(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-11-08
(45)【発行日】2023-11-16
(54)【発明の名称】皮膚バリア機能低下抑制用組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 8/9789 20170101AFI20231109BHJP
A61Q 19/00 20060101ALI20231109BHJP
A61K 36/73 20060101ALI20231109BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20231109BHJP
A61P 17/18 20060101ALI20231109BHJP
A61P 17/16 20060101ALI20231109BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231109BHJP
A61K 131/00 20060101ALN20231109BHJP
【ＦＩ】
A61K8/9789
A61Q19/00
A61K36/73
A61P17/00
A61P17/18
A61P17/16
A61P43/00 111
A61K131:00
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2019160399
(22)【出願日】2019-09-03
(65)【公開番号】P2021038168
(43)【公開日】2021-03-11
【審査請求日】2022-08-22
(73)【特許権者】
【識別番号】595048544
【氏名又は名称】ちふれホールディングス株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100149032
【弁理士】
【氏名又は名称】森本 敏明
(72)【発明者】
【氏名】行方 優子
(72)【発明者】
【氏名】武智 貴之
(72)【発明者】
【氏名】加藤 亜希子
【審査官】田中 雅之
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１８－１２７４０７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１７－１６０１９０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００７－２７７１４９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００８－００７４１２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１６－０７４６１０（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２００５／０００２８９４（ＵＳ，Ａ１）
【文献】独国特許出願公開第１０１６３２４６（ＤＥ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ８／００－ ８／９９
Ａ６１Ｑ １／００－９０／００
Ａ６１Ｐ １／００－４３／００
Ａ６１Ｋ ３６／００－３６／９０６８
Ｍｉｎｔｅｌ ＧＮＰＤ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
リンゴ果肉抽出物を有効成分として含有する、皮膚バリア機能低下抑制用組成物。
【請求項2】
リンゴ果肉抽出物を有効成分として含有する、コーニファイドエンベロープ形成阻害抑制用組成物。
【請求項3】
リンゴ果肉抽出物を有効成分として含有する、トランスグルタミナーゼ発現低下抑制用組成物又はトランスグルタミナーゼ活性低下抑制用組成物。
【請求項4】
前記トランスグルタミナーゼは、角化細胞内のトランスグルタミナーゼである、請求項３に記載の組成物。
【請求項5】
前記トランスグルタミナーゼは、トランスグルタミナーゼ－１である、請求項３～４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項6】
リンゴ果肉抽出物を有効成分として含有する、インボルクリン発現低下抑制用組成物。
【請求項7】
前記インボルクリンは、角化細胞内のインボルクリンである、請求項６に記載の組成物。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、皮膚バリア機能低下抑制用組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
表皮は、皮膚の最外層に位置し、外部からの異物の侵入を防ぐとともに、体内の水分の蒸散を防ぐバリア機能を有し、生体内部を保護する役割を担う。生活習慣の乱れ、太陽光線、温湿度変化といった環境因子は、シワの形成、キメの乱れ、炎症などを通じて、表皮が担う役割を損なわせる。
【0003】
表皮の中でも、皮膚バリア機能において中心的な役割を担うのは、角層である。表皮の正常なターンオーバーサイクルが恒常的に繰り返されることにより、角層バリアが構築される。角層バリアは、角化細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ；ｃｏｒｎｉｆｉｅｄ ｃｅｌｌ）から分化した角質細胞（ｃｏｒｎｅｏｃｙｔｅ）と、角質細胞の間を埋める細胞間脂質から主としてなる。細胞間脂質は、主要な構成成分がセラミドであり、規則正しく配置されたラメラ構造を呈する。セラミドは、表皮細胞の分化過程において、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ（ＳＰＴ）などによる数種類の酵素反応を経て合成される。
【0004】
角質細胞の細胞膜は厚く、その内側には、周辺帯ともよばれるコーニファイドエンベロープ（ｃｏｒｎｉｆｉｅｄ ｃｅｌｌ ｅｎｖｅｌｏｐｅ；ＣＥ）という裏打ち構造がある。ＣＥを構成するタンパク質は物理的及び化学的刺激に対して非常に安定であり、細胞膜を補強する役割を果たす。また、ＣＥの外側にはリピッドエンベロープ（ｃｏｒｎｅｏｃｙｔｅ－ｂｏｕｎｄ ｌｉｐｉｄ ｅｎｖｅｌｏｐｅ；ＣＬＥ）がある。ＣＬＥは、その外側に細胞間脂質のラメラ構造を構築する足場として機能する。このように角質細胞は、細胞膜内側にあるＣＥ、さらにはその外側にあるＣＬＥ及び細胞間脂質を介して、互いの細胞とともに膜状構造を呈し、角層バリアが構築される。
【0005】
ところで、ＣＥの形成には、トランスグルタミナーゼ－１（ＴＧＭ１）が深く関与していることが知られている。角化細胞が角質細胞に分化することに伴い、ＴＧＭ１はインボルクリン（ＩＮＶ）などのＣＥを構成するタンパク質間を架橋することにより、ＣＥの形成を促進する。さらに、ＴＧＭ１は、細胞膜側に沈着する足場タンパク質のグルタミン酸残基と超長鎖脂肪酸（ω－ヒドロキシセラミド）との間のエステル結合を触媒することにより、ＣＬＥの形成を促進する。したがって、ＴＧＭ１は、ＣＥの形成及びＣＬＥの形成の両方に関与し、角層の成熟化に伴う角層バリアの構築を担う。
【0006】
酸化タンパク質の一種としてカルボニル化タンパク質（ＣＰ）がある。ＣＰは、タンパク質中のアミノ基と脂質過酸化プロセス中に生成されるアルデヒド化合物とによる反応生成物である。タンパク質はカルボニル化により本来の機能が損なわれる。これまでの疫学的調査では、日光に曝露した皮膚、乾燥環境にある皮膚、アトピー患者の皮膚などで観察されている。ＣＰ量は春夏よりも低温低湿度環境下にある秋冬の方が有意に増加するという報告もある。また、特許文献１には、豚皮を、タンパク質を酸化してＣＰの生成を誘導するアクロレインで処理することにより、角層水分量が減少することが記載されている。
【0007】
リンゴ果実抽出物は、カテキン単量体、クロロゲン酸などのフェノールカルボン酸類、フロリジンなどのフラボノイド、プロシアニジンなどのカテキンの多量体構造物を豊富に含む複合生成物であり、優れた抗酸化力を有することから、エイジングケア用素材（抗老化素材）として着目されている。特許文献２には、リンゴ果実抽出物が、ヒト皮膚線維芽細胞に対して、紫外線惹起性のＣＰの生成を抑制することが記載されている。また、特許文献３には、リンゴ果実抽出物が、ヒト表皮細胞株に対して、アクロレイン誘導体惹起性のＣＰの生成を抑制することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【文献】特開２００５－２４９６７２号公報
【文献】特開２０１２－０３１１３３号公報
【文献】特開２０１７－０９５４３２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
特許文献１には、アクロレインにより豚皮の角層に内部生成したカルボニル化タンパク質（ＣＰ）によって角層水分量が減少することが記載されている。また、特許文献２及び３には、リンゴ果実抽出物が紫外線照射又はアクロレイン処理によるＣＰの内部生成を抑制することが記載されている。
【0010】
しかし、特許文献１～３には、細胞外において既に生成したＣＰによる皮膚組織又は角化細胞への影響についての記載は無い。すなわち、細胞外ＣＰに接触した皮膚組織及び角化細胞の状態変化又は機能変化についてはこれまでに知られていない。
【0011】
そこで、本発明は、細胞外において既に生成したカルボニル化タンパク質による皮膚組織及び角化細胞への影響を解明するとともに、細胞外カルボニル化タンパク質及びそれにより生成した細胞内カルボニル化タンパク質による皮膚組織及び角化細胞への影響を改善するための組成物を提供することを、発明が解決しようとする課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明者らは、上記の課題を解決しようとして鋭意検討を進めた結果、表皮角化細胞を細胞外ＣＰで処理した場合、角化細胞において新たなＣＰが生成することを見出し、また細胞膜において外部ＣＰが沈着する可能性を見出した。そして、驚くべきことに、本発明者らは、細胞外ＣＰが角化細胞におけるトランスグルタミナーゼ－１（ＴＧＭ１）及びインボルクリン（ＩＮＶ）の遺伝子発現並びにＴＧＭ１活性を低減することを見出した。
【0013】
また、本発明者らは、表皮組織モデルを細胞外ＣＰで処理することにより、経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）が上昇し、皮膚バリア機能が低下することを見出した。この細胞外ＣＰによる皮膚バリア機能の低下は、ＴＧＭ１及びＩＮＶの発現量が低下すること並びにＴＧＭ１活性が低下することを通じたＣＥの形成阻害によってもたらされている可能性がある。
【0014】
さらに驚くべきことに、本発明者らは、細胞外ＣＰによるＴＥＷＬ上昇に関連する皮膚バリア機能の低下はリンゴ果実抽出物によって抑制されることを見出した。このことによって、リンゴ果実抽出物は、皮膚バリア機能の低下を抑制する効果を示すことから、ＣＥの形成阻害を抑制し、ＴＧＭ１及びＩＮＶの発現量の低下を抑制し、並びにＴＧＭ１活性低下を抑制する可能性がある。
【0015】
そして、これらの知見を基にして、本発明者らは、遂に、本発明の課題を解決するものとして、リンゴ果実抽出物といったバラ科植物果実抽出物を有効成分として含有する、皮膚バリア機能低下抑制用組成物、コーニファイドエンベロープ形成阻害抑制用組成物、トランスグルタミナーゼ発現低下抑制用組成物、トランスグルタミナーゼ活性低下抑制用組成物及びインボルクリン発現低下抑制用組成物を創作することに成功した。本発明は、これらの知見及び成功例に基づき完成された発明である。
【0016】
したがって、本発明の一態様によれば、以下の組成物が提供される。
［１］バラ科植物果実抽出物を有効成分として含有する、皮膚バリア機能低下抑制用組成物。
［２］バラ科植物果実抽出物を有効成分として含有する、コーニファイドエンベロープ形成阻害抑制用組成物。
［３］バラ科植物果実抽出物を有効成分として含有する、トランスグルタミナーゼ発現低下抑制用組成物又はトランスグルタミナーゼ活性低下抑制用組成物。
［４］前記トランスグルタミナーゼは、角化細胞内のトランスグルタミナーゼである、［３］に記載の組成物。
［５］前記トランスグルタミナーゼは、トランスグルタミナーゼ－１である、［３］～［４］のいずれか１項に記載の組成物。
［６］バラ科植物果実抽出物を有効成分として含有する、インボルクリン発現低下抑制用組成物。
［７］前記インボルクリンは、角化細胞内のインボルクリンである、［６］に記載の組成物。
［８］前記バラ科植物果実抽出物がリンゴ果実抽出物である、［１］～［７］のいずれか１項に記載の組成物。
［１］バラ科植物果実抽出物を有効成分として含有する、皮膚バリア機能低下抑制用組成物。
［２］バラ科植物果実抽出物を有効成分として含有する、コーニファイドエンベロープ形成阻害抑制用組成物。
［３］バラ科植物果実抽出物を有効成分として含有する、トランスグルタミナーゼ発現低下抑制用組成物又はトランスグルタミナーゼ活性低下抑制用組成物。
［４］前記トランスグルタミナーゼは、角化細胞内のトランスグルタミナーゼである、［３］に記載の組成物。
［５］前記トランスグルタミナーゼは、トランスグルタミナーゼ－１である、［３］～［４］のいずれか１項に記載の組成物。
［６］バラ科植物果実抽出物を有効成分として含有する、インボルクリン発現低下抑制用組成物。
［７］前記インボルクリンは、角化細胞内のインボルクリンである、［６］に記載の組成物。
［８］前記バラ科植物果実抽出物がリンゴ果実抽出物である、［１］～［７］のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の効果】
【0017】
本発明の一態様の組成物によれば、細胞外カルボニル化タンパク質によってもたらされる、皮膚バリア機能の低下、コーニファイドエンベロープ形成阻害、トランスグルタミナーゼ発現低下、トランスグルタミナーゼ活性低下及び／又はインボルクリン発現低下を抑制することができる。
【0018】
また、本発明の一態様の組成物は、有効成分であるバラ科植物果実抽出物が化粧品成分などとして人体への使用実績が豊富であることから、使用者に日常的かつ安全に利用することができる。
【0019】
本発明の一態様である組成物は、利用態様に応じて、広く汎用的に利用することが期待される。例えば、本発明の一態様である組成物は、化粧水、美容液、乳液、クリームなどの態様をとることにより、スキンケア化粧品として利用することが期待される。また、例えば、本発明の一態様である組成物は、細胞保護効果、抗老化効果（アンチエイジング）、抗酸化効果、抗シワ効果、ラジカル消去効果、肌質維持効果、肌質改善効果、美白効果などの生理的な美容効果、及び／又は「皮膚にうるおいを与える」効果、「皮膚の水分を補い保つ」効果、「皮膚を保護する」効果、「皮膚の乾燥を防ぐ」効果を有する、化粧料として利用することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【発明を実施するための形態】
【0021】
以下、本発明の一態様の組成物の詳細について説明するが、本発明の技術的範囲は本項目の事項によってのみに限定されるものではなく、本発明はその目的を達成する限りにおいて種々の態様をとり得る。
【0022】
本明細書における各用語は、別段の定めがない限り、当業者により通常用いられている意味で使用され、不当に限定的な意味を有するものとして解釈されるべきではない。また、本明細書においてなされている理論や推測は、本発明者らのこれまでの知見や経験によってなされたものであることから、本発明の技術的範囲はこのような理論や推測のみによって拘泥されるものではない。
【0023】
「組成物」は、通常用いられている意味のものとして特に限定されないが、例えば、２種以上の物質が組み合わさってなる物であり、具体的には、有効成分と別の物質とが組み合わさってなるもの、有効成分の２種以上が組み合わさってなるものなどが挙げられ、より具体的には、有効成分の１種以上と固形成分又は溶媒成分の１種以上とが組み合わさってなる固形組成物及び液性組成物などが挙げられる。
「及び／又は」との用語は、列記した複数の関連項目のいずれか１つ、又は２つ以上の任意の組み合わせ若しくは全ての組み合わせを意味する。
「含有量」は、濃度と同義であり、組成物の全体量に対する成分の量の割合を意味する。ただし、成分の含有量の総量は、１００％を超えることはない。本明細書では、別段の定めがない限り、含有量の単位は「質量％（ｗｔ％）」を意味する。
数値範囲の「～」は、本明細書において、その前後の数値を含む範囲であり、例えば、「０質量％～１００質量％」は、０質量％以上であり、かつ、１００質量％以下である範囲を意味する。
「及び／又は」との用語は、列記した複数の関連項目のいずれか１つ、又は２つ以上の任意の組み合わせ若しくは全ての組み合わせを意味する。
「含有量」は、濃度と同義であり、組成物の全体量に対する成分の量の割合を意味する。ただし、成分の含有量の総量は、１００％を超えることはない。本明細書では、別段の定めがない限り、含有量の単位は「質量％（ｗｔ％）」を意味する。
数値範囲の「～」は、本明細書において、その前後の数値を含む範囲であり、例えば、「０質量％～１００質量％」は、０質量％以上であり、かつ、１００質量％以下である範囲を意味する。
【0024】
「皮膚バリア機能低下抑制作用」は、経表皮水分蒸散量の上昇を抑制する作用を意味する。皮膚バリア機能低下は、例えば、細胞外カルボニル化タンパク質が皮膚組織及び／又は角化細胞に接触することにより生じる。
「コーニファイドエンベロープ形成阻害抑制作用」は、コーニファイドエンベロープの形成及び／又は形成されたコーニファイドエンベロープの維持が阻害されることを抑制する作用を意味する。コーニファイドエンベロープ形成阻害は、例えば、細胞外カルボニル化タンパク質が皮膚組織及び／又は角化細胞に接触することにより生じる。
「トランスグルタミナーゼ」は、タンパク質中のグルタミン残基とリシン残基との間にイソペプチド結合を形成してタンパク質の架橋反応を触媒する酵素であれば特に限定されず、例えば、トランスグルタミナーゼ－１、トランスグルタミナーゼ－３及びトランスグルタミナーゼ－５などが挙げられるが、コーニファイドエンベロープ及びリピッドエンベロープの形成に深く関与しているトランスグルタミナーゼ－１であることが好ましい。
「トランスグルタミナーゼ発現低下抑制作用」及び「インボルクリン発現低下抑制作用」は、それぞれの遺伝子の発現量が低減することを抑制する作用、遺伝子産物（タンパク質）の翻訳量が低減することを抑制する作用、及び遺伝子産物の産生が低減することを抑制する作用のうち少なくともいずれか１つの作用をいう。
「トランスグルタミナーゼ活性低下抑制作用」は、トランスグルタミナーゼの活性低下を抑制する作用をいう。
皮膚バリア機能低下抑制作用、コーニファイドエンベロープ形成阻害抑制作用、トランスグルタミナーゼ発現低下抑制作用、トランスグルタミナーゼ活性低下抑制作用及びインボルクリン発現低下抑制作用を総称して「有効作用」とよぶ。有効作用は、これらの作用のいずれか１種、２種、３種、４種又は５種全ての作用をいう。
「コーニファイドエンベロープ形成阻害抑制作用」は、コーニファイドエンベロープの形成及び／又は形成されたコーニファイドエンベロープの維持が阻害されることを抑制する作用を意味する。コーニファイドエンベロープ形成阻害は、例えば、細胞外カルボニル化タンパク質が皮膚組織及び／又は角化細胞に接触することにより生じる。
「トランスグルタミナーゼ」は、タンパク質中のグルタミン残基とリシン残基との間にイソペプチド結合を形成してタンパク質の架橋反応を触媒する酵素であれば特に限定されず、例えば、トランスグルタミナーゼ－１、トランスグルタミナーゼ－３及びトランスグルタミナーゼ－５などが挙げられるが、コーニファイドエンベロープ及びリピッドエンベロープの形成に深く関与しているトランスグルタミナーゼ－１であることが好ましい。
「トランスグルタミナーゼ発現低下抑制作用」及び「インボルクリン発現低下抑制作用」は、それぞれの遺伝子の発現量が低減することを抑制する作用、遺伝子産物（タンパク質）の翻訳量が低減することを抑制する作用、及び遺伝子産物の産生が低減することを抑制する作用のうち少なくともいずれか１つの作用をいう。
「トランスグルタミナーゼ活性低下抑制作用」は、トランスグルタミナーゼの活性低下を抑制する作用をいう。
皮膚バリア機能低下抑制作用、コーニファイドエンベロープ形成阻害抑制作用、トランスグルタミナーゼ発現低下抑制作用、トランスグルタミナーゼ活性低下抑制作用及びインボルクリン発現低下抑制作用を総称して「有効作用」とよぶ。有効作用は、これらの作用のいずれか１種、２種、３種、４種又は５種全ての作用をいう。
【0025】
後述する実施例に示される事実から導き得る事項は以下のとおりである。
皮膚におけるカルボニル化タンパク質（ＣＰ）の局在を確認したところ、ＣＰは高齢者の皮膚において表皮全体に存在することがわかった。このことから、生細胞層も含めた表皮中のＣＰが皮膚保湿機能を低下させると推測した。細胞外ＣＰは表皮細胞内へのＣＰの沈着及び生成を導き、トランスグルタミナーゼ－１（ＴＧＭ１）発現及び活性を抑制した。この事実は、ＣＰが存在する表皮ではＴＧＭ１の活性が低下し、コーニファイドエンベロープ（ＣＥ）及びリピッドエンベロープ（ＣＬＥ）の形成が妨げられている可能性を示唆する。ＣＥの最外層に存在するＣＬＥは、細胞間脂質ラメラ構造体の安定化に寄与するとされている。このことから、ＣＰは角化細胞の分化に影響を及ぼし、角層の成熟不全を誘導することで皮膚保湿機能の低下の一要因になると考えられる。
皮膚におけるカルボニル化タンパク質（ＣＰ）の局在を確認したところ、ＣＰは高齢者の皮膚において表皮全体に存在することがわかった。このことから、生細胞層も含めた表皮中のＣＰが皮膚保湿機能を低下させると推測した。細胞外ＣＰは表皮細胞内へのＣＰの沈着及び生成を導き、トランスグルタミナーゼ－１（ＴＧＭ１）発現及び活性を抑制した。この事実は、ＣＰが存在する表皮ではＴＧＭ１の活性が低下し、コーニファイドエンベロープ（ＣＥ）及びリピッドエンベロープ（ＣＬＥ）の形成が妨げられている可能性を示唆する。ＣＥの最外層に存在するＣＬＥは、細胞間脂質ラメラ構造体の安定化に寄与するとされている。このことから、ＣＰは角化細胞の分化に影響を及ぼし、角層の成熟不全を誘導することで皮膚保湿機能の低下の一要因になると考えられる。
【0026】
先行研究より、細胞外ＣＰは、細胞内の活性酸素種（ＲＯＳ）レベルを上昇し、細胞内の酸化状態を上昇するとされている。したがって、ＴＧＭ１発現が減少する原因の一つとして、ＣＰによるＲＯＳ産生が引き金となり、細胞内にＣＰが生成され、皮膚保湿関連タンパク質が減少する可能性が考えられる。
【0027】
抗酸化力を有するリンゴ果実抽出物のＣＰ生成に対する効果を検証したところ、再構築培養表皮モデルを用いた経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）測定結果からは、ＣＰの存在がＴＥＷＬを上昇させ、リンゴ果実抽出物の前処理によってＴＥＷＬの上昇が抑制される傾向が確認された。したがって、ＣＰは角層バリア機能を低下させるが、リンゴ果実抽出物によって低下を抑制することが明らかとなった。ＣＰがもたらす角層バリア機能の低下は、ＴＧＭ１が関与していると考えられる。さらに、リンゴ果実抽出物の前処理によって細胞内のＣＰの沈着及び／又は生成が抑制されることで、皮膚バリア機能の低下が抑制されたと推測される。以上のことから、リンゴ果実抽出物は表皮中のＣＰの沈着及び／又は生成を抑制し、これに伴ってＴＧＭ１発現減少を抑え、皮膚保湿機能を正常化させることが期待される。
【0028】
本発明の一態様の組成物は、含有するバラ科植物果実抽出物によって、皮膚バリア機能低下抑制作用、コーニファイドエンベロープ形成阻害抑制作用、トランスグルタミナーゼ発現低下抑制作用、トランスグルタミナーゼ活性低下抑制作用及びインボルクリン発現低下抑制作用からなる群から選ばれる少なくとも１種の有効作用を有する。本発明の一態様の組成物は、有効作用を有することにより、代表的には皮膚バリア機能低下抑制用組成物、コーニファイドエンベロープ形成阻害抑制用組成物、トランスグルタミナーゼ発現低下抑制用組成物、トランスグルタミナーゼ活性低下抑制用組成物及びインボルクリン発現低下抑制用組成物の態様をとり、さらには細胞保護用組成物、抗老化用組成物（アンチエイジング用組成物）、抗酸化用組成物、抗シワ用組成物、ラジカル消去用組成物、肌質維持用組成物、肌質改善用組成物、美白用組成物などの態様をとり得る。本発明の別の一態様は、使用個体にバラ科植物果実抽出物を適用して、シワ、乾燥肌などの皮膚異常及び老化を治療、予防、抑制又は改善する方法である。
【0029】
本発明の一態様の組成物は、バラ科植物果実抽出物を有効成分として含有する。バラ科植物（Ｒｏｓａｃｅａｅ）は、例えば、リンゴ、イチゴ、ナシ、ビワ、カリンなどが挙げられるが、抗酸化力を有する多くのポリフェノールを含有することから、リンゴであることが好ましい。
【0030】
リンゴは、リンゴ属（Ｍａｌｕｓ）植物であれば特に限定されないが、例えば、リンゴ（Ｍａｌｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ、Ｍａｌｕｓ ｐｕｍｉｌａ）などが挙げられ、具体的には品種がふじ、王林、紅玉、陸奥、津軽、旭、デリシャス、ジョナゴールド、陽光などであるリンゴなどが挙げられる。以下、バラ科植物果実について、リンゴ果実を例にとり説明する。
【0031】
リンゴ果実の抽出部位は特に限定されず、例えば、全果、果肉、果皮及び種などが挙げられるが、ポリフェノールを多く含む果肉を含む部位であることが好ましい。リンゴ果実は成熟果であっても、未成熟果（幼果）であってもよいが、果肉がポリフェノールを多く含むことから、未成熟果（幼果）であることが好ましく、１個あたりの重量が５ｇ～２０ｇ程度の時期に摘果された未成熟果（幼果）であることがより好ましい。
【0032】
リンゴ果実抽出物は、リンゴ果実を抽出して得たリンゴ果実抽出物であってもよいし、市販のリンゴ果実抽出物であってもよく、特に限定されない。
【0033】
リンゴ果実抽出物を得る方法は、リンゴ果実から多くのポリフェノールを抽出する方法であれば特に限定されず、従来公知の方法を採用できる。リンゴ果実抽出物を得る方法としては、例えば、特開２００５－１７９３７３号公報に記載の方法などを挙げることができる。具体的には、リンゴ果実をエタノール、メタノールといったアルコールと混合して破砕し、そのまま浸漬及び圧搾、又は加熱還流しながら抽出して粗抽出液を得て、次いで得られた粗抽出液を減圧濃縮によりアルコールを除去した後、遠心分離及びろ過、又はヘキサン、クロロホルムなどの有機溶媒による分配及びろ過を行い、清澄抽出液を得て、次いで得られた清澄抽出液をポリフェノールを選択的に吸着及び溶離できる吸着剤を充填したカラムに通すことによりポリフェノール画分を吸着させ、次いで吸着させたカラムに蒸留水を通すことにより洗浄した後、含水エタノールなどのアルコール水溶液をカラムに通すことによりポリフェノール画分を溶出及び回収し、次いで得られたポリフェノール画分を減圧濃縮することによりアルコールを留去して、リンゴ果実抽出物を得ることができる。リンゴ果実抽出物は、噴霧乾燥、凍結乾燥などの乾燥処理に供された、リンゴ果実抽出物粉末であってもよい。
【0034】
市販のリンゴ果実抽出物としては、例えば、ＢＧＧ Ｊａｐａｎ社より「ＡｐｐｌｅＰｈｅｎｏｎ（登録商標）」として販売されており、「ＡｐｐｌｅＰｈｅｎｏｎ（登録商標）アップルフェノンＣ－１００」、「ＡｐｐｌｅＰｈｅｎｏｎ（登録商標）アップルフェノンＳＨ」及び「ＡｐｐｌｅＰｈｅｎｏｎ（登録商標）アップルプロシアニジン」などが挙げられるが、本発明の一態様の組成物を化粧品などの皮膚外用組成物として用いる場合は「ＡｐｐｌｅＰｈｅｎｏｎ（登録商標）アップルフェノンＣ－１００」が好ましい。
【0035】
リンゴ果実抽出物は、カテキン、クロロゲン酸などのフェノールカルボン酸、フロリジンなどのフラボノイド、プロシアニジンなどのカテキン多量体構造物などのポリフェノールを多く含むことが好ましい。リンゴ果実抽出物におけるポリフェノールの含有量は特に限定されないが、例えば、リンゴ果実抽出物の総量に対して９５質量％以上であることが好ましい。
【0036】
リンゴ果実抽出物の含有量は、有効作用が認められる程度であれば特に限定されず、例えば、組成物の形態及び使用態様、期待する作用の程度などによって適宜設定することができるが、本発明の一態様の組成物を皮膚外用組成物として用いる場合は、乾燥質量として、好ましくは０．００００５質量％～１質量％であり、より好ましくは０．０００５質量％～０．１質量％である。
【0037】
本発明の一態様の組成物は、有効作用の程度については特に限定されないが、例えば、バラ科植物果実抽出物を含有しない組成物と比べて、同一条件で測定した場合に、有効作用が認められる程度の作用である。
【0038】
本発明の一態様の組成物が有する有効作用は、後述の実施例に記載される方法によって評価する。概要として、皮膚バリア機能低下抑制作用は、表皮モデルを用いた経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）を測定することにより評価する。コーニファイドエンベロープ形成阻害抑制作用は、ＴＥＷＬ並びに表皮角化細胞におけるトランスグルタミナーゼ及びインボルクリンのｍＲＮＡ量を測定することにより評価する。トランスグルタミナーゼ発現低下抑制作用及びインボルクリン発現低下抑制作用は、表皮角化細胞におけるトランスグルタミナーゼ及びインボルクリンのｍＲＮＡ量を測定することにより評価する。トランスグルタミナーゼ活性低下抑制作用は、表皮角化細胞におけるトランスグルタミナーゼのタンパク質量を測定することにより評価する。なお、「測定すること」には、定量的に確認すること及び定性的に観察することの両方が含まれる。
【0039】
本発明の一態様の組成物の使用個体については特に限定されず、例えば、使用個体は動物、中でも哺乳類が挙げられ、哺乳類としてはヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマなどが挙げられ、これらの中でもヒトであることが好ましい。
【0040】
本発明の一態様の組成物の１回の使用量、１日の使用量、使用期間、使用間隔などの用法及び用量は特に限定されず、使用態様、使用個体の状態などに応じて適宜設定され得る。使用間隔は、例えば、１日に１回、２回、３回又は数回を、一定期間、すなわち１日以上、好ましくは１週間以上、より好ましくは２週間以上、さらに好ましくは１ヶ月以上にわたって継続的に適用することなどが挙げられる。本発明の一態様の組成物の適用は、毎日行うことが好ましいが、期間中継続的に適用する限り、本発明の一態様の組成物を毎日適用しなくてもよい。
【0041】
本発明の一態様の組成物を皮膚外用組成物として用いる場合は、予めリンゴ果実抽出物を水溶性の溶剤に溶解し、次いで所望の含有量になるように添加することにより、液状の組成物とすることができる。
【0042】
本発明の一態様の組成物は、それ自体として、又は他の成分とともに含有することにより、非経口用又は経口用の化粧品、医薬部外品、飲食品、医薬品、動物飼料などのための組成物の形態をとり得るが、有効作用を発揮する対象部位に直接的に適用できることから、非経口用組成物であることが好ましく、化粧品及び医薬部外品のための組成物であることがより好ましい。したがって、本発明の具体的な一態様は、少なくともバラ科植物果実抽出物を有効成分として含有する、化粧品用組成物又は医薬部外品用組成物である。
【0043】
化粧品用組成物は、皮膚に適用される態様であれば、その使用態様については特に限定されず、例えば、スキンケア化粧品、メイクアップ化粧品、フレグランス化粧品、ボディケア化粧品、オールインワン化粧品などが挙げられ、より具体的には化粧水、美容液、乳液、クリーム、ファンデーション、サンスクリーン、パック、ＢＢクリーム、フェースパウダー、ハンドクリーム、クレンジング、洗顔料、化粧下地、コンシーラー、ほほ紅、アイシャドウ、アイライナー、アイブロー、リップ、マスカラ、口紅などが挙げられ、固形状、パウダー状、液状、ゲル状、スプレー状等の形態を取り得る。化粧品用組成物は、有効作用を示すことを通じて、細胞保護効果、抗老化効果（アンチエイジング）、抗酸化効果、抗シワ効果、ラジカル消去効果、肌質維持効果、肌質改善効果、美白効果などの生理的な美容効果、及び／又は化粧品として認められている「皮膚にうるおいを与える」効果、「皮膚の水分を補い保つ」効果、「皮膚を保護する」効果、「皮膚の乾燥を防ぐ」効果、「乾燥による小ジワを目立たなくする」効果を有する、化粧水、美容液、乳液及びクリームであることが好ましい。
【0044】
化粧品用組成物は、本発明の課題を解決し得る限り、バラ科植物果実抽出物に加えて、化粧品に通常用いられ得るその他の成分を含有してもよい。
【0045】
化粧品に通常用いられ得るその他の成分は特に限定されず、例えば、水や有機溶媒などの基剤、油性成分、保湿剤、清涼剤、防腐剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、増粘剤、乳化剤、可溶化剤、美白剤、ビタミン類、その他各種薬効成分、粉体、香料、色材などが挙げられる。化粧品に通常用いられ得るその他の成分の含有量は、本発明の課題解決を妨げない限り、当業者により適宜設定し得る。その他の成分のいくつかについて以下に列挙するが、これらはあくまでも例示であり、限定されるものではない。
【0046】
油性成分としては、例えば、ジエチルヘキサン酸ネオペンチルグリコール、ジカプリン酸ネオペンチルグリコール、トリエチルヘキサノイン、パルミチン酸エチルヘキシル、パルミチン酸イソプロピル、テトライソステアリン酸ペンタエリスリチル、２－エチルヘキサン酸セチル、イソノナン酸イソノニル、イソノナン酸イソトリデシル、セバシン酸ジイソプロピル、テトラ２－エチルヘキサン酸ペンタエリスリチル、コハク酸ジエチルヘキシル、炭素数１２～１５のアルキルベンゾエートなどのエステル油；オクチルドデカノール、オレイルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、イソステアリルアルコール、ヘキシルデカノール、２－デシルテトラデシノール、などの高級アルコール；ジメチコン、メチルシクロポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、メチルハイドロジェンポリシロキサン、高級アルコール変性シリコーン油などのシリコーン油；水添ポリイソブテン、流動パラフィン、軽質イソパラフィン、ワセリン、スクワラン、スクワレン、イソヘキサデカン、イソドデカンなどの直鎖及び分岐鎖の炭化水素油；ウンデシレン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、イソステアリン酸などの高級脂肪酸；液状ラノリンなどの動物油；フルオロポリエーテル、パーフルオロアルキルエーテルシリコーンなどのフッ素油；オリーブ油、ホホバ油、ラベンダー油、月見草油、アボガド油、ツバキ油、マカデミアナッツ油、トウモロコシ油、ナタネ油、卵黄油、ゴマ油、パーシック油、コムギ胚芽油、サザンカ油、ヒマシ油、アマニ油、サフラワー油、綿実油、エゴマ油、大豆油、ピーナッツ油、チャ実油、カヤ種子油、コメヌカ油、コメ胚芽油などの天然油性成分などが挙げられ、これらの１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。油性成分の含有量は、０質量％～４０質量％程度が好ましい。
【0047】
保湿剤としては、例えば、グリセリン、ジグリセリン、トレハロース、ブチレングリコール（ＢＧ）、ジプロピレングリコール（ＤＰＧ）、キシリトール、マルチトール、マルトース、ソルビトール、ブドウ糖、果糖、加水分解エラスチン、乳酸ナトリウム、シクロデキストリン、ピロリドンカルボン酸などが挙げられ、これらの１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。保湿剤の含有量は、０質量％～１５質量％程度が好ましい。
【0048】
清涼剤としては、例えば、エタノールなどの低級アルコール、Ｌ－メントール、カンフル、メントキシプロピルジオールなどが挙げられ、これらの１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。清涼剤の含有量は、０質量％～１０質量％程度が好ましい。
【0049】
防腐剤としては、例えば、プロピルパラベン、メチルパラベン、安息香酸、サリチル酸、石炭酸、ソルビン酸、パラクロロメタクレゾール、ヘキサクロロフェン、塩化ベンザルコニウム、塩化クロルヘキシジン、トリクロロカルバニリド、感光素、フェノキシエタノール、エチルヘキシルグリセリン、アルカンジオールなどが挙げられ、これらの１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。防腐剤の含有量は、０質量％～５質量％程度が好ましい。
【0050】
キレート剤としては、例えば、アラニン、エデト酸２ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、フィチン酸ナトリウム、リン酸３ナトリウムなどが挙げられ、これらの１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。キレート剤の含有量は、０質量％～１質量％程度が好ましい。
【0051】
ｐＨ調整剤としては、例えば、乳酸、クエン酸、グリコール酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸、リンゴ酸ナトリウム、エチドロン酸、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素アンモニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アルギニン、トリエタノールアミン、モノエタノールアミンなどが挙げられ、これらの１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。ｐＨ調整剤の含有量は、０質量％～１質量％程度が好ましい。
【0052】
酸化防止剤としては、例えば、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、ｄ－δ－トコフェロールなどのビタミンＥ及びその誘導体；チオタウリン、メマツヨイグサ抽出液、βカロチン、カテキン化合物、フラボノイド化合物、ポリフェノール化合物などが挙げられ、これらの１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。酸化防止剤の含有量は、０質量％～１質量％程度が好ましい。
【0053】
増粘剤としては、例えば、水溶性高分子が挙げられ、具体的にはヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、アセチル化ヒアルロン酸、アセチル化ヒアルロン酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸ナトリウム、フコイダン、チューベロース多糖体、キサンタンガムなどの水溶性多糖類；カラギーナン、アルギン酸などの天然高分子；クインスシード、オレンジ果皮エキス、チューベロースエキスなどの植物抽出物；カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプンリン酸などの半合成高分子；カルボマー、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸ナトリウム、（メタ）アクリル酸／（メタ）アクリル酸アルキル共重合体などのアクリル酸系ポリマーなどの合成高分子などが挙げられる。増粘剤は、これらの１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。増粘剤の含有量は、０質量％～１質量％であることが好ましい。
【0054】
乳化剤としては、例えば、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤及び非イオン性界面活性剤などが挙げられ、より具体的にはステアリン酸ソルビタン、ジイソステアリン酸ポリグリセリル－１０、トリイソステアリン酸ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンセチルエーテル、自己乳化型モノステアリン酸グリセリル、モノミリスチン酸デカグリセリル、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビット、水素添加大豆リン脂質、ステアロイルグルタミン酸ナトリウム、モノステアリン酸ポリエチレングリコールなどが挙げられ、これらの１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。乳化剤の含有量は、０質量％～５質量％程度が好ましい。
【0055】
可溶化剤としては、例えば、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンフィトステロール、ポリオキシエチレンコレステロールなどが挙げられ、これらの１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。可溶化剤の含有量は、０質量％～５質量％程度が好ましい。
【0056】
化粧品用組成物には、バラ科植物果実抽出物以外の美肌用成分が含まれていてもよい。美肌用成分としては、例えば、胎盤抽出液、グルタチオン、ユキノシタ抽出物、油溶性甘草エキス、アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体、アルブチン、コウジ酸、トラネキサム酸、システイン、カミツレエキス、リノール酸、ルシノール、α－ヒドロキシ酸などの美白剤；ロイヤルゼリー、感光素、コレステロール誘導体、幼牛血液抽出液などの細胞賦活剤；肌荒れ改善剤；ノニル酸ワレニルアミド、ニコチン酸ベンジルエステル、ニコチン酸β－ブトキシエチルエステル、カプサイシン、ジンゲロン、カンタリスチンキ、イクタモール、カフェイン、α－ボルネオール、ニコチン酸トコフェロール、イノシトールヘキサニコチネート、シクランデレート、シンナリジン、トラゾリン、アセチルコリン、ベラパミル、セファランチン、γ－オリザノールなどの血行促進剤；酸化亜鉛などの皮膚収斂剤；イオウ、チアントロールなどの抗脂漏剤などが挙げられ、これらの１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。
【0057】
医薬部外品は、通常知られているとおりのものであれば特に限定されないが、例えば、人体に対する作用が緩和なものであり、医療機器ではなく、かつ、厚生労働大臣の指定するものということができ、具体的には育毛剤、染毛剤、ビタミン剤などが挙げられる。
【0058】
医薬部外品用組成物は、本発明の課題を解決し得る限り、バラ科植物果実抽出物に加えて、医薬部外品に通常用いられ得るその他の成分を含有し得る。その他の成分としては、前述の化粧品成分の他に、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、安定化剤、流動化剤、界面活性剤、着色剤、甘味剤、滑沢剤などの通常の医薬部外品の加工に使用される添加物などを挙げることができる。添加物の使用量は、本発明の課題の解決を妨げない限り特に限定されず、適宜設定され得る。
【0059】
本発明の一態様の組成物のその他の具体的態様は、薬用化粧品用組成物である。薬用化粧品は、医薬部外品に属す、いわゆる薬用化粧品をいう。薬用化粧品用組成物の使用態様、その他の成分の種類及び含有量などは、化粧品用組成物、医薬部外品用組成物と同様に、当業者により適宜設定し得る。
【0060】
本発明の一態様の組成物は、その製造方法について特に限定されず、例えば、化粧品、医薬部外品などの使用態様に応じて、当業者に知られる方法により、バラ科植物果実抽出物と任意にその他の成分とを混合することなどにより、製造することができる。
【0061】
本発明の一態様の組成物は、その使用方法について特に限定されず、例えば、化粧品、医薬部外品などの使用態様に応じて、通常使用される方法を採用することができる。
【0062】
本発明の一態様の組成物は、容器に詰めて密封した容器詰組成物とすることができる。容器は特に限定されないが、例えば、アルミなどの金属、紙、ＰＥ、ＰＰ、ＰＥＴ、ＰＢＴ、ＰＶＣなどのプラスチック、及び／又はガラスなどを、単層又は積層（ラミネート）の状態で使用した、袋、パウチ、パック、箱、ボトル容器、チューブ容器、瓶、缶などの包装容器が挙げられる。容器詰組成物は、製造して得られた組成物を、分注、充填及び／又は個装して、それ自体で独立して、流通におかれて市販され得るものであることが好ましい。
【0063】
以下、本発明を実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではなく、本発明の課題を解決し得る限り、本発明は種々の態様をとることができる。
【実施例】
【0064】
［１．評価方法］
（１－１）ヒト皮膚組織中でのカルボニル化タンパク質（ＣＰ）の局在箇所の確認
ヒト（６３歳及び６８歳の白人女性）の腹部から切除した皮膚組織について、常法に従って凍結薄切切片を作製した。作製した皮膚組織切片を、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－５－ｔｈｉｏｓｅｍｉｃａｒｂａｚｉｄｅ（ＦＴＳＣ）でラベルし、ＣＰを可視化した。
（１－１）ヒト皮膚組織中でのカルボニル化タンパク質（ＣＰ）の局在箇所の確認
ヒト（６３歳及び６８歳の白人女性）の腹部から切除した皮膚組織について、常法に従って凍結薄切切片を作製した。作製した皮膚組織切片を、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－５－ｔｈｉｏｓｅｍｉｃａｒｂａｚｉｄｅ（ＦＴＳＣ）でラベルし、ＣＰを可視化した。
【0065】
（１－２）ＣＰ－ＢＳＡの作製
１００ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と３００ｍＭ アクロレインとを１：１で混合し、３７℃にて４８時間反応させて、ＢＳＡをカルボニル化させた。その後、再生セルロース透析チューブ（「Ｔ１ ＭＷＣＯ３５００」；Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｅｒ社）を用いて透析を行い、未処理のアクロレインを取り除くことによって、ＣＰ－ＢＳＡを含む透析液を得た。得られた透析液について、蛍光強度（Ｅｘ：３６０ｎｍ，Ｅｍ：４６５ｎｍ）を測定することにより、ＣＰ－ＢＳＡの生成を確認した。
１００ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と３００ｍＭ アクロレインとを１：１で混合し、３７℃にて４８時間反応させて、ＢＳＡをカルボニル化させた。その後、再生セルロース透析チューブ（「Ｔ１ ＭＷＣＯ３５００」；Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｅｒ社）を用いて透析を行い、未処理のアクロレインを取り除くことによって、ＣＰ－ＢＳＡを含む透析液を得た。得られた透析液について、蛍光強度（Ｅｘ：３６０ｎｍ，Ｅｍ：４６５ｎｍ）を測定することにより、ＣＰ－ＢＳＡの生成を確認した。
【0066】
（１－３）細胞培養
正常ヒト表皮角化細胞（「ＮＨＥＫ」；Ｋｕｒａｂｏ社）をＨｕｍｅｄｉａ－ＫＧ２培地（Ｋｕｒａｂｏ社）を用いて、９６ウェルプレート（培養容器）中で３７℃にて５％ＣＯ２インキュベーター内で培養した。
正常ヒト表皮角化細胞（「ＮＨＥＫ」；Ｋｕｒａｂｏ社）をＨｕｍｅｄｉａ－ＫＧ２培地（Ｋｕｒａｂｏ社）を用いて、９６ウェルプレート（培養容器）中で３７℃にて５％ＣＯ２インキュベーター内で培養した。
【0067】
（１－４）ＣＰ共存培養表皮細胞の細胞内酸化状態
ＮＨＥＫ細胞を、５０μｇ／ｍＬ、７５μｇ／ｍＬ若しくは１００μｇ／ｍＬ ＢＳＡの存在下；５０μｇ／ｍＬ、７５μｇ／ｍＬ若しくは１００μｇ／ｍＬ ＣＰ－ＢＳＡの存在下；又はいずれも添加しない条件（コントロール）で、２４時間培養した。次いで、培養プレート中の培地をデカンテーションで除去し、－２０℃のメタノールで細胞固定した。メタノールを除去し、ＰＢＳで３回細胞を洗浄した後、ＰＢＳで２μｍｏｌ／ＬのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２溶液となるように希釈した溶液を加えて、３７℃、１５分間にて、細胞を処理して核内を染色した。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２溶液を除去し、ＰＢＳで３回洗浄した後、Ｍｅｓ－Ｎａ ｂｕｆｆｅｒで２０μｍｏｌ／Ｌとなるように希釈したＦＴＳＣ溶液を加えて、３７℃、１時間にて、細胞を処理して、細胞内のＣＰを染色した。
ＮＨＥＫ細胞を、５０μｇ／ｍＬ、７５μｇ／ｍＬ若しくは１００μｇ／ｍＬ ＢＳＡの存在下；５０μｇ／ｍＬ、７５μｇ／ｍＬ若しくは１００μｇ／ｍＬ ＣＰ－ＢＳＡの存在下；又はいずれも添加しない条件（コントロール）で、２４時間培養した。次いで、培養プレート中の培地をデカンテーションで除去し、－２０℃のメタノールで細胞固定した。メタノールを除去し、ＰＢＳで３回細胞を洗浄した後、ＰＢＳで２μｍｏｌ／ＬのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２溶液となるように希釈した溶液を加えて、３７℃、１５分間にて、細胞を処理して核内を染色した。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２溶液を除去し、ＰＢＳで３回洗浄した後、Ｍｅｓ－Ｎａ ｂｕｆｆｅｒで２０μｍｏｌ／Ｌとなるように希釈したＦＴＳＣ溶液を加えて、３７℃、１時間にて、細胞を処理して、細胞内のＣＰを染色した。
【0068】
ＦＴＳＣ溶液を除去し、ＰＢＳで３回洗浄した後、ＰＢＳを１００μＬ／ウェルを加えて、蛍光強度（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２はＥｘ：３４０ｎｍ，Ｅｍ：４６５ｎｍ；ＦＴＳＣは４８５ｎｍ，Ｅｍ：５３５ｎｍ）を測定した。
【0069】
（１－５）遺伝子発現測定（リアルタイムＰＣＲ）
上記１－４と同様にＮＨＥＫ細胞を１５０μｇ／ｍｌ ＣＰ－ＢＳＡ若しくは１５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ又はいずれも添加しない条件（コントロール）に供した。トータルＲＮＡは、「ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ」（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、細胞から抽出した。逆転写反応は、「ＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ」（Ｔｏｙｏｂｏ社）を用いて、製造業者の指示に従って行った。逆転写反応によって得られたｃＤＮＡについて、「ＳｔｅｐＯｎｅ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ」及び「ＰｏｗｅｒＵｐ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ」（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、製造業者の指示に従って、リアルタイムＰＣＲを行った。
上記１－４と同様にＮＨＥＫ細胞を１５０μｇ／ｍｌ ＣＰ－ＢＳＡ若しくは１５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ又はいずれも添加しない条件（コントロール）に供した。トータルＲＮＡは、「ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ」（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、細胞から抽出した。逆転写反応は、「ＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ」（Ｔｏｙｏｂｏ社）を用いて、製造業者の指示に従って行った。逆転写反応によって得られたｃＤＮＡについて、「ＳｔｅｐＯｎｅ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ」及び「ＰｏｗｅｒＵｐ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ」（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、製造業者の指示に従って、リアルタイムＰＣＲを行った。
【0070】
（１－６）トランスグルタミナーゼ－１（ＴＧＭ１）セルベースＥＬＩＳＡ
プレート中で培養したＮＨＥＫ細胞に１５０μｇ／ｍｌ ＣＰ－ＢＳＡ又は１５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡを含む培地を添加して、細胞培養の条件により細胞を処理した。ｃｏｎｔｒｏｌとしては、ＣＰ－ＢＳＡ及びＢＳＡを含まない培地を用いた。処理２４時間後に４％ パラホルムアルデヒド－ＰＢＳ溶液を用いて細胞の固定を行った。一次抗体として「ａｎｔｉ－ＴＧＭ１ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｂ１６７６５７」（Ａｂｃａｍ社）をＰＢＳで希釈した溶液を各ウェルに添加し、４℃にて一晩反応させた。
プレート中で培養したＮＨＥＫ細胞に１５０μｇ／ｍｌ ＣＰ－ＢＳＡ又は１５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡを含む培地を添加して、細胞培養の条件により細胞を処理した。ｃｏｎｔｒｏｌとしては、ＣＰ－ＢＳＡ及びＢＳＡを含まない培地を用いた。処理２４時間後に４％ パラホルムアルデヒド－ＰＢＳ溶液を用いて細胞の固定を行った。一次抗体として「ａｎｔｉ－ＴＧＭ１ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｂ１６７６５７」（Ａｂｃａｍ社）をＰＢＳで希釈した溶液を各ウェルに添加し、４℃にて一晩反応させた。
【0071】
次いで、一次抗体を除去して、ＰＢＳで細胞を洗浄した後、二次抗体である「ＶＥＣＴＡ ＳＴＡＩＮ Ｅｌｉｔｅ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ｋｉｔ ＰＫ－６１０１」（ＶＥＣＴＯＲ社）を用いた反応を行った。反応後、細胞を３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で発色反応に供し、２Ｍ Ｈ２ＳＯ４で発色反応を停止させた。反応停止後、各ウェルについて、マイクロプレートリーダーで波長４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【0072】
（１－７）モノダンシルカダベリン（ＭＤＣ）を用いたＴＧＭ１活性測定
上記１－６と同様にＮＨＥＫ細胞をＣＰ－ＢＳＡ処理（５０μｇ／ｍＬ、７５μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬ）若しくはＢＳＡ処理（５０μｇ／ｍＬ、７５μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬ）又はいずれも添加しない条件（コントロール）に供した。処理２４時間後に、培地をデカンテーションで除去し、ＭＤＣの最終濃度が７５μＭになるように調製したＭＤＣ含有Ｈｕｍｅｄｉａ－ＫＧ２を１００μＬ／ウェルで添加した。プレートを、３７℃にて、５％ＣＯ２インキュベーター内で２４時間インキュベートした。インキュベート後、培地をデカンテーションで除去した。各ウェルに対して、ＨＢＳＳ（ＧＩＢＣＯ社） ２００μＬで３回洗浄し、次いでＨＢＳＳ １００μＬを添加した状態で蛍光強度を測定した（Ｅｘ．：３３５ｎｍ，Ｅｍ．：５１２ｎｍ）。
上記１－６と同様にＮＨＥＫ細胞をＣＰ－ＢＳＡ処理（５０μｇ／ｍＬ、７５μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬ）若しくはＢＳＡ処理（５０μｇ／ｍＬ、７５μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬ）又はいずれも添加しない条件（コントロール）に供した。処理２４時間後に、培地をデカンテーションで除去し、ＭＤＣの最終濃度が７５μＭになるように調製したＭＤＣ含有Ｈｕｍｅｄｉａ－ＫＧ２を１００μＬ／ウェルで添加した。プレートを、３７℃にて、５％ＣＯ２インキュベーター内で２４時間インキュベートした。インキュベート後、培地をデカンテーションで除去した。各ウェルに対して、ＨＢＳＳ（ＧＩＢＣＯ社） ２００μＬで３回洗浄し、次いでＨＢＳＳ １００μＬを添加した状態で蛍光強度を測定した（Ｅｘ．：３３５ｎｍ，Ｅｍ．：５１２ｎｍ）。
【0073】
（１－８）細胞再播種後のＣＰ共存培養表皮細胞の細胞内酸化状態
上記１－６と同様にＮＨＥＫ細胞をＣＰ－ＢＳＡ処理に供した。処理２４時間後に、細胞外側を洗う目的で細胞をプレートから剥がして回収した。なお、細胞の回収は、ＮＨＥＫ細胞をトリプシン溶液（「ＨＫ－３１２０」；Ｋｕｒａｂｏ社）にて処理した後、トリプシン中和液（「ＨＫ－３２２０」；Ｋｕｒａｂｏ社）に作用させることにより行った。回収した細胞を遠心（１，０００ｒｐｍ、３分間）し、Ｈｕｍｅｄｉａ－ＫＧ２培地を用いて再懸濁させてから、別の培養プレートに播種した細胞を２４時間培養した。次いで培養後の細胞について、上記１－４と同様にして、ＦＴＳＣによりＣＰ染色に供し、蛍光強度を測定した。
上記１－６と同様にＮＨＥＫ細胞をＣＰ－ＢＳＡ処理に供した。処理２４時間後に、細胞外側を洗う目的で細胞をプレートから剥がして回収した。なお、細胞の回収は、ＮＨＥＫ細胞をトリプシン溶液（「ＨＫ－３１２０」；Ｋｕｒａｂｏ社）にて処理した後、トリプシン中和液（「ＨＫ－３２２０」；Ｋｕｒａｂｏ社）に作用させることにより行った。回収した細胞を遠心（１，０００ｒｐｍ、３分間）し、Ｈｕｍｅｄｉａ－ＫＧ２培地を用いて再懸濁させてから、別の培養プレートに播種した細胞を２４時間培養した。次いで培養後の細胞について、上記１－４と同様にして、ＦＴＳＣによりＣＰ染色に供し、蛍光強度を測定した。
【0074】
（１－９）表皮モデルを用いた経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）の測定
表皮モデルとして、ＬａｂＣｙｔｅ ＥＰＩ－ＭＯＤＥＬの６日培養品である「ＬａｂＣｙｔｅ ＥＰＩ－ＭＯＤＥＬ ６Ｄ」（ジャパンティッシュエンジニアリング社）を用いた。表皮モデルを、１時間、アッセイ培地（ジャパンティッシュエンジニアリング社）にて馴化培養した後、リンゴ果実抽出物（ＡＰ）（「ＡｐｐｌｅＰｈｅｎｏｎ（登録商標）アップルフェノンＣ－１００」；ＢＧＧ Ｊａｐａｎ社）を最終濃度が２００μｇ／ｍＬになるように培地に添加し、２４時間培養した（以下、「ＡＰ前処理」とよぶ。）。その後、培地を取り除き、ＢＳＡ又はＣＰ－ＢＳＡを最終濃度が１５０μｇ／ｍＬになるように添加したアッセイ培地（ただし、ｃｏｎｔｒｏｌはアッセイ培地のみ）を添加し、３日間培養した。培養期間中、１日毎にＴＥＷＬを水分蒸散量測定装置（「ＶＡＰＯ ＳＣＡＮ」；日本アッシュ社）で測定した。ＴＥＷＬ測定時は、３７℃に設定したヒートブロック上にフタを開けた状態で２０分間静置させた後に、ＴＥＷＬ測定を行った。
表皮モデルとして、ＬａｂＣｙｔｅ ＥＰＩ－ＭＯＤＥＬの６日培養品である「ＬａｂＣｙｔｅ ＥＰＩ－ＭＯＤＥＬ ６Ｄ」（ジャパンティッシュエンジニアリング社）を用いた。表皮モデルを、１時間、アッセイ培地（ジャパンティッシュエンジニアリング社）にて馴化培養した後、リンゴ果実抽出物（ＡＰ）（「ＡｐｐｌｅＰｈｅｎｏｎ（登録商標）アップルフェノンＣ－１００」；ＢＧＧ Ｊａｐａｎ社）を最終濃度が２００μｇ／ｍＬになるように培地に添加し、２４時間培養した（以下、「ＡＰ前処理」とよぶ。）。その後、培地を取り除き、ＢＳＡ又はＣＰ－ＢＳＡを最終濃度が１５０μｇ／ｍＬになるように添加したアッセイ培地（ただし、ｃｏｎｔｒｏｌはアッセイ培地のみ）を添加し、３日間培養した。培養期間中、１日毎にＴＥＷＬを水分蒸散量測定装置（「ＶＡＰＯ ＳＣＡＮ」；日本アッシュ社）で測定した。ＴＥＷＬ測定時は、３７℃に設定したヒートブロック上にフタを開けた状態で２０分間静置させた後に、ＴＥＷＬ測定を行った。
【0075】
（１－１０）表皮モデルにおけるＣＰ染色
上記１－９において３日間培養した後の表皮モデルについて、常法に従って凍結薄切切片を作製した。作製した表皮モデル切片を、ＦＴＳＣでラベルし、ＣＰを可視化した。
上記１－９において３日間培養した後の表皮モデルについて、常法に従って凍結薄切切片を作製した。作製した表皮モデル切片を、ＦＴＳＣでラベルし、ＣＰを可視化した。
【0076】
（１－１１）統計処理
統計分析ソフトには「４Ｓｔｅｐエクセル統計 第４版」（オーエムエス出版社）に付属のＥｘｃｅｌアドインソフト「Ｓｔａｔｃｅｌ４」を使用した。検定としては、Ｔｕｋｅｙ－ｋｒａｍｅｒ多重比較検定を行った。
統計分析ソフトには「４Ｓｔｅｐエクセル統計 第４版」（オーエムエス出版社）に付属のＥｘｃｅｌアドインソフト「Ｓｔａｔｃｅｌ４」を使用した。検定としては、Ｔｕｋｅｙ－ｋｒａｍｅｒ多重比較検定を行った。
【0077】
［２．細胞外カルボニル化タンパク質による表皮角化細胞への影響評価］
（２－１）ヒト皮膚中でのＣＰ局在箇所の確認
皮膚組織中でのＣＰの局在を確認するため、高齢者の腹部皮膚から採取した凍結切片を、ＦＴＳＣにて染色した。結果を図１に示す。図１が示すとおり、皮膚組織のうち、表皮層の全層にＣＰ由来の蛍光が確認された。
（２－１）ヒト皮膚中でのＣＰ局在箇所の確認
皮膚組織中でのＣＰの局在を確認するため、高齢者の腹部皮膚から採取した凍結切片を、ＦＴＳＣにて染色した。結果を図１に示す。図１が示すとおり、皮膚組織のうち、表皮層の全層にＣＰ由来の蛍光が確認された。
【0078】
（２－２）細胞外ＣＰによる皮膚保湿関連タンパク質の変化
細胞外ＣＰによる表皮角化細胞への影響を検証するため、ＮＨＥＫ細胞をＣＰ－ＢＳＡ処理に供した。本検証では、ＣＰ－ＢＳＡは、細胞内ではなく、細胞外に存在する、機能不全の状態にある種々のタンパク質を模していることになる。結果を図２Ａ及び図２Ｂに示す。図２Ａが示すとおり、ＣＰ－ＢＳＡ処理したＮＨＥＫ細胞においてＣＰ量が亢進した。また、図２Ｂが示すとおり、ＣＰ－ＢＳＡ処理後に、細胞を洗浄し、培地を交換した場合でも、ＣＰ染色によって細胞は染色された。このことより、表皮角化細胞は、貪食作用などによって、ＣＰ－ＢＳＡを細胞内に取り込むこと、又は細胞膜に沈着若しくは通過する可能性があることがわかった。
細胞外ＣＰによる表皮角化細胞への影響を検証するため、ＮＨＥＫ細胞をＣＰ－ＢＳＡ処理に供した。本検証では、ＣＰ－ＢＳＡは、細胞内ではなく、細胞外に存在する、機能不全の状態にある種々のタンパク質を模していることになる。結果を図２Ａ及び図２Ｂに示す。図２Ａが示すとおり、ＣＰ－ＢＳＡ処理したＮＨＥＫ細胞においてＣＰ量が亢進した。また、図２Ｂが示すとおり、ＣＰ－ＢＳＡ処理後に、細胞を洗浄し、培地を交換した場合でも、ＣＰ染色によって細胞は染色された。このことより、表皮角化細胞は、貪食作用などによって、ＣＰ－ＢＳＡを細胞内に取り込むこと、又は細胞膜に沈着若しくは通過する可能性があることがわかった。
【0079】
続いて、ＣＰが皮膚保湿関連遺伝子に与える影響を調べるため、リアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現解析を行った。結果を図３Ａ及び図３Ｂに示す。図３Ａ及び図３Ｂが示すとおり、ＣＰは、角化細胞の細胞膜におけるコーニファイドエンベロープ（ＣＥ）の形成の中心的な役割を担うＴＧＭ１及びインボルクリン（ＩＮＶ）の遺伝子発現を低減することがわかった。
【0080】
ＴＧＭ１は、角化細胞の細胞膜に結合して、角化とともに発現が亢進し、足場タンパク質間を架橋するとともに、足場タンパク質のグルタミン残基と超長鎖脂肪酸とのエステル結合を媒介する酵素である（例えば、石塚らの文献（Jpn. J. Clin. Immunol., 40 (6) 416-427 (2017) を参照）。これにより、ＴＧＭ１は、ＣＥの形成のみならず、ＣＥの外側にリピッドエンベロープ（ＣＬＥ）が形成することを促進する。したがって、ＴＧＭ１の発現低下又は機能不全は、ＣＥ及びＣＬＥの形成阻害をもたらし、葉状魚鱗癬の原因となり得る。
【0081】
ＩＮＶは、ＣＥ形成の第一段階において、角化細胞の細胞膜側に沈着する足場タンパク質としての機能を担う。ＩＮＶは、ＴＧＭ１の基質であり、ＣＥを形成するとともに、ＣＬＥの足場になり得る。ただし、ＩＮＶ欠損マウスのＣＥは、野生型と比べて形態上は著変がないことが知られており、これによりＣＥ足場タンパク質の代償性が示唆されている。
【0082】
上記の結果及びこれまでに知られている知見より、ＣＰによるＴＧＭ１の発現低下は、ＣＥ形成阻害及び／又はＣＬＥ形成阻害を通じて、皮膚バリア機能の低下をもたらし得ると考え、ＣＰ－ＢＳＡによる角化細胞の細胞膜におけるＴＧＭ１タンパク質の発現量及びＴＧＭ１活性の低下作用を評価した。結果を図４Ａ及び図４Ｂに示す。図４Ａ及び図４Ｂが示すとおり、ＣＰ－ＢＳＡの濃度依存的に、ＴＧＭ１タンパク質の発現量が減少し、ＴＧＭ１活性が減少することを確認した。
【0083】
［３．リンゴ果実抽出物による、細胞外カルボニル化タンパク質の皮膚バリア機能低下の抑制作用］
上記のとおり、ＴＧＭ１はＣＥ形成にとって重要な因子であり、ＴＧＭ１タンパク質の減少及びＴＧＭ１活性の低下により、ＣＥの脆弱化が引き起こされ、皮膚バリア機能の中心を担う角層バリアの形成が阻害されると考えられる。そこで、細胞外ＣＰによる角層バリア形成への影響を評価した。
上記のとおり、ＴＧＭ１はＣＥ形成にとって重要な因子であり、ＴＧＭ１タンパク質の減少及びＴＧＭ１活性の低下により、ＣＥの脆弱化が引き起こされ、皮膚バリア機能の中心を担う角層バリアの形成が阻害されると考えられる。そこで、細胞外ＣＰによる角層バリア形成への影響を評価した。
【0084】
細胞外ＣＰによる再構築培養表皮モデルの経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）の変化を評価した。また、この評価系において、細胞外ＣＰによる表皮モデルにおけるＴＥＷＬの変化に対するリンゴ果実抽出物（ＡＰ）の影響を評価した。結果を表１に示す。また、表１におけるＤａｙ １の結果をグラフ化したものを図５に示す。
【0085】
【表1】
【0086】
表１及び図５に示すとおり、表皮モデルをＣＰ－ＢＳＡで処理して１日後は、ＴＥＷＬは高い値を示した。これにより、細胞外ＣＰは、表皮組織において、皮膚バリア機能の低下をもたらすことがわかった。
【0087】
しかし、ＡＰ前処理によって、ＣＰ－ＢＳＡ処理１日後のＴＥＷＬは低下した。これにより、リンゴ果実抽出物は、表皮組織における細胞外ＣＰによる皮膚バリア機能の低下を抑制することがわかった。Ｄａｙ １の結果から、ＣＰによって角層の成熟の遅れがもたらされていると考えられる。実際のヒトの皮膚では通常、ターンオーバーによって角層が剥がれていく。しかし、表皮モデルでは、角層が剥がれずに重層していく。したがって、表皮モデルでは、Ｄａｙ ２以降はＴＥＷＬ値がそれ以上低下しない限度に達したと考えられる。よって、Ｄａｙ １の結果が、ヒトの皮膚でおきる現象のモデルとなると推測される。
【0088】
【0089】
以上の結果より、次の知見が得られた。
細胞外ＣＰに接触した表皮組織は皮膚バリア機能が低下する。しかし、予め表皮組織にリンゴ果実抽出物を曝しておくと、その後のＣＰが接触することによって生じる皮膚バリア機能の低下は抑制される。また、細胞外ＣＰに接触した角化細胞において、ＣＥ形成に関与するＴＧＭ１及びＩＮＶの発現量が低下し、さらにＴＧＭ１活性が低下する。これにより、細胞外ＣＰによる皮膚バリア機能の低下は、ＴＧＭ１発現低下、ＴＧＭ１活性低下及び／又はＩＮＶ発現低下を通じたＣＥの形成阻害によってもたらされている可能性がある。したがって、リンゴ果実抽出物が皮膚バリア機能の低下を抑制することにより、リンゴ果実抽出物は、ＣＥ形成阻害抑制作用、ＴＧＭ１発現低下抑制作用、ＴＧＭ１活性低下抑制作用及びＩＮＶ発現低下抑制作用を有することが示唆される。
細胞外ＣＰに接触した表皮組織は皮膚バリア機能が低下する。しかし、予め表皮組織にリンゴ果実抽出物を曝しておくと、その後のＣＰが接触することによって生じる皮膚バリア機能の低下は抑制される。また、細胞外ＣＰに接触した角化細胞において、ＣＥ形成に関与するＴＧＭ１及びＩＮＶの発現量が低下し、さらにＴＧＭ１活性が低下する。これにより、細胞外ＣＰによる皮膚バリア機能の低下は、ＴＧＭ１発現低下、ＴＧＭ１活性低下及び／又はＩＮＶ発現低下を通じたＣＥの形成阻害によってもたらされている可能性がある。したがって、リンゴ果実抽出物が皮膚バリア機能の低下を抑制することにより、リンゴ果実抽出物は、ＣＥ形成阻害抑制作用、ＴＧＭ１発現低下抑制作用、ＴＧＭ１活性低下抑制作用及びＩＮＶ発現低下抑制作用を有することが示唆される。
【産業上の利用可能性】
【0090】
本発明の一態様に係る組成物は、皮膚バリア機能低下抑制作用、コーニファイドエンベロープ形成阻害抑制作用、トランスグルタミナーゼ－１発現低下抑制作用、トランスグルタミナーゼ－１活性低下抑制作用及び／又はインボルクリン発現低下抑制作用を通じて、細胞保護効果、抗老化効果（アンチエイジング）、抗酸化効果、抗シワ効果、ラジカル消去効果、肌質維持効果、肌質改善効果、美白効果などを期待する使用個体の美容及び／又は健康に資することができる。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6】
