特許 7382645 双極性ナノ秒パルスの干渉による標的化遠隔電気刺激

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-11-09

(45)【発行日】2023-11-17

(54)【発明の名称】双極性ナノ秒パルスの干渉による標的化遠隔電気刺激

(51)【国際特許分類】

   A61N 1/36 20060101AFI20231110BHJP

   A61N 1/32 20060101ALI20231110BHJP

   A61N 1/362 20060101ALI20231110BHJP

【ＦＩ】

A61N1/36

A61N1/32

A61N1/362

【請求項の数】 26

(21)【出願番号】P 2020508575

(86)(22)【出願日】2018-08-16

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2020-11-05

(86)【国際出願番号】 US2018046823

(87)【国際公開番号】W WO2019036549

(87)【国際公開日】2019-02-21

【審査請求日】2021-05-19

(31)【優先権主張番号】62/546,229

(32)【優先日】2017-08-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】508102233

【氏名又は名称】オールド ドミニオン ユニバーシティ リサーチ ファウンデーション

(74)【代理人】

【識別番号】110001302

【氏名又は名称】弁理士法人北青山インターナショナル

(72)【発明者】

【氏名】パホモフ，アンドレイ，ジー．

(72)【発明者】

【氏名】パホモフ，オルガ，エヌ．

(72)【発明者】

【氏名】シャオ，シュ

【審査官】宮崎 敏長

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２０１４／０１９４９４９（ＵＳ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１０／０２６１９９４（ＵＳ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２００８／０２２８２４４（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｎ １／３２ － Ａ６１Ｎ １／３７８

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

システムにおいて、
第１の電気パルス送達チャネルおよび第２の電気パルス送達チャネルと、
少なくとも１つのパルス発生器であって、前記第１の電気パルス送達チャネルから送達される第１の双極性ナノ秒電気パルス、および前記第２の電気パルス送達チャネルから送達される第２の双極性ナノ秒電気パルスを少なくとも生成するように構成されたパルス発生器と、
前記パルス発生器と動作可能に接続された少なくとも１つの電源と、を具え、
前記システムが、前記第１の双極性ナノ秒電気パルスおよび前記第２の双極性ナノ秒電気パルスを少なくとも重畳させて、前記第１および第２の電気パルス送達チャネルから離れた位置に単極性ナノ秒電気パルスを作り出すように構成されていることを特徴とするシステム。

【請求項2】

請求項１に記載のシステムにおいて、前記第１の電気パルス送達チャネルが第１の少なくとも２つの電極を有し、および／または前記第２の電気パルス送達チャネルが第２の少なくとも２つの電極を有することを特徴とするシステム。

【請求項3】

請求項１または２に記載のシステムにおいて、前記第１の電気パルス送達チャネルおよび／または前記第２の電気パルス送達チャネルが、ニードル電極を有することを特徴とするシステム。

【請求項4】

請求項１乃至３のいずれか一項に記載のシステムにおいて、少なくとも前記第１の双極性ナノ秒電気パルスおよび前記第２の双極性ナノ秒電気パルスのいずれか一方が、１８００ナノ秒以下の持続時間を有することを有することを特徴とするシステム。

【請求項5】

請求項１乃至４のいずれか一項に記載のシステムにおいて、少なくとも前記第１の双極性ナノ秒電気パルスおよび前記第２の双極性ナノ秒電気パルスが、生物学的に無効な双極性パルスであって、前記単極性ナノ秒電気パルスが生物学的に有効な単極性電気パルスであることを特徴とするシステム。

【請求項6】

請求項５に記載のシステムにおいて、
前記生物学的に有効な単極性電気パルスが、前記重畳するステップがなされずに生成された第１または第２の生物学的に無効な双極性電気パルスに比べて、増強された刺激効率を有し、
前記重畳するステップがなされずに生成された第１または第２の生物学的に無効な双極性電気パルスが、前記第１または第２の生物学的に無効な双極性ナノ秒電気パルスの第２の位相が前記第１または第２の生物学的に無効な双極性ナノ秒電気パルスの第１の位相の刺激効果を相殺または低減することによって惹起される相殺効果を誘発し、
前記生物学的に有効な単極性ナノ秒電気パルスの前記増強された刺激効率は、前記相殺効果を相殺または低減することによって惹起されることを特徴とするシステム。

【請求項7】

請求項５または６に記載のシステムにおいて、少なくとも生物学的に無効な前記第１および第２の双極性ナノ秒電気パルスからの電場成分は、方向が反対になるように構成されていることを特徴とするシステム。

【請求項8】

請求項１乃至７のいずれか一項に記載のシステムにおいて、対象者の深部組織を選択的に標的とすること、対象者の神経および筋肉を励起すること、対象者の免疫細胞および内分泌細胞を活性化すること、対象者の細胞を分化させること、対象者のエレクトロポレーション、対象者の心臓ペーシング、対象者の心臓除細動、対象者の筋力トレーニングおよびリハビリテーション、対象者の疼痛を制御すること、対象者のパーキンソン病症状の緩和、対象者の神経筋および精神障害の診断および治療、対象者の深在腫瘍および／または血行性転移のアブレーション、ならびに対象者の深部脳刺激、を必要とする対象者の治療に使用するように前記システムが構成されていることを特徴とするシステム。

【請求項9】

請求項１乃至８のいずれか一項に記載のシステムにおいて、前記第１の電気パルス送達チャネルおよび／または前記第２の電気パルス送達チャネルが、線形アレイ内に整列された電極であって、ステンレス鋼またはタングステンロッドから形成された電極を含むことを特徴とするシステム。

【請求項10】

請求項１乃至９のいずれか一項に記載のシステムにおいて、前記第１の双極性ナノ秒電気パルスおよび前記第２の双極性ナノ秒電気パルスのいずれか一方または両方が、減衰した電気パルスを含むことを特徴とするシステム。

【請求項11】

請求項１乃至１０のいずれか一項に記載のシステムにおいて、前記第１の双極性ナノ秒電気パルスおよび／または前記第２の双極性ナノ秒電気パルスが、正弦波パルス、矩形パルス、または台形パルスであることを特徴とするシステム。

【請求項12】

請求項１乃至１１のいずれか一項に記載のシステムにおいて、少なくとも１つの前記パルス発生器が多相パルス発生器であることを特徴とするシステム。

【請求項13】

請求項１乃至１２のいずれか一項に記載のシステムにおいて、前記第１の双極性ナノ秒電気パルスおよび前記第２の双極性ナノ秒電気パルスの一方または両方が複数の位相を有し、当該複数の位相のうちの少なくとも１つの位相が、前記複数の位相の他の位相と異なる持続時間または振幅を有することを特徴とするシステム。

【請求項14】

請求項１乃至１３のいずれか一項に記載のシステムにおいて、前記第１の双極性ナノ秒電気パルスおよび前記第２の双極性ナノ秒電気パルスの一方または両方が、１つ以上の位相を有することを特徴とするシステム。

【請求項15】

システムにおいて、
第１の少なくとも２つの電極および第２の少なくとも２つの電極を有する電極のアレイと、
１つ以上のパルス発生器であって、前記第１の少なくとも２つの電極から送達される第１セットのパルスと、前記第２の少なくとも２つの電極から送達される第２セットのパルスとを生成し、前記第１セットのパルスと前記第２セットのパルスとを重畳させて、前記電極のアレイから離れた位置に単極性電気パルスをナノ秒の範囲で作り出すように構成されたパルス発生器と、
前記パルス発生器と動作可能に接続された少なくとも１つの電源と、を具え、
前記第１セットのパルスの各パルスの位相の数が、前記第２セットのパルスの各パルスの位相の数と、１つの位相だけ異なることを特徴とするシステム。

【請求項16】

請求項１５に記載のシステムにおいて、前記第１セットのパルスおよび前記第２セットのパルスの少なくとも一方が、二相または三相であることを特徴とするシステム。

【請求項17】

請求項１５または１６に記載のシステムにおいて、前記第１セットのパルスおよび前記第２セットのパルスの少なくとも一方が、双極性であることを特徴とするシステム。

【請求項18】

請求項１５乃至１７のいずれか一項に記載のシステムにおいて、前記第１セットのパルスおよび前記第２セットのパルスが、生物学的に無効なパルスであることを特徴とするシステム。

【請求項19】

請求項１５乃至１８のいずれか一項に記載のシステムにおいて、前記電極のアレイが、ニードル電極のアレイを有することを特徴とするシステム。

【請求項20】

請求項１５乃至１９のいずれか一項に記載のシステムにおいて、１つ以上の前記パルス発生器が、前記第１セットのパルスおよび前記第２セットのパルスがナノ秒の範囲のパルス幅を有するように構成されていることを特徴とするシステム。

【請求項21】

請求項１５乃至２０のいずれか一項に記載のシステムにおいて、前記第１セットのパルスおよび前記第２セットのパルスのいずれか一方または両方が、減衰した電気パルスを含むことを特徴とするシステム。

【請求項22】

請求項１５乃至２１のいずれか一項に記載のシステムにおいて、前記第１セットのパルスおよび前記第２セットのパルスの少なくとも一方が複数の位相を有し、当該複数の位相の少なくとも１つの位相が、前記複数の位相の他の位相と異なる持続時間または振幅を有することを特徴とするシステム。

【請求項23】

請求項１５乃至２２のいずれか一項に記載のシステムにおいて、前記第１セットのパルスおよび前記第２セットのパルスのいずれか一方または両方が、正弦波パルス、矩形パルス、または台形パルスを含むことを特徴とするシステム。

【請求項24】

請求項１５乃至２３のいずれか一項に記載のシステムにおいて、前記第１の少なくとも２つの電極および前記第２の少なくとも２つの電極が、それぞれ、独立した電気パルス送達チャネルに接続されていることを特徴とするシステム。

【請求項25】

請求項１５乃至２４のいずれか一項に記載のシステムにおいて、１つ以上の前記パルス発生器が、前記ナノ秒の範囲のパルスを１８００ナノ秒以下の持続時間を有するように生成するように構成されていることを特徴とするシステム。

【請求項26】

請求項１５乃至２５のいずれか一項に記載のシステムにおいて、前記電源が高電圧電源であることを特徴とするシステム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

政府支援
本発明は、空軍科学研究局により授与されたＦＡ９５５０－１５－１－０５１７のもとに政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に所定の権利を有する。

【0002】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年８月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／５４６，２２９号の利益を主張し、その出願日に依存し、その開示全体は参照により取り込まれるものとする。

【背景技術】

【0003】

電気刺激（ＥＳ）は、さまざまな用途において生物学的機能を操作するために使用される。それにもかかわらず、当技術分野では、例えば、深部組織および器官に対して選択的にＥＳを非侵襲的に標的化する必要性が残っている。

【発明の概要】

【0004】

一態様では、本開示は、生物学的に有効な単極性ナノ秒電気パルスを生成する方法を提供する。本方法は、第１の電極対から生成された第１の生物学的に無効な双極性ナノ秒電気パルスと、第２の電極対から生成された第２の生物学的に無効な双極性ナノ秒電気パルスとを重畳させて、第１および第２の電極対から離れた位置に生物学的に有効な単極性ナノ秒電気パルスを作り出すことを含む。生物学的に有効な単極性ナノ秒電気パルスは、重畳ステップの不在下で生成される第１または第２の生物学的に無効な双極性ナノ秒電気パルスと比較して、増強された刺激効率を有する。重畳ステップの不在下で生成される第１または第２の生物学的に無効な双極性ナノ秒電気パルスは、第１または第２の生物学的に無効な双極性ナノ秒電気パルスの第２の位相が第１または第２の生物学的に無効な双極性ナノ秒電気パルスの第１の位相の刺激効果を相殺または低減することにより惹起される相殺効果を誘発する。

【0005】

いくつかの実施形態では、第１および第２の電極対は、各々、独立したナノ秒電気パルス送達チャネルに接続される。特定の実施形態では、第１および第２の電極対は、各々、線形アレイ内に整列される。いくつかの実施形態では、単極性ナノ秒電気パルスは、対象者に非侵襲的に送達される。任意選択で、単極性ナノ秒電気パルスは、対象者の局在細胞、組織または器官に非侵襲的に送達される。特定の実施形態では、単極性ナノ秒電気パルスは、対象者の局在細胞、組織または器官に非侵襲的に送達される。いくつかの実施形態では、組織は深部組織である。他の実施形態では、単極性ナノ秒電気パルスは、典型的にはｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで試料に送達される。任意選択で、試料は細胞を含む。いくつかの実施形態では、生物学的に有効な単極性ナノ秒電気パルスの増強された刺激効率は、相殺効果の相殺または低減の程度に方向的に比例する。特定の実施形態では、第１および／または第２の生物学的に無効な双極性ナノ秒電気パルスは、二相または三相である。いくつかの実施形態では、第１および／または第２の生物学的に無効な双極性ナノ秒電気パルスは、少なくとも第１の位相と第２の位相とを有し、第１の位相の振幅は、１００／７０／４０％である。

【0006】

別の態様は、本明細書に記載の方法を実施するための装置に関する。さらに別の態様は、エレクトロポレーションを必要とする対象者を治療するためのこのような装置の使用に関する。特定の実施形態では、装置は、これらに限定されないが、疼痛制御、神経または筋興奮、免疫または内分泌細胞の活性化、腫瘍の標的化アブレーション、精神疾患の治療、またはパーキンソン病の治療を含む治療用途において使用される。装置は、例えば、エレクトロポレーションを含む非治療的用途にも使用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0007】

本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付の図面は、特定の実施形態を示し、記述による説明とともに、本明細書に開示された組成および方法の特定の原理を説明するのに役立つ。

【0008】

【図1】図１は、双極性および単極性ｎｓＥＰによるＣａ^２＋活性化を示す。上：一実施形態に従う刺激の形状および振幅。下：ＣＨＯ細胞中のピークＣａ^２＋応答（平均＋／－ｓ．ｅ．、ｎ＝２０～２８）。

【図2】図２は、一実施形態に従う位相化双極性刺激の重畳による遠隔ＥＳの概念を示す。上：Ａ－Ａ’およびＢ－Ｂ’は、２対の接地単離された刺激電極である。破線は、刺激が送達される容積を近似し、領域Ｃ－Ｃ’において重なり合う。下：Ａ－Ａ’とＢ－Ｂ’との間に印加される減衰正弦波は、領域Ｃ－Ｃ’において重畳して単極性パルスとなる。

【図3】図３は、一実施形態に従うＣＡＮＣＡＮ概念を説明する模式図を示す。上：Ａ－Ａ’およびＢ－Ｂ’は、独立した２対のｎｓＥＰ送達電極である。ＡとＢとの間の破線は、各電極対から電場が送達される領域を表し、電場は領域Ｃ－Ｃ’において互いに重なり合って無効となる。下：各電極対は、それ自体は生物学的に非効率的である減衰正弦波（ＤＳＷ）を送達する。Ｂ－Ｂ’からのＤＳＷを位相シフトすると、２つのＤＳＷは、領域Ｃ－Ｃ’において重畳して生物学的に有効な単極性パルスとなる。この領域では、「相殺の相殺」またはＣＡＮＣＡＮが存在する。

【図4】図４Ａ～図４Ｃは、一実施形態に従う、ＣＡＮＣＡＮ実験に使用された例示的な電極モデル化を示す。

【図5】図５Ａ～図５Ｄは、一実施形態に従う、例示的な電場線量測定および無効化効率を示す。

【図6】図６Ａ～図６Ｄは、一実施形態に従い、双極性および単極性ｎｓＥＰの重畳が遠隔的にＣＡＮＣＡＮを惹起することを示す。図６Ａ）４電極線形アレイ内の各電極対から送達されるｎｓＥＰを模式的に示す。チャネル１の電極（１および２）は、二相ｎｓＥＰ（双－ＡＢ）を送達し、チャネル２の電極（３および４）は単相パルス（単－Ｃ）を送達した。単－Ｃの振幅は双－ＡＢの第２の位相の振幅と同じであり、（１００％として設定された）第１の位相の５０％であった。単－Ｃが位相シフトされ、双－ＡＢ送達と同期化されるとき、「ＣＡＮＣＡＮ」暴露とみなされる。また、２つのｎｓＥＰが１０ｍｓ離して送達されるとき、暴露は「非同期化されている」とみなされる。２ａと３ａとの間の矢印は、測定が行われた領域を示す。図６Ｂ）各暴露条件に対する中間の電極対（２および３）を包含する代表的な明視野（ＢＦ、上のパネル）または蛍光（ＹＰ、下のパネル）の画像。縮尺＝５００μｍ。各画像において、左右の円形はそれぞれ電極２および電極３の跡に対応する。電極間のＸ軸（図６ＢのＹＰパネルの左側にある白い破線）に沿って画定された１６個の関心対象領域内でＹＰ取り込みを定量化し、図６Ｃ）に示したように単－Ａ中の局在電場の関数としてプロットした。図６Ｄ）「ＣＡＮＣＡＮ」暴露対「非同期」暴露の比を、電極２と電極３との間の距離の関数として示す。平均±Ｓ．Ｅ．、ｎ＝５。

【図7】図７Ａ～図７Ｇは、一実施形態に従い、例示的な多相ｎｓＥＰの同期化がＣＡＮＣＡＮ効果を改善することを示す。図７Ａ）チャネル１の電極（２および３）は、三相双極性ｎｓＥＰ（双－ＡＢＣ）を送達し、チャネル２の電極（３および４）は、二相ｎｓＥＰ（双－ＤＥ）を送達した。第２の位相および第３の位相（それぞれＢ／ＤおよびＣ／Ｅ）の振幅を各実験セットにおいて調整し、それぞれ、（１００％として設定された）第１の位相の５０％および２５％（図７Ｂおよび図７Ｃ）、７０％および２５％（図７Ｄおよび図７Ｅ）、または７０％および４０％（図７Ｆおよび図７Ｇ）のいずれかとした。電極２と電極３との間のＸ軸（図７Ａの２ａと３ａとの間の矢印）に沿ってＹＰ取り込みを定量化し、単－Ａ中の局在電場の関数としてプロットした（図７Ｂ、図７Ｄ、および図７Ｆ）。図７Ｃ、図７Ｅ、および図７Ｇでは、「ＣＡＮＣＡＮ」暴露と「非同期」暴露との比を、電極間の距離の関数としてプロットした。平均±Ｓ．Ｅ．、ｎ＝５～８。

【発明を実施するための形態】

【0009】

本開示は、電極を挿入することなく、深部組織および器官に対して選択的に電気刺激（ＥＳ）を標的化する方法および関連態様に関し、それは、例えば、ナノ秒持続時間の双極性刺激の局所重畳によって達成される。このパラダイムにより、非侵襲性ＥＳを利用する治療処置および診断処置の浸透深度、選択性、および精度が向上する。３７～３９）、ホスファチジルセリン外面化（３９）、Ｃａ^２＋可動化（３２、３６）、および細胞生存性（３２、３３）を含む異なるエンドポイントに対して、示されている。双極性相殺は、長さ１０μｓ（３２）またはさらには５０μｓ（３８）のパルス分離の間、継続する。対照的に、２つの同じ極性のパルスは、２倍の大きさの透過化を惹起した（３８、４０）。この相殺効果は、ナノ秒電場振動（ＮＥＦＯ）（３４、３９）、および各位相に対して異なる振幅（３９）または持続時間（３７）を有する非対称双極性ｎｓＥＰを含む、異なる持続時間および形状のｎｓＥＰについて観察された。特に、第２の位相の振幅が第１の位相の２３％に低減された場合であっても、ＮＥＦＯに見られるように、効果の相殺が依然として観察された。したがって、双極性相殺は、より長いｍｓＥＰおよびμｓＥＰについて観察されなかった、ｎｓＥＰに特有のロバストで再現性のある現象である（４１～４４）。

【0010】

電気刺激（ＥＳ）は、生物学的機能を操作するために広く使用されている。ＥＳの効果は多様であり、神経および筋興奮、免疫および内分泌細胞の活性化、細胞分化、エレクトロポレーションなどが挙げられる。ＥＳは、心臓ペーシング、除細動、筋肉トレーニングおよびリハビリテーション、疼痛制御、パーキンソン病症状の緩和、神経筋および精神疾患の診断および治療を含む、十分に確立された臨床用途を有する。これまで、脳内または体内の特定の領域に正確にＥＳを標的化する唯一の方法は、挿入されたまたは埋め込まれた電極を用いた直接的な刺激による。電極配置に関連する組織損傷、疼痛、出血、感染および炎症のリスクは、患者の検査、疾患診断、および埋め込み手術を妥当としない治療に対するこの技術の使用を制限している。

【0011】

本開示は、深部標的の選択的で、非侵襲的で、局在化されたＥＳを可能にするパラダイムを提供する。特定の実施形態では、本開示は、ナノ秒電気パルス（ｎｓＥＰ）の固有の特性を使用して、刺激極性の反転に続くそれらの刺激効果を相殺することに関する。いくつかの実施形態では、双極性ｎｓＥＰの第２の位相が第１の位相の刺激効果を相殺し、したがって、双極性刺激全体がそれの半分よりも弱くなる（図１）。そして、２つの双極性刺激を重畳させて単極性刺激にすると、相殺を相殺し（ＣＡＮＣＡＮ）、刺激効率を回復させる。図２の例は、２つの減衰正弦波が、電極から離れた領域Ｃ－Ｃ’に単極性刺激をどのように生成するかを示している。こうして、ＣＡＮＣＡＮは、電極から離れた位置でＥＳを選択的に可能にする。

【0012】

ＣＡＮＣＡＮ効果は、双極性相殺の現象に基づく。実施例にも記載されるように、多様な細胞型（ＣＨＯ、Ｕ９３７、心筋細胞）において、さまざまなエンドポイント（Ｃａ^２＋可動化、色素取り込み、膜導電性、細胞生存、ホスファチジルセリンの外面化）を使用して、および異なる持続時間および形状のｎｓＥＰに対して、双極性相殺が繰り返し実証されている。

【0013】

本明細書に記載されているように、本方法および関連態様は、最少破壊的（例えば、非侵襲性）である。競合的アプローチは、典型的には、細胞を分離し、スピン処理して異なる培地に移すことを必要とする。これらの手順は、エレクトロポレーションされた細胞に対して有害または致死的であり、それにより、トランスフェクトされた細胞の収率を低下、または実験を実行不可能にする。本明細書に開示される本方法および関連態様には、典型的には、既存のアプローチよりも少ない処理ステップ、より低いコスト、およびより少ない細胞が関与する。加えて、本明細書に開示される本方法および関連態様にはまた、一貫してかつ正確に規定された電場の使用、効率的な媒地交換および薬物の適用／除去、ならびに無菌状態への追加も関与する。

【0014】

エレクトロポレーション（または電気透過化）は、高電圧電気パルス（ＥＰ）に曝されると生じる膜透過性の増加と説明される（４、５）。エレクトロポレーションは、遺伝子電気転写（８）、電気化学療法（９）、および非可逆的エレクトロポレーションまたはＣａ^２＋エレクトロポレーションによる腫瘍アブレーション（１０、１１）を含む多くの生物医学的用途を有する。従来のエレクトロポレーションプロトコルは、ミリ秒およびマイクロ秒の持続時間のＥＰ（それぞれ、ｍｓＥＰおよびμｓＥＰ）を利用しているが、より最近の研究は、ナノ秒持続時間のＥＰ（ｎｓＥＰ）に焦点を当てている（５、１２、１３）。ｎｓＥＰは、血漿膜中のナノメートルサイズの細孔の形成（１４～１６）、ならびに細胞内膜構造（１７～２１）、細胞骨格再編成およびリン脂質スクランブリング（２１～２４）、Ｃａ^２＋可動化（２０、２５、２６）、および細胞死経路の誘導（２７～３１）を含む、ｍｓＥＰおよびμｓＥＰと比較して、細胞において明確な効果を有する。

【0015】

ｎｓＥＰに固有であって、より長いｍｓＥＰおよびμｓＥＰと明確に区別される特徴が、最近報告された（３２～３９）。双極性ｎｓＥＰに暴露された細胞は、同じ総持続時間の単極性ｎｓＥＰと比較して、エレクトロポレーションが少なく、より良好な細胞生存性を有した（３３）。同様に、単極性パルスの２倍の持続時間の双極性ｎｓＥＰは、２倍のエネルギーを送達するにもかかわらず、膜透過化は少なかった（３２）。電場反転による生体効果の減衰は、「双極性相殺」と呼ばれている。これは、第１のパルスの完了後に第２の反対極性パルスを印加することで、第１のパルスの効果を取り消すまたは「相殺」することができるからである。双極性相殺は、複数の細胞型において、ならびに膜を横切る分子およびイオンの輸送（３３、３４、３７～３９）、ホスファチジルセリン外面化（３９）、Ｃａ^２＋可動化（３２、３６）、および細胞生存性（３２、３３）を含む異なるエンドポイントに対して、示されている。双極性相殺は、長さ１０μｓ（３２）またはさらには５０μｓ（３８）のパルス分離の間、継続する。対照的に、２つの同じ極性のパルスは、２倍の大きさの透過化を惹起した（３８、４０）。この相殺効果は、ナノ秒電場振動（ＮＥＦＯ）（３４、３９）、および各位相に対して異なる振幅（３９）または持続時間（３７）を有する非対称双極性ｎｓＥＰを含む、異なる持続時間および形状のｎｓＥＰについて観察された。特に、第２の位相の振幅が第１の位相の２３％に低減された場合であっても、ＮＥＦＯに見られるように、効果の相殺が依然として観察された。したがって、双極性相殺は、より長いｍｓＥＰおよびμｓＥＰについて観察されなかった、ｎｓＥＰに特有のロバストで再現性のある現象である（４１～４４）。

【0016】

双極性相殺の現象により、照射電磁パルスからの生物学的効果の欠如が説明され得る（４５～４７）。高周波（ＲＦ）および超広帯域（ＵＷＢ）放射を含む照射電磁パルスは、非常に短いパルス幅（ナノ秒動作有効期間）を有することを特徴とし、本質的に双極性である。細胞増殖および遺伝子毒性（４８、５０、５２、５３）、心臓および神経興奮性（４９、５１）、ならびに心臓血管、神経学、行動性、運動性、および発生効果（４５、４６、５４～５６）に関するものを含むいくつかの研究で、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（４８～５３）およびｉｎ ｖｉｖｏ（５４～５６）の両方において、照射されたＲＦおよびＵＷＢパルスの生物学的効果が調査されている。さまざまな研究からの主な知見は、偽性暴露対照と効果に有意差がないことである。使用した最も強力なパルス暴露でさえ、単に熱応答と一致する効果を生み出した。興味深いことに、「マイクロ波ヒアリング」効果は、パルスＲＦ放射の最も広く受け入れられている唯一の生物効果である（５７）。したがって、ＲＦおよびＵＷＢ放射の生物学的効果の欠如および非効率性は、双極性相殺の結果である可能性が高い。

【0017】

特定の態様では、本開示は、標的化された非侵襲性エレクトロポレーションまたは電気刺激のための双極性ｎｓＥＰの固有の非効率性を克服するためのアプローチを提供する。この概念は、双極性ｎｓＥＰはそれ自体では低い生物学的効率性を有するという事実を利用する。図３に示すように、１対の電極（Α－Α’）間に印加される減衰正弦波（ＤＳＷ）は、生物学的に無効である。（電極Ｂ－Ｂ’間に印加される）位相シフトされた第２のＤＳＷも同様に無効である。しかしながら、２つのＤＳＷを重畳および同期化すると、２対の電極から離れた領域（Ｃ－Ｃ’）内に生物学的に有効な単極性パルスが作り出される。換言すれば、２つの生物学的に無効なＤＳＷを重畳させる効果により、双極性ｎｓＥＰの相殺効果が相殺され、単極性パルスが作り出される。この概念を「相殺の相殺」またはＣＡＮＣＡＮ効果と称する。

【0018】

さまざまな例示的な実施形態を本明細書に記載するが、特許請求の範囲によって記載されるような開示の範囲から逸脱することなく、多くの変更のうちのいずれもがさまざまな実施形態に対して行い得る。例えば、記載されたさまざまな方法ステップが実行される順序は、代替実施形態ではしばしば変更され得るし、他の代替実施形態では、１つ以上の方法ステップがまとめて省略され得る。さまざまな装置およびシステムの実施形態の任意選択の特徴は、いくつかの実施形態では含まれてもよく、他の実施形態では含まれていなくてもよい。したがって、本開示は、主に例示的な目的で提供され、本明細書に記載されたシステム、装置および方法の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。本開示は、さまざまな実施形態のあらゆる適応または変形をカバーすることを意図している。上記説明を検討することにより、本明細書に記載された実施形態と、本明細書に特に記載されていない他の実施形態との組み合わせが当業者には明らかとなろう。

【実施例】

【0019】

細胞質遊離Ｃａ^２＋の濃度（［Ｃａ^２＋］_ｉ）を、以前に報告されているように^１，２、Ｆｕｒａ－２を用いたレシオメトリック蛍光イメージングによりモニタリングした。簡単に述べると、色素を装填した細胞を、ＩＸ７１顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ａｍｅｒｉｃａ、Ｃｅｎｔｅｒ Ｖａｌｌｅｙ、ＰＡ）に取り付けられたガラス底チャンバに入れた。チャンバに、以下を含む溶液（単位はｍＭ）を連続的にかん流させた：１４０のＮａＣｌ、５．４のＫＣｌ、１．５のＭｇＣｌ_２、２のＣａＣｌ_２、１０のグルコース、および１０のＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３、２９０～３００ｍＯｓｍ／ｋｇ）。Ｃａ^２＋を含まない条件に対しては、ＣａＣｌ_２を２ｍＭのＮａ－ＥＧＴＡで置き換えた。いくつかの実験では、１０μＭのシクロピアゾン酸（ＣＰＡ）とともにプレインキュベートすることにより、Ｃａ^２＋を小胞体（ＥＲ）から枯渇させた。高速波長切替器Ｌａｍｂｄａ ＤＧ４（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡ）を使用して３４０ｎｍおよび３８０ｎｍで交互に、Ｆｕｒａ－２を励起した。発光を５１０ｎｍで測定した。（Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｆｌｏｗｅｒｙ Ｂｒａｎｃｈ、ＧＡ）、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、および０．１μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）。

【0020】

１対の直径０．１ｍｍタングステンロッド^３を有するカバースリップ上の選択された細胞に電気刺激を送達した。ＭＰＣ－２００マニピュレータ（Ｓｕｔｔｅｒ）を用いて、ロッドをカバースリップ表面から３０μｍ上方に正確に配置し、選択された細胞を、ロッド先端間の０．１７５ｍｍの隙間の中央においた。有限要素マクスウェル方程式ソルバＡｍａｚｅ ３Ｄ（Ｆｉｅｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ、Ａｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅ、ＮＭ）を用いた３Ｄシミュレーションによって電場を決定した。ＮｓＥＰを、外部からトリガし、Ｄｉｇｉｄａｔａ １４４０ＡボードおよびＣｌａｍｐｅｘ ｖ．１０．２ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用してのＴＴＬパルスプロトコルによる画像取得と同期させた。ＴＤＳ３０５２オシロスコープ（Ｔｅｋｔｒｏｎｉｘ，Ｂｅａｖｅｒｔｏｎ、ＯＲ）を用いてパルストレースを捕捉した。以下、報告する双極性パルスの振幅は、第１の位相の振幅である。各細胞は一度だけ暴露させた。

【0021】

実施例２
この実施例では、ＣＡＮＣＡＮ概念の実現可能性をさらに試験した。独立した２対のｎｓＥＰ送達電極を使用して、アガロースゲルに埋め込まれたＣＨＯ－Ｋ１細胞の透過化を測定した。２つのｎｓＥＰを同期および重畳させると、各刺激電極対から離れた領域に、単極性パルスのそれに等しい、透過化の増強が惹起されたことが判明した。したがって、独立した２つのｎｓＥＰを重畳させることにより生物学的に有効な単極性パルスを遠隔的に作り出し、ＣＡＮＣＡＮが成功したことを表す概念実証が初めて示された。この技術の最適化は、非侵襲的な深部組織のエレクトロポレーションまたは電気刺激に対して多くの意味を有する。

【0022】

材料および方法
細胞系および培地
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ－Ｋ１）細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入した。細胞を、１０％ウシ胎仔血清（Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｆｌｏｗｅｒｙ Ｂｒａｎｃｈ、ＧＡ）、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、および０．１μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を補充したＦ－１２Ｋ培地（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ Ｃｅｌｌｇｒｏ、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）中で培養した。

【0023】

３次元細胞培地
実験日に、既述の方法（５５）と同様に、細胞をアガロースゲル３次元（３Ｄ）培地に埋め込んだ。簡単に述べると、７ｍＬのＦ－１２Ｋ増殖培地中２％低ゲル化温度アガロース（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で６０ｍｍ皿の底部をコーティングした。細胞を回収し、増殖培地中０．７５％アガロース中に、５ｘ１０^６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁させ、この懸濁液４ｍＬを６０ｍｍ皿内の２％アガロースベース層上に滴下して堆積させた。皿を４℃で５分間インキュベートしてアガロースゼリー化を促進するとともに細胞沈降を防止し、次いで、ｎｓＥＰ暴露前に少なくとも３０分間、インキュベータに移した。ｎｓＥＰ暴露の５分前に、ＹＯ－ＰＲＯ－１ヨウ化物（ＹＰ；ＰＢＳ中１μＭ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を各皿に添加し、３７℃でインキュベートして、色素をアガロースゲル全体にわたって平衡化させた。

【0024】

電極およびｎｓＥＰ暴露
アガロース３Ｄ培地に埋め込まれた細胞へのｎｓＥＰ送達は、線形アレイに配列された２対のステンレス鋼ニードル電極を使用して達成された（図４Ａ；直径１．６６ｍｍで電極間隔は２ｍｍ）。各電極対を独立したｎｓＥＰ送達チャネルに接続し、電極１、２はチャネル１に接続し、電極３、４はチャネル２に接続した（図４Ｃ）。線形アレイの中央に位置する電極２および３はアクティブ（ａ）とし、周囲の電極１および４は接地（ｇ）とした。細胞を含むアガロースゲル中への電極の正確かつ安定した挿入を可能にするために、線形アレイを、マイクロマニピュレータ上に取り付けた。

【0025】

各々が単極性または双極性ｎｓＥＰを生成することができる、最近記載（５９）されたような３つの別個のＭＯＳＦＥＴベースのパルス発生器と、２つの別個の高圧直流電源との組み合わせを使用して、ｎｓＥＰを生成した。各発生器は、各々が充電コンデンサおよびＭＯＳＦＥＴスイッチを含む基本モジュールの２つのスタックから構成され、２つのチャネルによって生成される電場は、同じ方向の成分については加算され、反対の場合は減算され、電極から離れた領域で単極性暴露を生み出し、他の場所で双極性暴露を生み出すという、２つの多相パルスの空間的重畳を利用する。ＣＡＮＣＡＮ概念により、双極性暴露領域、すなわち電極近辺における生物学的効果の減少と、単極性パルスのみが送達される電極間での増強とが保証される。

【0026】

各実験において、細胞を以下の暴露条件のうちの１つとして１００、６００ｎｓのＥＰ（１０Ｈｚ）に暴露した：チャネル１からの単極性、チャネル１からの双極性（二相または三相）、チャネル２からの単極性、チャネル２からの双極性（二相）、「ＣＡＮＣＡＮ」暴露（同期化および位相シフトされたチャネル１およびチャネル２のｎｓＥＰ）、非同期（１０ｍｓ離して送達されたチャネル１およびチャネル２のｎｓＥＰ）、偽性（ｎｓＥＰは送達されない）。正確な比較のために、すべてのｎｓＥＰ暴露および偽性暴露は同じ細胞試料においてランダムな順序で行い、６０ｍｍ皿当たり最高８回の暴露とした。すべてのｎｓＥＰ暴露は、室温（２２±２℃）で行った。

【0027】

ｎｓＥＰ線量測定およびＣＡＮＣＡＮモデル化
実験条件に合致する３Ｄモデルを、市販の有限要素法ソルバＣＯＭＳＯＬ Ｍｕｌｔｉｐｈｙｓｉｃｓ（登録商標）、Ｒｅｌｅａｓｅ５．０（ＣＯＭＳＯＬ Ｉｎｃ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して実施した。

【0028】

２対のステンレス鋼ニードル電極（直径１．６６ｍｍ、高さ３ｃｍ）を、図４Ｂおよび図４Ｃに示すように、線形アレイ（電極間距離２ｍｍ）に配置した。電極を、導電率１．４Ｓ／ｍおよび比誘電率７６を有する溶液に浸漬し、ペトリ皿の底部から１ｍｍ上方に配置した。後者を、比誘電率３．８を有する誘電体シリンダ（直径３５ｍｍ、厚さ２ｍｍ）としてモデル化した。記載されたシステムは、空気球（直径３５ｍｍ）によって囲まれていた。

【0029】

シミュレーションドメインを離散化するように選択された四面体メッシュは、２２４４９．３ｍｍ^３のシミュレーション容積内で、メッシュ要素の最小サイズ０．１０ｍｍ、最大サイズ２．４５ｍｍ、および総要素数４０１，０３８となった。二次要素を溶液ドメイン全体にわたって使用して、０．５４×１０^６の自由度を与えた。

【0030】

電流インターフェースを使用して、定常状態条件におけるマクスウェルの方程式を解いた。

ここで、Ｖは、電場Ｅ＝－∇Ｖおよび電流Ｊ＝σＥを計算するために使用される電位であり、σは培地の導電率である。静電条件下では、培地の分散特性は無視した。

【0031】

実験の間、適切に同期化および遅延された多相矩形パルスを、各々が２つの電極に接続された２つのチャネル（図５Ａ）によって送達した。位相Ａの振幅を基準（１００％）とし、各後続位相の振幅を、Ａの百分率として設定した。２つのパルス暴露を１００／７０／４０％および１００／５０／２５％とモデル化した。

【0032】

シミュレーションにおいては、各位相組み合わせを別個にモデル化した。位相Ａをチャネル１で送達したとき、電極１および４は接地とし、電極２に１Ｖを印加し、電極３は回路から外した。位相ＢおよびＤをそれぞれチャネル１および２で送達したとき、電極１および４は接地とし、－０．７（７０％）Ｖまたは－０．５（５０％）Ｖのいずれかを両電極２および３に印加した。最後に、位相ＣおよびＥをそれぞれチャネル１および２で送達したとき、電極１および４は接地とし、０．４（４０％）Ｖまたは０．２５（２５％）Ｖのいずれかを両電極２および３に印加した。

【0033】

２つの多相パルスを重畳させると、異なる単極性暴露領域および双極性暴露領域が生成される。

【0034】

実験的研究のための線量測定を提供するため、およびＣＡＮＣＡＮ概念を検証するために、図５Ａの電極アレイによって生成された｜Ｅ｜分布の数値シミュレーションを計算した。このアプローチは、２つのチャネルによって生成される電場は、同じ方向の成分については加算され、反対の場合は減算され、電極から離れた領域で単極性暴露を生み出し、他の場所で双極性暴露を生み出すという、２つの多相パルスの空間的重畳を利用する。ＣＡＮＣＡＮ概念により、双極性暴露領域、すなわち電極近辺における生物学的効果の減少と、単極性パルスのみが送達される電極間での増強とが保証される。

【0035】

図５Ｂは、ペトリ皿から３．８ｍｍにある、すなわち細胞層に対応する、電極に垂直なｘｙ平面内の異なる位相組み合わせについての｜Ｅ｜分布を示す。チャネル１のみがアクティブであったとき（図５Ｂ、パネルＡ）、｜Ｅ｜は電極１と電極２との間でより強く、電極４に向かって減衰した。電極３は接地されていないので、電場の歪みのみを生み出した。両チャネルが同じ極性の電圧を送達したとき（図５Ｂ、パネルＢ＋ＤおよびパネルＣ＋Ｅ）、反対方向のＥ成分が減算されて、電極３と電極４との間の領域における｜Ｅ｜が減少した。

【0036】

図５Ｂから、電極２または電極３のいずれかに近い２つの点とそれらの間の中央にある１つの点との３つの点に対して、電場を時間の関数として抽出した。図５Ｃは、位相Ａ（０～６００ｎｓ）中に｜Ｅ｜が最大であったことを示す。後続位相の送達（６００～１８００ｎｓ）中、｜Ｅ｜は電極２と電極３との間の中央で完全に消失し（０ｋＶ／ｃｍ）、単極性パルスをもたらした。一方、電極の縁部付近では、この減少は約２０％であり、双極性暴露を示した。

【0037】

３．６×３．６ｍｍの領域内のこの減少を電極２と電極３との間で定量化した。

【0038】

図５Ｄは、１００／５０％および１００／７０％に対するＲ％を示す。両方の場合で、減少は電極間の中央で最大であり、１００／７０％暴露に対してより急峻な減衰を有した。ｘの関数としてＲ％をプロットするとこの差が強調され（図５Ｄ、右上パネル）、条件１００／７０％条件はより効率的で標的化されたＣＡＮＣＡＮ効果を提供し得ることが示唆される。

【0039】

ｎｓＥＰ暴露後、皿を１５分間カバーしたままにし、次いでＰＢＳで５回洗浄して、すべてのＹＰを除去した。Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｃ９１００ＥＭ－ＣＣＤカメラ（浜松、静岡県、日本）および０．８倍、０．１２ＮＡ対物レンズを備えたＯｌｙｍｐｕｓ ＳＺＸ１６蛍光立体顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ａｍｅｒｉｃａ、Ｈａｍｄｅｎ、ＣＴ）を使用して、電気透過化細胞の画像を取得した。Ｘ－Ｃｉｔｅ Ｓｅｒｉｅｓ １２０Ｑ蛍光光源（Ｅｘｃｅｌｉｔａｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）およびＧＦＰフィルタ（ｅｘ．４６０～４９０ｎｍ／ｅｍ．５１０－）を使用して、ＹＰ発光を検出した。

【0040】

ＭｅｔａＭｏｒｐｈ ７．８．１３ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して、画像を定量化した。電極２と電極３との間のｘ平面に沿って画定された１６個の関心対象領域（ＲＯＩ）内でＹＰ蛍光を測定し、電極間の中央からの距離の関数としてプロットした（ｍｍ、図４Ａ～図４Ｃを参照）。各画像について、各ＲＯＩ内の蛍光強度をバックグラウンド蛍光に対して補正した。データは、ｎ個の独立した実験の平均±ＳＥとして提示する。

【0041】

結果
双極性および単極性のｎｓＥＰの同期化は、エレクトロポレーションの増強を惹起する。

【0042】

ＣＡＮＣＡＮ仮説では、それ自体は非効率的である２つの適切に成形された双極性ｎｓＥＰを重畳および同期させると、生物学的に有効な単極性パルスを遠隔的に回復させる（図３を参照）。これは、電極から離れたある所定の位置では、時間的に互いに一致する各後続の位相の間に生成された電場が互いに無効化し、残るものは、単極性パルスとしての第１の位相だけであるからである。この無効化は、独立した２つのｎｓＥＰからの電場成分が反対方向であるときに発生し、その領域において０ｋＶ／ｃｍの｜Ｅ｜強度を生成する（図５Ａ～図５Ｄならびに材料および方法を参照）。

【0043】

実験的にＣＡＮＣＡＮを試験するための第１のアプローチとして、本発明者らは、２つの反対極性の位相のみを用いた電場無効化の可能性を評価した（図６Ａ～図６Ｄ）。成功するＣＡＮＣＡＮは、少なくとも部分的には、双極性相殺の程度に依存する。したがって、５０％の第２の位相を用いると双極性相殺が最大であることを示した従前の結果に基づいて、第２の位相の振幅を第１位相の５０％とした

【0044】

本発明者らは、ＹＯ－ＰＲＯ－１（ＹＰ）色素の取り込みによってアガロースゲルに埋め込まれたＣＨＯ－Ｋ１細胞における電気透過化を測定した。独立した２対のｎｓＥＰ送達電極を使用し、一方または両方の電極対からの単極性または双極性ｎｓＥＰのいずれかに細胞を暴露した（１００、６００ｎｓ、１０Ｈｚ）。チャネル１の電極（１および２）は、単極性（単－Ａ）または双極性（双－ＡＢ）のｎｓＥＰを送達し、チャネル２の電極（３および４）は、同期して送達されたときに双－ＡＢの第２の位相と一致するように位相シフトされた単極性パルス（単－Ｃ）を送達した（「ＣＡＮＣＡＮ」暴露；図６Ａ）。本発明者らは、双－ＡＢが、電極間（図６Ｂおよび図６Ｃ）の全長に沿って、単－Ａと比較して、透過化を約１／２～１／３に減少させ、３Ｄ培地モデルにおいて、成功した双極性相殺を示すことを見出した。単－Ｃによる透過化は、電極３（チャネル２内のアクティブ電極）付近で最大であり、電極３からの距離が長くなると減少した。双－ＡＢおよび単－Ｃが非同期的に（すなわち、間に１０ｍｓの遅延をもって）送達されたとき、電極間の長さの大部分に沿って、電気透過化効果は双－ＡＢとは違わなかった。電極３に近いほど、チャネル２の電場からの影響が感じられるので、効果は単－Ｃの効果により類似していた。対照的に、双－ＡＢおよび単－Ｃの同期化送達は、電極間の全長にわたって透過化の増強を惹起し、電極間の中央においては、非同期送達よりも最大で約３倍大きかった（図６Ｄ）。特に、中央における透過化の程度は単－Ａ暴露のものと同じであり、電場モデル化の結果と一致した。したがって、これらの知見は、双極性および単極性ｎｓＥＰの同期化送達によって、生物学的に有効な単極性パルスの遠隔生成を実証し、したがって、成功したＣＡＮＣＡＮを明らかにするものである。

【0045】

多相ｎｓＥＰの同期化は、エレクトロポレーションを遠隔的にさらに増強する。

【0046】

先の実験において、本発明者らは、独立した２対の電極から送達される電場を無効化することによって、単極性パルスを遠隔的に生成することが可能であることを示した。したがって、次の実験セットでは、本発明者らは、第３の反対極性位相を追加して、電場無効化、ひいてはＣＡＮＣＡＮの効率を評価した（図７Ａ～図７Ｇ）。チャネル１は、三相双極性ｎｓＥＰ（双－ＡＢＣ）を送達し、チャネル２は、位相ＤおよびＥが双－ＡＢＣからの位相ＢおよびＣとそれぞれ一致するように二相ｎｓＥＰ（双－ＤＥ）を送達した（図７Ａ）。第２の位相の振幅を第１の位相の５０％に維持し、第３の位相を同様に半分に低減して、位相Ａの２５％とした。特に、これらの実験においては、パルス発生器の限界のために、位相ＣおよびＥの振幅は完全に一致せず、したがって、振幅はそれぞれ位相Ａの約２０％および３０％であった。各位相は、目標とされた２５％位相振幅の５％以内であったので、本発明者らは、それでも、わずかに不一致の振幅を用いて実験を行った。

【0047】

本発明者らは、チャネル１からの双－ＡＢＣが透過化の相殺を惹起し、単－Ａと比較してＹＰ取り込みを約１／２～１／３に減少させ、三相ｎｓＥＰで双極性相殺が起こることを見出した（図７Ｂ）。同様に、チャネル２から送達された双－ＤＥでは、単Ｄと比較して透過化が約１／２に減少した。したがって、各双極性ｎｓＥＰはそれ自体では比較的低い生物学的効率を有していた。２つの双極性ｎｓＥＰを非同期的に送達しても、透過化効果は増強されなかった。チャネル１の電極付近では、透過化の程度は双－ＡＢＣと同様であり、電極３に近いほど、両チャネルからの結合された電場の影響は、双－ＡＢＣおよび双－ＤＣからの効果の本質的に加法的な透過化効果となった。この加法的効果は、双－ＤＣの効果は電極２付近では非常に小さく（ゼロに近い）、透過化の程度への寄与は無視し得るので、チャネル１付近では見られなかった。２つの双極性ｎｓＥＰが同期して送達されると、非同期送達と比較して、透過化効果が非常に増強され（約３～４倍大きい、図７Ｂおよび図７Ｃ）、中央において単－Ａのものにより類似していた（かつ実際、より大きかった）。中央における単－Ａ暴露よりも大きい同期化送達による増強された透過化は、位相ＣおよびＥの振幅のわずかな不一致に起因する可能性がある。これは、潜在的に、第３の位相中にＥの不完全な無効化をもたらし、減少せずに生物学的効果全体に寄与した残留電場を生成した可能性がある。それでもなお、本発明者らは、２つの非効率的な双極性ｎｓＥＰを重畳して、生物学的に効率的なｎｓＥＰを遠隔的に作り出すＣＡＮＣＡＮ効果を示す。

【0048】

後続の反対極性の位相の振幅を増大することにより、ＣＡＮＣＡＮが改善される。

【0049】

成功するＣＡＮＣＡＮのための主な目標の１つは、ｎｓＥＰ送達電極付近に、単極性パルスと比較して低い効果を有し、一方、単極性のものと同等の効果を遠隔的に作り出すことである。先の実験では、本発明者らは、電極間の中央に生物学的に等価な単極性ｎｓＥＰをうまく作り出したが、生物学的効果は、それでも、電極付近の単極性パルスと同様であるかまたはそれよりも大きかった。したがって、本発明者らは、ｎｓＥＰパラメータを変更することにより、本発明者らのＣＡＮＣＡＮ効果を改善することを追求した。電場モデル化の結果は、７０％の第２の位相振幅が、５０％の第２の位相振幅よりも、電極付近での電場の無効化を少なくし得ることを予測した（図５Ａ～図５Ｄを参照）。これは、ひいては、２つのｎｓＥＰが同期して送達されたときに、電極付近でより良好な双極性相殺をもたらす可能性がある。したがって、第１のアプローチとして、本発明者らは、第２の位相のみの振幅を位相Ａの７０％に増大し、第３の位相の振幅は２５％のままとした。先の実験のように、チャネル１は双－ＡＢＣ三相ｎｓＥＰを送達し、チャネル２は双－ＤＥ二相ｎｓＥＰを送達した。先の結果と一致して、双－ＡＢＣおよび双－ＤＥは、電極２と電極３との間の全長にわたって、透過化がそれぞれ単－Ａおよび単－Ｄよりも約１／２～１／３に減少した（図７Ｄ）。非同期的に送達された２つは、各双極性ｎｓＥＰと個々に類似した透過化効果を作り出した。すなわち、電極２付近では、透過化の程度は双－ＡＢＣと同様であり、電極３に近いほど、効果は双－ＤＥと同様であった。２つの双極性ｎｓＥＰの送達を同期化することにより、電極間の中央における透過化効果が増強され、それは、非同期送達よりも約２倍大きく（図７Ｅ）、単－Ａのものと同様であった。約２倍の双極性相殺効率を考えると、中央における約２倍の透過化の増強は、完全な電場無効化を仮定した場合に本発明者らが理論的に期待できる最大である。特に、電極に近いほど、透過化の程度は、各チャネルから送達された単極性ｎｓＥＰ（すなわち、チャネル１からの単－Ａおよびチャネル２からの単－Ｄ）よりも低く、電極３付近では非同期送達と違わなかった。

【0050】

次のステップとして、本発明者らは、遠隔ＣＡＮＣＡＮ効果をさらに改善する努力において、双極性相殺効率を向上させることを所望した。これを行うために、本発明者らは、第３の位相の振幅を位相Ａの４０％に増大させ（したがって、第２の位相と同様の程度で低減させ）、これは、ひいては、より良好な双極性相殺を提供し得る。第２の位相の振幅は、先の実験セットのように７０％に維持した。本発明者らは、双－ＡＢＣの第３の位相の振幅を４０％に増大すると、双極性相殺の効率が高まり、電極間の中央において、単－Ａと比較して、透過化が約１／３～１／４だけ減少したことを見出した（図７Ｆ）。二相双－ＤＥは、単－Ｄと比較して、透過化を約１／２～１／３だけ減少させ、位相Ｅの振幅を増大させても、相殺効率はさらに増強されないことを示した。２つのｎｓＥＰが非同期的に送達されたとき、透過化効果は、個々に送達された双極性ｎｓＥＰのいずれとも違わなかった。しかしながら、双－ＡＢＣおよび双－ＤＥの同期化送達は、単－Ａに類似しかつ非同期送達よりも約３倍大きい、電極間の中央における透過化の増強を惹起した（図７Ｇ）ｎｓＥＰの同期送達と非同期送達との効果の差は、双極性相殺の程度と密接に一致し、中央領域における完全な電場無効化を示唆する。先の結果と同様に、電極に近いほど、透過化効果は、いずれかの単極性暴露のそれよりも少なく、非同期送達により類似したものとなった。換言すれば、電極に近いほど、電場無効化は少なく、代わりに、双極性相殺が優勢である。興味深いことに、同期化暴露対非同期化暴露の比をプロットしたときに作られる曲線（図７Ｇ）は、図５Ｄに示したパーセント減少曲線に形状が似ており、電場モデル化の結果をさらに実証した。したがって、第３の位相の振幅を増大させることにより、双極性相殺の効率が高められ、ひいては、電極間の中央におけるＣＡＮＣＡＮ効率が改善および増強された。

【0051】

考察
この研究で、本発明者らは、２つの生物学的に無効な双極性ｎｓＥＰを重畳させて生物学的に有効な単極性パルスとすることによる遠隔エレクトロポレーションを初めて示す。相殺の相殺またはＣＡＮＣＡＮと称されたこの効果は、各双極性ｎｓＥＰの同時発生位相の間に生成される電場が反対方向であり、互いに無効化するときに発生し、電極から離れた領域における単極性暴露のみを残す一方で、他所では双極性のままである。結果的に、ＣＡＮＣＡＮは、標的化エレクトロポレーションのための双極性ｎｓＥＰの固有の非効率性に依存する。独立した２つのｎｓＥＰの送達を同期化することで、非同期ｎｓＥＰ送達（すなわち、１０ｍｓ離して送達される）よりも最高で３倍大きなエレクトロポレーションが遠隔的に惹起された。ＣＡＮＣＡＮによるエレクトロポレーションのこの単離された増強は、さまざまなｎｓＥＰパラメータを用いた異なる実験セットにおいて再現可能に観察された。したがって、本発明者らは、標的化された遠隔エレクトロポレーションを惹起するＣＡＮＣＡＮ概念のための概念実証を提示する。

【0052】

ＣＡＮＣＡＮの効率は、達成される双極性相殺の程度に直接比例することが期待される。したがって、各実験セットでは、本発明者らは、位相の数および振幅を含むｎｓＥＰパラメータを変更して、双極性相殺、ひいてはＣＡＮＣＡＮの効率を試験した。本発明者らは、二相および三相のｎｓＥＰを適用する場合の両方において、成功したＣＡＮＣＡＮを観察した。最も効率的なＣＡＮＣＡＮ効果は、第１の位相の１００／７０／４０％である位相振幅を有する三相ｎｓＥＰを使用したときに発生した（図７Ｆおよび図７Ｇ）。５０％の第２の位相振幅が最良の相殺効率を提供したことを示した本発明者らの先の結果（３９）を本発明者らが考えるならば、これは予想外であった。本発明者らの先の研究の結果に基づいて、本発明者らは、４０％の第２の位相振幅が、５０％の振幅と同様の程度に生体効果を相殺し得ると推測することができる。したがって、第３の位相を４０％の振幅で追加することにより、それ自体で十分な相殺がもたらされ、第２の位相からの効果と組み合わせると、全体的な双極性相殺効率を増強したことが考えられる。特に、本発明者らの実験結果は、電場モデル化においてなされた予測を裏付けた（図５Ａ～図５Ｄ）。異なる位相振幅に対するＥの減少率を定量化すると、第２の位相が第１の位相の７０％であるときに電極付近のＥの減少は少なく、より標的化されたＣＡＮＣＡＮ効果が示唆された。実際、本発明者らの実験結果はこれを実証し、これにより、２つのｎｓＥＰの同期化送達は、双極性相殺が優勢である電極付近では違わないが、双極性相殺の程度に一致して、非同期送達よりも最大で約３倍大きい効果を生み出した。したがって、最大の電場無効化が期待される領域では、ＣＡＮＣＡＮによるエレクトロポレーションの増強は、双極性相殺の程度に基づいて理論的に可能な最大であった。したがって、電場モデル化と実験的アプローチとの組み合わせを使用して、本発明者らは、ＣＡＮＣＡＮによる最も効率的な標的化エレクトロポレーションは、第１の位相の１００／７０／４０％のｎｓＥＰ振幅で起こることを示す。

【0053】

ＣＡＮＣＡＮによる遠隔的な単極性パルスの形成は、深部標的に非侵襲的にアクセスする可能性を提示する。本発明者らの結果はＣＡＮＣＡＮによる遠隔エレクトロポレーションのための概念実証を提示しているが、ＣＡＮＣＡＮ効果は電気刺激に同様に拡張することができる。このように、ＣＡＮＣＡＮの潜在的な生物医学的用途は多数あり、エレクトロポレーションによる深在腫瘍および／または血行性転移のアブレーション、さまざまな神経学的または心理的な疾患のための深部脳刺激（例えば、パーキンソン病、てんかん、またはうつ病）、疼痛制御、および心臓除細動を含む。エレクトロポレーションまたは電気刺激のいずれかを採用する現在の治療的アプローチは、侵襲性であり、接触電極の挿入または埋め込みを必要とする（６０、６１）。したがって、それらは、炎症、感染または出血を含む、手術に関連する通常のリスクを有する。経頭蓋磁気刺激（ＴＭＳ）、経皮電気神経刺激（ＴＥＮＳ）、および経頭蓋直流刺激（ｔＤＣＳ）を含む電気刺激のための非侵襲的技術は、標的に対する精度の欠如および／または不十分な浸透深度のいずれかによって制限されている（６０、６２）。したがって、非侵襲性エレクトロポレーションまたは電気刺激のための技術を開発する必要性は当然である。ある最近の研究では、非侵襲性の深部脳刺激のために、２つの時間的に干渉する電場を使用する可能性が評価された（６３）。彼らは、同時に送達された２つの高周波電場が、脳の海馬層内の位置で神経刺激を惹起することを示した。彼らのアプローチは、音波に関連する長期間の現象に基づく（６４）。つまり、一定の振幅を有する２つの閾値下の刺激が同時に送達されると、それらが加算され、閾値を超えた振幅を有するより低い周波数の振動電場エンベロープを作り出す。換言すれば、彼らのアプローチは、２つの閾値下の刺激を加算して、振幅が閾値を超える刺激を遠隔的に作り出すことを拠り所とする。対照的に、ＣＡＮＣＡＮによる電気刺激またはエレクトロポレーションは、パルスの振幅または持続時間の変化ではなく、代わりに、双極性から単極性へのパルスの形状の変化を独自に拠り所とする。したがって、ＣＡＮＣＡＮ概念は、新規であり、表面組織に危害を与えずに、深部標的を選択的にエレクトロポレーションまたは電気刺激する可能性を提示する。本発明者らの研究は、ＣＡＮＣＡＮのための先端技術の開発の基礎を提供する。一つの潜在的なＣＡＮＣＡＮの開発では、体内深くにある標的に焦点を合わせ得るパルスＲＦ送信器が利用されるであろう。

【0054】

要約すると、本発明者らは、ここに、ＣＡＮＣＡＮ効果による遠隔エレクトロポレーションのための概念実証を提示する。本発明者らは、２つのｎｓＥＰの同期化送達が、非同期送達よりも最大で約３倍大きく、単極性暴露のそれと類似した、エレクトロポレーションの増強を遠隔的に惹起したことを示す。ＣＡＮＣＡＮによるエレクトロポレーションの遠隔増強は、さまざまなｎｓＥＰパラメータを使用して、異なる実験セットにおいて再現可能であった。ＣＡＮＣＡＮ概念の先端技術への進展は、体内深くにある標的を非侵襲的にエレクトロポレーションまたは電気刺激する可能性を提示する。

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３７．Ｖａｌｄｅｚ ＣＭ，ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌ ｂｉｐｏｌａｒ ｎａｎｏｓｅｃｏｎｄ ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｕｌｓｅ ｗｉｄｔｈｓ ｍｏｄｉｆｙ ｂｉｐｏｌａｒ ｃａｎｃｅｌｌａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｒｅｐｏｒｔｓ ７（１）：１６３７２．

【0092】

３８．Ｇｉａｎｕｌｉｓ ＥＣ，Ｃａｓｃｉｏｌａ Ｍ，Ｘｉａｏ Ｓ，Ｐａｋｈｏｍｏｖａ ＯＮ，＆Ｐａｋｈｏｍｏｖ ＡＧ（２０１８）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｕｎｉ－ ｏｒ ｂｉｐｏｌａｒ ｎａｎｏｓｅｃｏｎｄ ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｕｌｓｅｓ：Ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １１９：１０－１９．

【0093】

３９．Ｐａｋｈｏｍｏｖ ＡＧ，ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ｐｈａｓｅ ｏｆ ｂｉｐｏｌａｒ，ｎａｎｏｓｅｃｏｎｄ－ｒａｎｇｅ ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｕｌｓｅｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｔｈｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２２：１２３－１３３．

【0094】

４０．Ｓｅｍｅｎｏｖ Ｉ，Ｃａｓｃｉｏｌａ Ｍ，Ｉｂｅｙ ＢＬ，Ｘｉａｏ Ｓ，＆Ｐａｋｈｏｍｏｖ ＡＧ（２０１８）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｃｌｏｓｅｌｙ ｓｐａｃｅｄ ｐａｉｒｅｄ ｎａｎｏｓｅｃｏｎｄ－ｒａｎｇｅ ｐｕｌｓｅｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２１：１３５－１４１．

【0095】

４１．Ｔｅｋｌｅ Ｅ，Ａｓｔｕｍｉａｎ ＲＤ，＆Ｃｈｏｃｋ ＰＢ（１９９１）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｂｉｐｏｌａｒ ｏｓｃｉｌｌａｔｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｉｅｌｄ： ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＤＮＡ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＮＩＨ ３Ｔ３ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ８８（１０）：４２３０－４２３４．

【0096】

４２．Ｋｏｔｎｉｋ Ｔ，Ｍｉｋｌａｖｃｉｃ Ｄ，＆Ｍｉｒ ＬＭ（２００１）Ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌ ｂｉｐｏｌａｒ ｒｅｃｔａｎｇｕｌａｒ ｐｕｌｓｅｓ．Ｐａｒｔ ＩＩ．Ｒｅｄｕｃｅｄ ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｉｃ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５４（１）：９１ －９５．

【0097】

４３．Ｋｏｔｎｉｋ Ｔ，Ｍｉｒ ＬＭ，Ｆｌｉｓａｒ Ｋ，Ｐｕｃ Ｍ，＆Ｍｉｋｌａｖｃｉｃ Ｄ（２００１）Ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌ ｂｉｐｏｌａｒ ｒｅｃｔａｎｇｕｌａｒ ｐｕｌｓｅｓ．Ｐａｒｔ Ｉ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５４（１）：８３－９０．

【0098】

４４．Ｋｏｔｎｉｋ Ｔ，Ｐｕｃｉｈａｒ Ｇ，Ｒｅｂｅｒｓｅｋ Ｍ，Ｍｉｋｌａｖｃｉｃ Ｄ，＆Ｍｉｒ ＬＭ（２００３）Ｒｏｌｅ ｏｆ ｐｕｌｓｅ ｓｈａｐｅ ｉｎ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ ａｃｔａ １６１４（２）：１９３－２００．

【0099】

４５．Ｓｅａｍａｎ ＲＬ（２００７）Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｏｆ ａｎｉｍａｌｓ ｔｏ ｕｌｔｒａ－ｗｉｄｅｂａｎｄ ｐｕｌｓｅｓ．Ｈｅａｌｔｈ ｐｈｙｓｉｃｓ ９２（６）：６２９－６３４．

【0100】

４６．Ｓｃｈｕｎｃｋ Ｔ，Ｂｉｅｔｈ Ｆ，Ｐｉｎｇｕｅｔ Ｓ，＆Ｄｅｌｍｏｔｅ Ｐ（２０１６）Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｔｔｅｒ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｐｏｗｅｒ ｕｌｔｒａ－ｗｉｄｅｂａｎｄ ｐｕｌｓｅｓ： ａ ｒｅｖｉｅｗ．Ｅｌｅｃｔｒｏｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３５（１）：８４－１０１．

【0101】

４７．Ｐａｋｈｏｍｏｖ ＡＧ，Ａｋｙｅｌ Ｙ，Ｐａｋｈｏｍｏｖａ ＯＮ，Ｓｔｕｃｋ ＢＥ，＆Ｍｕｒｐｈｙ ＭＲ（１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｅ ａｎｄ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍｉｌｌｉｍｅｔｅｒ ｗａｖｅｓ： ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｍａｇｎｅｔｉｃｓ １９（７）：３９３－４１３．

【0102】

４８．Ｐａｋｈｏｍｏｖａ ＯＮ，Ｂｅｌｔ ＭＬ，Ｍａｔｈｕｒ ＳＰ，Ｌｅｅ ＪＣ，＆Ａｋｙｅｌ Ｙ（１９９８）Ｕｌｔｒａ－ｗｉｄｅ ｂａｎｄ ｅｌｅｃｔｒｏｍａｇｎｅｔｉｃ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｄｏｅｓ ｎｏｔ ａｆｆｅｃｔ ＵＶ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｙｅａｓｔ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｍａｇｎｅｔｉｃｓ １９（２）：１２８－１３０．

【0103】

４９．Ｐａｋｈｏｍｏｖ ＡＧ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ ｈｉｇｈ ｐｏｗｅｒ ｍｉｃｒｏｗａｖｅ ｐｕｌｓｅｓ ａｎｄ ａ ｂｒｉｅｆ ＣＷ ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ ｏｎ ｐａｃｅｍａｋｅｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｇ ｈｅａｒｔ ｓｌｉｃｅｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｍａｇｎｅｔｉｃｓ ２１（４）：２４５－２５４．

【0104】

５０．Ｐａｋｈｏｍｏｖ ＡＧ，Ｇａｊｓｅｋ Ｐ，Ａｌｌｅｎ Ｌ，Ｓｔｕｃｋ ＢＥ，＆Ｍｕｒｐｈｙ ＭＲ（２００２）Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｄｏｓｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅｓ ｆｏｒ ｂｉｏｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ－ｗａｖｅ ａｎｄ ｈｉｇｈ－ｐｅａｋ ｐｏｗｅｒ ｍｉｃｒｏｗａｖｅ ｅｍｉｓｓｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ｇｅｌ－ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｍａｇｎｅｔｉｃｓ ２３（２）：１５８－１６７．

【0105】

５１．Ｐａｋｈｏｍｏｖ ＡＧ，Ｄｏｙｌｅ Ｊ，Ｓｔｕｃｋ ＢＥ，＆Ｍｕｒｐｈｙ ＭＲ（２００３）Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｈｉｇｈ ｐｏｗｅｒ ｍｉｃｒｏｗａｖｅ ｐｕｌｓｅｓ ｏｎ ｓｙｎａｐｔｉｃ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｌｏｎｇ ｔｅｒｍ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｍａｇｎｅｔｉｃｓ ２４（３）：１７４－１８１．

【0106】

５２．Ｃｈｅｍｅｒｉｓ ＮＫ，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｌａｃｋ ｏｆ ｄｉｒｅｃｔ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｌｏｏｄ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ａｆｔｅｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ ｈｉｇｈ ｐｏｗｅｒ ｍｉｃｒｏｗａｖｅ ｐｕｌｓｅｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｍａｇｎｅｔｉｃｓ ２７（３）：１９７－２０３．

【0107】

５３．Ｉｂｅｙ ＢＬ，ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ ｈｉｇｈ ｐｅａｋ ｐｏｗｅｒ ｍｉｃｒｏｗａｖｅ ｓｙｓｔｅｍｓ：Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｍａｇｎｅｔｉｃｓ．

【0108】

５４．Ｊａｕｃｈｅｍ ＪＲ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｕｌｔｒａ－ｗｉｄｅｂａｎｄ ｅｌｅｃｔｒｏｍａｇｎｅｔｉｃ ｐｕｌｓｅｓ： ｌａｃｋ ｏｆ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｈｅａｒｔ ｒａｔｅ ａｎｄ ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｄｕｒｉｎｇ ｔｗｏ－ｍｉｎｕｔｅ ｅｘｐｏｓｕｒｅｓ ｏｆ ｒａｔｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｍａｇｎｅｔｉｃｓ １９（５）：３３０－３３３．

【0109】

５５．Ｌｕ ＳＴ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｈｉｇｈ ｐｅａｋ ｐｏｗｅｒ ｍｉｃｒｏｗａｖｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｒｅｔｉｎａ ｏｆ ｔｈｅ ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｍａｇｎｅｔｉｃｓ ２１（６）：４３９－４５４．

【0110】

５６．Ｃｏｂｂ ＢＬ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎｅｕｒａｌ ａｎｄ ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ ｔｅｒａｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｔｓ ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ ｕｌｔｒａ－ｗｉｄｅｂａｎｄ ｅｌｅｃｔｒｏｍａｇｎｅｔｉｃ ｆｉｅｌｄｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｍａｇｎｅｔｉｃｓ ２１（７）：５２４－５３７．

【0111】

５７．Ｌｉｎ ＪＣ ＆Ｗａｎｇ Ｚ（２００７）Ｈｅａｒｉｎｇ ｏｆ ｍｉｃｒｏｗａｖｅ ｐｕｌｓｅｓ ｂｙ ｈｕｍａｎｓ ａｎｄ ａｎｉｍａｌｓ： ｅｆｆｅｃｔｓ，ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，ａｎｄ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｓ．Ｈｅａｌｔｈ ｐｈｙｓｉｃｓ ９２（６）：６２１－６２８．

【0112】

５８．Ｍｕｒａｔｏｒｉ Ｃ，Ｐａｋｈｏｍｏｖ ＡＧ，Ｘｉａｏ Ｓ，＆Ｐａｋｈｏｍｏｖａ ＯＮ（２０１６）Ｅｌｅｃｔｒｏｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ ａｓｓｉｓｔｓ ｃｅｌｌ ａｂｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｎａｎｏｓｅｃｏｎｄ ｐｕｌｓｅｄ ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｉｅｌｄ ｉｎ ３Ｄ ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｒｅｐｏｒｔｓ ６：２３２２５．

【0113】

５９．Ｈ．Ａ．Ｒｙａｎ ＳＨ，Ｅ．Ｙａｎｇ，Ｃ．Ｚｈｏｕ ａｎｄ Ｓ．Ｘｉａｏ（２０１８）Ｈｉｇｈ－Ｖｏｌｔａｇｅ，Ｍｕｌｔｉｐｈａｓｉｃ，Ｎａｎｏｓｅｃｏｎｄ Ｐｕｌｓｅｓ ｔｏ Ｍｏｄｕｌａｔｅ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ｏｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｉｒｃｕｉｔｓ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（９９）：１－１３．

【0114】

６０．Ｎｉｚａｒｄ Ｊ，Ｌｅｆａｕｃｈｅｕｒ ＪＰ，Ｈｅｌｂｅｒｔ Ｍ，ｄｅ Ｃｈａｕｖｉｇｎｙ Ｅ，＆Ｎｇｕｙｅｎ ＪＰ（２０１２）Ｎｏｎ－ｉｎｖａｓｉｖｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｐａｉｎ．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｍｅｄｉｃｉｎｅ １４（７４）：２１－３１．

【0115】

６１．Ｍｉｋｌａｖｃｉｃ Ｄ ＆Ｄａｖａｌｏｓ ＲＶ（２０１５）Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ（ＥＣＴ）ａｎｄ ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ（ＩＲＥ）－ａｄｖａｎｃｅｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｉｎｇ ｄｅｅｐ－ｓｅａｔｅｄ ｔｕｍｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｎｌｉｎｅ １４ Ｓｕｐｐｌ ３：１１．

【0116】

６２．Ｒｏｔｈ Ｙ，Ａｍｉｒ Ａ，Ｌｅｖｋｏｖｉｔｚ Ｙ，＆Ｚａｎｇｅｎ Ａ（２００７）Ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｉｅｌｄ ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ ｂｙ ｔｒａｎｓｃｒａｎｉａｌ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｆｉｇｕｒｅ－８ ａｎｄ ｄｅｅｐ Ｈ－ｃｏｉｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ： ｏｆｆｉｃｉａｌ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｇｒａｐｈｉｃ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２４（１）：３１－３８．

【0117】

６３．Ｇｒｏｓｓｍａｎ Ｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ Ｄｅｅｐ Ｂｒａｉｎ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｖｉａ Ｔｅｍｐｏｒａｌｌｙ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｆｉｅｌｄｓ．Ｃｅｌｌ １６９（６）：１０２９－１０４１ ｅ１０１６．

【0118】

６４．Ｄｍｏｃｈｏｗｓｋｉ Ｊ ＆Ｂｉｋｓｏｎ Ｍ（２０１７）Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ Ｇｏｅｓ Ｄｅｅｐ．Ｃｅｌｌ １６９（６）：９７７－９７８．

【0119】

明確化および理解のために、上述の本発明をある程度詳細に説明してきたが、本開示を一読することで、本発明の真の範囲から逸脱することなく、形態および詳細におけるさまざまな変更を行い得ることが当業者には明らかであろう。例えば、上述したすべての技術および装置は、さまざまな組み合わせで使用することができる。本出願において引用されたすべての刊行物、特許、特許出願、および／または他の文献は、各刊行物、特許、特許出願、および／または他の文献が、あらゆる目的のために参照により組み込まれていると個々に示されているのと同じ程度に、あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図7F】

【図7G】