特許 7382716 非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の予防または治療用医薬の調製におけるトリアセチル－３－ヒドロキシフェニルアデノシンの使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-11-09

(45)【発行日】2023-11-17

(54)【発明の名称】非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の予防または治療用医薬の調製におけるトリアセチル－３－ヒドロキシフェニルアデノシンの使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/7076 20060101AFI20231110BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20231110BHJP

   A61K 9/20 20060101ALI20231110BHJP

   A61K 9/48 20060101ALI20231110BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20231110BHJP

【ＦＩ】

A61K31/7076

A61K9/08

A61K9/20

A61K9/48

A61P1/16

【請求項の数】 5

(21)【出願番号】P 2018533743

(86)(22)【出願日】2016-12-28

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2019-01-10

(86)【国際出願番号】 CN2016112623

(87)【国際公開番号】W WO2017114413

(87)【国際公開日】2017-07-06

【審査請求日】2019-12-24

【審判番号】

【審判請求日】2021-10-20

(31)【優先権主張番号】201511034199.0

(32)【優先日】2015-12-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】522337772

【氏名又は名称】北京谷神生命健康科技有限公司

【氏名又は名称原語表記】Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｇｕｓｈｅｎ Ｌｉｆｅ Ｈｅａｌｔｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．

【住所又は居所原語表記】Ｒ１２０２， １１ｔｈ Ｆｌｏｏｒ， Ｂｕｉｌｄｉｎｇ Ｎｏ．１， Ｎｏ．１０５ Ｙａｏｊｉａｙｕａｎ Ｒｏａｄ， Ｃｈａｏｙａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００２６， Ｃｈｉｎａ

(73)【特許権者】

【識別番号】591120284

【氏名又は名称】中国医学科学院葯物研究所

【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＭＡＴＥＲＩＡ ＭＥＤＩＣＡ， ＣＨＩＮＥＳＥ ＡＣＡＤＥＭＹ ＯＦ ＭＥＤＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ

【住所又は居所原語表記】ＮＯ．１， Ｘｉａｎ Ｎｏｎｇ Ｔａｎ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｘｕａｎｗｕ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】100088580

【弁理士】

【氏名又は名称】秋山 敦

(72)【発明者】

【氏名】朱 海波

(72)【発明者】

【氏名】史 会杰

【合議体】

【審判長】藤原 浩子

【審判官】田中 耕一郎

【審判官】吉田 佳代子

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１２－５１９７１４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００７－２１０９２６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１１－１９６８７４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００５－１３２８１２（ＪＰ，Ａ）

【文献】Ｌｉｐｉｄｓ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ， ２０１１， １０， ｐ．６７（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｉｐｉｄｗｏｒｌｄ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／１０／１／６７）

【文献】ＰＬｏＳ Ｏｎｅ， ２０１２， ７（３）， ｅ３２１１５

【文献】日本消化器病学会雑誌、２０１４年、１１１巻１号、４～１３頁

【文献】肝臓、１９８１年、２２巻１号、１２３頁

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

A61K,A61P

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の治療用医薬の調製における式（I）で表されるトリアセチル－３－ヒドロキシフェニルアデノシンまたはその薬学的に許容可能な塩の使用であって、
前記医薬は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の治療において肝細胞の損傷を抑える肝機能保護医薬であって、
非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を有する患者に有効量の前記医薬を一日に２回投与することで、前記患者の血漿の総コレステロール（ＴＣ）、トリグリセリド（ＴＧ）、ＬＤＬ－Ｃ（低比重リポタンパク質コレステロール）、ＨＤＬ－Ｃ（高比重リポタンパク質コレステロール）及び遊離脂肪酸（ＦＦＡ）のレベルを低下させることを特徴とする使用。

【化1】

【請求項2】

前記医薬は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の治療において血清アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）のレベルを低下させる肝機能改善医薬であることを特徴とする請求項１に記載の使用。

【請求項3】

前記非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、高カロリー飲食によるものであることを特徴とする請求項１又は２に記載の使用。

【請求項4】

非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の治療用医薬の調製における医薬組成物の使用において、前記医薬組成物は、式（I）で表されるトリアセチル－３－ヒドロキシフェニルアデノシン又はその薬学的に許容可能な塩及びその薬学的に許容可能な担体を含み、
前記医薬は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の治療において肝細胞の損傷を抑える肝機能保護医薬であって、
非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を有する患者に有効量の前記医薬を一日に２回投与することで、前記患者の血漿の総コレステロール（ＴＣ）、トリグリセリド（ＴＧ）、ＬＤＬ－Ｃ（低比重リポタンパク質コレステロール）、ＨＤＬ－Ｃ（高比重リポタンパク質コレステロール）及び遊離脂肪酸（ＦＦＡ）のレベルを低下させることを特徴とする使用。

【化1】

【請求項5】

前記医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、丸剤または注射剤であって、
前記医薬組成物は、徐放性製剤、放出制御製剤または各種の微粒子投薬システムであることを特徴とする請求項４に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、非アルコール性脂肪肝の予防または治療用医薬の調製における、トリアセチル－３－ヒドロキシフェニルアデノシンおよびそれを含有する医薬組成物の使用に関し、医薬技術分野に属する。

【背景技術】

【0002】

非アルコール性脂肪肝（ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ，ＮＡＦＬＤ）とは、過度の飲酒およびその他の明らかに肝損傷を与える病気によるものを除く、肝実質細胞損傷および脂肪蓄積を特徴とする臨床病理症候群、インスリン抵抗性（ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ＩＲ）および遺伝的素因と密接に関連する代謝ストレス性の肝損傷を意味し、その病理学的変化はアルコール性肝炎と類似しているが、患者に過度の飲酒歴がない。その構成には、非アルコール性単純脂肪肝（ＮＡＦＬ）、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝線維化、非アルコール性脂肪肝硬変およびそれに関連する肝癌（ＨＣＣ）等が含まれる。中国の経済発展に伴い、人々の飲食の構成や時間が大きく変化して、非アルコール性脂肪肝の発症率が上昇し続けており、また、低年齢化の趨勢を示しており、人類の心身健康に深刻な脅威をもたらす一般的な疾病となった。

【0003】

ＮＡＦＬＤの正確な発症機序は未だに明らになっていないが、比較的に認められているのは「２ヒット」理論である。この理論の２つの段階において、第１ヒットは、高脂肪食の過剰摂取によって分解量が低下して、脂質蓄積が生じ、単純性脂肪肝を形成することである。第２ヒットにおいて、ＩＲは、インスリンの脂肪代謝に対する調節作用を弱化させ、損なわせて、脂質の溶解を増加させ、遊離脂肪酸（ｎｏｎｅｓｔｅｒｉｆｉｅｄ ｆｒｅｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ，ＦＦＡ）の濃度を高め、血中ＦＦＡの肝臓への摂取を高めてしまう。酸化ストレスと脂質過酸化損傷は、脂肪肝の形成および進行過程で重要な作用を行い、脂肪肝が第２ヒットを受けてさらに進行する際の重要な因子である。ミトコンドリアは細胞の呼吸器官であり、活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ）の増大によりミトコンドリアが損傷され、肝臓の脂質蓄積をさらに悪化させる。また、酸化ストレスで生じたラジカルが脂質過酸化（ｌｉｐｉｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ，ＬＰＯ）の損傷反応をもたらし、一連の脂質ラジカルおよび分解生成物であるマロンジアルデヒド（ｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ，ＭＤＡ）を形成するとともに、生体膜の構造と機能を損なわせ、細胞膜の透過性を増加させて、シトクロムＣが流出され、アポプトーシスプロセスを起こし、最終的には肝線維化、肝硬変をもたらし、ひいては肝癌へと進行してしまう。現在も特効薬がなく、通常用いられるスタチン系、フィブラート系等の抗高脂血症剤は、治療効果が低く、毒性副作用が大きい。

【0004】

トリアセチル－３－ヒドロキシフェニルアデノシン（特許番号ＺＬ２００９８０１０１１３１．６、公告番号ＣＮ１０１８７４０３６Ｂ、公告日２０１２年０１月２５日）は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａ Ｍｅｄｉｃａ， ＣＡＭＳ ＆ ＰＵＭＣがコルジセピン誘導体で選別した顕著な血中脂質調節活性を有する新規な構造タイプの化合物であり、また、毒性副作用が少なく、薬物動態学的に優れている等の特徴があり、現在、臨床前の研究段階にある。非アルコール性脂肪肝の予防または治療における当該化合物の使用については現在報告されていない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明が解決しようとする技術課題は、非アルコール性脂肪肝の予防または治療用医薬の調製における、化合物トリアセチル－３－ヒドロキシフェニルアデノシンおよびその医薬組成物の使用を提供することである。

【0006】

本発明の技術課題を解決するため、以下の技術態様を提供する。
本発明に係る技術態様の第一の態様は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の治療用医薬の調製における、式（I）で表されるトリアセチル－３－ヒドロキシフェニルアデノシンまたはその薬学的に許容可能な塩の使用であって、前記医薬は、前記非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）における肝細胞の損傷を抑える肝機能保護医薬であって、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を有する患者に有効量の前記医薬を一日に２回投与することで、前記患者の血漿の総コレステロール（ＴＣ）、トリグリセリド（ＴＧ）、ＬＤＬ－Ｃ（低比重リポタンパク質コレステロール）、ＨＤＬ－Ｃ（高比重リポタンパク質コレステロール）及び遊離脂肪酸（ＦＦＡ）のレベルを低下させることを特徴とする使用を提供する。

【化1】

【0007】

前記医薬は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の治療において血清アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）のレベルを低下させる肝機能改善医薬である。
前記非アルコール性脂肪肝は、高カロリーの飲食によるものである。

【0008】

本発明に係るトリアセチル－３－ヒドロキシフェニルアデノシンにより非アルコール性脂肪性肝疾患を治療することは、血清ＡＳＴ、ＡＬＴおよびＴＧレベルを明らかに低下させ、脂肪肝があるゴールデンハムスターの肝機能を顕著に改善し、脂肪肝の程度を軽減して、非アルコール性脂肪性肝疾患を治療できることを意味する。
本発明に係る技術態様の第二の態様は、非アルコール性脂肪性肝疾患の治療用医薬の調製における医薬組成物の使用において、前記医薬組成物は、式（I）で表されるトリアセチル－３－ヒドロキシフェニルアデノシン又はその薬学的に許容可能な塩及びその薬学的に許容可能な担体を含み、前記医薬は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）における肝細胞の損傷を抑える肝機能保護医薬であって、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を有する患者に有効量の前記医薬を一日に２回投与することで、前記患者の血漿の総コレステロール（ＴＣ）、トリグリセリド（ＴＧ）、ＬＤＬ－Ｃ（低比重リポタンパク質コレステロール）、ＨＤＬ－Ｃ（高比重リポタンパク質コレステロール）及び遊離脂肪酸（ＦＦＡ）のレベルを低下させることを特徴とする使用を提供する。

【化1】

【0009】

前記医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、丸剤および注射剤、徐放性製剤、放出制御製剤または各種の微粒子投薬システムを含む。該医薬組成物は当該分野の公知の方法に基づいて調製することができる。本発明に係る化合物を一種以上の薬学的に許容可能な固体または液体の賦形剤および／またはアジュバントと組み合わせることで、ヒトや動物への使用に適したいずれかの剤形を調製することができる。本発明に係る化合物のその医薬組成物における含有量は一般的に０．１～９５重量％である。

【0010】

本発明に係る化合物またはそれを含有する医薬組成物は、単位用量の形式で投薬してもよく、投薬経路は、腸または非腸であってもよく、例えば、経口、静脈注射、筋肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、目、肺および呼吸器、皮膚、腟、直腸等である。

【0011】

投薬剤形は、液体剤形、固体剤形または半固体剤形であってもよい。液体剤形は、溶液剤（真溶液およびコロイド溶液を含む）、乳剤（ｏ／ｗ型、ｗ／ｏ型およびダブルエマルションを含む）、懸濁剤、注射剤（水性注射剤、粉末注射剤および点滴を含む）、点眼剤、点鼻剤、洗剤および塗布剤等であってもよい。固体剤形は、錠剤（通常の錠剤、腸溶性錠剤、トローチ剤、分散性錠剤、チュアブル錠剤、発泡錠剤、口腔内崩壊錠剤を含む）、カプセル剤（硬カプセル剤、軟カプセル剤、腸溶性カプセル剤を含む）、顆粒剤、散剤、ピル、滴丸、坐薬、膜剤、パッチ、エアゾールおよび粉末吸入剤、スプレー等であってもよい。半固体剤形は、軟膏剤、ゲル剤、ペースト剤等であってもよい。好ましい医薬組成物の剤形は、錠剤、カプセル剤、丸剤、注射剤から選ばれる。

【0012】

本発明に係る化合物は、通常の製剤に調製してもよく、徐放性製剤、放出制御製剤、標的製剤および各種の微粒子投薬システムに調製してもよい。

【0013】

本発明に係る化合物を錠剤に調製するために、希釈剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、流動促進剤を含む、当該分野で公知の各種の賦形剤を広く使用することができる。希釈剤は、デンプン、デキストリン、スクロース、グルコース、ラクトース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、微結晶セルロース、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、炭酸カルシウム等であってもよい。湿潤剤は、水、エタノール、イソプロパノール等であってもよい。結合剤は、デンプンペースト、デキストリン、シロップ、蜂蜜、グルコース溶液、微結晶セルロース、アラビアゴムペースト、ゼラチンペースト、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アクリル樹脂、カルボマー、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール等であってもよい。崩壊剤は、乾燥デンプン、微結晶セルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、架橋ポリビニルピロリドン、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムおよびクエン酸、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、ドデシルスルホン酸ナトリウム等であってもよい。潤滑剤および流動促進剤は、タルク、シリカ、ステアリン酸塩、酒石酸、流動パラフィン、ポリエチレングリコール等であってもよい。

【0014】

錠剤を、例えば砂糖コーテイング錠、フィルムコーティング錠、腸溶コーティング錠、または二層錠および多層錠のようなコーティング錠にさらに調製することもできる。

【0015】

投薬ユニットをカプセル剤に調製するために、有効成分である本発明に係る化合物を希釈剤、流動促進剤とまず混合し、混合物を硬カプセル剤または軟カプセル剤中に直接入れてもよい。有効成分である本発明に係る化合物を希釈剤、結合剤、崩壊剤と顆粒またはピルにまず調製してから、硬カプセル剤または軟カプセル剤中に再度入れてもよい。本発明に係る化合物の錠剤の製造に用いられる各種の希釈剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、流動促進剤の品は、本発明に係る化合物のカプセル剤の製造に用いられてもよい。

【0016】

本発明に係る化合物を注射剤に調製するために、水、エタノール、イソプロパノール、プロピレングリコールまたはこれらの混合物を溶剤として、当該分野で通常用いられる可溶化剤、助溶剤、ＰＨ調整剤、浸透圧調節剤を適量加えてもよい。可溶化剤または流動促進剤は、ポロキサマー、レシチン、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン等であってもよい。ＰＨ調整剤は、リン酸塩、酢酸塩、塩酸、水酸化ナトリウム等であってもよい。浸透圧調節剤は、塩化ナトリウム、マンニトール、グルコース、リン酸塩、酢酸塩等であってもよい。凍結乾燥粉末注射剤を製造する場合、マンニトール、グルコース等をサポートエージェントとしてさらに加えてもよい。

【0017】

また、必要であれば、医薬製剤中に着色剤、防腐剤、香料、香味料またはその他の添加剤を添加してもよい。
薬物の使用目的を達成し、治療効果を増大させるため、本発明の医薬または医薬組成物は、任意の公知の投薬方法で投薬することができる。

【0018】

本発明に係る化合物の医薬組成物の投薬用量は、予防または治療すべき疾病の性質および深刻度や、患者または動物のそれぞれの状況に基づき、投薬経路および剤形等を広範囲に変化させてもよい。一般的に、本発明に係る化合物の適切な１日の用量の範囲は、０．００１～１５０ｍｇ／ｋｇ体重であり、好ましくは０．１～１００ｍｇ／ｋｇ体重であり、より好ましくは１～６０ｍｇ／ｋｇ体重であり、最も好ましくは２～３０ｍｇ／ｋｇ体重である。上記用量は、１つの用量単位または複数の用量単位に分けて投薬してもよく、これは、医師の臨床経験、およびその他の治療手段の運用を含む投薬方法によって左右される。

【0019】

本発明の化合物または組成物は、単独で服用してもよく、またはその他の治療薬や対症薬と併用してもよい。本発明の化合物は、その他の治療薬との相乗効果がある場合、実際の状況に応じてその用量を調整しなければならない。

【発明の効果】

【0020】

本発明は、薬力学研究方法を用いて、非アルコール性脂肪肝の予防または治療におけるトリアセチル－３－ヒドロキシフェニルアデノシンの顕著な作用を実証しており、このような発症機序が複雑で治療効果が低い慢性疾患に、新しい予防または治療薬であるトリアセチル－３－ヒドロキシフェニルアデノシンを提供しており、その治療効果が顕著で、毒性副作用が少なく、安全に使用できるため、非アルコール性脂肪肝の予防または治療方面における臨床使用に科学的な根拠を提供した。

【0021】

本発明の内容がより容易かつ明瞭に理解されるように、以下、本発明の具体的な実施例によりかつ図面を参照しながら、本発明についてさらに詳しく説明する。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】本発明に係る前記実験例において、ゴールデンハムスター各群の体重および肝臓係数を比較した図である。

【図2】本発明に係る前記実験例において、ゴールデンハムスターの血清中のコレステロール、トリグリセリド、高密度リポ蛋白質、低密度リポ蛋白質および遊離脂肪酸の含有量の測定結果を比較した図である。

【図3】本発明に係る前記実験例において、ゴールデンハムスターのＡＬＴおよびＡＳＴ酵素活性を比較した図である。

【図4】本発明に係る前記実験例において、各群のゴールデンハムスターの肝組織の脂質含有量の測定結果を比較した図である。

【図5】本発明に係る前記実験例における、ゴールデンハムスターの肝臓の磁気共鳴イメージング図である。

【図6】本発明に係る前記実験例において、各群のゴールデンハムスターの肝組織に対するＨＥ病理染色の結果を比較した図である。

【図7】本発明に係る前記実験例において、各群のゴールデンハムスターの肝組織に対するオイルレッドＯ染色状況の結果を比較した図である。

【発明を実施するための形態】

【0023】

以下の実施例を用いて本発明をさらに説明するが、本発明を何ら制限するものではない。

【0024】

実施例１：非アルコール性脂肪肝の治療におけるトリアセチル－３－ヒドロキシフェニルアデノシン（ＩＭＭ－Ｈ００７）の使用
一、実験材料
１．試薬
ＯＣＴ凍結組織包埋剤（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ ＵＳＡ， Ｉｎｃ．）、ペントバルビタールナトリウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ． ＬＬＣ．）、ＰＥＧ６０００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ． ＬＬＣ．）、グリシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ． ＬＬＣ．）、パラホルムアルデヒド（Ｓｉｎｏｐｈａｒｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＲｅａｇｅｎｔＣｏ．， Ｌｔｄ）、オイルレッドＯ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ． ＬＬＣ．）、ＨＥ染色液（ＢａＳＯ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．， ＬＴＤ．）、総コレステロール（ＴＣ）測定キット（Ｓｅｋｉｓｕｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｃｈｉｎａ）ＬＴＤ）、総トリグリセリド測定キット（ＢＩＯＳＩＮＯ ＢＩＯ－ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ＆ＳＣＩＥＮＣＥ ＩＮＣ）、遊離脂肪酸測定キット（Ｓｅｋｉｓｕｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｃｈｉｎａ）ＬＴＤ）、アラニントランスアミナーゼ（ＡＳＴ／ＡＬＴ）測定キット（Ｎａｎｊｉｎｇ Ｊｉａｎｃｈｅｎｇ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ／ＧＯＴ）測定キット（Ｎａｎｊｉｎｇ Ｊｉａｎｃｈｅｎｇ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）。

【0025】

２．機器
多用途低温高速遠心分離機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＡＧ）、パラフィンミクロトーム（Ｌｅｉｃａ Ｃａｍｅｒａ ＡＧ）、凍結ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ Ｃａｍｅｒａ ＡＧ）、Ｅｎ Ｖｉｓｉｏｎ多機能酵素標識機器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ， Ｉｎｃ．）、小動物麻酔器（Ｍａｔｒｉｘ ＵＳＡ製品）、小動物磁気共鳴イメージング装置（Ｂｒｕｋｅｒ ＰｈａｒｍａＳｃａｎ ７０Ｔ／１６ＵＳ）。

【0026】

３．実験動物
体重９０～１２０ｇ、雄性、ＳＰＦ級の６～８週齢のシリアンゴールデンハムスター（ＬＶＧ ｈａｍｓｔｅｒ，導入元Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）２０匹を、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．より購入した。許可証番号は、ＳＣＸＫ（京）２０１２－０００１である。

【0027】

二、実験方法
１．動物群および飼育
動物が適応するように５日間餌付けた後、体重に基づいてランダムに正常群（ｎ＝１５）、高脂肪飼料群（ｎ＝１５）、ＩＭＭＨ００７低用量群（２５ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝１５）、ＩＭＭＨ００７中用量群（５０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝１５）、ＩＭＭＨ００７高用量群（１００ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝１５）に分けて、一日に２回胃内投与する。動物は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａ Ｍｅｄｉｃａ， ＣＡＭＳ ＆ ＰＵＭＣの動物実験センター二部で飼育し、飼育条件は、ＳＰＦ級、温度２１±２℃、相対湿度５０±５％、光照射周期１２／１１２、各ケージに５匹とする。正常群に正常基礎飼料を与え、高脂肪飼料群に高脂肪飼料（基礎飼料７９．８％にラード２０％およびコレステロール０．２％を加える）を与え、動物は自由に摂食、飲水する。飼料は、ＢＥＩＪＩＮＧ ＨＦＫ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ ＣＯ．，ＬＴＤに委託して生産したものである。実験中、２週間毎に体重を一回記録する。

【0028】

２．観察指標および測定方法
２．１ 血清生化学指標
動物を１２時間断食させた後、眼角静脈から０．５ｍｌ採血して、６０ｍｉｎ静置し、６０００ｇで１０ｍｉｎ遠心し、できるだけ多くの上清を吸引してから、６０００ｇで１０ｍｉｎ遠心し、ＴＣ、ＴＧ、ＡＳＴおよびＡＬＴキットの説明書に基づいて吸光度値を測定して、各指標濃度を算出する。血清５０ｕｌを取りＰＥＧ６０００ ５０ｕｌと１：１で混合し、ボルテックスして均一化し、１０ｍｉｎ静置し、常温下で１９００ｇで２０ｍｉｎ遠心し、上清を注意深く吸引し、４℃で保存して、ＴＣキットの説明書に基づいてＨＤＬ－Ｃを測定する。血漿ＬＤＬレベルは、血漿の総コレステロールＴＣからＨＤＬ－Ｃおよび０．２倍のＴＧレベルを減算することによる。すなわちＬＤＬ＝ＴＣ－ＨＬＤ－０．２ＴＧとする。

【0029】

実験終了前に一晩断食させ、３％ペントバルビタールナトリウムの腹腔注射で麻酔し、腹腔を露出して腹部の大動脈から採血した後、肝臓を迅速に分離する。肝臓一葉を摘出し、固定部位に２つの１×１ｃｍ^３の小塊を切り取った後、一方の小塊は、ＯＣＴ包埋を用いて、液体窒素に投入して急冷し、液体窒素中または－８０℃で保存し、他方の小塊は、４％パラホルムアルデヒド固定液中に投入し、４℃で保存する。

【0030】

２．２ 磁気共鳴イメージング
動物を１２時間断食させた後、イソフルランで麻酔し、頭部を固定し、ラット用コイル上に仰臥させて固定し、頭を先に入れて、腹部を中心に位置させる。
高速スピンエコーシークエンスのＴ２強調画像（Ｔ２－ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｉｍａｇｉｎｇ，Ｔ２ＷＩ）：ＴＲ／ＴＥ＝２００／３ｍｓ、ＦＡ＝３０°。視野（ＦＯＶ）＝３．６×３．６、マトリックス＝２５６×２５６、励起回数＝２回。

【0031】

２．２ 肝組織脂質含有量分析
肝臓組織１００ｍｇを正確に秤り取り、トリグリセリドを加えてバッファを測定し、ホモジナイザーで組織を氷浴中で明らかな組織塊がなくなるまでホモジネートする。氷上に５ｍｉｎ放置し、１．５ｍｌ遠心管中に移し、１４０００ｇ、４℃で１０ｍｉｎ遠心し、上清を移し、上清の一部を取って蛋白定量を行い、ＴＣ、ＴＧキットの説明書に基づいて脂質含有量を測定する。

【0032】

２．３ 肝組織病理染色
２．３．１ パラフィン切片の作製
パラホルムアルデヒド固定液で固定された肝臓を水道水で清浄し、以下のステップによって脱水する。７０％エタノールで一晩、８０％エタノールで一晩、９０％エタノールIで３０ｍｉｎ、９０％エタノールIIで３０ｍｉｎ、９５％エタノールIで６０ｍｉｎ、９５％エタノールIIで６０ｍｉｎ、１００％エタノールIで６０ｍｉｎ、１００％エタノールIIで６０ｍｉｎであって、正常組織は脱水時間を適宜延ばすことができる。組織を脱水した後、ＣＨＡＯＡＮを用いて透明化する。ＣＨＡＯＡＮIで６０ｍｉｎ、ＣＨＡＯＡＮIIで６０ｍｉｎ、ＣＨＡＯＡＮIIIで６０ｍｉｎであって、正常対照群の肝臓は透明化時間を適宜延ばすことができる。６５℃でパラフィンに浸漬する。パラフィンIで５０ｍｉｎ、パラフィンIIで５０ｍｉｎ、パラフィンIIIで５０ｍｉｎである。包埋し、切片厚さは７ｕｍであり、４５℃で切片を伸展し、切片を５０℃で一晩乾かす。

【0033】

２．３．２ 凍結切片の作製
肝臓組織の切片化前にミクロトームの冷蔵庫の温度を－１９℃に設定し、試料ホルダを－２１℃に設定する。液体窒素または－８０℃で保存された肝臓は、先ず－２０℃の環境で温度を平衡させ、さらに組織をミクロトームの試料台に置いて温度を平衡させる。組織塊を速やかにトリミングした後、連続して切り出し、切片厚さは７ｕｍであり、清潔なポリリジンが包被されたスライドガラス上に貼り付ける。

【0034】

２．３．３ オイルレッドＯ染色
凍結切片を４％パラホルムアルデヒド生理溶液に１０ｍｉｎ固定し、水道水で２ｍｉｎ洗浄し、６０％イソプロパノールで数秒間リンスし、遮光された染色キット内に０．５％オイルレッドＯ作用液を用いて１０～１５ｍｉｎ滴下して染色し、６０％イソプロパノールで数秒間色分解し、水道水で軽く洗浄して、ヘマトキシリンで３～５ｍｉｎ再度染色し、水道水で軽く洗浄して、１％塩酸水で分別し、水道水で２ｍｉｎ洗浄して青色に戻し、グリセロゼラチンでシールし、顕微鏡下で観察する。

【0035】

２．３．４ ＨＥ染色
パラフィン切片を以下のステップによって脱水する。ＣＨＡＯＡＮIで５ｍｉｎ、ＣＨＡＯＡＮIIで５ｍｉｎ、ＣＨＡＯＡＮIIIで５ｍｉｎ、１００％エタノールIで３ｍｉｎ、１００％エタノールIIで３ｍｉｎ、９５％エタノールIで３ｍｉｎ、９５％エタノールIIで３ｍｉｎ、８０％エタノールで３ｍｉｎであり、水道水で１ｍｉｎ洗浄する。ヘマトキシリンで５ｍｉｎ染色し、水道水で１ｍｉｎ洗浄し、１％塩酸エタノールで数秒間分別し、水道水で洗浄して青色に戻し、８０％エタノールに入れて数秒間リンスし、エオジンで１０秒染色し、８０％エタノールおよび９５％エタノールで色を調整し、脱水する。すなわち９５％エタノール、１００％エタノールI、１００％エタノールII、ＣＨＡＯＡＮI、ＣＨＡＯＡＮII、ＣＨＡＯＡＮIII６０で各２ｍｉｎである。超洗浄高級Ｅｎｔｅｌｌａｎでシールし、顕微鏡下で観察する。

【0036】

３．データ分析
データを平均値±標準誤差で表し、全てのデータはＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ５．０ソフトウェアを用いてＯＮＥＷＡＹ－ＡＮＯＶＡ統計分析を行い、画像を比較分析する。

【0037】

三、実験結果
３．１ ＩＭＭ－Ｈ００７の、高脂肪食誘導非アルコール性脂肪肝ゴールデンハムスターの体重および肝臓係数への影響
表１および図１から分かるように、正常群のゴールデンハムスターに比べて、モデル群のゴールデンハムスターは、体重が明らかに増加し、肝臓係数が増加しており、モデル群に比べて、ＩＭＭ－Ｈ００７を与えて治療した後に、体重および肝臓係数がいずれも低下した。しかし、シンバスタチンを与えて治療した後には、ゴールデンハムスターの肝臓係数が低下せず、逆に顕著に上昇した。

【0038】

【表1】

【0039】

３．２ ＩＭＭ－Ｈ００７の、高脂肪食誘導非アルコール性脂肪肝ゴールデンハムスター血清中の血中脂質指標への影響
正常群のゴールデンハムスターに比べて、モデル群のゴールデンハムスター血清ＴＣ、ＴＧ、ＬＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ－ＣおよびＦＦＡがいずれも顕著に上昇しており、モデル群に比べて、ＩＭＭ－Ｈ００７を与えた後に、ＴＣ、ＴＧ、ＬＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ－ＣおよびＦＦＡがいずれも顕著に低下した（表２および図２）。

【0040】

【表2】

【0041】

３．３ ＩＭＭ－Ｈ００７の、高脂肪食誘導非アルコール性脂肪肝ゴールデンハムスターの肝機能への影響
表３から分かるように、モデル群のゴールデンハムスター血清アラニントランスアミナーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼのレベルが顕著に上昇し、ＩＭＭ－Ｈ００７治療後に、血清ＡＬＴおよびＡＳＴがいずれも顕著に低下した。しかし、シンバスタチンを与えて治療した後には、アラニントランスアミナーゼが低下せず、逆に顕著に上昇したが（表３および図３）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼのレベルはモデルと顕著な差がなく、ＩＭＭ－Ｈ００７が良好な肝保護作用を有するが、シンバスタチンが肝損傷作用を示すことが提示された。

【0042】

【表3】

【0043】

３．４ ＩＭＭ－Ｈ００７の、高脂肪食誘導非アルコール性脂肪肝ゴールデンハムスターの肝臓脂質の変化への影響
表４および図４から分かるように、正常群のゴールデンハムスターに比べて、モデル群のゴールデンハムスターの肝臓におけるＴＣ、ＴＧが顕著に上昇し、モデル群に比べて、シンバスタチンおよびＩＭＭ－Ｈ００７を与えた後に、ＴＣ、ＴＧがいずれも顕著に低下した。

【0044】

【表4】

【0045】

３．５ 肝臓ＭＲＩ分析
ＭＲＩ検査結果が示すように、正常群に比べて、モデル群のゴールデンハムスターの皮下および腹腔脂肪が顕著に増加し、シンバスタチンおよびＩＭＭ－Ｈ００７を与えた後に、皮下および腹腔脂肪を減少させることができた（図５）。

【0046】

３．６ 肝臓組織の病理学的観察
図６に示すＨＥ染色結果から、正常動物肝細胞は、中心静脈を中心として周囲に向かって放射状をなすように配列し、中心静脈およびその他の血管壁にコラーゲン線維が規則的に分布しており、モデル群の動物肝細胞には、空胞化が現われ、肝細胞間にコラーゲン線維が現われ、かつ不規則に分布していた。シンバスタチン群の動物肝細胞内には、空胞が現われ、肝細胞間にコラーゲン線維が現われ、かつ不規則な分布をなし、ＩＭＭ－Ｈ００７の各用量群の肝細胞は、中心静脈を中心として周囲に向かって放射状をなすように配列し、中心静脈および肝小葉境界領域にコラーゲン線維の規則的な分布をなすことが見出された。

【0047】

オイルレッドＯ染色結果から、正常群の動物肝細胞は、中心静脈を中心として周囲に向かって放射状をなすように配列し、肝細胞内の中性脂肪含有量が少なかった。高脂肪食事群の動物肝細胞内には、大量の脂肪蓄積があり、空胞化が現われ、シンバスタチン群の動物肝細胞内には、脂肪蓄積があり、大量の壊死巣があることが見出された（図７）。ＩＭＭ－Ｈ００７の各用量群の動物肝細胞内にも脂肪蓄積が見られるが、モデル群に比べて、明らかに減少した。

【0048】

上述のように、トリアセチル－３－ヒドロキシフェニルアデノシン（ＩＭＭ－Ｈ００７）は、非アルコール性脂肪肝ゴールデンハムスターの血中脂質レベルを顕著に低下させて、ＡＳＴ、ＡＬＴレベルを明らかに低下させ、肝機能を顕著に改善することができる。よって、ＩＭＭ－Ｈ００７が、非アルコール性脂肪肝の予防または治療用医薬の調製に使用可能であることを提示している。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】