特許 7381525 メタクリル酸およびその誘導体の生物学的製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-11-07

(45)【発行日】2023-11-15

(54)【発明の名称】メタクリル酸およびその誘導体の生物学的製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 7/40 20060101AFI20231108BHJP

   C12P 7/62 20220101ALI20231108BHJP

   C12N 15/53 20060101ALI20231108BHJP

   C12N 15/52 20060101ALI20231108BHJP

   C12N 15/54 20060101ALI20231108BHJP

   C12N 15/55 20060101ALI20231108BHJP

   C12N 9/00 20060101ALI20231108BHJP

   C12N 9/02 20060101ALI20231108BHJP

   C12N 9/10 20060101ALI20231108BHJP

   C12N 9/12 20060101ALI20231108BHJP

   C12N 9/16 20060101ALI20231108BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20231108BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20231108BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20231108BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20231108BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20231108BHJP

【ＦＩ】

C12P7/40

C12P7/62

C12N15/53 ZNA

C12N15/52 Z

C12N15/54

C12N15/55

C12N9/00

C12N9/02

C12N9/10

C12N9/12

C12N9/16

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12M1/00 D

【請求項の数】 52

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2021129068

(22)【出願日】2021-08-05

(62)【分割の表示】P 2017559640の分割

【原出願日】2016-05-18

(65)【公開番号】P2021176338

(43)【公開日】2021-11-11

【審査請求日】2021-09-01

(31)【優先権主張番号】1508582.2

(32)【優先日】2015-05-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(31)【優先権主張番号】1517545.8

(32)【優先日】2015-10-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】500460209

【氏名又は名称】ミツビシ ケミカル ユーケー リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＭＩＴＳＵＢＩＳＨＩ ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＵＫ ＬＩＭＩＴＥＤ

(74)【代理人】

【識別番号】100120891

【弁理士】

【氏名又は名称】林 一好

(74)【代理人】

【識別番号】100165157

【弁理士】

【氏名又は名称】芝 哲央

(74)【代理人】

【識別番号】100205659

【弁理士】

【氏名又は名称】齋藤 拓也

(74)【代理人】

【識別番号】100126000

【弁理士】

【氏名又は名称】岩池 満

(74)【代理人】

【識別番号】100185269

【弁理士】

【氏名又は名称】小菅 一弘

(72)【発明者】

【氏名】イーストハム グラハム ロナルド

(72)【発明者】

【氏名】ステファンズ ジル

(72)【発明者】

【氏名】イアコウメッティ アンドリュー

【審査官】田中 晴絵

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１５／０３１６５３（ＷＯ，Ａ２）

【文献】特開２００５－０６５５８３（ＪＰ，Ａ）

【文献】The Journal of Biological Chemistry，1999年，Vol.274, No.18, Issue of April 30，pp.12715-12721

【文献】The Journal of Biological Chemistry，2007年，Vol.282, No.34，pp.24980-24989

【文献】Acta Cryst.，2004年，D60，p.1125-1128

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｐ １／００－４１／００

Ｃ１２Ｎ１５／００－１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

メタクリル酸および／またはその誘導体を製造する方法であって、
（ａ）リョクトウ（Ｖｉｇｎａ ｒａｄｉａｔａ）からのペルオキシソームアシル－ＣｏＡオキシダーゼ及び／又はアルスロバクター・ニコチアナ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ Ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）からの短鎖アシル－ＣｏＡオキシダーゼの作用により、イソブチリル－ＣｏＡをメタクリリル－ＣｏＡへ生物学的に変換するステップと；
（ｂ）メタクリリル－ＣｏＡをメタクリル酸および／またはその誘導体へ変換するステップと
を含む方法。

【請求項2】

ステップ（ｂ）が生物学的にまたは化学的に実行される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記メタクリル酸のその誘導体がメタクリル酸エステルである、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記メタクリル酸エステルがメタクリル酸ブチルである、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記メタクリル酸エステルがトランスフェラーゼの作用によって生物学的に形成される、請求項３に記載の方法。

【請求項6】

前記トランスフェラーゼが、アルコールアシルトランスフェラーゼである、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記アルコールアシルトランスフェラーゼが、ＥＣグループ番号２．３．１．８４のものである、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記アルコールアシルトランスフェラーゼが果物起源から誘導される、請求項６又は７に記載の方法。

【請求項9】

前記アルコールアシルトランスフェラーゼがアルコールの存在下で作用して、対応するアルキルエステルを形成する、請求項６に記載の方法。

【請求項10】

ステップ（ｂ）で形成されたメタクリル酸をメタクリル酸エステルへ変換するステップ（ｃ）をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。

【請求項11】

ステップ（ｃ）が生物学的にまたは化学的に実行される、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

ステップ（ｃ）がエステラーゼまたはヒドロラーゼの作用によって生物学的に実行される、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

メタクリリル－ＣｏＡが、チオエステラーゼ、トランスフェラーゼ、シンテターゼ、ならびに／またはホスホトランスアシラーゼおよび短鎖脂肪酸キナーゼの作用によってメタクリル酸に変換される、請求項１または２に記載の方法。

【請求項14】

前記チオエステラーゼが、４－ヒドロキシベンゾイル－ＣｏＡチオエステラーゼである、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記４－ヒドロキシベンゾイル－ＣｏＡチオエステラーゼが、ＥＣグループ番号３．１．２．２３のものである、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記チオエステラーゼがＥＣグループ番号３．１．２．Ｘのものであり、前記トランスフェラーゼがＥＣグループ番号２．８．３．ＸのＣｏＡトランスフェラーゼであり、前記シンテターゼがＥＣグループ番号６．２．１．Ｘの酸－チオールシンテターゼであり、前記ホスホトランスアシラーゼがＥＣグループ番号２．３．１．Ｘのものであり、かつ前記短鎖脂肪酸キナーゼがＥＣグループ番号２．７．２．Ｘのものである、請求項１３に記載の方法。

【請求項17】

前記チオエステラーゼが以下の酵素：アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）からのアシル－ＣｏＡチオエステラーゼ４ＨＢＴ、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）ＳＵ株からのアシル－ＣｏＡチオエステラーゼ４ＨＢＴ、アルスロバクター・グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）からのアシル－ＣｏＡチオエステラーゼ４ＨＢＴ、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＣＢＳ－３株からの４ＨＢＴ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）からのＥｎｔＨ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）またはインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）からのＹｃｉＡ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）からのＴｅｓＡまたはＴｅｓＢ、およびマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）からのＦｃｏＴのいずれかから選択され、前記ＣｏＡトランスフェラーゼが以下の酵素：クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．）ＳＢ４からのブチリル－ＣｏＡ：アセトアセテートＣｏＡトランスフェラーゼ、クロストリジウム・スティックランディ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｉｃｋｌａｎｄｉｉ）からのブチリル－ＣｏＡ：アセトアセテートＣｏＡトランスフェラーゼ、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ８２４からのブチレート：アセトアセテートＣｏＡ－トランスフェラーゼ、および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）からのアセテート補酵素ＡトランスフェラーゼｙｄｉＦのいずれかから選択され、前記ホスホトランスアシラーゼがクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ８２４からのホスホトランスブチリラーゼであり、かつ前記短鎖脂肪酸キナーゼが以下の酵素：スピロヘータ（Ｓｐｉｒｏｃｈｅｔｅ）ＭＡ－２からの分枝鎖脂肪酸キナーゼ、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）からのブチレートキナーゼ、および酪酸菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）からのブチレートキナーゼのいずれかから選択される、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

ステップ（ａ）におけるイソブチリル－ＣｏＡからメタクリリル－ＣｏＡへの生物学的変換と、
ステップ（ｂ）が生物学的に実行される場合、ステップ（ｂ）におけるメタクリリル－ＣｏＡからメタクリル酸への生物学的変換とが１種以上の宿主微生物において酵素によって実行される、請求項１に記載の方法、又は、
ステップ（ａ）におけるイソブチリル－ＣｏＡからメタクリリル－ＣｏＡへの生物学的変換と、
ステップ（ｂ）が生物学的に実行される場合、ステップ（ｂ）におけるメタクリリル－ＣｏＡからメタクリル酸への生物学的変換と、
ステップ（ｃ）が生物学的に実行される場合、ステップ（ｃ）におけるステップ（ｂ）で形成されたメタクリル酸からメタクリル酸エステルへの生物学的変換とが１種以上の宿主微生物において酵素によって実行される、請求項１０に記載の方法。

【請求項19】

請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法によるメタクリル酸および／またはその誘導体の製造における使用のための微生物であって、リョクトウ（Ｖｉｇｎａ ｒａｄｉａｔａ）からのペルオキシソームアシル－ＣｏＡオキシダーゼ及び／又はアルスロバクター・ニコチアナ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ Ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）からの短鎖アシル－ＣｏＡオキシダーゼを発現し、４－ヒドロキシベンゾイル－ＣｏＡチオエステラーゼ及び／又はアルコールアシルトランスフェラーゼを発現する微生物。

【請求項20】

（ａ）リョクトウ（Ｖｉｇｎａ ｒａｄｉａｔａ）からのペルオキシソームアシル－ＣｏＡオキシダーゼ及び／又はアルスロバクター・ニコチアナ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ Ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）からの短鎖アシル－ＣｏＡオキシダーゼの発現により、イソブチリル－ＣｏＡをメタクリリル－ＣｏＡへ生物学的に変換するステップと；
（ｂ）メタクリリル－ＣｏＡをメタクリル酸へ生物学的に変換するステップと
を実行することができる組換型微生物であって、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）であり、リョクトウ（Ｖｉｇｎａ ｒａｄｉａｔａ）からのペルオキシソームアシル－ＣｏＡオキシダーゼ及び／又はアルスロバクター・ニコチアナ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ Ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）からの短鎖アシル－ＣｏＡオキシダーゼを発現するように遺伝子組み換えされた組換型微生物。

【請求項21】

（ａ）リョクトウ（Ｖｉｇｎａ ｒａｄｉａｔａ）からのペルオキシソームアシル－ＣｏＡオキシダーゼ及び／又はアルスロバクター・ニコチアナ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ Ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）からの短鎖アシル－ＣｏＡオキシダーゼの発現により、イソブチリル－ＣｏＡをメタクリリル－ＣｏＡへ生物学的に変換するステップと；
（ｂ）メタクリリル－ＣｏＡをメタクリル酸へ生物学的に変換するステップと
を実行することができる組換型微生物であって、リョクトウ（Ｖｉｇｎａ ｒａｄｉａｔａ）からのペルオキシソームアシル－ＣｏＡオキシダーゼ及び／又はアルスロバクター・ニコチアナ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ Ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）からの短鎖アシル－ＣｏＡオキシダーゼを発現するように１種以上の異種核酸によって改質された組換型微生物。

【請求項22】

前記メタクリル酸のその誘導体がメタクリル酸エステルである、請求項１９に記載の微生物。

【請求項23】

前記メタクリル酸エステルがＣ１～Ｃ４アルキルエステルまたはＣ４～Ｃ１２アルキルエステルである、請求項２２に記載の微生物。

【請求項24】

請求項１９～２３のいずれか一項に記載の微生物を使用してメタクリル酸を製造する方法。

【請求項25】

以下の酵素：
（ａ）（ｉ）リョクトウ（Ｖｉｇｎａ ｒａｄｉａｔａ）からのペルオキシソームアシル－ＣｏＡオキシダーゼ及び／又はアルスロバクター・ニコチアナ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ Ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）からの短鎖アシル－ＣｏＡオキシダーゼと；
（ｂ）（ｉ）アシル－ＣｏＡチオエステラーゼ；
（ｉｉ）ＣｏＡトランスフェラーゼ；
（ｉｉｉ）酸－チオールシンテターゼ；
（ｉｖ）ホスホトランスアシラーゼおよび短鎖脂肪酸キナーゼ；
（ｖ）アルコールアシルトランスフェラーゼ
の１種以上と
を発現する、請求項２０または２１に記載の微生物。

【請求項26】

以下の酵素：
（ａ）リョクトウ（Ｖｉｇｎａ ｒａｄｉａｔａ）からのペルオキシソームアシル－ＣｏＡオキシダーゼ及び／又はアルスロバクター・ニコチアナ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ Ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）からの短鎖アシル－ＣｏＡオキシダーゼと；
（ｂ）アシル－ＣｏＡチオエステラーゼと
を発現する、請求項２５に記載の微生物。

【請求項27】

前記アシル－ＣｏＡチオエステラーゼが４ＨＢＴである、請求項２６に記載の微生物。

【請求項28】

前記４ＨＢＴがアルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）からのものである、請求項２７に記載の微生物。

【請求項29】

前記１種以上の酵素を内在的に発現するか、または前記１種以上の酵素を異種的に発現するか、または内在性および異種酵素の組合せを発現する、請求項２０または２２に記載の微生物。

【請求項30】

野生型または組換型微生物のいずれかから選択される、請求項２９に記載の微生物。

【請求項31】

細菌、古細菌、酵母、真菌、藻類または発酵プロセスに適用可能な種々の他の微生物のいずれかから選択される、請求項３０に記載の微生物。

【請求項32】

エシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、パントエア属（Ｐａｎｔｏｅａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、モルガネラ属（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）などのプロテオバクテリアに属する腸内細菌、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）またはミクロバクテリウム属（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に属するいわゆるコリネ型細菌、およびアリサイクロバチルス属（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、桿菌属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ハイドロゲノバクター属（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ）、メタノコックス属（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アクソリゾビウム属（Ａｘｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アゾトバクター属（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、アナプラスマ属（Ａｎａｐｌａｓｍａ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、バルトネラ属（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、カリマトバクテリウム属（Ｃａｌｙｍｍａｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、クラミドフィラ属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コクシエラ属（Ｃｏｘｉｅｌｌａ）、エールリキア属（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）、腸球菌属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、フゾバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ガードネレラ属（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、クレブシエラ属（Ｋｅｌｂｓｉｅｌｌａ）、メタノバクテリウム属（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ミクロコッカス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、モラクセラ属（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、ペプトストレプトコッカス属（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、プレボテーラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、根粒菌属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、ロシャリメア属（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ）、ロティア属（Ｒｏｔｈｉａ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ステノトロホモナス属（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、ボルバキア属（Ｗｏｌｂａｃｈｉａ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）に属する細菌から選択される細菌である、請求項３１に記載の微生物。

【請求項33】

（ａ）リョクトウ（Ｖｉｇｎａ ｒａｄｉａｔａ）からのペルオキシソームアシル－ＣｏＡオキシダーゼ及び／又はアルスロバクター・ニコチアナ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ Ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）からの短鎖アシル－ＣｏＡオキシダーゼの発現により、イソブチリル－ＣｏＡをメタクリリル－ＣｏＡへ生物学的に変換するステップと；
（ｂ）アルコールアシルトランスフェラーゼの発現により、メタクリリル－ＣｏＡをＣ１～Ｃ２０メタクリル酸エステルへ生物学的に変換するステップと
を実行することができる組換型微生物であって、リョクトウ（Ｖｉｇｎａ ｒａｄｉａｔａ）からのペルオキシソームアシル－ＣｏＡオキシダーゼ及び／又はアルスロバクター・ニコチアナ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ Ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）からの短鎖アシル－ＣｏＡオキシダーゼを発現するように遺伝子組み換えされた組換型微生物。

【請求項34】

大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、および／または、前記アルコールアシルトランスフェラーゼが果物起源からのものである、請求項３３に記載の微生物。

【請求項35】

前記アルコールアシルトランスフェラーゼがリンゴ、メロンもしくはトマト起源のものである、請求項３３に記載の微生物。

【請求項36】

メタクリル酸および／またはその誘導体の製造を増強するように遺伝的に改質されている、請求項２０、２１または３３に記載の微生物。

【請求項37】

同じ基質および／もしくは中間体に対して競合することにより、メタクリル酸および／もしくはその誘導体以外の化合物の合成に触媒作用を引き起こす酵素の活性を減少させるかもしくは排除する改質、メタクリル酸を代謝させるか、もしくはメタクリル酸の製造における中間体を代謝させる酵素の活性を減少させるかもしくは排除する改質、ならびに／またはメタクリル酸および／もしくはその誘導体の製造における中間体を除去する他の細胞機能に関与するタンパク質の活性を減少させるかもしくは排除する改質により、遺伝的に改質され得る、請求項２０、２１または３３に記載の微生物。

【請求項38】

前記メタクリル酸のその誘導体がメタクリル酸エステルである、請求項３７に記載の微生物。

【請求項39】

前記メタクリル酸エステルが、Ｃ１～Ｃ４アルキルエステルまたはＣ４～Ｃ１２アルキルエステルである、請求項３８に記載の微生物。

【請求項40】

発酵培地において請求項２０～２３または２５～３９のいずれか一項に記載の１種以上の微生物を培養して、メタクリル酸および／またはその誘導体を製造するステップを含む、発酵の方法。

【請求項41】

前記メタクリル酸のその誘導体がメタクリル酸エステルである、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

前記メタクリル酸エステルがＣ１～Ｃ４アルキルエステルまたはＣ４～Ｃ１２アルキルエステルである、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

請求項２０～２３または２５～３９のいずれか一項に記載の１種以上の微生物を含む発酵培地。

【請求項44】

メタクリル酸および／またはその誘導体をさらに含む、請求項４３に記載の発酵培地。

【請求項45】

前記メタクリル酸のその誘導体がメタクリル酸エステルである、請求項４４に記載の発酵培地。

【請求項46】

前記メタクリル酸エステルが、Ｃ１～Ｃ４アルキルエステルまたはＣ４～Ｃ１２アルキルエステルである、請求項４５に記載の発酵培地。

【請求項47】

請求項２０～２３もしくは２５～３９のいずれか一項に記載の１種以上の微生物および／または請求項４３～４６のいずれか一項に記載の発酵培地を含むバイオリアクター。

【請求項48】

メタクリル酸またはメタクリル酸エステルのポリマーを調製する方法であって、
（ｉ）請求項１～１８または２４のいずれか一項に従ってメタクリル酸および／またはその誘導体を調製するステップと；
（ｉｉ）（ｉ）において調製された前記メタクリル酸および／もしくはその誘導体を重合させて、そのポリマーを製造するステップと
を含む方法。

【請求項49】

メタクリル酸またはメタクリル酸エステルのポリマーまたはコポリマーを調製する方法であって、
（ｉ）請求項１～１８または２４のいずれか一項に従ってメタクリル酸および／またはその誘導体を調製するステップと；
（ｉｉ）（ｉ）において調製された前記メタクリル酸をエステル化して、前記メタクリル酸エステルを製造するステップと；
（ｉｉｉ）（ｉ）において調製された前記メタクリル酸および／もしくはその誘導体、ならびに／または（ｉｉ）において調製された前記エステルを重合させて、そのポリマーまたはコポリマーを製造するステップと
を含む方法。

【請求項50】

前記メタクリル酸および／もしくはその誘導体、ならびに／または前記メタクリル酸エステルを１種以上のコモノマーと重合させて、そのコポリマーを製造するステップと
を含む、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

前記メタクリル酸のその誘導体がメタクリル酸エステルである、請求項４８または４９に記載の方法。

【請求項52】

前記メタクリル酸エステルが、Ｃ１～Ｃ４アルキルエステルまたはＣ４～Ｃ１２アルキルエステルである、請求項５１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、メタクリル酸およびその誘導体の生物学的製造方法に関する。特に、この方法は、メタクリリル－ＣｏＡを介してイソブチリル－ＣｏＡからメタクリル酸を形成するために特定の酵素的変換を使用することと、それから製造されたポリマーまたはコポリマーとに関する。

【背景技術】

【0002】

アクリル酸およびそれらのアルキルエステル、特にメタクリル酸（ＭＡＡ）およびそのメチルエステル、メタクリル酸メチル（ＭＭＡ）は、化学工業において重要なモノマーである。それらの主な用途は、様々な用途のプラスチックの製造である。最も重要な重合用途は、高い光学的透明度のプラスチックを製造するためのポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）のキャスティング、成形または押出である。加えて、多くのコポリマーが使用され、重要なコポリマーは、メタクリル酸メチル、ならびにメタクリル酸エチルと、α－メチルスチレン、アクリル酸エチルおよびアクリル酸ブチルとのコポリマーである。さらに、単純なエステル交換反応により、ＭＭＡは、メタクリル酸ブチル、メタクリル酸ラウリルなどの他のエステルに変換されてもよい。

【0003】

現在、ＭＭＡ（およびＭＡＡ）は、多くの化学的手順によって製造されており、その１つは、ＭＭＡがホルムアルデヒドとの無水反応によってエステル、プロピオン酸メチルから得られる良好な「アルファ法」である。アルファ法において、プロピオン酸メチルは、エチレンのカルボニル化によって製造される。このエチレン供給原料は化石燃料から誘導される。近年、化学工業に関しても持続可能なバイオマス原料を入手することが望ましくなっている。したがって、アルファ法を使用する代わりに、ＭＭＡの代替のバイオマス経路が有利となるであろう。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

したがって、上記課題に取り組み、かつメタクリル酸の製造のための生物学的または部分的に生物学的方法を提供することが本発明の１つの目的である。

【0005】

驚くべきことに、本発明者らは、工業的に適用可能なレベルでのメタクリル酸の形成に関して、以前に考えられなかった新規な酵素基質の組合せを用いる方法を見出した。それにより、ＭＭＡなどの重要なモノマーへの新規かつ実行可能なバイオベースの経路が提供される。

【0006】

メタクリリル－ＣｏＡへのイソブチリル－ＣｏＡの酸化は、バリン分解Ｉ経路において自然発生し、この変換を実行する酵素はいくつかの細胞で観察されることが知られている。これらの系において、この変換は、典型的に、基質の酸化をその後再生されるユビキノンの還元と組み合わせる、対応する電子伝達系を必要とするアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素を使用する。

【0007】

国際公開第２０１４３８２１６号パンフレットは、微生物からのメタクリル酸の製造方法、およびアルコールアシルトランスフェラーゼを使用するエステルへのメタクリリルＣｏＡ変換を記載する。上記文献は、２－オキソイソ吉草酸からイソブチリルＣｏＡへ、かつイソブチリルＣｏＡからメタクリリルＣｏＡへの少量の変換を示す。また、それは、生体内でのメタクリリル－ＣｏＡからのメタクリル酸の理論的な製造を論議するが、これは良好に製造されない。

【0008】

しかしながら、国際公開第２０１４３８２１６号パンフレットにおいて、メタクリル酸の生体内製造の唯一の例は、同属の宿主；ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）細菌において組換え的に発現されたロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）誘導アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼを使用する。異なる宿主生物の緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）において発見された同様のアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼを異種的に発現することを試みる他の例では、メタクリル酸は製造されなかった。宿主生物における異種アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼの発現上昇または発現は達成することが困難であり、依然として報告されていない。

【0009】

したがって、メタクリル酸の改善された製造を提供することが本発明のさらなる目的である。

【0010】

生成物または中間体として、メタクリル酸の製造が生じる周知の代謝経路はない。アシル－ＣｏＡチオエステラーゼ酵素は、構造的に関連する基質の加水分解に触媒作用を引き起こすことが知られているが、これらの酵素は、非常に狭い基質特異性を有する傾向があり、いずれもメタクリリル－ＣｏＡの加水分解に関して試験されていないか、またはメタクリリル－ＣｏＡの加水分解に触媒作用を引き起こさない。さらに、広い基質特異性を有するそれらのより希な変種は、必須細胞チオエステルの非特異的な加水分解のため、発現宿主細胞などの生物系において問題となる可能性が高い。繰り返すが、メタクリリル－ＣｏＡの加水分解に触媒作用を引き起こすものは知られていない。したがって、これらの酵素は、これまでのところ、メタクリル酸の生物学的製造を伴う工業的応用における使用のために実行可能なものとして実証されていない。

【0011】

したがって、上記課題に取り組み、かつ工業的方法で使用することができ、およびイソブチリルＣｏＡをメタクリリルＣｏＡに変換するために作用するいずれの酵素からも独立して使用することができる、メタクリリル－ＣｏＡからメタクリル酸への実行可能な酵素的変換を提供することが本発明のさらなる目的である。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本発明の第１の態様によると、メタクリル酸および／またはその誘導体を製造する方法であって、
（ａ）オキシダーゼの作用により、イソブチリル－ＣｏＡをメタクリリル－ＣｏＡへ生物学的に変換するステップと；
（ｂ）メタクリリル－ＣｏＡをメタクリル酸および／またはその誘導体へ変換するステップと
を含む方法が提供される。

【0013】

本発明の第２の態様によると、メタクリル酸を製造する方法であって、
（ａ）イソブチリル－ＣｏＡをメタクリリル－ＣｏＡへ変換するステップと；
（ｂ）チオエステラーゼ、好適には４－ヒドロキシベンゾイル－ＣｏＡチオエステラーゼ（４ＨＢＴ）、トランスフェラーゼ、シンテターゼ、ならびに／またはホスホトランスアシラーゼおよび短鎖脂肪酸キナーゼの作用により、メタクリリル－ＣｏＡをメタクリル酸へ生物学的に変換するステップと
を含む方法が提供される。

【0014】

好ましくは、本発明の第２の態様の方法において、メタクリリル－ＣｏＡは、チオエステラーゼ、より好ましくは、好適にはＥＣ３．１．２．２３の４－ヒドロキシベンゾイル－ＣｏＡチオエステラーゼ（４ＨＢＴ）の作用により、メタクリル酸に変換される。最も好ましくは、メタクリリル－ＣｏＡは、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）ＳＵ株からのアシル－ＣｏＡチオエステラーゼ４ＨＢＴの作用によってメタクリル酸に変換される。

【0015】

有利には、本発明の方法は、化石燃料への工業的依存を減少させ、かつ持続可能性を増加する、重要な化学物質であるメタクリル酸およびその周知の誘導体を製造するためのさらなる生物学的経路を提供する。

【0016】

この方法により、微生物発酵による再生可能な原料からイソブチリル－ＣｏＡへの容易な変換が可能となり、かつステップ（ａ）および（ｂ）に触媒作用を引き起こす酵素の同時発現により、ＭＡＡへの直接的な微生物発酵経路が提供されるであろう。

【0017】

なおさらに、この方法は、メタクリル酸の製造のためには、以前に考えられず、また自然発生バリン経路において見出されなかったステップ（ａ）または（ｂ）のいずれかに関する酵素を使用する。特に、ステップ（ａ）のための酵素は、関連する電子伝達系を必要とせずにイソブチリルＣｏＡをメタクリリルＣｏＡに変換するように作用し、かつステップ（ｂ）のための酵素は、メタクリリルＣｏＡに対して高い基質特異性を有し、宿主生物におけるこの中間体の蓄積の問題が回避される。したがって、ステップ（ａ）または（ｂ）の酵素のいずれも、メタクリル酸を形成するための部分的な化学的手順を改善するため、またはメタクリル酸を形成するための生物学的方法を改善するために単独で使用され得る。あるいは、ステップ（ａ）および（ｂ）の両方の酵素は、異種宿主生物において機能的である、工業的に適用可能なレベルまでメタクリル酸を製造するための独立型の生物学的方法を形成するために一緒に使用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】基質としてメタクリリルＣｏＡを用いた、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）ＳＵからのカルボキシ末端ヘキサヒスチジンタグ付け４－ヒドロキシベンゾイル－ＣｏＡチオエステラーゼ（７５μｇ．ｍｌ^－１）の動力学的特徴に関するラインウィーバー＝バーク（Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ－Ｂｕｒｋｅ）プロットを示す。

【図2】基板としてイソブチリルＣｏＡを用いた、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）ＳＵからのカルボキシ末端ヘキサヒスチジンタグ付け４－ヒドロキシベンゾイル－ＣｏＡチオエステラーゼ（１ｍｇ．ｍｌ^－１）の動力学的特徴に関するラインウィーバー＝バーク（Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ－Ｂｕｒｋｅ）プロットを示す。

【図3】イソブチリル－ＣｏＡからメタクリリル－ＣｏＡへの酸化に関して、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）からの短鎖アシル－ＣｏＡオキシダーゼ（ＡＣＸ４）の生体外活性を決定するためにＨＰＬＣ方法を使用する、標準イソブチリル－ＣｏＡ（３２．２分に主要ピークおよび３２．９分にマイナーピーク）、メタクリリル－ＣｏＡ（３０．８分に主要ピークおよび３１．６分にマイナーピーク）、メタクリル酸（１３．５分にピーク）および補酵素Ａ（１１分に主要ピークおよび１２分にマイナーピーク）のオーバーレイドＨＰＬＣトレースを示す。フラビンアデニンジヌクレオチドを２７．８分において溶出し、かつイソブチリル－ＣｏＡおよびメタクリリル－ＣｏＡの内標準として使用した。

【図4】ＨＥＰＥＳアッセイ緩衝液中にＡＣＸ４無細胞抽出液、カルボキシ末端ヘキサヒスチジンタグ付け４ＨＢＴおよびフラビンアデニンジヌクレオチドを含有するが、基質は添加されていない、陰性対照としてのアッセイ混合物のＨＰＬＣトレースを示す。

【図5】フラビンアデニンジヌクレオチドを含有するＨＥＰＥＳアッセイ緩衝液中での、イソブチリル－ＣｏＡと一緒のＡＣＸ４の無細胞抽出液の３０分インキュベーション後のアッセイ混合物のＨＰＬＣ分析を示す。

【図6】反応混合物が酸性化によって停止された後、追加のイソブチリル－ＣｏＡが添加された、フラビンアデニンジヌクレオチドを含有するＨＥＰＥＳアッセイ緩衝液中での、イソブチリル－ＣｏＡと一緒のＡＣＸ４の無細胞抽出液の３０分インキュベーション後のアッセイ混合物のＨＰＬＣ分析を示す。

【図7】ＡＣＸ４無細胞抽出液および精製されたカルボキシ末端Ｈｉｓタグ付け４ＨＢＴによる、イソブチリルＣｏＡからメタクリル酸および補酵素Ａへの変換に関する酵素結合反応のＨＰＬＣ分析を示す。

【図8】ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴ－ＡＣＸ－ＡｃｓＡプラスミドを示す。ｐＥＴ２０ｂ（＋）プラスミドは、全て単一Ｔ７促進因子の制御下で４ＨＢＴ遺伝子、ＡＣＸ４遺伝子およびＡｃｓＡ遺伝子を含有する。

【図9】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４－ＡｃｓＡ４によるＨＢＴ、ＡＣＸ４およびＡｃｓＡ同時発現のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。

【図10】２０．５時間の誘導後のイソ酪酸からメタクリル酸への生体内変換および全ての関連する対照の分析のために実行されたＨＰＬＣトレースを示す。 図１０Ａは、イソ酪酸が添加されない、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４－ＡｃｓＡの培養のために実行されたトレースを示す。 図１０Ｂは、イソ酪酸が添加されない、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）の培養を示す。 図１０Ｃは、イソ酪酸の５ｍＭ標準のＨＰＬＣトレースを示す。 図１０Ｄは、組換型タンパク質発現の誘導の１時間後にイソ酪酸（５ｍＭ）が補充された、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）の培養のＨＰＬＣトレースを示す。 図１０Ｅは、イソ酪酸（５ｍＭ）およびメタクリル酸（２００μＭ）標準のカクテルのＨＰＬＣトレースを示す。 図１０Ｆは、組換型タンパク質発現の誘導の１時間後にイソ酪酸（５ｍＭ）が添加された、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４－ＡｃｓＡ培養のＨＰＬＣトレースを示す。

【図11】イソ酪酸が補充された、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４－ＡｃｓＡ培養における経時的なメタクリル酸濃度の変化（底部ライン）、ならびにイソ酪酸が培養物に添加されたときからの経時的な培養物のｌｎ（ＯＤ_６００）（上部ライン）を示す。

【図12】ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４－ｐｐＢＣＫＤプラスミドを示す。ｐＥＴ２０ｂ（＋）プラスミドは、全て単一Ｔ７促進因子の制御下でアルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）ＳＵ株からの４ＨＢＴ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）からのＡＣＸ４をコード化する最適化遺伝子、ならびにシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０からのｂｋｄＡ１、ｂｋｄＡ２、ｂｋｄＢおよびｌｐｄＶ遺伝子を有する。

【図13】２－ケトイソ吉草酸（５ｍＭ）、イソ酪酸（５ｍＭ）およびメタクリル酸（２００μＭ）標準のカクテルのＨＰＬＣ分析を示す。それにより、成分は、１ｍｌ．分^－１の流速において、ＨＣｌによってｐＨ２．５に酸化された５０ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４中１４％のアセトニトリルを使用して定組成溶出によって分離された。

【図14】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）陰性対照株の培養のＨＰＬＣ分析を示す。それにより、成分は、１ｍｌ．分^－１の流速において、ＨＣｌによってｐＨ２．５に酸化された５０ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４中１４％のアセトニトリルを使用して定組成溶出によって分離された。

【図15】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４－ｐｐＢＣＫＤの培養のＨＰＬＣ分析を示す。それにより、成分は、１ｍｌ．分^－１の流速において、ＨＣｌによってｐＨ２．５に酸化された５０ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４中１４％のアセトニトリルを使用して定組成溶出によって分離された。グルコースからのメタクリル酸の製造を実証する。

【図16】追加的な０．２４ｍＭ標準メタクリル酸が添加された、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４－ｐｐＢＣＫＤの培養の試料のＨＰＬＣ分析を示す。それにより、成分は、１ｍｌ．分^－１の流速において、ＨＣｌによってｐＨ２．５に酸化された５０ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４中１４％のアセトニトリルを使用して定組成溶出によって分離された。

【図17】２－ケトイソ吉草酸が補充された、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）陰性対照株の培養のＨＰＬＣ分析を示す。それにより、成分は、１ｍｌ．分^－１の流速において、ＨＣｌによってｐＨ２．５に酸化された５０ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４中１４％のアセトニトリルを使用して定組成溶出によって分離された。

【図18】２－ケトイソ吉草酸（５ｍＭ）が補充された、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４－ｐｐＢＣＫＤの培養のＨＰＬＣ分析を示す。それにより、成分は、１ｍｌ．分^－１の流速において、ＨＣｌによってｐＨ２．５に酸化された５０ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４中１４％のアセトニトリルを使用して定組成溶出によって分離された。２－ケトイソ吉草酸を培養物に補充することにより、この株によるメタクリル酸の製造が上昇することを実証する。

【図19】２－ケトイソ吉草酸（５ｍＭ）が補充され、追加的な０．２４ｍＭ標準メタクリル酸が添加された、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４－ｐｐＢＣＫＤの培養の試料のＨＰＬＣ分析を示す。それにより、成分は、１ｍｌ．分^－１の流速において、ＨＣｌによってｐＨ２．５に酸化された５０ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４中１４％のアセトニトリルを使用して定組成溶出によって分離された。

【図20】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＡＣＸ４タンパク質の発現のためのプラスミドｐＭＭＡ１２１の構造を示す。

【図21】実施例５の組換型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から製造されたシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＡＣＸ４タンパク質を使用する、イソブチリル－ＣｏＡからのメタクリリル－ＣｏＡの製造を示す。

【図22】シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＡＣＸ４タンパク質を含有する、実施例５の組換型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のフラクションのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。

【図23】組換型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるリンゴＡＡＴ（ＭｐＡＡＴ１）、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）からのＡＣＸ４、ならびに緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡ０１株からのｂｋｄＡ１、ｂｋｄＡ２、ｂｋｄＢおよびｌｐｄＶ：ＢＣＫＡＤ複合遺伝子の発現のためのプラスミドｐＷＡ００８、ｐＭＭＡ１３３およびｐＭＭＡ１３４の構造を示す。

【図24】プラスミドｐＭＭＡ１３４を発現する組換型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）製造の培養の試料のＨＰＬＣ分析による、２－ケトイソバレレートおよびブタノールからメタクリル酸ブチルの製造を示す。

【発明を実施するための形態】

【0019】

酵素
本発明に関連して、「生物学的に」とは、生物学的触媒を使用することを意味する。好ましくは、生物学的触媒は酵素であるが、生物学的供給源から誘導されたいずれの触媒的構造も含まれ得る。

【0020】

本発明に関連して、「化学的に」とは、酵素などの生物学的触媒を使用すること以外に化学的手段を使用することを意味する。

【0021】

第１の態様に関して、ステップ（ｂ）は、生物学的にまたは化学的に、好ましくは生物学的に実行され得る。

【0022】

第２の態様に関して、ステップ（ａ）は、生物学的にまたは化学的に、好ましくは生物学的に実行され得る。

【0023】

好ましくは、ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）は、生物学的触媒として作用する１種以上の酵素を使用して酵素的に実行される。

【0024】

好ましくは、オキシダーゼは、ＥＣ番号１．３．ｘ．ｘのＣＨ－ＣＨ結合において作用するオキシダーゼであり、より好ましくはＥＣ番号ＥＣ１．３．３．ｘの、電子受容体として酸素を使用する、ＣＨ－ＣＨ結合において作用するオキシダーゼである。更により好ましくは、オキシダーゼは、好適にはＥＣ番号ＥＣ１．３．３．６のアシル－ＣｏＡオキシダーゼである。より好ましくは、アシル－ＣｏＡオキシダーゼは、以下の酵素のいずれかから選択される：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）からのＡＣＸ４、アルスロバクター・ニコチアナ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ Ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）からの短鎖アシル－ＣｏＡオキシダーゼ、リョクトウ（Ｖｉｇｎａ ｒａｄｉａｔａ）からのペルオキシソームアシル－ＣｏＡオキシダーゼ、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐ．）からのアシル－ＣｏＡオキシダーゼおよびカンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）からのアシル－ＣｏＡオキシダーゼ４。最も好ましくは、アシル－ＣｏＡオキシダーゼは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）からのＡＣＸ４である。

【0025】

あるいは、イソブチリル－ＣｏＡは、好適にはＥＣグループ番号１．Ｘ．Ｘ．Ｘのオキシドレダクターゼの作用によってメタクリリル－ＣｏＡに変換され得る。好ましくは、オキシドレダクターゼは、好適にはＥＣ１．３．Ｘ．Ｘの、電子供与体のＣＨ－ＣＨ基において作用するオキシドレダクターゼである。より好ましくは、供与体のＣＨ－ＣＨ基に作用するオキシドレダクターゼは、ＦＡＤ依存型オキシドレダクターゼであり、更により好ましくは、オキシドレダクターゼは、ＥＣ１．３．８．ＸのＣｏＡデヒドロゲナーゼである。更により好ましくは、オキシドレダクターゼは、好適にはＥＣ１．３．８．１の短鎖アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ＥＣ１．３．８．４のイソバレリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、好適にはＥＣ１．３．８．５の２－メチル－分枝鎖アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、またはイソブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼなど、好適にはＥＣグループ１．３．８．－のアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼである。最も好ましくは、オキシドレダクターゼは、以下の酵素のいずれかから選択される：シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）からの短鎖／分枝鎖アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）からのイソブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）からのイソバレリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ。

【0026】

ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素は、一般に、基質の酸化をその後再生されるユビキノンの還元と組み合わせる、対応する電子伝達系を必要とするであろう。そのような電子伝達系は、電子伝達フラビンタンパク質（ＥＴＦ）および電子伝達フラビンタンパク質ユビキノンオキシドレダクターゼ（ＥＴＦＱＯ）からなる。ＥＴＦは、アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素およびＥＴＦＱＯの両方と共存可能でなければならない。したがって、アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼが使用さる実施形態において、以下の再生系の１つが好ましく利用される。

【0027】

一実施形態において、例えば、イソブチリル－ＣｏＡは、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）の場合など、イソブチリル－ＣｏＡおよびその関連する電子伝達系において活性を有する、内在性ＣｏＡデヒドロゲナーゼを含む宿主微生物を使用してメタクリリル－ＣｏＡに変換される。

【0028】

第２の実施形態において、イソブチリル－ＣｏＡは、異種ＣｏＡデヒドロゲナーゼと同じ生物からの電子伝達系のタンパク質を伴う異種ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素の作用により、宿主生物においてメタクリリル－ＣｏＡに変換される。例えば、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、パラコッカス・デニトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）またはシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）からのＣｏＡデヒドロゲナーゼおよび電子伝達系成分は、全て大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（または別の宿主生物）で発現した。

【0029】

第３の実施形態において、イソブチリル－ＣｏＡは、また異なる微生物からの電子伝達系成分を伴う異種ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素の作用により、宿主生物においてメタクリリル－ＣｏＡに変換され、それにより、それらの成分は互いにかつＣｏＡデヒドロゲナーゼと共存可能である。例えば、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）からのＣｏＡデヒドロゲナーゼは、イノシシ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ）の電子伝達フラビンタンパク質と共存可能であり、これは、次にロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）からの電子伝達フラビンタンパク質ユビキノンオキシドレダクターゼと共存可能である。あるいは、シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）のＥＴＦ－ユビキノンオキシドレダクターゼは、Ｒ．スフェロイデス（Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）のＥＴＦ－ユビキノンオキシドレダクターゼとの良好な配列同族体を有するため、シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）のイソバレリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼおよびＥＴＦは、イソブチリル－ＣｏＡの酸化に関して、Ｒ．スフェロイデス（Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）からのＥＴＦ－ユビキノンオキシドレダクターゼとの機能系を形成することが可能であろう。最終的に、ヒトまたはブタＥＴＦとのＰ．デニトリフィカンス（Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ＥＴＦの類似性のため、パラコッカス・デニトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）からのＥＴＦおよびＥＴＦ－ユビキノンオキシドレダクターゼは、ヒトなどの別の供給源からのイソブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼまたは異なる生物からの相同体と共存可能であることが予想される。

【0030】

好ましくは、メタクリリル－ＣｏＡは、好適にはＥＣ３．１．２．Ｘの（チオエステラーゼとしても知られている）チオエステルヒドロラーゼの作用によってメタクリル酸に変換される。更により好ましくは、酵素は、好適にはＥＣ３．１．２．２０のアシルＣｏＡチオエステラーゼ、好適にはＥＣ３．１．２．４の３－ヒドロキシイソブチル－ＣｏＡヒドロラーゼ、好適にはＥＣ３．１．２．１８のＡＤＰ依存アシル－ＣｏＡチオエステラーゼ、好適にはＥＣ３．１．２．２３の４－ヒドロキシベンゾイル－ＣｏＡチオエステラーゼ、または例えば、サリシロイル－ＣｏＡチオエステラーゼなど、好適にはＥＣ３．１．２．－のチオエステラーゼである。より好ましくは、チオエステラーゼは、以下の酵素のいずれかから選択される：アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）ＳＵ株からの４ＨＢＴ、アルスロバクター・グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）からの４ＨＢＴ、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＣＢＳ－３株からの４ＨＢＴ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）からのＥｎｔＨ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのＹｃｉＡ、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）からのＹｃｉＡ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）からのＴｅｓＡまたは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）からのＴｅｓＢ、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）からのＦｃｏＴ。更により好ましくは、チオエステラーゼは、アシル－ＣｏＡチオエステラーゼである。更により好ましくは、チオエステラーゼは、好適にはＥＣ３．１．２．２３の４－ヒドロキシベンゾイル－ＣｏＡのチオエステラーゼである。最も好ましくは、アシル－ＣｏＡチオエステラーゼは、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）ＳＵ株からの４ＨＢＴである。

【0031】

したがって、一実施形態において、イソブチリル－ＣｏＡは、オキシダーゼの作用によってメタクリリル－ＣｏＡに変換され得、かつメタクリリル－ＣｏＡは、好適にはＥＣ３．１．２．２３の４－ヒドロキシベンゾイル－ＣｏＡのチオエステラーゼ、より好ましくはアルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）ＳＵ株からのアシル－ＣｏＡチオエステラーゼ４ＨＢＴの作用によってメタクリル酸に変換され得る。

【0032】

一実施形態において、イソブチリル－ＣｏＡは、好適にはＥＣグループ番号１．３．３．６のアシル－ＣｏＡオキシダーゼ、より好ましくはシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）からのＡＣＸ４の作用によってメタクリリル－ＣｏＡに変換され得、かつメタクリリル－ＣｏＡは、好適にはＥＣ３．１．２．２３の４－ヒドロキシベンゾイル－ＣｏＡチオエステラーゼ、より好ましくはアルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）ＳＵ株からのアシル－ＣｏＡチオエステラーゼ４ＨＢＴの作用によってメタクリル酸に変換され得る。

【0033】

あるいは、メタクリリル－ＣｏＡは、以下の酵素的経路の１つの作用によってメタクリル酸に変換され得る。

【0034】

一実施形態において、メタクリリル－ＣｏＡは、好適にはＥＣグループ番号２．Ｘ．Ｘ．Ｘのトランスフェラーゼの作用によってメタクリル酸に変換される。好ましくは、トランスフェラーゼは、好適にはＥＣグループ番号２．８．Ｘ．Ｘの、硫黄含有基を転移するトランスフェラーゼである。より好ましくは、トランスフェラーゼは、好適にはＥＣグループ番号２．８．３．ＸのＣｏＡ－トランスフェラーゼである。更により好ましくは、トランスフェラーゼは、それぞれ好適にはＥＣグループ番号２．８．３．８および２．８．３．９のアセテート依存アシル－ＣｏＡトランスフェラーゼまたはアセトアセテート依存ブチリック－ＣｏＡトランスフェラーゼである。最も好ましくは、トランスフェラーゼは以下の酵素のいずれかから選択される：クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．）ＳＢ４からのブチリル－ＣｏＡ：アセトアセテートＣｏＡトランスフェラーゼ、クロストリジウム・スティックランディ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｉｃｋｌａｎｄｉｉ）からのブチリル－ＣｏＡ：アセトアセテートＣｏＡトランスフェラーゼ、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ８２４からのブチレート：アセトアセテートＣｏＡ－トランスフェラーゼ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）からのアセテート補酵素ＡトランスフェラーゼｙｄｉＦ。

【0035】

当該技術分野において理解されるように、本明細書で使用される場合、リガーゼ、シンテターゼおよびシンターゼという用語は互換的に使用される。

【0036】

第２の実施形態において、メタクリリル－ＣｏＡは、好適にはＥＣグループ番号６．Ｘ．Ｘ．Ｘの、逆方向に作用するシンテターゼの作用によってメタクリル酸に変換される。好ましくは、シンテターゼは、好適にはＥＣグループ番号６．２．Ｘ．Ｘの炭素－硫黄結合形成シンテターゼである。より好ましくは、シンテターゼは、好適にはＥＣグループ番号６．２．１．Ｘの酸－チオールリガーゼである。最も好ましくは、シンテターゼは、好適にはＥＣ６．２．１．４のＧＤＰ形成スクシネート－ＣｏＡシンテターゼ、ＥＣ６．２．１．５のＡＤＰ形成スクシネート－ＣｏＡシンテターゼ、ＥＣ６．２．１．６のＡＤＰ形成グルタレート－ＣｏＡシンテターゼ、ＥＣ６．２．１．９のＡＤＰ形成マレエート－ＣｏＡシンテターゼ、ＥＣ６．２．１．１０のＧＤＰ形成カルボン酸－ＣｏＡシンテターゼ、ＥＣ６．２．１．１３のＡＤＰ形成アセテート－ＣｏＡシンテターゼ、またはＥＣ６．２．１．１８のＡＤＰ形成シトレート－ＣｏＡシンテターゼなどの可逆性ＡＤＰまたはＧＤＰ形成アシル－ＣｏＡリガーゼである。

【0037】

第３の実施形態において、メタクリリル－ＣｏＡは、ＥＣグループ番号ＥＣ２．Ｘ．Ｘ．Ｘ、より好ましくはＥＣグループ番号ＥＣ２．３．Ｘ．Ｘ、更により好ましくはＥＣ２．３．１．Ｘ、最も好ましくはＥＣグループ番号２．３．１．８または２．３．１．１９のホスホトランスアシラーゼまたはホスホトランスブチリラーゼと同種であるホスホトランスアシラーゼと、ＥＣグループ番号ＥＣ２．Ｘ．Ｘ．Ｘ、好ましくはＥＣ２．７．Ｘ．Ｘ、より好ましくはＥＣ２．７．２．Ｘの短鎖脂肪酸キナーゼ、最も好ましくはＥＣ２．７．２．１のアセテートキナーゼ、ＥＣ２．７．２．６のホルメートキナーゼ、ＥＣ２．７．２．７のブチレートキナーゼ、ＥＣ２．７．２．１４の分枝鎖脂肪酸キナーゼまたはＥＣ２．７．２．１５のプロピオネートキナーゼとの組み合わせた作用によってメタクリル酸に変換される。好ましくは、ホスホトランスアシラーゼは、メタクリリル－ＣｏＡホスホトランスアシラーゼである。好ましくは、短鎖脂肪酸キナーゼは、可逆性メタクリル酸キナーゼである。最も好ましくは、ホスホトランスアシラーゼは、以下の酵素のいずれかから選択される：クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ８２４からのホスホトランスブチリラーゼ。最も好ましくは、短鎖脂肪酸キナーゼは、以下の酵素のいずれかから選択される：スピロヘータ（Ｓｐｉｒｏｃｈｅｔｅ）ＭＡ－２からの分枝鎖脂肪酸キナーゼ、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）からのブチレートキナーゼ、酪酸菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）からのブチレートキナーゼ。

【0038】

本発明に関連して、「その誘導体」という用語は、そのエステル、そのアシルハライド、その無水物、そのアミド、そのニトリル、そのラクトン、その塩、その複合体、その異性体、そのオリゴマーもしくはポリマー、およびさらにこれらのいずれかの置換体など、メタクリリルＣｏＡまたはメタクリル酸のいずれかに直接関連するか、またはそれを含むいずれかの化学物質を意味し、より好ましくは、それはエステルまたはその塩を意味する。

【0039】

好ましくは、メタクリル酸のその誘導体は、メタクリル酸エステルである。好ましくは、メタクリル酸エステルは、メタクリル酸アルキル、より好ましくはメタクリル酸低級アルキル（Ｃ１～Ｃ２０）、更により好ましくはメタクリル酸Ｃ１～Ｃ１２アルキル、特にメタクリル酸メチル、エチルまたはブチルなどのメタクリル酸Ｃ１～Ｃ４アルキルまたはメタクリル酸Ｃ４～Ｃ１２アルキルである。最も好ましくは、メタクリル酸エステルは、メタクリル酸ブチル、例えばメタクリル酸ｎ－ブチルである。

【0040】

メタクリル酸エステルは、好ましくは、ＥＣグループ番号ＥＣ２．Ｘ．Ｘ．Ｘのトランスフェラーゼ酵素、より好ましくはＥＣグループ番号２．３．Ｘ．Ｘのアシルトランスフェラーゼ、更により好ましくはＥＣグループ番号ＥＣ２．３．１．８４のアルコールアシルトランスフェラーゼの作用により、メタクリリル－ＣｏＡから生物学的に形成され得る。

【0041】

好ましくは、メタクリル酸エステルがメタクリリル－ＣｏＡから生物学的に形成される場合、メタクリリル－ＣｏＡは、オキシダーゼの作用によってイソブチリル－ＣｏＡから生物学的に形成される。

【0042】

したがって、本発明の第３の態様によると、メタクリル酸エステルを製造する方法であって、
（ａ）オキシダーゼの作用により、イソブチリル－ＣｏＡをメタクリリル－ＣｏＡへ生物学的に変換するステップと；
（ｂ）アルコールアシルトランスフェラーゼの作用により、メタクリリル－ＣｏＡをメタクリル酸エステルへ変換するステップと
を含む方法が提供される。

【0043】

好ましくは、第３の態様のオキシダーゼは、ＥＣ番号１．３．ｘ．ｘのＣＨ－ＣＨ結合において作用するオキシダーゼであり、より好ましくはＥＣ番号ＥＣ１．３．３．ｘの、電子受容体として酸素を使用する、ＣＨ－ＣＨ結合において作用するオキシダーゼである。更により好ましくは、オキシダーゼは、好適にはＥＣ番号ＥＣ１．３．３．６のアシル－ＣｏＡオキシダーゼである。より好ましくは、アシル－ＣｏＡオキシダーゼは、以下の酵素のいずれかから選択される：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）からのＡＣＸ４、アルスロバクター・ニコチアナ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）からの短鎖アシル－ＣｏＡオキシダーゼ、リョクトウ（Ｖｉｇｎａ ｒａｄｉａｔａ）からのペルオキシソームアシル－ＣｏＡオキシダーゼ、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐ．）からのアシル－ＣｏＡオキシダーゼおよびカンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）からのアシル－ＣｏＡオキシダーゼ４。最も好ましくは、アシル－ＣｏＡオキシダーゼは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）からのＡＣＸ４である。

【0044】

好ましくは、第３の態様のメタクリル酸エステルは、メタクリル酸アルキル、より好ましくはメタクリル酸低級アルキル（Ｃ１～Ｃ２０）、更により好ましくはメタクリル酸Ｃ１～Ｃ１２アルキル、特にメタクリル酸メチル、エチルまたはブチルなどのメタクリル酸Ｃ１～Ｃ４アルキルまたはメタクリル酸Ｃ４～Ｃ１２アルキルである。最も好ましくは、メタクリル酸エステルは、メタクリル酸ブチル、例えばメタクリル酸ｎ－ブチルである。

【0045】

好適には、アルコールアシルトランスフェラーゼは、アルコールまたはフェノール、好ましくは直鎖または分枝鎖Ｃ１～２０未置換アルコール、アラルキルアルコールまたはフェノール、特に好ましくはメタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール、ｎ－ブタノール、イソブチルアルコール、ｓｅｃ－ブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、ｎ－ペンチルアルコール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ－ペンチルアルコール、ｎ－ヘキシルアルコール、イソヘキシルアルコール、２－ヘキシルアルコール、ジメチルブチルアルコール、エチルブチルアルコール、ヘプチルアルコール、オクチルアルコール、２－エチルヘキシルアルコールなどのＣ１～８またはＣ１～４アルキルアルコール；ベンジルアルコールまたはフェノールの存在下で作用する。好ましくは、アルコールアシルトランスフェラーゼは、アルコール、より好ましくはＣ１～Ｃ１２アルコール、より好ましくはＣ１～Ｃ４またはＣ４～Ｃ１２アルコールの存在下で、更により好ましくはｎ－ブタノール、イソブチルアルコール、ｓｅｃ－ブタノールまたはｔｅｒｔ－ブタノールなどのブタノールの存在下で作用する。最も好ましくは、アルコールアシルトランスフェラーゼはｎ－ブタノールの存在下で作用する。

【0046】

本明細書中、アルコールという用語は、ヒドロキシル基（－ＯＨ基）を有し、メタクリレートとエステル基を形成することができる種を意味する。好ましくは、アルコールは、Ｃ１～Ｃ２０アルカノール、より好ましくはＣ１～Ｃ１２アルカノール、更により好ましくはＣ１～Ｃ４アルカノールまたはＣ４～Ｃ１２アルカノール、最も好ましくはＣ４アルカノールであり得る。

【0047】

好ましくは、アルコールアシルトランスフェラーゼは、植物起源から誘導され、より好ましくは、植物は、ショウガ目（Ｚｉｎｇｉｂｅｒａｌｅｓ）、バラ目（Ｒｏｓａｌｅｓ）、ツツジ目（Ｅｒｉｃａｌｅｓ）、ウリ目（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｌｅｓ）、アブラナ目（Ｂｒａｓｓｉｃａｌｅｓ）およびクスノキ目（Ｌａｕｒａｌｅｓ）からなる群から選択されるいずれかの目に属し；更により好ましくは、植物は、バショウ科（Ｍｕｓａｃｅａｅ）、バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）、ツツジ科（Ｅｒｉｃａｃｅａｅ）、マタタビ科（Ａｃｔｉｎｉｄｉａｃｅａｅ）、ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）、パパイヤ科（Ｃａｒｉｃａｃｅａｅ）およびクスノキ科（Ｌａｕｒａｃｅａｅ）からなる群から選択されるいずれかの科に属し；更により好ましくは、植物は、バショウ属（Ｍｕｓａ）、オランダイチゴ属（Ｆｒａｇａｒｉａ）、リンゴ属（Ｍａｌｕｓ）、サクラ属（Ｐｒｕｎｕｓ）、ナシ属（Ｐｙｒｕｓ）、スノキ属（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ）、マタタビ属（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ）、キュウリ属（Ｃｕｃｕｍｉｓ）、パパイヤ属（Ｃａｒｉｃａ）およびワニナシ属（Ｐｅｒｓｅａ）からなる群から選択されるいずれかの属に属し；更により好ましくは、植物は、バナナ、イチゴ、リンゴ、ウメ（Ｐｒｕｎｕｓ ｍｕｍｅ）、セイヨウナシ（Ｐｙｒｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、ブルーベリー、キウィ、メロン、パパイヤおよびアボカドからなる群から選択されるいずれか１つである。最も好ましくは、アルコールアシルトランスフェラーゼは、リンゴ、メロンまたはトマト起源などの果物起源、好適にはリンゴ起源から誘導される。

【0048】

アルコールアシルトランスフェラーゼが存在する生物学的組織または加工されたその製品、例えば、果物、葉、花弁、茎、種、果皮、果肉などが使用され得る。あるいは、これらの生物学的組織から抽出された粗酵素液、精製された酵素などが使用され得る。あるいは、アルコールアシルトランスフェラーゼに関する遺伝子が単離され得、かつその中での発現のための宿主微生物に導入され得る。

【0049】

メタクリリルＣｏＡをメタクリル酸エステルに変換するためのアルコールアシルトランスフェラーゼの使用、特にアルコールアシルトランスフェラーゼ遺伝子およびその配列、ならびに前記配列を含むベクトルプラスミドは、参照によりその開示が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４／０３８２１４号パンフレットに詳細に記載されている。

【0050】

さらなる方法ステップ
任意選択的に、本発明の第１または第２の態様は、ステップ（ｂ）で形成されたいずれかのメタクリル酸をメタクリル酸エステルへ変換するステップ（ｃ）をさらに含み得る。

【0051】

好ましくは、メタクリル酸エステルは、メタクリル酸アルキル、より好ましくはメタクリル酸低級アルキル（Ｃ１～Ｃ２０）、より好ましくはメタクリル酸Ｃ１～Ｃ１２アルキル、更により好ましくはメタクリル酸Ｃ１～Ｃ４またはＣ４～Ｃ１２アルキルである。最も好ましくは、メタクリル酸エステルは、メタクリル酸ブチルである。

【0052】

ステップ（ｃ）で形成されたメタクリル酸エステルは、生物学的にまたは化学的に形成され得、好ましくは、それらは生物学的に形成される。

【0053】

任意選択的に、ステップ（ｃ）は、適切なアルコールとのエステル化反応によって化学的に実行され得る。エステル化が実行される反応条件は非常に様々であり得る。反応は、室温で非常にゆっくり進むが、高温で非常に急速に進む。典型的に、反応物の１つは、反応を促進するために化学量論的過剰量で使用される。他の反応物は限界試薬と呼ばれる。約９９％の限界試薬、例えば、酸、アルコールまたはポリオールは、数時間以内にエステルに変換され得る。限界試薬は、典型的に、化学量論的過剰量で存在しない試薬であり、例えば、ポリオールエステルを製造するために使用される限界試薬はポリオールである。

【0054】

エチルアルコールおよび有機酸のエステル化は可逆反応であるため、エステル化反応は、通常、完了しない。しかしながら、エステル化生成物の少なくとも１つ、典型的に水を除去することにより、９９％超の変換を達成することができる。生成物の１つが他のものおよび試薬より低い温度で沸騰する場合、この除去は典型的に蒸留によって達成される。製造された水を反応ゾーンから除去するための種々の蒸留技術が当該技術分野において知られている。水の除去方法の１つは、反応のいずれかまたはそれぞれの成分の沸点より低い沸点を有する共沸混合物を形成し得る液体媒体中で反応を実行することを含む。試薬および得られるエステルが大気圧において１００℃より高い沸点を有する場合、水を除去するために反応温度を単純に調節することができ、かつ水と共沸混合物を形成することができる液体媒体は必要とされない。加えて、反応混合物からの水の蒸留を補助するために共沸剤が使用され得る。シクロヘキサン、ヘキサン、ベンゼン、トルエンまたはキシレンなどの不活性材料は、エステルの製造において共沸剤として使用され得る。加えて、より低い沸点を有する反応物も共沸剤として利用され得る。この後者の場合、共沸剤として使用される反応物は、典型的に、反応のために必要とされる理論量よりも過剰に反応混合物中に装填される。水除去の利用を含むエステル化方法は、バッチまたは連続モードの操作において実行され得る。種々のエステル化方法は、参照により内容が本明細書に組み込まれるＶｏｌｕｍｅ ９ ｏｆ ｔｈｅ Ｋｉｒｋ－Ｏｔｈｍｅｒ Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９４），ｐｐ．７６２－７６８に開示されている。

【0055】

従来のバッチエステル化手順は、反応サイクルの開始時に反応器中に反応物の全てを装填するステップを含む。触媒的エステル化方法において、バッチが目標温度に達した後、触媒を典型的に反応混合物に添加する。次いで、反応混合物はさらに加熱されてよい。反応混合物温度は、反応混合物の沸点に達するまで上昇し、その時点において、使用する場合には共沸剤および水副産物は、反応混合物から沸騰して除去される。典型的に、オーバーヘッド蒸気は濃縮され、水は共沸剤から分離され、かつ共沸剤は反応容器にリサイクルされる。反応温度と、したがって反応速度とは、反応混合物の沸点のみによって制限される。より低い沸点を有する反応物が共沸剤としても使用される場合、反応が進むにつれて、その濃度は徐々に減少する。また、反応物の濃度は反応中に減少し、これは反応速度に悪影響を及ぼす。したがって、反応温度と、したがって反応速度定数とは、共沸剤が使用されるかどうかに無関係に、特に入熱が反応過程で継続される場合に反応が進むにつれて増加する。

【0056】

好ましくは、ステップ（ｃ）は、ＥＣグループ番号ＥＣ３．１．ｘ．ｘ．のエステル結合と関連して作用するエステラーゼまたはヒドロラーゼ酵素の作用によって生物学的に実行され、より好ましくは、酵素はＥＣ３．１．１．Ｘのものであり、かつエステル結合の分裂および形成の触媒作用に関与するヒドロラーゼ類の酵素である。微生物エステラーゼの最近の概説は、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ａｐｐ．Ｓｃｉ（２０１３）２（７）：１３５－１４６である。

【0057】

好ましくは、この方法は、イソブチリル－ＣｏＡを製造する、より好ましくは２－ケトイソ吉草酸および／またはイソ酪酸からイソブチリル－ＣｏＡを製造する１つ以上のステップをさらに含む。

【0058】

一実施形態において、この方法は、２－ケトイソ吉草酸からイソブチリル－ＣｏＡを製造する、以下のいずれかである１つ以上のさらなるステップをさらに含む。

【0059】

好ましくは、この方法は、２－ケトイソ吉草酸をイソブチリル－ＣｏＡに変換するステップをさらに含む。より好ましくは、２－ケトイソ吉草酸は、アルファサブユニット成分、リポアミドアシルトランスフェラーゼ成分およびリポアミドデヒドロゲナーゼ成分からなる分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ酵素複合体によってイソブチリル－ＣｏＡに変換される。最も好ましくは、デヒドロゲナーゼは、以下の酵素のいずれかから選択される：Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）からの分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ（ＢＣＫＤ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からのＢＣＫＤ、緑膿菌（Ｐ．ａｅｕｒｕｇｉｎｏｓａ）からのＢＣＫＤ、シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）からのＢＣＫＤ、ストレプトミセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）からのＢＣＫＤおよびサーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）からのＢＣＫＤ。

【0060】

あるいは、イソブチリル－ＣｏＡへの２－ケトイソ吉草酸の変換は、好適にはＥＣ１．Ｘ．Ｘ．Ｘのオキシドレダクターゼ酵素、好ましくはＥＣ１．２．Ｘ．Ｘの供与体のアルデヒドまたはオキソ基において作用するオキシドレダクターゼ、より好ましくは、好適にはＥＣ１．２．７．Ｘの電子受容体として鉄－硫黄タンパク質を使用して供与体のアルデヒドまたはオキソ基において作用するオキシドレダクターゼ酵素、最も好ましくは、好適にはＥＣグループ番号１．２．７．７の、アルファ、ベータ、ガンマおよびデルタサブユニットからなる四量体である２－ケトイソバレレートフェレドキシンレダクターゼ（ケトバリンフェレドキシンオキシドレダクターゼとしても知られている）によって触媒作用を引き起こされ得る。そのような酵素の例は、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｉｓ）からの２－ケトイソバレレートフェレドキシンレダクタ－ゼ；パイロコッカス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）からの２－ケトイソバレレートフェレドキシンレダクタ－ゼ；サーモコッカス属（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ）からの２－ケトイソバレレートフェレドキシンレダクタ－ゼ；サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）からの２－ケトイソバレレートフェレドキシンレダクタ－ゼ；サーモコッカス・プロファンダス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｐｒｏｆｕｎｄｕｓ）からの２－ケトイソバレレートフェレドキシンレダクタ－ゼおよびメタノバクテリウム・サーモオートトロピカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）からの２－ケトイソバレレートフェレドキシンレダクタ－ゼである。

【0061】

第２の実施形態において、この方法は、イソ酪酸からイソブチリル－ＣｏＡを製造する、以下のいずれかである１つ以上のさらなるステップをさらに含む。

【0062】

好ましくは、この方法は、イソ酪酸をイソブチリル－ＣｏＡに変換するステップをさらに含む。

【0063】

任意選択的に、イソ酪酸は、好適にはＥＣグループ番号６．Ｘ．Ｘ．Ｘのリガーゼ酵素、好ましくはＥＣ６．２．Ｘ．Ｘの炭素－硫黄結合形成リガーゼ、より好ましくはＥＣ６．２．１．Ｘの酸－チオール形成リガーゼ、より好ましくはＧＤＰ－形成、ＡＤＰ形成またはＡＭＰ形成リガーゼ、例えば、好適にはＥＣ６．２．１．１のＡＭＰ形成アセテート－ＣｏＡリガーゼ、好適にはＥＣ６．２．１．２のブチレート－ＣｏＡリガーゼ、好適にはＥＣ６．２．１．１０のカルボン酸－ＣｏＡリガーゼ、好適にはＥＣ６．２．１．１３のＡＤＰ形成アセテート－ＣｏＡリガーゼ、好適にはＥＣ６．２．１．１７のプロピオネート－ＣｏＡリガーゼ、またはＥＣ６．２．１．Ｘの酸－チオールリガーゼの作用によってイソブチリル－ＣｏＡに変換される。最も好ましくは、リガーゼは、以下の酵素のいずれかから選択される：シュードモナス・クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）からのＡｃｓＡ、ペシロミセス・バリオチ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉ）からのブチリル－ＣｏＡシンテターゼ、ウシ心臓ミトコンドリアからのブチリル－ＣｏＡシンテターゼ。

【0064】

第３の実施形態において、この方法は、イソブチレートからイソブチリル－ＣｏＡを製造する、以下のいずれかである１つ以上のさらなるステップをさらに含む。

【0065】

好ましくは、この方法は、イソブチレートをイソブチリル－ホスフェートに変換するステップと、イソブチリル－ホスフェートをイソブチリル－ＣｏＡに変換するステップとをさらに含む。

【0066】

好ましくは、イソブチレートは、好適にはＥＣグループ番号ＥＣ２．Ｘ．Ｘ．Ｘ、好ましくはＥＣ２．７．Ｘ．Ｘ、より好ましくはＥＣグループ番号ＥＣ２．７．２．Ｘのキナーゼ酵素、最も好ましくは、好適にはＥＣ２．７．２．１のアセテートキナーゼ、ＥＣ２．７．２．６のホルメートキナーゼ、ＥＣ２．７．２．７のブチレートキナーゼ、ＥＣ２．７．２．１４の分枝鎖脂肪酸キナーゼまたはＥＣ２．７．２．１５のプロピオネートキナーゼによってイソブチリル－ホスフェートに変換される。最も好ましくは、キナーゼは、以下の酵素のいずれかから選択される：スピロヘータ（Ｓｐｉｒｏｃｈｅｔｅ）ＭＡ－２からの分枝鎖脂肪酸キナーゼ、酪酸菌（Ｃ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）からのブチレートキナーゼ。

【0067】

好ましくは、イソブチリル－ホスフェートは、ＥＣグループ番号２．Ｘ．Ｘ．Ｘのトランスフェラーゼ酵素の作用により、より好ましくはＥＣグループ番号２．３．Ｘ．Ｘのアシルトランスフェラーゼの作用により、更により好ましくはＥＣグループ番号２．３．１．Ｘのアミノ－アシル基以外の基を転移するアシルトランスフェラーゼの作用により、イソブチリル－ＣｏＡに変換される。更により好ましくは、それぞれＥＣグループ番号２．３．１．８および２．３．１．１９のホスフェートアセチルトランスフェラーゼまたはホスフェートブチリルトランスフェラーゼである。より好ましくは、トランスフェラーゼは、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ８２４からのホスフェートブチリルトランスフェラーゼ、または枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）およびクロストリジウム・クライベリ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）からのホスフェートアセチルトランスフェラーゼである。これらの酵素の他の供給源としては、他の嫌気性細菌、特にクロストリジウム・パストゥリアヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）またはクロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）などのクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種を含む。

【0068】

最も好ましくは、この方法は、シンテターゼ酵素、好ましくはイソブチリル－ＣｏＡシンテターゼ、最も好ましくはＰ．クロロラフィス（Ｐ．ｃｈｌｏｒａｐｈｉｓ）Ｂ２３からのイソブチリル－ＣｏＡシンテターゼ（ＡｃｓＡ）の作用によってイソ酪酸からイソブチリル－ＣｏＡを製造するステップをさらに含む。

【0069】

任意選択的に、第１および／または第２および／または第３の実施形態に関連して上記されたさらなる方法ステップのいずれも組み合わされてよい。

【0070】

微生物
上記方法の酵素は、１種以上の微生物に含まれ得るか、または無微生物で、例えば、反応容器中の無細胞抽出液または精製酵素として存在し得るか、またはカラムに保持され得る。

【0071】

好ましくは、この方法の生物学的変換は、１種以上の宿主微生物中で実行される。より好ましくは、生物学的変換を実行するための１種以上の酵素は、１種以上の微生物に含まれる。

【0072】

好ましくは１種以上の微生物は、関連するステップに触媒作用を引き起こすために必要な１種以上の酵素を発現する。より好ましくは、関連するステップおよびいずれのさらなる酵素的ステップも１種以上の微生物中において生体内で実行される。

【0073】

本発明の第４の態様によれば、第１、第２または第３の態様のいずれかの方法に従ってメタクリル酸および／またはその誘導体を製造する用途の微生物が提供される。

【0074】

１種以上の微生物は、１種以上の酵素を自然に発現し得るか、または１種以上の酵素を発現するように遺伝子組み換えされ得るか、または野生型および遺伝子組み換えされた酵素の両方の組合せを発現し得る。そのような遺伝子組み換えされた生物は、組換型生物と記載されてもよい。

【0075】

１種以上の微生物は、１種以上の酵素を内在的もしくは異種的に、または内在性および異種酵素の組合せを発現し得る。

【0076】

本発明に関連して、「組換型生物」という用語は、人工的に組み立てられ、生物に挿入された遺伝材料を含む、遺伝子が改質されたかまたは組み換えられた生物を意味する。遺伝材料は、さらに遺伝的に改質されても、または改質されなくてもよい内在性または異種核酸を含み得る。

【0077】

本発明に関連して、「内在性」という用語は、同種の生物に由来することを意味する。

【0078】

本発明に関連して、「異種」という用語は、異なる種の生物に由来することを意味する。

【0079】

本発明に関連して、「適応された」という用語は、微生物に関して使用される場合、上記で定義されるように、遺伝子が改質されたかまたは組み換えられた生物を意味するか、または例えば１種以上の酵素を自然に発現することに基づき選択された生物の変異株を意味する。

【0080】

上記方法のいずれかにおいて使用するための上記のように遺伝子組み換えされたかまたは改質された微生物は、自然発生野生型または非自然発生組換型微生物、例えば、細菌、古細菌、酵母、真菌、藻類もしくは発酵プロセスに適用可能な種々の他の微生物のいずれかから選択され得る。

【0081】

したがって、本発明の第５の態様によると、
（ａ）オキシダーゼの発現により、イソブチリル－ＣｏＡをメタクリリル－ＣｏＡへ生物学的に変換するステップと；
（ｂ）メタクリリル－ＣｏＡをメタクリル酸へ生物学的に変換するステップと
を実行するように適応されている、メタクリル酸を製造する方法において使用するための組換型微生物であって、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である組換型微生物が提供される。

【0082】

本発明の第６の態様によると、
（ａ）オキシダーゼの発現により、イソブチリル－ＣｏＡをメタクリリル－ＣｏＡへ生物学的に変換するステップと；
（ｂ）メタクリリル－ＣｏＡをメタクリル酸へ生物学的に変換するステップと
を実行するように１種以上の異種核酸によって改質されている、メタクリル酸を製造する方法において使用するための微生物が提供される。

【0083】

本発明の第７の態様によると、
（ａ）オキシダーゼの発現により、イソブチリル－ＣｏＡをメタクリリル－ＣｏＡへ生物学的に変換するステップと；
（ｂ）メタクリリル－ＣｏＡをメタクリル酸および／またはその誘導体へ生物学的に変換するステップと
を実行するように適応された微生物が提供される。

【0084】

本発明の第８の態様によると、
（ａ）イソブチリル－ＣｏＡをメタクリリル－ＣｏＡへ生物学的に変換するステップと；
（ｂ）チオエステラーゼ、好適には４－ヒドロキシベンゾイル－ＣｏＡチオエステラーゼ（４ＨＢＴ）、トランスフェラーゼ、シンテターゼ、ならびに／またはホスホトランスアシラーゼおよび短鎖脂肪酸キナーゼの発現により、メタクリリル－ＣｏＡをメタクリル酸へ生物学的に変換するステップと
を実行するように適応された微生物が提供される。

【0085】

本発明のさらなる態様によれば、好適には４－ヒドロキシベンゾイル－ＣｏＡチオエステラーゼ（４ＨＢＴ）、トランスフェラーゼ、シンテターゼ、ならびに／またはホスホトランスアシラーゼおよび短鎖脂肪酸キナーゼの発現により、メタクリリル－ＣｏＡをメタクリル酸へ変換するように適応された微生物が提供される。

【0086】

本発明のさらなる態様によれば、メタクリリル－ＣｏＡをメタクリル酸へ変換する１種以上の酵素をコード化する、１種以上の組換型核酸によって改質された微生物が提供される。

【0087】

本発明のさらなる態様によれば、メタクリリル－ＣｏＡをメタクリル酸エステルへ変換する１種以上の酵素をコード化する、１種以上の組換型核酸によって改質された微生物が提供される。

【0088】

本発明のさらなる態様によれば、さらなる態様に従って１種以上の酵素を使用する、メタクリル酸を製造する方法が提供される。

【0089】

本発明のさらなる態様によれば、さらなる態様に従って１種以上の酵素を使用する、メタクリル酸エステルを製造する方法が提供される。

【0090】

第１、第２または第３の態様の方法のさらなる好ましい特徴は、上記の第４、第５、第６、第７、第８またはさらなる態様の微生物と組み合わせられてもよい。

【0091】

一実施形態において、微生物は、少なくとも以下の酵素：
（ａ）（ｉ）アシル－ＣｏＡオキシダーゼ；および／または
（ｉｉ）ＣｏＡデヒドロゲナーゼと；任意選択的に、
（ｂ）（ｉ）アシル－ＣｏＡチオエステラーゼ、好適には４－ヒドロキシベンゾイル－ＣｏＡチオエステラーゼ（４ＨＢＴ）；および／または
（ｉｉ）アシル－ＣｏＡトランスフェラーゼ；および／または
（ｉｉｉ）アシル－ＣｏＡシンテターゼ；および／または
（ｉｖ）ホスホトランスアシラーゼおよび短鎖脂肪酸キナーゼ；ならびに任意選択的に、
（ｖ）アルコールアシルトランスフェラーゼ
の１種以上と
を発現する。

【0092】

一実施形態において、微生物は、少なくとも以下の酵素：
（ａ）（ｉ）アシル－ＣｏＡオキシダーゼと；任意選択的に、
（ｂ）（ｉ）アシル－ＣｏＡチオエステラーゼ；および／または
（ｉｉ）アシル－ＣｏＡトランスフェラーゼ；および／または
（ｉｉｉ）アシル－ＣｏＡシンテターゼ；および／または
（ｉｖ）ホスホトランスアシラーゼおよび短鎖脂肪酸キナーゼ；ならびに任意選択的に、
（ｖ）アルコールアシルトランスフェラーゼ
の１種以上と
を発現する。

【0093】

第４、第５または第８の態様の一実施形態において、微生物は、少なくとも以下の酵素：
（ａ）（ｉ）アシル－ＣｏＡチオエステラーゼ、好適には４－ヒドロキシベンゾイル－ＣｏＡチオエステラーゼ（４ＨＢＴ）；および／または
（ｉｉ）アシル－ＣｏＡトランスフェラーゼ；および／または
（ｉｉｉ）アシル－ＣｏＡシンテターゼ；および／または
（ｉｖ）ホスホトランスアシラーゼおよび短鎖脂肪酸キナーゼと；任意選択的に、
（ｂ）（ｉ）アシル－ＣｏＡオキシダーゼ；および／または
（ｉｉ）アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ
の１種以上と、さらに任意選択的に、
（ｃ）（ｉ）アルコールアシルトランスフェラーゼと
を発現する。

【0094】

好ましくは、存在する場合、ＣｏＡデヒドロゲナーゼは補足的な電子伝達系を伴う。

【0095】

好ましい実施形態において、微生物は、以下の酵素：
（ａ）ＡＣＸ４などのアシル－ＣｏＡオキシダーゼと；
（ｂ）４ＨＢＴなどのアシル－ＣｏＡチオエステラーゼと
の少なくとも１種を発現する。

【0096】

より好ましい実施形態において、微生物は、以下の酵素：
（ａ）好適にはシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）からのＡＣＸ４と；
（ｂ）好適にはアルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）からの４ＨＢＴと
の少なくとも１種を発現する。

【0097】

いくつかの実施形態において、微生物は、
（ａ）アシル－ＣｏＡオキシダーゼの発現により、イソブチリル－ＣｏＡをメタクリリル－ＣｏＡへ生物学的に変換するステップと；
（ｂ）アルコールアシルトランスフェラーゼの発現により、メタクリリル－ＣｏＡをＣ１～Ｃ２０メタクリル酸エステル、好適にはＣ１～Ｃ１２メタクリル酸エステル、例えば、Ｃ１～Ｃ４またはＣ４～Ｃ１２メタクリル酸エステルへ生物学的に変換するステップと
を実行するように適応される。

【0098】

好ましくは、メタクリル酸エステルは、Ｃ１～Ｃ２０メタクリル酸エステル、より好ましくはＣ１～Ｃ１２メタクリル酸エステル、更により好ましくはＣ１～Ｃ４またはＣ４～Ｃ１２メタクリル酸エステル、最も好ましくはメタクリル酸ブチルである。

【0099】

これらの実施形態において、微生物は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）であってよく、かつ／またはアシル－ＣｏＡオキシダーゼは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）からのＡＣＸ４であり、かつ／またはアルコールアシルトランスフェラーゼは、本明細書に明示された植物起源、例えば、リンゴなどの果物から誘導され、かつ／または微生物は、組換型微生物である。好ましくは、微生物は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）であってよく、アシル－ＣｏＡオキシダーゼは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）からのＡＣＸ４であってよく、アルコールアシルトランスフェラーゼは、リンゴ、メロンまたはトマト起源から誘導されてもよく、かつ微生物は組換型生物であってよい。

【0100】

好ましくは、微生物は、前記好ましいまたはいくつかの実施形態の前記酵素（ａ）および（ｂ）の両方を発現する。

【0101】

好ましくは、微生物は、以下の酵素：分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ酵素、またはＡＤＰ形成、ＧＤＰ形成もしくはＡＭＰ形成アシル－ＣｏＡシンテターゼ／シンターゼ／リガーゼ；あるいは短鎖脂肪酸キナーゼおよびホスホトランスアシラーゼの１種以上をさらに発現する。

【0102】

より好ましくは、微生物は、以下の酵素：２－ケトイソバレレートデヒドロゲナーゼ、イソブチレート－ＣｏＡリガーゼ、ＡＤＰ形成、ＧＤＰ形成もしくはＡＭＰ形成アシル－ＣｏＡシンテターゼ／シンターゼ／リガーゼ、または短鎖脂肪酸キナーゼおよびホスホトランスアシラーゼの１種以上をさらに発現する。

【0103】

最も好ましくは、微生物は、イソブチリル－ＣｏＡシンテターゼ、特にシュードモナス・クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）、特にシュードモナス・クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）Ｂ２３をさらに発現する。

【0104】

第４、第６、第７、第８およびさらなる態様に関連して、好ましくは、宿主微生物は細菌であり、適切な細菌の例としては、エシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、パントエア属（Ｐａｎｔｏｅａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、モルガネラ属（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）などのプロテオバクテリアに属する腸内細菌、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）またはミクロバクテリウム属（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に属するいわゆるコリネ型細菌、およびアリサイクロバチルス属（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、桿菌属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ハイドロゲノバクター属（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ）、メタノコックス属（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アクソリゾビウム属（Ａｘｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アゾトバクター属（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、アナプラスマ属（Ａｎａｐｌａｓｍａ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、バルトネラ属（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、カリマトバクテリウム属（Ｃａｌｙｍｍａｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、クラミドフィラ属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コクシエラ属（Ｃｏｘｉｅｌｌａ）、エールリキア属（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）、腸球菌属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、フゾバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ガードネレラ属（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、クレブシエラ属（Ｋｅｌｂｓｉｅｌｌａ）、メタノバクテリウム属（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ミクロコッカス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、モラクセラ属（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、ペプトストレプトコッカス属（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、プレボテーラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、根粒菌属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、ロシャリメア属（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ）、ロティア属（Ｒｏｔｈｉａ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ステノトロホモナス属（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、ボルバキア属（Ｗｏｌｂａｃｈｉａ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）に属する細菌などが含まれる。

【0105】

例示的な細菌としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、アネロビオスピリウム・サクシニシプロデュセンス（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）、アクチノバチルス・サクシノゲネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、バスフィア・サクシニシプロデュセンス（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）、リゾビウム・エトリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｅｔｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）、ジモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ストレプトミセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、ハイドロゲノバクター・サーモフィラス（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、メタノコックス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）およびシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）から選択される種が含まれる。

【0106】

第４、第６、第７、第８およびさらなる態様に関連して、好ましくは、細菌は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である。

【0107】

例示的な酵母または真菌としては、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミケス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｔｐｏｃｏｃｃｕｓ）などに属するものが含まれる。例示的な酵母または真菌の種としては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クリベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、クリベロミセス・マルキシアナス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などから選択されるものが含まれる。

【0108】

第４、第６、第７、第８またはさらなる態様のいずれかの微生物は、１種以上の上記天然または遺伝子組み換えされた酵素の活性を増強するか、または減少させるように遺伝的に改質されてもよい。

【0109】

好ましくは、微生物は、メタクリル酸および／またはその誘導体の製造を増強するように遺伝子組み換えされている。

【0110】

メタクリル酸および／またはその誘導体の製造を増強することは、当該技術分野において既知の種々の遺伝子工学技術の使用により、既存の細胞代謝プロセス、核酸および／またはタンパク質を改質することを含み得る。メタクリル酸および／またはその誘導体の製造を増強することは、微生物中で１種以上の異種遺伝子を発現するように微生物を改質することも含み得る。これらは、本明細書に開示されたものなどの炭素ベースの工業原料からのメタクリル酸までの望ましい経路の酵素をコート化する遺伝子を含み得るか、または以下に詳細に議論されるように、直接的または間接的にそのような経路における酵素の機能および発現を促進するために作用する他の補助遺伝子を含み得る。

【0111】

したがって、微生物は、メタクリル酸および／またはその誘導体の製造のための１種以上の遺伝子を発現するように改質され得、かつ好ましくは、微生物は、メタクリル酸および／またはその誘導体の製造を増強するようにさらに改質される。

【0112】

それがメタクリル酸および／またはその誘導体を製造するように改質されるように微生物中で発現され得る１種以上の遺伝子としては、以下の酵素：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）からのＡＣＸ４、アルスロバクター・ニコチアナ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）からの短鎖アシル－ＣｏＡオキシダーゼ、リョクトウ（Ｖｉｇｎａ ｒａｄｉａｔａ）からのペルオキシソームアシル－ＣｏＡオキシダーゼ、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）からのアシル－ＣｏＡオキシダーゼ４、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐ．）からのアシル－ＣｏＡオキシダーゼおよび広い基質範囲を有する関連するオキシダーゼ、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ）からの４－ヒドロキシベンゾイル－ＣｏＡチオエステラーゼ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）からのＹｃｉＡ、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）からのＹｃｉＡ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）からのＴｅｓＡ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）からのＴｅｓＢ、アルスロバクター・グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）からの４ＨＢＴ、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＣＢＳ－３株からの４ＨＢＴ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）からのＥｎｔＨ、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．）ＳＢ４からのブチリル－ＣｏＡアセトアセテートＣｏＡトランスフェラーゼ、クロストリジウム・スティックランディ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｉｃｋｌａｎｄｉｉ）からのブチリル－ＣｏＡアセトアセテートＣｏＡトランスフェラーゼ、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ８２４からのブチレート－アセトアセテートＣｏＡ－トランスフェラーゼ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）からのアセテート補酵素ＡトランスフェラーゼｙｄｉＦ、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ８２４からのホスホトランスブチリラーゼ、スピロヘータ（Ｓｐｉｒｏｃｈｅｔｅ）ＭＡ－２からの分枝鎖脂肪酸キナーゼ、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）からのブチレートキナーゼ、酪酸菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）からのブチレートキナーゼ、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）からの分枝鎖アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）からのイソブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）からのイソバレリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）から電子伝達フラビンタンパク質、イノシシ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ）からの電子伝達フラビンタンパク質、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）からの電子伝達フラビンタンパク質、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）からの電子伝達フラビンタンパク質、パラコッカス・デニトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）からの電子伝達フラビンタンパク質、ヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）からの電子伝達フラビンタンパク質ユビキノンオキシドレダクターゼ、イノシシ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ）からの電子伝達フラビンタンパク質ユビキノンオキシドレダクターゼ、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）からの電子伝達フラビンタンパク質ユビキノンオキシドレダクターゼ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）からの電子伝達フラビンタンパク質ユビキノンオキシドレダクターゼ、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）からの電子伝達フラビンタンパク質ユビキノンオキシドレダクターゼ、パラコッカス・デニトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）からの電子伝達フラビンタンパク質ユビキノンオキシドレダクターゼのいずれかをコード化するものが含まれる。

【0113】

それがメタクリル酸および／またはその誘導体の製造を増強するように改質されるように微生物中で発現され得る１種以上の遺伝子としては、以下の酵素：シュードモナス・クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）からのＡｃｓＡ；枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からのｂｋｄＡ１、ｂｋｄＡ２、ｂｋｄＢおよびｌｐｄＶ；シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）からのｂｋｄＡ１、ｂｋｄＡ２、ｂｋｄＢおよびｌｐｄＶ；枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からのａｌｓＳ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）からのｉｌｖＤ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）からのｉｌｖＣ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）からのｉｌｖＢ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）からのｉｌｖＮ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）からのｉｌｖＩ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）からのｉｌｖＧ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）からのｉｌｖＭ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）からのｉｌｖＨ、ならびにＧ１４ＤおよびＳ１７Ｆ突然変異を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）からのｉｌｖＨ、Ｓ３４Ｇ、Ｌ４８ＥおよびＲ４９Ｆ突然変異を有するコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＲからのｉｌｖＣ、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＲからのｉｌｖＢおよびｉｌｖＮ、ならびにＧ１５６Ｅ突然変異を有するコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＲからのｉｌｖＮ、ならびに酵素のフィードバック阻害を軽減するため、かつ適切である場合には補因子依存を変更するための上記と同様の突然変異を有する他の生物からの相同体のいずれかをコード化するものが含まれる。

【0114】

本発明は、上記生合成経路において、同じ基質および／もしくは中間体に対して競合することによってメタクリル酸および／もしくはその誘導体以外の化合物の合成に触媒作用を引き起こす酵素の活性を減少させるか、もしくは排除する改質をさらに含み得る。そのような酵素の例としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）からのＹｃｉＡ、ＴｅｓＡ、ＴｅｓＢ、ならびに大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）においてｆａｄＢ、ｉｌｖＡ、ｐａｎＢ、ｌｅｕＡ、ｙｇａＺ、ｙｇａＨ、ａｃｅＦ、ａｃｅＥ、ｌｐｄＡ、ｔｐｉＡ、ｐｆｋＡ、ｐｆｋＢ、ｍｄｈ、ｐｏｘＢ、ｉｌｖＥ、ｌｄｈＡおよびｌｌｄＤによってコード化されたもの、ならびに本明細書に記載の他の宿主株における相同体を含む。

【0115】

本発明は、メタクリル酸および／もしくはその誘導体を代謝させるか、もしくは上記生合成経路において中間体を代謝させる酵素の活性を減少させるかもしくは排除する改質をさらに含み得る。代謝と関連するそのような酵素の例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における固有のバリン分解経路の酵素、または設計された経路のチオエステル中間体を消費し得る他のチオエステラーゼである。

【0116】

本発明は、上記の生合成経路において中間体を除去する他の細胞機能に関与するタンパク質の活性を減少させるかもしくは排除する改質もさらに含み得る。そのような細胞機能の例としては、蓄積型液胞（例えば、酵母において）または代謝産物を蓄積することができる他の細胞内構造体（例えば、細菌の極小コンパートメント）などの蓄積機構、代謝産物を輸送することができる膜内外ポンプまたはポリンなどの細菌周辺質または搬送機構が含まれ得る。

【0117】

タンパク質、特に本発明に従って微生物において発現した酵素をコード化する遺伝子のための核酸の供給源としては、例えば、コード化された遺伝子産物が参照された反応に触媒作用を引き起こすことができるいずれの種も含むことができる。そのような種としては、限定されないが、古細胞および真性細菌を含む細菌、酵母、植物、昆虫、動物およびヒトを含む哺乳動物を含む真核生物を含む、原核および真核生物の両方を含む。そのような供給源のための例示的な種としては、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）、メチロバクテリウム・エキストロクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、シゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）、エルシニア・フレデリクセニイ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｅｎｉｉ）、プロピオニバクテリウム・アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ）、ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、エレガンス線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、アシネトバクター・ベイリイ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｙｌｙｉ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、クロストリジウム・クライベリ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、カイウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、リゥコノストック・メゼンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ユーバクテリウム・バーケリ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂａｒｋｅｒｉ）、バクテロイデス・カピロスス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｃａｐｉｌｌｏｓｕｓ）、アナエロツルンカス・コリホミニス（Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ ｃｏｌｉｈｏｍｉｎｉｓ）、ナトラナエロビウス・サーモフィラス（Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、イノシシ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ）、桿菌菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、ストレプトミセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、メチリビウム・ペトロレイフィルム（Ｍｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍ ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ）、ストレプトミセス・シンナモネンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ）、ストレプトミセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、アルカエオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、ハロアーキュラ・マリスモルツイ（Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ）、ピロバクルム・アエロフィルム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クロストリジウム・コクレアリウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｃｈｌｅａｒｉｕｍ）、破傷風様菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｏｍｏｒｐｈｕｍ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、シトロバクター・アマロナチクス（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ａｍａｌｏｎａｔｉｃｕｓ）、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）、ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、モルガネラ・モルガニー（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ）、クロストリジウム・パストゥリアヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、キサントバクター・オートトロフィカス（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、クロストリジウム・プロピオニカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）、メガスファエラ・エルスデニイ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、スルフォロブス・トコダイイ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ）、メタロスファエラ・セデュラ（Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ ｓｅｄｕｌａ）、クロロフレクサス・アウランチアカス（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、クロストリジウム・サッカロペルブチルアセトニカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）、アシドアミノコックス・フェルメンタンス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、ならびに本明細書に開示されたまたは対応する遺伝子のための供給源生物として利用可能な他の例示的な種が含まれる。

【0118】

本発明の微生物において発現され得る酵素をコード化する１種以上の遺伝子は、前記酵素の変異体、例えば、前記ポリペプチドが未改質酵素の活性を維持するポリペプチド配列における１つまたはいくつかのアミノ酸の置換、欠損、挿入または付加を含む変異酵素をコード化する遺伝子も含むことに留意すべきである。そのような変異酵素は、未改質酵素および改質されたアロステリック制御を有する酵素、例えば、Ｇ１４ＤおよびＳ１７Ｆ突然変異を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）からのｉｌｖＨ、Ｓ３４Ｇ、Ｌ４８ＥおよびＲ４９Ｆ突然変異を有するコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＲからのｉｌｖＣ、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＲからのｉｌｖＢおよびｉｌｖＮ、ならびにＧ１５６Ｅ突然変異を有するコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＲからのｉｌｖＮと比較した場合、減少した酵素活性を有する変異酵素も含む。

【0119】

非自然発生メタクリル酸を製造する微生物中のタンパク質の発現を構成および試験するための方法は、例えば、当該技術分野において周知の組換技術および検出方法によって実行することができる。そのような方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１）；およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．（１９９９）に見出すことができる。

【0120】

メタクリル酸および／もしくはその誘導体、またはその形成における中間体の製造に関する経路に関与する外来性核酸配列は、限定されないが、接合、電気穿孔、化学的転換、導入、移入および超音波転換を含む、当該技術分野において周知の技術を使用して、微生物細胞中に安定してまたは一時的に導入することができる。

【0121】

転換方法の例は、ＤＮＡの浸透性を増加させるために塩化カルシウムで受容体微生物／細胞を処理すること、および増殖期にある細胞からコンピテント細胞を調製し、続いてＤＮＡによって転換することを含むことができる。あるいは、ＤＮＡ－受容細胞から組換型ＤＮＡを容易に取り込むことができるプロトプラストまたはスフェロプラストを製造し、続いて、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉ）、放線菌（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）および酵母に適用可能であることが知られている細胞に組換型ＤＮＡを導入する方法も使用可能である。加えて、微生物の転換は、電気穿孔によっても実行可能である。そのような方法は当該技術分野において周知である。

【0122】

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または他の原核微生物細胞における外来性発現に関して、真核性核酸の遺伝子またはｃＤＮＡにおけるいくつかの核酸配列は、必要に応じて、原核微生物細胞への転換前に除去が可能なＮ末端ミトコンドリアなどの標的シグナルまたは他の標的シグナルをコード化することができる。例えば、ミトコンドリアリーダー配列の除去により、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現の増加が導かれた（Ｈｏｆｆｍｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：４３２９－４３３８（２００５））。酵母または他の真核微生物細胞における外来性発現に関して、遺伝子は、リーダー配列を添加させずに、細胞質ゾル中で発現可能であるか、または標的細胞器官に適切なミトコンドリア標的もしくは分泌物シグナルなどの適切な標的シーケンスを添加することにより、ミトコンドリアもしくは他の細胞器官を標的にすること、または分泌物に関して標的にすることが可能である。したがって、標的配列を除去するかまたは含む核酸配列への適切な改質が、所望の特性を付与するために外来性核酸配列に組み込まれ得ることは理解される。さらに、遺伝子は、微生物内のタンパク質の最適化された発現を達成するため、当該技術分野において周知の技術によってコドン最適化を受けさせることができる。

【0123】

発現ベクターは、微生物中の発現制御配列機能と作動可能に関連する、本明細書に例示される核酸をコード化する１種以上の生合成経路酵素を含むように構成可能である。本発明の微生物における使用のために適用可能な発現ベクターとしては、例えば、プラスミド、コスミド、ファージベクター、ウィルスベクター、エピソームおよび人工染色体が含まれ、ベクターおよび選別配列または宿主染色体への安定した組み込みのために作動可能なマーカーを含む。

【0124】

さらに、発現ベクターは、１種以上の選択可能なマーカー遺伝子および適切な発現制御配列を含むことができる。例えば、抗生物質もしくは毒素に対する耐性、補体栄養要求性欠損を提供するか、または培地においてではなく不可欠の栄養を供給する選択可能なマーカー遺伝子も含まれ得る。発現制御配列は、当該技術分野において周知の構成的、誘導性または抑制性促進因子、転写促進因子、転写終結因子、翻訳シグナルなどを含むことが可能である。２種以上の外来性コード化核酸配列が同時発現可能である場合、両核酸配列は、例えば、単一発現ベクター中に、または個々の発現ベクター中に挿入可能である。単一ベクター発現に関して、コード化核酸は、作動上、１つの共通発現制御配列に関連付けられ得るか、または誘導性促進因子および構成的促進因子などの異なる発現制御配列に関連付けられ得る。いくつかの実施形態において、ベクターは、同義遺伝子またはオペロンの同時発現のために２種以上の促進因子を有していてもよい。いくつかの実施形態において、遺伝子／オペロンは、１種以上の対応する促進因子により、１種以上の異なるベクター上で発現されてもよい。

【0125】

転換のために使用されるベクターは、微生物の細胞中で自律複製可能なベクターであり得る。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）の細菌において自律複製可能なベクターの例としては、プラスミドベクターｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ＲＳＦ１０１０、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ｐＳＴＶ２８、ｐＳＴＶ２９、ｐＥＴ２０ｂ（＋）、ｐＥＴ２８ｂ（＋）（ｐＥＴベクターは、Ｎｏｖａｇｅｎから入手可能である）、ｐＬｙｓＳ、（ｐＨＳＧおよびｐＳＴＶベクターは、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．から入手可能である）、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８（ｐＭＷベクターは、Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から入手可能である）などおよびそれらの誘導体を含むことができる。さらに、コリネ型細菌に関するベクターとしては、ｐＡＭ３３０（特開昭５８－６７６９９号公報）、ｐＨＭ１５１９（特開昭５８－７７８９５号公報）、ｐＳＦＫ６（特開２０００－２６２２８８号公報）、ｐＶＫ７（米国特許出願公開第２００３－０１７５９１２Ａ号明細書）、ｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１、ｐＡＪ１８４４（特開昭５８－１９２９００号公報）、ｐＣＧ１（特開昭５７－１３４５００号公報）、ｐＣＧ２（特開昭５８－３５１９７号公報）、ｐＣＧ４、ｐＣＧ１１（特開昭５７－１８３７９９号公報）、ｐＨＫ４（特開平５－７４９１号公報）などを含むことができる。さらに、酵母に関するベクターとしては、酵母プラスミド、例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）に関するｐＤ９０２またはｐＤ９０５など、またはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に関するｐＤ１２０１、ｐＤ１２０４、ｐＤ１２０５、ｐＤ１２０７、ｐＤ１２１１、ｐＤ１２１４ ｐＤ１２１５、ｐＤ１２１７、ｐＤ１２１８、ｐＤ１２２１、ｐＤ１２２４、ｐＤ１２２５、ｐＤ１２２７、ｐＤ１２３１、ｐＤ１２３４、ｐＤ１２３５、ｐＤ１２３７などを含むことができる。遺伝子は、周知の方法を使用して宿主染色体にも組み込まれ得る（例えば、Ｄａｔｅｎｓｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ，Ｋ．Ａ．ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ，Ｂ．Ｌ．２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：６６４０－６６４５））。

【0126】

酵素の活性の増強は、ゲノムＤＮＡまたはプラスミド上の促進因子などの標的遺伝子の発現調節配列を、適切な強度を有する促進因子で置き換えることにより、標的遺伝子の発現を増強することを含むことができる。例えば、ｔｈｒ促進因子、ラック促進因子、ｔｒｐ促進因子、ｔｒｃ促進因子、ｐＬ促進因子、ｔａｃ促進因子などは、頻繁に使用される促進因子として知られている。細菌などの微生物において高い発現活性を有する促進因子の例としては、伸長因子Ｔｕ（ＥＦ－Ｔｕ）遺伝子の促進因子、ｔｕｆ、コシャペロニンＧｒｏＥＳ／ＥＬをコード化する遺伝子の促進因子、チオレドキシンレダクタ－ゼ、ホスホグリセレートムターゼ、グリセルアルデヒド－３－ホスフェートデヒドロゲナーゼなど（国際公開第２００６／０２８０６３号パンフレット、欧州特許第１６９７５２５号明細書）を含むことができる。強い促進因子の例および促進因子の強度を評価するための方法は、当該技術分野において周知である。

【0127】

さらに、国際公開第２０００／１８９３５号パンフレットに開示されるように、促進因子が適切な強度を有するように、遺伝子の促進因子領域におけるいくつかのヌクレオチドを置換することも可能である。発現調節配列の置換は、例えば、温度に感応性であるプラスミドを使用する遺伝子置換と同じ方法で実行することができる。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）またはパントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｎａｎａｔｉｓ）のために使用することが可能である、温度に感応性の複製開始点を有するベクターの例としては、例えば、国際公開第１９９９／０３９８８号パンフレットに記載されるプラスミドｐＭＡＮ９９７およびその誘導体などを含むことができる。さらに、発現調節配列の置換は、λ－ファージのＲｅｄレコンビナーゼを使用する、「Ｒｅｄドリブンインテグレーション（Ｒｅｄ－ｄｒｉｖｅｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）」と呼ばれる直鎖ＤＮＡを利用する方法（Ｄａｔｓｅｎｋｏ，Ｋ．Ａ．ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ，Ｂ．Ｌ．２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：６６４０－６６４５）、およびＲｅｄドリブンインテグレーション法とλファージ切り出しシステム（Ｃｈｏ，Ｅ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．２００２．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：５２００－５２０３）とを組み合わせた方法（国際公開第２００５／０１０１７５号パンフレット）によっても実行可能である。発現調節配列の改質は、遺伝子複写数の増加と組み合わせることができる。

【0128】

さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサーにおけるいくつかのヌクレオチドの置換、特に開始コドンの直接上流の配列がｍＲＮＡの翻訳性能に非常に影響を与えることが知られている。翻訳は、これらの配列を改質することによって増強することができる。

【0129】

標的遺伝子が上記プラスミドまたは染色体中に導入される場合、使用される微生物中で作用する促進因子が選択される限り、いずれの促進因子も遺伝子の発現のために使用することができる。促進因子は、遺伝子の固有の促進因子または改質された促進因子であり得る。遺伝子の発現は、選択された微生物において強力に作用する促進因子を適切に選択することにより、またはコンセンサス配列に近い促進因子の－３５およびー１０領域を近似することによっても制御可能である。

【0130】

代謝または合成経路に関与する外来性核酸配列の転換、導入、接合または染色体挿入は、当該技術分野において周知の方法を使用して確認される。そのような方法は、例えば、プラスミドまたは染色体ＤＮＡの抽出、それに続く特定の標的配列のポリメラーゼ鎖増幅、または制限マッピング、さらなる核酸分析、例えば、ノーザンブロット、もしくはｍＲＮＡのポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）増幅、またはポリアクリルアミドゲル電気泳動、または酵素活性測定、遺伝子産物の発現に関するイムノブロット、または導入された核酸配列あるいはその対応する遺伝子産物の発現を試験するための他の適切な分析法が含まれる。外来性核酸が所望の遺伝子産物を製造するために十分な量で発現されることは当業者によって理解され、発現レベルは、当該技術分野において周知の方法を使用して十分な発現を得るために最適化され得ることもさらに理解される。

【0131】

任意選択的に、本発明の上記方法のいずれかにおける使用のための第４、第６、第７、第８またはさらなる態様の微生物は、
（ｉ）メタクリル酸製造経路から材料の方向を転換し；かつ／または
（ｉｉ）メタクリル酸および／またはその誘導体を代謝させる、
細胞機能に関与する酵素またはタンパク質の活性を減少させるか、または排除するためにさらに改質されてもよい。

【0132】

上記酵素またはタンパク質の活性を減少させるか、または排除するため、酵素またはタンパク質の細胞内活性を減少させるか、または排除するための突然変異を、従来のランダムもしくは定方向突然変異誘発または遺伝子工学技術により、上記酵素またはタンパク質の遺伝子中に導入することができる。突然変異誘発の例としては、例えば、エックス線または紫外線照射、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジンなどの変異原物質による処理、それぞれ高忠実度またはエラープローンポリメラーゼ鎖反応による生体外での定方向またはランダム突然変異誘発などを含むことができる。突然変異が導入される遺伝子上の部位は、酵素またはタンパク質または促進因子などの発現制御領域をコード化するコーディング領域にあることが可能である。遺伝子工学技術の例としては、遺伝的組換え、導入、細胞融合、遺伝子ノックアウトなどを含むことができる。

【0133】

目標酵素またはタンパク質の細胞内活性の減少および排除ならびに減少度は、候補株から得られた細胞抽出液またはその精製フラクション中の酵素またはタンパク質活性を測定し、かつそれを野生型株のものと比較することにより、または細胞全体による目標産物の形成を測定することにより確認することができる。

【0134】

メタクリル酸および／またはその誘導体および／またはその中間体の製造能力を付与または増強するための他の方法の例としては、メタクリル酸または有機酸類似体、呼吸阻害因子などに対する耐性を付与すること、および細胞壁体合成阻害因子に対する感応性を付与することを含むことができる。これらの方法としては、例えば、有毒物質の濃度増加による成長による耐性細胞のための選択、モノフルオロ酢酸耐性の付与、アデニン耐性またはチミン耐性の付与、ウレアーゼの軽減、マロン酸耐性の付与、ベンゾピロンまたはナフトキノン耐性の付与、ＨＯＱＮＯ耐性の付与、アルファ－ケトマロン酸耐性の付与、グアニジン耐性の付与、ペニシリンに対する感応性の付与などの当該技術分野において既知のものを含むことができる。

【0135】

そのような耐性細菌の例としては、以下の菌株：ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＡＪ３９４９ ＦＥＲＭ ＢＰ－２６３２；コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＪ１１６２８ ＦＥＲＭ Ｐ－５７３６；ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＡＪ１１３５５ ＦＥＲＭ Ｐ－５００７；コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＪ１１３６８ ＦＥＲＭ Ｐ－５０２０；ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＡＪ１１２１７ ＦＥＲＭ Ｐ－４３１８；コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＪ１１２１８ ＦＥＲＭ Ｐ－４３１９；ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＡＪ１１５６４ ＦＥＲＭ Ｐ－５４７２；ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＡＪ１１４３９ ＦＥＲＭ Ｐ－５１３６；コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｈ７６８４ ＦＥＲＭ ＢＰ－３００４；ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンツム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＪ１１４２６ ＦＥＲＭ Ｐ－５１２３；コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＪ１１４４０ ＦＥＲＭ Ｐ－５１３７；およびブレビバクテリウム・ラクトフェルメンツム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＪ１１７９６ ＦＥＲＭ Ｐ－６４０２を含むことができる。

【0136】

メタクリル酸ならびに／またはその誘導体および／もしくはその中間体の製造能力を付与または増強するためのさらなる方法としては、下方調節因子／阻害因子への耐性付与、上方調節因子／阻害因子への感応性付与、または他の化合物による酵素のアロステリック活性化の要求の軽減を含むことができる。例えば、バリンによるシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）からの分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼのアロステリック活性化の要求の軽減、または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）からのアセトラクターゼシンターゼのアロステリック阻害の軽減である。

【0137】

発酵
したがって、本発明の上記方法は、好適には培地中でメタクリリル－ＣｏＡ中間体および／またはメタクリル酸および／またはメタクリル酸エステルなどのその誘導体を製造することが可能な本発明の第４、第６、第７、第８またはさらなる態様の微生物の培養によって実行され得る。

【0138】

したがって、好適には、本発明の第１、第２または第３の態様の方法は、１種以上の微生物を培養して、メタクリル酸および／またはメタクリル酸エステルなどのその誘導体を製造するステップをさらに含み得る。

【0139】

好ましくは、前記培養ステップは、発酵培地で実行される。

【0140】

したがって、本発明の第９の態様によれば、発酵培地において第４、第５、第６、第７、第８またはさらなる態様の１種以上の微生物を培養して、メタクリル酸および／またはメタクリル酸エステルなどのその誘導体を製造するステップを含む、発酵の方法が提供される。

【0141】

メタクリル酸および／またはその誘導体は、発酵培地中または微生物の細胞中に存在し得る。

【0142】

したがって、好適には、本発明の第１、第２または第３の態様の方法は、発酵培地または微生物細胞から、メタクリル酸および／またはその形成における中間体および／またはメタクリル酸エステルなどのその誘導体を回収するステップをさらに含み得る。

【0143】

メタクリル酸および／またはメタクリル酸エステルなどのその誘導体は、上記のとおり、メタクリル酸および／またはメタクリル酸エステルなどのその誘導体を分泌する微生物により、発酵培地中に存在し得る。

【0144】

メタクリル酸および／またはメタクリル酸エステルなどのその誘導体は、上記のとおり、メタクリル酸および／またはメタクリル酸エステルなどのその誘導体を蓄積する微生物により、微生物の細胞中に存在し得る。

【0145】

したがって、好適には、細胞は、ろ過、遠心分離などの当該技術分野において既知のいずれかの手段によって発酵培地から除去され、かつメタクリル酸またはその塩および／またはメタクリル酸エステルは、蒸留、液体－液体抽出法などの当該技術分野において既知のいずれかの手段によって発酵培地から回収される。したがって、好適には、本発明の方法は、周囲培地からメタクリル酸および／またはメタクリル酸エステルなどのその誘導体を回収するステップをさらに含み得、これは、最初にろ過または遠心分離によって細胞を培地から除去し、次いで蒸留、液体－液体抽出法により、純化された培地からメタクリル酸および／またはその誘導体を抽出することによって実行され得る。

【0146】

任意選択的に、メタクリル酸および／またはメタクリル酸エステルなどのその誘導体を回収するステップは、当該技術分野において既知のいずれかの手段によって実行され得、好ましくは、細胞が溶解して所望の産物が放出される、超音波処理、均質化、酵素的処理、ビード－ミリング、浸透圧衝撃、凍結融解、酸／塩基処理、ファージ溶解など、細胞からメタクリル酸および／またはメタクリル酸エステルなどのその誘導体を放出させるステップと、それに続いて発酵培地からの上記と同様の回収ステップとをさらに含み得る。したがって、好適には、本発明の方法は、細胞からメタクリル酸および／またはメタクリル酸エステルなどのその誘導体を回収するさらなるステップを含み得、細胞の溶解と、その後の細胞細片のろ過と、それに続くメタクリル酸および／またはメタクリル酸エステルなどのその誘導体の抽出とによって実行され得る。

【0147】

好適には、微生物の培養には、微生物がエネルギーを得ることができかつ増殖することができる炭素ベースの供給原料が必要とされる。したがって、好ましくは、微生物は、炭素ベースの供給原料上で培養され、本発明の第１または第２の態様の方法は、炭素ベースの供給原料からメタクリル酸および／またはその誘導体を製造することが可能な１種以上の微生物培養するステップをさらに含み得る。

【0148】

好ましくは、培養は、発酵培地、好適には微生物を包囲する周囲培地において実行され、炭素ベースの供給原料は、培地中に存在し、任意選択的に培地中に溶解または懸濁され、培地を通してバブリングされ、かつ／または培地と混合される。したがって、好ましくは、培地は、いずれかの緩衝液および塩と一緒に微生物および炭素ベースの供給原料を含む。

【0149】

したがって、本発明の第１０の態様によれば、第４、第５、第６、第７、第８またはさらなる態様の１種以上の微生物を含む発酵培地が提供される。

【0150】

好ましくは、発酵培地は、メタクリル酸および／またはメタクリル酸エステルなどのその誘導体をさらに含む。

【0151】

好ましくは、微生物は、好ましくは、直接分泌または細胞の溶解のいずれかから培地中に存在するメタクリル酸および／またはメタクリル酸エステルなどのその誘導体の濃度が高滴定値にあるように、上記で説明された基礎速度よりも高い速度でメタクリル酸および／またはメタクリル酸エステルなどのその誘導体を製造する。

【0152】

好ましくは、発酵培地に存在するメタクリル酸および／またはメタクリル酸エステルなどのその誘導体の滴定値は、少なくとも５ｍｇ／ｌである。例えば、５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５、１０５、１１５、１２５、１３５、１４５、１５５ｍｇ／ｌ、好ましくは少なくとも１３０ｍｇ／ｌより高い。

【0153】

好ましくは、メタクリル酸および／またはメタクリル酸エステルなどのその誘導体が微生物中で蓄積する実施形態において、細胞中に存在するメタクリル酸および／またはその中間体および／またはメタクリル酸エステルなどのその誘導体の濃度は、少なくとも０．０５ｍＭ、より好ましくは少なくとも０．１ｍＭ、より好ましくは少なくとも１ｍＭ、より好ましくは少なくとも２ｍＭ、より好ましくは少なくとも５ｍＭ、より好ましくは少なくとも１０ｍＭである。好ましくは、細胞中のメタクリル酸またはその中間体および／またはメタクリル酸エステルなどのその誘導体の濃度は、１０ｍＭ～約３００ｍＭ、より好ましくは約２０ｍＭ～約２００ｍＭ、更により好ましくは約３０ｍＭ～約１００ｍＭ、最も好ましくは約４０ｍＭ～約７０ｍＭの範囲である。

【0154】

本発明の微生物は、バッチ、繰り返しバッチ、フェド－バッチ、繰り返しフェド－バッチまたは連続培養プロセスとして培養され得る。

【0155】

好適には、培養プロセスは、他には本明細書中で周囲培地または発酵培地として知られている培養培地で実行される。好ましくは、フェド－バッチまたは繰り返しフェド－バッチが適用され、そこでは炭素源および／または窒素源および／または追加化合物が培養プロセスに供給される。より好ましくは、炭素および／または窒素源が培養プロセスに供給される。

【0156】

本発明の微生物培養される発酵培地は、生物によって必要とされる適切な栄養が制限するという条件で、対象の生物の要求に適切である、いずれの市販品として入手可能な培地であってもよい。培養は、好気性であってもまたは嫌気性であってもよいが、オキシダーゼ酵素が利用される本発明に関して、培養は、好ましくは好気性である。

【0157】

発酵培地は、上記の炭素ベースの供給原料、窒素源、ならびに微生物の増殖および／またはメタクリル酸および／またはメタクリル酸エステルの形成に必要とされる追加化合物を好適に含有する。

【0158】

当該技術分野において既知の適切な炭素ベースの供給原料の例には、グルコース、バルトース、マルトデキストリン、スクロース、加水分解でんぷん、でんぷん、リグニン、芳香族、合成ガスまたはその成分、メタン、エタン、プロパン、ブタン、糖蜜およびオイルが含まれる。好ましくは、炭素ベースの供給原料は、バイオマスから誘導される。混合物ならびに地方自治体の廃棄物などの廃棄物、食品加工業、林業または農業からの食品廃棄物およびリグノセルロース系廃棄物も使用され得る。

【0159】

当該技術分野において既知の適切な窒素源の例には、大豆ミール、コーンスチープリカー、酵母抽出液、アンモニア、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、窒素ガスまたは他の窒素源が含まれる。

【0160】

微生物の増殖のために必要とされる追加化合物の例としては、抗生物質、抗真菌薬、酸化防止剤、緩衝液、ホスフェート、スルフェート、マグネシウム塩、微量元素および／またはビタミンが含まれる。

【0161】

培地に添加される炭素ベースの供給原料および窒素源の総量は、微生物の必要および／または培養プロセスの長さ次第で変更され得る。

【0162】

培地中の炭素ベースの供給原料および窒素源間の比率は大幅に変動し得る。

【0163】

微生物の増殖のため、かつメタクリル酸および／またはメタクリル酸エステルなどその誘導体の製造のために必要とされるホスフェート、スルフェートまたは微量元素などの追加化合物は、微生物の、すなわち真菌、酵母および細菌間の種々の分類間で変更され得る。加えて、追加される追加化合物の量は、メタクリル酸および／またはメタクリル酸エステルなどのその誘導体が形成されるかどうか、かつそれらを形成するためにいずれの経路が使用されるかによって決定され得る。

【0164】

典型的に、微生物の増殖のために必要なそれぞれの発酵培地成分の量は、養分上の増殖収率を測定することによって決定され、かつさらに形成されたバイオマスの量が主に使用された炭素ベースの供給原料の量および任意の供給レジーム中に課せられた栄養制限によって測定されるため、培養プロセスにおいて使用された炭素ベースの供給原料の量に関連して評価される。

【0165】

本発明による培養プロセスは、好ましくは、工業規模で実行される。工業規模プロセスは、好ましくは≧０．０１ｍ^３、好ましくは≧０．１ｍ^３、好ましくは≧０．５ｍ^３、好ましくは≧５ｍ^３、好ましくは≧１０ｍ^３、より好ましくは≧２５ｍ^３、より好ましくは≧５０ｍ^３、より好ましくは≧１００ｍ^３、最も好ましくは≧２００ｍ^３である体積規模の１つ以上の発酵器における培養プロセスを含むと理解される。

【0166】

好ましくは、本発明の微生物の培養は、一般に、バイオリアクターで実行される。「バイオリアクター」は、一般に、微生物が工業的に培養される容器を意味するものとして理解される。バイオリアクターは、いずれのサイズ、数および形状でもあり得、かつ栄養、増殖のための追加化合物、新しい培地、炭素ベースの供給原料、限定されないが、空気、窒素、酸素または二酸化炭素などのガスの添加を供給するための注入口を含むことができる。バイオリアクターは、発酵培地自体または微生物中からメタクリル酸および／またはメタクリル酸エステルを回収するために、培養培地の体積を除去するための排出口も含み得る。バイオリアクターは、好ましくは、培養物をサンプリングするための排出口も有する。バイオリアクターは、一般に、例えば、撹拌、ロッキング、振とう、裏返し、培養物を通してガスのバブリングなどにより、発酵培地を混合するように構成され得る。あるいは、いくつかの連続培養は混合を必要とせず、例えば、プラグフローシステムを使用する極小リアクターシステムである。バイオリアクターは、当該技術分野において一般的かつ周知であり、‘Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ’（１９８９）Ａｕｔｈｏｒｓ：Ｗｕｌｆ Ｃｒｕｅｇａｒ ａｎｄ Ａｎｎｅｌｉｓｅ Ｃｒｕｅｇｅｒ，ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｂｙ Ｔｈｏｍａｓ Ｄ．Ｂｒｏｃｋ Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡなどの標準的なテキストに見られ得る。

【0167】

したがって、本発明の第１１の態様によれば、第４、第５、第６、第７、第８またはさらなる態様の１種以上の微生物および／または第１０の態様の発酵培地を含むバイオリアクターが提供される。

【0168】

任意選択的に、バイオリアクターは、本発明の複数の異なる微生物を含み得る。

【0169】

好ましくは、バイオリアクターは、本発明の方法を実行することが可能な微生物のみを含む。

【0170】

より好ましくは、全体的に同じ培養条件が使用され得るように、バイオリアクターは同じ種の微生物のみを含む。

【0171】

バイオマス供給原料
好ましくは、使用されるバイオマスは、高い量の炭水化物を含み、特に好ましくはＣ５またはＣ６糖類、炭素ベースガスまたは芳香族、好ましくはＣ５またはＣ６糖類、より好ましくはグルコースの供給源である炭水化物、例えば、限定されないが、でんぷん、リグニン、セルロース、グリコーゲン、アラビノキシラン、キチンまたはペクチンである。

【0172】

あるいは、使用されるバイオマスは、高い量の脂肪を含み、特に好ましくはグリセロールおよび脂肪酸の供給源である脂肪または油、特にトリグリセリドである。適切なトリグリセリドとしては、植物または動物源から容易に入手可能ないずれの油または脂肪も含まれる。油および脂肪の例としては、パーム油、アマニ油、ナタネ油、ラード、バター、ニシン油、ココナッツ油、植物油、ヒマワリ油、ヒマシ油、ダイズ油、オリーブ油、カカオバター、牛酪油、鯨脂などが含まれる。

【0173】

バイオマスは、１種以上の異なるバイオマス供給源から構成されてもよい。適切なバイオマス供給源の例は、原木、エネルギー作物、農業廃棄物、食品廃棄物、地方自治体の廃棄物および産業廃棄物または連結製品である。

【0174】

原木バイオマス供給源としては、限定されないが、砕木片、バーク、ブラッシュ、ログ、のこ屑、木材タブレットまたはブリケットが含まれ得る。

【0175】

エネルギー作物バイオマス供給源としては、限定されないが、短期輪作雑木林もしくは森林；ススキ、麻スイッチグラス、アシもしくはライ麦などの非林草；糖、でんぷんもしくは油作物などの農業作物；または小型もしくは大型藻類などの水生植物ならびに雑草が含まれ得る。

【0176】

農業廃棄物としては、限定されないが、外皮、わら、コーンストーバー、小麦粉、穀物、家禽放棄物、堆肥、スラリー、合成ガスまたはサイレージが含まれ得る。

【0177】

食品廃棄物としては、限定されないが、皮／表皮、シェル、外皮、コア、種子／種、動物もしくは魚の不可食部分、ジュースおよび油抽出からのパルプ、醸造からの穀物もしくはホップ、家庭内台所廃棄物、ラード、または油もしくは脂肪が含まれ得る。

【0178】

工業廃棄物としては、限定されないが、パレットを含む未処理木材、処理木材、シェールガス、ＭＤＦ／ＯＳＤを含む木材複合材料、木材ラミネート、紙パルプ／シュレッダーくず／廃棄物、繊維／ヤーン／溶出物を含む織物、または下水スラッジが含まれ得る。

【0179】

さらなる生成物
さらに、他の有用な有機化合物、例えば、種々のエステルなどのメタクリル酸の誘導体の製造も考えられる。したがって、メタクリル酸生成物は、エステルを製造するためにエステル化されてもよい。可能なエステルは、Ｃ_１～Ｃ_２０アルキルまたはＣ_２～Ｃ_１２ヒドロキシアルキル、グリシジル、イソボルニル、ジメチルエアミノエチル、トリプロピレングリコースエステルから選択されてよい。最も好ましくは、エステルを形成するために使用されるアルコールまたはアルケンは、バイオ供給源、例えば、バイオメタノール、バイオエタノール、バイオブタノールから誘導され得る。好ましいエステルは、メタクリル酸エチル、ｎ－ブチル、ｉ－ブチル、ヒドロキシメチル、ヒドロキシプロピルまたはメチルであり、最も好ましくはメタクリル酸メチルまたはメタクリル酸ブチルである。

【0180】

好ましくは、メタクリル酸は、エステル化反応により、メタクリル酸アルキルまたはヒドロキシアルキルに変換される。そのような変換のための適切な反応条件は、当該技術分野において周知であり、かつ国際公開第２０１２／０６９８１３号パンフレット中にメタクリル酸の製造に関連して記載されている。

【0181】

本発明の第１２の態様によれば、メタクリル酸またはメタクリル酸エステルのポリマーまたはコポリマーを調製する方法であって、
（ｉ）本発明の第１、第２もしくは第３の態様またはさらなる態様に従ってメタクリル酸および／またはその誘導体を調製するステップと；
（ｉｉ）（ｉ）において調製されたメタクリル酸をエステル化して、メタクリル酸エステルを製造する任意選択的なステップと；
（ｉｉｉ）（ｉ）において調製されたメタクリル酸および／もしくはその誘導体ならびに／または存在する場合には（ｉｉ）において調製されたエステルを任意選択的に１種以上のコモノマーと重合させて、そのポリマーまたはコポリマーを製造するステップと
を含む方法が提供される。

【0182】

ステップ（ｉ）は、第１２の態様の特徴と組み合わせて、上記の第１、第２および第３の態様に関連して概説されたさらなる特徴のいずれかを含み得る。

【0183】

好ましくは、上記（ｉｉ）のメタクリル酸エステルは、Ｃ_１～Ｃ_２０アルキルまたはＣ_２～Ｃ_１２ヒドロキシアルキル、グリシジル、イソブロニル、ジメチルアミノエチル、トリプロピレングリコールエステル、より好ましくはエチル、ｎ－ブチル、ｉ－ブチル、ヒドロキシメチル、ヒドロキシプロピルまたはメチルメタクリレート、最も好ましくはメチルメタクリレート、エチルメタクリレート、ブチルメタクリレートまたはブチルメタクリレートである。

【0184】

したがって、本発明のさらなる態様によれば、メタクリル酸エステルのポリマーまたはコポリマーを調製する方法であって、
（ｉ）本発明の第３の態様またはさらなる態様に従ってメタクリル酸エステルを調製するステップと；
（ｉｉ）（ｉ）において調製されたメタクリル酸および／またはその誘導体を任意選択的に１種以上のコモノマーと重合させて、そのポリマーまたはコポリマーを製造するステップと
を含む方法が提供される。

【0185】

ステップ（ｉ）は、第１２の態様の特徴と組み合わせて、上記の第３の態様に関連して概説されたさらなる特徴のいずれかを含み得る。

【0186】

有利には、モノマー残基の全てが化石燃料以外の供給源から誘導されない場合、そのようなポリマーは相当な部分を有するであろう。

【0187】

いずれにしても、好ましいコモノマーとしては、例えば、モノエチレン性不飽和カルボン酸およびジカルボン酸、ならびにエステル、アミドおよび無水物などのそれらの誘導体が含まれる。

【0188】

特に好ましいコモノマーは、アクリル酸、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸プロピル、アクリル酸ｎ－ブチル、アクリル酸イソ－ブチル、アクリル酸ｔ－ブチル、アクリル酸２－エチルヘキシル、アクリル酸ヒドロキシエチル、アクリル酸イソ－ボルニル、メタクリル酸、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸プロピル、メタクリル酸ｎ－ブチル、メタクリル酸イソ－ブチル、メタクリル酸ｔ－ブチル、メタクリル酸２－エチルヘキシル、メタクリル酸ヒドロキシエチル、メタクリル酸ラウリル、メタクリル酸グリシジル、メタクリル酸ヒドロキシプロピル、メタクリル酸イソ－ボルニル、メタクリル酸ジメチルアミノエチル、ジアクリル酸トリプロピレングリコール、スチレン、α－メチルスチレン、酢酸ビニル、ジイソシアン酸トルエンおよびジイソシアン酸ｐ，ｐ’－メチレンジフェニルを含むイソシアネート、アクリロニトリル、ブタジエン、ブタジエンおよびスチレン（ＭＢＳ）ならびにＡＢＳであるが、ただし、（ｉ）の前記酸モノマーもしくはエステルまたは（ｉｉ）の前記エステルモノマーと、１種以上のコモノマーとのいずれかの所与の共重合において、上記コモノマーのいずれも上記（ｉ）または（ｉｉ）のメタクリル酸またはメタクリル酸エステルから選択されるモノマー以外であることを条件とする。

【0189】

当然のことながら、異なるコモノマーの混合物を使用することも可能である。コモノマー自体は、上記（ｉ）または（ｉｉ）からのモノマーと同じ方法によって調製されてもよく、または調製されなくてもよい。

【0190】

本発明の第１２の態様によれば、本発明の第１１の態様の方法から形成されたポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）およびポリメタクリル酸ブチルホモポリマーまたはコポリマーが提供される。

【実施例】

【0191】

ここで、本発明が以下の非限定的な実施例および図面を参照して説明される。

【0192】

実施例１：メタクリリル－ＣｏＡの選択的加水分解
実施例２：酵素結合反応におけるイソブチリル－ＣｏＡからメタクリリル－ＣｏＡへの酸化およびイソブチリル－ＣｏＡからメタクリル酸および補酵素Ａへの生体外変換
実施例３：イソ酪酸からメタクリル酸への全細胞生体内変換
実施例４：２－ケトイソバレレート中間体を介したグルコースからのメタクリル酸の全細胞製造
実施例５：組換型大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）による２－ケトイソバレレートからのメタクリル酸ブチルの全細胞製造

【0193】

１．１ 実施例１～４のための材料
実施例１～４を通して使用された細菌株、ならびに実験を通して使用された増殖培地および寒天板を列挙する。プライマーの表に本研究で使用される全てのプライマーを列挙し、かつプラスミドの表に、本研究中に使用されかつ構成される全てのプラスミドを列挙する。

【0194】

１．１．１ 細菌株
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０７がプラスミドクローニング宿主として使用され、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳが遺伝子発現宿主として使用された。

【0195】

１．１．２ 細菌増殖培地および寒天板
１．１．２．１ ルリア・ベルターニ（Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ）ブロス（ＬＢ培地）
ＬＢ培地が示される場合には常に、ルリア・ベルターニ（Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ）高塩濃度培地（Ｍｅｌｆｏｒｄ）（２５ｇ．Ｌ^－１）が使用された。それにより、１リットル中２５ｇのＬＢ高塩濃度培地は、カゼイン消化物からのペプトン（１０ｇ．Ｌ^－１）、酵母抽出液（５ｇ．Ｌ^－１）および塩化ナトリウム（１０ｇ．Ｌ^－１）からなる。ＬＢ培地には、多くの場合、カルベニシリン（５０μｇ．ｍｌ^－１）、クロラムフェニコール（３４μｇ．ｍｌ^－１）および／またはグルコース（１％ｗ／ｖ）が補充された。ＬＢ培地はオートクレーブによって滅菌されたが、水中グルコース（２０％ｗ／ｖ）、水中カルベニシリン（１００ｍｇ．ｍｌ^－１）およびエタノール中クロラムフェニコール（３４ｍｇ．ｍｌ^－１）の貯蔵溶液は、別々にろ過滅菌されかつ添加された。

【0196】

１．１．２．２ ＭＳＸ最少培地
ＭＳＸ培地は、室温でＭＳＡ培地（７６０ｍｌ．Ｌ^－１）、ＭＳＢ培地（２００ｍｌ．Ｌ^－１）および１２．５％（ｗ／ｖ）グルコース貯蔵溶液（４０ｍｌ．Ｌ^－１）を組み合わせることによって調製された。ＭＳＢ培地は、ＮＨ_４Ｃｌ（１５ｇ．Ｌ^－１）およびＭｇＳＯ４．７Ｈ_２Ｏ（２．０ｇ．Ｌ^－１）から構成されており、かつオートクレーブによって滅菌された。ＭＳＡ培地は、ＫＨ_２ＰＯ_４（７．８９ｇ．Ｌ^－１）から構成されており、ＭＳＡがオートクレーブによって滅菌される前に、ｐＨが７．０に達するまでヴィシュニアック（ｖｉｓｈｎｉａｃ）微量元素（２．６３ｍｌ．Ｌ^－１）およびＫＯＨ溶液が添加された。ヴィシュニアック微量元素は、以前に記載されたとおり（Ｖｉｓｈｎｉａｃ Ｗ，Ｓａｎｔｅｒ Ｍ．ＴＨＥ ＴＨＩＯＢＡＣＩＬＬＩ，Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ１９５７；２１（３）：１９５－２１３）調製されたが、３．９ｇ．Ｌ^－１のみのＺｎＳＯ４．７Ｈ_２Ｏを使用した。グルコースは、０．２２μｍ滅菌フィルターを使用してろ過滅菌された。ＭＳＸ培地には、リボフラビン（１ｍｇ．ｌ^－１）が補充されることもあり、これは、リボフラビンを最初にＭＳＢ培地（５ｍｇ．ｌ^－１）に溶解することによって達成された。次いで、この溶液をろ過滅菌し、次いでＭＳＢ＋リボフラビン溶液を、ＭＳＸ培地が単独の場合と同体積でＭＳＡおよびグルコースと混合し、リボフラビンで補充されたＭＳＸを形成した。ＭＳＸおよびリボフラビンで補充されたＭＳＸは、両方ともＬＢ培地に関して上記されたとおり、常にカルベニシリン（５０μｇ．ｍｌ^－１）およびクロラムフェニコール（３４μｇ．ｍｌ^－１）で補充された。

【0197】

１．１．２．３ ルリア・ベルターニ（Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ）寒天板
ルリア・ベルターニ（Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ）寒天板は、ルリア・ベルターニ（Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ）高塩濃度培地（Ｍｅｌｆｏｒｄ）（２５ｇ．Ｌ^－１）および寒天（２０ｇ．Ｌ^－１）を使用して調製された。ＬＢおよび寒天混合物をオートクレーブによって滅菌し、かつ注入前に５０℃の水浴で１時間冷却した。ＬＢ寒天板には、多くの場合、カルベニシリン（５０μｇ．ｍｌ^－１）、クロラムフェニコール（３４μｇ．ｍｌ^－１）および／またはグルコース（１％ｗ／ｖ）が補充された。カルベニシリン、クロラムフェニコールおよびグルコース貯蔵溶液は、ルリア・ベルターニ（Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ）液体ブロスに関して上記のとおりに調製され、かつ注入直前にＬＢ寒天溶液に添加された。グルコース貯蔵溶液は、ＬＢ寒天への添加前に１時間、５０℃の水浴で事前に加温された。

【0198】

【表1】

【0199】

配列番号１ － 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）における発現に関する、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）ＳＵ株からの４－ヒドロキシベンゾイル－ＣｏＡチオエステラーゼ（４ＨＢＴ）のコドン最適化遺伝子配列。

【0200】

配列番号４ － ＰＣＲ生成物からｐＥＴ２０ｂ（＋）プラスミドへのサブクローニングによってｐＥＴ２０ｂ（＋）：：ＣｔＨｉｓ－４ＨＢＴプラスミドが形成するように４ＨＢＴ遺伝子を改質するために実行されたポリメラーゼ鎖反応の生成物。

【0201】

配列番号５ － ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：ＣｔＨｉｓ－４ＨＢＴプラスミドにおいてカルボキシ末端ヒスチジンタグ付け４ＨＢＴ酵素をコード化する遺伝子。

【0202】

配列番号６ － 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）における発現に関する、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）からの短鎖アシル－ＣｏＡオキシダーゼ（ＡＣＸ４）をコード化するコドン最適化遺伝子配列。

【0203】

配列番号１１ － ４ＨＢＴおよびＡＣＸ４を１つのポリヌクレオチド中に連結するオーバーラップ伸長ポリメラーゼ鎖反応の生成物。

【0204】

配列番号１２ －大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）における発現に関する、シュードモナス・クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）Ｂ２３からのアシル－ＣｏＡシンテターゼ（ＡｃｓＡ）をコード化するコドン最適化遺伝子配列。

【0205】

配列番号１３ － ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４－ＡｃｓＡにおけるＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ制限部位間であり、かつそれらを含む配列。

【0206】

配列番号１４ － ｐＢＳＫ：：ｐｐＢＣＫＤにおいて送達されるシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼのサブユニットをコード化する４種の遺伝子を含有する、Ｂｉｏｍａｔｉｋによって合成された「ｐｐＢＣＫＤ」ポリヌクレオチド。

【0207】

配列番号１５ － ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４－ｐｐＢＣＫＤプラスミドにおけるＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ制限部位間であり、かつそれらを含む配列。

【0208】

配列番号２２ － 改質されたＳｓｅ８３８７Ｉ制限部位を含有するｐＥＴ１６ｂ（Ｓｓｅ）発現ベクターの配列。

【0209】

配列番号２３ － ｐＥＴ１６ｂ（Ｓｓｅ）発現ベクターにおける発現に関する、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）からの短鎖アシル－ＣｏＡオキシダーゼ（ＡＣＸ４）をコード化するコドン最適化遺伝子配列。

【0210】

配列番号２４ － ｐＥＴ１６ｂ（Ｓｓｅ）発現ベクターにおける発現に関する、リンゴからのアルコールアシルトランスフェラーゼ（ＡＡＴ）をコード化するコドン最適化遺伝子配列。

【0211】

【表2】

【0212】

【表3】

【0213】

【表4】

【0214】

【表5】

【0215】

１．２ 実施例１～４のための一般的方法
１．２．１ 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０７クローニング宿主中へのプラスミドの転換
プラスミド（１ｎｇ）は、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ ＴｒａｎｓｆｏｒｍＡｉｄ（商標）細菌転換キットを使用してコンピテントにされた大腸菌ＪＭ１０７（５０μｌ）に転換された。新たに転換された細胞を氷上で５分間インキュベーションし、次いでカルベニシリン（５０ｎｇ．μｌ^－１）が補充された、事前に加温されたＬＢ寒天板に蒔いた。寒天板は、１６時間、３７℃でインキュベーションした。

【0216】

１．２．２ プラスミドの制限消化
プラスミドから遺伝子またはポリヌクレオチド挿入を単利するため、制限エンドヌクレアーゼのＦｅｒｍｅｎｔａｓ ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ（登録商標）シリーズを使用して、提供された使用説明書に従ってプラスミドの制限消化を実行した。全ての制限消化反応は、３７℃の水浴中、３時間実行された。

【0217】

１．２．３ 線形発現ベクターの調製
プラスミドは、プラスミドＤＮＡ（１００ｎｇ．μｌ^－１）、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ緩衝液（１倍）およびＦｅｒｍｅｎｔａｓ ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ（登録商標）制限エンドヌクレアーゼを含有する制限消化反応（１００μｌ）において上記のとおり線形化された。線形化ベクターは、制限エンドヌクレアーゼを最初に熱非活性化することなく、アガロースゲル電気泳動およびゲル抽出によって精製された。次いで、線形化ベクターの５’ホスフェートにより、提供された使用説明書に従ってＡｎｔａｒｃｔｉｃ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）によって加水分解された。脱リン酸化ベクターをエタノール沈殿によって濃縮したが、これには、試料への３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）の添加（添加された体積：最初の試料体積の１／１０）と、それに続く無水エタノールの添加（添加された体積：新たな試料体積の２倍）とが必要とされた。沈殿混合物を一晩、－２０℃でインキュベーションした。次いで、沈殿したＤＮＡは、３０分間、１３４００ｒｐｍにおいてＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ｍｉｎｉＳｐｉｎ Ｆ－４５－１２－１１ローター中で遠心分離機にかけられた。上清は廃棄し、かつ細胞ペレットを７０％（ｖ／ｖ）エタノールで洗浄した。次いで、ＤＮＡペレットは、１０分間、上記と同じローター中において同じ速度で遠心分離機にかけられた。上清を除去し、ＤＮＡペレットを２０分間、換気フード中で風乾し、その後、ヌクレアーゼ水（５０μｌ）中で再び懸濁させた。線形化ベクターの濃度は、分析的アガロースゲル電気泳動によって決定された。

【0218】

１．２．４ アガロースゲル電気泳動およびゲル抽出
プラスミド消化またはＰＣＲ増幅からの線形ＤＮＡフラグメントは、アガロースゲル電気泳動によって精製された。消化またはＰＣＲ生成物をアガロース（１％（ｗ／ｖ））、臭化エチジウム（１．７８μＭ）、トリスアセテート（４ｍＭ）およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（１ｍＭ）からなるアガロースゲル上に添加した。ゲル長さ１センチメートルあたり７Ｖの電位差をゲル全体に適用し、ポリヌクレオチドを溶解した。ＤＮＡを、トランスルミネーターを有するゲル上に視覚化し、かつ興味深いポリヌクレオチドを含有するゲルスライスをメスで削除した。ポリヌクレオチドは、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ抽出キットを用いてゲルスライスから精製された。ポリヌクレオチドの濃度は、分析的アガロースゲル電気泳動によって決定された。

【0219】

１．２．５ 線形化プラスミド中への挿入の結合
遺伝子挿入は、結合反応において線形化プラスミド中へ結合された（２０μｌ）。結合反応は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（１ユニット）およびＴ４ ＤＮＡリガーゼのためのＦｅｒｍｅｎｔａｓ緩衝液（１倍）と一緒に、３ｋｂ未満の長さの遺伝子挿入に関してモル比３：１、または３ｋｂより長い長さの遺伝子挿入に関してモル比１：１における遺伝子挿入および線形ベクター（５０ｎｇ）からなった。結合は、２０分間、室温で実行され、かつ結合混合物（２．５μｌ）が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０７への転換のためのプラスミドの供給源として使用され、これは、上記のとおりＦｅｒｍｅｎｔａｓ ＴｒａｎｓｆｏｒｍＡｉｄ細菌転換キットを使用して実行された。転換された細胞は、カルベニシリンで補充された、事前に加温されたＬＢ寒天板上に蒔かれ、かつ１６時間、３７℃でインキュベーションされた。

【0220】

１．２．６ 発現ベクターへのポリヌクレオチドのサブクローニング
新たなベクターへのポリヌクレオチドのサブクローン化のため、供給源ベクターを、最初にＦｅｒｍｅｎｔａｓ ＴｒａｎｓｆｏｒｍＡｉｄ（商標）細菌転換キットを使用して、それ（１ｎｇ）を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０７中に転換することによって増幅して、次いで寒天板上でそれぞれ５つの固有のコロニーに対し、カルベニシリンで補充されたＬＢ培養物（５ｍｌ）を調製した。５×５ｍｌのＬＢ＋カルベニシリン培養物を１６時間、２５０ｒｐｍにおいて振とうしながら３７℃でインキュベーションし、次いでマニュアルに記載されるようにＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）Ｓｐｉｎミニプレップキットを使用してプラスミドを培養物から精製した。興味深いポリヌクレオチドは、所望の５’および３’クローニング部位のそれぞれに対して必要とされる制限エンドヌクレアーゼの１μｌを使用して、制限消化反応（２０μｌ）においてそれぞれのプラスミド調製物から消化された。制限消化は一緒にプールされ、かつ新たなベクター中にサブクローン化されるポリヌクレオチドは、アガロースゲル電気泳動およびゲル抽出によって供給源ベクターの残余から精製された。結合反応は、挿入に対する補足的な粘着末端を有するように事前に調製された、線形化発現ベクターへのポリヌクレオチド挿入の結合のために確立された。結合反応（２．５μｌ）は、上記のとおり大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０７への転換のためのプラスミドの供給源として使用された。発現プラスミドは、転換体のプレートから単一コロニーをＬＢ＋カルベニシリン培養物（１００ｍｌ）に接種して、１６時間、２００ｒｐｍにおいて振とうしながら３７℃において培養物をインキュベーションし、かつＱＩＡＧＥＮプラスミドＭｉｄｉＰｒｅｐキットを使用して培養物からプラスミドを精製することによって増幅された。

【0221】

１．２．７ 発現ベクターを有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳの転換
発現ベクター（１ｎｇ）は、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ発現宿主に転換された。コンピテント細胞をＮｏｖａｇｅｎから購入し、かつ氷冷された円形プラスミド（１ｎｇ）を氷冷されたコンピテント細胞（２０μｌ）に添加した。転換混合物を４２℃で３０秒の熱ショック前に５分間、氷上でインキュベーションした。熱ショック後、細胞をさらに２分間、氷上でインキュベーションした。ＳＯＣ培地（Ｎｏｖａｇｅｎ）（８０μｌ）を転換された細胞に添加し、かつ細胞をカルベニシリン（５０μｇ．ｍｌ^－１）、クロラムフェニコール（３４μｇ．ｍｌ^－１）およびグルコース（１％、ｗ／ｖ）で補充されたＬＢ寒天板に蒔く前に、６０分間、２５０ｒｐｍにおいて振とうしながら３７℃でインキュベーションした。寒天板を１６時間、３７℃でインキュベーションした。

【0222】

１．２．８ 分析的アガロースゲル電気泳動
線形ＤＮＡ同種性および濃度は、分析的アガロースゲル電気泳動によって決定した。アガロースゲルは、アガロース（１％（ｗ／ｖ））、臭化エチジウム（１．７８μＭ）、トリスアセテート（４ｍＭ）およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（１ｍＭ）からなった。ＤＮＡ試料の固定体積（５μｌ）を、ＧｅｎｅＲｕｌｅｒ（商標）１ｋｂ Ｐｌｕｓ ＤＮＡラダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（５μｌ）と一緒にゲル上に装填した。試料の濃度を推測するため、ＧｅｎｅＲｕｌｅｒ（商標）１ｋｂ Ｐｌｕｓ ＤＮＡラダーのマニュアルに記載のとおり、試料バンドの強度をラダーの類似の径および既知の質量のバンドの強度と視覚的に比較した。

【0223】

１．２．９ ナトリウム－ドデシル－スルフェートポリアクリルアミドゲル電気泳動
試料（１．５ｍｌ）を細胞培養物から採取し、かつ細胞を１０分間、５０００ｇにおける遠心分離によってペレット化した。試料が採取されたときの各ＯＤ_６００ユニットの細胞培養物に対して１００μｌを使用して、細胞ペレットを細胞溶解緩衝液に再び懸濁させた。細胞溶解緩衝液は、リン酸カリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．５）、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ細胞溶解清浄剤（Ｍｅｒｃｋ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）（１倍）、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅヌクレアーゼ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）（０．０１％、ｖ／ｖ）およびプロテアーゼ阻害薬カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含有した。再懸濁させた細胞を２５０ｒｐｍで振とうしながら２０分間インキュベーションし、かつ４℃で２０分間、１８，０００ｇにおいて遠心分離機にかけた。細胞ペレットを再懸濁させたときに使用したものと同じ体積を使用して、不溶性フラクションをリン酸カリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．５）中に再懸濁した。可溶性および不溶解性フラクションを、β－メルカプトエタノール（５％、ｖ／ｖ）を含有する２倍量Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）と混合した。試料を５分間、１００℃で沸騰し、かつＢｉｏ－Ｒａｄ ＡｎｙＫＤ ＴＧＸプレキャストゲル上に装填した。Ｔｒｉｓ／Ｇｌｙｃｉｎｅ／ＳＤＳランニング緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）中、２００Ｖで電気泳動を実行した。５分間、緩やかに振とう（５０ｒｐｍ）しながら、室温で再蒸留水中にそれらを浸漬することによってゲルを洗浄した。水は除去され、かつ洗浄手順をさらに４回繰り返した。次いで、１６時間、緩やかに振とうしながら、室温でＥＺＢｌｕｅ（商標）ゲル染色試薬（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）中に一晩（１６時間）浸漬することによって染色した。

【0224】

１．３ 実施例１ － メタクリリル－ＣｏＡからのメタクリル酸の製造：
アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）ＳＵ株（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＣ８０２２４．１、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ０４４１６、ＥＣ番号３．１．２．２３）からの酵素、４－ヒドロキシベンゾイル－ＣｏＡチオエステラーゼ（４ＨＢＴ）は、構造上メタクリリル－ＣｏＡと関連する基質における既知の活性を有するチオエステラーゼに関するデータベースおよび文献調査後、メタクリリル－ＣｏＡの加水分解のための候補者チオエステラーゼとして識別された。

【0225】

４ＨＢＴに関してアミノ酸配列をコード化する遺伝子は、ＮｏｔＩ制限部位が５’末端に組み込まれ、かつＮｄｅＩ制限部位が３’末端に付加された状態で、Ｂｉｏｍａｔｉｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のためにコドン最適化および合成された。

【0226】

合成されたポリヌクレオチド（配列番号１）は、ｐＢＭＨ：：４ＨＢＴクローニングベクターに送達され、かつ４ＨＢＴ遺伝子挿入は、ＮｄｅＩおよびＮｏｔＩ制限部位において、事前に線形化されたｐＥＴ２０ｂ（＋）発現ベクター中にサブクローン化され、ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴが形成した。次いで、新たに構成されたｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ中に転換され、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴが形成した。

【0227】

４－ヒドロキシベンゾイル－ＣｏＡチオエステラーゼ酵素を発現するため、ブルコース、カルベニシリンおよびクロラムフェニコールで補充されたＬＢ培地の発端培養物（２０ｍｌ）を最初にグルコース、クロラムフェニコールおよびカルベニシリンで補充されたＬＢ寒天板からの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴの単一コロニーで接種した。培養物が１．０のＯＤ_６００に達するまで２００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で発端培養物をインキュベーションした。次いで、細胞を４℃で１５分間、５０００ｇにおける遠心分離によって回収して、同じくグルコース、カルベニシリンおよびクロラムフェニコールで補充されたＬＢ培地の中間培養物（１００ｍｌ）に接種するために使用した。中間培養物も１．０のＯＤ_６００まで２００ｒｐｍにおいて振とうしながら３７℃でインキュベーションされた。次いで、中間培養物中の細胞を４℃で１５分間、５０００ｇにおける遠心分離によって回収して、その後、２．５Ｌバッフル付き振とうフラスコ中で再びグルコース、カルベニシリンおよびクロラムフェニコールで補充された新しいＬＢ培地（１Ｌ）中で再懸濁した。この培養物は、１．０のＯＤ_６００まで２００ｒｐｍにおいて振とうしながら３７℃でインキュベーションされ、次いで０．４ｍＭの最終濃度までイソプロプル－β－Ｄ－チオガラクトピランノシド（ＩＰＴＧ）の添加により、４ＨＢＴの発現が誘導された。培養物をさらに５．５時間、同じ条件下でインキュベーションした。培養物を均等に３本の遠心分離管に分割し、次いで細胞を４℃において２０分間、５０００ｇにおける遠心分離によって回収した。細胞が回収される前に採取された培養物の試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析したところ、タンパク質が非常に溶解性であり、良好に発現されていることが示された。各遠心分離管の細胞ペレットをアッセイ緩衝液（５０ｍｌ）で３回洗浄した。このアッセイ緩衝液は、水酸化カリウムでｐＨ７．５に調節された、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル］）エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）（５０ｍＭ）から構成されていた。細胞ペレットは、溶解するまで－８０℃で冷凍した。このプロセスを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）、空ｐＥＴ２０ｂ（＋）ベクター陰性対照株で繰り返した。

【0228】

４ＨＢＴ酵素の無細胞抽出液を調整するため、以前に調製された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴの細胞ペレットの１つをＨＥＰＥＳ（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）アッセイ緩衝液に再懸濁させ、かつＣｏｎｓｔａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ細胞破壊器中で溶解させた。細胞溶解物を４℃で１５分間、１８，０００ｇにおいて遠心分離機にかけ、かつその上清を４℃でさらに６０分間、５７，７５０ｇにおいて遠心分離機にかけた。この上清を、ＶｉｖａＳｐｉｎ Ｖｉｖａ６ １０，０００ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｃｕｔ Ｏｆｆ遠心分離濃縮装置を使用して、体積が１／６に減少するまで１８℃で１０，０００ｇにおいて遠心分離機にかけ、続いてＨＥＰＥＳアッセイ緩衝液中で６倍に再希釈し、さらに遠心分離濃縮装置において体積を１／６に減少させて洗浄した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴ過剰発現培養からの無細胞抽出液の合計タンパク質濃度は、ＢｉｏＲａｄ ＤＣアッセイキットを使用して、ウシ血清アルブミンをタンパク質標準として使用して実行された。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）、陰性対照株の細胞ペレットからの無細胞抽出液を調製するために同じ手順を実行した。

【0229】

メタクリリル－ＣｏＡにおける活性に関して４ＨＢＴ酵素を分析するため、メタクリリル－ＣｏＡを最初に調製した。メタクリリル－ＣｏＡの合成は、補酵素Ａとメタクリル酸無水物との反応によって実行された。この反応は、リン酸ナトリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ８．５）中での補酵素Ａ（２０ｍＭ）およびメタクリル酸無水物（４０ｍＭ）からなった。この反応物を氷上でインキュベーションし、かつ３０分間、２分ごとにボルテックスし、最終反応混合を塩酸でｐＨ３．５まで酸性化した。メタクリル酸副産物および未反応のメタクリル酸無水物を１０ｍｌの水飽和ジエチルエーテルでの４回の抽出によって除去した。メタクリリル－ＣｏＡが分析規模のカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ Ｃ１８カラム、４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）上での逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）によって精製された。試料（７５μｌ）をＣ１８カラム上に注入し、かつ１ｍｌ．分^－１の流速で０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中線形アセトニトリル勾配（１．８％～１３．５％）によって４０分間かけて溶出させた。主要ピークは、メタクリリル－ＣｏＡ含有ピークであり、かつメタクリリル－ＣｏＡ含有フラクションを回収し、プールした。アセトニトリルをロータリーエバポレーション（２１℃、３ｋＰａ）によって除去し、メタクリリル－ＣｏＡおよびトリフルオロ酢酸の水溶液が残った。このメタクリリルＣｏＡおよびトリフルオロ酢酸の溶液は、水酸化ナトリウムによってｐＨ７にされ、かつ凍結乾燥前に液体窒素で急速冷凍された。ＴＦＡは、フリーズドライされた試料を無ヌクレアーゼ水（ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ,１０ｍｌ）に再溶解し、かつ一度は５ｍｌ、最終的に１ｍｌの無ヌクレアーゼ水中でさらに２回凍結乾燥－再溶解サイクルを繰り返すことによって除去された。メタクリリル－ＣｏＡの濃度は、１６８００Ｍ１．ｃｍ^－１のモル吸光係数で２６０ｎｍにおける吸光度によって決定された。

【0230】

４ＨＢＴの粗酵素的アッセイを、無細胞タンパク質抽出液（１ｍｇ．ｍｌ^－１）、メタクリリル－ＣｏＡ（約１００μＭ）、５’，５－ジチオビス－（２－ニトロベンゼン）酸（ＤＴＮＢ）（５００μＭ）を含有するキュベット（１ｍｌ）中で実行した。反応は基質の添加によって開始され、かつ４１２ｎｍで監視された。酵素的アッセイは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）の無細胞抽出液に関して繰り返した。４ＨＢＴ過剰発現株および空ベクター対照株の両方の無細胞抽出液に関する酵素アッセイも基質としてイソブチリル－ＣｏＡに対して繰り返した。

【0231】

４ＨＢＴの粗酵素アッセイは、４ＨＢＴがメタクリリル－ＣｏＡの加水分解に触媒作用を引き起こし、かつ基質としてイソブチリル－ＣｏＡを上回ってメタクリリル－ＣｏＡに対して選別性を示したことを明示した。

【0232】

４－ヒドロキシベンゾイル－ＣｏＡのチオエステラーゼをより良好に特徴付けるため、それが無細胞抽出液の一部である場合とは対照的に純粋な酵素として分析され得るように、酵素はＨｉｓタグ付けされた。酵素をＨｉｓタグ付けするため、ポリメラーゼ鎖反応が確立された。４ＨＢＴのＨｉｓタグ付けのためのフォワードプライマーおよびリバースプライマー、ＨＨＴ．Ｆ（配列番号２）およびＨＨＴ．Ｒ（配列番号３）は、（５’－ＧＧＡ－３’）配列を有する４ＨＢＴをコード化する遺伝子からの（５’－ＴＡＡ－３’）停止コドンを置き換え、かつその直後に３’ＸｈｏＩ制限部位を導入するよう設計された。したがって、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ制限部位間にｐＥＴ２０ｂ（＋）に戻るＰＣＲ生成物をクローン化するとき、グリシン－ロイシン－グルタメートスペーサー配列およびカルボキシ末端ヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ）タグを有する４ＨＢＴをコード化するオープンリーディングフレームが作成された。

【0233】

ポリメラーゼ鎖反応混合物は、鋳型ＤＮＡとしてのｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴプラスミド（５０ｐｇ．μｌ^－１）、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（１ユニット）、プライマーＨＨＴ．Ｆ（０．４μＭ）、プライマーＨＨＴ．Ｒ（０．４μＭ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）（０．２ｍＭ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）（０．２ｍＭ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）（０．２ｍＭ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）（０．２ｍＭ）、ＭｇＣｌ_２（１ｍＭ）およびＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ用のＮｏｖａｇｅｎ緩衝液＃１（１倍）を含有した。ＰＣＲ混合物を、３分間の９４℃で開始し、次いで９４℃での３０秒の融解、５５℃での３０秒の焼き鈍し、７２℃での８０秒の伸長の３０回の反復を通してサイクルし、その後、５分間７２℃で終了するようにプログラムされたサーモサイクラーに装填した。

【0234】

ＰＣＲ生成物（配列番号４）は、アガロースゲル電気泳動、それに続くゲル抽出によって精製され、かつｐＪＥＴ１．２クローニングベクター中に平滑断端結合され、ｐＪＥＴ１．２：：ＣｔＨｉｓ－４ＨＢＴを形成した。次いで、挿入は、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ制限部位間でｐＪＥＴ１．２：：ＣｔＨｉｓ－４ＨＢＴからｐＥＴ２０ｂ（＋）へサブクローン化され、ｐＥＴ２０ｂ（＋）を形成した。次いで、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ発現宿主は、ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：ＣｔＨｉｓ－４ＨＢＴによって転換され、Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグ付け４ＨＢＴ発現宿主、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：ＣｔＨｉｓ－４ＨＢＴを形成した。

【0235】

次いで、純粋なカルボキシ末端Ｈｉｓタグ付け４ＨＢＴ酵素は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴと正確に同じ方法において、最初に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：ＣｔＨｉｓ－４ＨＢＴの培養物を増殖させ、発現を誘発することによって調製された。発現の５．５時間後に採取された培養物からの試料は、カルボキシ末端Ｈｉｓタグ付け４ＨＢＴ酵素も非常に溶解性であり、かつ高レベルで発現されたことを示した。細胞は、細胞培養物を３本の遠心分離管に分割し、かつ４℃で２０分間、５０００ｇにおいて遠心分離にかけることによって回収された。細胞ペレットは洗浄されなかったが、代わりに直接－８０℃において貯蔵された。カルボキシ末端ヘキサヒスチジンタグ付け４ＨＢＴの無細胞抽出液は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：ＣｔＨｉｓ－４ＨＢＴ細胞ペレットの１つをニッケル－セファローズ（Ｎｉｃｋｅｌ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ＦＰＬＣカラム用の結合緩衝液（６ｍｌ）中で再懸濁することによって調製された。結合緩衝液は、ＮａＨ_２ＰＯ_４（１０ｍＭ）、Ｎａ_２ＨＰＯ_４（１０ｍＭ）、ＮａＣｌ（５００ｍＭ）、イミダゾール（３０ｍＭ）からなり、かつ塩酸（ＨＣｌ）でｐＨ７．４に調整された。それらをＣｏｎｓｔａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ細胞破壊器中で溶解させる前に、再懸濁された細胞にＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼ（０．６μｌ）を添加した。細胞溶解物を４℃で１５分間、１８，０００ｇにおいて遠心分離機にかけ、かつその上清を４℃で６０分間、５７，７５０ｇにおいて遠心分離機にかけることによって浄化した。次いで、この上清を結合緩衝液で均衡化されたＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＨｉｓＴｒａｐ（商標）ＦＦ Ｃｒｕｄｅカラム（１ｍｌ）上に装填した。未結合タンパク質は、５カラム床体積の結合緩衝液でカラムから洗浄除去され、かつＨｉｓタグ付けタンパク質は、２０カラムにわたる３０ｍＭから５００ｍＭまでの線形イミダゾール濃度勾配で溶出された。タンパク質溶出を２８０ｎｍで監視し、かつＳＤＳ－ＰＡＧＥにより、カルボキシ末端Ｈｉｓタグ付け４ＨＢＴの存在および純度に関してフラクションをチェックした。純粋なＣｔＨｉｓ－４ＨＢＴタンパク質を含有するフラクションをプールし、かつ溶出緩衝液をリン酸カリウムアッセイ緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．５）で置き換える緩衝液交換は、ＶｉｖａＳｐｉｎ Ｖｉｖａ６ １０，０００ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｃｕｔ－Ｏｆｆ遠心分離濃縮装置において実行された。緩衝液交換を実行するため、プールされたフラクションの量が１ｍｌまで低下するまで、プールされたフラクションを１８℃で１０，０００ｇにおいて遠心分離濃縮装置の限外ろ過膜を通して遠心分離機にかけた。残りのタンパク質フラクションは、リン酸カリウムアッセイ緩衝液で６倍に希釈し、１／６までの体積減少が達成されるまで、試料を同じ条件下で限外ろ過膜を通してさらなる遠心分離によって濃縮した。リン酸カリウムアッセイ緩衝液での後の希釈および再濃縮を再度実行し、かつＣｔＨＩＳ－４ＨＢＴタンパク質の濃度は、カルボキシ末端Ｈｉｓタグ付け４ＨＢＴ酵素に関して、２０９７０Ｍ１．ｃｍ^－１のモル吸光係数および１７５１６．５ｍｇ．ｍｍｏｌ^－１の分子量を使用して、ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ１０００分光測光器においてＵＶ２８０吸光度によって決定した。モル吸光係数および分子量の値は、Ｅｘｐａｓｙ ＰｒｏｔＰａｒａｍツールを使用し、ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：ＣｔＨｉｓ－４ＨＢＴプラスミド中でカルボキシ末端Ｈｉｓタグ付け４ＨＢＴ酵素をコード化する遺伝子配列（配列番号５）のアミノ酸翻訳を使用して決定された。

【0236】

精製されたカルボキシ末端ヘキサヒスチジンタグ付け４ＨＢＴ酵素の動力学的特徴決定は、以前に調製されたメタクリリル－ＣｏＡに対して、および（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈからイソブチリル－ＣｏＡリチウム塩として購入された）イソブチリル－ＣｏＡに対して実行された。

【0237】

メタクリリル－ＣｏＡ加水分解反応（２００μｌ）は、精製されたＣｔＨｉｓ－４ＨＢＴタンパク質（０．０７５ｍｇ．ｍｌ^－１）および反応を監視するためのＤＴＮＢ（０．５ｍＭ）を使用して、Ｎｕｎｃ ９６ウェルプレートにおいて実行された。最初の速度は、０．３７５ｍＭ、０．３ｍＭ、０．２２５ｍＭ、０．１５ｍＭおよび０．０７５ｍＭのメタクリリル－ＣｏＡ開始濃度に対して決定された。反応は酵素の添加によって開始した。

【0238】

イソブチリル－ＣｏＡ加水分解反応（２００μｌ）も、精製されたＣｔＨＩＳ－４ＨＢＴタンパク質（１ｍｇ．ｍｌ^－１）および反応を監視するためのＤＴＮＢ（０．５ｍＭ）を使用して、Ｎｕｎｃ ９６ウェルプレートにおいて実行された。最初の速度は、０．５ｍＭ、０．４ｍＭ、０．３ｍＭ、０．２ｍＭおよび０．１ｍＭのイソブチリル－ＣｏＡ開始濃度に対して決定された。反応は酵素の添加によって開始した。

【0239】

Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ－Ｂｕｒｋｅプロットをメタクリリル－ＣｏＡ（図１）およびイソブチリル－ＣｏＡ（図２）の両方の動力学的特徴決定のためにプロットした。メタクリリル－ＣｏＡに関するカルボキシ末端ヘキサヒスチジンタグ付け４ＨＢＴの速度定数は、１．６ｍＭのＫ_Ｍおよび４７０ｎｍｏｌｓ．ｍｇ^－１．分^－１のＶ_ｍａｘであったのに対し、イソブチリル－ＣｏＡに関して、それらは３ｍＭのＫ_Ｍおよび１６．７ｎｍｏｌｓ．ｍｇ^－１．分^－１のＶ_ｍａｘであった。

【0240】

したがって、４ＨＢＴがメタクリリル－ＣｏＡの加水分解に触媒作用を引き起こし、かつメタクリル酸を製造するために使用可能であることが明示された。４ＨＢＴは、イソブチリル－ＣｏＡに関するよりも低いＫ_Ｍ値および高いＶ_ｍａｘ値でメタクリリル－ＣｏＡを加水分解するため、メタクリリル－ＣｏＡの加水分解は、有利に非常に選択的である。

【0241】

１．４ 実施例２ － イソブチリル－ＣｏＡからのメタクリリル－ＣｏＡおよびメタクリル酸の形成
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＢ０１７６４３．１、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ９６３２９、ＥＣ番号１．３．３．６）からの酵素短鎖アシル－ＣｏＡオキシダーゼ（ＡＣＸ４）は、文献調査後、昆虫細胞株において発現する場合、基質としてイソブチリルＣｏＡにおいて検出可能な活性を有するアシル－ＣｏＡオキシダーゼ酵素として識別された。

【0242】

このオキシダーゼが、代謝経路へのその組み込みのために基質としてのイソブチリル－ＣｏＡにおいて有用なレベルの活性で大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において機能的に発現できるかどうかを決定するため、ＡＣＸ４に関してアミノ酸配列をコード化する遺伝子は、ＮｄｅＩ制限部位が５’末端で組み込まれ、かつＸｈｏＩ制限部位が３’末端で組み込まれた状態で、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のためにコドン最適化された。

【0243】

合成されたポリヌクレオチド（配列番号６）は、ｐＭＡ－ＲＱ：：ＡＣＸ４プラスミドに送達され、かつ遺伝子挿入は、ＮｄｅＩおよびＮｏｔＩ制限部位において、事前に線形化されたｐＥＴ２０ｂ（＋）ベクター中にサブクローン化され、ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：ＡＣＸ４が形成した。次いで、新たに構成されたｐＥＴ２０ｂ（＋）：：ＡＣＸ４は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ中に転換され、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：ＡＣＸ４が形成した。

【0244】

ＡＣＸ４の発現を試験するため、カルベニシリンおよびクロラムフェニコールで補充されたＭＳＸ発端培養物をグルコース、クロラムフェニコールおよびカルベニシリンで補充されたＬＢ寒天板からの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：ＡＣＸ４の単一コロニーで接種した。１６時間、２００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で発端培養物（２０ｍｌ）をインキュベーションした。細胞を４℃で１５分間、５０００ｇにおける遠心分離によって発端培養物から回収し、かつ同じくクロラムフェニコールおよびカルベニシリンで補充されたＭＳＸ培地中間培養物（１００ｍｌ）中に再懸濁させた。中間培養物は、１．０のＯＤ_６００まで２００ｒｐｍにおいて振とうしながら３７℃でインキュベーションされた。次いで、４℃で１５分間、５０００ｇにおける遠心分離によって細胞を中間培養物から回収し、かつ２．５Ｌバッフル付き振とうフラスコ中でクロラムフェニコール、カルベニシリンおよびリボフラビンで補充された新しいＭＳＸ培地（１Ｌ）中で再懸濁した。この培養物は、０．７のＯＤ_６００まで２００ｒｐｍにおいて振とうしながら３７℃でインキュベーションされ、次いで０．４ｍＭの最終濃度までＩＰＴＧの添加によって発現が誘導された。培養物をさらに７時間、同じ条件下でインキュベーションし、その後、細胞を３本の遠心分離管に分割し、次いで４℃において２０分間、５０００ｇにおける遠心分離によって回収した。細胞が回収される前に採取された培養物の試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析したところ、ＡＣＸ４タンパク質が良好に発現され、かつＡＣＸ４タンパク質の１／３が可溶性フラクションに存在し、かつ２／３が不溶性フラクションに存在することが示された。細胞ペレットをＫＯＨでｐＨ７．５に調節されたＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ）で３回洗浄した。細胞ペレットは、溶解するまで－８０℃で冷凍した。このプロセスを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）陰性対照株で繰り返した。

【0245】

４ＨＢＴ酵素の無細胞抽出液を調整するため、以前に調製された細胞ペレットの１つを１０μＭの最終濃度でフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）が補充されたＨＥＰＥＳ（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）緩衝液（６ｍｌ）に再懸濁させた。次いで、再懸濁された細胞をＣｏｎｓｔａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ細胞破壊器中で溶解させた。この溶解物を４℃で１５分間、１８，０００ｇにおいて遠心分離機にかけ、かつその上清を４℃でさらに６０分間、５７，７５０ｒｐｍにおいて遠心分離機にかけた。この上清をＶｉｖａＳｐｉｎ Ｖｉｖａ６ １０，０００ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｃｕｔ Ｏｆｆ遠心分離濃縮装置において、残余物の体積が１／６に減少するまで１８℃で１０，０００ｇにおいて遠心分離機にかけて濃縮した。残余物を再びＦＡＤ（１０μＭ）ｇａ補充されたＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）中で６倍に再希釈することによって一度洗浄し、続いて遠心分離濃縮装置において１／６の体積減少による第２の濃縮ステップを行った。残余物における合計タンパク質濃度は、ＢｉｏＲａｄ ＤＣタンパク質アッセイキットを使用して、ウシ血清アルブミンをタンパク質標準として使用して決定された。

【0246】

イソブチリル－ＣｏＡ（ＩＢ－ＣｏＡ）、メタクリリル－ＣｏＡ（ＭＡＡ－ＣｏＡ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、メタクリル酸（ＭＡＡ）および補酵素Ａ（ＣｏＡ－ＳＨ）を確認するため、分析的ＨＰＬＣ法が展開された。補酵素Ａ、メタクリリル－ＣｏＡおよびイソブチリル－ＣｏＡは、それぞれ１１．０分、３０．８分および３２．２分で溶出した。補酵素Ａ、メタクリリル－ＣｏＡおよびイソブチリル－ＣｏＡは、それぞれ１２分、３１．６分および３２．９分における主要ピークと関連する小テーリング（マイナー）ピークをそれぞれ有した（図３）。メタクリル酸は１３．５分で溶出し、ＡＣＸ４の粗分析において、かつイソブチリル－ＣｏＡおよびメタクリリル－Ｃｏａ標準のための内標準として使用されるＦＡＤは２７．８分で溶出した。

【0247】

補酵素Ａ、メタクリル酸、イソブチリル－ＣｏＡおよびメタクリリル－ＣｏＡが無細胞抽出液からのピークと混同されなかったことを保証するため、ＨＥＰＥＳ緩衝液中の無ＡＣＸ４細胞抽出液（０．８ｍｇ．ｍｌ^－１）、精製されたＣｔＨｉｓ－４ＨＢＴ（０．６ｍｇ．ｍｌ^－１）およびＦＡＤ（１０μＭ）を使用して非基質対照を実行した。補酵素Ａ、メタクリル酸、メタクリリルＣｏＡまたはイソブチリル－ＣｏＡ溶出時間においてピークは観察されなかった（図４）。

【0248】

ＡＣＸ４の活性試験は、１．５ｍｌの極小遠心分離管で実行された。粗酵素反応は、ＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）中の無細胞ＡＣＸ４タンパク質抽出液（０．８ｍｇ．ｍｌ^－１）、イソブチリル－ＣｏＡ（５００μＭ）およびフラビンアデニンジヌクレオチド（１０μＭ）からなった。反応物は、３０分間、２５０ｒｐｍにおいて振とうしながら１．５ｍｌの極小遠心分離管中で３０℃においてインキュベーションされ、最終反応生成物は、分析的ＨＰＬＣによって分析された（図５）。メタクリリル－ＣｏＡが、３０．７分においてピークを有する主生成物であった。粗酵素アッセイ中に形成されたメタクリル酸の濃度は７４μＭであった。

【0249】

メタクリリル－ＣｏＡのピークが本物であることと、それが、溶出時間がシフトしたイソブチリル－ＣｏＡのピークではないこととを確認するため、試料にイソブチリル－ＣｏＡを添加し、再びＨＰＬＣによって分析した。試料が酸性化されたときにＡＣＸ４は非活性化され、かつこれによりいずれの追加のイソブチリル－ＣｏＡもメタクリリル－ＣｏＡに変換されないであろうことを保証した。実際、イソブチリル－ＣｏＡを添加した試料は、最初のメタクリリル－ＣｏＡピークのみではなく、イソブチリル－ＣｏＡの特徴的テールピークを有する３２分における追加のピークも示した（図６）。

【0250】

メタクリル酸は、酵素結合反応においてイソ酪酸から製造され得るかどうかを決定するため、それによって粗ＡＣＸ４が精製されたＣｔＨｉｓ－４ＨＢＴ酵素とインキュベーションされる実験が確立された。ＡＣＸ４の同じ無細胞抽出液がＡＣＸ４のためのタンパク質供給源として使用されたが、純粋なＣｔＨｉｓ－４ＨＢＴは、実施例１の動力学的特徴決定に関するものと同じであるが、以前に使用されたホスフェート緩衝液の代わりに、最後にＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）への緩衝液変更が実行される方法で再び調製された。したがって、粗ＡＣＸ４（０．８ｍｇ．ｍｌ^－１）は、ＨＥＰＥＳ緩衝液中のＦＡＤ（１０μＭ）およびイソブチリル－ＣｏＡ（５００μＭ）と一緒に純粋なＣｔＨｉｓ－４ＨＢＴ（０．６ｍｇ．ｍｌ^－１）と同時インキュベーションされた。試料を３０分間２５０ｒｐｍにおいて振とうしながら３０℃においてインキュベーションし、かつＨＰＬＣによって分析した。メタクリル酸および補酵素Ａが主生成物であった。メタクリル酸のピークは１３．４５分で観察されたが、補酵素Ａの主要およびマイナーピークは、それぞれ１１．１分および１２．１分で観察された。結合酵素反応（図７）中に生成されたメタクリル酸の濃度は、粗ＡＣＸ４アッセイ中のみのものより４．７倍高く、かつ３４５μＭであった。

【0251】

これにより、ＡＣＸ４がイソブチリル－ＣｏＡを酸化させることが確認される。生体外でのＡＣＸ４と４ＨＢＴとの組合せがイソブチリル－ＣｏＡからメタクリル酸への変換を工業的に適用可能なレベルまで可能にすることがさらに実証された。

【0252】

１．５ 実施例３ － イソ酪酸からメタクリル酸への全細胞生体内変換
補酵素Ａによってイソ酪酸を活性化して、イソブチリル－ＣｏＡを形成するためのアシル－ＣｏＡシンテターゼを使用する、イソ酪酸からメタクリル酸へのさらなる生体内変換が本実施例において示され、かつイソブチリル－ＣｏＡをメタクリリル－ＣｏＡへ酸化させるシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）からのアシル－ＣｏＡオキシダーゼＡＣＸ４、ならびにメタクリリル－ＣｏＡをメタクリル酸へ加水分解するアルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）ＳＵ株からのアシルＣｏＡチオエステラーゼ４ＨＢＴおよび補酵素Ａも示される。

【0253】

シュードモナス・クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）Ｂ２３（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＢＡＤ９０９３３．１、ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号：Ｑ５ＣＤ７２）からのアシル－ＣｏＡシンテターゼＡｃｓＡは、データベースおよび文献調査から、０．１４ｍＭの発表されたミカエリス（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ）定数（ｋ_ｍ）および１０．６秒^－１のターンオーバー数（ｋ_ｃａｔ）でイソ酪酸をイソブチリル－ＣｏＡへ活性化することができるＡＭＰ形成アシル－ＣｏＡシンテターゼとして識別された。

【0254】

本実施例において、本発明者らは、ｐＥＴ２０ｂ（＋）のＴ７促進因子の制御下での単一操作から、４ＨＢＴ、ＡＣＸ４およびＡｃｓＡをコード化する遺伝子の同時発現のためのｐＥＴ２０ｂ（＋）ベースのベクター、ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４－ＡｃｓＡの構成、ならびにイソ酪酸からメタクリル酸への全細胞生体内変換のための代謝経路をコード化するためのその使用を実証する。

【0255】

オペロンの構成は２段階で実行された。第１段階は、４ＨＢＴおよびＡＣＸ４のみをコード化する遺伝子の同時発現のためのｐＥＴ２０ｂ（＋）ベースのベクター、ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４の構成を含み、一方、第２段階は、最終的なｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４－ＡｃｓＡプラスミドを構成するための、適所にそのリボソーム結合部位を有するｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４ベクターへのＡｃｓＡをコード化する遺伝子のサブクローン化が関与した。

【0256】

ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４ベクターを構成するため、４ＨＢＴおよびＡＣＸ４をコード化する遺伝子が最初に単一ポリヌクレオチド中に結合し、かつ後者の効率的な翻訳を保証するため、４ＨＢＴをコード化する遺伝子およびＡＣＸ４をコード化する遺伝子間に新たなリボソーム結合部位があった。２つの遺伝子を一緒に結合させるため、オーバーラップ伸長ポリメラーゼ鎖反応が実行された。オーバーラップ伸長ポリメラーゼ鎖反応は、それ自体、２ステップで実行された。最初に、４ＨＢＴをコード化する遺伝子およびＡＣＸ４をコード化する遺伝子は、２つの別個のポリメラーゼ鎖反応、反応「Ａ」および「Ｂ」において、それらのそれぞれの発現ベクター、ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴおよびｐＥＴ２０ｂ（＋）：：ＡＣＸ４から増幅された。

【0257】

オーバーラップ伸長ポリメラーゼ鎖反応のために使用されるプライマーは、プライマーＯＥ．Ａ．Ｆ（配列番号７）、オーバーラップ伸長ポリメラーゼ鎖反応Ａのためのフォワードプライマー；プライマーＯＥ．Ａ．Ｒ（配列番号８）、ポリメラーゼ鎖反応Ａのリバースプライマー；プライマーＯＥ．Ｂ．Ｆ（配列番号９）、オーバーラップ伸長ポリメラーゼ鎖反応Ａのためのフォワードプライマー、および最終的にＯＥ．Ｂ．Ｒ（配列番号１０）、オーバーラップ伸長ポリメラーゼ鎖反応Ａのためのリバースプライマーであった。プライマーＯＥ．Ａ．Ｆの突出部は、新たなポリヌクレオチドの５’末端においてＮｄｅＩ制限部位を維持するよう設計された。プライマーＯＥ．Ａ．ＲおよびＯＥ．Ｂ．Ｆの突出部は、反応ＡおよびＢからの２種のＰＣＲ生成物の連結を可能にするために、互いに補足的配列を含有するよう設計された。補足的配列は、２種のＰＣＲ生成物の連結において、４ＨＢＴ遺伝子およびＡＣＸ４遺伝子間の遺伝子間配列が、後者の遺伝子のための新たなリボソーム結合部位を含有するように導入されるように設計された。最終的に、プライマーＯＥ．Ｂ．Ｒの突出部は、２種の制限部位、ＮｈｅＩ制限部位およびＸｈｏＩ制限部位を含有するように設計された。これにより、４ＨＢＴおよびＡＣＸ４遺伝子を含有する連結されたポリヌクレオチドが、そのＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ制限部位においてｐＥＴ２０ｂ（＋）プラスミド中にクローン化され、ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４を形成することが可能となり、かつＡｃｓＡ遺伝子が、ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩ制限部位間でｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４プラスミド中にクローン化されて、ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４－ＡｃｓＡプラスミドを形成することが可能となった。アデニンおよびチミンリッチスペーサー配列は、それが他のプライマーの焼き鈍し温度とより近く一致するようにプライマーの焼き鈍し温度を低下するため、かつ隣接するＮｈｅＩおよびＸｈｏＩ制限部位における効率的な二重消化を可能にするため、プライマーＯＥ．Ｂ．ＲにおいてＮｈｅＩおよびＸｈｏＩ制限部位間に含まれた。

【0258】

ポリメラーゼ鎖反応物Ａ（５０μｌ）は、鋳型ＤＮＡとしてのｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴ（１０ｐｇ．μｌ^－１）、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（１ユニット）、プライマーＯＥ．Ａ．Ｆ（０．４μＭ）、プライマーＯＥ．Ａ．Ｒ（０．４μＭ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）（０．２ｍＭ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）（０．２ｍＭ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）（０．２ｍＭ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）（０．２ｍＭ）、ＭｇＣｌ_２（１ｍＭ）およびＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ用のＮｏｖａｇｅｎ緩衝液（１倍）を含有した。

【0259】

ポリメラーゼ鎖反応物Ａ（５０μｌ）は、鋳型ＤＮＡとしてのｐＥＴ２０ｂ（＋）：：ＡＣＸ４（２０ｐｇ．μｌ^－１）、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（１ユニット）、プライマーＯＥ．Ｂ．Ｆ（０．４μＭ）、プライマーＯＥ．Ｂ．Ｒ（０．４μＭ）、ｄＡＴＰ（０．２ｍＭ）、ｄＴＴＰ（０．２ｍＭ）、ｄＣＴＰ（０．２ｍＭ）、ｄＧＴＰ（０．２ｍＭ）、ＭｇＣｌ_２（１ｍＭ）およびＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ用のＮｏｖａｇｅｎ緩衝液（１倍）を含有した。

【0260】

両ＰＣＲ反応は、平行に同じ条件下で実行され、３分間の９５℃における最初の変性ステップで開始して、続いて１５秒の９８℃における変性ステップ、２秒の５０℃における焼き鈍しステップおよび２０秒の７２℃における伸長ステップからなる２５回のサイクルが実行された。これらの２５回のサイクルに続いて、さらに５分間の７２℃における伸長ステップが実行された。２種の二重鎖ＰＣＲ生成物、生成物Ａおよび生成物Ｂは、アガロースゲル電気泳動およびゲル抽出によって精製され、かつそれらの濃度は、分析的アガロースゲル電気泳動によって決定された。

【0261】

次いで、ＰＣＲ生成物ＡおよびＢは、ＰＣＲ生成物Ａ（１５ｎＭ）、ＰＣＲ生成物Ｂ（１５ｎＭ）、ｄＡＴＰ（０．２ｍＭ）、ｄＴＴＰ（０．２ｍＭ）、ｄＣＴＰ（０．２ｍＭ）、ｄＧＴＰ（０．２ｍＭ）、ＭｇＣｌ_２（１ｍＭ）、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ用Ｎｏｖａｇｅｎ緩衝液＃１（１倍）、ジメチルスルホキシド（５％（ｖ／ｖ））およびＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（８ｎｌ／μｌ）からなる第２のポリメラーゼ連鎖反応において連結された。この反応は、３分間９５℃において開始し、かつ１５秒の９８℃における変性ステップ、２秒の５０℃での焼き鈍しステップおよび２０秒の７２℃における伸長ステップの１５回のサイクルが続けられ、最終的に７２℃において５分間続くさらなる伸長ステップによって終了するようにプログラムされたサーモサイクラーにおいて実行された。

【0262】

このＰＣＲプログラム後、ＡおよびＢの増幅において使用されたアウターフォワードプライマーおよびアウターリバースプライマーは、それぞれ濃縮原料（５０μＭ）から０．５μＭの最終濃度まで直接添加された。次いで、変性ＰＣＲ反応混合物は、９５℃における最初の３分間の融解ステップで開始され、かつ９８℃における１５秒間続く融解ステップ、５５℃における２秒間続く焼き鈍しステップおよび７２℃における２０秒間続く伸長ステップからなる１５回のサイクルが続き、その後、７２℃における５分間続くさらなる伸長ステップで終了するようにプログラムされたサーモサイクラーを用いて別のＰＣＲを受けさせた。

【0263】

この連結ステップの生成物（配列番号１１）は、アガロースゲル電気泳動およびゲル抽出によって精製され、かつｐＪＥＴ１．２クローニングベクター中に平滑断端結合され、ｐＪＥＴ１．２：：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４を形成した。連結された４ＨＢＴおよびＡＣＸ４遺伝子を含有するポリヌクレオチドは、次いでｐＥＴ２０ｂ（＋）中にサブクローン化され、ｐＥＴ２０ｂ（＋）：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４が形成された。ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４プラスミドは、次いでＮｈｅＩおよびＸｈｏＩ制限部位における制限消化によって線形化された。

【0264】

ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４－ＡｃｓＡプラスミドの構成の次の段階のために、ＡｃｓＡのアミノ酸配列をコード化する遺伝子は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のためにコドン最適化され、かつ３’末端に付加されたＸｈｏ制限部位および５’末端に付加された短い配列を有するようにＢｉｏｍａｔｉｋ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって合成された。この配列は、ＮｈｅＩ制限部位、リボソーム結合部位、およびＡｃｓＡの開始コドンと一緒にＮｄｅＩ制限部位をコード化したシトシン－アデニン－チミントリヌクレオチドで終了するスペーサー配列を含有した。

【0265】

合成されたコドン最適化ＡｃｓＡポリヌクレオチド（配列番号１２）は、ｐｐＢＭＨ：：ＡｃｓＡクローニグプラスミドに送達され、かつＡｃｓＡ遺伝子は、その５’リボソーム結合部位と一緒に線形化ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４ベクター中にＮｈｅＩおよびＸｈｏＩ制限部位間でサブクローン化されて、ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４－ＡｃｓＡプラスミドが形成された（図８）。このプラスミドは、次いで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中に転換され、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４－ＡｃｓＡが形成された。ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４－ＡｃｓＡプラスミド中のＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ制限部位間であり、かつそれらを含む配列は配列番号１３に示される。

【0266】

ＡｃｓＡ遺伝子のみの発現のための株を構成するため、ＡｃｓＡ遺伝子は、単独でｐＢＭＨ：：ＡｃｓＡクローニングベクターからｐＥＴ２０ｂ（＋）中にＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ制限部位間でサブクローン化されて、ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：ＡｃｓＡが形成された。ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：ＡｃｓＡプラスミドは、次いで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに転換され、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：ＡｃｓＡが形成された。

【0267】

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４－ＡｃｓＡによる４ＨＢＴ、ＡＣＸ４およびＡｃｓＡの同時発現は、リボフラビン（１ｍｇ．ｌ^－１）が補充されたＭＳＸ培地中、２つの異なる試験温度、３７℃および２８℃において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４－ＡｃｓＡの培養液（１００ｍｌ）をインキュベーションすることによって確認された。培養物は、０．５のＯＤ_６００まで培養され、発現はＩＰＴＧ（０．４ｍＭ）の添加によって誘導された。試料を、発現誘導の直前ならびに発現後１時間、３時間、５時間および２０時間において採取した。実施例２において調製された対照株大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：ＡＣＸ４および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：ＡｃｓＡも同じ条件下で培養した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４－ＡｃｓＡにおける４ＨＢＴ、ＡＣＸ４およびＡｃｓＡの同時発現中に採取された試料、ならびに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：ＡＣＸ４におけるＡＣＸ４のみ、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：ＡｃｓＡにおけるＡｃｓＡのみの発現中に採取された試料をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって分析した。

【0268】

ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析（図９）は、発現が３７℃において実行された場合、誘導から５時間後、不溶性タンパク質の検出が非常に低い状態で高レベルの可溶性４ＨＢＴ（左側底部のバンド）および良好なレベルのＡＣＸ４（左側上部のバンド）が検出されるが、可溶性フラクションＡｃｓＡタンパク質が見られない状態で高レベルの不溶性ＡｃｓＡ（右側上部のバンド）が検出される。レーン１）空ｐＥＴ２０ｂ（＋）ベクター陰性対照。２）スペクトルＢＲタンパク質ラダー。３）ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４－ＡｃｓＡ発現、０時間、可溶性。３）３時間、可溶性。４）５時間、可溶性。５）０時間、不溶性。６）ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：ＡｃｓＡ発現、５時間、可溶性。７）ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：ＡＣＸ４、可溶性。８）ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴ、可溶性。９）ｐＥＴ２０ｂ（＋）：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４－ＡｃｓＡ、０時間、不溶性。１０）ｐＥＴ２０ｂ（＋）：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４－ＡｃｓＡ、３時間、不溶性。１１）ｐＥＴ２０ｂ（＋）：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４－ＡｃｓＡ、５時間、不溶性。１２）ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：ＡｃｓＡ、５時間、不溶性。

【0269】

イソブチル酸をメタクリル酸へ変換する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４－ＡｃｓＡの能力を試験するため、カルベニシリンおよびクロラムフェニコールで補充されたＭＳＸプレ培養物（２０ｍｌ）をグルコース、クロラムフェニコールおよびカルベニシリンで補充されたＬＢ寒天板において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４－ＡｃｓＡの単一コロニーから接種し、かつ１６時間、２００ｒｐｍで振とうしながら３７℃においてインキュベーションした。細胞を４℃で１５分間、５０００ｇにおける遠心分離によって回収し、かつ２５０ｍｌ振とうフラスコ中でカルベニシリン、クロラムフェニコールおよびリボフラビンで補充されたＭＳＸ培地（１００ｍｌ）中に再懸濁させ、この培養物を２００ｒｐｍにおいて振とうしながら３７℃でインキュベーションした。遺伝子の同時発現は、０．５のＯＤ_６００においてＩＰＴＧ（０．４ｍＭ）の添加によって誘導された。培養物をさらに１時間インキュベーションし、その後、５００ｍＭの濃縮原料濃度から培養培地中での５ｍＭの最終濃度までイソ酪酸カリウム（ｐＨ７．０）の添加を実行した。試料は、イソ酪酸の添加の直後（０時間試料）、次いで添加後１時間、２時間、４時間、６時間、８時間および１９．５時間において採取された。

【0270】

イソ酪酸からメタクリル酸への全生体内変換において採取された試料は、６０００ｒｐｍにおいて５分間、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｍｉｎｉＳｐｉｎ Ｆ－４５－１２－１１ローター中で遠心分離機にかけられた。上澄みは、０．２μｍ Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＲＣ ４ｍｍフィルターを通してろ過されて、次いで５Ｍ ＨＣｌでｐＨ２．５に酸性化された。酸性化された上清をＡｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ Ｃ１８カラム（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）に注入した。ＨＰＬＣを０．４ｍｌ．分^－１で実行し、かつメタクリル酸は、ＨＣｌでｐＨ２．５に調節されたＫＨ_２ＰＯ_４中１４％のアセトニトリルによる定組成溶出により、イソ酪酸から溶解された。条件が次の試料のための０．４ｍｌ．分^－１の流速および１４％のアセトニトリルに戻される前に、１５分間、流速を１ｍｌ．分^－１にかつアセトニトリル濃度を７５％に増加させることによってカラムを運転間に洗浄した。カラムは、次の試料の注入前に２０分間、均衡化することが可能であった。

【0271】

３種の陰性対照も実行および分析した。第１の対照は、陰性対照株、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）であり、これは４ＨＢＴ－ＡＣＸ４－ＡｃｓＡ同時発現オペロンを含まず、かつＩＰＴＧが培養培地に添加された後、イソ酪酸が培地に添加されない状態で培養された。第２の対照は、第１の対照において使用されたものと同じ株を使用したが、培養培地へのＩＰＴＧの添加から１時間後にイソ酪酸（５ｍＭ）が添加された。第３の対照は、主要生体内変換培養で使用されたものと同じ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４－ＡｃｓＡを使用したが、４ＨＢＴ、ＡＣＸ４およびＡｃｓＡの同時発現の誘導後、イソ酪酸が培養培地に添加されなかった。

【0272】

ＨＰＬＣトレースの要約は図１０に観察され、これは、試験された全４種の培養物から誘導後２０．５時間で採取された試料のトレースである（１９．５時間の生体内変換時間）。図１０Ｃは、イソ酪酸の標準（５ｍＭ）であり、かつ図１０Ｅは、メタクリル酸の標準（２００μＭ）と混合されたイソ酪酸の標準（５ｍＭ）である。図１０Ａ、１０Ｂおよび１０Ｄは、メタクリル酸がいずれの対照においても形成されなかったことを示し、かつ図１０Ｆは、生体内変換中にメタクリル酸が実際に形成されたことを示す。

【0273】

図１１は、経時的なメタクリル酸の製造、ならびにメタクリル酸の所望の生成物の最終濃度が約０．２５ｍＭである生体内変換中の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４－ＡｃｓＡの増殖を要約する。

【0274】

本実施例において、工業的に適用可能なレベルでイソ酪酸供給原料をメタクリル酸に変換するための全細胞プロセスが、組換型大腸菌中で、生体外において、４ＨＢＴ、ＡＣＸ４およびＡｃｓＡの同時発現によって実証された。

【0275】

１．６ 実施例４ － グルコースからのメタクリル酸の形成
シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０からの分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体は、以前に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるイソ酪酸の製造のための組換型代謝経路における２－ケトイソ吉草酸からイソブチリル－ＣｏＡへの酸化性脱炭酸に触媒作用を引き起こすことが示された（Ｚｈａｎｇ，Ｋ．，Ｘｉｏｎｇ，Ｍ．ａｎｄ Ｗｏｏｄｒｕｆｆ，Ａ．Ｐ．２０１２，Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ、国際公開第２０１２／１０９５３４Ａ２号パンフレット）。分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体の分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼアルファサブユニット（ｂｋｄＡ１）、分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼベータサブユニット（ｂｋｄＡ２）、リポアミドアシルトランスフェラーゼ成分（ｂｋｄＢ）およびリポアミドデヒドロゲナーゼ成分（ｌｐｄＶ）をコード化している遺伝子は、互いに隣接してグループ化し、かつ全てシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０ゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＥ０１５４５１．１）における単一促進因子の制御下で見出される。

【0276】

ｂｋｄＡ１、ｂｋｄＡ２、ｂｋｄＶおよびｌｐｄＶ遺伝子をコード化する全野生型配列は、それらがヌクレオチド４９９２０４２および４９９６９８８間でシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０ゲノムＤＮＡに出現するように、単一、ｐｐＢＣＫＤ、ポリヌクレオチド（配列番号１４）としてＢｉｏｍａｔｉｋ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって合成された。ｐｐＢＣＫＤポリヌクレオチドは、３’末端においてＸｈｏＩ制限部位と、ｂｋｄＡ１遺伝子の開始コドンの直前に５’末端において短配列とを含有した。この５’付加配列は、ＸｂａＩ制限部位、スペーサー配列、ＮｈｅＩ制限部位、リボソーム結合部位および第２のスペーサー配列を含有した。ＸｂａＩ部位は、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２５５０分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼの４種の遺伝子を発現することができるｐＥＴ２０ｂ（＋）：：ｐｐＢＣＫＤの構成のためのｐＥＴ２０ｂ（＋）プラスミドへのｐｐＢＣＫＤポリヌクレオチドの挿入を可能にするために含まれていた。第１のスペーサー配列は、リボソーム結合部位の直前にＮｈｅＩ部位をコード化する６つのヌクレオチドを例外として、ｐＥＴ２０ｂ（＋）プラスミドに存在するように、ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：ｐｐＢＣＫＤプラスミドにおけるＴ７促進因子およびリボソーム結合部位間に同数の塩基対を維持するために含まれ、かつスペーサー配列は、ｐＥＴ２０ｂ（＋）プラスミドにおけるＸｂａＩ部位およびリボソーム結合部位間のものと同じである。ＮｈｅＩ制限部位は、ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４－ｐｐＢＣＫＤを構成するために、ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４中にｐｐＢＣＫＤポリヌクレオチドの挿入を可能にするために含まれた。リボソーム結合部位およびスペーサー配列は、ＢＣＫＤ遺伝子が以前に報告されたイソ酪酸の製造のために発現する場合、ｂｋｄＡ１遺伝子の直前に使用されたものと同じであった（Ｚｈａｎｇ，Ｋ．，Ｘｉｏｎｇ，Ｍ．ａｎｄ Ｗｏｏｄｒｕｆｆ，Ａ．Ｐ．２０１２，Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ、国際公開第２０１２／１０９５３４Ａ２号パンフレット）。

【0277】

シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼの４種の遺伝子を含有する単一ポリヌクレオチドは、ｐＢＳＫプラスミド（ｐＢＳＫ：：ｐｐＢＣＫＤ）に送達された。４種の遺伝子は、ｐＢＳＫ：：ｐｐＢＣＫＤプラスミドから、実施例２からのｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４プラスミドへＮｈｅＩおよびＸｈｏＩ制限部位間でサブクローン化され、ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４－ｐｐＢＣＫＤが形成された（図１２）。配列番号１５は、ＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４－ｐｐＢＣＫＤプラスミドにおけるＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ制限部位間の配列を示す。ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４－ｐｐＢＣＫＤプラスミドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４－ｐｐＢＣＫＤを形成するため、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに変換された。同様に、４種の遺伝子は、ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩ制限部位間でｐＥＴ２０ｂ（＋）プラスミド中にサブクローン化され、ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：ｐｐＢＣＫＤが形成し、かつこのプラスミドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：ｐｐＢＣＫＤを形成するため、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに変換された。この後者の株は、発現研究（示されない）中、ｂｋｄＡ１、ｂｋｄＡ２、ｂｋｄＢおよびｌｐｄＶ遺伝子に対応するＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにおけるバンドを識別するために有用となるように使用された。

【0278】

カルベニシリンおよびクロラムフェニコールで補充されたＭＳＸプレ培養物（１０ｍｌ）は、グルコース、カルベニシリンおよびクロラムフェニコールで補充されたＬＢ寒天板上の単一コロニーからの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４－ｐｐＢＣＫＤで接種された。培養物は、１６時間、２５０ｒｐｍにおいて振とうしながら３７℃においてインキュベーションした。細胞を４℃で１５分間、５０００ｇにおける遠心分離によって回収し、かつ５００ｍｌ振とうフラスコ中でリボフラビンならびにカルベニシリンおよびクロラムフェニコールで補充された新しいＭＳＸ培地（１００ｍｌ）中に再懸濁させた。この新たな培養物を２５０ｒｐｍにおいて振とうしながら３７℃でインキュベーションし、かつ発現は、０．５のＯＤ_６００において、ＩＰＴＧ（０．４ｍＭ）の添加によって誘導された。培養物をさらに１７時間インキュベーションし、その後、試料を逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）による分析のために採取した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）陰性対照培養物のために繰り返しの培養を実行した。

【0279】

試料は、６０００ｒｐｍにおいて５分間、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ｍｉｎｉＳｐｉｎ Ｆ－４５－１２－１１ローター中で遠心分離機にかけられた。上澄みは、０．２ミクロンＳａｒｔｏｒｉｕｓ ＲＣ ４ｍｍフィルターを通してろ過されて、次いで５Ｍ ＨＣｌでｐＨ２．５に酸性化された。酸性化された上清をＡｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ Ｃ１８カラム（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）に注入した。ＨＰＬＣを１ｍｌ．分^－１で実行し、かつ分析物は、ＨＣｌでｐＨ２．５に調節された５０ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４中１４％のアセトニトリルによる定組成溶出によって溶解された。２０分間の再均衡化ステップのための１４％のアセトニトリルに戻される前に、１５分間、アセトニトリル濃度を７５％に増加させることによってカラムを運転間に洗浄した。

【0280】

メタクリル酸（０．２ｍＭ）、イソ酪酸（５ｍＭ）および２－ケトイソ吉草酸（５ｍＭ）の標準は、それぞれ３．６分、８．３分および８．６分において、かつそれぞれ５９８０ｍＡＵ．分、３３０ｍＡＵ．分および１５８０ｍＡＵ．分のピーク面積で溶出した。２－ケトイソ吉草酸（５ｍＭ）、イソ酪酸（５ｍＭ）およびメタクリル酸（２００μＭ）のカクテルのＨＰＬＣ分析を図１３に示す。

【0281】

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）陰性対照培養物から採取した試料のＨＰＬＣ分析を図１４に示す。これによると、メタクリル酸に対して予測される領域においてピークは示されなかった。一方、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４－ｐｐＢＣＫＤ培養物から採取した試料の分析では、８．６分において、０．８８ＡＵ．分のピーク面積を有するピークが示され、これは０．１１ｍＭのメタクリル酸濃度に対応する（図１５）。

【0282】

ピークが実際にメタクリル酸を表していることを確認するため、試料に１０ｍＭ貯蔵溶液からの追加の０．２４ｍＭメタクリル酸を添加し、かつこの追加試料もＨＰＬＣによって分析した。これを図１６に示す。０．３４ｍＭのメタクリル酸濃度に対応する２．７ＡＵ．分の面積を有する単一ピークが８．５分において観察され、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４－ｐｐＢＣＫＤ株がグルコースからメタクリル酸を直接製造することが裏付けられた。

【0283】

培養物に２－ケトイソ吉草酸を補充することにより、メタクリル酸製造を増強することができるかどうかを決定するため、カルベニシリンおよびクロラムフェニコールが補充された２種のＭＳＸプレ培養物（１０ｍｌ）を再び調製し、一方では大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４－ｐｐＢＣＫＤを接種し、他方では上記のとおり大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）を接種した。プレ培養物を１６時間、２５０ｒｐｍにおいて振とうしながら３７℃においてインキュベーションし、その後、細胞をペレット化し、かつ５００ｍｌ振とうフラスコ中でリボフラビン、クロラムフェニコールおよびカルベニシリンで補充された新しいＭＳＸ培地（１００ｍｌ）中に再懸濁させた。発現は、各培養物中、０．５のＯＤ_６００においてＩＰＴＧ（０．４ｍＭ）の添加によって誘導され、かつ培養物をさらに３時間インキュベーションし、その後、各培養物中、５ｍＭの最終濃度まで２－ケトイソ吉草酸（ｐＨ７．０）を添加した。培養物をさらに１４時間インキュベーションした。２－ケトイソ吉草酸が補充されていない培養物に関して記載されたとおり、培養物試料を採取し、かつ定組成溶出によって高速液体クロマトグラフィーによって分析した。

【0284】

空大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）陰性対照培養物に２－ケトイソ吉草酸が添加された１４時間後に採取された試料のＨＰＬＣ分析を図１７に示す。これによると、メタクリル酸は、通常、予測されたように観察される領域においてピークを示さなかった。しかしながら、これには、いくらかの２－ケトイソ吉草酸のバックグラウンド消費（図６）が示された。この培養物中の２－ケトイソ吉草酸のピーク面積は、３３５３ｍＡＵ．分であり、最初に５ｍＭであったのに対し、２．８ｍＭの２－ケトイソ吉草酸が残留することに対応した。

【0285】

２－ケトイソ吉草酸からメタクリル酸への転換のための遺伝子を発現する培養物、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ２０ｂ（＋）：：４ＨＢＴ－ＡＣＸ４－ｐｐＢＣＫＤ培養物に２－ケトイソ吉草酸が添加された１４時間後に採取された試料の場合、ＨＰＬＣトレース上、８．４分において１８９０ｍＡＵ．分のピーク面積を有するピークが出現し（図１８）、メタクリル酸が０．２４ｍＭの濃度まで製造されたことを示した。この試料では、２－ケトイソ吉草酸は検出されず、これは２－ケトイソ吉草酸からメタクリル酸への転換中に完全に消費されたことを示す。

【0286】

試料に追加の０．２４ｍＭメタクリル酸を添加し、かつこの追加試料の分析（図１９）によると、３．４ＡＵ．分のピーク面積を有するピークが示され、これは０．４４ｍＭのメタクリル酸濃度に対応し、したがって最初のメタクリル酸ピークは本物であった。

【0287】

本実施例において、分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ、すなわちシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０からのＢＣＫＤは、細胞系においてアシル－ＣｏＡオキシダーゼ、すなわちシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）からのＡＣＸ４、およびチオエステラーゼ酵素、すなわちアルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）ＳＵ株からの４ＨＢＴと同時発現した。組換型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を使用してバイオマスから容易に入手可能なグルコースなどの重要な供給原料からのメタクリル酸の製造が可能であることと、さらに前記メタクリル酸の製造が２－ケトイソ吉草酸で培地を補充することによって増強可能であることとが実証された。

【0288】

１．７ 実施例５：組換型大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）による２－ケトイソバレレートからのメタクリル酸ブチルの全細胞製造
シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）からのＡＣＸ４遺伝子は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対してコドン最適化および合成され、かつｐＥＴ１６ｂ（Ｓｓｅ）ベクター中にクローン化された。遺伝子は、ＮｈｅＩ／Ｓｓｅ８３８７Ｉによって消化され、かつＸｂａＩ／Ｓｓｅ８３８７Ｉによって消化されたｐＥＴ１６ｂ（Ｓｓｅ）中に結合された。得られたプラスミド、ｐＭＭＡ１２１（図２０を参照されたい）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）中に導入され、かつ組換型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＭＭＡ１２１）を以下のように培養した；ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ１６ｂ（ベクター対照）またはＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＭＭＡ１２１をアンピシリン（０．１ｍｇ／ｍｌ）が補充されたＬＢ培地に接種し、かつ３７℃において試験管中で一晩増殖させた。一晩培養物のアリコートをフラスコ中で１００ｍｌの同じ媒体中に移し、かつ２～３時間、３７℃で振とうした。ＩＰＴＧ（最終１ｍＭ）をフラスコに添加し、かつ培養物を一晩、２０℃で振とうしながらインキュベーションした。

【0289】

細胞を遠心分離機によって回収し、かつ０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中に懸濁させ、次いで超音波処理によって破壊させた。破壊された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は、上清およびペレットフラクションに遠心分離され、かつベクター対照およびｐＭＭＡ１２１を含有する細胞の両方を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより、ＡＣＯ（アシル－ＣｏＡオキシダーゼ）活性（図２１を参照されたい）およびＡＣＸ４タンパク質の発現に関して分析した（図２２を参照されたい）。図２１は、緩衝液中ではＩＢＡ－ＣｏＡのみが存在すること、未変化のプラスミドｐＥＴ１６ｂのみを含む細胞を含有する試料中ではＩＢＡ－ＣｏＡおよび少量のＣｏＡが存在することと、プラスミドｐＭＭＡ１２１を含む細胞を含有する試料中ではＭＡＡ－ＣｏＡならびにより小量のＩＢＡ－ＣｏＡおよび未知の化合物が存在することとを示す。したがって、ＢＬ２１／ｐＭＭＡ１２１の上清フラクションにおいて高いＡＣＯ活性が検出され、これはメタクリリルＣｏＡの製造を示しており、図２２のＳＤＳ－ＰＡＧＥによって検出された４０ｋＤａのタンパク質がＡＣＸ４タンパク質であることが示された。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）は、レーン１－ＢＬ２１／ｐＥＴ１６ｂ（ベクター）ＳＦ（可溶性フラクション）；レーン２－ＢＬ２１／ｐＭＭＡ１２１ ＳＦ；レーン３－ＢＬ２１／ｐＥＴ１６ｂ ＩＦ（不溶性フラクション）；レーン４－ＢＬ２１／ｐＭＭＡ１２１ ＩＦ；およびレーン５－分子量マーカーを示す。約４０ｋＤａの（ブラックボックスによってハイライトされた）バンドは、ＢＬ２１／ｐＥＴ１６ｂ（ベクター）レーンではなく、ＢＬ２１／ｐＭＭＡ１２１レーンでのみ観察された。

【0290】

ＢＣＫＡＤ複合体遺伝子は、以下のように緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡ０１株からクローン化された。ＢＣＫＡＤ複合体遺伝子をコード化する全遺伝子オペロンを含有するＤＮＡ断片は、鋳型としてゲノムＤＮＡを使用する、プライマーＢＣＫＡＤ．ＦおよびＢＣＫＡＤ．Ｒ（１．１．３の表）によるＰＣＲ法によって得られた。得られた断片は、制限酵素ＢｓｐＨＩおよびＳｓｅ８３８７Ｉによって消化され、かつＮｃｏＩ／Ｓｓｅ８３８７Ｉ間でベクターｐＥＴ１６ｂ（Ｓｓｅ）に挿入された（ｐＥＴ１６ｂのＢａｍＨ部位は、Ｓｓｅ８３８７Ｉ部位に変換された）。得られたプラスミドは、ｐＷＡ００８と命名された（図２３を参照されたい）。

【0291】

リンゴＡＡＴおよびシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ＡＣＸ４を発現するためのプラスミドは、以下のように構成された。ＡＡＴまたはＡＣＸ４遺伝子を含有するＤＮＡ断片は、それぞれ鋳型としてコドン最適化ＡＡＴ遺伝子またはｐＭＭＡ１２１を含有するプラスミドを使用して、プライマーＡＡＴ．ＦおよびＡＡＴ．ＲまたはＡＣＸ４．ＦおよびＡＣＸ４．Ｒ（１．１．３の表）によるＰＣＲ法によって増幅された。ｐＥＴ（Ｓｓｅ）ベクターは、制限酵素ＮｃｏＩおよびＳｓｅ８３８７Ｉによって消化され、かつＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）を使用することにより、ＡＡＴ遺伝子を含有するＤＮＡ断片に結合させた。得られたプラスミド、ｐＡＡＴ２１２は、制限酵素ＳｐｅＩによって消化され、かつＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを使用することにより、ＡＣＸ４遺伝子を含有するＤＮＡ断片に結合させた。得られたプラスミド、ｐＭＭＡ１３３は、Ｔ７促進因子制御を有するＡＡＴおよびＡＣＸ４遺伝子を含有した（図２３を参照されたい）。

【0292】

ＢＣＫＡＤ、ＡＡＴおよびＡＣＸ４を発現するためのプラスミドは、以下のように構成された。プラスミドｐＭＭＡ１３３は、制限酵素ＳｐｅＩおよびＳｓｅ８３８７Ｉによって消化され、かつ線形化ＤＮＡ断片が得られた。プラスミドｐＷＡ００８は、制限酵素ＸｂａＩおよびＳｓｅ８３８７Ｉによって消化され、かつＢＣＫＡＤ複合体遺伝子を含有する５．０ｋｂ断片が分離された。両断片は、ＤＮＡ結合キット「Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ」（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．製）を使用して結合された。得られたプラスミドｐＭＭＡ１３４（図２３を参照されたい）は、メタクリル酸ブチル製造実験のために大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）中に導入された。

【0293】

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＭＭＡ１３４は、ＡＣＸ４の発現と関連して上記されたものと本質的に同じ方法で培養された。細胞は、遠心分離機によって回収され、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄し、かつ同じ緩衝液中で懸濁させて細胞懸濁液を得た。細胞懸濁液を使用することにより、約１ｍｌの休止細胞反応溶液を、４０ｍＭの２－ケトイソバレレート（２－オキソイソバレレート）、６０ｍＭのブタノール、０．０５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）および細胞（ＯＤ_６５０＝１２．５）を含有するそれぞれのバイアルで調製した。反応は、３０℃、１８０ｒｐｍにおいて３～４４時間実行し、かつ反応を停止するため、１ｍｌのアセトニトリルをバイアルに添加し、十分に混合した。シリンジフィルター、ＤＩＳＭＩＣ／ホール直径０．４５ミクロン（ＡＤＶＡＮＴＥＣ製）を使用するろ過後、ＯＤＳカラム上でのＨＰＬＣによって分析を行った。ＨＰＬＣ条件は以下のとおりであった：装置：Ｗａｔｅｒｓ ２６９５、カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ１２０、内径２．０ｍｍ×２５０ｍｍ、移動相：０．１％リン酸／６５％メタノール、流量：０．２５ｍｌ／分、実行時間：１２分、カラム温度：３５℃および検出：ＵＶ２１０ｎｍ。図２４は、発酵の経時的な以下の化学物質の濃度を示す：■、２－ケトイソバレレート（２－ＯＩＶ）；▲、イソ酪酸（ＩＢＡ）；◆、メタクリル酸ブチル（ＢＭＡ）：および×、メタクリル酸（ＭＡＡ）。２－ケトイソバレレート（２－オキソイソバレレート）の供給原料の濃度が低下すると、経路の中間体であるイソ酪酸の製造が増加し、最終エステル生成物のメタクリル酸ブチルの製造も増加する。

【0294】

本実施例は、グルコースおよび一般的な供給原料である試薬ブタノールから直接製造される生化学的中間体の２－ケトイソバレレート（２－オキソイソバレレート）からのメタクリル酸の誘導体であるメタクリル酸エステル、メタクリル酸ブチルの実行可能な生体内製造を実証する。メタクリル酸ブチルの製造は、２－ケトイソバレレートをイソブチリルＣｏＡへと変換するＢＣＫＡＤオペロン、イソブチリルｃｏＡをメタクリリルｃｏＡへ変換するＡＣＸ４オキシダーゼ、およびメタクリリルＣｏＡをブタノールとの反応によってメタクリル酸ブチルへ変換するＡＡＴを発現する組換型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の培養から工業的に適用可能なレベルで実証される。

【0295】

本出願と関連して、本明細書と同時にまたはそれより以前に提出され、かつ本明細書による縦覧のために公開され、かつその内容が参照により本明細書に組み込まれる全ての論文および文献に注意が向けられる。

【0296】

（いずれの添付の請求項、要約および図面も含む）本明細書において開示された特徴の全て、および／またはそのように開示されたいずれの方法もしくはプロセスのステップの全ては、そのような特徴および／またはステップの少なくともいくつかが相互に排他的である組合せを除き、いずれの組合せにおいても組み合わせられ得る。

【0297】

（いずれの添付の請求項、要約および図面も含む）本明細書において開示されたそれぞれの特徴は、他に特別に記載されない限り、同じ、均等な、または類似の目的を果たす他の特徴によって置き換えられてもよい。したがって、他に特別に記載されない限り、開示されたそれぞれの特徴は、均等なまたは類似の特徴の一般的系列の一例である。

【0298】

本発明は、上記実施形態の詳細に限定されない。本発明は、（いずれの添付の請求項、要約および図面も含む）本明細書において開示された特徴のいずれかの新規のもの、またはいずれかの新規の組合せに及ぶか、またはそのように開示されたいずれの方法もしくはプロセスのステップのいずれかの新規のもの、またはいずれかの新規の組合せに及ぶ。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【配列表】

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