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特許7383043アミロスフェロイド（ＡＳＰＤ）の代替物となりうるアミロイドβタンパク質（Ａβ）の架橋体、及びＡＳＰＤの分析
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-11-09
(45)【発行日】2023-11-17
(54)【発明の名称】アミロスフェロイド（ＡＳＰＤ）の代替物となりうるアミロイドβタンパク質（Ａβ）の架橋体、及びＡＳＰＤの分析
(51)【国際特許分類】
G01N 33/531 20060101AFI20231110BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20231110BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20231110BHJP
G01N 33/543 20060101ALI20231110BHJP
G01N 33/547 20060101ALI20231110BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20231110BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20231110BHJP
【ＦＩ】
G01N33/531 A
G01N33/50 F ZNA
G01N33/53 D
G01N33/543 511D
G01N33/547
C07K14/47
C07K16/18
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2021558415
(86)(22)【出願日】2020-11-18
(86)【国際出願番号】 JP2020042938
(87)【国際公開番号】W WO2021100744
(87)【国際公開日】2021-05-27
【審査請求日】2022-08-09
(31)【優先権主張番号】P 2019209136
(32)【優先日】2019-11-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【早期審査対象出願】
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】300061835
【氏名又は名称】公益財団法人神戸医療産業都市推進機構
(74)【代理人】
【識別番号】110000040
【氏名又は名称】弁理士法人池内アンドパートナーズ
(72)【発明者】
【氏名】星 美奈子
(72)【発明者】
【氏名】荒井 由江
(72)【発明者】
【氏名】町田 清隆
【審査官】西浦 昌哉
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１７／１７９６４６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２００８－２９１０２５（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２００９／０５７６６４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２００８－５３１６３５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１９－５１８１９６（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２００９／０２４６１９１（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第９９／０４１２７９（ＷＯ，Ａ２）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／４８－３３／９８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記の工程：（１）不溶性担体に結合している、アミロスフェロイド（ＡＳＰＤ）に結合可能な抗体（第一抗体）に、ＡＳＰＤを含有している可能性がある生体由来試料を接触させて、ＡＳＰＤが含有されている場合に第一抗体にＡＳＰＤを結合させる工程；及び
（２）工程（１）で第一抗体に結合したＡＳＰＤに、抗ＡＳＰＤモノクローナル抗体（第二抗体）を反応させる工程
を含み、
第一抗体が、ヒト化抗ＡＳＰＤモノクローナル抗体ｈｕＡＳＤ２、又は、モノクローナル抗体ＢＡＮ５０ａであり、
第二抗体が、マウスモノクローナル抗ＡＳＰＤ抗体ｍＡＳＤ３又はその標識化抗体である、ＡＳＰＤの分析方法。
【請求項2】
さらに、下記の工程：（３）工程（２）でＡＳＰＤに結合した第二抗体に、レポーターが連結した抗マウス抗体を反応させる工程、又は、工程（２）でＡＳＰＤに結合した第二抗体の標識に、レポーターが連結した前記標識の結合パートナーを反応させる工程
を含む、請求項１に記載の分析方法。
【請求項3】
ＡＳＰＤの標準物質として、ＡＳＰＤに特異的な抗体に対してＡＳＰＤと競合する物質を使用し、前記物質は、アミロイドβタンパク質（Ａβ）が架橋剤によって架橋された物質であり、
前記架橋剤は、両端の反応末端がＮＨＳエステルである架橋剤であって、前記架橋剤は、スペーサーアーム長が２１Å以上３６Å以下である架橋剤、又は、スペーサーアームとして１以上１３以下のオキシエチレン基（－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－）及び／又はオキシプロピレン基（－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－）を有する架橋剤である、請求項１又は２に記載の分析方法。
【請求項4】
前記架橋剤は、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）、スルホエチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）、ビス（スクシンイミジル）ペンタ（エチレングリコール）、及びビス（スクシンイミジル）ノナ（エチレングリコールからなる群から選択される、請求項３に記載の分析方法。
【請求項5】
請求項３又は４に記載の分析方法に使用するための、ＡＳＰＤに特異的な抗体に対してＡＳＰＤと競合する物質であって、アミロイドβタンパク質（Ａβ）が架橋剤によって架橋された物質であり、
前記架橋剤は、両端の反応末端がＮＨＳエステルである架橋剤であって、前記架橋剤は、スペーサーアーム長が２１Å以上３６Å以下である架橋剤、又は、スペーサーアームとして１以上１３以下のオキシエチレン基（－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－）及び／又はオキシプロピレン基（－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－）を有する架橋剤である、物質。
【請求項6】
前記架橋剤は、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）、スルホエチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）、ビス（スクシンイミジル）ペンタ（エチレングリコール）、及びビス（スクシンイミジル）ノナ（エチレングリコール）からなる群から選択される、請求項５に記載の物質。
【請求項7】
請求項５又は６に記載の物質と、請求項１で規定された第１抗体と請求項１で規定された第２抗体とを含む、請求項３又は４に記載の分析方法に使用するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、アミロイドβタンパク質（Ａβ）の架橋体、アミロスフェロイド（ＡＳＰＤ）の代替物となりうるＡβ架橋体（cross-linked Aβ）、及びＡＳＰＤの分析に関する。
【背景技術】
【0002】
アミロスフェロイド（amylospheroids（ＡＳＰＤ））は、アミロイドβタンパク質（Ａβ）が約３０個集まった直径約１０～１５ｎｍの球状のＡβ集合体であって、アルツハイマー病の神経細胞死が起きるうえで重要な役割を果たすと考えられる構造体である。
【0003】
ＡＳＰＤは、強い神経毒性を示すin vitroで合成されたＡβ集合体（すなわち、合成ＡＳＰＤ）として単離された（非特許文献１）。この合成ＡＳＰＤに対する特異的な抗体が作製され（特許文献１及び２）、この抗体を用い、アルツハイマー病のヒト患者の脳から、実際に、生体内で形成されたＡＳＰＤ（すなわち、ネイティブＡＳＰＤ）が単離された（非特許文献１）。
【0004】
ネイティブＡＳＰＤ及び合成ＡＳＰＤは、同様に、成熟神経細胞に対して選択的に細胞死を誘発する。この神経細胞死におけるＡＳＰＤのターゲットが、神経の生存と機能に極めて重要な役割を果たしているシナプスタンパク質「Ｎａ+，Ｋ+－ＡＴＰａｓｅポンプのα３サブユニット（以下、ＮＡＫα３）」であることが発見され、ＡＳＰＤの結合によりＮＡＫα３の機能が低下し、神経細胞が過剰に興奮することで神経細胞が死に至ることが明らかにされた（特許文献３、非特許文献２）。
【0005】
アルツハイマー病における臨床症状と最も相関するのが神経細胞の脱落である。神経細胞脱落が認められるアルツハイマー病患者の大脳皮質におけるネイティブＡＳＰＤ量は、アルツハイマー病の重症度に相関して増加し、そして、神経細胞脱落があまり認められないアルツハイマー病患者の小脳におけるネイティブＡＳＰＤ量は微量しか存在しないことが明らかとなった（非特許文献３）。したがってアミロスフェロイドは、アルツハイマー病が発症する不可逆的段階において重要な役割を果たすと考えられる。さらに、ネイティブＡＳＰＤは、レビー小体型認知症患者の脳からも検出されており（非特許文献３）、レビー小体型認知症においてもＡＳＰＤはその発症において重要な役割を果たすと考えられる。
【0006】
ネイティブＡＳＰＤと等価であると考えられる合成ＡＳＰＤは、Ａβを含む液体をゆっくり撹拌することにより製造されうる（非特許文献１、特許文献４）。
また、ネイティブＡＳＰＤと等価であると考えられる細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体は、例えば、所定のＡＰＰタンパク質を発現するＣＨＯ細胞から分泌させることができ、該ＣＨＯ細胞の培養上清から得ることができる（特許文献５）。
また、ネイティブＡＳＰＤと等価であると考えられる細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体は、例えば、所定のＡＰＰタンパク質を発現するＣＨＯ細胞から分泌させることができ、該ＣＨＯ細胞の培養上清から得ることができる（特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【文献】ＷＯ２００６／０１６６４４
【文献】ＷＯ２００９／０５７６６４
【文献】ＷＯ２０１３／０９９８０６
【文献】ＷＯ２０１３／０９４６１４
【文献】ＷＯ２０１７／１７９６４６
【非特許文献】
【0008】
【文献】Hoshi et al., Spherical aggregates of β-amyloid (amylospheroid) show high neurotoxicity and activate tau protein kinase I/glycogen synthase kinase-3β, PNAS May 27, 2003 vol. 100 no. 11 6370-6375
【文献】Ohnishi et al., Na, K-ATPase α3 is a death target of Alzheimer patient amyloid-β assembly, PNAS August 11, 2015 vol. 112 no. 32 E4465-E4474
【文献】Noguchi et al., Isolation and characterization of patient-derived, toxic, high mass amyloid beta-protein (Abeta) assembly from Alzheimer disease brains, J Biol Chem. 2009 Nov 20;284(47):32895-905
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
上述のとおり、アミロスフェロイド（ＡＳＰＤ）はアルツハイマー病やレビー小体型認知症において重要な役割を果たす。ＡＳＰＤが関与する疾病の予防、診断、治療等において、対象（患者）の生体試料中のＡＳＰＤを分析する必要性が高まっている。
また、ＡＳＰＤを標的とする治療薬が開発された際には、そのコンパニオン診断のためにＡＳＰＤの分析が必要となる。
また、ＡＳＰＤを標的とする治療薬が開発された際には、そのコンパニオン診断のためにＡＳＰＤの分析が必要となる。
【0010】
物質を分析（測定を含む）する場合、通常、標準物質（スタンダード）が必要である。標準物質は、例えば、キャリブレーションや検量線の作成に使用される。ネイティブＡＳＰＤ、合成ＡＳＰＤ、及び細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体は、ＡＳＰＤの分析の標準物質として使用できる。
一方で、診断キットの標準物質としては、安定した製造が可能で、保管安定性に優れ、製造コストが低いことが望まれる。ネイティブＡＳＰＤ、合成ＡＳＰＤ、及び細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体は、ＡＳＰＤを分析するためのキットの標準物質としては、製造の容易性、保管安定性、製造コストなどの観点から問題がある。
そこで、本開示は、一態様において、ＡＳＰＤの代替物となりうる物質、又は、ＡＳＰＤの分析においてＡＳＰＤの標準物質となりうる物質を提供する。
一方で、診断キットの標準物質としては、安定した製造が可能で、保管安定性に優れ、製造コストが低いことが望まれる。ネイティブＡＳＰＤ、合成ＡＳＰＤ、及び細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体は、ＡＳＰＤを分析するためのキットの標準物質としては、製造の容易性、保管安定性、製造コストなどの観点から問題がある。
そこで、本開示は、一態様において、ＡＳＰＤの代替物となりうる物質、又は、ＡＳＰＤの分析においてＡＳＰＤの標準物質となりうる物質を提供する。
【0011】
また、本開示は、その他の一態様において、生体試料、例えば、血液や脳脊髄液中のＡＳＰＤを分析できる方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本開示は、一態様において、ＡＳＰＤに特異的な抗体に対してＡＳＰＤと競合する物質であって、Ａβが架橋剤によって架橋された物質であり、前記架橋剤は、スペーサーアーム長が４Å以上５０Å以下である架橋剤、又は、スペーサーアームとして１以上１３以下のオキシエチレン基（－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－）及び／又はオキシプロピレン基（－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－）を有する架橋剤である物質に関する。
本開示は、その他の態様において、Ａβの架橋体であって、Ａβが、スペーサーアーム長が４Å以上５０Å以下である架橋剤、又は、スペーサーアームとして１以上１３以下のオキシエチレン基及び／又はオキシプロピレン基を有する架橋剤によって架橋されている架橋体に関する。
本開示は、その他の態様において、Ａβの架橋体であって、Ａβが、スペーサーアーム長が４Å以上５０Å以下である架橋剤、又は、スペーサーアームとして１以上１３以下のオキシエチレン基及び／又はオキシプロピレン基を有する架橋剤によって架橋されている架橋体に関する。
【0013】
本開示は、その他の態様において、下記の工程：
（１）不溶性担体に結合している、ＡＳＰＤに結合可能な抗体（第一抗体）に、ＡＳＰＤを含有している可能性がある生体由来試料を接触させて、ＡＳＰＤが含有されている場合に第一抗体にＡＳＰＤを結合させる工程；及び
（２）工程（１）で第一抗体に結合したＡＳＰＤに、抗ＡＳＰＤモノクローナル抗体（第二抗体）を反応させる工程
を含み、
第一抗体が、ヒト化抗ＡＳＰＤモノクローナル抗体ｈｕＡＳＤ２、又は、モノクローナル抗体ＢＡＮ５０ａであり、第二抗体が、抗ＡＳＰＤモノクローナル抗体ｍＡＳＤ３又はその標識化抗体である、ＡＳＰＤの分析方法に関する。
（１）不溶性担体に結合している、ＡＳＰＤに結合可能な抗体（第一抗体）に、ＡＳＰＤを含有している可能性がある生体由来試料を接触させて、ＡＳＰＤが含有されている場合に第一抗体にＡＳＰＤを結合させる工程；及び
（２）工程（１）で第一抗体に結合したＡＳＰＤに、抗ＡＳＰＤモノクローナル抗体（第二抗体）を反応させる工程
を含み、
第一抗体が、ヒト化抗ＡＳＰＤモノクローナル抗体ｈｕＡＳＤ２、又は、モノクローナル抗体ＢＡＮ５０ａであり、第二抗体が、抗ＡＳＰＤモノクローナル抗体ｍＡＳＤ３又はその標識化抗体である、ＡＳＰＤの分析方法に関する。
【発明の効果】
【0014】
本開示によれば、一態様において、ＡＳＰＤの代替物となりうる物質、又は、ＡＳＰＤの分析においてＡＳＰＤの標準物質となりうる物質を提供できる。
また、本開示によれば、その他の一態様において、生体試料、例えば、血液や脳脊髄液中のＡＳＰＤを分析できる方法を提供できる。
また、本開示によれば、その他の一態様において、生体試料、例えば、血液や脳脊髄液中のＡＳＰＤを分析できる方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【発明を実施するための形態】
【0016】
本開示は、一態様において、所定の架橋剤で架橋したＡβの架橋体が、ＡＳＰＤに特異的な抗体に対してＡＳＰＤと同様の反応性を示すという知見に基づく。
本開示は、その他の態様において、所定の抗体の組み合わせにより、生体試料内のＡＳＰＤを効率的に分析できるという知見に基づく。
本開示は、その他の態様において、所定の抗体の組み合わせにより、生体試料内のＡＳＰＤを効率的に分析できるという知見に基づく。
【0017】
本開示において、単にＡＳＰＤという場合には、ネイティブＡＳＰＤ、合成ＡＳＰＤ、及び細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体を含みうる。
【0018】
ＡＳＰＤに特異的な抗体としては、一又は複数の実施形態において、ＷＯ２００６／０１６６４４及びＷＯ２００９／０５７６６４に開示されるポリクローナル抗ＡＳＰＤ抗体及びモノクローナル抗ＡＳＰＤ抗体が挙げられ、さらなる一又は複数の実施形態において、ウサギポリクローナル抗ＡＳＰＤ抗体（ｒｐＡＳＤ１、ｒｐＡＳＤ２及びｒｐＡＳＤ３）、マウスモノクローナル抗ＡＳＰＤ抗体（ｍＡＳＤ１、ｍＡＳＤ２及びｍＡＳＤ３）、ハムスターモノクローナル抗ＡＳＰＤ抗体（ｈａＡＳＤ１、ｈａＡＳＤ２、ｈａＡＳＤ３、ｈａＡＳＤ４及びｈａＡＳＤ５）、並びに、ヒト化モノクローナル抗ＡＳＰＤ抗体（ｈｕＡＳＤ２）等が挙げられる。
【0019】
［アミロイドβタンパク質］
Ａβは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の一部に相当する配列からなるタンパク質で、生体内でβセレクターゼ及びγセレクターゼによってＡＰＰから切り出されるペプチドの配列を有するタンパク質である。
本開示において、単にＡβというときは、Ａβ３８（Ａβ１－３８）、Ａβ３９（Ａβ１－３９）、Ａβ４０（Ａβ１－４０）、Ａβ４１（Ａβ１－４１）、Ａβ４２（Ａβ１－４２）、Ａβ４３（Ａβ１－４３）、又はこれらの全部若しくは一部を指し得る。
本開示において、単にＡβというときは、ヒトＡβ及び非ヒト哺乳類Ａβを含みうる。
ヒトＡＰＰとしては、一又は複数の実施形態において、ｈＡＰＰ７７０、ｈＡＰＰ７５１、及びｈＡＰＰ６９５などのスプライシングバリアントが挙げられる。ｈＡＰＰ７７０（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０００４７５（VERSION NP#000475.1 GI:4502167）が挙げられるが、これに限定されない。
ヒトＡβのＮ末端のアミノ酸（Ａβの１番目のアミノ酸）は、ｈＡＰＰ７７０の６７２番目のアミノ酸Ｄ（アスパラギン酸）に相当する。
Ａβは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の一部に相当する配列からなるタンパク質で、生体内でβセレクターゼ及びγセレクターゼによってＡＰＰから切り出されるペプチドの配列を有するタンパク質である。
本開示において、単にＡβというときは、Ａβ３８（Ａβ１－３８）、Ａβ３９（Ａβ１－３９）、Ａβ４０（Ａβ１－４０）、Ａβ４１（Ａβ１－４１）、Ａβ４２（Ａβ１－４２）、Ａβ４３（Ａβ１－４３）、又はこれらの全部若しくは一部を指し得る。
本開示において、単にＡβというときは、ヒトＡβ及び非ヒト哺乳類Ａβを含みうる。
ヒトＡＰＰとしては、一又は複数の実施形態において、ｈＡＰＰ７７０、ｈＡＰＰ７５１、及びｈＡＰＰ６９５などのスプライシングバリアントが挙げられる。ｈＡＰＰ７７０（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０００４７５（VERSION NP#000475.1 GI:4502167）が挙げられるが、これに限定されない。
ヒトＡβのＮ末端のアミノ酸（Ａβの１番目のアミノ酸）は、ｈＡＰＰ７７０の６７２番目のアミノ酸Ｄ（アスパラギン酸）に相当する。
【0020】
本開示において、単にＡβというときは、野生型及び変異型のＡβを含みうる。
変異型Ａβとしては、一又は複数の実施形態において、変異型ＡＰＰから切り出されるペプチドの配列を有するものが挙げられる。変異型ＡＰＰとしては、家族性アルツハイマー病に連鎖する変異が挙げられ、例えば、Ｓｗｅｄｉｓｈ変異、Ｌｅｕｖｅｎ変異、Ｉｃｅｌａｎｄｉｃ変異、Ｌｏｎｄｏｎ変異、Ｉｒａｎｉａｎ変異、Ａｕｓｔｒｉａｎ変異、Ｇｅｒｍａｎ変異、Ｆｒｅｎｃｈ変異、Ｆｌｏｒｉｄａ変異、Ｉｂｅｒｉａｎ変異、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ変異、Ｂｅｌｇｉａｎ変異、Ｆｌｅｍｉｓｈ変異、Ｉｃｅｌａｎｄｉｃ変異、Ｂｒｉｔｉｓｈ変異、Ｔｏｔｔｏｒｉ変異、Ｉｔａｌｉａｎ変異、Ａｒｃｔｉｃ変異、Ｏｓａｋａ変異、Ｉｏｗａ変異、Ｄｕｔｃｈ変異などが挙げられる。その他の変異としては、修飾アミノ酸、非天然アミノ酸、Ｄ－アミノ酸等への変異を含みうる。修飾アミノ酸としては、一又は複数の実施形態において、アミノ基修飾、カルボキシル基修飾、チオール基修飾、水酸基修飾、糖化修飾、ＰＥＧ化修飾等が挙げられる。
変異型Ａβとしては、一又は複数の実施形態において、変異型ＡＰＰから切り出されるペプチドの配列を有するものが挙げられる。変異型ＡＰＰとしては、家族性アルツハイマー病に連鎖する変異が挙げられ、例えば、Ｓｗｅｄｉｓｈ変異、Ｌｅｕｖｅｎ変異、Ｉｃｅｌａｎｄｉｃ変異、Ｌｏｎｄｏｎ変異、Ｉｒａｎｉａｎ変異、Ａｕｓｔｒｉａｎ変異、Ｇｅｒｍａｎ変異、Ｆｒｅｎｃｈ変異、Ｆｌｏｒｉｄａ変異、Ｉｂｅｒｉａｎ変異、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ変異、Ｂｅｌｇｉａｎ変異、Ｆｌｅｍｉｓｈ変異、Ｉｃｅｌａｎｄｉｃ変異、Ｂｒｉｔｉｓｈ変異、Ｔｏｔｔｏｒｉ変異、Ｉｔａｌｉａｎ変異、Ａｒｃｔｉｃ変異、Ｏｓａｋａ変異、Ｉｏｗａ変異、Ｄｕｔｃｈ変異などが挙げられる。その他の変異としては、修飾アミノ酸、非天然アミノ酸、Ｄ－アミノ酸等への変異を含みうる。修飾アミノ酸としては、一又は複数の実施形態において、アミノ基修飾、カルボキシル基修飾、チオール基修飾、水酸基修飾、糖化修飾、ＰＥＧ化修飾等が挙げられる。
【0021】
［Ａβ架橋体］
本開示は、一態様において、所定の架橋体でＡβが架橋されたＡβ架橋体に関する。Ａβについては、上述のとおりである。
本開示は、一態様において、所定の架橋体でＡβが架橋されたＡβ架橋体に関する。Ａβについては、上述のとおりである。
【0022】
本開示に係るＡβ架橋体に用いる架橋剤は、一又は複数の実施形態において、スペーサーアーム長が４Å以上５０Å以下である架橋剤である。スペーサーアーム長とは、架橋剤の分子スパン（結合分子間の距離）をいう。架橋体のスペーサーアーム長は、市販の架橋体のカタログや製品説明書に記載されており、当業者であれば適宜選択し入手できる。
スペーサーアーム長としては、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤに特異的な抗体に対する反応性をＡＳＰＤに近づける観点から、４Å以上であって、７Å以上が好ましく、１０Å以上が好ましく、１３Å以上がより好ましく、１４Å以上がより好ましく、１５Å以上がより好ましく、１６Å以上がさらに好ましく、１７Å以上がさらに好ましく、１８Å以上がさらに好ましく、１９Å以上がさらに好ましく、２０Å以上がさらに好ましく、２１Å以上がさらに好ましい。
スペーサーアーム長としては、一又は複数の実施形態において、同様の観点から、５０Å以下であって、４５Å以下が好ましく、４０Å以下がより好ましく、３６Å以下がさらに好ましく、３３Å以下がさらに好ましく、３０Å以下がさらに好ましく、２７Å以下がさらに好ましく、２４Å以下がさらに好ましい。
スペーサーアーム長としては、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤに特異的な抗体に対する反応性をＡＳＰＤに近づける観点から、４Å以上であって、７Å以上が好ましく、１０Å以上が好ましく、１３Å以上がより好ましく、１４Å以上がより好ましく、１５Å以上がより好ましく、１６Å以上がさらに好ましく、１７Å以上がさらに好ましく、１８Å以上がさらに好ましく、１９Å以上がさらに好ましく、２０Å以上がさらに好ましく、２１Å以上がさらに好ましい。
スペーサーアーム長としては、一又は複数の実施形態において、同様の観点から、５０Å以下であって、４５Å以下が好ましく、４０Å以下がより好ましく、３６Å以下がさらに好ましく、３３Å以下がさらに好ましく、３０Å以下がさらに好ましく、２７Å以下がさらに好ましく、２４Å以下がさらに好ましい。
【0023】
本開示に係るＡβ架橋体に用いる架橋剤は、一又は複数の実施形態において、スペーサーアームとして１以上１３以下のオキシエチレン基（－ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－、ＥＯ基）及び／又はオキシプロピレン基（－ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｏ－、ＰＯ基）を有する架橋剤である。スペーサーアームとは、架橋剤の反応性末端間の骨格又は基をいう。
スペーサーアームにおけるＥＯ基及びＰＯ基の合計の数としては、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤに特異的な抗体に対する反応性をＡＳＰＤに近づける観点から、１以上であって、２以上が好ましく、３以上がより好ましく、４以上がさらに好ましい。
スペーサーアームにおけるＥＯ基及びＰＯ基の合計の数としては、一又は複数の実施形態において、同様の観点から、１３以下であって、１０以下が好ましく、９以下がより好ましく、８以下がさらに好ましく、７以下がさらに好ましく、６以下がさらに好ましい。
スペーサーアームにおけるＥＯ基及びＰＯ基の合計の数としては、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤに特異的な抗体に対する反応性をＡＳＰＤに近づける観点から、１以上であって、２以上が好ましく、３以上がより好ましく、４以上がさらに好ましい。
スペーサーアームにおけるＥＯ基及びＰＯ基の合計の数としては、一又は複数の実施形態において、同様の観点から、１３以下であって、１０以下が好ましく、９以下がより好ましく、８以下がさらに好ましく、７以下がさらに好ましく、６以下がさらに好ましい。
【0024】
本開示に係るＡβ架橋体に用いる架橋剤の架橋標的は、一又は複数の実施形態において、アミノ基、スルフヒドリル基、カルボキシル基、非選択などが挙げられる。
本開示に係るＡβ架橋体に用いる架橋剤の反応末端は、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤに特異的な抗体に対する反応性をＡＳＰＤに近づける観点から、アミノ基間を架橋する反応末端が好ましく、ＮＨＳエステル又はイミドエステルが挙げられる。
本開示に係るＡβ架橋体に用いる架橋剤は、開裂性があってもよく、なくてもよい。安定性の観点からは、開裂性はないことが好ましい。
本開示に係るＡβ架橋体に用いる架橋剤の反応末端は、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤに特異的な抗体に対する反応性をＡＳＰＤに近づける観点から、アミノ基間を架橋する反応末端が好ましく、ＮＨＳエステル又はイミドエステルが挙げられる。
本開示に係るＡβ架橋体に用いる架橋剤は、開裂性があってもよく、なくてもよい。安定性の観点からは、開裂性はないことが好ましい。
【0025】
本開示に係るＡβ架橋体に用いる架橋剤は、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤに特異的な抗体に対する反応性をＡＳＰＤに近づける観点から、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート） （ＥＧＳ、スペーサーアーム長１６．１Å）、スルホＥＧＳ（スペーサーアーム長１６．１Å）、ビス（スクシンイミジル）ペンタ（エチレングリコール） （ＢＳ（ＰＥＧ）5、スペーサーアーム長２１．７Å）、ビス（スクシンイミジル）ノナ（エチレングリコール） （ＢＳ（ＰＥＧ）9、スペーサーアーム長３５．８Å）が好ましく、ＢＳ（ＰＥＧ）5、及びＢＳ（ＰＥＧ）9がより好ましく、ＢＳ（ＰＥＧ）5がさらに好ましい。
【0026】
本開示に係るＡβ架橋体に用いるＡβは、ＡＳＰＤに特異的な抗体に対する反応性をＡＳＰＤに近づける観点から、Ａβ３８、Ａβ３９、Ａβ４０、Ａβ４１又はＡβ４２が挙げられ、Ａβ４０又はＡβ４２が好ましく、Ａβ４２がより好ましい。
【0027】
本開示に係るＡβ架橋体の分子量は、一又は複数の実施形態において、１０－２０％ＳＤＳＰＡＧＥで分析される分子量として、１００ｋＤａを超え、又は、１１４ｋＤａを超える。
【0028】
本開示に係るＡβ架橋体は、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤの細胞毒性、すなわち、機能的に成熟した神経細胞に選択的に細胞死を誘発する特性が、ＡＳＰＤと同等であってもよく、或いは、ＡＳＰＤよりも弱毒性であってもよく、或いは、細胞毒性を有していなくてもよく、或いは、ＡＳＰＤと比べて毒性が高くてもよい。本開示に係るＡβ架橋体は、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤよりも弱毒性であってもよく、或いは、細胞毒性を有していない。
【0029】
本開示に係るＡβ架橋体は、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤに特異的な抗体に対する反応性が、ＡＳＰＤ以外のＡβ凝集体の反応性に比べて、ＡＳＰＤの反応性に近く、より好ましくは、ＡＳＰＤと同等な反応性である。
本開示に係るＡβ架橋体は、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤに特異的な抗体に対してＡＳＰＤと競合する物質である。
本開示に係るＡβ架橋体は、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤに特異的な抗体に対する反応性の観点から、ＡＳＰＤの代替物となりうる。
本開示に係るＡβ架橋体は、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤに特異的な抗体に対してＡＳＰＤと競合する物質である。
本開示に係るＡβ架橋体は、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤに特異的な抗体に対する反応性の観点から、ＡＳＰＤの代替物となりうる。
【0030】
本開示に係るＡβ架橋体は、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤ分析又はそのキットの標準物質となりうる。
本開示において、ＡＳＰＤの分析は、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤの検出、測定、定量、及びそれらを利用するスクリーニングを含みうる。
本開示に係るＡβ架橋体が標準物質として使用されるＡＳＰＤ分析としては、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤに特異的な抗体を使用する免疫測定法を利用した分析が挙げられ、より具体的には、ＡＳＰＤに特異的な抗体を使用する酵素免疫測定法、化学発光・酵素免疫測定法が挙げられ、より具体的には、ＡＳＰＤに特異的な抗体を使用するEnzyme-Linked Immunosorbent Assay（ＥＬＩＳＡ）やChemiluminescent Enzyme immunoassay（ＣＬＥＩＡ）などが挙げられる。
一又は複数の実施形態において、本開示に係るＡβ架橋体は、ＡＳＰＤ分析において検量線の作成に使用されうる。その他の一又は複数の実施形態において、本開示に係るＡβ架橋体は、ＡＳＰＤ分析においてポジティブコントロールとして使用されうる。
本開示において、ＡＳＰＤの分析は、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤの検出、測定、定量、及びそれらを利用するスクリーニングを含みうる。
本開示に係るＡβ架橋体が標準物質として使用されるＡＳＰＤ分析としては、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤに特異的な抗体を使用する免疫測定法を利用した分析が挙げられ、より具体的には、ＡＳＰＤに特異的な抗体を使用する酵素免疫測定法、化学発光・酵素免疫測定法が挙げられ、より具体的には、ＡＳＰＤに特異的な抗体を使用するEnzyme-Linked Immunosorbent Assay（ＥＬＩＳＡ）やChemiluminescent Enzyme immunoassay（ＣＬＥＩＡ）などが挙げられる。
一又は複数の実施形態において、本開示に係るＡβ架橋体は、ＡＳＰＤ分析において検量線の作成に使用されうる。その他の一又は複数の実施形態において、本開示に係るＡβ架橋体は、ＡＳＰＤ分析においてポジティブコントロールとして使用されうる。
【0031】
本開示に係るＡβ架橋体は、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病の診断におけるＡＳＰＤ分析の標準物質となりうる。ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病としては、一又は複数の実施形態において、アルツハイマー病、及びレビー小体型認知症などが挙げられる。
本開示に係るＡβ架橋体は、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤを標的とした治療薬のコンパニオン診断におけるＡＳＰＤ分析又はそのキットの標準物質となりうる。本開示に係るＡβ架橋体は、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤを標的とした治療薬のコンパニオン診断薬の一成分となりうる。
本開示に係るＡβ架橋体は、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤを標的とした治療薬のコンパニオン診断におけるＡＳＰＤ分析又はそのキットの標準物質となりうる。本開示に係るＡβ架橋体は、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤを標的とした治療薬のコンパニオン診断薬の一成分となりうる。
【0032】
よって、本開示は、その他の態様において、本開示に係るＡβ架橋体を標準物質として含むＡＳＰＤ分析キットに関する。本態様に係るＡＳＰＤ分析キットは、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤに特異的な抗体を使用する免疫測定法に必要な試薬を含む。前記試薬としては、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤに特異的な抗体が挙げられる。
本態様に係るＡＳＰＤ分析キットは、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病の診断のためのＡＳＰＤ分析キット、ＡＳＰＤを標的とした治療薬のコンパニオン診断のためのＡＳＰＤ分析キット、又は、ＡＳＰＤを標的とした治療薬のコンパニオン診断薬である。
ＡＳＰＤを標的とした治療薬としては、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病の予防、改善、及び／又は治療のための医薬組成物が挙げられる。
本態様に係るＡＳＰＤ分析キットは、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病の診断のためのＡＳＰＤ分析キット、ＡＳＰＤを標的とした治療薬のコンパニオン診断のためのＡＳＰＤ分析キット、又は、ＡＳＰＤを標的とした治療薬のコンパニオン診断薬である。
ＡＳＰＤを標的とした治療薬としては、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病の予防、改善、及び／又は治療のための医薬組成物が挙げられる。
【0033】
本開示に係るＡβ架橋体は、一又は複数の実施形態において、免疫原性を有し、本開示に係るＡβ架橋体に対する抗体の産生を誘導しうる。
また、本開示に係るＡβ架橋体は、一又は複数の実施形態において、免疫原性を有し、ＡＳＰＤに対する抗体の産生を誘導しうる。
よって、本開示に係るＡβ架橋体は、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤに対する抗体を誘導できる観点から、ＡＳＰＤの代替物となりうる。
また、本開示に係るＡβ架橋体は、一又は複数の実施形態において、免疫原性を有し、ＡＳＰＤに対する抗体の産生を誘導しうる。
よって、本開示に係るＡβ架橋体は、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤに対する抗体を誘導できる観点から、ＡＳＰＤの代替物となりうる。
【0034】
ＡＳＰＤを、ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病に対して能動ワクチンとして使用することはすでに開示されている（例えば、ＷＯ２０１７／１７９６４６）。
本開示に係るＡβ架橋体はＡＳＰＤの代替物となりうることから、本開示に係るＡβ架橋体も、能動ワクチンとして使用でき、また、ワクチンの製造に使用できる。
本開示に係るＡβ架橋体はＡＳＰＤの代替物となりうることから、本開示に係るＡβ架橋体も、能動ワクチンとして使用でき、また、ワクチンの製造に使用できる。
【0035】
よって、本開示は、一態様において、本開示に係るＡβ架橋体を有効成分とする医薬組成物に関する。本開示に係る医薬組成物の一又は複数の実施形態として、本開示に係るＡβ架橋体を含むワクチンが挙げられる。本開示に係る医薬組成物及びワクチンは、薬学的に許容される腑形剤及び／又はアジュバントを含んでもよい。
【0036】
本開示に係る医薬組成物及びワクチンは、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病の予防、改善、及び／又は治療のために使用されうる。本開示に係る医薬組成物及びワクチンは、一又は複数の実施形態において、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症の予防、改善、及び／又は治療のために使用されうる。
本開示に係る医薬組成物及びワクチンは、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病を罹患するおそれのある対象、罹患したおそれのある対象、又は、罹患した対象に投与されうる。本開示に係る医薬組成物は、一又は複数の実施形態において、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症を罹患するおそれのある対象、罹患したおそれのある対象、又は、罹患した対象に投与されうる。該対象としては、哺乳類、ヒト、ヒト以外の哺乳類が挙げられる。
本開示に係る医薬組成物及びワクチンは、一又は複数の実施形態において、ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病を罹患するおそれのある対象、罹患したおそれのある対象、又は、罹患した対象に投与されうる。本開示に係る医薬組成物は、一又は複数の実施形態において、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症を罹患するおそれのある対象、罹患したおそれのある対象、又は、罹患した対象に投与されうる。該対象としては、哺乳類、ヒト、ヒト以外の哺乳類が挙げられる。
【0037】
本開示に係る医薬組成物及びワクチンをＡＳＰＤ、ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病、又は、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症に対する免疫を対象に獲得させる一又は複数の実施形態について説明する。本開示に係る医薬組成物及びワクチンの投与法は、一又は複数の実施形態において、筋内、腹腔内、皮内若しくは皮下への注射、又は、口道、消化管、気道、尿生殖路への経粘膜投与が含まれうる。本開示に係る医薬組成物及びワクチンにおけるＡβ架橋体の投与量としては、投与対象に著しい副作用を及ぼすことなく免疫防御応答を誘発する量が挙げられる。本開示に係る医薬組成物及びワクチンの投与量は、一又は複数の実施形態において、細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体を０．０１μｇ～１０ｍｇ、０．１μｇ～１０００μｇ、１μｇ～１００μｇ、５μｇ～５０μｇ、又は５μｇ～２５μｇの範囲で含むことになると量と見込まれる。初期投与に続いて、十分な間を置いて１回又は数回のブースター投与をしてもよい。
【0038】
したがって、本開示は一態様において、ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病（例えば、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症）の予防、改善、及び／又は治療の方法であって、本開示に係るＡβ架橋体又は本開示に係る医薬組成物若しくはワクチンを対象に投与することを含む方法に関する。
本開示は、その他の態様において、ＡＳＰＤそれ自体に対する免疫を対象に獲得させる方法であって、本開示に係るＡβ架橋体又は本開示に係る医薬組成物若しくはワクチンを対象に投与することを含む方法に関する。
本開示は、さらにその他の態様において、ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病に対する免疫を対象に獲得させる方法であって、本開示に係るＡβ架橋体又は本開示に係る医薬組成物若しくはワクチンを対象に投与することを含む方法に関する。
本開示は、その他の態様において、ＡＳＰＤそれ自体に対する免疫を対象に獲得させる方法であって、本開示に係るＡβ架橋体又は本開示に係る医薬組成物若しくはワクチンを対象に投与することを含む方法に関する。
本開示は、さらにその他の態様において、ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病に対する免疫を対象に獲得させる方法であって、本開示に係るＡβ架橋体又は本開示に係る医薬組成物若しくはワクチンを対象に投与することを含む方法に関する。
【0039】
また、本開示は、一態様において、本開示に係るＡβ架橋体と、腑形剤及び／又はアジュバントとを組合せることを含む、医薬組成物又はワクチンの製造方法に関する。
本開示は、その他の態様において、本開示に係るＡβ架橋体を有効成分とする医薬組成物、又は、本開示に係るＡβ架橋体を有するワクチンの製造方法であって、後述する製造方法により本開示に係るＡβ架橋体を製造する工程を含む製造方法に関する。
本開示は、その他の態様において、本開示に係るＡβ架橋体を有効成分とする医薬組成物、又は、本開示に係るＡβ架橋体を有するワクチンの製造方法であって、後述する製造方法により本開示に係るＡβ架橋体を製造する工程を含む製造方法に関する。
【0040】
［Ａβ架橋体の製造方法］
本開示に係るＡβ架橋体は、一又は複数の実施形態において、Ａβが水性溶媒に溶解したＡβ水溶液に、架橋剤を添加して架橋反応をさせることで得ることができる。
Ａβは、ペプチド合成により調製してもよく、組み換え技術で生産してもよい。
添加する架橋剤の量は、一又は複数の実施形態において、Ａβに対しモル換算で、１０倍以上、２０倍以上、又は３０倍以上である。添加する架橋剤の量は、一又は複数の実施形態において、モル換算で、２００倍以下、１００倍以下、又は７５倍以下である。
架橋反応後の架橋体は、さらに、限外ろ過に供してもよい。保持液又はフィルター残渣の回収液中に本開示に係るＡβ架橋体を得ることができる。
限外ろ過フィルターの分子量カットオフ値（ＭＷＣＯ）としては、一又は複数の実施形態において、３０ｋＤａ、５０ｋＤａ、又は１００ｋＤａが挙げられる。
本開示に係るＡβ架橋体は、一又は複数の実施形態において、実施例の記載の方法で製造できる。
本開示に係るＡβ架橋体は、一又は複数の実施形態において、Ａβが水性溶媒に溶解したＡβ水溶液に、架橋剤を添加して架橋反応をさせることで得ることができる。
Ａβは、ペプチド合成により調製してもよく、組み換え技術で生産してもよい。
添加する架橋剤の量は、一又は複数の実施形態において、Ａβに対しモル換算で、１０倍以上、２０倍以上、又は３０倍以上である。添加する架橋剤の量は、一又は複数の実施形態において、モル換算で、２００倍以下、１００倍以下、又は７５倍以下である。
架橋反応後の架橋体は、さらに、限外ろ過に供してもよい。保持液又はフィルター残渣の回収液中に本開示に係るＡβ架橋体を得ることができる。
限外ろ過フィルターの分子量カットオフ値（ＭＷＣＯ）としては、一又は複数の実施形態において、３０ｋＤａ、５０ｋＤａ、又は１００ｋＤａが挙げられる。
本開示に係るＡβ架橋体は、一又は複数の実施形態において、実施例の記載の方法で製造できる。
【0041】
したがって、本開示は、以下の実施形態に関しうる；
［Ａ１］ Ａβが、スペーサーアーム長が４Å以上５０Å以下である架橋剤によって架橋されている、Ａβ架橋体。
［Ａ２］ Ａβが、スペーサーアームとして１以上１３以下のＥＯ基及び／又はＰＯ基を有する架橋剤によって架橋されている、Ａβ架橋体。
［Ａ３］ Ａβが、Ａβ３８、Ａβ３９、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２、又はＡβ４３である、［Ａ１］又は［Ａ２］に記載のＡβ架橋体。
［Ａ４］ 架橋剤が、アミノ基間を架橋する反応末端を有する架橋剤である、［Ａ１］から［Ａ３］のいずれかに記載のＡβ架橋体。
［Ａ５］ １０－２０％ＳＤＳＰＡＧＥで分析される分子量が１００ｋＤａを超える、［Ａ１］から［Ａ４］のいずれかに記載のＡβ架橋体。
［Ａ６］ ＡＳＰＤに特異的な抗体に対してＡＳＰＤと競合する物質である、［Ａ１］から［Ａ５］のいずれかに記載のＡβ架橋体。
［Ａ７］ ＡＳＰＤ分析の標準物質である、［Ａ１］から［Ａ６］のいずれかに記載のＡβ架橋体。
［Ａ８］ ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病の診断におけるＡＳＰＤ分析の標準物質である、［Ａ１］から［Ａ７］のいずれかに記載のＡβ架橋体。
［Ａ９］ ＡＳＰＤを標的とした治療薬のコンパニオン診断におけるＡＳＰＤ分析の標準物質である、［Ａ１］から［Ａ８］のいずれかに記載のＡβ架橋体。
［Ａ１０］ ＡＳＰＤを標的とした治療薬のコンパニオン診断薬の一成分である、［Ａ１］から［Ａ９］のいずれかに記載のＡβ架橋体。
［Ｂ１］ ＡＳＰＤに特異的な抗体に対してＡＳＰＤと競合する物質としての、［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体の使用。
［Ｂ２］ ＡＳＰＤに特異的な抗体に対するＡＳＰＤの代替物としての、［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体の使用。
［Ｂ３］ ＡＳＰＤ分析の標準物質としての、［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体の使用。
［Ｂ４］ ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病の診断における、［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体の使用。
［Ｂ５］ 前記診断が、ＡＳＰＤを標的とした治療薬のコンパニオン診断である［Ｂ４］に記載の使用。
［Ｂ６］ ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病の診断におけるＡＳＰＤ分析の標準物質としての、［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体の使用。
［Ｂ７］ ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病が、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症である、［Ｂ６］に記載のＡβ架橋体の使用。
［Ｂ８］ ＡＳＰＤを標的とした治療薬のコンパニオン診断におけるＡＳＰＤ分析の標準物質としての、［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体の使用。
［Ｂ９］ ＡＳＰＤを標的とした治療薬のコンパニオン診断薬の一成分としての、［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体の使用。
［Ｃ１］ ［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体を標準物質として含む、ＡＳＰＤ分析キット。
［Ｃ２］ さらに、ＡＳＰＤに特異的な抗体を含む、［Ｃ１］に記載のＡＳＰＤ分析キット。
［Ｃ３］ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病の診断のための、［Ｃ１］又は［Ｃ２］に記載のＡＳＰＤ分析キット。
［Ｃ４］ ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病が、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症である、［Ｃ３］に記載のＡＳＰＤ分析キット。
［Ｃ５］ＡＳＰＤを標的とした治療薬のコンパニオン診断のための、［Ｃ１］から［Ｃ４］のいずれかに記載のＡＳＰＤ分析キット。
［Ｃ６］ ［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体を標準物質として含む、ＡＳＰＤを標的とした治療薬のコンパニオン診断薬。
［Ｃ７］ ［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体を標準物質として使用することを含む、ＡＳＰＤ分析方法。
［Ｃ８］ ＡＳＰＤに特異的な抗体を用いて免疫分析することを含む、［Ｃ７］に記載のＡＳＰＤ分析方法。
［Ｃ９］ ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病の診断のための、［Ｃ７］又は［Ｃ８］に記載のＡＳＰＤ分析方法。
［Ｃ１０］ ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病が、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症である、［Ｃ９］に記載のＡＳＰＤ分析方法。
［Ｃ１１］ ＡＳＰＤを標的とした治療薬のコンパニオン診断のための、［Ｃ７］から［Ｃ１０］のいずれかに記載のＡＳＰＤ分析方法。
［Ｃ１２］ ＡＳＰＤを標的とした治療薬のコンパニオン診断方法であって、[Ｃ７］から［Ｃ１１］のいずれかに記載のＡＳＰＤ分析方法を行うことを含む、診断方法。
［Ｃ１３］ ＡＳＰＤを標的とした治療薬が、ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病の予防、改善、及び／又は治療のための医薬組成物である、［Ｃ１２］に記載の診断方法。
［Ｃ１４］ ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病が、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症である、［Ｃ１３］に記載の診断方法。
［Ｄ１］ ［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体を有効成分とする医薬組成物。
［Ｄ２］ ［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体を含むワクチン。
［Ｄ３］ ［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体の能動ワクチンとしての使用。
［Ｄ４］ ワクチン製造における［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体の使用。
［Ｄ５］ ワクチンは、ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病に対するワクチンである、［Ｄ２］に記載のワクチン、又は、［Ｄ３］若しくは［Ｄ４］に記載の使用。
［Ｄ６］ ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病の予防、改善、及び／又は治療の方法であって、［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体、［Ｄ１］に記載の医薬組成物、又は、［Ｄ２］に記載のワクチンを対象に投与することを含む、方法。
［Ｄ７］ ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病が、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症である、［Ｄ６］に記載の方法。
［Ｄ８］ ＡＳＰＤに対する免疫を対象に獲得させる方法であって、［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体、［Ｄ１］に記載の医薬組成物、又は、［Ｄ２］に記載のワクチンを対象に投与することを含む、方法。
［Ｄ９］ ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病に対する免疫を対象に獲得させる方法であって、［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体、［Ｄ１］に記載の医薬組成物、又は、［Ｄ２］に記載のワクチンを対象に投与することを含む、方法。
［Ｄ１０］ ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病が、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症である、［Ｄ９］に記載の方法。
［Ｄ１１］ ［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体と、薬学的に許容される腑形剤とを組み合わせることを含む、医薬組成物又はワクチンの製造方法。
［Ａ１］ Ａβが、スペーサーアーム長が４Å以上５０Å以下である架橋剤によって架橋されている、Ａβ架橋体。
［Ａ２］ Ａβが、スペーサーアームとして１以上１３以下のＥＯ基及び／又はＰＯ基を有する架橋剤によって架橋されている、Ａβ架橋体。
［Ａ３］ Ａβが、Ａβ３８、Ａβ３９、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２、又はＡβ４３である、［Ａ１］又は［Ａ２］に記載のＡβ架橋体。
［Ａ４］ 架橋剤が、アミノ基間を架橋する反応末端を有する架橋剤である、［Ａ１］から［Ａ３］のいずれかに記載のＡβ架橋体。
［Ａ５］ １０－２０％ＳＤＳＰＡＧＥで分析される分子量が１００ｋＤａを超える、［Ａ１］から［Ａ４］のいずれかに記載のＡβ架橋体。
［Ａ６］ ＡＳＰＤに特異的な抗体に対してＡＳＰＤと競合する物質である、［Ａ１］から［Ａ５］のいずれかに記載のＡβ架橋体。
［Ａ７］ ＡＳＰＤ分析の標準物質である、［Ａ１］から［Ａ６］のいずれかに記載のＡβ架橋体。
［Ａ８］ ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病の診断におけるＡＳＰＤ分析の標準物質である、［Ａ１］から［Ａ７］のいずれかに記載のＡβ架橋体。
［Ａ９］ ＡＳＰＤを標的とした治療薬のコンパニオン診断におけるＡＳＰＤ分析の標準物質である、［Ａ１］から［Ａ８］のいずれかに記載のＡβ架橋体。
［Ａ１０］ ＡＳＰＤを標的とした治療薬のコンパニオン診断薬の一成分である、［Ａ１］から［Ａ９］のいずれかに記載のＡβ架橋体。
［Ｂ１］ ＡＳＰＤに特異的な抗体に対してＡＳＰＤと競合する物質としての、［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体の使用。
［Ｂ２］ ＡＳＰＤに特異的な抗体に対するＡＳＰＤの代替物としての、［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体の使用。
［Ｂ３］ ＡＳＰＤ分析の標準物質としての、［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体の使用。
［Ｂ４］ ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病の診断における、［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体の使用。
［Ｂ５］ 前記診断が、ＡＳＰＤを標的とした治療薬のコンパニオン診断である［Ｂ４］に記載の使用。
［Ｂ６］ ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病の診断におけるＡＳＰＤ分析の標準物質としての、［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体の使用。
［Ｂ７］ ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病が、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症である、［Ｂ６］に記載のＡβ架橋体の使用。
［Ｂ８］ ＡＳＰＤを標的とした治療薬のコンパニオン診断におけるＡＳＰＤ分析の標準物質としての、［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体の使用。
［Ｂ９］ ＡＳＰＤを標的とした治療薬のコンパニオン診断薬の一成分としての、［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体の使用。
［Ｃ１］ ［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体を標準物質として含む、ＡＳＰＤ分析キット。
［Ｃ２］ さらに、ＡＳＰＤに特異的な抗体を含む、［Ｃ１］に記載のＡＳＰＤ分析キット。
［Ｃ３］ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病の診断のための、［Ｃ１］又は［Ｃ２］に記載のＡＳＰＤ分析キット。
［Ｃ４］ ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病が、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症である、［Ｃ３］に記載のＡＳＰＤ分析キット。
［Ｃ５］ＡＳＰＤを標的とした治療薬のコンパニオン診断のための、［Ｃ１］から［Ｃ４］のいずれかに記載のＡＳＰＤ分析キット。
［Ｃ６］ ［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体を標準物質として含む、ＡＳＰＤを標的とした治療薬のコンパニオン診断薬。
［Ｃ７］ ［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体を標準物質として使用することを含む、ＡＳＰＤ分析方法。
［Ｃ８］ ＡＳＰＤに特異的な抗体を用いて免疫分析することを含む、［Ｃ７］に記載のＡＳＰＤ分析方法。
［Ｃ９］ ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病の診断のための、［Ｃ７］又は［Ｃ８］に記載のＡＳＰＤ分析方法。
［Ｃ１０］ ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病が、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症である、［Ｃ９］に記載のＡＳＰＤ分析方法。
［Ｃ１１］ ＡＳＰＤを標的とした治療薬のコンパニオン診断のための、［Ｃ７］から［Ｃ１０］のいずれかに記載のＡＳＰＤ分析方法。
［Ｃ１２］ ＡＳＰＤを標的とした治療薬のコンパニオン診断方法であって、[Ｃ７］から［Ｃ１１］のいずれかに記載のＡＳＰＤ分析方法を行うことを含む、診断方法。
［Ｃ１３］ ＡＳＰＤを標的とした治療薬が、ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病の予防、改善、及び／又は治療のための医薬組成物である、［Ｃ１２］に記載の診断方法。
［Ｃ１４］ ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病が、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症である、［Ｃ１３］に記載の診断方法。
［Ｄ１］ ［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体を有効成分とする医薬組成物。
［Ｄ２］ ［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体を含むワクチン。
［Ｄ３］ ［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体の能動ワクチンとしての使用。
［Ｄ４］ ワクチン製造における［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体の使用。
［Ｄ５］ ワクチンは、ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病に対するワクチンである、［Ｄ２］に記載のワクチン、又は、［Ｄ３］若しくは［Ｄ４］に記載の使用。
［Ｄ６］ ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病の予防、改善、及び／又は治療の方法であって、［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体、［Ｄ１］に記載の医薬組成物、又は、［Ｄ２］に記載のワクチンを対象に投与することを含む、方法。
［Ｄ７］ ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病が、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症である、［Ｄ６］に記載の方法。
［Ｄ８］ ＡＳＰＤに対する免疫を対象に獲得させる方法であって、［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体、［Ｄ１］に記載の医薬組成物、又は、［Ｄ２］に記載のワクチンを対象に投与することを含む、方法。
［Ｄ９］ ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病に対する免疫を対象に獲得させる方法であって、［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体、［Ｄ１］に記載の医薬組成物、又は、［Ｄ２］に記載のワクチンを対象に投与することを含む、方法。
［Ｄ１０］ ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病が、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症である、［Ｄ９］に記載の方法。
［Ｄ１１］ ［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体と、薬学的に許容される腑形剤とを組み合わせることを含む、医薬組成物又はワクチンの製造方法。
【0042】
［ＡＳＰＤの分析方法］
本開示は、一態様において、下記の工程（１）及び（２）を含むＡＳＰＤの分析方法（以下、「本開示に係るＡＳＰＤ分析方法」ともいう）に関する。
（１）不溶性担体に結合している、ＡＳＰＤに結合可能な抗体（第１抗体）に、ＡＳＰＤを含有している可能性がある生体由来試料を接触させて、ＡＳＰＤが含有されている場合に第１抗体にＡＳＰＤを結合させる工程。
（２）工程（１）で第１抗体に結合したＡＳＰＤに、抗ＡＳＰＤモノクローナル抗体（第２抗体）を反応させる工程。
ここで、第１抗体が、ヒト化抗ＡＳＰＤモノクローナル抗体ｈｕＡＳＤ２、又は、モノクローナル抗体ＢＡＮ５０ａであり、
第２抗体が、マウスモノクローナル抗ＡＳＰＤ抗体ｍＡＳＤ３又はその標識化抗体である。
本開示は、一態様において、下記の工程（１）及び（２）を含むＡＳＰＤの分析方法（以下、「本開示に係るＡＳＰＤ分析方法」ともいう）に関する。
（１）不溶性担体に結合している、ＡＳＰＤに結合可能な抗体（第１抗体）に、ＡＳＰＤを含有している可能性がある生体由来試料を接触させて、ＡＳＰＤが含有されている場合に第１抗体にＡＳＰＤを結合させる工程。
（２）工程（１）で第１抗体に結合したＡＳＰＤに、抗ＡＳＰＤモノクローナル抗体（第２抗体）を反応させる工程。
ここで、第１抗体が、ヒト化抗ＡＳＰＤモノクローナル抗体ｈｕＡＳＤ２、又は、モノクローナル抗体ＢＡＮ５０ａであり、
第２抗体が、マウスモノクローナル抗ＡＳＰＤ抗体ｍＡＳＤ３又はその標識化抗体である。
【0043】
本開示に係るＡＳＰＤ分析方法は、免疫測定法の原理を利用する方法であって、一又は複数の実施形態において、ＥＬＩＳＡなどの酵素免疫測定法、ＣＬＥＩＡなどの化学発光酵素免疫測定法である。
【0044】
不溶性担体に結合させる第１抗体としては、一又は複数の実施形態において、血液、血漿成分、脳脊髄液又はそれらの希釈液を試料とした場合の検出感度を向上させる観点からｈｕＡＳＤ２、又は、ＢＡＮ５０ａが好ましい。
ｈｕＡＳＤ２は、ＷＯ２００９／０５７６６４に記載されるものであり、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列の重鎖可変領域及び、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列の軽鎖可変領域を有するヒト化モノクローナル抗ＡＳＰＤ抗体である。
配列番号１：EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYFMSWVRQAPGKGLEWVGGIEIKSYFYATYYFGSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTTNREVGGLDNWGQGTLVTVSS
配列番号２：QSVLTQPSSLSASPGASASLTCTLRSGISVGGKNIYWYQQKPGSPPQYLLKYSSYSNKQLGPGVPSRFSGSKDASANAGILLISGLQSEDEADYYCSIHESNAYVFGGGTKLTVLGR
ｈｕＡＳＤ２は、例えば、ＡＳＤ２ＲＨＡｐＧ１Ｄ２００（特許生物寄託センター受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ－１１０４０）ＡＳＤ２ＲＬＡｐＬＮ１００（特許生物寄託センター受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ－１１０４１）を公知の動物細胞にコトランスフェクトし、発現させることにより得ることができる。
なお、一又は複数の実施形態において、本開示におけるｈｕＡＳＤ２は、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列の重鎖可変領域及び、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列の軽鎖可変領域を有する抗ＡＳＰＤ抗体で代用できる。
配列番号３：EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYFMSWVRQAPGKGLEWVXGIEIKSYFYATYYFGSVKGRFTISRDDSKNTXYLQMNSLKTEDTAVYYCTXNREVGGLDNWGQGTLVTVSS
配列番号４：QXVLTQPXSLSASPGASASLTCTLRSGISVGGKNIYWYQQKPGSPPQXXLXYSSYSNKQLGPGVPSRFSGSKDXSANAXILLISGLQSEDEADYYCSIHESNAYVFGGGTKLTVLG
（配列番号３において、第４９位のＸは、Ｇ又はＡであり、第８１のＸは、Ｌ又はＶであり、第１００位のＸは、Ｔ又はＲである。配列番号４において、第２位のＸは、Ｓ又はＡであり、第８位のＸは、Ｓ又はＡであり、第４８位のＸは、Ｙ又はＦであり、第４９位のＸは、Ｌ又はＦであり、第５１位のＸは、Ｋ又はＦ又はＲであり、第７４位のＸは、Ａ又はＴであり、第７９位のＸは、Ｇ又はＡである。）
本開示において、ＢＡＮ５０ａは、国際公開ＷＯ９４－１７１９７号パンフレットに記載された、ＡβのＮ末端領域を特異的に認識する公知のモノクローナル抗体である。ＢＡＮ５０ａは市販のものを使用でき、あるいは、特許生物寄託センターハイブリドーマＢＡＮ５０（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ４１６３）を用いて、公知の方法により製造することができる。
第２抗体は、一又は複数の実施形態において、検出感度を向上させる観点から、ｍＡＳＤ３の標識化抗体が挙げられる。標識化としては、一又は複数の実施形態において、ビオチン化が挙げられる。
ｈｕＡＳＤ２は、ＷＯ２００９／０５７６６４に記載されるものであり、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列の重鎖可変領域及び、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列の軽鎖可変領域を有するヒト化モノクローナル抗ＡＳＰＤ抗体である。
配列番号１：EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYFMSWVRQAPGKGLEWVGGIEIKSYFYATYYFGSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTTNREVGGLDNWGQGTLVTVSS
配列番号２：QSVLTQPSSLSASPGASASLTCTLRSGISVGGKNIYWYQQKPGSPPQYLLKYSSYSNKQLGPGVPSRFSGSKDASANAGILLISGLQSEDEADYYCSIHESNAYVFGGGTKLTVLGR
ｈｕＡＳＤ２は、例えば、ＡＳＤ２ＲＨＡｐＧ１Ｄ２００（特許生物寄託センター受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ－１１０４０）ＡＳＤ２ＲＬＡｐＬＮ１００（特許生物寄託センター受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ－１１０４１）を公知の動物細胞にコトランスフェクトし、発現させることにより得ることができる。
なお、一又は複数の実施形態において、本開示におけるｈｕＡＳＤ２は、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列の重鎖可変領域及び、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列の軽鎖可変領域を有する抗ＡＳＰＤ抗体で代用できる。
配列番号３：EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYFMSWVRQAPGKGLEWVXGIEIKSYFYATYYFGSVKGRFTISRDDSKNTXYLQMNSLKTEDTAVYYCTXNREVGGLDNWGQGTLVTVSS
配列番号４：QXVLTQPXSLSASPGASASLTCTLRSGISVGGKNIYWYQQKPGSPPQXXLXYSSYSNKQLGPGVPSRFSGSKDXSANAXILLISGLQSEDEADYYCSIHESNAYVFGGGTKLTVLG
（配列番号３において、第４９位のＸは、Ｇ又はＡであり、第８１のＸは、Ｌ又はＶであり、第１００位のＸは、Ｔ又はＲである。配列番号４において、第２位のＸは、Ｓ又はＡであり、第８位のＸは、Ｓ又はＡであり、第４８位のＸは、Ｙ又はＦであり、第４９位のＸは、Ｌ又はＦであり、第５１位のＸは、Ｋ又はＦ又はＲであり、第７４位のＸは、Ａ又はＴであり、第７９位のＸは、Ｇ又はＡである。）
本開示において、ＢＡＮ５０ａは、国際公開ＷＯ９４－１７１９７号パンフレットに記載された、ＡβのＮ末端領域を特異的に認識する公知のモノクローナル抗体である。ＢＡＮ５０ａは市販のものを使用でき、あるいは、特許生物寄託センターハイブリドーマＢＡＮ５０（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ４１６３）を用いて、公知の方法により製造することができる。
第２抗体は、一又は複数の実施形態において、検出感度を向上させる観点から、ｍＡＳＤ３の標識化抗体が挙げられる。標識化としては、一又は複数の実施形態において、ビオチン化が挙げられる。
【0045】
本開示に係るＡＳＰＤ分析方法における不溶性担体としては、一又は複数の実施形態において、ビーズや、マルチウェルプレートなどの固相物が挙げられる。
ＡＳＰＤを含有している可能性がある生体由来試料としては、一又は複数の実施形態として血液、血漿、及び脳脊髄液、ならびにそれらの希釈物が挙げられる。
本開示に係るＡＳＰＤ分析方法は、一又は複数の実施形態において、工程（１）の前に生体由来試料を調製する工程（０）を含んでもよい。この試料調製工程（０）は、一又は複数の実施形態において、血液、血漿、及び脳脊髄液などの生体試料を適当な溶媒又はバッファーに希釈することを含む。また、この試料調製工程（０）は、一又は複数の実施形態において、前記溶媒又はバッファーは、分析を妨げない範囲で、界面活性剤やその他の薬剤を含んでもよい。
ＡＳＰＤを含有している可能性がある生体由来試料としては、一又は複数の実施形態として血液、血漿、及び脳脊髄液、ならびにそれらの希釈物が挙げられる。
本開示に係るＡＳＰＤ分析方法は、一又は複数の実施形態において、工程（１）の前に生体由来試料を調製する工程（０）を含んでもよい。この試料調製工程（０）は、一又は複数の実施形態において、血液、血漿、及び脳脊髄液などの生体試料を適当な溶媒又はバッファーに希釈することを含む。また、この試料調製工程（０）は、一又は複数の実施形態において、前記溶媒又はバッファーは、分析を妨げない範囲で、界面活性剤やその他の薬剤を含んでもよい。
【0046】
本開示に係るＡＳＰＤ分析方法は、一又は複数の実施形態において、さらに下記の工程（３）を含んでいてもよい。
（３）工程（２）でＡＳＰＤに結合した第２抗体に、レポーターが連結した抗マウス抗体を反応させる工程、又は、工程（２）でＡＳＰＤに結合した第２抗体の標識に、レポーターが連結した前記標識の結合パートナーを反応させる工程。
レポーターとしては、一又は複数の実施形態において、化学発光や生物発光を利用する物質、蛍光タンパク質などが挙げられ、検出感度を向上させる観点からは化学発光や生物発光を利用する物質が好ましい。
化学発光や生物発光を利用する物質としては、一又は複数の実施形態において、生物発光酵素やその改変体などの酵素が挙げられる。
前記酵素としては、一又は複数の実施形態において、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）、及び、アルカリフォスファターゼなどが挙げられる。
前記結合パートナーとしては、一又は複数の実施形態において、標識がビオチンである場合、ストレプトアビジン等が挙げられる。
発光の測定は、一又は複数の実施形態において、ルミノメーターやマルチプレートリーダーで行うことができる。
（３）工程（２）でＡＳＰＤに結合した第２抗体に、レポーターが連結した抗マウス抗体を反応させる工程、又は、工程（２）でＡＳＰＤに結合した第２抗体の標識に、レポーターが連結した前記標識の結合パートナーを反応させる工程。
レポーターとしては、一又は複数の実施形態において、化学発光や生物発光を利用する物質、蛍光タンパク質などが挙げられ、検出感度を向上させる観点からは化学発光や生物発光を利用する物質が好ましい。
化学発光や生物発光を利用する物質としては、一又は複数の実施形態において、生物発光酵素やその改変体などの酵素が挙げられる。
前記酵素としては、一又は複数の実施形態において、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）、及び、アルカリフォスファターゼなどが挙げられる。
前記結合パートナーとしては、一又は複数の実施形態において、標識がビオチンである場合、ストレプトアビジン等が挙げられる。
発光の測定は、一又は複数の実施形態において、ルミノメーターやマルチプレートリーダーで行うことができる。
【0047】
本開示に係るＡＳＰＤ分析方法は、一又は複数の実施形態において、本開示に係るＡβ架橋体を標準物質として使用してもよい。
【0048】
したがって、本開示は、以下の実施形態に関しうる；
［Ｅ１］ 下記の工程（１）及び（２）を含むＡＳＰＤの分析方法。
工程（１）不溶性担体に結合している、ＡＳＰＤに結合可能な抗体（第１抗体）に、ＡＳＰＤを含有している可能性がある生体由来試料を接触させて、ＡＳＰＤが含有されている場合に第１抗体にＡＳＰＤを結合させる工程。
工程（２）工程（１）で第１抗体に結合したＡＳＰＤに、抗ＡＳＰＤモノクローナル抗体（第２抗体）を反応させる工程。
ここで、第１抗体が、ヒト化抗ＡＳＰＤモノクローナル抗体ｈｕＡＳＤ２、又は、モノクローナル抗体ＢＡＮ５０ａであり、
第２抗体が、マウスモノクローナル抗ＡＳＰＤ抗体ｍＡＳＤ３又はその標識化抗体である。
［Ｅ２］ 免疫測定法の原理を利用する方法である、［Ｅ１］に記載の分析方法。
［Ｅ３］ 免疫測定法の原理を利用する方法が、ＥＬＩＳＡ又はＣＬＥＩＡである、［Ｅ２］に記載の分析方法。
［Ｅ４］ 生体由来試料が、血液、血漿成分、脳脊髄液又はそれらの希釈液である、［Ｅ１］から［Ｅ３］のいずれかに記載の分析方法。
［Ｅ５］ 工程（１）の前に生体由来試料を調製する工程（０）を含む、［Ｅ１］から［Ｅ４］のいずれかに記載の分析方法。
［Ｅ６］ 試料調製工程（０）は血液、血漿、及び脳脊髄液からなる群から選択される生体試料を溶媒又はバッファーに希釈することを含む、［Ｅ５］に記載の分析方法。
［Ｅ７］ さらに、下記の工程（３）を含む、［Ｅ１］から［Ｅ６］のいずれかに記載の分析方法。
工程（３）工程（２）でＡＳＰＤに結合した第２抗体に、レポーターが連結した抗マウス抗体を反応させる工程、又は、工程（２）でＡＳＰＤに結合した第２抗体の標識に、レポーターが連結した前記標識の結合パートナーを反応させる工程。
［Ｅ８］ ＡＳＰＤの標準物質として後記［１］に記載の物質を使用する、［Ｅ１］から［Ｅ７］のいずれかに記載の分析方法。
［Ｅ９］ ［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体を標準物質として使用することを含む、［Ｅ１］から［Ｅ７］のいずれかに記載の分析方法。
［Ｅ１０］ ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病の診断のための、［Ｅ１］から［Ｅ９］のいずれかに記載の分析方法。
［Ｅ１１］ ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病が、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症である、［Ｅ１０］に記載の分析方法。
［Ｅ１２］ ＡＳＰＤを標的とした治療薬のコンパニオン診断のための、［Ｅ１］から［Ｅ１１］のいずれかに記載の分析方法。
［Ｅ１３］ ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病の診断方法であって、[Ｅ１］から［Ｅ１２］のいずれかに記載の分析方法を行うことを含む、診断方法。
［Ｅ１４］ ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病が、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症である、［Ｅ１３］に記載の診断方法。
［Ｅ１５］ ＡＳＰＤを標的とした治療薬のコンパニオン診断方法であって、[Ｅ１］から［Ｅ１２］のいずれかに記載の分析方法を行うことを含む、診断方法。
［Ｅ１６］ ＡＳＰＤを標的とした治療薬が、ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病の予防、改善、及び／又は治療のための医薬組成物である、［Ｅ１５］に記載の診断方法。
［Ｅ１７］ ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病が、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症である、［Ｅ１６］に記載の診断方法。
［Ｆ１］ ヒト化抗ＡＳＰＤモノクローナル抗体ｈｕＡＳＤ２又はモノクローナル抗体ＢＡＮ５０ａ（第１抗体）と、マウスモノクローナル抗ＡＳＰＤ抗体ｍＡＳＤ３又はその標識化抗体（第２抗体）とを含む、ＡＳＰＤ分析キット。
［Ｆ２］ さらに、［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体を含む、［Ｆ１］に記載のＡＳＰＤ分析キット。
［Ｆ３］ ［Ｅ１］から［Ｅ１２］のいずれかに記載の分析方法又は［Ｅ１３］から［Ｅ１７］のいずれかに記載の診断方法のための、[Ｆ１]又は［Ｆ２］に記載のＡＳＰＤ分析キット。
［Ｅ１］ 下記の工程（１）及び（２）を含むＡＳＰＤの分析方法。
工程（１）不溶性担体に結合している、ＡＳＰＤに結合可能な抗体（第１抗体）に、ＡＳＰＤを含有している可能性がある生体由来試料を接触させて、ＡＳＰＤが含有されている場合に第１抗体にＡＳＰＤを結合させる工程。
工程（２）工程（１）で第１抗体に結合したＡＳＰＤに、抗ＡＳＰＤモノクローナル抗体（第２抗体）を反応させる工程。
ここで、第１抗体が、ヒト化抗ＡＳＰＤモノクローナル抗体ｈｕＡＳＤ２、又は、モノクローナル抗体ＢＡＮ５０ａであり、
第２抗体が、マウスモノクローナル抗ＡＳＰＤ抗体ｍＡＳＤ３又はその標識化抗体である。
［Ｅ２］ 免疫測定法の原理を利用する方法である、［Ｅ１］に記載の分析方法。
［Ｅ３］ 免疫測定法の原理を利用する方法が、ＥＬＩＳＡ又はＣＬＥＩＡである、［Ｅ２］に記載の分析方法。
［Ｅ４］ 生体由来試料が、血液、血漿成分、脳脊髄液又はそれらの希釈液である、［Ｅ１］から［Ｅ３］のいずれかに記載の分析方法。
［Ｅ５］ 工程（１）の前に生体由来試料を調製する工程（０）を含む、［Ｅ１］から［Ｅ４］のいずれかに記載の分析方法。
［Ｅ６］ 試料調製工程（０）は血液、血漿、及び脳脊髄液からなる群から選択される生体試料を溶媒又はバッファーに希釈することを含む、［Ｅ５］に記載の分析方法。
［Ｅ７］ さらに、下記の工程（３）を含む、［Ｅ１］から［Ｅ６］のいずれかに記載の分析方法。
工程（３）工程（２）でＡＳＰＤに結合した第２抗体に、レポーターが連結した抗マウス抗体を反応させる工程、又は、工程（２）でＡＳＰＤに結合した第２抗体の標識に、レポーターが連結した前記標識の結合パートナーを反応させる工程。
［Ｅ８］ ＡＳＰＤの標準物質として後記［１］に記載の物質を使用する、［Ｅ１］から［Ｅ７］のいずれかに記載の分析方法。
［Ｅ９］ ［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体を標準物質として使用することを含む、［Ｅ１］から［Ｅ７］のいずれかに記載の分析方法。
［Ｅ１０］ ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病の診断のための、［Ｅ１］から［Ｅ９］のいずれかに記載の分析方法。
［Ｅ１１］ ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病が、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症である、［Ｅ１０］に記載の分析方法。
［Ｅ１２］ ＡＳＰＤを標的とした治療薬のコンパニオン診断のための、［Ｅ１］から［Ｅ１１］のいずれかに記載の分析方法。
［Ｅ１３］ ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病の診断方法であって、[Ｅ１］から［Ｅ１２］のいずれかに記載の分析方法を行うことを含む、診断方法。
［Ｅ１４］ ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病が、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症である、［Ｅ１３］に記載の診断方法。
［Ｅ１５］ ＡＳＰＤを標的とした治療薬のコンパニオン診断方法であって、[Ｅ１］から［Ｅ１２］のいずれかに記載の分析方法を行うことを含む、診断方法。
［Ｅ１６］ ＡＳＰＤを標的とした治療薬が、ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病の予防、改善、及び／又は治療のための医薬組成物である、［Ｅ１５］に記載の診断方法。
［Ｅ１７］ ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病が、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症である、［Ｅ１６］に記載の診断方法。
［Ｆ１］ ヒト化抗ＡＳＰＤモノクローナル抗体ｈｕＡＳＤ２又はモノクローナル抗体ＢＡＮ５０ａ（第１抗体）と、マウスモノクローナル抗ＡＳＰＤ抗体ｍＡＳＤ３又はその標識化抗体（第２抗体）とを含む、ＡＳＰＤ分析キット。
［Ｆ２］ さらに、［Ａ１］から［Ａ１０］のいずれかに記載のＡβ架橋体を含む、［Ｆ１］に記載のＡＳＰＤ分析キット。
［Ｆ３］ ［Ｅ１］から［Ｅ１２］のいずれかに記載の分析方法又は［Ｅ１３］から［Ｅ１７］のいずれかに記載の診断方法のための、[Ｆ１]又は［Ｆ２］に記載のＡＳＰＤ分析キット。
【0049】
本開示は、以下の実施形態に関しうる；
［１］ ＡＳＰＤに特異的な抗体に対してＡＳＰＤと競合する物質であって、Ａβが架橋剤によって架橋された物質であり、前記架橋剤は、スペーサーアーム長が４Å以上５０Å以下である架橋剤、又は、スペーサーアームとして１以上１３以下のＥＯ基及び／又はＰＯ基を有する架橋剤である、物質。
［２］ Ａβの架橋体であって、Ａβが、スペーサーアーム長が４Å以上５０Å以下である架橋剤、又は、スペーサーアームとして１以上１３以下のＥＯ基及び／又はＰＯ基を有する架橋剤によって架橋されている架橋体。
［３］ ［１］に記載の物質又は［２］に記載の架橋体と、抗ＡＳＰＤ抗体とを含む、ＡＳＰＤを分析するためのキット。
［４］ ＡＳＰＤ分析における、［１］に記載の物質又は［２］に記載の架橋体の標準物質としての使用。
［５］ ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病の診断における、［１］に記載の物質又は［２］に記載の架橋体の標準物質としての使用。
［６］ 前記診断が、ＡＳＰＤを標的とした治療薬のコンパニオン診断である、［５］に記載の使用。
［７］ ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病が、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症である、［５］又は［６］に記載の使用。
［８］ 下記の工程：
（１）不溶性担体に結合している、ＡＳＰＤに結合可能な抗体（第１抗体）に、ＡＳＰＤを含有している可能性がある生体由来試料を接触させて、ＡＳＰＤが含有されている場合に第１抗体にＡＳＰＤを結合させる工程；及び
（２）工程（１）で第１抗体に結合したＡＳＰＤに、抗ＡＳＰＤモノクローナル抗体（第２抗体）を反応させる工程
を含み、
第１抗体が、ヒト化抗ＡＳＰＤモノクローナル抗体ｈｕＡＳＤ２、又は、モノクローナル抗体ＢＡＮ５０ａであり、
第２抗体が、マウスモノクローナル抗ＡＳＰＤ抗体ｍＡＳＤ３又はその標識化抗体である、ＡＳＰＤの分析方法。
［９］ さらに、下記の工程：
（３）工程（２）でＡＳＰＤに結合した第２抗体に、レポーターが連結した抗マウス抗体を反応させる工程、又は、工程（２）でＡＳＰＤに結合した第２抗体の標識に、レポーターが連結した前記標識の結合パートナーを反応させる工程
を含む、［８］に記載の分析方法。
［１０］ ＡＳＰＤの標準物質として［１］に記載の物質又は［２］に記載の架橋体を使用する、［８］又は［９］に記載の分析方法。
［１］ ＡＳＰＤに特異的な抗体に対してＡＳＰＤと競合する物質であって、Ａβが架橋剤によって架橋された物質であり、前記架橋剤は、スペーサーアーム長が４Å以上５０Å以下である架橋剤、又は、スペーサーアームとして１以上１３以下のＥＯ基及び／又はＰＯ基を有する架橋剤である、物質。
［２］ Ａβの架橋体であって、Ａβが、スペーサーアーム長が４Å以上５０Å以下である架橋剤、又は、スペーサーアームとして１以上１３以下のＥＯ基及び／又はＰＯ基を有する架橋剤によって架橋されている架橋体。
［３］ ［１］に記載の物質又は［２］に記載の架橋体と、抗ＡＳＰＤ抗体とを含む、ＡＳＰＤを分析するためのキット。
［４］ ＡＳＰＤ分析における、［１］に記載の物質又は［２］に記載の架橋体の標準物質としての使用。
［５］ ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病の診断における、［１］に記載の物質又は［２］に記載の架橋体の標準物質としての使用。
［６］ 前記診断が、ＡＳＰＤを標的とした治療薬のコンパニオン診断である、［５］に記載の使用。
［７］ ＡＳＰＤの蓄積を伴う疾病が、アルツハイマー病及び/又はレビー小体型認知症である、［５］又は［６］に記載の使用。
［８］ 下記の工程：
（１）不溶性担体に結合している、ＡＳＰＤに結合可能な抗体（第１抗体）に、ＡＳＰＤを含有している可能性がある生体由来試料を接触させて、ＡＳＰＤが含有されている場合に第１抗体にＡＳＰＤを結合させる工程；及び
（２）工程（１）で第１抗体に結合したＡＳＰＤに、抗ＡＳＰＤモノクローナル抗体（第２抗体）を反応させる工程
を含み、
第１抗体が、ヒト化抗ＡＳＰＤモノクローナル抗体ｈｕＡＳＤ２、又は、モノクローナル抗体ＢＡＮ５０ａであり、
第２抗体が、マウスモノクローナル抗ＡＳＰＤ抗体ｍＡＳＤ３又はその標識化抗体である、ＡＳＰＤの分析方法。
［９］ さらに、下記の工程：
（３）工程（２）でＡＳＰＤに結合した第２抗体に、レポーターが連結した抗マウス抗体を反応させる工程、又は、工程（２）でＡＳＰＤに結合した第２抗体の標識に、レポーターが連結した前記標識の結合パートナーを反応させる工程
を含む、［８］に記載の分析方法。
［１０］ ＡＳＰＤの標準物質として［１］に記載の物質又は［２］に記載の架橋体を使用する、［８］又は［９］に記載の分析方法。
【0050】
以下に、実施例を用いて本発明の一又は複数の実施形態をさらに説明する。
【実施例】
【0051】
以下の実施例において、Ａβ架橋体及びＡＳＰＤの濃度は、特に言及がない場合、Ａβモノマー換算である。
【0052】
１．Ａβ架橋体の調製
下記のＡβ架橋体１－３を調製した。
Ａβ架橋体１：Ａβ４２、架橋剤は、ＢＳ（ＰＥＧ）5
Ａβ架橋体２：Ａβ４２、架橋剤は、ＢＳ（ＰＥＧ）9
Ａβ架橋体３：Ａβ４２、架橋剤は、ＤＦＤＮＢ
使用した架橋剤は、以下の通り。
ＢＳ（ＰＥＧ）5：Bis(succinimidyl) penta(ethylene glycol)
（スペーサーアーム長：２１．７Å）
ＢＳ（ＰＥＧ）9：Bis(succinimidyl) nona(ethylene glycol)
（スペーサーアーム長：３５．８Å）
ＤＦＤＮＢ：1,5-difluoro-2,4-dinitorobenzene
（スペーサーアーム長：３．０Å）
下記のＡβ架橋体１－３を調製した。
Ａβ架橋体１：Ａβ４２、架橋剤は、ＢＳ（ＰＥＧ）5
Ａβ架橋体２：Ａβ４２、架橋剤は、ＢＳ（ＰＥＧ）9
Ａβ架橋体３：Ａβ４２、架橋剤は、ＤＦＤＮＢ
使用した架橋剤は、以下の通り。
ＢＳ（ＰＥＧ）5：Bis(succinimidyl) penta(ethylene glycol)
（スペーサーアーム長：２１．７Å）
ＢＳ（ＰＥＧ）9：Bis(succinimidyl) nona(ethylene glycol)
（スペーサーアーム長：３５．８Å）
ＤＦＤＮＢ：1,5-difluoro-2,4-dinitorobenzene
（スペーサーアーム長：３．０Å）
【0053】
【化1】
【0054】
Ａβ架橋体のプロトコール
Ａβ４２ ０．５６ｍｇを１２０μＬ ＤＭＳＯで溶解（１ｍＭ）
↓
１０μＬを９０μＬ ＰＢＳ（－）に添加後２５℃、１５分静置（Ａβとして１００μＭ、０．０４６６６７ｍｇに相当）
↓
架橋試薬ＢＳ（ＰＥＧ）5，ＢＳ（ＰＥＧ）9，又はＤＦＤＮＢを５０倍モル添加後、２５℃、３０分静置
↓
Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０を添加（終濃度５０ｍＭ）、２５℃、３０分静置
↓
ＭＷＣＯ５０Ｋの限外ろ過フィルターでフィルター処理して、高分子画分を得る
ＰＢＳ（－）３００μＬ洗浄ｘ３
メンブレン残渣を５０μＬのＰＢＳ（－）で回収
↓
ＢＣＡ法で濃度測定
Ａβ４２ ０．５６ｍｇを１２０μＬ ＤＭＳＯで溶解（１ｍＭ）
↓
１０μＬを９０μＬ ＰＢＳ（－）に添加後２５℃、１５分静置（Ａβとして１００μＭ、０．０４６６６７ｍｇに相当）
↓
架橋試薬ＢＳ（ＰＥＧ）5，ＢＳ（ＰＥＧ）9，又はＤＦＤＮＢを５０倍モル添加後、２５℃、３０分静置
↓
Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０を添加（終濃度５０ｍＭ）、２５℃、３０分静置
↓
ＭＷＣＯ５０Ｋの限外ろ過フィルターでフィルター処理して、高分子画分を得る
ＰＢＳ（－）３００μＬ洗浄ｘ３
メンブレン残渣を５０μＬのＰＢＳ（－）で回収
↓
ＢＣＡ法で濃度測定
【0055】
２．Ａβ架橋体のＳＤＳＰＡＧＥ
得られたＡβ架橋体１～３を用いてＳＤＳＰＡＧＥ（１０－２０％Ｇｅｌ）を行い、架橋されていることを確認した。その結果の一例を図１に示す。
図１に示す通り、Ａβ架橋体１～３は、それぞれ、高分子化しており、分子量は１００ｋＤａ以上であると認められた。
得られたＡβ架橋体１～３を用いてＳＤＳＰＡＧＥ（１０－２０％Ｇｅｌ）を行い、架橋されていることを確認した。その結果の一例を図１に示す。
図１に示す通り、Ａβ架橋体１～３は、それぞれ、高分子化しており、分子量は１００ｋＤａ以上であると認められた。
【0056】
３．Ａβ架橋体のＡＳＰＤ ＣＬＥＩＡ反応性
得られたＡβ架橋体１～３のＡＳＰＤ ＣＬＥＩＡ反応性を確認した。
使用したＡＳＰＤ ＣＬＥＩＡは、図２に示すシステムであり、固相に固定化した抗ＡＳＰＤポリクローナル抗体（第一抗体）、検出側のマウス抗ＡＳＰＤモノクローナル抗体ｍＡＳＤ３（第二抗体）、及び抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰを使用するシステムである。ｍＡＳＤ３は、ＷＯ２００６／０１６６４４及びＷＯ２００９／０５７６６４に記載されるモノクローナル抗体であって、ハイブリドーマは特許生物寄託センターに寄託されている（寄託番号は、ＦＥＲＭ ＢＰ－１０３９４）。ＨＲＰは、ホースラディッシュペルオキシダーゼを表す。
Ａβ架橋体１～３を被検体としたＡＳＰＤ ＣＬＥＩＡ［抗ＡＳＰＤポリクローナル抗体／ｍＡＳＤ３］の反応性を、ＡＳＰＤを被検体とした時と比べた結果の一例を図３に示す。
図３に示す通り、Ａβ架橋体１及び２は、Ａβ架橋体３に比べてＡＳＰＤの反応性に近かった。なかでも、Ａβ架橋体１は、ＡＳＰＤと同等の反応性を示した。
得られたＡβ架橋体１～３のＡＳＰＤ ＣＬＥＩＡ反応性を確認した。
使用したＡＳＰＤ ＣＬＥＩＡは、図２に示すシステムであり、固相に固定化した抗ＡＳＰＤポリクローナル抗体（第一抗体）、検出側のマウス抗ＡＳＰＤモノクローナル抗体ｍＡＳＤ３（第二抗体）、及び抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰを使用するシステムである。ｍＡＳＤ３は、ＷＯ２００６／０１６６４４及びＷＯ２００９／０５７６６４に記載されるモノクローナル抗体であって、ハイブリドーマは特許生物寄託センターに寄託されている（寄託番号は、ＦＥＲＭ ＢＰ－１０３９４）。ＨＲＰは、ホースラディッシュペルオキシダーゼを表す。
Ａβ架橋体１～３を被検体としたＡＳＰＤ ＣＬＥＩＡ［抗ＡＳＰＤポリクローナル抗体／ｍＡＳＤ３］の反応性を、ＡＳＰＤを被検体とした時と比べた結果の一例を図３に示す。
図３に示す通り、Ａβ架橋体１及び２は、Ａβ架橋体３に比べてＡＳＰＤの反応性に近かった。なかでも、Ａβ架橋体１は、ＡＳＰＤと同等の反応性を示した。
【0057】
Ａβ架橋体の反応性比較（続き）
次に、ＡβのＮ末端を特異的に認識するモノクローナル抗体８２Ｅ１を使用する市販のＡβオリゴマー測定キットを用いてＡβ架橋体の反応性を比較した。
被検体として、Ａβ架橋体１、ＡＳＰＤ、及びＡβ１－１６ダイマーを使用した。
また、ＡＳＰＤ ＣＬＥＩＡ［抗ＡＳＰＤポリクローナル抗体／ｍＡＳＤ３］におけるＡβ架橋体１、ＡＳＰＤ、及びＡβ１－１６ダイマーの反応性を比較した。
その結果の一例を図４に示す。
図４に示すとおり、ＡＳＰＤ ＣＬＥＩＡと同様に、市販のＡβオリゴマー測定キットにおいても、Ａβ架橋体１は、ＡＳＰＤと同等の反応性を示した。
８２Ｅ１を使用する市販のＡβオリゴマー測定キットでは、Ａβ架橋体１及びＡＳＰＤは、Ａβ１－１６ダイマーと比較して著しく反応性が弱かった。
反対に、ＡＳＰＤ ＣＬＥＩＡにおいては、Ａβ１－１６ダイマーの反応性は、Ａβ架橋体１及びＡＳＰＤと比べて著しく反応性が弱かった。
また、ＡＳＰＤ ＣＬＥＩＡは、Ａβ架橋体１及びＡＳＰＤに対して特性が高い検出感度を有していることが認められた。
次に、ＡβのＮ末端を特異的に認識するモノクローナル抗体８２Ｅ１を使用する市販のＡβオリゴマー測定キットを用いてＡβ架橋体の反応性を比較した。
被検体として、Ａβ架橋体１、ＡＳＰＤ、及びＡβ１－１６ダイマーを使用した。
また、ＡＳＰＤ ＣＬＥＩＡ［抗ＡＳＰＤポリクローナル抗体／ｍＡＳＤ３］におけるＡβ架橋体１、ＡＳＰＤ、及びＡβ１－１６ダイマーの反応性を比較した。
その結果の一例を図４に示す。
図４に示すとおり、ＡＳＰＤ ＣＬＥＩＡと同様に、市販のＡβオリゴマー測定キットにおいても、Ａβ架橋体１は、ＡＳＰＤと同等の反応性を示した。
８２Ｅ１を使用する市販のＡβオリゴマー測定キットでは、Ａβ架橋体１及びＡＳＰＤは、Ａβ１－１６ダイマーと比較して著しく反応性が弱かった。
反対に、ＡＳＰＤ ＣＬＥＩＡにおいては、Ａβ１－１６ダイマーの反応性は、Ａβ架橋体１及びＡＳＰＤと比べて著しく反応性が弱かった。
また、ＡＳＰＤ ＣＬＥＩＡは、Ａβ架橋体１及びＡＳＰＤに対して特性が高い検出感度を有していることが認められた。
【0058】
４．Ａβ架橋体の免疫原性
ウサギ（ニュージーランドホワイト）に、フロイントアジュバント（ＦＣＡ、初回）、不完全フロイントアジュバント（ＦＩＡ、５回）のアジュバンドとともにＡβ架橋体１の免疫（１００μｇ／回）を６回行い、その後、全採血を行い、血清中の抗体のＡβ架橋体１及び合成ＡＳＰＤに対する反応性の評価を行った。その結果の一例を図５に示す。
図５において、「ｐｒｅ血清」は、免疫前の血清のＡβ架橋体１固相化プレートに対する反応性を示し、「固相化Ａβ架橋体」は、得られた血清のＡβ架橋体１固相化プレートに対する反応性を示し、「固相化合成ＡＳＰＤ」は、得られた血清の合成ＡＳＰＤ固相化プレートに対する反応性を示し、「ｃｏｎｔｒｏｌ」は、得られた血清のＦ１２タンパク質固相化プレートに対する反応性を示し、「Ｅｍｐｔｙ」は、得られた血清の空プレートに対する反応性を示す。
図５の結果から、Ａβ架橋体１は、免疫原性があり、ＡＳＰＤに反応する抗体を誘導できることが示された。
ウサギ（ニュージーランドホワイト）に、フロイントアジュバント（ＦＣＡ、初回）、不完全フロイントアジュバント（ＦＩＡ、５回）のアジュバンドとともにＡβ架橋体１の免疫（１００μｇ／回）を６回行い、その後、全採血を行い、血清中の抗体のＡβ架橋体１及び合成ＡＳＰＤに対する反応性の評価を行った。その結果の一例を図５に示す。
図５において、「ｐｒｅ血清」は、免疫前の血清のＡβ架橋体１固相化プレートに対する反応性を示し、「固相化Ａβ架橋体」は、得られた血清のＡβ架橋体１固相化プレートに対する反応性を示し、「固相化合成ＡＳＰＤ」は、得られた血清の合成ＡＳＰＤ固相化プレートに対する反応性を示し、「ｃｏｎｔｒｏｌ」は、得られた血清のＦ１２タンパク質固相化プレートに対する反応性を示し、「Ｅｍｐｔｙ」は、得られた血清の空プレートに対する反応性を示す。
図５の結果から、Ａβ架橋体１は、免疫原性があり、ＡＳＰＤに反応する抗体を誘導できることが示された。
【0059】
５．脳脊髄液（ＣＳＦ）中のＡＳＰＤの測定
ＡＳＰＤ ＣＬＥＩＡシステム［抗ＡＳＰＤポリクローナル抗体／ｍＡＳＤ３］で、ヒトＣＳＦ検体中のＡＳＰＤの測定を行った。具体的には以下のフローで行った。
（１）ＣＳＦに既知濃度ＡＳＰＤを添加し、検体希釈液で希釈（１～１６倍希釈）。
（２）一次反応：ウサギ抗ＡＳＰＤポリクローナル抗体を固定化したマルチウェルプレートに１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃６０分静置。
洗浄×３
（３）二次反応：ｍＡＳＤ３（１μｇ／ｍｌ）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃６０分静置。
洗浄×３
（４）三次反応：抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（１／２００００）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃６０分静置。
洗浄×３
（５）測定：ＨＲＰの化学発光基質（商品名：SuperSignal pico、ThermoFisher社製）を１００μＬ／ウェルで添加し、プレートリーダー（商品名：infinite M200pro、TECAN社製）で発光を測定。
測定用のスタンダードには、Ａβ凝集体１又は細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体（ＷＯ２０１７／１７９６４６）を用いた。
検体希釈液には、３％ＢＳＡ ｉｎ ＰＢＳ（－） ０．０５％防腐剤（商品名：プロクリン、シグマアルドリッチ社製）を用いた。
洗浄液には、ＰＢＳ（－） ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を用いた。
ＡＳＰＤ ＣＬＥＩＡシステム［抗ＡＳＰＤポリクローナル抗体／ｍＡＳＤ３］で、ヒトＣＳＦ検体中のＡＳＰＤの測定を行った。具体的には以下のフローで行った。
（１）ＣＳＦに既知濃度ＡＳＰＤを添加し、検体希釈液で希釈（１～１６倍希釈）。
（２）一次反応：ウサギ抗ＡＳＰＤポリクローナル抗体を固定化したマルチウェルプレートに１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃６０分静置。
洗浄×３
（３）二次反応：ｍＡＳＤ３（１μｇ／ｍｌ）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃６０分静置。
洗浄×３
（４）三次反応：抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（１／２００００）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃６０分静置。
洗浄×３
（５）測定：ＨＲＰの化学発光基質（商品名：SuperSignal pico、ThermoFisher社製）を１００μＬ／ウェルで添加し、プレートリーダー（商品名：infinite M200pro、TECAN社製）で発光を測定。
測定用のスタンダードには、Ａβ凝集体１又は細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体（ＷＯ２０１７／１７９６４６）を用いた。
検体希釈液には、３％ＢＳＡ ｉｎ ＰＢＳ（－） ０．０５％防腐剤（商品名：プロクリン、シグマアルドリッチ社製）を用いた。
洗浄液には、ＰＢＳ（－） ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を用いた。
【0060】
ヒトＣＳＦ（Ａｇｅ８４／Ｃａｕｃａｓｉａｎ／Ｍ）に既知濃度ＡＳＰＤを添加し（高濃度Ｈ：１０８ｐＭ、中濃度Ｍ：５４ｐＭ、低濃度Ｌ：２７．５ｐＭ、なしＮ：０ｐＭ）、４倍希釈して定量した結果の一例を下記表１に示す。
【0061】
【表1】
【0062】
表１に示すように、ほぼ１００％の回収率があった。なお、ヒトＣＳＦ（Ａｇｅ６６／Ｃａｕｃａｓｉａｎ／Ｍ）及びヒトＣＳＦ（Ａｇｅ６９／Ｃａｕｃａｓｉａｎ／Ｍ）を使用した場合も同様の結果が得られた。
次に、ヒトＣＳＦにＡＳＰＤをスパイクしたサンプルを検体希釈液で２倍、４倍、８倍に希釈し、希釈率が１倍、１／２、１／４、及び１／８であるサンプルを測定した結果を図６に示す。
図６に示すように、希釈サンプルの結果をプロットした結果、希釈直線性が得られた。
次に、ヒトＣＳＦにＡＳＰＤをスパイクしたサンプルを検体希釈液で２倍、４倍、８倍に希釈し、希釈率が１倍、１／２、１／４、及び１／８であるサンプルを測定した結果を図６に示す。
図６に示すように、希釈サンプルの結果をプロットした結果、希釈直線性が得られた。
【0063】
６．ヒト血漿中のＡＳＰＤの測定
ＡＳＰＤ ＣＬＥＩＡ［抗ＡＳＰＤポリクローナル抗体／ｍＡＳＤ３］で、ヒト血漿検体中のＡＳＰＤの測定を行った。具体的には以下のフローで行った。
（１）ヒト血漿に既知濃度ＡＳＰＤを添加し、検体希釈液で希釈（１～１６倍希釈）。
（２）一次反応：ウサギ抗ＡＳＰＤポリクローナル抗体を固定化したマルチウェルプレートに１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃６０分振とう。
洗浄×３
（３）二次反応：ｍＡＳＤ３（１μｇ／ｍｌ）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃６０分振とう。
洗浄×３
（４）三次反応：抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（１／２００００）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃６０分振とう。
洗浄×３
（５）測定：ＨＲＰの化学発光基質（商品名：SuperSignal pico、ThermoFisher社製）を１００μＬ／ウェルで添加し、プレートリーダー（商品名：infinite M200pro、TECAN社製）で発光を測定。
測定用のスタンダードには、Ａβ凝集体１又は細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体（ＷＯ２０１７／１７９６４６）を用いた。
検体希釈液には、３％ＢＳＡ ｉｎ ＰＢＳ（－） ０．０５％防腐剤（商品名：プロクリン、シグマアルドリッチ社製）を用いた。
洗浄液には、ＰＢＳ（－） ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を用いた。
ＡＳＰＤ ＣＬＥＩＡ［抗ＡＳＰＤポリクローナル抗体／ｍＡＳＤ３］で、ヒト血漿検体中のＡＳＰＤの測定を行った。具体的には以下のフローで行った。
（１）ヒト血漿に既知濃度ＡＳＰＤを添加し、検体希釈液で希釈（１～１６倍希釈）。
（２）一次反応：ウサギ抗ＡＳＰＤポリクローナル抗体を固定化したマルチウェルプレートに１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃６０分振とう。
洗浄×３
（３）二次反応：ｍＡＳＤ３（１μｇ／ｍｌ）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃６０分振とう。
洗浄×３
（４）三次反応：抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（１／２００００）を１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃６０分振とう。
洗浄×３
（５）測定：ＨＲＰの化学発光基質（商品名：SuperSignal pico、ThermoFisher社製）を１００μＬ／ウェルで添加し、プレートリーダー（商品名：infinite M200pro、TECAN社製）で発光を測定。
測定用のスタンダードには、Ａβ凝集体１又は細胞分泌型ＡＳＰＤ様構造体（ＷＯ２０１７／１７９６４６）を用いた。
検体希釈液には、３％ＢＳＡ ｉｎ ＰＢＳ（－） ０．０５％防腐剤（商品名：プロクリン、シグマアルドリッチ社製）を用いた。
洗浄液には、ＰＢＳ（－） ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を用いた。
【0064】
ヒト血漿（Ａｇｅ２９／Ｃａｕｃａｓｉａｎ／Ｆ）に既知濃度ＡＳＰＤを添加し、３％ＢＳＡ ＰＢＳ（－）で４倍希釈して定量した結果の一例を下記表２に示す。
【0065】
【表2】
【0066】
表２に示すように、ヒトＣＳＦに変えてヒト血漿を用いてもＡＳＰＤを測定できた。しかし、回収率が半分程度であった。血漿成分の影響であると考えられる。
次に、ヒト血漿にＡＳＰＤをスパイクしたサンプルを検体希釈液で２倍、４倍、８倍、１６倍に希釈し、希釈率が１倍、１／２、１／４、１／８、及び１／１６であるサンプルを測定した結果を図７に示す。
図７に示すように、希釈サンプルの結果をプロットした結果、希釈直線性が得られた。しかし、バッファーに比べて傾きが１／２になった。血漿成分の影響であると考えられる。
なお、ヒト血漿試料における回収率への影響は、試料の希釈率を１／１６とすると解消できた。
次に、ヒト血漿にＡＳＰＤをスパイクしたサンプルを検体希釈液で２倍、４倍、８倍、１６倍に希釈し、希釈率が１倍、１／２、１／４、１／８、及び１／１６であるサンプルを測定した結果を図７に示す。
図７に示すように、希釈サンプルの結果をプロットした結果、希釈直線性が得られた。しかし、バッファーに比べて傾きが１／２になった。血漿成分の影響であると考えられる。
なお、ヒト血漿試料における回収率への影響は、試料の希釈率を１／１６とすると解消できた。
【0067】
７．ＡＳＰＤ ＣＬＥＩＡ［ｈｕＡＳＤ２／ｍＡＳＤ３］
固相に固定化する抗体としてヒト化抗ＡＳＰＤモノクローナル抗体ｈｕＡＳＤ２を使用し、マウス抗ＡＳＰＤモノクローナル抗体ｍＡＳＤ３、及び抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰを使用したＡＳＰＤ ＣＬＥＩＡでＡＳＰＤを測定した（図８）。
ｈｕＡＳＤ２はＷＯ２００９／０５７６６４に記載されるものである。
その結果の一例を図９に示す。図９に示すとおり、４回の独立したＡＳＰＤ測定を実施したところ、ほぼ同じ発光値が得られた。
固相に固定化する抗体としてヒト化抗ＡＳＰＤモノクローナル抗体ｈｕＡＳＤ２を使用し、マウス抗ＡＳＰＤモノクローナル抗体ｍＡＳＤ３、及び抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰを使用したＡＳＰＤ ＣＬＥＩＡでＡＳＰＤを測定した（図８）。
ｈｕＡＳＤ２はＷＯ２００９／０５７６６４に記載されるものである。
その結果の一例を図９に示す。図９に示すとおり、４回の独立したＡＳＰＤ測定を実施したところ、ほぼ同じ発光値が得られた。
【0068】
８．ＡＳＰＤ ＣＬＥＩＡ［ｈｕＡＳＤ２／ビオチン化ｍＡＳＤ３］
ＡＳＰＤの検出感度を向上させるため、ｍＡＳＤ３抗体をビオチン化し、ストレプトアビジン（ＳＡ）が結合したＨＲＰを使用するシステムを構築した（図１０）。
ｈｕＡＳＤ２／ビオチン化ｍＡＳＤ３システムでＡＳＰＤを測定したところ、ｈｕＡＳＤ２／ｍＡＳＤ３のシステムに比べて検出感度が向上した（図１１）。
また、ｈｕＡＳＤ２／ビオチン化ｍＡＳＤ３システムは、ＡＳＰＤに対する特性が高く、Ａβ１－１０が１６分子結合したマルチ抗原ペプチド（ＭＡＰ１６、富士フィルム和光社製）をほとんど検出しなかった（図１２）。一方、コントロールとしてＢＡＮ５０／ビオチン化ＢＡＮ５０システム（高分子アミロイドβオリゴマーＥＬＩＳＡキット、富士フィルム和光社製）で測定したところ、同システムは、ＭＡＰ１６を感度よく検出したが、ＡＳＰＤをほとんど検出できなかった（図１２）。
ＡＳＰＤの検出感度を向上させるため、ｍＡＳＤ３抗体をビオチン化し、ストレプトアビジン（ＳＡ）が結合したＨＲＰを使用するシステムを構築した（図１０）。
ｈｕＡＳＤ２／ビオチン化ｍＡＳＤ３システムでＡＳＰＤを測定したところ、ｈｕＡＳＤ２／ｍＡＳＤ３のシステムに比べて検出感度が向上した（図１１）。
また、ｈｕＡＳＤ２／ビオチン化ｍＡＳＤ３システムは、ＡＳＰＤに対する特性が高く、Ａβ１－１０が１６分子結合したマルチ抗原ペプチド（ＭＡＰ１６、富士フィルム和光社製）をほとんど検出しなかった（図１２）。一方、コントロールとしてＢＡＮ５０／ビオチン化ＢＡＮ５０システム（高分子アミロイドβオリゴマーＥＬＩＳＡキット、富士フィルム和光社製）で測定したところ、同システムは、ＭＡＰ１６を感度よく検出したが、ＡＳＰＤをほとんど検出できなかった（図１２）。
【0069】
９．血漿の影響を低減できる抗体の組み合わせ
固定化する第一抗体と、検出側の第二抗体の組み合わせの中から、血漿の影響を低減できる組み合わせを見出した。
下記の［第一抗体／第二抗体］の組み合わせでＡＳＰＤ ＣＥＩＬＡのシステムを構築し、血漿試料中のＡＳＰＤを測定した。
［第一抗体／第二抗体］の組み合わせとしては、［ｈｕＡＳＤ２／ビオチン化ｍＡＳＤ３］、［ｍＡＳＤ３／ビオチン化ｍＡＳＤ３］、［８２Ｅ１／ビオチン化ｍＡＳＤ３］、［ＢＡＮ５０ａ／ビオチン化ｍＡＳＤ３］、及び［６Ｅ１０／ビオチン化ｍＡＳＤ３］を採用した。サンプルとしては、ＡＳＰＤを含有する希釈率１／４の血漿サンプルを準備し、バッファーサンプルと比較した。
その結果の一例を図１３に示す。
図１３に示す通り、［ＢＡＮ５０ａ／ビオチン化ｍＡＳＤ３］の組み合わせの場合に、血漿成分の影響をもっとも効果的に回避できることが確認された。
固定化する第一抗体と、検出側の第二抗体の組み合わせの中から、血漿の影響を低減できる組み合わせを見出した。
下記の［第一抗体／第二抗体］の組み合わせでＡＳＰＤ ＣＥＩＬＡのシステムを構築し、血漿試料中のＡＳＰＤを測定した。
［第一抗体／第二抗体］の組み合わせとしては、［ｈｕＡＳＤ２／ビオチン化ｍＡＳＤ３］、［ｍＡＳＤ３／ビオチン化ｍＡＳＤ３］、［８２Ｅ１／ビオチン化ｍＡＳＤ３］、［ＢＡＮ５０ａ／ビオチン化ｍＡＳＤ３］、及び［６Ｅ１０／ビオチン化ｍＡＳＤ３］を採用した。サンプルとしては、ＡＳＰＤを含有する希釈率１／４の血漿サンプルを準備し、バッファーサンプルと比較した。
その結果の一例を図１３に示す。
図１３に示す通り、［ＢＡＮ５０ａ／ビオチン化ｍＡＳＤ３］の組み合わせの場合に、血漿成分の影響をもっとも効果的に回避できることが確認された。
【0070】
１０．ＡＤ患者の血液試料を用いた測定
アルツハイマー病（ＡＤ）と診断された患者の血漿サンプル１０例（○）と、健常者の血漿サンプル１０例（△）に対して、［ｈｕＡＳＤ２／ビオチン化ｍＡＳＤ３］の組み合わせでＡＳＰＤ ＣＬＥＩＡを行った。その結果、ＡＤ患者の４例についてＡＳＰＤが検出された。その結果を図１４に示す。
以上のこれら結果から、ＡＳＰＤ ＣＬＥＩＡによって血液中のＡＳＰＤを測定することが可能であることが示された。
アルツハイマー病（ＡＤ）と診断された患者の血漿サンプル１０例（○）と、健常者の血漿サンプル１０例（△）に対して、［ｈｕＡＳＤ２／ビオチン化ｍＡＳＤ３］の組み合わせでＡＳＰＤ ＣＬＥＩＡを行った。その結果、ＡＤ患者の４例についてＡＳＰＤが検出された。その結果を図１４に示す。
以上のこれら結果から、ＡＳＰＤ ＣＬＥＩＡによって血液中のＡＳＰＤを測定することが可能であることが示された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【配列表】