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特許7381750ナチュラルキラー細胞培養用組成物及びこれを用いたナチュラルキラー細胞の製造方法

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-11-07

(45)【発行日】2023-11-15

(54)【発明の名称】ナチュラルキラー細胞培養用組成物及びこれを用いたナチュラルキラー細胞の製造方法

(51)【国際特許分類】

C12N 5/0783 20100101AFI20231108BHJP

C07K 14/54 20060101ALI20231108BHJP

C07K 19/00 20060101ALI20231108BHJP

A61K 35/17 20150101ALN20231108BHJP

A61P 35/00 20060101ALN20231108BHJP

A61P 35/02 20060101ALN20231108BHJP

C12N 15/26 20060101ALN20231108BHJP

C12N 15/62 20060101ALN20231108BHJP

【ＦＩ】

C12N5/0783 ZNA

C07K14/54

C07K19/00

A61K35/17

A61P35/00

A61P35/02

C12N15/26

C12N15/62

【請求項の数】 9

(21)【出願番号】P 2022529598

(86)(22)【出願日】2020-11-19

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-11-11

(86)【国際出願番号】 KR2020016376

(87)【国際公開番号】W WO2021101270

(87)【国際公開日】2021-05-27

【審査請求日】2022-07-19

(31)【優先権主張番号】10-2019-0149779

(32)【優先日】2019-11-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2020-0015802

(32)【優先日】2020-02-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

【早期審査対象出願】

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】521126254

【氏名又は名称】ジーアイ・セル・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＧＩＣＥＬＬ，ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100139594

【弁理士】

【氏名又は名称】山口健次郎

(72)【発明者】

【氏名】チャンミョンホ

(72)【発明者】

【氏名】ホンチュンピョ

(72)【発明者】

【氏名】コドンウ

(72)【発明者】

【氏名】イチュンソプ

【審査官】藤山純

(56)【参考文献】

【文献】PARK, J. C. et al.，GI101, a novel triple-targeting bispecific CD80-IgG4-IL2variant fusion protein, elicits synergistic anti-tumor effects in preclinical models.，Annals of Oncology，2019年10月，Vol.30, Suppl 5，P1223(v500)，doi: 10.1093/annonc/mdz253.049

【文献】CARMENATE, Tania et al.，Human IL-2 Mutein with Higher Antitumor Efficacy Then Wild Type IL-2.，J. Immunol.，2013年06月15日，Vol.190, No.12，p.6230-6238，doi: 10.1049/jimmunol.1201895

【文献】INGLAM, Wendy et al.，Human CD80/IL2 lentivirus transduced acute myeloid leukaemia cells enhance cytolytic activity in vitro in spite of an increase in regulatory CD4+ T cells in a subset of cultures.，Cancer Immunol. Immunother.，2009年03月13日，Vol.58, No.10，p.1679-1690，doi: 10.1007/s00262-009-0679-6

【文献】INGLAM, Wendy et al.，Human CD80/IL2 lentivirus-transduced acute myeloid leukaemia (AML) cells promote natural killer (NK) cell activation and cytolytic activity: implications for a phase I clinical study.，Br. J. Haematol.，2009年04月20日，Vol.145, No.6，p.749-760，doi: 10.1111/j.1365-2141.2009.07684.x

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ５／０７８３

Ｃ０７Ｋ１４／５４

Ｃ０７Ｋ１９／００

Ａ６１Ｋ３５／１７

Ａ６１Ｐ３５／００

Ａ６１Ｐ３５／０２

Ｃ１２Ｎ１５／２６

Ｃ１２Ｎ１５／６２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＩＬ－２又はその変異体及びＣＤ８０又はその断片を含む融合タンパク質二量体を有効成分として含むＣＤ３＋細胞又はＣＤ５６－細胞なしの分離されたナチュラルキラー細胞のｉｎｖｉｔｒｏ培養用組成物であって、
前記ＩＬ－２タンパク質変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列における３８番目及び４２番目のアミノ酸の置換を含み、
前記ＣＤ８０断片はＣＤ８０の細胞外ドメインを含み、前記分離されたナチュラルキラー細胞はＣＤ３－ＣＤ５６＋ナチュラルキラー細胞である、分離されたナチュラルキラー細胞培養用組成物。

【請求項2】

前記融合タンパク質二量体は、下記構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）を含む、請求項１に記載のナチュラルキラー細胞培養用組成物。
Ｎ’－Ｘ－［リンカー（１）］ｎ－Ｆｃドメイン－［リンカー（２）］ｍ－Ｙ－Ｃ’（Ｉ）
Ｎ’－Ｙ－［リンカー（１）］ｎ－Ｆｃドメイン－［リンカー（２）］ｍ－Ｘ－Ｃ’（ＩＩ）
（式中、Ｎ’は、融合タンパク質のＮ末端であり、
Ｃ’は、融合タンパク質のＣ末端であり、
Ｘは、ＣＤ８０タンパク質、又はその断片であり、
Ｙは、ＩＬ－２タンパク質、又はその変異体であり、
リンカー（１）及びリンカー（２）は、ペプチドリンカーであり、そして
ｎ及びｍはそれぞれ独立して、０又は１である。）

【請求項3】

前記ＩＬ－２の変異体は、配列番号６で表示されるアミノ酸配列からなるものである、請求項１に記載のナチュラルキラー細胞培養用組成物。

【請求項4】

前記ＣＤ８０の断片は、配列番号１１で表示されるアミノ酸配列のうち３５番～２４２番のアミノ酸からなるものである、請求項１に記載のナチュラルキラー細胞培養用組成物。

【請求項5】

前記融合タンパク質二量体は、配列番号９で表示されるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のナチュラルキラー細胞培養用組成物。

【請求項6】

ＩＬ－２又はその変異体及びＣＤ８０又はその断片を含む融合タンパク質二量体の存在下で、ＣＤ３＋細胞又はＣＤ５６－細胞なしの、分離されたナチュラルキラー細胞を培養する段階を含むナチュラルキラー細胞の培養方法であって、
前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列における３８番目及び４２番目のアミノ酸の置換を含み、
前記ＣＤ８０断片はＣＤ８０の細胞外ドメインを含み、前記分離されたナチュラルキラー細胞はＣＤ３－ＣＤ５６＋ナチュラルキラー細胞である、ナチュラルキラー細胞の培養方法。

【請求項7】

前記融合タンパク質二量体は、１ｎＭ～５００ｎＭの濃度で処理されたものである、請求項６に記載のナチュラルキラー細胞の培養方法。

【請求項8】

前記培養する段階において、培養期間は５日～２５日であることを特徴とする、請求項６に記載のナチュラルキラー細胞の培養方法。

【請求項9】

前記融合タンパク質二量体は、下記構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）を含む、請求項６に記載のナチュラルキラー細胞の培養方法。
Ｎ’－Ｘ－［リンカー（１）］ｎ－Ｆｃドメイン－［リンカー（２）］ｍ－Ｙ－Ｃ’（Ｉ）
Ｎ’－Ｙ－［リンカー（１）］ｎ－Ｆｃドメイン－［リンカー（２）］ｍ－Ｘ－Ｃ’（ＩＩ）
（式中、Ｎ’は、融合タンパク質のＮ末端であり、
Ｃ’は、融合タンパク質のＣ末端であり、
Ｘは、ＣＤ８０タンパク質、又はその断片であり、
Ｙは、ＩＬ－２タンパク質、又はその変異体であり、
リンカー（１）及びリンカー（２）は、ペプチドリンカーであり、そして
ｎ及びｍはそれぞれ独立して、０又は１である。）

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ナチュラルキラー細胞培養用組成物及びこれを用いたナチュラルキラー細胞の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

癌を治療するために外科的な手術、放射線治療、化学療法などの多様な治療法が開発されてきたが、多くの副作用が報告されながら、近年、患者の免疫機能を用いた免疫治療法が開発されている。特に、大量生産及び凍結が可能なナチュラルキラー細胞を用いた免疫治療法が研究されている。

【0003】

具体的に、ナチュラルキラー細胞は、リンパ球の一種として体内骨髓、脾臓、末梢リンパ節及び末梢血液に分布し、末梢血リンパ球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）の約１０％程度を占め、先天性免疫反応に重要な役割をする（ＡｎｎＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ．，２４：２５７－２８６，２００６）。また、ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ５６及びＣＤ１６には陽性を示すが、ＣＤ３には陰性を示す。ナチュラルキラー細胞が細胞を殺害する方法は、パーフォリン（ｐｅｒｆｏｒｉｎ）及びグランザイム（ｇｒａｎｚｙｍｅ）を含む細胞質顆粒の排出を通じて行われる。ナチュラルキラー細胞は、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－１０などの多様なサイトカインを分泌する。

【0004】

また、ナチュラルキラー細胞は、細胞表面に多くの受容体を発現するが、これらの受容体は、細胞吸着、細胞殺害能力の活性化、又は細胞殺害能力の抑制に関与する。しかし、正常人の体内に存在するほとんどのナチュラルキラー細胞は非活性化状態で存在する。よって、癌を除去するためには、活性化されたナチュラルキラー細胞が必要である。また、癌患者の体内に存在するナチュラルキラー細胞の場合、癌細胞の免疫回避機構によってナチュラルキラー細胞の機能的欠陥が存在する。したがって、ナチュラルキラー細胞を治療剤として用いるためには、ナチュラルキラー細胞を活性化させることが非常に重要である。また、体内に存在するナチュラルキラー細胞の細胞数は限定されているので、正常人の血液又は患者の血液のナチュラルキラー細胞を大量に増殖させて凍結する技術の開発が必須となる。

【0005】

一方、ＩＬ－２は、Ｔ細胞成長因子（Ｔ－ｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｓ、ＴＣＧＦ）とも呼ばれ、リンパ球の生成、生存及び恒常性において中心的な役割をする球状の糖タンパク質である。ＩＬ－２のタンパク質は、そのサイズが１５．５ｋＤａ乃至１６ｋＤａで、１３３個のアミノ酸からなっている。ＩＬ－２は、個別的な３個のサブユニットで構成されたＩＬ－２受容体に結合することによって各種免疫作用を媒介する。

【0006】

また、ＣＤ８０はＢ７－１として知られており、リガンドと結合することによって共刺激反応（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）及び共抑制反応（ｃｏｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）を伝達し、免疫調節に関与する膜タンパク質（ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｂｏｕｎｄｐｒｏｔｅｉｎｓ）のうちＢ７ファミリの一つである。ＣＤ８０は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞及び単核球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）の表面に発現する膜貫通タンパク質である。ＣＤ８０は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４（ＣＤ１５２）及びＰＤ－Ｌ１に結合するものとして知られている。

【0007】

このように、ナチュラルキラー細胞が抗癌治療に重要であることは多く知られているが、これを効果的に使用するために増幅できる具体的な方法は未だに不足な状況である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

そこで、本発明者等は、活性化されたナチュラルキラー細胞を大量に製造するために研究した結果、ＩＬ－２タンパク質及びＣＤ８０タンパク質を含む融合タンパク質二量体を用いてナチュラルキラー細胞を製造した。また、このように製造したナチュラルキラー細胞の活性が増加し、優れた抗癌効果を示すことを確認することによって本発明を完成した。

【課題を解決するための手段】

【0009】

前記目的を達成するために、本発明の一側面は、ＩＬ－２又はその変異体及びＣＤ８０又はその断片を含む融合タンパク質二量体を有効成分として含むナチュラルキラー細胞培養用組成物を提供する。

【0010】

本発明の他の側面は、ｉ）ＰＢＭＣ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌ）からＣＤ３を発現しない細胞を分離する段階；ｉｉ）前記分離されたＣＤ３を発現しない細胞からＣＤ５６を発現する細胞を分離する段階；及びｉｉｉ）ＩＬ－２又はその変異体及びＣＤ８０又はその断片を含む融合タンパク質二量体の存在下で、前記分離された細胞を培養する段階；を含むナチュラルキラー細胞を培養する方法を提供する。

【0011】

本発明の更に他の側面は、前記ナチュラルキラー細胞の培養方法で製造されたナチュラルキラー細胞を提供する。

【0012】

本発明の更に他の側面は、前記ナチュラルキラー細胞を有効成分として含む癌予防又は治療用医薬組成物を提供する。

【0013】

本発明の更に他の側面は、ｉ）ＰＢＭＣからＣＤ３を発現しない細胞を分離する段階；及びｉｉ）ＩＬ－２又はその変異体及びＣＤ８０又はその断片を含む融合タンパク質二量体の存在下で、前記分離された細胞を培養する段階；を含むナチュラルキラー細胞を培養する方法を提供する。

【0014】

本発明の更に他の側面は、前記ナチュラルキラー細胞の培養方法で製造されたナチュラルキラー細胞を提供する。

【0015】

本発明の更に他の側面は、前記ナチュラルキラー細胞を有効成分として含む癌予防又は治療用医薬組成物を提供する。

【0016】

本発明の更に他の側面は、ｉ）ＰＢＭＣからＣＤ５６を発現する細胞を分離する段階；及びｉｉ）ＩＬ－２又はその変異体及びＣＤ８０又はその断片を含む融合タンパク質二量体の存在下で、前記分離された細胞を培養する段階；を含むナチュラルキラー細胞を培養する方法を提供する。

【0017】

本発明の更に他の側面は、前記ナチュラルキラー細胞の培養方法で製造されたナチュラルキラー細胞を提供する。

【0018】

本発明の更に他の側面は、前記ナチュラルキラー細胞を有効成分として含む癌予防又は治療用医薬組成物を提供する。

【0019】

本発明の更に他の側面は、ＩＬ－２又はその変異体及びＣＤ８０又はその断片を含む融合タンパク質二量体の存在下で、ＰＢＭＣを培養する段階を含むＰＢＭＣ内のナチュラルキラー細胞の活性を促進させる方法を提供する。

【0020】

本発明の更に他の側面は、前記ＰＢＭＣ内のナチュラルキラー細胞の活性を促進させる方法で製造されたＰＢＭＣを提供する。

【0021】

本発明の更に他の側面は、前記ＰＢＭＣを有効成分として含む癌予防又は治療用医薬組成物を提供する。

【発明の効果】

【0022】

本発明のＩＬ－２又はその変異体及びＣＤ８０又はその断片を含む融合タンパク質を有効成分として含むナチュラルキラー細胞培養用組成物は、ナチュラルキラー細胞の増殖を促進させ、ＣＤ１６、ＮＫｐ４６発現を誘導し、グランザイムＢ及びパーフォリンの発現及び分泌を増加させ、抗癌免疫機能に優れたナチュラルキラー細胞の製造に有用に使用され得る。

【図面の簡単な説明】

【0023】

図１ａは、本発明で使用された融合タンパク質二量体の模式図である。

【0024】

図１ｂは、収得した融合タンパク質二量体（ＧＩ－１０１）をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確
認した図である。

【0025】

図１ｃは、吸光度による融合タンパク質二量体（ＧＩ－１０１）の含量を示した図で
ある。

【0026】

図１ｄは、収得した融合タンパク質二量体（ＧＩ－１０１）をサイズ排除クロマトグ
ラフィー（ＳＥＣ）で分析した図である。

【0027】

図２ａは、収得したｈＣＤ８０－Ｆｃ融合タンパク質二量体をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確
認した図である。

【0028】

図２ｂは、収得したｈＣＤ８０－Ｆｃ融合タンパク質二量体をサイズ排除クロマトグ
ラフィー（ＳＥＣ）で分析した図である。

【0029】

図３ａは、収得したＦｃ－ＩＬ２ｖ２融合タンパク質二量体をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確
認した図である。

【0030】

図３ｂは、収得したＦｃ－ＩＬ２ｖ２融合タンパク質二量体をサイズ排除クロマトグ
ラフィー（ＳＥＣ）で分析した図である。

【0031】

図３ｃは、収得したＦｃ－ＩＬ２ｗｔ融合タンパク質二量体をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確
認した図である。

【0032】

図３ｄは、収得したＦｃ－ＩＬ２ｗｔ融合タンパク質二量体をサイズ排除クロマトグ
ラフィー（ＳＥＣ）で分析した図である。

【0033】

図４ａは、収得したｈＣＤ８０－Ｆｃ－ＩＬ２ｗｔ融合タンパク質二量体をＳＤＳ－
ＰＡＧＥで確認した図である。

【0034】

図４ｂは、収得したｈＣＤ８０－Ｆｃ－ＩＬ２ｗｔ融合タンパク質二量体をサイズ排
除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で分析した図である。

【0035】

図５ａ及び図５ｂは、ＡＩＭ－Ｖ（５％ＳＲ）条件で培養するときのＮＫ細胞数を示
した図である。

【0036】

図６ａ及び図６ｂは、ＡＩＭ－Ｖ（５％ＳＲ）条件で培養するときのＮＫ細胞の生存
率を示した図である。

【0037】

図７ａ及び図７ｂは、ＡＩＭ－Ｖ（５％ｈＡＢＳ）条件で培養するときのＮＫ細胞数
を示した図である。

【0038】

図８ａ及び図８ｂは、ＡＩＭ－Ｖ（５％ｈＡＢＳ）条件で培養するときのＮＫ細胞の
生存率を示した図である。

【0039】

図９ａ及び図９ｂは、Ｘ－ｖｉｖｏ（５％ｈＡＢＳ）条件で培養するときのＮＫ細胞
数を示した図である。

【0040】

図１０ａ及び図１０ｂは、Ｘ－ｖｉｖｏ（５％ｈＡＢＳ）条件で培養するときのＮＫ
細胞の生存率を示した図である。

【0041】

図１１ａ及び図１１ｂは、ＮＫＭＡＣＳ（５％ｈＡＢＳ）条件で培養するときのＮ
Ｋ細胞数を示した図である。

【0042】

図１２ａ及び図１２ｂは、ＮＫＭＡＣＳ（５％ｈＡＢＳ）条件で培養するときのＮ
Ｋ細胞の生存率を示した図である。

【0043】

図１３は、ＡＩＭ－Ｖ（５％ＳＲ）培地含有組成物から培養されたナチュラルキラー
細胞の純度を確認したＦＡＣＳ分析結果を示した図である。

【0044】

図１４は、ＡＩＭ－Ｖ（５％ｈＡＢＳ）培地含有組成物から培養されたナチュラルキ
ラー細胞の純度を確認したＦＡＣＳ分析結果を示した図である。

【0045】

図１５は、Ｘ－ｖｉｖｏ１５（５％ｈＡＢＳ）培地含有組成物から培養されたナチュ
ラルキラー細胞の純度を確認したＦＡＣＳ分析結果を示した図である。

【0046】

図１６は、ＮＫＭＡＣＳ（５％ｈＡＢＳ）培地含有組成物から培養されたナチュラ
ルキラー細胞の純度を確認したＦＡＣＳ分析結果を示した図である。

【0047】

図１７は、ＡＩＭ－Ｖ（５％ＳＲ）培地含有組成物から培養されたナチュラルキラー
細胞の活性マーカーに対する分析結果を示した図である。

【0048】

図１８は、ＡＩＭ－Ｖ（５％ＳＲ）培地含有組成物から培養されたナチュラルキラー
細胞の阻害マーカーに対する分析結果を示した図である。

【0049】

図１９は、ＡＩＭ－Ｖ（５％ｈＡＢＳ）培地含有組成物から培養されたナチュラルキ
ラー細胞の活性マーカーに対する分析結果を示した図である。

【0050】

図２０は、ＡＩＭ－Ｖ（５％ｈＡＢＳ）培地含有組成物から培養されたナチュラルキ
ラー細胞の阻害マーカーに対する分析結果を示した図である。

【0051】

図２１は、Ｘ－ｖｉｖｏ（５％ｈＡＢＳ）培地含有組成物から培養されたナチュラル
キラー細胞の活性マーカーに対する分析結果を示した図である。

【0052】

図２２は、Ｘ－ｖｉｖｏ（５％ｈＡＢＳ）培地含有組成物から培養されたナチュラル
キラー細胞の阻害マーカーに対する分析結果を示した図である。

【0053】

図２３は、ＮＫＭＡＣＳ（５％ｈＡＢＳ）培地含有組成物から培養されたナチュラ
ルキラー細胞の活性マーカーに対する分析結果を示した図である。

【0054】

図２４は、ＮＫＭＡＣＳ（５％ｈＡＢＳ）培地含有組成物から培養されたナチュラ
ルキラー細胞の阻害マーカーに対する分析結果を示した図である。

【0055】

図２５は、ＡＩＭ－Ｖ（５％ＳＲ）培地含有組成物から培養されたナチュラルキラー
細胞の細胞殺害（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）マーカーに対する分析結果を示した図である。

【0056】

図２６は、ＡＩＭ－Ｖ（５％ｈＡＢＳ）培地含有組成物から培養されたナチュラルキ
ラー細胞の細胞殺害（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）マーカーに対する分析結果を示した図である。

【0057】

図２７は、Ｘ－ｖｉｖｏ１５（５％ｈＡＢＳ）培地含有組成物から培養されたナチュ
ラルキラー細胞の細胞殺害マーカーに対する分析結果を示した図である。

【0058】

図２８は、ＮＫＭＡＣＳ（５％ｈＡＢＳ）培地含有組成物から培養されたナチュラ
ルキラー細胞の細胞殺害マーカーに対する分析結果を示した図である。

【0059】

図２９は、ＡＩＭ－Ｖ（５％ｈＡＢＳ）培地にＧＩ－１０１（５０ｎＭ）、ＧＩ－１
０１＿ｗｔ（５０ｎＭ）、ＣＤ８０－Ｆｃ（５０ｎＭ）＋Ｆｃ－ＩＬ２ｖ２（５０ｎＭ）又はＣＤ８０－Ｆｃ（５０ｎＭ）＋Ｆｃ－ＩＬ２ｗｔ（５０ｎＭ）を含む組成物から２１日間培養されたナチュラルキラー細胞の脱顆粒能を分析した結果を示した図である。

【0060】

図３０は、ＡＩＭ－Ｖ（５％ｈＡＢＳ）培地にＧＩ－１０１（５０ｎＭ）、ＧＩ－１
０１＿ｗｔ（５０ｎＭ）、ＣＤ８０－Ｆｃ（５０ｎＭ）＋Ｆｃ－ＩＬ２ｖ２（５０ｎＭ）又はＣＤ８０－Ｆｃ（５０ｎＭ）＋Ｆｃ－ＩＬ２ｗｔ（５０ｎＭ）を含む組成物から２１日間培養されたナチュラルキラー細胞による癌細胞死滅効果を分析した結果を示した図である。

【0061】

図３１は、Ｘ－ｖｉｖｏ１５（５％ｈＡＢＳ）培地にＧＩ－１０１（５０ｎＭ）、Ｇ
Ｉ－１０１＿ｗｔ（５０ｎＭ）、ＣＤ８０－Ｆｃ（５０ｎＭ）＋Ｆｃ－ＩＬ２ｖ２（５０ｎＭ）又はＣＤ８０－Ｆｃ（５０ｎＭ）＋Ｆｃ－ＩＬ２ｗｔ（５０ｎＭ）を含む組成物から２１日間培養されたナチュラルキラー細胞の脱顆粒能を分析した結果を示した図である。

【0062】

図３２は、Ｘ－ｖｉｖｏ１５（５％ｈＡＢＳ）培地にＧＩ－１０１（５０ｎＭ）、Ｇ
Ｉ－１０１＿ｗｔ（５０ｎＭ）、ＣＤ８０－Ｆｃ（５０ｎＭ）＋Ｆｃ－ＩＬ２ｖ２（５０ｎＭ）又はＣＤ８０－Ｆｃ（５０ｎＭ）＋Ｆｃ－ＩＬ２ｗｔ（５０ｎＭ）を含む組成物から２１日間培養されたナチュラルキラー細胞による癌細胞死滅効果を分析した結果を示した図である。

【0063】

図３３は、ＮＫＭＡＣＳ（５％ｈＡＢＳ）培地にＧＩ－１０１（５０ｎＭ）、ＧＩ
－１０１＿ｗｔ（５０ｎＭ）、ＣＤ８０－Ｆｃ（５０ｎＭ）＋Ｆｃ－ＩＬ２ｖ２（５０ｎＭ）又はＣＤ８０－Ｆｃ（５０ｎＭ）＋Ｆｃ－ＩＬ２ｗｔ（５０ｎＭ）を含む組成物から２１日間培養されたナチュラルキラー細胞の脱顆粒能を分析した結果を示した図である。

【0064】

図３４は、ＮＫＭＡＣＳ（５％ｈＡＢＳ）培地にＧＩ－１０１（５０ｎＭ）、ＧＩ
－１０１＿ｗｔ（５０ｎＭ）、ＣＤ８０－Ｆｃ（５０ｎＭ）＋Ｆｃ－ＩＬ２ｖ２（５０ｎＭ）又はＣＤ８０－Ｆｃ（５０ｎＭ）＋Ｆｃ－ＩＬ２ｗｔ（５０ｎＭ）を含む組成物から２１日間培養されたナチュラルキラー細胞による癌細胞死滅効果を分析した結果を示した図である。

【発明を実施するための形態】

【0065】

ＮＫ細胞増殖用組成物及び培地

【0066】

本発明の一側面は、ＩＬ－２又はその変異体及びＣＤ８０又はその断片を含む融合タンパク質二量体を有効成分として含むナチュラルキラー細胞培養用組成物を提供する。また、前記融合タンパク質二量体を有効成分として含むナチュラルキラー細胞培養用培地を提供する。

【0067】

前記ナチュラルキラー細胞培養用組成物は、培地、血清、補充剤及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれるいずれか一つをさらに含むことができる。

【0068】

前記ＮＫ細胞培養用培地は、細胞培養用培地に前記ＩＬ－２タンパク質及びＣＤ８０タンパク質を含む融合タンパク質二量体が添加された培地であり得る。このとき、前記細胞培養用培地は、アミノ酸（ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ）、糖類（ｓｕｇａｒｓ）、無機塩（ｉｎｏｒｇａｎｉｃｓａｌｔｓ）及びビタミンからなる群から選ばれるいずれか一つを含むことができる。好ましくは、前記細胞培養用培地は、アミノ酸、糖類、無機塩及びビタミンを全て含むものであり得る。一具体例として、前記ＮＫ細胞培養用培地は、下記の表１乃至表４の成分を含むことができる。

【0069】

本明細書で使用された用語である「細胞培養用培地」は、細胞を培養するために使用された培地を意味し、具体的にＮＫ細胞、より具体的にＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞を培養するための培地を意味する。試験管内で（ｉｎｖｉｔｒｏ）細胞成長及び生存のために細胞が必要とする成分を含有したり、細胞成長及び生存を促進する成分を含有する。具体的に、前記成分は、ビタミン、必須又は非必須アミノ酸、及び微量元素であり得る。前記培地は、細胞、好ましくは真核細胞、さらに好ましくはＮＫ細胞の培養に使用される培地であり得る。

【0070】

本発明に係る前記細胞培養培地は、アミノ酸成分、ビタミン成分、無機塩成分、その他の成分及び精製水で構成され、

【0071】

ａ）前記アミノ酸成分は、グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－バリン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－トレオニン、Ｌ－セリン、Ｌ－システイン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－リシン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－チロシン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－プロリン、β－アラニン、γ－アミノ酪酸、オルニチン、シトルリン、ホモセリン、トリヨードチロニン、チロキシン及びジオキシフェニルアラニンで構成された群から選ばれる少なくともいずれか一つのアミノ酸又はその組み合わせで、好ましくは、グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－システイン、Ｌ－グルタミン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－リシン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－トレオニン及びＬ－バリンで構成された群から選ばれる少なくともいずれか一つのアミノ酸又はその組み合わせであり、

【0072】

ｂ）前記ビタミン成分は、ビオチン、Ｄ－パントテン酸カルシウム、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、チアミン塩酸塩、ビタミンＢ１２、塩化コリン、ｉ－イノシトール及びアスコルビン酸で構成された群から選ばれる少なくともいずれか一つのビタミン又はその組み合わせで、好ましくは、ｉ－イノシトール、チアミン塩酸塩、ナイアシンアミド及びピリドキシン塩酸塩で構成された群から選ばれる少なくとも一つ以上のビタミン又はその組み合わせであり、

【0073】

ｃ）前記無機塩成分は、塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）（無水）、硫酸銅五水和物（ＣｕＳＯ_４－５Ｈ_２Ｏ）、硫酸第二鉄七水和物（ＦｅＳＯ_４－７Ｈ_２Ｏ）、塩化マグネシウム（無水）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）（無水）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）、リン酸水素ナトリウム一水和物（ＮａＨ_２ＰＯ_４－Ｈ_２Ｏ）、硫酸亜鉛七水和物（ＺｎＳＯ_４－７Ｈ_２Ｏ）、硝酸第二鉄九水和物（Ｆｅ（ＮＯ_３）_３・９Ｈ_２Ｏ）及び炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ_３）で構成された群から選ばれる少なくともいずれか一つの無機塩又はその組み合わせで、好ましくは、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ_３）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）（無水）及びリン酸水素ナトリウム一水和物（ＮａＨ_２ＰＯ_４－Ｈ_２Ｏ）で構成された群から選ばれる少なくともいずれか一つの無機塩又はその組み合わせであり、

【0074】

ｄ）前記その他の成分は、Ｄ－グルコース（デキストロース）、ピルビン酸ナトリウム、ヒポキサンチンＮａ、チミジン、リノール酸、リポ酸、アデノシン、シチジン、グアノシン、ウリジン、２'－デオキシアデノシン、２'－デオキシシチジンＨＣｌ及び２'－デオキシグアノシンで構成された群から選ばれる少なくともいずれか一つのその他の成分又はその組み合わせで、好ましくは、ピルビン酸ナトリウムであり得る。

【0075】

ｅ）精製水は、前記アミノ酸、ビタミン、無機塩及びその他の成分を溶解させるために使用され、１次以上の蒸留を経て収得されたり、フィルターを通じて精製された水であり得る。

【0076】

また、本発明に係る前記細胞培養培地に成長因子又はサイトカインをさらに含むことができる。前記成長因子として、ＩＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＧＦ、ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ又はＰＤＧＦなどを単独で又は２種以上使用できるが、これに特に制限するのではない。前記サイトカインとして、ＩＬ－１、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７又はＩＬ－２１などを単独で又は２種以上使用できるが、これに特に制限するのではない。

【0077】

また、本発明に係る前記細胞培養培地にナチュラルキラー細胞活性用抗体をさらに含むことができる。前記活性用抗体として、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３３５抗体などを単独で又は２種以上使用できるが、これに特に制限するのではない。また、前記ナチュラルキラー細胞活性用抗体が結合されたビーズを含むことができる。また、前記ナチュラルキラー細胞活性用抗体又は可変領域断片を２種以上含む融合タンパク質を使用することができる。

【0078】

特に、前記ＮＫ培養用培地は、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれるいずれか一つをさらに含むことができる。

【0079】

前記ＩＬ－１５及びＩＬ－２１は、インターロイキン（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ、ＩＬ）の一種類として、リンパ球や単核球及び大食細胞などの免疫担当細胞が生産するタンパク質性生物活性物質を意味する。前記ＩＬ－１５及びＩＬ－２１は、ナチュラルキラー細胞の増殖を促進させ、単核細胞を原料細胞として用いてナチュラルキラー細胞を培養する場合に使用できるが、これらのみを単独で又は混合して使用する場合、増殖率及び純度が低いという問題がある（ＢｉｏｓｓｅｌＬ．ｅｔａｌ．，ＢｉｏｌｏｇｙｏｆＢｌｏｏｄａｎｄＭａｒｒｏｗＴｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１４，１０３１－１０３８，２００８）。

【0080】

具体的に、前記培地としては、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ'ｓＭｅｄｉｕｍ）、ＥＤＭ（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍ）、ＭＥＭ（ＭｉｎｉｍａｌＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ）、ＢＭＥ（ＢａｓａｌＭｅｄｉｕｍＥａｇｌｅ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ－１０、Ｆ－１２、ａ－ＭＥＭ（ａ－ＭｉｎｉｍａｌＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ）、Ｇ－ＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ'ｓＭｉｎｉｍａｌＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ）、Ｉｓｃｏｖｅ'ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｅｄｉｕｍ、ＡＩＭ－ＶＭｅｄｉｕｍ、Ｘ－ｖｉｖｏ^ＴＭ１５Ｍｅｄｉｕｍ、ＮＫＭＡＣＳＭｅｄｉｕｍなどの通常の動物細胞培養用培地を使用することができる。本発明の一実施例では、培地として、ＡＩＭ－ＶＭｅｄｉｕｍ、Ｘ－ｖｉｖｏ^ＴＭ１５Ｍｅｄｉｕｍ、ＮＫＭＡＣＳＭｅｄｉｕｍを使用した。

【0081】

本発明で使用される用語である「血清」とは、血液が完全に凝固された後、血液から遊離された透明な上澄液を意味する。また、動物細胞の培養には、合成培地に血清を必ず添加しなければならなく、ウシやウマ、ヒトの血清を使用することが一般的である。ウシ由来血清の場合、採血時期によってウシ胎児血清（ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）、ウシ新生仔血清（ｎｅｗｂｏｒｎｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ）、子ウシ血清（ｃａｌｆｓｅｒｕｍ）、母ウシ血清（ｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ）などを使用することができる。ヒト由来血清の場合、血液型がＡＢ型である供与者のヒト血清を使用し、Ａ及びＢ血液型抗原に対する抗体がないため免疫反応性を最小化できるヒトＡＢ血清（ＨｕｍａｎＡＢｓｅｒｕｍ）を使用することができる。また、前記「血清」の代替剤として、ＣＴＳＩｍｍｕｎｅＣｅｌｌＳＲなどを使用することができる。本発明の一実施例では、ヒトＡＢ血清又はＣＴＳＩｍｍｕｎｅＣｅｌｌＳＲを使用した。

【0082】

前記補充剤は、細胞を培養するときの安定性及び細胞活性を改善するために、Ｌ－グルタミン代替剤であるＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））を使用することができる。また、前記補充剤は、ＮＫＭＡＣＳｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ、１３０－１１３－１０２）であり得る。

【0083】

ＩＬ－２タンパク質及びＣＤ８０タンパク質を含む融合タンパク質二量体

【0084】

本明細書で使用する用語である「ＩＬ－２」又は「インターロイキン－２」は、別に断りのない限り、哺乳動物、例えば、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）を含めて任意の脊椎動物供給源から収得した任意の野生型ＩＬ－２を意味する。前記ＩＬ－２は、動物細胞から収得されたものであってもよいが、ＩＬ－２を生産できる組換え細胞から収得されたものも含む。また、前記ＩＬ－２は、野生型ＩＬ－２又はその変異体であり得る。

【0085】

本明細書では、ＩＬ－２或いはその変異体を総称して「ＩＬ－２タンパク質」或いは「ＩＬ－２ポリペプチド」の用語と表現することもある。ＩＬ－２、ＩＬ－２タンパク質、ＩＬ－２ポリペプチド、及びＩＬ－２変異体は、例えば、ＩＬ－２受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に特異的に結合する。この特異的な結合は、当業者に知られている方法によって確認することができる。

【0086】

前記ＩＬ－２の一具体例は、配列番号３５又は配列番号３６のアミノ酸配列を有することができる。また、このとき、前記ＩＬ－２は、成熟した形態であり得る。具体的に、前記成熟したＩＬ－２は、信号配列を含まないものであってよく、配列番号１０のアミノ酸配列を有するものであってよい。このとき、前記ＩＬ－２は、野生型ＩＬ－２のＮ末端又はＣ末端の一部が欠失した（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）断片を含む概念で利用され得る。

【0087】

また、前記ＩＬ－２の断片は、配列番号３５又は配列番号３６のアミノ酸配列を有するタンパク質のＮ末端から連続して１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個又は２５個のアミノ酸が欠失した形態であり得る。また、前記ＩＬ－２の断片は、配列番号３５又は配列番号３６のアミノ酸配列を有するタンパク質のＣ末端から連続して１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個又は２５個のアミノ酸が欠失した形態であり得る。

【0088】

本明細書で使用する用語である「ＩＬ－２変異体」は、全長（ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ）ＩＬ－２又は上述したＩＬ－２断片のアミノ酸の一部が置換された形態を意味する。すなわち、ＩＬ－２変異体は、野生型ＩＬ－２又はその断片と異なるアミノ酸配列を有することができる。しかし、前記ＩＬ－２変異体は、野生型ＩＬ－２と同等又は類似の活性を有することができる。ここで、「ＩＬ－２活性」は、例えば、ＩＬ－２受容体に特異的に結合することを意味でき、この特異的結合は、当業者に知られている方法によって測定できる。

【0089】

具体的に、前記ＩＬ－２変異体は、野生型ＩＬ－２のアミノ酸の一部が置換されたものであり得る。アミノ酸置換によるＩＬ－２変異体の一具体例としては、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、４２番目、４５番目、６１番目及び７２番目のアミノ酸のうち少なくとも一つが置換されたものであり得る。

【0090】

具体的に、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、４２番目、４５番目、６１番目又は７２番目のアミノ酸のうち少なくともいずれか一つが別のアミノ酸に置換されたものであり得る。その他にも、ＩＬ－２が配列番号３５のアミノ酸配列のＮ末端の一部分が欠失した形態である場合、配列番号１０のアミノ酸配列において相補的に対応する位置のアミノ酸が別のアミノ酸に置換され得る。例えば、ＩＬ－２が配列番号３５のアミノ酸配列を有する場合に、前記ＩＬ－２の変異体は、配列番号３５のアミノ酸配列において５８番目、６２番目、６５番目、８１番目又は９２番目のアミノ酸のうち少なくともいずれか一つが別のアミノ酸に置換されたものであり得る。それらは、それぞれ、配列番号１０のアミノ酸配列の３８番目、４２番目、４５番目、６１番目及び７２番目のアミノ酸残基に該当する。一具体例によると、ＩＬ－２活性が維持される限り、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、或いは１０個のアミノ酸が置換され得る。更に他の具体例によると、１個から５個までのアミノ酸が置換され得る。

【0091】

一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、２箇所のアミノ酸が置換された形態であり得る。具体的に、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目及び４２番目のアミノ酸が置換されたものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目及び４５番目のアミノ酸が置換されたものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目及び６１番目のアミノ酸が置換されたものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において４２番目及び４５番目のアミノ酸が置換されたものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において４２番目及び６１番目のアミノ酸が置換されたものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において４２番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において４５番目及び６１番目のアミノ酸が置換されたものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において４５番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において６１番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものであり得る。

【0092】

さらに、前記ＩＬ－２変異体は、３箇所のアミノ酸が置換された形態であり得る。具体的に、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、４２番目及び４５番目のアミノ酸が置換されたものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、４２番目及び６１番目のアミノ酸が置換されたものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、４２番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、４５番目及び６１番目のアミノ酸が置換されたものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、４５番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、６１番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において４２番目、４５番目及び６１番目のアミノ酸が置換されたものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において４２番目、４５番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において４５番目、６１番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものであり得る。

【0093】

また、前記ＩＬ－２変異体は、４箇所のアミノ酸が置換された形態であり得る。具体的に、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、４２番目、４５番目及び６１番目のアミノ酸が置換されたものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、４２番目、４５番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、４５番目、６１番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、４２番目、６１番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において４２番目、４５番目、６１番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものであり得る。

【0094】

さらに、前記ＩＬ－２変異体は、５箇所のアミノ酸が置換された形態であり得る。具体的に、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、４２番目、４５番目、６１番目及び７２番目のアミノ酸がいずれも別のアミノ酸に置換されたものであり得る。

【0095】

このとき、前記置換によって導入される「別のアミノ酸」は、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ）、アルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ）、アスパラギン（Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）、アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃａｃｉｄ）、システイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄ）、グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）、ヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）、イソロイシン（ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）、ロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ）、リシン（ｌｙｓｉｎｅ）、メチオニン（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）、フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）、プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）、セリン（ｓｅｒｉｎｅ）、トレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）、トリプトファン（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）、チロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）及びバリン（ｖａｌｉｎｅ）からなる群から選ばれるいずれか一つであり得る。ただし、前記ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換において、前記配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目はアルギニンに置換できなく、４２番目はフェニルアラニンに置換できなく、４５番目はチロシンに置換できなく、６１番目はグルタミン酸に置換できなく、７２番目はロイシンに置換できない。

【0096】

前記ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換において、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目のアミノ酸であるアルギニンは、アルギニン以外の別のアミノ酸に置換され得る。好ましくは、前記ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換において、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目のアミノ酸であるアルギニンは、アラニンに置換（Ｒ３８Ａ）され得る。

【0097】

前記ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換において、配列番号１０のアミノ酸配列において４２番目のアミノ酸であるフェニルアラニンは、フェニルアラニン以外の別のアミノ酸に置換され得る。好ましくは、前記ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換において、配列番号１０のアミノ酸配列において４２番目のアミノ酸であるフェニルアラニンは、アラニンに置換（Ｆ４２Ａ）され得る。

【0098】

前記ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換において、配列番号１０のアミノ酸配列において４５番目のアミノ酸であるチロシンは、チロシン以外の別のアミノ酸に置換され得る。好ましくは、前記ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換において、配列番号１０のアミノ酸配列において４５番目のアミノ酸であるチロシンは、アラニンに置換（Ｙ４５Ａ）され得る。

【0099】

前記ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換において、配列番号１０のアミノ酸配列において６１番目のアミノ酸であるグルタミン酸は、グルタミン酸以外の別のアミノ酸に置換され得る。好ましくは、前記ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換において、配列番号１０のアミノ酸配列において６１番目のアミノ酸であるグルタミン酸は、アルギニンに置換（Ｅ６１Ａ）され得る。

【0100】

前記ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換において、配列番号１０のアミノ酸配列において７２番目のアミノ酸であるロイシンは、ロイシン以外の別のアミノ酸に置換され得る。好ましくは、前記ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換において、配列番号１０のアミノ酸配列において７２番目のアミノ酸であるロイシンは、グリシンに置換（Ｌ７２Ｇ）され得る。

【0101】

具体的に、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列においてＲ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６１Ｒ及びＬ７２Ｇからなる群から選ばれる少なくともいずれか一つの置換が起こったものであり得る。

【0102】

具体的に、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６１Ｒ及びＬ７２Ｇからなる群から選ばれる位置において２箇所、３箇所、４箇所又は５箇所の位置でアミノ酸置換が起こり得る。

【0103】

また、前記ＩＬ－２変異体は、２箇所のアミノ酸が置換された形態であり得る。具体的に、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ及びＦ４２Ａに置換が起こったものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ及びＹ４５Ａに置換が起こったものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ及びＥ６１Ｒに置換が起こったものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ及びＬ７２Ｇに置換が起こったものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｆ４２Ａ及びＹ４５Ａに置換が起こったものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｆ４２Ａ及びＥ６１Ｒに置換が起こったものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｆ４２Ａ及びＬ７２Ｇに置換が起こったものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｅ６１Ｒ及びＬ７２Ｇに置換が起こったものであり得る。

【0104】

さらに、前記ＩＬ－２変異体は、３箇所のアミノ酸が置換された形態であり得る。具体的に、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ及びＹ４５Ａに置換が起こったものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ及びＥ６１Ｒに置換が起こったものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ及びＬ７２Ｇに置換が起こったものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６１Ｒに置換が起こったものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇに置換が起こったものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＥ６１Ｒに置換が起こったものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇに置換が起こったものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｆ４２Ａ、Ｅ６１Ｒ及びＬ７２Ｇに置換が起こったものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｙ４５Ａ、Ｅ６１Ｒ及びＬ７２Ｇに置換が起こったものであり得る。

【0105】

また、前記ＩＬ－２変異体は、４箇所のアミノ酸が置換された形態であり得る。具体的に、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＥ６１Ｒに置換が起こったものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇに置換が起こったものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｅ６１Ｒ及びＬ７２Ｇに置換が起こったものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６１Ｒ及びＬ７２Ｇに置換が起こったものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６１Ｒ及びＬ７２Ｇに置換が起こったものであり得る。

【0106】

さらに、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６１Ｒ及びＬ７２Ｇに置換が起こったものであり得る。

【0107】

好ましくは、前記ＩＬ－２変異体の一具体例は、配列番号１０のアミノ酸配列において下記の（ａ）～（ｄ）組み合わせから選ばれるいずれか一つの組み合わせの置換が起こったものであり得る：

【0108】

（ａ）Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ａ

【0109】

（ｂ）Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ａ／Ｙ４５Ａ

【0110】

（ｃ）Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ａ／Ｅ６１Ｒ

【0111】

（ｄ）Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ａ／Ｌ７２Ｇ

【0112】

このとき、ＩＬ－２が配列番号３５のアミノ酸配列を有する場合に、配列番号１０と相補的に対応する位置にアミノ酸置換を有することができる。また、ＩＬ－２が配列番号３５のアミノ酸配列の断片である場合にも、配列番号１０と相補的に対応する位置のアミノ酸が置換され得る。

【0113】

具体的に、前記ＩＬ－２の変異体は、配列番号６、２２、２３又は２４のアミノ酸配列を有するものであり得る。

【0114】

また、前記ＩＬ－２変異体は、生体内で低い毒性を有することを特徴とするものであり得る。このとき、前記「生体内で低い毒性」とは、ＩＬ－２がＩＬ－２受容体のアルファチェーン（ＩＬ－２Ｒα）と結合して誘発される副作用であり得る。前記ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒαとの結合による副作用を改善させるために様々なＩＬ－２変異体が開発されており、このようなＩＬ－２変異体は、米国特許第５，２２９，１０９号及び大韓民国特許第１０－１６６７０９６号に開示されたものを使用することができる。特に、本出願で記述されるＩＬ－２の変異体は、ＩＬ－２受容体のアルファチェーン（ＩＬ－２Ｒα）との結合力が低いので、生体内毒性が野生型ＩＬ－２に比べて低い。

【0115】

本明細書で使用する用語である「ＣＤ８０」は、「Ｂ７－１」とも呼ばれ、樹状細胞、活性化されたＢ細胞及び単核球に存在する膜タンパク質である。ＣＤ８０は、Ｔ細胞の活性化と生存に必須な共刺激信号を提供する。ＣＤ８０は、Ｔ細胞表面に存在する異なる２つのタンパク質であるＣＤ２８及びＣＴＬＡ－４に対するリガンドとして知られている。ＣＤ８０は、２８８個のアミノ酸で構成されており、具体的に、配列番号１１のアミノ酸配列を有するものであり得る。また、本明細書において「ＣＤ８０タンパク質」は、全長ＣＤ８０又はＣＤ８０断片を意味する。

【0116】

本明細書で使用する用語である「ＣＤ８０断片」とは、ＣＤ８０の切断型を意味する。また、前記ＣＤ８０断片は、ＣＤ８０の細胞外ドメインであり得る。ＣＤ８０断片の一具体例は、ＣＤ８０の信号配列であるＮ末端から１番目乃至３４番目のアミノ酸が除外されたものであり得る。具体的に、前記ＣＤ８０断片の一具体例は、配列番号１１の３５番目乃至２８８番目のアミノ酸で構成されたタンパク質であり得る。また、前記ＣＤ８０断片の一具体例は、配列番号１１の３５番目乃至２４２番目のアミノ酸で構成されたタンパク質であり得る。また、前記ＣＤ８０断片の一具体例は、配列番号１１の３５番目乃至２３２番目のアミノ酸で構成されたタンパク質であり得る。また、前記ＣＤ８０断片の一具体例は、配列番号１１の３５番目乃至１３９番目のアミノ酸で構成されたタンパク質であり得る。また、前記ＣＤ８０断片の一具体例は、配列番号１１の１４２番目乃至２４２番目のアミノ酸で構成されたタンパク質であり得る。前記一実施例として、ＣＤ８０断片は、配列番号２のアミノ酸配列を有するものであり得る。

【0117】

また、前記ＩＬ－２タンパク質及び前記ＣＤ８０タンパク質は、リンカー或いはキャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）によって結合したものであり得る。具体的に、前記ＩＬ－２又はその変異体及び前記ＣＤ８０（Ｂ７－１）又はその断片は、リンカー或いはキャリアによって結合したものであり得る。本明細書において、リンカーとキャリアは同じ意味で使用されてもよい。

【0118】

前記リンカーは、２つのタンパク質を連結する。リンカーの一具体例としては、１個乃至５０個のアミノ酸、アルブミン又はその断片、又は免疫グロブリンのＦｃドメインなどを含むことができる。このとき、前記免疫グロブリンのＦｃドメインは、免疫グロブリンの重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び重鎖定常領域３（ＣＨ３）を含み、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の可変領域及び軽鎖定常領域１（ＣＨ１）を含まないタンパク質を意味する。前記免疫グロブリンはＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭであってよく、好ましくは、ＩｇＧ４であってよい。このとき、野生型免疫グロブリンＧ４のＦｃドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を有するものであり得る。

【0119】

また、前記免疫グロブリンのＦｃドメインは、野生型Ｆｃドメインの他、Ｆｃドメイン変異体であり得る。また、本明細書で使用する用語である「Ｆｃドメイン変異体」は、野生型Ｆｃドメインの糖鎖形態（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｐａｔｔｅｒｎ）と異なるか、野生型Ｆｃドメインに比べて増加した糖鎖、野生型Ｆｃドメインに比べて減少した糖鎖、又は糖鎖が除去された（ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）形態であり得る。また、無糖鎖（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）Ｆｃドメインも含まれる。Ｆｃドメイン或いは変異体は、培養条件或いはホストの遺伝子操作によって含量が調節されたシアル酸（ｓｉａｌｉｃａｃｉｄ）、フコシル化（ｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、糖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）を有させたものであり得る。

【0120】

また、化学的方法、酵素的方法及び微生物を使用した遺伝工学的エンジニアリング方法などのように通常の方法で免疫グロブリンのＦｃドメインの糖鎖を変形させることができる。また、前記Ｆｃドメイン変異体は、免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭのＦｃ領域が混合された形態であり得る。また、前記Ｆｃドメイン変異体は、前記Ｆｃドメインの一部のアミノ酸が別のアミノ酸に置換された形態であり得る。前記Ｆｃドメイン変異体の一具体例としては、配列番号１２のアミノ酸配列を有するものであり得る。

【0121】

融合タンパク質は、Ｆｃドメインをリンカー（或いは、キャリア）にしてそのＮ末端及びＣ末端にそれぞれＣＤ８０及びＩＬ－２タンパク質が連結されるか或いはＩＬ－２及びＣＤ８０が連結された構造を有することができる（図１ａ）。ＦｃドメインのＮ末端或いはＣ末端とＣＤ８０或いはＩＬ－２との連結は、任意にリンカーペプチドによってなされ得る。

【0122】

具体的に、前記融合タンパク質は、下記構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）からなるものであり得る：

【0123】

Ｎ’－Ｘ－［リンカー（１）］ｎ－Ｆｃドメイン－［リンカー（２）］ｍ－Ｙ－Ｃ’（Ｉ）

【0124】

Ｎ’－Ｙ－［リンカー（１）］ｎ－Ｆｃドメイン－［リンカー（２）］ｍ－Ｘ－Ｃ’（ＩＩ）

【0125】

このとき、前記構造式（Ｉ）及び（ＩＩ）において、

【0126】

前記Ｎ’は、融合タンパク質のＮ末端であり、

【0127】

前記Ｃ’は、融合タンパク質のＣ末端であり、

【0128】

前記Ｘは、ＣＤ８０タンパク質であり、

【0129】

前記Ｙは、ＩＬ－２タンパク質であり、

【0130】

前記リンカー（１）及びリンカー（２）は、ペプチドリンカーであり、

【0131】

前記ｎ及びｍはそれぞれ独立に、Ｏ又は１である。

【0132】

好ましくは、前記融合タンパク質は、構造式（Ｉ）からなるものであり得る。前記ＩＬ－２タンパク質は、上述した通りである。また、前記ＣＤ８０タンパク質は、上述した通りである。一具体例によると、ＩＬ－２タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、１個から５個までのアミノ酸が置換されたＩＬ－２変異体であり得る。ＣＤ８０タンパク質は、野生型ＣＤ８０のＮ末端或いはＣ末端から連続して約３４個までのアミノ酸残基が欠失した（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）断片であり得る。或いは、ＣＤ８０タンパク質は、Ｔ細胞表面受容体（Ｔｃｅｌｌｓｕｒｆａｃｅｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）ＣＴＬＡ－４とＣＤ２８に結合する活性を有する細胞外免疫グロブリン様ドメインであり得る。

【0133】

具体的に、前記融合タンパク質は、配列番号９、２６、２８又は３０のアミノ酸配列を有するものであり得る。更に他の具体例によると、融合タンパク質は、配列番号９、２６、２８又は３０のアミノ酸配列に対して８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％或いは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。このとき、同一性は、例えば、パーセント相同性、ＮＣＢＩ（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＢｌａｓｔＮｓｏｆｔｗａｒｅのような相同性比較ソフトウェアによって決定され得る。

【0134】

前記ＣＤ８０タンパク質とＦｃドメインとの間にはペプチドリンカー（１）が含まれ得る。前記ペプチドリンカー（１）は、５個乃至８０個の連続したアミノ酸、２０個乃至６０個の連続したアミノ酸、又は２５個乃至５０個の連続したアミノ酸、又は３０個乃至４０個のアミノ酸からなり得る。一具体例として、ペプチドリンカー（１）は、３０個のアミノ酸からなり得る。また、ペプチドリンカー（１）は、少なくとも一つのシステインを含むことができ、具体的に、１個、２個又は３個のシステインを含むことができる。また、前記ペプチドリンカー（１）は、免疫グロブリンのヒンジに由来するものであり得る。一具体例では、前記ペプチドリンカー（１）が配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーであり得る。

【0135】

前記ペプチドリンカー（２）は、１個乃至５０個の連続したアミノ酸、又は３個乃至３０個の連続したアミノ酸、又は５個乃至１５個のアミノ酸からなり得る。一具体例として、前記ペプチドリンカー（２）は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ここで、ｎは１～１０の整数）であり得る。このとき、（Ｇ４Ｓ）ｎにおいて、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０であり得る。一実施例として、前記ペプチドリンカー（２）が配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーであり得る。

【0136】

本発明の他の側面は、前記ＩＬ－２タンパク質及び前記ＣＤ８０タンパク質を含む融合タンパク質が２個結合した二量体を提供する。前記ＩＬ－２又はその変異体及びＣＤ８０又はその断片を含む融合タンパク質は、上述した通りである。

【0137】

このとき、二量体を構成する融合タンパク質間の結合は、リンカー内に存在するシステインによって二硫化結合によってなされたものであり得るが、これに限定されるものではない。二量体を構成する融合タンパク質は、同一又は個別の融合タンパク質であり得る。好ましくは、前記二量体は、同型二量体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）であり得る。前記二量体を構成する融合タンパク質の一実施例は、配列番号９のアミノ酸配列を有するタンパク質であり得る。

【0138】

ＮＫ細胞培養方法１

【0139】

本発明の他の側面は、ｉ）ＰＢＭＣ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌ）からＣＤ３を発現しない細胞を分離する段階；ｉｉ）前記段階で分離されたＣＤ３を発現しない細胞からＣＤ５６を発現する細胞を分離する段階；及びｉｉｉ）ＩＬ－２又はその変異体及びＣＤ８０又はその断片を含む融合タンパク質二量体の存在下で、前記分離された細胞を培養する段階；を含むナチュラルキラー細胞を培養する方法を提供する。

【0140】

本発明で使用する用語である「ＰＢＭＣ」とは、末梢血液単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌ）を意味する。前記ＰＢＭＣは、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞）及び単核球で構成され、全血からフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）と遠心分離を用いて分離することができる。前記ＰＢＭＣは、個体から収得された全血から分離されたものであり得る。

【0141】

前記融合タンパク質二量体は、ナチュラルキラー細胞培養用組成物で既に説明した通りである。前記融合タンパク質二量体は、１ｎＭ乃至５００ｎＭの濃度で処理され得る。具体的に、前記融合タンパク質二量体は、１ｎＭ乃至５００ｎＭ、５ｎＭ乃至３００ｎＭ又は１０ｎＭ乃至１５０ｎＭの濃度で処理され得る。本発明の一実施例では、前記融合タンパク質二量体を１．６ｎＭ及び５０ｎＭの濃度で処理した。

【0142】

前記分離された細胞を培養する方法は、当業界に広く知られている方法を用いて行うことができる。具体的に、前記分離された細胞を培養する段階において、培養温度は、２７℃乃至４０℃又は３０℃乃至３７℃であり得る。本発明の一実施例では、３７℃の温度で培養した。また、前記分離された細胞を培養する段階において、培養時のＣＯ_２濃度条件は１％乃至１０％であってよく、好ましくは、５％ＣＯ_２の条件で培養することができる。

【0143】

前記分離された細胞を培養する段階において、培養期間は５日乃至２５日、６日乃至２３日又は７日乃至２１日であり得る。本発明の一実施例では、培養期間は２０日で、５日目から有意味な増殖差が表れた。

【0144】

収得されたＮＫ細胞及びその用途

【0145】

本発明の更に他の側面は、前記ナチュラルキラー細胞の培養方法で製造されたナチュラルキラー細胞を提供する。

【0146】

前記ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ１６及びＮＫｐ４６の発現が増加したものであり得る。前記ナチュラルキラー細胞は、グランザイムＢ及びパーフォリンの発現が増加したものであり得る。前記ナチュラルキラー細胞の培養方法によって培養されたナチュラルキラー細胞は凍結が可能であり、再び解凍する場合にも細胞の機能が損傷しない。

【0147】

前記ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ１６及びＮＫｐ４６などの活性化受容体（ａｃｔｉｖａｔｉｎｇｒｅｃｅｐｔｏｒ）の発現が高く、癌細胞株に対する殺害能及びグランザイムＢ及びパーフォリンの分泌が増加するので、優れた抗癌効果を期待することができる。よって、臨床適用が可能な多量の活性化されたナチュラルキラー細胞を用いて癌治療に有効な治療剤を製造することができる。また、前記ナチュラルキラー細胞は、ＮＫｐ３０、ＤＮＡＭ１の発現が高い場合がある。

【0148】

本発明の更に他の側面は、前記ナチュラルキラー細胞を有効成分として含む癌予防又は治療用医薬組成物を提供する。

【0149】

また、前記ナチュラルキラー細胞の培養方法によって製造されたナチュラルキラー細胞は、医薬組成物の総重量に対して１０重量％乃至９５重量％で含むことができる。また、前記医薬組成物は、前記有効成分以外に同一又は類似の機能を示す有効成分を１種以上さらに含むことができる。

【0150】

前記医薬組成物の投与量は、疾患の種類、疾患の重症度、組成物に含まれた有効成分及び他の成分の種類及び含量、剤形の種類、患者の年齢、体重、一般健康状態、性別及び食餌、投与時間、投与経路、組成物の分泌率、治療期間、同時に使用される薬物を始めとした多様な因子によって調節され得る。

【0151】

しかし、好ましい効果のために、前記医薬組成物の投与量は、有効成分であるナチュラルキラー細胞を基準にして１×１０^２ｃｅｌｌｓ／ｋｇ乃至１．０×１０^１３ｃｅｌｌｓ／ｋｇであってよく、１×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｋｇ乃至１．５×１０^１１ｃｅｌｌｓ／ｋｇであってよい。このとき、投与は、１日に１回行うことができ、数回に分けて行うこともできる。

【0152】

また、前記医薬組成物は、当業界に公知となっている多様な方法で個体に投与され得る。前記投与経路は、投与方法、体液の体積、粘度などを考慮した上で、通常の技術者が適宜選択することができる。

【0153】

前記癌は、胃癌、肝癌、肺癌、大腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵癌、子宮頸癌、甲状腺癌、喉頭癌、急性骨髄性白血病、脳腫瘍、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、頭頸部癌、唾液腺癌及びリンパ腫からなる群から選ばれるいずれか一つであり得る。

【0154】

収得されたＮＫ細胞を用いた治療方法

【0155】

本発明の更に他の側面において、前記ＮＫ細胞を癌にかかった個体に投与する段階を含む癌治療方法を提供する。このとき、ＮＫ細胞及び癌は、上述した通りである。本発明の更に他の側面において、癌の治療のための前記ＮＫ細胞の用途を提供する。

【0156】

ＮＫ細胞培養方法２

【0157】

【0158】

本発明の更に他の側面は、前記ナチュラルキラー細胞の培養方法で製造されたナチュラルキラー細胞を提供する。本発明の更に他の側面は、前記ナチュラルキラー細胞を有効成分として含む癌予防又は治療用医薬組成物を提供する。本発明の更に他の側面において、前記ＮＫ細胞を癌にかかった個体に投与する段階を含む癌治療方法を提供する。このとき、ＮＫ細胞及び癌は上述した通りである。本発明の更に他の側面において、癌の治療のための前記ＮＫ細胞の用途を提供する。

【0159】

【0160】

【0161】

ＮＫ細胞培養方法３

【0162】

【0163】

本発明の更に他の側面は、前記ナチュラルキラー細胞の培養方法で製造されたナチュラルキラー細胞を提供する。前記ナチュラルキラー細胞は、ＣＤ１６及びＮＫｐ４６などの活性化受容体（ａｃｔｉｖａｔｉｎｇｒｅｃｅｐｔｏｒ）の発現が高く、癌細胞株に対する殺害能及びグランザイムＢ及びパーフォリンの分泌が増加するので、優れた抗癌効果を期待することができる。よって、臨床適用が可能な多量の活性化されたナチュラルキラー細胞を用いて癌治療に有効な治療剤を製造することができる。また、前記ナチュラルキラー細胞は、ＮＫｐ３０、ＤＮＡＭ１の発現が高い場合がある。

【0164】

本発明の更に他の側面は、前記ナチュラルキラー細胞を有効成分として含む癌予防又は治療用医薬組成物を提供する。本発明の更に他の側面において、前記ＮＫ細胞を癌にかかった個体に投与する段階を含む癌治療方法を提供する。このとき、ＮＫ細胞及び癌は上述した通りである。本発明の更に他の側面において、癌の治療のための前記ＮＫ細胞の用途を提供する。

【0165】

【0166】

ＮＫ細胞培養方法４

【0167】

【0168】

本発明の更に他の側面は、前記ＰＢＭＣ内のナチュラルキラー細胞の活性を促進させる方法で製造されたＰＢＭＣを提供する。前記ＰＢＭＣ内のナチュラルキラー細胞は、ＣＤ１６及びＮＫｐ４６などの活性化受容体（ａｃｔｉｖａｔｉｎｇｒｅｃｅｐｔｏｒ）の発現が高く、癌細胞株に対する殺害能及びグランザイムＢ及びパーフォリンの分泌が増加するので、優れた抗癌効果を期待することができる。よって、臨床適用が可能な多量の活性化されたナチュラルキラー細胞を含むＰＢＭＣを用いて癌治療に有効な治療剤を製造することができる。また、前記ＰＢＭＣ内のナチュラルキラー細胞は、ＮＫｐ３０、ＤＮＡＭ１の発現が高い場合がある。

【0169】

本発明の更に他の側面は、前記ＰＢＭＣを有効成分として含む癌予防又は治療用医薬組成物を提供する。本発明の更に他の側面において、前記ＮＫ細胞を癌にかかった個体に投与する段階を含む癌治療方法を提供する。このとき、ＮＫ細胞及び癌は上述した通りである。本発明の更に他の側面において、癌の治療のための前記ＮＫ細胞の用途を提供する。

【0170】

【実施例】

【0171】

以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。ただし、下記の実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎなく、本発明が下記の実施例に限定されるのではない。

【0172】

Ｉ．ＧＩ－１０１、ナチュラルキラー細胞及びナチュラルキラー細胞培養組成物の製造

【0173】

製造例１．ｈＣＤ８０－Ｆｃ－ＩＬ－２変異体（２Ｍ）の製造：ＧＩ－１０１

【0174】

ヒトＣＤ８０断片、Ｆｃドメイン及びＩＬ－２変異体を含む融合タンパク質を生産するために、シグナルペプチド（配列番号１）、ＣＤ８０断片（配列番号２）、リンカーが結合したＩｇヒンジ（配列番号３）、Ｆｃドメイン（配列番号４）、リンカー（配列番号５）及び２個のアミノ酸が置換されたＩＬ－２変異体（２Ｍ）（Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ）（配列番号６）をＮ末端から順次に含む融合タンパク質をコードする塩基配列（配列番号８）を含むポリヌクレオチドを、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＧｅｎｅＡｒｔＧｅｎｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓサービスを用いてポリヌクレオチド合成してｐｃＤＮＡ３＿４ベクターに積載した。また、前記ベクターをＣＨＯ細胞（Ｅｘｐｉ－ＣＨＯ^ＴＭ）に導入し、配列番号９の融合タンパク質を発現させた。ベクターを導入した後、３７℃、１２５ＲＰＭ、ＣＯ_２８％濃度の環境において７日培養後に培養液を回収し、融合タンパク質を精製した。前記精製した融合タンパク質二量体を「ＧＩ－１０１」と命名した。

【0175】

精製は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅｐｒｏｔｅｉｎＡレジンが含まれたクロマトグラフィーを用いて行った。２５ｍＭトリス、２５ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４の条件で融合タンパク質を結合させた。その後、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ３の１００ｍＭの酢酸で溶出した。ｐＨ９の２０％の１Ｍトリス－ＨＣｌを回収用チューブに入れた後、融合タンパク質を回収した。回収した融合タンパク質をＰＢＳバッファーで１６時間透析して変えた。

【0176】

その後、ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷＸＬカラム（ＴＯＳＯＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてサイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅｅｘｃｌｕｓｉｏｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で時間による２８０ｎｍ波長における吸光度を測定し、高濃度融合タンパク質を確保した。このとき、分離精製された融合タンパク質は、還元（Ｒ）又は非還元（ＮＲ）条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、クマシーブルー（ｃｏｏｍａｓｓｉｅｂｌｕｅ）で染色し、その純度を確認した（図１ｂ）。ＮａｎｏＤｒｏｐを用いた検出時に、２．７８ｍｇ／ｍｌの濃度で融合タンパク質が含まれたことを確認した（図１ｃ）。また、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて分析した結果は、図３に示す通りである。

【0177】

製造例２．Ｆｃ－ＩＬ－２変異体（２Ｍ）二量体の製造：Ｆｃ－ＩＬ－２ｖ２

【0178】

Ｆｃドメイン及びＩＬ－２変異体を含む融合タンパク質を生産するために、シグナルペプチド（配列番号１）、Ｉｇヒンジ（配列番号３８）、Ｆｃドメイン（配列番号４）、リンカー（配列番号５）及び２個のアミノ酸が置換されたＩＬ－２変異体（２Ｍ）（Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ）（配列番号６）を含む融合タンパク質をコードする塩基配列（配列番号４５）をＮ末端から順次に含むポリヌクレオチドを、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＧｅｎｅＡｒｔＧｅｎｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓサービスを用いてポリヌクレオチド合成してｐｃＤＮＡ３＿４ベクターに積載した。また、前記ベクターをＣＨＯ細胞（Ｅｘｐｉ－ＣＨＯ^ＴＭ）に導入し、配列番号４４の融合タンパク質を発現させた。ベクターを導入した後、３７℃、１２５ＲＰＭ、ＣＯ_２８％濃度の環境において７日培養後に培養液を回収し、融合タンパク質二量体を精製した。前記精製した融合タンパク質二量体を「Ｆｃ－ＩＬ２ｖ２」と命名した。

【0179】

前記精製及び融合タンパク質の回収は、前記製造例１と同じ方法で行った。分離精製された融合タンパク質は、還元（Ｒ）又は非還元（ＮＲ）条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、クマシーブルーで染色し、その純度を確認した（図３ａ）。その結果、前記融合タンパク質が二量体を形成することを確認した。また、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて分析した結果は、図３ｂに示す通りである。

【0180】

製造例３．Ｆｃ－ＩＬ－２二量体の製造：Ｆｃ－ＩＬ－２ｗｔ

【0181】

Ｆｃドメイン及び野生型ＩＬ－２を含む融合タンパク質を生産するために、シグナルペプチド（配列番号１）、Ｉｇヒンジ（配列番号３８）、Ｆｃドメイン（配列番号４）、リンカー（配列番号５）及び野生型ＩＬ－２（配列番号１０）を含む融合タンパク質をコードする塩基配列（配列番号４３）をＮ末端から順次に含むポリヌクレオチドを、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＧｅｎｅＡｒｔＧｅｎｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓサービスを通じてポリヌクレオチド合成してｐｃＤＮＡ３＿４ベクターに積載した。また、前記ベクターをＣＨＯ細胞（Ｅｘｐｉ－ＣＨＯ^ＴＭ）に導入し、配列番号４２の融合タンパク質を発現させた。ベクターを導入した後、３７℃、１２５ＲＰＭ、ＣＯ_２８％濃度の環境において７日培養後に培養液を回収し、融合タンパク質二量体を精製した。前記精製した融合タンパク質二量体を「Ｆｃ－ＩＬ２ｗｔ」と命名した。

【0182】

前記精製及び融合タンパク質の回収は、前記製造例１と同じ方法で行った。分離精製された融合タンパク質は、還元（Ｒ）又は非還元（ＮＲ）条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、クマシーブルーで染色し、その純度を確認した（図３ｃ）。その結果、前記融合タンパク質が二量体を形成することを確認した。また、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて分析した結果は、図３ｄに示す通りである。

【0183】

製造例４．ｈＣＤ８０－Ｆｃ－ＩＬ－２野生型二量体の製造：ｈＣＤ８０－Ｆｃ－ＩＬ－２ｗｔ

【0184】

ヒトＣＤ８０断片、Ｆｃドメイン及びＩＬ－２野生型タンパク質を含む融合タンパク質を生産するために、シグナルペプチド（配列番号１）、ＣＤ８０断片（配列番号２）、リンカーが結合されたＩｇヒンジ（配列番号３）、Ｆｃドメイン（配列番号４）、リンカー（配列番号５）及びＩＬ－２野生型（配列番号１０）をＮ末端から順次に含む融合タンパク質をコードする塩基配列（配列番号４１）を含むポリヌクレオチドを、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＧｅｎｅＡｒｔＧｅｎｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓサービスを通じてポリヌクレオチド合成してｐｃＤＮＡ３＿４ベクターに積載した。また、前記ベクターをＣＨＯ細胞（Ｅｘｐｉ－ＣＨＯ^ＴＭ）に導入し、配列番号４６の融合タンパク質を発現させた。ベクターを導入した後、３７℃、１２５ＲＰＭ、ＣＯ_２８％濃度の環境において７日培養後に培養液を回収し、融合タンパク質二量体を精製した。前記精製した融合タンパク質二量体を「ｈＣＤ８０－Ｆｃ－ＩＬ２ｗｔ」と命名した。

【0185】

【0186】

その後、ＴＳＫｇｅl Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（ＴＯＳＯＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてサイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅｅｘｃｌｕｓｉｏｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で時間による２８０ｎｍ波長における吸光度を測定し，高濃度融合タンパク質を確保した。このとき、分離精製された融合タンパク質は、還元（Ｒ）又は非還元（ＮＲ）条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、クマシーブルー（ｃｏｏｍａｓｓｉｅｂｌｕｅ）で染色し、その純度を確認した（図４ａ）。その結果、前記融合タンパク質が二量体を形成することを確認した。また、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて分析した結果は、図４ｂに示す通りである。

【0187】

製造例５．ｈＣＤ８０－Ｆｃ二量体の製造：ｈＣＤ８０－Ｆｃ

【0188】

ヒトＣＤ８０断片及びＦｃドメインを含む融合タンパク質を生産するために、シグナルペプチド（配列番号１）、ＣＤ８０断片（配列番号２）、リンカーが結合されたＩｇヒンジ（配列番号３）及びＦｃドメイン（配列番号４）をＮ末端から順次に含む融合タンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド（配列番号３９）を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＧｅｎｅＡｒｔＧｅｎｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓサービスを通じてポリヌクレオチド合成してｐｃＤＮＡ３＿４ベクターに積載した。また、前記ベクターをＣＨＯ細胞（Ｅｘｐｉ－ＣＨＯ^ＴＭ）に導入し、配列番号４０の融合タンパク質を発現させた。ベクターを導入した後、３７℃、１２５ＲＰＭ、ＣＯ_２８％濃度の環境において７日培養後に培養液を回収し、融合タンパク質二量体を精製した。前記精製した融合タンパク質二量体を「ｈＣＤ８０－Ｆｃ」と命名した。

【0189】

【0190】

その後、ＴＳＫｇｅl Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（ＴＯＳＯＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてサイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅｅｘｃｌｕｓｉｏｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で時間による２８０ｎｍ波長における吸光度を測定し，高濃度融合タンパク質を確保した。このとき、分離精製された融合タンパク質は、還元（Ｒ）又は非還元（ＮＲ）条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、クマシーブルー（ｃｏｏｍａｓｓｉｅｂｌｕｅ）で染色し、その純度を確認した（図２ａ）。その結果、前記融合タンパク質が二量体を形成することを確認した。また、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて分析した結果は、図２ｂに示す通りである。

【0191】

準備例１．ナチュラルキラー細胞培養培地の製造

【0192】

下記の表１乃至表４の組成を有する基本培養培地別に下記の表５の添加条件１乃至４に該当する物質をそれぞれ添加し、ナチュラルキラー細胞培養培地組成物を製造した。

【0193】

【表1】

【0194】

【表2】

【0195】

【表3】

【0196】

【表4】

【0197】

【表5】

【0198】

実施例１．末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）由来ＣＤ３（－）ＣＤ５６（＋）ナチュラルキラー細胞の準備

【0199】

ＣＤ３（－）細胞を収得するために、ＰＢＭＣ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌ、Ｚｅｎ－Ｂｉｏ．Ｉｎｃ、ＮＣ２７７０９、ＵＳＡ、Ｃａｔ＃：ＳＥＲ－ＰＢＭＣ－２００－Ｆ）に対して、ＡＤＡＭ－ＭＣ２自動細胞計数器（ＮａｎｏＥｎＴｅｋ、（株）コスモジンテック社製）を用いて細胞数を測定した。前記ＰＢＭＣを新しいチューブに移した後、３００×ｇ、４℃の温度で５分間遠心分離した。ＰＢＳに０．５％（ｖ／ｖ）ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ）と２ｍＭ濃度のＥＤＴＡが含まれたＭＡＣＳバッファー（ｐＨ７．２）を製造した。遠心分離が終了した後、１×１０^７細胞数当たり８０μｌのＭＡＣｓバッファーと２０μｌのＣＤ３磁性ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉｂｉｏｔｅｃｈ、１３０－０５０－１０１）を処理し、細胞ペレットを懸濁した後、４℃の温度で１５分間反応させた。洗浄のために、１０ｍｌのＭＡＣｓバッファーを入れ、３００×ｇ、４℃の温度で１０分間遠心分離した後、０．５ｍｌのＭＡＣｓバッファーに細胞ペレットを再懸濁した。

【0200】

ＬＤカラム（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ、ＢｅｒｇｉｓｃｈＧｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ、Ｃａｔ＃：１３０－０４２－９０１）にまず２ｍｌのＭＡＣｓバッファーを流した後、前記細胞懸濁液を流した。その後、ＬＤカラムを通過して出るＣＤ３（－）細胞を収得した。このとき、ＬＤカラム内に残っている細胞が十分に分離され得るように、２ｍｌのＭＡＣｓバッファーを３回流し、ＣＤ３（－）細胞を収得した。収得したＣＤ３（－）細胞に対して細胞計数器を用いて細胞数を測定した後、新しいチューブに入れ、３００×ｇ、４℃の温度で５分間遠心分離した。その後、上澄液を除去した後、１×１０^７個の細胞数当たり８０μｌのＭＡＣｓバッファーと２０μｌのＣＤ５６磁性ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉｂｉｏｔｅｃｈ、Ｃａｔ＃：１３０－０５０－４０１）を入れ、４℃の温度で１５分間反応させた。洗浄のために、１０ｍｌのＭＡＣｓバッファーを入れ、３００×ｇ、４℃の温度で１０分間遠心分離した後、０．５ｍｌのＭＡＣｓバッファーに細胞ペレットを再懸濁した。

【0201】

ＬＳカラム（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ、ＢｅｒｇｉｓｃｈＧｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ、Ｃａｔ＃：１３０－０４２－９０１）にまず３ｍｌのＭＡＣｓバッファーを流した後、前記細胞懸濁液を流した。このとき、ＬＳカラム内に残っている細胞が十分に分離され得るように２ｍｌのＭＡＣｓバッファーを３回流した。その後、ＬＳカラムを磁性スタンド（Ｍａｇｎｅｔｓｔａｎｄ）から分離した後、５ｍｌのＭＡＣｓバッファーを入れ、ピストンで圧力を与えてＣＤ３（－）ＣＤ５６（＋）ナチュラルキラー細胞を収得した。前記収得したＣＤ３（－）ＣＤ５６（＋）ナチュラルキラー細胞を新しいチューブに入れ、３００×ｇ、４℃の温度で５分間遠心分離した。上澄液を除去した後、培養条件を考慮した上で、表１乃至表４の基本培養培地に細胞を懸濁した。前記懸濁された細胞の細胞数は、細胞計数器を用いて測定した。

【0202】

実施例２．末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）由来ＣＤ３（－）ＣＤ５６（＋）ナチュラルキラー細胞の培養

【0203】

ＮＫＣｅｌｌＡｃｔｉｖａｔｉｏｎ／ＥｘｐａｎｓｉｏｎＫｉｔ（Ｃａｔ＃：１３０－１１２－９６８）（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ、ＢｅｒｇｉｓｃｈＧｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）内に含まれているＣＤ３３５（ＮＫｐ４６）－Ｂｉｏｔｉｎ１００μＬとＣＤ２－Ｂｉｏｔｉｎ１００μＬを１．５ｍＬマイクロチューブに入れて混ぜた後、Ａｎｔｉ－ＢｉｏｔｉｎＭＡＣＳＳｉＢｅａｄＰａｒｔｉｃｌｅｓ５００μＬを入れて混ぜた。その後、ＭＡＣｓバッファー３００μＬを入れ、マイクロチューブローテーター（ＭｉｃｒｏｔｕｂｅＲｏｔａｔｏｒ）を用いて２℃～８℃で２時間にわたって混ぜた。細胞数を考慮した上で、１×１０^６ｃｅｌｌｓ当たり５μＬのＮＫａｃｔｉｖａｔｉｏｎＢｅａｄｓを新しいチューブに移した。１ｍＬのＰＢＳを入れ、３００×ｇで５分間遠心分離した。上澄液を除去した後、使用するＮＫＭＡＣｓ培地（Ｃａｔ＃：１３０－０９４－４８３）（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ、ＢｅｒｇｉｓｃｈＧｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を１０^６ＮＫｃｅｌｌｓ当たり５μＬを基準にして追加し、ビーズ（ｂｅａｄ）を解した後、実施例１で分離されたＣＤ３（－）ＣＤ５６（＋）ナチュラルキラー細胞に接種した。

【0204】

次に、前記準備されたＣＤ３（－）ＣＤ５６（＋）ナチュラルキラー細胞を、総細胞数が２．５×１０^５になるように準備例１で製造した添加物質を含む培養培地組成物に懸濁して４８－ウェルプレートに播種した後、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で培養した。その後、２日間隔で細胞数を確認し、細胞が培養容器の８０％以上を占める（Ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）場合、４８－ウェルプレート、２４－ウェルプレート、１２－ウェルプレート、６－ウェルプレート、２５Ｔフラスコの順に継代培養し、最終的に、２１日目に全ての細胞を収穫した。

【0205】

実施例３．細胞数の測定及び細胞生存率の比較

【0206】

培養されたナチュラルキラー細胞の総細胞数及び生存率を５日、９日、１１日、１３日、１５日、１７日、２１日に細胞計数器（ＡＤＡＭ－ＭＣ２）を用いて測定した。このとき、処理された物質及び培養培地の種類によって細胞増殖速度が異なるので、継代基準である８０％を満たす速度に合わせて前記日付に細胞数を測定した。

【0207】

準備例１で製造された培養培地組成物の条件下で培養されたＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞の総細胞数及び生存率を比較した結果は、表６乃至表１３、及び図５ａ乃至図１２ｂに示した。

【0208】

その結果、製造例１によって製造されたＧＩ－１０１が添加された培養培地組成物は、４種の基本培養培地（表１乃至表４）の条件において、処理濃度と関係なく、いずれも対照群（ＣＤ８０－Ｆｃ＋Ｆｃ－ＩＬ２ｖ２、ＣＤ８０－Ｆｃ＋Ｆｃ－ＩＬ２ＷＴ添加）に比べてナチュラルキラー細胞の総細胞数が多いことを確認した（図５ａ、図５ｂ、図７ａ、図７ｂ、図９ａ、図９ｂ、図１１ａ及び図１１ｂ）。

【0209】

また、細胞生存率においても、ＧＩ－１０１を添加した場合、基本培養培地及び濃度と関係なく、いずれも高い生存率を示した（図６ａ、図６ｂ、図８ａ、図８ｂ、図１０ａ、図１０ｂ、図１２ａ及び図１２ｂ）。

【0210】

前記結果を通じて、ＧＩ－１０１は、基本培養培地及び濃度と関係なく、対照群（ＣＤ８０－Ｆｃ＋Ｆｃ－ＩＬ２ｖ２、ＣＤ８０－Ｆｃ＋Ｆｃ－ＩＬ２ＷＴ添加）よりもナチュラルキラー細胞増殖能力の向上及び生存率に重要な役割をすることが確認された。

【0211】

【表6】

【0212】

【表7】

【0213】

【表8】

【0214】

【表9】

【0215】

【表10】

【0216】

【表11】

【0217】

【表12】

【0218】

【表13】

【0219】

ＩＩ．ナチュラルキラー細胞培養組成物を用いたナチュラルキラー細胞の特性分析

【0220】

実施例４．ナチュラルキラー細胞の純度確認

【0221】

実施例２で収得したＣＤ３－ＣＤ５６＋ナチュラルキラー細胞をそれぞれ３００×ｇの条件で５分間遠心分離し、上澄液を除去し、ＦＡＣＳバッファー１ｍｌを入れてペレットを解した。その後、ＰＢＳに３％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１０ｍＭＥＤＴＡ、２０ｍＭＨＥＰＥＳ、１０μｇ／ｍｌポリミキシンＢ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムを添加して製造したＦＡＣＳバッファー１ｍｌを入れ、細胞ペレットを再懸濁した。その後、細胞計数器を用いて２×１０^６細胞数／ｍｌになるようにＦＡＣＳバッファーで希釈した。

【0222】

５ｍｌＦＡＣＳチューブに希釈した細胞溶液を１００μｌずつ入れ、ＦＡＣＳバッファー１００μｌをさらに入れ、ＰｅｒＣＰが標識された抗－ヒトＣＤ３抗体（ＰｅｒＣＰｈｕｍａｎａｎｔｉ－ＣＤ３（ＣｌｏｎｅＵＣＨＴ１））及びＰＥ／ｃｙ７が標識された抗－ヒトＣＤ５６抗体（ＰＥ／ｃｙ７ｈｕｍａｎａｎｔｉ－ＣＤ５６（ＣｌｏｎｅＢ１５９））を処理した。その後、２０分間４℃の温度で反応させた後、２００μｌＦＡＣＳバッファーを入れ、１，５００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上澄液を除去し、２００μｌＦＡＣＳバッファーを入れて懸濁した後、フローサイトメーター（Ｃｙｔｅｋ（登録商標）Ａｕｒｏｒａ、Ｃｙｔｅｋ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて細胞の表現型を確認した。

【0223】

前記実験で使用された抗体情報は表１４に示した。また、準備例１で製造された培養培地組成物の条件下で２１日間培養されたＣＤ３－ＣＤ５６＋ナチュラルキラー細胞の純度を測定し、これを図１３乃至図１６に示した。

【0224】

【表14】

【0225】

実施例５．ナチュラルキラー細胞の活性及び阻害マーカーの確認

【0226】

実施例２で収得したＣＤ３－ＣＤ５６＋ナチュラルキラー細胞をそれぞれ３００×ｇの条件で５分間遠心分離し、上澄液を除去し、ＦＡＣＳバッファー１ｍｌを入れてペレットを解した。

【0227】

ＰＢＳに３％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１０ｍＭＥＤＴＡ、２０ｍＭＨＥＰＥＳ、１０μｇ／ｍｌポリミキシンＢ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムを添加して製造したＦＡＣＳバッファー１ｍｌを入れ、細胞ペレットを再懸濁した。その後、細胞計数器を用いて２×１０^６細胞数／ｍｌになるようにＦＡＣＳバッファーで希釈した。５ｍｌＦＡＣＳチューブに希釈した細胞溶液を１００μｌずつ入れ、フローサイトメーターを用いてＰｅ－ＣＦ５９４が標識された抗－ヒトＣＤ１６抗体（ＰＥ－ＣＦ５９４ｈｕｍａｎａｎｔｉ－ＣＤ１６（Ｃｌｏｎｅ３Ｇ８））、ＡＰＣが標識された抗－ヒトＤＮＡＭ１抗体（ＡＰＣｈｕｍａｎａｎｔｉ－ＤＮＡＭ１（Ｃｌｏｎｅ１１Ａ８））、ＢＶ６０５が標識された抗－ヒトＮＫＧ２Ｃ抗体（ＢＶ６０５ｈｕｍａｎａｎｔｉ－ＮＫＧ２Ｃ（Ｃｌｏｎｅ１３４５９１））、ＢＶ６５０が標識された抗－ヒトＮＫＧ２Ｄ抗体（ＢＶ６５０ｈｕｍａｎａｎｔｉ－ＮＫＧ２Ｄ（Ｃｌｏｎｅ１Ｄ１１））、ＢＢ５１５が標識された抗－ヒトＮＫｐ４６抗体（ＢＢ５１５ｈｕｍａｎａｎｔｉ－ＮＫｐ４６（Ｃｌｏｎｅ９Ｅ２））、ＢＶ４８０が標識された抗－ヒトＮＫｐ３０抗体（ＢＶ４８０ｈｕｍａｎａｎｔｉ－ＮＫｐ３０（Ｃｌｏｎｅｐ３０－１５））、ＰＥが標識された抗－ヒトＰＤ－１抗体（ＰＥｈｕｍａｎａｎｔｉ－ＰＤ－１（ＣｌｏｎｅＥＨ１２．２Ｈ７））、及びＡＰＣが標識された抗－ヒトＮＫＧ２Ａ抗体（ＡＰＣａｎｔｉ－ｈｕｍａｎＮＫＧ２Ａ（Ｃｌｏｎｅ１３１４１１））を用いて確認した。その後、２０分間４℃の温度で反応させた後、１００μｌＦＡＣＳバッファーを入れ、１,５００ｒｐｍで３分間遠心分離した。

【0228】

上澄液を除去し、２００μｌＦＡＣＳバッファーを入れて懸濁した後、フローサイトメーター（Ｃｙｔｅｋ（登録商標）Ａｕｒｏｒａ、Ｃｙｔｅｋ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて細胞の表現型を確認した。前記実験で使用された抗体情報は表１５に示した。準備例１で製造された培養培地組成物の条件下で２１日間培養されたＣＤ３－ＣＤ５６＋ナチュラルキラー細胞の活性及び阻害マーカーを確認し、これを図１７乃至図２４に示した。

【0229】

【表15】

【0230】

実施例６.ナチュラルキラー細胞のグランザイムＢ、パーフォリン、インターフェロンガンマ分泌能の確認

【0231】

実施例２で収得したＣＤ３－ＣＤ５６＋ナチュラルキラー細胞のグランザイム及びパーフォリンの分泌能を確認するために、細胞内染色（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｓｔａｉｎｉｎｇ）を通じてナチュラルキラー細胞内のグランザイムＢ、パーフォリン、インターフェロンガンマの発現量を測定した。培養されたナチュラルキラー細胞を３００×ｇの条件で５分間遠心分離し、上澄液を除去した。その後、細胞計数器を用いて２×１０^６細胞数／ｍｌになるように各培養組成物で希釈した。

【0232】

準備された細胞を９６－ウェルプレートのそれぞれのウェルに２００μｌずつ分注した後、１％（ｖ／ｖ）ＳｔｉｍｕｌａｔｉｏｎＣｏｃｋｔａｉｌ（１Ｘ）（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を入れ、３７℃、ＣＯ_２の条件で４時間反応させた。その後、プレートを３００×ｇの条件で５分間遠心分離し、上澄液を除去した。その後、ＰＢＳに３％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１０ｍＭＥＤＴＡ、２０ｍＭＨＥＰＥＳ、１０μｇ／ｍｌポリミキシンＢ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムを添加して製造したＦＡＣＳバッファー１００μｌを入れ、細胞ペレットを再懸濁した。上澄液を除去し、固定（ｆｉｘａｔｉｏｎ）及び浸透（ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ）のために１００μｌＢＤＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ^ＴＭバッファー（ｐｅｒｍ／ｆｉｘａｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ、ＢＤｓｃｉｅｎｃｅ）を入れて懸濁した後、これを３０分間４℃の温度で反応させた。ＦＡＣＳバッファー１００μｌをさらに入れ、１，５００ｒｐｍで３分間遠心分離した。

【0233】

Ｐｅ／ｃｙ７が標識された抗－ヒトグランザイムＢ抗体（ＰＥ／ｃｙ７ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎＧｒａｎｚｙｍｅＢ（ＣｌｏｎｅＮＧＺＢ））、及びＡＰＣが標識された抗－ヒトパーフォリン抗体（ＡＰＣａｎｔｉ－ｈｕｍａｎＰｅｒｆｏｒｉｎ（ＣｌｏｎｅＢ－Ｄ４８））、ＢＶ４２１が標識された抗－ヒトインターフェロンガンマ抗体（ＢＶ４２１ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎＩＦＮ－ｇａｍｍａ（ＣｌｏｎｅＢ２７））を処理した。その後、２０分間４℃の温度で反応させた後、１００μｌＦＡＣＳバッファーを入れ、１,５００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上澄液を除去し、２００μｌＦＡＣＳバッファー（ｆｉｘａｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ）を入れて懸濁した後、フローサイトメーターを用いて細胞の発現量を確認した。

【0234】

前記実験で使用された抗体情報は表１６に示した。準備例１で製造された培養培地組成物の条件下で２１日間培養されたＣＤ３－ＣＤ５６＋ナチュラルキラー細胞のマーカーを確認し、これを図２５乃至図２８に示した。

【0235】

【表16】

【0236】

ＩＩＩ．培養組成物によるナチュラルキラー細胞の癌細胞殺害能分析

【0237】

実施例８．癌細胞に対するナチュラルキラー細胞の脱顆粒能及び死滅効果の確認

【0238】

具体的に、Ｋ５６２癌細胞株（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ）を下記の表１７に示した細胞数になるようにＰＢＳに希釈させ、これを各ウェルに分注した。

【0239】

【表17】

【0240】

具体的に、Ｋ５６２癌細胞株を１×１０^７細胞数／ｍｌになるように各培養組成物で希釈させた後、各ウェル当たり前記表に定められた細胞数によって分注した。その後、ナチュラルキラー細胞も、５×１０^６細胞数／ｍｌになるように各培養組成物で希釈させた後、各ウェル当たり前記表に定められた細胞数によって分注し、３０×ｇの条件で３分間遠心分離させた。その後、３７℃、５％ＣＯ_２の条件で４時間培養した後、ＢＶ４２１が標識された抗－ヒトＣＤ３抗体（ＢＶ４２１ｈｕｍａｎａｎｔｉ－ＣＤ３（ＣｌｏｎｅＵＣＨＴ１））、ＰＥが標識された抗－ヒトＣＤ１６抗体（ＰＥｈｕｍａｎａｎｔｉ－ＣＤ１６（Ｃｌｏｎｅ３Ｇ８））、ＰＥ／ｃｙ７が標識された抗－ヒトＣＤ５６抗体（ＰＥ／ｃｙ７ｈｕｍａｎａｎｔｉ－ＣＤ５６（ＣｌｏｎｅＢ１５９））及びＦＩＴＣが標識された抗－ヒトＣＤ１０７ａ抗体（ＣｌｏｎｅＨ４Ａ３）を処理し、これを氷の上で２０分間反応させた。

【0241】

その後、１００μｌのＦＡＣＳバッファーを入れ、１，３００ｒｐｍ、４℃の条件で５分間遠心分離した。上澄液を除去した後、７－ＡＡＤＶｉａｂｉｌｉｔｙＳｔａｉｎｉｎｇＳｏｌｕｔｉｏｎを処理し、光を遮断して常温で１５分間反応させた。その後、１００μｌのＦＡＣＳバッファーを入れ、１，３００ｒｐｍ、４℃の条件で５分間遠心分離した。再び２００μｌのＦＡＣＳバッファーを入れ、１，３００ｒｐｍ、４℃の条件で５分間遠心分離した。前記過程をもう一度繰り返した後、上澄液を除去し、４００μｌのＦＡＣＳバッファーを入れ、フローサイトメーター（Ｃｙｔｅｋ（登録商標）Ａｕｒｏｒａ、Ｃｙｔｅｋ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて分析した。

【0242】

前記実験を通じて表１乃至表４の基本培養培地に表５の添加物質をそれぞれ５０ｎＭ添加した組成物で２１日間培養されたナチュラルキラー細胞の脱顆粒能及び死滅効果は、図２９乃至図３４に示した。

【図1a】