチド（ＩＬＤＴＡＧＱＥＥＹ；配列番号２９）とでパルスした細胞を示す。細胞を、細胞１００μＬあたり１０μＬの沈殿ファージで染色し、ウサギ抗Ｍ１３抗体で洗浄および染色し、その後抗ウサギＰＥ抗体で洗浄および染色した。細胞を、生／死近赤外色素で染色し、洗浄し、ＬＳＲＩＩフローサイトメーターで分析した。
【図15】図１５Ａ－１５Ｂは、ＭＡＮＡボディクローンをＣＡＲ－Ｔ細胞に変換することができることを示している。図１５Ａは、ＩＤＨ２ Ｒ１４０Ｑ（１３４－１４３）－Ｂ７ ｃｌ．１ ＭＡＮＡ－ＣＡＲ－Ｔ細胞を４時間３７℃で、ＨＬＡ－Ｂ７、ＩＤＨ２（ＷＴ）、およびＩＤＨ２（Ｒ１４０Ｑ）のさまざまな組み合わせをコードするプラスミドで共トランスフェクトしたＣＯＳ－７細胞と共培養した。共培養後、馴化培地を収集し、ＥＬＩＳＡにより分泌ＩＦＮγについてアッセイした。図１５Ｂは、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ（７－１６）－Ａ３ ｃｌ．２ ＭＡＮＡ－ＣＡＲ－Ｔ細胞を４時間３７℃で、ＨＬＡ－Ａ３、ＫＲＡＳ（ＷＴ）、およびＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｖ）のさまざまな組み合わせをコードするプラスミドでトランスフェクトしたＣＯＳ－７細胞と共培養した。共培養後、馴化培地を収集し、ＥＬＩＳＡにより分泌ＩＦＮγについてアッセイした。
【図16】図１６Ａ－１６Ｂは、ＭＡＮＡボディクローンを一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）に変換することができることを示している。図１６Ａは、抗ＣＤ３クローンｍＵＣＨＴ１またはｈＵＣＨＴ１ｖ９のいずれかを含むＩＤＨ２ Ｒ１４０Ｑ（１３４－１４３）－Ｂ７ ｃｌ．２９、ｃｌ．１、およびｃｌ．３ ｓｃＤｂを指定濃度で、ＨＬＡ－Ｂ７、ＩＤＨ２（ＷＴ）、ＩＤＨ２（Ｒ１４０Ｑ）、およびＧＦＰのさまざまな組み合わせをコードするプラスミドで共トランスフェクトしたＴ細胞およびＣＯＳ－７細胞と２４時間３７℃でインキュベートした。共培養後、プレートを急速凍結し、馴化培地を収集し、ＥＬＩＳＡにより分泌ＩＦＮγについてアッセイした。図１６Ｂは、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ（７－１６）－Ａ３ ｃｌ．２ ｍＵＣＨＴ１ ｓｃＤｂを指定濃度で、Ｔ細胞ありまたはなしで、１）標的細胞なしで、２）ＨＬＡ－Ａ３およびＫＲＡＳ（ＷＴ）もしくはＨＬＡ－Ａ３およびＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｖ）をコードするプラスミドで共トランスフェクトしたＣＯＳ－７細胞と、または３）ＮＣＩ－Ｈ４４１親細胞もしくはＨＬＡ－Ａ３ノックアウト細胞とのいずれかで２４時間３７℃でインキュベートした。共培養後、プレートを急速凍結し、馴化培地を収集し、ＥＬＩＳＡにより分泌ＩＦＮγについてアッセイした。
【図17】ｓｃＤｂに変換されたＭＡＮＡボディクローンが標的細胞を殺すことができることを示している。ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ（７－１６）－Ａ３ ｃｌ．２ ｍＵＣＨＴ１ ｓｃＤｂおよびｐａｎ－ＨＬＡ－Ａ３ ｓｃＤｂを０または５０ｎｇ／ｍＬで、Ｔ細胞ありまたはなしで、ＮＣＩ－Ｈ４４１親細胞またはＨＬＡ－Ａ３ノックアウト細胞とともに２４時間３７℃でインキュベートした。共培養後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏを使用して各ウェルの生細胞をアッセイした。Ｔ細胞のみのウェルからの値を差し引き、標的細胞のみのウェルからの値に正規化することにより、標的細胞の生存率を計算した。
【発明を実施するための形態】
【0019】
本文書は、がんを有するまたはがんを有すると疑われる哺乳動物を評価するための、および／またはがんを有する哺乳動物を治療するための方法および材料を提供する。例えば、１つまたは複数の修飾ペプチド（例えば、ペプチド－ＨＬＡ－ｂ２Ｍ複合体などのペプチド－ＨＬＡ複合体に存在するペプチド）を標的とする（例えば、結合する）ことができる１つもしくは複数の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つもしくは複数の分子を使用して、がんを有するまたはがんを有すると疑われる哺乳動物を評価することができる、および／あるいはがん（例えば、１つもしくは複数の修飾ペプチドを発現するがん）を有する哺乳動物を治療することができる。場合によっては、１つまたは複数の分子は、修飾ペプチドに結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメインを含み、これらを使用して、がんを患っているまたはがんを有すると疑われる哺乳動物から得た試料中の１つまたは複数の修飾ペプチドの有無を検出することができる。場合によっては、修飾ペプチドに結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメインを含む１つまたは複数の分子を、がん（例えば、修飾ペプチドを発現するがん）を有する哺乳動物に投与し、哺乳動物を治療することができる。
【0020】
本明細書で使用される場合、修飾ペプチドは、修飾ポリペプチドに由来するペプチドである。修飾ポリペプチドは、任意の適切な修飾ポリペプチド（例えば、発がん性突然変異などの疾患を引き起こす突然変異を有するポリペプチド）であり得る。修飾ペプチドは、野生型（ｗｔ）ペプチド（例えば、修飾ポリペプチドが由来するｗｔポリペプチドに由来するペプチド）に対して１つまたは複数のアミノ酸修飾（例えば、置換）を有し得る。修飾ペプチドは、変異ペプチドとも呼ばれる。場合によっては、修飾ペプチドは腫瘍抗原であり得る。腫瘍抗原の例には、非限定的に、変異関連ネオ抗原（ＭＡＮＡ）、腫瘍関連抗原、および腫瘍特異的抗原が含まれる。修飾ペプチドは、任意の適切な長さであり得る。場合によっては、修飾ペプチドは、約７アミノ酸～約１５アミノ酸（例えば、約８アミノ酸～約１５アミノ酸、約９アミノ酸～約１５アミノ酸、約１０アミノ酸～約１５アミノ酸、約１１アミノ酸～約１５アミノ酸、約１２アミノ酸～約１５アミノ酸、約１３アミノ酸～約１５アミノ酸、約７アミノ酸～約１４アミノ酸、約７アミノ酸～約１３アミノ酸、約７アミノ酸～約１２アミノ酸、約７アミノ酸～約１１アミノ酸、約７アミノ酸～約１０アミノ酸、約７アミノ酸～約９アミノ酸、または約９アミノ酸～約１０アミノ酸）の長さであり得る。例えば、修飾ペプチドは、約９アミノ酸の長さであり得る。例えば、修飾ペプチドは、約１０アミノ酸の長さであり得る。修飾ペプチドは、任意の修飾（例えば、発がん性）ポリペプチドに由来し得る。本明細書に記載の修飾ペプチドが由来し得る修飾ポリペプチドの例には、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ２（ＩＤＨ２）、ｐ５３、ＲＡＳ（例えば、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、およびＮＲＡＳ）、ならびにＣＴＮＮＢが含まれるが、これらに限定されない。修飾ペプチドには、任意の適切な修飾が含まれ得る。場合によっては、本明細書に記載の修飾ペプチドは、表１に示す１つまたは複数の修飾（例えば、突然変異）を含み得る。
【表1】
【0021】
本明細書に記載の修飾ペプチド（例えば、配列番号１、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、および配列番号３２のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む修飾ペプチド）は、任意の適切なＨＬＡとの複合体中にあり得る。ＨＬＡは、任意の適切なＨＬＡ対立遺伝子であり得る。場合によっては、ＨＬＡはクラスＩ ＨＬＡ（例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ）対立遺伝子であり得る。本明細書に記載の修飾ペプチドが複合できるＨＬＡ対立遺伝子の例には、ＨＬＡ－Ａ１、ＨＬＡ－Ａ２、ＨＬＡ－Ａ３、ＨＬＡ－１１、およびＨＬＡ－Ｂ７が含まれ得るが、これらに限定されない。特定の修飾ペプチドの例示的なＨＬＡ対立遺伝子を表１に示す。例えば、修飾ＥＧＦＲポリペプチドに由来する修飾ペプチド（例えば、ＩＭＱＬＭＰＦＧＣ（配列番号１３））は、ＨＬＡ－Ａ２およびｂ２Ｍとの複合体中にあり得る。例えば、修飾ＩＤＨ２ポリペプチドに由来する修飾ペプチド（例えば、ＳＰＮＧＴＩＱＮＩＬ（配列番号１））は、ＨＬＡ－Ｂ７およびｂ２Ｍとの複合体中にあり得る。例えば、修飾ｐ５３ポリペプチドに由来する修飾ペプチド（例えば、ＧＭＮＱＲＰＩＬＴＩ（配列番号１５）またはＧＭＮＷＲＰＩＬＴＩ １（配列番号１６））は、ＨＬＡ－Ａ２およびｂ２Ｍとの複合体中にあり得る。例えば、修飾ＫＲＡＳポリペプチドに由来する修飾ペプチド（例えば、ＬＶＶＶＧＡＶＧＶ（配列番号１８）、ＶＶＶＧＡＣＧＶＧＫ（配列番号２０）、ＶＶＶＧＡＤＧＶＧＫ（配列番号２１）、ＶＶＶＧＡＶＧＶＧＫ（配列番号２２）、およびＶＶＧＡＤＧＶＧＫ（配列番号２４））は、ＨＬＡ－Ａ２、ＨＬＡ－Ａ３、および／またはＨＬＡ－Ａ１１、およびｂ２Ｍとの複合体中にあり得る。例えば、修飾ＣＴＮＮＢポリペプチドに由来する修飾ペプチド（例えば、ＴＴＡＰＦＬＳＧＫ（配列番号２６））は、ＨＬＡ－Ａ３およびｂ２Ｍとの複合体中にあり得る。例えば、修飾ＫＲＡＳポリペプチドに由来する修飾ペプチド（例えば、ＡＶＧＶＧＫＳＡＬ（配列番号１１））は、ＨＬＡ-Ｂ７およびｂ２Ｍとの複合体中にあり得る。例えば、修飾Ｈ／Ｋ／Ｎ ＲＡＳポリペプチドに由来する修飾ペプチド（例えば、ＩＬＤＴＡＧＨＥＥＹ（配列番号２８）、ＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ（配列番号３０）、ＩＬＤＴＡＧＬＥＥＹ（配列番号３１）、ＩＬＤＴＡＧＲＥＥＹ（配列番号３２））は、ＨＬＡ－Ａ１およびｂ２Ｍとの複合体中にあり得る。
【0022】
本文書は、本明細書に記載の修飾ペプチド（例えば、配列番号１、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、および配列番号３２のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む修飾ペプチド）に結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む分子を提供する。場合によっては、本明細書に記載の修飾ペプチドに結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメインを含む分子は、複合体（例えば、ペプチド－ＨＬＡ－ｂ２Ｍ複合体）に存在しない本明細書に記載の修飾ペプチドを標的としない（例えば、結合しない）。場合によっては、本明細書に記載の修飾ペプチドに結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメインを含む分子は、ｗｔペプチド（例えば、修飾ポリペプチドが由来するｗｔポリペプチドに由来するペプチド）を標的としない（例えば、結合しない）。
【0023】
本明細書に記載の修飾ペプチドに結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む分子は、任意の適切なタイプの分子であり得る。場合によっては、分子は一価分子（例えば、単一の抗原結合ドメインを含む）であり得る。場合によっては、分子は多価分子（例えば、２つ以上の抗原結合ドメインを含み、同時に２つ以上の抗原を標的とする）であり得る。例えば、二重特異性分子は２つの抗原結合ドメインを含むことができ、三重特異性分子は３つの抗原結合ドメインを含むことができ、四重特異性分子は４つの抗原結合ドメインを含むことができる、などである。抗原結合ドメインを含む分子の例には、抗体、抗体フラグメント、ｓｃＦｖ、ＣＡＲ、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＴＣＲ模倣体、タンデムｓｃＦｖ、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、ダイアボディ、ｓｃＤｂ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、二重特異性抗体、二重親和性再標的化抗体（ＤＡＲＴ）、および少なくとも１つの可変重鎖（ＶＨ）と少なくとも１つの可変軽鎖（ＶＬ）とを含む任意の他の分子が含まれるが、これらに限定されない。これらの分子のいずれも、本明細書に記載の材料および方法に従って使用することができる。場合によっては、抗原結合ドメインはｓｃＦｖであり得る。例えば、本明細書に記載の修飾ペプチドに結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメイン（例えば、１つまたは複数のｓｃＦｖ）を含む分子は、ＣＡＲであり得る。例えば、本明細書に記載の修飾ペプチドに結合することができる２つのｓｃＦｖを含む分子は、一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）であり得る。
【0024】
場合によっては、本明細書に記載の修飾ペプチド（例えば、配列番号１、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、および配列番号３２のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む修飾ペプチド）に結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメイン（例えば、１つまたは複数のｓｃＦｖ）を含む分子がＣＡＲである場合、ＣＡＲは任意の適切なＣＡＲであり得る。本明細書で提供されるＣＡＲは、本明細書に記載の修飾ペプチド、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメイン（例えば、共刺激ドメインなどの細胞内シグナル伝達ドメイン）に結合することができる少なくとも１つの抗原結合ドメインを有する細胞外ドメインを含み得る。ＣＡＲは、任意の適切な細胞外ドメインを含み得る。例えば、ＣＡＲは、配列番号１、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、および配列番号３２のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む修飾ペプチドに結合することができる抗原結合ドメインを有する分子（例えば、ｓｃＦｖ）を含み得る。ＣＡＲは、任意の適切な膜貫通ドメインを含み得る。膜貫通ドメインは、任意の適切なポリペプチドに由来し得る。本明細書に記載のＣＡＲにおいて使用され得る膜貫通ドメインの例には、ＣＤ４、ＣＤ８（例えば、ＣＤ８－アルファおよびＣＤ８－ベータ）、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、４－１ＢＢ、およびＣＤ１５４の膜貫通ドメインが含まれるが、これらに限定されない。場合によっては、本明細書に記載のＣＡＲはＣＤ２８膜貫通ドメインを含み得る。ＣＡＲは、適切な細胞内ドメインを含み得る。細胞内ドメインは、任意の適切なポリペプチドに由来し得る。細胞内ドメインは、共刺激ドメイン（例えば、単一の共刺激ドメインまたは複数の共刺激ドメイン）を含み得る。ＣＡＲが複数の共刺激ドメインを含む場合、ＣＡＲは同じタイプの複数の共刺激ドメインまたは異なるタイプの複数の共刺激ドメインを含み得る。細胞内ドメインは、シグナル伝達ドメインを含み得る。本明細書に記載のＣＡＲにおいて使用され得る細胞内ドメインの例には、ＣＤ３（例えばＣＤ３－ゼータ）、ＣＤ２８、ＤＡＰ１０、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＤＡＰ－１２、ＣＤ２２、およびＣＤ７９の細胞内ドメインが含まれるが、これらに限定されない。ＣＡＲは、任意の適切な方法を使用して作製され得る。場合によっては、ＣＡＲは、ヒンジ配列（例えば、細胞外ドメインと膜貫通ドメインの間に位置する）も含み得る。場合によっては、ＣＡＲは、他で説明されるように作製され得る（Ｃｕｒｒａｎ ｅｔ ａｌ．,２０１２ Ｊ． Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ １４：４０５－４１５；Ｋｅｒｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．,２００５ Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ５（１２）：９２８－９４０；Ｅｓｈｈａｒ ｅｔ ａｌ．,１９９３ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９０（２）：７２０－７２４；Ｓａｄｅｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．,２００９ Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２１（２）：２１５－２２３；ＷＯ ２０１５／１４２６７５；ＷＯ ２０１５／１５０５２６；およびＷＯ ２０１４／１３４１６５を参照）。また、１つまたは複数のＣＡＲを発現するＣＡＲＴも本明細書において提供され、ＣＡＲは、本明細書に記載の１つまたは複数の修飾ペプチド（例えば、２つ以上の抗原結合ドメインを有するＣＡＲ）を標的とする（例えば、結合する）ことができる。また、１つまたは複数のＣＡＲを発現するＣＡＲＴも本明細書において提供され、ＣＡＲＴは、本明細書に記載の１つまたは複数の修飾ペプチドを標的とする（例えば、結合する）ことができる。
【0025】
場合によっては、本明細書に記載の修飾ペプチド（例えば、配列番号１、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、および配列番号３２のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む修飾ペプチド）に結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む分子が多価分子（例えば、二重特異性分子）である場合、第１抗原結合ドメインは本明細書に記載の修飾ペプチドに結合することができ、第２抗原結合ドメインはエフェクター細胞（例えば、エフェクター細胞上に存在する抗原）に結合することができる。エフェクター細胞の例には、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、Ｂ細胞、形質細胞、マクロファージ、単球、ミクログリア、樹状細胞、好中球、線維芽細胞、およびマスト細胞が含まれるが、これらに限定されない。エフェクター細胞上に存在する抗原の例には、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ１６ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、および任意の他のエフェクター細胞表面受容体が含まれるが、これらに限定されない。場合によっては、本明細書に記載の分子は、本明細書に記載の修飾ペプチドに結合することができる第１抗原結合ドメインと、Ｔ細胞に存在する抗原（例えばＣＤ３）に結合することができる第２抗原結合ドメインとを含み得る。場合によっては、ＣＤ３に結合することができる配列（例えば、ｓｃＦｖ配列）は、表４に示される通りであり得る。場合によっては、ＣＤ３に結合することができる配列（例えば、ｓｃＦｖ配列）は、他で説明される通りであり得る（例えば、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ ｅｔ ａｌ．,１９９２ Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｐｐｌ． ７：４５－５０；Ｓｈａｌａｂｙ ｅｔ ａｌ．,１９９２ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． １７５：２１７－２５；Ｂｒｉｓｃｈｗｅｉｎ ｅｔ ａｌ．,２００６ Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４３：１１２９－４３；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．,２００５ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． １１６：４８７－９８；ＷＯ２０１２１６２０６７；ＵＳ２００７００６５４３７；ＵＳ２００７００６５４３７；ＵＳ２００７００６５４３７；ＵＳ２００７００６５４３７；ＵＳ２００７００６５４３７；およびＵＳ２００７００６５４３７を参照）。場合によっては、本明細書に記載の分子は、本明細書に記載の修飾ペプチドに結合することができる第１抗原結合ドメインと、ＮＫ細胞上に存在する抗原（例えば、ＣＤ１６ａまたはＮＫＧ２Ｄ）に結合することができる第２抗原結合ドメインとを含み得る。修飾ペプチドとエフェクター細胞の両方に結合することにより、多価分子は、修飾ペプチドを（例えば、ＨＬＡ複合体の一部として）発現する細胞をエフェクター細胞に接近させることができ、エフェクター細胞が修飾ペプチドを発現する細胞に作用することを可能する。
【0026】
場合によっては、本明細書に記載の修飾ペプチド（例えば、配列番号１、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、および配列番号３２のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む修飾ペプチド）に結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む分子が多価分子（例えば、二重特異性分子）である場合、分子は、少なくとも１つのＶＨと少なくとも１つのＶＬとを含む任意の適切な型であり得る。例えば、ＶＨおよびＶＬは、任意の適切な配向性であり得る。場合によっては、ＶＨはＶＬのＮ末端であり得る。場合によっては、ＶＨはＶＬのＣ末端であり得る。場合によっては、リンカーのアミノ酸配列は、ＶＨとＶＬとの間に配置され得る。
【0027】
場合によっては、二重特異性分子がタンデムｓｃＦｖである場合、タンデムｓｃＦｖは任意の適切な配向性であり得る。ｓｃＦｖ－ＡおよびｓｃＦｖ－Ｂを含むタンデムｓｃＦｖ配向性の例には、ＶＬＡ－ＬＬ－ＶＨＡ－ＳＬ－ＶＬＢ－ＬＬ－ＶＨＢ、ＶＬＡ－ＬＬ－ＶＨＡ－ＳＬ－ＶＨＢ－ＬＬ－ＶＬＢ、ＶＨＡ－ＬＬ－ＶＬＡ－ＳＬ－ＶＬＢ－ＬＬ－ＶＨＢ、ＶＨＡ－ＬＬ－ＶＬＡ－ＳＬ－ＶＨＢ－ＬＬ－ＶＬＢ、ＶＬＢ－ＬＬ－ＶＨＢ－ＳＬ－ＶＬＡ－ＬＬ－ＶＨＡ、ＶＬＢ－ＬＬ－ＶＨＢ－ＳＬ－ＶＨＡ－ＬＬ－ＶＬＡ、ＶＨＢ－ＬＬ－ＶＬＢ－ＳＬ－ＶＬＡ－ＬＬ－ＶＨＡ、およびＶＨＢ－ＬＬ－ＶＬＢ－ＳＬ－ＶＨＡ－ＬＬ－ＶＬＡが含まれるが、これらに限定されず、ここでＳＬは短いリンカーであり、ＬＬは長いリンカーである。短いリンカーは、約３アミノ酸～約１０アミノ酸の長さであり得る。短いリンカーは、任意の適切な組み合わせで任意の適切なアミノ酸（例えば、グリシンおよびセリン）を含み得る。長いリンカーは、約１０アミノ酸～約２５アミノ酸の長さであり得る。長いリンカーは、任意の適切な組み合わせで任意の適切なアミノ酸（例えば、グリシンおよびセリン）を含み得る。
【0028】
場合によっては、二重特異性分子がダイアボディである場合、ダイアボディは任意の適切な配向性であり得る。ｓｃＦｖ－ＡおよびｓｃＦｖ－Ｂを含むダイアボディの配向性の例には、ＶＬＡ－ＳＬ－ＶＨＢおよびＶＬＢ－ＳＬ－ＶＨＡ、ＶＬＡ－ＳＬ－ＶＬＢおよびＶＨＢ－ＳＬ－ＶＨＡ、ＶＨＡ－ＳＬ－ＶＬＢおよびＶＨＢ－ＳＬ－ＶＬＡ、ＶＬＢ－ＳＬ－ＶＨＡおよびＶＬＡ－ＳＬ－ＶＨＢ、ＶＬＢ－ＳＬ－ＶＬＡおよびＶＨＡ－ＳＬ－ＶＨＢ，ならびにＶＨＢ－ＳＬ－ＶＬＡおよびＶＨＡ－ＳＬ－ＶＬＢが含まれるが、これらに限定されず、ここでＳＬは短いリンカーである。短いリンカーは、約３アミノ酸～約１０アミノ酸の長さであり得る。短いリンカーは、任意の適切な組み合わせで任意の適切なアミノ酸（例えば、グリシンおよびセリン）を含み得る。
【0029】
場合によっては、二重特異性分子がｓｃＤｂである場合、ｓｃＤｂは任意の適切な配向性であり得る。ｓｃＦｖ－ＡおよびｓｃＦｖ－Ｂを含むｓｃＤｂの配向性の例には、ＶＬＡ－ＳＬ－ＶＨＢ－ＬＬ－ＶＬＢ－ＳＬ－ＶＨＡ、ＶＨＡ－ＳＬ－ＶＬＢ－ＬＬ－ＶＨＢ－ＳＬ－ＶＬＡ、ＶＬＡ－ＳＬ－ＶＬＢ－ＬＬ－ＶＨＢ－ＳＬ－ＶＨＡ、ＶＨＡ－ＳＬ－ＶＨＢ－ＬＬ－ＶＬＢ－ＳＬ－ＶＬＡ、ＶＬＢ－ＳＬ－ＶＨＡ－ＬＬ－ＶＬＡ－ＳＬ－ＶＨＢ、ＶＨＢ－ＳＬ－ＶＬＡ－ＬＬ－ＶＨＡ－ＳＬ－ＶＬＢ、ＶＬＢ－ＳＬ－ＶＬＡ－ＬＬ－ＶＨＡ－ＳＬ－ＶＨＢ、およびＶＨＢ－ＳＬ－ＶＨＡ－ＬＬ－ＶＬＡ－ＳＬ－ＶＬＢが含まれるが、これらに限定されず、ここでＳＬは短いリンカーであり、ＬＬは長いリンカーである。短いリンカーは、約３アミノ酸～約１０アミノ酸の長さであり得る。短いリンカーは、任意の適切な組み合わせで任意の適切なアミノ酸（例えば、グリシンおよびセリン）を含み得る。長いリンカーは、約１０アミノ酸～約２５アミノ酸の長さであり得る。長いリンカーは、任意の適切な組み合わせで任意の適切なアミノ酸（例えば、グリシンおよびセリン）を含み得る。
【0030】
場合によっては、二重特異性分子がｓｃＦｖ－Ｆｃである場合、ｓｃＦｖ－Ｆｃは任意の適切な配向性であり得る。ｓｃＦｖ－Ｆｃ－Ａ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ－Ｂ、およびＦｃドメインを含むｓｃＦｖ－Ｆｃの配向性の例には、ＶＬＡ－ＬＬ－ＶＨＡ－ヒンジ－ＦｃおよびＶＬＢ－ＬＬ－ＶＨＢ－ヒンジ－Ｆｃ、ＶＨＡ－ＬＬ－ＶＬＡ－ヒンジ－ＦｃおよびＶＨＢ－ＬＬ－ＶＬＢ－ヒンジ－Ｆｃ、ＶＬＡ－ＬＬ－ＶＨＡ－ヒンジ－ＦｃおよびＶＨＢ－ＬＬ－ＶＬＢ－ヒンジ－Ｆｃ、ＶＨＡ－ＬＬ－ＶＬＡ－ヒンジ－ＦｃおよびＶＬＢ－ＬＬ－ＶＨＢ－ヒンジ－Ｆｃが含まれるが、これらに限定されず、ここでＬＬは長いリンカーである。長いリンカーは、約１０アミノ酸～約２５アミノ酸の長さであり得る。長いリンカーは、任意の適切な組み合わせで任意の適切なアミノ酸（例えば、グリシンおよびセリン）を含み得る。場合によっては、ｓｃＦｖ－ＦｃのＦｃドメインは１つまたは複数の修飾を含み、ｓｃＦｖ－Ｆｃのヘテロ二量体化を増加させるおよび／またはホモ二量体化を減少させ得る。場合によっては、ｓｃＦｖ－ＦｃのＦｃドメインはヒンジドメインを除外し得る。場合によっては、ｓｃＦｖ－ＦｃのＦｃドメインはｓｃＦｖのＮ末端であり得る。
【0031】
本明細書に記載の修飾ペプチド（例えば、配列番号１、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、および配列番号３２のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む修飾ペプチド）に結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む分子は、任意の適切な相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み得る。例えば、本明細書に記載の修飾ペプチドに結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメインを含む分子は、３つのＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ－ＶＨ）有する可変重鎖（ＶＨ）と３つのＶＬ ＣＤＲ（ＣＤＲ－ＶＬ）を有する可変軽鎖（ＶＬ）を含み得る。例えば、修飾ＥＧＦＲポリペプチドに由来する修飾ペプチド（例えば、ＩＭＱＬＭＰＦＧＣ（配列番号１３））に結合することができる分子は、以下に示すＣＤＲのそれぞれの１つを含み得る：
ＣＤＲ－ＶＬ１：ＱＤＶＮＴＡ（配列番号３３）；
ＣＤＲ－ＶＬ２：ＳＡＳ；
ＣＤＲ－ＶＬ３：ＱＱＹＤＹＡＰＩＴ（配列番号３４）、ＱＱＳＰＹＹＹＬＰＩＴ（配列番号３５）、ＱＱＹＹＹＳＰＶＴ（配列番号３６）、ＱＱＨＹＧＮＰＦＴ（配列番号３７）、ＱＱＳＹＹＳＰＰＴ（配列番号３８）、ＱＱＹＹＳＹＰＰＴ（配列番号３９）、ＱＱＹＹＹＹＰＰＴ（配列番号４０）；
ＣＤＲ－ＶＨ１：ＧＦＮＩＳＷＹＱ（配列番号４１）、ＧＦＮＶＳＷＳＹ（配列番号４２）、ＧＦＮＩＳＷＮＱ（配列番号４３）、ＧＦＮＶＧＹＹＧ（配列番号４４）、ＧＦＮＩＴＳＳＹ（配列番号４５）、ＧＦＮＩＮＳＳＹ（配列番号４６）、ＧＦＮＩＳＴＳＹ（配列番号４７）；
ＣＤＲ－ＶＨ２：ＶＴＰＹＳＧＹＴ（配列番号４８）、ＩＹＧＤＳＧＹＴ（配列番号４９）、ＶＳＰＹＳＧＹＴ（配列番号５０）、ＶＳＧＭＥＧＹＴ（配列番号５１）、ＩＳＰＡＤＧＹＮ（配列番号５２）、ＩＳＰＴＤＧＹＹ（配列番号５３）、ＩＤＰＮＤＧＹＳ（配列番号５４）；および
ＣＤＲ－ＶＨ３：ＳＲＳＹＴＤＧＦＤＹ（配列番号５５）、ＳＲＧＱＷＥＡＳＹＹＡＭＤＹ（配列番号５６）、ＳＲＳＤＹＹＡＭＤＹ（配列番号５７）、ＳＲＤＩＹＧＹＡＭＤＶ（配列番号５８）、ＳＲＴＤＳＴＡＹＴＡＭＤＶ（配列番号５９）、ＳＲＴＳＤＴＳＹＡＡＭＤＶ（配列番号６０）、ＳＲＴＮＮＴＡＡＤＡＭＤＶ（配列番号６１）。
ＣＤＲ－ＶＬ１：ＱＤＶＮＴＡ（配列番号３３）；
ＣＤＲ－ＶＬ２：ＳＡＳ；
ＣＤＲ－ＶＬ３：ＱＱＹＤＹＡＰＩＴ（配列番号３４）、ＱＱＳＰＹＹＹＬＰＩＴ（配列番号３５）、ＱＱＹＹＹＳＰＶＴ（配列番号３６）、ＱＱＨＹＧＮＰＦＴ（配列番号３７）、ＱＱＳＹＹＳＰＰＴ（配列番号３８）、ＱＱＹＹＳＹＰＰＴ（配列番号３９）、ＱＱＹＹＹＹＰＰＴ（配列番号４０）；
ＣＤＲ－ＶＨ１：ＧＦＮＩＳＷＹＱ（配列番号４１）、ＧＦＮＶＳＷＳＹ（配列番号４２）、ＧＦＮＩＳＷＮＱ（配列番号４３）、ＧＦＮＶＧＹＹＧ（配列番号４４）、ＧＦＮＩＴＳＳＹ（配列番号４５）、ＧＦＮＩＮＳＳＹ（配列番号４６）、ＧＦＮＩＳＴＳＹ（配列番号４７）；
ＣＤＲ－ＶＨ２：ＶＴＰＹＳＧＹＴ（配列番号４８）、ＩＹＧＤＳＧＹＴ（配列番号４９）、ＶＳＰＹＳＧＹＴ（配列番号５０）、ＶＳＧＭＥＧＹＴ（配列番号５１）、ＩＳＰＡＤＧＹＮ（配列番号５２）、ＩＳＰＴＤＧＹＹ（配列番号５３）、ＩＤＰＮＤＧＹＳ（配列番号５４）；および
ＣＤＲ－ＶＨ３：ＳＲＳＹＴＤＧＦＤＹ（配列番号５５）、ＳＲＧＱＷＥＡＳＹＹＡＭＤＹ（配列番号５６）、ＳＲＳＤＹＹＡＭＤＹ（配列番号５７）、ＳＲＤＩＹＧＹＡＭＤＶ（配列番号５８）、ＳＲＴＤＳＴＡＹＴＡＭＤＶ（配列番号５９）、ＳＲＴＳＤＴＳＹＡＡＭＤＶ（配列番号６０）、ＳＲＴＮＮＴＡＡＤＡＭＤＶ（配列番号６１）。
【0032】
例えば、修飾ＩＤＨ２ポリペプチドに由来する修飾ペプチド（例えば、ＳＰＮＧＴＩＱＮＩＬ（配列番号１）に結合することができる分子は、以下に示すＣＤＲのそれぞれの１つを含み得る：
ＣＤＲ－ＶＬ１：ＱＤＶＮＴＡ（配列番号３３）；
ＣＤＲ－ＶＬ２：ＳＡＳ；
ＣＤＲ－ＶＬ３：ＱＱＹＳＹＳＰＰＴ（配列番号６２）、ＱＱＧＫＡＹＷＰＡＴ（配列番号６３）、ＱＱＶＹＳＳＰＦＴ（配列番号６４）、ＱＱＹＳＬＹＳＰＭＴ（配列番号６５）、ＱＱＳＹＹＭＰＦＴ（配列番号６６）；
ＣＤＲ－ＶＨ１：ＧＦＮＩＳＤＴＹ（配列番号６７）、ＧＦＮＶＧＨＹＲ（配列番号６８）、ＧＦＮＶＫＹＹＭ（配列番号６９）、ＧＦＮＳＦＬＳ（配列番号７０）、ＧＦＮＩＦＲＧＹ（配列番号７１）；
ＣＤＲ－ＶＨ２：ＩＳＰＲＴＧＹＮ（配列番号７２）、ＶＳＰＮＧＹＹＴ（配列番号７３）、ＩＳＰＧＹＤＹＴ（配列番号７４）、ＩＦＰＳＳＤＹＴ（配列番号７５）、ＩＳＰＨＳＤＹＴ（配列番号７６）；および
ＣＤＲ－ＶＨ３：ＳＲＡＹＹＳＹＡＹＡＭＤＶ（配列番号７７）、ＳＲＧＹＳＳＹＡＦＤＹ（配列番号７８）、ＳＲＳＹＷＲＹＳＶＤＶ（配列番号７９）、ＳＲＧＫＨＳＳＤＳＮＹＹＭＤＹ（配列番号８０）、ＳＲＳＹＧＷＡＡＦＤＹ（配列番号８１）
ＣＤＲ－ＶＬ１：ＱＤＶＮＴＡ（配列番号３３）；
ＣＤＲ－ＶＬ２：ＳＡＳ；
ＣＤＲ－ＶＬ３：ＱＱＹＳＹＳＰＰＴ（配列番号６２）、ＱＱＧＫＡＹＷＰＡＴ（配列番号６３）、ＱＱＶＹＳＳＰＦＴ（配列番号６４）、ＱＱＹＳＬＹＳＰＭＴ（配列番号６５）、ＱＱＳＹＹＭＰＦＴ（配列番号６６）；
ＣＤＲ－ＶＨ１：ＧＦＮＩＳＤＴＹ（配列番号６７）、ＧＦＮＶＧＨＹＲ（配列番号６８）、ＧＦＮＶＫＹＹＭ（配列番号６９）、ＧＦＮＳＦＬＳ（配列番号７０）、ＧＦＮＩＦＲＧＹ（配列番号７１）；
ＣＤＲ－ＶＨ２：ＩＳＰＲＴＧＹＮ（配列番号７２）、ＶＳＰＮＧＹＹＴ（配列番号７３）、ＩＳＰＧＹＤＹＴ（配列番号７４）、ＩＦＰＳＳＤＹＴ（配列番号７５）、ＩＳＰＨＳＤＹＴ（配列番号７６）；および
ＣＤＲ－ＶＨ３：ＳＲＡＹＹＳＹＡＹＡＭＤＶ（配列番号７７）、ＳＲＧＹＳＳＹＡＦＤＹ（配列番号７８）、ＳＲＳＹＷＲＹＳＶＤＶ（配列番号７９）、ＳＲＧＫＨＳＳＤＳＮＹＹＭＤＹ（配列番号８０）、ＳＲＳＹＧＷＡＡＦＤＹ（配列番号８１）
【0033】
例えば、修飾ｐ５３ポリペプチドに由来する修飾ペプチド（例えば、ＧＭＮＱＲＰＩＬＴＩ（配列番号１５）およびＧＭＮＷＲＰＩＬＴＩ（配列番号１６））に結合することができる分子は、以下に示すＣＤＲのそれぞれの１つを含み得る：
ＣＤＲ－ＶＬ１：ＱＤＶＮＴＡ（配列番号３３）；
ＣＤＲ－ＶＬ２：ＳＡＳ；
ＣＤＲ－ＶＬ３：ＱＱＳＧＹＡＰＩＴ（配列番号８２）、ＱＱＹＳＹＡＰＩＴ（配列番号８３）、ＱＱＳＬＹＧＰＦＴ（配列番号８４）、ＱＱＹＳＹＳＰＩＴ（配列番号８５）、ＱＱＳＧＹＱＰＤＴ（配列番号８６）、ＱＱＹＬＹＱＰＷＴ（配列番号８７）；
ＣＤＲ－ＶＨ１：ＧＦＮＩＳＹＹＳ（配列番号８９）、ＧＦＮＩＧＹＹＴ（配列番号９０）、ＧＦＮＩＡＹＥＹ（配列番号９１）、ＧＦＮＬＦＧＹＧ（配列番号９２）、ＧＦＮＩＳＷＹＡ（配列番号９３）、ＧＦＮＩＤＹＹＧ（配列番号９４）；
ＣＤＲ－ＶＨ２：ＶＤＰＤＳＤＹＴ（配列番号９６）、ＶＳＰＷＳＹＳＴ（配列番号９７）、ＩＧＰＤＳＧＹＴ（配列番号９８）、ＩＧＰＹＹＹＹＴ（配列番号９９）、ＩＷＰＤＳＤＷＴ（配列番号１００）、ＬＹＧＧＳＤＳＴ（配列番号１０１）；および
ＣＤＲ－ＶＨ３：ＳＲＳＷＩＨＭＦＳＭＤＹ（配列番号１０３）、ＳＲＤＨＷＤＥＡＦＤＶ（配列番号１０４）、ＳＲＶＷＹＹＳＴＹＧＭＤＹ（配列番号１０５）、ＳＲＥＮＹＤＭＡＭＤＹ（配列番号１０６）、ＳＲＹＹＹＳＳＡＦＤＶ（配列番号１０７）、ＳＲＱＹＳＡＹＦＤＹ（配列番号１０８）。
ＣＤＲ－ＶＬ１：ＱＤＶＮＴＡ（配列番号３３）；
ＣＤＲ－ＶＬ２：ＳＡＳ；
ＣＤＲ－ＶＬ３：ＱＱＳＧＹＡＰＩＴ（配列番号８２）、ＱＱＹＳＹＡＰＩＴ（配列番号８３）、ＱＱＳＬＹＧＰＦＴ（配列番号８４）、ＱＱＹＳＹＳＰＩＴ（配列番号８５）、ＱＱＳＧＹＱＰＤＴ（配列番号８６）、ＱＱＹＬＹＱＰＷＴ（配列番号８７）；
ＣＤＲ－ＶＨ１：ＧＦＮＩＳＹＹＳ（配列番号８９）、ＧＦＮＩＧＹＹＴ（配列番号９０）、ＧＦＮＩＡＹＥＹ（配列番号９１）、ＧＦＮＬＦＧＹＧ（配列番号９２）、ＧＦＮＩＳＷＹＡ（配列番号９３）、ＧＦＮＩＤＹＹＧ（配列番号９４）；
ＣＤＲ－ＶＨ２：ＶＤＰＤＳＤＹＴ（配列番号９６）、ＶＳＰＷＳＹＳＴ（配列番号９７）、ＩＧＰＤＳＧＹＴ（配列番号９８）、ＩＧＰＹＹＹＹＴ（配列番号９９）、ＩＷＰＤＳＤＷＴ（配列番号１００）、ＬＹＧＧＳＤＳＴ（配列番号１０１）；および
ＣＤＲ－ＶＨ３：ＳＲＳＷＩＨＭＦＳＭＤＹ（配列番号１０３）、ＳＲＤＨＷＤＥＡＦＤＶ（配列番号１０４）、ＳＲＶＷＹＹＳＴＹＧＭＤＹ（配列番号１０５）、ＳＲＥＮＹＤＭＡＭＤＹ（配列番号１０６）、ＳＲＹＹＹＳＳＡＦＤＶ（配列番号１０７）、ＳＲＱＹＳＡＹＦＤＹ（配列番号１０８）。
【0034】
例えば、修飾ＫＲＡＳポリペプチドに由来する修飾ペプチド（例えば、ＬＶＶＶＧＡＶＧＶ（配列番号１８）、ＶＶＶＧＡＣＧＶＧＫ（配列番号２０）、ＶＶＶＧＡＤＧＶＧＫ（配列番号２１）、ＶＶＶＧＡＶＧＶＧＫ（配列番号２２）、およびＶＶＧＡＤＧＶＧＫ（配列番号２４））に結合することができる分子は、以下に示すＣＤＲのそれぞれの１つを含み得る：
ＣＤＲ－ＶＬ１：ＱＤＶＮＴＡ（配列番号３３）；
ＣＤＲ－ＶＬ２：ＳＡＳおよび ＳＡＹ；
ＣＤＲ－ＶＬ３：ＱＱＷＹＳＳＰＶＴ（配列番号１１０），ＱＱＹＹＳＲＰＶＴ（配列番号１１１）、ＱＱＳＹＧＳＧＳＰＷＴ（配列番号１２１）、ＱＱＴＹＹＳＰＷＴ（配列番号１２２）、ＱＱＹＹＹＰＰＩＴ（配列番号１２３）、ＱＱＳＹＹＹＦＲＰＩＴ（配列番号１３２）、ＱＱＡＳＹＹＹＰＬＴ（配列番号１３３）、ＱＱＫＳＥＹＳＰＷＴ（配列番号１３４）、ＱＱＳＧＹＩＰＦＴ（配列番号１３５）、ＱＱＧＡＹＹＲＰＦＴ（配列番号１３６）、ＱＱＹＭＹＳＰＶＴ（配列番号１５２）、ＱＱＳＳＳＳＰＩＴ（配列番号１５３）、ＱＱＳＳＡＳＰＬＴ（配列番号１５４）、ＱＱＹＡＹＳＰＬＴ（配列番号１５５）、ＱＱＹＳＹＹＰＩＴ（配列番号１６８）、ＱＱＹＳＹＴＰＶＴ（配列番号１６９）、ＱＱＹＳＹＥＰＶＴ（配列番号１７０）、ＱＱＹＡＹＹＳＰＶＴ（配列番号１７１）、ＱＱＹＥＹＹＰＭＴ（配列番号１７２）、ＱＱＹＳＦＹＰＦＴ（配列番号１８８）、ＱＱＹＳＹＳＰＩＴ（配列番号８５）、ＱＱＹＳＡＹＹＱＰＩＴ（配列番号１８９）、ＱＱＹＳＹＹＰＩＴ（配列番号１６８）、ＱＱＹＥＹＶＰＨＴ（配列番号１９０）、ＱＱＹＳＹＭＰＩＴ（配列番号１９１）、ＱＱＹＡＹＹＰＶＴ（配列番号１９２）、ＱＱＹＳＹＭＰＩＴ（配列番号１９１）、ＱＱＹＤＹＲＰＶＴ（配列番号１９３）、ＱＱＹＤＦＴＰＭＴ（配列番号１９４）、ＱＱＹＳＳＳＳＰＶＴ（配列番号１９５）、ＱＱＳＳＹＴＰＩＴ（配列番号２２９）、ＱＱＹＡＹＹＰＩＴ（配列番号２３０）、ＱＱＹＥＹＹＰＩＴ（配列番号２３１）、ＱＱＹＴＹＹＰＩＴ（配列番号２３２）、ＱＱＹＳＹＹＰＩＴ（配列番号１６８）、ＱＱＳＳＶＥＰＷＴ（配列番号２３３）；
ＣＤＲ－ＶＨ１：ＧＦＮＩＮＷＡＮ（配列番号１１２）、ＧＦＮＩＹＬＨＤ（配列番号１１３）、ＧＦＮＩＹＷＳＨ（配列番号１１４）、ＧＦＮＩＶＧＧＧ（配列番号１２４）、ＧＦＮＩＲＳＹＡ（配列番号１２５）、ＧＦＮＶＳＨＴＧ（配列番号１２６）、ＧＦＮＬＳＹＳＤ（配列番号１３７）、ＧＦＮＩＳＡＳＧ（配列番号１３８）、ＧＦＮＩＹＲＹＧ（配列番号１３９）、ＧＦＮＩＹＧＴＭ（配列番号１４０）、ＧＦＮＩＳＹＳＹ（配列番号１４１）、ＧＦＮＶＳＡＹＷ（配列番号１５６）、ＧＦＮＩＳＧＹＧ（配列番号１５７）、ＧＦＮＶＳＳＶＧ（配列番号１５８）、ＧＦＮＶＳＳＹＧ（配列番号１５９）、ＧＦＮＦＳＹＧＹ（配列番号１７３）、ＧＦＮＶＷＧＰＧ（配列番号１７４）、ＧＦＮＶＳＧＳＱ（配列番号１７５）、ＧＦＮＩＹＧＱＭ（配列番号１７６）、ＧＦＮＶＭＹＳＴ（配列番号１７７）、ＧＦＮＦＧＳＹ（配列番号１９６）、ＧＦＮＩＳＤＳＹ（配列番号１９７）、ＧＦＮＩＦＳＤＱ（配列番号１９８）、ＧＦＮＬＳＹＳＹ（配列番号１９９）、ＧＦＮＩＳＹＧＹ（配列番号２００）、ＧＦＮＩＳＹＱＨ（配列番号２０１）、ＧＦＮＬＳＧＹＹ（配列番号２０２）、ＧＦＮＶＳＧＱＹ（配列番号２０３）、ＧＦＮＶＳＴＳＧ（配列番号２０４）、ＧＦＮＩＳＹＡＫ（配列番号２０５）、ＧＦＮＦＳＳＹＶ（配列番号２０６）、ＧＦＮＩＳＱＧＧ（配列番号２３４）、ＧＦＮＩＳＳＴＧ（配列番号２３５）、ＧＦＮＦＦＳＴＶ（配列番号２３６）、ＧＦＮＬＨＧＹＬ（配列番号２３７）、ＧＦＮＬＳＴＨＶ（配列番号２３８）、ＧＦＮＶＳＹＹＳ（配列番号２３９）；
ＣＤＲ－ＶＨ２：ＩＳＰＰＹＤＹＴ（配列番号１１５）、ＩＩＰＡＩＤＹＴ（配列番号１１６）、ＩＳＳＦＥＧＹＴ（配列番号１１７）、ＩＹＰＱＧＤＹＴ（配列番号１２７）、ＶＧＰＧＫＧＹＴ（配列番号１２８）、ＶＧＰＧＫＧＹＴ（配列番号１２８）、ＶＭＰＤＳＧＨＴ（配列番号１４２）、ＩＨＰＬＫＰＹＴ（配列番号１４３）、ＬＹＰＹＧＹＳＴ（配列番号１４４）、ＦＫＰＤＳＹＮＴ（配列番号１４５）、ＬＬＰＹＤＧＮＴ（配列番号１４６）、ＩＹＧＧＳＧＹＴ（配列番号１６０）、ＬＹＧＧＳＤＹＴ（配列番号１６１）、ＩＹＧＴＳＤＹＴ（配列番号１６２）、ＩＡＰＲＲＤＹＴ（配列番号１６３）、ＩＳＧＹＴＧＮＴ（配列番号１７８）、ＩＨＰＦＳＧＮＴ（配列番号１７９）、ＩＰＧＷＳＧＹＴ（配列番号１８０）、ＬＳＰＦＳＧＮＴ（配列番号１８１）、ＩＹＳＷＳＤＹＴ（配列番号１８２）、ＩＳＧＹＳＧＮＴ（配列番号２０７）、ＦＳＰＹＳＳＮＴ（配列番号２０８）、ＦＭＰＹＤＳＹＹＴ（配列番号２０９）、ＩＳＧＦＳＧＮＴ（配列番号２１０）、ＦＨＹＧＳＧＮＴ（配列番号２１１）、ＦＭＰＹＱＧＳＴ（配列番号２１２）、ＦＳＰＹＳＧＹＴ（配列番号２１３）、ＩＳＰＶＳＧＮＴ（配列番号２１４）、ＩＹＧＡＹＳＧＴ（配列番号２１５）、ＬＴＹＷＧＧＹＴ（配列番号２１６）、ＶＹＰＤＳＧＧＴ（配列番号２１７）、ＶＹＰＧＧＧＱＴ（配列番号２４０）、ＬＬＧＧＳＧＮＴ（配列番号２４１）、ＩＹＰＷＳＧＳＴ（配列番号２４２）、ＩＹＰＰＮＧＹＴ（配列番号２４３）、ＦＹＰＹＶＧＹＴ（配列番号２４４）、ＩＹＰＷＮＤＹＴ（配列番号２４５）；
およびＣＤＲ－ＶＨ３：ＳＲＳＹＳＹＹＦＤＹ（配列番号１１８）、ＳＲＲＤＧＹＹＦＤＹ（配列番号１１９）、ＳＲＳＹＳＹＹＭＤＹ（配列番号１２０）、ＳＲＤＳＳＹＬＡＦＤＹ（配列番号１２９）、ＳＲＮＦＱＳＴＳＨＡＦＤＹ（配列番号１３０）、ＳＲＫＴＹＹＡＦＤＹ（配列番号１３１）、ＳＲＡＴＮＩＰＶＹＡＦＤＹ（配列番号１４７）、ＳＲＹＳＳＭＹＹＹＹＦＤＹ（配列番号１４８）、ＳＲＳＹＡＹＧＹＦＡＹ（配列番号１４９）、ＳＲＧＥＶＹＨＹＹＡＦＤＹ（配列番号１５０）、ＳＲＡＡＹＳＳＭＤＶ（配列番号１５１）、ＳＲＴＨＳＹＷＳＡＦＤＹ（配列番号１６４）、ＳＲＴＶＲＹＡＦＤＹ（配列番号１６５）、ＳＲＳＳＲＹＳＭＤＹ（配列番号１６６）、ＳＲＫＳＳＹＹＦＤＹ（配列番号１６７）、ＳＲＡＡＳＬＳＳＳＹＹＳＡＦＤＶ（配列番号１８３）、ＳＲＧＹＳＹＳＡＭＤＹ（配列番号１８４）、ＳＲＧＹＳＹＦＡＭＤＹ（配列番号１８５）、ＳＲＮＩＳＹＥＱＳＳＡＦＤＹ（配列番号１８６）、ＳＲＧＹＡＨＮＳＦＤＹ（配列番号１８７）、ＳＲＳＮＱＳＡＹＳＹＭＤＹ（配列番号２１８）、ＳＲＳＱＦＴＦＹＱＹＦＤＹ（配列番号２１９）、ＳＲＭＳＶＲＮＡＦＤＹ（配列番号２２０）、ＳＲＳＤＳＹＹＴＡＭＤＹ（配列番号２２１）、ＳＲＳＮＹＹＹＬＤＹ（配列番号２２２）、ＳＲＡＮＩＹＳＳＨＳＦＦＤＹ（配列番号２２３）、ＳＲＴＨＳＳＩＹＨＳＦＤＹ（配列番号２２４）、ＳＲＰＭＫＴＳＹＹＧＡＦＤＹ（配列番号２２５）、ＳＲＳＱＳＹＴＹＷＳＡＭＤＹ（配列番号２２６）、ＳＲＧＥＹＧＴＹＭＤＹ（配列番号２２７）、ＳＲＴＳＳＹＹＡＦＤＹ（配列番号２２８）、ＳＲＧＹＤＹＳＡＦＤＹ（配列番号２４６）、ＳＲＧＬＱＹＳＡＭＤＹ（配列番号２４７）、ＳＲＳＲＳＳＮＹＹＦＤＶ（配列番号２４８）、ＳＲＧＶＤＹＡＹＬＤＹ（配列番号２４９）、ＳＲＧＹＲＹＱＹＭＤＶ（配列番号２５０）、ＳＲＧＳＹＹＳＦＤＹ（配列番号２５１）。
ＣＤＲ－ＶＬ１：ＱＤＶＮＴＡ（配列番号３３）；
ＣＤＲ－ＶＬ２：ＳＡＳおよび ＳＡＹ；
ＣＤＲ－ＶＬ３：ＱＱＷＹＳＳＰＶＴ（配列番号１１０），ＱＱＹＹＳＲＰＶＴ（配列番号１１１）、ＱＱＳＹＧＳＧＳＰＷＴ（配列番号１２１）、ＱＱＴＹＹＳＰＷＴ（配列番号１２２）、ＱＱＹＹＹＰＰＩＴ（配列番号１２３）、ＱＱＳＹＹＹＦＲＰＩＴ（配列番号１３２）、ＱＱＡＳＹＹＹＰＬＴ（配列番号１３３）、ＱＱＫＳＥＹＳＰＷＴ（配列番号１３４）、ＱＱＳＧＹＩＰＦＴ（配列番号１３５）、ＱＱＧＡＹＹＲＰＦＴ（配列番号１３６）、ＱＱＹＭＹＳＰＶＴ（配列番号１５２）、ＱＱＳＳＳＳＰＩＴ（配列番号１５３）、ＱＱＳＳＡＳＰＬＴ（配列番号１５４）、ＱＱＹＡＹＳＰＬＴ（配列番号１５５）、ＱＱＹＳＹＹＰＩＴ（配列番号１６８）、ＱＱＹＳＹＴＰＶＴ（配列番号１６９）、ＱＱＹＳＹＥＰＶＴ（配列番号１７０）、ＱＱＹＡＹＹＳＰＶＴ（配列番号１７１）、ＱＱＹＥＹＹＰＭＴ（配列番号１７２）、ＱＱＹＳＦＹＰＦＴ（配列番号１８８）、ＱＱＹＳＹＳＰＩＴ（配列番号８５）、ＱＱＹＳＡＹＹＱＰＩＴ（配列番号１８９）、ＱＱＹＳＹＹＰＩＴ（配列番号１６８）、ＱＱＹＥＹＶＰＨＴ（配列番号１９０）、ＱＱＹＳＹＭＰＩＴ（配列番号１９１）、ＱＱＹＡＹＹＰＶＴ（配列番号１９２）、ＱＱＹＳＹＭＰＩＴ（配列番号１９１）、ＱＱＹＤＹＲＰＶＴ（配列番号１９３）、ＱＱＹＤＦＴＰＭＴ（配列番号１９４）、ＱＱＹＳＳＳＳＰＶＴ（配列番号１９５）、ＱＱＳＳＹＴＰＩＴ（配列番号２２９）、ＱＱＹＡＹＹＰＩＴ（配列番号２３０）、ＱＱＹＥＹＹＰＩＴ（配列番号２３１）、ＱＱＹＴＹＹＰＩＴ（配列番号２３２）、ＱＱＹＳＹＹＰＩＴ（配列番号１６８）、ＱＱＳＳＶＥＰＷＴ（配列番号２３３）；
ＣＤＲ－ＶＨ１：ＧＦＮＩＮＷＡＮ（配列番号１１２）、ＧＦＮＩＹＬＨＤ（配列番号１１３）、ＧＦＮＩＹＷＳＨ（配列番号１１４）、ＧＦＮＩＶＧＧＧ（配列番号１２４）、ＧＦＮＩＲＳＹＡ（配列番号１２５）、ＧＦＮＶＳＨＴＧ（配列番号１２６）、ＧＦＮＬＳＹＳＤ（配列番号１３７）、ＧＦＮＩＳＡＳＧ（配列番号１３８）、ＧＦＮＩＹＲＹＧ（配列番号１３９）、ＧＦＮＩＹＧＴＭ（配列番号１４０）、ＧＦＮＩＳＹＳＹ（配列番号１４１）、ＧＦＮＶＳＡＹＷ（配列番号１５６）、ＧＦＮＩＳＧＹＧ（配列番号１５７）、ＧＦＮＶＳＳＶＧ（配列番号１５８）、ＧＦＮＶＳＳＹＧ（配列番号１５９）、ＧＦＮＦＳＹＧＹ（配列番号１７３）、ＧＦＮＶＷＧＰＧ（配列番号１７４）、ＧＦＮＶＳＧＳＱ（配列番号１７５）、ＧＦＮＩＹＧＱＭ（配列番号１７６）、ＧＦＮＶＭＹＳＴ（配列番号１７７）、ＧＦＮＦＧＳＹ（配列番号１９６）、ＧＦＮＩＳＤＳＹ（配列番号１９７）、ＧＦＮＩＦＳＤＱ（配列番号１９８）、ＧＦＮＬＳＹＳＹ（配列番号１９９）、ＧＦＮＩＳＹＧＹ（配列番号２００）、ＧＦＮＩＳＹＱＨ（配列番号２０１）、ＧＦＮＬＳＧＹＹ（配列番号２０２）、ＧＦＮＶＳＧＱＹ（配列番号２０３）、ＧＦＮＶＳＴＳＧ（配列番号２０４）、ＧＦＮＩＳＹＡＫ（配列番号２０５）、ＧＦＮＦＳＳＹＶ（配列番号２０６）、ＧＦＮＩＳＱＧＧ（配列番号２３４）、ＧＦＮＩＳＳＴＧ（配列番号２３５）、ＧＦＮＦＦＳＴＶ（配列番号２３６）、ＧＦＮＬＨＧＹＬ（配列番号２３７）、ＧＦＮＬＳＴＨＶ（配列番号２３８）、ＧＦＮＶＳＹＹＳ（配列番号２３９）；
ＣＤＲ－ＶＨ２：ＩＳＰＰＹＤＹＴ（配列番号１１５）、ＩＩＰＡＩＤＹＴ（配列番号１１６）、ＩＳＳＦＥＧＹＴ（配列番号１１７）、ＩＹＰＱＧＤＹＴ（配列番号１２７）、ＶＧＰＧＫＧＹＴ（配列番号１２８）、ＶＧＰＧＫＧＹＴ（配列番号１２８）、ＶＭＰＤＳＧＨＴ（配列番号１４２）、ＩＨＰＬＫＰＹＴ（配列番号１４３）、ＬＹＰＹＧＹＳＴ（配列番号１４４）、ＦＫＰＤＳＹＮＴ（配列番号１４５）、ＬＬＰＹＤＧＮＴ（配列番号１４６）、ＩＹＧＧＳＧＹＴ（配列番号１６０）、ＬＹＧＧＳＤＹＴ（配列番号１６１）、ＩＹＧＴＳＤＹＴ（配列番号１６２）、ＩＡＰＲＲＤＹＴ（配列番号１６３）、ＩＳＧＹＴＧＮＴ（配列番号１７８）、ＩＨＰＦＳＧＮＴ（配列番号１７９）、ＩＰＧＷＳＧＹＴ（配列番号１８０）、ＬＳＰＦＳＧＮＴ（配列番号１８１）、ＩＹＳＷＳＤＹＴ（配列番号１８２）、ＩＳＧＹＳＧＮＴ（配列番号２０７）、ＦＳＰＹＳＳＮＴ（配列番号２０８）、ＦＭＰＹＤＳＹＹＴ（配列番号２０９）、ＩＳＧＦＳＧＮＴ（配列番号２１０）、ＦＨＹＧＳＧＮＴ（配列番号２１１）、ＦＭＰＹＱＧＳＴ（配列番号２１２）、ＦＳＰＹＳＧＹＴ（配列番号２１３）、ＩＳＰＶＳＧＮＴ（配列番号２１４）、ＩＹＧＡＹＳＧＴ（配列番号２１５）、ＬＴＹＷＧＧＹＴ（配列番号２１６）、ＶＹＰＤＳＧＧＴ（配列番号２１７）、ＶＹＰＧＧＧＱＴ（配列番号２４０）、ＬＬＧＧＳＧＮＴ（配列番号２４１）、ＩＹＰＷＳＧＳＴ（配列番号２４２）、ＩＹＰＰＮＧＹＴ（配列番号２４３）、ＦＹＰＹＶＧＹＴ（配列番号２４４）、ＩＹＰＷＮＤＹＴ（配列番号２４５）；
およびＣＤＲ－ＶＨ３：ＳＲＳＹＳＹＹＦＤＹ（配列番号１１８）、ＳＲＲＤＧＹＹＦＤＹ（配列番号１１９）、ＳＲＳＹＳＹＹＭＤＹ（配列番号１２０）、ＳＲＤＳＳＹＬＡＦＤＹ（配列番号１２９）、ＳＲＮＦＱＳＴＳＨＡＦＤＹ（配列番号１３０）、ＳＲＫＴＹＹＡＦＤＹ（配列番号１３１）、ＳＲＡＴＮＩＰＶＹＡＦＤＹ（配列番号１４７）、ＳＲＹＳＳＭＹＹＹＹＦＤＹ（配列番号１４８）、ＳＲＳＹＡＹＧＹＦＡＹ（配列番号１４９）、ＳＲＧＥＶＹＨＹＹＡＦＤＹ（配列番号１５０）、ＳＲＡＡＹＳＳＭＤＶ（配列番号１５１）、ＳＲＴＨＳＹＷＳＡＦＤＹ（配列番号１６４）、ＳＲＴＶＲＹＡＦＤＹ（配列番号１６５）、ＳＲＳＳＲＹＳＭＤＹ（配列番号１６６）、ＳＲＫＳＳＹＹＦＤＹ（配列番号１６７）、ＳＲＡＡＳＬＳＳＳＹＹＳＡＦＤＶ（配列番号１８３）、ＳＲＧＹＳＹＳＡＭＤＹ（配列番号１８４）、ＳＲＧＹＳＹＦＡＭＤＹ（配列番号１８５）、ＳＲＮＩＳＹＥＱＳＳＡＦＤＹ（配列番号１８６）、ＳＲＧＹＡＨＮＳＦＤＹ（配列番号１８７）、ＳＲＳＮＱＳＡＹＳＹＭＤＹ（配列番号２１８）、ＳＲＳＱＦＴＦＹＱＹＦＤＹ（配列番号２１９）、ＳＲＭＳＶＲＮＡＦＤＹ（配列番号２２０）、ＳＲＳＤＳＹＹＴＡＭＤＹ（配列番号２２１）、ＳＲＳＮＹＹＹＬＤＹ（配列番号２２２）、ＳＲＡＮＩＹＳＳＨＳＦＦＤＹ（配列番号２２３）、ＳＲＴＨＳＳＩＹＨＳＦＤＹ（配列番号２２４）、ＳＲＰＭＫＴＳＹＹＧＡＦＤＹ（配列番号２２５）、ＳＲＳＱＳＹＴＹＷＳＡＭＤＹ（配列番号２２６）、ＳＲＧＥＹＧＴＹＭＤＹ（配列番号２２７）、ＳＲＴＳＳＹＹＡＦＤＹ（配列番号２２８）、ＳＲＧＹＤＹＳＡＦＤＹ（配列番号２４６）、ＳＲＧＬＱＹＳＡＭＤＹ（配列番号２４７）、ＳＲＳＲＳＳＮＹＹＦＤＶ（配列番号２４８）、ＳＲＧＶＤＹＡＹＬＤＹ（配列番号２４９）、ＳＲＧＹＲＹＱＹＭＤＶ（配列番号２５０）、ＳＲＧＳＹＹＳＦＤＹ（配列番号２５１）。
【0035】
例えば、修飾ＣＴＮＮＢポリペプチドに由来する修飾ペプチド（例えば、ＴＴＡＰＦＬＳＧＫ（配列番号２６））に結合することができる分子は、以下に示すＣＤＲのそれぞれの１つを含み得る：
ＣＤＲ－ＶＬ１：ＱＤＶＮＴＡ（配列番号３３）；
ＣＤＲ－ＶＬ２：ＳＡＳおよび ＳＡＹ；
ＣＤＲ－ＶＬ３：ＱＱＳＹＹＳＰＰＴ（配列番号３８）、ＱＱＩＹＴＳＰＩＴ（配列番号２５２）、ＱＱＲＡＹＦＰＩＴ（配列番号２５３）、ＱＱＱＹＡＹＴＰＩＴ（配列番号２５４）、ＱＱＩＨＹＫＰＬＴ（配列番号２５５）；
ＣＤＲ－ＶＨ１：ＧＦＮＩＮＮＴＹ（配列番号２５６）、ＧＦＮＦＩＴＴＧ（配列番号２５７）、ＧＦＮＦＳＤＹＧ（配列番号２５８）、ＧＦＮＶＷＳＹＧ（配列番号２５９）、ＧＦＮＶＡＷＹＳ（配列番号２６０）；
ＣＤＲ－ＶＨ２：ＩＹＰＴＤＧＹＴ（配列番号２６０）、ＩＧＰＧＳＤＹＴ（配列番号２６１）、ＬＩＰＡＳＧＹＴ（配列番号２６２）、ＶＴＰＤＧＳＹＴ（配列番号２６３）、ＶＹＧＧＳＳＹＴ（配列番号２６４）；および
ＣＤＲ－ＶＨ３：ＳＲＴＹＹＳＹＹＳＡＭＤＶ（配列番号２６５）、ＳＲＹＹＹＡＳＡＬＤＹ（配列番号２６６）、ＳＲＧＷＳＹＹＭＤＹ（配列番号２６７）、ＳＲＳＹＧＷＡＭＤＹ（配列番号２６８）、ＳＲＤＦＹＳＳＧＭＤＹ（配列番号２６９）。
ＣＤＲ－ＶＬ１：ＱＤＶＮＴＡ（配列番号３３）；
ＣＤＲ－ＶＬ２：ＳＡＳおよび ＳＡＹ；
ＣＤＲ－ＶＬ３：ＱＱＳＹＹＳＰＰＴ（配列番号３８）、ＱＱＩＹＴＳＰＩＴ（配列番号２５２）、ＱＱＲＡＹＦＰＩＴ（配列番号２５３）、ＱＱＱＹＡＹＴＰＩＴ（配列番号２５４）、ＱＱＩＨＹＫＰＬＴ（配列番号２５５）；
ＣＤＲ－ＶＨ１：ＧＦＮＩＮＮＴＹ（配列番号２５６）、ＧＦＮＦＩＴＴＧ（配列番号２５７）、ＧＦＮＦＳＤＹＧ（配列番号２５８）、ＧＦＮＶＷＳＹＧ（配列番号２５９）、ＧＦＮＶＡＷＹＳ（配列番号２６０）；
ＣＤＲ－ＶＨ２：ＩＹＰＴＤＧＹＴ（配列番号２６０）、ＩＧＰＧＳＤＹＴ（配列番号２６１）、ＬＩＰＡＳＧＹＴ（配列番号２６２）、ＶＴＰＤＧＳＹＴ（配列番号２６３）、ＶＹＧＧＳＳＹＴ（配列番号２６４）；および
ＣＤＲ－ＶＨ３：ＳＲＴＹＹＳＹＹＳＡＭＤＶ（配列番号２６５）、ＳＲＹＹＹＡＳＡＬＤＹ（配列番号２６６）、ＳＲＧＷＳＹＹＭＤＹ（配列番号２６７）、ＳＲＳＹＧＷＡＭＤＹ（配列番号２６８）、ＳＲＤＦＹＳＳＧＭＤＹ（配列番号２６９）。
【0036】
例えば、修飾ＫＲＡＳポリペプチドに由来する修飾ペプチド（例えば、ＡＶＧＶＧＫＳＡＬ（配列番号１１））に結合することができる分子は、以下に示すＣＤＲのそれぞれの１つを含み得る：
ＣＤＲ－ＶＬ１：ＱＤＶＮＴＡ（配列番号３３）；
ＣＤＲ－ＶＬ２：ＳＡＳ；
ＣＤＲ－ＶＬ３：ＱＱＥＷＲＬＰＩＴ（配列番号２７０）、ＱＱＧＴＳＴＰＦＴ（配列番号２７１）、ＱＱＳＷＲＹＰＭＴ（配列番号２７２）、ＱＱＳＹＳＹＰＶＴ（配列番号２７３）、ＱＱＧＷＬＹＳＰＦＴ（配列番号２７４）；
ＣＤＲ－ＶＨ１：ＧＦＮＶＹＧＮＱ，（配列番号２７５）、ＧＦＮＬＳＹＹＧ（配列番号４０２）、ＧＦＮＩＳＲＹＧ（配列番号２７６）、ＧＦＮＩＹＳＳＷ（配列番号２７７）、ＧＦＮＩＳＧＹＧ（配列番号１５７）；
ＣＤＲ－ＶＨ２：ＩＹＰＹＳＧＳＴ（配列番号２７８）、ＩＹＰＤＳＧＹＴ（配列番号２７９）、ＦＹＰＳＳＳＹＴ（配列番号２８０）、ＦＱＰＹＳＧＹＴ（配列番号２８１）、ＶＹＧＧＳＧＹＴ（配列番号２８２）；および
ＣＤＲ－ＶＨ３：ＳＲＳＡＹＶＡＹＳＹＦＤＹ（配列番号２８３）、ＳＲＡＹＬＹＹＹＬＡＹ（配列番号２８４）、ＳＲＫＹＹＥＡＭＤＹ（配列番号２８５）、ＳＲＥＹＴＹＹＦＤＹ（配列番号２８６）、ＳＲＡＨＳＳＹＹＶＤＹ（配列番号２８７）。
ＣＤＲ－ＶＬ１：ＱＤＶＮＴＡ（配列番号３３）；
ＣＤＲ－ＶＬ２：ＳＡＳ；
ＣＤＲ－ＶＬ３：ＱＱＥＷＲＬＰＩＴ（配列番号２７０）、ＱＱＧＴＳＴＰＦＴ（配列番号２７１）、ＱＱＳＷＲＹＰＭＴ（配列番号２７２）、ＱＱＳＹＳＹＰＶＴ（配列番号２７３）、ＱＱＧＷＬＹＳＰＦＴ（配列番号２７４）；
ＣＤＲ－ＶＨ１：ＧＦＮＶＹＧＮＱ，（配列番号２７５）、ＧＦＮＬＳＹＹＧ（配列番号４０２）、ＧＦＮＩＳＲＹＧ（配列番号２７６）、ＧＦＮＩＹＳＳＷ（配列番号２７７）、ＧＦＮＩＳＧＹＧ（配列番号１５７）；
ＣＤＲ－ＶＨ２：ＩＹＰＹＳＧＳＴ（配列番号２７８）、ＩＹＰＤＳＧＹＴ（配列番号２７９）、ＦＹＰＳＳＳＹＴ（配列番号２８０）、ＦＱＰＹＳＧＹＴ（配列番号２８１）、ＶＹＧＧＳＧＹＴ（配列番号２８２）；および
ＣＤＲ－ＶＨ３：ＳＲＳＡＹＶＡＹＳＹＦＤＹ（配列番号２８３）、ＳＲＡＹＬＹＹＹＬＡＹ（配列番号２８４）、ＳＲＫＹＹＥＡＭＤＹ（配列番号２８５）、ＳＲＥＹＴＹＹＦＤＹ（配列番号２８６）、ＳＲＡＨＳＳＹＹＶＤＹ（配列番号２８７）。
【0037】
例えば、修飾Ｈ／Ｋ／Ｎ ＲＡＳポリペプチドに由来する修飾ペプチド（例えば、ＩＬＤＴＡＧＨＥＥＹ（配列番号２８）、ＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ（配列番号３０）、ＩＬＤＴＡＧＬＥＥＹ（配列番号３１）、ＩＬＤＴＡＧＲＥＥＹ（配列番号３２））に結合することができる分子は、以下に示すＣＤＲのそれぞれの１つを含み得る：
ＣＤＲ－ＶＬ１：ＱＤＶＮＴＡ（配列番号３３）；
ＣＤＲ－ＶＬ２：ＳＡＳ；
ＣＤＲ－ＶＬ３：ＱＱＨＹＹＳＰＶＴ（配列番号２９２）、ＱＱＹＡＹＡＰＦＴ（配列番号２９６）、ＱＱＡＨＭＩＰＩＴ（配列番号３００）、ＱＱＳＶＹＤＰＩＴ（配列番号３０１）、ＱＱＳＹＴＳＰＬＴ（配列番号３０２）、ＱＱＧＱＹＳＰＦＴ（配列番号３０３）、ＱＱＹＷＹＬＰＴＴ（配列番号３２０）；
ＣＤＲ－ＶＨ１：ＧＦＮＩＧＹＹＧ（配列番号２８９）、ＧＦＮＩＦＹＱＤ（配列番号２９３）、ＧＦＮＶＳＹＳＭ（配列番号２９７）、ＧＦＮＦＳＦＰＧ（配列番号３０５）、ＧＦＮＩＳＧＳＷ（配列番号３０６）、ＧＦＮＩＹＹＧＶ，（配列番号３０７）、ＧＦＮＶＳＹＥＹ（配列番号３０８）、ＧＦＮＩＳＷＹＤ（配列番号３２１）；
ＣＤＲ－ＶＨ２：ＶＹＰＧＧＧＹＴ（配列番号２９０）、ＩＹＰＤＹＤＹＴ（配列番号２９４）、ＶＷＧＤＧＧＶＴ（配列番号２９８）、ＦＶＧＹＤＧＹＴ（配列番号３１０）、ＬＹＰＤＳＤＹＴ（配列番号３１１）、ＩＹＰＤＳＳＷＴ（配列番号３１２）、ＩＹＧＧＳＤＮＴ（配列番号３１３）、ＩＥＰＳＶＧＹＴ（配列番号３２２）；および
ＣＤＲ－ＶＨ３：ＳＲＹＹＹＹＧＦＤＹ（配列番号２９１）、ＳＲＴＹＳＶＹＭＤＹ（配列番号２９５）、ＳＲＧＳＹＹＡＦＤＹ（配列番号２９９）、ＳＲＤＹＹＳＦＳＭＤＹ（配列番号３１６）、ＳＲＡＨＴＹＡＦＤＹ（配列番号３１７）、ＳＲＤＱＤＦＨＹＭＮＹＹＬＳＹＡＬＤＹ（配列番号３１８）、ＳＲＰＬＧＳＹＦＤＹ（配列番号３１９）、ＳＲＳＹＰＹＹＹＦＤＹ（配列番号３２３）。
ＣＤＲ－ＶＬ１：ＱＤＶＮＴＡ（配列番号３３）；
ＣＤＲ－ＶＬ２：ＳＡＳ；
ＣＤＲ－ＶＬ３：ＱＱＨＹＹＳＰＶＴ（配列番号２９２）、ＱＱＹＡＹＡＰＦＴ（配列番号２９６）、ＱＱＡＨＭＩＰＩＴ（配列番号３００）、ＱＱＳＶＹＤＰＩＴ（配列番号３０１）、ＱＱＳＹＴＳＰＬＴ（配列番号３０２）、ＱＱＧＱＹＳＰＦＴ（配列番号３０３）、ＱＱＹＷＹＬＰＴＴ（配列番号３２０）；
ＣＤＲ－ＶＨ１：ＧＦＮＩＧＹＹＧ（配列番号２８９）、ＧＦＮＩＦＹＱＤ（配列番号２９３）、ＧＦＮＶＳＹＳＭ（配列番号２９７）、ＧＦＮＦＳＦＰＧ（配列番号３０５）、ＧＦＮＩＳＧＳＷ（配列番号３０６）、ＧＦＮＩＹＹＧＶ，（配列番号３０７）、ＧＦＮＶＳＹＥＹ（配列番号３０８）、ＧＦＮＩＳＷＹＤ（配列番号３２１）；
ＣＤＲ－ＶＨ２：ＶＹＰＧＧＧＹＴ（配列番号２９０）、ＩＹＰＤＹＤＹＴ（配列番号２９４）、ＶＷＧＤＧＧＶＴ（配列番号２９８）、ＦＶＧＹＤＧＹＴ（配列番号３１０）、ＬＹＰＤＳＤＹＴ（配列番号３１１）、ＩＹＰＤＳＳＷＴ（配列番号３１２）、ＩＹＧＧＳＤＮＴ（配列番号３１３）、ＩＥＰＳＶＧＹＴ（配列番号３２２）；および
ＣＤＲ－ＶＨ３：ＳＲＹＹＹＹＧＦＤＹ（配列番号２９１）、ＳＲＴＹＳＶＹＭＤＹ（配列番号２９５）、ＳＲＧＳＹＹＡＦＤＹ（配列番号２９９）、ＳＲＤＹＹＳＦＳＭＤＹ（配列番号３１６）、ＳＲＡＨＴＹＡＦＤＹ（配列番号３１７）、ＳＲＤＱＤＦＨＹＭＮＹＹＬＳＹＡＬＤＹ（配列番号３１８）、ＳＲＰＬＧＳＹＦＤＹ（配列番号３１９）、ＳＲＳＹＰＹＹＹＦＤＹ（配列番号３２３）。
【0038】
特定の修飾ペプチドに結合することができるＣＤＲの例（例えば、ＣＤＲ－ＶＬ１、ＣＤＲ－ＶＬ２、ＣＤＲ－ＶＬ３、ＣＤＲ－ＶＨ１、ＣＤＲ－ＶＨ２、およびＣＤＲ－ＶＨ３の特定の組み合わせ）を、表２に示す。場合によっては、本明細書に記載の修飾ペプチド（例えば、配列番号１、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、および配列番号３２のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む修飾ペプチド）に結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む分子は、ＣＤＲ配列の任意の適切なセット（例えば、本明細書に記載のＣＤＲ配列セットのいずれか）を含み得る。
【0039】
本明細書に記載の修飾ペプチド（例えば、配列番号１、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、および配列番号３２のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む修飾ペプチド）に結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む分子は、任意の適切な配列を含み得る。例えば、修飾ＥＧＦＲポリペプチドに由来する修飾ペプチド（例えば、ＩＭＱＬＭＰＦＧＣ（配列番号１３））に結合することができる分子は、配列番号３２４、配列番号３２５、配列番号３２６、配列番号３２７、配列番号３２８、配列番号３２９、および配列番号３３０のいずれか１つで示されるｓｃＦｖ配列を含み得るが、これらに限定されない。例えば、修飾ＩＤＨ２ポリペプチドに由来する修飾ペプチド（例えば、ＳＰＮＧＴＩＱＮＩＬ（配列番号１））に結合することができる分子は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号８のいずれか１つで示されるｓｃＦｖ配列を含み得るが、これらに限定されない。例えば、修飾ｐ５３ポリペプチドに由来する修飾ペプチド（例えば、ＧＭＮＱＲＰＩＬＴＩ（配列番号１５）およびＧＭＮＷＲＰＩＬＴＩ １（配列番号１６））に結合することができる分子は、配列番号３３１、配列番号３３２、配列番号３３３、配列番号３３４、配列番号３３５、配列番号３３６、および配列番号３３７のいずれか１つで示されるｓｃＦｖ配列を含み得るが、これらに限定されない。例えば、修飾ＫＲＡＳポリペプチドに由来する修飾ペプチド（例えばＬＶＶＶＧＡＶＧＶ（配列番号１８）、ＶＶＶＧＡＣＧＶＧＫ（配列番号２０）、ＶＶＶＧＡＤＧＶＧＫ（配列番号２１）、ＶＶＶＧＡＶＧＶＧＫ（配列番号２２）、およびＶＶＧＡＤＧＶＧＫ（配列番号２４））に結合することができる分子は、配列番号３３８、配列番号３３９、配列番号３４０、配列番号３４１、配列番号３４２、配列番号３４３、配列番号３４４、配列番号３４５、配列番号３４６、配列番号３４７、配列番号３４８、配列番号３４９、配列番号３５０、配列番号３５１、配列番号３５２、配列番号３５３、配列番号３５４、配列番号３５５、配列番号３５６、配列番号３５７、配列番号３５８、配列番号３５９、配列番号３６０、配列番号３６１、配列番号３６２、配列番号３６３、配列番号３６４、配列番号３６５、配列番号３６６、配列番号３６７、配列番号３６８、配列番号３６９、配列番号３７０、配列番号３７１、配列番号３７２、配列番号３７３、および配列番号３７４のいずれか１つで示されるｓｃＦｖ配列を含み得るが、これらに限定されない。例えば、修飾ＣＴＮＮＢポリペプチドに由来する修飾ペプチド（例えば、ＴＴＡＰＦＬＳＧＫ（配列番号２６））に結合することができる分子は、配列番号３７５、配列番号３７６、配列番号３７７、配列番号３７８、配列番号３７９のいずれか１つで示されるｓｃＦｖ配列を含み得るが、これらに限定されない。例えば、修飾ＫＲＡＳポリペプチドに由来する修飾ペプチド（例えば、ＡＶＧＶＧＫＳＡＬ（配列番号１１））に結合することができる分子は、配列番号３８０、配列番号３９０、配列番号３９１、配列番号３９２、および配列番号３９３のいずれか１つで示されるｓｃＦｖ配列を含み得るが、これらに限定されない。例えば、修飾Ｈ／Ｋ／Ｎ ＲＡＳポリペプチドに由来する修飾ペプチド（例えば、ＩＬＤＴＡＧＨＥＥＹ（配列番号２８）、ＩＬＤＴＡＧＫＥＥＹ（配列番号３０）、ＩＬＤＴＡＧＬＥＥＹ（配列番号３１）、ＩＬＤＴＡＧＲＥＥＹ（配列番号３２））に結合することができる分子は、配列番号３９４、配列番号３９５、配列番号３９６、配列番号３９７、配列番号３９８、配列番号３９９、および配列番号４００のいずれか１つで示されるｓｃＦｖ配列が含まれるが、これらに限定されない。特定の修飾ペプチドに結合することができる配列（例えば、ｓｃＦｖ配列）の例を、表３に示す。場合によっては、本明細書に記載の修飾ペプチド（例えば、配列番号１、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、および配列番号３２のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む修飾ペプチド）に結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む分子は、表３に示す配列から逸脱する配列を有する場合があり、変異配列と呼ばれることもある。例えば、本明細書に記載の修飾ペプチドに結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメインを含む分子は、少なくとも７５％の配列同一性（例えば、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、またはそれ以上）を表３に示す配列のいずれかに対して、変異配列が本明細書に記載の修飾ペプチドに結合する能力を維持する限り、有し得る。場合によっては、本明細書に記載の修飾ペプチドに結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメインを含む分子は、本明細書に記載のＣＤＲ配列の任意の適切なセットを含むことができ、表３に示す配列からの任意の配列の逸脱は、足場配列内（単数または複数）にあり得る。
【0040】
本明細書に記載の修飾ペプチド（例えば、配列番号１、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、および配列番号３２のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む修飾ペプチド）に結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む分子は、標識（例えば、検出可能な標識）に結合（例えば、共有結合または非共有結合）され得る。検出可能な標識は、任意の適切な標識である。場合によっては、標識を使用して、本明細書に記載の１つまたは複数の修飾ペプチドの有無を検出することを補助することができる。例えば、標識された本明細書に記載の分子をｉｎ ｖｉｔｒｏで使用し、哺乳動物から得た試料中のがん細胞（例えば、本明細書に記載の修飾ペプチドを発現するがん細胞）を検出することができる。場合によっては、標識（例えば、検出可能な標識）を使用し、本明細書に記載の１つまたは複数の修飾ペプチドの位置の決定を補助することができる。例えば、標識された本明細書に記載の分子をｉｎ ｖｉｖｏで使用し、抗腫瘍療法をモニターし、および／または哺乳動物のがん細胞（例えば、本明細書に記載の修飾ペプチドを発現するがん細胞）を検出することができる。本明細書に記載の分子に結合させることができる標識の例には、放射性核種、発色団、酵素、および蛍光分子（例えば、緑色蛍光タンパク質）が含まれるが、これらに限定されない。
【0041】
本明細書に記載の修飾ペプチド（例えば、配列番号１、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、および配列番号３２のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む修飾ペプチド）に結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む分子は、治療薬に結合（例えば、共有結合または非共有結合）され得る。治療薬は、任意の治療薬であり得る。場合によっては、治療薬は抗がん剤であり得る。本明細書に記載の分子に結合させることができる治療薬の例には、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、メイタンシン、メルタンシン／エムタンシン（ＤＭ１）、ラブタンシン／ソラブタンシン（ＤＭ４）、ＳＮ－３８、カリケアマイシン、Ｄ６．５、二量体ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、リシン、シュードモナス外毒素Ａ、ジフテリア毒素、およびゲロニンなどの抗がん剤が含まれるが、これらに限定されない。
【0042】
本文書は、本明細書に記載の修飾ペプチド（例えば、配列番号１、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、および配列番号３２のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む修飾ペプチド）に結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つまたは複数の分子を使用する方法も提供する。例えば、１つもしくは複数の修飾ペプチドを標的とする（例えば、結合する）ことができる１つもしくは複数の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つもしくは複数の分子を使用して、がんを有するまたはがんを有すると疑われる哺乳動物を評価することができる、および／あるいはがん（例えば、１つもしくは複数の修飾ペプチドを発現するがん）を有する哺乳動物を治療することができる。場合によっては、１つまたは複数の分子は、修飾ペプチドに結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメインを含み、これらを使用して、がんを患っているまたはがんを有すると疑われる哺乳動物から得た試料中の１つまたは複数の修飾ペプチドの有無を検出することができる。場合によっては、修飾ペプチドに結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメインを含む１つまたは複数の分子を、がん（例えば、修飾ペプチドを発現するがん）を有する哺乳動物に投与し、哺乳動物を治療することができる。本明細書に記載の修飾ペプチドに結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメインを含む１つまたは複数の分子の、がんを有する哺乳動物（例えば、ヒト）への投与は、哺乳動物の治療に有効であり得る。
【0043】
本明細書に記載されるように、任意のタイプの哺乳動物を評価および／または治療することができる。本明細書に記載のように評価および／または治療され得る哺乳動物の例には、霊長類（例えば、ヒトおよびチンパンジー、ヒヒ、またはサルなどの非ヒト霊長類）、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、マウス、およびラットが含まれるが、これらに限定されない。場合によっては、哺乳動物はヒトであり得る。
【0044】
哺乳動物を、適切ながんについて評価および／または治療することができる。場合によっては、がんは、本明細書に記載の１つまたは複数の修飾ペプチド（例えば、１つまたは複数のＭＡＮＡ）を発現し得る。がんは原発性がんであり得る。がんは転移性がんであり得る。がんは、１つまたは複数の固形腫瘍を含み得る。がんは、１つまたは複数の非固形腫瘍を含み得る。本明細書に記載のように（例えば、本明細書に記載の１つまたは複数の修飾ペプチドの存在に少なくとも部分的に基づいて）評価および／または本明細書に記載のように（例えば、本明細書に記載の修飾ペプチドに結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つまたは複数の分子を投与することにより）治療され得るがんの例には、血液がん（例えば、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）などの白血病、および骨髄腫）、肺がん、膵臓がん、胃がん、結腸がん（例えば、大腸がん）、卵巣がん、子宮内膜がん、胆道がん、肝臓がん、骨および軟部組織がん、乳がん、前立腺がん、食道がん、胃がん、腎臓がん、頭頸部がん、脳腫瘍（例えば、多形性膠芽腫および星状細胞腫）が含まれるが、これらに限定されない。
【0045】
がんを有するまたはがんを有すると疑われる哺乳動物を評価する場合、本明細書に記載の修飾ペプチド（例えば、配列番号１、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、および配列番号３２のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む修飾ペプチド）に結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つまたは複数の分子を使用して、本明細書に記載の１つまたは複数の修飾ペプチドの有無を評価することができる。例えば、ヒトから得た試料中の本明細書に記載の１つまたは複数の修飾ペプチドの有無、またはレベルを使用して、ヒトががんを有するかどうかを判定することができる。場合によっては、哺乳動物から得た試料中の本明細書に記載の１つまたは複数の修飾ペプチドの存在を使用して、哺乳動物ががんを有すると特定することができる。例えば、哺乳動物は、哺乳動物から得た試料が本明細書に記載の１つまたは複数の修飾ペプチドを有した場合、がんを有すると特定され得る。
【0046】
哺乳動物から得た任意の適切な試料は、本明細書に記載の１つまたは複数の修飾ペプチドの有無、またはレベルについて評価され得る。例えば、組織試料（例えば、乳房組織）、および体液試料（例えば、血液、血清、血漿、または尿）などの生体試料は、哺乳動物から得られ、本明細書に記載の１つまたは複数の修飾ペプチドの有無、またはレベルについて評価され得る。任意の適切な方法を使用して、本明細書に記載の１つまたは複数の修飾ペプチドの有無、またはレベルを検出することができる。例えば、サンガーシークエンシング、化学シークエンシング、ナノポアシークエンシング、ライゲーションによるシークエンシング（ＳＯＬｉＤシークエンシング）、質量分析を使用したシークエンシングが含まれるが、これらに限定されないシークエンシング技術を使用して、哺乳動物から得た試料中の本明細書に記載の１つまたは複数の修飾ペプチドの有無、またはレベルを判断できる。
【0047】
がんを有する哺乳動物を治療する場合、本明細書に記載の修飾ペプチド（例えば、配列番号１、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、および配列番号３２のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む修飾ペプチド）に結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つまたは複数の分子を、がんを有する哺乳動物に投与し、哺乳動物を治療することができる。場合によっては、哺乳動物は、本明細書に記載の１つまたは複数の修飾ペプチドを発現するがんを有し得る。例えば、本明細書に記載の修飾ペプチドに結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメインを含む１つまたは複数の分子を、その修飾ペプチドを発現するがんを有する哺乳動物に投与し、哺乳動物を治療することができる。例えば、本明細書に記載の修飾ペプチド（例えば、１つまたは複数のＣＡＲおよび／または１つまたは複数のｓｃＤｂ）に結合することができる１つまたは複数のｓｃＦｖを含む１つまたは複数の分子を、その修飾ペプチドを発現するがんを有する哺乳動物に投与し、哺乳動物を治療することができる。
【0048】
場合によっては、本明細書に記載の修飾ペプチド（例えば、配列番号１、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、および配列番号３２のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む修飾ペプチド）に結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つまたは複数の分子は、哺乳動物（例えば、がんを有する哺乳動物）に、数日～数週間にわたる期間に１回または複数回投与され得る。場合によっては、本明細書に記載の修飾ペプチドに結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つまたは複数の分子は、哺乳動物への投与用の薬学的に許容される組成物に製剤化され得る。例えば、本明細書に記載の修飾ペプチドに結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つまたは複数の分子の有効量は、１つまたは複数の薬学的に許容される担体（添加剤）および／あるいは希釈剤とともに製剤化され得る。医薬組成物は、限定されないが、滅菌溶液、懸濁液、徐放性製剤、錠剤、カプセル、丸薬、粉末、および顆粒を含む固体または液体形態での投与用に製剤化され得る。本明細書に記載の医薬組成物において使用され得る薬学的に許容される担体、充填剤、および溶媒には、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン－ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が含まれるが、これらに限定されない。
【0049】
本明細書に記載の修飾ペプチド（例えば、配列番号１、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、および配列番号３２のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む修飾ペプチド）に結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つまたは複数の分子を含む組成物は、経口、非経口（皮下、筋肉内、静脈内、および皮内を含む）、または腫瘍内投与用に設計され得る。非経口投与に適した組成物には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を対象レシピエントの血液と等張にする溶質を含み得る水性および非水性滅菌注射液が含まれる。製剤は、単位用量または複数用量の容器、例えば、密閉アンプルおよびバイアルで提供され得、使用直前に注射用の滅菌液体担体、例えば、水を追加するだけでよい凍結乾燥（凍結乾燥）状態で保存され得る。滅菌粉末、顆粒、および錠剤から即時注射溶液および懸濁液を調製してもよい。
【0050】
本明細書に記載の修飾ペプチド（例えば、配列番号１、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、および配列番号３２のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む修飾ペプチド）に結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つまたは複数の分子を含む組成物は、任意の適切な技術を使用して、任意の適切な場所に投与され得る。本明細書に記載の修飾ペプチドに結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つまたは複数の分子を含む組成物は、局所（例えば、腫瘍内）または全身投与され得る。例えば、本明細書で提供される組成物は、腫瘍内投与（例えば、腫瘍への注射）により、または腫瘍が浸潤した生物学的空間への投与（例えば、脊髄内投与、小脳内投与、腹腔内投与および／または胸膜投与）により局所投与され得る。例えば、本明細書で提供される組成物は、哺乳動物（例えば、ヒト）への経口投与または静脈内投与（例えば、注射または注入）により全身投与され得る。
【0051】
有効用量は、がんのリスクおよび／または重症度、投与経路、被験体の年齢および一般的な健康状態、賦形剤の使用、他の薬剤の使用などの他の治療的処置との併用の可能性、ならびに治療する医師の判断に応じて異なり得る。本明細書に記載の修飾ペプチド（例えば、配列番号１、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、および配列番号３２のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む修飾ペプチド）に結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つまたは複数の分子を含む組成物の有効量は、被験体に重大な毒性を生じることなく被験体内に存在するがんを治療する任意の量であり得る。特定の被験体が特定の量に応答しない場合、本明細書に記載の修飾ペプチドに結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つまたは複数の分子の量を（例えば２倍、３倍、４倍、またはそれ以上に）増やすことができる。このより多くの量を投与された後、哺乳動物は、治療に対する反応性と毒性症状の両方についてモニターされ、それに応じて調整が行われ得る。有効量は、一定に維持することも、治療に対する被験体の応答に応じて、スライディングスケールまたは可変用量として調整することもできる。特定の投与に使用される実際の有効量には、さまざまな要因が影響する。例えば、投与頻度、治療期間、複数の治療薬剤の使用、投与経路、および症状（例えば、がん）の重症度により、投与される実際の有効量の増加または減少が必要とされる場合がある。
【0052】
本明細書に記載の修飾ペプチド（例えば、配列番号１、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、および配列番号３２のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む修飾ペプチド）に結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つまたは複数の分子の投与頻度は、哺乳動物に重大な毒性を生じることなくがんを有する哺乳動物を効果的に治療する任意の頻度であり得る。例えば、本明細書に記載の修飾ペプチドに結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つまたは複数の分子の投与頻度は、週に約２～約３回から年に約２～約３回であり得る。場合によっては、がんを有する被験体は、本明細書に記載の１つまたは複数の抗体の単回投与を受けることができる。本明細書に記載の修飾ペプチドに結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つまたは複数の分子の投与頻度は、一定のままであっても、治療期間中に変更してもよい。本明細書に記載の修飾ペプチドに結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つまたは複数の分子を含む組成物での治療過程は、休薬期間を含み得る。例えば、本明細書に記載の修飾ペプチドに結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つまたは複数の分子を含む組成物を、２年の期間にわたって１か月おきに投与し、その後６か月の休薬期間を設けることができ、そのようなレジメンを複数回繰り返すことができる。有効量と同様に、さまざまな要因が、特定の投与に使用される実際の投与頻度に影響を与え得る。例えば、有効量、治療期間、複数の治療薬剤の使用、投与経路、および症状（例えば、がん）の重症度により、投与頻度の増加または減少が必要とされる場合がある。
【0053】
本明細書に記載の修飾ペプチド（例えば、配列番号１、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、および配列番号３２のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む修飾ペプチド）に結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つまたは複数の分子を含む組成物を投与するための有効期間は、哺乳動物に重大な毒性を生じることなく哺乳動物内に存在するがんを効果的に治療する任意の期間であり得る。場合によっては、有効期間は、数か月～数年までさまざまである。一般的に、がんを有する哺乳動物を治療するための有効期間は、約１または２ヶ月～５年以上の期間に及び得る。特定の治療に使用される実際の有効期間には、複数の要因が影響し得る。例えば、有効期間は、投与頻度、有効量、複数の治療薬剤の使用、投与経路、および治療中の症状の重症度によって異なる場合がある。
【0054】
特定の例では、哺乳動物内のがんをモニターして、がん治療の有効性を評価することができる。任意の適切な方法を使用して、がんを有する哺乳動物を治療するかどうかを決定することができる。例えば、イメージング技術または実験室アッセイを使用して、がん細胞数および／または哺乳動物内に存在する腫瘍のサイズを評価することができる。例えば、イメージング技術または実験室アッセイを使用して、哺乳動物内に存在するがん細胞および／または腫瘍の位置を評価することができる。
【0055】
場合によっては、本明細書に記載の修飾ペプチド（例えば、配列番号１、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、および配列番号３２のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む修飾ペプチド）に結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つまたは複数の分子は、がんを有する哺乳動物に、１つまたは複数の追加のがん治療（例えば、抗がん剤）との併用治療として投与され得る。がん治療には、任意の適切ながん治療が含まれ得る。場合によっては、がん治療には手術が含まれ得る。場合によっては、がん治療には放射線療法が含まれ得る。場合によっては、がん治療には、１つまたは複数の治療薬剤（例えば、１つまたは複数の抗がん剤）の投与が含まれ得る。抗がん剤の例には、白金化合物（例えば、シスプラチンまたはカルボプラチン）、タキサン（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、またはｎａｂ－パクリタキセルなどのアルブミン結合パクリタキセル）、アルトレタミン、カペシタビン、シクロホスファミド、エトポシド（ｖｐ－１６）、ゲムシタビン、イホスファミド、イリノテカン（ｃｐｔ－１１）、リポソームドキソルビシン、メルファラン、ペメトレキセド、トポテカン、ビノレルビン、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニスト（例えば、ゴセレリンおよびリュープロリド）、抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）、アロマターゼ阻害剤（例えば、レトロゾール、アナストロゾール、エキセメスタン）、血管新生阻害剤（例えば、ベバシズマブ）、ポリ（ＡＤＰ）リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤（例えば、オラパリブ、ルカパリブ、およびニラパリブ）、放射性リン、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、ＩＬ－２および他のサイトカイン、ならびにそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。本明細書に記載の修飾ペプチドに結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つまたは複数の分子が、１つまたは複数の追加のがん治療と組み合わせて使用される場合、１つまたは複数の追加のがん治療は同時にまたは独立して投与され得る。例えば、本明細書に記載の修飾ペプチドに結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つまたは複数の分子を含む組成物を最初に投与し、１つまたは複数の追加のがん治療を次に投与することができ、またはその逆も可能である。
【0056】
また、本明細書に記載の修飾ペプチド（例えば、配列番号１、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、および配列番号３２のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む修飾ペプチド）に結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つまたは複数の分子を含むキットも、本明細書で提供される。例えば、キットは、本明細書に記載の修飾ペプチドに結合することができる１つまたは複数の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含む１つまたは複数の分子を含む組成物（例えば、薬学的に許容される組成物）を含み得る。場合によっては、キットには、本明細書に記載の方法のいずれかを実行するための指示書が含まれ得る。場合によっては、キットは、本明細書に記載の組成物（例えば、医薬組成物）のいずれかの少なくとも１用量を含み得る。場合によっては、キットは、本明細書に記載の組成物（例えば、医薬組成物）のいずれかを投与するための手段（例えば、注射器）を提供し得る。
【0057】
本発明を以下の実施例でさらに説明するが、これらは特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【0058】
（実施例１：追加のＭＡＮＡボディクローンの識別およびＭＡＮＡボディクローンのＴ細胞ベースの治療型への変換）
この研究では、２つのファージディスプレイライブラリーが設計および構築され、どちらもファージ表面に単一鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を表示した。両方のライブラリーに存在するｓｃＦｖは、ｓｃＦｖの相補性決定領域（ＣＤＲ）の重要な位置にアミノ酸の可変性が導入されたヒト化４Ｄ５（トラスツズマブ）フレームワークに基づいていた。
この研究では、２つのファージディスプレイライブラリーが設計および構築され、どちらもファージ表面に単一鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を表示した。両方のライブラリーに存在するｓｃＦｖは、ｓｃＦｖの相補性決定領域（ＣＤＲ）の重要な位置にアミノ酸の可変性が導入されたヒト化４Ｄ５（トラスツズマブ）フレームワークに基づいていた。
【0059】
ファージディスプレイライブラリーを使用して、組換えＨＬＡ対立遺伝子アルファ鎖およびベータ－２ミクログロブリン（ｂ２Ｍ）との複合体に折り畳まれた変異含有ペプチドを特異的に認識するｓｃＦｖを特定した。本明細書ではモノマーとも呼ばれるこれらの複合体は、がん細胞表面上の天然ペプチド／ＨＬＡ複合体を模倣する。
【0060】
ペプチドＨＬＡ標的は、表１に示す変異ペプチド（例えば、変異関連ネオ抗原（ＭＡＮＡ））を含み得る。表１のペプチドＨＬＡターゲットに特異的に結合することができる相補性決定領域（ＣＤＲ）を表２に示す。表１のペプチドＨＬＡターゲットに特異的に結合することができるｓｃＦｖを表３に示す。これらのｓｃＦｖは、変異関連ネオ抗原に結合する能力からＭＡＮＡボディとも呼ばれ得る。
【0061】
【表2-1】
【表2-2】
【表2-3】
【表2-4】
【表2-5】
【表2-6】
【表2-7】
【表2-8】
【表2-9】
【0062】
【表3-1】
【表3-2】
【表3-3】
【表3-4】
【表3-5】
【表3-6】
【表3-7】
【表3-8】
【表3-9】
【表3-10】
【表3-11】
【表3-12】
【表3-13】
【表3-14】
【表3-15】
【表3-16】
【表3-17】
【表3-18】
【0063】
ＨＬＡ－Ｂ７との複合体中のＲ１４０Ｑ変異を含むＩＤＨ２ペプチド（ＳＰＮＧＴＩＱＮＩＬ；配列番号１）を特異的に認識するｓｃＦｖの代表的なＥＬＩＳＡデータを図１に示す。ｓｃＦｖは同じＨＬＡ対立遺伝子との複合体中の目的のペプチドのｗｔバージョンを認識しなかった。ｓｃＦｖｓは、モノマーでコーティングされたＥＬＩＳＡプレートへの結合を試験したときに、ＨＬＡ対立遺伝子との複合体中の他の対照ペプチドを認識しなかった。
【0064】
さらにフローサイトメトリーを使用すると、ＭＡＮＡボディのｓｃＦｖクローンが、ＨＬＡ対立遺伝子適合細胞株を、ｗｔペプチドまたは他の対照ペプチドではなく変異ペプチドでこれら細胞がパルスされたときに特異的に染色することが示された（図２－１４）。
【0065】
ＭＡＮＡボディクローンを治療法として利用できることを実証するために、選択したＭＡＮＡボディクローンをＣＡＲ－Ｔ細胞に組み込んだ。ＨＬＡ分子の文脈で内因性のプロセシングおよび提示機構を介して発がん性変異含有ペプチドを発現する細胞を認識および殺すことができるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞（ＣＡＲＴ）を設計した。具体的には、ＨＬＡ－Ａ３において提示される変異ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖペプチドを標的とするＣＡＲＴを設計し、ＨＬＡ－Ｂ７において提示される変異ＩＤＨ２ Ｒ１４０Ｑペプチドを標的とするＣＡＲＴを設計した。いずれかの変異ペプチドを標的とするＭＡＮＡボディｓｃＦｖを第３世代ＣＡＲ構築物に移植し、ｍＲＮＡエレクトロポレーションによりＣＡＲ受容体をＣＤ３＋Ｔ細胞で発現させた。続いて、ＣＡＲ－Ｔ細胞を、それぞれのＨＬＡと組み合わせてＫＲＡＳ／ＩＤＨ２変異体およびｗｔタンパク質をコードするプラスミドで共トランスフェクトしたＣＯＳ－７細胞と共培養した。Ｔ細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞を含めて、標的細胞上の同種抗原による活性化後にサイトカインを産生するため、共培養培地上清中のＩＦＮγの放出をＥＬＩＳＡにより測定した。ＣＯＳ－７細胞に変異体および同種ＨＬＡプラスミドを共トランスフェクトした場合のみ、バックグラウンドを超えるＩＦＮγの有意な放出があった（図１５）。ｗｔおよび同種ＨＬＡを共トランスフェクトしたＣＯＳ－７細胞と共培養したＣＡＲ－Ｔ細胞は、バックグラウンドレベルのＩＦＮγのみを放出した。合わせると、これらの発見は、ＭＡＮＡボディクローンを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞がＨＬＡ分子において提示されるＭＡＮＡを発現する腫瘍細胞を標的にすることができることを示唆している。
【0066】
ＭＡＮＡボディクローンを治療法として利用できることを実証するために、選択したＭＡＮＡボディクローンを二重特異性抗体に組み込んだ。標的がん細胞に結合する１つの抗体フラグメントを有し、Ｔ細胞表面上のＣＤ３タンパク質に結合する１つの抗体フラグメントを有する二重特異性抗体を設計した。ヒトＣＤ３イプシロン、デルタ、および／またはガンマ分子を標的とする多くの異なる抗ＣＤ３ ｓｃＦｖクローンがある。そのようなクローンの例を表４に示す。
【0067】
ＨＬＡ－Ａ３において提示される変異ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖペプチドに結合する１つの抗体フラグメントを有し、Ｔ細胞表面のＣＤ３タンパク質に結合する１つの抗体フラグメントを有する二重特異性抗体を設計した。具体的には、ＨＬＡ－Ａ３において提示される変異ＫＲＡＳ Ｇ１２ＶペプチドおよびＣＤ３を標的とする二重特異性抗体を設計し、ＨＬＡ－Ｂ７において提示される変異ＩＤＨ２ Ｒ１４０ＱペプチドおよびＣＤ３を標的とする二重特異性抗体を設計した。
【表4-1】
【表4-2】
【0068】
２つの異なる抗ＣＤ３ ｓｃＦｖクローンと組み合わせた３つのＩＤＨ２ Ｒ１４０Ｑ ＨＬＡ－Ｂ７ ＭＡＮＡボディｓｃＦｖクローンの代表的なｓｃＤｂ共培養結果を図１６Ａに示す。Ｔ細胞を、ＨＬＡ－Ｂ７、全長ＩＤＨ２変異体、および／またはＧＦＰをコードするプラスミドで共トランスフェクトされたＣＯＳ－７細胞と指定濃度のｓｃＤｂの存在下で共培養した。標的細胞上の同種抗原によるＴ細胞活性化の読み取りとして、共培養培地上清中のＩＦＮγの放出をＥＬＩＳＡにより測定した。ＣＯＳ－７細胞にＨＬＡ－Ｂ７および変異ＩＤＨ２ Ｒ１４０Ｑプラスミドを共トランスフェクトした場合にのみ、バックグラウンドを超えるＩＦＮγの有意なＴ細胞放出があり、ＩＦＮγのレベルはウェルに含まれるｓｃＤｂの濃度に依存した。ＨＬＡ－Ｂ７およびｗｔ ＩＤＨ２で共トランスフェクトされたＣＯＳ－７細胞と共培養されたＴ細胞は、バックグラウンドレベルのＩＦＮγのみを放出した。ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＨＬＡ－Ａ３ ＭＡＮＡボディｓｃＦｖクローンを抗ＣＤ３クローンと組み合わせて一本鎖ダイアボディにした代表的なｓｃＤｂ共培養結果を図１６Ｂに示す。この共培養では、一本鎖ダイアボディを０、５０、および１００ｎｇ／ｍＬの濃度で試験した。ＣＯＳ－７細胞にＨＬＡ－Ａ３および変異ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖプラスミドを共トランスフェクトした場合にのみ、バックグラウンドを超えるＩＦＮγの有意なＴ細胞放出があった。ＨＬＡ－Ａ３およびｗｔ ＫＲＡＳと共トランスフェクトしたＣＯＳ－７細胞と共培養したＴ細胞は、Ｔ細胞なし、標的細胞なし、ｓｃＤｂなしのウェルで見られるＩＦＮγのレベルと同様に、バックグラウンドレベルのＩＦＮγのみを放出した。その同質遺伝子ＨＬＡ－Ａ３ノックアウト対照とともに標的細胞株としての内因性ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＨＬＡ－Ａ３陽性細胞株ＮＣＩ－Ｈ４４１。ＩＦＮγ放出は、親ＮＣＩ－Ｈ４４１細胞株に対してのみ見られ、ＨＬＡ－Ａ３ノックアウトＮＣＩ－Ｈ４４１では見られなかった。合わせると、これらの発見は、ＨＬＡ分子において提示されるＭＡＮＡを発現する腫瘍細胞を標的とするＭＡＮＡボディクローンを含む二重特異性抗体を示唆している。
【0069】
ＭＡＮＡボディクローンを治療法として使用することの有効性を評価するために、ＰｒｏｍｅｇａのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬を使用して、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＨＬＡ－Ａ３一本鎖ダイアボディの標的細胞生存率をアッセイした（図１７）。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏはウェル内のＡＴＰ濃度を測定し、これは生細胞の数に比例する。Ｔ細胞のみのウェルからＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ値を差し引き、標的細胞のみのウェルに正規化することにより、標的細胞の生存率を測定した。ＮＣＩ－Ｈ４４１親細胞をＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ－Ａ３ ｓｃＤｂまたはｐａｎ－ＨＬＡ－Ａ３ ｓｃＤｂ陽性対照の存在下でＴ細胞とインキュベートした場合にのみ、有意な標的細胞死が認められた。ｓｃＤｂの非存在下またはＮＣＩ－Ｈ４４１ ＨＬＡ－Ａ３ノックアウトウェルの間では、標的細胞死は観察されなかった。
【0070】
合わせると、これらの発見は、ＭＡＮＡボディを使用してＴ細胞をリダイレクトおよび活性化し、特定の変異タンパク質とＨＬＡ対立遺伝子対（例えば、ＩＤＨ２ Ｒ１４０ＱとＨＬＡ－Ｂ７およびＫＲＡＳ Ｇ１２ＶとＨＬＡ－Ａ３）を発現する腫瘍細胞を殺すことができることを実証している。
【0071】
（材料および方法）
（細胞および細胞株）
ＲＰＭＩ－６６６６細胞（ＡＴＣＣ、マナッサス、バージニア州）を、２０％ＦＢＳ（ＧＥ Ｈｙｃｌｏｎｅ、ローガン、ユタ州、米国）と、１％ペニシリンストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とを含むＲＰＭＩ－１６４０（ＡＴＣＣ）で培養した。Ｔ２細胞（ＡＴＣＣ）およびＭＩＮＯ細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％ＦＢＳ（ＧＥ Ｈｙｃｌｏｎｅ）と、１％ペニシリンストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）とを含むＲＰＭＩ－１６４０（ＡＴＣＣ）で培養した。Ｔ２Ａ３細胞（エリック・ルッツ博士から贈られた）を、１０％ＦＢＳ（ＧＥ Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１％ペニシリンストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、０．１ｍＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と、５００μｇ／ｍＬジェネティシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）とを含むＲＰＭＩ－１６４０（ＡＴＣＣ）で培養した。ＳｉｇＭ５細胞（ＤＳＭＺ、ブラウンシュヴァイク、ドイツ）を、２０％ＦＢＳ（ＧＥ Ｈｙｃｌｏｎｅ）と、１％ペニシリンストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）とを含むイスコフＭＤＭ（ＡＴＣＣ）で培養した。Ｈｓ６１１．Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％ＦＢＳ（ＧＥ Ｈｙｃｌｏｎｅ）と、１％ペニシリンストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）とを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＡＴＣＣ）で培養した。ＮＣＩ－Ｈ４４１細胞（ＡＴＣＣ）およびＣＯＳ－７細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％ＦＢＳ（ＧＥ Ｈｙｃｌｏｎｅ）と、１％ペニシリンストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）とを含むマッコイ５Ａ（改変）培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で培養した。ＣＯＳ－７細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１６５１（商標））を、１０％ＦＢＳ（ＧＥ Ｈｙｃｌｏｎｅ）と、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒと）を含むＤＭＥＭ（高グルコース、ピルビン酸；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で培養した。２９３ＦＴ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を、１０％ＦＢＳ（ＧＥ Ｈｙｃｌｏｎｅ）と、０．１ｍＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と、６ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と、１ｍＭ ＭＥＭピルビン酸ナトリウム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と、５００μｇ／ｍｌジェネティシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）とを含む高グルコースＤ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で培養した。全ての細胞株を、５％ＣＯ２下で３７℃に維持した。
（細胞および細胞株）
ＲＰＭＩ－６６６６細胞（ＡＴＣＣ、マナッサス、バージニア州）を、２０％ＦＢＳ（ＧＥ Ｈｙｃｌｏｎｅ、ローガン、ユタ州、米国）と、１％ペニシリンストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とを含むＲＰＭＩ－１６４０（ＡＴＣＣ）で培養した。Ｔ２細胞（ＡＴＣＣ）およびＭＩＮＯ細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％ＦＢＳ（ＧＥ Ｈｙｃｌｏｎｅ）と、１％ペニシリンストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）とを含むＲＰＭＩ－１６４０（ＡＴＣＣ）で培養した。Ｔ２Ａ３細胞（エリック・ルッツ博士から贈られた）を、１０％ＦＢＳ（ＧＥ Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１％ペニシリンストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、０．１ｍＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と、５００μｇ／ｍＬジェネティシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）とを含むＲＰＭＩ－１６４０（ＡＴＣＣ）で培養した。ＳｉｇＭ５細胞（ＤＳＭＺ、ブラウンシュヴァイク、ドイツ）を、２０％ＦＢＳ（ＧＥ Ｈｙｃｌｏｎｅ）と、１％ペニシリンストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）とを含むイスコフＭＤＭ（ＡＴＣＣ）で培養した。Ｈｓ６１１．Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％ＦＢＳ（ＧＥ Ｈｙｃｌｏｎｅ）と、１％ペニシリンストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）とを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＡＴＣＣ）で培養した。ＮＣＩ－Ｈ４４１細胞（ＡＴＣＣ）およびＣＯＳ－７細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％ＦＢＳ（ＧＥ Ｈｙｃｌｏｎｅ）と、１％ペニシリンストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）とを含むマッコイ５Ａ（改変）培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で培養した。ＣＯＳ－７細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１６５１（商標））を、１０％ＦＢＳ（ＧＥ Ｈｙｃｌｏｎｅ）と、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒと）を含むＤＭＥＭ（高グルコース、ピルビン酸；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で培養した。２９３ＦＴ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を、１０％ＦＢＳ（ＧＥ Ｈｙｃｌｏｎｅ）と、０．１ｍＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と、６ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と、１ｍＭ ＭＥＭピルビン酸ナトリウム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と、５００μｇ／ｍｌジェネティシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）とを含む高グルコースＤ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で培養した。全ての細胞株を、５％ＣＯ２下で３７℃に維持した。
【0072】
ＰＢＭＣを、健康なボランティアドナーからの全血のＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）勾配遠心分離によって得た。ＣＤ３＋細胞を、ＣＤ３マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によりＰＢＭＣからポジティブセレクションし、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で活性化および増殖した。特に明記しない限り、初代ＣＤ３＋Ｔ細胞を、１０％ＦＢＳ（ＧＥ Ｈｙｃｌｏｎｅ）と、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と、１００ＩＵ／ｍＬ組換えヒトインターロイキン－２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標））とを含むＲＰＭＩ－１６４０（ＡＴＣＣ）で、３７℃で５％ＣＯ２下で培養した。
【0073】
（ファージディスプレイライブラリーの構築）
第１世代ファージライブラリーについては、混合およびスプリットプール縮重オリゴヌクレオチド合成を使用して、オリゴヌクレオチドをＤＮＡ ２．０（メンローパーク、カリフォルニア州）で合成した。第２世代ファージライブラリーについては、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ヘールソープ、メリーランド州）でトリヌクレオチド突然変異誘発（ＴＲＩＭ）技術を使用してオリゴヌクレオチドを合成した。両方のライブラリーについて、オリゴヌクレオチドをｐＡＤＬ－１０ｂファージミド（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ、サンディエゴ、カリフォルニア州）に組み込んだ。このファージミドには、Ｆ１複製起点、非誘導発現を制限する転写抑制因子、ｌａｃオペレーター、およびｌａｃ抑制因子が含まれている。ｓｃＦｖをｐｅｌＢペリプラズム分泌シグナルを用いて合成し、ｌａｃオペレーターの下流にサブクローニングした。第１世代ライブラリーでは、ｍｙｃエピトープタグとそれに続くＴＥＶプロテアーゼ切断認識配列が可変重鎖のすぐ下流に配置され、第２世代ライブラリーでは、ｓｃＦｖにＦＬＡＧタグが続いた。ｓｃＦｖ、タグ、および切断部位に続いて、完全長のインフレームＭ１３ ｐＩＩＩコートタンパク質配列があった。
第１世代ファージライブラリーについては、混合およびスプリットプール縮重オリゴヌクレオチド合成を使用して、オリゴヌクレオチドをＤＮＡ ２．０（メンローパーク、カリフォルニア州）で合成した。第２世代ファージライブラリーについては、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ヘールソープ、メリーランド州）でトリヌクレオチド突然変異誘発（ＴＲＩＭ）技術を使用してオリゴヌクレオチドを合成した。両方のライブラリーについて、オリゴヌクレオチドをｐＡＤＬ－１０ｂファージミド（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ、サンディエゴ、カリフォルニア州）に組み込んだ。このファージミドには、Ｆ１複製起点、非誘導発現を制限する転写抑制因子、ｌａｃオペレーター、およびｌａｃ抑制因子が含まれている。ｓｃＦｖをｐｅｌＢペリプラズム分泌シグナルを用いて合成し、ｌａｃオペレーターの下流にサブクローニングした。第１世代ライブラリーでは、ｍｙｃエピトープタグとそれに続くＴＥＶプロテアーゼ切断認識配列が可変重鎖のすぐ下流に配置され、第２世代ライブラリーでは、ｓｃＦｖにＦＬＡＧタグが続いた。ｓｃＦｖ、タグ、および切断部位に続いて、完全長のインフレームＭ１３ ｐＩＩＩコートタンパク質配列があった。
【0074】
ファージミドＤＮＡを細菌に形質転換するために、１０～２０ｎｇのライゲーション産物を氷上で、１０μＬのエレクトロコンピテントＳＳ３２０細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ、ミドルトン、ウィスコンシン州）および１４μＬの再蒸留水と混合した。この混合液を、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒエレクトロポレーションシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）を使用してエレクトロポレーションし、Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｍｅｄｉａ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）で６０分間３７℃で回復させた。ライゲーション産物６０ｎｇで形質転換した細胞をプールし、カルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）と２％グルコースを添加した２ｘＹＴ培地を含む２４ｃｍｘ２４ｃｍプレートに播種した。細胞を３７℃で６時間増殖させ、４℃で一晩置いた。エレクトロポレーションの各シリーズの形質転換効率を決定するために、アリコートを取り、連続希釈により力価を測定した。プレート上で増殖した細胞を、カルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）と２％グルコースとを含む８５０ｍＬの２ｘＹＴ培地に擦り込み、最終ＯＤ６００を５～１５にした。８５０ｍＬの培養液２ｍＬを採取し、約１：２００に希釈して、０．０５～０．０７の最終ＯＤ６００を達成した。残りの培養物に、急速凍結する前に、滅菌グリセロール１５０ｍＬを加え、グリセロールストックを生成した。希釈した細菌をＯＤ６００が０．２～０．４になるまで増殖させ、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ、サンディエゴ、カリフォルニア州）に感染させ、３７℃で１時間振盪した。培養液を遠心分離し、細胞をカルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）とカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）とを含む２ｘＹＴ培地に再懸濁し、ファージ産生のために３０℃で一晩増殖させた。翌朝、細菌培養物を５０ｍＬ Ｆａｌｃｏｎチューブに分注し、高速で２回ペレット化して清澄化上清を得た。ファージを含む上清を氷上で４０分間、２０％ＰＥＧ－８０００／２．５Ｍ ＮａＣｌ溶液を４：１のＰＥＧ／ＮａＣｌ対上清の比率で用いて沈殿させた。沈殿後、ファージを１２，０００ｇで４０分間遠心分離し、１ｍＬ ｖｏｌ １Ｘ ＴＢＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁した。複数のチューブからのファージをプールし、再沈殿させ、１ｘ１０１３ｃｆｕ／ｍＬの平均力価に再懸濁した。第１世代ライブラリーでは、得られた形質転換体の総数は５．５ｘ１０９である。第２世代ライブラリーでは、得られた形質転換体の総数は３．６ｘ１０１０であった。各ライブラリーを小分けし、１５％グリセロールに－８０℃で保存した。
【0075】
（完全ファージライブラリーの次世代シークエンシング）
ライブラリーからのＤＮＡを、ＣＤＲ－Ｈ３領域に隣接するプライマーを使用して増幅した。これらのプライマーの５´末端の配列には分子バーコードが組み込まれており、別個のファージ配列の明確な列挙を容易にする。ＰＣＲ増幅およびシークエンシングのプロトコルは、Ｋｉｎｄｅらに記載されている。配列を、カスタムＳＱＬデータベースを使用して処理および翻訳し、ヌクレオチド配列とアミノ酸翻訳の両方を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌを使用して分析した。
ライブラリーからのＤＮＡを、ＣＤＲ－Ｈ３領域に隣接するプライマーを使用して増幅した。これらのプライマーの５´末端の配列には分子バーコードが組み込まれており、別個のファージ配列の明確な列挙を容易にする。ＰＣＲ増幅およびシークエンシングのプロトコルは、Ｋｉｎｄｅらに記載されている。配列を、カスタムＳＱＬデータベースを使用して処理および翻訳し、ヌクレオチド配列とアミノ酸翻訳の両方を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌを使用して分析した。
【0076】
（ペプチドおよびＨＬＡモノマー）
変異体、ｗｔ、および対照ペプチド（表１に記載）は、ＮｅｔＭＨＣバージョン４．０を使用してＨＬＡ対立遺伝子に結合すると予測された。全てのペプチドを、ペプチド２．０（シャンティリー、バージニア州）により＞９０％の純度で合成した。ペプチドをＤＭＳＯまたはＤＭＦに１０ｍｇ／ｍＬで再懸濁し、－２０℃で保存した。ＨＬＡモノマーを、組換えＨＬＡをペプチドおよびベータ２ミクログロブリンとリフォールディングすることにより合成し、ゲルろ過により精製し、ビオチン化した（Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｌａｂ、シアトル、ワシントン州）。Ｗ６／３２抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、サンディエゴ、カリフォルニア州）を使用してＥＬＩＳＡを行うことにより、選択前にモノマーがフォールディングされていることを確認した。
変異体、ｗｔ、および対照ペプチド（表１に記載）は、ＮｅｔＭＨＣバージョン４．０を使用してＨＬＡ対立遺伝子に結合すると予測された。全てのペプチドを、ペプチド２．０（シャンティリー、バージニア州）により＞９０％の純度で合成した。ペプチドをＤＭＳＯまたはＤＭＦに１０ｍｇ／ｍＬで再懸濁し、－２０℃で保存した。ＨＬＡモノマーを、組換えＨＬＡをペプチドおよびベータ２ミクログロブリンとリフォールディングすることにより合成し、ゲルろ過により精製し、ビオチン化した（Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｌａｂ、シアトル、ワシントン州）。Ｗ６／３２抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、サンディエゴ、カリフォルニア州）を使用してＥＬＩＳＡを行うことにより、選択前にモノマーがフォールディングされていることを確認した。
【0077】
（変異ペプチド－ＨＬＡモノマーに結合したファージの選択）
ＨＬＡおよびベータ－２－ミクログロブリンタンパク質を含むビオチン化モノマーを、ＭｙＯｎｅ Ｔ１ストレプトアビジン磁気ビーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールスバッド、カリフォルニア州）に結合させた。ビオチン化モノマーを、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．１％Ｎａ－アジド）中３０μＬのＭｙＯｎｅ Ｔ１ビーズ（モノマー１ｕｇあたり）と１時間室温（ＲＴ）でインキュベートした。最初のインキュベーション後、複合体を１ｍｌのブロッキング緩衝液で３回洗浄し、１ｍｌのブロッキング緩衝液に再懸濁した。
ＨＬＡおよびベータ－２－ミクログロブリンタンパク質を含むビオチン化モノマーを、ＭｙＯｎｅ Ｔ１ストレプトアビジン磁気ビーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールスバッド、カリフォルニア州）に結合させた。ビオチン化モノマーを、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．１％Ｎａ－アジド）中３０μＬのＭｙＯｎｅ Ｔ１ビーズ（モノマー１ｕｇあたり）と１時間室温（ＲＴ）でインキュベートした。最初のインキュベーション後、複合体を１ｍｌのブロッキング緩衝液で３回洗浄し、１ｍｌのブロッキング緩衝液に再懸濁した。
【0078】
（濃縮段階）
選択の濃縮段階（１回目）で、ライブラリーの１０００倍のカバー率を表すファージを、むき出しの洗浄済みＭｙＯｎｅ Ｔ１ビーズおよび加熱変性したビーズ結合ＨＬＡモノマーとともに、回転子上で一晩４℃でインキュベートした。この工程は、ビオチン化モノマーの全ての調製物中にわずかに存在するストレプトアビジンまたは変性モノマーのいずれかを認識するファージを除去するために必要であった。ネガティブセレクション後、ビーズをＤｙｎａＭａｇ－２マグネット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分離し、非結合ファージを含む上清を、ＭｙＯｎｅ Ｔ１ストレプトアビジン磁気ビーズに結合した１ｕｇの変異ペプチドＨＬＡモノマーに対するポジティブセレクションのために移した。溶出の前に、マグネットを使用して、０．５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含む１ｍｌの１Ｘ ＴＢＳでビーズを１０回洗浄した。１ｍＬの０．２ Ｍグリシン、ｐＨ ２．２にビーズを再懸濁することにより、ファージを溶出した。１０分間のインキュベーション後、１５０μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ９．０を添加して溶液を中和した。中和されたファージを使用し、対数増殖中期ＳＳ３２０の１０ｍｌ培養物に感染させ、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージ（４のＭＯＩ）と２％グルコースを加えた。３７℃で１時間振とうした後、バクテリアを、カルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）と、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）と、５０ｕＭのＩＰＴＧとを含む２ｘＹＴ培地に再懸濁し、ファージ産生のために一晩３０℃で培養した。翌朝、前述のように、ファージをＰＥＧ／ＮａＣｌで沈殿させた。
選択の濃縮段階（１回目）で、ライブラリーの１０００倍のカバー率を表すファージを、むき出しの洗浄済みＭｙＯｎｅ Ｔ１ビーズおよび加熱変性したビーズ結合ＨＬＡモノマーとともに、回転子上で一晩４℃でインキュベートした。この工程は、ビオチン化モノマーの全ての調製物中にわずかに存在するストレプトアビジンまたは変性モノマーのいずれかを認識するファージを除去するために必要であった。ネガティブセレクション後、ビーズをＤｙｎａＭａｇ－２マグネット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分離し、非結合ファージを含む上清を、ＭｙＯｎｅ Ｔ１ストレプトアビジン磁気ビーズに結合した１ｕｇの変異ペプチドＨＬＡモノマーに対するポジティブセレクションのために移した。溶出の前に、マグネットを使用して、０．５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含む１ｍｌの１Ｘ ＴＢＳでビーズを１０回洗浄した。１ｍＬの０．２ Ｍグリシン、ｐＨ ２．２にビーズを再懸濁することにより、ファージを溶出した。１０分間のインキュベーション後、１５０μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ９．０を添加して溶液を中和した。中和されたファージを使用し、対数増殖中期ＳＳ３２０の１０ｍｌ培養物に感染させ、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージ（４のＭＯＩ）と２％グルコースを加えた。３７℃で１時間振とうした後、バクテリアを、カルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）と、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）と、５０ｕＭのＩＰＴＧとを含む２ｘＹＴ培地に再懸濁し、ファージ産生のために一晩３０℃で培養した。翌朝、前述のように、ファージをＰＥＧ／ＮａＣｌで沈殿させた。
【0079】
（最終選択段階）
濃縮段階で生じたファージを用いて、３～５回の最終選択を行った。最終選択の各回について、目的の変異タンパク質を欠くＨＬＡ対立遺伝子適合細胞に対して１０～０．１％の沈殿ファージを使用し、最初のネガティブセレクションを行った。次いで、未結合ファージを、天然ｗｔペプチド－ＨＬＡモノマーおよび無関係なＨＬＡ－対立遺伝子適合モノマーに対してネガティブセレクションを行った。ネガティブセレクション後、ビーズをＤｙｎａｍａｇ ２マグネット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分離し、上記の濃縮フェーズで説明したように、非結合ファージを含む上清を２５０ｎｇ～１ｕｇの変異ペプチドＨＬＡモノマーでのポジティブセレクションのために移した。
濃縮段階で生じたファージを用いて、３～５回の最終選択を行った。最終選択の各回について、目的の変異タンパク質を欠くＨＬＡ対立遺伝子適合細胞に対して１０～０．１％の沈殿ファージを使用し、最初のネガティブセレクションを行った。次いで、未結合ファージを、天然ｗｔペプチド－ＨＬＡモノマーおよび無関係なＨＬＡ－対立遺伝子適合モノマーに対してネガティブセレクションを行った。ネガティブセレクション後、ビーズをＤｙｎａｍａｇ ２マグネット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分離し、上記の濃縮フェーズで説明したように、非結合ファージを含む上清を２５０ｎｇ～１ｕｇの変異ペプチドＨＬＡモノマーでのポジティブセレクションのために移した。
【0080】
（ＥＬＩＳＡ）
ストレプトアビジンコーティング９６ウェルプレート（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州）を、ブロッキング緩衝液（０．５％ＢＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）中の５０ｎｇ（５０ｕＬ中）のビオチン化変異体またはｗｔペプチドＨＬＡモノマーで４℃で一晩コーティングした。プレートを１Ｘ ＴＢＳＴ（ＴＢＳ＋０．０５％Ｔｒｉｔｉｏｎ－Ｘ １００）で簡単に洗浄した。ファージをブロッキング緩衝液で指定濃度に連続希釈し、各ウェルに５０ｕＬを加えた。ファージをＲＴで２時間インキュベートした後、洗浄した（ＥＬＩＳＡプレートウォッシャー（ＢｉｏＴｅｋ、ウィヌースキ、バーモント州）を使用して１Ｘ ＴＢＳ－０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０（ＴＢＳＴ）で６回洗浄）。結合ファージを、１Ｘ ＴＢＳＴで１：３０００に希釈し５０μＬのウサギ抗Ｍ１３抗体（Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ州）と室温で１時間インキュベートし、その後さらに６回洗浄し、１Ｘ ＴＢＳＴで１：１０，０００に希釈した５０μＬの抗ウサギＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と１時間室温でインキュベートした。１Ｘ ＴＢＳＴで最後の６回の洗浄をした後、５０μＬのＴＭＢ基質（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、サンディエゴ、カリフォルニア州）をウェルに加え、１Ｎ硫酸で反応をクエンチした。４５０ｎｍでの吸光度をＳｙｎｅｒｇｙ Ｈ１マルチモードリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、ウィヌースキ、バーモント州）で測定した。
ストレプトアビジンコーティング９６ウェルプレート（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州）を、ブロッキング緩衝液（０．５％ＢＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）中の５０ｎｇ（５０ｕＬ中）のビオチン化変異体またはｗｔペプチドＨＬＡモノマーで４℃で一晩コーティングした。プレートを１Ｘ ＴＢＳＴ（ＴＢＳ＋０．０５％Ｔｒｉｔｉｏｎ－Ｘ １００）で簡単に洗浄した。ファージをブロッキング緩衝液で指定濃度に連続希釈し、各ウェルに５０ｕＬを加えた。ファージをＲＴで２時間インキュベートした後、洗浄した（ＥＬＩＳＡプレートウォッシャー（ＢｉｏＴｅｋ、ウィヌースキ、バーモント州）を使用して１Ｘ ＴＢＳ－０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０（ＴＢＳＴ）で６回洗浄）。結合ファージを、１Ｘ ＴＢＳＴで１：３０００に希釈し５０μＬのウサギ抗Ｍ１３抗体（Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ州）と室温で１時間インキュベートし、その後さらに６回洗浄し、１Ｘ ＴＢＳＴで１：１０，０００に希釈した５０μＬの抗ウサギＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と１時間室温でインキュベートした。１Ｘ ＴＢＳＴで最後の６回の洗浄をした後、５０μＬのＴＭＢ基質（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、サンディエゴ、カリフォルニア州）をウェルに加え、１Ｎ硫酸で反応をクエンチした。４５０ｎｍでの吸光度をＳｙｎｅｒｇｙ Ｈ１マルチモードリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、ウィヌースキ、バーモント州）で測定した。
【0081】
最終選択から得たファージの限界希釈で形質転換したＳＳ３２０細胞の個々のコロニーを選択することにより、モノクローナルファージＥＬＩＳＡを実施した。個々のコロニーを、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンと２％グルコースとを含む２００μｌの２ｘＹＴ培地に接種し、３７℃で３時間増殖させた。次に、細胞に１．６ｘ１０７Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ、サンディエゴ、カリフォルニア州）を感染させ、３７℃で振盪しながらインキュベートした。細胞をペレット化し、カルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）と、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）と、５０ｕＭ ＩＰＴＧとを含む３００μＬの２ｘＹＴ培地に再懸濁し、３０℃で一晩増殖させた。細胞をペレット化し、ファージを含む上清を上記のようにＥＬＩＳＡに使用した。
【0082】
（ペプチドパルスおよびフローサイトメトリー）
ペプチドパルスについては、ＨＬＡ適合細胞をＰＢＳで１回、無血清ＲＰＭＩ－１６４０で１回洗浄した後、１ｍＬあたり１０６細胞を、５０μｇ／ｍＬペプチドと１０μｇ／ｍＬヒトベータ２ミクログロブリン（ＰｒｏＳｐｅｃ、イーストブランズウィック、ニュージャージー州）とを含む無血清ＲＰＭＩ－１６４０中で３７℃で一晩インキュベートした。パルス細胞をペレット化し、冷染色緩衝液（０．５％ＢＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）で１回洗浄し、１００μＬの染色緩衝液に再懸濁した。ファージ染色を、氷上で１０ｕＬ（約１ｘ１０９）のファージを用い、１００ｕＬの総容量で１時間行い、続いて冷染色緩衝液４ｍＬで１回洗浄した。次いで、細胞を、１ｕＬのウサギ抗Ｍ１３抗体（Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ州）で１００ｕＬの総容量で氷上で１時間染色し、４ｍＬの冷染色緩衝液で１回洗浄した。細胞を抗ウサギ－ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で氷上で１００ｕＬの総容量で１時間染色し、製造元の指示に従って室温で１０分間、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ－ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）とインキュベートした。細胞を４ｍＬの染色緩衝液で１回洗浄した後、分析前に３００ｕＬの染色緩衝液に再懸濁した。ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、マンスフィールド、マサチューセッツ州）を使用して染色細胞を分析した。
ペプチドパルスについては、ＨＬＡ適合細胞をＰＢＳで１回、無血清ＲＰＭＩ－１６４０で１回洗浄した後、１ｍＬあたり１０６細胞を、５０μｇ／ｍＬペプチドと１０μｇ／ｍＬヒトベータ２ミクログロブリン（ＰｒｏＳｐｅｃ、イーストブランズウィック、ニュージャージー州）とを含む無血清ＲＰＭＩ－１６４０中で３７℃で一晩インキュベートした。パルス細胞をペレット化し、冷染色緩衝液（０．５％ＢＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）で１回洗浄し、１００μＬの染色緩衝液に再懸濁した。ファージ染色を、氷上で１０ｕＬ（約１ｘ１０９）のファージを用い、１００ｕＬの総容量で１時間行い、続いて冷染色緩衝液４ｍＬで１回洗浄した。次いで、細胞を、１ｕＬのウサギ抗Ｍ１３抗体（Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ州）で１００ｕＬの総容量で氷上で１時間染色し、４ｍＬの冷染色緩衝液で１回洗浄した。細胞を抗ウサギ－ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で氷上で１００ｕＬの総容量で１時間染色し、製造元の指示に従って室温で１０分間、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ－ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）とインキュベートした。細胞を４ｍＬの染色緩衝液で１回洗浄した後、分析前に３００ｕＬの染色緩衝液に再懸濁した。ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、マンスフィールド、マサチューセッツ州）を使用して染色細胞を分析した。
【0083】
（ＣＡＲの構築および生成）
ＭＡＮＡボディｓｃＦｖ、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ならびに４－１ＢＢおよびＣＤ３ζ細胞内ドメインを含む第３世代キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物を合成し（ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標））、哺乳動物発現ベクターｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。ｍＲＮＡを、Ｔ７ ｍＳｃｒｉｐｔ（商標）Ｓｔａｎｄａｒｄ ｍＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｋｉｔ（ＣｅｌｌＳｃｒｉｐｔ（商標））を使用し、製造元の指示に従い合成した。ＣＡＲ ｍＲＮＡを、ＢＴＸ ＥＣＭ ２００１ Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を使用して初代ＣＤ３＋Ｔ細胞にエレクトロポレーションし、ＣＡＲ－Ｔ細胞を生成した。
ＭＡＮＡボディｓｃＦｖ、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ならびに４－１ＢＢおよびＣＤ３ζ細胞内ドメインを含む第３世代キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物を合成し（ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標））、哺乳動物発現ベクターｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。ｍＲＮＡを、Ｔ７ ｍＳｃｒｉｐｔ（商標）Ｓｔａｎｄａｒｄ ｍＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｋｉｔ（ＣｅｌｌＳｃｒｉｐｔ（商標））を使用し、製造元の指示に従い合成した。ＣＡＲ ｍＲＮＡを、ＢＴＸ ＥＣＭ ２００１ Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を使用して初代ＣＤ３＋Ｔ細胞にエレクトロポレーションし、ＣＡＲ－Ｔ細胞を生成した。
【0084】
（ＣＡＲ－Ｔ活性化共培養アッセイ）
ＣＯＳ－７細胞に、ＨＬＡ－Ａ３、ＨＬＡ－Ｂ７、ＩＤＨ２（ＷＴ）、ＩＤＨ２（Ｒ１４０Ｑ）、ＫＲＡＳ（ＷＴ）、およびＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｖ）をコードするｐｃＤＮＡ３．１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）プラスミドの様々な組み合わせを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で、製造元の指示に従い９６ウェルプレート形式でトランスフェクトした。１００，０００個のエレクトロポレーションしたＣＡＲ－Ｔ細胞を、トランスフェクトしたＣＯＳ－７細胞に重ね、共培養物を５％ＣＯ２下、３７℃で４時間インキュベートした。共培養後、馴化培地を収集し、ＥＬＩＳＡ（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）により分泌ＩＦＮγについてアッセイした。
ＣＯＳ－７細胞に、ＨＬＡ－Ａ３、ＨＬＡ－Ｂ７、ＩＤＨ２（ＷＴ）、ＩＤＨ２（Ｒ１４０Ｑ）、ＫＲＡＳ（ＷＴ）、およびＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｖ）をコードするｐｃＤＮＡ３．１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）プラスミドの様々な組み合わせを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で、製造元の指示に従い９６ウェルプレート形式でトランスフェクトした。１００，０００個のエレクトロポレーションしたＣＡＲ－Ｔ細胞を、トランスフェクトしたＣＯＳ－７細胞に重ね、共培養物を５％ＣＯ２下、３７℃で４時間インキュベートした。共培養後、馴化培地を収集し、ＥＬＩＳＡ（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）により分泌ＩＦＮγについてアッセイした。
【0085】
（二重特異性抗体産生）
二重特異性抗体をコードするｇＢＬＯＣＫを、ＩＤＴ（スコーキー、イリノイ州）に注文した。製造業者のプロトコルに従って、ｇＢＬＯＣＫをｐｃＤＮＡ３．４プラスミド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）にトポクローニングした。２９３ＦＴ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に、二重特異性抗体ｐｃＤＮＡ３．４プラスミドを、製造元の指示に従ってＴ７５フラスコ中でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してトランスフェクトした。５～７日間のインキュベーション後、培地を回収し、４℃で１０分間３，０００ｇで遠心分離した。製造業者の指示に従って、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｃａｐｔｕｒｅｍ（商標）Ｈｉｓ－Ｔａｇｇｅｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ、マウンテンビュー、カリフォルニア州）を使用して、二重特異性抗体タンパク質を精製した。製造業者の指示に従って、Ｚｅｂａ ｓｐｉｎ ７ｋ ＭＷＣＯ脱塩カラムを使用して、二重特異性抗体タンパク質をＰＢＳに脱塩した。Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅ（商標）Ｐｒｅｃａｓｔ Ｇｅｌｓ（Ｂｉｏｒａｄ、ヘラクレス、カリフォルニア州）を使用して、既知濃度のタンパク質の標準曲線を使用して、二重特異性抗体濃度を定量した。ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ＋Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して、染色されていないゲルをイメージングした。
二重特異性抗体をコードするｇＢＬＯＣＫを、ＩＤＴ（スコーキー、イリノイ州）に注文した。製造業者のプロトコルに従って、ｇＢＬＯＣＫをｐｃＤＮＡ３．４プラスミド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）にトポクローニングした。２９３ＦＴ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に、二重特異性抗体ｐｃＤＮＡ３．４プラスミドを、製造元の指示に従ってＴ７５フラスコ中でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してトランスフェクトした。５～７日間のインキュベーション後、培地を回収し、４℃で１０分間３，０００ｇで遠心分離した。製造業者の指示に従って、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｃａｐｔｕｒｅｍ（商標）Ｈｉｓ－Ｔａｇｇｅｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ、マウンテンビュー、カリフォルニア州）を使用して、二重特異性抗体タンパク質を精製した。製造業者の指示に従って、Ｚｅｂａ ｓｐｉｎ ７ｋ ＭＷＣＯ脱塩カラムを使用して、二重特異性抗体タンパク質をＰＢＳに脱塩した。Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅ（商標）Ｐｒｅｃａｓｔ Ｇｅｌｓ（Ｂｉｏｒａｄ、ヘラクレス、カリフォルニア州）を使用して、既知濃度のタンパク質の標準曲線を使用して、二重特異性抗体濃度を定量した。ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ＋Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して、染色されていないゲルをイメージングした。
【0086】
（二重特異性抗体共培養アッセイ）
ＣＯＳ－７細胞に、ＨＬＡ－Ａ３、ＨＬＡ－Ｂ７、ＩＤＨ２（ｗｔ）、ＩＤＨ２（Ｒ１４０Ｑ）、ＫＲＡＳ（ｗｔ）、およびＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｖ）をコードするｐｃＤＮＡ３．１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）プラスミドの様々な組み合わせを、製造元の指示に従ってＴ７５フラスコ中でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してトランスフェクトした。５０，０００個のＴ細胞を、トランスフェクトした３０，０００個のＣＯＳ－７細胞または１０，０００個のＮＣＩ－Ｈ４４１細胞および９６ウェルプレート中の指定濃度の二重特異性抗体と合わせ、共培養物を５％ＣＯ２下で３７℃で２４時間インキュベートした。共培養後、９６ウェルプレートを急速凍結し、馴化培地溶解物を回収し、ＥＬＩＳＡ（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）により分泌ＩＦＮγについてアッセイした。あるいは、共培養後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して標的細胞の生存率を測定した。
ＣＯＳ－７細胞に、ＨＬＡ－Ａ３、ＨＬＡ－Ｂ７、ＩＤＨ２（ｗｔ）、ＩＤＨ２（Ｒ１４０Ｑ）、ＫＲＡＳ（ｗｔ）、およびＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｖ）をコードするｐｃＤＮＡ３．１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）プラスミドの様々な組み合わせを、製造元の指示に従ってＴ７５フラスコ中でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してトランスフェクトした。５０，０００個のＴ細胞を、トランスフェクトした３０，０００個のＣＯＳ－７細胞または１０，０００個のＮＣＩ－Ｈ４４１細胞および９６ウェルプレート中の指定濃度の二重特異性抗体と合わせ、共培養物を５％ＣＯ２下で３７℃で２４時間インキュベートした。共培養後、９６ウェルプレートを急速凍結し、馴化培地溶解物を回収し、ＥＬＩＳＡ（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）により分泌ＩＦＮγについてアッセイした。あるいは、共培養後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して標的細胞の生存率を測定した。
【0087】
（その他の実施形態）
本発明をその詳細な説明と併せて説明したが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例示するものであり、限定するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、および修正は、添付の特許請求の範囲内である。
本発明をその詳細な説明と併せて説明したが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例示するものであり、限定するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、および修正は、添付の特許請求の範囲内である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【図17】