特許 7384365 口腔乾燥症を診断するための唾液バイオマーカー及びその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-11-13

(45)【発行日】2023-11-21

(54)【発明の名称】口腔乾燥症を診断するための唾液バイオマーカー及びその用途

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/50 20060101AFI20231114BHJP

   G01N 33/68 20060101ALI20231114BHJP

   C12Q 1/6851 20180101ALN20231114BHJP

   C07K 16/40 20060101ALN20231114BHJP

   C07K 16/42 20060101ALN20231114BHJP

   C07K 16/18 20060101ALN20231114BHJP

   C12N 15/115 20100101ALN20231114BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20231114BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20231114BHJP

   C12N 15/53 20060101ALN20231114BHJP

   C12N 15/54 20060101ALN20231114BHJP

   C12N 15/52 20060101ALN20231114BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20231114BHJP

【ＦＩ】

G01N33/50 G

G01N33/68

C12Q1/6851 Z

C07K16/40

C07K16/42

C07K16/18

C12N15/115 Z

C12N15/13

C12N15/12

C12N15/53

C12N15/54

C12N15/52 Z

C12N15/113 Z

【請求項の数】 13

(21)【出願番号】P 2021180275

(22)【出願日】2021-11-04

(65)【公開番号】P2022080853

(43)【公開日】2022-05-30

【審査請求日】2021-11-04

(31)【優先権主張番号】10-2020-0154577

(32)【優先日】2020-11-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2020-0154578

(32)【優先日】2020-11-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】304039548

【氏名又は名称】コリア・インスティテュート・オブ・サイエンス・アンド・テクノロジー

(73)【特許権者】

【識別番号】507107394

【氏名又は名称】アイユーシーエフ－エイチワイユー（インダストリー－ユニバーシティー コーオペレイション ファウンデーション ハンヤン ユニバーシティー）

(74)【代理人】

【識別番号】110000338

【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ

(72)【発明者】

【氏名】ファン，キョン－ギュン

(72)【発明者】

【氏名】イ，ジョン ファ

(72)【発明者】

【氏名】イ，ジ ウン

(72)【発明者】

【氏名】イ，ス ジン

(72)【発明者】

【氏名】パク，イェ ウン

【審査官】高田 亜希

(56)【参考文献】

【文献】特開２００８－２４９６１８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００９－２６４９８８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００６－５２８６６２（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１５／０２７３０８３（ＵＳ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１４／０３１４７１５（ＵＳ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１０／００２１９０６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】Yoo, MH, Rhee, Y-H, Jung, JY, et al.，TRPV1 regulates inflammatory process in the tongue of surgically induced xerostomia mouse，Head & Neck，2019年11月13日，Volume 42, Issue 2，198-209

【文献】Shin Eui Kang，Soluble Semaphorin 4D/CD100 Is Increased in the Saliva of Sjogren’s Syndrome，2018 ACR/ARHP Annual Meeting Online Program，2018年10月22日，1

【文献】Tomoko Ichiyama, Eiji Nakatani, Kasumi Tatsumi, Katsumi Hideshima, Takeshi Urano, Yoshiki Nariai, Joji Sekine，Expression of aquaporin 3 and 5 as a potential marker for distinguishing dry mouth from Sjogren’s syndrome，Journal of Oral Science，2018年06月20日，60 巻, 2 号，p. 212-220

【文献】Nguyen, C.Q., Sharma, A., Lee, B.H. et al.，Differential gene expression in the salivary gland during development and onset of xerostomia in Sjogren's syndrome-like disease of the C57BL/6.NOD-Aec1Aec2mouse，Arthritis Res Ther，2009年04月20日，11，R56

【文献】Fleissig, Y., Deutsch, O., Reichenberg, E., Redlich, M., Zaks, B., Palmon, A. and Aframian, D.，Different proteomic protein patterns in saliva of Sjogren's syndrome patients，Oral Diseases，2008年12月10日，15，61-68，https://doi.org/10.1111/j.1601-0825.2008.01465.x

【文献】Baldini, C., Giusti, L., Ciregia, F. et al.，Correspondence between salivary proteomic pattern and clinical course in primary Sjogren syndrome and non-Hodgkin's lymphoma: a case report，J Transl Med，2011年11月02日，9，188，https://doi.org/10.1186/1479-5876-9-188

【文献】Atsuko Igarashi, Kouji Katsura, Kayoko Ito, Saori Funayama，Current Status of Salivary Gland Diseases: Sjogren's Syndrome and Dry Mouth，Journal of Oral Biosciences，2011年，Volume 53, Issue 1，Pages 31-37，https://doi.org/10.1016/S1349-0079(11)80033-2

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３３／４８ －３３／９８

Ｃ１２Ｑ １／６８５１

Ｃ０７Ｋ １６／１８ －１６／４２

Ｃ１２Ｎ １５／１１３－１５／５４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＮＵＣＢ２（Nucleobindin－２）遺伝子の発現レベル、あるいは蛋白質またはその断片の発現レベルを測定する製剤を含む、口腔乾燥症診断用組成物。

【請求項2】

唾液試料において検出するためのものである、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前述のＮＵＣＢ２遺伝子の発現レベルは、正常対照群の発現レベルに比べて低下する、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

前記製剤は、
前記蛋白質またはその断片に特異的に結合する抗体、その抗原結合断片またはアプタマー、または
前記蛋白質またはその断片を暗号化するポリヌクレオチドと同一であるか、またはそれに相補的なポリヌクレオチドを含む核酸である、請求項１に記載の組成物。

【請求項5】

前記抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である、請求項４に記載の組成物。

【請求項6】

前記核酸は、プライマー、プローブまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項４に記載の組成物。

【請求項7】

ＫＶ１０８（immunoglobulin kappa variable １－８）、ＧＳＬＧ１（golgi apparatus protein １）、ＦＡＭ３Ｂ（protein ＦＡＭ３Ｂ）、ＭＵＣ２１（mucin－２１）、ＲＢ１１Ａ（Ｒａｓ－related protein Ｒａｂ－１１Ａ）、ＬＹＳＣ（Lysozyme Ｃ）、ＣＡＬＬ３（calmodulin－like protein ３）、Ａ１ＢＧ（alpha－１Ｂ－glycoprotein）、Ａ１ＡＧ１（alpha－１－acid glycoprotein １）、ＣＡＬＲ（calreticulin）、ＰＬＭＮ（plasminogen）、ＥＣＭ１（extracellular matrix protein １）、ＡＮＸＡ６（Annexin Ａ６）、ＷＤＲ１（ＷＤ repeat－containing protein １）、ＩＬＥＵ（leukocyte elastase inhibitor）、ＦＥＴＵＡ（alpha－２－ＨＳ－glycoprotein）、ＭＮＤＡ（myeloid cell nuclear differentiation antigen）、ＭＭＰ９（matrix metalloproteinase－９）、ＮＧＡＬ（neutrophil gelatinase－associated lipocalin）、ＤＯＰＤ（Ｄ－dopachrome decarboxylase）、ＭＭＰ８（neutrophil collagenase）、Ａ１ＡＴ（alpha－１－antitrypsin）、ＩＧＧ１（Immunoglobulin gamma－１ heavy chain）、ＰＤＣＤ６ＩＰ（Programmed cell death ６－interacting protein）、ＰＴＧＲ１（Prostaglandin reductase １）、ＦＡＭ３Ｄ、ＺＧ１６Ｂ（Zymogen granule protein １６ homolog Ｂ）、ＡＮＴ３（Antithrombin－ＩＩＩ）、ＡＴＰＡ（ＡＴＰ synthase subunit alpha， mitochondrial）、ＨＲＧ（histidine－rich glycoprotein）、Ｈ１５（histone Ｈ１．５）、Ｈ２Ｂ１Ｌ（histone Ｈ２Ｂ type １－Ｌ）、ＰＣＢＰ１（poly（ｒＣ）－binding protein １）及びＰＴＰＲＪ（receptor－type tyrosine－protein phosphatase eta）からなる群のうちから選択された遺伝子の発現レベル、あるいは蛋白質またはその断片の発現レベルを測定する製剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項8】

ＮＵＣＢ２遺伝子の発現レベル、あるいは蛋白質またはその断片の発現レベルを測定する製剤を含む、口腔乾燥症診断用キット。

【請求項9】

ＫＶ１０８、ＧＳＬＧ１、ＦＡＭ３Ｂ、ＭＵＣ２１、ＲＢ１１Ａ、ＬＹＳＣ、ＣＡＬＬ３、Ａ１ＢＧ、Ａ１ＡＧ１、ＣＡＬＲ、ＰＬＭＮ、ＥＣＭ１、ＡＮＸＡ６、ＷＤＲ１、ＩＬＥＵ、ＦＥＴＵＡ、ＭＮＤＡ、ＭＭＰ９、ＮＧＡＬ、ＤＯＰＤ、ＭＭＰ８、Ａ１ＡＴ、ＩＧＧ１、ＰＤＣＤ６ＩＰ、ＰＴＧＲ１、ＦＡＭ３Ｄ、ＺＧ１６Ｂ、ＡＮＴ３、ＡＴＰＡ、ＨＲＧ、Ｈ１５、Ｈ２Ｂ１Ｌ、ＰＣＢＰ１及びＰＴＰＲＪからなる群のうちから選択された遺伝子の発現レベル、あるいは蛋白質またはその断片の発現レベルを測定する製剤をさらに含む、請求項８に記載のキット。

【請求項10】

口腔乾燥症が疑われる個体から分離された唾液試料において、ＮＵＣＢ２遺伝子の発現レベル、あるいは蛋白質またはその断片の発現レベルを測定する段階と、
前記測定された発現レベルを、正常対照群の発現レベルと比較する段階と、を含む、口腔乾燥症の診断に必要な情報を提供するためにバイオマーカーを検出する方法。

【請求項11】

前記測定する段階は、前記唾液試料と、前記蛋白質またはその断片に特異的に結合する抗体、その抗原結合断片またはアプタマーと、をインキュベーションさせるか、あるいは前記遺伝子をコーディングするポリヌクレオチドと同一であるか、あるいはそれに相補的なポリヌクレオチドをインキュベーションさせる段階を含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記測定する段階は、ＬＣ－ＭＳによって遂行される、請求項１０に記載の方法。

【請求項13】

ＫＶ１０８、ＧＳＬＧ１、ＦＡＭ３Ｂ、ＭＵＣ２１、ＲＢ１１Ａ、ＬＹＳＣ、ＣＡＬＬ３、Ａ１ＢＧ、Ａ１ＡＧ１、ＣＡＬＲ、ＰＬＭＮ、ＥＣＭ１、ＡＮＸＡ６、ＷＤＲ１、ＩＬＥＵ、ＦＥＴＵＡ、ＭＮＤＡ、ＭＭＰ９、ＮＧＡＬ、ＤＯＰＤ、ＭＭＰ８、Ａ１ＡＴ、ＩＧＧ１、ＰＤＣＤ６ＩＰ、ＰＴＧＲ１、ＦＡＭ３Ｄ、ＺＧ１６Ｂ、ＡＮＴ３、ＡＴＰＡ、ＨＲＧ、Ｈ１５、Ｈ２Ｂ１Ｌ、ＰＣＢＰ１及びＰＴＰＲＪからなる群のうちから選択された遺伝子の発現レベル、あるいは蛋白質またはその断片の発現レベルを測定する段階をさらに含む、請求項１０に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、口腔乾燥症を診断するための唾液バイオマーカー、それを利用した口腔乾燥症診断用組成物、そのキット、及びそれを利用したバイオマーカーの検出方法に関する。

【背景技術】

【0002】

唾液腺機能は、さまざまな状態によって影響を受けることになる。口腔乾燥症は、口内に唾液がなく、主観的に、口腔乾燥を感じるものである。口腔乾燥症により、唾液腺の機能が低下し、潤滑作用または抗菌作用の機能が低下すれば、口腔に現われる二次疾患として、歯牙齲蝕と歯周疾患が示されうる。該口腔乾燥症は、唾液分泌機能低下初期段階においては、認知し難く、一時的な口腔乾燥症と、器質的な口腔乾燥症との区分が困難であり、器質的な唾液腺機能低下による口腔乾燥症は、迅速な診断が困難である。老化による老人性口腔乾燥症も、器質的な唾液腺機能低下に起因する。該唾液腺機能低下による口腔乾燥症は、病気が進んだ後、完治が困難であり、治療法も、疾病を完全に治療するものではなく、症状を緩和するところに重点を置いている。

【0003】

口腔乾燥症は、シェーグレン症侯群、貧血、糖尿、老化、薬物服用、神経系疾患のような多様な原因によっても生じる。最近、該口腔乾燥症を有する個体の唾液試料においてバイオマーカーを検出し、シェーグレン症侯群（Sjogren's syndrome:）を診断して治療する方法が開発された（特許文献１）。しかし、該口腔乾燥症を診断するためのバイオマーカーは、開発されていない。

【0004】

従って、口腔乾燥症を迅速であり、客観的であり、簡便であり、廉価でもって診断することができ、診断の正確度及び特異度が高いバイオマーカーを開発する必要がある。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【文献】米国特許公告ＵＳ９，８３３，５１９Ｂ２

【文献】国際公開ＷＯ２０２１／０８６０６７Ａ１

【文献】韓国特許ＫＲ１０－２０９１４８３Ｂ１

【文献】米国特許出願公開ＵＳ２０１５／０２１９６６５Ａ１

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明が解決しようとする課題は、口腔乾燥症診断用組成物を提供することである。

【0007】

本発明が解決しようとする課題は、また、口腔乾燥症診断用キットを提供することである。

【0008】

本発明が解決しようとする課題は、また、口腔乾燥症の診断方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0009】

前記課題を解決するために、本発明は、ＮＵＣＢ２（Nucleobindin－２）、ＰＤＣＤ６ＩＰ（Programmed cell death ６－interacting protein）、ＰＴＧＲ１（Prostaglandin reductase １）、ＦＡＭ３Ｄ、ＺＧ１６Ｂ（Zymogen granule protein １６ homolog Ｂ）、Ａ１ＡＴ（alpha－１－antitrypsin）、ＡＮＴ３（Antithrombin－ＩＩＩ）、ＡＴＰＡ（ＡＴＰ synthase subunit alpha，mitochondrial）、ＨＲＧ（histidine－rich glycoprotein）、Ｈ１５（histone Ｈ１．５）、Ｈ２Ｂ１Ｌ（histone Ｈ２Ｂ type １－Ｌ）、ＩＧＧ１（Immunoglobulin gamma－１heavy chain）、ＰＣＢＰ１（poly（ｒＣ）－binding protein １）及びＰＴＰＲＪ（receptor－type tyrosine－protein phosphatase eta）からなる群のうちから選択された遺伝子の発現レベル、あるいは蛋白質またはその断片の発現レベルを測定する製剤を含む口腔乾燥症診断用組成物を提供する。

【0010】

前記課題を解決するために、本発明は、ＮＵＣＢ２、ＰＤＣＤ６ＩＰ、ＰＴＧＲ１、ＦＡＭ３Ｄ、ＺＧ１６Ｂ、Ａ１ＡＴ、ＡＮＴ３、ＡＴＰＡ、ＨＲＧ、Ｈ１５、Ｈ２Ｂ１Ｌ、ＩＧＧ１、ＰＣＢＰ１及びＰＴＰＲＪからなる群のうちから選択された遺伝子の発現レベル、あるいは蛋白質またはその断片の発現レベルを測定する製剤を含む口腔乾燥症診断用キットを提供する。

【0011】

前記課題を解決するために、本発明は、口腔乾燥症が疑われる個体から分離された唾液試料において、ＮＵＣＢ２、ＰＤＣＤ６ＩＰ、ＰＴＧＲ１、ＦＡＭ３Ｄ、ＺＧ１６Ｂ、Ａ１ＡＴ、ＡＮＴ３、ＡＴＰＡ、ＨＲＧ、Ｈ１５、Ｈ２Ｂ１Ｌ、ＩＧＧ１、ＰＣＢＰ１及びＰＴＰＲＪからなる群のうちから選択された遺伝子の発現レベル、あるいは蛋白質またはその断片の発現レベルを測定する段階と、前記測定された発現レベルを、正常対照群の発現レベルと比較する段階と、前述のＮＵＣＢ２、ＰＤＣＤ６ＩＰ、ＰＴＧＲ１、ＦＡＭ３Ｄ及びＺＧ１６Ｂからなる群のうちから選択された遺伝子の発現レベルが、正常対照群の発現レベルと比較して低下するか、あるいは前述のＡ１ＡＴ、ＡＮＴ３、ＡＴＰＡ、ＨＲＧ、Ｈ１５、Ｈ２Ｂ１Ｌ、ＩＧＧ１、ＰＣＢＰ１及びＰＴＰＲＪからなる群のうちから選択された遺伝子の発現レベルが、正常対照群の発現レベルと比較して上昇した場合、口腔乾燥症と決定する段階と、を含む、口腔乾燥症の診断に必要な情報を提供するためにバイオマーカーを検出する方法を提供する。

【発明の効果】

【0012】

一様相による口腔乾燥症診断用組成物、そのキット、及びそれを利用した口腔乾燥症の診断方法によれば、口腔乾燥症を簡便であって客観的であり、高い正確度及び特異度でもって診断するのに利用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】正常対照群と口腔乾燥症患者グループとの唾液試料のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルイメージである。

【図2】唾液試料で同定された蛋白質と、ｐ値が０．０５未満と、統計的に有意な蛋白質とを分析し、個数を示したベン図式である。

【図3A】ＮＵＣＢ２の正常対照群と口腔乾燥症患者群とのスコアによる発現レベルを示すグラフである（ｙ軸：LFQ強度、Ｎ：正常対照群、Ｓ１：スコア１、Ｓ２：スコア２、Ｓ３４５：スコア３以上）。

【図3B】ＰＤＣＤ６ＩＰの正常対照群と口腔乾燥症患者群とのスコアによる発現レベルを示すグラフである（ｙ軸：LFQ強度、Ｎ：正常対照群、Ｓ１：スコア１、Ｓ２：スコア２、Ｓ３４５：スコア３以上）。

【図3C】ＰＴＧＲ１の正常対照群と口腔乾燥症患者群とのスコアによる発現レベルを示すグラフである（ｙ軸：LFQ強度、Ｎ：正常対照群、Ｓ１：スコア１、Ｓ２：スコア２、Ｓ３４５：スコア３以上）。

【図3D】ＦＡＭ３Ｄの正常対照群と口腔乾燥症患者群とのスコアによる発現レベルを示すグラフである（ｙ軸：LFQ強度、Ｎ：正常対照群、Ｓ１：スコア１、Ｓ２：スコア２、Ｓ３４５：スコア３以上）。

【図3E】ＺＧ１６Ｂの正常対照群と口腔乾燥症患者群とのスコアによる発現レベルを示すグラフである（ｙ軸：LFQ強度、Ｎ：正常対照群、Ｓ１：スコア１、Ｓ２：スコア２、Ｓ３４５：スコア３以上）。

【図4A】Ａ１ＡＴの正常対照群と口腔乾燥症患者群とのスコアによる発現レベルを示すグラフである（ｙ－軸：LFQ強度、Ｎ：正常対照群、Ｓ１：スコア１、Ｓ２：スコア２、Ｓ３４５：スコア３以上）。

【図4B】ＡＮＴ３の正常対照群と口腔乾燥症患者群とのスコアによる発現レベルを示すグラフである（ｙ－軸：LFQ強度、Ｎ：正常対照群、Ｓ１：スコア１、Ｓ２：スコア２、Ｓ３４５：スコア３以上）。

【図4C】ＡＴＰＡの正常対照群と口腔乾燥症患者群とのスコアによる発現レベルを示すグラフである（ｙ－軸：LFQ強度、Ｎ：正常対照群、Ｓ１：スコア１、Ｓ２：スコア２、Ｓ３４５：スコア３以上）。

【図4D】ＨＲＧの正常対照群と口腔乾燥症患者群とのスコアによる発現レベルを示すグラフである（ｙ－軸：LFQ強度、Ｎ：正常対照群、Ｓ１：スコア１、Ｓ２：スコア２、Ｓ３４５：スコア３以上）。

【図4E】Ｈ１５の正常対照群と口腔乾燥症患者群とのスコアによる発現レベルを示すグラフである（ｙ－軸：LFQ強度、Ｎ：正常対照群、Ｓ１：スコア１、Ｓ２：スコア２、Ｓ３４５：スコア３以上）。

【図4F】Ｈ２Ｂ１Ｌの正常対照群と口腔乾燥症患者群とのスコアによる発現レベルを示すグラフである（ｙ－軸：LFQ強度、Ｎ：正常対照群、Ｓ１：スコア１、Ｓ２：スコア２、Ｓ３４５：スコア３以上）。

【図4G】ＩＧＧ１の正常対照群と口腔乾燥症患者群とのスコアによる発現レベルを示すグラフである（ｙ－軸：LFQ強度、Ｎ：正常対照群、Ｓ１：スコア１、Ｓ２：スコア２、Ｓ３４５：スコア３以上）。

【図4H】ＰＣＢＰ１の正常対照群と口腔乾燥症患者群とのスコアによる発現レベルを示すグラフである（ｙ－軸：LFQ強度、Ｎ：正常対照群、Ｓ１：スコア１、Ｓ２：スコア２、Ｓ３４５：スコア３以上）。

【図4I】ＰＴＰＲＪの正常対照群と口腔乾燥症患者群とのスコアによる発現レベルを示すグラフである（ｙ－軸：LFQ強度、Ｎ：正常対照群、Ｓ１：スコア１、Ｓ２：スコア２、Ｓ３４５：スコア３以上）。

【発明を実施するための形態】

【0014】

一様態は、ＮＵＣＢ２（Nucleobindin－２）、ＰＤＣＤ６ＩＰ（Programmed cell death ６－interacting protein）、ＰＴＧＲ１（Prostaglandin reductase １）、ＦＡＭ３Ｄ、ＺＧ１６Ｂ（Zymogen granule protein １６ homolog Ｂ）、Ａ１ＡＴ（alpha－１－antitrypsin）、ＡＮＴ３（（Antithrombin－ＩＩＩ）、ＡＴＰＡ（ＡＴＰ synthase subunit alpha，mitochondrial）、ＨＲＧ（histidine－rich glycoprotein）、Ｈ１５（histone Ｈ１．５）、Ｈ２Ｂ１Ｌ（histone Ｈ２Ｂ type １－Ｌ）、ＩＧＧ１（Immunoglobulin gamma－１ heavy chain）、ＰＣＢＰ１（poly（ｒＣ）－binding protein １）及びＰＴＰＲＪ（receptor－type tyrosine－protein phosphatase eta）からなる群のうちから選択された遺伝子の発現レベル、あるいは蛋白質またはその断片の発現レベルを測定する製剤を含む口腔乾燥症診断用組成物を提供する。

【0015】

用語「口腔乾燥症（xerostomiaまたはdry mouth）」は、唾液分泌低減や、それ以外の他の多様な原因により、口内が乾く症状を言う。口腔乾燥症は、唾液腺機能低下（salivary gland hypofunction）とも呼ばれる。口腔乾燥症は、シェーグレン症侯群（Sjogren's syndrome）、貧血、糖尿、栄養素欠乏、老化、薬物服用（例：抗ヒスタミン剤、精神神経系作用薬物、高血圧治療剤）、神経系疾患、精神的疾患（例：鬱病）及び放射線療法などの原因によっても引き起こされる。口腔乾燥症が誘発されれば、乾燥感自体により、飲食物を飲み込み難く、話をするのが不便になるということを感じ、虫歯（歯牙齲蝕症）及び歯槽膿漏（歯周炎）の発生が増大して悪化しやすく、口腔内かび感染、舌痛症、口臭、味覚異常などが誘発されてしまう。口腔乾燥症は、口腔潰瘍のような口腔疾患の発生にも影響を及ぼしうる。口腔乾燥症は、唾液分泌量測定（休息時の唾液分泌量が０．１ｍＬ／分以下）、唾液腺造影術、組織検査または核医学検査方法によっても診断される。また、唾液腺組織検査を介しても診断することができるが、唾液腺組織における唾液腺実質の退縮程度によって診断することができる。シェーグレン症侯群症侯群において、唾液腺機能低下に係わる評価において、唾液腺組織内の免疫細胞の浸透様相を測定し、免疫細胞の浸透が多い程度により、スコア０ないし６に分類することができる。

【0016】

前記組成物は、唾液試料において検出するためのものでもある。

【0017】

前述のＮＵＣＢ２、ＰＤＣＤ６ＩＰ、ＰＴＧＲ１、ＦＡＭ３Ｄ及びＺＧ１６Ｂからなる群のうちから選択された遺伝子の発現レベルは、正常対照群の発現レベルに比べても低下する。

【0018】

ＮＵＣＢ２（Nucleobindin－２）は、カルシウム恒常性に機能を行うことができるカルシウム結合蛋白質であり、ＨＥＬ－Ｓ－１０９またはＮＥＦＡとも呼ばれる。ＮＵＣＢ２蛋白質は、ＮＵＣＢ２遺伝子によってコーディングされる蛋白質でもある。該ＮＵＣＢ２は、ヒトにおいて、UniProt番号Ｐ８０３０３のアミノ酸配列を含むものでもある。該ＮＵＣＢ２は、マウスにおいて、UniProt番号Ｐ８１１１７のアミノ酸配列を含むものでもある。

【0019】

ＰＤＣＤ６ＩＰ（Programmed cell death ６－interacting protein）は、細胞内取り込み（endocytosis）または予定細胞死（programmed cell death）に機能を行う蛋白質であり、ＡＩＰ１、ＡＬＩＸ、ＤＲＩＰ４またはＨＰ９５とも呼ばれる。ＰＤＣＤ６ＩＰの過発現は、細胞自殺（apoptosis）を遮断することができる。ＰＤＣＤ６ＩＰは、ヒトにおいて、UniProt番号Ｑ８ＷＵＭ４のアミノ酸配列を含むものでもある。ＰＤＣＤ６ＩＰは、マウスにおいて、UniProt番号Ｑ９ＷＵ７８のアミノ酸配列を含むものでもある。

【0020】

ＰＴＧＲ１（Prostaglandin reductase １）は、プロスタグランジン（prostaglandin）、ロイコトリエン（leukotriene）及びリポキシン（lipoxin）の炎症性及び抗炎症性のエイコサノイド（eicosanoid）の代謝不活性化に関与するＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性酸化還元酵素である。ＰＴＧＲ１は、ＰＲＧ－１、１５－オキソプロスタグランジン１３－還元酵素（１５－oxoprostaglandin １３－reductase）、ジチオールエチオン誘導性遺伝子１蛋白質（dithiolethione－inducible gene １ protein）、ＤＩＧ－１、ロイコトリエンＢ４１２－ヒドロキシ脱水素（ＬＴＢ４ＤＨ：leukotriene Ｂ４１２－hydroxydehydrogenase）またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性アルケナル／オン酸化還元酵素（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ－dependent alkenal／one oxidoreductase）とも呼ばれる。該ＰＴＧＲ１は、ヒトにおいて、UniProt番号Ｑ１４９１４のアミノ酸配列を含むものでもある。該ＰＴＧＲ１は、マウスにおいて、UniProt番号Ｐ４８７５８のアミノ酸配列を含むものでもある。

【0021】

ＦＡＭ３Ｄは、サイトカイン活性に機能することができ、グルカゴン分泌またはインシュリン分泌において、陰性調節を担当することができる。該ＦＡＭ３Ｄは、ヒトにおいて、UniProt番号Ｑ９６ＢＱ１のアミノ酸配列を含むものでもある。該ＦＡＭ３Ｄは、マウスにおいて、UniProt番号Ｐ９７８０５のアミノ酸配列を含むものでもある。

【0022】

ＺＧ１６Ｂ（Zymogen granule protein １６ homolog Ｂ）は、炭水化物結合または網膜恒常性に機能を担当することができる。ＺＧ１６Ｂは、ＥＥＣＰ、ＨＲＰＥ７７３、ＪＣＬＮ２、ＰＡＵＦ、ＰＲＯ１５６７またはＬＯＣ１２４２２０とも呼ばれる。該ＺＧ１６Ｂは、ヒトにおいて、UniProt番号Ｑ９６ＤＡ０のアミノ酸配列を含むものでもある。該ＺＧ１６Ｂは、ラットにおいて、UniProt番号Ａ０Ａ０Ｇ２Ｋ７Ｙ９のアミノ酸配列を含むものでもある。

【0023】

前述のＡ１ＡＴ、ＡＮＴ３、ＡＴＰＡ、ＨＲＧ、Ｈ１５、Ｈ２Ｂ１Ｌ、ＩＧＧ１、ＰＣＢＰ１及びＰＴＰＲＪからなる群のうちから選択された遺伝子の発現レベルは、正常対照群の発現レベルに比べて上昇するものでもある。

【0024】

Ａ１ＡＴ（alpha－１－antitrypsin）は、セルピン（serpin）スーパーファミリーに属する蛋白質である。Ａ１ＡＴは、ＳＥＲＰＩＮＡ１、Ａ１Ａ、ＡＡＴ、ＰＩ、ＰＩ１、ＰＲＯ２２７５、ａｌｐｈａ１ＡＴ、serpin family Ａ member １またはｎＮＩＦとも呼ばれる。Ａ１ＡＴは、多様な蛋白質分解酵素を阻害する蛋白質分解酵素阻害剤でもある。Ａ１ＡＴは、一本鎖の糖蛋白質でもある。該Ａ１ＡＴは、ヒトにおいて、UniProt番号Ｐ０１００９のアミノ酸配列を含むものでもある。

【0025】

ＡＮＴ３（Antithrombin－ＩＩＩ）は、血液凝固システムのさまざまな酵素を非活性化させる小蛋白質である。ＡＮＴ３は、血漿において、トロンビンを非活性化させることができる。ＡＮＴ３は、ＳＥＲＰＩＮＣ１、ＡＴ３、ＡＴ３Ｄ、ＡＴＩＩＩ、ＴＨＰＨ７、serpin系列Ｃメンバー１、ＡＴＩＩＩ－Ｒ２、ＡＴＩＩＩ－Ｔ２またはＡＴＩＩＩ－Ｔ１とも呼ばれる。該ＡＮＴ３は、ヒトにおいて、UniProt番号Ｐ０１００８のアミノ酸配列を含むものでもある。該ＡＮＴ３は、マウスにおいて、UniProt番号Ｐ３２２６１のアミノ酸配列を含むものでもある。

【0026】

ＡＴＰＡ（ＡＴＰ synthase subunit alpha，mitochondrial）は、細胞呼吸電子輸送複合体によって生成される陽性子濃度勾配下において、ＡＤＰからＡＴＰを生合成する蛋白質をなすサブユニットである。ＡＴＰＡは、ＡＴＰ合成酵素Ｆ１サブユニットアルファとも呼ばれる。該ＡＴＰＡは、ヒトにおいて、UniProt番号Ｐ２５７０５のアミノ酸配列を含むものでもある。該ＡＴＰＡは、マウスにおいて、UniProt番号Ｑ０３２６５のアミノ酸配列を含むものでもある。

【0027】

ＨＲＧ（histidine－rich glycoprotein）は、肝臓で生成される糖蛋白質である。ＨＲＧは、ＨＰＲＧ、ＨＲＧＰまたはＴＨＰＨ１１とも呼ばれる。該ＨＲＧは、ヒトにおいて、UniProt番号Ｐ０４１９６のアミノ酸配列を含むものでもある。該ＨＲＧは、マウスにおいて、UniProt番号Ｑ９ＥＳＢ３のアミノ酸配列を含むものでもある。

【0028】

Ｈ１５（histone Ｈ１．５）は、ヌクレオソーム間のリンカーＤＮＡに結合し、クロマチンという巨大分子構造を形成する蛋白質である。Ｈ１５は、histone Ｈ１ａ、histone Ｈ１ｂまたはhistone Ｈ１ｓ－３とも呼ばれる。該Ｈ１５は、ヒトにおいて、UniProt番号Ｐ１６４０１のアミノ酸配列を含むものでもある。該Ｈ１５は、マウスにおいて、UniProt番号Ｐ４３２７６のアミノ酸配列を含むものでもある。

【0029】

Ｈ２Ｂ１Ｌ（histone Ｈ２Ｂtype １－Ｌ）は、ヌクレオソームをなす蛋白質のうち一つである。Ｈ２Ｂ１Ｌは、histone Ｈ２Ｂ．ｃとも呼ばれる。該Ｈ２Ｂ１Ｌは、ヒトにおいて、UniProt番号Ｑ９９８８０のアミノ酸配列を含むものでもある。

【0030】

ＩＧＧ１（Immunoglobulin gamma－１ heavy chain）は、抗体の重鎖でもある。ＩＧＧ１は、ＩＧＨＧ１またはImmunoglobulin gamma－１ heavy chain ＮＩＥとも呼ばれる。該ＩＧＧ１は、ヒトにおいて、UniProt番号Ｐ０ＤＯＸ５のアミノ酸配列を含むものでもある。該ＩＧＧ１は、マウスにおいて、UniProt番号Ｐ０１８６８または同Ｐ０１８６９のアミノ酸配列を含むものでもある。

【0031】

ＰＣＢＰ１（poly（ｒＣ）－binding protein １）は、オリゴｄＣに結合する一本鎖核酸結合蛋白質である。ＰＣＢＰ１は、ＨＥＬ－Ｓ－８５、ＨＮＲＰＥ１、ＨＮＲＰＸ、ｈｎＲＮＰ－Ｅ１またはｈｎＲＮＰ－Ｘとも呼ばれる。該ＰＣＢＰ１は、ヒトにおいて、UniProt番号Ｑ１５３６５のアミノ酸配列を含むものでもある。該ＰＣＢＰ１は、マウスにおいて、UniProt番号Ｐ６０３３５のアミノ酸配列を含むものでもある。

【0032】

ＰＴＰＲＪ（receptor－type tyrosine－protein phosphatase eta）は、ＣＴＮＮＤ１、ＦＬＴ３、ＰＤＧＦＲＢ、ＭＥＴ、ＲＥＴ（変異体ＭＥＮ２Ａ）、ＫＤＲ、ＬＹＮ、ＳＲＣ、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫ３、ＥＧＦＲ、ＴＪＰ１、ＯＣＬＮ、ＰＩＫ３Ｒ１及びＰＩＫ３Ｒ２の脱リン酸化に関与するチロシンホスファターゼである。ＰＴＰＲＪは、ＣＤ１４８、ＤＥＰ１、ＨＰＴＰｅｔａ、Ｒ－ＰＴＰ－ＥＴＡまたはＳＣＣ１とも呼ばれる。該ＰＴＰＲＪは、ヒトにおいて、UniProt番号Ｑ１２９１３のアミノ酸配列を含むものでもある。該ＰＴＰＲＪは、マウスにおいて、UniProt番号Ｑ６４４５５のアミノ酸配列を含むものでもある。

【0033】

前記断片（fragment）は、前記蛋白質の一部であり、免疫原性ポリペプチドでもある。
前記遺伝子は、前記蛋白質を暗号化する核酸を言う。前記遺伝子の発現レベルは、前記蛋白質を暗号化するｍＲＮＡの発現レベルでもある。該ｍＲＮＡの発現レベルは、ｍＲＮＡの相対的量、または絶対的な量でもある。前記遺伝子の発現レベルの測定は、ｍＲＮＡの量を測定することでもある。

【0034】

前記蛋白質またはその断片の発現レベルは、前記蛋白質またはその断片の相対的量、または絶対的な量でもある。前記蛋白質またはその断片の発現レベルの測定は、前記蛋白質またはその断片の量を測定することでもある。

【0035】

前記製剤は、前記蛋白質またはその断片に特異的に結合する抗体、その抗原結合断片またはアプタマー（aptamer）でもある。前記抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体でもある。用語「抗体（antibody）」は、用語「免疫グロブリン（immunoglobulin）」と相互交換的にも使用される。前記抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体でもある。前記抗体は、全長抗体でもある。前記抗原結合断片は、抗原結合部位を含むポリペプチドを言う。前記抗原結合断片は、単一ドメイン抗体（single－domain antibody）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはｓｃＦｖでもある。前記抗体または抗原結合断片は、固体支持体に付着されたものでもある。前記固体支持体は、例えば、金属チップ、プレートまたはウェル（well）の表面である。前記抗体または抗原結合断片は、抗体または抗原結合断片でもある。前記アプタマーは、前記蛋白質またはその断片に特異的に結合する単一鎖の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡまたは変形核酸）やペプチドでもある。

【0036】

前記製剤は、前記蛋白質またはその断片を暗号化するポリヌクレオチドと同一であるか、あるいはそれに相補的なポリヌクレオチドを含む核酸でもある。前記核酸は、プライマー、プローブまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドでもある。前述のプライマー、プローブまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、その末端または内部に、蛍光物質、化学発光物質（chemiluminescent）または放射性同位元素などよって標識されたものでもある。

【0037】

前記組成物は、ＫＶ１０８（immunoglobulin kappa variable １－８）、ＧＳＬＧ１（golgi apparatus protein １）、ＦＡＭ３Ｂ（protein ＦＡＭ３Ｂ）、ＭＵＣ２１（mucin－２１）、ＲＢ１１Ａ（Ｒａｓ－related protein Ｒａｂ－１１Ａ）、ＬＹＳＣ（Lysozyme Ｃ）、ＣＡＬＬ３（calmodulin－like protein ３）、Ａ１ＢＧ（alpha－１Ｂ－glycoprotein）、Ａ１ＡＧ１（alpha－１－acid glycoprotein １）、ＣＡＬＲ（calreticulin）、ＰＬＭＮ（plasminogen）、ＥＣＭ１（extracellular matrix protein １）、ＡＮＸＡ６（Annexin Ａ６）、ＷＤＲ１（ＷＤ repeat－containing protein １）、ＩＬＥＵ（leukocyte elastase inhibitor）、ＦＥＴＵＡ（alpha－２－ＨＳ－glycoprotein）、ＭＮＤＡ（myeloid cell nuclear differentiation antigen）、ＭＭＰ９（matrix metalloproteinase－９）、ＮＧＡＬ（neutrophil gelatinase－associated lipocalin）、ＤＯＰＤ（Ｄ－dopachrome decarboxylase）及びＭＭＰ８（neutrophil collagenase）からなる群のうちから選択された遺伝子の発現レベル、あるいは蛋白質またはその断片の発現レベルを測定する製剤をさらに含んでもよい。

【0038】

前述のＫＶ１０８、ＧＳＬＧ１、ＦＡＭ３Ｂ、ＭＵＣ２１、ＲＢ１１Ａ、ＬＹＳＣ及びＣＡＬＬ３からなる群のうちから選択された遺伝子の発現レベルは、正常対照群の発現レベルに比べて低下するものでもある。

【0039】

ＫＶ１０８（immunoglobulin kappa variable １－８）は、免疫グロブリン軽鎖の可変部位でもある。ＫＶ１０８は、ＩＧＫＶ１８、Ｌ９またはＩＧＫＶ１－８とも呼ばれる。該ＫＶ１０８は、ヒトにおいて、UniProt番号Ａ０Ａ０Ｃ４ＤＨ６７のアミノ酸配列を含むものでもある。

【0040】

ＧＳＬＧ１（golgi apparatus protein １）は、線維芽細胞成長因子（fibroblast growth factor）とＥ－セレクチンに結合することができる。ＧＳＬＧ１は、ＣＦＲ－１（cysteine－rich fibroblast growth factor receptor）、ＥＳＬ－１（Ｅ－selectin ligand １）またはgolgi sialoglycoprotein ＭＧ－１６０とも呼ばれる。該ＧＳＬＧ１は、ヒトにおいて、UniProt番号Ｑ９２８９６のアミノ酸配列を含むものでもある。該ＧＳＬＧ１は、マウスにおいて、UniProt番号Ｑ６１５４３のアミノ酸配列を含むものでもある。

【0041】

ＦＡＭ３Ｂ（protein ＦＡＭ３Ｂ）は、膵臓において、アルファ細胞及びベータ細胞の細胞自殺を誘導することができる。ＦＡＭ３Ｂは、cytokine－like protein ２－２１またはＰＡＮＤＥＲ（pancreatic－derived factor）とも呼ばれる。該ＦＡＭ３Ｂは、ヒトにおいて、UniProt番号Ｐ５８４９９のアミノ酸配列を含むものでもある。該ＦＡＭ３Ｂは、マウスにおいて、UniProt番号Ｑ９Ｄ３０９のアミノ酸配列を含むものでもある。

【0042】

ＭＵＣ２１（mucin－２１）は、肺癌腫のバイオマーカーでもある。ＭＵＣ２１は、エピグリカニン（epiglycanin）とも呼ばれる。該ＭＵＣ２１は、ヒトにおいて、UniProt番号Ｑ５ＳＳＧ８のアミノ酸配列を含むものでもある。該ＭＵＣ２１は、マウスにおいて、UniProt番号Ｄ９Ｎ００８または同Ａ８ＱＷ５０のアミノ酸配列を含むものでもある。

【0043】

ＲＢ１１Ａ（Ｒａｓ－related protein Ｒａｂ－１１Ａ）は、細胞内膜移動を調節するsmall ＧＴＰａｓｅ Ｒａｂでもある。ＲＢ１１Ａは、Ｒａｂ－１１またはＹＬ８とも呼ばれる。該ＲＢ１１Ａは、ヒトにおいて、UniProt番号Ｐ６２４９１のアミノ酸配列を含むものでもある。該ＲＢ１１Ａは、マウスにおいて、UniProt番号Ｐ６２４９２のアミノ酸配列を含むものでもある。

【0044】

ＬＹＳＣ（Lysozyme Ｃ）は、加水分解と糖転移とに機能を行う酵素である。ＬＹＳＣは、１，４－beta－Ｎ－acetylmuramidase Ｃとも呼ばれる。該ＬＹＳＣは、ヒトにおいて、UniProt番号Ｐ６１６２６のアミノ酸配列を含むものでもある。該ＬＹＳＣは、マウスにおいて、UniProt番号Ｐ１７８９７または同Ｐ０８９０５のアミノ酸配列を含むものでもある。

【0045】

ＣＡＬＬ３（calmodulin－like protein ３）は、ミオシン－１０の特定軽鎖として機能することができる。ＣＡＬＬ３は、ＣＬＰ（ＣａＭ－like protein）またはcalmodulin－related protein ＮＢ－１とも呼ばれる。該ＣＡＬＬ３は、ヒトにおいて、UniProt番号Ｐ２７４８２のアミノ酸配列を含むものでもある。該ＣＡＬＬ３は、マウスにおいて、UniProt番号医アミノ酸配列を含むものでもある。

【0046】

前述のＡ１ＢＧ、Ａ１ＡＧ１、ＣＡＬＲ、ＰＬＭＮ、ＥＣＭ１、ＡＮＸＡ６、ＷＤＲ１、ＩＬＥＵ、ＦＥＴＵＡ、ＭＮＤＡ、ＭＭＰ９、ＮＧＡＬ、ＤＯＰＤ及びＭＭＰ８からなる群のうちから選択された遺伝子の発現レベルは、正常対照群の発現レベルに比べて上昇するものでもある。

【0047】

Ａ１ＢＧ（alpha－１Ｂ－glycoprotein）は、好中球または血小板の脱顆粒（degranulation）に機能することができる。Ａ１ＢＧは、Ａ１Ｂ、ＡＢＧ、ＧＡＢ、ＨＹＳＴ２４７７またはアルファ－１－Ｂ糖蛋白質とも呼ばれる。該Ａ１ＢＧは、ヒトにおいて、UniProt番号Ｐ０４２１７のアミノ酸配列を含むものでもある。該Ａ１ＢＧは、マウスにおいて、UniProt番号Ｑ１９ＬＩ２のアミノ酸配列を含むものでもある。

【0048】

Ａ１ＡＧ１（alpha－１－acid glycoprotein １）は、血液において、伝達蛋白質として機能することができる。Ａ１ＡＧ１は、ＡＧＰ１またはＯＭＤ１（orosomucoid－１）とも呼ばれる。該Ａ１ＡＧ１は、ヒトにおいて、UniProt番号Ｐ０２７６３のアミノ酸配列を含むものでもある。該Ａ１ＡＧ１は、マウスにおいて、UniProt番号Ｑ６０５９０のアミノ酸配列を含むものでもある。

【0049】

ＣＡＬＲ（calreticulin）は、カルシウムイオンに結合する水溶性蛋白質である。ＣＡＬＲは、ＣＲＴ、ＨＥＬ－Ｓ－９９ｎ、ＲＯ、ＳＳＡまたはｃＣ１ｑＲとも呼ばれる。該ＣＡＬＲは、ヒトにおいて、UniProt番号Ｐ２７７９７のアミノ酸配列を含むものでもある。該ＣＡＬＲは、マウスにおいて、UniProt番号Ｐ１４２１１のアミノ酸配列を含むものでもある。

【0050】

ＰＬＭＮ（plasminogen）は、プラスミンの前駆体である。ＰＬＭＮは、、plasmin heavy chain Ａ、activation peptide、アンギオスタチン（angiostatin）、plasmin heavy chain Ａ（short form）及びplasmin light chain Ｂによっても切断される。該ＰＬＭＮは、ヒトにおいて、UniProt番号Ｐ００７４７のアミノ酸配列を含むものでもある。該ＰＬＭＮは、マウスにおいて、UniProt番号Ｐ０６８６９のアミノ酸配列を含むものでもある。

【0051】

ＥＣＭ１（extracellular matrix protein １）は、骨無機質化の陰性調節因子であり、軟骨内骨生成に関与する。ＥＣＭ１は、secretory component ｐ８５とも呼ばれる。該ＥＣＭ１は、ヒトにおいて、UniProt番号Ｑ１６６１０のアミノ酸配列を含むものでもある。該ＥＣＭ１は、マウスにおいて、UniProt番号Ｑ６１５０８のアミノ酸配列を含むものでもある。

【0052】

ＡＮＸＡ６（Annexin Ａ６）は、カルシウム依存性膜及びリン脂質結合蛋白質である。ＡＮＸＡ６は、ＡＮＸ６、ＣＢＰ６８、annexin Ａ６、ＣＰＢ－ＩＩ、ｐ７０またはｐ６８とも呼ばれる。該ＡＮＸＡ６は、ヒトにおいて、UniProt番号Ｐ０８１３３のアミノ酸配列を含むものでもある。該ＡＮＸＡ６は、マウスにおいて、UniProt番号Ｐ１４８２４のアミノ酸配列を含むものでもある。

【0053】

ＷＤＲ１（ＷＤ repeat－containing protein １）は、蛋白質間相互作用に関与しうる。ＷＤＲ１は、ＡＩＰ１、ＨＥＬ－Ｓ－５２またはＮＯＲＩ－１とも呼ばれる。該ＷＤＲ１は、ヒトにおいて、UniProt番号Ｏ７５０８３のアミノ酸配列を含むものでもある。該ＷＤＲ１は、マウスにおいて、UniProt番号Ｏ８８３４２のアミノ酸配列を含むものでもある。

【0054】

ＩＬＥＵ（leukocyte elastase inhibitor）は、先天性免疫反応、炎症及び細胞恒常性の調節に関与する好中球セリンプロテアーゼ阻害剤である。ＩＬＥＵは、ＬＥＩ、ＥＩ、Ｍ／ＮＥＩ（monocyte／neutrophil elastase inhibitor）、ＰＩ－２（peptidase inhibitor ２）またはserpin Ｂ１とも呼ばれる。該ＩＬＥＵは、ヒトにおいて、UniProt番号Ｐ３０７４０のアミノ酸配列を含むものでもある。該ＩＬＥＵは、マウスにおいて、UniProt番号Ｑ９Ｄ１５４のアミノ酸配列を含むものでもある。

【0055】

ＦＥＴＵＡ（alpha－２－ＨＳ－glycoprotein）は、胎児において豊富な血漿結合蛋白質である。ＦＥＴＵＡは、ＡＨＳＧ（alpha－２－ＨＳ－glycoprotein）、Ａ２ＨＳ、ＡＨＳまたはＨＳＧＡとも呼ばれる。該ＦＥＴＵＡは、ヒトにおいて、UniProt番号Ｐ０２７６５のアミノ酸配列を含むものでもある。該ＦＥＴＵＡは、マウスにおいて、UniProt番号Ｐ２９６９９のアミノ酸配列を含むものでもある。

【0056】

ＭＮＤＡ（myeloid cell nuclear differentiation antigen）は、顆粒球・単核球系細胞の核から検出される蛋白質である。ＭＮＤＡは、ＰＹＨＩＮ３とも呼ばれる。該ＭＮＤＡは、ヒトにおいて、UniProt番号Ｐ４１２１８のアミノ酸配列を含むものでもある。

【0057】

ＭＭＰ９（matrix metalloproteinase－９）は、細胞外基質の分解と係わる亜鉛・金属蛋白質分解酵素のうち一つである。ＭＭＰ９は、ＣＬＧ４Ｂ、ＧＥＬＢ、ＭＡＮＤＰ２、ＭＭＰ－９、９２ ｋＤａ ｔｙｐｅ ＩＶ collagenase、９２ ｋＤａgelatinaseまたはgelatinase Ｂとも呼ばれる。該ＭＭＰ９はヒトにおいて、UniProt番号Ｐ１４７８０のアミノ酸配列を含むものでもある。該ＭＭＰ９は、マウスにおいて、UniProt番号Ｐ４１２４５のアミノ酸配列を含むものでもある。

【0058】

ＮＧＡＬ（neutrophil gelatinase－associated lipocalin）は、先天性免疫に係わる蛋白質である。ＮＧＡＬは、ＬＣＮ２、２４ｐ３、ＭＳＦＩ、ｐ２５またはlipocalin ２とも呼ばれる。該ＮＧＡＬは、ヒトにおいて、UniProt番号Ｐ８０１８８のアミノ酸配列を含むものでもある。該ＮＧＡＬは、マウスにおいて、UniProt番号Ｐ１１６７２のアミノ酸配列を含むものでもある。

【0059】

ＤＯＰＤ（Ｄ－dopachrome decarboxylase）は、Ｄ－ドーパクロムを５，６－ジヒドロキシインドール（ＤＨＩ：dihydroxyindole）で脱カルボキシ化させる酵素である。ＤＯＰＤは、phenylpyruvate tautomerase ＩＩとも呼ばれる。該ＤＯＰＤは、ヒトにおいて、UniProt番号Ｐ３００４６のアミノ酸配列を含むものでもある。

【0060】

ＭＭＰ８（neutrophil collagenase）は、纎維性Ｉ型，ＩＩ型及びＩＩＩ型コラーゲンを分解することができる酵素である。ＭＭＰ８は、ＭＭＰ－８（matrix metalloproteinase－８）またはＰＭＮＬ－ＣＬ（ＰＭＮＬ－ＣＬ）とも呼ばれる。該ＭＭＰ８は、ヒトにおいて、UniProt番号Ｐ２２８９４のアミノ酸配列を含むものでもある。該ＭＭＰ８は、マウスにおいて、UniProt番号Ｏ７０１３８のアミノ酸配列を含むものでもある。

【0061】

他の様態は、ＮＵＣＢ２、ＰＤＣＤ６ＩＰ、ＰＴＧＲ１、ＦＡＭ３Ｄ、ＺＧ１６Ｂ、Ａ１ＡＴ、ＡＮＴ３、ＡＴＰＡ、ＨＲＧ、Ｈ１５、Ｈ２Ｂ１Ｌ、ＩＧＧ１、ＰＣＢＰ１及びＰＴＰＲＪからなる群のうちから選択された遺伝子の発現レベル、あるいは蛋白質またはその断片の発現レベルを測定する製剤を含む口腔乾燥症診断用キットを提供する。

【0062】

ＮＵＣＢ２、ＰＤＣＤ６ＩＰ、ＰＴＧＲ１、ＦＡＭ３Ｄ、ＺＧ１６Ｂ、Ａ１ＡＴ、ＡＮＴ３、ＡＴＰＡ、ＨＲＧ、Ｈ１５、Ｈ２Ｂ１Ｌ、ＩＧＧ１、ＰＣＢＰ１、ＰＴＰＲＪ及び口腔乾燥症は、前述の通りである。

【0063】

前記キットは、口腔乾燥症診断に必要な試料をさらに含んでもよい。前記キットは、固体支持体、抗体または抗原結合断片の免疫学的検出のために、基質、適する緩衝溶液、発色酵素、蛍光物質で標識された二次抗体、または発色基質を含んでもよい。前記キットは、核酸検出のために、重合酵素、緩衝剤、核酸、補酵素（coenzyme）、蛍光物質、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。前記重合酵素は、例えば、Ｔａｑ重合酵素である。

【0064】

前記キットは、ＫＶ１０８、ＧＳＬＧ１、ＦＡＭ３Ｂ、ＭＵＣ２１、ＲＢ１１Ａ、ＬＹＳＣ、ＣＡＬＬ３、Ａ１ＢＧ、Ａ１ＡＧ１、ＣＡＬＲ、ＰＬＭＮ、ＥＣＭ１、ＡＮＸＡ６、ＷＤＲ１、ＩＬＥＵ、ＦＥＴＵＡ、ＭＮＤＡ、ＭＭＰ９、ＮＧＡＬ、ＤＯＰＤ及びＭＭＰ８からなる群のうちから選択された遺伝子の発現レベル、あるいは蛋白質またはその断片の発現レベルを測定する製剤をさらに含んでもよい。

【0065】

他の様態は、口腔乾燥症が疑われる個体から分離された唾液試料において、ＮＵＣＢ２、ＰＤＣＤ６ＩＰ、ＰＴＧＲ１、ＦＡＭ３Ｄ、ＺＧ１６Ｂ、Ａ１ＡＴ、ＡＮＴ３、ＡＴＰＡ、ＨＲＧ、Ｈ１５、Ｈ２Ｂ１Ｌ、ＩＧＧ１、ＰＣＢＰ１及びＰＴＰＲＪからなる群のうちから選択された遺伝子の発現レベル、あるいは蛋白質またはその断片の発現レベルを測定する段階と、前記測定された発現レベルを、正常対照群の発現レベルと比較する段階と、前述のＮＵＣＢ２、ＰＤＣＤ６ＩＰ、ＰＴＧＲ１、ＦＡＭ３Ｄ及びＺＧ１６Ｂからなる群のうちから選択された遺伝子の発現レベルが、正常対照群の発現レベルと比較して低下するか、あるいは前述のＡ１ＡＴ、ＡＮＴ３、ＡＴＰＡ、ＨＲＧ、Ｈ１５、Ｈ２Ｂ１Ｌ、ＩＧＧ１、ＰＣＢＰ１及びＰＴＰＲＪからなる群のうちから選択された遺伝子の発現レベルが、正常対照群の発現レベルと比較して上昇した場合、口腔乾燥症と決定する段階と、を含む、口腔乾燥症の診断に必要な情報を提供するためにバイオマーカーを検出する方法を提供する。

【0066】

ＮＵＣＢ２、ＰＤＣＤ６ＩＰ、ＰＴＧＲ１、ＦＡＭ３Ｄ、ＺＧ１６Ｂ、Ａ１ＡＴ、ＡＮＴ３、ＡＴＰＡ、ＨＲＧ、Ｈ１５、Ｈ２Ｂ１Ｌ、ＩＧＧ１、ＰＣＢＰ１、ＰＴＰＲＪ及び口腔乾燥症は、前述の通りである。

【0067】

前記方法は、口腔乾燥症が疑われる個体から分離された唾液試料において、ＮＵＣＢ２、ＰＤＣＤ６ＩＰ、ＰＴＧＲ１、ＦＡＭ３Ｄ、ＺＧ１６Ｂ、Ａ１ＡＴ、ＡＮＴ３、ＡＴＰＡ、ＨＲＧ、Ｈ１５、Ｈ２Ｂ１Ｌ、ＩＧＧ１、ＰＣＢＰ１及びＰＴＰＲＪからなる群のうちから選択された遺伝子の発現レベル、あるいは蛋白質またはその断片の発現レベルを測定する段階を含む。

【0068】

前記個体は、哺乳動物、例えば、ヒト、牛、馬、豚、犬、羊、山羊または猫でもある。前記個体は、口腔乾燥症障害を病んでいるか、あるいは口腔乾燥症にかかっていると疑われる個体でもある。

【0069】

前記唾液試料は、前記個体から得られた唾液試料を言う。前記唾液試料は、遠心分離、濾過などの前処理を経た試料でもある。前記唾液試料は、唾液試料から得られた蛋白質試料または核酸試料を含む。

【0070】

前記測定する段階は、前記唾液試料と、前記蛋白質またはその断片に特異的に結合する抗体、その抗原結合断片またはアプタマーと、をインキュベーションさせるか、あるいは前記遺伝子をコーディングするポリヌクレオチドと同一であるか、またはそれに相補的なポリヌクレオチドをインキュベーションさせる段階を含んでもよい。

【0071】

前記測定する段階は、電気泳動、免疫ブロッティング、酵素結合免疫吸着分析法（ＥＬＩＳＡ：enzyme－linked immunosorbent assay）、重合酵素連鎖反応、ノーザンブロッティング（northern blotting）、ポリメラーゼ増幅反応（ＰＣＲ：polymerase chain reaction）、蛋白質チップ、免疫沈降、マイクロアレイ、電子顕微鏡法（electron microscopy）、またはそれらの組み合わせによっても遂行される。前記電気泳動は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、二次元電気泳動、またはそれらの組み合わせでもある。

【0072】

前記方法は、測定された発現レベルを、正常対照群の発現レベルと比較する段階を含む。

【0073】

前記方法は、ＮＵＣＢ２、ＰＤＣＤ６ＩＰ、ＰＴＧＲ１、ＦＡＭ３Ｄ及びＺＧ１６Ｂからなる群のうちから選択されたいずれか１つの発現レベルが、正常対照群の発現レベルと比較して低下したか否かということを確認する段階を含んでもよい。前記正常対照群は、口腔乾燥症かかっていない群であり、陰性対照群を意味する。前記方法において、測定された唾液試料において、ＮＵＣＢ２、ＰＤＣＤ６ＩＰ、ＰＴＧＲ１、ＦＡＭ３Ｄ及びＺＧ１６Ｂからなる群のうちから選択されたいずれか１つの発現レベルの程度が、正常対照群の発現レベルに比べて低下し、例えば、前記検出されたバイオマーカーの量が、正常対照群の量より少ない場合、前記個体は、口腔乾燥症にかかっているか、あるいはかかる確率が高いとも診断される。

【0074】

前記方法は、Ａ１ＡＴ、ＡＮＴ３、ＡＴＰＡ、ＨＲＧ、Ｈ１５、Ｈ２Ｂ１Ｌ、ＩＧＧ１、ＰＣＢＰ１及びＰＴＰＲＪからなる群のうちから選択されたいずれか１つの発現レベルが、正常対照群の発現レベルと比較して上昇したか否かということを確認する段階を含んでもよい。前記正常対照群は、口腔乾燥症かかっていない群であり、陰性対照群を意味する。前記方法において、測定された唾液試料において、Ａ１ＡＴ、ＡＮＴ３、ＡＴＰＡ、ＨＲＧ、Ｈ１５、Ｈ２Ｂ１Ｌ、ＩＧＧ１、ＰＣＢＰ１及びＰＴＰＲＪからなる群のうちから選択されたいずれか１つの発現レベルの程度が、正常対照群の発現レベルに比べて上昇し、例えば、前記検出されたバイオマーカーの量が、正常対照群の量より多い場合、前記個体は、口腔乾燥症にかかっているか、あるいはかかる確率が高いとも診断される。

【0075】

口腔乾燥症と診断された個体に、口腔管理、薬物投与調節、唾液代替剤投与、口腔保湿剤投与、口腔の電気刺激、または針などの治療を施すことができる。

【0076】

前記方法は、ＫＶ１０８、ＧＳＬＧ１、ＦＡＭ３Ｂ、ＭＵＣ２１、ＲＢ１１Ａ、ＬＹＳＣ、ＣＡＬＬ３、Ａ１ＢＧ、Ａ１ＡＧ１、ＣＡＬＲ、ＰＬＭＮ、ＥＣＭ１、ＡＮＸＡ６、ＷＤＲ１、ＩＬＥＵ、ＦＥＴＵＡ、ＭＮＤＡ、ＭＭＰ９、ＮＧＡＬ、ＤＯＰＤ及びＭＭＰ８からなる群のうちから選択された遺伝子の発現レベル、あるいは蛋白質またはその断片の発現レベルを測定する段階をさらに含んでもよい。

【実施例】

【0077】

以下、実施例を介し、さらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、１以上の具体例について例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例に限定されるものではない。

【0078】

〔実施例１．口腔乾燥症患者の唾液試料において差等発現されたバイオマーカーの確認〕
〔１．口腔乾燥症患者の唾液試料の準備〕
漢陽大学校から、正常対照群（ｎ＝３）と、口腔乾燥症と診断された患者とからの唾液試料を収集した。該口腔乾燥症は、唾液腺分泌と口腔粘膜状態とに対する臨床検査、及び唾液腺スキャンにより、唾液腺機能に対する評価によって診断した。該唾液腺機能は、唾液腺組織検査を施し、唾液腺組織の状態と、唾液腺実質周辺におけるリンパ球の浸透いかんとにより、スコア１ないしスコア５に分類した。スコア１、スコア２、及びスコア３ないし５の３群に分類し、唾液サンプリングを行った。

【0079】

唾液試料の蛋白質の分解または変形を防ぐために、血清を得た直後に得られた唾液試料に、蛋白質分解酵素阻害剤として、ｃＯｍｐｌｅｔｅ、Mini ＥＤＴＡ－freeプロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche）、及びホスファターゼ阻害剤として、ＰｈｏｓＳＴＯＰ（Roche）を添加した。 該阻害剤を添加した唾液試料を定量した後、実験に使用するまで、－８０℃で保管した。

【0080】

〔２．唾液試料の濃縮及び定量〕
４個グループの総１２個の唾液試料を、３ｋ遠心分離フィルタ（Amicon Ultra，Millipore）を使用して濃縮した。３ｋ遠心分離フィルタに、４００μｌの水（ＨＰＬＣ等級、Ｊ．Ｔ Baker）を２回加え、４００μｌの０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳが含まれた１０ｍＭTris緩衝液（ｐＨ８．０）を２回加えてフィルタを準備した。

【0081】

唾液試料を０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳが含まれた１０ｍＭ Tris緩衝液で２倍に希釈し、ボルテキシング（vortexing）して沈殿物を除去した。希釈された試料を、準備されたフィルタに加えた後、１４，０００ｘ ｇの速度で、１０℃で約１０分間遠心分離し、試料を濃縮した。その後、試料が含まれたフィルタを、０．０５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳが含まれた１０ｍＭ Tris緩衝液で５回洗浄した。新たなチューブに、洗浄後の濃縮された試料が含まれたフィルタを裏返しにして挿入した後、３，０００ｘ ｇの速度で、１０℃で約２分間遠心分離し、濃縮された試料を回収（recovery）した。

【0082】

回収された試料は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ：bicinchoninic acid）分析法で定量した。

【0083】

〔３．質量分析のための試料の準備及びゲル内分解（in－gel digestion）〕
プロテオーム分析のために、２．で得られた４個のグループの１２個の個別試料５５μｇを、ＮｕＰＡＧＥゲル（４％ないし１２％のBis－Trisゲル、Invitrogen，Carlsbad，ＣＡ、米国）を使用し、分子量によって分離した。該ゲルを、クマシーブリリアントブルー（Coomassie Brillant Blue Ｒ－２５０）で染色した（図１）。１２個の個別試料に対して染色されたゲルを、１２個の切片（slice）で分け、それぞれのゲル切片をマイクロ遠心分離チューブに移した。それぞれのゲル切片に含まれた蛋白質に対し、５６℃で二硫化結合を還元させた後、２５℃の暗い環境でアルキル化させ、トリプシンで一晩分解させた。次に、６７％（ｖ／ｖ）のアセトニトリル（ＡＣＮ：acetonitrile）／５％（ｖ／ｖ）のギ酸（ＦＡ：formic acid）（Wako Pure Chemicals、大阪、日本）溶液でペプチドを抽出した。抽出されたペプチドは、Ｓｐｅｅｄｖａｃで乾燥させた後、２０μｌの０．４％（ｖ／ｖ）酢酸に溶解させた。

【0084】

〔４．質量スペクトラム分析〕
０.４％酢酸に再懸濁した ３．で得たそれぞれの試料１０μｌを、Eksigent ＭＤＬＣシステム（Eksigent Technologies， Dublin，ＣＡ、米国）上において、逆相Magic Ｃ１８ＡＱカラム（１５ｃｍＸ７５μｍ）に注入した。前記カラムを、９５％の緩衝液Ａ（０．１％（ｖ／ｖ）のギ酸を含む１００％（ｖ／ｖ）の水）と５％の緩衝液Ｂ（０．１％（ｖ／ｖ）のギ酸を含む１００％（ｖ／ｖ）のＡＣＮ）とを混合した緩衝液で平衡化させた。作業流速は、次の勾配条件において、０．３５μｌ／分（ｍｉｎ）にした：
０分ないし５分において、０－８％緩衝液Ｂ；５分ないし８５分において、８－３０％緩衝液Ｂ；８５分ないし９０分において、３０－７０％緩衝液Ｂ；９０分ないし９５分において、７０％緩衝液Ｂ；９５分ないし１００分において、７０－２％緩衝液Ｂ；並びに１００分ないし１１０分において、２％緩衝液Ｂ
ナノＨＰＬＣシステムを、ＬＴＱ ＸＬ－Orbitrap質量スペクトロメーター（Thermo Scientific，San Jose，ＣＡ、米国）に装着させた。噴霧電圧（spray voltage）は、２．５ｋＶに設定し、加熱された毛細管の温度は、２５０℃に設定した。調査全体スキャンＭＳスペクトラ（Survey full－scan ＭＳ spectra）（３００ないし１，８００ｍ／ｚ）を、１マイクロスキャン（microscan）及び６０，０００の解像度（resolution）で得て、先導物質（precursor）を選別し、電荷状態測定のためのプレビューモードを設定した。プレビューの調査スキャンから、１０個の最も強力なイオンに係わるＭＳ／ＭＳスペクトラを、下記のようなオプションで、全体スキャンに係わるイオントラップから得た：分離間隔（isolation width） ２ｍ／ｚ（質量対電荷）；標準化された衝突エネルギー（collision energy） ３５％；動的排除時間（dynamic exclusion duration） ３６０秒（ｓｅｃ）。＋１電荷、及び電荷状態が定まっていない先導物質は、データ従属的に（data－dependent）得られる間に廃棄した。

【0085】

それぞれのＬＣ－ＭＳ／ＭＳファイルを、ＭａｘＱｕｎａｔ１．５．８．３のAndromedaアルゴリズムを利用して分析した。ＭＳデータ及びＭＳ／ＭＳデータをＳｗｉｓｓＰｒｏｔヒトデータベース（２０１９年１月）と比較調査した。該調査は、２つの未切断（missed cleavages）トリプシン分解されたペプチド（tryptic peptide）を許容すると制限した。システイン（cysteine）のカルボアミドメチル化（carboamidomethylation）を、固定された修飾化（＋５７．０２１Ｄａ）に設定し、メチオニン酸化を、流動型修飾化（＋１５．９９５Ｄａ）に設定した。質量許容範囲（mass tolerance）をＭＳ／ＭＳデータについて０．５Ｄａに設定し、ＭＳデータについて１５ｐｐｍで設定した。デコイ（decoy）データベース調査のために、０．０１の厳格な誤謬発見比率（ＦＤＲ：false discovery rate）と、０．０５の緩和されたＦＤＲとのどちらの２つの目標数値も適用した。全ての蛋白質は、２個以上の一致するペプチドを利用して同定した。

【0086】

〔５．ラベルフリー（label－free）定量分析〕
正常対照群と口腔乾燥症患者群との３個のグループから、唾液試料をそれぞれ３個ずつ収集した総１２個のサンプルに存在する蛋白質の相対的な存在量を、ラベルフリー定量強度分析法（ＬＦＱ強度（label－free quantification intensity）に基づいて算出した。ＭａｘＱｕｎａｔ１．５．８．３を使用してLFQ強度を抽出した。次に、それぞれの蛋白質に係わるＬＦＱ強度を、Perseusを利用し、相対的な定量分析を行った。蛋白質が存在しないか、あるいは検出限界以下である場合にも、零点（null）数値を補償した。正常対照群と、口腔乾燥症による患者群とのグループ間の倍数差を計算するために、正規分布（normal distribution）において、広さ０．３から１．８ほどをダウンシフトし、欠測値（missingvalue）を充填した。統計的な有意性は、正常対照群と、口腔乾燥症による患者群との３個の個別試料でもって、ANOVA検定から得たＬＦＱ強度について行い、ｐ値が０．０５未満である場合、統計的に有意であると見なした。

【0087】

〔６．口腔乾燥症による患者群と係わる唾液蛋白質の同定、及び差等発現された蛋白質の確認〕
ＬＦＱ強度分析から、正常対照群と、口腔乾燥症によるグループとの１２個の個別試料において、総７０３種の蛋白質を同定した。同定された蛋白質のうち、ｐ値が０．０５未満である蛋白質５１種を確認した。同定された蛋白質と、ｐ値が０．０５未満と、統計的に有意な蛋白質とを分析し、個数をベン図式で示した結果を図２に示した。

【0088】

また、ｐ値が０．０５未満と、統計的に有意な蛋白質を表１に示した。

【0089】

【表1】

【0090】

ｐ値が０．０５未満と、統計的に有意な蛋白質のうち、正常対照群に比べて発現レベルが低下する蛋白質を表２に示した。

【0091】

【表2】

【0092】

表２に記載された蛋白質の正常対照群と口腔乾燥症患者群とのスコアによる発現レベルを、図３Ａないし図３Ｅに示した（Ｎ：正常対照群、Ｓ１：スコア１、Ｓ２：スコア２、Ｓ３４５：スコア３以上）。

【0093】

図３Ａないし図３Ｅから分かるように、Nucleobindin－２、Programmed cell death ６－interacting protein、Prostaglandin reductase １、protein ＦＡＭ３Ｄ及びZymogen granule protein １６ homolog Ｂは、口腔乾燥症において、有意に発現レベルが低下し、口腔乾燥症のスコアにより、発現レベルが異なるということを確認した。

【0094】

次に、ｐ値が０．０５未満と、統計的に有意な蛋白質のうち、正常対照群に比べて発現手順が２倍以上増加する蛋白質を表３に示した。

【0095】

【表3】

【0096】

表３に記載された蛋白質の正常対照群と口腔乾燥症患者群とのスコアによる発現レベルを、図４Ａないし図４Ｉに示した（Ｎ：正常対照群、Ｓ１：スコア１、Ｓ２：スコア２、Ｓ３４５：スコア３以上）。

【0097】

図４Ａないし図４Ｉから分かるように、Ａ１ＡＴ、ＡＮＴ３、ＡＴＰＡ、ＨＲＧ、Ｈ１５、Ｈ２Ｂ１Ｌ、ＩＧＧ１、ＰＣＢＰ１及びＰＴＰＲＪは、口腔乾燥症において、有意に発現レベルが上昇し、口腔乾燥症のスコアにより、発現レベルが異なるということを確認した。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図4F】

【図4G】

【図4H】

【図4I】