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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-11-13
(45)【発行日】2023-11-21
(54)【発明の名称】蛍光標識用色素および蛍光標識剤
(51)【国際特許分類】
C09B 47/30 20060101AFI20231114BHJP
C09B 47/067 20060101ALI20231114BHJP
C09B 47/18 20060101ALI20231114BHJP
C09B 47/24 20060101ALI20231114BHJP
C09B 57/00 20060101ALI20231114BHJP
C09K 11/06 20060101ALI20231114BHJP
G01N 21/78 20060101ALI20231114BHJP
【ＦＩ】
C09B47/30 CSP
C09B47/067
C09B47/18
C09B47/24
C09B57/00 Z
C09K11/06
G01N21/78 C
【請求項の数】
3
(21)【出願番号】P 2021164190
(22)【出願日】2021-10-05
(65)【公開番号】P2023055077
(43)【公開日】2023-04-17
【審査請求日】2023-08-10
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】000222118
【氏名又は名称】東洋インキＳＣホールディングス株式会社
(72)【発明者】
【氏名】山本 竜太郎
(72)【発明者】
【氏名】皆嶋 英範
(72)【発明者】
【氏名】河内 寛明
【審査官】齊藤 光子
(56)【参考文献】
【文献】特開平０５－１６３４３９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１９－１７２８２６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０２０－１７７０１４（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０９Ｂ ４７／００，５７／００
Ｃ０９Ｋ １１／００
Ｇ０１Ｎ ２１／００
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
非水溶性の蛍光標識用色素を含む蛍光標識剤（ただし、色素と、水溶性樹脂と、水とを含む蛍光標識剤用色素組成物であって、水溶性樹脂が、イオン性官能基を有する重合性不飽和単量体由来の構成単位（Ａ）、およびアルキル基を有する重合性不飽和単量体由来の構成単位（Ｂ）を含有することを特徴とする蛍光標識剤用色素組成物を除く。）であって、前記蛍光標識用色素を有機溶媒に溶解させた色素溶液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して添加した色素分散液（色素分散液Ｉ）において形成される色素分散体の平均粒子径が５００ｎｍ以下であり、
前記蛍光標識用色素の、下記式（Ｉ）により算出される吸光度維持率が０．５以上であり、蛍光標識用色素が、下記一般式（１）で表される蛍光標識剤。
式（Ｉ） 吸光度維持率＝Ａ１／Ａ０
式（Ｉ）中、Ａ０は蛍光標識用色素を有機溶媒に溶解させた色素溶液（色素溶液Ｉ）の最大吸収波長における吸光度を表し、Ａ１は蛍光標識用色素溶液をＰＢＳに添加した色素分散液（色素分散液ＩＩ）の最大吸収波長における吸光度を表す。ただし、色素溶液Ｉと色素分散液ＩＩの色素濃度は同一である。
一般式（１）：
Ｑ－Ｚ－Ｌ １ －Ｌ ２ －Ｌ ３
（式中、Ｑは、蛍光標識用色素の残基を表す。
Ｚは、直接結合、置換もしくは無置換のアルキレン基、又は、置換もしくは無置換のアリーレン基を表す。
Ｌ １ は、直接結合、－Ｏ－、－ＯＰ（＝Ｏ）Ｒ １ －、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＯＳ（＝Ｏ） ２ －、－ＯＳｉＲ ２ Ｒ ３ －、－Ｃ（＝Ｏ）－、又は－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－を表す。
Ｌ ２ は、炭素数が１～１０である、置換もしくは無置換のアルキレン基を表す。
Ｌ ３ は、－ＣＯＯＭ １ 、－ＮＲ ４ Ｒ ５ 、－Ｎ ＋ Ｒ ６ Ｒ ７ Ｒ ８ 、－ＯＭ ２ 、又は－Ｐ（＝
Ｏ）（ＯＭ ３ ）ＯＭ ４ を表す。
前記Ｒ １ は、水素原子、水酸基、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、置換もしくは無置換のアルコキシ基、置換もしくは無置換のアリールオキシ基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。
前記Ｒ ２ 及びＲ ３ は、それぞれ独立に、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。
前記Ｒ ４ ～Ｒ ８ は、それぞれ独立に、水素原子、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基を表す。
前記Ｍ １ 、Ｍ ２ 、Ｍ ３ 、及びＭ ４ は、それぞれ独立に、水素原子、又は１価のカチオンを表す。）
【請求項2】
蛍光標識用色素が、フタロシアニン類又はボロンジピロメテン類である、請求項１に記載の蛍光標識剤。
【請求項3】
蛍光標識用色素が、フタロシアニン類である、請求項２に記載の蛍光標識剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、蛍光標識用色素及びそれを含有する蛍光標識剤に関する。
【背景技術】
【0002】
バイオイメージングは、タンパク質や細胞、組織などを可視化する技術であり、生体内分子・細胞機能の解明や創薬の研究等、生物学、医学の研究領域で幅広く活用されている。
中でも蛍光バイオイメージング法は、現象の動的な観察、多色観察、高感度観察が可能なイメージング法である。さらに、近年では、蛍光バイオイメージング法は非侵襲的に診断可能なイメージング法として注目されており、患者への負担が少ない画像診断や手術中のリアルタイム診断など臨床現場における応用が期待されている。
中でも蛍光バイオイメージング法は、現象の動的な観察、多色観察、高感度観察が可能なイメージング法である。さらに、近年では、蛍光バイオイメージング法は非侵襲的に診断可能なイメージング法として注目されており、患者への負担が少ない画像診断や手術中のリアルタイム診断など臨床現場における応用が期待されている。
【0003】
例えば特許文献１には、フタロシアニン骨格を用いた蛍光標識用色素が記載されている。
【0004】
例えば特許文献２には、ボロンジピロメテン（ＢＯＤＩＰＹ）骨格を用いた蛍光標識用色素が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】国際公開第２００４／０３８３７８号
【文献】特開２０１９－１７２８２６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
特許文献１及び特許文献２に記載の蛍光標識用色素を用いて蛍光バイオイメージングを行う場合には、蛍光標識用色素単体で使用することはできず、特定の生体組織と特異的に結合するような生体組織認識物質（抗原、ビオチン等）と、蛍光標識用色素とをあらかじめ結合させ使用する必要がある。このような蛍光標識用色素の前処理は、評価サンプル数が膨大なハイスループットスクリーニングにおいては、労力と実験時間の大幅な増加につながる。
そこで本発明が解決しようとする課題は、生体組織認識物質との結合が不要な蛍光標識用色素を提供することである。
そこで本発明が解決しようとする課題は、生体組織認識物質との結合が不要な蛍光標識用色素を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、上記課題を解決するための優れた特性を有する蛍光標識用色素を見出し、本発明をなしたものである。
【0008】
すなわち、本発明は、下記の手段によって解決された。
［Ｉ］蛍光標識用色素を有機溶媒に溶解させた色素溶液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して添加した色素分散液（色素分散液Ｉ）において形成される色素分散体の平均粒子径が５００ｎｍ以下であり、
下記式（Ｉ）により算出される吸光度維持率が０．５以上である蛍光標識用色素。
式（Ｉ） 吸光度維持率＝Ａ１／Ａ０
式（Ｉ）中、Ａ０は蛍光標識用色素を有機溶媒に溶解させた色素溶液（色素溶液Ｉ）の最大吸収波長における吸光度を表し、Ａ１は蛍光標識用色素溶液をＰＢＳに添加した色素分散液（色素分散液ＩＩ）の最大吸収波長における吸光度を表す。ただし、色素溶液Ｉと色素分散液ＩＩの色素濃度は同一である。
［Ｉ］蛍光標識用色素を有機溶媒に溶解させた色素溶液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して添加した色素分散液（色素分散液Ｉ）において形成される色素分散体の平均粒子径が５００ｎｍ以下であり、
下記式（Ｉ）により算出される吸光度維持率が０．５以上である蛍光標識用色素。
式（Ｉ） 吸光度維持率＝Ａ１／Ａ０
式（Ｉ）中、Ａ０は蛍光標識用色素を有機溶媒に溶解させた色素溶液（色素溶液Ｉ）の最大吸収波長における吸光度を表し、Ａ１は蛍光標識用色素溶液をＰＢＳに添加した色素分散液（色素分散液ＩＩ）の最大吸収波長における吸光度を表す。ただし、色素溶液Ｉと色素分散液ＩＩの色素濃度は同一である。
【0009】
［ＩＩ］フタロシアニン類又はボロンジピロメテン類である、［Ｉ］に記載の蛍光標識用色素。
【0010】
［ＩＩＩ］下記一般式（１）で表される［Ｉ］又は［ＩＩ］に記載の蛍光標識用色素。
一般式（１）：
Ｑ－Ｚ－Ｌ１－Ｌ２－Ｌ３
（式中、Ｑは、蛍光標識用色素の残基を表す。
Ｚは、直接結合、置換もしくは無置換のアルキレン基、又は、置換もしくは無置換のアリーレン基を表す。
Ｌ１は、直接結合、－Ｏ－、－ＯＰ（＝Ｏ）Ｒ１－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＯＳ（＝Ｏ）２－、－ＯＳｉＲ２Ｒ３－、－Ｃ（＝Ｏ）－、又は－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－を表す。
Ｌ２は、置換もしくは無置換のアルキレン基、置換もしくは無置換のアリーレン基、及び置換もしくは無置換の複素環基からなる群から選択される１種の基、又はこれらの基を組み合わせてなる基を表す。
Ｌ３は、－ＣＯＯＭ１、－ＮＲ４Ｒ５、－Ｎ＋Ｒ６Ｒ７Ｒ８、－ＯＭ２、又は－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＭ３）ＯＭ４を表す。
前記Ｒ１は、水素原子、水酸基、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、置換もしくは無置換のアルコキシ基、置換もしくは無置換のアリールオキシ基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。
前記Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。
前記Ｒ４～Ｒ８は、それぞれ独立に、水素原子、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基を表す。
前記Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、及びＭ４は、それぞれ独立に、水素原子、又は１価のカチオンを表す。）
一般式（１）：
Ｑ－Ｚ－Ｌ１－Ｌ２－Ｌ３
（式中、Ｑは、蛍光標識用色素の残基を表す。
Ｚは、直接結合、置換もしくは無置換のアルキレン基、又は、置換もしくは無置換のアリーレン基を表す。
Ｌ１は、直接結合、－Ｏ－、－ＯＰ（＝Ｏ）Ｒ１－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＯＳ（＝Ｏ）２－、－ＯＳｉＲ２Ｒ３－、－Ｃ（＝Ｏ）－、又は－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－を表す。
Ｌ２は、置換もしくは無置換のアルキレン基、置換もしくは無置換のアリーレン基、及び置換もしくは無置換の複素環基からなる群から選択される１種の基、又はこれらの基を組み合わせてなる基を表す。
Ｌ３は、－ＣＯＯＭ１、－ＮＲ４Ｒ５、－Ｎ＋Ｒ６Ｒ７Ｒ８、－ＯＭ２、又は－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＭ３）ＯＭ４を表す。
前記Ｒ１は、水素原子、水酸基、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、置換もしくは無置換のアルコキシ基、置換もしくは無置換のアリールオキシ基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。
前記Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。
前記Ｒ４～Ｒ８は、それぞれ独立に、水素原子、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基を表す。
前記Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、及びＭ４は、それぞれ独立に、水素原子、又は１価のカチオンを表す。）
【0011】
［ＩＶ］ 上記［Ｉ］～［ＩＩＩ］のいずれかに記載の蛍光標識用色素を含有する蛍光標識剤。
【発明の効果】
【0012】
本発明の実施形態によれば、蛍光標識用色素と生体組織認識物質との結合処理を必要としない、蛍光バイオイメージングに適した蛍光標識用色素を提供することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【発明を実施するための形態】
【0014】
以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。但し、本発明の実施形態は、以下の記載に限定されず様々な実施形態を含む。
【0015】
本発明の一実施形態である蛍光標識用色素は、
蛍光標識用色素を有機溶媒に溶解させた色素溶液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して添加した色素分散液（色素分散液Ｉ）において形成される色素分散体の平均粒子径が５００ｎｍ以下であり、
下記式（Ｉ）により算出される吸光度維持率が０．５以上である蛍光標識用色素。
式（Ｉ） 吸光度維持率＝Ａ１／Ａ０
式（Ｉ）中、Ａ０は蛍光標識用色素を有機溶媒に溶解させた色素溶液（色素溶液Ｉ）の最大吸収波長における吸光度を表し、Ａ１は蛍光標識用色素溶液をＰＢＳに添加した色素分散液（色素分散液ＩＩ）の最大吸収波長における吸光度を表す。ただし、色素溶液Ｉと色素分散液ＩＩの色素濃度は同一である。
蛍光標識用色素を有機溶媒に溶解させた色素溶液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して添加した色素分散液（色素分散液Ｉ）において形成される色素分散体の平均粒子径が５００ｎｍ以下であり、
下記式（Ｉ）により算出される吸光度維持率が０．５以上である蛍光標識用色素。
式（Ｉ） 吸光度維持率＝Ａ１／Ａ０
式（Ｉ）中、Ａ０は蛍光標識用色素を有機溶媒に溶解させた色素溶液（色素溶液Ｉ）の最大吸収波長における吸光度を表し、Ａ１は蛍光標識用色素溶液をＰＢＳに添加した色素分散液（色素分散液ＩＩ）の最大吸収波長における吸光度を表す。ただし、色素溶液Ｉと色素分散液ＩＩの色素濃度は同一である。
【0016】
上記本発明の蛍光標識用色素が、上記効果を奏する理由は、発明者らの検討によれば以下の通りと推察される。
本発明の一実施形態である蛍光標識用色素は、優れた細胞質染色色素として好適に利用できる。これは、本発明の蛍光標識用色素有機溶媒に溶解させた色素溶液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に添加した色素分散液（色素分散液Ｉ）において、生じた色素分散体の平均粒子径が５００ｎｍ以下であることに起因して、エンドサイトーシス機構による細胞膜透過が起きやすくなったためであると考えられる。ここで、色素分散体とは、媒体中に完全溶解せずに分散した状態の色素であって、複数の色素分子が弱い分子間力によって集合し、一つの粒子単位として行動している状態を意味する。
よって本発明では、ＰＢＳに分散させた時に形成する色素分散体の平均粒子径が５００ｎｍ以下である蛍光標識用色素は細胞染色性が高く、細胞染色に好適に利用できる。
本発明の一実施形態である蛍光標識用色素は、優れた細胞質染色色素として好適に利用できる。これは、本発明の蛍光標識用色素有機溶媒に溶解させた色素溶液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に添加した色素分散液（色素分散液Ｉ）において、生じた色素分散体の平均粒子径が５００ｎｍ以下であることに起因して、エンドサイトーシス機構による細胞膜透過が起きやすくなったためであると考えられる。ここで、色素分散体とは、媒体中に完全溶解せずに分散した状態の色素であって、複数の色素分子が弱い分子間力によって集合し、一つの粒子単位として行動している状態を意味する。
よって本発明では、ＰＢＳに分散させた時に形成する色素分散体の平均粒子径が５００ｎｍ以下である蛍光標識用色素は細胞染色性が高く、細胞染色に好適に利用できる。
【0017】
色素分散液Ｉに含まれる色素分散体の平均粒子径は、５００ｎｍ以下であり、４００ｎｍ以下が好ましく、さらに２００ｎｍ以下がより好ましい。
【0018】
色素分散液Ｉに含まれる色素の平均粒子径は、以下のようにして測定した。
蛍光標識用色素を可溶な有機溶媒に２０μＭになるように溶かし、これをＰＢＳで１０倍希釈し２μＭの色素分散液Ｉを調製した。この色素分散液Ｉについての粒度分布を粒度分布測定装置（スペクトリス株式会社製、ゼータサイザーナノ ＺＳＰ）にて測定した。平均粒子径の測定は２５℃の条件下で行うことが好ましい。
蛍光標識用色素を可溶な有機溶媒に２０μＭになるように溶かし、これをＰＢＳで１０倍希釈し２μＭの色素分散液Ｉを調製した。この色素分散液Ｉについての粒度分布を粒度分布測定装置（スペクトリス株式会社製、ゼータサイザーナノ ＺＳＰ）にて測定した。平均粒子径の測定は２５℃の条件下で行うことが好ましい。
【0019】
平均粒子径の値としては、Ｚ平均粒子径、数平均粒子径、体積平均粒子径、面積平均粒子径等の値を採用することができるが、本実施例では、動的光散乱法により測定したＺ平均粒子径を色素分散液Ｉに含まれる色素分散体の平均粒子径とした。
【0020】
また、色素分散液の蛍光標識用色素の吸光度が低くなると、励起光の吸収率が低下するため、細胞染色時の蛍光強度は低下すると考えられる。よって本発明では、蛍光標識用色素を有機溶媒に溶解させた時の吸光度Ａ０とＰＢＳに分散させた時の吸光度Ａ１の比（吸光度維持率）が高いほど、細胞染色時の蛍光強度が高く、蛍光標識用色素として好適に利用できる。
【0021】
蛍光標識用色素が可溶な有機溶媒としては、水と任意に混和可能な有機溶媒が好ましく、特にジメチルスルホキシド、エタノールが好ましい。
【0022】
式（Ｉ）により算出される吸光度維持率０．５以上であり、０．６以上が好ましく、０．７以上がより好ましい。
【0023】
式（Ｉ）により算出される吸光度維持率は、以下のようにして算出した。
蛍光標識用色素を、可溶な有機溶媒に２μＭになるように溶かし、色素溶液Ｉを調製した。色素溶液Ｉの吸収スペクトルを分光光度計（株式会社日立ハイテクノロジーズ社製、Ｕ－４１００）を用いて測定し、最大吸収波長における吸光度Ａ０を決定した。
また、蛍光標識用色素を、可溶な有機溶媒に２０μＭになるように溶かし、さらにこれをＰＢＳで１０倍希釈し、２μＭの色素分散液ＩＩを調製した。色素分散液ＩＩの吸収スペクトルを分光光度計（株式会社日立ハイテクノロジーズ社製、Ｕ－４１００）を用いて測定し、最大吸収波長における吸光度Ａ１を決定した。吸光度の測定は２５℃の条件下で行うことが好ましい。
蛍光標識用色素を、可溶な有機溶媒に２μＭになるように溶かし、色素溶液Ｉを調製した。色素溶液Ｉの吸収スペクトルを分光光度計（株式会社日立ハイテクノロジーズ社製、Ｕ－４１００）を用いて測定し、最大吸収波長における吸光度Ａ０を決定した。
また、蛍光標識用色素を、可溶な有機溶媒に２０μＭになるように溶かし、さらにこれをＰＢＳで１０倍希釈し、２μＭの色素分散液ＩＩを調製した。色素分散液ＩＩの吸収スペクトルを分光光度計（株式会社日立ハイテクノロジーズ社製、Ｕ－４１００）を用いて測定し、最大吸収波長における吸光度Ａ１を決定した。吸光度の測定は２５℃の条件下で行うことが好ましい。
【0024】
本明細書において蛍光標識用色素とは、紫外領域から近赤外領域の光（例えば、波長５６０～９００ｎｍの光）を照射した際に蛍光を発する色素であり、公知の化合物であってよい。蛍光標識用色素を構成する蛍光色素としては、特に限定されないが、例えば、フルオレセイン類、ローダミン類、クマリン類、シアニン類、フタロシアニン類、ジケトピロロピロール類、ボロンジピロメテン（ＢＯＤＩＰＹ）類、キサンテン類、ピレン類、メロシアニン類、ぺリレン類、アクリジン類、スチルベン類、ピロメテン類、アクリジン類、ポルフィリン類及びウンべリフェロン類等の色素が挙げられる。
【0025】
本発明の一実施形態である蛍光標識用色素は、下記一般式（１）で表される蛍光標識用色素であることが好ましい。
一般式（１）：
Ｑ－Ｚ－Ｌ１－Ｌ２－Ｌ３
（式中、Ｑは、蛍光標識用色素の残基を表す。
Ｚは、直接結合、置換もしくは無置換のアルキレン基、又は、置換もしくは無置換のアリーレン基を表す。
Ｌ１は、直接結合、－Ｏ－、－ＯＰ（＝Ｏ）Ｒ１－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＯＳ（＝Ｏ）２－、－ＯＳｉＲ２Ｒ３－、－Ｃ（＝Ｏ）－、又は－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－を表す。
Ｌ２は、置換もしくは無置換のアルキレン基、置換もしくは無置換のアリーレン基、及び置換もしくは無置換の複素環基からなる群から選択される１種の基、又はこれらの基を組み合わせてなる基を表す。
Ｌ３は、－ＣＯＯＭ１、－ＮＲ４Ｒ５、－Ｎ＋Ｒ６Ｒ７Ｒ８、－ＯＭ２、又は－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＭ３）ＯＭ４を表す。
前記Ｒ１は、水素原子、水酸基、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、置換もしくは無置換のアルコキシ基、置換もしくは無置換のアリールオキシ基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。
前記Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。
前記Ｒ４～Ｒ８は、それぞれ独立に、水素原子、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基を表す。
前記Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、及びＭ４は、それぞれ独立に、水素原子、又は１価のカチオンを表す。）
一般式（１）：
Ｑ－Ｚ－Ｌ１－Ｌ２－Ｌ３
（式中、Ｑは、蛍光標識用色素の残基を表す。
Ｚは、直接結合、置換もしくは無置換のアルキレン基、又は、置換もしくは無置換のアリーレン基を表す。
Ｌ１は、直接結合、－Ｏ－、－ＯＰ（＝Ｏ）Ｒ１－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＯＳ（＝Ｏ）２－、－ＯＳｉＲ２Ｒ３－、－Ｃ（＝Ｏ）－、又は－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－を表す。
Ｌ２は、置換もしくは無置換のアルキレン基、置換もしくは無置換のアリーレン基、及び置換もしくは無置換の複素環基からなる群から選択される１種の基、又はこれらの基を組み合わせてなる基を表す。
Ｌ３は、－ＣＯＯＭ１、－ＮＲ４Ｒ５、－Ｎ＋Ｒ６Ｒ７Ｒ８、－ＯＭ２、又は－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＭ３）ＯＭ４を表す。
前記Ｒ１は、水素原子、水酸基、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、置換もしくは無置換のアルコキシ基、置換もしくは無置換のアリールオキシ基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。
前記Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。
前記Ｒ４～Ｒ８は、それぞれ独立に、水素原子、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基を表す。
前記Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、及びＭ４は、それぞれ独立に、水素原子、又は１価のカチオンを表す。）
【0026】
上記実施形態の蛍光標識用色素において、「－Ｚ－Ｌ１－Ｌ２－Ｌ３」は、親水基を有する置換基であり、リン脂質における親水基との静電的な相互作用によって、リン脂質に対する蛍光標識用色素の透過性を高めることができる。上記置換基の具体的な構成は以下のとおりである。
【0027】
Ｚは、直接結合、置換もしくは無置換のアルキレン基、又は、置換もしくは無置換のアリーレン基を表す。一実施形態において、Ｚは、直接結合であることが好ましい。
【0028】
Ｌ１は、直接結合、－Ｏ－、－ＯＰ（＝Ｏ）Ｒ１－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＯＳ（＝Ｏ）２－、－ＯＳｉＲ２Ｒ３－、－Ｃ（＝Ｏ）－、又は－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－を表す。一実施形態において、Ｒ１は、－ＯＰ（＝Ｏ）Ｒ１－、－ＯＳ（＝Ｏ）２－、－ＯＳｉＲ２Ｒ３－であることが好ましい。
【0029】
Ｌ２は、置換もしくは無置換のアルキレン基、置換もしくは無置換のアリーレン基、及び、置換もしくは無置換の複素環基からなる群から選択される１種の基、又はこれらの基を組み合わせてなる基を表す。一実施形態において、Ｌ２は、置換もしくは無置換のアルキレン基、又は、置換もしくは無置換のアリーレン基であることが好ましく、又は、置換もしくは無置換のアルキレン基であることがより好ましい。一実施形態において、Ｌ２は、アルキレン基であることが好ましい。アルキレン基の主鎖の炭素数は１～１０であることが好ましい。
【0030】
Ｌ３は、－ＣＯＯＭ１、－ＮＲ４Ｒ５、－Ｎ＋Ｒ６Ｒ７Ｒ８、－ＯＭ２、又は－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＭ３）ＯＭ４を表す。一実施形態において、Ｒ３は、－ＣＯＯＭ１、－ＯＭ２、又は－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＭ３）ＯＭ４であることが好ましい。
【0031】
上記において、Ｒ１は、水素原子、水酸基、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、置換もしくは無置換のアルコキシ基、置換もしくは無置換のアリールオキシ基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。一実施形態において、Ｒ１は、水素原子、水酸基、置換もしくは無置換のアルキル基、又は無置換のアリール基であることが好ましい。
【0032】
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。一実施形態において、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、置換もしくは無置換のアルキル基、又は無置換のアリール基であることが好ましい。上記アルキル基は、炭素数１～５の直鎖又は分岐のアルキル基であることがより好ましい。
【0033】
Ｒ４～Ｒ８は、それぞれ独立に、水素原子、置換もしくは無置換のアルキル基、又は、置換もしくは無置換のアリール基を表す。一実施形態において、Ｒ４～Ｒ８は、それぞれ独立に、水素原子、又は置換もしくは無置換のアルキル基であることが好ましい。アルキル基は、炭素数１～５の直鎖又は分岐のアルキル基であることがより好ましい。
【0034】
Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、及びＭ４は、それぞれ独立に、水素原子、又は１価のカチオンを表す。１価のカチオンとしては、例えば、アルカリ金属、及び４級アミン等が挙げられる。アルカリ金属としては、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、及びセシウム等が挙げられる。一実施形態において、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、及びＭ４は、それぞれ、水素原子であることが好ましい。
【0035】
一実施形態である蛍光標識用色素を構成する蛍光色素は、蛍光色素が発する蛍光の生体透過性の観点から、フタロシアニン類またはＢＯＤＩＰＹ類が好ましい。また、耐光性の観点からフタロシアニン類が好ましい。
【0036】
一実施形態において、下記一般式（２）で表されるフタロシアニンを蛍光標識用色素として好適に使用することができる。上記蛍光標識用色素を構成する蛍光色素が、下記一般式（２）で表される化合物を含む場合、色素の骨格に由来して、イン・ビトロ及びイン・ビボでのバイオイメージングに適した波長（例えば、６５０～９００ｎｍ）での発光を容易に得ることができる。
【0037】
【化1】
【0038】
Ｘ１～Ｘ１６は、それぞれ独立に、水素原子、又は、－Ｚ－Ｌ１－Ｌ２－Ｌ３、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、置換もしくは無置換のシクロアルキル基、置換もしくは無置換のアルケニル基、置換もしくは無置換の複素環基、－ＡＢ、－ＣＯＯＭ５からなる群から選択される置換基を表す。
上記において、Ｍ５は、それぞれ独立に、１価のカチオンを表す。１価のカチオンとしては、例えば、水素原子、アルカリ金属、及び４級アミン等が挙げられる。アルカリ金属としては、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、及びセシウム等が挙げられる。
上記において、Ｍ５は、それぞれ独立に、１価のカチオンを表す。１価のカチオンとしては、例えば、水素原子、アルカリ金属、及び４級アミン等が挙げられる。アルカリ金属としては、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、及びセシウム等が挙げられる。
【0039】
一実施形態において、Ｘ１～Ｘ１６の少なくとも１つ、好ましくは４つ以上は、上記置換基であることが好ましい。一実施形態において、色素骨格に対する上記置換基は、それぞれ独立して、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、又は－ＡＢであることが好ましい。
【0040】
上記式－ＡＢにおいて、Ａは、第１６族元素を表す。第１６族元素としては、酸素、硫黄、セレン、及びテルル等が挙げられる。一実施形態において、Ａは、酸素、硫黄、又はセレンであることが好ましい。合成の容易さ、及び安定性の点から、酸素、又は硫黄がより好ましい。蛍光強度の点から、酸素がさらに好ましい。Ｂは、水素原子、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、置換もしくは無置換のシクロアルキル基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。一実施形態において、Ｂは、水素原子、置換もしくは無置換のアルキル基、又は置換もしくは無置換のアリール基であることが好ましい。したがって、一実施形態において、－ＡＢは、－ＯＲ、－ＯＡｒ、－ＳＲ、又は－ＳＡｒであることが好ましい。ここで、Ｒはアルキル基を表し、Ａｒはアリール基を表す。細胞膜透過性の観点から、－ＡＢは－ＯＲ又は－ＳＲであることが好ましく、さらに上記アルキル基は、炭素数１～５の直鎖又は分岐のアルキル基であることがより好ましい。
【0041】
Ｙは、２価～５価の金属原子を表し、ｋは整数である。Ｙが２価の金属原子である場合のｋは０であり、Ｙが３価の金属原子である場合のｋは１であり、Ｙが４価または５価の金属原子である場合のｋは２である。２価の金属原子としては、Ｍｇ、Ｃｕ、Ｚｎ等が挙げられる。３価の金属原子としては、Ａｌ、Ｇａ、Ｉｎ等が挙げられる。４価の金属原子としては、Ｓｉ、Ｍｎ、Ｓｎ、Ｃｒ、Ｚｒ等が挙げられる。５価の金属原子としては、Ｐ等が挙げられる。蛍光強度の観点からは、Ｙは、Ｍｇ、Ｚｎ、Ａｌ、Ｓｉ、又はＰであることが好ましく、さらに耐光性の観点からＡｌ、又はＳｉが好ましい。
【0042】
一実施形態において、Ｘ１～Ｘ１６は、隣接する置換基同士が互いに連結して、環を形成してもよい。上記環の構造は、シクロアルキル、シクロアルケン、アリール、ヘテロアリールのいずれであってもよく、フタロシアニン骨格における芳香環との縮合環を形成する。上記環の構造は、さらに置換基を有してもよく、非置換であってもよい。環の構造を形成する炭素数は、２～３０であってよく、４～６の範囲が好ましい。環は、５員環又は６員環であることが好ましい。
一実施形態において、隣接する置換基同士が互いに連結してフェニレン基を形成することが好ましい。この場合、フタロシアニン骨格における芳香環と結合し、ナフタレン構造が形成される。他の実施形態において、隣接する置換基同士が互いに連結して窒素原子を含む環を形成してもよい。この場合、フタロシアニン骨格における芳香環と結合し、例えば、イミダゾール構造が形成される。上記ナフタレン構造又はイミダゾール構造などの環構造は、さらにアルキル基又はアリール基などの置換基を有してもよい。
一実施形態において、隣接する置換基同士が互いに連結してフェニレン基を形成することが好ましい。この場合、フタロシアニン骨格における芳香環と結合し、ナフタレン構造が形成される。他の実施形態において、隣接する置換基同士が互いに連結して窒素原子を含む環を形成してもよい。この場合、フタロシアニン骨格における芳香環と結合し、例えば、イミダゾール構造が形成される。上記ナフタレン構造又はイミダゾール構造などの環構造は、さらにアルキル基又はアリール基などの置換基を有してもよい。
【0043】
Ｘ１７は、－Ｚ－Ｌ１－Ｌ２－Ｌ３、水酸基、ハロゲン元素、置換または無置換のアルコキシ基、置換または無置換のアリールオキシ基、－ＯＰ（＝Ｏ）Ｖ１Ｖ２、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｖ３、－ＯＳ（＝Ｏ）２Ｖ４、－ＯＳｉＶ５Ｖ６Ｖ７を表す。一実施形態において、Ｘ１７は、－Ｚ－Ｌ１－Ｌ２－Ｌ３、又は水酸基であることが好ましい。Ｚ、Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３は、先に説明したとおりである。
【0044】
上記において、Ｖ１及びＶ２は、それぞれ独立に、水素原子、水酸基、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、置換もしくは無置換のアルコキシ基、置換もしくは無置換のアリールオキシ基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。
Ｖ３は、水素原子、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。
Ｖ４は、水酸基、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。
Ｖ５～Ｖ７は、それぞれ独立に、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。
Ｖ３は、水素原子、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。
Ｖ４は、水酸基、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。
Ｖ５～Ｖ７は、それぞれ独立に、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基、又は、置換もしくは無置換の複素環基を表す。
【0045】
一実施形態において、下記一般式（３）又は（４）で表されるボロンジピロメテンを蛍光標識用色素として好適に使用することができる。上記蛍光標識用色素を構成する蛍光色素が、下記一般式（３）又は（４）で表される化合物を含む場合、色素の骨格に由来して、イン・ビトロ及びイン・ビボでのバイオイメージングに適した波長（例えば、６５０～９００ｎｍ）での発光を容易に得ることができる。
【0046】
【化2】
【0047】
式中、Ｘ１８～Ｘ２５は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、置換もしくは無置換のアルキル基、置換もしくは無置換のアリール基を表す。前記Ｘ１８とＸ１９、Ｘ１９とＸ２０、Ｘ２２とＸ２３、Ｘ２３とＸ２４は互いに協働して、イオウ、酸素、窒素及びリンから成る群より選ばれる少なくとも１個のヘテロ原子を含む５員若しくは６員のヘテロ環を形成するか、炭素原子のみからなる６員のベンゼン環を形成してもよい。形成した環上の置換基は－Ｚ－Ｌ１－Ｌ２－Ｌ３、水素原子、又はハロゲン原子より選ばれるいずれかを有する。Ｚ、Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３は、先に説明したとおりである。
一実施形態において、Ｘ１８とＸ１９、Ｘ２３とＸ２４を縮環させ、５員のヘテロ環、又は６員のベンゼン環を有することが好ましい。また、一実施形態において、Ｘ１８とＸ１９、Ｘ２３とＸ２４を縮環させ、酸素原子を含む５員のヘテロ環を有することが好ましい。
一実施形態において、Ｘ１８とＸ１９、Ｘ２３とＸ２４を縮環させ、５員のヘテロ環、又は６員のベンゼン環を有することが好ましい。また、一実施形態において、Ｘ１８とＸ１９、Ｘ２３とＸ２４を縮環させ、酸素原子を含む５員のヘテロ環を有することが好ましい。
【0048】
前記Ｗ１～Ｗ４はそれぞれ独立に、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、複素環基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アルケニル基、又はアルキニル基を表し、これらは置換基を有していてもよく、Ｗ１とＷ２およびＷ３とＷ４は互いに連結して環を形成してもよい。一実施形態において、Ｗ１～Ｗ４はハロゲン原子であることが好ましい。
【0049】
前記Ｑは炭素原子又は窒素原子を表す。ただし、Ｑが窒素原子の場合にはＲ４およびＲ８は存在しない。一実施形態において、Ｑは炭素原子であることが好ましい。
【0050】
ここで、上記Ｘ１～Ｘ２５、Ｖ１～Ｖ７、Ｒ１～Ｒ４及びＷ１～Ｗ４におけるアルキル基は、それぞれ独立して選択される。アルキル基は、置換基を有しても、非置換であってもよい。
アルキル基としては、直鎖状または分岐鎖状のアルキル基が挙げられる。具体例としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ドデシル基、オクタデシル基、イソプロピル基、イソブチル基、イソペンチル基、２－エチルヘキシル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｓｅｃ－ペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、ｔｅｒｔ－オクチル基、及びネオペンチル基等を挙げることができる。アルキル基の炭素数は、１～３０の範囲内であることが好ましい。上記炭素数は、１～２０の範囲がより好ましく、１～５の範囲がさらに好ましい。
アルキル基としては、直鎖状または分岐鎖状のアルキル基が挙げられる。具体例としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ドデシル基、オクタデシル基、イソプロピル基、イソブチル基、イソペンチル基、２－エチルヘキシル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｓｅｃ－ペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、ｔｅｒｔ－オクチル基、及びネオペンチル基等を挙げることができる。アルキル基の炭素数は、１～３０の範囲内であることが好ましい。上記炭素数は、１～２０の範囲がより好ましく、１～５の範囲がさらに好ましい。
【0051】
上記アルキル基における置換基としては、フッ素、塩素、臭素等のハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、ホルミル基、シアノ基、カルボキシル基等の他、上述したアルキル基、後述するアリール基、シクロアルキル基、複素環基が挙げられる。また、構造の一部が、アミド結合（－ＮＨＣＯ－）、エステル結合（－ＣＯＯ－）、エーテル結合（－Ｏ－）、ウレア結合（－ＮＨＣＯＮＨ－）、又はウレタン結合（－ＮＨＣＯＯ－）で置換されている場合、その置換部分も「置換基」とみなす。
【0052】
したがって、置換アルキル基としては、上記の置換基で置換されたアルキル基を意味する。置換アルキル基は、一つ又は二つ以上の置換基で置換されたアルキル基であってもよい。例えば、ハロゲン原子で置換されたアルキル基の具体例としては、トリフルオロメチル基、２，２，２－トリフルオロエチル基、－（ＣＦ２）４ＣＦ３、－（ＣＦ２）５ＣＦ３、－（ＣＦ２）６ＣＦ３、－（ＣＦ２）７ＣＦ３、－（ＣＦ２）８ＣＦ３、トリクロロメチル基、２，２－ジブロモエチル基等を挙げることができる。
【0053】
アミド結合で置換されたアルキル基の具体例としては、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ（－ＣＨ３）－ＣＨ２－ＮＨＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ２－ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ３、－（ＣＨ２）５－ＮＨＣＯ－（ＣＨ２）１１－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｃ（－ＮＨＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ３） ３等を挙げることができる。アミド結合で置換されたアルキル基の炭素数は、２～３０の範囲内であることが好ましい。上記炭素数は、２～１０の範囲がより好ましく、２～５の範囲がさらに好ましい。
【0054】
エステル結合で置換されたアルキル基の具体例としては、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＯＯ－ＣＨ２－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ（－ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＯＯ－ＣＨ２－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＯＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＯＯ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ２－ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ３、－（ＣＨ２）５－ＣＯＯ－（ＣＨ２）１１－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ－（ＣＯＯ－ＣＨ２－ＣＨ３） ２等を挙げることができる。エステル結合で置換されたアルキル基の炭素数は、２～３０の範囲内であることが好ましい。上記炭素数は、２～１０の範囲がより好ましく、２～５の範囲がさらに好ましい。
【0055】
エーテル結合で置換されたアルキル基の具体例としては、－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ３、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－ＣＨ３（ここでｎは１から８の整数である）、－（ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－ＣＨ３（ここでｍは１から５の整数である）、－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ３－、－ＣＨ２－ＣＨ－（ＯＣＨ３）２等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。エーテル結合で置換されたアルキル基の炭素数は、２～３０の範囲内であることが好ましい。上記炭素数は、２～１０の範囲がより好ましく、２～５の範囲がさらに好ましい。
【0056】
ウレア結合（－ＮＨＣＯＮＨ－）で置換されたアルキル基の具体例としては、－ＣＨ２－ＮＨＣＯＮＨ－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨＣＯＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨＣＯＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ３、－（ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨＣＯＮＨ）ｎ－ＣＨ３（ここでｎは１から８の整数である）、－（ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨＣＯＮＨ）ｍ－ＣＨ３（ここでｍは１から５の整数である）、－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）－ＮＨＣＯＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ３－、－ＣＨ２－ＣＨ－（ＮＨＣＯＮＨＣＨ３）２等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。エーテル結合で置換されたアルキル基の炭素数は、２～３０の範囲内であることが好ましい。上記炭素数は、２～１０の範囲がより好ましく、２～５の範囲がさらに好ましい。
【0057】
ウレタン結合で置換されたアルキル基の具体例としては、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨＣＯＯ－ＣＨ２－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ（－ＣＨ３）－ＣＨ２－ＮＨＣＯＯ－ＣＨ２－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨＣＯＯ－ＣＨ２－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨＣＯＯ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ２－ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ３、－（ＣＨ２）５－ＮＨＣＯＯ－（ＣＨ２）１１－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ－（ＮＨＣＯＯ－ＣＨ２－ＣＨ３） ２等を挙げることができる。エステル結合で置換されたアルキル基の炭素数は、２～３０の範囲内であることが好ましい。上記炭素数は、２～１０の範囲がより好ましく、２～５の範囲がさらに好ましい。
【0058】
アミド結合（－ＮＨＣＯ－）、エステル結合（－ＣＯＯ－）、およびエーテル結合（－Ｏ－）、ウレア結合（－ＮＨＣＯＮＨ－）、ウレタン結合（－ＮＨＣＯＯ－）のうち２種以上の置換基で置換されたアルキル基の具体例としては、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ２－ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＯＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨＣＯＯ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ２－ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨＣＯ―ＣＨ２（ＯＣＯ－ＣＨ２）－ＣＨ２－を挙げることができる。アミド結合（－ＮＨＣＯ－）、エステル結合（－ＣＯＯ－）、エーテル結合（－Ｏ－）、ウレア結合（－ＮＨＣＯＮＨ－）、およびウレタン結合（－ＮＨＣＯＯ－）のうち２種以上の置換基で置換されたアルキル基の炭素数は、３～３０の範囲内であることが好ましい。上記炭素数は、３～１０の範囲がより好ましく、３～５の範囲がさらに好ましい。
【0059】
上記Ｘ１～Ｘ２５、Ｖ１～Ｖ７、Ｒ１～Ｒ８及びＷ１～Ｗ４におけるアリール基は、それぞれ独立して選択される。アリール基は、置換基を有しても、非置換であってもよい。
アリール基としては、単環、又は縮合多環のアリール基が挙げられる。例えば、フェニル基、１－ナフチル基、２－ナフチル基、ｐ－ビフェニル基、ｍ－ビフェニル基、２－アントリル基、９－アントリル基、２－フェナントリル基、３－フェナントリル基、９－フェナントリル基、２－フルオレニル基、３－フルオレニル基、９－フルオレニル基、１－ピレニル基、２－ピレニル基、３－ペリレニル基、ｏ－トリル基、ｍ－トリル基、ｐ－トリル基、４－メチルビフェニル基、ターフェニル基、４－メチル－１－ナフチル基、４－ｔｅｒｔ－ブチル－１－ナフチル基、４－ナフチル－１－ナフチル基、６－フェニル－２－ナフチル基、１０－フェニル－９－アントリル基、スピロフルオレニル基、２－ベンゾシクロブテニル基等が挙げられる。アリール基の炭素数は６～１８の範囲内であることが好ましい。上記炭素数は、６～１０の範囲がより好ましい。
置換アリール基の置換基としては、上記アルキル基における置換基として例示した置換基と同じであってよい。
アリール基としては、単環、又は縮合多環のアリール基が挙げられる。例えば、フェニル基、１－ナフチル基、２－ナフチル基、ｐ－ビフェニル基、ｍ－ビフェニル基、２－アントリル基、９－アントリル基、２－フェナントリル基、３－フェナントリル基、９－フェナントリル基、２－フルオレニル基、３－フルオレニル基、９－フルオレニル基、１－ピレニル基、２－ピレニル基、３－ペリレニル基、ｏ－トリル基、ｍ－トリル基、ｐ－トリル基、４－メチルビフェニル基、ターフェニル基、４－メチル－１－ナフチル基、４－ｔｅｒｔ－ブチル－１－ナフチル基、４－ナフチル－１－ナフチル基、６－フェニル－２－ナフチル基、１０－フェニル－９－アントリル基、スピロフルオレニル基、２－ベンゾシクロブテニル基等が挙げられる。アリール基の炭素数は６～１８の範囲内であることが好ましい。上記炭素数は、６～１０の範囲がより好ましい。
置換アリール基の置換基としては、上記アルキル基における置換基として例示した置換基と同じであってよい。
【0060】
上記Ｘ１～Ｘ１６におけるシクロアルキル基は、それぞれ独立して選択される。シクロアルキル基は、置換基を有しても、非置換であってもよい。シクロアルキル基としては、シクロペンチル基、シクロへキシル基、２，５－ジメチルシクロペンチル基、４－ｔｅｒｔ－プチルシクロヘキシル基等が挙げられる。また、シクロアルキル基の炭素数は３～１２の範囲内であることが好ましい。上記炭素数は３～６の範囲内であることがより好ましい。置換シクロアルキル基の置換基は、上記アルキル基における置換基として例示した置換基と同じであってよい。
【0061】
上記Ｘ１～Ｘ１６及びＷ１～Ｗ４におけるアルケニル基は、それぞれ独立して選択される。アルケニル基は、置換基を有しても、非置換であってもよい。アルケニル基としては、直鎖状または分岐鎖状のアルケニル基が挙げられる。アルケニル基は、一般的に、その構造内に一つの二重結合を有する基を指すが、本明細書において、アルケニル基は、その構造内に複数の二重結合を有してもよい。アルケニル基の具体例としては、ビニル基、１－プロペニル基、アリル基、２－ブテニル基、３－ブテニル基、イソプロペニル基、イソブテニル基、１－ペンテニル基、２－ペンテニル基、３－ペンテニル基、４－ペンテニル基、１－ヘキセニル基、２－ヘキセニル基、３－ヘキセニル基、４－ヘキセニル基、１，３－ブタジエニル基等を挙げることができる。アルケニル基の炭素数は、２～１８の範囲内であることが好ましい。上記炭素数は、２～１０であることがより好ましく、２～５であることがさらに好ましい。置換アルケニル基の置換基としては、上記アルキル基における置換基として例示した置換基と同じであってよい。
【0062】
上記Ｒ２、Ｒ３、Ｘ１～Ｘ２４、Ｖ３～Ｖ７及びＷ１～Ｗ４における複素環基は、それぞれ独立して選択される。複素環基は、置換基を有しても、非置換であってもよい。
複素環基としては、脂肪族複素環基や芳香族複素環基が挙げられる。具体例としては、ピリジル基、ピラジル基、ピペリジノ基、ピラニル基、モルホリノ基、アクリジニル基等が挙げられる。また、下記構造式で表される基も挙げられる。複素環基の炭素数（環を構成する炭素数）は、４～１２であることが好ましい。環員数は、５～１３であることが好ましい。
複素環基としては、脂肪族複素環基や芳香族複素環基が挙げられる。具体例としては、ピリジル基、ピラジル基、ピペリジノ基、ピラニル基、モルホリノ基、アクリジニル基等が挙げられる。また、下記構造式で表される基も挙げられる。複素環基の炭素数（環を構成する炭素数）は、４～１２であることが好ましい。環員数は、５～１３であることが好ましい。
【0063】
【化3】
【0064】
置換複素環基の置換基としては、上記アルキル基における置換基として例示した置換基と同じであってよい。置換複素環基は、例えば、複素環基３－メチルピリジル基、Ｎ－メチルピペリジル基、Ｎ－メチルピローリル基等が挙げられる。
【0065】
上記Ｘ１７、Ｒ１、Ｖ１、Ｗ１～Ｗ４におけるアルコキシ基は、それぞれ独立して選択される。アルコキシ基は、置換基を有しても、非置換であってもよい。
アルコキシ基としては、直鎖状または分岐鎖状のアルコキシル基が挙げられる。具体例としては、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ－ブトキシ基、イソブトキシ基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、ネオペンチルオキシ基、２，３－ジメチル－３－ペンチルオキシ基、ｎ－へキシルオキシ基、ｎ－オクチルオキシ基、ステアリルオキシ基、２－エチルへキシルオキシ基等が挙げられる。アルコキシル基の炭素数は１～６の範囲内であることが好ましい。
置換アルコキシル基の置換基としては、上記アルキル基における置換基として例示した置換基と同じであってよい。
アルコキシ基としては、直鎖状または分岐鎖状のアルコキシル基が挙げられる。具体例としては、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ－ブトキシ基、イソブトキシ基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、ネオペンチルオキシ基、２，３－ジメチル－３－ペンチルオキシ基、ｎ－へキシルオキシ基、ｎ－オクチルオキシ基、ステアリルオキシ基、２－エチルへキシルオキシ基等が挙げられる。アルコキシル基の炭素数は１～６の範囲内であることが好ましい。
置換アルコキシル基の置換基としては、上記アルキル基における置換基として例示した置換基と同じであってよい。
【0066】
置換アルコキシ基の置換基としては、上記アルキル基における置換基として例示した置換基と同じであってよい。置換アルコキシ基の具体例としては、トリクロロメトキシ基、トリフルオロメトキシ基、２，２，２－トリフルオロエトキシ基、２，２，３，３－テトラフルオロプロポキシ基、２，２－ビス（トリフルオロメチル）プロポキシ基、２－エトキシエトキシ基、２－ブトキシエトキシ基、２－ニトロプロポキシ基、ベンジルオキシ基等が挙げられる。
【0067】
上記Ｘ１７、Ｒ１、Ｖ１、Ｗ１～Ｗ４におけるアリールオキシ基は、それぞれ独立して選択される。アリールオキシ基は、置換基を有しても、非置換であってもよい。
アリールオキシ基としては、単環または縮合多環のアリールオキシ基が挙げられる。具体例としては、フェノキシ基、ｐ－メチルフェノキシ基、ナフチルオキシ基、アンスリルオキシ基等が挙げられる。アリールオキシ基は、単環のアリールオキシ基が好ましい。また、炭素数６～１２のアリールオキシ基が好ましい。
アリールオキシ基としては、単環または縮合多環のアリールオキシ基が挙げられる。具体例としては、フェノキシ基、ｐ－メチルフェノキシ基、ナフチルオキシ基、アンスリルオキシ基等が挙げられる。アリールオキシ基は、単環のアリールオキシ基が好ましい。また、炭素数６～１２のアリールオキシ基が好ましい。
【0068】
置換アリールオキシ基の置換基としては、上記アリール基における置換基として例示した置換基と同じであってよい。置換アリールオキシ基として、例えば、ｐ－ニトロフェノキシ基、ｐ－メトキシフェノキシ基、２，４－ジクロロフェノキシ基、ペンタフルオロフェノキシ基、２－メチル－４－クロロフェノキシ基等が挙げられる。
【0069】
上記Ｚ、及びＬ２におけるアルキレン基は、それぞれ独立して選択される。アルキレン基は、置換基を有しても、非置換であってもよい。アルキレン基としては、上記アルキル基から一つの水素原子を除いた二価の基が挙げられる。置換もしくは無置換のアルキレン基の具体例としては、－ＣＨ２－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＯＣＯ－ＣＨ２－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－等が挙げられる。
【0070】
上記Ｚ、及びＬ２におけるアリーレン基は、それぞれ独立して選択される。アリーレン基は、置換基を有しても、非置換であってもよい。アリーレン基としては、アリール基から一つの水素原子を除いた二価の基が挙げられる。アリーレン基は、炭素数６～１０の範囲であることが好ましい。一実施形態において、アリーレン基は、フェニレン基、またはナフチレン基であってよい。置換もしくは無置換のアリーレン基の具体例としては、下記構造式で表される基が挙げられる。
【0071】
【化4】
【0072】
Ｗ１～Ｗ４におけるアルキニル基は、それぞれ独立して選択される。アルキニル基は、置換基を有しても、非置換であってもよい。アルキニル基としては、直鎖状または分岐鎖状のアルキニル基が挙げられる。アルキニル基は、一般的に、その構造内に一つの三重結合を有する基を指すが、本明細書において、アルキニル基は、その構造内に複数の三重結合を有してもよい。アルケニル基の具体例としては、エチニル基、プロピニル基、プロパルギル基、アルコールプロパルギル基等が挙げられる。アルキニル基の炭素数は、２～５であることが好ましい。
【0073】
Ｗ１～Ｗ４におけるアルキルチオ基は、それぞれ独立して選択される。アルキルチオ基は、置換基を有しても、非置換であってもよい。アルキルチオ基としては、例えば、メチルチオ基、エチルチオ基、プロピルチオ基、ブチルチオ基、オクチルチオ基、２－エチルヘキシルチオ基などのアルキルチオ基が挙げられる。また、アルキルチオ基の炭素数は１～５の範囲内であることが好ましい。
【0074】
置換アルキルチオ基の置換基としては、上記アルキル基における置換基として例示した置換基と同じであってよい。
【0075】
Ｗ１～Ｗ４におけるアリールチオ基は、それぞれ独立して選択される。アリールチオ基は、置換基を有しても、非置換であってもよい。アリールチオ基としては、例えば、フェニルチオ基、ナフチルチオ基、アンスリルチオ基、フェナントリルチオ基、ピレニルチオ基などのアリールチオ基が挙げられる。また、アリールチオ基の炭素数は１～５の範囲内であることが好ましい。
【0076】
置換アリールチオ基の置換基としては、上記アルキル基における置換基として例示した置換基と同じであってよい。
【0077】
本発明の一実施形態は、上記蛍光標識用色素を含む蛍光標識剤に関する。この蛍光標識剤は、生化学研究から医療診断までの幅広い分野において、バイオイメージングでの蛍光標識のために応用可能である。例えば、遺伝子診断分野、免疫診断分野、医療開発分野、再生医療分野、環境試験分野、バイオテクノロジー分野、及び蛍光検査等の分野において、蛍光標識等の用途で使用することができる。蛍光標識対象となる生体物質としては、特に限定するものではないが、細胞、細胞小器官（オルガネラ）、エクソソーム等の細胞外小胞、リポソーム等の固体脂質ナノ粒子等が挙げられる。
【0078】
上記実施形態の蛍光標識剤において、蛍光標識用色素の濃度は特に限定されない。例えば、細胞を取り扱う場合、細胞の機能障害、及び増殖阻害等への影響を考慮すると、蛍光標識用色素の濃度は低い方が好ましい。一実施形態において、例えば、９６ウェルプレートに播種した１０，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞に対する上記蛍光標識用色素の濃度は、１００μＭ以下であることが好ましい。上記濃度は、５０μＭ以下であることがより好ましく、１０μＭ以下であることがさらに好ましい。上記実施形態の蛍光標識用色素によれば、優れた細胞膜透過性によって、低濃度であっても高い蛍光強度でイメージングできる。そのため、例えば２μＭ以下の低濃度であっても、より高精度な検出を行うことができる。
【0079】
上記実施形態の蛍光標識剤は、上記実施形態の蛍光標識用色素を含有していればよいが、必要に応じて、その他の成分を含有してもよい。その他の成分としては、当技術分野で周知の成分であってよい。例えば、溶剤、及び両親媒性物質等が挙げられる。
【0080】
溶剤は、水、又は有機溶剤であってよく、水がより好ましい。蛍光標識用色素の溶解性を考慮し、水と有機溶剤とを混合して使用してもよい。例えば、有機溶剤は、エタノール、又はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が好ましい。
【0081】
両親媒性物質とは、一つの分子内に親水基と疎水基とを有する化合物の総称である。具体例として、界面活性剤、又はリン脂質等が挙げられる。両親媒性物質は、１類のみを使用しても、又は２種以上を混合して使用してもよい。上記実施形態の蛍光標識用色素において、両親媒性物質は、特に限定されず、近赤外領域で蛍光を発する非水溶性の蛍光色素を水に可溶化できれば、いかなる化合物でもよい。特に限定するものではないが、使用できる両親媒性物質の具体例を以下に挙げる。
【0082】
界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、及び高分子界面活性剤などを挙げることができる。
【0083】
非イオン性界面活性剤としては、例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）４０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０、及びＴｗｅｅｎ（登録商標）８０等のポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステル、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）ＥＬ、及びＣｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）ＲＨ６０等のポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、Ｓｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ １５等の１２－ヒドロキシステアリン酸－ポリエチレングリコールコポリマー、並びに、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、及びＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１１４等のオクチルフェノールエトキシレート、などを挙げることができる。
【0084】
カチオン性界面活性剤としては、例えば、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ラウリルトリメチルアンモニウム等のアルキルトリメチルアンモニウム塩、塩化セチルピリジニウム等のアルキルピリジニウム塩、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、及び塩化ポリ（Ｎ，Ｎ’－ジメチル－３，５－メチレンピペリジニウム）等のアルキル四級アンモニウム塩、アルキルジメチルベンジルアンモニウム塩、アルキルイソキノリニウム塩、ジアルキルモリホニウム塩、ポリオキシエチレンアルキルアミン、アルキルアミン塩、ポリアミン脂肪酸誘導体、アミルアルコール脂肪酸誘導体、塩化ベンザルコニウム、及び塩化ベンゼトニウム、などを挙げることができる。
【0085】
アニオン性界面活性剤としては、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホネート、デシルベンゼンスルホネート、ウンデシルベンゼンスルホネート、トリデシルベンゼンスルホネート、及びノニルベンゼンスルホネート、並びにこれらのナトリウム、カリウム及びアンモニウム塩などが挙げられる。
【0086】
高分子界面活性剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリエチレングリコール－ポリアルキル、ポリエチレングリコール－ポリ乳酸、ポリエチレングリコール－ポリカプロラクトン、ポリエチレングリコール－ポリグリコール酸、ポリエチレングリコール－ポリ（ラクチド－グリコリド）等のブロック共重合体を挙げることができる。
【0087】
一実施形態において、上記実施形態の蛍光標識剤は、両親媒性物質として上記例示した化合物の１種又は２種以上を含んでよい。しかし、上記実施形態の蛍光標識剤は、細胞膜透過性に優れるため、両親媒性物質を必要とすることなく、高い感度での検出が可能である。
【0088】
原料であるフタロニトリル誘導体が非対称の構造である場合、フタロシアニンは、置換基の位置が異なる異性体の混合物として得られる。以下、本明細書においては、フタロシアニン構造の一例のみを示すが、置換基の位置が異なる異性体を排除するものではない。
【0089】
本発明の一実施形態である蛍光標識用色素の具体例としては、以下が挙げられる。但し、本発明による蛍光標識用色素は、これらに限定されない。
【0090】
【表1-1】
【0091】
【表1-2】
【0092】
【表1-3】
【0093】
【表1-4】
【実施例】
【0094】
以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明はこれによって限定されるものではない。なお、実施例中「部」とは、「質量部」を表す。
【0095】
（質量分析）
質量分析装置（ＴＯＦ－ＭＳ：ブルカー・ダルトニクス社製 ａｕｔｏｆｌｅｘＩＩ）により分析した。
質量分析装置（ＴＯＦ－ＭＳ：ブルカー・ダルトニクス社製 ａｕｔｏｆｌｅｘＩＩ）により分析した。
【0096】
＜Ｉ＞蛍光標識用色素
［製造例１］
＜化合物Ａ－１の製造方法＞
キノリン５０部と四塩化ケイ素１部との溶液に、アンモニアガスを導入し、さらに３－エトキシフタロニトリルを３部添加し、これらを１８０℃で７時間反応させた。この反応液を室温まで冷却した後、メタノール２００部、及び１０％塩酸水溶液２００部を加えた。次いで、析出した固体をろ取し、水２００部で固体の洗浄を行った。洗浄後の固体を８０℃で乾燥させ、表２に示す化合物Ａ－１を得た（収率８０．２％）。質量分析の結果、ｍ／ｚ＝７８７．５４（理論値７８７．１７）に分子イオンピークが検出され、表２に示す化合物Ａ－１の構造を有することが同定された。
［製造例１］
＜化合物Ａ－１の製造方法＞
キノリン５０部と四塩化ケイ素１部との溶液に、アンモニアガスを導入し、さらに３－エトキシフタロニトリルを３部添加し、これらを１８０℃で７時間反応させた。この反応液を室温まで冷却した後、メタノール２００部、及び１０％塩酸水溶液２００部を加えた。次いで、析出した固体をろ取し、水２００部で固体の洗浄を行った。洗浄後の固体を８０℃で乾燥させ、表２に示す化合物Ａ－１を得た（収率８０．２％）。質量分析の結果、ｍ／ｚ＝７８７．５４（理論値７８７．１７）に分子イオンピークが検出され、表２に示す化合物Ａ－１の構造を有することが同定された。
【0097】
［製造例２～６］
＜化合物Ａ－２～Ａ－６の製造方法＞
化合物Ａ－１の製造方法で使用した３－エトキシフタロニトリルと四塩化ケイ素を、表２に示すフタロニトリル誘導体と金属源に変更した以外は、化合物Ａ－１の製造と同様にして、表２に示す化合物Ａ－２～Ａ－６をそれぞれ製造した。なお、フタロニトリル誘導体、及び金属源は、化合物Ａ－１の製造における３－エトキシフタロニトリル、及び四塩化ケイ素と同じモル量で使用した。得られた化合物Ａ－２～Ａ－６の構造は、質量分析によって同定し、表２に示した構造を有することが確認された。表２にマススペクトルの分析結果を示す。
＜化合物Ａ－２～Ａ－６の製造方法＞
化合物Ａ－１の製造方法で使用した３－エトキシフタロニトリルと四塩化ケイ素を、表２に示すフタロニトリル誘導体と金属源に変更した以外は、化合物Ａ－１の製造と同様にして、表２に示す化合物Ａ－２～Ａ－６をそれぞれ製造した。なお、フタロニトリル誘導体、及び金属源は、化合物Ａ－１の製造における３－エトキシフタロニトリル、及び四塩化ケイ素と同じモル量で使用した。得られた化合物Ａ－２～Ａ－６の構造は、質量分析によって同定し、表２に示した構造を有することが確認された。表２にマススペクトルの分析結果を示す。
【0098】
【表2-1】
【0099】
【表2-2】
【0100】
［製造例７］
＜化合物Ｂ－１の製造方法＞
キノリン５０部と無水塩化アルミニウム１部との溶液に、アンモニアガスを導入し、さらに３－エトキシフタロニトリルを３．８部と４―フルオロフタロニトリルを１．１部添加した。これらを１８０℃で７時間反応させた。この反応液を室温まで冷却した後、メタノール２００部と１０％塩酸水溶液２００部を加えた。次いで、析出した固体をろ取し、水２００部で固体の洗浄を行った。洗浄後の固体（粗製物）を、中圧分取液体クロマトグラフ（山善製Ｓｍａｒｔ Ｆｌａｓｈ ＡＫＲＯＳ）を用いて精製した。得られた精製物を８０℃で乾燥させ、表３に示す化合物Ｂ－１を得た（収率３０．５％）。質量分析の結果、ｍ／ｚ＝７０７．３０（理論値７０７．２０）に分子イオンピークが検出され、表３に示す化合物Ｂ－１の構造を有することが同定された。
＜化合物Ｂ－１の製造方法＞
キノリン５０部と無水塩化アルミニウム１部との溶液に、アンモニアガスを導入し、さらに３－エトキシフタロニトリルを３．８部と４―フルオロフタロニトリルを１．１部添加した。これらを１８０℃で７時間反応させた。この反応液を室温まで冷却した後、メタノール２００部と１０％塩酸水溶液２００部を加えた。次いで、析出した固体をろ取し、水２００部で固体の洗浄を行った。洗浄後の固体（粗製物）を、中圧分取液体クロマトグラフ（山善製Ｓｍａｒｔ Ｆｌａｓｈ ＡＫＲＯＳ）を用いて精製した。得られた精製物を８０℃で乾燥させ、表３に示す化合物Ｂ－１を得た（収率３０．５％）。質量分析の結果、ｍ／ｚ＝７０７．３０（理論値７０７．２０）に分子イオンピークが検出され、表３に示す化合物Ｂ－１の構造を有することが同定された。
【0101】
【表3】
【0102】
［実施例１］
＜蛍光標識用色素１の製造方法＞
化合物Ａ－１を１部と、アジピン酸０．６部とをピリジンに溶解させ、この溶液を１１５℃で３時間還流して反応液を得た。エバポレーターを用いて反応液からピリジンを除去した後、エタノール１０部と水５０部の混合溶液を加えた。次いで、析出した固体をろ取し、水５０部で固体の洗浄を行った。洗浄後の固体を８０℃で乾燥させ、表１に示す蛍光標識用色素１を得た（収率３３．７％）。質量分析の結果、ｍ／ｚ＝１００７．５４（理論値１００７．３３）に分子イオンピークが検出され、表１に示す蛍光標識用色素１の構造を有することが同定された。
＜蛍光標識用色素１の製造方法＞
化合物Ａ－１を１部と、アジピン酸０．６部とをピリジンに溶解させ、この溶液を１１５℃で３時間還流して反応液を得た。エバポレーターを用いて反応液からピリジンを除去した後、エタノール１０部と水５０部の混合溶液を加えた。次いで、析出した固体をろ取し、水５０部で固体の洗浄を行った。洗浄後の固体を８０℃で乾燥させ、表１に示す蛍光標識用色素１を得た（収率３３．７％）。質量分析の結果、ｍ／ｚ＝１００７．５４（理論値１００７．３３）に分子イオンピークが検出され、表１に示す蛍光標識用色素１の構造を有することが同定された。
【0103】
［実施例２～１８］
＜蛍光標識用色素１～５、７～１１、１３～２０の製造方法＞
蛍光標識用色素１の製造方法で使用した化合物Ａ－１とアジピン酸を表４に示す化合物Ａと軸配位子に変更した以外は、蛍光標識用色素１の製造と同様にして、表１に示す蛍光標識用色素１～５、７～１１、１３～２０をそれぞれ製造した。なお、化合物Ａは、蛍光標識用色素１の製造における化合物Ａ－１と同じモル量で使用した。得られた蛍光標識用色素２～５の構造は、質量分析によって同定し、表１に示した構造を有することが確認された。表４にマススペクトルの分析結果を示す。
＜蛍光標識用色素１～５、７～１１、１３～２０の製造方法＞
蛍光標識用色素１の製造方法で使用した化合物Ａ－１とアジピン酸を表４に示す化合物Ａと軸配位子に変更した以外は、蛍光標識用色素１の製造と同様にして、表１に示す蛍光標識用色素１～５、７～１１、１３～２０をそれぞれ製造した。なお、化合物Ａは、蛍光標識用色素１の製造における化合物Ａ－１と同じモル量で使用した。得られた蛍光標識用色素２～５の構造は、質量分析によって同定し、表１に示した構造を有することが確認された。表４にマススペクトルの分析結果を示す。
【0104】
【表4-1】
【0105】
【表4-2】
【0106】
【表4-3】
【0107】
【表4-4】
【0108】
［実施例１９］
＜蛍光標識用色素６の製造方法＞
蛍光標識用色素５を１部と、ヨウ化メチルを０．８部と、炭酸カリウム０．８部とをテトラヒドロフラン５０部に溶解させ、この溶液を２５℃で５時間反応させた。エバポレーターを用いて反応液からテトラヒドロフランを除去した後、テトラヒドロフラン２０部と水６０部を加えた。次いで、析出物した固体をろ取し、水６０部で固体の洗浄を行った。洗浄後の固体を８０℃で乾燥させ、０．２１部の表１に示す蛍光標識用色素６を得た（収率３３．３％）。質量分析の結果、ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）＝１１９３．５５（理論値［Ｍ－Ｉ］＋＝１１９３．４２）に分子イオンピークが検出され、表１に示す蛍光標識用色素６の構造を有することが同定された。
＜蛍光標識用色素６の製造方法＞
蛍光標識用色素５を１部と、ヨウ化メチルを０．８部と、炭酸カリウム０．８部とをテトラヒドロフラン５０部に溶解させ、この溶液を２５℃で５時間反応させた。エバポレーターを用いて反応液からテトラヒドロフランを除去した後、テトラヒドロフラン２０部と水６０部を加えた。次いで、析出物した固体をろ取し、水６０部で固体の洗浄を行った。洗浄後の固体を８０℃で乾燥させ、０．２１部の表１に示す蛍光標識用色素６を得た（収率３３．３％）。質量分析の結果、ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）＝１１９３．５５（理論値［Ｍ－Ｉ］＋＝１１９３．４２）に分子イオンピークが検出され、表１に示す蛍光標識用色素６の構造を有することが同定された。
【0109】
［実施例２０］
＜蛍光標識用色素１２の製造方法＞
蛍光標識用色素６の製造方法で使用した蛍光標識用色素５を蛍光標識用色素１１に変更した以外は、蛍光標識用色素６の製造と同様にして、表１に示す蛍光標識用色素１２を製造した。蛍光標識用色素１１は、蛍光標識用色素６の製造における蛍光標識用色素５と同じモル量で使用した。質量分析の結果、ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）＝８９０．１１（理論値［Ｍ－Ｉ］＋＝８９０．３８）に分子イオンピークが検出され、表１に示す蛍光標識用色素１２の構造を有することが同定された。
＜蛍光標識用色素１２の製造方法＞
蛍光標識用色素６の製造方法で使用した蛍光標識用色素５を蛍光標識用色素１１に変更した以外は、蛍光標識用色素６の製造と同様にして、表１に示す蛍光標識用色素１２を製造した。蛍光標識用色素１１は、蛍光標識用色素６の製造における蛍光標識用色素５と同じモル量で使用した。質量分析の結果、ｍ／ｚ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）＝８９０．１１（理論値［Ｍ－Ｉ］＋＝８９０．３８）に分子イオンピークが検出され、表１に示す蛍光標識用色素１２の構造を有することが同定された。
【0110】
［実施例２１］
＜蛍光標識用色素２１の製造方法＞
化合物Ｂ－１を１．０部と、（２－カルボキシエチル）フェニルホスフィン酸０．６部とをジメチルスルホキシド５０部に溶解させ、さらに１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン０．４部を添加した後、この溶液を９０℃で８時間反応させた。この反応液を室温まで冷却した後、水１００部を加えた。次いで、析出した固体をろ取し、水５０部で固体の洗浄を行った。得られた固体（粗製物）を中圧分取液体クロマトグラフ（山善製Ｓｍａｒｔ Ｆｌａｓｈ ＡＫＲＯＳ）を用いて精製した。得られた精製物を８０℃で乾燥させ、表１に示す蛍光標識用色素２１を得た（収率６０．１％）。質量分析の結果、ｍ／ｚ＝９０１．４６（理論値９０１．２４）に分子イオンピークが検出され、表１に示す蛍光標識用色素２１の構造を有することが同定された。
＜蛍光標識用色素２１の製造方法＞
化合物Ｂ－１を１．０部と、（２－カルボキシエチル）フェニルホスフィン酸０．６部とをジメチルスルホキシド５０部に溶解させ、さらに１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン０．４部を添加した後、この溶液を９０℃で８時間反応させた。この反応液を室温まで冷却した後、水１００部を加えた。次いで、析出した固体をろ取し、水５０部で固体の洗浄を行った。得られた固体（粗製物）を中圧分取液体クロマトグラフ（山善製Ｓｍａｒｔ Ｆｌａｓｈ ＡＫＲＯＳ）を用いて精製した。得られた精製物を８０℃で乾燥させ、表１に示す蛍光標識用色素２１を得た（収率６０．１％）。質量分析の結果、ｍ／ｚ＝９０１．４６（理論値９０１．２４）に分子イオンピークが検出され、表１に示す蛍光標識用色素２１の構造を有することが同定された。
【0111】
［実施例２２］
＜蛍光標識用色素２２の製造方法＞
蛍光標識用色素２１の製造方法で使用した（２－カルボキシエチル）フェニルホスフィン酸を、１，４－フェニレン二酢酸に変更した以外は、蛍光標識用色素２１の製造と同様にして、表１に示す蛍光標識用色素２２を製造した。１，４－フェニレン二酢酸は、蛍光標識用色素２１の製造における（２－カルボキシエチル）フェニルホスフィン酸と同じモル量で使用した。得られた蛍光標識用色素２２の構造は、質量分析によって同定し、表１に示した構造を有することが確認された。質量分析の結果、ｍ／ｚ＝８８１．４４（理論値８８１．２５）に分子イオンピークが検出され、表１に示す蛍光標識用色素２２の構造を有することが同定された。
＜蛍光標識用色素２２の製造方法＞
蛍光標識用色素２１の製造方法で使用した（２－カルボキシエチル）フェニルホスフィン酸を、１，４－フェニレン二酢酸に変更した以外は、蛍光標識用色素２１の製造と同様にして、表１に示す蛍光標識用色素２２を製造した。１，４－フェニレン二酢酸は、蛍光標識用色素２１の製造における（２－カルボキシエチル）フェニルホスフィン酸と同じモル量で使用した。得られた蛍光標識用色素２２の構造は、質量分析によって同定し、表１に示した構造を有することが確認された。質量分析の結果、ｍ／ｚ＝８８１．４４（理論値８８１．２５）に分子イオンピークが検出され、表１に示す蛍光標識用色素２２の構造を有することが同定された。
【0112】
［製造例１］
＜化合物Ｃ－１の製造方法＞
表５のピロール－２－カルボン酸誘導体１．０部を出発原料とし、有機酸としてトリフルオロ酢酸を８５．１部加えて５０℃で溶解させた。さらに、使用した有機酸の酸無水物３１．４部を添加した後、この溶液を９０℃で６時間反応させた。この反応液を室温まで冷却した後、氷、炭酸水素ナトリウム１７４．２部を加えた。次いで、塩化アンモニウム４４．０部を加え、析出した固体をろ取し、減圧乾燥で十分に乾かしてから、新しい反応容器に入れた。そこにトリエチルアミン２．５部とＮ－メチル―２―ピロリドン４２．３部を加えて溶解させたのち、トリフルオロホウ素ジエチルエーテル錯体を５．２部添加し、この溶液を８０℃で４時間反応させた。塩化アンモニウム５．２部を加え、酢酸エチルによる分液操作によって得られた有機相を乾燥させ、粗生成物を得た。粗製物を中圧分取液体クロマトグラフ（山善製Ｓｍａｒｔ Ｆｌａｓｈ ＡＫＲＯＳ）を用いて精製し、表５に示す化合物Ｃ－１を得た（収率１５．０％）。質量分析の結果、ｍ／ｚ＝５２５．０２（理論値５２５．１０）に分子イオンピークが検出され、表５に示す化合物Ｃ－１の構造を有することが同定された。
＜化合物Ｃ－１の製造方法＞
表５のピロール－２－カルボン酸誘導体１．０部を出発原料とし、有機酸としてトリフルオロ酢酸を８５．１部加えて５０℃で溶解させた。さらに、使用した有機酸の酸無水物３１．４部を添加した後、この溶液を９０℃で６時間反応させた。この反応液を室温まで冷却した後、氷、炭酸水素ナトリウム１７４．２部を加えた。次いで、塩化アンモニウム４４．０部を加え、析出した固体をろ取し、減圧乾燥で十分に乾かしてから、新しい反応容器に入れた。そこにトリエチルアミン２．５部とＮ－メチル―２―ピロリドン４２．３部を加えて溶解させたのち、トリフルオロホウ素ジエチルエーテル錯体を５．２部添加し、この溶液を８０℃で４時間反応させた。塩化アンモニウム５．２部を加え、酢酸エチルによる分液操作によって得られた有機相を乾燥させ、粗生成物を得た。粗製物を中圧分取液体クロマトグラフ（山善製Ｓｍａｒｔ Ｆｌａｓｈ ＡＫＲＯＳ）を用いて精製し、表５に示す化合物Ｃ－１を得た（収率１５．０％）。質量分析の結果、ｍ／ｚ＝５２５．０２（理論値５２５．１０）に分子イオンピークが検出され、表５に示す化合物Ｃ－１の構造を有することが同定された。
【0113】
【表5】
【0114】
［実施例２３］
＜蛍光標識用色素２３の製造方法＞
１．０部の化合物Ｃ－１を出発原料とし、テトラヒドロフラン７０．３部で溶解させ、溶液を０℃まで冷却した。さらに、３－ブロモプロピオン酸０．５４部を添加し、ナトリウムヒドリド０．１４部をゆっくり添加した後、この溶液を還流攪拌で４時間反応させた。この反応液を室温まで冷却した後、塩化アンモニウム水溶液で中和した。次いで、水１００部を加えて、析出した固体をろ取し、減圧乾燥で十分に乾かして表３に示す蛍光標識用色素２３を０．６１部得た（収率５０．０％）。質量分析の結果、ｍ／ｚ＝６６９．４２（理論値６６９．１４）に分子イオンピークが検出され、表１に示す蛍光標識用色素２３の構造を有することが同定された。
＜蛍光標識用色素２３の製造方法＞
１．０部の化合物Ｃ－１を出発原料とし、テトラヒドロフラン７０．３部で溶解させ、溶液を０℃まで冷却した。さらに、３－ブロモプロピオン酸０．５４部を添加し、ナトリウムヒドリド０．１４部をゆっくり添加した後、この溶液を還流攪拌で４時間反応させた。この反応液を室温まで冷却した後、塩化アンモニウム水溶液で中和した。次いで、水１００部を加えて、析出した固体をろ取し、減圧乾燥で十分に乾かして表３に示す蛍光標識用色素２３を０．６１部得た（収率５０．０％）。質量分析の結果、ｍ／ｚ＝６６９．４２（理論値６６９．１４）に分子イオンピークが検出され、表１に示す蛍光標識用色素２３の構造を有することが同定された。
【0115】
［実施例２４］
＜蛍光標識用色素２４の製造方法＞
蛍光標識用色素２３の製造方法で使用した３－ブロモプロピオン酸を（２－ブロモエチル）ホスホン酸に変更した以外は、蛍光標識用色素２３の製造と同様にして、表１に示す蛍光標識用色素２４を製造した。なお、（２－ブロモエチル）ホスホン酸は、蛍光標識用色素２３の製造における３－ブロモプロピオン酸と同じモル量で使用した。得られた蛍光標識用色素２４の構造は、質量分析によって同定し、表１に示した構造を有することが確認された。質量分析の結果、ｍ／ｚ＝７４１．２４（理論値７４１．０９）に分子イオンピークが検出され、表１に示す蛍光標識用色素２４の構造を有することが同定された。
＜蛍光標識用色素２４の製造方法＞
蛍光標識用色素２３の製造方法で使用した３－ブロモプロピオン酸を（２－ブロモエチル）ホスホン酸に変更した以外は、蛍光標識用色素２３の製造と同様にして、表１に示す蛍光標識用色素２４を製造した。なお、（２－ブロモエチル）ホスホン酸は、蛍光標識用色素２３の製造における３－ブロモプロピオン酸と同じモル量で使用した。得られた蛍光標識用色素２４の構造は、質量分析によって同定し、表１に示した構造を有することが確認された。質量分析の結果、ｍ／ｚ＝７４１．２４（理論値７４１．０９）に分子イオンピークが検出され、表１に示す蛍光標識用色素２４の構造を有することが同定された。
【0116】
［比較例１］
＜比較化合物１の製造方法＞
キノリン３０部と、無水塩化アルミニウム０．２部との溶液に、アンモニアガスを導入し、さらに３－（２，６－ジメチル－３－ペントキシ）フタロニトリルを１．０部添加し、この溶液を１８０℃で７時間反応させた。この反応液を室温まで冷却した後、メタノール２００部と１０％塩酸水溶液２００部を加えた。次いで、析出した固体をろ取し、水２００部で固体の洗浄を行った。洗浄後の固体を８０℃で乾燥させ、表６に示す比較化合物１を得た（収率８５．４％）。質量分析の結果、ｍ／ｚ＝１０３１．４５（理論値１０３１．５２）に分子イオンピークが検出され、表６に示す比較化合物１の構造を有することが同定された。
＜比較化合物１の製造方法＞
キノリン３０部と、無水塩化アルミニウム０．２部との溶液に、アンモニアガスを導入し、さらに３－（２，６－ジメチル－３－ペントキシ）フタロニトリルを１．０部添加し、この溶液を１８０℃で７時間反応させた。この反応液を室温まで冷却した後、メタノール２００部と１０％塩酸水溶液２００部を加えた。次いで、析出した固体をろ取し、水２００部で固体の洗浄を行った。洗浄後の固体を８０℃で乾燥させ、表６に示す比較化合物１を得た（収率８５．４％）。質量分析の結果、ｍ／ｚ＝１０３１．４５（理論値１０３１．５２）に分子イオンピークが検出され、表６に示す比較化合物１の構造を有することが同定された。
【0117】
［比較例２］
＜比較化合物２の製造方法＞
比較化合物を１．０部と、トリフェニルシラノール０．３５部とをジメチルスルホキシド２０部に溶解させ、この溶液を８０℃で８時間反応させた。この反応液を室温まで冷却した後、水５０部と食塩１０部を加えた。次いで、析出した固体をろ取し、水５０部で固体の洗浄を行った。洗浄後の固体を８０℃で乾燥させ、１．００部の表６に示す比較化合物２を得た（収率８０．５％）。質量分析の結果、ｍ／ｚ＝１２７１．５３（理論値１２７１．６４）に分子イオンピークが検出され、表６に示す比較化合物２の構造を有することが同定された。
＜比較化合物２の製造方法＞
比較化合物を１．０部と、トリフェニルシラノール０．３５部とをジメチルスルホキシド２０部に溶解させ、この溶液を８０℃で８時間反応させた。この反応液を室温まで冷却した後、水５０部と食塩１０部を加えた。次いで、析出した固体をろ取し、水５０部で固体の洗浄を行った。洗浄後の固体を８０℃で乾燥させ、１．００部の表６に示す比較化合物２を得た（収率８０．５％）。質量分析の結果、ｍ／ｚ＝１２７１．５３（理論値１２７１．６４）に分子イオンピークが検出され、表６に示す比較化合物２の構造を有することが同定された。
【0118】
［比較例３］
比較化合物３として、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈより購入した「Ａｌｕｍｉｎｕｍ １，８，１５，２２－ｔｅｔｒａｋｉｓ（ｐｈｅｎｙｌｔｈｉｏ）－２９Ｈ，３１Ｈ－ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ」を使用した。
比較化合物３として、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈより購入した「Ａｌｕｍｉｎｕｍ １，８，１５，２２－ｔｅｔｒａｋｉｓ（ｐｈｅｎｙｌｔｈｉｏ）－２９Ｈ，３１Ｈ－ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ」を使用した。
【0119】
［比較例４］
比較化合物４として、化合物Ａ－１を使用した。
比較化合物４として、化合物Ａ－１を使用した。
【0120】
［比較例５］
比較化合物５として、化合物Ａ－２を使用した。
比較化合物５として、化合物Ａ－２を使用した。
【0121】
【表6】
【0122】
＜ＩＩ＞色素溶液
［実施例２５］
＜色素溶液１の調製＞
ジメチルスルホキシド１０ｍｌに蛍光標識用色素１を０．２０１４ｍｇ溶解した。この溶液を孔径０．２μｍのナイロン製メンブレンフィルターを用いてろ過し、色素濃度２０μＭの色素溶液１を調製した。
［実施例２５］
＜色素溶液１の調製＞
ジメチルスルホキシド１０ｍｌに蛍光標識用色素１を０．２０１４ｍｇ溶解した。この溶液を孔径０．２μｍのナイロン製メンブレンフィルターを用いてろ過し、色素濃度２０μＭの色素溶液１を調製した。
【0123】
［実施例２６～４８］
＜色素溶液２～２４の調製＞
色素溶液１の調製で使用した蛍光標識用色素１を、表７に示す蛍光標識用色素と溶剤に変更した以外は、色素溶液１の調製と同様にして、色素溶液２～２４をそれぞれ調製した。但し、各蛍光標識用色素は蛍光標識用色素１と同じモル量使用した。
＜色素溶液２～２４の調製＞
色素溶液１の調製で使用した蛍光標識用色素１を、表７に示す蛍光標識用色素と溶剤に変更した以外は、色素溶液１の調製と同様にして、色素溶液２～２４をそれぞれ調製した。但し、各蛍光標識用色素は蛍光標識用色素１と同じモル量使用した。
【0124】
［比較例６～１０］
＜色素溶液２５～２９の調製＞
色素溶液１の調製で使用した蛍光標識用色素１を、表７に示す蛍光標識用色素に変更した以外は、色素溶液１の調製と同様にして、色素溶液２５～２９をそれぞれ調製した。但し、各蛍光標識用色素は蛍光標識用色素１と同じモル量使用した。
＜色素溶液２５～２９の調製＞
色素溶液１の調製で使用した蛍光標識用色素１を、表７に示す蛍光標識用色素に変更した以外は、色素溶液１の調製と同様にして、色素溶液２５～２９をそれぞれ調製した。但し、各蛍光標識用色素は蛍光標識用色素１と同じモル量使用した。
【0125】
【表7】
【0126】
＜蛍光標識用色素の粒子径の測定＞
各々の色素溶液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１０倍希釈して色素濃度２μＭの色素分散液Ｉを得た後、すぐに粒度分布測定装置（スペクトリス株式会社製、ゼータサイザーナノ ＺＳＰ）にて測定した。各蛍光標識用色素の色素分散体のＺ平均粒子径を、下記の基準に基づいて判定した。判定結果を表８中の「平均粒子径」に示す。
（判定基準）
４：Ｚ平均粒子径 １００ｎｍ未満
３：Ｚ平均粒子径 １００ｎｍ以上～３００ｎｍ未満
２：Ｚ平均粒子径 ３００ｎｍ以上～５００ｎｍ以下
１：Ｚ平均粒子径 ５００ｎｍ超
各々の色素溶液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１０倍希釈して色素濃度２μＭの色素分散液Ｉを得た後、すぐに粒度分布測定装置（スペクトリス株式会社製、ゼータサイザーナノ ＺＳＰ）にて測定した。各蛍光標識用色素の色素分散体のＺ平均粒子径を、下記の基準に基づいて判定した。判定結果を表８中の「平均粒子径」に示す。
（判定基準）
４：Ｚ平均粒子径 １００ｎｍ未満
３：Ｚ平均粒子径 １００ｎｍ以上～３００ｎｍ未満
２：Ｚ平均粒子径 ３００ｎｍ以上～５００ｎｍ以下
１：Ｚ平均粒子径 ５００ｎｍ超
【0127】
＜蛍光標識用色素の吸光度維持率の測定＞
各々の色素溶液をジメチルスルホキシドで１０倍希釈して色素濃度２μＭの色素溶液Ｉを得た後に、分光光度計（株式会社日立ハイテクノロジーズ社製、Ｕ－４１００）を用いて吸収スペクトルを測定し、最大吸収波長における吸光度Ａ０を得た。また、各々の色素溶液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１０倍希釈して色素濃度２μＭの色素分散液ＩＩを得た後、すぐに上記分光光度計を用いて吸収スペクトルを測定し、最大吸収波長における吸光度Ａ１を得た。得られたＡ０、Ａ１の値を用いて式（Ｉ）から吸光度維持率を算出し、下記の基準に基づいて判定した。判定結果を表８中の「吸光度維持率」に示す。
（判定基準）
４：吸光度維持率 ０．８以上
３：吸光度維持率 ０．８未満～０．５以上
２：吸光度維持率 ０．５未満～０．３以上
１：吸光度維持率 ０．３未満
各々の色素溶液をジメチルスルホキシドで１０倍希釈して色素濃度２μＭの色素溶液Ｉを得た後に、分光光度計（株式会社日立ハイテクノロジーズ社製、Ｕ－４１００）を用いて吸収スペクトルを測定し、最大吸収波長における吸光度Ａ０を得た。また、各々の色素溶液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１０倍希釈して色素濃度２μＭの色素分散液ＩＩを得た後、すぐに上記分光光度計を用いて吸収スペクトルを測定し、最大吸収波長における吸光度Ａ１を得た。得られたＡ０、Ａ１の値を用いて式（Ｉ）から吸光度維持率を算出し、下記の基準に基づいて判定した。判定結果を表８中の「吸光度維持率」に示す。
（判定基準）
４：吸光度維持率 ０．８以上
３：吸光度維持率 ０．８未満～０．５以上
２：吸光度維持率 ０．５未満～０．３以上
１：吸光度維持率 ０．３未満
【0128】
図１に、蛍光標識用色素７を２０μＭ含む色素溶液７をジメチルスルホキシドおよびＰＢＳで１０倍希釈した時の吸収スペクトルを示す。
【0129】
図２に、比較化合物２を２０μＭ含む色素溶液２６をジメチルスルホキシドおよびＰＢＳで１０倍希釈した時の吸収スペクトルを示す。
【0130】
＜ＩＩＩ＞蛍光標識剤
＜蛍光標識剤の調製＞
各々の色素溶液をイーグル最少必須培地で２０倍希釈し、１μＭの蛍光標識用色素を含む蛍光標識剤を調製した。
＜蛍光標識剤の調製＞
各々の色素溶液をイーグル最少必須培地で２０倍希釈し、１μＭの蛍光標識用色素を含む蛍光標識剤を調製した。
【0131】
＜蛍光標識用色素の細胞染色性評価＞
Ｈｅｌａ細胞を９６ウェルプレートに播種（１×１０４ ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）し、１０％Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）および１％ペニシリン―ストレプトマイシンを含ませたイーグル最少必須培地を用いて、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２含有Ａｉｒ、加湿環境）内で４８時間培養した。その後培地を取り除き、上記にて調製した蛍光標識剤を各ウェルに添加した。これをインキュベーター内に１時間静置した後、イーグル最少必須培地で洗浄した。プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社製、ＳＰＡＲＫ）を用いて、７８０～８００ｎｍの範囲内で蛍光強度測定を行い、下記の基準に基づいて評価した。評価が２以上である蛍光標識用色素はＰＢＳ分散時の色素微粒子の粒子径が小さく、エンドサイトーシスによる細胞膜透過性が良好で、細胞質染色に適しているといえる。評価結果を表８中の「細胞染色時の蛍光強度」に示す。
（評価基準）
４：蛍光強度測定値 ２０００以上
３：蛍光強度測定値 ２０００未満～１０００以上
２：蛍光強度測定値 １０００未満～５００以上
１：蛍光強度測定値 ５００未満
Ｈｅｌａ細胞を９６ウェルプレートに播種（１×１０４ ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）し、１０％Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）および１％ペニシリン―ストレプトマイシンを含ませたイーグル最少必須培地を用いて、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２含有Ａｉｒ、加湿環境）内で４８時間培養した。その後培地を取り除き、上記にて調製した蛍光標識剤を各ウェルに添加した。これをインキュベーター内に１時間静置した後、イーグル最少必須培地で洗浄した。プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社製、ＳＰＡＲＫ）を用いて、７８０～８００ｎｍの範囲内で蛍光強度測定を行い、下記の基準に基づいて評価した。評価が２以上である蛍光標識用色素はＰＢＳ分散時の色素微粒子の粒子径が小さく、エンドサイトーシスによる細胞膜透過性が良好で、細胞質染色に適しているといえる。評価結果を表８中の「細胞染色時の蛍光強度」に示す。
（評価基準）
４：蛍光強度測定値 ２０００以上
３：蛍光強度測定値 ２０００未満～１０００以上
２：蛍光強度測定値 １０００未満～５００以上
１：蛍光強度測定値 ５００未満
【0132】
図３に、蛍光標識用色素７を用いて細胞染色した時の蛍光顕微鏡観察画像を示す（倍率：４０倍、蛍光取り込み時間：１秒）。
【0133】
図４に、比較化合物２を用いて細胞染色した時の蛍光顕微鏡観察画像を示す（倍率：４０倍、蛍光取り込み時間：１秒）。
【0134】
上記の結果から、本発明の蛍光標識用色素はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に分散させた際に生じる色素微粒子の平均粒子径が５００ｎｍ以下と小さく、また細胞染色性が高いことが確認された。一方、比較化合物１～５は、ＰＢＳに分散させたときの平均粒子径が大きく、細胞染色性が低いことが確認された。この理由として、比較化合物１～５は色素の疎水性が高いためにＰＢＳ添加時に粒子径の大きな色素分散体を形成しやすく、細胞質内への送達効率が大きく低下しているためであると考えられる。また、本発明の蛍光標識用色素は吸光度維持率が高いため、水系溶媒に分散させた場合でも励起光吸収率が低下せず、細胞染色時においても高い蛍光強度を示したと考えられる。よって本発明によれば、蛍光標識用色素を有機溶媒に溶解させた色素溶液をＰＢＳに対して添加した色素分散液において形成される色素分散体の平均粒子径が５００ｎｍ以下であり、式（Ｉ）により算出される吸光度維持率が０．５以上である蛍光標識用色素は、細胞質の染色効率が高く、細胞質染色色素として好適に利用できることを見出した。
【0135】
【表8】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
