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特許7382945生体サンプルの電気パルスに基づく活性化のためのシステムおよび方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-11-09
(45)【発行日】2023-11-17
(54)【発明の名称】生体サンプルの電気パルスに基づく活性化のためのシステムおよび方法
(51)【国際特許分類】
A61N 1/00 20060101AFI20231110BHJP
A61M 1/36 20060101ALI20231110BHJP
A61N 1/36 20060101ALN20231110BHJP
【ＦＩ】
A61N1/00
A61M1/36 185
A61N1/36
【請求項の数】
6
(21)【出願番号】P 2020543970
(86)(22)【出願日】2019-02-20
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-06-17
(86)【国際出願番号】 US2019018747
(87)【国際公開番号】W WO2019164928
(87)【国際公開日】2019-08-29
【審査請求日】2022-01-27
(31)【優先権主張番号】15/905,463
(32)【優先日】2018-02-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】390041542
【氏名又は名称】ゼネラル・エレクトリック・カンパニイ
(74)【代理人】
【識別番号】100133503
【弁理士】
【氏名又は名称】関口 一哉
(72)【発明者】
【氏名】カイアファ，アントニオ
(72)【発明者】
【氏名】ネクラエス，ヴァシーレ ボグダン
【審査官】石川 薫
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１７－５０５６５６（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１４／０３６３４１２（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許第０６３４８１７６（ＵＳ，Ｂ１）
【文献】特表２０１０－５１０８６４（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開平１１－３２２６１９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１７－５３０３４９（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２００６／０２４６５７２（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２００３－５２３２３６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００６－１９７８７２（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｎ １／００－１／４４
Ａ６１Ｍ １／３６－１／３８
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
カートリッジレール（１５０、２２２）と、前記カートリッジレールに隣接したサンプルローダー電極の対（１５２、１５４、２２６、２２８）とを有し、前記カートリッジレールが、複数のキュベット（１３２、２２４）を含むキュベットカートリッジ（１３０）を収容するように構成され、前記キュベットカートリッジの各キュベットが、それぞれ電極対（１３６、１３８）を有する、サンプルローダー（１０４）と、前記キュベットカートリッジに接触する機械的レバー（１６２）を使用して、前記カートリッジレールに沿って、前記キュベットカートリッジを動かすように構成されたモーター（１６３）と、
前記サンプルローダー電極の対の間に、電気パルスを生成するように構成されたパルス発生回路（１０２）と、
前記モーターおよび前記パルス発生回路に通信可能に結合されたコントローラ（１０６）とを備え、
前記コントローラが、
前記モーターにより、前記複数のキュベットの第１のキュベットの電極対がそれぞれ、前記サンプルローダーの対に電気的に結合する、第１位置に、前記キュベットカートリッジを動かし、
前記パルス発生回路により、前記サンプルローダーの電極の対間に電気パルスを生成して、前記第１のキュベット内にパルス電界を生成し、
前記モーターにより、前記複数のキュベットの第２のキュベットの電極対がそれぞれ、前記サンプルローダーの対に電気的に結合する第２位置に、前記キュベットカートリッジを前記第１位置から動かすように構成され、
前記コントローラが、多血小板血漿サンプル中の血小板の活性化に関連する第１の手順を含むメモリを有する、電気パルス発生システム（１００）。
【請求項2】
前記機械的レバーがねじレバーを含む、請求項１に記載の電気パルス発生システム。
【請求項3】
前記カートリッジレールが、複数の機械的停止部を備え、各機械的停止部は、複数の位置のうちの１つの位置に関連付けられる、請求項１に記載の電気パルス発生システム。
【請求項4】
前記カートリッジレールが、線形カートリッジレールを含む、請求項１に記載の電気パルス発生システム。
【請求項5】
前記カートリッジレールが、円形カートリッジレールを含む、請求項１に記載の電気パルス発生システム。
【請求項6】
前記メモリが、血液サンプル中の血小板の活性化に関連する第２の手順を含む、請求項１に記載の電気パルス発生システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本明細書に開示される主題は、自動カートリッジデバイスまたはフローセルデバイスを使用する方法およびシステムによる、電気パルスに基づく生体サンプルの活性化に関する。
【背景技術】
【0002】
このセクションは、以下に説明および／または請求される、本開示の様々な態様に関連し得る技術の様々な態様を読者に紹介することを意図している。この説明が、本開示の様々な態様を理解しやすくする背景情報を読者に提供するのに役立つと考えている。したがって、これらの説明は、上記の観点から読まれるべきであり、従来技術の承認として読まれるべきではないことが理解されたい。
【0003】
診療所やその他の医療施設で採用され得る、新たな治療方法として、活性化多血小板血漿（「活性化血小板」とも称される）の使用が挙げられる。例えば、活性化多血小板血漿を使用して、治療用途のための活性化血小板化合物を生成することができる。活性化血小板化合物の治療用途として、創傷治癒（手術後など）および止血の促進が挙げられる。特に、神経損傷、腱炎、変形性関節症、心筋損傷、ならびに骨の修復および再生などの多く多様な損傷および症状についての創傷治癒に、活性化血小板治療が供される。患者に使用される活性化血小板生成物は患者自身から由来し得る。即ち、活性化血小板化合物が患者自身の組織および／または体液から得られるのである。したがって、患者からの血液サンプルを使用して、患者を治療するために使用される活性化血小板化合物を得ることができる。
【0004】
一例として、医師が患者から採決し、血液サンプル中の血小板を活性化し得る。活性化されると、血液内の血小板は成長因子とタンパク質を放出し、これらが創傷治癒カスケードの向上を図る。したがって、臨床ワークフローとしては、患者からの採決、血小板を分離するための血液遠心分離、および体外血小板活性化を含み得る。血小板の活性化は、生体サンプルをパルス電界に曝露することを含み得る。次いで、活性化血小板または血小板ゲルは、創傷部または他の治療部位に投与され得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
生体サンプルに電界を印加できる既存の装置の空間的および幾何学的制約により、パルス電界を使用して活性化できるサンプルの容量は、キュベットの容量（通常１０μｌから１ｍｌである）に限定され得る。結果として、臨床医は、サンプルの量がキュベットの容量を大幅に上回る、血小板活性化ベースの治療に電気パルスを採用することに大きな困難を感じ得る。大量の活性化血小板化合物を生成するためプロセスを手動で繰り返すと、多くの場合、サンプル間で一貫性が損なわれ、治療効果が弱まる。さらに、生体サンプルへの電界の印加に使用される既存のデバイスが、臨床用設定での使用には適切でない可能性もある。既存のパルス発生システムは、血液または多血小板血漿サンプルの受容に適した設定ではない可能性があり、血小板活性化のために事前に構成された手順が欠如している可能性がある。これらのシステムはまた、生成物の無菌性を維持するための保護手段を欠いている場合もある。
【課題を解決するための手段】
【0006】
最初に請求された発明の範囲に該当する、特定の実施形態を以下にまとめる。これらの実施形態は、特許請求される発明の範囲を限定することを意図しておらず、むしろこれらの実施形態は、本発明の可能な形態の簡潔な要約を提供することのみを意図している。実際、本発明は、以下に述べる実施形態と同様または異なり得る様々な形態を包含することができる。
【0007】
一実施形態では、電気パルス発生システムが説明される。電気パルス発生システムは、カートリッジレールに隣接するサンプルローダー電極の対を有するサンプルホルダーを含む。カートリッジレールは、複数のキュベットを有するキュベットカートリッジを保持することができ、各キュベットは、それぞれ電極対を有する。システムはまた、キュベットカートリッジをカートリッジレールに沿って動かすことができる機械的モーターと、カートリッジレールに隣接するサンプルローダー電極の対に電気的に接続されたパルス発生回路と、パルス発生回路および機械的モーターを制御するコントローラとを備える。コントローラは特に、機械的モーターを操作して、カートリッジ内の対象キュベットの電極対がそれぞれサンプルローダー電極の対と位置合わせされるようにキュベットカートリッジを配置し、パルス発生回路を操作して、対象キュベット内にパルス電界を発生させる。
【0008】
別の実施形態では、別の電気パルス発生システムが説明される。この電気パルス発生システムは、チャネルによって接続された第１および第２のリザーバを有するサンプルローダーと、チャネルを介した第１から第２のリザーバへの流れを生成することができるポンプとを備える。チャネルは、電極対を有する。システムはさらに、電極対に結合されたパルス発生回路を含む。システムはまた、処理回路を有するコントローラと、ポンプを作動させて第１の流量の流れを生成し、かつパルス発生回路に、電極対間に電気パルスシーケンスを発生させる命令を含むメモリとを備える。生成された電気パルスシーケンスは、流量に基づく、電界強度またはパルス周波数などの少なくとも１つの特徴を有し得る。
【0009】
別の実施形態では、活性化血小板治療システムが説明される。このシステムは、内部チャネルと、内部チャネルに結合された電極対と、チャネルを通る流れを生成することができるポンプとを有する血小板活性化回路とを備える。システムはさらに、内部チャネルに結合された収集管および投与管を備える。収集管は、血液サンプル（例えば、生の血液、血漿、多血小板血漿）が注入され得、投与管は、活性化血小板生成物が注入され得る。システムはさらに、ポンプを作動させて、収集管から投与管への内部チャネルを介した流れ生成し、かつ血液サンプル中の血小板を活性化する電極対の間にパルス電界を生成するコントローラを備える。
【図面の簡単な説明】
【0010】
本発明のこれらおよび他の特徴、態様、および利点は、添付の図面を参照して以下の詳細な説明を読むと、よりよく理解されるであろう。図面全体を通して、同様の文字は同様の部分を表す。
【図1】実施形態に係る、大量の血小板の活性化に使用することができるパルス発生システムの概略図である。
【図2】実施形態に係る、生体サンプルの大量血小板活性化のために使用され得る線形キュベットカートリッジの概略図である。
【図5】一実施形態に係る、血小板活性化のためのカートリッジベースのキュベット取り付けシステムを操作する方法のフローチャートである。
【図6】実施形態に係る、生体サンプルの大量活性化のために使用され得る円形サンプルローダーと、円形キュベットカートリッジの概略図である。
【図7】実施形態に係る、生体サンプルの大量活性化のために使用され得るフローベースのサンプルローダーの概略図である。
【図9】実施形態による、オンデマンドのサンプル収集および活性化のために使用され得る、フローベースのオンデマンド血小板活性化システムの概略図である。
【図10】実施形態による、オンデマンドのサンプル前処理および活性化のために使用され得る、フローベースのオンデマンド血小板活性化システムの概略図である。
【図11】実施形態に係る、オンデマンド血小板活性化システムのために使用され得るフローベースのサンプルローダーの概略図である。
【発明を実施するための形態】
【0011】
本主題の１つまたは複数の具体的な実施形態を以下に説明する。これらの実施形態の説明を簡潔にするため、実際の実装における所定の特徴は、明細書では省略されない場合がある。このような実際の実施の開発では、あらゆるエンジニアリングプロジェクトや設計プロジェクトと同様に、実施毎に異なり得るシステム関連およびビジネス関連の制約の遵守など、開発者固有の目標を達成するために、実施固有の多数の決定を行う必要があることが理解されたい。そのような開発努力は複雑で時間がかかる可能性があるが、それでも、本開示の利益を享受する当業者にとっては、設計、組み立て、および製造の日常業務の範囲内であることを理解されたい。
【0012】
本発明の様々な実施形態の要素を紹介するとき、冠詞「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」、および「前記（ｓａｉｄ）」は、１つまたは複数の要素があることを意味するものとする。「備える」、「含む」、および「有する」という用語は、包括的であることを意図し、列挙された要素以外の追加の要素が存在する可能性があることを意味する。
【0013】
本明細書に示される例または図の表現は決して、それらで仕様される用語を制限、限定、または定義するものと見なされるべきではない。むしろ、これらの例または図の表現は、様々な特定の実施形態に関して記載されていると見なされるべきであり、あくまでも例示と見なされるべきである。当業者には、これらの例または図の表現と共に使用される任意の１または複数の用語が、一部の実施形態や明細書のその他箇所で使用されなかったとしてもそれら実施形態にも適用され、それら実施形態のすべてが、当該１または複数の用語の範囲に含まれることが理解されよう。そのような非限定的な例および図の表現を指定する言語には、「例えば」、「例えば」、「など」、「例えば」、「含む」、および「一（ある）実施形態における」が含まれるが、これらに限定されない。
【0014】
血小板の活性化および／または凝集により、体内および／または体外創傷治療を実現できる。体内血小板活性化では、不活性多血小板血漿（ＰＲＰ）が損傷部位に投与または注入され、結合組織に存在するコラーゲンなどの体内に自然に存在する化合物によって活性化される。一方、体外プロセスでは、前処理された血液サンプル（ＰＲＰなど）の血小板が、損傷部位に注入される前に活性化される。活性化は、血液、血漿、またはＰＲＰサンプルをトロンビンなどの血小板活性化化合物に曝露することで行われ、成長因子（例えば、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ））の放出を誘起する。活性化は、血液、血漿、またはＰＲＰサンプルをパルス電界に曝露することによっても実現され得る。例えば、体外血小板活性化の場合、医師は患者から採血し、血液サンプルを遠心分離してＰＲＰサンプルを生成し得る。塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）およびトロンビンなどの血小板活性化化合物をＰＲＰサンプルに添加して、血小板の活性化をトリガーしてもよい。これらの添加剤は、溶液、懸濁液として、またはそのまま添加され得る。ＰＲＰサンプルは、特定のパルスシーケンス手順を使用することによる血小板のカスタム活性化および／または成長因子の放出に使用され得る電界パルスに曝露されてもよい。より具体的には、印加され得る１つ以上のカスタマイズ可能または調整可能な電界パルスに応じて、様々なレベルまたは量の成長因子の放出が実現され得る。電界のカスタマイズは特に、ターゲット電界、ピーク電圧、パルス幅、パルス数、パルス周期、および／またはパルス形状の調整によって行われ得る。
【0015】
成長因子の放出に加えて、単独で、または活性化化合物と組み合わせて印加されるパルス電界を使用して、活性化手順における他の因子の放出を制御してもよい。例えば、活性化血小板（または曝露されたサンプル内の他の細胞）は、適切な電界パルスに応じて、内因性抗酸化物質、活性酸素種、マトリックスメタロプロテイナーゼ２（ＭＭＰ－２）およびその他の因子を、制御または調整可能に放出し得る。したがって、調整可能またはカスタマイズ可能な活性化は、成長因子のカスタマイズされた放出だけでなく、創傷治癒プロセスに関連する可能性がある他の因子（上に挙げたものなど）の放出も伴い得る。電気パルスを使用した、カスタマイズされた活性化血小板組成物の生成については、米国特許９，７５２，１２０号として発行され、あらゆる目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０１５年３月３１日に出願された「成長因子レベル調整可能な活性化血小板組成物」と題する米国特許出願第１４／６７４，９７１号に記載されている。
【0016】
本明細書に記載の体外血小板活性化は、血液、血漿、ＰＲＰ、または血小板を含む任意の懸濁液などの血液サンプルを電気パルスに曝露して（例えば、パルス電界への曝露）、血小板活性化を実現するものであるが、他の種類のエネルギーへの曝露も考えられ、包含される。体外成長因子放出のための方法は、電気パルス刺激の前に血液サンプルに添加される化学添加物および／または血小板活性化化合物を伴っても、伴わなくてもよい。本明細書に記載のように、活性化は、活性化曝露のパラメータに応じて、サンプル内の細胞（例えば、赤血球）の破壊（例えば、溶解）を伴っても、伴わなくてもよい。特定の実施形態では、互いに異なる成長因子レベル、および／または成長因子の異なる割り合いとなる、異なるパラメータまたは、パラメータの組み合わせによる、異なる電気パラメータ（例えば、振幅、電圧、電界、エネルギー密度、電流、パルス幅、パルス数など）を使用して、電気刺激または活性化が適用され得る。このような異なる複数の配合の活性化組成物により、異なる複数の生物学的または医学的効果が実現され得る（例えば、創傷治癒の向上）。したがって、所望の効果から、所与の細胞組織の活性化に利用される電気パルスパラメータが決定され得る。
【0017】
パルス電界を使用する生体外血小板活性化は、キュベットの導電性電極の間にサンプルを配置し、２つの導電性電極の間に電気パルス電位を生成することにより行われる。導電性電極間のサンプルの領域は、パルス電界に曝露され得る。したがって、同領域内の血小板の活性化が実現される。本明細書では電極ギャップまたはキュベットギャップとも称される２つの電極間の間隔は、現実的な考慮事項により、通常１～２ｃｍ未満に制限される。電極間に印加される所与の電圧について、サンプルローダーの電極対間の間隔が大きいほど、印加電圧とキュベットギャップ距離の比として定義されるパルス電界が弱くなり得る。例えば、１ｃｍ幅のキュベットを使用して１ｋＶ／ｃｍの電界強度を得るために、１ｋＶパルスが使用され得る。一方、１０ｃｍのキュベットギャップを持つ仮想のキュベットを使用して同じ電界強度を実現するには、１０ｋＶのパルスを使用する必要がある。これには非現実的なほど複雑なパルス発生システムが必要となり得る。結果として、生成され得る活性化サンプルの量は、数ミリリットルに制限される（例えば、１～２ｍｌ未満）。数ミリリットル（１０～２０ｍｌ、またはそれ以上）の活性化血小板生成物が効果を示す治療では、電界パルスの使用は煩雑になり得る。
【0018】
本明細書に記載の実施形態は、生体外でより大量の活性化血小板化合物を生成するために使用することができる電界活性化装置に関する。本明細書で詳述するように、いくつかの実施形態は、カートリッジ式機構に配置された複数のキュベットを活性化するための自動化された方法を利用する。一部の実施形態は、「フローセル」、すなわち、活性化された電極間で、制御された流れ内の血液サンプルをパルス電界に曝露するための、電極表面を有し得るフローチャネルを利用する。システムの操作方法についても説明する。本明細書の方法およびシステムは、血液サンプルにおける血小板活性化について説明されるが、本明細書で説明される方法およびシステムは、生体物質がパルス電界に曝露され得る他の用途（例えば、細胞へのヌクレオチド挿入のためのエレクトロポレーションシステムや、免疫療法のための免疫細胞の活性化）にも適用され得る。
【0019】
上記を念頭に、図１は、大量の体外血小板活性化および、カスタマイズ可能または調整可能な成長因子放出のためのパルス発生システム１００を概略的に示す。システム１００は、パルス発生回路１０２およびサンプルローダー１０４を含む。図示の実施形態では、サンプルローダー１０４は、電気接続１０５によってパルス発生回路１０２に電気的に結合されている。以下に詳述するように、サンプルローダー１０４の実施形態は、少なくとも、電気接続１０５に電気的に結合された一対の電極と、一対の電極間に配置されたボリューム領域を含むサンプル用の容器とを含む。本明細書で論じられる電気接続１０５は、抵抗性、容量性、および／または誘電性であり得ることを理解されたい。
【0020】
特定の実施形態では、システムは、制御および入力回路を含み得、専用の筐体に実装され得るか、またはコンピュータまたは他のプロセッサベースの制御システムに結合され得る。例えば、システム１００は、パルス発生回路１０２を制御するプロセッサ１０６を含み得る。そのために、プロセッサ１０６は、パルス発生回路１０２に、サンプルローダー１０４に配置された血液、血液成分または血小板懸濁液を電気的に刺激または活性化させてもよい。電界強度、電極分離距離、および生成された電気パルスに関連する他のパラメータは、本明細書に記のとおり、活性化手順中に互いに対する成長因子レベル間で変化させるための、変化または調整できる要素である。これら要素に基づいて、プロセッサは、パルス発生回路１０２が電気接続１０５に生成する電気信号を決定することができる。
【0021】
プロセッサ１０６はまた、詳細に後述するように、制御信号１０９を使用してサンプルローダー１０４の動作のための機構を制御することもできる。例えば、フロー中に生体サンプルがパルス電界に曝露されるフローセルでは、流量とフローチャネルの直径は調整可能な要素であり、活性化血小板化合物の成長因子レベルを変化させるために使用され得る。したがって、プロセッサは、電気接続１０５で提供されるパルスを、制御信号１０９を介して提供される制御信号に合わせ得る。
【0022】
システム１００は追加の構成要素として、プロセッサ１０６によって実行される命令を格納するメモリ１０８を含み得る。この命令は、パルス発生回路１０２を使用して電気パルスを生成するための手順および／またはパラメータ、ならびに制御信号１０９を使用してサンプルローダー１０４を動作させるための命令を含み得る。プロセッサ１０６は、例えば、汎用シングルまたはマルチチップマイクロプロセッサを含み得る。さらに、プロセッサ１０６は、特定用途向けプロセッサまたは回路などの、従来の任意の専用プロセッサであってもよい。メモリ１０８は、ランダムアクセスメモリ、大容量記憶装置、固体メモリ装置、または取り外し可能なメモリなどの任意の適切な非一時的なコンピュータ可読媒体であり得る。
【0023】
さらに、ディスプレイ１１０は、システム１００の操作に関連する指示を操作者に提供することができる。システム１００はまた、パルス発生回路１０２およびサンプルローダー１０４を操作するため、さらにシステム１００動作のための適切な電気パルスパラメータ、サンプルの数、サンプルの体積、フローセルの直径、電極ギャップ寸法、フロー圧力、および他のそのようなパラメータの選択または指定のためのユーザ入力装置１１２（例えば、キーボード、マウス、タッチスクリーン、トラックボール、ＰＤＡまたはスマートフォンなどのハンドヘルドデバイス、あるいはそれらの任意の組み合わせ）を備え得る。さらに、ユーザは、ユーザ入力装置１１２を使用して、メモリに格納され得る、多数の事前設定パルス特性（それぞれ異なる創傷治癒の段階に対応する特性）から、当該特性を選択し得る。ユーザ入力装置１１２は、「オンデマンド」相互作用を可能にする専用制御システムであってもよい。そのようなシステムの例は、図９～図１１に示される「オンデマンド」実施形態に関して説明される。
【0024】
例として、一実施形態では、システム１０によって生成されるパルスは、用途に応じて、約１ナノ秒から約１００マイクロ秒の持続時間、および約０．１ｋＶ／ｃｍから約３５０ｋＶ／ｃｍの電界強度を有し得る。活性化手順ではまた、パルスシーケンス（すなわち、一連の電気パルス）を利用することができ、パルスシーケンス内の各パルスは、異なる強度および／または持続時間の電界を発生することができる。システム１００によって生成されるパルスは、通常、０．１ｋＶ／ｃｍ以上の電界強度を有するが、通常、パルスが細胞を含む懸濁液の破壊電界を超えることはない。さらに、いくつかの実施形態では、パルス発生システム１００は、感知機能を有し得る。そのために、パルス発生回路１０２は、サンプルローダー１０４内のサンプルを感知信号に曝露してもよい。感知信号（例えば、電圧）は、細胞活性化に使用される電界よりも小さい電界強度を生じさせる電気パルスであり得、感知信号（例えば、電圧に対応する電流）に対する応答は、パルス発生回路１０２で測定され得る。本明細書に記載の実施形態では、電極は、金属電極（例えば、ステンレス鋼、タングステン、プラチナ、イリジウム、プラチナ－イリジウム合金、酸化イリジウム、窒化チタンなどを含む）、塩橋電極、カーボンナノチューブ電極、導電性ポリマー（例えば、導電性ポリマーフィルム）であり得る。
【0025】
図２は、活性化生成物の体積を増加させるために使用され得るキュベットカートリッジ１３０を図示する。キュベットカートリッジ１３０は、線形キュベットカートリッジであってよい。図示のキュベットカートリッジ１３０は、５つのサンプル容器１３２Ａ、１３２Ｂ、１３２Ｃ、１３２Ｄ、および１３２Ｅを含む。各サンプル容器は、サンプルを入れるためのそれぞれの内部空間１３４Ａ、１３４Ｂ、１３４Ｃ、１３４Ｄ、および１３４Ｅを有する。各内部空間は、２つの電極の間に配置され得る。この例では、内部空間１３４Ａは電極１３６Ａおよび１３８Ａの間に配置され、内部空間１３４Ｂが電極１３６Ｂおよび１３８Ｂの間に配置され、内部空間１３４Ｃが電極１３６Ｃおよび１３８Ｃの間に配置され、内部空間１３４Ｄが電極１３６Ｄおよび１３８Ｄの間に配置され、内部空間１３４Ｅが電極１３６Ｅおよび１３８Ｅの間に配置される。図示の実施形態では、キュベットカートリッジ１３０は一体的に構築されている。キュベットカートリッジ１３０はまた、内部にキュベットを配置することができるフレームを有することによって、モジュール式の実施形態で構築することができる。例えば、容器１３２Ａ、１３２Ｂ、１３２Ｃ、１３２Ｄ、および１３２Ｅは、個々のキュベットを収容するように構成された構造的支持体（例えば、キュベット容器、キュベット収容可能フレーム）であり得る。個々のキュベットは、それぞれ、内部空間１３４Ａ、１３４Ｂ、１３４Ｃ、１３４Ｄ、および１３４Ｅの内の対応するものと、電極対１３６Ａおよび１３８Ａ、１３６Ｂおよび１３８Ｂ、１３６Ｃおよび１３８Ｃ、１３６Ｄおよび１３８Ｄ、１３６Ｅおよび１３８Ｅの内の対応するものを有し得る。本明細書で説明する例は５キュベットカートリッジに関するが、本説明は５キュベットを有する線形キュベットカートリッジの実施形態に限定されず、キュベットの数は、線形キュベットカートリッジ設計の調整により増減し得る。
【0026】
図２のカートリッジ１３０は、図３に示されるサンプルローダー１０４と組み合わせて使用され得る。図示のサンプルローダー１０４は、線形カートリッジサンプルローダーである。サンプルローダー１０４は、キュベットカートリッジ１３０を収容するように構成されたカートリッジレール１５０を有し得る。概して、カートリッジレール１５０は、キュベットカートリッジ１３０の少なくとも２倍の長さであり得る。サンプルローダー１０４はまた、図１に示すように、電気接続１０５に結合され得る電極１５２および１５４（例えば、サンプルローダー電極）を有し得る。さらに、カートリッジレール１５０は、機械的レバー１６２を有し得る。機械的レバー１６２は、機械的レバー１６２を動かすことができる制御可能モーター１６３に結合し得る。機械的レバー１６２は、図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄ、および図４Ｅに詳細に示すように、プロセス中にキュベットカートリッジ１３０を動かすために使用され得る。即ち、機械的レバー１６２を使用して、キュベットカートリッジ１３０をカートリッジレール１５０に沿って移動させ、キュベットカートリッジ１３０の電極（例えば、電極１３６Ａ～Ｅおよび電極１３８Ａ～Ｅ）を電極１５２および１５４に位置合わせすることができる。
【0027】
図３に示すように、機械的レバー１６２は、機械的停止部１６４を備えた「ばね」システムを使用して実現され得る。そのようなシステムでは、キュベットカートリッジ１３０を定位置に保持する機械的停止部１６４は、キュベットカートリッジの移動を妨げないように取り外されてもよい。協調動作として、機械的レバー１６２は、モーター１６３から動力を受け取り、キュベットカートリッジを次の機械的停止部１６４に移動させることができる。機械的レバー１６２は、「ねじ」システムを使用して実現することもできる。このようなシステムでは、モーター１６３は、ねじ結合を介して機械的レバー１６２に結合され、機械的レバー１６２の動きは、モーター１６３の回転数によって制御され得る。機械的レバー１６２およびキュベットカートリッジ１３０の制御された動きを生成可能な他の方法も採用され得る。
【0028】
図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄ、および図４Ｅの概略図は、図２および図３に示された線形カートリッジシステムの動作を示す。図４Ａの第１の概略図１８０Ａは、動作開始時の線形カートリッジシステムを示している。キュベットカートリッジ１３０は、カートリッジレール１５０の端部に配置され得る。この初期段階では、キュベットは電極１５２および１５４に電気的に結合されていない。初期化の後、図４Ｂの第２の概略図１８０Ｂに示すように、電界曝露用に第１のキュベットを準備するために、キュベットカートリッジ１３０が移動されてもよい。機械的レバー１６２は、第１のキュベットの電極が電極１５２および１５４に位置合わせされるように、キュベットカートリッジ１３０を動かしている。この位置で、パルス発生回路（例えば、図１のパルス発生回路１０２）は、第１のキュベットにパルス電界を生成して、そこに配置された血液サンプルまたはＰＲＰサンプルを活性化し得る。
【0029】
最初の活性化後、機械的レバー１６２は、キュベットカートリッジ１３０を図４Ｃの第３の概略図１８０Ｃに示す位置に移動させてもよい。図４Ｃに示す位置では、一連のキュベットのうちの第２のキュベットの電極を電極１５２および１５４と位置合わせしてもよい。このとき、パルス発生回路は、第２のキュベットにパルス電界を生成して、そこに配置された血液サンプルまたはＰＲＰサンプルを活性化し得る。キュベットカートリッジ１３０の移動および電極１５２および１５４を介した電気パルス印加を含むプロセスは、キュベットカートリッジ１３０の最後のキュベットがパルス電界に曝露されるまで繰り返されてもよい。この最終状態を、図４Ｄの第４の概略図１８０Ｄに示す。３番目と４番目のキュベットでのサンプルの活性化（明確さのため、この例では不図示）後にこの位置に到達し得る。第４の概略図１８０Ｄに示される位置では、活性化パルスは、電極１５２および１５４を介して提供され得る。最後のサンプルの活性化後、機械的レバーは、キュベットカートリッジ１３０を、図４Ｅの第５の概略図１８０Ｅに示す最終位置に移動させることができる。この時点で、活性化血小板化合物は、収集および治療での使用が可能であり得る。
【0030】
キュベットカートリッジ１３０およびカートリッジレール１５０は、パルス発生回路１０２と連携して、より複雑な活性化手順を実現するために使用され得る。例えば、機械的レバー１６２は、図４Ａ～図４Ｄに示されるものとは反対の方向へのキュベットカートリッジ１３０の移動を可能にし得る。図４Ａ～図４Ｄに示すものとは反対方向へのキュベットカートリッジ１３０の移動は、カートリッジレール１５０に動作可能に結合された第２の機械的レバーによっても実現され得る。そのようなシステムでの血小板活性化手順は、「休止期間」によって間隔を空けた、パルス電界パルスの複数回の印加を含み得る。例えば、システム１００のメモリに格納された手順は、キュベットカートリッジ１３０の各キュベットが上述の方法で第１のパルスシーケンスを受信する第１のパルス命令と、キュベットカートリッジを自動的に開始点に戻すカートリッジ戻し命令（つまり、キュベットカートリッジ１３０が図４Ｅに示す位置から図４Ａに示す位置に戻る）と、キュベットカートリッジ１３０の各キュベットが第２のパルスシーケンスを受けるようにする第２のパルス命令とを含み得る。この種の手順は、時間を大幅に延長することなく、大量の血液サンプルの活性化手順に「休止期間」を含めるように利用でき得る。実際、２つのパルスシーケンスの間に１分の休止期間を含む手順では、カートリッジ戻し命令により１分強が追加され得る。ただ一方で、単純な手順（例えば、第１および第２のパルスシーケンスをキュベットカートリッジレールの２番目のキュベットに印加する前に第１および第２のパルスシーケンスをキュベットカートリッジレールの最初のキュベットに印加する）でも、キュベットカートリッジ内のキュベット毎に少なくとも１分が追加され得る。
【0031】
大容量処理のためのキュベットカートリッジの使用を、図５のフローチャートによって示される方法２００を参照にさらに説明する。ボックス２０２では、ユーザは全血液またはＰＲＰサンプルをキュベットカートリッジの複数のキュベットに挿入し得る。キュベットは手動で、または自動システムを使用して取り付け可能である。ボックス２０４では、モジュール式の実施形態（例えば、キュベットカートリッジが上述のようにキュベットを収容するための構造的支持体であるシステム）において、キュベットをキュベットカートリッジに挿入してもよい。一体的に構築されたキュベットカートリッジでは、ボックス２０２および２０４によって説明されるプロセス同士が、ある程度重複し得ることに留意されたい。ボックス２０６では、ユーザは、キュベットカートリッジを、カートリッジレールの初期位置に配置することができる。初期位置の非限定的な例は、上述の図４Ａに示されている。キュベットカートリッジを初期位置に配置した後、ユーザは、メモリに格納され得る手順を実行することによってシステム１００のプロセスを開始してもよい。
【0032】
各キュベット内のサンプルを活性化するために、方法２００は、ボックス２０８および２１０によって示されるプロセスを複数回繰り返してもよい。ボックス２０８では、サンプルローダー１０４の電極と位置合わせされたキュベットカートリッジのキュベットが、電界パルスに曝露されてもよい。ボックス２１０では、サンプルローダー１０４は、キュベットカートリッジを動かして、別のキュベットをサンプルローダー１０４の電極と位置合わせさせてもよい。上記繰り返しの例については、図４Ａ～図Ｅを参照に説明した。さらに、上述のように、ボックス２１０によって示されるプロセスとして、カートリッジを移動させて、キュベットが複数のパルスシーケンスを受けるようにして、例えば「休止」期間を含む手順を実現するようにもできることにも留意されたい。プロセスの最後に、ボックス２１２で、キュベットカートリッジ内のキュベットは、手順によってカスタマイズされた、活性化血小板生成物を含み得る。ユーザは、キュベットから生成物を収集し、治療目的で使用し得る。
【0033】
上述の方法２００は、非線形形状などの他の形状を有するサンプルローダー１０４でも利用可能である。概略図２２０は、円形レール２２２を有するサンプルローダー１０４を示す。図示の円形レール２２２は、１３個のキュベット２２４Ａ、２２４Ｂ、２２４Ｃ、２２４Ｄ、２２４Ｅ、２２４Ｆ、２２４Ｇ、２２４Ｈ、２２４Ｉ、２２４Ｊ、２２４Ｋ、２２４Ｌ、および２２４Ｍを有する。図示のように、各キュベットは、サンプルローダー１０４の電極２２６および２２８と位置合わせされると、パルス発生回路１０２に電気的に結合する一対の電極を有する。円形レール２２２を有するシステムでは、図５のボックス２１０に関連する動きは、円形レール２２２の円形回転（例えば、角回転）であり得る。本明細書で説明する例は１３キュベットカートリッジに関するが、本説明は１３キュベットを有する円形キュベットカートリッジの実施形態に限定されず、キュベットの数は、円形レール２２２の調整により増減し得る。
【0034】
上記のように、自動システム１００における複数のキュベットの電気パルスへの曝露が、大容量処理のために利用され得る。図７の図２４０に示すような、電極を備えたフローセル２４１を使用することによって、大容量曝露も可能である。フローセル２４１は、２つのサンプルリザーバ２４２および２４４を含み得る。サンプルは、接続チャネル２４５を通ってサンプルリザーバ２４２と２４４の間を流れ得る。リザーバ２４２および２４４は、非導電性（例えば、非導電性）および／または生体適合性であり得るポリプロピレンおよび／またはポリエチレンバッグなどの可撓性プラスチックバッグとして実現され得る。可撓性プラスチックバッグを使用する実施形態では、リザーバ２４２と２４４との間の流れは、サンプルローダー１０４の圧縮システム（例えば、圧力ポンプ）によって生成し得る。圧縮システムを使用して流れを生成するためのメカニズムを、以下の図８Ａおよび図８Ｂに参照してさらに詳細に説明する。接続チャネル２４５を介したリザーバ２４２と２４４との間の流れは、システム間の無菌フローのための他の機構、例えば、チャネル２４５に結合された蠕動ポンプを使用して発生し得る。
【0035】
チャネル２４５は、一対の電極２４６および２４８を含むように構成され得る。一対の電極２４６および２４８とチャネル２４５との間の配置は、電極２４６と２４８との間に電位が生じると、一対の電極間の領域に配置されたサンプル体積がパルス電界に曝露されるようになっている。チャネルを流れるサンプルが電極２４６および２４８と接触して、パルス電界の生成を可能にする電気回路を閉じることができるように電極２４６および２４８は、チャネル２４５の内部に表面を有する。
【0036】
フローセル２４１によると、電極ギャップ、すなわち一対の電極２４６と２４８間の距離と、リザーバ２４２および２４４の容量に対応する、処理対象サンプル体積とを非相関にでき得る。例えば、１ｍｍ～１ｃｍの電極ギャップを有するフローセルは、例えば、５００μｌ～１００ｍｌの範囲の体積を処理することができ、適切な設計であればこれを数リットルまで増大できる。サンプル体積と電極ギャップとが相関しないことで、パルス発生回路１０２によって提供される全体的な電圧が低減可能となり得る。実際、生成される活性化生成物のサンプル体積を減らすことなく、電極ギャップを減らすことができ得る。例えば、１０ｍｍの電極ギャップを有するフローセル２４１を使用して１ｋＶ／ｃｍの電界を生成するために、パルス発生回路１０２は、電極２４６と２４８との間で１００Ｖの電気パルスを使用し得る。一方、従来の１ｃｍキュベットを使用して同じ１ｋＶ／ｃｍの電界を生成するために、パルス発生回路１０２は、１ｋＶを出力するように設計され得るが、これにはより複雑な発電回路が必要となる。
【0037】
図８Ａおよび図８Ｂは、フローセル２４１の動作を示す。図８Ａの第１の概略図２６０は、フローセル２４１がサンプルを第１のリザーバ２４２から第２のリザーバ２４４に移送または移動させている状況を示している。この例では、第１のリザーバ２４２に結合された圧力ポンプは、リザーバ２４２の可撓性壁に圧力２６２を生成する。この圧力により、チャネル２４５を通じてサンプルを動かす流れ２６４が生じる。サンプルがチャネル２４５を通って流れる間、パルス発生回路１０２は、サンプルがチャネル２４５に沿って流れるとき、電極２４６と２４８との間に位置するサンプル体積内にパルス電界を発生させる。図８Ｂの概略図２８０に示すように、このプロセスは、すべてのサンプルがリザーバ２４２からリザーバ２４４に移動するまで継続し得る。このとき、第２のリザーバ２４４に結合された第２の圧力ポンプ（図示せず）は、リザーバ２４２の壁に圧力２８２を生成し、これによりチャネル２４５を介してリザーバ２４２に戻るサンプルの流れ２８４を生じる。流れ２８４が生じている間、パルス発生回路１０２は、サンプルがチャネルに沿って流れるとき、電極２４６と２４８との間に位置するサンプル体積内にパルス電界を発生させる。
【0038】
電極２４６および２４８を使用するパルス電界の印加は、連続的に印加されてもよい。そのようなシステムでは、パルス発生回路１０２は、高周波数交流（ＡＣ）パルス信号（正および負を繰り返す）を生成することができる。生成されるＡＣ信号の周波数は、フロー２６４および２８４の流量、ならびにサンプルが接続チャネル２４５の内面に沿って流れるときにサンプルと接触する電極２４６および２４８の長さに基づいて決定される。例えば、いくつかの実施形態では、流速が速いほど、周波数が高くなり得る。別の例として、サンプルと接触する電極の長さが長いほど、低い周波数が利用され得る。流れ２６４の流量は、システム内の圧力から、またはチャネル２４５内の速度の直接測定に基づいて計算され得る。一例として、チャネル２４５に沿って測定された長さが１ｃｍの電極２４６および２４８を備え、圧力２６２および２８２がチャネル２４５に沿って１ｃｍ／ｓの流量となるように構成されているフローセル２４１では、ＡＣ信号は約１Ｈｚとなり得る。より一般的には、ＡＣ信号の周波数は、サンプル体積の一部または全体がパルス電界に曝されることを可能にするように調整され得る。チャネル２４５に沿って単一の対の電極２４６および２４８を有するシステムが説明されている、本明細書に記載の実施形態に対して多少の調整で、より多くの電極対が使用され得る。
【0039】
電極２４６および２４８を使用したパルス電界の印加は、流れ２６４および２８４を生成するポンプと協調するなどして、断続的に実施することもできる。そのために、流れと電気信号が「ストップアンドゴー」手順を使用して調整され得る。そのような手順において、短い圧力パルス（例えば、短時間の圧力パルス）が、チャネル２４５に沿ったサンプルの短い変位を生じるために印加され得る。短い圧力パルスに続いて、パルス電界をパルス発生回路１０２から発生させてもよい。短い圧力パルスとパルス電界を含むこのプロセスは、サンプル全体がリザーバ２４２と２４４の間を移動するまで繰り返され得る。
【0040】
フローセルは、オンデマンドの活性化システムにも使用され得る。同システムでは、血液サンプルは、使用時に活性化電界パルスに曝露される。図９に示される活性化血小板システム３００は、活性化生成物を生成するためのオンデマンドシステムの例を示す。この図では、活性化血小板システム３００を使用して施術者３０４が患者３０２を治療中である。活性化血小板化合物は、血小板活性化装置３０６を使用して生成され得る。図示の例では、血小板活性化装置３０６は、収集管３０８を介して患者３０２から採血する。収集管３０８は、患者３０２の静脈に配置されるシリンジに結合されてもよい。血小板活性化装置３０６は、図１１を参照にさらに詳述されるように、患者３０２から収集された血液を、血液サンプルを活性化することができる一組の電気パルスに曝露させ得る。そして活性化されたサンプルは、投与管３１０を介して患者３０２に投与され得る。
【0041】
オンデマンド機能を実現するために、血小板活性化装置３０６は、圧力および電気信号を調整して、投与管３１０内の生成物の流れと、パルス電界を使用する血小板の活性化との間の調整をしやすくするように構成され得る。投与プロセス中に、施術者は入力方法を使用して、投与管３１０の端に配置された入力装置３１２（例えば、投与管３１０の端のノズル、活性血小板システムのペダル、またはその他任意の入力装置）またはその他の入力装置での、活性化血小板化合物流内の調整（例：増加、減少、停止、一時停止、再開、急速な増加、緩やかな増加、迅速な停止、緩やかな停止等）を要求し得る。入力装置３１２は、活性化血小板生成物を患者３０２に投与するために使用されてもよい。一実施形態では、入力装置３１２は、施術者３０４が血小板活性化装置３０６からの、治療用活性化生成物の流れの調整を要求するために使用することができるトリガーまたは他の何らかの入力機構を有し得る。別の実施形態では、血小板活性化装置３０６は、施術者３０４が入力装置３１２での、活性化生成物の流れの調整を要求するために使用することができるペダルに動作可能に結合され得る。そのために、トリガーまたはペダルは、上述のように圧力およびパルス電界などのパラメータを制御して流れを調整するプロセッサに通信可能に結合され得る。血小板活性化装置３０６が入力装置３１２で流れを調整する要求を受け取ると、血小板活性化装置３０６は、より多くの活性化生成物をオンデマンドで生成し、投与管３１０を介した活性化生成物の流れを調整し得る。この機能については、図１１を参照に詳述する。
【0042】
特定の治療において、サンプルは、パルス電界の活性化の前に前処理されてもよい。図１０に示される活性化血小板治療システム３２０は、前処理装置３２４に結合され得る血小板活性化装置３２２を含む。前処理システムの例には、例えば、生の血液生成物からＰＲＰｓ生成物を生成するために使用され得る自動遠心分離システムが含まれる。前処理装置３２４は、前処理された生成物を入れることができる内部容器３２５を有し得る。収集管３２６により、内部容器３２５を血小板活性化装置３２２に結合してもよい。血小板活性化装置３２２は、図１１でさらに詳述するように、前処理装置３２４からの前処理生成物を、前処理生成物中の血小板を活性化する１つ以上の電気パルスシーケンスに曝露し得る。次に、活性化血小板生成物は、投与管３１０を介して患者３０２に投与され得る。活性化血小板生成物は、上述のように、投与管３１０に結合された入力装置３１２によって投与され得る。
【0043】
図１０の血小板活性化装置３２２は、オンデマンド機能を有し得る。血小板活性化装置３２２は、施術者３０４が操作可能なペダル、入力装置３１２のトリガー、または他の何らかの入力装置に通信可能に結合され得る。入力装置は、施術者が入力装置３１２での流れの調整を要求するために使用することができる。血小板活性化装置３２２が入力装置３１２で流れを調整する要求を受け取ると、血小板活性化装置３２２は生成を調整することができる。例えば、血小板活性化装置３２２が流れを増加させる要求を受け取った場合、血小板活性化装置３２２は、オンデマンドでより多くの活性化生成物を生成し、上記のように、投与管３１０を通る流れを増加させる。
【0044】
図１１は、オンデマンドフローセル３４２の概略図３４０を示す。オンデマンドフローセル３４２は、図９の血小板活性化装置３０６および図１０の３２２などの血小板活性化装置で使用されてもよい。オンデマンドフローセル３４２は、収集管、例えば、図９の収集管３０８または図１０の収集管３２６からサンプルを受け取る内部チャネル３４６を有し得る。内部チャネル３４６は、パルス発生回路に電気的に結合され得る一対の電極３４８および３５０を有し得る。電極３４８および３５０の一部は、内部チャネル３４６の内面の一部を形成し得る。オンデマンドフローセル３４２は、流体ポンプ３５２をさらに備え得る。流体ポンプ３５２は、内部チャネルに沿った流れを生成し、内部チャネル３４６から投与管３１０内に液体を押し出すことができる蠕動ポンプおよび／または圧力ポンプであり得る。図９および１０に示すように、投与管３１０は、活性化血小板生成物を患者３０２に投与するために使用され得る入力装置３１２に結合され得る。血小板活性化装置（例えば、血小板活性化装置３０６、血小板活性化装置３２２）はまた、コントローラ３６２に結合され得、コントローラ３６２は、コントローラ３６２に動作可能に結合された入力装置３６４から命令を受信し得る。入力装置の例には、上述のように、入力装置３１２のペダルまたはトリガー、またはノズル／アプリケータ／ディストリビュータへの流れを調整または遮断する任意の制御機構が含まれる。
【0045】
図３４０に示されているシステムは、上述のように、オンデマンド方式で動作し得る。そのために、施術者は、入力装置３６４との相互作用を通じて、入力装置３１２での活性化血小板生成物の流れを要求することができる。コントローラ３６２は、入力装置３６４からのコマンドに応じて、電極３４８および３５０に結合されたパルス発生回路（図示せず）を動作させて、内部チャネル３４６に沿って流れるサンプルを活性化させることができる。さらに、入力装置３６４からのコマンドに応じて、コントローラ３６２はまた、圧力ポンプ３５２を操作して、流体を収集管（例えば、収集管３０８、収集管３２６）から投与管３１０に押し込むことができる。圧力ポンプ３５２およびパルス発生回路の動作は、図７に示されるフローセル２４１に関して説明されたものと同様の方法で調整されてもよい。圧力ポンプ３５２は、入力装置３１２での処理を妨害する可能性がある気泡または同様のガスの蓄積の形成を低減するための弁を含み得ることに留意されたい。そのために、圧力ポンプ３５２は、内部チャネル３４６に蓄積された空気の放出を可能にすることができる弁を備え得る。
【0046】
本発明の技術的効果には、血液およびＰＲＰサンプル中の大量の（例えば、１ｍｌを超える）血小板の自動活性化を可能にする方法およびシステムが含まれる。本明細書に記載の実施形態を使用して、血小板活性化化合物の使用の有無にかかわらず、無菌の自動方式で活性化血小板生成物のより速い生成を実現できる。カートリッジベースのシステムの使用により、血小板活性化化合物の大量生産を確実に容易にし得る。フローベースのシステムの使用により、使用させる電極ギャップが低減され得、それにより電源の複雑さが低減され得る。さらに、本明細書で論じられるフローベースのシステムは、血小板生成物の「オンデマンド」活性化を可能にするように適合され得る。したがって、活性化生成物の生成と治療への利用との間のタイムラグを低減することによって治療の効力を増大し得る。
【0047】
本稿記載の説明は、例を使用して、最良の形態を含む本発明を開示し、また、当業者に任意のデバイスまたはシステムの作製および使用、および組み込まれた方法の実行を含む、本発明を実施できるようにする。本発明の特許可能な範囲は、特許請求の範囲によって定義され、当業者が想到する他の例を含み得る。そのような他の例は、クレームの文言に反しない構造要素がある限り、またはクレームの文言から大きく異なることはない、同等の構造要素を含む場合、クレームの範囲内にあるものとする。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10】
【図11】
