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特許7382088光エネルギーにより調節される自己組織化複合体、及びそれを含むナノシステム
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-11-08
(45)【発行日】2023-11-16
(54)【発明の名称】光エネルギーにより調節される自己組織化複合体、及びそれを含むナノシステム
(51)【国際特許分類】
A61K 47/56 20170101AFI20231109BHJP
A61K 47/61 20170101ALI20231109BHJP
A61K 47/59 20170101ALI20231109BHJP
A61K 47/58 20170101ALI20231109BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231109BHJP
【ＦＩ】
A61K47/56
A61K47/61
A61K47/59
A61K47/58
A61P43/00
【請求項の数】
19
(21)【出願番号】P 2022094123
(22)【出願日】2022-06-10
(65)【公開番号】P2023113545
(43)【公開日】2023-08-16
【審査請求日】2022-06-10
(31)【優先権主張番号】10-2022-0014028
(32)【優先日】2022-02-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】518107501
【氏名又は名称】コリア ユニバーシティ リサーチ アンド ビジネス ファウンデーション
【氏名又は名称原語表記】ＫＯＲＥＡ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＡＮＤ ＢＵＳＩＮＥＳＳ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
【住所又は居所原語表記】１４５，Ａｎａｍ－ｒｏ，Ｓｅｏｎｇｂｕｋ－ｇｕ，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ
(74)【代理人】
【識別番号】100107766
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠重
(74)【代理人】
【識別番号】100070150
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠彦
(74)【代理人】
【識別番号】100135079
【弁理士】
【氏名又は名称】宮崎 修
(72)【発明者】
【氏名】カン，ヒ－ミン
(72)【発明者】
【氏名】キム，ユリ
(72)【発明者】
【氏名】ペ，グン－ヒュ
(72)【発明者】
【氏名】イ，ソン－グ
(72)【発明者】
【氏名】カン，ナ－ヨン
【審査官】伊藤 幸司
(56)【参考文献】
【文献】特開２００１－２７０８６０（ＪＰ，Ａ）
【文献】ACS Macro Lett.，2021年，10，pp.914-920
【文献】Langmuir，2020年，36，pp.13051-13059
【文献】J. Phys. Chem. B，2020年，124，pp.6913-6923
【文献】Langmuir，2014年，30，pp.10818-10825
【文献】Macromolecules，2009年，42，pp.4775-4786
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ
Ａ６１Ｐ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
リガンド及び負に荷電したポリマーを含むポリマー複合体と、正に荷電して、前記ポリマー複合体と結合し、光エネルギーにより異性化する光切替異性体と、を含み、
前記光切替異性体は、可逆的にシス（ｃｉｓ）異性体またはトランス（ｔｒａｎｓ）異性体として備えられ、
前記光切替異性体のトランス異性体は、化学式１の構造を有し、
（化学式１）
【化1】
前記光切替異性体の異性化により、体積が可逆的に膨張または収縮するものである、光エネルギーにより調節される自己組織化複合体。
【請求項2】
前記自己組織化複合体は、水溶性液体のある環境で、光エネルギーにより可逆的に膨張及び収縮し、前記自己組織化複合体は、前記水溶性液体のある環境で、ヒドロゲルの形態で備えられるが、
前記自己組織化複合体が膨張する過程で、前記水溶性液体を吸収し、
前記自己組織化複合体が収縮する過程で、前記水溶性液体を放出する、請求項１に記載の光エネルギーにより調節される自己組織化複合体。
【請求項3】
前記自己組織化複合体に吸収された水溶性液体は、採取して分析可能であり、前記水溶性液体は、血液、血漿、血清、尿、唾、脳脊髄液、涙、汗、大便、腹水、羊水、精液、乳、細胞培地、組織抽出物、及び癌組織のうち少なくともいずれか一つを含む、請求項２に記載の光エネルギーにより調節される自己組織化複合体。
【請求項4】
前記光切替異性体の異性化により、前記自己組織化複合体は、最大膨張または最大収縮が可能であり、前記自己組織化複合体は、紫外線照射後、前記最大膨張まで３０秒乃至９０秒が所要され、
前記自己組織化複合体の前記最大膨張時の重量は、前記最大収縮時の重量の３倍乃至５倍である、請求項２に記載の光エネルギーにより調節される自己組織化複合体。
【請求項5】
前記自己組織化複合体は、前記自己組織化複合体の内部に伝達物質をさらに含み、前記伝達物質は、前記自己組織化複合体が膨張して放出され、
前記伝達物質は、前記自己組織化複合体の収縮時、内部に維持される、請求項１に記載の光エネルギーにより調節される自己組織化複合体。
【請求項6】
前記伝達物質は、タンパク質、核酸、及び小分子薬物のうち少なくともいずれか一つを含んでもよく、前記タンパク質は、サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）、ケモカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）、免疫抗癌治療抗体、成長因子、ボツリヌストキシン（ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｔｏｘｉｎ）、及び抗原のうち少なくともいずれか一つを含み、
前記核酸は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ）、及びプラスミドＤＮＡ（ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ）のうち少なくともいずれか一つを含む、請求項５に記載の光エネルギーにより調節される自己組織化複合体。
【請求項7】
前記自己組織化複合体は、少なくとも一つのポリマー複合体と、少なくとも一つの光切替異性体と、を含み、前記自己組織化複合体は、
前記ポリマー複合体が、互いに隣り合うポリマー複合体または前記光切替異性体と結合され、前記光切替異性体が、互いに隣り合う光切替異性体と相互作用して形成され、
前記光切替異性体と互いに隣り合う光切替異性体の相互作用は、π－カチオン相互作用及びπ－π相互作用のうち少なくともいずれか一つを含む、請求項１に記載の光エネルギーにより調節される自己組織化複合体。
【請求項8】
前記光切替異性体は、紫外線により、シス異性体に変換して、前記自己組織化複合体が膨張し、前記光切替異性体は、可視光線により、トランス異性体に変換して、前記自己組織化複合体が収縮する、請求項１に記載の光エネルギーにより調節される自己組織化複合体。
【請求項9】
前記ポリマーは、カルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、アルギン酸（ａｌｇｉｎａｔｅ）、ポリ（Ｌ－グルタミン酸）（ｐｏｌｙ（Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ））、ポリ（Ｌ－アスパラギン酸）（ｐｏｌｙ（Ｌ－ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ））、ポリアクリル酸（ＰＡＡ、ｐｏｌｙａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ）、ゼラチン、及びコラーゲンのうち少なくともいずれか一つを含む、請求項１に記載の光エネルギーにより調節される自己組織化複合体。
【請求項10】
前記リガンドは、ブラシカステロール（ｂｒａｓｓｉｃａｓｔｅｒｏｌ）、スチグマステロール（ｓｔｉｇｍａｓｔｅｒｏｌ）、アスコルブ酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）、サイアノコバラミン（ｃｙａｎｏｃｏｂａｌａｍｉｎ）、トコフェロール（ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ）、レチノール（ｒｅｔｉｎｏｌ）、アミノ酪酸（ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）、アミン－Ｂｏｃ塩酸塩（ａｍｉｎｅ－Ｂｏｃ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、シクロＲＧＤ（ｃｙｃｌｏ ＲＧＤ）、ＶＨ ０３２アミド－ＰＥＧ２－アミン（ＶＨ ０３２ ａｍｉｄｅ－ＰＥＧ２－ａｍｉｎｅ）、ヒスタミン（ｈｉｓｔａｍｉｎｅ）、チラミン（ｔｙｒａｍｉｎｅ）、β－フェニルエチルアミン（β－ｐｈｅｎｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）、トリプタミン（ｔｒｙｐｔａｍｉｎｅ）、セロトニン（ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ）、プトレシン（ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ）、カダベリン（ｃａｄａｖｅｒｉｎｅ）、スペルミジン（ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ）、及びスペルミン（ｓｐｅｒｍｉｎｅ）のうち少なくともいずれか一つを含む、請求項１に記載の光エネルギーにより調節される自己組織化複合体。
【請求項11】
前記自己組織化複合体のうち、前記光切替異性体と前記ポリマー複合体は、０．１：１０乃至１．０：１０の重量比で含まれる、請求項１に記載の光エネルギーにより調節される自己組織化複合体。
【請求項12】
前記光切替異性体は、シス異性体に変換され、前記自己組織化複合体を膨張させ、前記自己組織化複合体とマクロファージの付着及びＭ２分極を促進するか、または
前記光切替異性体は、トランス異性体に変換され、前記自己組織化複合体を収縮させ、
前記自己組織化複合体とマクロファージの付着を抑制し、Ｍ１分極を促進する、請求項１に記載の光エネルギーにより調節される自己組織化複合体。
【請求項13】
請求項１及び請求項１２のうちいずれか一項に記載の光エネルギーにより調節される自己組織化複合体と、前記自己組織化複合体の少なくとも一部が備えられる基板と、
前記基板に結合したアップコンバージョンナノ粒子と、を含み、
前記アップコンバージョンナノ粒子は、
コアシェル部と、前記コアシェル部の表面にコートされるコーティング部と、を含み、
前記コアシェル部は、赤外線を吸収し、前記赤外線のエネルギーを紫外線または可視光線のうち少なくともいずれか一つにアップコンバージョンさせ、
前記コーティング部は、前記コアシェル部においてアップコンバージョンされた可視光線を吸収し、
前記アップコンバージョンナノ粒子は、前記コアシェル部においてアップコンバージョンされた紫外線を放出する、光エネルギーにより調節されるナノシステム。
【請求項14】
前記コアシェル部は、９７０ｎｍ乃至９９０ｎｍ波長の光を吸収する、請求項１３に記載の光エネルギーにより調節されるナノシステム。
【請求項15】
前記コアシェル部は、中心部に備えられるコアと、前記コアの外面を取り囲むように備えられるシェルと、を含み、前記コアは、ＮａＹｂＦ４、ＮａＹＦ３、ＮａＧｄＦ４、ＫＧｄＦ４、ＹＯＦ、ＢａＬａＦ５、ＬａＦ３、ＮａＬｕＦ４、及びＳｒＦ２のうち少なくともいずれか一つを含み、
前記シェルは、ＣａＦ２、Ｎａ（Ｙｂ，Ｇｄ）Ｆ４、ＮａＧｄＦ４、及びＴｉＯ２のうち少なくともいずれか一つを含み、
前記コアシェル部は、ドーパントでドープされ、
前記ドーパントは、Ｙｂ３＋、Ｔｍ３＋、Ｌｎ３＋、及びＥｒ３＋のうち少なくともいずれか一つを含む、請求項１３に記載の光エネルギーにより調節されるナノシステム。
【請求項16】
前記コーティング部は、第１コーティング剤及び第２コーティング剤のうち少なくともいずれか一つを含み、前記第１コーティング剤は、β－カロチン（β－ｃａｒｏｔｅｎｅ）、クルクミン（ｃｕｒｃｕｍｉｎ）、蛍光タンパク質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｒ－フィコエリトリン（Ｒ－ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、ローダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、ＦＤＢ－００３、ＦＤＢ－００４、及びＦＤＢ－００５のうち少なくともいずれか一つを含み、
前記第２コーティング剤は、ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ ２０）、ツイーン８０（Ｔｗｅｅｎ ８０）、オレイン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｏｌｅａｔｅ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ、ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｐｈａｔｅ）、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｂｅｎｚｅｎｅ ｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ）、ステアリン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｓｔｅａｒａｔｅ）、ドデシルアミン塩酸塩（ｄｏｄｅｃｙｌａｍｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、スパン－６０（ｓｐａｎ－６０）、スパン－８０（ｓｐａｎ－８０）、ポリエチレンオキシド（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｏｘｉｄｅ）、及びドデシルベタイン（ｄｏｄｅｃｙｌ ｂｅｔａｉｎｅ）のうち少なくともいずれか一つを含む、請求項１３に記載の光エネルギーにより調節されるナノシステム。
【請求項17】
前記第１コーティング剤は、４２０ｎｍ乃至５００ｎｍ波長の光を吸収する、請求項１６に記載の光エネルギーにより調節されるナノシステム。
【請求項18】
前記ナノシステムは、生体内部で作動するが、生体外部から印加される光エネルギーにより調節され、前記ナノシステムに生体外部から赤外線が印加される場合、生体内部において、前記光切替異性体は、シス異性体に変換され、前記自己組織化複合体は、生体内部において膨張し、
前記ナノシステムに生体外部から可視光線が印加される場合、生体内部において、前記光切替異性体は、トランス異性体に変換され、前記自己組織化複合体は、生体内部において収縮する、請求項１３に記載の光エネルギーにより調節されるナノシステム。
【請求項19】
前記自己組織化複合体は、水溶性液体のある環境で、光エネルギーにより可逆的に膨張及び収縮し、前記ナノシステムに赤外線を照射し、前記自己組織化複合体が膨張して、前記水溶性液体を吸収し、
前記ナノシステムに可視光線を照射し、前記自己組織化複合体が収縮して、前記水溶性液体を放出する、請求項１３に記載の光エネルギーにより調節されるナノシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、光エネルギーにより調節される自己組織化複合体、及びそれを含むナノシステムに係り、さらに詳しくは、光エネルギーを吸収して異性化する自己組織化複合体、及びそれを含むナノシステムに関する。
【背景技術】
【0002】
光は、分子システムを、非浸湿的、かつ極めて選択的な方式で、高い空間及び時間分解能で処理することができる独特な機会を提供する。形、生物学的及び化学的活性、比誘電率及び屈折率が、光の制御下で、可逆的に切り替えられる化合物は、分子プローブから分子ナノテクノロジー及び光線力学に至る領域まで広範囲な応用分野に適用され得る。
【0003】
アゾベンゼン及びその誘導体は、このような化合物の主な例の一つである。広範囲な実験条件下で、光安定性及び機能的活性のような有利な特性は、多くの側面で光変色性システムの追加開発及び適用の可能性を有する。アゾベンゼンは、機能的挙動に基づき、光励起時、Ｎ＝Ｎ結合の可逆的なトランス（Ｅ）→シス（Ｚ）の異性化が可能である。したがって、アゾベンゼンの吸収スペクトルは、長期間関心を引いた。
【0004】
また、生体に適用される検査、治療等は、生体に無害であり、最大限生体を損なわない方法が要求される。
【0005】
このようなアゾベンゼン及びその誘導体の光切替特性を用いて、生体に非浸湿的に適用できる技術を開発する必要があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【文献】大韓民国公開特許第１０－２０１４－０１０７８１０号（２０１４．０９．０５．公開）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明の目的は、光エネルギーを用いて、自己組織化複合体、及びそれを含むナノシステムを調節して、生体試料を採取することができ、生体内に物質を伝達することができ、マクロファージの付着及び分極化を調節する技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明の一側面によれば、本発明の実施形態は、リガンド及び負に荷電したポリマーを含むポリマー複合体と、正に荷電して、前記ポリマー複合体と結合し、光エネルギーにより可逆的に異性化する光切替異性体と、を含み、前記光切替異性体は、可逆的にシス（ｃｉｓ）異性体またはトランス（ｔｒａｎｓ）異性体として備えられ、前記光切替異性体の異性化により、体積が可逆的に膨張または収縮するものである、光エネルギーにより調節される自己組織化複合体を含んでもよい。
【0009】
一実施形態において、前記自己組織化複合体は、水溶性液体のある環境で、光エネルギーにより可逆的に膨張及び収縮し、前記自己組織化複合体は、前記水溶性液体のある環境で、ヒドロゲルの形態で備えられるが、前記自己組織化複合体が膨張する過程で、前記水溶性液体を吸収し、前記自己組織化複合体が収縮する過程で、前記水溶性液体を放出するものであってもよい。
【0010】
一実施形態において、前記自己組織化複合体に吸収された水溶性液体は、採取して分析可能であり、前記水溶性液体は、血液、血漿、血清、尿、唾、脳脊髄液、涙、汗、大便、腹水、羊水、精液、乳、細胞培地、組織抽出物、及び癌組織のうち少なくともいずれか一つを含むものであってもよい。
【0011】
一実施形態において、前記光切替異性体の異性化により、前記自己組織化複合体は、最大膨張または最大収縮が可能であり、前記自己組織化複合体は、紫外線照射後、前記最大膨張まで３０秒乃至９０秒が所要され、前記自己組織化複合体の前記最大膨張時の重量は、前記最大収縮時の重量の３倍乃至５倍であるものであってもよい。
【0012】
一実施形態において、前記自己組織化複合体は、内部に伝達物質をさらに含み、前記伝達物質は、前記自己組織化複合体が膨張して放出され、前記伝達物質は、前記自己組織化複合体の収縮時、内部に維持されるものであってもよい。
【0013】
一実施形態において、前記伝達物質は、タンパク質、核酸、及び小分子薬物のうち少なくともいずれか一つを含んでもよく、前記タンパク質は、サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）、ケモカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）、免疫抗癌治療抗体、成長因子、ボツリヌストキシン（ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｔｏｘｉｎ）、及び抗原のうち少なくともいずれか一つを含み、前記核酸は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ
ＲＮＡ）、及びプラスミドＤＮＡ（ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ）のうち少なくともいずれか一つを含むものであってもよい。
ＲＮＡ）、及びプラスミドＤＮＡ（ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ）のうち少なくともいずれか一つを含むものであってもよい。
【0014】
一実施形態において、前記自己組織化複合体は、少なくとも一つのポリマー複合体と、少なくとも一つの光切替異性体と、を含み、前記自己組織化複合体は、前記ポリマー複合体が、互いに隣り合うポリマー複合体または前記光切替異性体と結合され、前記光切替異性体が、互いに隣り合う光切替異性体と相互作用して形成され、前記光切替異性体と互いに隣り合う光切替異性体の相互作用は、π－カチオン相互作用及びπ－π相互作用のうち少なくともいずれか一つを含むものであってもよい。
【0015】
一実施形態において、前記光切替異性体は、紫外線により、シス異性体に変換して、前記自己組織化複合体が膨張し、可視光線により、トランス異性体に変換して、前記自己組織化複合体が収縮するものであってもよい。
【0016】
一実施形態において、前記ポリマーは、カルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、
ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、アルギン酸（ａｌｇｉｎａｔｅ）、ポリ（Ｌ－グルタミン酸）（ｐｏｌｙ（Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ））、ポリ（Ｌ－アスパラギン酸）（ｐｏｌｙ（Ｌ－ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ））、ポリアクリル酸（ＰＡＡ、ｐｏｌｙａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ）、ゼラチン、及びコラーゲンのうち少なくともいずれか一つを含むものであってもよい。
ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、アルギン酸（ａｌｇｉｎａｔｅ）、ポリ（Ｌ－グルタミン酸）（ｐｏｌｙ（Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ））、ポリ（Ｌ－アスパラギン酸）（ｐｏｌｙ（Ｌ－ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ））、ポリアクリル酸（ＰＡＡ、ｐｏｌｙａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ）、ゼラチン、及びコラーゲンのうち少なくともいずれか一つを含むものであってもよい。
【0017】
一実施形態において、前記リガンドは、ブラシカステロール（ｂｒａｓｓｉｃａｓｔｅｒｏｌ）、スチグマステロール（ｓｔｉｇｍａｓｔｅｒｏｌ）、アスコルブ酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）、サイアノコバラミン（ｃｙａｎｏｃｏｂａｌａｍｉｎ）、トコフェロール（ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ）、レチノール（ｒｅｔｉｎｏｌ）、アミノ酪酸（ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）、アミン－Ｂｏｃ塩酸塩（ａｍｉｎｅ－Ｂｏｃ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、シクロＲＧＤ（ｃｙｃｌｏ ＲＧＤ）、ＶＨ ０３２アミド－ＰＥＧ２－アミン（ＶＨ ０３２ ａｍｉｄｅ－ＰＥＧ２－ａｍｉｎｅ）、ヒスタミン（ｈｉｓｔａｍｉｎｅ）、チラミン（ｔｙｒａｍｉｎｅ）、β－フェニルエチルアミン（β－ｐｈｅｎｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）、トリプタミン（ｔｒｙｐｔａｍｉｎｅ）、セロトニン（ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ）、プトレシン（ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ）、カダベリン（ｃａｄａｖｅｒｉｎｅ）、スペルミジン（ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ）、及びスペルミン（ｓｐｅｒｍｉｎｅ）のうち少なくともいずれか一つを含むものであってもよい。
【0018】
一実施形態において、前記光切替異性体のトランス異性体は、化学式１の構造を有してもよい。
【0019】
(化学式１)
【0020】
前記化学式１において、Ａは、Ｃ０乃至Ｃ１５のうちいずれか一つであり、Ｒは、水素、メチル、エチル、及びプロピルのうちいずれか一つであり、Ｘは、１乃至３のうちいずれか一つの整数である。
【0021】
一実施形態において、前記自己組織化複合体のうち、前記光切替異性体と前記ポリマー複合体は、０．１：１０乃至１．０：１０の重量比で含まれてもよい。
【0022】
一実施形態において、前記光切替異性体は、シス異性体に変換され、前記自己組織化複合体を膨張させ、前記自己組織化複合体とマクロファージの付着及びＭ２分極を促進するか、または前記光切替異性体は、トランス異性体に変換され、前記自己組織化複合体を収縮させ、前記自己組織化複合体とマクロファージの付着を抑制し、Ｍ１分極を促進するものであってもよい。
【0023】
また、本発明において、一実施形態は、前記光エネルギーにより調節される自己組織化複合体と、前記自己組織化複合体の少なくとも一部が備えられる基板と、前記基板に結合したアップコンバージョンナノ粒子と、を含み、前記アップコンバージョンナノ粒子は、コアシェル部と、前記コアシェル部の表面にコートされるコーティング部と、を含み、前記コアシェル部は、赤外線を吸収し、前記赤外線のエネルギーを紫外線または可視光線のうち少なくともいずれか一つにアップコンバージョンさせ、前記コーティング部は、前記コアシェル部においてアップコンバージョンされた可視光線を吸収し、前記アップコンバージョンナノ粒子は、前記コアシェル部においてアップコンバージョンされた紫外線を放出する、光エネルギーにより調節されるナノシステムをさらに含んでもよい。
【0024】
一実施形態において、前記コアシェル部は、９７０ｎｍ乃至９９０ｎｍ波長の光を吸収するものであってもよい。
【0025】
一実施形態において、前記コアシェル部は、中心部に備えられるコアと、前記コアの外面を取り囲むように備えられるシェルと、を含み、前記コアは、ＮａＹｂＦ４、ＮａＹＦ３、ＮａＧｄＦ４、ＫＧｄＦ４、ＹＯＦ、ＢａＬａＦ５、ＬａＦ３、ＮａＬｕＦ４、及びＳｒＦ２のうち少なくともいずれか一つを含み、前記シェルは、ＣａＦ２、Ｎａ（Ｙｂ，Ｇｄ）Ｆ４、ＮａＧｄＦ４、及びＴｉＯ２のうち少なくともいずれか一つを含み、前記コアシェル部は、ドーパントでドープされ、前記ドーパントは、Ｙｂ３＋、Ｔｍ３＋、Ｌｎ３＋、及びＥｒ３＋のうち少なくともいずれか一つを含むものであってもよい。
【0026】
一実施形態において、前記コーティング部は、第１コーティング剤及び第２コーティング剤のうち少なくともいずれか一つを含み、前記第１コーティング剤は、β－カロチン（β－ｃａｒｏｔｅｎｅ）、クルクミン（ｃｕｒｃｕｍｉｎ）、蛍光タンパク質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｒ－フィコエリトリン（Ｒ－ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、ローダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、ＦＤＢ－００３、ＦＤＢ－００４、及びＦＤＢ－００５のうち少なくともいずれか一つを含み、前記第２コーティング剤は、ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ ２０）、ツイーン８０（Ｔｗｅｅｎ ８０）、オレイン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｏｌｅａｔｅ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ、ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｐｈａｔｅ）、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｂｅｎｚｅｎｅ ｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ）、ステアリン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｓｔｅａｒａｔｅ）、ドデシルアミン塩酸塩（ｄｏｄｅｃｙｌａｍｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、スパン－６０（ｓｐａｎ－６０）、スパン－８０（ｓｐａｎ－８０）、ポリエチレンオキシド（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｏｘｉｄｅ）、及びドデシルベタイン（ｄｏｄｅｃｙｌ ｂｅｔａｉｎｅ）のうち少なくともいずれか一つを含むものであってもよい。
【0027】
一実施形態において、前記第１コーティング剤は、４２０ｎｍ乃至５００ｎｍ波長の光を吸収してもよい。
【0028】
一実施形態において、前記ナノシステムは、生体内部で作動するが、生体外部から印加される光エネルギーにより調節され、前記ナノシステムに生体外部から赤外線が印加される場合、前記光切替異性体は、シス異性体に変換され、前記自己組織化複合体は膨張し、前記ナノシステムに可視光線が印加される場合、前記光切替異性体は、トランス異性体に変換され、前記自己組織化複合体は収縮するものであってもよい。
【0029】
一実施形態において、前記自己組織化複合体は、水溶性液体のある環境で、光エネルギーにより可逆的に膨張及び収縮し、前記ナノシステムに赤外線を照射し、前記自己組織化複合体が膨張して、前記水溶性液体を吸収し、前記ナノシステムに可視光線を照射し、前記自己組織化複合体が収縮して、前記水溶性液体を放出するものであってもよい。
【発明の効果】
【0030】
本発明によれば、光エネルギーを用いて、自己組織化複合体、及びそれを含むナノシステムを調節して、生体試料を採取することができ、生体内に物質を伝達することができ、マクロファージの付着及び分極化を調節する技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0031】
【図1】本発明の一実施例によるナノシステムを用いて、マクロファージの付着及び分極化を調節し、物質伝達を調節するものを模式的に示す図である。
【図2】本発明の一実施例による光切替異性体の合成メカニズムである。
【図3】本発明の一実施例による光切替異性体の合成ステップ別の化合物の１Ｈ ＮＭＲ分析である。
【図4】本発明の一実施例による光切替異性体の特性を分析したものである。
【図5】本発明の一実施例によるリガンドが付着したポリマーの合成メカニズムである。
【図6】本発明の一実施例による自己組織化複合体の形成メカニズムの模式図及び光切替異性体の相互作用の数を比較したものである。
【図7】本発明の一実施例による自己組織化複合体の異性化による分子動力学（ＭＤ；ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）シミュレーションの分析結果である。
【図8】本発明の一実施例によるアップコンバージョンナノ粒子の特性分析を分析した結果である。
【図9】本発明の一実施例によるアップコンバージョンナノ粒子の特性分析を分析した結果である。
【図10】本発明の一実施例によるアップコンバージョンナノ粒子におけるコーティング部の有無による蛍光を分析した結果である。
【図11】本発明の実施例１を用いて、自己組織化複合体の膨張／収縮を実験した結果である。
【図12】本発明の一実施例によるナノシステムを用いて、マクロファージの付着実験を行った結果及び模式図である。
【図13】本発明の一実施例によるナノシステムを用いて、マクロファージの付着実験を行った結果及び模式図である。
【図14】本発明の一実施例による比較例を用いて、マクロファージの付着実験を行った結果である。
【図15】本発明の一実施例による比較例を用いて、マクロファージの付着実験を行った結果である。
【図16】本発明の一実施例による比較例を用いて、マクロファージの付着実験を行った結果である。
【図17】本発明の一実施例による比較例を用いて、マクロファージの付着実験を行った結果である。
【図18】本発明の一実施例によるナノシステムを用いて、自己組織化複合体の膨張／収縮に対する時間制御試験結果である。
【図19】本発明の一実施例によるナノシステムを用いて、自己組織化複合体の膨張／収縮に対する時間制御試験結果である。
【図20】本発明の一実施例によるナノシステムを用いて、マクロファージの分極化調節実験を行った結果である。
【図21】本発明の一実施例によるナノシステムを用いて、マクロファージの分極化調節実験を行った結果である。
【図22】本発明の一実施例によるナノシステムを用いて、マクロファージの分極化調節実験を行った結果である。
【図23】本発明の一実施例によるナノシステムを用いて、マクロファージの分極化調節実験を行った結果である。
【図24】本発明の一実施例によるナノシステムを用いて、物質伝達調節実験を行った結果である。
【図25】本発明の一実施例によるナノシステムを用いて、物質伝達調節実験を行った結果である。
【図26】本発明の一実施例によるナノシステムを用いて、物質伝達調節実験を行った結果である。
【図27】本発明の一実施例によるナノシステムの生体内安定性を実験した結果である。
【発明を実施するための形態】
【0032】
その他、実施例の具体的な事項は、詳細な説明及び図面に含まれている。
【0033】
本発明の利点及び特徴、またそれらを達成する方法は、添付した図面とともに詳細に後述されている実施例を参照すれば、明確になるであろう。しかしながら、本発明は、以下で開示される実施例に限定されるものではなく、相違した様々な形態で実現されてもよく、以下の説明において、他に明示されない限り、本明細書で使用された成分、反応条件、成分の含量を表す数字、値、及び／または表現はいずれも、これらの数字が本質的に異なるものの中からこのような値を得る上で発生する測定の多様な不確実性が反映された近似値であるので、全ての場合、「約」という用語によって修飾されると理解されるべきである。また、本記載から数値範囲が開示される場合、このような範囲は、連続的であり、他に指摘されない限り、このような範囲の最小値から最大値の含まれた前記最大値までの全ての値を含む。ひいては、このような範囲が整数を指し示す場合、他に指摘されない限り、最小値から最大値の含まれた前記最大値までを含む全ての整数が含まれる。
【0034】
また、本明細書において、範囲が変数について記載される場合、前記変数は、前記範囲の記載された終了点を含む記載範囲内の全ての値を含むと理解されるべきである。例えば、「５乃至１０」の範囲は、５、６、７、８、９及び１０の値だけでなく、６乃至１０、７乃至１０、６乃至９、７乃至９等の任意の下位範囲を含み、５．５、６．５、７．５、５．５乃至８．５、及び６．５乃至９等の記載範囲の範疇に妥当な整数の任意の値も含むと理解されるべきである。また、例えば、「１０％乃至３０％」の範囲は、１０％、１１％、１２％、１３％等の値と３０％までを含む全ての整数だけでなく、１０％乃至１５％、１２％乃至１８％、２０％乃至３０％等の任意の下位範囲を含み、１０．５％、１５．５％、２５．５％等のように記載された範囲の範疇内の妥当な整数の任意の値も含むと理解されるべきである。
【0035】
この明細書における用語の意味は、次の通りである。
【0036】
「光切替異性体」は、特定波長の光を吸収して、トランス異性体またはシス異性体へ切り替えられる化合物を意味する。「自己組織化体」または「自己組織化複合体」は、リガンドが付着したポリマーと光切替異性体が組織化されたものを意味する。「アップコンバージョンナノ粒子」は、吸収した赤外線をアップコンバージョンさせる機能を有し、コアシェル部にコーティング部がコートされたことを意味する。「アップコンバージョンナノ粒子がコートされた基板」は、前記アップコンバージョンナノ粒子が基板の表面を全体的にコートしている基板を意味する。「ナノシステム」は、前記アップコンバージョンナノ粒子がコートされた基板に前記自己組織化複合体の少なくとも一部が結合したものを意味し、特定波長の光を吸収して異性化することにより、水溶性液体の吸収を調節し、細胞の付着及び分極化を調節し、担持された物質の放出を調節することができるシステムを意味する。
【0037】
また、光、光エネルギー、ライト、及びライトエネルギーは、同じ意味で用いられてもよい。
【0038】
図１は、本発明の一実施例によるナノシステムに光を照射して、マクロファージの付着及び分極化を調節し、自己組織化複合体に担持された物質の放出を調節することを模式的に示す図である。
【0039】
本発明の実施例は、光エネルギーにより調節される自己組織化複合体に関するものであって、前記自己組織化複合体は、リガンド及び負に荷電したポリマーを含むポリマー複合体と、正に荷電して、前記ポリマー複合体と結合し、光エネルギーにより可逆的に異性化する光切替異性体と、を含む自己組織化複合体を含んでもよい。前記光切替異性体は、光エネルギーにより異性化して、前記自己組織化複合体を可逆的に膨張または収縮させ、前記光切替異性体のシス（ｃｉｓ）異性体は、前記自己組織化複合体を膨張させ、前記光切替異性体のトランス（ｔｒａｎｓ）異性体は、前記自己組織化複合体を収縮させてもよい。
【0040】
前記自己組織化複合体は、少なくとも一つのポリマー複合体と、少なくとも一つの光切替異性体と、を含み、前記自己組織化複合体は、前記ポリマー複合体が互いに隣り合うポリマー複合体または前記光切替異性体と結合され、前記光切替異性体が互いに隣り合う光切替異性体と相互作用して形成されるものであってもよい。
【0041】
具体的に、前記自己組織化複合体は、複数個のポリマー複合体と、複数個の光切替異性体とが互いに結合されるか、または相互作用して形成されてもよい。例えば、前記自己組織化複合体を構成する前記ポリマー複合体とポリマー複合体との間には、物理的または化学的結合が形成され、前記ポリマー複合体と前記光切替異性体との間には、静電気的結合が形成され、前記光切替異性体と光切替異性体との間に相互作用が形成されて前記自己組織化複合体が形成されてもよい。
【0042】
前記自己組織化複合体の膨張及び収縮は、このような前記光切替異性体と光切替異性体との間の相互作用が変更されて行われてもよい。
【0043】
前記光切替異性体は、芳香族官能基を含んでもよく、前記芳香族官能基により、前記光切替異性体と光切替異性体との間に相互作用が形成されてもよい。前記光切替異性体と光切替異性体との間の相互作用は、光切替異性体と隣り合った光切替異性体との間に形成されると言え、ここで、隣り合うとは、ある光切替異性体の周辺に他の光切替異性体が存在することを言ってもよい。
【0044】
前記光切替異性体と光切替異性体との間の相互作用は、いずれかの光切替異性体の芳香族官能基と他の光切替異性体のカチオンとの間にπ－カチオン相互作用（π－ｃａｔｉｏｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）を形成するものであってもよい。また、前記光切替異性体と光切替異性体との間の相互作用は、いずれかの光切替異性体の芳香族官能基と他の光切替異性体の芳香族官能基との間にπ－π相互作用（π－π ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）を形成するものであってもよい。
【0045】
前記光切替異性体の芳香族官能基は、ベンゼン官能基であってもよい。前記光切替異性体は、トランス異性体及びシス異性体のうちいずれかの形態で存在してもよく、さらに安定した形態は、トランス異性体であってもよい。前記光切替異性体のシス異性体は、可視光線を吸収して、トランス異性体に異性化してもよい。また、前記トランス異性体は、紫外線を吸収して、シス異性体に異性化してもよい。このようなトランス異性体とシス異性体との間の切替は、可逆的に繰り返して速く形成されてもよい。
【0046】
前記光切替異性体のトランス異性体は、化学式１の構造を有してもよい。
【0047】
(化学式１)
【0048】
前記化学式１において、Ａは、Ｃ０乃至Ｃ１５のうちいずれか一つであり、Ｒは、水素、メチル、エチル、及びプロピルのうちいずれか一つであってもよく、Ｘは、１乃至３のうちいずれか一つの整数である。前記Ｘは、好ましくは、３であってもよい。具体的に、Ａは、Ｃ１乃至Ｃ１５またはＣ１乃至Ｃ１０であってもよい。
【0049】
また、前記光切替異性体のシス異性体は、化学式２の構造を有してもよい。
【0050】
（化学式２）
【0051】
前記化学式２において、Ａは、Ｃ０乃至Ｃ１５のうちいずれか一つであり、Ｒは、水素、メチル、エチル、及びプロピルのうちいずれか一つであってもよく、Ｘは、１乃至３のうちいずれか一つの整数である。前記Ｘは、好ましくは、３であってもよい。具体的に、Ａは、Ｃ１乃至Ｃ１５またはＣ１乃至Ｃ１０であってもよい。
【0052】
前記自己組織化複合体において、前記光切替異性体と前記ポリマー複合体は、０．１：１０乃至１．０：１０の重量比を有して含まれてもよい。前記自己組織化複合体は、光エネルギーにより可逆的に収縮及び膨張することができ、前記光切替異性体と前記ポリマー複合体の重量比を制御することにより、収縮及び膨張の大きさ及び／または速度の差を多様に変化させてもよい。
【0053】
前記ポリマー複合体において、前記ポリマーは、前記自己組織化複合体の全体的なフレームを形成してもよい。前記自己組織化複合体が収縮するとき、前記ポリマー複合体は、凝縮されてもよい。また、前記自己組織化複合体が膨張するとき、前記ポリマー複合体は、凝縮が緩んでもよい。前記ポリマーは、負に荷電した部位を含んでおり、前記光切替異性体が静電気的に結合可能な部位を提供してもよい。前記ポリマーは、カルボン酸塩（ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）を有してもよい。
【0054】
前記ポリマーは、カルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、
ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、アルギン酸（ａｌｇｉｎａｔｅ）、ポリ（Ｌ－グルタミン酸）（ｐｏｌｙ（Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ））、ポリ（Ｌ－アスパラギン酸）（ｐｏｌｙ（Ｌ－ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ））、ポリアクリル酸（ＰＡＡ、ｐｏｌｙａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ）、ゼラチン、及びコラーゲンのうち少なくともいずれか一つであってもよい。
ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、アルギン酸（ａｌｇｉｎａｔｅ）、ポリ（Ｌ－グルタミン酸）（ｐｏｌｙ（Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ））、ポリ（Ｌ－アスパラギン酸）（ｐｏｌｙ（Ｌ－ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ））、ポリアクリル酸（ＰＡＡ、ｐｏｌｙａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ）、ゼラチン、及びコラーゲンのうち少なくともいずれか一つであってもよい。
【0055】
前記ポリマー複合体において、前記リガンドは、前記ポリマーに結合して存在してもよい。前記自己組織化複合体が収縮すると、前記ポリマーがコイリングされて凝縮され、前記リガンドの殆どが前記自己組織化複合体の内部に存在し、前記自己組織化複合体の外部では、前記リガンドが認識され難くなり得る。したがって、前記自己組織化複合体の外部に露出するリガンドは、極めて少なくてもよい。これに対して、前記自己組織化複合体が膨張すると、前記ポリマーがアンコイリング（ｕｎｃｏｉｌｉｎｇ）され、少なくとも一部は、互いに離隔して、前記リガンドの殆どが前記自己組織化複合体の外部に現れ、前記自己組織化複合体の外部において、前記リガンドが認識されやすくなり得る。したがって、前記自己組織化複合体の外部に露出するリガンドは、相対的に増加してもよい。
【0056】
前記リガンドは、細胞付着性質を有し、細胞が付着のために認識する部位であってもよい。したがって、前記自己組織化複合体が膨張する場合は、前記自己組織化複合体の外部に備えられる細胞が認識する前記リガンドの数及び密度が大きくなるので、前記細胞の付着が増加し得る。これに対して、前記自己組織化複合体が収縮する場合は、前記自己組織化複合体の外部に備えられる細胞が認識する前記リガンドの数及び密度が小さくなるので、前記細胞の付着が減少し得る。
【0057】
前記リガンドは、ヒドロキシル基（－ＯＨ、ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐ）及びアミノ基（－ＮＲ３、ａｍｉｎｏ
ｇｒｏｕｐ）のうち少なくとも一つを含んでもよい。
ｇｒｏｕｐ）のうち少なくとも一つを含んでもよい。
【0058】
前記リガンドは、ブラシカステロール（ｂｒａｓｓｉｃａｓｔｅｒｏｌ）、スチグマステロール（ｓｔｉｇｍａｓｔｅｒｏｌ）、アスコルブ酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）、サイアノコバラミン（ｃｙａｎｏｃｏｂａｌａｍｉｎ）、トコフェロール（ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ）、レチノール（ｒｅｔｉｎｏｌ）、アミノ酪酸（ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）、アミン－Ｂｏｃ塩酸塩（ａｍｉｎｅ－Ｂｏｃ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、シクロＲＧＤ（ｃｙｃｌｏ ＲＧＤ）、ＶＨ ０３２アミド－ＰＥＧ２－アミン（ＶＨ ０３２ ａｍｉｄｅ－ＰＥＧ２－ａｍｉｎｅ）、ヒスタミン（ｈｉｓｔａｍｉｎｅ）、チラミン（ｔｙｒａｍｉｎｅ）、β－フェニルエチルアミン（β－ｐｈｅｎｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）、トリプタミン（ｔｒｙｐｔａｍｉｎｅ）、セロトニン（ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ）、プトレシン（ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ）、カダベリン（ｃａｄａｖｅｒｉｎｅ）、スペルミジン（ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ）、及びスペルミン（ｓｐｅｒｍｉｎｅ）のうち少なくともいずれか一つであってもよい。
【0059】
前記自己組織化複合体は、前記ポリマー複合体により、フレームの形態で形成されてもよく、前記フレームの内部空間を有してもよい。前記フレームの内部空間には、伝達物質を担持してもよい。
【0060】
前記伝達物質は、前記自己組織化複合体に担持され、前記伝達物質の作用部位まで運搬されてもよい。前記伝達物質は、前記自己組織化複合体が膨張するとき、前記自己組織化複合体の外部に放出されてもよく、前記自己組織化複合体が収縮するときは、放出されなくてもよい。したがって、前記自己組織化複合体が収縮するとき、前記伝達物質は、前記自己組織化複合体の内部に維持されてもよい。前記伝達物質は、前記自己組織化複合体が膨張するとき、一定の時間、持続的に放出されてもよい。
【0061】
前記伝達物質は、前記ポリマー複合体に対して、１：１００乃至１：１０００の重量比で含まれてもよい。例えば、本実施形態による自己組織化複合体は、上述した範囲で、前記伝達物質及び前記ポリマー複合体の重量比を制御することにより、前記自己組織化複合体の内部に担持される伝達物質の量または／及び伝達物質の種類を多様に変えてもよく、前記伝達物質の放出速度を制御することができる。
【0062】
前記伝達物質は、タンパク質、核酸、及び小分子薬物のうち少なくともいずれか一つを含んでもよい。具体的に、前記タンパク質は、サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）、ケモカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）、免疫抗癌治療抗体、成長因子、ボツリヌストキシン（ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｔｏｘｉｎ）、及び抗原のうち少なくともいずれか一つを含んでもよい。また、具体的に、前記核酸は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ
ＲＮＡ）、及びプラスミドＤＮＡ（ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ）のうち少なくともいずれか一つを含んでもよい。
ＲＮＡ）、及びプラスミドＤＮＡ（ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ）のうち少なくともいずれか一つを含んでもよい。
【0063】
さらに具体的に、前記伝達物質は、サイトカインであってもよく、好ましくは、ＡＮＧ、ＢＤＮＦ、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ２、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＳＦ１、ＣＳＦ２、ＣＳＦ３、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＥＧＦ、ＦＧＦ４、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ９、ＦＬＴ３ＬＧ、ＧＤＮＦ、ＨＧＦ、ＩＦＮＧ、ＩＧＦ１、ＩＧＦＢＰ１、ＩＧＦＢＰ２、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ４、ＩＬ１０、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１３、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＫＩＴＬＧ、ＬＥＰ、ＬＩＦ、ＬＴＡ、ＭＩＦ、ＮＴＦ３、ＮＴＦ４、ＯＳＭ、ＰＤＧＦＢ、ＰＧＦ、ＰＰＢＰ、ＳＰＰ１、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢ３、ＴＨＰＯ、ＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ２、ＴＮＦ、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４、ＴＰＯ、ＶＥＧＦＡ、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ、ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）のうち少なくともいずれか一つであってもよい。
【0064】
またさらに具体的に、前記伝達物質は、ケモカインであつてもよく、好ましくは、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮＬ１、ＡＸＬ、ＢＴＣ、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ４、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、及びＣＸＣＬ６のうち少なくともいずれか一つであってもよい。
【0065】
またさらに具体的に、前記伝達物質は、免疫抗癌治療抗体であってもよく、好ましくは、ａｎｔｉ－ＰＤ－１抗体及びａｎｔｉ－ＰＤ－Ｌ１抗体のうち少なくともいずれか一つであってもよい。
【0066】
またさらに具体的に、前記伝達物質は、成長因子であってもよく、好ましくは、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ、Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ、Ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ－β、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－β）、及びインスリン様成長因子（ＩＧＦ、Ｉｎｓｕｌｉｎ－Ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）のうち少なくともいずれか一つであってもよい。
【0067】
またさらに具体的に、前記伝達物質は、小分子薬物であってもよく、好ましくは、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、ビタミンＢ３、ビタミンＣ、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｌｕｂｉｃｉｎ）、アデノシン（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ）、トリアムシノロン（ｔｒｉａｍｃｉｎｏｌｏｎｅ）、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ、ｎｏｎ－ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｒｕｇｓ）、アラントイン（Ａｌｌａｎｔｏｉｎ）、及びゲンタマイシン（Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎｅ）のうち少なくともいずれか一つであってもよい。
【0068】
前記自己組織化複合体は、水溶性液体のある環境で、光エネルギーの照射により、可逆的に膨張及び収縮し、前記自己組織化複合体が膨張して、前記水溶性液体を吸収し、前記自己組織化複合体が収縮して、前記水溶性液体を放出するものであってもよい。したがって、前記自己組織化複合体は、前記水溶性液体を吸収して、ヒドロゲルの形態で備えられてもよい。例えば、前記自己組織化複合体は、ヒドロゲルは、形成されたヒドロゲルが合わせられてさらに大きなヒドロゲルを形成してもよい。
【0069】
前記自己組織化複合体が膨張するとき、水溶性液体を吸収してもよく、前記自己組織化複合体が収縮するときは、水溶性液体を放出してもよい。前記自己組織化複合体は、水溶性液体のある環境で、挙動することができ、すなわち親水性環境で挙動することができる。したがって、前記自己組織化複合体の周辺は、水溶性液体を含んでもよく、前記自己組織化複合体は、水溶性液体を、周辺から吸収するか、周辺へ放出することができる。
【0070】
また、前記自己組織化複合体の内部は、収縮した状態でも、少しの水溶性液体を含んでいてもよい。したがって、前記自己組織化複合体が膨張して、水溶性液体を吸収してから収縮し、水溶性液体を放出する場合にも、前記自己組織化複合体の内部には、少しの水溶性液体を含んでもよい。
【0071】
前記光切替異性体の異性化により、前記自己組織化複合体が水溶性液体を吸収または放出するときに、前記自己組織化複合体は、最大膨張または最大収縮することができる。ここで、最大膨張及び最大収縮は、光切替異性体の異性化または／及び水溶性液体の吸収－放出により、前記自己組織化複合体内の結合乃至相互作用が維持される限度で、最大限膨張するか収縮することを言う。前記自己組織化複合体の最大膨張と最小膨張は、極めて高速で切り替えられてもよい。例えば、前記自己組織化複合体は、最大収縮から、紫外線を照射した後、３０秒乃至９０秒の時間内で、最大膨張に到達してもよい。
【0072】
また、前記自己組織化複合体の最大膨張時は、吸収された水溶性液体により重量が増加してもよい。前記自己組織化複合体の最大膨張時の重量は、最大収縮時の重量の３倍乃至５倍であってもよい。
【0073】
例えば、前記自己組織化複合体の前記光切替異性体が紫外線を吸収すると、シス異性化され、このとき、前記自己組織化複合体が膨張しながら、前記自己組織化複合体の内部に水溶性液体が吸収されてもよい。また、例えば、前記自己組織化複合体の前記光切替異性体が可視光線を吸収すると、トランス異性化され、このとき、前記自己組織化複合体が収縮しながら、前記自己組織化複合体の内部の水溶性液体が放出されてもよい。
【0074】
具体的に、前記自己組織化複合体に光を照射して、前記光切替異性体が紫外線を吸収すると、シス異性化が起こる。前記シス異性体は、π－π相互作用は形成しやすいが、π－カチオン相互作用は形成し難い。前記シス異性体が形成する相互作用が弱くなるにつれて、前記自己組織化複合体は膨張し、このとき、周辺にある水溶性液体が吸収されてもよい。また、このとき、前記自己組織化複合体の内部に担持されている場合は、前記伝達物質が放出されてもよく、前記ポリマー複合体に付着したリガンドが外部に多く露出してもよい。
【0075】
また、具体的に、前記自己組織化複合体に光を照射して、前記光切替異性体が可視光線を吸収すると、トランス異性化が起こる。前記トランス光切替異性体は、π－カチオン及びπ－π相互作用を全て形成する。前記光切替異性体が形成する相互作用が強くなるにつれて、前記自己組織化複合体は収縮され、このとき、前記自己組織化複合体の内部の水溶性液体が周辺に放出されてもよい。このときは、前記自己組織化複合体の内部に担持されている場合は、前記伝達物質の放出が抑制されてもよく、前記ポリマー複合体に付着したリガンドが外部に殆ど露出しなくてもよい。
【0076】
前記自己組織化複合体の内部に水溶性液体が吸収される場合、前記水溶性液体の吸収は、前記自己組織化複合体が膨張することを助けてもよい。また、前記自己組織化複合体の内部の水溶性液体が放出される場合、前記水溶性液体の放出は、前記自己組織化複合体が収縮することを助けてもよい。
【0077】
前記水溶性液体は、水、水溶性分子、及び生体内で体液に存在できる生体分子のうち少なくともいずれか一つを含んでもよい。前記水溶性液体は、血液、血漿、血清、尿、唾、脳脊髄液、涙、汗、大便、腹水、羊水、精液、乳、細胞培地、組織抽出物、及び癌組織のうち少なくともいずれか一つを含んでもよい。
【0078】
上記したような自己組織化複合体が可逆的に膨張及び収縮する特性を用いて、前記自己組織化複合体を生体内に移植して活用することができる。
【0079】
前記自己組織化複合体は、肌、組織、及び臓器のような部位に移植することができる。このとき、前記自己組織化複合体に光エネルギーを照射して、当該部位の水溶性液体を吸収するように操作することができ、前記自己組織化複合体を回収し、吸収した水溶性液体を抽出して、生体試料として用いることができる。前記生体試料は、疾病検査、細胞分析等に活用され得る。
【0080】
また、前記自己組織化複合体は、血管及びリンパ管のような生体内の管に移植され得る。このとき、前記自己組織化複合体に光エネルギーを照射して、当該部位の水溶性液体を吸収するように操作してもよい。また、前記自己組織化複合体に光エネルギーを照射し、管内で膨張するようにして、管内を流れる液体の流れを止めるか、管の成長を妨害してもよい。例えば、前記自己組織化複合体を血管内で膨張するように操作して、癌細胞の成長を妨害することができる。この場合、前記自己組織化複合体に抗癌剤が担持されている場合は、癌の治療を誘導することができる。
【0081】
また、前記自己組織化複合体は、前記伝達物質を担持して、生体内に移植されてもよい。このとき、前記自己組織化複合体に光エネルギーを照射して、前記伝達物質の放出を調節してもよい。したがって、前記自己組織化複合体を用いて、所望の部位に前記伝達物質を直接かつ速く伝達することができる。
【0082】
また、前記自己組織化複合体は、例えば、マクロファージのような細胞とともに移植されてもよい。このとき、前記自己組織化複合体に光エネルギーを照射して、移植された部位におけるマクロファージの付着及び分極化を調節することができる。前記自己組織化複合体は、生体内または生体外に備えられ、体積が可逆的に膨張または収縮してもよく、前記光エネルギーは、前記生体内または生体外において、前記自己組織化複合体に印加されてもよい。具体的に、前記自己組織化複合体が生体内にある場合、前記光エネルギーを生体外から印加しても、前記自己組織化複合体は、可逆的に体積が膨張または収縮することができる。
【0083】
また、本発明の実施形態において、光照射により挙動するナノシステムは、前記光照射により挙動する自己組織化複合体と、前記自己組織化複合体の少なくとも一部と結合される基板と、前記基板に結合したアップコンバージョンナノ粒子と、を含んでもよい。前記アップコンバージョンナノ粒子は、コアシェル部と、前記コアシェル部の表面にコートされるコーティング部と、を含み、前記コアシェル部は、赤外線を吸収して、前記赤外線のエネルギーを可視光線または紫外線へアップコンバージョンさせ、前記コーティング部は、前記コアシェル部においてアップコンバージョンされた可視光線を吸収し、前記アップコンバージョンナノ粒子は、前記コアシェル部においてアップコンバージョンされた紫外線を放出するものであってもよい。
【0084】
前記コアシェル部は、中心部に備えられるコアと、前記コアの外面の全体を取り囲むように備えられるシェルと、を含んでもよい。前記コアシェル部は、特定波長の光を吸収し、吸収した光のエネルギーをアップコンバージョンさせてもよい。
【0085】
例えば、前記コアシェル部は、赤外線を吸収して紫外線に変換させてもよい。この過程で、吸収された赤外線は、可視光線及び紫外線のうち少なくとも一つに変換されてもよい。
【0086】
前記コアシェル部は、９７０ｎｍ乃至９９０ｎｍ波長の光を吸収するものであってもよい。
【0087】
前記コアシェル部において、コアは、ＮａＹｂＦ４、ＮａＹＦ３、ＮａＧｄＦ４、ＫＧｄＦ４、ＹＯＦ、ＢａＬａＦ５、ＬａＦ３、ＮａＬｕＦ４、及びＳｒＦ２のうち少なくともいずれか一つを含んでもよい。また、前記コアシェル部において、シェルは、ＣａＦ２、Ｎａ（Ｙｂ，Ｇｄ）Ｆ４、ＮａＧｄＦ４、及びＴｉＯ２のうち少なくともいずれか一つを含んでもよい。
【0088】
また、前記コアは、トパンドでドープされてもよく、前記ドーパントは、Ｙｂ３＋、Ｔｍ３＋、Ｌｎ３＋、及びＥｒ３＋のうち少なくともいずれか一つを含んでもよい。好ましくは、前記ドーパントにおいて、Ｙｂ３＋及びＴｍ３＋のうち少なくともいずれか一つは、必須にドープされるものであってもよい。
【0089】
前記コアシェル部は、前記コアシェル部の外面を全体的に取り囲むコーティング部でコートされてもよい。前記コーティング部は、前記コアシェル部において変換された光から可視光線を吸収し、紫外線を吸収しなくてもよい。言い換えれば、前記コアシェル部において吸収された赤外線から変換された光のうち、可視光線は、前記コーティング部により吸収され、紫外線のみが外部に放出されてもよい。したがって、前記コーティング部により、前記アップコンバージョンナノ粒子は、赤外線を吸収して、紫外線を選択的に放出することができる。
【0090】
したがって、前記コーティング部は、４２０ｎｍ乃至５００ｎｍ波長の光を吸収し、３２０ｎｍ乃至３８０ｎｍ波長の光を吸収しなくてもよい。
【0091】
前記コーティング部は、第１コーティング剤及び第２コーティング剤を混合して形成されてもよい。前記第１コーティング剤は、前記コアシェル部においてアップコンバージョンされた可視光線を吸収し、紫外線を吸収しなくてもよく、好ましくは、染料であってもよい。前記第２コーティング剤は、前記第１コーティング剤が安定的にコートされるように助けてもよく、好ましくは、界面活性剤であってもよい。前記第２コーティング剤は、前記第１コーティング剤の表面を取り囲む形態であってもよい。
【0092】
前記第１コーティング剤は、染料であってもよく、β－カロチン（β－ｃａｒｏｔｅｎｅ）、クルクミン（ｃｕｒｃｕｍｉｎ）、Ｒ－フィコエリトリン（Ｒ－ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、ローダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、ＦＤＢ－００３、ＦＤＢ－００４、及びＦＤＢ－００５のうち少なくともいずれか一つを含んでもよい。
【0093】
前記第２コーティング剤は、界面活性剤であってもよく、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、及び両性界面活性剤のうち少なくともいずれか一つを含んでもよい。
【0094】
前記第２コーティング剤は、陽イオン界面活性剤を含んでもよく、オレイン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｏｌｅａｔｅ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ、ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｐｈａｔｅ）、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｂｅｎｚｅｎｅ ｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ）、及びステアリン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｓｔｅａｒａｔｅ）のうち少なくともいずれか一つを含んでもよい。
【0095】
また、前記第２コーティング剤は、陰イオン界面活性剤を含んでもよく、ドデシルアミン塩酸塩（ｄｏｄｅｃｙｌａｍｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を含んでもよい。
【0096】
また前記第２コーティング剤は、非イオン界面活性剤を含んでもよく、ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ ２０）、ツイーン８０（Ｔｗｅｅｎ ８０）、スパン－６０（ｓｐａｎ－６０）、スパン－８０（ｓｐａｎ－８０）、及びポリエチレンオキシド（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｏｘｉｄｅ）のうち少なくともいずれか一つを含んでもよい。
【0097】
また、前記第２コーティング剤は、両性界面活性剤を含んでもよく、ドデシルベタイン（ｄｏｄｅｃｙｌ ｂｅｔａｉｎｅ）であってもよい。
【0098】
前記光エネルギーにより調節されるナノシステムにおいて、前記アップコンバージョンナノ粒子は、前記基板に結合し、前記自己組織化複合体は、前記基板及び前記アップコンバージョンナノ粒子のうち少なくともいずれか一つに結合したものであってもよい。
【0099】
前記ナノシステムに赤外線を照射して、前記光切替異性体をシス異性化させてもよい。このとき、前記自己組織化複合体は、可逆的に体積が膨張または収縮してもよい。
【0100】
例えば、前記自己組織化複合体が膨張する場合、前記自己組織化複合体の内部に水溶性液体が吸収されてもよく、前記自己組織化複合体に前記伝達物質が担持された場合、前記伝達物質が前記自己組織化複合体の外部に放出されてもよい。前記ナノシステムに照射された赤外線は、前記アップコンバージョンナノ粒子を介して紫外線にアップコンバージョンされてもよく、前記光切替異性体は、アップコンバージョンされた紫外線を吸収して、シス異性化してもよい。
【0101】
あるいは、前記ナノシステムに可視光線を照射して、前記光切替異性体をトランス異性化させてもよい。このとき、前記自己組織化複合体が収縮し、前記自己組織化複合体の内部にある前記水溶性液体が放出されてもよい。前記ナノシステムに照射された可視光線は、前記アップコンバージョンナノ粒子に吸収されず、前記光切替異性体に直ちに吸収されて、トランス異性化を誘導してもよい。
【0102】
ここで、前記自己組織化複合体が膨張して、水溶性液体を吸収し、担持された前記伝達物質を放出してもよい。あるいは、前記自己組織化複合体が収縮して、水溶性液体を放出してもよく、このときは、担持された前記伝達物質が放出されなくてもよい。
【0103】
また、前記自己組織化複合体は、前記自己組織化複合体に細胞付着性リガンドを含んでおり、細胞の付着及び分極化を調節することができる。前記細胞は、マクロファージであってもよい。
【0104】
前記自己組織化複合体に紫外線を照射すると、前記光切替異性体は、紫外線を吸収し、シス異性化して、前記自己組織化複合体を膨張させてもよい。このとき、前記リガンドが前記自己組織化複合体の外部に多く露出し、マクロファージの付着及びＭ２分極を促進することができる。
【0105】
あるいは、前記自己組織化複合体に可視光線を照射すると、前記光切替異性体をトランス異性化させ、前記自己組織化複合体は、収縮してもよい。このとき、前記リガンドが自己組織化複合体の外部に殆ど露出せず、マクロファージの付着を抑制し、Ｍ１分極を促進することができる。
【0106】
前記自己組織化複合体が、前記基板及びアップコンバージョンナノ粒子とともに前記ナノシステムを形成する場合は、前記ナノシステムに赤外線を照射して、マクロファージの付着及びＭ２分極化を促進することができ、前記ナノシステムに可視光線を照射して、マクロファージの付着を抑制し、Ｍ１分極化を促進することができる。
【0107】
このような赤外線または可視光線は、生体の外部から照射されて、生体の内部にある前記ナノシステムに作用することができる。
【0108】
紫外線は、前記光切替異性体をシス異性化するが、生体毒性が高くて、生体透過性が低いという問題があり得る。また、アップコンバージョンナノ粒子を用いることなく、光切替異性体を用いるか、従来のアップコンバージョン物質を用いる場合、生体に有害な紫外線を照射しなければならないので、問題になり得る。これに対して、前記ナノシステムに直ちに照射される赤外線及び可視光線は、生体に無害であり、前記アップコンバージョンナノ粒子が含まれたナノシステムの挙動を調節することができる。したがって、前記アップコンバージョンナノ粒子を含む場合、紫外線を直ちに照射せず、前記ナノシステムを調節することができる。
【0109】
したがって、前記ナノシステムは、生体に無害な赤外線及び可視光線を生体の外部から照射して、生体の内部にあるナノシステムの挙動を調節し、これにより、水溶性液体の吸収を調節し、物質伝達を調節し、マクロファージの付着及び分極化を調節することができる。
【0110】
以下、本発明の実施例及び比較例を記載する。しかしながら、下記の実施例は、本発明の好適な一実施例であるだけで、本発明の権利の範囲が下記の実施例により制限されるものではない。
【0111】
［製造例］
１．光切替異性体の合成
自己組織化複合体の収縮／膨張を可逆的に調節する光切替異性体として、Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋を合成した。
１．光切替異性体の合成
自己組織化複合体の収縮／膨張を可逆的に調節する光切替異性体として、Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋を合成した。
【0112】
まず、４－アミノフェノール（４－ａｍｉｎｏｐｈｅｎｏｌ、２７．４９ｍｍｏｌ）３．００ｇ及びニトロソベンゼン（ｎｉｔｒｏｓｏｂｅｎｚｅｎｅ、３０．２４ｍｍｏｌ）３．２４ｇを、二口丸底フラスコで、酢酸（ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）１００ｍＬと混合し、次いで、室温、Ｎ２の条件で一晩中撹拌して、Ａｚｏ－ＯＨを合成した。この混合溶液に、ＤＩウォーターを添加して、赤茶色（Ｒｅｄｄｉｓｈ－Ｂｒｏｗｎ）の沈殿物を得た。この沈殿物を、酢酸エチル（ＥＡ、ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）を用いて収集し、ＭｇＳＯ４を用いて乾燥させた後、ＭｇＳＯ４を濾過して除去し、ＥＡは、蒸発させて除去した。最後に、６：１（ｖ／ｖ）のヘキサン／酢酸エチルを溶離液（ｅｌｕｅｎｔ）として、ゲルカラムクロマトグラフィを行った。
【0113】
自己組織化複合体内において、Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋分子の芳香族基と陽イオンとの間の相互作用を容易にするために、芳香族基とＢｒとの間に疎水性尾部を形成して間隔を置いた。このようなＡｚｏ－Ｃ１０－Ｂｒ分子を得るために、Ａｚｏ－ＯＨに、１，１０－ジブロモデカン（１，１０－ｄｉｂｒｏｍｏｄｅｃａｎｅ）を結合した。Ａｚｏ－ＯＨ（２．５２ｍｍｏｌ）０．５ｇを、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）４０ｍＬに溶かし、ここに、水素化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｈｙｄｒｉｄｅ、５．０４ｍｍｏｌ）４０ｍＬを、氷浴（ｉｃｅ ｂａｔｈ）内で添加した。この溶液を、３０分間撹拌し、１，１０－ジブロモデカン（１２．６０ｍｍｏｌ）３．７８ｇを含むＤＭＦ
５ｍＬを添加し、次いで、室温で一晩中かき混ぜた。その後、この溶液にメタノール５ｍＬを添加して、反応をクエンチング（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）し、ここで、合成されたＡｚｏ－Ｃ１０－Ｂｒを、ＤＩウォーター及びジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）の混合物を用いて抽出した。ジクロロメタンに溶解させたＡｚｏ－Ｃ１０－Ｂｒを、ＤＩウォーターを除去するために、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、ついで、溶離剤として１：４（ｖ／ｖ）のジクロロメタン／ヘキサンが含まれたゲルカラムクロマトグラフィを用いて、ＭｇＳＯ４を濾過して除去し、ジクロロメタンを蒸発させた。
５ｍＬを添加し、次いで、室温で一晩中かき混ぜた。その後、この溶液にメタノール５ｍＬを添加して、反応をクエンチング（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）し、ここで、合成されたＡｚｏ－Ｃ１０－Ｂｒを、ＤＩウォーター及びジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）の混合物を用いて抽出した。ジクロロメタンに溶解させたＡｚｏ－Ｃ１０－Ｂｒを、ＤＩウォーターを除去するために、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、ついで、溶離剤として１：４（ｖ／ｖ）のジクロロメタン／ヘキサンが含まれたゲルカラムクロマトグラフィを用いて、ＭｇＳＯ４を濾過して除去し、ジクロロメタンを蒸発させた。
【0114】
以降、Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｂｒ分子において、Ｂｒは、窒素陽イオンを有するトリエチルアミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）に代替され、芳香族基と窒素陽イオンとの間に疎水性尾部による間隔があるＡｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋分子を生成した。この分子は、カチオン（π－ｃａｔｉｏｎ）及びπ－π相互作用（π－
π ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）を通じて積層され、リガンドが含まれた自己組織化複合体を形成した。Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｂｒ（０．７２ｍｍｏｌ）０．３ｇ及びトリエチルアミン（８．６３ｍｍｏｌ）０．８７ｇを含むアセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）４０ｍＬの混合溶液を、Ｎ２条件、６０℃で一晩中撹拌した。アセトニトリルを蒸発させた後、黄色の固体生成物をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ、ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ）に溶解して、過量のトリエチルアミンを除去した。この溶液に、ヘキサンを添加して、Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋生成物を沈殿させ、それを濾過し、真空オーブンで乾燥させた。
π ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）を通じて積層され、リガンドが含まれた自己組織化複合体を形成した。Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｂｒ（０．７２ｍｍｏｌ）０．３ｇ及びトリエチルアミン（８．６３ｍｍｏｌ）０．８７ｇを含むアセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）４０ｍＬの混合溶液を、Ｎ２条件、６０℃で一晩中撹拌した。アセトニトリルを蒸発させた後、黄色の固体生成物をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ、ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ）に溶解して、過量のトリエチルアミンを除去した。この溶液に、ヘキサンを添加して、Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋生成物を沈殿させ、それを濾過し、真空オーブンで乾燥させた。
【0115】
２．リガンドを含むポリマーの合成
自己組織化複合体に細胞付着性のＲＧＤリガンドを結合するために、リガンドがあり、負に荷電したポリマーであるポリアクリル酸（ＰＡＡ、ｐｏｌｙａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ）を、正に荷電して積層されたＡｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋分子と静電気的に結合させた。ここで、ＲＧＤリガンドは、アミン基を有するリシン残基のある環状－ＲＧＤｙＫ（ｃｙｃｌｏ－ＲＧＤｙＫ、ｃｙｃｌｏ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－ｄ－Ｔｙｒ－Ｌｙｓ）を用いた。
自己組織化複合体に細胞付着性のＲＧＤリガンドを結合するために、リガンドがあり、負に荷電したポリマーであるポリアクリル酸（ＰＡＡ、ｐｏｌｙａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ）を、正に荷電して積層されたＡｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋分子と静電気的に結合させた。ここで、ＲＧＤリガンドは、アミン基を有するリシン残基のある環状－ＲＧＤｙＫ（ｃｙｃｌｏ－ＲＧＤｙＫ、ｃｙｃｌｏ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－ｄ－Ｔｙｒ－Ｌｙｓ）を用いた。
【0116】
ＲＧＤｙＫのアミン基とＰＡＡのカルボキシレート基との間に（ベンゾトリアゾール－１－イロキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート［ＢＯＰ、（ｂｅｎｚｏｔｒiａｚｏl－１－ｙｌｏｘｙ）tｒiｓ（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ］が介されたアミド連結を通じて、ＲＧＤリガンドとＰＡＡを連結した。ＰＡＡ（Ｍｗ＝１８００Ｄａ、０．０６５ｍｍｏｌ）１１６ｍｇ、環状－ＲＧＤｙＫ（ＲＧＤリガンドペプチド、ＡｎａＳｐｅｃ社、０．０１６ｍｍｏｌ）１０ｍｇ、ＢＯＰ（０．１２９ｍｍｏｌ）５７．１ｍｇ、及びヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（ＨＯＢｔ、ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ ｈｙｄｒａｔｅ、０．１２９ｍｍｏｌ）１７．４ｍｇを、Ｎ、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、Ｎ、Ｎ－ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ、０．２５８ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ２ｍＬの中で一緒に混合した。
【0117】
この混合物を、室温、Ｎ２条件で、一晩中激しく撹拌した。リガンドが付着したＰＡＡを選択的に収集するために、生成物を、５００Ｄａの分子量カットオフを有する透析袋（ｄｉａｌｙｓｉｓ ｂａｇ）を用いて、ＤＩウォーターに対して透析した。
【0118】
３．自己組織化複合体の用意
リガンドが付着した自己組織化複合体を、収縮／膨張する可逆的な光切替のために、リガンドが付着したＰＡＡ（１６．８μｍｏｌ）を含む生理学的水溶液であるリン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）３ｍＬを、Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋（Ｍｗ＝４３８．７Ｄａ、３．４２μｍｏｌ）を含むＰＢＳ３ｍＬと１０分間超音波処理して混合し、これらが静電気的相互作用を介して連結された自己組織化複合体を製造した。
リガンドが付着した自己組織化複合体を、収縮／膨張する可逆的な光切替のために、リガンドが付着したＰＡＡ（１６．８μｍｏｌ）を含む生理学的水溶液であるリン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）３ｍＬを、Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋（Ｍｗ＝４３８．７Ｄａ、３．４２μｍｏｌ）を含むＰＢＳ３ｍＬと１０分間超音波処理して混合し、これらが静電気的相互作用を介して連結された自己組織化複合体を製造した。
【0119】
以降、前記溶液を１０００ｒｐｍで１０分間簡単に遠心分離し、均一なリガンドが付着した自己組織化複合体（大きな沈殿物は、除去した）が含まれた上澄液を収集した。
【0120】
４．アップコンバージョンナノ粒子の合成
ＵＶのない（したがって、相対的に組織透過性である）二重波長の光刺激（ＮＩＲ及びＶｉｓ光）により、ナノアセンブリーの収縮／膨張を調節するために、アップコンバージョンナノ粒子（ＵＣＮＴ、ｕｐｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｎａｎｏｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ）を合成した。
ＵＶのない（したがって、相対的に組織透過性である）二重波長の光刺激（ＮＩＲ及びＶｉｓ光）により、ナノアセンブリーの収縮／膨張を調節するために、アップコンバージョンナノ粒子（ＵＣＮＴ、ｕｐｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｎａｎｏｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ）を合成した。
【0121】
（１）コアシェル部の製造
前記アップコンバージョンナノ粒子のコアシェル部（ＮａＲＦ４：Ｒｂ、Ｔｍ＠ＮａＹＦ４）を製造した。コアシェル部のコアの上に、等角シェルコーティング（ｃｏｎｆｏｒｍａｌ ｓｈｅｌｌ ｃｏａｔｉｎｇ）を通じて、表面欠陥から発生する光ルミネセンスの消滅を制限するために、コアシェル部の表面を不動態化し、これは、照射されたＮＩＲをアップコンバージョンさせ、高光ルミネセンス強度のＵＶを放出させた。
前記アップコンバージョンナノ粒子のコアシェル部（ＮａＲＦ４：Ｒｂ、Ｔｍ＠ＮａＹＦ４）を製造した。コアシェル部のコアの上に、等角シェルコーティング（ｃｏｎｆｏｒｍａｌ ｓｈｅｌｌ ｃｏａｔｉｎｇ）を通じて、表面欠陥から発生する光ルミネセンスの消滅を制限するために、コアシェル部の表面を不動態化し、これは、照射されたＮＩＲをアップコンバージョンさせ、高光ルミネセンス強度のＵＶを放出させた。
【0122】
コアシェル部において、４９％Ｙｂ－及び１％Ｔｍ－ドープされたＮａＹＦ４コアは、イットリウム(III)クロリドヘキサハイドレート（ＹＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、ｙｔｔｒｉｕｍ（III）ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｈｅｘａｈｙｄｒａｔｅ、９９．９９％）０．５ｍｍｏｌ、イッテルビウム（III）クロリドヘキサハイドレート（ＹｂＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、ｙｔｔｅｒｂｉｕｍ（III）ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｈｅｘａｈｙｄｒａｔｅ、９９．９９％）０．４９ｍｍｏｌ、ツリウム（III）クロリドヘキサハイドレート（ＴｍＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、ｔｈｕｌｉｕｍ（III）ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｈｅｘａｈｙｄｒａｔｅ、９９．９９％）１ｍｍｏｌ、オレイン酸（ｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ、９０％）６ｍＬ、及びオクタデセン（ｏｃｔａｄｅｃｅｎｅ、９０％）１５ｍＬを、三口フラスコで混合し、次いで、１５０℃で、４０分間加熱して製造した。その後、ＮａＯＨ２．５ｍｍｏｌ及びＮＨ４Ｆ４ｍｍｏｌを含むメタノール１０ｍＬを混合液に添加した後、４０分間撹拌した。その後、メタノールを蒸発させ、混合溶液を、３２０℃、アルゴン雰囲気で、６０分間加熱した。この混合溶液を、エタノールで３回洗浄し、合成されたコア（ＮａＹＦ４：Ｙｂ、Ｔｍ）をシクロヘキサン（ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ）１０ｍＬに分散させた。
【0123】
ＮａＹＦ４シェルは、コアの上に表面欠陥を最小化し、光ルミネセンス強度を高めるために、エピタキシアル成長（ｅｐｉｔａｘｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ）で形成した。ＹＣｌ３・６Ｈ２Ｏ １ｍｍｏｌ、オレイン酸６ｍＬ、及び１－オクタデセン１５ｍＬを三口フラスコで混合して混合溶液を作り、１５０℃で、４０分間加熱した。その後、この混合溶液に上記で製造したコア懸濁液１０ｍＬ、ＮａＯＨ２．５ｍｍｏｌ、及びＮＨ４Ｆ４ｍｍｏｌを含むメタノール溶液を順次添加し、４０分間撹拌した。メタノールを蒸発させた後、この混合溶液を、アルゴン雰囲気で、６０分間３２０℃まで加熱した後、エタノールで３回洗浄した。
【0124】
最後に、製造されたコア＠シェル部（ＮａＹＦ４：Ｙｂ、Ｔｍ＠ＮａＹＦ４）をシクロヘキサン１０ｍＬに分散させた。
【0125】
（２）コアシェル部へのコーティング部の形成
自己組織化複合体に光エネルギーを照射し、選択的な異性化を誘導するために、アップコンバージョンナノ粒子にＮＩＲを照射し、Ｖｉｓ光だけではなく、ＵＶまで最大限アップコンバージョンさせるように製造した。このため、前記（１）で製造したコアシェル部の表面に、４００ｎｍ乃至５００ｎｍ範囲の可視光線を吸収する天然染料（β－カロチン）をコートし、このコーティング部は、光切替異性体をトランス異性化することができるアップコンバージョンされた可視光線を吸収した。
自己組織化複合体に光エネルギーを照射し、選択的な異性化を誘導するために、アップコンバージョンナノ粒子にＮＩＲを照射し、Ｖｉｓ光だけではなく、ＵＶまで最大限アップコンバージョンさせるように製造した。このため、前記（１）で製造したコアシェル部の表面に、４００ｎｍ乃至５００ｎｍ範囲の可視光線を吸収する天然染料（β－カロチン）をコートし、このコーティング部は、光切替異性体をトランス異性化することができるアップコンバージョンされた可視光線を吸収した。
【0126】
コアシェル部（１０ｍｇ／ｍＬ）５００μＬ、臨床的に用いられる天然染料であるβ－－カロチン（β－ｃａｒｏｔｅｎｅ、１ｍｇ／ｍＬ）１００μＬ、及び臨床的に用いられるＴｗｅｅｎ ８０（１０ｍｇ／ｍＬ）２００μＬを含むシクロヘキサン溶液を激しくボルテックシングして混合した。この溶液を空気乾燥（ａｉｒ－ｄｒｉｅｄ）して、シクロヘキサンを蒸発させ、乾燥した残留物をＤＩウォーター２ｍＬに分散させた。以降、この分散液を連続的に超音波処理し、形成されたアップコンバージョンナノ粒子（コア＠シェル＠コーティング部）が固まらないように２分間撹拌した。
【0127】
得られたアップコンバージョンナノ粒子は、使用前、暗室で貯蔵した。
【0128】
（３）アップコンバージョンナノ粒子がコートされた基板の形成
（２）で製造したアップコンバージョンナノ粒子をガラス基板の表面に、全体的にコートした。
（２）で製造したアップコンバージョンナノ粒子をガラス基板の表面に、全体的にコートした。
【0129】
細胞培養用レベルの有機基板及びシリコン基板（天然の酸化ケイ素の表面が形成され、ガラス基板に似た表面化学を有する）を１２ｍｍ×１２ｍｍの大きさに切って実験に用いた。前記基板を、ＨＣｌに３０分間漬け、表面をきれいにし、Ｈ２ＳＯ４を１時間の間処理して、ヒドロキシル基を活性化した。その後、基板をＤＩウォーターで３回濯ぎ、アップコンバージョンナノ粒子４００μＬを含むＤＩウォーターでインキュベートし、基板の表面にアップコンバージョンナノ粒子をコートした。以降、４０℃の乾燥オーブンで６時間の間乾燥させた。
【0130】
アップコンバージョンナノ粒子の表面は、基板表面のヒドロキシル基と親水性相互作用を形成して、均一に分散し、アップコンバージョンナノ粒子は、基板表面を全体的に覆った。このアップコンバージョンナノ粒子がコートされた基板は、追加で天然染料（β－ｃａｒｏｔｅｎｅ）４００μＬを含むＤＩウォーターでコートされた後、４０℃のオーブンで、６時間の間完全に乾燥した。
【0131】
このように製造された基板は、細胞培養前、１時間の間、ＵＶ光で殺菌された。
【0132】
５．ナノシステムの用意
上記で製造した自己組織化複合体及びアップコンバージョンナノ粒子がコートされた基板を結合させて、ナノシテムを用意した。
上記で製造した自己組織化複合体及びアップコンバージョンナノ粒子がコートされた基板を結合させて、ナノシテムを用意した。
【0133】
アップコンバージョンナノ粒子がコートされた基板を、自己組織化複合体１ｍＬを含む生理学的水溶液（ＰＢＳ）で、室温条件で、３０分間インキュベートし、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ－ＰＢＳ、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）で洗浄した。
【0134】
この過程で、アップコンバージョンナノ粒子と自己組織化複合体との間の親水性相互作用により、自己組織化複合体が、アップコンバージョンナノ粒子がコートされた基板に結合して、広がった形態（ｓｐｒｅａｄ ｓｈａｐｅ）を形成した。
【0135】
したがって、光エネルギーを照射して光切替異性体を異性化することにより、自己組織化複合体を可逆的に収縮／膨張させることができるナノシステムが製造された。
【0136】
［実施例］
上記した製造例により実施例を製造した。
上記した製造例により実施例を製造した。
【0137】
１．実施例１
Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋構造の光切替異性体を、ＲＧＤリガンドが付着しているＰＡＡポリマーに静電気的に結合させて、自己組織化複合体を形成した。
Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋構造の光切替異性体を、ＲＧＤリガンドが付着しているＰＡＡポリマーに静電気的に結合させて、自己組織化複合体を形成した。
【0138】
また、ＮａＹＦ４：Ｙｂ、Ｔｍ＠ＮａＹＦ４＠コーティング部構造のアップコンバージョンナノ粒子を、基板上に、親水性相互作用を通じて、全体的にコートした。コーティング部の内層を形成する染料は、β－カロチンを用いており、内層の表面を、界面活性剤であるＴｗｅｅｎ ８０で全体的にコートして、コーティング部の外層を形成した。
【0139】
前記自己組織化複合体を、前記アップコンバージョンナノ粒子の外層に親水性相互作用で付着した。
【0140】
前記自己組織化複合体の内部は、染料としてβ－カロチン（β－ｃａｒｏｔｅｎｅ）を担持した。
【0141】
２．実施例２
前記実施例１において、自己組織化複合体内に担持される物質をローダミンに変えたことを除いては、同様にして製造した。
前記実施例１において、自己組織化複合体内に担持される物質をローダミンに変えたことを除いては、同様にして製造した。
【0142】
３．実施例３
前記実施例１において、自己組織化複合体内に担持される物質をＩＬ－４に変えたことを除いては、同様にして製造した。
前記実施例１において、自己組織化複合体内に担持される物質をＩＬ－４に変えたことを除いては、同様にして製造した。
【0143】
［比較例］
１．比較例１
前記実施例１において、自己組織化複合体及びアップコンバージョンナノ粒子を除き、基板のみの物質を製造した。
１．比較例１
前記実施例１において、自己組織化複合体及びアップコンバージョンナノ粒子を除き、基板のみの物質を製造した。
【0144】
２．比較例２
前記実施に１において、基板上に、シェルとコーティング部を除き、コアだけあるアップコンバージョンナノ粒子及び自己組織化複合体がある物質を製造した。
前記実施に１において、基板上に、シェルとコーティング部を除き、コアだけあるアップコンバージョンナノ粒子及び自己組織化複合体がある物質を製造した。
【0145】
３．比較例３
前記実施例１において、基板上に、コーティング部を除き、コアシェル部だけあるアップコンバージョンナノ粒子及び自己組織化複合体がある物質を製造した。
前記実施例１において、基板上に、コーティング部を除き、コアシェル部だけあるアップコンバージョンナノ粒子及び自己組織化複合体がある物質を製造した。
【0146】
４．比較例４
前記実施例１において、アップコンバージョンナノ粒子を除き、基板上に自己組織化複合体がある物質を製造した。
前記実施例１において、アップコンバージョンナノ粒子を除き、基板上に自己組織化複合体がある物質を製造した。
【0147】
５．比較例５
前記実施例１において、自己組織化複合体を除き、基板上にアップコンバージョンナノ粒子がある物質を製造した。
前記実施例１において、自己組織化複合体を除き、基板上にアップコンバージョンナノ粒子がある物質を製造した。
【0148】
６．比較例６
前記実施例１において、基板上に、リガンドのない自己組織化複合体及びアップコンバージョンナノ粒子がある物質を製造した。
前記実施例１において、基板上に、リガンドのない自己組織化複合体及びアップコンバージョンナノ粒子がある物質を製造した。
【0149】
［実験方法］
１．１Ｈ ＮＭＲ分光法（１Ｈ ＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）
Ａｚｏ－ＯＨ、Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｂｒ、及びＡｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋分子において、一連の化学結合変化を確認するために、１Ｈ ＮＭＲ分光（Ｂｒｕｋｅｒ Ａｄｖａｎｃｅ ４００ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ、４００ＭＨｚ）を用いた。
１．１Ｈ ＮＭＲ分光法（１Ｈ ＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）
Ａｚｏ－ＯＨ、Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｂｒ、及びＡｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋分子において、一連の化学結合変化を確認するために、１Ｈ ＮＭＲ分光（Ｂｒｕｋｅｒ Ａｄｖａｎｃｅ ４００ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ、４００ＭＨｚ）を用いた。
【0150】
分析に先立って、Ａｚｏ－ＯＨを、重水素化ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ－ｄ６）に溶解させ、Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｂｒ及びＡｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋は、重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ３）に溶解させた。特性ピークは、それぞれの試料の合成後、索引付けされた。
【0151】
Ａｚｏ－ＯＨの試料は、黄色－オレンジ色（ｙｅｌｌｏｗ－ｏｒａｎｇｅ ｃｏｌｏｒ）であった（１．４ｇ、収率２５．７％）。Ａｚｏ－ＯＨ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６、δ（ｐｐｍ））の１Ｈ ＮＭＲは、１０．３４（ｓ、１Ｈ）、７．８４－７．８２（ｍ、４Ｈ）７．５９－７．４９（ｍ、３Ｈ）、６．９９－６．９５（ｍ、２Ｈ）であった。Ａｚｏ－ＯＨ分子の特性ピークとして、フェノール基が確認された。
【0152】
Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｂｒ分子の試料は、黄色－オレンジ色（ｙｅｌｌｏｗ－ｏｒａｎｇｅ ｃｏｌｏｒ）であった（０．５ｇ、収率：４７．６％）。Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｂｒ（４００
ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３, δ（ｐｐｍ））の１Ｈ ＮＭＲは、７．９３－７．８５（ｍ、４Ｈ）、７．５２－７．４１（ｍ、３Ｈ）、７．００－６．９９（ｄ、Ｊ＝９．２Ｈｚ、２Ｈ）、４．０５－４．０２（ｔ、J＝６．４Ｈｚ、２Ｈ）、３．４２－３．３９（ｔ、J＝７．２Ｈｚ、２Ｈ）、１．８９－１．７８（ｍ、４Ｈ）、１．５１－１．３８（ｍ、４Ｈ）、１．３２（ｓ、８Ｈ）であった。Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｂｒ分子の特性ピークでは、エーテル基が確認された。
ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３, δ（ｐｐｍ））の１Ｈ ＮＭＲは、７．９３－７．８５（ｍ、４Ｈ）、７．５２－７．４１（ｍ、３Ｈ）、７．００－６．９９（ｄ、Ｊ＝９．２Ｈｚ、２Ｈ）、４．０５－４．０２（ｔ、J＝６．４Ｈｚ、２Ｈ）、３．４２－３．３９（ｔ、J＝７．２Ｈｚ、２Ｈ）、１．８９－１．７８（ｍ、４Ｈ）、１．５１－１．３８（ｍ、４Ｈ）、１．３２（ｓ、８Ｈ）であった。Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｂｒ分子の特性ピークでは、エーテル基が確認された。
【0153】
Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋分子の試料は、黄色であった（０．２４ｇ、収率：６４．９％）。Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３、δ（ｐｐｍ））の１Ｈ ＮＭＲは、７．９２－７．８６（ｍ、４Ｈ）、７．５２－７．４２（ｍ、３Ｈ）、７．０２－６．９９（ｄ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、２Ｈ）、４．０６－４．０３（ｔ、J＝６．４Ｈｚ、２Ｈ）、３．５４－３．４６（ｍ、６Ｈ）、３．２９－３．２５（ｍ、２Ｈ）、１．４９－１．３３（ｍ、２５Ｈ）であった。Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋分子の特性ピークとして、三級アミンのα－ハイドロゲンが確認された。
【0154】
２．分子動態シミュレーション（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｙｎａｍｉｃ ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ）
ｔｒａｎｓ－Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋と比較して、ｃｉｓ－Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋の水吸収量がさらに多いことを確認するために、シュレディンガースイーツ
を用いて、水和エネルギーを計算し、水に対するＡｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋のそれぞれの親和度を決めた。
ｔｒａｎｓ－Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋と比較して、ｃｉｓ－Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋の水吸収量がさらに多いことを確認するために、シュレディンガースイーツ
【0155】
（１）分子の予備コンフォマーに対する検索は、次の媒介変数を持って、マクロモデルを通じて行った。
【0156】
１）力場（ｆｏｒｃｅ ｆｉｅｌｄ）：ＯＰＬＳ３
２）溶媒：Ｈ２Ｏ
３）力場において充電
４）カットオフ：無し
５）最小化方法：ＰＲＣＧ（Ｐｏｌａｋ－Ｒｉｂｉｅｒｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｇｒａｄｉｅｎｔ）
６）最大繰り返し回数：２,５００
７）収束（ｃｏｎｖｅｒｇｅ ｏｎ）：勾配（ｇｒａｄｉｅｎｔ）
８）収束閾値（ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｃｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）：０．０５
９）コンホメーション探索法（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｓｅａｒｃｈ ｍｅｔｈｏｄ）：混合捩れ／低モード（ｔｏｒｓｉｏｎａｌ／ｌｏｗ－ｍｏｄｅ）サンプリング
１０）捩れサンプリングオプション：中間
１１）最大ステップ数：１,０００
１２）構造節約のためのエネルギー窓（ｅｎｅｒｇｙ ｗｉｎｄｏｗ ｆｏｒ ｓａｖｉｎｇ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）：
２１ｋＪ／ｍｏｌ
１３）最大原子偏差カットオフを用いた重複コンフォマーの除去：０．５
２）溶媒：Ｈ２Ｏ
３）力場において充電
４）カットオフ：無し
５）最小化方法：ＰＲＣＧ（Ｐｏｌａｋ－Ｒｉｂｉｅｒｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｇｒａｄｉｅｎｔ）
６）最大繰り返し回数：２,５００
７）収束（ｃｏｎｖｅｒｇｅ ｏｎ）：勾配（ｇｒａｄｉｅｎｔ）
８）収束閾値（ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｃｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）：０．０５
９）コンホメーション探索法（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｓｅａｒｃｈ ｍｅｔｈｏｄ）：混合捩れ／低モード（ｔｏｒｓｉｏｎａｌ／ｌｏｗ－ｍｏｄｅ）サンプリング
１０）捩れサンプリングオプション：中間
１１）最大ステップ数：１,０００
１２）構造節約のためのエネルギー窓（ｅｎｅｒｇｙ ｗｉｎｄｏｗ ｆｏｒ ｓａｖｉｎｇ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）：
２１ｋＪ／ｍｏｌ
１３）最大原子偏差カットオフを用いた重複コンフォマーの除去：０．５
【0157】
（２）微細幾何最適化（ｆｉｎｅ ｇｅｏｍｅｔｒｙ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）は、次の媒介変数を有する密度汎関数理論（ＤＦＴ、ｄｅｎｓｉｔｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｔｈｅｏｒｙ）に基づき、ジャガー（Ｊａｇｕａｒ）モジュールで行った。
【0158】
１）理論：Ｂ３ＬＹＰ－Ｄ３
２）電荷：１
３）基準：６－３１Ｇ＊＊
４）スピン多重度：１
５）ハミルトニアン（Ｈａｍｉｌｔｏｎｉａｎ）：非相対論的（ｎｏｎｒｅｌａｔｉｖｉｓｔｉｃ）
６）ＳＣＦ正確度の水準：速い
７）初期推測：原子重複
８）収束基準：最大繰り返し回数４８回、エネルギー変化５ｅ－０５、及びＲＭＳ密度行列変化回数（ＲＭＳ ｄｅｎｓｉｔｙ ｍａｔｒｉｘ ｃｈａｎｇｅ）５ｅ－０６
９）融合計画：ＤＩＩＳ
１０）溶媒和モデル：Ｈ２Ｏ
１１）気相基準エネルギー：最適化された気相構造
２）電荷：１
３）基準：６－３１Ｇ＊＊
４）スピン多重度：１
５）ハミルトニアン（Ｈａｍｉｌｔｏｎｉａｎ）：非相対論的（ｎｏｎｒｅｌａｔｉｖｉｓｔｉｃ）
６）ＳＣＦ正確度の水準：速い
７）初期推測：原子重複
８）収束基準：最大繰り返し回数４８回、エネルギー変化５ｅ－０５、及びＲＭＳ密度行列変化回数（ＲＭＳ ｄｅｎｓｉｔｙ ｍａｔｒｉｘ ｃｈａｎｇｅ）５ｅ－０６
９）融合計画：ＤＩＩＳ
１０）溶媒和モデル：Ｈ２Ｏ
１１）気相基準エネルギー：最適化された気相構造
【0159】
（３）ＭＤシミュレーションは、次の媒介変数を有するシュレディンガースイーツにおいて、デズモンドモジュールを通じて、アクリル酸を有する２つのＡｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋に対するパッキングモードを用いることにより、自己組織化複合体内に主要分子間相互作用を調査するために行われた。
【0160】
１）力場（ｆｏｒｃｅ ｆｉｅｌｄ）：ＯＰＬＳ３ｅ
２）溶媒和モデル：ＴＩＰ４ＰＤ
３）イオン配置：２つの臭化物イオン
４）境界条件（ｂｏｕｎｄａｒｙ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）：斜方晶系箱型（ｏｒｔｈｏｒｈｏｍｂｉｃ ｂｏｘ ｓｈａｐｅ）、箱サイズの計算方法（バッファー）
５）シミュレーション時間：２０ｎｓ、記録間隔：４０ｐｓ
６）凡そのフレーム数：５００
７）アンサンブルクラス（ｅｎｓｅｍｂｌｅ ｃｌａｓｓ）：ＮＰＴ
８）温度：３００Ｋ
９）圧力：１．０１３２５Ｂａｒ
１０）温度調節機方式（ｔｈｅｒｍｏｓｔａｔ ｍｅｔｈｏｄ）：
ノーズ－フーバーチェーン（Ｎｏｓｅ－Ｈｏｏｖｅｒ ｃｈａｉｎ）
１１）クーロン相互作用のカットオフ半径（ｃｏｕｌｏｍｂｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｃｕｔｏｆｆ ｒａｄｉｕｓ）：９．０Å。１０フレーム毎に分子間相互作用を分析した。
２）溶媒和モデル：ＴＩＰ４ＰＤ
３）イオン配置：２つの臭化物イオン
４）境界条件（ｂｏｕｎｄａｒｙ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）：斜方晶系箱型（ｏｒｔｈｏｒｈｏｍｂｉｃ ｂｏｘ ｓｈａｐｅ）、箱サイズの計算方法（バッファー）
５）シミュレーション時間：２０ｎｓ、記録間隔：４０ｐｓ
６）凡そのフレーム数：５００
７）アンサンブルクラス（ｅｎｓｅｍｂｌｅ ｃｌａｓｓ）：ＮＰＴ
８）温度：３００Ｋ
９）圧力：１．０１３２５Ｂａｒ
１０）温度調節機方式（ｔｈｅｒｍｏｓｔａｔ ｍｅｔｈｏｄ）：
ノーズ－フーバーチェーン（Ｎｏｓｅ－Ｈｏｏｖｅｒ ｃｈａｉｎ）
１１）クーロン相互作用のカットオフ半径（ｃｏｕｌｏｍｂｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｃｕｔｏｆｆ ｒａｄｉｕｓ）：９．０Å。１０フレーム毎に分子間相互作用を分析した。
【0161】
３．ＵＶ－Ｖｉｓ分光法（ＵＶ－Ｖｉｓ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）
Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋分子の異性状態の吸収スペクトルを確認するために、ＵＶ－Ｖｉｓ分光計測定（Ａｇｉｌｅｎｔ社 ８４５３）は、ＵＶ光（３６５ｎｍ、０．２５Ｗ／ｃｍ２、３０ｓ）またはＶｉｓ光（４４８ｎｍ、０．２Ｗ／ｃｍ２、３０ｓ）を交互に処理して、２００ｎｍ乃至７００ｎｍ範囲の波長で行った。
Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋分子の異性状態の吸収スペクトルを確認するために、ＵＶ－Ｖｉｓ分光計測定（Ａｇｉｌｅｎｔ社 ８４５３）は、ＵＶ光（３６５ｎｍ、０．２５Ｗ／ｃｍ２、３０ｓ）またはＶｉｓ光（４４８ｎｍ、０．２Ｗ／ｃｍ２、３０ｓ）を交互に処理して、２００ｎｍ乃至７００ｎｍ範囲の波長で行った。
【0162】
３１５ｎｍ及び３４５ｎｍにおける最大吸収ピークは、自己組織化複合体のそれぞれのｃｉｓ－Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋及びｔｒａｎｓ－Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋に相当するものであった。速いＵＶ処理（３６５ｎｍ、０．２５Ｗ／ｃｍ２、３０ｓ）後、多様な時間ポイントにおいて、Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋分子の残留シス－割合（百分率）は、多様な時間ポイントでの３７５ｎｍにおいて、相対的な吸収値を用いて決めた。ＵＶ処理後、約３７５ｎｍにおいて、さらに低い吸収値はシス－割合を示し、これに対して、Ｖｉｓ処理後、約３７５ｎｍにおいて、さらに高い吸収値はトランス－割合を示す。可視光線－吸収の天然染料であるβ－カロチン（β－ｃａｒｏｔｅｎｅ）のＵＶ－Ｖｉｓ吸収スペクトルも測定した。
【0163】
４．透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）
アップコンバージョンナノ粒子のコア及びコアシェルの大きさ及び形態の均一性を、ＴＥＭイメージング（Ｔｅｃｎａｉ Ｆ２０、ＦＥＩ社）で特性化した。
アップコンバージョンナノ粒子のコア及びコアシェルの大きさ及び形態の均一性を、ＴＥＭイメージング（Ｔｅｃｎａｉ Ｆ２０、ＦＥＩ社）で特性化した。
【0164】
５．アップコンバージョンナノ粒子（コアシェル部）の高解像度透過型電子顕微鏡（ＨＲ－ＴＥＭ、Ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ－ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）
ＨＲ－ＴＥＭイメージング（Ｔｅｃｎａｉ Ｆ２０、ＦＥＩ社）は、原子分解能において、コア及びコアシェルの格子模様を識別するために、２００ｋＶの作動電圧で行われた。隣り合う格子模様間の平均間隔は、六方晶相（ｈｅｘａｇｏｎａｌ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｐｈａｓｅ）を確認するためにラベリングされ、コア上でエピタキシャル成長されたシェルを確認した。
ＨＲ－ＴＥＭイメージング（Ｔｅｃｎａｉ Ｆ２０、ＦＥＩ社）は、原子分解能において、コア及びコアシェルの格子模様を識別するために、２００ｋＶの作動電圧で行われた。隣り合う格子模様間の平均間隔は、六方晶相（ｈｅｘａｇｏｎａｌ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｐｈａｓｅ）を確認するためにラベリングされ、コア上でエピタキシャル成長されたシェルを確認した。
【0165】
６．アップコンバージョンナノ粒子（コアシェル部）の高角環状暗視野走査型透過電子顕微鏡（ＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭ、Ｈｉｇｈ－ａｎｇｌｅ ａｎｎｕｌａｒ ｄａｒｋ ｆｉｅｌｄ－ｓｃａｎｎｉｎｇ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）
アップコンバージョンナノ粒子において、コアシェルナノ構造の大きさ及び形態の均一性を特性化するために、ＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭイメージングは、Ｔａｌｏｓ ２００ｘ ＴＥＭ（ＦＥＩ社）を用いて、６のスポットサイズ、２ｎｍのプローブサイズを用いて、２００ｋＶで行った。イメージにおいて、アップコンバージョンナノ粒子のシェルは、コアよりもさらに暗く現れた。
アップコンバージョンナノ粒子において、コアシェルナノ構造の大きさ及び形態の均一性を特性化するために、ＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭイメージングは、Ｔａｌｏｓ ２００ｘ ＴＥＭ（ＦＥＩ社）を用いて、６のスポットサイズ、２ｎｍのプローブサイズを用いて、２００ｋＶで行った。イメージにおいて、アップコンバージョンナノ粒子のシェルは、コアよりもさらに暗く現れた。
【0166】
７．エネルギー分散Ｘ線分光マッピング（ＥＤＳ、Ｅｎｅｒｇｙ－ｄｉｓｐｅｒｓｉｖｅ Ｘ－Ｒａｙ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｍａｐｐｉｎｇ）
アップコンバージョンナノ粒子のコア及びシェルにおいて、Ｆ及びＹ元素の均一な分布及びコアにのみ存在するＹｂ及びＴｍ元素の存在を確認するために、ＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭに用いられたものと同じ設定で、ＥＤＳマッピングを行った。
アップコンバージョンナノ粒子のコア及びシェルにおいて、Ｆ及びＹ元素の均一な分布及びコアにのみ存在するＹｂ及びＴｍ元素の存在を確認するために、ＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭに用いられたものと同じ設定で、ＥＤＳマッピングを行った。
【0167】
８．動的光散乱分析（ＤＬＳ、ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ）
アップコンバージョンナノ粒子のコア及びコアシェルの均一な直径分布を確認するために、室温で、ＤＬＳ分析（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ、Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＫ）を行った。これにより、３４±０．９ｎｍサイズのコアが、４７±１．２ｎｍサイズのコアシェルに成長することを確認した。
アップコンバージョンナノ粒子のコア及びコアシェルの均一な直径分布を確認するために、室温で、ＤＬＳ分析（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ、Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＫ）を行った。これにより、３４±０．９ｎｍサイズのコアが、４７±１．２ｎｍサイズのコアシェルに成長することを確認した。
【0168】
９．光ルミネセンス測定（ｐｈｏｔｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）
可視光線を吸収する天然染料（β－ｃａｒｏｔｅｎｅ）でコートされたアップコンバージョンナノ粒子の効率を確認するために、９８０ｎｍ ＮＩＲダイオードレーザーを照射するＨｉｔａｃｈｉ Ｆ－７０００分光光度計を用いて、光ルミネセンススペクトルを分析した。コア、コア＠シェル、及びコア＠シェル＠コーティング部をそれぞれ測定した。光ルミネセンス強度は、３４０ｎｍにおいて、ＵＶ領域の最大ピーク強度で正規化された。ＵＶ対Ｖｉｓ光ルミネセンスの割合は、ＵＶ（３４０ｎｍ）の最大ピーク強度を、青色Ｖｉｓ領域（４５０ｎｍ）で割って計算された。ＵＶピークは、Ｔｍ３＋元素において、１Ｉ６→３Ｆ４及び１Ｄ２→３Ｈ６の電子遷移に由来したことに対して、青色ピークは、Ｔｍ３＋元素において、１Ｄ２→３Ｆ４及び１Ｇ４→３Ｈ６の電子遷移に由来した。
可視光線を吸収する天然染料（β－ｃａｒｏｔｅｎｅ）でコートされたアップコンバージョンナノ粒子の効率を確認するために、９８０ｎｍ ＮＩＲダイオードレーザーを照射するＨｉｔａｃｈｉ Ｆ－７０００分光光度計を用いて、光ルミネセンススペクトルを分析した。コア、コア＠シェル、及びコア＠シェル＠コーティング部をそれぞれ測定した。光ルミネセンス強度は、３４０ｎｍにおいて、ＵＶ領域の最大ピーク強度で正規化された。ＵＶ対Ｖｉｓ光ルミネセンスの割合は、ＵＶ（３４０ｎｍ）の最大ピーク強度を、青色Ｖｉｓ領域（４５０ｎｍ）で割って計算された。ＵＶピークは、Ｔｍ３＋元素において、１Ｉ６→３Ｆ４及び１Ｄ２→３Ｈ６の電子遷移に由来したことに対して、青色ピークは、Ｔｍ３＋元素において、１Ｄ２→３Ｆ４及び１Ｇ４→３Ｈ６の電子遷移に由来した。
【0169】
１０．走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ、ｓｃａｎｎｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）
基板の表面がアップコンバージョンナノ粒子で完全にコートされたかを確認するために、ＳＥＭイメージング（ＦＥＩ社、Ｑｕａｎｔａ ２５０ ＦＥＧ）を行った。ＳＥＭイメージングの前、アップコンバージョンナノ粒子がコートされた基板を完全に乾燥させた後、９０秒間、白金コーティングを行った。
基板の表面がアップコンバージョンナノ粒子で完全にコートされたかを確認するために、ＳＥＭイメージング（ＦＥＩ社、Ｑｕａｎｔａ ２５０ ＦＥＧ）を行った。ＳＥＭイメージングの前、アップコンバージョンナノ粒子がコートされた基板を完全に乾燥させた後、９０秒間、白金コーティングを行った。
【0170】
１１．自己組織化複合体の形成過程において、蛍光染料を担持して自己組織化複合体の蛍光追跡
蛍光を通じて自己組織化複合体を追跡するために、リガンドが付着したＰＡＡ（１６．８μｍｏｌ）を含むＰＢＳ３ｍＬを、Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋分子（３．４２μｍｏｌ）を含むＰＢＳ３ｍＬと混合し、５分間、超音波処理した。その後、ここに、０．２Ｍ赤色蛍光ローダミン６Ｇ染料（Ｒｅｄ－ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ６Ｇ ｄｙｅ）３０μＬを含むＰＢＳ溶液を添加し、自己組織化複合体内に染料（ローダミン６Ｇ）を担持するために、この混合溶液を５分間さらに超音波処理した。この溶液を、１０００ｒｐｍで、１０分間遠心分離した後、担持されていないローダミン６Ｇが残っている上澄液を捨てた。ローダミン６Ｇが担持された自己組織化複合体１ｍＬを、アップコンバージョンナノ粒子がコートされた基板上に、室温で、３０分間処理して付着させた。その後、この基板上の自己組織化複合体の数を可視化及び定量化するために、この基板を共焦点顕微鏡でイメージ化した。
蛍光を通じて自己組織化複合体を追跡するために、リガンドが付着したＰＡＡ（１６．８μｍｏｌ）を含むＰＢＳ３ｍＬを、Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋分子（３．４２μｍｏｌ）を含むＰＢＳ３ｍＬと混合し、５分間、超音波処理した。その後、ここに、０．２Ｍ赤色蛍光ローダミン６Ｇ染料（Ｒｅｄ－ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ６Ｇ ｄｙｅ）３０μＬを含むＰＢＳ溶液を添加し、自己組織化複合体内に染料（ローダミン６Ｇ）を担持するために、この混合溶液を５分間さらに超音波処理した。この溶液を、１０００ｒｐｍで、１０分間遠心分離した後、担持されていないローダミン６Ｇが残っている上澄液を捨てた。ローダミン６Ｇが担持された自己組織化複合体１ｍＬを、アップコンバージョンナノ粒子がコートされた基板上に、室温で、３０分間処理して付着させた。その後、この基板上の自己組織化複合体の数を可視化及び定量化するために、この基板を共焦点顕微鏡でイメージ化した。
【0171】
１２．自己組織化複合体におけるＲＧＤリガンド数の定量化
自己組織化複合体に含まれたＲＧＤリガンドが飽和され、光異性体の切替中、一定に維持されるかを確認するために、Ｎａｎｏｄｒｏｐ Ａ２８０方法（ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた。自己組織化複合体は、ＰＢＳで合成され、ＵＶ光（３６５ｎｍ、０．２５Ｗ／ｃｍ２、１分間照射）処理して膨張させ、Ｖｉｓ光（４４８ｎｍ、０．２Ｗ／ｃｍ２、１０分間照射）処理して収縮させた。以降、遠心分離（１０００ｒｐｍで１０分間行う）し、１．２μｍ気孔サイズの注射器フィルターを用いて、自己組織化複合体を濾過した。上澄液で反応せずに残ったリガンドが付着したＰＡＡの量は、ＰＡＡに結合した環状－ＲＧＤｙＫ（ｃｙｃｌｏ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－ｄ－Ｔｙｒ－Ｌｙｓ）のチロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）基を追跡して測定した。自己組織化複合体に結合していないリガンドの量は、初期に添加されたリガンドが付着したＰＡＡの量から、上澄液にある反応していないリガンドが付着したＰＡＡの量を差し引いて決めた。測定されたリガンドの数は、計算された自己組織化複合体の数で割って、自己組織化複合体当たりのリガンドの数を決めた。
自己組織化複合体に含まれたＲＧＤリガンドが飽和され、光異性体の切替中、一定に維持されるかを確認するために、Ｎａｎｏｄｒｏｐ Ａ２８０方法（ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた。自己組織化複合体は、ＰＢＳで合成され、ＵＶ光（３６５ｎｍ、０．２５Ｗ／ｃｍ２、１分間照射）処理して膨張させ、Ｖｉｓ光（４４８ｎｍ、０．２Ｗ／ｃｍ２、１０分間照射）処理して収縮させた。以降、遠心分離（１０００ｒｐｍで１０分間行う）し、１．２μｍ気孔サイズの注射器フィルターを用いて、自己組織化複合体を濾過した。上澄液で反応せずに残ったリガンドが付着したＰＡＡの量は、ＰＡＡに結合した環状－ＲＧＤｙＫ（ｃｙｃｌｏ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－ｄ－Ｔｙｒ－Ｌｙｓ）のチロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）基を追跡して測定した。自己組織化複合体に結合していないリガンドの量は、初期に添加されたリガンドが付着したＰＡＡの量から、上澄液にある反応していないリガンドが付着したＰＡＡの量を差し引いて決めた。測定されたリガンドの数は、計算された自己組織化複合体の数で割って、自己組織化複合体当たりのリガンドの数を決めた。
【0172】
１３．自己組織化複合体の切替時の膨張程度
自己組織化複合体の水吸収が媒介された膨張を確認するために、膨張の程度を湿潤重量の比で計算し、これは、ＵＶ処理が媒介された膨張（０．２５Ｗ／ｃｍ２で３６５ｎｍ）またはＶｉｓ処理が媒介された収縮（０．２Ｗ／ｃｍ２で４４８ｎｍ）の後に測定し、自己組織化複合体の乾燥重量で割った。Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋１．５ｍｇを含むＰＢＳ３ｍＬ及びリガンドが付着したＰＡＡ３０ｍｇを含むＰＢＳ３ｍＬを混合し、自己組織化複合体の形成を誘導するために、１０分間超音波処理した。ＵＶまたはＶｉｓ処理し、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄液を廃棄して、反応していないＰＡＡを除去した後、自己組織化複合体の湿潤重量を測定した。湿潤自己組織化複合体は、空気中に７日間乾燥させ、乾燥重量を測定した。膨張の程度は、自己組織化複合体の湿潤重量に対する乾燥重量の比で計算された。
自己組織化複合体の水吸収が媒介された膨張を確認するために、膨張の程度を湿潤重量の比で計算し、これは、ＵＶ処理が媒介された膨張（０．２５Ｗ／ｃｍ２で３６５ｎｍ）またはＶｉｓ処理が媒介された収縮（０．２Ｗ／ｃｍ２で４４８ｎｍ）の後に測定し、自己組織化複合体の乾燥重量で割った。Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋１．５ｍｇを含むＰＢＳ３ｍＬ及びリガンドが付着したＰＡＡ３０ｍｇを含むＰＢＳ３ｍＬを混合し、自己組織化複合体の形成を誘導するために、１０分間超音波処理した。ＵＶまたはＶｉｓ処理し、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄液を廃棄して、反応していないＰＡＡを除去した後、自己組織化複合体の湿潤重量を測定した。湿潤自己組織化複合体は、空気中に７日間乾燥させ、乾燥重量を測定した。膨張の程度は、自己組織化複合体の湿潤重量に対する乾燥重量の比で計算された。
【0173】
１４．基板上における速くて可逆的な自己組織化複合体の収縮／膨張に対するリアルタイムの共焦点顕微鏡イメージング
基板上において、自己組織化複合体が速くて可逆的に収縮／膨張することをリアルタイムイメージングで確認するために、リアルタイム共焦点顕微鏡イメージング（Ｋ１ Ｆｌｕｏ、Ｎａｎｏｓｃｏｐｅ ｓｙｓｔｅｍｓ）を行った。自己組織化複合体の鮮明なイメージングのために、自己組織化複合体４００μＬを含む溶液に基板をインキュベートして、親水性相互作用を通じて、ガラス基板に自己組織化複合体を付着させた。映像及びタイムラプスのスナップショットイメージで製作されたリアルタイムイメージングは、１分間、ＵＶ光（０．２５Ｗ／ｃｍ２で３６５ｎｍ）を照射して自己組織化複合体を膨張させた後、引き続き、９分間、Ｖｉｓ光（０．２Ｗ／ｃｍ２で４４８ｎｍ）を照射して収縮させて行った。タイムラプスのスナップショットイメージは、自己組織化複合体が同一平面に焦点が合わせられていることを確認し、側面膨張及び収縮を確認した。
基板上において、自己組織化複合体が速くて可逆的に収縮／膨張することをリアルタイムイメージングで確認するために、リアルタイム共焦点顕微鏡イメージング（Ｋ１ Ｆｌｕｏ、Ｎａｎｏｓｃｏｐｅ ｓｙｓｔｅｍｓ）を行った。自己組織化複合体の鮮明なイメージングのために、自己組織化複合体４００μＬを含む溶液に基板をインキュベートして、親水性相互作用を通じて、ガラス基板に自己組織化複合体を付着させた。映像及びタイムラプスのスナップショットイメージで製作されたリアルタイムイメージングは、１分間、ＵＶ光（０．２５Ｗ／ｃｍ２で３６５ｎｍ）を照射して自己組織化複合体を膨張させた後、引き続き、９分間、Ｖｉｓ光（０．２Ｗ／ｃｍ２で４４８ｎｍ）を照射して収縮させて行った。タイムラプスのスナップショットイメージは、自己組織化複合体が同一平面に焦点が合わせられていることを確認し、側面膨張及び収縮を確認した。
【0174】
また、これらのイメージは、単位面積当たりの自己組織化複合体の数を定量化（４９９２．７±２３３．０自己組織化体／ｍｍ２）するために用いられ、基板上で、収縮／膨張するとき、自己組織化複合体の直径及び側面領域を測定するために用いられた。単位面積当たりの自己組織化複合体の数にそれぞれの自己組織化複合体の側面領域を掛けて、自己組織化複合体の全体の側面領域のパーセントを求めた。
【0175】
１５．細胞調節のために、それぞれＮＩＲ及びＶｉｓ光の照明を通じて、自己組織化複合体の収縮及び膨張を切替
ナノシステムにおいて、ＮＩＲをＵＶ光に変換して、自己組織化複合体の収縮／膨張を遠隔で調節する効果を試験するために、マクロファージを用いて実験した。アップコンバージョンナノ粒子がコートされた基板だけで実験した場合は、表面を不活性化して、自己組織化複合体の細胞調節効果のための後続付着を防止した。マクロファージ（ＲＡＷ ２６４．７、ＡＴＣＣの５回継代）を、ナノシステムの上に、５．３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２（０ｈにのみ培養）の密度でプレーティングし、１０％熱不活性化ウシ胎児血清及び５０Ｕ／ｍｌのペニシリンとストレプトマイシン抗生体が補充された基本成長培地（ＤＭＥＭ、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）で、３７℃、５％ＣＯ２条件で培養した。基板には、自己組織化複合体の膨張／収縮を誘導するために、ＮＩＲ（９８０ｎｍ、１Ｗ／ｃｍ２、１分間照射）またはＶｉｓ光（４４８ｎｍ、０．２Ｗ／ｃｍ２、１０分間照射）を交互に繰り返して照射した。
ナノシステムにおいて、ＮＩＲをＵＶ光に変換して、自己組織化複合体の収縮／膨張を遠隔で調節する効果を試験するために、マクロファージを用いて実験した。アップコンバージョンナノ粒子がコートされた基板だけで実験した場合は、表面を不活性化して、自己組織化複合体の細胞調節効果のための後続付着を防止した。マクロファージ（ＲＡＷ ２６４．７、ＡＴＣＣの５回継代）を、ナノシステムの上に、５．３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２（０ｈにのみ培養）の密度でプレーティングし、１０％熱不活性化ウシ胎児血清及び５０Ｕ／ｍｌのペニシリンとストレプトマイシン抗生体が補充された基本成長培地（ＤＭＥＭ、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）で、３７℃、５％ＣＯ２条件で培養した。基板には、自己組織化複合体の膨張／収縮を誘導するために、ＮＩＲ（９８０ｎｍ、１Ｗ／ｃｍ２、１分間照射）またはＶｉｓ光（４４８ｎｍ、０．２Ｗ／ｃｍ２、１０分間照射）を交互に繰り返して照射した。
【0176】
細胞機能（例：マクロファージの炎症／再生特性）に対するこのような遠隔制御の効果は、炎症性のＭ１分極培地（１０ｎｇ／ｍＬの脂質多糖類を含む）または再生性のＭ２分極培地（インターロイキン（ＩＬ）－４及びＩＬ－３を、それぞれ２０ｎｇ／ｍＬずつ含む）で調査された。マクロファージの付着及び炎症／再生機能特性間の相関関係は、ＲＯＣＫ（抑制剤であるＹ２７６３２を５０μＭを含む）、アクチン重合（抑制剤であるサイトカラシンＤを２μｇ／ｍＬ含む）、及びミオシンII（抑制剤であるブレビスタチンを１０μＭ含む）の特定の薬理学的抑制剤を用いて調査した。
【0177】
陰性対照群は、自己組織化複合体／アップコンバージョンナノ粒子、アップコンバージョンナノ粒子、アップコンバージョンナノ粒子のシェルとコーティング部、アップコンバージョンナノ粒子におけるコーティング部または自己組織化複合体のうちいずれか一つがないナノシステムを用いて実験した。
【0178】
１６．共焦点免疫蛍光イメージング（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ）
ナノシステムの上に細胞を培養し、自己組織化複合体を膨張／収縮させて、遠隔で調節する効果を評価するために、共焦点免疫蛍光イメージングを行った。
ナノシステムの上に細胞を培養し、自己組織化複合体を膨張／収縮させて、遠隔で調節する効果を評価するために、共焦点免疫蛍光イメージングを行った。
【0179】
培養されたマクロファージは、Ｄ－ＰＢＳで２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ、ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で１０分間固定した後、Ｄ－ＰＢＳで４回洗浄した。固定されたマクロファージは、遮断バッファー（３％ウシ血清アルブミン及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００を含むＰＢＳ）を用いて、３７℃で、１時間の間遮断及び透過化させ、次いで、遮断バッファーを用いて、４℃で、１６時間の間、一次抗体とともにインキュベートした。
【0180】
以降、０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ
２０を含むＰＢＳで４回洗浄し、マクロファージは、二次抗体及びファロイジン（ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ）を含む遮断バッファーを用いて、室温で、４５分間処理した。以降、マクロファージを、０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳで４回洗浄し、ＤＡＰＩアンチフエードで覆った後、スライドガラスに載せた。
２０を含むＰＢＳで４回洗浄し、マクロファージは、二次抗体及びファロイジン（ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ）を含む遮断バッファーを用いて、室温で、４５分間処理した。以降、マクロファージを、０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳで４回洗浄し、ＤＡＰＩアンチフエードで覆った後、スライドガラスに載せた。
【0181】
免疫蛍光染色されたマクロファージは、全てのグループに対して同じレーザー露出及びイメージ獲得セッティングされた共焦点顕微鏡（ＬＳＭ７００、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）を用いてイメージ化された後、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて定量的に分析した。細胞付着数は、５つの異なるイメージからＤＡＰＩ－陽性細胞核を用いて計算され、これに対して、付着した細胞面積及び伸長因子（長軸と短軸の割合）は、５つの異なるイメージからＦ－アクチン染色された細胞を用いて計算した。細胞のタンパク質発現は、５つの異なるイメージを用いて、Ｆ－アクチン染色された細胞のタンパク質蛍光強度を定量化して計算した。
【0182】
１７．ウエスタンブロッティング分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ）
ナノシステムを膨張／収縮することにより、マクロファージに対する効果を定量化するために、ウエスタンブロッティング分析を行った。培養されたマクロファージの全体タンパク質は、１０μＬのタンパク質分解抑制剤カクテルを混合した４００μＬのＰＲＯ－ＰＲＥＰＴＭタンパク質抽出溶液（ｉＮｔＲＯＮ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を適用して抽出した。抽出されたタンパク質の濃度は、Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＴＭ ＰｉｅｒｃｅＴＭ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いて定量化した。抽出されたタンパク質は、変性させ、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ－ｇｅｌ、ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｏｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ－ｇｅｌｓ、１０％）を用いて、１１０Ｖで、５５分間、ゲル電気泳動して分離し、その後、１２０Ｖで、９０分間、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ、ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）膜に移した。移したタンパク質は、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０（ＴＢＳＴ）バッファーを含むトリス緩衝生理食塩水（ｔｒｉｓ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）で、１０分間、洗浄し、遮断バッファー（５％脱脂乳を含むＴＢＳＴ）で、４℃で、一晩中遮断した。
ナノシステムを膨張／収縮することにより、マクロファージに対する効果を定量化するために、ウエスタンブロッティング分析を行った。培養されたマクロファージの全体タンパク質は、１０μＬのタンパク質分解抑制剤カクテルを混合した４００μＬのＰＲＯ－ＰＲＥＰＴＭタンパク質抽出溶液（ｉＮｔＲＯＮ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を適用して抽出した。抽出されたタンパク質の濃度は、Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＴＭ ＰｉｅｒｃｅＴＭ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いて定量化した。抽出されたタンパク質は、変性させ、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ－ｇｅｌ、ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｏｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ－ｇｅｌｓ、１０％）を用いて、１１０Ｖで、５５分間、ゲル電気泳動して分離し、その後、１２０Ｖで、９０分間、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ、ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）膜に移した。移したタンパク質は、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０（ＴＢＳＴ）バッファーを含むトリス緩衝生理食塩水（ｔｒｉｓ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）で、１０分間、洗浄し、遮断バッファー（５％脱脂乳を含むＴＢＳＴ）で、４℃で、一晩中遮断した。
【0183】
その後、ｉＮＯＳ（１３５ｋＤａ）、Ａｒｇ－１（３７ｋＤａ）、及びＧＡＰＤＨ（３６ｋＤａ）に対する一次抗体が溶解された遮断バッファーを、遮断されたタンパク質に室温で１時間の間適用した。このように処理されたタンパク質は、その後、ＴＢＳＴバッファーでそれぞれ５分間隔で３回洗浄し、抗－ＨＲＰ－接合された二次抗体で、室温で、１時間の間インキュベートした。その後、タンパク質は、ＴＢＳＴバッファーで洗浄され、ＥＣＬウエスタンブロッティング試薬（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ＨＲＰ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、ＭＥＲＣＫ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で処理した。その後、タンパク質は、Ｌｉｎｅａｒ Ｉｍａｇｅ Ｑｕａｎｔ ＬＡＳ ４０００の化学発光イメージングシステムを用いて分析された。標的タンパク質の発現レベルは、ＧＡＰＤＨのそれに対して正規化した後、提示した。
【0184】
１８．自己組織化複合体への二重波長光（ｄｕａｌ－ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｌｉｇｈｔ）を介したタンパク質伝達の時間調節の遠隔制御
自己組織化複合体が、二重波長で調節されたタンパク質伝達輸送体として用いられるかを調査するために、リガンドが付着したＰＡＡ（１６．８μｍｏｌ）を含むＰＢＳ３ｍＬを、Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｂ＋分子（３．４２μｍｏｌ）を含むＰＢＳ３ｍＬと混合した後、５分間超音波処理した。その後、ここに、組み替えネズミＩＬ－４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ｃａｔａｌｏｇ＃：２１４－１４、１０μｇ／ｍＬ）６０μＬを含むＰＢＳを添加し、次いで、自己組織化複合体の上にＩＬ－４タンパク質がロードされるように、５分間ボルテックシングした。その後、溶液は、１０００ｒｐｍで、１５分間遠心分離し、ロードされなかったＩＬ－４を含む上澄液を捨てた。ＰＢＳ４０ｍＬを、タンパク質がロードされた自己組織化複合体にスムーズに添加して懸濁させた後、１００ｋＤａ分子量カットオフを有する透析袋に入れた。ＵＶ光（３６５ｎｍ、０．２５Ｗ／ｃｍ２）及びＶｉｓ光（４４８ｎｍ、０．２Ｗ／ｃｍ２）を、タンパク質がロードされた自己組織化複合体に、３０分間隔で、それぞれ１分間２回照射した。多様な時間で、透析袋を通過した上澄液４００μＬを収集し、反応していない自己組織化複合体を除去するために、１００００ｒｐｍで、１５分間遠心分離した。上澄液は、適宜希釈させ、放出されたＩＬ－４タンパク質の濃度を、ＥＬＩＳＡ（Ａｂｃａｍ、ｃａｔａｌｏｇ＃：ａｂ１００７１０）を用いて定量化した。これにより、最終的に自己組織化複合体の時間調節された膨張／収縮に対する累積タンパク質放出プロファイルが得られた。
自己組織化複合体が、二重波長で調節されたタンパク質伝達輸送体として用いられるかを調査するために、リガンドが付着したＰＡＡ（１６．８μｍｏｌ）を含むＰＢＳ３ｍＬを、Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｂ＋分子（３．４２μｍｏｌ）を含むＰＢＳ３ｍＬと混合した後、５分間超音波処理した。その後、ここに、組み替えネズミＩＬ－４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ｃａｔａｌｏｇ＃：２１４－１４、１０μｇ／ｍＬ）６０μＬを含むＰＢＳを添加し、次いで、自己組織化複合体の上にＩＬ－４タンパク質がロードされるように、５分間ボルテックシングした。その後、溶液は、１０００ｒｐｍで、１５分間遠心分離し、ロードされなかったＩＬ－４を含む上澄液を捨てた。ＰＢＳ４０ｍＬを、タンパク質がロードされた自己組織化複合体にスムーズに添加して懸濁させた後、１００ｋＤａ分子量カットオフを有する透析袋に入れた。ＵＶ光（３６５ｎｍ、０．２５Ｗ／ｃｍ２）及びＶｉｓ光（４４８ｎｍ、０．２Ｗ／ｃｍ２）を、タンパク質がロードされた自己組織化複合体に、３０分間隔で、それぞれ１分間２回照射した。多様な時間で、透析袋を通過した上澄液４００μＬを収集し、反応していない自己組織化複合体を除去するために、１００００ｒｐｍで、１５分間遠心分離した。上澄液は、適宜希釈させ、放出されたＩＬ－４タンパク質の濃度を、ＥＬＩＳＡ（Ａｂｃａｍ、ｃａｔａｌｏｇ＃：ａｂ１００７１０）を用いて定量化した。これにより、最終的に自己組織化複合体の時間調節された膨張／収縮に対する累積タンパク質放出プロファイルが得られた。
【0185】
１９．生体内における、ＮＩＲ及びＶｉｓ光の照射を通じて、自己組織化複合体の膨張／収縮の切替
生体内で、ＮＩＲ及びＶｉｓ光の照射を用いて、宿主細胞調節の効果を確認するための概念の証明として、ナノシステムをマウスに皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｅ）移植した。
生体内で、ＮＩＲ及びＶｉｓ光の照射を用いて、宿主細胞調節の効果を確認するための概念の証明として、ナノシステムをマウスに皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｅ）移植した。
【0186】
大韓民国高麗大学校動物管理委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の承認を得た後、生後２ヶ月のｂａｌｂ／ｃマウス４４匹を、アルファキサン（ａｌｆａｘａｎ）及びロムパン（ｒｏｍｐｕｎ）を２：１（ｖ／ｖ）で混合した溶液１００μＬを腹腔内注射して麻酔した。炎症が誘発された初期宿主反応に対応するために、宿主細胞にタンパク質（再生性／抗炎症性ＩＬ－４）が一定に伝達されるように、ＩＬ－４タンパク質をロードするために、ナノシステム１ｍＬを含むＰＢＳを用いて、室温で、３０分間インキュベートした。その後、ＩＬ－４タンパク質がロードされたナノシステムを、１．８ｃｍ長さの切開部を通じてマウスの背中に移植した後、縫合した。移植後、０時間及び１２時間に、マウスの背中（基板に向けて）にＮＩＲ（９８０ｎｍ、１Ｗ／ｃｍ２、１分間照射）またはＶｉｓ（４４８ｎｍ、０．２Ｗ／ｃｍ２、１０分間照射）レーザーを外部から交互に繰り返し照射して、自己組織化複合体の膨張／収縮を促進した。
【0187】
自己組織化複合体の生体内安定性を確認するために、ローダミン６Ｇがカプセル化されたナノシステムも移植し、共焦点イメージングを通じて分析した。移植前及び移植から６時間後に、赤色蛍光ナノシステムが確認され、これを、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて定量化した。移植から２４時間後に、ナノシステムに付着した宿主マクロファージは、共焦点免疫蛍光イメージング及び柔細胞分析で分析した。全炎症性ｉＮＯＳ及び全再生性Ａｒｇ－１マーカーのうちいずれか一つが発現される宿主細胞は、宿主マクロファージと確認された。ナノシステムの生体内で局所的及び全体的な毒性は、組織学的分析を通じて評価された。
【0188】
２０．生体内細胞調節の柔細胞分析（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ）
宿主細胞の調節に（ＵＶ－ｆｒｅｅ）ＮＩＲ及びＶｉｓ光の照射が及ぼす影響を定量的に分析するために、柔細胞分析を行った。移植から２４時間後、回収されたナノシステムを、１０％
ＦＢＳを含む冷たいＰＢＳでスムーズに洗浄し、次いで、宿主細胞を収集するために、３０００ｒｐｍで、５分間遠心分離した。収集された細胞は、４％ＰＦＡで、１０分間再懸濁された後、３％ＢＳＡを含むＰＢＳで、１時間の間暗室で遮断された。遮断された細胞は、３％ＢＳＡを含むＰＢＳにおいて、炎症性（ＣＤ６８）または再生性（ＣＤ１６３）の一次抗体で、１時間の間、適切なアイソタイプ対照群がある暗室で処理された。その後、細胞は、遠心分離した後、ＰＢＳで洗浄し、次いで、３％ＢＳＡを含むＰＢＳにおいて、二次蛍光抗体で、３０分間暗室で処理された。蛍光ラベルされた細胞は、３％ＢＳＡ、１％アジ化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｚｉｄｅ）を含むＰＢＳで洗浄した後、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒを用いて分析し、Ｂｄ ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ
Ｐｒｏソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｅｎｃｅｓ）を用いて定量化した。このデータは、それぞれのアイソタイプ対照群で正規化した後、平均蛍光強度のヒストグラムを生成するために、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析した。
宿主細胞の調節に（ＵＶ－ｆｒｅｅ）ＮＩＲ及びＶｉｓ光の照射が及ぼす影響を定量的に分析するために、柔細胞分析を行った。移植から２４時間後、回収されたナノシステムを、１０％
ＦＢＳを含む冷たいＰＢＳでスムーズに洗浄し、次いで、宿主細胞を収集するために、３０００ｒｐｍで、５分間遠心分離した。収集された細胞は、４％ＰＦＡで、１０分間再懸濁された後、３％ＢＳＡを含むＰＢＳで、１時間の間暗室で遮断された。遮断された細胞は、３％ＢＳＡを含むＰＢＳにおいて、炎症性（ＣＤ６８）または再生性（ＣＤ１６３）の一次抗体で、１時間の間、適切なアイソタイプ対照群がある暗室で処理された。その後、細胞は、遠心分離した後、ＰＢＳで洗浄し、次いで、３％ＢＳＡを含むＰＢＳにおいて、二次蛍光抗体で、３０分間暗室で処理された。蛍光ラベルされた細胞は、３％ＢＳＡ、１％アジ化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｚｉｄｅ）を含むＰＢＳで洗浄した後、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒを用いて分析し、Ｂｄ ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ
Ｐｒｏソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｅｎｃｅｓ）を用いて定量化した。このデータは、それぞれのアイソタイプ対照群で正規化した後、平均蛍光強度のヒストグラムを生成するために、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析した。
【0189】
２１．局所及び全身生体内における毒性
ナノシステムの材料には、臨床試験中のアップコンバージョンナノ粒子だけでなく、β－カロチン（β－ｃａｒｏｔｅｎｅ）染料及びＴｗｅｅｎ ８０も含まれているが、これらが、生体内で（ＵＶ－ｆｒｅｅ）ＮＩＲ及びＶｉｓ光を照射することにより、潜在的な毒性を示すかを実験した。
ナノシステムの材料には、臨床試験中のアップコンバージョンナノ粒子だけでなく、β－カロチン（β－ｃａｒｏｔｅｎｅ）染料及びＴｗｅｅｎ ８０も含まれているが、これらが、生体内で（ＵＶ－ｆｒｅｅ）ＮＩＲ及びＶｉｓ光を照射することにより、潜在的な毒性を示すかを実験した。
【0190】
まず、ナノシステムを、マウスに皮下移植した。組織学的分析は、移植前及び移植から７日後、細胞構造を確認するために行われた。皮下組織は、生体内の局所的な毒性を評価するために分析され、これに対して、多様な臓器（例えば、肝、腎臓、脾臓、及び心臓）は、生体内の全体的な毒性を評価するために分析された。多様な組織及び臓器は、４％ＰＦＡを用いて、４８時間の間固定された。その後、固定された組織サンプルを、ＤＩウォーターで洗浄し、エタノール－ＤＩウォーター混合物で、エタノールの濃度勾配（順序通りに、７０％、８０％、９０％、９５％、及び１００％エタノール）を用いて、１時間の間（それぞれ２回ずつ）脱水し、次いで、６０℃で、一晩中パラフィン包埋（ｐａｒａｆｆｉｎ ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ）を行った。パラフィン包埋サンプルの５μｍ厚さ部分をマイクロトーム（ＨｉｓｔｏＣｏｒｅ Ｍｕｌｔｉｃｕｔ、Ｌｅｉｃａ ＲＭ２１２５ ＲＴＳ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて切断し、スライドガラスに載せ、キシレン代替物を用いて、パラフィンを除去した後、ＤＩウォーター－エタノール混合物で、エタノールの濃度勾配（順序通りに、７０％、８０％、９０％、９５％、及び１００％エタノール）を用いて、再水和（ｒｅ－ｈｙｄｒａｔｅ）した。再水和された部分は、ナノシステムを移植して、ＮＩＲまたはＶｉｓ光を照射する前と７日後の多様な組織及び臓器の細胞組織で生じる変化を調査するために、ヘマトキシリン及びエオジン（Ｈ＆Ｅ、ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ａｎｄ ｅｏｓｉｎ）溶液で脱水して、スライドガラスに載せた。
【0191】
２２．統計分析
全ての実験は、独立的に２回または３回再現された。グラフパッドプリズム８（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ８）ソフトウェアは、全ての統計処理に用いられた。グループ間に統計的に有意味な差は、０．０５未満のｐ値と設定された。スチューデントの両側ｔ検定（Ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔ）は、二つのグループの比較に用いられるのに対して、チューキー・クレーマー事後検定（Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ ｐｏｓｔ－ｈｏｃ ｔｅｓｔ）を用いた一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）は、多重グループ比較で行われた。
全ての実験は、独立的に２回または３回再現された。グラフパッドプリズム８（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ８）ソフトウェアは、全ての統計処理に用いられた。グループ間に統計的に有意味な差は、０．０５未満のｐ値と設定された。スチューデントの両側ｔ検定（Ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔ）は、二つのグループの比較に用いられるのに対して、チューキー・クレーマー事後検定（Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ ｐｏｓｔ－ｈｏｃ ｔｅｓｔ）を用いた一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）は、多重グループ比較で行われた。
【0192】
下記の実験及び図面において、ＮＩＲ、Ｖｉｓ（またはＶｉｓ光）及びＵＶは、該当光を照射したという意味である。すなわち、例えば、ＮＩＲ－Ｖｉｓは、ＮＩＲ光を照射した後、Ｖｉｓ光を照射したという意味である。
【0193】
アップコンバージョンナノ粒子において、コアは、シェル及びコーティング部がなく、コアだけある構造を意味する。また、アップコンバージョンナノ粒子において、コアシェル、コアシェル部、コア＠シェル、コア＠シェル部、及びｃｏｒｅ＠ｓｈｅｌｌは、コーティング部がなく、コア及びその表面を全体的に取り囲むシェルだけある構造を意味する。また、アップコンバージョンナノ粒子において、構成要素の制限がない場合、及びｃｏｒｅ＠ｓｈｅｌｌ＠ｄｙｅは、コアシェルの表面をコーティング部が全体的に取り囲む構造のアップコンバージョンナノ粒子を意味する。
【0194】
［実験例１］ナノシステムの特性分析
１．光切替異性体の特性分析
自己組織化複合体の自己組織を媒介する光切替異性体として、Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋分子を合成した。
１．光切替異性体の特性分析
自己組織化複合体の自己組織を媒介する光切替異性体として、Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋分子を合成した。
【0195】
Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋分子の合成メカニズムは、図２に示した。まず、Ａｚｏ－ＯＨを合成した後、芳香族基とＢｒとの間に疎水性尾部スペーサを含むＡｚｏ－Ｃ１０－Ｂｒに変換した。以降、Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｂｒ分子におけるＢｒは、π－カチオン及びπ－π相互作用を通じて、自己組織化複合体において積層させることができるＡｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋分子を得るために、Ｎ＋で代替された。
【0196】
当該分子の合成を確認するために、１Ｈ ＮＭＲスペクトルを、図３に示した。Ａｚｏ－ＯＨ、Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｂｒ、及びＡｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋分子の１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、フェノール基（１０．３４ｐｐｍ）、エーテル基（４．０５ｐｐｍ）、及び四次アミンのα－水素（３．５４－３．２５ｐｐｍ）の特性ピークを示し、光切替可能なＡｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋分子が成功的に合成されたことを示す。
【0197】
図４は、Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋分子の分子動力学（ＭＤ；ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）シミュレーションを分析して示すものである。
【0198】
分子動力学シミュレーションは、Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋分子のトランス－及びシス－状態の切替が、分子内の積層及び水の吸収を調節することを示す。トランス及びシス状態のＡｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋分子に対するＭＤシミュレーションのスナップショットは、Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋分子の分子内のπ相互作用がトランス状態で促進されることを示す（図４ａ）。これは、窒素陽イオンと疎水性尾部スペーサがＡｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋分子の積層を媒介するからである。
【0199】
ＭＤシミュレーションの２０ｎｓにおける、Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋分子のπ－カチオン相互作用に対するヒートマップチャート（ｈｅａｔ ｍａｐ ｃｈａｒｔ）及び頻度数から、これらの相互作用がシス状態よりもトランス状態において極めて促進されることがさらに確認される。これに対して、π－π相互作用の程度は、シスとトランスの状態が似ている。このような特性は、図６ｂ、ｃ及び図４ｂ、ｃにより確認される。
【0200】
Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋分子のそれぞれの異性体に対する密度汎関数理論（ＤＦＴ、ｄｅｎｓｉｔｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｔｈｅｏｒｙ）の計算に対する数値を、図４ｄ、ｅに示した。シス状態のＡｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋分子がさらに高い水素エネルギー及びさらに大きな極性表面積を見せることを示し、これは、トランス状態よりも水に対する親和度が極めて大きいことを示す。
【0201】
まとめると、π－カチオン相互作用が抑制されたｃｉｓ－Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋分子のねじれた構造は、分子の極性及び親水性を向上させ、したがって、水を吸収して自己組織化複合体の膨張を促進させる。また、これに対して、相対的に弱い極性であるｔｒａｎｓ－Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋分子におけるπ－カチオン相互作用は、自己組織化複合体内に水が吸収されることを抑制して、自己組織化複合体を稠密にする。
【0202】
２．リガンドが付着したポリマー及び自己組織化複合体の特性分析
自己組織化複合体にＲＧＤリガンドを取り込むために、リガンドが付着し、負に荷電したポリマーを合成し、ここに、静電気的相互作用を通じて積層されたＡｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋分子を結合させた。ここで、ポリマーは、ポリアクリル酸（ＰＡＡ、ｐｏｌｙａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ）を用い、ＲＧＤリガンドは、アミン基を有するリジン残基のある環状－ＲＧＤｙＫを用いた。ＰＡＡのカルボキシレート基にリガンドが結合する過程は、図５に示した。
自己組織化複合体にＲＧＤリガンドを取り込むために、リガンドが付着し、負に荷電したポリマーを合成し、ここに、静電気的相互作用を通じて積層されたＡｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋分子を結合させた。ここで、ポリマーは、ポリアクリル酸（ＰＡＡ、ｐｏｌｙａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ）を用い、ＲＧＤリガンドは、アミン基を有するリジン残基のある環状－ＲＧＤｙＫを用いた。ＰＡＡのカルボキシレート基にリガンドが結合する過程は、図５に示した。
【0203】
自己組織化複合体は、π－カチオン及びπ－π相互作用を通じて、Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋分子の積層を促進すると同時に、リガンドが付着したＰＡＡが固まることを媒介として形成されてもよい。このような自己組織化複合体の形成過程は、図６ａに模式的に示した。
【0204】
前記自己組織化複合体のＡｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋分子のトランス及びシス型を用いたＭＤシミュレーションを行い、図７に示した。
【0205】
図７ａは、トランス及びシスの状態で、Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋分子がアクリル酸と連結された状態で残っていることを示す。
【0206】
自己組織化複合体内において、ｃｉｓ－Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋分子の安定性（例えば、寿命）を評価するために、シス状態を促進するように、ＵＶ光を照射した後、シス状態からトランス状態への時間分解切替（ｔｉｍｅ－ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）を調査した。このため、ＵＶ－Ｖｉｓ分光を用いて実験して、図７ｂ－ｅに示した。
【0207】
ＵＶ－Ｖｉｓ分光法の結果は、トランス状態の形成のための可視光線処理後、最大ピーク強度は、３４５ｎｍを示し、シス状態の形成のために０時間からＵＶ処理後は、３１５ｎｍを示す。この結果から、３０秒間ＵＶ処理してから２４時間になる時点に、シス状態が殆ど８０％以上残っていることが確認され、１日スケールのシス状態の安定性を確認することができる（図７ｂ、ｃ）。
【0208】
このように、シス状態の長い寿命は、トランス状態で吸収ピークの青方偏移（ｂｌｕｅ－ｓｈｉｆｔｅｄ）を示すように設計されたアゾベンゼン誘導体に相応するものである。３０秒間、ＵＶ処理後、引き続き、３０秒間Ｖｉｓ処理することを５サイクル以上繰り返すＵＶ－Ｖｉｓ吸収スペクトル、及び時間－依存残留シス集団から、５サイクルの間、シスとトランス集団間に、速くて可逆的な変換が可能であることが確認される（図７ｄ、ｅ）。
【0209】
３．アップコンバージョンナノ粒子の特性分析
ＵＶのない（このため、組織透過的な）刺激を通じて、自己組織化複合体の可逆的な膨張／収縮を遠隔で調節するために、ＮＩＲをＵＶ光にアップコンバージョンさせるアップコンバージョンナノ粒子を合成した。アップコンバージョンナノ粒子は、表面欠陥を防止するために、コア上に、シェルをエピタキシアル成長（ｅｐｉｔａｘｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ）させ、コア＠シェル構造（ＮａＹＦ４：Ｙｂ、Ｔｍ＠ＮａＹＦ４）で設計された。アップコンバージョンナノ粒子に対する分析結果は、図８及び９に示した。
ＵＶのない（このため、組織透過的な）刺激を通じて、自己組織化複合体の可逆的な膨張／収縮を遠隔で調節するために、ＮＩＲをＵＶ光にアップコンバージョンさせるアップコンバージョンナノ粒子を合成した。アップコンバージョンナノ粒子は、表面欠陥を防止するために、コア上に、シェルをエピタキシアル成長（ｅｐｉｔａｘｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ）させ、コア＠シェル構造（ＮａＹＦ４：Ｙｂ、Ｔｍ＠ＮａＹＦ４）で設計された。アップコンバージョンナノ粒子に対する分析結果は、図８及び９に示した。
【0210】
図８ａ及び図９におけるＨＲ－ＴＥＭイメージは、合成されたコアとシェルが、サイズ分布及び形態が均一に合成されたことを示す。また、イメージは、コア（ＮａＹＦ４：Ｙｂ、Ｔｍ）とシェル（ＮａＹＦ４）がいずれも、欠陥のない六方晶構造を有することを示す。当該図面のＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭイメージとＥＤＳマッピングは、コアとシェルの構造にＦ及びＹ元素が均一に分布されているだけではなく、Ｙｂ及びＴｍのドーパント元素がコアにのみ均一に存在することを示す。
【0211】
図８ｂは、合成されたアップコンバージョンナノ粒子のコアがＮＩＲ（９８０ｎｍ）励起以下のＵＶ及びＶｉｓ（青色）領域において光ルミネセンスピークを見せることを示す。また、図８ｂ、ｃは、アップコンバージョンナノ粒子のシェルが、コア上においてエピタキシアル成長したとき、コアシェルの蛍光強度及び直径が、コアだけあるときと比べて、顕著に増加することが確認される。
【0212】
図１０は、アップコンバージョンナノ粒子において、コーティング部の有無による蛍光を分析した結果である。ＮＩＲが変換されたＵＶ（ＮＩＲ－ｃｏｎｖｅｒｔｅｄ－ＵＶ）光により、自己組織化複合体の膨張を媒介するｃｉｓ－Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋の形成を選択的に誘導するために、ＮＩＲからＵＶまたはＶｉｓへの変換を天然染料を用いて最大化した。ここで、使った天然染料は、青色領域において可視光線を吸収するβ－カロチンである。これに対して、ｔｒａｎｓ－Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋の形成は、自己組織化複合体の可視光線により誘導されてもよく、このとき、自己組織化複合体は、収縮される。
【0213】
したがって、ＮＩＲは、ｃｉｓ－Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋を選択的に誘導するために、Ｖｉｓを超えてＵＶ光に変換される必要がある。結局、コアシェルは、ＮＩＲを照射して、ｃｉｓ－Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋を形成するために、可視光線を吸収する染料で表面をコートして、アップコンバージョンナノ粒子を得ることができる。図８ｄは、このように形成されたアップコンバージョンナノ粒子を基板上にコートしたことを示す図である。ＮＩＲ（９８０ｎｍ）が励起された光ルミネセンススペクトルは、３４０ｎｍのＵＶ領域のピークにおいて正規化され、コア、コアシェル、及びコーティング部まで形成されたアップコンバージョンナノ粒子へ行くほど、４５０ｎｍにおけるピーク強度が次第に減少した（図８ｅ）。ＮＩＲが励起された光ルミネセンスを示す図（図８ｆ）は、コアシェルでは、青色の光ルミネセンスが極めて強く現れるが、コーティング部まで形成されたアップコンバージョンナノ粒子へ行くほど、強度が顕著に減少することが確認される。
【0214】
図８ｇでは、ＵＶ（３４０ｎｍ）及びＶｉｓ（４５０ｎｍ）の光ルミネセンス強度比を定量化して示し、アップコンバージョンナノ粒子において、ＮＩＲからＵＶへアップコンバージョンされることが、ＮＩＲからＶｉｓ光へアップコンバージョンされることよりも、さらに好まれることを示す。
【0215】
【0216】
したがって、このような結果から、アップコンバージョンナノ粒子が、ＮＩＲをＵＶへ選択的にアップコンバージョンさせ、その強度も強く示されることが確認される。
【0217】
４．ナノシステムの特性分析
自己組織化複合体を、アップコンバージョンナノ粒子がコートされた基板に、親水性相互作用を通じて、結合させて、ナノシステムを形成した。このナノシステムは、ＮＩＲを照射すると、ＮＩＲが、アップコンバージョンナノ粒子を通じて、ＵＶへアップコンバージョンされ、このＵＶが、自己組織化複合体を刺激し、自己組織化複合体の光切替異性体（Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋）をシス異性化して、自己組織化複合体を膨張させる。また、ナノシステムにＶｉｓ光を照射すると、自己組織化複合体の光切替異性体がトランス異性化して、自己組織化複合体を収縮させる。
自己組織化複合体を、アップコンバージョンナノ粒子がコートされた基板に、親水性相互作用を通じて、結合させて、ナノシステムを形成した。このナノシステムは、ＮＩＲを照射すると、ＮＩＲが、アップコンバージョンナノ粒子を通じて、ＵＶへアップコンバージョンされ、このＵＶが、自己組織化複合体を刺激し、自己組織化複合体の光切替異性体（Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋）をシス異性化して、自己組織化複合体を膨張させる。また、ナノシステムにＶｉｓ光を照射すると、自己組織化複合体の光切替異性体がトランス異性化して、自己組織化複合体を収縮させる。
【0218】
このようなナノシステムの挙動を確認するために、自己組織化複合体にローダミンを担持して、余膨張／収縮実験を行い、その結果を図１１に示した。
【0219】
図１１ａは、自己組織化複合体内にローダミンが担持される過程を模式的に示す図である。図１１ｂは、自己組織化複合体の蛍光イメージであり、自己組織化複合体に担持されたローダミンにより、強い赤色蛍光が示すことが確認される。
【0220】
図１１ｃは、自己組織化複合体の膨張／収縮による様々な数値を定量化して示すグラフである。自己組織化複合体当たりのリガンドの数は、二重波長光で自己組織化複合体を調節して、膨張／収縮させた後に調査しており、膨張（２．２３±０．１１×１０１０）及び収縮（２．０３±０．０３×１０１０）の状態において殆ど類似した。
【0221】
これは、リガンドの飽和数よりも露出数が重要であることを意味する。また、光が媒介されて膨張した状態で、自己組織化複合体の完全に飽和された湿潤重量を乾燥重量で割ったものは、膨張状態では、水を吸収するので、収縮状態と比べて、３０８％まで極めて増加した。自己組織化複合体の膨張は、Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋分子の積層構造が減少することにより、リガンドが付着したポリマーがねじれるを防止し、拡がった自己組織化複合体の内部に水を吸収する。このとき、ポリマーに付着したリガンドが外部に極めて露出する。これに対して、自己組織化複合体の収縮は、Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋分子の積層構造が増加して、自己組織化複合体の内部構造が稠密になり、ポリマーのねじれも増加する。したがって、自己組織化複合体の内部に水が吸収されず、ポリマーに付着したリガンドも外部に少しだけ露出するようになる。
【0222】
図１１ｄは、自己組織化複合体のリアルタイムの共焦点顕微鏡イメージのスナップショットであり、自己組織化複合体を１分間膨張させ、引き続き、９分間収縮させて変化を確認したものである。図面において、自己組織化複合体の膨張／収縮により、軸変化が最小化されることに対して、側面（ｌａｔｅｒａｌ）の膨張／収縮が起こることが確認される。これは、自己組織化複合体と基板表面との間に可逆的な親水性相互作用に起因したものである。
【0223】
自己組織化複合体の膨張／収縮に対する図１１ｃ－ｅを総合すると、自己組織化複合体の可逆的な膨張／収縮により、直径、側面断面積、及び全体断面積の百分率は、それぞれ極めて大きな差を有して、可逆的に増加され減少された。自己組織化複合体の全体断面積の百分率は、自己組織化複合体の膨張／収縮により、細胞の付着を、敏感かつ一時的に調節することができることを意味する。
【0224】
［実験例２］ナノシステムのマクロファージ付着の調節実験
ナノシステムの膨張／収縮する特性を用いて、細胞の付着及び分極化を調節することができるかを実験した。このため、ポリマーに付着したリガンドとして、細胞付着性ＲＧＤリガンド（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ）を用いた。細胞タイプは、細胞と自己組織化複合体との間の直接的な相関関係を調査するために、自己組織化複合体のサイズ（３－５μｍ）に似ているマクロファージを用いた。
ナノシステムの膨張／収縮する特性を用いて、細胞の付着及び分極化を調節することができるかを実験した。このため、ポリマーに付着したリガンドとして、細胞付着性ＲＧＤリガンド（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ）を用いた。細胞タイプは、細胞と自己組織化複合体との間の直接的な相関関係を調査するために、自己組織化複合体のサイズ（３－５μｍ）に似ているマクロファージを用いた。
【0225】
マクロファージをナノシステムの上に位置させ、ＮＩＲ（９８０ｎｍ、１Ｗ／ｃｍ２、１分間照射）及びＶｉｓ光（４４８ｎｍ、０．２Ｗ／ｃｍ２、１０分間照射）を照射し、照射されたＮＩＲは、ＵＶへアップコンバージョンされた。
【0226】
【0227】
図１２ａ、ｂにおいて、ＮＩＲグループの共焦点免疫蛍光イメージを通じて、高い付着細胞数、サイズ、及び伸長において、リガンドが極めて露出し、インテグリンβ１組立体、Ｆ－アクチンフィラメント、及び焦点付着複合体の発現が増加することが確認され、これは、マクロファージが膨張した自己組織化複合体に付着しやすいことを意味する。
【0228】
また、図１４乃至図１７は、陰性対照群に対する実験結果であり、それぞれ、順序通りに、ナノシステムにおいて、アップコンバージョンナノ粒子がない場合、及び基板だけある場合、アップコンバージョンナノ粒子がコアのみで形成された場合、アップコンバージョンナノ粒子がコアシェル部だけある場合、自己組織化複合体またはリガンドがない場合に対する実験結果である。それぞれの陰性対照群において、ＮＩＲまたはＶｉｓ光の照射にもかかわらず、マクロファージの付着細胞、付着した細胞の面積及び細胞の伸長因子において有意味な変化がないことが確認される。これは、ナノシステムにおいて、アップコンバージョンナノ粒子の各構成要素、リガンドが、細胞付着及び調節に必須要素であることを意味する。
【0229】
【0230】
それぞれ、０時間及び１２時間にＮＩＲまたはＶｉｓ光を照射し、１２時間及び３６時間に細胞付着を観察した。実験グループは、照射方式により、それぞれ「ＮＩＲ－ＮＩＲ」、「ＮＩＲ－Ｖｉｓ」、「Ｖｉｓ－ＮＩＲ」、及び「Ｖｉｓ－Ｖｉｓ」グループとした。
【0231】
注目すべきことは、「ＮＩＲ－Ｖｉｓ」グループにおいて、１２時間で、ＮＩＲが媒介された膨張により細胞付着が促進され、３６時間では、Ｖｉｓが媒介された収縮により細胞付着が可逆的に抑制された。これは、本発明の光切替可能なナノシステムが、Ｖｉｓ光により誘導された自己組織化複合体内において、ｃｉｓ－Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋分子の長時間（２４ｈ）安定性に寄与された時間－調節細胞付着を効率的に行うことができることを意味する（図７ｂ、ｃ参照）。
【0232】
したがって、このような結果は、ナノシステムに、ＮＩＲまたはＶｉｓ光を照射して、マクロファージの付着を調節することができることを意味する。
【0233】
［実験例３］ナノシステムの光切替によるマクロファージの分極化実験
次に、ナノシステムを用いて、マクロファージの付着を調節し、引き続き、マクロファージの分極化を調節することができるかを実験し、その結果を、図２０乃至図２３に示した。
次に、ナノシステムを用いて、マクロファージの付着を調節し、引き続き、マクロファージの分極化を調節することができるかを実験し、その結果を、図２０乃至図２３に示した。
【0234】
マクロファージにおいて、細胞骨格のＦ－アクチンフィラメントの明らかな組立を含む強力な細胞付着及び細胞の伸長された形態の付着複合体が、全再生性／抗炎症性機能を有するように刺激するＲＯＣＫ（ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）を活性化することが明らかになっている。
【0235】
共焦点免疫蛍光イメージ及びウエスタンブロッティングイメージは、ＮＩＲが後に照射されるグループ（「ＮＩＲ－ＮＩＲ」及び「Ｖｉｓ－ＮＩＲ」グループ）が、それぞれの培地条件において、全再生性／抗炎症性機能を示し、これに対して、Ｖｉｓが後に照射されるグループ（「ＮＩＲ－Ｖｉｓ」及び「Ｖｉｓ－Ｖｉｓ」グループ）は、高い全炎症性機能を示すことが確認される（図２０、２１）。
【0236】
また、細胞付着を妨害するそれぞれのタンパク質の抑制剤を入れて実験した場合、全再生性／抗炎症性機能が損なわれることが確認され、これにより、細胞付着及び細胞の機能間に相関関係があることが確認される（図２２、２３）。この実験において、それぞれのタンパク質は、ＲＯＣＫ、アクチン重合、及びミオシンIIであり、これに対する抑制剤として、それぞれＹ２７６３２、サイトカラシンＤ（ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ Ｄ）、及びブレビスタチン（ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ）を用いた。
【0237】
このような結果は、ナノシステムに、ＮＩＲまたはＶｉｓ光を照射して、マクロファージの付着だけでなく、分極化まで調節することができることを意味する。
【0238】
［実験例４］ナノシステムの光切替によるタンパク質伝達実験
ナノシステムに、ＮＩＲまたはＶｉｓ光を照射して、自己組織化複合体の膨張／収縮される時間を調節することにより、ナノシステムを用いた物質伝達が可能であるかを実験し、実験結果を図２４に示した。
ナノシステムに、ＮＩＲまたはＶｉｓ光を照射して、自己組織化複合体の膨張／収縮される時間を調節することにより、ナノシステムを用いた物質伝達が可能であるかを実験し、実験結果を図２４に示した。
【0239】
図２４ａは、ＮＩＲまたはＶｉｓ光の照射により、光切替異性体であるＡｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋が、シス及びトランスで異性化して、物質が伝達される過程を模式的に示すものである。Ａｚｏ－Ｃ１０－Ｎ＋分子は、シス及びトランスの形態に応じて、分子内相互作用により、リガンドが付着したＰＡＡと絡んだり解けたりするようになる。ここで、伝達物質は、インターロイキン－４（ＩＬ－４）タンパク質を用い、自己組織化複合体内に担持された。
【0240】
図２４ｂにおいて、０分及び３０分に、ナノシステムにＶｉｓ光を１分間照射して、自己組織化複合体を収縮させると、担持されたタンパク質が、６０分間、自己組織化複合体内で維持される。しかし、６０分及び９０分に、ナノシステムに、ＵＶ（ＮＩＲからアップコンバージョンされたＵＶ）を１分間照射して、自己組織化複合体を膨張させると、６０分から、担持されたタンパク質が、時間により拡散して、自己組織化複合体の外部に出ることが確認される。
【0241】
したがって、ナノシステムに、ＮＩＲまたはＶｉｓ光を照射して、自己組織化複合体内に担持された物質を特定部位に伝達することができ、伝達される時間も調節することができる。
【0242】
［実験例５］ナノシステムの生体内実験
ナノシステムを生体内に注入して、マクロファージ及び物質伝達に関する実験を行った。
ナノシステムを生体内に注入して、マクロファージ及び物質伝達に関する実験を行った。
【0243】
実験過程において、ナノシステムの挙動は、組織、及び肺、心臓、並びに脳のような臓器を模倣し、これにより、液体の移動を通じて、自己組織化複合体の膨張／収縮が繰り返され、生体高分子ネットワークの構造を動的に変更することが確認された。宿主マクロファージは、初期炎症反応を調節して、線維症（ｆｉｂｒｏｓｉｓ）及び組織再生性のような後期反応を調節するという重要な役割のため、本実験で分析された。
【0244】
まず、全再生性ＩＬ－４タンパク質が担持されたナノシステムを、マウスの皮下に移植した後、試験管と生体内における光による安定性が同じかを観察し、図２４ｃ、ｄに示した。免疫蛍光イメージ、及びそれを定量化したグラフのいずれにおいても、移植されたナノシステムの数が殆ど変わらないことが確認される。
【0245】
また、共焦点免疫蛍光及び柔細胞分析は、膨張が媒介されたタンパク質が放出され、高いリガンドの露出が後の反応において示されるように設計された「ＮＩＲ－ＮＩＲ」及び「Ｖｉｓ－ＮＩＲ」グループにおいて行われ、図２４ｅ、図２５、及び図２６に示した。ここで、「Ｖｉｓ－ＮＩＲ」及び「Ｖｉｓ－Ｖｉｓ」グループと比較して、好中球の募集とともに、宿主マクロファージの付着及び全再生性／抗炎症性機能がシナジー効果を出して促進されることが確認される。
【0246】
図２７は、ナノシステムに、ＮＩＲまたはＶｉｓ光を照射した場合、生体に無毒性を実験した結果である。無毒性実験は、７日間行われ、局所皮下組織、及び肝、腎臓、脾臓、心臓のような全体の臓器に対して照射した。図面は、ナノシステムの移植前、移植から７日後、及び光照射から７日後における、それぞれの部位に対するイメージであり、特別な細胞構造の差は見られなかった。
【0247】
前記ナノシステムは、ＵＶ無しに可逆的に調節することができるシステムであり、これは、生体に有害なＵＶを用いず、ＮＩＲ及びＶｉｓ光を照射して、マクロファージ及び物質伝達を調節することができることを意味する。
【0248】
本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明が、その技術的思想や必須的な特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施されてもよいことが理解されるであろう。そのため、上述した実施例は、全ての面において、例示的なものであり、限定的なものではないと理解されなければならない。本発明の範囲は、上記した詳細な説明よりも、後述する特許請求の範囲により定められ、特許請求の範囲の意味及び範囲、また、その均等概念から導出される全ての変更または変形された形態が、本発明の範囲に含まれると解析されなければならない。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
