特許 7383607 選択された抗体を発現するように遺伝子改変されたＢ細胞を産生するシステム及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-11-10

(45)【発行日】2023-11-20

(54)【発明の名称】選択された抗体を発現するように遺伝子改変されたＢ細胞を産生するシステム及び方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0781 20100101AFI20231113BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20231113BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20231113BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20231113BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20231113BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20231113BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20231113BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20231113BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20231113BHJP

【ＦＩ】

C12N5/0781 ZNA

C12N5/10

C12P21/08

C12N15/13

C12N15/09 110

C12N15/864 100Z

A61K35/17

A61P31/00

A61P29/00

【請求項の数】 30

(21)【出願番号】P 2020522004

(86)(22)【出願日】2018-10-19

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-01-07

(86)【国際出願番号】 US2018056789

(87)【国際公開番号】W WO2019079772

(87)【国際公開日】2019-04-25

【審査請求日】2021-10-18

(31)【優先権主張番号】62/575,275

(32)【優先日】2017-10-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/580,303

(32)【優先日】2017-11-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/623,371

(32)【優先日】2018-01-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】522256406

【氏名又は名称】フレッド ハッチンソン キャンサー センター

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】テイラー，ジャスティン・ジェイ

(72)【発明者】

【氏名】モフェット，ハウエル・エフ

【審査官】西 賢二

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１７／１７６８０６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１５－５０２１４９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１７－５０５７８０（ＪＰ，Ａ）

【文献】Delpy, L. et al.，"B cell development arrest upon insertion of a neo gene between JH and Emu: promoter competition results in transcriptional silencing of germline JH and complete VDJ rearrangements"，J. Immunol.，2002年，Vol. 169，pp. 6875-6882

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １／００－７／０８

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

Ｃ１２Ｐ ２１／０８

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｂ細胞を遺伝子操作して、選択された抗体を発現させる方法であって、該方法はＢ細胞に、
遺伝子構築物の挿入のために標的にされるＢ細胞における遺伝子領域を切断する遺伝子編集剤及び、
５’から３’に向かって
（ｉ）重鎖プロモーターのヌクレオチド配列、
（ｉｉ）シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）選択された抗体の軽鎖をコードするヌクレオチド配列
（ｉｖ）（ａ）柔軟なリンカー又は自己切断ペプチドをコードするヌクレオチド配列又は（ｂ）スキッピングエレメントのヌクレオチド配列、
（ｖ）選択された抗体の重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列、及び
（ｖｉ）スプライスジャンクションを含むヌクレオチド配列
を含む遺伝子構築物、を送達することを含み、
遺伝子領域は、
（Ａ）配列番号１、又は
（Ｂ）配列番号３
の配列を含み、
遺伝子編集剤による切断後、（Ａ）又は（Ｂ）の遺伝子領域に遺伝子構築物が挿入され、それによりＢ細胞が選択された抗体を発現するように遺伝子操作して、選択された抗体を発現させる方法。

【請求項2】

Ｂ細胞の内因性可変重鎖コードゲノムが切り出されない、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

遺伝子編集剤が、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と会合したヌクレアーゼを含み、
該ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が、
遺伝子領域が（Ａ）であるとき、配列番号８８、８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６又は３０７の配列を有し、又は
遺伝子領域が（Ｂ）であるとき、配列番号８７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５又は３４６の配列を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

送達することが電気穿孔、ナノ粒子又はウイルス媒介送達を通じてである、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

ｇＲＮＡ及びヌクレアーゼが電気穿孔を通じて送達され、遺伝子構築物がウイルスベクターの一部として送達される、請求項３に記載の方法。

【請求項6】

ヌクレアーゼがＣａｓ９又はＣｐｆ１である、請求項３に記載の方法。

【請求項7】

重鎖プロモーターが、
遺伝子領域が（Ａ）のとき、配列番号１１１で表される配列を有し、又は
遺伝子領域が（Ｂ）のとき、配列番号１２８で表される配列を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

シグナルペプチドが、
配列番号１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１又は１９２で表されるアミノ酸配列を有し、
配列番号１９３又は１９４で表されるアミノ酸配列を有し、
遺伝子領域が（Ａ）のとき、配列番号１１８で表されるアミノ酸配列を有し、又は
遺伝子領域が（Ｂ）のとき、配列番号１３４で表されるアミノ酸配列を有する、
請求項１に記載の方法。

【請求項9】

柔軟なリンカーが配列番号１１６で表されるヌクレオチド配列によりコードされ、配列番号１２２、１８０、１８１、１８２、１８３又は１８４で表されるアミノ酸配列を有し、及び／又は
５０～８０アミノ酸を含むＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーである、
請求項１に記載の方法。

【請求項10】

自己切断ペプチドが配列番号１７６、１７７、１７８又は１７９で表される配列を有し、又はスキッピングエレメントが内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）である、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

スプライスジャンクションを含むヌクレオチド配列が、
遺伝子領域が（Ａ）のとき、配列番号１２４又は１５１で表され、又は
遺伝子領域が（Ｂ）のとき、配列番号１３９で表される、
請求項１に記載の方法。

【請求項12】

遺伝子構築物が、配列番号１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３又は２０４で表される配列を有するタグをコードする、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

遺伝子構築物が、アデノ随伴ウイルスベクターの一部である、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

遺伝子構築物の挿入の後、
（Ａ）の遺伝子領域が配列番号１０９で表される配列を含み、又は
（Ｂ）の遺伝子領域が配列番号１０８で表される配列を含む、
請求項１に記載の方法。

【請求項15】

選択された抗体が、
（ａ）配列番号１３８で表される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する可変重鎖及び、配列番号１３６で表される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する可変軽鎖、
（ｂ）配列番号１３８で表される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する可変重鎖及び、配列番号２０５で表される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する可変軽鎖、
（ｃ）配列番号１２３で表される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する可変重鎖及び、配列番号１２０で表される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する可変軽鎖、又は
（ｄ）配列番号１２３で表される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する可変重鎖及び、配列番号２０６で表される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する可変軽鎖、
を含む、抗呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）抗体、
配列番号１５０で表される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する可変重鎖及び、配列番号１４９で表される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する可変軽鎖、を含む抗ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗体、
配列番号２３５で表される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する可変重鎖及び、配列番号２３６で表される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する可変軽鎖、を含む抗百日咳抗体、
配列番号１５９で表される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する可変重鎖及び、配列番号１５８で表される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する可変軽鎖、を含む抗インフルエンザ抗体、
配列番号１６８で表される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する可変重鎖及び、配列番号１６６で表される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する可変軽鎖、を含む抗エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）抗体、又は
配列番号２５４で表される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する可変重鎖及び、配列番号２５５で表される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する可変軽鎖、を含む抗腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）抗体
を含み、前記各抗体中の前記可変重鎖及び前記可変軽鎖における相補決定配列（ＣＤＲ配列）には変異が含まれない、請求項１に記載の方法。

【請求項16】

選択された抗体が、Ｋａｂａｔ番号付けに従い、
配列番号２０７を含むＣＤＲＨ１、配列番号２０８を含むＣＤＲＨ２、配列番号２０９を含むＣＤＲＨ３、配列番号２１０を含むＣＤＲＬ１、配列番号２１１を含むＣＤＲＬ２及び配列番号２１２を含むＣＤＲＬ３を含む、抗呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）抗体、
（ａ）配列番号２１３を含むＣＤＲＨ１、配列番号２１４を含むＣＤＲＨ２、配列番号２１５を含むＣＤＲＨ３、配列番号２１６を含むＣＤＲＬ１、配列番号２１７を含むＣＤＲＬ２及び配列番号２１８を含むＣＤＲＬ３、若しくは
（ｂ）配列番号２１９を含むＣＤＲＨ１、配列番号２２０を含むＣＤＲＨ２、配列番号２２１を含むＣＤＲＨ３、ＱＹＧＳを含むＣＤＲＬ１、ＳＧＳを含むＣＤＲＬ２及び配列番号２２２を含むＣＤＲＬ３
を含む、抗ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗体、
（ａ）配列番号２２３を含むＣＤＲＨ１、配列番号２２４を含むＣＤＲＨ２、配列番号２２５を含むＣＤＲＨ３、配列番号２２６を含むＣＤＲＬ１、配列番号２２７を含むＣＤＲＬ２及び配列番号２２８を含むＣＤＲＬ３、若しくは
（ｂ）配列番号２２９を含むＣＤＲＨ１、配列番号２３０を含むＣＤＲＨ２、配列番号２３１を含むＣＤＲＨ３、配列番号２３２を含むＣＤＲＬ１、配列番号２３３を含むＣＤＲＬ２及び配列番号２３４を含むＣＤＲＬ３
を含む、抗デングウイルス抗体、
配列番号２３７を含むＣＤＲＨ１、配列番号２３８を含むＣＤＲＨ２、配列番号２３９を含むＣＤＲＨ３、配列番号２４０を含むＣＤＲＬ１、配列番号２４１を含むＣＤＲＬ２及び配列番号２４２を含むＣＤＲＬ３を含む、抗Ｃ型肝炎抗体、
配列番号２４３を含むＣＤＲＨ１、配列番号２４４を含むＣＤＲＨ２、配列番号２４５を含むＣＤＲＨ３、配列番号２４６を含むＣＤＲＬ１、ＫＴＳを含むＣＤＲＬ２及び配列番号２４７を含むＣＤＲＬ３を含む、抗インフルエンザウイルス抗体、
配列番号２４８を含むＣＤＲＨ１、配列番号２４９を含むＣＤＲＨ２、配列番号２５０を含むＣＤＲＨ３、配列番号２５１を含むＣＤＲＬ１、配列番号２５２を含むＣＤＲＬ２及び配列番号２５３を含むＣＤＲＬ３を含む、抗エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）抗体、
配列番号２５６を含むＣＤＲＨ１、配列番号２５７を含むＣＤＲＨ２、配列番号２５８を含むＣＤＲＨ３、配列番号２５９を含むＣＤＲＬ１、配列番号２６０を含むＣＤＲＬ２及び配列番号２６１を含むＣＤＲＬ３を含む、抗ＴＮＦ抗体、
配列番号２６２を含むＣＤＲＨ１、配列番号２６３を含むＣＤＲＨ２、配列番号２６４を含むＣＤＲＨ３、配列番号２６５を含むＣＤＲＬ１、配列番号２６６を含むＣＤＲＬ２及び配列番号２６７を含むＣＤＲＬ３を含む、抗ＴＮＦ抗体、又は
配列番号２６８を含むＣＤＲＨ１、配列番号２６９を含むＣＤＲＨ２、配列番号２７０を含むＣＤＲＨ３、配列番号２７１を含むＣＤＲＬ１、配列番号２７２を含むＣＤＲＬ２及び配列番号２７３を含むＣＤＲＬ３を含む、抗ＴＮＦ抗体
を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項17】

選択された抗体が、抗呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）抗体、抗ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗体、抗デングウイルス抗体、抗ボルデテラ・ペルツシス（Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）抗体、抗Ｃ型肝炎抗体、抗インフルエンザウイルス抗体、抗パラインフルエンザウイルス抗体、抗メタニューモウイルス（ＭＰＶ）抗体、抗サイトメガロウイルス抗体、抗エプスタイン・バーウイルス抗体、抗単純ヘルペスウイルス抗体、抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細菌毒素抗体、又は抗腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）抗体である、請求項１に記載の方法。

【請求項18】

遺伝子構築物が、重鎖プロモーターの相同性アーム５’及びスプライスジャンクションの相同性アーム３’を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項19】

遺伝子構築物が、
配列番号１２６で表されるアミノ酸配列を有する抗ＲＳＶ抗体をコードするコード配列を含む、配列番号１０２で表されるヌクレオチド配列、
配列番号１４１で表されるアミノ酸配列を有する抗ＲＳＶ抗体をコードするコード配列を含む、配列番号１０３で表されるヌクレオチド配列、
配列番号１４１で表されるアミノ酸配列を有する抗ＲＳＶ抗体をコードするコード配列を含む、配列番号１０４で表されるヌクレオチド配列、
配列番号１５２で表されるアミノ酸配列を有する抗ＨＩＶ抗体をコードするコード配列を含む、配列番号１０５で表されるヌクレオチド配列、
配列番号１６０で表されるアミノ酸配列を有する抗インフルエンザ抗体をコードするコード配列を含む、配列番号１０６で表されるヌクレオチド配列、
配列番号１６９で表されるアミノ酸配列を有する抗ＥＢＶ抗体をコードするコード配列を含む、配列番号１０７で表されるヌクレオチド配列、
を含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

遺伝子領域が（Ａ）であるとき、
５’相同性アームが配列番号１１０又は１５３で表され、３’相同性アームが配列番号１２５で表され、
５’相同性アームが配列番号９２で表され、３’相同性アームが配列番号９３で表され、もしくは
５’相同性アームが配列番号９４で表され、３’相同性アームが配列番号９５で表され、又は
遺伝子領域が（Ｂ）であるとき、
５’相同性アームが配列番号１２７で表され、３’相同性アームが配列番号１４０で表され、
５’相同性アームが配列番号９０で表され、３’相同性アームが配列番号９１で表され、もしくは
５’相同性アームが配列番号１４２で表され、３’相同性アームが配列番号１４３で表される、
請求項１８に記載の方法。

【請求項21】

遺伝子領域が（Ａ）を含むとき、遺伝子構築物は、
（ｉ）配列番号１１０で表される５’相同性アーム配列、
（ｉｉ）配列番号１１１で表される配列を有する重鎖プロモーター、
（ｉｉｉ）配列番号１１８で表されるアミノ酸配列を有するシグナルペプチドをコードするコード配列、
（ｉｖ）配列番号２８５で表されるアミノ酸配列を有する選択された抗体の軽鎖をコードするコード配列、
（ｖ）配列番号１２２で表されるアミノ酸配列を有する柔軟なリンカーをコードするコード配列、
（ｖｉ）配列番号１２３で表されるアミノ酸配列を有する選択された抗体の重鎖の可変領域をコードするコード配列、
（ｖｉｉ）配列番号１２４で表される配列を有するスプライスジャンクション、及び
（ｖｉｉｉ）配列番号１２５で表される３’相同性アーム配列、を含む、又は
遺伝子領域が（Ａ）を含むとき、遺伝子構築物は、
（ｉ）配列番号１１０で表される５’相同性アーム配列、
（ｉｉ）配列番号１１１で表される配列を有する重鎖プロモーター、
（ｉｉｉ）配列番号１１８で表されるアミノ酸配列を有するシグナルペプチドをコードするコード配列、
（ｉｖ）配列番号２８７で表されるアミノ酸配列を有する選択された抗体の軽鎖をコードするコード配列、
（ｖ）配列番号１２２で表されるアミノ酸配列を有する柔軟なリンカーをコードするコード配列、
（ｖｉ）配列番号１５０で表されるアミノ酸配列を有する選択された抗体の重鎖の可変領域をコードするコード配列、
（ｖｉｉ）配列番号１５１で表される配列を有するスプライスジャンクション、及び
（ｖｉｉｉ）配列番号１２５で表される３’相同性アーム配列、を含む、又は
遺伝子領域が（Ａ）を含むとき、遺伝子構築物は、
（ｉ）配列番号１５３で表される５’相同性アーム配列、
（ｉｉ）配列番号１１１で表される配列を有する重鎖プロモーター、
（ｉｉｉ）配列番号１１８で表されるアミノ酸配列を有するシグナルペプチドをコードするコード配列、
（ｉｖ）配列番号２８８で表されるアミノ酸配列を有する選択された抗体の軽鎖をコードするコード配列、
（ｖ）配列番号１２２で表されるアミノ酸配列を有する柔軟なリンカーをコードするコード配列、
（ｖｉ）配列番号１５９で表されるアミノ酸配列を有する選択された抗体の重鎖の可変領域をコードするコード配列、
（ｖｉｉ）配列番号１５１で表される配列を有するスプライスジャンクション、及び
（ｖｉｉｉ）配列番号１２５で表される３’相同性アーム配列、を含む、又は
遺伝子領域が（Ａ）を含むとき、遺伝子構築物は、
（ｉ）配列番号１５３で表される５’相同性アーム配列、
（ｉｉ）配列番号１１１で表される配列を有する重鎖プロモーター、
（ｉｉｉ）配列番号１１８で表されるアミノ酸配列を有するシグナルペプチドをコードするコード配列、
（ｉｖ）配列番号２８９で表されるアミノ酸配列を有する選択された抗体の軽鎖をコードするコード配列、
（ｖ）配列番号１２２で表されるアミノ酸配列を有する柔軟なリンカーをコードするコード配列、
（ｖｉ）配列番号１６８で表されるアミノ酸配列を有する選択された抗体の重鎖の可変領域をコードするコード配列、
（ｖｉｉ）配列番号１５１で表される配列を有するスプライスジャンクション、及び
（ｖｉｉｉ）配列番号１２５で表される３’相同性アーム配列、を含む、又は
遺伝子領域が（Ｂ）を含むとき、遺伝子構築物は、
（ｉ）配列番号１２７で表される５’相同性アーム配列、
（ｉｉ）配列番号１２８で表される配列を有する重鎖プロモーター、
（ｉｉｉ）配列番号１３４で表されるアミノ酸配列を有するシグナルペプチドをコードするコード配列、
（ｉｖ）配列番号２８６で表されるアミノ酸配列を有する選択された抗体の軽鎖をコードするコード配列、
（ｖ）配列番号１２２で表されるアミノ酸配列を有する柔軟なリンカーをコードするコード配列、
（ｖｉ）配列番号１３８で表されるアミノ酸配列を有する選択された抗体の重鎖の可変領域をコードするコード配列、
（ｖｉｉ）配列番号１３９で表される配列を有するスプライスジャンクション、及び
（ｖｉｉｉ）配列番号１４０で表される３’相同性アーム配列、を含む、又は
遺伝子領域が（Ｂ）を含むとき、遺伝子構築物は、
（ｉ）配列番号１４２で表される５’相同性アーム配列、
（ｉｉ）配列番号１２８で表される配列を有する重鎖プロモーター、
（ｉｉｉ）配列番号１３４で表されるアミノ酸配列を有するシグナルペプチドをコードするコード配列、
（ｉｖ）配列番号２８６で表されるアミノ酸配列を有する選択された抗体の軽鎖をコードするコード配列、
（ｖ）配列番号１２２で表されるアミノ酸配列を有する柔軟なリンカーをコードするコード配列、
（ｖｉ）配列番号１３８で表されるアミノ酸配列を有する選択された抗体の重鎖の可変領域をコードするコード配列、
（ｖｉｉ）配列番号１３９で表される配列を有するスプライスジャンクション、及び
（ｖｉｉｉ）配列番号１４３で表される３’相同性アーム配列、を含む、
請求項１８に記載の方法。

【請求項22】

Ｂ細胞が、抗体産生Ｂ細胞、記憶Ｂ細胞、ナイーブＢ細胞、Ｂ１ Ｂ細胞又は周辺帯Ｂ細胞である、請求項１に記載の方法。

【請求項23】

遺伝子操作され、選択された抗体を発現するＢ細胞であって、該Ｂ細胞には、
遺伝子構築物の挿入のために標的にされるＢ細胞における遺伝子領域を切断する遺伝子編集剤、及び
５’から３’に向かって
（ｉ）重鎖プロモーターのヌクレオチド配列、
（ｉｉ）シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）選択された抗体の軽鎖をコードするヌクレオチド配列
（ｉｖ）（ａ）柔軟なリンカー又は自己切断ペプチドをコードするヌクレオチド配列又は（ｂ）スキッピングエレメントのヌクレオチド配列、
（ｖ）選択された抗体の重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列、及び
（ｖｉ）スプライスジャンクションを含むヌクレオチド配列
を含む遺伝子構築物、が送達され、
遺伝子領域は、
（Ａ）配列番号１、又は
（Ｂ）配列番号３
の配列を含み、
遺伝子編集剤による切断後、（Ａ）又は（Ｂ）の遺伝子領域に遺伝子構築物が挿入されたＢ細胞。

【請求項24】

Ｂ細胞が、抗体分泌Ｂ細胞、記憶Ｂ細胞、ナイーブＢ細胞、Ｂ１ Ｂ細胞又は周辺帯Ｂ細胞である、請求項２３に記載のＢ細胞。

【請求項25】

抗感染効果を必要とする対象において抗感染効果を提供するための、治療有効量の請求項２３に記載のＢ細胞を含む医薬組成物。

【請求項26】

ワクチン接種の必要を取り除く、請求項２５に記載の医薬組成物。

【請求項27】

ワクチン接種プロトコールに取って代わる、請求項２５に記載の医薬組成物。

【請求項28】

対象が免疫抑制された対象である、請求項２５に記載の医薬組成物。

【請求項29】

対象が、骨髄移植、造血幹細胞移植又は遺伝子改変造血幹細胞の投与を含む処置レジメンの一部として免疫抑制された対象である、請求項２５に記載の医薬組成物。

【請求項30】

抗炎症効果を必要とする対象において抗炎症効果を提供するための、治療有効量の請求項２３に記載のＢ細胞を含む医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は２０１７年１０月２０日出願の米国特許仮出願第６２／５７５，２７５号、２０１７年１１月１日出願の米国特許仮出願第６２／５８０，３０３号、及び２０１８年１月２９日出願の米国特許仮出願第６２／６２３，３７１号の優先権を主張するものであり、これらはそれぞれ、本明細書で完全に記載されているかのように、参照によりその全体を本明細書に組み込む。

【0002】

配列表に関する陳述
本出願に関連する配列表はハードコピーの代わりにテキスト形式で提供され、それによって参照により本明細書に組み込む。配列表を含有するテキストファイル名は１８－０２４－ＷＯ－ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは１８４ＫＢであり、２０１８年１０月１９日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂにより電子的に提出されている。

【0003】

本開示は、Ｂ細胞を遺伝子改変して選択された抗体を発現させるシステム及び方法を提供する。このシステム及び方法を使用して、古典的なワクチン接種の必要性を取り除き、現在利用可能なワクチン接種ができない感染病原体に対する防御を提供し、患者が他の方法で免疫抑制されている場合に感染病原体に対する防御を提供し、及び／又は自己免疫障害の処置においてなど、治療抗体により提供される利益をもたらすことができる。

【背景技術】

【0004】

ワクチンは、Ｂ細胞を刺激して標的感染病原体に対する抗体を産生させることにより特定の感染症に対して対象の免疫を増加するように設計される。通例の小児ワクチン接種は、比較的リスクが低く有効性が高い長い間確立している臨床的介入である。しかし、不運なことに、ワクチン接種はあらゆる感染病原体に利用可能なわけではない。一例として、米国では毎年、何百万もの子供たちが呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の感染により医者又は救急処置室にかかっている。

【0005】

何十年も、研究者たちは、Ｂ細胞を誘導して、ＲＳＶ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、及びジカウイルスなどのウイルスに対して防御するのに有効な抗体を産生させることが可能なワクチンの開発に努力している。しかし、防御抗体を誘導するあらゆる努力は失敗してきた。広く試験された唯一のＲＳＶワクチンは実際には感染をさらに悪化させ、ワクチン接種の後に生成される抗体はウイルスを無力化しなかったが、代わりに、ウイルスが細胞に感染する能力を増強した。ＲＳＶ、ＨＩＶ、及びジカウイルスに加えて、利用可能である有効なワクチンがない他のいくつかの感染病原体が存在する。

【0006】

感染と闘うことに加えて、抗体は、自己免疫疾患などの他の状態についての処置としても有用である場合がある。しかし、これらの抗体ベースの療法は典型的には、防御を維持するために抗体の繰り返し注射が必要になる。

【0007】

その上、注目すべきことに、数多くの患者は血液系腫瘍（例えば、白血病、リンパ腫、骨髄腫）の処置として骨髄又は造血幹細胞移植片を受ける。他の患者は、その患者に欠けている治療遺伝子を与える遺伝子改変された造血幹細胞の注入を受ける。こうした処置はすべて、患者の既存の免疫系が、移植片又は遺伝子改変された造血幹細胞の投与前に取り除かれることを必要とし、患者の免疫系が処置に続いて再定植する前に免疫抑制の危険な時間帯を残す。免疫抑制のこの時間中、患者は、ＲＳＶ、インフルエンザ、パラインフルエンザ、及びメタニューモウイルス（ＭＰＶ）などの感染症に信じられないほど罹りやすくなる。これらの感染症は高リスク因子であり、こうした処置に続いて多数の死亡数を伴う。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0008】

（発明の要旨）
本開示は、Ｂ細胞を遺伝子改変して選択された抗体を発現させるシステム及び方法を提供する。特定の実施形態では、選択された抗体は既存のワクチン接種の必要性を減らす又は取り除く。特定の実施形態では、選択された抗体は、現在利用可能である有効なワクチン接種戦略がないウイルス（例えば、ＲＳＶ、ＨＩＶ、ジカ）由来の感染に対して防御する。特定の実施形態では、選択された抗体は、種々の自己免疫障害を処置するために施される注射などの治療抗体注射の必要を減らす又は取り除く。特定の実施形態では、選択された抗体は、免疫抑制患者を感染症から防御する。特定の実施形態では、本開示の方法を使用して、何百もの異なる感染病原体又は病原菌に対して、すべてが数日に及ぶ単回研究室操作によって防御するようＢ細胞を再プログラムすることができる。

【0009】

特定の実施形態では、本開示は、Ｂ細胞の内因性ゲノムの特定の領域中への遺伝的構築物の標的された挿入を通じてこれらの利点を提供する。重要なことに、抗体多様性に必要とされるこれらの細胞内の遺伝子配列の高度な可変性のために、Ｂ細胞の遺伝子改変は困難である。この高度な遺伝子可変性により、遺伝子操作のために抗体コード領域を直接標的にするのは実行不可能である。さらに、Ｂ細胞のゲノムのコード部分を取り除き置き換えることも、このアプローチではＢ細胞機能に否定的な影響を及ぼすために、有効ではない。

【0010】

抗体は、重鎖及び軽鎖と呼ばれる別々のタンパク質単位から形成されるので、Ｂ細胞を遺伝子改変して選択された抗体を発現させることに関してさらなる難問が生じる。異なる鎖はＢ細胞ゲノムの異なる部分によりコードされるが、機能的な抗体を形成するためには集合しなければならない。

【0011】

本開示は、とりわけ、遺伝子挿入のために確実に標的にすることができ、改変されると、Ｂ細胞の天然のゲノムの対応する部分よりも挿入された遺伝子構築物を優先的に発現するＢ細胞ゲノムの定常領域を同定することにより注目される困難を克服する。この戦略は、Ｂ細胞ゲノムに関連する配列可変性を克服し、選択された抗体の機能的発現を達成するための内因性Ｂ細胞ゲノムの部分を取り除き置き換える必要性も克服する。内因性Ｂ細胞ゲノムの部分を取り除き置き換える必要性を克服すれば、遺伝子操作後Ｂ細胞機能は保存される。

【0012】

特定の実施形態では、遺伝子挿入のために標的にされる注目の領域は、配列番号８５（ヒト）又は配列番号８６（マウス）のＥμエンハンサーエレメントの上流又は下流のイントロン領域である。特定の実施形態では、遺伝子挿入のために標的にされる領域は、配列番号１若しくは２（ヒト）又は配列番号３若しくは４（マウス）から選択される定常イントロン領域である。特定の実施形態では、遺伝子挿入のために標的にする配列番号１内のヒトＤＮＡ配列は、配列番号５～２４を含む。特定の実施形態では、遺伝子挿入のために標的にする配列番号２内のヒトＤＮＡ配列は、配列番号２５～４４を含む。特定の実施形態では、遺伝子挿入のために標的にする配列番号３内のマウスＤＮＡ配列は、配列番号４５～６４を含む。特定の実施形態では、遺伝子挿入のために標的にする配列番号４内のマウスＤＮＡ配列は、配列番号６５～８４を含む。遺伝子改変のためにこれらの部位を特に標的にすることができる遺伝子配列は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列番号８７～８９、及び２９０～３６６として本開示内に記載されている。

【0013】

特定の実施形態では、挿入された遺伝子構築物の配置及び構成成分は、Ｂ細胞の内因性ゲノムの対応する部分よりも挿入された遺伝子構築物の優先的な発現をもたらす。これらの実施形態は、内因性Ｂ細胞ゲノムの異なる領域によりコードされる抗体の部分に関連する難問を克服するエレメントも含む。

【0014】

特定の実施形態では、遺伝子構築物は配列番号１、２、３、及び４のうちの１つ中に挿入され、（ｉ）プロモーター；（ｉｉ）シグナルペプチド；（ｉｉｉ）選択された抗体の全軽鎖をコードする導入遺伝子；（ｉｖ）柔軟なリンカー又はスキッピングエレメント；（ｖ）選択された抗体の重鎖の可変部分；及び（ｖｉ）Ｂ細胞の内因性重鎖定常領域の発現をもたらすスプライスジャンクションを含む。これらの実施形態では、選択された抗体を単一の構築物として発現すれば、内因性Ｂ細胞ゲノムの異なる領域によりコードされる抗体の部分に関連する難問は克服される。柔軟なリンカーを包含すれば、発現された選択された抗体の軽鎖部分と重鎖部分は、軽鎖と重鎖が機能的な単位を形成するのを可能にし、同時に抗体部分がＢ細胞の内因性ゲノム由来の他の潜在的に発現される抗体鎖と結合するリスクを低減するように、物理的に連結される。スキッピングエレメントを使用すれば、軽鎖部分と重鎖部分を物理的に連結することはないが、それらの鎖が近接して発現すると、会合して機能的な単位を形成し、同時に、抗体部分がＢ細胞の内因性ゲノム由来の他の潜在的に発現される抗体鎖と結合するリスクを低減する。スプライスジャンクションを包含すれば、Ｂ細胞の目下の活性化及び／又は成熟状態に適した重鎖定常領域を含む選択された抗体が生じる。言い換えると、Ｂ細胞の内因性重鎖定常領域のいずれでも有しつつ選択され発現された抗体を発現することが可能であり、選択された抗体と一緒に発現される重鎖定常領域は時間をかけて自然に変化することが可能である。

【0015】

本開示は、選択された抗体を発現するように有効に遺伝子改変されたＢ細胞のみが製剤化及び患者への投与のために収集されることを保証する方法も提供する。例えば、遺伝子改変前に、Ｂ細胞は、カッパ軽鎖又はラムダ軽鎖を含む抗体を天然に発現する。Ｂ細胞は、それが天然に発現するカッパ又はラムダ鎖とは異なる軽鎖を発現するように改変することが可能であり、置き換えた鎖を発現するＢ細胞のみが製剤化及び投与のために選択される。

【0016】

本開示は、本明細書に記載される利点を提供するようにＢ細胞を有効に改変する数多くの追加の戦略も提供する。これらの及び他の戦略は、下の詳細な説明にさらに完全に説明される。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】古典的ワクチン接種戦略に対するＢ細胞応答の模式図。

【図2】呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対する先行技術ワクチン接種戦略の模式図。ホルマリン不活化ＲＳＶワクチン（図２Ａ）；「改良された」ＲＳＶワクチン（図２Ｂ）；ＲＳＶエピトープスキャフォールドワクチン（図２Ｃ）。

【図3】ワクチン接種を迂回しＲＳＶに対する防御抗体を直接提供する以前の努力の要約。パリビズマブ注射（図３Ａ）；アデノウイルス媒介パリビズマブ発現（図３Ｂ）；（図３Ｃ）。

【図4A】本明細書で開示される防御戦略の特定の実施形態についての模式図。ＲＳＶに対して防御するＢ細胞改変。

【図4B】本明細書で開示される防御戦略の特定の実施形態についての模式図。同時防御のための戦略。

【図5】感染の存在及び非存在でのＢ細胞サブタイプによるパリビズマブの仮定される分泌。

【図6】抗体遺伝子（図６Ａ）及び抗体タンパク質（図６Ｂ）の構造であり、抗体が２つの別々の遺伝子産物から作製されるタンパク質であるという本開示の技術的難問を強調している。特定の実施形態では、本明細書に開示される選択された抗体をコードする合成遺伝子構築物は、この難問に取り組むためにスキッピングエレメント（例えば、自己切断ペプチド）を利用する。

【図7】円及び楕円として示されるエンハンサーエレメントと発現可能な６つの潜在的定常領域を組み換えるＶ、Ｄ及びＪセグメントを含む、内因性重鎖遺伝子座を描く模式図である。Ｂ細胞はμ／δ定常領域を発現することにより始まるが、介在性のＤＮＡを欠失することによりγ、α又はε定常領域を使用することに切り替え可能である。それぞれのＶセグメントは、組換えに続いて重鎖の発現を駆動する矢印で示される重鎖プロモーターと会合していることにも留意されたい。

【図8A】２つのタンパク質が一体となって抗体を形成するので、Ｂ細胞の内因性抗体重鎖（ＩｇＨ）及び／又は内因性抗体軽鎖（ＩｇＬ）を標的にする又は不活化するのが望ましいことがある。そのようなターゲティング又は不活化がない場合には、望ましくないハイブリッド抗体が形成されるおそれがある（すなわち、内因性軽鎖が選択された抗体重鎖と対合する又は逆もある）。内因性ＩｇＨターゲティングへのアプローチ及び選択された抗体（例えば、パリビズマブ）の一部を含む得られたキメラ。

【図8B】２つのタンパク質が一体となって抗体を形成するので、Ｂ細胞の内因性抗体重鎖（ＩｇＨ）及び／又は内因性抗体軽鎖（ＩｇＬ）を標的にする又は不活化するのが望ましいことがある。そのようなターゲティング又は不活化がない場合には、望ましくないハイブリッド抗体が形成されるおそれがある（すなわち、内因性軽鎖が選択された抗体重鎖と対合する又は逆もある）。ＩｇＬ不活化へのアプローチ。描かれているアプローチでは、終止コドンは挿入された遺伝子構築物の上流に（又はその一部として）置くことが可能である。

【図9】重鎖エンハンサーと（上）内因性ＶＤＪ又は（下）挿入された遺伝子構築物によりコードされた合成ＶＤＪの相互作用を描く模式図。プロモーターは矢印として描かれている。核酸は箱として描かれている。Ｂ細胞は、Ｅμエンハンサーのもっとも近くにあるプロモーターの下流にある核酸を天然に発現する。図９に描かれている内因性Ｂ細胞ゲノムでは、次に、Ｅμエンハンサーのもっとも近くの第１の上流プロモーターは内因性重鎖ＶＤＪセグメントの発現を駆動する。Ｅμエンハンサーと第１の内因性プロモーターの間にプロモーターを含む遺伝子構築物を挿入すると、Ｂ細胞は内因性重鎖ＶＤＪセグメントよりむしろ挿入された遺伝子構築物を発現する。この挿入された遺伝子は、重鎖のＶＤＪ可変領域、重鎖可変ＶＤＪと一体になった対合した完全抗体軽鎖又はＢ細胞重鎖定常領域との融合物として発現されることができる別の合成遺伝子が可能だと考えられる。図９では、定常領域は、挿入された遺伝子構築物が潜在的重鎖定常領域のいずれかと一緒に発現可能であることを強調するために個々に示されている。

【図10】挿入のための標的領域（ヒト）。ゲノム中への遺伝子構築物挿入のための領域：＃１：末端Ｊ領域（ヒトでＩＧＨＪ６、マウスでＩＧＨＪ４）からＥμエンハンサーまで；又は＃２：Ｅμエンハンサーから定常ドメインスイッチ領域の反復配列まで。

【図11A】ヒトＥμイントロンエンハンサー（配列番号８５）及びＩＧＨＪ６からＥμイントロンエンハンサーまでを含む遺伝子挿入のために標的にするヒトＤＮＡ配列（配列番号１）。

【図11B-1】例示的関連ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）標的部位（配列番号５～２４）及びｇＲＮＡ配列（配列番号８８、８９、及び２９０～３０７）。

【図11B-2】例示的関連ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）標的部位（配列番号５～２４）及びｇＲＮＡ配列（配列番号８８、８９、及び２９０～３０７）。

【図12A】Ｅμイントロンエンハンサーからスイッチ領域までを含む遺伝子挿入のために標的にするヒトＤＮＡ配列（配列番号２）。

【図12B-1】例示的関連ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）標的部位（配列番号２５～４４）及びｇＲＮＡ配列（配列番号３０８～３２７）。

【図12B-2】例示的関連ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）標的部位（配列番号２５～４４）及びｇＲＮＡ配列（配列番号３０８～３２７）。

【図13A】マウスＥμイントロンエンハンサー（配列番号８６）及びＩＧＨＪ４からＥμイントロンエンハンサーまでを含む遺伝子挿入のために標的にするマウスＤＮＡ配列（配列番号３）。

【図13B-1】例示的関連ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）標的部位（配列番号４５～６４）及びｇＲＮＡ配列（配列番号８７、及び３２８～３４６）。

【図13B-2】例示的関連ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）標的部位（配列番号４５～６４）及びｇＲＮＡ配列（配列番号８７、及び３２８～３４６）。

【図14A】Ｅμイントロンエンハンサーからスイッチ領域までを含む遺伝子挿入のために標的にするマウスＤＮＡ配列（配列番号４）。

【図14B-1】例示的関連ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）標的部位（配列番号６５～８４）及びｇＲＮＡ配列（配列番号３４７～３６６）。

【図14B-2】例示的関連ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）標的部位（配列番号６５～８４）及びｇＲＮＡ配列（配列番号３４７～３６６）。

【図15A】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集システムを利用しての、抗ＲＳＶ抗体をコードする遺伝子構築物の内因性重鎖遺伝子座中への挿入を描く模式図である。遺伝子構築物は、挿入部位のゲノムＤＮＡに相同なヌクレオチドオーバーハングである相同性アーム又はステッチを含むことが可能である。

【図15B】ゲノムのＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ切断（上）、挿入された配列に隣接する長い相同性アームを含有する一本鎖ＤＮＡ（中央）、及びＤＮＡオリゴのアニーリングにより産生される挿入された配列に隣接する短い相同性アーム（下）と協働して、挿入された配列に隣接する二本鎖ＤＮＡ切断を生成するためのｓｇＲＮＡ標的部位が隣接する配列を含むＤＮＡ修復鋳型の追加の例を描いている。

【図16】（上）抗ＲＳＶ抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子構築物で改変した改変重鎖遺伝子座；（中央）抗ＲＳＶ抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子構築物で改変した改変軽鎖遺伝子座；及び（下）抗ＲＳＶ抗体の軽鎖（すなわち、ＩｇＬ）、及び抗ＲＳＶ抗体の重鎖可変領域を、軽鎖と重鎖可変領域の間のリンカー（Ｓｔｒｅｐタグを含む）と共にコードする遺伝子構築物で改変された改変重鎖遺伝子座を描く模式図。

【図17】本明細書に開示されるように、改変記憶Ｂ細胞及び改変抗体分泌Ｂ細胞による複数の病原体に対する同時防御の模式図。

【図18】マウス及びヒトＢ細胞における標的イントロン領域の効率的Ｃａｓ９切断。マウス及びヒトＢ細胞におけるＣａｓ９／ｓｇＲＮＡリボ核タンパク質複合体媒介有効切断を用いる電気穿孔。細胞はＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ複合体を用いて電気穿孔した。編集効率は、マウスＢ細胞株（Ａ２０）（図１８Ａ）、初代Ｂ細胞（図１８Ｂ）及びヒトＢ細胞株（Ｒａｍｏｓ）（図１８Ｃ）において、電気穿孔後の３日目に分解によるインデルのトラッキング（ＴＩＤＥ）により評価した。

【図19】ＲＳＶ特異的抗体をコードする遺伝子構築物のマウスＢ細胞中への挿入。

【図20】遺伝子改変されたＢ細胞の濃縮及び分析。

【図21】遺伝子改変されたＢ細胞はＲＳＶ結合抗体を分泌する。

【図22A】非相同末端結合（ＮＨＥＪ）及びマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）アプローチは、初代マウスＢ細胞のゲノム操作のための長い相同組換え修復（ＨＤＲ）の代替手段を提供する。初代Ｂ細胞は２４時間プライミングされ、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）と１２時間共インキュベートされ、洗浄され、電気穿孔される又はｍＣｈｅｒｒｙ発現の分析前の３日間で二次培養に直接移された。

【図22B】非相同末端結合（ＮＨＥＪ）及びマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）アプローチは、初代マウスＢ細胞のゲノム操作のための長い相同組換え修復（ＨＤＲ）の代替手段を提供する。初代Ｂ細胞は２４時間プライミングされ、モック電気穿孔される、又は鋳型＋Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡを用いて電気穿孔され、ｍＣｈｅｒｒｙ発現の分析前の５日間で二次培養に移された。

【図23A】機能的抗体をコードする新規の遺伝子構築物をマウス及びヒトＢ細胞株に挿入すると、表面結合及び分泌抗体の発現が可能になる。部分的抗体構築物の挿入用の部位を示すＩｇＨ遺伝子座の図、並びに表面結合及び分泌抗体の描写。ｅｍＡｂ＝合成抗体であり、本明細書ではｓｙｎＡｂと互換的に使用される。

【図23B】機能的抗体をコードする新規の遺伝子構築物をマウス及びヒトＢ細胞株に挿入すると、表面結合及び分泌抗体の発現が可能になる。ＲＳＶプレ融合Ｆタンパク質テトラマー（ＲＳＶテトラマー）及び抗ＳｔｒｅｐタグＩＩテトラマー（αＴａｇＡｂテトラマー）を用いた非改変又は抗ＲＳＶ合成抗体（αＲＳＶ ｓｙｎＡｂ）改変マウスＡ２０ Ｂ細胞株の染色。

【図23C】機能的抗体をコードする新規の遺伝子構築物をマウス及びヒトＢ細胞株に挿入すると、表面結合及び分泌抗体の発現が可能になる。ＲＳＶプレ融合テトラマー及び抗ＳｔｒｅｐタグＩＩ抗体テトラマーを用いた非改変又は抗ＲＳＶ ｓｙｎＡｂ改変ヒトＲＡＭＯＳ Ｂ細胞株の染色。

【図23D】機能的抗体をコードする新規の遺伝子構築物をマウス及びヒトＢ細胞株に挿入すると、表面結合及び分泌抗体の発現が可能になる。非改変又は抗ＲＳＶ ｓｙｎＡｂ改変Ａ２０細胞培養物の培養培地由来のＲＳＶプレ融合Ｆタンパク質への抗体の結合についてのＥＬＩＳＡ。パリビズマブは陽性対照として使用した。

【図23E】機能的抗体をコードする新規の遺伝子構築物をマウス及びヒトＢ細胞株に挿入すると、表面結合及び分泌抗体の発現が可能になる。非改変又は抗ＲＳＶ ｓｙｎＡｂ改変ＲＡＭＯＳ細胞培養物の培養培地由来のＲＳＶプレ融合Ｆタンパク質への抗体の結合についてのＥＬＩＳＡ。パリビズマブは陽性対照として使用した。

【図24A】新規の特異性を有する初代マウスＢ細胞の産生。濃縮前（左パネル）並びに濃縮及び拡大後の抗ＳｔｒｅｐタグＩＩテトラマーを用いた、抗ＳｔｒｅｐタグＩＩテトラマー（中央パネル）及びＲＳＶプレ融合ウイルスタンパク質テトラマー（右パネル）を用いた、モック処置（上）又は抗ＲＳＶ ｓｙｎＡｂ改変マウスＢ細胞株（下）の表面染色。

【図24B】新規の特異性を有する初代マウスＢ細胞の産生。非改変又は抗ＲＳＶ ｓｙｎＡｂ改変マウスＢ細胞培養物の培養培地由来のＲＳＶプレ融合Ｆタンパク質への抗体の結合についてのＥＬＩＳＡ。パリビズマブは陽性対照として使用した。抗体結合は、ポリクローナル抗ヒトＩｇとＨＲＰに結合している抗マウスＩｇの１対１混合物を用いて検出される。

【図24C】新規の特異性を有する初代マウスＢ細胞の産生。３Ｔ３－ＣＤ４０Ｌフィーダー細胞及びＩＬ－２１を用いた培養における濃縮されたＢ ｓｙｎＡｂ細胞の急速な拡大。

【図25A】例示的配列。例示的ｓｇＲＮＡ配列（配列番号８７、８８、８９）、ゲノム相同性領域（配列番号９０～９５）及びスプライシングオリゴヌクレオチド（配列番号９６～１０１）。

【図25B-1】例示的配列。ヒト抗ＲＳＶ－ｅｍＡｂ ＡＡＶ（２５３１ｂｐ（配列番号１０２）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１１０～１２６、２８０、２８５））。

【図25B-2】例示的配列。ヒト抗ＲＳＶ－ｅｍＡｂ ＡＡＶ（２５３１ｂｐ（配列番号１０２）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１１０～１２６、２８０、２８５））。

【図25B-3】例示的配列。ヒト抗ＲＳＶ－ｅｍＡｂ ＡＡＶ（２５３１ｂｐ（配列番号１０２）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１１０～１２６、２８０、２８５））。

【図25B-4】例示的配列。ヒト抗ＲＳＶ－ｅｍＡｂ ＡＡＶ（２５３１ｂｐ（配列番号１０２）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１１０～１２６、２８０、２８５））。

【図25B-5】例示的配列。ヒト抗ＲＳＶ－ｅｍＡｂ ＡＡＶ（２５３１ｂｐ（配列番号１０２）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１１０～１２６、２８０、２８５））。

【図25B-6】例示的配列。ヒト抗ＲＳＶ－ｅｍＡｂ ＡＡＶ（２５３１ｂｐ（配列番号１０２）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１１０～１２６、２８０、２８５））。

【図25B-7】例示的配列。ヒト抗ＲＳＶ－ｅｍＡｂ ＡＡＶ（２５３１ｂｐ（配列番号１０２）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１１０～１２６、２８０、２８５））。

【図25B-8】例示的配列。ヒト抗ＲＳＶ－ｅｍＡｂ ＡＡＶ（２５３１ｂｐ（配列番号１０２）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１１０～１２６、２８０、２８５））。

【図25B-9】例示的配列。ヒト抗ＲＳＶ－ｅｍＡｂ ＡＡＶ（２５３１ｂｐ（配列番号１０２）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１１０～１２６、２８０、２８５））。

【図25B-10】例示的配列。ヒト抗ＲＳＶ－ｅｍＡｂ ＡＡＶ（２５３１ｂｐ（配列番号１０２）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１１０～１２６、２８０、２８５））。

【図25C-1】例示的配列。マウス抗ＲＳＶ－ｅｍＡｂ ＡＡＶ（３１３４ｂｐ（配列番号１０３）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１２７～１４１、２８１、２８６））。

【図25C-2】例示的配列。マウス抗ＲＳＶ－ｅｍＡｂ ＡＡＶ（３１３４ｂｐ（配列番号１０３）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１２７～１４１、２８１、２８６））。

【図25C-3】例示的配列。マウス抗ＲＳＶ－ｅｍＡｂ ＡＡＶ（３１３４ｂｐ（配列番号１０３）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１２７～１４１、２８１、２８６））。

【図25C-4】例示的配列。マウス抗ＲＳＶ－ｅｍＡｂ ＡＡＶ（３１３４ｂｐ（配列番号１０３）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１２７～１４１、２８１、２８６））。

【図25C-5】例示的配列。マウス抗ＲＳＶ－ｅｍＡｂ ＡＡＶ（３１３４ｂｐ（配列番号１０３）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１２７～１４１、２８１、２８６））。

【図25C-6】例示的配列。マウス抗ＲＳＶ－ｅｍＡｂ ＡＡＶ（３１３４ｂｐ（配列番号１０３）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１２７～１４１、２８１、２８６））。

【図25C-7】例示的配列。マウス抗ＲＳＶ－ｅｍＡｂ ＡＡＶ（３１３４ｂｐ（配列番号１０３）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１２７～１４１、２８１、２８６））。

【図25C-8】例示的配列。マウス抗ＲＳＶ－ｅｍＡｂ ＡＡＶ（３１３４ｂｐ（配列番号１０３）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１２７～１４１、２８１、２８６））。

【図25C-9】例示的配列。マウス抗ＲＳＶ－ｅｍＡｂ ＡＡＶ（３１３４ｂｐ（配列番号１０３）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１２７～１４１、２８１、２８６））。

【図25C-10】例示的配列。マウス抗ＲＳＶ－ｅｍＡｂ ＡＡＶ（３１３４ｂｐ（配列番号１０３）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１２７～１４１、２８１、２８６））。

【図25C-11】例示的配列。マウス抗ＲＳＶ－ｅｍＡｂ ＡＡＶ（３１３４ｂｐ（配列番号１０３）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１２７～１４１、２８１、２８６））。

【図25D-1】例示的配列。マウスｅｍＡｂ－ＲＳＶ－ｄｓＤＮＡ（１７３６ｂｐ（配列番号１０４）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１４２～１４４））。

【図25D-2】例示的配列。マウスｅｍＡｂ－ＲＳＶ－ｄｓＤＮＡ（１７３６ｂｐ（配列番号１０４）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１４２～１４４））。

【図25D-3】例示的配列。マウスｅｍＡｂ－ＲＳＶ－ｄｓＤＮＡ（１７３６ｂｐ（配列番号１０４）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１４２～１４４））。

【図25D-4】例示的配列。マウスｅｍＡｂ－ＲＳＶ－ｄｓＤＮＡ（１７３６ｂｐ（配列番号１０４）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１４２～１４４））。

【図25D-5】例示的配列。マウスｅｍＡｂ－ＲＳＶ－ｄｓＤＮＡ（１７３６ｂｐ（配列番号１０４）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１４２～１４４））。

【図25D-6】例示的配列。マウスｅｍＡｂ－ＲＳＶ－ｄｓＤＮＡ（１７３６ｂｐ（配列番号１０４）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１４２～１４４））。

【図25E-1】例示的配列。ヒトｅｍＡｂ－ＶＲＣ０１－ＡＡＶ（２５５１ｂｐ（配列番号１０５）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１４５～１５２、２８２、２８７））。

【図25E-2】例示的配列。ヒトｅｍＡｂ－ＶＲＣ０１－ＡＡＶ（２５５１ｂｐ（配列番号１０５）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１４５～１５２、２８２、２８７））。

【図25E-3】例示的配列。ヒトｅｍＡｂ－ＶＲＣ０１－ＡＡＶ（２５５１ｂｐ（配列番号１０５）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１４５～１５２、２８２、２８７））。

【図25E-4】例示的配列。ヒトｅｍＡｂ－ＶＲＣ０１－ＡＡＶ（２５５１ｂｐ（配列番号１０５）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１４５～１５２、２８２、２８７））。

【図25E-5】例示的配列。ヒトｅｍＡｂ－ＶＲＣ０１－ＡＡＶ（２５５１ｂｐ（配列番号１０５）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１４５～１５２、２８２、２８７））。

【図25E-6】例示的配列。ヒトｅｍＡｂ－ＶＲＣ０１－ＡＡＶ（２５５１ｂｐ（配列番号１０５）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１４５～１５２、２８２、２８７））。

【図25E-7】例示的配列。ヒトｅｍＡｂ－ＶＲＣ０１－ＡＡＶ（２５５１ｂｐ（配列番号１０５）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１４５～１５２、２８２、２８７））。

【図25E-8】例示的配列。ヒトｅｍＡｂ－ＶＲＣ０１－ＡＡＶ（２５５１ｂｐ（配列番号１０５）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１４５～１５２、２８２、２８７））。

【図25E-9】例示的配列。ヒトｅｍＡｂ－ＶＲＣ０１－ＡＡＶ（２５５１ｂｐ（配列番号１０５）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１４５～１５２、２８２、２８７））。

【図25F-1】例示的配列。ヒトｅｍＡｂ－Ｍｅｄｉ８８５２－ＡＡＶ（２５４４ｂｐ（配列番号１０６）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１５３～１６０、２８３、２８８））。

【図25F-2】例示的配列。ヒトｅｍＡｂ－Ｍｅｄｉ８８５２－ＡＡＶ（２５４４ｂｐ（配列番号１０６）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１５３～１６０、２８３、２８８））。

【図25F-3】例示的配列。ヒトｅｍＡｂ－Ｍｅｄｉ８８５２－ＡＡＶ（２５４４ｂｐ（配列番号１０６）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１５３～１６０、２８３、２８８））。

【図25F-4】例示的配列。ヒトｅｍＡｂ－Ｍｅｄｉ８８５２－ＡＡＶ（２５４４ｂｐ（配列番号１０６）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１５３～１６０、２８３、２８８））。

【図25F-5】例示的配列。ヒトｅｍＡｂ－Ｍｅｄｉ８８５２－ＡＡＶ（２５４４ｂｐ（配列番号１０６）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１５３～１６０、２８３、２８８））。

【図25F-6】例示的配列。ヒトｅｍＡｂ－Ｍｅｄｉ８８５２－ＡＡＶ（２５４４ｂｐ（配列番号１０６）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１５３～１６０、２８３、２８８））。

【図25F-7】例示的配列。ヒトｅｍＡｂ－Ｍｅｄｉ８８５２－ＡＡＶ（２５４４ｂｐ（配列番号１０６）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１５３～１６０、２８３、２８８））。

【図25F-8】例示的配列。ヒトｅｍＡｂ－Ｍｅｄｉ８８５２－ＡＡＶ（２５４４ｂｐ（配列番号１０６）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１５３～１６０、２８３、２８８））。

【図25F-9】例示的配列。ヒトｅｍＡｂ－Ｍｅｄｉ８８５２－ＡＡＶ（２５４４ｂｐ（配列番号１０６）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１５３～１６０、２８３、２８８））。

【図25G-1】例示的配列。ヒトｅｍＡｂ－ＡＭＭ０１－ＡＡＶ（２５５５ｂｐ（配列番号１０７）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１６１～１６９、２８４、２８９））。

【図25G-2】例示的配列。ヒトｅｍＡｂ－ＡＭＭ０１－ＡＡＶ（２５５５ｂｐ（配列番号１０７）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１６１～１６９、２８４、２８９））。

【図25G-3】例示的配列。ヒトｅｍＡｂ－ＡＭＭ０１－ＡＡＶ（２５５５ｂｐ（配列番号１０７）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１６１～１６９、２８４、２８９））。

【図25G-4】例示的配列。ヒトｅｍＡｂ－ＡＭＭ０１－ＡＡＶ（２５５５ｂｐ（配列番号１０７）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１６１～１６９、２８４、２８９））。

【図25G-5】例示的配列。ヒトｅｍＡｂ－ＡＭＭ０１－ＡＡＶ（２５５５ｂｐ（配列番号１０７）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１６１～１６９、２８４、２８９））。

【図25G-6】例示的配列。ヒトｅｍＡｂ－ＡＭＭ０１－ＡＡＶ（２５５５ｂｐ（配列番号１０７）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１６１～１６９、２８４、２８９））。

【図25G-7】例示的配列。ヒトｅｍＡｂ－ＡＭＭ０１－ＡＡＶ（２５５５ｂｐ（配列番号１０７）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１６１～１６９、２８４、２８９））。

【図25G-8】例示的配列。ヒトｅｍＡｂ－ＡＭＭ０１－ＡＡＶ（２５５５ｂｐ（配列番号１０７）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１６１～１６９、２８４、２８９））。

【図25G-9】例示的配列。ヒトｅｍＡｂ－ＡＭＭ０１－ＡＡＶ（２５５５ｂｐ（配列番号１０７）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１６１～１６９、２８４、２８９））。

【図25H-1】例示的配列。Ｂａｌｂ／Ｃ ｍＲＳＶ－スプライス組み込み配列（２２６１ｂｐ（配列番号１０８）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１７０～１７２））。

【図25H-2】例示的配列。Ｂａｌｂ／Ｃ ｍＲＳＶ－スプライス組み込み配列（２２６１ｂｐ（配列番号１０８）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１７０～１７２））。

【図25H-3】例示的配列。Ｂａｌｂ／Ｃ ｍＲＳＶ－スプライス組み込み配列（２２６１ｂｐ（配列番号１０８）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１７０～１７２））。

【図25H-4】例示的配列。Ｂａｌｂ／Ｃ ｍＲＳＶ－スプライス組み込み配列（２２６１ｂｐ（配列番号１０８）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１７０～１７２））。

【図25H-5】例示的配列。Ｂａｌｂ／Ｃ ｍＲＳＶ－スプライス組み込み配列（２２６１ｂｐ（配列番号１０８）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１７０～１７２））。

【図25H-6】例示的配列。Ｂａｌｂ／Ｃ ｍＲＳＶ－スプライス組み込み配列（２２６１ｂｐ（配列番号１０８）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１７０～１７２））。

【図25H-7】例示的配列。Ｂａｌｂ／Ｃ ｍＲＳＶ－スプライス組み込み配列（２２６１ｂｐ（配列番号１０８）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１７０～１７２））。

【図25I-1】例示的配列。ＴＴ－ｈＲＳＶ－Ｔ７－組み込み配列（１７０７ｂｐ（配列番号１０９）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１７３～１７５））。

【図25I-2】例示的配列。ＴＴ－ｈＲＳＶ－Ｔ７－組み込み配列（１７０７ｂｐ（配列番号１０９）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１７３～１７５））。

【図25I-3】例示的配列。ＴＴ－ｈＲＳＶ－Ｔ７－組み込み配列（１７０７ｂｐ（配列番号１０９）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１７３～１７５））。

【図25I-4】例示的配列。ＴＴ－ｈＲＳＶ－Ｔ７－組み込み配列（１７０７ｂｐ（配列番号１０９）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１７３～１７５））。

【図25I-5】例示的配列。ＴＴ－ｈＲＳＶ－Ｔ７－組み込み配列（１７０７ｂｐ（配列番号１０９）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１７３～１７５））。

【図25I-6】例示的配列。ＴＴ－ｈＲＳＶ－Ｔ７－組み込み配列（１７０７ｂｐ（配列番号１０９）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１７３～１７５））。

【図25I-7】例示的配列。ＴＴ－ｈＲＳＶ－Ｔ７－組み込み配列（１７０７ｂｐ（配列番号１０９）並びに関連ヌクレオチド及びタンパク質配列（配列番号１７３～１７５））。

【図26A】新しい抗体カセットの挿入のためのＥμエンハンサーの上流の標的領域；この領域を標的にすることによって、挿入されたｅｍＡｂ遺伝子は天然の（しかし挿入された）ＩｇＨプロモーターにより駆動することが可能であり、免疫グロブリン発現の天然の制御を最大にする。単一ヒット挿入を可能にし、オフターゲット相互作用を最小限にするため、ｅｍＡｂ構築物は単一鎖融合物として発現された。この融合物は、５７アミノ酸グリシン－セリンリンカーで重鎖の可変領域に連結された完全軽鎖配列からなる。軽鎖と重鎖を物理的に連結すれば、挿入されたｅｍＡｂと内因性軽鎖の間での誤対合の可能性が小限に抑えられる。最適化されたスプライスジャンクションは、ｅｍＡｂが下流内因性ＩｇＨ定常領域にスプライスすることを可能にする。これにより、ｅｍＡｂは重鎖アイソタイプクラスのいずれかとして発現されることが可能になる。

【図26B】バーキットリンパ腫由来Ｂ細胞株は、ラムダ軽鎖と対合した表面及び分泌型のＩｇＭを天然に発現する。パリビズマブ由来の操作されたαＲＳＶ－ｅｍＡｂの発現は、モノマーＲＳＶ－Ｆタンパク質及びリンカー中のＳｔｒｅｐｔａｇＩＩモチーフに対して高親和性を有する改変されたストレプトアビジンであるｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎを使用して検出した。αＲＳＶ－ｅｍＡｂ改変ＲＡＭＯＳ細胞は操作されたＲＳＶ特異的抗体を発現し、この抗体は細胞の表面で検出できた。

【図26C】操作されたＲＳＶ特異的抗体は、上澄み中分泌型でも検出された。

【図26D】αＲＳＶ－ｅｍＡｂ改変細胞は、タンパク質抗原に応答して急速で持続するカルシウムシグナル伝達を示したが、対照細胞はそうではなかった。

【図27A】ヒトＢ細胞は、対合されたｃａｓ９－ｓｇＲＮＡ及びＡＡＶ鋳型送達により効率的に遺伝子改変されて一本鎖ｅｍＡｂを発現する。ヒト細胞操作工程の概略図。０日目：Ｂ細胞はＰＢＭＣから単離され、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ２、ＩＬ１０、ＩＬ１５及びＣｐＧオリゴヌクレオチドによりプライミングされる。２日目：細胞はｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ ＲＮＰで電気穿孔され、電気穿孔の１時間後ｅｍＡｂ ＨＲ鋳型をコードするＡＡＶで処理され、続いて０日目に記載された通りに培養される。４日目：細胞は抗原結合又はタグ発現により選択される。４～１５日目Ｌ：選択された細胞は、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ２及びＩＬ２１を発現し、ＩＬ１５を補充された照射フィーダー細胞上で拡大される。１５～１８日目：細胞はＩＬ６、ＩＬ１５及びＩＦＮγを含む無フィーダー分化培養に移行した。

【図27B】ヒトＢ細胞は、対合されたｃａｓ９－ｓｇＲＮＡ及びＡＡＶ鋳型送達により効率的に遺伝子改変されて一本鎖ｅｍＡｂを発現する。ｅｍＡｂターゲティングＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ ＲＮＰで処理された６人の独立したＰＢＭＣドナー由来のＢ細胞におけるインデル頻度。

【図27C】ヒトＢ細胞は、対合されたｃａｓ９－ｓｇＲＮＡ及びＡＡＶ鋳型送達により効率的に遺伝子改変されて一本鎖ｅｍＡｂを発現する。ターゲティングｓｇＲＮＡ部位により報告されている頻度のすべてのヒトＳＮＰ。

【図27D】ヒトＢ細胞は、対合されたｃａｓ９－ｓｇＲＮＡ及びＡＡＶ鋳型送達により効率的に遺伝子改変されて一本鎖ｅｍＡｂを発現する。培養の４日目の対照培養された又はＲＳＶ－ｅｍＡｂ遺伝子改変されたヒトＢ細胞へのＲＳＶ－Ｆプレ融合モノマーの結合についての代表的ＦＡＣＳ。

【図27E】ヒトＢ細胞は、対合されたｃａｓ９－ｓｇＲＮＡ及びＡＡＶ鋳型送達により効率的に遺伝子改変されて一本鎖ｅｍＡｂを発現する。６人の独立したドナー由来のＢ細胞の操作後ＲＳＶ－ｅｍＡｂ Ｂ細胞の頻度。

【図27F】ヒトＢ細胞は、対合されたｃａｓ９－ｓｇＲＮＡ及びＡＡＶ鋳型送達により効率的に遺伝子改変されて一本鎖ｅｍＡｂを発現する。プライミングされた細胞（２日目）及びインビトロで分化した細胞（１８日目）におけるプラズマ細胞マーカー（ＣＤ１９、ＣＤ２７、ＣＤ３８及びＣＤ１３８）についてのＦＡＣＳ。

【図27G】ヒトＢ細胞は、対合されたｃａｓ９－ｓｇＲＮＡ及びＡＡＶ鋳型送達により効率的に遺伝子改変されて一本鎖ｅｍＡｂを発現する。培養１８日目の対照Ｂ細胞又はインフルエンザ標的ＭＥＤＩ８８５２－ｅｍＡｂ Ｂ細胞の培養培地中の分泌された抗ＨＡ－幹抗体についてのＥＬＩＳＡ。

【図28】一本鎖ｅｍＡｂは抗ウイルス抗体の発現のための柔軟なプラットフォームである。ヒトＢ細胞はモック電気穿孔される（対照Ｂ、上列）又は指示された広域中和抗体構築物及びヒトカッパ（パリビズマブ、ＶＲＣ０１及びＭＥＤＩ８８５２）又はラムダ（ＡＭＭ０１）軽鎖の可変領域由来のｅｍＡｂ構築物で遺伝子改変された（下列）。対照及びｅｍＡｂ操作された細胞は指示された病原体：ＲＳＶ－Ｆモノマー、又はＨＩＶ－ＥＮＶ、ＥＢＶ ＧＨ／ＧＬ若しくはＨＡ－幹のテトラマー由来の適合抗原で染色された。

【図29A】生産的ＩｇＨ対立遺伝子上のｅｍＡｂ挿入は内因性ＩｇＨ産生を遮断することが可能である。ＲＡＭＯＳ ＩｇＨ対立遺伝子の図：１つの生産的対立遺伝子はｅｍＡｂ標的部位を含有し、１つの対立遺伝子はｃ－ｍｙｃ転座がｅｍＡｂ標的部位を除去している。

【図29B】生産的ＩｇＨ対立遺伝子上のｅｍＡｂ挿入は内因性ＩｇＨ産生を遮断することが可能である。インプットＲＡＭＯＳ細胞（ＣＤ７９ｂ＋にゲートをかけた）及びαＲＳＶ－ｅｍＡｂ操作ＲＡＭＯＳ細胞（ＣＤ７９ｂ＋／ＲＳＶ－Ｆ＋にゲートをかけた）において結合するラムダ軽鎖及びＲＳＶ－Ｆ抗原の表面発現を示すフローサイトメトリー。

【図29C】生産的ＩｇＨ対立遺伝子上のｅｍＡｂ挿入は内因性ＩｇＨ産生を遮断することが可能である。初代ＩｇＨ対立遺伝子の図：１つの生産的対立遺伝子及び機能的な組み合わされたＶＤＪがない１つの非生産的対立遺伝子で、その両方ともｅｍＡｂ標的部位を含有する。

【図29D】生産的ＩｇＨ対立遺伝子上のｅｍＡｂ挿入は内因性ＩｇＨ産生を遮断することが可能である。インプット分別されたλ軽鎖＋Ｂ細胞（ＣＤ７９ｂ＋にゲートをかけた）及びαＲＳＶ－ｅｍＡｂ操作Ｂ細胞（ＣＤ７９ｂ＋／ＲＳＶ－Ｆ＋にゲートをかけた）上で結合するλ軽鎖及びＲＳＶ－Ｆ抗原の表面発現を示すフローサイトメトリー。

【図30A】αＲＳＶ－ｅｍＡｂカセットを用いた初代マウスＢ細胞の操作。マウスＢ細胞操作工程の概略図。０日目：Ｂ細胞はネガティブ選択を介して脾臓及び末梢リンパ節（ＰＬＮ）から単離され、ＣＤ４０Ｌ－ＨＡ、抗ＨＡ ｍＡｂ及びＩＬ４でプライミングされる。１日目：細胞はｄｓＤＮＡと一緒にｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ ＲＮＰ（ｄｓＤＮＡ条件）又はｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ ＲＮＰ単独で電気穿孔され、続いて電気穿孔の１時間後ｅｍＡｂ ＨＲ鋳型を含有するＡＡＶで処理する（ＡＡＶ条件）。次に、細胞は０日目について記載される通りに培養で維持された。３日目：細胞は抗原結合又はタグ発現により選択される。４～８日目Ｌ：選択された細胞は、ＣＤ４０Ｌを発現し、ＩＬ－２１を補充された照射フィーダー細胞上で拡大される。

【図30B】αＲＳＶ－ｅｍＡｂカセットを用いた初代マウスＢ細胞の操作。ＩｇＨターゲティングｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ ＲＮＰで処理されたＢ細胞中でのインデルパーセント。

【図30C】αＲＳＶ－ｅｍＡｂカセットを用いた初代マウスＢ細胞の操作。対照Ｂ細胞又はｄｓＤＮＡ若しくはＡＡＶ鋳型を使用して操作されたｅｍＡｂ Ｂ細胞におけるモノマープレ融合ＲＳＶ－Ｆタンパク質への結合についての代表的ＦＡＣＳ。

【図30D】αＲＳＶ－ｅｍＡｂカセットを用いた初代マウスＢ細胞の操作。ｄｓＤＮＡ又はＡＡＶ鋳型を用いて操作されたＢ細胞でのｅｍＡｂ細胞の頻度。

【図30E】αＲＳＶ－ｅｍＡｂカセットを用いた初代マウスＢ細胞の操作。対照Ｂ細胞又はｄｓＤＮＡ若しくはＡＡＶ鋳型を使用して操作されたＢ細胞の上澄み中の抗ＲＳＶ特異的分泌抗体。

【図31A】操作されたαＲＳＶ－ｅｍＡｂ Ｂ細胞によるウイルス感染からの防御。移入されたｅｍＡｂ細胞による抗ウイルス防御の概略図。０日目：１．５×１０^７濃縮ＲＳＶ－ｅｍＡｂ Ｂ細胞は、Ｉ．Ｐ．注射により移入される。５日目：１５ｍｇ／ｋｇでのパリビズマブＩ．Ｐ．注射。６日目：抗ウイルスＡｂ力価を測定するための採血。７日目：１０^６ｐｆｕ ＲＳＶウイルスでの鼻腔内負荷。１２日目：肺中でのウイルス力価の測定。

【図31B】操作されたαＲＳＶ－ｅｍＡｂ Ｂ細胞によるウイルス感染からの防御。ＲＳＶ－Ｆモノマー及びストレプトアクチンタグ結合を用いて測定されたＲＳＣ－ｅｍＡｂ細胞の移入前又は２４時間後のＲＳＶ－ｅｍＡｂ受容体の表面発現。

【図31C】操作されたαＲＳＶ－ｅｍＡｂ Ｂ細胞によるウイルス感染からの防御。６日目のマウスにおけるαＲＳＶ－ｅｍＡｂ抗体のプラズマ力価。

【図31D】操作されたαＲＳＶ－ｅｍＡｂ Ｂ細胞によるウイルス感染からの防御。細胞が移入されていない、αＲＳＶ－ｅｍＡｂ Ｂ細胞を有する、対照Ｂ細胞を有する又は１５ｍｇ／ｋｇのパリビズマブが感染の４８時間前にＩ．Ｐ．送達されたマウスの肺におけるＲＳＶのウイルス力価。

【図32A】ＮＳＧマウスへのヒト抗体分泌細胞の複数の移入。ＮＳＧマウス中へのヒトｅｍＡｂ Ｂ細胞の移入の模式図。０日目：図２７に記載される通りに産生された５×１０^６抗Ｆｌｕ ｅｍＡｂ Ｂ細胞及び５×１０^６抗ＲＳＶ ｅｍＡｂ Ｂ細胞をＩ．Ｐ．注射を介して移入した。７日目：血清における抗体産生についての採血。

【図32B】ＮＳＧマウスへのヒト抗体分泌細胞の複数の移入。ｅｍＡｂ細胞（二重移入）対対照血清（移入なし）を受けたマウスにおける抗ＲＳＶ－Ｆ及び抗ＨＡ－幹抗体の血清力価についてのＥＬＩＳＡ。

【図33A】マウスＩｇＨ遺伝子座へのｅｍＡｂカセットの長い挿入用の鋳型。ゲノムごとに上列に示されているのは、最終Ｊ領域、Ｅμイントロンエンハンサーエレメント及びμ定常ドメインの開始部を含む生殖系列ＩｇＨ遺伝子座におけるエレメントの位置である。ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ標的部位の位置が示されている（切断部位）。下には、マウスＡＡＶ及びｄｓＤＮＡ構築物に含まれる相同性アームを標的にするターゲティングアームの位置が示されている。ゲノムに挿入されるｅｍＡｂカセットも示されている。

【図33B】ヒトＩｇＨ遺伝子座へのｅｍＡｂカセットの長い挿入用の鋳型。ゲノムごとに上列に示されているのは、最終Ｊ領域、Ｅμイントロンエンハンサーエレメント及びμ定常ドメインの開始部を含む生殖系列ＩｇＨ遺伝子座におけるエレメントの位置である。ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ標的部位の位置が示されている（切断部位）。下には、ヒトＡＡＶ構築物に含まれる相同性アームを標的にするターゲティングアームの位置が示されている。ゲノムに挿入されるｅｍＡｂカセットも示されている。

【発明を実施するための形態】

【0018】

詳細な説明
ワクチンは、Ｂ細胞を刺激して標的感染病原体に対する抗体を産生させることにより特定の感染症に対して対象の免疫を増加するように設計される。抗体は、病原体に対する防御を提供できるタンパク質である。抗体は病原体に結合でき、この結合が病原体の正常な機能を妨害する場合、抗体は防御性である。例えば、多くの防御抗体は、病原体のうちその病原体が細胞に進入するのを妨げる部分に結合する。抗体はＢ細胞の表面（Ｂ細胞受容体として知られる）に結合していることができるが、血液中に分泌される場合にその防御機能の大部分を発揮する。

【0019】

病原体とは、疾患を引き起こすことができる任意の物質を指すことが可能であり、病原性とは疾患を引き起こす物質の能力を指すことが可能である。病原体の例は、宿主に感染して疾患を引き起こすことができるウイルス、細菌及び真菌を含む。病原体の他の例は、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、数多くの自己免疫状態（例えば、関節炎）に関連する炎症性分子及びアルツハイマー病の間脳に蓄積する線維性タンパク質であるベータアミロイドプラークなどの、疾患を引き起こす宿主由来タンパク質又は他の宿主由来物質を含む。特定の実施形態では、がん細胞及び／又は腫瘍は、疾患を引き起こすその能力に基づいて病原体又は病原性物質とも呼ぶことができる。

【0020】

ワクチン又は天然の病原体に曝露されると、ワクチンに提供される及び／又は病原体上に存在するエピトープは、ナイーブＢ細胞上に存在するＢ細胞受容体に結合することができる。この結合により、Ｂ細胞は活性化され防御抗体を産生することが可能になる。

【0021】

ナイーブＢ細胞は、そのエピトープに接触し終える前のＢ細胞を指す。それぞれのナイーブＢ細胞が、独特のエピトープ特異性を有する独特の抗体を発現する。それぞれのナイーブＢ細胞により発現される独特の抗体は、遺伝子組換えを通じて無作為に生成される。ナイーブＢ細胞は、膜結合抗体（すなわち、Ｂ細胞受容体）を発現し、エピトープ結合すると、急速に増殖することができる。増殖及び成熟中、抗体遺伝子は体細胞突然変異を受け、これがエピトープ結合の親和性を増やすのに役立つ。Ｂ細胞成熟中に生じるエピトープ結合の親和性の増加は、病原体に対する有効な防御に必要である。単一のナイーブＢ細胞は、何十回も細胞分裂を受けて、同じ抗体を発現する何千もの抗体分泌Ｂ細胞及び記憶Ｂ細胞（図１）、又は病原体への結合を改善するよう突然変異されている関連抗体を創造することができる。

【0022】

活動性の抗体分泌Ｂ細胞に加えて、記憶Ｂ細胞は病原体に対する防御に重要である。記憶Ｂ細胞は通常、抗体を積極的に分泌しないが、急速に抗体分泌細胞に分化することが可能である。記憶Ｂ細胞の抗体分泌細胞への急速な分化は、二次感染又は以前ワクチン接種を通じて遭遇したことのある病原体に対して免疫系が迅速な応答を開始するのを助けることができる（ＭｃＨｅｙｚｅｒ－Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１年；１２（１）：２４～３４頁；Ｔａｙｌｏｒら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２年；３３（１２）：５９０～７頁）。例えば、記憶Ｂ細胞は、抗体分泌Ｂ細胞により産生される抗体のレベルが減少した場合、Ｂ型肝炎ウイルスに対する防御を維持する（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ．２００１年；１９（２８～２９）：４０８１～５頁；Ｂａｕｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ．２００６年；２４（５）：５７２～７頁）。したがって、成功したワクチンは、抗体分泌Ｂ細胞及び長命の記憶Ｂ細胞の生成を刺激し、すべてが病原体上のエピトープに高親和性で結合する抗体を発現することができる。

【0023】

不運なことに、利用可能なワクチンがない感染病原体が数多く存在する。利用可能である有効なワクチン戦略のない感染病原体の例は、ＲＳＶ、ＨＩＶ及びジカウイルスを含む。

【0024】

ＲＳＶに関しては、１９６０年代のホルマリン不活化ＲＳＶワクチンの惨憺たる失敗はおそらくＲＳＶを標的にする抗体分泌Ｂ細胞及び記憶Ｂ細胞を誘導できなかったためではなかった。ワクチンはＲＳＶを中和しない抗体の産生を誘導したが、代わりにＲＳＶ感染を増強した可能性がある（図２Ａ）（Ｂｌａｎｃｏら、Ｈｕｍ Ｖａｃｃｉｎ．２０１０年；６（６）：４８２～９２頁；Ｂｒｏａｄｂｅｎｔら、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｏｔｈｅｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ．２０１５年；９（４）：１６９～７８頁）。このことは、ワクチンが達成しなければならない微妙なバランス：正しくないエピトープを標的にする「病原性」抗体の産生を刺激することを回避しつつ、ある特定のエピトープを標的にする「防御」抗体の産生を誘導すること、を強調している（図２Ａ）。

【0025】

世界保健機構国際臨床試験レジストリープラットフォームの２０１５年分析では、２００８年以降臨床的に評価された９種の候補ＲＳＶワクチンが確認されたが、そのどれも第２相試験以上に進まなかった（Ｂｒｏａｄｂｅｎｔら、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｏｔｈｅｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ．２０１５年；９（４）：１６９～７８頁）。これらの中で、３種の治験のみが完了され、１種のみが結果を報告している。ＭＥＤＩ－５５９と呼ばれるそのワクチンは、ＲＳＶ感染を低減するように思われるが、呼吸器症状はさらに試験するには高すぎた（Ｍａｌｋｉｎら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３年；８（１０）：ｅ７７１０４）。これらのデータによれば、ＭＥＤＩ－５５９は防御抗体の産生を誘導したが、おそらく病原性抗体の産生も誘導したことが示唆される（図２Ｂ）。

【0026】

他の「改良された」ワクチン接種戦略は、患者に投与される製剤を変えることである。これらの戦略は、ウイルスを不活化し／減弱する代替法及び炎症応答を増やすことを目指すアジュバントへの変更を含む（Ｂｒｏａｄｂｅｎｔら、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｏｔｈｅｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ．２０１５年；９（４）：１６９～７８頁；Ｇａｒｇら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｇｅｎｅｒａｌ ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２０１４年；９５（Ｐｔ ５）：１０４３～５４頁；Ｓｗａｎｓｏｎら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１４年；８８（２０）：１１８０２～１０頁；Ｗｉｄｊａｊａら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１５年；１０（６）：ｅ０１３０８２９；Ｓｔｅｗａｒｔ－Ｊｏｎｅｓら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１５年；１０（６）：ｅ０１２８７７９）。これらのアプローチの一部は、動物モデルにおいて防御抗体の増加をもたらしたが、病原性抗体を誘導する可能性があるため、これらの「改良された」ＲＳＶワクチンはＭＥＤＩ－５５９と同じ運命を辿るおそれがある。

【0027】

免疫応答を防御抗体が標的にするエピトープに集中させようと努力する中で、最近のアプローチは非ＲＳＶスキャフォールド上に単一ＲＳＶエピトープを移植することであった（図２Ｃ）。このアプローチは、他のＲＳＶエピトープに特異的である病原性抗体の可能性を取り除く。なぜならば、スキャフォールドにはそうした抗体が存在しないからである。アカゲザルのＲＳＶエピトープスキャフォールドワクチン接種により、一部の動物によって中和抗体が産生されたが、３～５回の注射後のみであった（Ｃｏｒｒｅｉａら、Ｎａｔｕｒｅ．２０１４年；５０７（７４９１）：２０１～６頁）。

【0028】

ワクチン接種を迂回し防御抗体を直接提供するアプローチも開発されている。ＲＳＶについての唯一の臨床的に承認された予防処置は、高親和性ＲＳＶ特異的防御抗体パリビズマブの注射である（図３Ａ）（Ｔｈｅ ＰＲＥＶＥＮＴ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ．１９９７年；９９（１）：９３～９頁；Ｔｈｅ ＩＭｐａｃｔ－ＲＳＶ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ．１９９８年；１０２（３ Ｐｔ １）：５３１～７頁）。不運なことに、５カ月続くパリビズマブの費用が１０，０００ドルかかるため、重篤なＲＳＶ感染による高いリスクを抱えた子供への使用が制限されてきた（Ｍｅｉｓｓｎｅｒ＆Ｋｉｍｂｅｒｌｉｎ、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ．２０１３年；１３２（５）：９１５～８頁）。最長１年にわたるよう設計された他のＲＳＶ特異的抗体は現在臨床評価中である（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｏｔｈｅｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ．２０１５年；９（４）：１６９～７８頁）。しかし、年１回の抗体再注射は生涯にわたる防御には実行可能ではない。

【0029】

一生続く注射の必要性をなくすため、アデノウイルスベクターを使用して、防御抗体をコードする遺伝子を筋肉細胞に移入する方法が開発されている（図３Ｂ）（Ｓｃｈｎｅｐｐ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ ＨＩＶ ＡＩＤＳ．２０１４年；９（３）：２５０～６頁）。有望なことに、パリビズマブのアデノウイルス媒介発現によりマウスはＲＳＶ感染から部分的に防御された（Ｓｋａｒｉｃｉｃら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００８年；３７８（１）：７９～８５頁）。しかし、このアプローチの限界は、防御レベルの抗体を達成するのに必要な高用量のウイルスを製造する費用が高額であることである（２４）。高用量が必要なのは、筋肉細胞による抗体の発現では、単一Ｂ細胞による１秒あたり分泌される推定１０，０００抗体と比べて低いからである（Ｈｅｌｍｒｅｉｃｈら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９６１年；２３６：４６４～７３頁；Ｈｉｂｉ＆Ｄｏｓｃｈ、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８６年；１６（２）：１３９～４５頁）。Ｂ細胞は、そのタンパク質産生機構を完全に再プログラム化して抗体分泌に集中することによりこの高率の分泌を達成している。製造能力の大変革がなければ、筋肉細胞へのアデノウイルス媒介抗体遺伝子の移入はＲＳＶ予防にとり現実的な選択肢ではない。

【0030】

別のアプローチは、レンチウイルスベクターを使用して防御抗体をコードする遺伝子を造血幹細胞のゲノム中に組み込み、続いてこの細胞を誘導して抗体分泌Ｂ細胞に分化させる（図３Ｃ）。このアプローチの１つの限界は、抗体遺伝子挿入が無作為であり、このために疾患をもたらすオフターゲット遺伝子効果のリスクが持ち込まれることである。このアプローチの２つ目の限界は、造血幹細胞から抗体分泌細胞への分化を誘導するのに長期の２カ月間のインビトロ培養条件が必要なことである（Ｌｕｏら、Ｂｌｏｏｄ．２００９年；１１３（７）：１４２２～３１頁）。最後の限界は、この戦略が、感染するとすぐに増加させることが可能な抗体の供給源を生成しないことである。したがって、抗体分泌細胞が多数存在しない、又は長命でない場合、感染に対する防御は不十分になる。

【0031】

特定の実施形態では、本開示はワクチン接種を回避する及び／又はＢ細胞を遺伝子操作して選択された抗体（例えば、感染病原体に対する抗体（例えば、パリビズマブ；図４Ａ））を発現させることにより繰り返される治療抗体注射の必要性をなくすことを提供する。遺伝子操作するのに特に有用であるＢ細胞のタイプは、既存の抗体分泌Ｂ細胞、記憶Ｂ細胞、ナイーブＢ細胞、Ｂ１ Ｂ細胞及び周辺帯Ｂ細胞を含む。ナイーブＢ細胞は、最大の増殖的及び機能的潜在力があり、胚中心応答に入ってその結合能力を改善することができる。Ｂ１ Ｂ細胞はＢＣＲを発現し、腹膜腔などの異なる場所に移動する。Ｂ１ Ｂ細胞は、ＢＣＲを通じて刺激を受けると急速に抗体分泌細胞に分化し、最適機能のためにＴ細胞のシグナルを必要としない。周辺帯Ｂ細胞は大部分が脾臓の周辺帯に位置しており、ＢＣＲを通じて刺激を受けると急速に抗体分泌細胞に分化する。周辺帯Ｂ細胞も最適機能のためにＴ細胞からのシグナルを必要としない。Ｂ細胞のこれらのサブセットの１種以上を遺伝子操作すると、進行中の又は即座の感染を処置するためのベースラインレベルの抗体及び将来再感染した場合の誘導性抗体の長命の供給源を創造することが可能である。図４Ｂは、本開示の教示を利用して多数の病原体に対する同時防御についての関連する戦略を示しており、図５は、感染の存在下及び非存在下での例示的Ｂ細胞サブタイプによるパリビズマブの仮定される分泌を描いている。

【0032】

本開示は、導入遺伝子を含む遺伝子構築物を、内因性Ｂ細胞ゲノムの構造及び機能を利用するために特に選択された内因性抗体遺伝子座中に挿入することによるＢ細胞の遺伝子操作を提供する。例えば、選択された抗体の少なくとも一部をコードする導入遺伝子を内因性抗体遺伝子座中に挿入すれば、内因性抗体発現調節機構を利用することにより選択された抗体の頑強な産生が可能になる。導入遺伝子は、異種（すなわち、外来性）タンパク質をコードするＤＮＡの部分を指す場合がある。遺伝子構築物は、異種タンパク質の発現を可能にするために細胞中に導入されることを目的とする核酸の人工的に構築されたセグメントを指す場合がある。

【0033】

特定の実施形態では、本開示は、選択された抗体を発現するように改変されているＢ細胞を提供する。抗体は、２つの遺伝子、重鎖遺伝子と軽鎖遺伝子から産生される。一般に、抗体は重鎖の２つの同一のコピー及び軽鎖の２つの同一のコピーを含む（例えば、図６Ｂ参照）。重鎖は２つのより大きなサブユニットであり、それぞれの重鎖はＶＤＪセグメント及び定常領域を含む（図６Ｂにおいて「Ｃ」として示される）。ＶＤＪセグメント（又はＶＤＪ）は、病原体上のエピトープに結合する抗体重鎖の独特の部分をコードするＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントの独特の対合を指す。したがって、Ｖは、病原体上のエピトープに結合する抗体重鎖の独特の部分をコードするＤ及びＪセグメントと無作為に対合する遺伝子セグメントの１つを指す。同様に、Ｄは、病原体上のエピトープに結合する抗体重鎖の独特の部分をコードするＶ及びＪセグメントと無作為に対合する遺伝子セグメントの１つを指す。最後に、Ｊは、病原体上のエピトープに結合する抗体重鎖の独特の部分をコードするＶ及びＤセグメントと無作為に対合する遺伝子セグメントの１つを指す。種々の異なる組合せで一体となって特定の重鎖の特定のＶＤＪセグメントを形成することが可能ないくつかのＶセグメント、Ｄセグメント及びＪセグメントが存在する（例えば、図７参照）。

【0034】

それぞれのＢ細胞は、単一のＶＤＪ組合せを保存された定常Ｃ領域と対合して完全長重鎖を形成する。重鎖Ｃ領域は、Ｆｃ受容体などの他の免疫タンパク質と相互作用して他の免疫細胞を活性化することができる。すべてのナイーブＢ細胞は同じＣ領域セグメントを発現するが、活性化に続いて異なるＣ領域セグメントを発現するように変化することができ、Ｃ領域が異なれば抗体は異なる機能を与えられる。例えば、１つのＣ遺伝子セグメントはεをコードし、εを発現している抗体は「ＩｇＥ」である。ＩｇＥタイプ抗体は体の細胞に結合して、アレルギー反応を媒介することが多い。αＣ領域を発現する抗体はＩｇＡ抗体であり、γＣ領域を発現する抗体はＩｇＧ抗体であり、μＣ領域を発現する抗体はＩｇＭ抗体である。ヒトゲノムは、単一の重鎖遺伝子座を含み、これは第１４染色体上に存在する。

【0035】

再び図６Ｂに言及して、抗体の軽鎖（ＩｇＬ）は可変領域及び定常領域を含む。軽鎖可変領域はＶ及びＪ遺伝子セグメントを含み、軽鎖定常領域は単一の免疫グロブリン定常ドメインを含むことができる。ヒトは２つの異なる軽鎖を発現し：Ｉｇκは第２染色体上の免疫グロブリンカッパ遺伝子座によりコードされ、Ｉｇλは第２２染色体上の免疫グロブリンラムダ遺伝子座によりコードされている。

【0036】

図６は、ＩｇＨ鎖及びＩｇＬ鎖をコードする内因性Ｂ細胞ゲノムの模式図を描いている。図８Ａ及び８Ｂは、本開示に従った外来性遺伝子構築物をどこに挿入すれば選択された抗体の発現を達成できるかの最初の模式図を描いている。図８Ａは、［終止シグナル、選択された抗体のＩｇＬ鎖（ここでは、ＰＶ）、スキッピングエレメント（ここでは、２Ａ）、及び重鎖のＶＤＪセグメント］を含む遺伝子構築物を内因性ＶＤＪセグメントと内因性Ｃ領域コードセグメントの間の内因性ＩｇＨゲノムに挿入することを描いている。このアプローチは、全外来性ＩｇＬ鎖、重鎖の外来性ＶＤＪセグメント、及び重鎖の内因性Ｃ領域の発現をもたらす。内因性Ｃ領域を含む抗体の発現は、例えば、この発現により改変されたＢ細胞は、天然のＢ細胞活性化及び成熟状態に基づいてＣ領域発現を調節することが可能になるので、有用になりうる。例えば、重鎖遺伝子座の定常領域における選択的スプライシングにより、改変されたＢ細胞は膜結合抗体の発現と分泌抗体の発現を切り替えることが可能になる。このアプローチは、内因性ＶＤＪの切り出しを必要とせずに外来性ＶＤＪの発現も可能にする。この特長は、ＶＤＪがＤＮＡの比較的大きなセグメントでありその切り出しが細胞機能にネガティブな影響を及ぼすことがあるので、有益である。

【0037】

図９は、内因性Ｂ細胞ゲノムの構造及び機能、並びに本開示がどのようにしてこの構造及び機能を利用して選択された抗体の発現を達成するかに関してさらに詳細に類似する模式図を描いている。プロモーター領域は、遺伝子セグメントの転写を達成するのに必要である。重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）プロモーターはＢ細胞系列においては選択的に活性であり、転写開始部位の１００塩基対（ｂｐ）内にＴＡＴＡボックス、Ｉｎｒエレメント、及びオクタマーエレメントを含む。Ｖ_Ｈプロモーター活性は、内因性Ｂ細胞ゲノムのＥμエンハンサーエレメント（灰色卵円）及び重鎖α定常遺伝子の近位の重鎖遺伝子座の３’末端に位置するエンハンサーエレメント（灰色円）による近位依存性調節下にある。Ｅμエンハンサーエレメントは、免疫グロブリン重鎖遺伝子座のＪ重鎖セグメントとＣ ｍｕ（μ）セグメントの間の７００ｂｐイントロン内のＤＮＡのイントロン領域（４０～１５００ｂｐ長）である。Ｅμエンハンサーエレメントは、アクチベータータンパク質に結合して重鎖遺伝子の転写を増やす又は活性化することができる。ヒトＥμエンハンサーエレメントの配列は図１１に配列番号８５として提供されている。マウスＥμエンハンサーエレメントの配列は図１３Ａに配列番号８６として提供されている。

【0038】

内因性重鎖可変領域と内因性Ｅμエンハンサーの間にＶ_Ｈプロモーターを含む遺伝子構築物を挿入すると、内因性Ｖ_Ｈプロモーターからの転写活性化を低減する又は遮断しうる。なぜならば、Ｅμエンハンサーはもっとも近位の上流プロモーターで転写を開始するからである。この方法であれば、内因性ＶＤＪの発現は、そのような大きなＤＮＡセグメントの除去（これは、示されるように、細胞機能及び生存にとり問題を含む）を必要とせずに遮断することが可能である。特定の実施形態では、ＶＤＪ組換えは、Ｖ_ＨプロモーターとＥμエンハンサーの間の遺伝物質を取り除き、これによりエンハンサーは本明細書に開示される遺伝子構築物の外来性プロモーターから適切な距離に置かれ、挿入された遺伝子構築物中のプロモーターから開始する転写を活性化する。特定の実施形態では、内因性遺伝物質は除去されない。特定の実施形態では、５０未満の塩基対が除去される。特定の実施形態では、外来性遺伝子構築物内のＶ_Ｈプロモーターは、ＩｇＫ又はＩｇＬについての天然の軽鎖プロモーター、天然のヒトＩｇＨプロモーター、脾フォーカス形成ウイルスプロモーターＳＦＦＶ、Ｊ５５８ｈ１０プロモーター又はＩｇＶＨ１－６９プロモーターを含む。

【0039】

図１０は、遺伝子構築物挿入用の標的領域の追加の模式図を提供する。これらの標的領域は、すべてのＢ細胞に存在する２つの保存された領域：終端Ｊ遺伝子セグメント（ヒトでのＩＧＨＪ６、マウスでのＩＧＨＪ４）から重鎖イントロンエンハンサー（Ｅμ）まで及びＥμからＤＮＡスイッチ組換えに関連する反復配列までを包含する。

【0040】

特定の実施形態では、遺伝子構築物の挿入のために標的にされる内因性Ｂ細胞ゲノムの領域は、配列番号８５又は８６のＥμエンハンサーの上流にある。図１１Ａ～１４Ｂは、本明細書に開示される選択された抗体の発現を達成するために遺伝子構築物挿入用に標的にすることができる特定の配列を提供している。

【0041】

図１１Ａは、ＩＧＨＪ６からＥμイントロンエンハンサーまでのヒトＤＮＡ配列（配列番号１；＞ｈｇ３８＿ｄｎａ レンジ＝ｃｈｒ１４：１０５８６２５２３～１０５８６３２４４ ５’ｐａｄ＝０ ３’ｐａｄ＝０ ストランド＝－ リピートマスキング＝なし）。図１１Ｂは、配列番号５～２４を含むこの配列内の標的（例えば、ｇＲＮＡ部位）までの例示的レンジ及び関連するｇＲＮＡ配列（配列番号８８、８９及び２９０～３０７）を提供している。例として、特定の実施形態では、配列番号８８のｓｇＲＮＡ（図２５Ａも参照）は配列番号７のｇＲＮＡ部位を標的にするのに使用することができる。特定の実施形態では、配列番号８９のｓｇＲＮＡ（図２５Ａも参照）は配列番号１０のｇＲＮＡ部位を標的にするのに使用することができる。

【0042】

図１２Ａは、領域２についてのヒトＤＮＡ配列：Ｅμイントロンエンハンサーからスイッチ領域まで（配列番号２；＞ｈｇ３８＿ｄｎａ レンジ＝ｃｈｒ１４：１０５８６０３８３～１０５８６１６９０ ５’ｐａｄ＝０ ３’ｐａｄ＝０ ストランド＝－）を提供している。図１２Ｂは、配列番号２５～４４を含むこの配列内の標的（例えば、ｇＲＮＡ部位）までの例示的レンジ及び関連するｇＲＮＡ配列（配列番号３０８～３２７）を提供している。

【0043】

図１３Ａは、領域１についてのマウスＤＮＡ配列：ＩＧＨＪ４からＥμイントロンエンハンサーまで（配列番号３；＞ｍｍ１０＿ｄｎａ レンジ＝ｃｈｒ１２：１１３４２７９７３～１１３４２８５５４ ５’ｐａｄ＝０ ３’ｐａｄ＝０ ストランド＝－ リピートマスキング＝なし）を提供している。図１３Ｂは、配列番号４５～６４を含むこの配列内の標的（例えば、ｇＲＮＡ部位）までの例示的レンジ及び関連するｇＲＮＡ配列（配列番号８７、及び３２８～３４６）を提供している。例として、特定の実施形態では、配列番号８７のｓｇＲＮＡ（図２５Ａも参照）は配列番号４６のｇＲＮＡ部位を標的にするのに使用することができる。

【0044】

図１４Ａは、領域２についてのマウスＤＮＡ配列：Ｅμイントロンエンハンサーからスイッチ領域まで（配列番号４；＞ｍｍ１０＿ｄｎａ レンジ＝ｃｈｒ１２：１１３４２５４４６～１１３４２６９７３ ５’ｐａｄ＝０ ３’ｐａｄ＝０ ストランド＝－ リピートマスキング＝なし）を提供している。図１４Ｂは、配列番号６５～８４を含むこの配列内の標的（例えば、ｇＲＮＡ部位）までの例示的レンジ及び関連するｇＲＮＡ配列（配列番号３４７～３６６）を提供している。

【0045】

したがって、特定の実施形態では、本開示は、すべてのＢ細胞において一定である（組換え前及び後に）イントロン領域での（ｉ）プロモーター及び（ｉｉ）選択された抗体の一部をコードする導入遺伝子を含む遺伝子構築物の標的挿入を提供し、（ｉ）プロモーターはプロモーターと相互作用するエンハンサーエレメントに対して位置付けられており、（ｉｉ）導入遺伝子はＢ細胞の内因性重鎖ＶＤＪ配列が発現されないような立体配置である。特定の実施形態では、選択された抗体のコードされた部分は、抗体の全軽鎖及び重鎖のＶＤＪセグメントを含む。選択された抗体のこれらの部分は、任意の時間に改変されたＢ細胞により発現される重鎖定常領域と一緒に発現することができる。遺伝子構築物の特定の実施形態は、シグナルペプチド、柔軟なリンカー、スキッピングエレメント及び／又はスプライスジャンクションも含む又はコードしうる。

【0046】

本開示の１つの技術的難問は、抗体が２つの別々の遺伝子産物、重鎖（ＩｇＨ）と軽鎖（ＩｇＬ）から作られているタンパク質であることである（図６Ａ、６Ｂ）。これは、特定の実施形態では、選択された抗体を正しく発現するためには、両方の遺伝子の位置が同時に改変されなければならないことを意味する。しかし、本開示は、両方の遺伝子位置を改変する必要がなく機能的な選択された抗体を産生する戦略も提供する。これを可能にする１つのアプローチは、単一の構築物を通じた抗体発現を可能にする配列の使用を通じてである。特定の実施形態では、これは、遺伝子構築物内にスキッピングエレメントを含むことにより達成される。スキッピングエレメントの１つの例は、自己切断「２Ａ」などの自己切断ペプチドである。２Ａペプチドは、リボソームに限定された位置でペプチド結合の合成をスキップさせ、１つのｍＲＮＡから２つのタンパク質を産生することにより機能する。２Ａ配列は短く（例えば、２０アミノ酸）、サイズが限定された構築物での使用を促進し、タンパク質は１対１比で産生される。特定の例は、Ｔ２Ａ（ＧＳＧ）ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１７６）；Ｐ２Ａ（ＧＳＧ）ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１７７）；Ｅ２Ａ（ＧＳＧ）ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰＰ（配列番号１７８）；及びＦ２Ａ（ＧＳＧ）ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号１７９）を含む。

【0047】

特定の実施形態では、遺伝子構築物は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列を含む。ＩＲＥＳは遺伝子構築物の重鎖ＶＤＪの上流に配置することができる。ＩＲＥＳは、リボソームにｍＲＮＡ分子上の第２の内部部位で翻訳を開始させ、１つのｍＲＮＡから２つのタンパク質の産生をもたらす非コード構造ＲＮＡ配列である。しかし、ＩＲＥＳ駆動翻訳は２Ａ駆動翻訳ほど効率的ではなく、転写産物中の第２のタンパク質の発現は低くなる。

【0048】

特定の実施形態では、遺伝子構築物は、選択された抗体の軽鎖部分と選択された抗体の重鎖部分の間の柔軟なリンカーをコードする。リンカーは、連結された配列に相互作用して機能的なユニットを形成させるように１つのタンパク質ドメインを別のタンパク質ドメインに柔軟に連結させる一連のアミノ酸でありうる。

【0049】

特定の実施形態では、柔軟なリンカーは、リンカー配列に柔軟性をもたらす１つ以上の一連のグリシンとセリンの組合せを含むことができる。例示的Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーは、（ＧＧＳ）ｎ（配列番号１８０）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１８１）、及び（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１８２）を含み、ｎ＝１～１００及びその間のすべての整数である。特定の実施形態では、ｎ＝１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０である。特定の実施形態では、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーは、５０～８０アミノ酸を含む。特定の実施形態では、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーは、５４、５７、又は６０アミノ酸を含む。特定の実施形態では、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーは、配列番号１１６によりコードされる。特定の実施形態では、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーは、配列番号１２２を含む。

【0050】

柔軟なリンカーの追加の例は、（ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ）ｎ（配列番号１８３）及び（ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ）ｎ（配列番号１８４）を含む。これらのリンカーでは、リンカー中のＧｌｙとＳｅｒ残基は柔軟性をもたらすように設計されており、Ｇｌｕ及びＬｙｓは可溶性を改善するのに追加された。Ｂｉｒｄ、ＲＥら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８８年；２４２：４２３～４２６頁。特定の実施形態では、ｎ＝１～１００及びその間のすべての整数である。特定の実施形態では、ｎ＝１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０である。特定の実施形態では、これらのリンカーは、５０～８０アミノ酸を含む。

【0051】

特定の実施形態は、遺伝子構築物によりコードされているＲＮＡと内因性重鎖定常領域によりコードされているＲＮＡの間のスプライシングを可能にするスプライスジャンクションを含む。特定の実施形態では、遺伝子構築物は３’末端にスプライスジャンクション配列を含む。スプライシングとは、スプライソソームとして知られるＲＮＡ／タンパク質複合体によりイントロンを除去しエキソンを１つに結合させることを指すことができる。スプライスジャンクションは、エキソンに直接隣接しているイントロン配列を指す。エキソンの３’末端のスプライスジャンクションは、スプライスドナー部位を含むことができる。スプライスドナー部位配列は典型的には「ＧＵ」で始まる。特定の実施形態では、スプライスジャンクションは、ＶＤＪの最後のエキソンに続く４０～８０ｂｐのイントロンを含む場合がある。特定の実施形態では、スプライスジャンクションは、ヒトＩＧＨＪ１遺伝子セグメント又はマウスＩＧＨＪ３遺伝子の３’末端に隣接する４０～８０ｂｐのイントロンを含む。特定の実施形態では、スプライスジャンクションは、ＣＡＧ／ｇｔａａｇｔを含み、切断及びスプライスは大文字のＧの後で行われる（「スプライス」注釈により示される）。特定の実施形態では、スプライスジャンクションは、ＣＡＧ／ｇｔｇａｇｔを含む。ＣＡはセリンコドンの末端を形成し、Ｇは定常領域から最初のコドンを始める。特定の実施形態では、隣接配列のあるスプライスジャンクションは、ヒト遺伝子座への挿入のために遺伝子構築物に配列番号１２４又は１５１を含む。特定の実施形態では、隣接配列のあるスプライスジャンクションは、マウス遺伝子座への挿入のために遺伝子構築物に配列番号１３９を含む。

【0052】

本明細書に開示される遺伝子構築物はシグナルペプチドをコードすることもできる。例示的シグナルペプチドは、ＭＥＬＧＬＳＷＩＦＬＬＡＩＬＫＧＶＱＣ（配列番号１８５）；ＭＥＬＧＬＲＷＶＦＬＶＡＩＬＥＧＶＱＣ（配列番号１８６）；ＭＫＨＬＷＦＦＬＬＬＶＡＡＰＲＷＶＬＳ（配列番号１８７）；ＭＤＷＴＷＲＩＬＦＬＶＡＡＡＴＧＡＨＳ（配列番号１８８）；ＭＤＷＴＷＲＦＬＦＶＶＡＡＡＴＧＶＱＳ（配列番号１８９）；ＭＥＦＧＬＳＷＬＦＬＶＡＩＬＫＧＶＱＣ（配列番号１９０）；ＭＥＦＧＬＳＷＶＦＬＶＡＬＦＲＧＶＱＣ（配列番号１９１）；及びＭＤＬＬＨＫＮＭＫＨＬＷＦＦＬＬＬＶＡＡＰＲＷＶＬＳ（配列番号１９２）などのヒトＩｇＨ重鎖由来のシグナルペプチド；並びにＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＳＧＡＲＣ（配列番号１９３）；及びＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡ（配列番号１９４）などのヒトＩｇＬ軽鎖由来のシグナルペプチドを含む。特定の実施形態では、シグナルペプチドは配列番号１１２によりコードされ、ヒト遺伝子座への挿入のために遺伝子構築物に配列番号１１８を含む。特定の実施形態では、シグナルペプチドは配列番号１２９によりコードされ、マウス遺伝子座への挿入のために遺伝子構築物に配列番号１３４を含む。図２５Ｂ～２５Ｉ及びＨａｒｙａｄｉ Ｒら、ｔＰＬｏＳ Ｏｎｅ ｖ．１０（２）；２０１５年 ＰＭＣ４３３８１４４も参照されたい。

【0053】

示されているように、本開示の特定の実施形態は、内因性Ｂ細胞ゲノム内の標的にされた位置での外来性遺伝子構築物の挿入を利用する。特定の実施形態では、そのような標的挿入は、遺伝子構築物の１つ又は両方の末端に相同性領域を含むことにより促進することができる。相同性領域（すなわち、相同性ステッチ又は相同性アーム）は所望の挿入部位での配列に相同である。特定の実施形態では、相同性アームとは、遺伝子構築物に含まれ、改変されているＤＮＡの領域に１００％同一であるＤＮＡのセグメントを指す。特定の実施形態では、１００％同一性は標的挿入を達成するのに必要とされない場合がある（例えば、少なくとも９０％同一性で十分である場合がある）。

【0054】

相同性領域は遺伝子構築物を標的にされた遺伝子領域の隣に整列させ、遺伝子構築物由来のＤＮＡの一部は遺伝子編集技法により切断された領域中に交換される。特定の実施形態では、遺伝子構築物は、２０～１，５００ｂｐのゲノム相同性のある上流ゲノム相同性末端、及び２０～１，５００ｂｐのゲノム相同性のある下流ゲノム相同性末端を含む場合がある。相同性の領域は、例えば、図１５Ａに示される「相同性ステッチ」を提供する場合があり、このステッチは標的にされた挿入部位への遺伝子構築物の挿入を媒介することができる。特定の実施形態では、上流ゲノム相同性末端及び下流ゲノム相同性末端は、重鎖ＶＤＪ領域と重鎖Ｅμエンハンサーエレメントの間のゲノム配列に相同性のある配列を含んでもよい。特定の実施形態では、相同性の領域は、特に、２０～５０塩基対；３００～５００塩基対；３５０～５５０塩基対；９００～１，０００塩基対、又は４００～６００塩基対を含んでもよい。特定の実施形態では、相同性の領域は、特に、３０～４０塩基対（例えば、３６塩基対）；４４５～４５５塩基対（例えば、４５０塩基対）；４９５～５１０塩基対（例えば、５０３塩基対）；及び／又は９６０～９８０塩基対（例えば、９６８塩基対）を含んでもよい。特定の実施形態では、マウス遺伝子構築物において使用するための相同性領域は、配列番号９０、９１、９６、９７、１２７、１４０、１４２、１４３、１７０、及び１７１を含む。特定の実施形態では、ヒト遺伝子構築物において使用するための相同性領域は、配列番号９２～９５、９８～１０１、１１０、１２５、１５３、１７３、及び１７４を含む。

【0055】

特定の実施形態では、遺伝子構築物はタグ配列もコードする。タグ配列は、例えば、遺伝子構築物を発現する細胞が遺伝子改変工程中に同定され及び／若しくは分類されるように、並びに／又は細胞を対象への投与に続いて制御できるように、有用になりうる。例えば、特定の実施形態では、タグ配列は、対象への投与に続いて遺伝子改変された細胞を追跡する及び／又は終了させるように有用になりうる。例示的タグは、ＳＴＲＥＰＴＡＧ（登録商標）（ＧｍｂＨ、ＬＬＣ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、ＤＥ）、ＳＴＲＥＰ（登録商標）タグＩＩ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号１９５））又はこれらの任意の変異体；例えば、米国特許第７，９８１，６３２号参照）、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１９６））、Ｘｐｒｅｓｓタグ（ＤＬＹＤＤＤＤＫ（配列番号１９７））、Ａｖｉタグ（ＧＬＮＤＩＥＡＱＫＩＥＷＨＥ（配列番号１９８））、カルモジュリンタグ（ＫＲＲＷＫＫＮＦＩＡＶＳＡＡＮＲＦＫＫＩＳＳＳＧＡＬ（配列番号１９９））、ポリグルタメートタグ、ＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号２００））、Ｍｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号２０１））、Ｎｕｓタグ、Ｓタグ、ＳＢＰタグ、Ｓｏｆｔａｇ １（ＳＬＡＥＬＬＮＡＧＬＧＧＳ（配列番号２０２））、Ｓｏｆｔａｇ ３（ＴＱＤＰＳＲＶＧ（配列番号２０３））、及びＶ５タグ（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ（配列番号２０４））を含む。

【0056】

特定の実施形態では、本開示は、（ｉ）重鎖プロモーター、及び／又は（ｉｉ）免疫グロブリン軽鎖、及び／又は（ｉｉｉ）重鎖可変領域、及び／又は（ｉｖ）終止コドン、及び／又は（ｖ）スキッピングエレメント及び／又は（ｖｉ）スプライスジャンクション及び／又は（ｖｉｉ）相同性アーム及び／又は（ｖｉｉｉ）リンカー及び／又は（ｉｘ）タグを含む又はコードする選択された抗体発現のための遺伝子構築物を提供する。

【0057】

特定の実施形態は、（ｉ）重鎖プロモーター；（ｉｉ）シグナルペプチド；（ｉｉｉ）選択された抗体の全軽鎖；（ｉｖ）柔軟なリンカー又はスキッピングエレメント；（ｖ）選択された抗体重鎖の可変領域；及び（ｖｉ）スプライスジャンクションを含む又はコードする。

【0058】

特定の実施形態は、（ｉ）重鎖プロモーター；（ｉｉ）シグナルペプチド；（ｉｉｉ）選択された抗体の全軽鎖；（ｉｖ）柔軟なリンカー又はスキッピングエレメント；（ｖ）選択された抗体重鎖の可変領域；（ｖｉ）スプライスジャンクション、及び（ｖｉｉ）相同性アームを含む又はコードする。

【0059】

特定の実施形態は、（ｉ）重鎖プロモーター；（ｉｉ）シグナルペプチド；（ｉｉｉ）選択された抗体の全軽鎖；（ｉｖ）柔軟なリンカー又はスキッピングエレメント；（ｖ）選択された抗体重鎖の可変領域；（ｖｉ）スプライスジャンクション、（ｖｉｉ）相同性アーム；及び（ｖｉｉｉ）タグを含む又はコードする。

【0060】

図１５Ｂは、ＤＮＡ修復鋳型の追加の例を描いている。使用することができるＤＮＡ修復鋳型の例は合成ＤＮＡ鋳型及びアデノ随伴ウイルスも含む。特定の実施形態では、合成ＤＮＡ鋳型は、ゲノム中の標的部位に相同性の２０～１，５００塩基対が隣接するプロモーター及び選択された抗体部分を含む又はコードする二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を含むことができる。特定の実施形態では、合成ＤＮＡ鋳型は、ゲノム中の標的部位に相同性の１０～８０塩基対、又は４００～１０００塩基対が隣接するプロモーター及び選択された抗体部分を含む又はコードする一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を含むことができる。特定の実施形態では、合成ＤＮＡ鋳型は、最終的にリン酸化により修飾されてＤＮＡライゲーション効率を増やす、ｄｓＤＮＡとｓｓＤＮＡの両方を含むことができる。特定の実施形態では、ｄｓＤＮＡとｓｓＤＮＡの両方は最終的にホスホロチオエート結合で修飾されて安定性を増しエンドヌクレアーゼ消化を防ぐことができる。

【0061】

特定の実施形態では、アデノ随伴ウイルスは、ゲノム中の標的部位に相同性の２０～１，５００塩基対が隣接する合成抗体部分をコードするセグメントを含むことができる。特定の実施形態では、プロモーターと合成抗体部分コード配列は、相同性配列をゲノムの標的部位に適合させることにより隣接させることができる。

【0062】

特定の実施形態では、ＤＮＡ修復機構を含む遺伝子構築物（例えば、相同性ステッチ、合成ＤＮＡ鋳型）は、下でさらに詳しく記載されるＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、ｍｅｇａＴＡＬ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼなどの遺伝子編集システム及び／又はアデノ随伴ウイルスを利用して送達しうる。例えば、本明細書に記載されるゲノムターゲティングエレメント、ゲノムカッティングエレメント、及び遺伝子構築物をＢ細胞に投与することができる。

【0063】

本開示の適用の特定の例として、Ｂ細胞を改変してパリビズマブ抗体を発現させてもよい。Ｂ細胞は、２Ａペプチドにより分離されているパリビズマブ由来の完全軽鎖（ＩｇＬＰＶ）及びＶＤＪ重鎖遺伝子セグメント（ＶＤＪＰＶ）の上流で重鎖プロモーターに連接している８０ｂｐの相同性アームを含む遺伝子構築物で改変してもよい。ここでは、２Ａペプチドは、リボソームスキッピング事象を誘導するために含まれ（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｇｅｎｅｒａｌ ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００１年；８２（Ｐｔ ５）：１０１３～２５頁）、この事象により重鎖と軽鎖は、正常に会合して選択された抗体を形成する別々のサブユニットとして産生されることができる。特定の実施形態では、終止コドンは、内因性重鎖可変領域のいかなる潜在的転写も停止するように、挿入された重鎖プロモーターの上流に含まれることが可能である。

【0064】

図１６は、「改変された」Ｂ細胞ゲノムの例を描いており、図１７は、選択された抗体を発現する得られたＢ細胞集団を描いている。

【0065】

以下の段落は、（ｉ）例示的な選択された抗体及び配列；（ｉｉ）遺伝子編集技法及び細胞選別；（ｉｉｉ）改変Ｂ細胞の製剤化；及び（ｉｖ）使用方法に関してさらに詳細な説明を提供する。

【0066】

（ｉ）例示的な選択された抗体及び配列。特定の実施形態では、選択された抗体は、病原体又は状態（例えば、自己免疫疾患）に対する防御効果を提供できる抗体である。特定の実施形態では、選択された抗体は抗ＲＳＶ抗体、抗ＨＩＶ抗体、抗デングウイルス抗体、抗ボルデテラ・ペルツシス（Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）抗体、抗Ｃ型肝炎抗体、抗インフルエンザウイルス抗体、抗パラインフルエンザウイルス抗体、抗メタニューモウイルス（ＭＰＶ）抗体、抗サイトメガロウイルス抗体、抗エプスタイン・バーウイルス抗体、抗単純ヘルペスウイルス抗体、抗クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細菌毒素抗体、又は抗腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）抗体である。

【0067】

特定の実施形態では、選択された抗体はキメラ抗体である。特定の実施形態では、キメラ抗体は、（ｉ）Ｂ細胞の内因性ゲノムによりコードされている少なくとも１つの部分、及び（ｉｉ）挿入された遺伝子構築物によりコードされている少なくとも１つの部分を含む合成抗体を指す。特定の実施形態では、キメラ抗体は、内因性重鎖定常ドメイン、外来性免疫グロブリン可変及び定常軽鎖、並びに外来性可変重鎖を含む。

【0068】

以下の抗体及び配列は、目的の病原体又は抗原に対する標的結合を選択された抗体に与えるのに有用である（明記されなければ、Ｋａｂａｔ番号付けが意図されている）。

【0069】

例示的抗ＲＳＶ抗体はパリビズマブであり、これはＲＳＶ融合タンパク質を標的にし、ＲＳＶ感染症を予防する又は減少するのに使用される。

【0070】

特定の実施形態では、抗ＲＳＶ抗体は、

【0071】

【化1】

を含む可変重鎖配列、及び

【0072】

【化2】

を含む可変軽鎖配列を含むマウスパリビズマブである。

【0073】

追加の例示的抗ＲＳＶ抗体はヒトパリビズマブであり、

【0074】

【化3】

を含む可変軽鎖配列、及び

【0075】

【化4】

を含む可変重鎖配列を含む。

【0076】

可変重鎖及び可変軽鎖内では、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれるセグメントがエピトープ結合を指示する。それぞれの重鎖は３種のＣＤＲ（すなわち、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３）を有し、それぞれの軽鎖は３種のＣＤＲ（すなわち、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３）を有する。

【0077】

追加の例示的抗ＲＳＶ抗体は、米国特許第９，４０３，９００号に記載されている。この抗ＲＳＶ抗体は、ＧＡＳＩＮＳＤＮＹＹＷＴ（配列番号２０７）を含むＣＤＲＨ１配列、ＨＩＳＹＴＧＮＴＹＹＴＰＳＬＫＳ（配列番号２０８）を含むＣＤＲＨ２配列、及びＣＧＡＹＶＬＩＳＮＣＧＷＦＤＳ（配列番号２０９）を含むＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖；並びにＱＡＳＱＤＩＳＴＹＬＮ（配列番号２１０）を含むＣＤＲＬ１配列、ＧＡＳＮＬＥＴ（配列番号２１１）を含むＣＤＲＬ２配列、及びＱＱＹＱＹＬＰＹＴ（配列番号２１２）を含むＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖を含む。

【0078】

例示的抗ＲＳＶ抗体は、ＡＢ１１２８（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥから入手可能）及びａｂ２０７４５（ＡＢＣＡＭから入手可能）も含む。

【0079】

抗ＨＩＶ抗体の例は１０Ｅ８であり、これはｇｐ４１に結合する広域中和抗体である。１０Ｅ８抗ＨＩＶ抗体は、ＧＦＤＦＤＮＡＷ（配列番号２１３）を含むＣＤＲＨ１配列、ＩＴＧＰＧＥＧＷＳＶ（配列番号２１４）を含むＣＤＲＨ２配列、及びＴＧＫＹＹＤＦＷＳＧＹＰＰＧＥＥＹＦＱＤ（配列番号２１５）を含むＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖；並びにＴＧＤＳＬＲＳＨＹＡＳ（配列番号２１６）を含むＣＤＲＬ１配列、ＧＫＮＮＲＰＳ（配列番号２１７）を含むＣＤＲＬ２配列、及びＳＳＲＤＫＳＧＳＲＬＳＶ（配列番号２１８）を含むＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖を含む。

【0080】

抗ＨＩＶ抗体の追加の例はＶＲＣ０１であり、これはｇｐ１２０のＣＤ４結合部位に結合する広域中和抗体である。ＶＲＣ０１抗体は、ＧＹＥＦＩＤＣＴ（配列番号２１９）を含むＣＤＲＨ１配列、ＫＰＲＧＧＡＶＮ（配列番号２２０）を含むＣＤＲＨ２配列、及びＲＧＫＮＣＤＹＮＷＤＦＥＨＷ（配列番号２２１）を含むＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖；並びにＱＹＧＳを含むＣＤＲＬ１配列、ＳＧＳを含むＣＤＲＬ２配列、及びＱＱＹＥＦ（配列番号２２２）を含むＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖を含む。

【0081】

例示的抗ＨＩＶ抗体は、ａｂ１８６３３及び３９／５．４Ａ（ＡＢＣＡＭから入手可能）；並びにＨ８１Ｅ（ＴＨＥＲＭＯＦＩＳＨＥＲから入手可能）も含む。

【0082】

抗デングウイルス抗体の例は米国特許出願公開第２０１７０２３３４６０号に記載される抗体５５であり、ＥＶＱＬＨＱＳＧＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＬＳＣＴＶＳＧＦＮＩＫ（配列番号２２３）を含むＣＤＲＨ１配列、ＷＶＫＱＲＰＥＱＧＬＥＷＩ（配列番号２２４）を含むＣＤＲＨ２配列、及びＡＴＩＫＡＤＴＳＳＮＴＡＹＬＱＬＩＳＬＴＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＦ（配列番号２２５）を含むＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖；並びにＤＩＱＭＴＱＳＰＡＳＬＳＶＳＶＧＥＴＶＴＩＴＣ（配列番号２２６）を含むＣＤＲＬ１配列、ＷＹＱＱＫＱＧＫＳＰＱＬＬＶＹ（配列番号２２７）を含むＣＤＲＬ２配列、及びＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＱＹＳＬＫＩＮＳＬＱＳＥＤＦＧＴＹＹＣ（配列番号２２８）を含むＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖を含む。

【0083】

抗デングウイルス抗体の追加の例は米国特許８，６３７，０３５号に記載されるＤＢ２－３であり、ＹＴＦＴＤＹＡＩＴ（配列番号２２９）を含むＣＤＲＨ１配列、ＧＬＩＳＴＹＹＧＤＳＦＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号２３０）を含むＣＤＲＨ２配列、及びＴＩＲＤＧＫＡＭＤＹ（配列番号２３１）を含むＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖；並びにＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨ（配列番号２３２）を含むＣＤＲＬ１配列、ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号２３３）を含むＣＤＲＬ２配列、及びＳＱＳＴＨＶＰＹＴ（配列番号２３４）を含むＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖を含む。抗デングウイルス抗体の例は、ａｂ１５５０４２及びａｂ８０９１４（両方ともＡＢＣＡＭから入手可能）も含む。

【0084】

抗百日咳抗体の例は米国特許第９，５１２，２０４号に記載されており、

【0085】

【化5】

を含む可変重鎖、及び

【0086】

【化6】

を含む可変軽鎖を含む。

【0087】

抗Ｃ型肝炎抗体の例は、ＳＹＧＭＨＷ（配列番号２３７）を含むＣＤＲＨ１配列、ＶＩＷＬＤＧＳＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲ（配列番号２３８）を含むＣＤＲＨ２配列、及びＡＲＤＩＦＴＶＡＲＧＶＩＩＹＦＤＹ（配列番号２３９）を含むＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖；並びにＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡ（配列番号２４０）を含むＣＤＲＬ１配列、ＤＡＳＮＲＡＴ（配列番号２４１）を含むＣＤＲＬ２配列、及びＱＱＲＳＮＷＶＴ（配列番号２４２）を含むＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖を含む。抗Ｃ型肝炎抗体の例は、ＭＡＢ８６９４（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥから入手可能）及びＣ７－５０（ＡＢＣＡＭから入手可能）も含む。

【0088】

抗インフルエンザウイルス抗体の例は、米国特許第９，４６９，６８５号に記載されており、ＧＭＴＳＮＳＬＡ（配列番号２４３）を含むＣＤＲＨ１配列、ＩＩＰＶＦＥＴＰ（配列番号２４４）を含むＣＤＲＨ２配列、及びＡＴＳＡＧＧＩＶＮＹＹＬＳＦＮＩ（配列番号２４５）を含むＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖；並びにＱＴＩＴＴＷ（配列番号２４６）を含むＣＤＲＬ１配列、ＫＴＳを含むＣＤＲＬ２配列、及びＱＱＹＳＴＹＳＧＴ（配列番号２４７）を含むＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖を含む。抗インフルエンザウイルス抗体の例は、Ｃ１０２（ＴＨＥＲＭＯＦＩＳＨＥＲから入手可能である）も含む。

【0089】

例示的抗ＭＰＶ抗体はＭＰＥ８を含む。

【0090】

例示的抗ＣＭＶ抗体は、ＭＣＭＶ５３２２Ａ、ＭＣＭＶ３０６８Ａ、ＬＪＰ５３８及びＬＪＰ５３９を含む。ＲＧ７６６７は、ＭＣＭＶ５３２２ＡとＭＣＭＶ３０６８Ａの混合物を含み、ＣＳＪ１４８は、ＬＪＰ５３８とＬＪＰ５３９の混合物を含む。例えば、Ｄｅｎｇら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ６２（２）ｅ０１１０８～１７頁（２０１８年２月）；及びＤｏｌｅら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ６０（５）２８８１～２８８７頁（２０１６年５月）も参照されたい。

【0091】

抗ＥＢＶ抗体の例は、ＹＴＦＩＨＦＧＩＳＷ（配列番号２４８）を含むＡＭＭ０１ ＣＤＲＨ１配列、ＩＤＴＮＮＧＮＴＮＹＡＱＳＬＱＧ（配列番号２４９）を含むＡＭＭ０１ ＣＤＲＨ２配列、及びＲＡＬＥＭＧＨＲＳＧＦＰＦＤＹ（配列番号２５０）を含むＡＭＭ０１ ＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖；並びにＧＧＨＮＩＧＡＫＮＶＨ（配列番号２５１）を含むＡＭＭ０１ ＣＤＲＬ１配列、ＹＤＳＤＲＰＳ（配列番号２５２）を含むＡＭＭ０１ ＣＤＲＬ２配列、及びＣＱＶＷＤＳＧＲＧＨＰＬＹＶ（配列番号２５３）を含むＡＭＭ０１ ＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖を含む。

【0092】

抗ＨＳＶ抗体の例は、ＨＳＶ８－Ｎ及びＭＢ６６を含む。

【0093】

抗クロストリジウム・ディフィシル抗体の例は、アクトクスマブ及びベズロトクスマブを含む。例えば、Ｗｉｌｃｏｘら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７６（４）３０５～３１７頁（２０１７年）も参照されたい。

【0094】

市販されている抗ＴＮＦ抗体は、インフリキシマブ（レミケード（登録商標）Ｃｅｎｔｏｃｏｒ、Ｉｎｃ．、Ｍａｌｖｅｒｎ、ＰＡ、バイオシミラーにインフレクトラ（登録商標）Ｐｆｉｚｅｒ、Ｋｅｎｔ、ＵＫ、及びＩｘｉｆｉ（登録商標）Ｐｆｉｚｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹがある）、アダリムマブ（ヒュミラ（登録商標）Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ、バイオシミラーにＡｍｊｅｖｉｔａ（登録商標）Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ、ＣＡ、及びＣｙｌｔｅｚｏ（登録商標）Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ Ｉｎｔ’ｌ、Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ、ＤＥがある）、ゴリムマブ（Ｓｉｍｐｏｎｉ（登録商標）Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｃｏｒｐ．、Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ）、エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ、ＣＡ、バイオシミラーにＥｒｅｌｚｉ（登録商標）Ｎｏｖａｒｔｉｓ ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、ＣＨがある）、及びセルトリズマブペゴル（Ｃｉｍｚｉａ（登録商標）ＵＣＢ Ｐｈａｒｍａ、Ｂｒｕｓｓｅｌｓ、ＢＥ）を含む。

【0095】

特定の実施形態では、インフリキシマブのＣＤＲは、重鎖残基２６～３７、５２～７０、及び１０３～１１６並びに軽鎖残基２４～３９、５５～６１、及び９４～１０２を含む。特定の実施形態では、インフリキシマブの重鎖はＥＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＭＫ（配列番号２５４）から始まり、軽鎖はＤＩＬＬＴＱＳＰＡＩＬＳＶＳＰＧＥＲ（配列番号２５５）から始まる。

【0096】

特定の実施形態では、インフリキシマブは、ＩＦＳＮＨＷ（配列番号２５６）を含むＣＤＲＨ１配列、ＲＳＫＳＩＮＳＡＴＨ（配列番号２５７）を含むＣＤＲＨ２配列、及びＮＹＹＧＳＴＹ（配列番号２５８）を含むＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖；並びにＦＶＧＳＳＩＨ（配列番号２５９）を含むＣＤＲＬ１配列、ＫＹＡＳＥＳＭ（配列番号２６０）を含むＣＤＲＬ２配列、及びＱＳＨＳＷ（配列番号２６１）を含むＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖を含む。

【0097】

特定の実施形態では、アダリムマブは、ＴＦＤＤＹＡ（配列番号２６２）を含むＣＤＲＨ１配列、ＴＷＮＳＧＨＩＤ（配列番号２６３）を含むＣＤＲＨ２配列、及びＶＳＹＬＳＴＡＳＳＬ（配列番号２６４）を含むＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖；並びにＧＩＲＮＹＬＡ（配列番号２６５）を含むＣＤＲＬ１配列、ＹＡＡＳＴＬＱ（配列番号２６６）を含むＣＤＲＬ２配列、及びＲＹＮＲＡ（配列番号２６７）を含むＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖を含む。

【0098】

特定の実施形態では、セルトリズマブは、ＶＦＴＤＹＧ（配列番号２６８）を含むＣＤＲＨ１配列、ＮＴＹＩＧＥＰＩ（配列番号２６９）を含むＣＤＲＨ２配列、及びＧＹＲＳＹＡＭ（配列番号２７０）を含むＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖；並びにＮＶＧＴＮＶＡ（配列番号２７１）を含むＣＤＲＬ１配列、ＹＳＡＳＦＬＹ（配列番号２７２）を含むＣＤＲＬ２配列、及びＱＹＮＩＹ（配列番号２７３）を含むＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖を含む。

【0099】

本開示の教示内で使用可能な数多くの追加の抗体配列が利用可能であり当業者には公知である。市販の抗体についての配列情報は、Ｄｒｕｇ Ｂａｎｋデータベース、ＣＡＳ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ、及び／又はＲＳＣＢ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＤＡＴＡ Ｂａｎｋで見つけられる。さらに、本明細書に記載される選択された抗体の部分をコードする核酸配列は当業者であれば容易に導き出せる。

【0100】

（ｉｉ）遺伝子編集技法及び細胞選別。遺伝子編集システムは遺伝子療法の標的部位に対する制御を可能にする。本開示の教示内で、正確な配列ターゲティング及び改変が可能であるいかなる遺伝子編集システムも使用可能である。これらのシステムは典型的には、正確なターゲティングのためのターゲティングエレメント及び標的遺伝子部位を切断するためのカッティングエレメントを含む。ガイドＲＮＡはターゲティングエレメントの一例であり、種々のヌクレアーゼはカッティングエレメントの例を提供する。ターゲティングエレメントとカッティングエレメントは、別々の分子でも又は、例えば、ナノ粒子により連結されていることも可能である。代わりに、ターゲティングエレメントとカッティングエレメントは、繋ぎ合わせて１つの二重の目的の分子にすることが可能である。治療核酸配列の挿入が意図される場合、システムは、遺伝子構築物に関連する相同組換え修復鋳型（すなわち、上記の相同性アーム）も含むことができる。しかし、さらに下に詳述するように、異なる遺伝子編集システムは、選択されたゲノム部位を正確に標的にし、切断し、改変する能力は維持しつつ、異なる成分及び立体配置を取り入れることが可能である。

【0101】

特定の実施形態は、遺伝子編集剤として亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を利用する。ＺＦＮは、特定の位置でＤＮＡに結合し切断するように操作された部位特異的ヌクレアーゼの一種である。ＺＦＮを使用してＤＮＡ配列中の特定の部位に二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入し、これによりＺＦＮは種々の異なる細胞においてゲノム内の独特の配列を標的にすることが可能になる。さらに、二本鎖切断に続いて、相同組換え修復（ＨＤＲ）又は非相同末端結合（ＮＨＥＪ）が起きてＤＳＢを修復し、したがって、ゲノム編集が可能になる。

【0102】

ＺＦＮは、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合させることにより合成される。ＤＮＡ結合ドメインは、転写因子である３～６つの亜鉛フィンガータンパク質を含む。ＤＮＡ切断ドメインは、例えば、Ｆｏｋｌエンドヌクレアーゼの触媒ドメインを含む。Ｆｏｋｌドメインは、標的配列上の部位への独特のＤＮＡ結合ドメインを有する２つの構築物を必要とするダイマーとして機能する。Ｆｏｋｌ切断ドメインは、２つの逆位半部位を分離する５～６塩基対スペーサー配列内で切断する。

【0103】

ＺＦＮに関する追加の情報は、Ｋｉｍら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９３、１１５６～１１６０頁（１９９６年）；Ｗｏｌｆｅら、Ａｎｎｕａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ａｎｄ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２９、１８３～２１２頁（２０００年）；Ｂｉｂｉｋｏｖａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３００、７６４（２００３年）；Ｂｉｂｉｋｏｖａら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６１、１１６９～１１７５頁（２００２年）；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ ｊｏｕｒｎａｌ ４、１６０９～１６１４頁（１９８５年）；及びＭｉｌｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５、７７８～７８５頁（２００７年）を参照されたい。

【0104】

特定の実施形態は、遺伝子編集剤として転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を使用可能である。ＴＡＬＥＮは、転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合タンパク質及びＤＮＡ切断ドメインを含む融合タンパク質を指す。ＴＡＬＥＮを使用して、ＤＮＡ中にＤＳＢを誘導し、これにより細胞において修復機構を誘導することにより遺伝子及びゲノムを編集する。一般に、２つのＴＡＬＥＮは、ＤＮＡ切断ドメインが二量体化してＤＳＢを誘導するためには、標的ＤＮＡ部位のそれぞれの側に結合して隣接しなければならない。外来性二本鎖ドナーＤＮＡ断片が存在する場合には、ＤＳＢはＮＨＥＪ又はＨＤＲにより細胞で修復される。

【0105】

示されるように、ＴＡＬＥＮは、例えば、内因性ゲノムの標的配列に結合し、標的配列の位置でＤＮＡを切断するように操作されている。ＴＡＬＥＮのＴＡＬＥは、キサントモナス細菌により分泌されるＤＮＡ結合タンパク質である。ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインは高度に保存された３３又は３４個のアミノ酸反復を含み、それぞれの反復の１２番目及び１３番目の位置に多様な残基を有する。これら２つの位置は、反復可変二残基（ＲＶＤ）と呼ばれ、特定のヌクレオチド認識と強い相関を示す。したがって、ターゲティング特異性は、ＲＶＤのアミノ酸を変え、従来にないＲＶＤアミノ酸を組み込むことにより改善することができる。

【0106】

ＴＡＬＥＮ融合物において使用可能であるＤＮＡ切断ドメインの例は、野生型及び変異Ｆｏｋｌエンドヌクレアーゼである。ＴＡＬＥＮに関する追加の情報については、Ｂｏｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６、１５０９～１５１２頁（２００９年）；Ｍｏｓｃｏｕ＆Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６、１５０１（２００９年）；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １８６、７５７～７６１頁（２０１０年）；及びＭｉｌｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９、１４３～１４８頁（２０１１年）を参照されたい。

【0107】

特定の実施形態は遺伝子編集剤としてＭｅｇａＴＡＬを利用する。ＭｅｇａＴＡＬは、ＴＡＬＥがメガヌクレアーゼのＤＮＡ切断ドメインと融合している一本鎖希少切断ヌクレアーゼ構造を有する。メガヌクレアーゼは、ホーミングエンドヌクレアーゼとしても知られるが、同じドメインにＤＮＡ認識とヌクレアーゼ機能の両方を有する単一ペプチド鎖である。ＴＡＬＥＮとは対照的に、ｍｅｇａＴＡＬは、機能的活性のためには単一ペプチド鎖の送達だけが必要である。

【0108】

特定の実施形態では、内因性Ｂ細胞ゲノムは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムにより標的にすることが可能である。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼシステムは、プラスミド及びファージなどの異種遺伝子エレメントに対する抵抗性を与え、一種の獲得免疫を提供する原核生物免疫系である。ＣＲＩＳＰＲは塩基配列の短い反復を含有するＤＮＡ遺伝子座である。原核生物免疫系という文脈では、それぞれの反復には、原核生物が曝露された異種遺伝子エレメントに属するスペーサーＤＮＡの短いセグメントが続く。スペーサーで分散された反復のこのＣＲＩＳＰＲアレーはＲＮＡに転写することができる。ＲＮＡは成熟型まで処理され、ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ－会合）ヌクレアーゼなどのヌクレアーゼと会合することができる。異種遺伝子エレメントにハイブリダイズすることができる配列を有するＲＮＡ及びＣａｓヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、次に、ゲノム中のこれらの外来性遺伝子エレメントを認識し切断することができる。

【0109】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、特定の配列を標的にするのにカスタマイズされたタンパク質の生成を必要としないが、むしろ、単一Ｃａｓ酵素は、特定のＤＮＡ標的を認識するよう短いガイドＲＮＡ分子（ｃｒＲＮＡ）によりプログラムすることが可能である。細菌及び古細菌適応免疫のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、タンパク質組成及びゲノム遺伝子座構造の極端な多様性を示す。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム遺伝子座は、５０を超える遺伝子ファミリーを有し厳密に普遍的な遺伝子はなく、急速な進化及び遺伝子座構造の極端な多様性を示している。今までのところ、多方面アプローチを採用して、９３のＣａｓタンパク質については３９５プロファイルの広範なｃａｓ遺伝子が同定されている。分類は、シグネチャー遺伝子プロファイルプラス遺伝子座構造のシグネチャーを含む。これらのシステムが２つのクラス、多サブユニットエフェクター複合体を有するクラス１、及びＣａｓ９タンパク質が例証する単一サブユニットエフェクターモジュールを有するクラス２に広く分割されるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの新しい分類が提唱されている。

【0110】

少なくとも３つの異なるＣａｓ９ヌクレアーゼがゲノム編集のために開発されている。第１は野生型Ｃａｓ９であり、これは特定のＤＮＡ部位に二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入し、ＤＳＢ修復機構を活性化する。ＤＳＢは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、相同組換え修復（ＨＤＲ）又はマイクロホモロジー媒介修復（ＭＭＥＪ）により修復可能である。ＮＨＥＪは、修復中に結合する２つの末端間に相同性（＜５ｂｐ）のないＤＳＢを修復することができ、ＨＤＲは、修復中結合された末端間に大きな領域（１００以上のヌクレオチド）の相同性があるＤＳＢを修復することができ、ＭＭＥＪは修復中結合された末端間に小さな（５～５０ｂｐ）領域の相同性があるＤＳＢを修復することができる。別のタイプのＣａｓ９は、Ｃａｓ９Ｄ１０Ａとして知られ、ニッカーゼ活性のみがある変異Ｃａｓ９を含み、これはこの変異Ｃａｓ９が１つのＤＮＡ鎖のみを切断し、ＮＨＥＪを活性化しないことを意味する。したがって、ＤＮＡ修復はＨＤＲ経路のみを介して進行する。第３は、切断活性はないがＤＮＡに結合することができるヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）である。したがって、ｄＣａｓ９は切断なしにゲノムの特定の配列を標的にすることができる。ｄＣａｓ９を種々のエフェクタードメインと融合させることにより、ｄＣａｓ９は遺伝子サイレンシングツール又は活性化ツールとして使用可能である。

【0111】

クラス１及びクラス２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに加えて、つい最近、Ｃｐｆ１により例証される推定クラス２、タイプＶ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓクラスが同定されているＺｅｔｓｃｈｅら、（２０１５年）Ｃｅｌｌ １６３（３）：７５９～７７１頁。Ｃｐｆ１ヌクレアーゼは特に、プロトスペーサー隣接モチーフ又はＰＡＭとして知られる短い３塩基対認識配列（ＴＴＮ）によって標的部位選択の追加の柔軟性を提供できる。Ｃｐｆ１の切断部位はＰＡＭ配列から少なくとも１８ｂｐ離れており、したがって、この酵素は、インデル（挿入と欠失）形成後特定の遺伝子座を繰り返し切断して、ＨＤＲの効率を増やすことができる。さらに、粘着末端を持つ食い違いＤＳＢは、配向特異的ドナー鋳型挿入を可能にする。

【0112】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム及びこの構成成分に関する追加の情報は、米国特許第８６９７３５９号、米国特許第８７７１９４５号、米国特許第８７９５９６５号、米国特許第８８６５４０６号、米国特許第８８７１４４５号、米国特許第８８８９３５６号、米国特許第８８８９４１８号、米国特許第８８９５３０８号、米国特許第８９０６６１６号、米国特許第８９３２８１４号、米国特許第８９４５８３９号、米国特許第８９９３２３３号、及び米国特許第８９９９６４１号、及びにこれらに関係する出願、並びに国際公開第２０１４／０１８４２３号、国際公開第２０１４／０９３５９５号、国際公開第２０１４／０９３６２２号、国際公開第２０１４／０９３６３５号、国際公開第２０１４／０９３６５５号、国際公開第２０１４／０９３６６１号、国際公開第２０１４／０９３６９４号、国際公開第２０１４／０９３７０１号、国際公開第２０１４／０９３７０９号、国際公開第２０１４／０９３７１２号、国際公開第２０１４／０９３７１８号、国際公開第２０１４／１４５５９９号、国際公開第２０１４／２０４７２３号、国際公開第２０１４／２０４７２４号、国際公開第２０１４／２０４７２５号、国際公開第２０１４／２０４７２６号、国際公開第２０１４／２０４７２７号、国際公開第２０１４／２０４７２８号、国際公開第２０１４／２０４７２９号、国際公開第２０１５／０６５９６４号、国際公開第２０１５／０８９３５１号、国際公開第２０１５／０８９３５４号、国際公開第２０１５／０８９３６４号、国際公開第２０１５／０８９４１９号、国際公開第２０１５／０８９４２７号、国際公開第２０１５／０８９４６２号、国際公開第２０１５／０８９４６５号、国際公開第２０１５／０８９４７３号、国際公開第２０１５／０８９４８６号、国際公開第２０１６２０５７１１号、国際公開第２０１７／１０６６５７号、国際公開第２０１７／１２７８０７号、及びにこれらに関係する出願に記載されている。

【0113】

特定の実施形態は、ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡを組み合わせて単一の合成単一ガイドＲＮＡにする（例えば、配列番号８７～８９、又は２９０～３６６を利用するｓｇＲＮＡ）。特定の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列に類似している２０ヌクレオチド配列を含むことができる。ある特定の遺伝子編集システムでは、標的配列はＰＡＭに隣接していてもよい（例えば、５’－２０ｎｔ標的－ＮＧＧ－３’）。特定の実施形態では、標的配列はＰＡＭ（配列番号５～８４）を含むことができる。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、ゲノム編集複合体が標的にするＰＡＭに隣接する標的部位を含む。ｇＲＮＡは、ＰＡＭに隣接する少なくとも１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２ヌクレオチドを含むことができる。

【0114】

特定の実施形態では、カッティングエレメントは、操作されたｇＲＮＡの助けを借りて標的ＤＮＡ位置に向けられる（図２５Ａ（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２０１５年；５８（４）：５６８～７４頁））。相同性アームが切断ゲノム領域に隣接している遺伝子構築物は、相同性組換えＤＮＡ修復機構によりこの位置に効率的に挿入される（例えば、図１５Ｂ参照（Ｅｌｌｉｏｔｔら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９８年；１８（１）：９３～１０１頁））。このアプローチを使用すると、内因性抗体の発現を除き、選択された抗体をコードする遺伝子は標的遺伝子位置に挿入される。この標的挿入は、無作為な遺伝子挿入から生じるオフターゲット効果の可能性を除く又は著しく減少させる。

【0115】

特定の実施形態では、それぞれの内因性抗体のマウス又はヒトＩｇＨを標的にするｓｒＲＮＡは、Ｊ領域の１００ｂｐ下流の領域を標的にする（図９）。実験例では、この領域は標的にされて、内因性ゲノム由来のＣ領域を含有する選択された抗体パリビズマブのバージョンを発現した（図７及び９）。ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕアルゴリズム（Ｈｓｕら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３年；３１（９）：８２７～３２頁）は、この領域について、オフターゲット結合がたとえあるにしてもほとんどないと予想される２２のターゲティング配列を同定した。個々のターゲティング配列は完全長ｓｇＲＮＡ中に挿入させ、記載される通りにインキュベーションの直前にＣａｓ９などのヌクレアーゼと混合させ（Ｓｃｈｕｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１５年；１１２（３３）：１０４３７～４２頁）、Ｂ細胞中に電気穿孔することができる（Ｋｉｍら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９７９年；１２２（２）：５４９～５４頁）。Ｃａｓ９により切断されるＤＮＡの細胞修復により遺伝子機能が失われることが多いので（Ｓｙｍｉｎｇｔｏｎ＆Ｇａｕｔｉｅｒ、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．２０１１年；４５：２４７～７１頁）、抗体コード領域を標的にする効率的なｓｇＲＮＡは抗体を欠くいくつかのＢ細胞の出現をもたらすと予想され、これはフローサイトメトリーにより容易に評価することができる。イントロン配列を標的にするｓｇＲＮＡの活性は、シーケンシングにより、又はＴ７エンドヌクレアーゼアッセイなどの酵素的アッセイを通じて評価することができる。

【0116】

特定の実施形態では、ゲノムターゲティング及びカッティングエレメントは、電気穿孔、ナノ粒子媒介送達及び／又はウイルスベクター送達を通じて投与することができる。電気穿孔は、例えば、ターゲティングエレメント及び／又はカッティングエレメントを送達するのに有用になりうる。なぜならば、細胞の膜は通常ではそのような異種分子を細胞内に入れないからである。電気穿孔は細胞に電気ショックを送り、このショックがそのような異種分子が細胞膜を通過するのを一時的に可能にする。

【0117】

特定の実施形態では、挿入用の遺伝子構築物は、電気穿孔、ナノ粒子媒介送達及び／又はウイルスベクター送達を通じて投与することができる。アデノ随伴ウイルスベクターは、例えば、アデノウイルス５（Ａｄ５）、アデノウイルス３５（Ａｄ３５）、アデノウイルス１１（Ａｄ１１）、アデノウイルス２６（Ａｄ２６）、アデノウイルス４８（Ａｄ４８）、又はアデノウイルス５０（Ａｄ５０）、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ；例えば、米国特許第５，６０４，０９０号；Ｋａｙら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２４：２５７（２０００年）；Ｎａｋａｉら、Ｂｌｏｏｄ ９１：４６００（１９９８年）参照）由来のベクターを含む。

【0118】

特定の実施形態では、ゲノムターゲティング及びカッティングエレメントは、電気穿孔を通じて投与することができ、挿入用の遺伝子構築物はＡＡＶ媒介送達を通じて投与することができる。特定の実施形態では、ゲノムターゲティング及びカッティングエレメントは、ナノ粒子媒介送達を通じて投与することができ、挿入用の遺伝子構築物はＡＡＶ媒介送達を通じて投与することができる。

【0119】

特定の実施形態では、導入遺伝子を含む遺伝子構築物は、電気穿孔の直前又は少し前にターゲティングエレメント（例えば、ｓｇＲＮＡ）及びカッティングエレメント（例えば、Ｃａｓ９又はｃｐｆ１）と混合することができる。選択された抗体発現は、フローサイトメトリーにより蛍光的にタグ付けされた標的タンパク質への細胞結合を測定することにより後で（例えば、３日後に）確認することができる。エピトープ特異的Ｂ細胞を検出し分析するための濃縮及び分析方法を使用することができる（Ｐａｐｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１１年；３３１（６０２１）：１２０３～７頁；Ｔａｙｌｏｒら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２０１２年；２０９（３）：５９７～６０６頁；Ｔａｙｌｏｒら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２０１２年；２０９（１１）：２０６５～７７頁；Ｈａａｓｋｅｎら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３年；１９１（３）：１０５５～６２頁；Ｔａｙｌｏｒら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４年；４０５：７４～８６頁；Ｎａｎｔｏｎら、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５年；４５（２）：４２８～４１頁；Ｈａｍｉｌｔｏｎら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５年；１９４（１０）：５０２２～３４頁；Ｔａｙｌｏｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１５年；３４７（６２２３）：７８４～７頁）。これらの方法は、全Ｂ細胞集団の異常なほどわずか０．００００２％の頻度で選択された抗体発現Ｂ細胞の検出を可能にする（Ｔａｙｌｏｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１５年；３４７（６２２３）：７８４～７頁）。

【0120】

特定の実施形態では、細胞は、遺伝子構築物を送達する前又は後で、マーカー発現に基づいて同定する及び／又は分別することができる。例えば、遺伝子構築物の送達に先立って、特定のタイプのＢ細胞（例えば、記憶Ｂ細胞、抗体分泌Ｂ細胞、ナイーブＢ細胞、Ｂ１ Ｂ細胞、周辺帯Ｂ細胞）を試料から単離することが有用である場合がある。別の例として、血液試料に存在する他の細胞からＢ細胞を単離することが有用である場合がある。ＣＤ１９は、Ｂ細胞により発現されるタンパク質の例であるが、身体の他の細胞ではほとんど発現されない。ＣＤ１９を蛍光分子で標識することにより、Ｂ細胞を特異的に同定することができる。Ｂ２２０はマウスＢ細胞を同定するのに有用なマーカーである。

【0121】

ＣＤ２７は、記憶Ｂ細胞で発現されるタンパク質の例であるが、ナイーブヒトＢ細胞では発現されない。ＣＤ２７を蛍光分子で標識することにより、記憶Ｂ細胞を同定することができる。

【0122】

ＣＤ２１は、感染に続いて急速に抗体を分泌する能力を持つ一部の記憶ヒトＢ細胞により発現されない（又は発現される程度が低い）タンパク質の例である。低ＣＤ２１発現を使用して、プラズマ細胞分化のためにプライミングされたＢ細胞を規定することができる。ＣＤ２１を蛍光分子で標識することにより、これらのＢ細胞は、例えば、負の選択により特異的に同定することができる。

【0123】

ヒトナイーブＢ細胞は、マーカープロファイルＩｇＭ＋ ＩｇＤ＋ ＣＤ２７－により同定することができる。マウスナイーブＢ細胞は、マーカープロファイルＣＤ３８＋ ＧＬ７－ ＩｇＭ＋ ＩｇＤ＋により同定することができる。ヒトＢ１ Ｂ細胞は、マーカープロファイルＣＤ５＋ ＣＤ４３＋により同定することができる。マウスＢ１ Ｂ細胞は、マーカープロファイルＣＤ４３＋ Ｂ２２０ＬＯＷにより同定することができる。ヒト周辺帯Ｂ細胞は、マーカープロファイルＣＤ２１＋＋＋ ＩｇＭ＋＋ ＩｇＤ－ ＣＤ２７＋により同定することができる。マウス周辺帯Ｂ細胞は、マーカープロファイルＣＤ２１＋＋＋ ＩｇＭ＋＋ ＩｇＤ－により同定することができる。

【0124】

特定の実施形態は、ＣＤ１９^＋ＣＤ２７^＋ＣＤ２１^ｌｏマーカープロファイルを利用しうる。

【0125】

ＣＤ４５は、本明細書に記載される実験において使用される細胞型を同定する及び／又は単離するために使用されるマーカーである。マウス系統が異なればＣＤ４５と呼ばれるタンパク質の異なるバージョンが発現され、ＣＤ４５．１及びＣＤ４５．２と名付けられる。本明細書で開示される実験では、ＣＤ４５．２を発現するマウス由来のＢ細胞が採取され、ＣＤ４５．１を発現するマウス中に移される。ＣＤ４５．１とＣＤ４５．２を異なる蛍光分子で標識することにより、ドナー動物由来の細胞を同定することができる。なぜならば、この細胞はＣＤ４５．２を発現するがＣＤ４５．１は発現しないからである。

【0126】

特定の実施形態は、外来性軽鎖の発現に基づいて遺伝子改変後Ｂ細胞を分別することを含む。例えば、天然にカッパ軽鎖を発現するＢ細胞は、ラムダ軽鎖を含む選択された抗体を発現するように改変することが可能である。天然にラムダ軽鎖を発現するＢ細胞は、カッパ軽鎖を含む選択された抗体を発現するように改変することが可能である。外来性軽鎖の発現に基づく分別は、選択された抗体を発現するＢ細胞のみの単離を可能にする。特定の実施形態では、その内因性軽鎖の表面発現を完全に欠くＢ細胞のみが製剤化及び対象への投与のために単離される。

【0127】

特定の実施形態では、細胞はフローサイトメトリーを使用して同定しうる及び／又は単離しうる。フローサイトメトリーは、レーザー光を使用して何百万もの個々の細胞を標識する蛍光分子を個別に分析する感度の良い強力な分析アプローチである。それぞれの細胞を標識している蛍光分子の組合せを分析することにより、異なるＢ細胞サブタイプを同定することができる。フローサイトメトリーを使用して、Ｂ細胞サブセットを同定しこれらの細胞内での選択された抗体（例えば、パリビズマブ）の発現を分析することができる。

【0128】

特定の実施形態では、Ｂ細胞を改変する方法は、造血幹細胞（ＨＳＣ）を入手する、及び／又は遺伝子構築物をＨＳＣに送達することを含むことができる。ＨＳＣとは、Ｂ細胞並びに免疫系の他のあらゆる細胞を天然に産生するタイプの幹細胞を指すことができる。ＨＳＣは、例えば、臍帯血から入手可能である。

【0129】

本明細書に記載される特定の実験結果は、新たに単離したＢ細胞に移るのに先立ってＡ２０細胞を利用して遺伝子改変方法を開発した。Ａ２０は、マウスＢ細胞から作られた不死化細胞株である。

【0130】

特定の実施形態では、Ｂ細胞はヒト対象から入手してもよく、入手したＢ細胞又はこのサブセットはイクスビボで改変しうる。

【0131】

改変Ｂ細胞の製剤化。改変後、細胞は培養培地から採取し、洗浄して、治療有効量で担体中に濃縮することができる。例示的担体は、食塩水、緩衝食塩水、生理食塩水、水、ハンクス液、リンゲル液、Ｎｏｎｎｏｓｏｌ－Ｒ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ）、ＰＬＡＳＭＡ－ＬＹＴＥ Ａ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｍｏｒｔｏｎ Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ）、グリセロール、エタノール、及びこれらの組合せを含む。

【0132】

特定の実施形態では、担体は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）若しくは他のヒト血清成分又はウシ胎仔血清で補充することができる。特定の実施形態では、注入用の担体は、５％ヒアルロン酸ナトリウム塩（ＨＡＳ）又はブドウ糖を含む緩衝食塩水を含む。追加の等張剤は、グリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、又はマンニトールなどの三価以上の糖アルコールを含む多価糖アルコールを含む。

【0133】

担体は、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、酒石酸緩衝液、フマル酸緩衝液、グルコン酸緩衝液、シュウ酸緩衝液、乳酸緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、及び／又はトリエチルアミン塩などの緩衝剤を含むことができる。

【0134】

安定化剤とは、充填剤から容器壁への細胞接着を予防する一助となる添加剤まで機能範囲が及ぶことができる広い範疇の賦形剤を指す。典型的な安定化剤は、多価糖アルコール；アルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ－ロイシン、２－フェニルアラニン、グルタミン酸及びスレオニンなどのアミノ酸；ラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイノシトール、ガラクチトール、グリセロール及びイノシトールなどのシクリトールなどの有機糖又は糖アルコール；ＰＥＧ；アミノ酸ポリマー；尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、アルファ－モノチオグリセロール及びチオ硫酸ナトリウムなどの硫黄含有還元剤；低分子量ポリペプチド（すなわち、＜１０残基）；ＨＳＡ、ウシ血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；キシロース、マンノース、フルクトース及びグルコースなどの単糖；ラクトース、マルトース及びサクロースなどの二糖；ラフィノースなどの三糖、並びにデキストランなどの多糖を含むことができる。

【0135】

必要である又は有益である場合、製剤は注射部位の疼痛を和らげるためにリドカインなどの局所麻酔薬を含むことができる。

【0136】

例示的保存剤は、フェノール、ベンジルアルコール、メタクレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ベンザルコニウムハロゲン化物、塩化ヘキサメトニウム、メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール及び３－ペンタノールを含む。

【0137】

製剤は、例えば、１０^２よりも多い改変Ｂ細胞、１０^３よりも多い改変Ｂ細胞、１０^４よりも多い改変Ｂ細胞、１０^５よりも多い改変Ｂ細胞、１０^６よりも多い改変Ｂ細胞、１０^７よりも多い改変Ｂ細胞、１０^８よりも多い改変Ｂ細胞、１０^９よりも多い改変Ｂ細胞、１０^１０よりも多い改変Ｂ細胞、又は１０^１１よりも多い改変Ｂ細胞を含むことができる。

【0138】

使用方法。本明細書に開示される方法は、対象（例えば、ヒト、獣医動物（イヌ、ネコ、爬虫類、鳥類）、家畜（例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、ニワトリ）及び研究動物（例えば、サル、ラット、マウス、魚））を本明細書で開示される製剤で処置することを含む。対象の処置は、治療有効量を送達することを含む。治療有効量は、有効量、予防的処置及び／又は治療的処置を提供する量を含む。

【0139】

「有効量」とは、対象において所望の生理的変化をもたらすのに必要な組成物の量である。有効量は、研究目的で投与される場合が多い。本明細書で開示される有効量は、状態の発症、進行及び／又は消散の評価に関連する動物モデルにおいて又はインビトロアッセイにおいて統計的に有意な効果を引き起こすことができる。

【0140】

「予防的処置」は、処置が状態を発症するリスクを軽減する又は減少させる目的で施されるように、状態の徴候若しくは症状を示さない又は状態の初期の徴候若しくは症状のみを示す対象に施される処置を含む。したがって、予防的処置は、状態に対する予防治療として機能する。特定の実施形態では、予防的処置は、状態の悪化を低減する、遅延させる、又は予防する。特定の実施形態は、現在のところ有効なワクチンがない場合に予防的防御として本明細書に記載される製剤の投与を含む。特定の実施形態は、従来のワクチン接種戦略の代替法としての予防的な防御として本明細書に記載される製剤の投与を含む。特定の実施形態は、従来のワクチン接種戦略の補助法としての予防的な防御として本明細書に記載される製剤の投与を含む。

【0141】

「治療的処置」は、状態の症状又は徴候を示す対象に施される処置を含み、状態のそれらの徴候又は症状を軽減する又は除く目的で対象に施される。治療的処置は、状態の存在若しくは活性を低減する、制御する若しくは除く及び／又は状態の副作用を低減する、制御する若しくは除くことができる。

【0142】

特定の実施形態では、状態は感染症である。

【0143】

有効量としての機能、予防的処置又は治療的処置は互いに排他的ではなく、特定の実施形態では、管理された投薬量は１つよりも多い処置タイプを達成しうる。

【0144】

特定の実施形態では、治療有効量は抗病原体効果を提供する。抗病原体効果は、抗感染効果を含むことができる。抗感染効果は、感染症の発生の減少、感染症の重篤度の減少、感染症の持続期間の減少、感染した細胞数の減少、感染した組織量の減少、平均余命の増加、免疫クリアランスに対する感染細胞の誘導感受性、減少した感染関連疼痛、及び／又は処置された感染症に関連する症状の低減若しくは除去を含むことができる。

【0145】

特定の実施形態では、治療有効量は抗炎症効果を提供する。抗炎症効果は、炎症関連疼痛、発熱、発赤、腫脹及び／又は機能喪失の減少を含むことができる。

【0146】

特定の実施形態では、治療有効量は、抗クローン病効果又は抗潰瘍性大腸炎効果を提供する。抗クローン病効果又は抗潰瘍性大腸炎効果は、下痢、直腸出血の減少、不可解な体重減少の縮小、発熱の減少、腹痛及び筋痙攣の減少、疲労及び活気のなさの減少、並びに／又は食欲の回復を含むことができる。

【0147】

特定の実施形態では、治療有効量は抗関節炎効果を提供する。抗関節炎効果は、関節の疼痛、こわばり、腫脹、発赤の減少及び／又は可動域の回復を含むことができる。関節炎の種類は、関節リウマチ（ＲＡ）、強直性脊椎炎、及び乾癬性関節炎を含む。

【0148】

特定の実施形態では、治療有効量は抗尋常性乾癬効果を提供する。抗尋常性乾癬効果は、赤斑、鱗屑性斑点、掻痒、灼熱痛、ひりひりする痛み、爪床異常及び／又は腫脹若しくは硬直した関節の減少を含むことができる。

【0149】

特定の実施形態では、Ｂ細胞は対象から入手してもよく、Ｂ細胞のサブセットはイクスビボで改変してもよく、次に、改変されたＢ細胞は製剤化して対象に投与してもよい。特定の実施形態では、対象のＢ細胞の最初のサブセットは、最初の遺伝子構築物で改変して最初の病原体に対する選択された抗体を産生させてもよく、対象のＢ細胞の第２のサブセットは、第２の遺伝子構築物で改変して第２の病原体に対する選択された抗体を産生させて、それによって２つの病原体に対する防御抗体を提供してもよい。示されたように、いかなる数の病原体に対してもＢ細胞を形成して対象に投与することが可能である。特定の実施形態では、選択された抗体は、抗ＲＳＶ抗体、抗ＨＩＶ抗体、抗デングウイルス抗体、抗ボルデテラ・パータシス（Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）抗体、抗Ｃ型肝炎抗体、抗インフルエンザウイルス抗体、抗パラインフルエンザウイルス抗体、抗ＭＰＶ抗体、抗サイトメガロウイルス抗体、抗エプスタイン・バーウイルス抗体、抗単純ヘルペスウイルス抗体、抗クロストリジウム・ディフィシル細菌毒素抗体、及び／又は抗ＴＮＦ抗体でありうる。特定の実施形態では、選択された抗体は、抗ＲＳＶ抗体、抗インフルエンザウイルス抗体、抗パラインフルエンザウイルス抗体及び／又は抗ＭＰＶ抗体のうちの１種以上でありうる。特定の実施形態では、選択された抗体は、抗ＲＳＶ抗体、抗インフルエンザウイルス抗体、抗パラインフルエンザウイルス抗体及び抗ＭＰＶ抗体でありうる。特定の実施形態では、選択された抗体はパリビズマブである。

【0150】

特定の実施形態では、Ｂ細胞は、免疫学的にレシピエントに適合している骨髄ドナー又は造血幹細胞ドナーから入手しうる。特定の実施形態では、ドナーのＢ細胞の最初のサブセットは最初の遺伝子構築物で改変して最初の病原体に対する選択された抗体を産生させてもよく、ドナーのＢ細胞の第２のサブセットは第２の遺伝子構築物で改変して第２の病原体に対する選択された抗体を産生させて、それによって２つの病原体に対する防御抗体を提供してもよい。示されたように、いかなる数の病原体に対してもＢ細胞を形成して対象に投与することが可能である。特定の実施形態では、選択された抗体は、抗ＲＳＶ抗体、抗ＨＩＶ抗体、抗デングウイルス抗体、抗ボルデテラ・パータシス抗体、抗Ｃ型肝炎抗体、抗インフルエンザウイルス抗体、抗パラインフルエンザウイルス抗体、抗ＭＰＶ抗体、抗サイトメガロウイルス抗体、抗エプスタイン・バーウイルス抗体、抗単純ヘルペスウイルス抗体、抗クロストリジウム・ディフィシル細菌毒素抗体、及び／又は抗ＴＮＦ抗体でありうる。特定の実施形態では、選択された抗体は、抗ＲＳＶ抗体、抗インフルエンザウイルス抗体、抗パラインフルエンザウイルス抗体及び／又は抗ＭＰＶ抗体のうちの１種以上でありうる。特定の実施形態では、選択された抗体は、抗ＲＳＶ抗体、抗インフルエンザウイルス抗体、抗パラインフルエンザウイルス抗体及び抗ＭＰＶ抗体でありうる。特定の実施形態では、選択された抗体はパリビズマブである。遺伝子改変されたＢ細胞は、レシピエントに投与されて、移植された細胞がレシピエント自身の免疫系に再定植するまで、感染に対する防御（例えば、抗感染効果）を与えることができる。

【0151】

特定の実施形態では、レシピエントは、血液系腫瘍に対する処置としてドナー由来の骨髄又は造血幹細胞移植片を受けている。血液系腫瘍の例は、急性リンパ性白血病、Ｂ細胞性前リンパ球性白血病、バーキットリンパ腫／白血病、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫（悪性度Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、又はＩＶ）、ホジキンリンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、周辺帯リンパ腫（節外性又は結節性）、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、ＰＯＥＭＳ症候群／骨硬化性骨髄腫、原発性体液性リンパ腫、脾臓周辺帯リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、くすぶり型多発性骨髄腫（ＳＭＭ）、及びワルデンストレームマクログロブリン血症を含む。

【0152】

特定の実施形態では、レシピエントは、レシピエントが欠いている遺伝子を与える遺伝子改変造血幹細胞を受けている。これらのレシピエントは、造血幹細胞を通じた治療遺伝子の提供で処置することができる原発性又は続発性免疫不全症を抱えている可能性がある。８０を超える原発性免疫不全疾患が世界保健機構により認識されている。これらの疾患は、一部の場合、身体が感染に対するいかなる抗体も又は十分な抗体を産生できない免疫系の固有の欠陥を特徴とする。他の場合では、感染と闘う細胞防御が正しく働けなくなる。典型的には、原発性免疫不全症は遺伝性障害である。Ｘ連鎖重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ－Ｘ１）は原発性免疫不全症の別の例である。Ｘ連鎖ＳＣＩＤは、共通ガンマ鎖遺伝子（γＣ）における突然変異により引き起こされる細胞性と体液性免疫枯渇の両方をもたらし、この突然変異によりＴ及びナチュラルキラー（ＮＫ）リンパ球がなくなる。

【0153】

続発性又は後天性免疫不全症は、受け継がれた遺伝子異常の結果ではなく、むしろ、免疫系が免疫系以外の要因により損なわれる個人において起こる。例は、外傷、ウイルス、化学療法、毒素及び汚染を含む。後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）はウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）により引き起こされる続発性免疫不全障害の例であり、Ｔリンパ球の枯渇により身体が感染と闘えなくなる。

【0154】

特定の実施形態では、Ｂ細胞は対象から入手してもよく、Ｂ細胞のサブセットはイクスビボで改変してもよく、次に、改変されたＢ細胞は製剤化して対象に投与してもよい。特定の実施形態では、対象のＢ細胞の最初のサブセットは、最初の遺伝子構築物で改変して、炎症性サイトカインなどの炎症性分子に対する選択された抗体を産生させてもよい。特定の実施形態では、選択された抗体は、抗ＴＮＦ抗体及び／又は抗ＩＬ－１抗体でありうる。特定の実施形態では、選択された抗体は、インフリキシマブ、アダリムマブ及び／若しくはゴリムマブ、並びに／又はこれらの承認されたバイオシミラーである。

【0155】

投与では、治療有効量（本明細書では用量とも呼ばれる）は、最初は、インビトロアッセイ及び／又は動物モデル研究からの結果に基づいて評価することが可能である。そのような情報を使用して、目的の対象における有用な用量をもっと正確に決定することができる。特定に対象に投与される実際の投与量は、年齢、以前の予防接種（もしあれば）、標的、体重、状態の重篤度、状態の種類、状態の段階、以前若しくは現在の治療介入、対象の特発性疾患及び投与経路を含む身体的及び生理的要因などのパラメータを考慮に入れて医師、獣医又は研究者により決定することができる。

【0156】

示されるように、特定の実施形態では、改変されたＢ細胞は、例えば、対象への投与後トラッキング及び／又は除去を可能にするタグを発現する。

【0157】

例示的用量は、１０^２よりも多い改変Ｂ細胞、１０^３よりも多い改変Ｂ細胞、１０^４よりも多い改変Ｂ細胞、１０^５よりも多い改変Ｂ細胞、１０^６よりも多い改変Ｂ細胞、１０^７よりも多い改変Ｂ細胞、１０^８よりも多い改変Ｂ細胞、１０^９よりも多い改変Ｂ細胞、１０^１０よりも多い改変Ｂ細胞、又は１０^１１よりも多い改変Ｂ細胞を含むことができる。

【0158】

特定の実施形態では、選択された抗体の効果は、ウイルス力価を使用して測定可能である。ウイルス力価とは、検出可能なウイルスの量を指す。高ウイルス力価は高レベルの感染を意味する。最適防御応答は、ゼロまで下がる力価で観察される。

【0159】

当業者であれば理解するように、特定の実施形態が説明されてきたが、本開示の範囲内で追加の実施形態も利用しうる。以下の説明は、代表的な追加の実施形態の説明及び実施可能性を提供する。

【0160】

例示的実施形態
１．Ｂ細胞を遺伝子操作して選択された抗体を発現させる方法であって、すべてのＢ細胞において一定であるイントロン領域での（ｉ）プロモーター及び（ｉｉ）選択された抗体の一部をコードする導入遺伝子を含む遺伝子構築物の標的挿入を含み、（ｉ）プロモーターはプロモーターと相互作用して導入遺伝子の発現を駆動させるエンハンサーエレメントに対して位置付けられており、（ｉｉ）導入遺伝子はＢ細胞の内因性抗体コードゲノムの一部が発現されないような立体配置である方法。
２．Ｂ細胞を遺伝子操作して選択された抗体を発現させる方法であって、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４中に、（ｉ）重鎖プロモーター、（ｉｉ）シグナルペプチド、（ｉｉｉ）選択された抗体の完全長軽鎖；（ｉｖ）柔軟なリンカー又はスキッピングエレメント；（ｖ）選択された抗体の重鎖の可変領域；及び（ｖｉ）スプライスジャンクションを含む遺伝子構築物を挿入し、それによってＢ細胞を遺伝子操作して選択された抗体を発現させることを含む方法。
３．Ｂ細胞の内因性可変重鎖コードゲノムが遺伝子改変中に切り出されない、実施形態１又は２の方法。
４．選択された抗体が、抗呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）抗体、抗ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗体、抗デングウイルス抗体、抗ボルデテラ・ペルツシス抗体、抗Ｃ型肝炎抗体、抗インフルエンザウイルス抗体、抗パラインフルエンザウイルス抗体、抗メタニューモウイルス（ＭＰＶ）抗体、抗サイトメガロウイルス抗体、抗エプスタイン・バーウイルス抗体、抗単純ヘルペスウイルス抗体、抗クロストリジウム・ディフィシル細菌毒素抗体又は抗腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）抗体である、実施形態１～３のいずれかの方法。
５．遺伝子構築物が、配列番号１０２～１７５、２７８、２７９又は２８０～２８９を含む、実施形態１～４のいずれかの方法。
６．柔軟なリンカーが、選択された抗体の完全長軽鎖と選択された抗体の重鎖の可変領域の間にある、実施形態２～５のいずれかの方法。
７．柔軟なリンカーが、配列番号１８０～１８４から選択される、実施形態２～６のいずれかの方法。
８．柔軟なリンカーが、５０～８０アミノ酸を含むＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーである、実施形態２～７のいずれかの方法。
９．柔軟なリンカーが、５７アミノ酸を含むＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーである、実施形態２～８のいずれかの方法。
１０．柔軟なリンカーが配列番号１２２である、実施形態２～６、８又は９のいずれかの方法。
１１．スキッピングエレメントが、選択された抗体の完全長軽鎖と選択された抗体の重鎖の可変領域の間にある、実施形態２～１０のいずれかの方法。
１２．スキッピングエレメントが自己切断ペプチドである、実施形態２～１１のいずれかの方法。
１３．自己切断ペプチドが配列番号１７６～１７９から選択される、実施形態１２の方法。
１４．スキッピングエレメントが内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）である、実施形態２～１３のいずれかの方法。
１５．重鎖プロモーターが配列番号１１１及び１２８から選択される、実施形態２～１４のいずれかの方法。
１６．重鎖プロモーターがＩｇＶＨ１－６９又はＪ５５８Ｈ１０である、実施形態２～１５のいずれかの方法。
１７．シグナルペプチドが配列番号１１８、１３４及び１８５～１９４から選択される、実施形態２～１６のいずれかの方法。
１８．シグナルペプチドが、ヒトＩｇＨ重鎖又はヒトＩｇＬ軽鎖に由来する、実施形態２～１７のいずれかの方法。
１９．遺伝子構築物が相同性アームを含む、実施形態１～１８のいずれかの方法。
２０．相同性アームが、配列番号９０～１０１、１１０、１２５、１２７、１４０、１４２、１４３、１５３、１７０、１７１、１７３、１７４、２７８又は２７９を含む、実施形態１９の方法。
２１．遺伝子構築物がタグをコードする、実施形態１～２０のいずれかの方法。
２２．タグが、ＳＴＲＥＰＴＡＧ（登録商標）、ＳＴＲＥＰ（登録商標）タグＩＩ、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、Ａｖｉタグ、カルモジュリンタグ、ポリグルタメートタグ、ＨＡタグ、Ｍｙｃタグ、Ｎｕｓタグ、Ｓタグ、ＳＢＰタグ、Ｓｏｆタグ１、Ｓｏｆタグ３又はＶ５タグを含む、実施形態２１の方法。
２３．タグが配列番号１２２又は１９５～２０４を含む、実施形態２１又は２２の方法。
２４．配列番号８７～８９及び２９０～３６６の１つ以上から選択されるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列並びにヌクレアーゼをＢ細胞に送達することをさらに含む、実施形態１～２３のいずれかの方法。
２５．送達することが電気穿孔、ナノ粒子又はウイルス媒介送達を通じてである、実施形態２４の方法。
２６．遺伝子構築物がアデノ随伴ウイルスベクターの一部である、実施形態１～２５のいずれかの方法。
２７．ｇＲＮＡ及びヌクレアーゼが電気穿孔を通じて送達され、遺伝子構築物がアデノ随伴ウイルスベクターの一部として送達される、実施形態２４～２６のいずれかの方法。
２８．ヌクレアーゼがＣａｓ９又はＣｐｆ１である、実施形態２４～２７のいずれかの方法。
２９．ｇＲＮＡ配列の１つ以上により標的にされる標的配列が配列番号５～８４の１つ以上から選択され、ｇＲＮＡが配列番号８７～８９及び２９０～３６６の１つ以上から選択される、実施形態２４～２８のいずれかの方法。
３０．選択された抗体が、パリビズマブ、ＡＢ１１２８又はａｂ２０７４５を含む抗ＲＳＶ抗体である、実施形態１～２９のいずれかの方法。
３１．選択された抗体が、配列番号１３８を含む重鎖及び配列番号１３６を含む軽鎖を含むパリビズマブ；配列番号１３８を含む重鎖及び配列番号２０５を含む軽鎖を含むパリビズマブ；配列番号１２３を含む重鎖及び配列番号１２０を含む軽鎖を含む抗ＲＳＶ抗体；又は配列番号１２３を含む重鎖及び配列番号２０６を含む軽鎖を含む抗ＲＳＶ抗体である、実施形態１～３０のいずれかの方法。
３２．選択された抗体が、配列番号２０７を含むＣＤＲＨ１、配列番号２０８を含むＣＤＲＨ２、配列番号２０９を含むＣＤＲＨ３；配列番号２１０を含むＣＤＲＬ１、配列番号２１１を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号２１２を含むＣＤＲＬ３を含む抗ＲＳＶ抗体である、実施形態１～３０のいずれかの方法。
３３．選択された抗体が、１０Ｅ８、ＶＲＣ０１、ａｂ１８６３３又は３９／５．４Ａを含む抗ＨＩＶ抗体である、実施形態１～２９のいずれかの方法。
３４．選択された抗体が、配列番号１５０を含む重鎖及び配列番号１４９を含む軽鎖を含む抗ＨＩＶ抗体である、実施形態１～２９又は３３のいずれかの方法。
３５．選択された抗体が、配列番号２１３を含むＣＤＲＨ１、配列番号２１４を含むＣＤＲＨ２、配列番号２１５を含むＣＤＲＨ３、配列番号２１６を含むＣＤＲＬ１、配列番号２１７を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号２１８を含むＣＤＲＬ３又は配列番号２１９を含むＣＤＲＨ１、配列番号２２０を含むＣＤＲＨ２、配列番号２２１を含むＣＤＲＨ３、ＱＹＧＳを含むＣＤＲＬ１、ＳＧＳを含むＣＤＲＬ２、及び配列番号２２２を含むＣＤＲＬ３を含む抗ＨＩＶ抗体である、実施形態１～２９又は３３のいずれかの方法。
３６．選択された抗体が、抗体５５、ＤＢ２－３、ａｂ１５５０４２又はａｂ８０９１４を含む抗デングウイルス抗体である、実施形態１～２９のいずれかの方法。
３７．選択された抗体が、配列番号２２３を含むＣＤＲＨ１、配列番号２２４を含むＣＤＲＨ２、配列番号２２５を含むＣＤＲＨ３；配列番号２２６を含むＣＤＲＬ１、配列番号２２７を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号２２８を含むＣＤＲＫＬ３又は配列番号２２９を含むＣＤＲＨ１、配列番号２３０を含むＣＤＲＨ２、配列番号２３１を含むＣＤＲＨ３、配列番号２３２を含むＣＤＲＬ１、配列番号２３３を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号２３４を含むＣＤＲＬ３を含む抗デングウイルス抗体である、実施形態１～２９又は３６のいずれかの方法。
３８．選択された抗体が、配列番号２３５を含む重鎖及び配列番号２３６を含む軽鎖を含む抗百日咳抗体である、実施形態１～２９のいずれかの方法。
３９．選択された抗体が、ＭＡＢ８６９４又はＣ７－５０を含む抗Ｃ型肝炎抗体である、実施形態１～２９のいずれかの方法。
４０．選択された抗体が、配列番号２３７を含むＣＤＲＨ１、配列番号２３８を含むＣＤＲＨ２、配列番号２３９を含むＣＤＲＨ３、配列番号２４０を含むＣＤＲＬ１、配列番号２４１を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号２４２を含むＣＤＲＬ３を含む抗Ｃ型肝炎抗体である、実施形態１～２９又は３９のいずれかの方法。
４１．選択された抗体が、Ｃ１０２を含む抗インフルエンザウイルス抗体である、実施形態１～２９のいずれかの方法。
４２．選択された抗体が、配列番号１５９を含む重鎖及び配列番号１５８を含む軽鎖を含む抗インフルエンザウイルス抗体である、実施形態１～２９又は４１のいずれかの方法。
４３．選択された抗体が、配列番号２４３を含むＣＤＲＨ１、配列番号２４４を含むＣＤＲＨ２、配列番号２４５を含むＣＤＲＨ３、配列番号２４６を含むＣＤＲＬ１、ＫＴＳを含むＣＤＲＬ２、及び配列番号２４７を含むＣＤＲＬ３を含む抗インフルエンザウイルス抗体である、実施形態１～２９又は４１のいずれかの方法。
４４．選択された抗体が、ＭＰＥ８を含む抗ＭＰＶ抗体である、実施形態１～２９のいずれかの方法。
４５．選択された抗体が、ＭＣＭＶ５３２２Ａ、ＭＣＭＶ３０６８Ａ、ＬＪＰ５３８又はＬＪＰ５３９を含む抗ＣＭＶ抗体である、実施形態１～２９のいずれかの方法。
４６．選択された抗体が、配列番号１６８を含む重鎖及び配列番号１６６を含む軽鎖を含む抗ＥＢＶ抗体である、実施形態１～２９のいずれかの方法。
４７．選択された抗体が、配列番号２４８を含むＣＤＲＨ１、配列番号２４９を含むＣＤＲＨ２、配列番号２５０を含むＣＤＲＨ３、配列番号２５１を含むＣＤＲＬ１、配列番号２５２を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号２５３を含むＣＤＲＬ３を含む抗ＥＢＶ抗体である、実施形態１～２９のいずれかの方法。
４８．選択された抗体が、ＨＳＶ８－Ｎ及びＭＢ６６を含む抗ＨＳＶ抗体である、実施形態１～２９のいずれかの方法。
４９．選択された抗体が、アクトクスマブ又はベズロトクスマブを含む抗クロストリジウム・ディフィシル抗体である、実施形態１～２９のいずれかの方法。
５０．選択された抗体が、インフリキシマブ、アダリムマブ、エタネルセプト、セルトリズマブ又はこれらの承認されたバイオシミラーを含む抗ＴＮＦ抗体である、実施形態１～２９のいずれかの方法。
５１．選択された抗体が、配列番号２５４を含む重鎖及び配列番号２５５を含む軽鎖；配列番号２５６を含むＣＤＲＨ１、配列番号２５７を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号２５８を含むＣＤＲＨ３；配列番号２５９を含むＣＤＲＬ１、配列番号２６０を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号２６１を含むＣＤＲＬ３；配列番号２６２を含むＣＤＲＨ１、配列番号２６３を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号２６４を含むＣＤＲＨ３；配列番号２６５を含むＣＤＲＬ１、配列番号２６６を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号２６７を含むＣＤＲＬ３；又は配列番号２６８を含むＣＤＲＨ１、配列番号２６９を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号２７０を含むＣＤＲＨ３；配列番号２７１を含むＣＤＲＬ１、配列番号２７２を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号２７３を含むＣＤＲＬ３を含む抗ＴＮＦ抗体である、実施形態１～２９又は５０のいずれかの方法。
５２．遺伝子改変が配列番号８７、８８、８９、９０～１７５、２７８～３６６のいずれかを含む配列を利用する、実施形態１～５１のいずれかの方法。
５３．Ｂ細胞が、抗体産生Ｂ細胞、記憶Ｂ細胞、ナイーブＢ細胞、Ｂ１ Ｂ細胞又は周辺帯Ｂ細胞である、実施形態１～５２のいずれかの方法。
５４．実施形態１～５３のいずれか１つの方法に従って改変されたＢ細胞。
５５．Ｂ細胞が、抗体分泌Ｂ細胞、記憶Ｂ細胞、ナイーブＢ細胞、Ｂ１ Ｂ細胞又は周辺帯Ｂ細胞である、実施形態５４のＢ細胞。
５６．抗感染効果を必要とする対象において抗感染効果を提供する方法であって、実施形態５４又は５５のＢ細胞の治療有効量を対象に投与し、それによって抗感染効果を提供することを含む方法。
５７．提供することでワクチン接種の必要を取り除く、実施形態５６の方法。
５８．投与することがワクチン接種プロトコールに取って代わる、実施形態５６又は５７の方法。
５９．対象が免疫抑制されている、実施形態５６～５８のいずれかの方法。
６０．対象が、骨髄移植、造血幹細胞移植又は遺伝子改変造血幹細胞の投与を含む処置レジメンの一部として免疫抑制されている、実施形態５６～５９のいずれかの方法。
６１．抗炎症効果を必要とする対象において抗炎症効果を提供する方法であって、実施形態５４又は５５のＢ細胞の治療有効量を対象に投与し、それによって抗炎症効果を提供することを含む方法。
６２．Ｂ細胞を改変して選択された抗体を発現させるための遺伝子構築物であって、（ｉ）重鎖プロモーター、（ｉｉ）シグナルペプチド、（ｉｉｉ）選択された抗体の完全長軽鎖；（ｉｖ）柔軟なリンカー又はスキッピングエレメント；（ｖ）選択された抗体の重鎖の可変領域；及び（ｖｉ）スプライスジャンクションを含む又はコードする遺伝子構築物。
６３．配列番号１０２～１７５又は２８０～２８９を含む、実施形態６２の遺伝子構築物。
６４．柔軟なリンカーが、選択された抗体の完全長軽鎖と選択された抗体の重鎖の可変領域の間にある、実施形態６２又は６３の遺伝子構築物。
６５．柔軟なリンカーが、配列番号１８０～１８４から選択される、実施形態６２～６４のいずれかの遺伝子構築物。
６６．柔軟なリンカーが、５０～８０アミノ酸を含むＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーである、実施形態６２～６５のいずれかの遺伝子構築物。
６７．柔軟なリンカーが、５７アミノ酸を含むＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーである、実施形態６２～６６のいずれかの遺伝子構築物。
６８．柔軟なリンカーが配列番号１２２である、実施形態６２～６４、６６又は６７のいずれかの遺伝子構築物。
６９．スキッピングエレメントが、選択された抗体の完全長軽鎖と選択された抗体の重鎖の可変領域の間にある、実施形態６２～６８のいずれかの遺伝子構築物。
７０．スキッピングエレメントが自己切断ペプチドである、実施形態６２～６９のいずれかの遺伝子構築物。
７１．自己切断ペプチドが配列番号１７６～１７９から選択される、実施形態７０の遺伝子構築物。
７２．スキッピングエレメントが内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）である、実施形態６２～６９のいずれかの遺伝子構築物。
７３．重鎖プロモーターが配列番号１１１及び１２８から選択される、実施形態６２～７２のいずれかの遺伝子構築物。
７４．重鎖プロモーターがＩｇＶＨ１－６９又はＪ５５８Ｈ１０である、実施形態６２～７３のいずれかの遺伝子構築物。
７５．シグナルペプチドが配列番号１１８、１３４及び１８５～１９４から選択される、実施形態６２～７４のいずれかの遺伝子構築物。
７６．シグナルペプチドが、ヒトＩｇＨ重鎖又はヒトＩｇＬ軽鎖に由来する、実施形態６２～７５のいずれかの遺伝子構築物。
７７．相同性アームを含む、実施形態６２～７６のいずれかの遺伝子構築物。
７８．相同性アームが、配列番号９０～１０１、１１０、１２５、１２７、１４０、１４２、１４３、１５３、１７０、１７１、１７３、１７４、２７８又は２７９を含む、実施形態７７の遺伝子構築物。
７９．タグをコードする、実施形態６２～７８のいずれかの遺伝子構築物。
８０．タグが、ＳＴＲＥＰＴＡＧ（登録商標）、ＳＴＲＥＰ（登録商標）タグＩＩ、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、Ａｖｉタグ、カルモジュリンタグ、ポリグルタメートタグ、ＨＡタグ、Ｍｙｃタグ、Ｎｕｓタグ、Ｓタグ、ＳＢＰタグ、Ｓｏｆタグ１、Ｓｏｆタグ３又はＶ５タグを含む、実施形態７９の遺伝子構築物。
８１．タグが配列番号１２２又は１９５～２０４を含む、実施形態７９又は８０の遺伝子構築物。
８２．選択された抗体が、パリビズマブ、ＡＢ１１２８又はａｂ２０７４５を含む抗ＲＳＶ抗体である、実施形態６２～８１のいずれかの遺伝子構築物。
８３．選択された抗体が、配列番号１３８を含む重鎖及び配列番号１３６を含む軽鎖を含むパリビズマブ；配列番号１３８を含む重鎖及び配列番号２０５を含む軽鎖を含むパリビズマブ；配列番号１２３を含む重鎖及び配列番号１２０を含む軽鎖を含む抗ＲＳＶ抗体；又は配列番号１２３を含む重鎖及び配列番号２０６を含む軽鎖を含む抗ＲＳＶ抗体である、実施形態６２～８２のいずれかの遺伝子構築物。
８４．選択された抗体が、配列番号２０７を含むＣＤＲＨ１、配列番号２０８を含むＣＤＲＨ２、配列番号２０９を含むＣＤＲＨ３；配列番号２１０を含むＣＤＲＬ１、配列番号２１１を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号２１２を含むＣＤＲＬ３を含む抗ＲＳＶ抗体である、実施形態６２～８２のいずれかの遺伝子構築物。
８５．選択された抗体が、１０Ｅ８、ＶＲＣ０１、ａｂ１８６３３又は３９／５．４Ａを含む抗ＨＩＶ抗体である、実施形態６２～８１のいずれかの遺伝子構築物。
８６．選択された抗体が、配列番号１５０を含む重鎖及び配列番号１４９を含む軽鎖を含む抗ＨＩＶ抗体である、実施形態６２～８１又は８５のいずれかの遺伝子構築物。
８７．選択された抗体が、配列番号２１３を含むＣＤＲＨ１、配列番号２１４を含むＣＤＲＨ２、配列番号２１５を含むＣＤＲＨ３、配列番号２１６を含むＣＤＲＬ１、配列番号２１７を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号２１８を含むＣＤＲＬ３又は配列番号２１９を含むＣＤＲＨ１、配列番号２２０を含むＣＤＲＨ２、配列番号２２１を含むＣＤＲＨ３、ＱＹＧＳを含むＣＤＲＬ１、ＳＧＳを含むＣＤＲＬ２、及び配列番号２２２を含むＣＤＲＬ３を含む抗ＨＩＶ抗体である、実施形態６２～８１又は８５のいずれかの遺伝子構築物。
８８．選択された抗体が、抗体５５、ＤＢ２－３、ａｂ１５５０４２又はａｂ８０９１４を含む抗デングウイルス抗体である、実施形態６２～８１のいずれかの遺伝子構築物。
８９．選択された抗体が、配列番号２２３を含むＣＤＲＨ１、配列番号２２４を含むＣＤＲＨ２、配列番号２２５を含むＣＤＲＨ３；配列番号２２６を含むＣＤＲＬ１、配列番号２２７を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号２２８を含むＣＤＲＫＬ３又は配列番号２２９を含むＣＤＲＨ１、配列番号２３０を含むＣＤＲＨ２、配列番号２３１を含むＣＤＲＨ３、配列番号２３２を含むＣＤＲＬ１、配列番号２３３を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号２３４を含むＣＤＲＬ３を含む抗デングウイルス抗体である、実施形態６２～８１又は８８のいずれかの遺伝子構築物。
９０．選択された抗体が、配列番号２３５を含む重鎖及び配列番号２３６を含む軽鎖を含む抗百日咳抗体である、実施形態６２～８１のいずれかの遺伝子構築物。
９１．選択された抗体が、ＭＡＢ８６９４又はＣ７－５０を含む抗Ｃ型肝炎抗体である、実施形態６２～８１のいずれかの遺伝子構築物。
９２．選択された抗体が、配列番号２３７を含むＣＤＲＨ１、配列番号２３８を含むＣＤＲＨ２、配列番号２３９を含むＣＤＲＨ３、配列番号２４０を含むＣＤＲＬ１、配列番号２４１を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号２４２を含むＣＤＲＬ３を含む抗Ｃ型肝炎抗体である、実施形態６２～８１又は９１のいずれかの遺伝子構築物。
９３．選択された抗体が、Ｃ１０２を含む抗インフルエンザウイルス抗体である、実施形態６２～８１のいずれかの遺伝子構築物。
９４．選択された抗体が、配列番号１５９を含む重鎖及び配列番号１５８を含む軽鎖を含む抗インフルエンザウイルス抗体である、実施形態６２～８１又は９３のいずれかの遺伝子構築物。
９５．選択された抗体が、配列番号２４３を含むＣＤＲＨ１、配列番号２４４を含むＣＤＲＨ２、配列番号２４５を含むＣＤＲＨ３、配列番号２４６を含むＣＤＲＬ１、ＫＴＳを含むＣＤＲＬ２、及び配列番号２４７を含むＣＤＲＬ３を含む抗インフルエンザウイルス抗体である、実施形態６２～８１又は９３のいずれかの遺伝子構築物。
９６．選択された抗体が、ＭＰＥ８を含む抗ＭＰＶ抗体である、実施形態６２～８１のいずれかの遺伝子構築物。
９７．選択された抗体が、ＭＣＭＶ５３２２Ａ、ＭＣＭＶ３０６８Ａ、ＬＪＰ５３８又はＬＪＰ５３９を含む抗ＣＭＶ抗体である、実施形態６２～８１のいずれかの遺伝子構築物。
９８．選択された抗体が、配列番号１６８を含む重鎖及び配列番号１６６を含む軽鎖を含む抗ＥＢＶ抗体である、実施形態６２～８１のいずれかの遺伝子構築物。
９９．選択された抗体が、配列番号２４８を含むＣＤＲＨ１、配列番号２４９を含むＣＤＲＨ２、配列番号２５０を含むＣＤＲＨ３、配列番号２５１を含むＣＤＲＬ１、配列番号２５２を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号２５３を含むＣＤＲＬ３を含む抗ＥＢＶ抗体である、実施形態６２～８１のいずれかの遺伝子構築物。
１００．選択された抗体が、ＨＳＶ８－Ｎ及びＭＢ６６を含む抗ＨＳＶ抗体である、実施形態６２～８１のいずれかの遺伝子構築物。
１０１．選択された抗体が、アクトクスマブ又はベズロトクスマブを含む抗クロストリジウム・ディフィシル抗体である、実施形態６２～８１のいずれかの遺伝子構築物。
１０２．選択された抗体が、インフリキシマブ、アダリムマブ、エタネルセプト、セルトリズマブ又はこれらの承認されたバイオシミラーを含む抗ＴＮＦ抗体である、実施形態６２～８１のいずれかの遺伝子構築物。
１０３．選択された抗体が、配列番号２５４を含む重鎖及び配列番号２５５を含む軽鎖；配列番号２５６を含むＣＤＲＨ１、配列番号２５７を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号２５８を含むＣＤＲＨ３；配列番号２５９を含むＣＤＲＬ１、配列番号２６０を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号２６１を含むＣＤＲＬ３；配列番号２６２を含むＣＤＲＨ１、配列番号２６３を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号２６４を含むＣＤＲＨ３；配列番号２６５を含むＣＤＲＬ１、配列番号２６６を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号２６７を含むＣＤＲＬ３；又は配列番号２６８を含むＣＤＲＨ１、配列番号２６９を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号２７０を含むＣＤＲＨ３；配列番号２７１を含むＣＤＲＬ１、配列番号２７２を含むＣＤＲＬ２、及び配列番号２７３を含むＣＤＲＬ３を含む抗ＴＮＦ抗体である、実施形態６２～８１又は１０２のいずれかの遺伝子構築物。
１０４．実施形態６２～１０３のいずれかの遺伝子構築物及び配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４を標的にするｇＲＮＡを含む、Ｂ細胞を遺伝子改変するためのキット。
１０５．ｇＲＮＡが、配列番号８７、８８、８９及び２９０～３６６の１つ以上から選択される実施形態１０４のキット。
１０６．ヌクレアーゼをさらに含む、実施形態１０４又は１０５のキット。
１０７．ヌクレアーゼがＣａｓ９又はＣｐｆ１である、実施形態１０６のキット。
１０８．ナノ粒子又はアデノ随伴ウイルスベクターをさらに含む、実施形態１０４～１０７のいずれかのキット。
１０９．ｇＲＮＡ及びヌクレアーゼがナノ粒子と会合している、実施形態１０４～１０８のいずれかのキット。
１１０．遺伝子構築物がアデノ随伴ウイルスベクターの一部である、実施形態１０４～１０９のいずれかのキット。

【実施例】

【0161】

［実施例１］ワクチンなしで呼吸器合胞体ウイルス感染に対する生涯の防御を提供する。呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、幼い子供、特に、慢性肺疾患、先天性心疾患又は早産の幼児における重篤な呼吸器疾患の主因である。液性免疫はＲＳＶに対する有効な防御を媒介することができ、組換え抗体Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）（Ｍｅｄｌｍｍｕｎｅ、Ｉｎｃ．）／パリビズマブの治療効果により実証されている。しかし、自然感染も以前のワクチン治験も、ＲＳＶに対する完全防御免疫応答を誘導できないでいた。

【0162】

疾患に対してワクチン接種するのが困難なＲＳＶなどでは、初代Ｂ細胞を操作して所望の治療抗体の発現を誘発させることによりワクチン接種を迂回することは極めて魅力的である。免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座は極めて大きく、多様で、広範なゲノム組換え及び編集を受けやすい。さらに、膜と分泌型の両方を産生するための免疫グロブリン遺伝子の転写は、調節ＤＮＡエレメントによるｍＲＮＡスプライシングの調節及びポリアデニル化を利用している。この複雑さにより、リンパ球の細胞工学のための従来のアプローチである、ウイルス形質導入は、治療Ｂ細胞を産生するには技術的に実行不可能である。

【0163】

特定の実施形態は、シングルヒット免疫遺伝子操作による初代Ｂ細胞抗体特異性の迅速及び選択的再プログラミングのためのプラットフォームを含む。このプラットフォームは、初代Ｂ細胞におけるマイクロホモロジー媒介末端結合ＤＮＡ修復経路の高活性を利用して、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡリボタンパク質によるＤＮＡ切断の作出後完全合成ハイブリッド二本鎖／一本鎖ＤＮＡ鋳型を挿入する。このアプローチのキーとなるのは、内因性調節エレメントの保存であり、これにより表面結合及び分泌抗体発現の天然の制御が可能になる。さらに、戦略はＲＳＶに制限されない。単回採血とそれに続く数日後の細胞注入だけで、実質的にいかなる病原体に対しても防御する抗体を発現することが可能になる。

【0164】

材料及び方法。ｓｇＲＮＡの設計。マウス及びヒトＩｇＨ遺伝子座におけるイントロン配列を標的にするｓｇＲＮＡはＣｒｉｓｐＲＧｏｌｄ（ｃｒｉｓｐｒｇｏｌｄ．ｍｄｃ－ｂｅｒｌｉｎ．ｄｅ）を使用して設計し、２’－Ｏ－メチル類似物及び３’ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を最初の３つの５’及び３’終端ＲＮＡ残基で組み込む合成の形態で産生した（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）。ゲノムターゲティング配列は以下の通りである：

【0165】

【化7】

【0166】

鋳型配列の設計及び組立
ヒト：抗体構築物は、ＩｇＶＨ１－６９重鎖プロモーター領域（配列番号１１１）、パリビズマブの完全長コドン最適化軽鎖（配列番号１１３（ヌクレオチド）及び配列番号１２０（アミノ酸））、ＳｔｒｅｐタグＩＩモチーフの３直列コピーを含有する５７アミノ酸グリシン－セリンリンカー（配列番号１１６（ヌクレオチド）及び配列番号１２２（アミノ酸））、パリビズマブ重鎖のコドン最適化可変領域（配列番号１１７（ヌクレオチド）及び配列番号１２３（アミノ酸））、及びヒトＩｇＨＪ１遺伝子セグメント由来の６０ｂｐの隣接配列のあるスプライスジャンクション（配列番号１２４）を含む。

【0167】

マウス：ｍＣｈｅｒｒｙ鋳型は、Ｊ５５５８Ｈ１０重鎖プロモーター、完全コドン最適化ｍＣｈｅｒｒｙオープンリーディングフレーム及びｓｖ４０ポリアデニル化部位を含む。抗体構築物は、Ｊ５５５８Ｈ１０重鎖プロモーター（配列番号１２８、Ｖ．Ａ Ｌｏｖｅら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０００年）、完全長コドン最適化抗体軽鎖（配列番号１３０（ヌクレオチド）及び配列番号１３５（アミノ酸））、ＳｔｒｅｐタグＩＩ配列の２直列コピーを含有する５７アミノ酸グリシン－セリンリンカー（配列番号１１６（ヌクレオチド）及び配列番号１２２（アミノ酸））、重抗体鎖のコドン最適化可変領域（配列番号１３３（ヌクレオチド）及び配列番号１３８（アミノ酸））、及びマウスＩｇＨＪ３遺伝子セグメント由来の６０ｂｐの隣接配列のあるスプライスジャンクション（配列番号１３９）を含む。

【0168】

ステッチングオリゴヌクレオチド（すなわち、スプライシングオリゴヌクレオチド）のアニーリング。パム末端及びパム近位非標的ＤＮＡ鎖に３６ｂｐの相補性並びに挿入された鋳型に５０～１００ｂｐの相補性のあるステッチングオリゴヌクレオチドは合成的に産生され、使用前にＤＮＡ鋳型（例えば、配列番号９６～１０１）にプレアニールされた。図１５に示されるように、スプライシングオリゴヌクレオチドは「相同性ステッチ」を提供できる。

【0169】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスベクター鋳型送達。ＡＡＶウイルスベクターは、ＭＮＤプロモーター、完全コドン最適化ｍＣｈｅｒｒｙオープンリーディングフレーム及び２つのマウスｓｇＲＮＡ認識部位又は４００ｂｐの相同性により隣接しているｓｖ４０ポリアデニル化部位を含有していた。ＡＡＶビリオンはＡＶＶ６ウイルスカプシドを持つ偽型の２９３Ｔ細胞において産生され、サクロース勾配遠心分離により精製され－８０℃で保存した。鋳型ＤＮＡのウイルス送達では、濃縮されたＡＡＶウイルスは、電気穿孔１２時間前に全培養容積の１０％の最終容積に添加された。

【0170】

マウスＢ細胞及び電気穿孔。基本Ｂ細胞培地は、１０％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５５μＭのβメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、及び示される無抗生物質ステップを除いて、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンプラス１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を備えたＲＰＭＩ培地を含んだ。

【0171】

Ｂ細胞は、磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いたネガティブ選択により脾臓及びリンパ節から単離し、１００ｎｇ／ｍｌの無組換えキャリアーＨＡタグ付きマウスＣＤ４０Ｌ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、１００ｎｇ／ｍｌの抗ＨＡ抗体（クローン５４３８５１、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）及び４ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ－４（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充したＢ細胞培地において２×１０^６／ｍｌで２４時間培養した。次に、Ｂ細胞を、以下の通りＮｅｏｎトランスフェクションシステム及び１０μｌチップを使用して電気穿孔した。Ｃａｓ９タンパク質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び合成ｓｇＲＮＡ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）を、３μｇのＣａｓ９／９００ｎｇのｓｇＲＮＡの比で混合し、室温で少なくとも１０分間インキュベートした。Ｂ細胞はＰＢＳで洗浄し、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ及び予め組み立てられたＤＮＡ鋳型と一緒に、最終密度２．５×１０^７細胞／ｍｌでＮｅｏｎバッファーＴに懸濁した。細胞は電気穿孔し（１６７５Ｖ、１０ミリ秒、３パルス）、直ちに予め温めた無抗生物質培地に分注した。

【0172】

細胞拡大では、Ｂ細胞は、２０ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ－２１の存在下で、照射（８０ｇｙ）３Ｔ３－ＣＤ４０Ｌフィーダー細胞と共培養された。

【0173】

分解によるインデルのトラッキング（ＴＩＤＥ）によるｓｇＲＮＡ活性の評価。全ゲノムＤＮＡは、電気穿孔後３～５日目にモック及びＣａｓ９処置細胞から単離した。切断部位に隣接する５００～６００ｂｐ領域は、以下のオリゴ：

【0174】

【化8】

を使用してＰＣＲにより増幅した。

【0175】

結果。結果は図１８Ａ～１８Ｃ、図２２Ａ＆２２Ｂ、図２３Ｂ～２３Ｅ及び図２４Ａ～２４Ｃに示されている。図１８Ａ、１８Ｂ及び１８Ｃは、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡリボ核タンパク質を用いた細胞の電気穿孔後の標的ＩｇＨ遺伝子座でのそれぞれマウスＢ細胞株Ａ２０、初代マウスＢ細胞及びヒトＢ細胞株ＲＡＭＯＳの成功した切断を実証している。図２２Ａ及び２２Ｂは、初代マウスＢ細胞のＩｇＨ遺伝子座中へのｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質レポーターの挿入を描いている。図２３Ｂ及び２３Ｃは、Ａ２０マウスＢ細胞株（図２３Ｂ）及びＲＡＭＯＳヒトＢ細胞株（図２３Ｃ）中への部分的抗体カセットの挿入後の抗ＲＳＶ抗体の表面発現を実証している。図２３Ｄ及び２３Ｅは、Ａ２０マウスＢ細胞株（図２３Ｄ）及びＲＡＭＯＳヒトＢ細胞株（図２３Ｅ）中への部分的抗体カセットの挿入後の抗ＲＳＶ抗体の分泌を実証している。図２４Ａは、最初の（左パネル）及びインビトロでの濃縮及び拡大後（右パネル）の、初代マウスＢ細胞中への部分的抗体カセットの挿入後の抗ＲＳＶ抗体の表面発現を実証している。図２４Ｂは、初代マウスＢ細胞株中への部分的抗体カセットの挿入後の抗ＲＳＶ抗体の分泌を実証している。図２４Ｃは、操作されたＢ細胞のインビトロ増殖ポテンシャルを示している。

【0176】

［実施例２］本実施例の目標は、ＩｇＨ遺伝子座のゲノム操作を通じて分泌されたＩｇ及び表面Ｉｇ発現の自然な制御を維持する限定された特異性を持つ遺伝子改変Ｂ細胞を産生することであった。Ｂ細胞におけるＩｇＨ遺伝子座は、Ｂ細胞に存在する高度に可変的な配列に起因して、ゲノム操作のために標的にするのが困難な領域である。Ｂ細胞発生により、１メガベースを超えるＤＮＡ上でＶ、Ｄ及びＪエレメントが組み換えられて、抗体多様性にとって必須のＶＤＪ可変領域が生成される。後にＢ細胞個体発生過程において、異なる定常領域間のクラススイッチにより類似する配列範囲にわたりＤＮＡが失われる（Ｒｅｖｉｅｗｅｄ ｉｎ Ｗａｔｓｏｎら、（２０１７年）．Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３８（７）：４５９～４７０頁）。

【0177】

この配列多様性により、抗体コード領域を直接標的にするのは実行不可能である。しかし、すべてのＢ細胞には、最後のＪ遺伝子セグメントとクラススイッチに関与するスイッチ領域の間に小さなＤＮＡ領域が存在する。この普遍的な標的は、その弱いプロモーターにもかかわらず、ＩｇＨ遺伝子の高レベルの発現を協働して駆動するいくつかの強力なエンハンサーエレメントの１つである、重要なイントロンＥμエンハンサーを含有する。これらのエンハンサーの活性は、一部Ｅμエンハンサーに対するプロモーターの近接により調節されており、組換えＶＤＪセグメントとＥμエンハンサーの間に導入遺伝子を挿入するとＶＤＪ転写を完全に遮断することができる（Ｄｅｌｐｙら、（２００２年）．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６９（１２）：６８７５～６８８２頁）。この理由で、本実施例で使用される方法は、新しい抗体カセットを挿入するためにＥμエンハンサーの上流の領域を標的にした（図２６Ａ）。この領域を標的にすることにより、挿入されたｅｍＡｂ遺伝子は天然の（しかし、挿入された）ＩｇＨプロモーターが駆動させることができ、免疫グロブリン発現の自然な制御を最大にする。

【0178】

ワンヒット挿入を可能にし、オフターゲット相互作用を最小限に抑えるため、ｅｍＡｂ構築物は一本鎖融合物として発現された。この融合物は、一本鎖Ｆ（ａｂ）断片について記載されてきた（Ｋｏｅｒｂｅｒら、（２０１５年）．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４２７（２）：５７６～５８６頁）５７アミノ酸グリシン－セリンリンカーで重鎖の可変領域に連結された、完全軽鎖配列からなる（図２６Ａ）。このリンカーは、遺伝子改変細胞の検出及び濃縮を促進するためＳｔｒｅｐタグＩＩモチーフの３直列反復を含有する（Ｓｃｈｍｉｄｔ＆Ｓｋｅｒｒａ（２００７年）．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ２（６）：１５２８～１５３５頁）。軽鎖と重鎖を物理的に連結すると、挿入されたｅｍＡｂと内因性軽鎖の間の誤対合の可能性が最小限に抑えられる。最適化されたスプライスジャンクションはｅｍＡｂを下流内因性ＩｇＨ定常領域にスプライスさせる。これによりｅｍＡｂは重鎖アイソタイプクラスのいずれかとして発現される。

【0179】

戦略はＲＡＭＯＳヒトＢ細胞株において試験された。このバーキットリンパ腫由来Ｂ細胞株は、ラムダ軽鎖と対合した表面及び分泌型のＩｇＭを天然に発現する。これらの実験では、パリビズマブ由来の操作されたαＲＳＶ－ｅｍＡｂの発現は、単量体ＲＳＶ－Ｆタンパク質及びリンカー中のＳｔｒｅｐタグＩＩモチーフに対して高親和性の改変ストレプトアビジンであるストレプトアクチンを使用して検出した。αＲＳＶ－ｅｍＡｂ遺伝子改変ＲＡＭＯＳ細胞は、操作されたＲＳＶ特異的抗体を発現し、この抗体は細胞の表面で（図２６Ｂ）及び上澄み中分泌型として（図２６Ｃ）検出することができた。ｅｍＡｂ ＢＣＲがＢＣＲシグナル伝達にとって重要な二次タンパク質複合体と会合することを確かめるため、ＲＡＭＯＳ細胞を多量体化ＲＳＶ－Ｆ抗原での刺激に晒した。αＲＳＶ－ｅｍＡｂ操作されたしかし対照ではない細胞は、タンパク質抗原に応答して急速で持続したカルシウムシグナル伝達を示した（図２６Ｄ）。これらのデータは、ｅｍＡｂ操作アプローチの実行可能性を確認するのに役立った。

【0180】

次に、ヒト初代Ｂ細胞を、拡大及び分化の多段階工程を使用して遺伝子改変した（図２７Ａ）。予め複合体化したガイドＲＮＡとＣａｓ９の電気穿孔により、ゲノムＤＮＡは高度に効率的に切断され、複数の独立したドナーにわたり分析された標的対立遺伝子の７０％においてこの領域に不完全な修復が生じた（図２７Ｂ）。ｓｇＲＮＡ標的部位はヒトでは強力に保存されており、報告されている一塩基多型で１％を超える頻度で報告されたものはなかった（図２７Ｃ）。ＡＡＶ送達αＲＳＶ－ｅｍＡｂカセットの添加によりヒトＢ細胞はＲＳＶ－Ｆタンパク質に結合するように効率的に再プログラムされた（図２７Ｄ）。注目すべきことに、ｅｍＡｂ Ｂ細胞は試験されたすべてのヒトドナーから首尾よく産生されており、平均操作率は２４％であった（図２７Ｅ）。ｅｍＡｂ産生中のインビトロ培養及び分化は抗体分泌ポテンシャルを増加した。２日目にプライミングされた細胞は、高レベルのＣＤ１９、並びにわずかな量のプラズマ細胞マーカーＣＤ１３８、ＣＤ２７及びＣＤ１３８を発現し、ＣＤ１９のレベルがもっと低く、並びにＣＤ３８、ＣＤ２７及びＣＤ１３８が増加した１８日目の細胞とは対照的であった（図２７Ｆ）。細胞表面マーカーのこれらの変化に対応して、分化したｅｍＡｂ操作Ｂ細胞は、相当量の標的抗体を分泌する（図２７Ｇ）。まとめると、これらのデータは、初代Ｂ細胞を急速に効率的に操作して特定の防御抗体を産生させる能力を実証している。

【0181】

プラットフォームの柔軟な側面を実証するため、抗ＨＩＶ標的ＶＲＣ０１、ＥＢＶ標的ＡＭＭ０１及びインフルエンザＨＡ－幹標的ＭＥＤＩ８８５２を含む、３つの追加の広域中和抗ウイルス抗体由来のｅｍＡｂカセットを試験した。初代Ｂ細胞は４つすべての構築物を用いて効率的に再プログラムされ、構築物はカッパ（パリビズマブ、ＶＲＣ０１、ＭＥＤｉ８８５２）とラムダ（ＡＭＭ０１）軽鎖の両方を持つ抗体を含んでいた（図２８）。これらのデータは、ｅｍＡｂプラットフォームの柔軟で広く適用可能な性質を実証している。

【0182】

内因性Ｉｇ重鎖の産生を遮断することは、ｅｍＡｂの産生を最大化し、遺伝子改変細胞からの未知の内因性抗体の産生の可能性を最小化するために重要である。ＲＡＭＯＳ Ｂ細胞株は、ラムダ軽鎖と対合したＩｇＨを内在的に発現する。これらの細胞をカッパ軽鎖に連結したαＲＳＶ－ｅｍＡｂを用いて操作すると、ＩｇＨ発現の有効な手段としての表面ラムダ軽鎖発現の使用が可能になる。さらに、ＲＡＭＯＳ細胞は、いかなるｅｍＡｂ挿入も必要性によって生産的対立遺伝子中であるように、ｃ－ｍｙｃ転座を受けて、１つのＩｇＨ対立遺伝子を破壊している（図２９Ａ）。インプットＲＡＭＯＳ細胞は表面上に高レベルのラムダ軽鎖を発現し、αＲＳＶ－ｅｍＡｂを発現している細胞はほぼ完全にラムダ発現を失っている（図２９Ｂ）。これらのデータは、生産的対立遺伝子上のｅｍＡｂ挿入は内因性ＩｇＨの発現を有効に遮断できることを示している。ほぼすべての初代Ｂ細胞では、１つのＩｇＨ対立遺伝子は生産的ＶＤＪ再編成を有し、もう一方の対立遺伝子はＶＤＪ組換えを受けていない、又は非生産的に組み換えられた。しかし、これらの対立遺伝子は両方がｅｍＡｂ挿入のための潜在的な部位を有している（図２９Ｃ）。ｅｍＡｂ挿入の効果を試験するため、精製されたラムダ軽鎖発現初代Ｂ細胞をαＲＳＶ－ｅｍＡｂを用いて遺伝子改変した。インプット細胞は表面上でラムダ軽鎖と対合した内因性抗体を発現し続けた。これとは対照的に、αＲＳＶ－ｅｍＡｂ操作Ｂ細胞の半分はラムダ軽鎖発現を失った（図２９Ｄ）。ＲＡＭＯＳ及び初代Ｂ細胞で見られる差示的発現パターンは、ｅｍＡｂ挿入が、生産的対立遺伝子中に挿入された場合は内因性ＩｇＨ発現を遮断できることを示唆している。表面軽鎖の差示的発現は、ｅｍＡｂ構築物を排他的に発現する細胞の精製のための手段である。代わりに、いずれかの対立遺伝子への挿入の可能性は、操作のための抗ウイルス記憶Ｂ細胞の最初のプールの選択により、又はそれぞれの対立遺伝子上への異なるカセットの挿入により、二重抗体発現ｅｍＡｂ細胞の産生の可能性を提供する。

【0183】

Ｂ細胞を操作する能力を実証したので、次にウイルス感染のマウスモデルにおいて細胞の防御能力を確かめた。マウスｅｍＡｂ Ｂ細胞は、プライミング、電気穿孔＋ｅｍＡｂカセット送達、及びヒト初代Ｂ細胞において使用された拡大に類似する拡大を使用して産生された（図３０Ａ）。予め複合体化したガイドＲＮＡとＣａｓ９切断と組み合わせた電気穿孔は高度に効率的であり、分析されたＤＮＡの８０％においてこの領域に不完全な修復が生じた（図３０Ｂ）。ＡＡＶを介したマウスαＲＳＶ－ｅｍＡｂカセットの送達はマウスＢ細胞を再現性よく改変し、マウスＢ細胞の８～２４％がＲＳＶ－Ｆと結合した（図３０Ｃ、３０Ｄ）。細胞の１～７％における挿入も、ＡＡＶの代わりに短い相同性領域を含有する二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を使用して達成され（図３０Ｃ、３０Ｄ（実施例１も参照））、純粋に合成的な成分を使用するＢ細胞のｅｍＡｂ操作の可能性を提供する。分泌された操作された抗体の高力価も両方の方法により産生された培養上澄みにおいて検出できた（図３０Ｅ）。

【0184】

抗ウイルス防御の可能性を試験するため、１．５×１０^７遺伝子改変マウスＢ細胞を野生型Ｂａｌｂｃ／ｂｙＪマウス中に注入し、続いて採血及びＲＳＶ負荷を行った（図３１Ａ）。ＲＳＶ特異的抗体及び遺伝子改変Ｂ細胞が、遺伝子改変マウスＢ細胞の移入の６日後血液中に存在していた（図３１Ｂ、３１Ｃ）。重要なことに、遺伝子改変マウスＢ細胞を受けたマウスはＲＳＶ感染に対してほぼ完全に防御されていた（図３１Ｄ）。この防御は、感染２日前にパリビズマブの注射により提供される防御に近づいた（図３１Ｄ）。ＲＳＶ及びインフルエンザを標的にする混合ヒトｅｍＡｂ細胞のＮＯＤ－ｓｃｉｄＩＬ２Ｒガンマヌル（ＮＳＧ）マウスへの移入により、両方のウイルスを標的にする抗体の血清力価が生じる（図３２Ａ、３２Ｂ）。これらの結果は、本明細書に開示される遺伝子改変Ｂ細胞がウイルス感染に対して防御することを示している。

【0185】

方法。一本鎖抗体鋳型配列の設計。ヒト：抗体構築物は、ＩｇＶＨ１－６９重鎖プロモーター領域（配列番号１１１）、完全長抗体軽鎖（例えば、配列番号１１３、１４５、１５４及び１６１（ヌクレオチド）並びに配列番号１１９、１４８、１５７及び１６５（アミノ酸））、ＳｔｒｅｐタグＩＩモチーフの３直列コピーを含有する５７アミノ酸グリシン－セリンリンカー（配列番号１１６（ヌクレオチド）及び配列番号１２２（アミノ酸））、重鎖の可変領域（例えば、配列番号１１７、１４７、１５６及び１６４（ヌクレオチド）並びに配列番号１２３、１５０、１５９及び１６８（アミノ酸））、及びＩｇＨＪ可変領域を適合させることに由来する６０塩基対の隣接配列を有するスプライスジャンクション（例えば、配列番号１２４及び１５１）を含んでいた。

【0186】

マウス：抗体構築物は、Ｊ５５５８Ｈ１０重鎖プロモーター（配列番号１２８、Ｖ．Ａ Ｌｏｖｅら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０００年）、完全長コドン最適化抗体軽鎖（例えば、配列番号１３０（ヌクレオチド）及び配列番号１３５（アミノ酸））、ＳｔｒｅｐタグＩＩモチーフの３直列コピーを含有する５７アミノ酸グリシン－セリンリンカー（配列番号１１６（ヌクレオチド）及び配列番号１２２（アミノ酸））、重抗体鎖のコドン最適化可変領域（配列番号１３３（ヌクレオチド）及び配列番号１３８（アミノ酸））、及びマウスＩｇＨＪ３遺伝子セグメント由来の６０塩基対の隣接配列を有するスプライスジャンクション（例えば、配列番号１３９）を含んでいた。

【0187】

例示的抗体構築物の完全配列は図２５Ｂ～２５Ｉで入手可能である。

【0188】

組換えＡＡＶベクターの産生。ＡＡＶベクターは、ＰＥＩを使用するＨＥＫ２３９Ｔ細胞中へのＡＡＶベクター、セロタイプ６カプシド及びアデノウイルスヘルパープラスミド（ｐＨｅｌｐｅｒ）三重トランスフェクションにより生成した。トランスフェクション後２４時間で、培地は無血清ＤＭＥＭに交換し、７２時間後細胞を収集し、凍結融解により溶解し、ベンゾナーゼ処理し、イオジキサノール勾配上で精製し、続いてＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５カラム（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してＰＢＳ中に濃縮した（Ｃｈｏｉら、（２００７年）．Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｈａｐｔｅｒ １６：Ｕｎｉｔ １６ ２５）。ウイルスストックの力価は、ＡＡＶゲノムのｑＰＣＲにより決定し、範囲はマイクロリットルあたり５×１０^１０～１×１０^１２に及んだ（Ａｕｒｎｈａｍｍｅｒら、（２０１２年）．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３（１）：１８～２８頁）。

【0189】

マウスｄｓＤＮＡ ｅｍＡｂ鋳型の産生。

【0190】

αＲＳＶ－ｅｍＡｂ鋳型を増幅し、短い相同性領域は以下の通り改変ＤＮＡオリゴ：
フォワードプライマー：（太字の５’リン酸、マウスゲノム相同性領域を含有する）

【0191】

【化9】

リバースプライマー（太字のホスホロチオエート安定化ＤＮＡ結合（^＊）マウスゲノム相同性領域を含有する）

【0192】

【化10】

により付加し、ｄｓＤＮＡ鋳型はＰＣＲにより増幅し、ｍｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲクリーンアップカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し濃縮した。

【0193】

細胞株。３Ｔ３－ｍｓＣＤ４０Ｌは、ＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ＡＩＤＳ、ＮＩＡＩＤ、ＮＩＨ：Ｃａｔ＃１２５３５のＤｒ．Ｍａｒｋ Ｃｏｎｎｏｒｓから入手した。３Ｔ３は、１０％のウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンプラス１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、及びＧ４１８（３５０μｇ／ｍＬ）を備えたＤＭＥＭ培地で培養した。

【0194】

ＲＡＭＯＳ細胞はＡＴＣＣ（ＣＲＬ－１５９６（商標））から入手した。ＲＡＭＯＳ細胞は、１０％のウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）及び１００Ｕ／ｍｌのペニシリンプラス１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を備えたＲＰＭＩ培地で培養した。

【0195】

マウスＢ細胞培養及び電気穿孔。基本Ｂ細胞培地は、１０％のウシ胎仔血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、５５μＭのベータメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）及び示されるように無抗生物質ステップを除いて、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンプラス１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を備えたＲＰＭＩ培地を含んでいた。

【0196】

Ｂ細胞は、磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いたネガティブ選択により脾臓及びリンパ節から単離し、１００ｎｇ／ｍｌの無組換えキャリアーＨＡタグ付きマウスＣＤ４０Ｌ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、１００ｎｇ／ｍｌの抗ＨＡ抗体（クローン５４３８５１、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）及び４ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ－４（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充したＢ細胞培地において２×１０^６／ｍｌで２４時間培養した。次に、Ｂ細胞を、以下の通りＮｅｏｎトランスフェクションシステムを使用して電気穿孔した。Ｃａｓ９タンパク質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び合成ｓｇＲＮＡ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）を、１μｇのＣａｓ９対３００ｎｇのｓｇＲＮＡの比で混合し、室温で少なくとも１０分間インキュベートした。Ｂ細胞はＰＢＳで洗浄し、１２μｇのＣａｓ９ ＲＮＰ／１０^８細胞と一緒に、最終密度２．５×１０^７細胞／ｍｌでＮｅｏｎバッファーＴに懸濁した。ｄｓＤＮＡ条件では、７．５μｇのｄｓＤＮＡ鋳型／１０^６細胞も電気穿孔に含めた。細胞は電気穿孔し（１６７５Ｖ、１０ミリ秒、３パルス）、直ちに予め温めた無抗生物質培地に分注した。ＡＡＶ条件では、ＰＢＳに濃縮したＡＡＶは１５％の最終培養容積まで添加した。電気穿孔後、Ｂ細胞は、１００ｎｇ／ｍｌの無組換えキャリアーＨＡタグ付きマウスＣＤ４０Ｌ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、１００ｎｇ／ｍｌの抗ＨＡ抗体（クローン５４３８５１、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、４ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ－４（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）及び２０ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ－２１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を補充したＢ細胞培地を用いてさらに４８時間拡大した。二次拡大では、Ｂ細胞は、２０ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ－２１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）の存在下で照射（８０ｇｙ）ＮＩＨ ３Ｔ３－ＣＤ４０Ｌフィーダー細胞と共培養した。

【0197】

ヒトＢ細胞培養及び電気穿孔。ヒトＢ細胞培養（ｈＢＣＭ）用の基本培地は、１０％のウシ胎仔血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、注記される無抗生物質ステップを除いて、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を備えたＩＭＤＭ培地においてであった。

【0198】

ヒトＰＢＭＣはＦｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒを通じて入手した。細胞は解凍し、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂ細胞単離キットＩＩ（Ｈｕｍａｎ）を製造業者のプロトコールに従って使用するネガティブ選択を使って単離した。単離した細胞は、１００ｎｇ／ｍＬのＭＥＧＡＣＤ４０Ｌ（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、５０ｎｇ／ｍＬの組換えＩＬ－２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１０（Ｓｈｅｎａｎｄｏａｈ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５（Ｓｈｅｎａｎｄｏａｈ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、１μｇ／ｍＬのＣｐＧ ＯＤＮ２００６（ＩＤＴ）を補充したｈＢＣＭに０．５～１．０×１０^６細胞／ｍＬで再懸濁した。

【0199】

４８時間の刺激後、細胞はＮｅｏｎトランスフェクションシステムを使用して電気穿孔した。Ｃａｓ９タンパク質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＨ７ ｓｇＲＮＡ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）は、バッファーＴ中、室温で２０分間、２対１の比で予め複合体化した。細胞はＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で洗浄し、予め複合体化したＣａｓ９ ＲＮＰを含有するバッファーＴ中最終濃度２．５×１０^７細胞／ｍｌでバッファーＴに再懸濁した。細胞－ＲＮＰ混合物は１０μＬのＮｅｏｎトランスフェクションＴｉｐ中に充填し、製造業者のプロトコールに従って１７５０Ｖ、２０ｍｓ及び１パルスの設定で電気穿孔した。電気穿孔直後、細胞は抗生物質なしで上記の通り刺激培地に蒔いた。３０分後、ＡＡＶは最終濃度１０～１５％培養容積まで添加し、徹底的に混合した。２～４時間後、細胞はもっと大きな培養皿に移して、さらに拡大させた。

【0200】

電気穿孔の２日後、細胞は蛍光色素標識抗原又はストレプトアクチンを用いて染色し、遺伝子改変された細胞を選択した。二次拡大では、Ｂ細胞は、５μｇ／ｍＬのヒト組換えインスリン（Ｓｉｇｍａ）、５０μｇ／ｍＬのトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ）、５０ｎｇ／ｍＬの組換えＩＬ－２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及び１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５（Ｓｈｅｎａｎｄｏａｈ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を含有するｈＢＣＭにおいて、照射（８０ｇｙ）ＮＩＨ ３Ｔ３－ＣＤ４０Ｌフィーダー細胞と共培養した。

【0201】

プラズマ細胞への分化を促進するため、細胞は、拡大条件から、５μｇ／ｍＬのヒト組換えインスリン（Ｓｉｇｍａ）、５０μｇ／ｍＬのトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ）、５００Ｕ／ｍＬのユニバーサルタイプ１ ＩＦＮタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－６（Ｓｈｅｎａｎｄｏａｈ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５（Ｓｈｅｎａｎｄｏａｈ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を補充したｈＢＣＭを含有する新鮮な無フィーダー培養条件に移した。

【0202】

ＴＩＤＥによるｓＧＲＮＡ活性の評価。全ゲノムＤＮＡは、電気穿孔後３～５日でモック及びＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ処理細胞から単離した。ｓｇＲＮＡ標的部位に隣接する５００～６００塩基対領域は、以下のオリゴ：
マウス：

【0203】

【化11】

を使用してＰＣＲにより増幅した。

【0204】

精製ＰＣＲ産物はサンガー塩基配列決定し、モック電気穿孔細胞と比べたＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ電気穿孔細胞中のインデルの頻度はＩＣＥアルゴリズムを使用して決定した（Ｈｓｉａｕら、（２０１８年）．「Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ Ｅｄｉｔｓ ｆｒｏｍ Ｓａｎｇｅｒ Ｔｒａｃｅ Ｄａｔａ．」ｂｉｏＲｘｉｖ）。

【0205】

タンパク質抗原。プレ融合ＲＳＶ－Ｆタンパク質、ＥＢＶｇｈ／ｇｌ複合体及び改変ＨＩＶ ｅｎｖ抗原（４２６ｃ ＴＭ４ ｄ１－３）は記載される通りに産生した（ＭｃＬｅｌｌａｎら、（２０１３年）．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４２（６１５８）：５９２～５９８頁；ＭｃＧｕｉｒｅら、（２０１６年）．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ７：１０６１８； Ｓｎｉｊｄｅｒら、（２０１８年）．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４８（４）：７９９～８１１頁 ｅ７９９）。安定化したインフルエンザＨＡ－幹は、記載される通りに株Ｈ１ １９９９ＮＣ由来のＶＲＣクローン３９２５から産生した（Ｙａｓｓｉｎｅら、（２０１５年）．Ｎａｔ Ｍｅｄ ２１（９）：１０６５～１０７０頁）。単量体プレ融合ＲＳＶ－Ｆタンパク質はＡｌｅｘａ－４８８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で標識した。他のすべてのタンパク質は、０．８～２のビオチン対タンパク質モル比を使用してビオチンにコンジュゲートし、続いてストレプトアビジン－ＰＥ又は－ＡＰＣ（ｐｒｏｚｙｍｅ）を用いて四量体化した。

【0206】

フローサイトメトリー。フローサイトメトリー分析はＦＡＣＳｙｍｐｈｏｎｙ装置（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で行い、細胞はＡｒｉａＩＩ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）上で分別し、データはＦｌｏｗｊｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を使用して解析した。

【0207】

マウスにおけるＥｍＡｂ治療研究。動物研究は、フレッド・ハッチンソンがん研究センター動物実験委員会により承認されこれに従って行った。

【0208】

ＲＳＶ負荷では、ＥｍＡｂ又は対照Ｂ細胞を１．５×１０^７細胞の単一腹腔内（ＩＰ）用量として投与した。パリビズマブの受動移入では、マウスは１５ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．の単一用量を受けた。ＧＦＰ－発現ＲＳＶ（本明細書では簡単化のためＲＳＶと呼ばれる）は豊富に提供された（Ｍｕｎｉｒら、（２００８年）．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８２（１７）：８７８０～８７９６頁）。同齢ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）は、４０μＬのＰＢＳ中１０^６ｐｆｕのサクロース精製ＲＳＶで鼻腔内に接種した。肺は感染後５日目に採取し、力価はプラークアッセイにより以前記載された通りに決定した（Ｍｕｒｐｈｙら、（１９９０年）．Ｖａｃｃｉｎｅ ８（５）：４９７～５０２頁）。手短に言えば、肺は、ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳディソシエーター中２ｍｌ培養液においてホモジナイズし、４００×ｇ、１０分間の遠心分離により浄化し、次に瞬間冷凍して－８０℃で保存した。上澄みはＤＭＥＭ培養液において１対１０及び１対２０で２通りに希釈した。１００μＬのそれぞれの希釈液は、３７℃で２時間、２４ウェルプレートにおいてコンフルエントＶｅｒｏ細胞に添加した。次に、０．８％メチルセルロースの上塗りを添加し、プレートは、ＧＦＰについてのフィルター設定付きのＴｙｐｈｏｏｎイメージャーでの撮像に先立って５日間インキュベートした。ｐｆｕ／肺における力価は、もっとも高い陽性希釈液中のプラークの数を計数し希釈係数について補正することにより計算した。

【0209】

ヒト細胞の生着では、ヒトｅｍＡｂ Ｂ細胞は、５×１０^６細胞の単一ＩＰ用量／ｅｍＡｂ特異性（１×１０^７全体）としてＮＯＤ－ｓｃｉｄ ＩＬ２Ｒガンマ^ヌル（ＮＳＧ）マウス（ＦＨＣＲＣ飼育室により産生）に投与した。移入７日後、採血し、血清中のＲＳＶ－Ｆ及びＨＡ－幹に対するヒトｅｍＡｂ力価はＥＬＩＳＡにより決定した。

【0210】

統計解析。統計解析はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７を使用して実施した。ペアワイズ比較はウェルチ補正付きの独立ｔ検定を使用して実施した。

【0211】

本明細書に記載される核酸配列は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２で定義されている通り、ヌクレオチド塩基を表す標準文字省略形を使用して示される。一部の例では、それぞれの核酸配列の１つの鎖のみが示されるが、相補鎖は、それが適切だと考えられる実施形態に含まれると理解されている。例としては、配列番号５～８４を含む標的部位に相補的な配列は、これらの部位を標的にするｇＲＮＡターゲティング配列を提供する。

【0212】

本明細書に記載される選択された抗体構築物をコードするいかなる核酸も利用しうる。本明細書で開示される核酸配列の変異体は、配列の違いがコードされたタンパク質の機能に実質的な影響を及ぼさない種々の配列多型、突然変異及び変化を含む。用語核酸又は「遺伝子」は、コード配列だけではなく、プロモーター、エンハンサー及び終結領域などの調節領域も含んでいてよい。用語は、すべてのイントロン及びｍＲＮＡ転写物からスプライスされた他のＤＮＡ配列、加えて選択的スプライシング部位から生じる変異体をさらに含むことができる。コード核酸は１つ以上の選択された抗体構築物の発現を指示するＤＮＡ又はＲＮＡでありうる。これらの核酸配列は、ＲＮＡに転写されるＤＮＡ鎖配列又はタンパク質に翻訳されるＲＮＡ配列でもよい。核酸配列は、完全長核酸配列並びに完全長タンパク質に由来する非完全長配列の両方を含む。配列は、天然の配列又は特定の細胞型でコドン選択を提供するように導入してもよい配列の縮重コドンも含むことができる。選択された抗体構築物をコードする核酸配列は、選択された抗体構築物の関連するアミノ酸配列から容易に調製することができる。

【0213】

タンパク質配列の「変異体」は、本明細書の他の場所で開示されているタンパク質配列と比べて、１つ以上のアミノ酸付加、欠失、停止位置又は置換を有するタンパク質配列を含む。

【0214】

アミノ酸置換は保存的又は非保存的置換でありうる。本明細書で開示されるタンパク質配列の変異体は、１つ以上の保存的アミノ酸置換を有するタンパク質配列を含むことができる。「保存的置換」又は「保存的アミノ酸置換」は、以下の保存的置換群：群１：Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｔ；群２：Ｄ、Ｅ；群３：Ｎ、Ｑ；群４：Ｒ、Ｋ、Ｈ；群５：Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ；及び群６：Ｆ、Ｙ、Ｗの１つに見出される置換を含む。

【0215】

さらに、アミノ酸は、類似する機能、化学構造又は組成（例えば、酸性、塩基性、脂肪族の、芳香族の又は硫黄含有）により保存的置換群に分類することができる。例えば、脂肪族分類化は、置換の目的で、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ及びＩを含みうる。互いに保存的置換と見なされるアミノ酸を含む他の群は、硫黄含有：Ｍ及びＣ；酸性の：Ｄ、Ｅ、Ｎ及びＱ；小さな脂肪族非極性又はわずかに極性の残基：Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｐ及びＧ；極性負電荷残基及びそのアミド：Ｄ、Ｎ、Ｅ及びＱ；極性正電荷残基：Ｈ、Ｒ及びＫ；大きな脂肪族非極性残基：Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ及びＣ；並びに大きな芳香族残基：Ｆ、Ｙ及びＷを含む。

【0216】

非保存的置換は：変化の領域でのペプチド骨格の構造（例えば、アルファヘリックス又はベータシート構造）；標的部位の分子の電荷若しくは疎水性；又は側鎖の容積に著しい影響を及ぼす置換を含む。一般に、タンパク質の特性に最大の変化を生み出すと予想される非保存的置換は、（ｉ）親水性残基（例えば、Ｓ又はＴ）は疎水性残基（例えば、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｖ又はＡ）を（又は疎水性残基（例えば、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｖ又はＡ）で）置換可能である；（ｉｉ）Ｃ若しくはＰは他のいかなる残基をも（又は他のいかなる残基によっても）置換可能である；（ｉｉｉ）正電荷を持つ側鎖を有する残基（例えば、Ｋ、Ｒ又はＨ）は負電荷を有する残基（例えば、Ｑ又はＤ）を（又は負電荷を有する残基（例えば、Ｑ又はＤ）で）置換可能である；又は（ｉｖ）かさばった側鎖を有する残基（例えば、Ｆ）はかさばった側鎖を持たない残基（例えば、Ｇ）を（又はかさばった側鎖を持たない残基（例えば、Ｇ）で）置換可能である置換である。追加の情報は、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４年）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙに見出される。

【0217】

本明細書に開示される核酸及びタンパク質配列の変異体は、本明細書に開示される基準配列に少なくとも７０％配列同一性、少なくとも８０％配列同一性、少なくとも８５％配列同一性、少なくとも９０％配列同一性、少なくとも９５％配列同一性、少なくとも９６％配列同一性、少なくとも９７％配列同一性、少なくとも９８％配列同一性、又は少なくとも９９％配列同一性のある配列も含む。

【0218】

本明細書で同定された配列に関して「パーセント（％）配列同一性」は、最大パーセント配列同一性を達成するために配列を整列させ、必要であれば、ギャップを導入した後の、基準配列中の核酸又はアミノ酸残基と同一である候補配列中の核酸又はアミノ酸残基の百分率と定義される。パーセント核酸又はアミノ酸配列同一性を決定する目的での整列は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの一般公開されているコンピュータソフトウェアを使用して、当技術分野の技術の範囲内である種々の方法で達成可能である。当業者であれば、比較されている配列の全長にわたって最大整列を達成するのに必要ないかなるアルゴリズムも含む、整列を測定するための適切なパラメータを決定することができる。例えば、ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２コンピュータプログラムを使用して生み出される％配列同一性値（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２６６：４６０～４８０頁（１９９６年））は、いくつかの検索パラメータを使用し、その大半がデフォルト値に設定されている。デフォルト値に設定されていないパラメータ（すなわち、調整可能パラメータ）は以下の値：オバーラップスパン＝１、オバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１及びスコアリングマトリックスＢＬＯＳＵＭ６２を用いて設定される。

【0219】

変異体は典型的には、同じ質的生物活性を示し、基準核酸又はペプチド配列に実質的に類似する生体応答を誘発するが、変異体は、必要とされる基準核酸又はペプチドの特徴を改変するように選択することが可能である。変異体のスクリーニングは、本明細書に記載される実験プロトコールを使用して実施することができる。

【0220】

当業者であれば理解するように、本明細書に開示されるそれぞれの実施形態は、その特定の記述される要素、ステップ、成分又は構成成分を含む、から本質的になる又はからなることができる。したがって、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」又は「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）、からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）又はから本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」を列挙すると解釈されるべきである。転換語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）を意味するが、これに限定されず、特定されていない要素、ステップ、成分又は構成成分の包含を、たとえ多量でも、許容する。転換語句「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、特定されていないいかなる要素、ステップ、成分又は構成成分も排除する。転換語句「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、実施形態の範囲を特定された要素、ステップ、成分又は構成成分に及び実施形態に物質的に影響を及ぼさない要素、ステップ、成分又は構成成分に限定する。物質的効果は、選択された抗体のＢ細胞発現の統計的に有意な減少を引き起こすと考えられる。

【0221】

他の方法で示されていなければ、明細書及び特許請求の範囲において使用される分子量、反応条件、その他などの成分の量、特性を表すすべての数字は、あらゆる場合に、用語「約（ａｂｏｕｔ）」に修飾されていると理解するべきである。したがって、反対に示されていなければ、明細書及び添付の特許請求の範囲に述べられている数値パラメータは本発明が入手しようとしている所望の特性に応じて変動しうる近似である。少なくとも及び均等論の適用を特許請求の範囲に限定しようとする試みとしてではなく、それぞれの数値パラメータは、報告された有効数字の数に照らして及び通常の四捨五入法を適用することにより少なくとも解釈するべきである。さらに明確さが必要な場合には、用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、述べられた数値又は範囲と併せて使用した場合、当業者がその用語に帰すと考えるのが道理にかなっている意味を有し、すなわち、述べられた値又は範囲より幾分多い又は幾分少なく、述べられた値の±２０％、述べられた値の±１９％、述べられた値の±１８％、述べられた値の±１７％、述べられた値の±１６％、述べられた値の±１５％、述べられた値の±１４％、述べられた値の±１３％、述べられた値の±１２％、述べられた値の±１１％、述べられた値の±１０％、述べられた値の±９％、述べられた値の±８％、述べられた値の±７％、述べられた値の±６％、述べられた値の±５％、述べられた値の±４％、述べられた値の±３％、述べられた値の±２％、又は述べられた値の±１％の範囲内までを意味する。

【0222】

本発明の広い範囲を示す数値範囲及びパラメータは近似であるにもかかわらず、特定の実施例で示される数値はできる限り正確に報告されている。しかし、いかなる数値も、そのそれぞれの試験測定値に見出される標準偏差から必然的に生じるある種の誤差を本質的に含有する。

【0223】

本発明を説明するという文脈で（特に、以下の特許請求の範囲という文脈で）使用される用語「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」及び類似する指示対象は、本明細書において別段指示されていない又は文脈と明白に矛盾しなければ、単数と複数の両方を包含すると解釈するべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、その範囲内に収まるそれぞれ個別の値に個々に言及する簡略表記法として働くことが意図されているだけである。本明細書において別段指示されていなければ、それぞれ個々の値はそれが本明細書において個々に列挙されているかのように明細書に組み込まれる。本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書において別段指示されていない又は文脈と別段明白に矛盾しなければ、いかなる適切な順にでも実施可能である。本明細書で提供されるありとあらゆる実施例又は例示的言語（例えば、「などの（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、本発明をもっとよく明らかにするためだけに意図されており、他の方法で請求される本発明の範囲を限定しない。明細書の言語は、本発明の実行に不可欠ないずれかの請求されない要素をも示していると解釈するべきではない。

【0224】

本明細書で開示される本発明の代わりの要素又は実施形態の群化は限定と解釈するべきではない。それぞれの群メンバーは、個別に又は群の他のメンバー若しくは本明細書に見出される他の要素と任意の組合せで言及する及び請求してもよい。群の１つ以上のメンバーは、便宜上及び／又は特許資格の理由で群に含めても、群から削除してもよいことが予期されている。いかなるそのような包含又は削除が生じた場合でも、明細書は、改変された群を含有し、したがって、添付された特許請求の範囲において使用されるすべてのマーカッシュ群の書面による明細を満たしていると見なされる。

【0225】

本発明を実行するために本発明者らに知られている最良の様式を含む、本発明のある特定の実施形態が本明細書に記載されている。当然のことながら、これらの記載された実施形態の変動は、前述の説明を読めば当業者には明らかになる。本発明者は、当業者であれば適切であるとしてそのような変動を用いるものと予想しており、本発明者らは、本発明が本明細書に具体的に記載される以外の方法で実行されることを意図している。したがって、本発明は、適用法令により認められる通り、これに添付されている特許請求の範囲に列挙される主題のすべての改変物及び等価物を含む。さらに、そのあらゆる考えられる変動における上記の要素のいかなる組合せも、本明細書において別段指示されていない又は文脈と別段明白に矛盾しなければ、本発明に包含される。

【0226】

さらに、本明細書全体を通じて、特許、出版物、雑誌論文及び他の文書を数多く参照してきた（本明細書の参照資料）。参照資料のそれぞれは個別に、その参照される教示のために参照によりその全体を本明細書に組み込む。

【0227】

締めくくりに、本明細書に開示される本発明の実施形態は本発明の原理を説明していることは理解されるべきである。用いてもよい他の改変は本発明の範囲内である。したがって、例として、しかし、限定としてではなく、本発明の代わりの構成は、本明細書の教示に従って利用しうる。したがって、本発明は正確に示され記載された発明に限定されない。

【0228】

本明細書に示される特徴は、例としてのものであり本発明の好ましい実施形態の例証となる議論のみを目的とし、本発明の原理及び種々の実施形態の概念上の側面のもっとも有用であり容易に理解される説明だと考えられることを提供するために提示される。これに関して、本発明の基本的な理解に必要である以上に詳細に本発明の構造的な詳細を示そうと試みてはおらず、図及び／又は実施例と一緒に取り入れた記述は、本発明のいくつかの形態がどのようにして実際に用いられうるかを当業者に明らかにする。

【0229】

本開示において使用される定義及び説明は、以下の実施例において明白に曖昧さを残さずに改変されなければ、又は意味の適用がいかなる解釈も無意味にする若しくは本質的に無意味にする場合、いかなる将来の解釈においても支配的であることが意味され意図されている。用語の解釈がその解釈を無意味にする又は本質的に無意味にすると考えられる場合には、定義はウェブスター辞典第３版又は生化学及び分子生物学のオックスフォード辞典（Ｅｄ．Ａｎｔｈｏｎｙ Ｓｍｉｔｈ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、２００４年）などの当業者に公知である辞書から取り入れるべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図9】

【図10】

【図11A】

【図11B-1】

【図11B-2】

【図12A】

【図12B-1】

【図12B-2】

【図13A】

【図13B-1】

【図13B-2】

【図14A】

【図14B-1】

【図14B-2】

【図15A】

【図15B】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22A】

【図22B】

【図23A】

【図23B】

【図23C】

【図23D】

【図23E】

【図24A】

【図24B】

【図24C】

【図25A】

【図25B-1】

【図25B-2】

【図25B-3】

【図25B-4】

【図25B-5】

【図25B-6】

【図25B-7】

【図25B-8】

【図25B-9】

【図25B-10】

【図25C-1】

【図25C-2】

【図25C-3】

【図25C-4】

【図25C-5】

【図25C-6】

【図25C-7】

【図25C-8】

【図25C-9】

【図25C-10】

【図25C-11】

【図25D-1】

【図25D-2】

【図25D-3】

【図25D-4】

【図25D-5】

【図25D-6】

【図25E-1】

【図25E-2】

【図25E-3】

【図25E-4】

【図25E-5】

【図25E-6】

【図25E-7】

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【図25F-1】

【図25F-2】

【図25F-3】

【図25F-4】

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【図25F-6】

【図25F-7】

【図25F-8】

【図25F-9】

【図25G-1】

【図25G-2】

【図25G-3】

【図25G-4】

【図25G-5】

【図25G-6】

【図25G-7】

【図25G-8】

【図25G-9】

【図25H-1】

【図25H-2】

【図25H-3】

【図25H-4】

【図25H-5】

【図25H-6】

【図25H-7】

【図25I-1】

【図25I-2】

【図25I-3】

【図25I-4】

【図25I-5】

【図25I-6】

【図25I-7】

【図26A】

【図26B】

【図26C】

【図26D】

【図27A】

【図27B】

【図27C】

【図27D】

【図27E】

【図27F】

【図27G】

【図28】

【図29A】

【図29B】

【図29C】

【図29D】

【図30A】

【図30B】

【図30C】

【図30D】

【図30E】

【図31A】

【図31B】

【図31C】

【図31D】

【図32A】

【図32B】

【図33A】

【図33B】

【配列表】

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