知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-11-13
(45)【発行日】2023-11-21
(54)【発明の名称】精子の質を改善するための方法および製品
(51)【国際特許分類】
A61K 31/4545 20060101AFI20231114BHJP
A61P 15/08 20060101ALI20231114BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231114BHJP
【ＦＩ】
A61K31/4545
A61P15/08
A61P43/00 107
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2020517211
(86)(22)【出願日】2018-09-21
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-11-26
(86)【国際出願番号】 AU2018051040
(87)【国際公開番号】W WO2019056070
(87)【国際公開日】2019-03-28
【審査請求日】2021-09-17
(31)【優先権主張番号】2017903857
(32)【優先日】2017-09-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU
(73)【特許権者】
【識別番号】520094824
【氏名又は名称】ザ ユニヴァーシティー オブ アデレード
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＡＤＥＬＡＩＤＥ
(74)【代理人】
【識別番号】100123788
【弁理士】
【氏名又は名称】宮崎 昭夫
(74)【代理人】
【識別番号】100127454
【弁理士】
【氏名又は名称】緒方 雅昭
(72)【発明者】
【氏名】ロブカー、 レベッカ、 ルイーズ
(72)【発明者】
【氏名】バーミュデッツ、 ゴンザレス、 マカレナ
【審査官】金子 亜希
(56)【参考文献】
【文献】Biochem pharmacol，2000年，59，937-945
【文献】Br J clin Pharmac，1981年，12(5)，751-753
【文献】Gamete Research，1983年，7，111-122
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３１／４５４５
Ａ６１Ｐ １５／０８
Ａ６１Ｐ ４３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
精子の質を向上させるためのインビトロの方法であって、該方法は、精子をＢＧＰ－１５（式（Ｉ）のｏ－［３－ピぺリジノ－２－オキシ－１－プロピル］－ニコチンアミドキシム）：【化1】
および／または許容される溶媒和物、塩、互変異性体、立体異性体、および／またはそのラセミ体に曝露することを含む方法であって、精子の質が、
受精能力；
その種の最適時間枠内に卵割受精を完了した接合子を産生する能力、その種についての最適時間枠内に２つの細胞胚芽が胚盤胞の生育を完了する能力、および／または胚盤胞が孵化を開始する能力；
ＤＮＡ完全性；並びに
精子を凍結／凍結保存する能力を含む方法。
【請求項2】
前記精子が、４０歳を超える被検体および／または肥満である被検体由来の精子である請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記精子が、１時間以下の時間、前記ＢＧＰ－１５に曝露される、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
被検体における精子の質を向上させるために用いるための製剤であって、該製剤がＢＧＰ－１５（式（Ｉ）のｏ－［３－ピぺリジノ－２－オキシ－１－プロピル］－ニコチンアミドキシム）：【化2】
および／または許容される溶媒和物、塩、互変異性体、立体異性体、および／またはそのラセミ体を含む製剤であって、精子の質が、
受精能力；
その種の最適時間枠内に卵割受精を完了した接合子を産生する能力、その種についての最適時間枠内に２つの細胞胚芽が胚盤胞の生育を完了するの能力、および／または胚盤胞が孵化を開始する能力；
ＤＮＡ完全性；並びに
精子を凍結／凍結保存する能力を含む製剤。
【請求項5】
前記被検体における低下した精子の質を治療するために用いる請求項４に記載の製剤。
【請求項6】
前記被検体が、４０歳を超える被検体および／または肥満である被検体である請求項４または５に記載の製剤。
【請求項7】
卵母細胞を受精させる精子によって産生される胚の発達能を改善するためのインビトロの方法であって、精子をＢＧＰ－１５（式（Ｉ）のｏ－［３－ピぺリジノ－２－オキシ－１－プロピル］－ニコチンアミドキシム）：【化3】
および／または許容される溶媒和物、塩、互変異性体、立体異性体、および／またはそのラセミ体に曝露することを含む方法。
【請求項8】
前記精子が、４０歳を超える被験体および／または肥満である被験体由来の精子である請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は２０１７年９月２２日に出願されたオーストラリア仮特許出願２０１７９０３８５７号の優先権を主張し、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本開示は、精子の質を改善するための方法および製品、精子の質を改善するかまたは受精能を改善するために被験体を処置するための方法、ならびに生殖補助技術における改善された質を有する精子の使用に関する。
【背景技術】
【0003】
生殖医療の数多くの進歩にもかかわらず、かなりの割合の夫婦が男性の生殖能力の低下のために妊娠できない。男性の生殖能力が低下する原因は数多くあるが、精子が精子の質を低下させる場合もある。精子の質が低下する理由の多くは未だ不明である。
【0004】
例えば、種々の研究は、精子機能が加齢の関数として減少することを示している。父親の年齢が増加する傾向があることを考えると、明らかに加齢に伴う精子の質の低下が懸念される。
【0005】
さらに、生殖年齢男性の男性肥満率は過去数十年間で有意に増加しており、世界中で男性不妊症の増加と一致している。過体重または肥満であることは、精子の質を低下させることを含め、男性の生殖能に負の影響を及ぼすという新たな証拠がある。最近の研究では、精子の質の低下は単に精子の産生量や運動性の低下によるものではないことが示されている。
【0006】
以前の研究はまた、喫煙する男性はより不妊であることを示した。タバコの煙が精子パラメータ、精漿、および様々な他の生殖能力因子に負の影響を及ぼす可能性があることが報告されているが、喫煙が男性の生殖能力に及ぼす実際の影響は依然として不明である。
【0007】
精子の質を改善するために利用可能な薬理学的介入は限られている。一部のサプリメントは男性の生殖能力の改善を支援するために利用可能であり、妊娠率を改善するためにしばしばビタミンおよび抗酸化剤に頼っている。生殖補助技術はまた、不良な生殖能力を処置するための介入を可能にし、場合によっては、不妊の理由の１つが精子の質の低下によるものである場合には妊娠の達成を支援するために用いることができる。しかしながら、生殖補助の分野においてなされた多くの進歩にもかかわらず、生殖補助技術の成功率は、依然として一般的に低いままである。体外受精（ＩＶＦ）、細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）および（ＩＵＩ）のような生殖補助技術の成功率の低さは、部分的に品質低下の精子の使用に起因する可能性がある。
【0008】
生殖補助技術は、動物、特に遺伝的メリットの高い動物にも広く用いられている。精子の質を改善することは、動物の繁殖率および／または産生された動物の質を改善することに利点があり、これは経済的利点を提供する。
【0009】
野生生物種では、生物多様性を維持するために、捕獲種および／または絶滅危惧種の繁殖性を改善するために、生殖補助技術が緊急に必要とされている。
【0010】
従って、種々の理由のために、精子の質を改善するための新規な方法および製品が必要とされている。
【発明の概要】
【0011】
本開示は、精子の質を改善するための方法および製品、精子の質を改善するために被験体を処置するための方法、または低減した受精能を処置するための方法、ならびに生殖補助技術における改善された質を有する精子の使用に関する。
【0012】
本開示の特定の実施形態は精子の質を改善する方法、すなわち、精子をＢＧＰ－１５および／またはその誘導体に曝露し、それによって精子の質を改善する方法を提供する。
【0013】
本開示の特定の実施形態は、精子を本明細書に記載のＢＧＰ－１５および／またはその誘導体に曝露することによって産生される分離された精子を提供する。
【0014】
本開示の特定の実施形態は精子の質を改善するために被験体を処置する方法を提供し、この方法は有効量のＢＧＰ－１５および／またはその誘導体を被験体に投与し、それによって被験体における精子の質を改善することを含む。
【0015】
本開示の特定の実施形態は被験体において低減した精子の質を処置する方法を提供し、この方法は有効量のＢＧＰ－１５および／またはその誘導体を被験体に投与し、そしてそれによって被験体を処置することを包含する。
【0016】
本開示の特定の実施形態は、精子の質を改善するための構成において、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体の使用を提供する。
【0017】
本開示の特定の実施形態は、有効量のＢＧＰ－１５および／またはその誘導体を含む、精子の質を改善するための医薬組成物を提供する。
【0018】
本開示の特定の実施形態は、精子の質を改善するために被験体を処置する方法を提供し、この方法は、本明細書に記載の医薬組成物を被験体に投与することを含む。
【0019】
本開示の特定の実施形態は受精した卵母細胞によって産生された胎芽の発生能(developmental competence)を向上させる方法、すなわち精子をＢＧＰ－１５および／またはその誘導体に曝露する方法を提供し、それによって胎芽の発生能を向上させる方法を提供する。
【0020】
本開示の特定の実施形態は精子を用いた生殖補助の方法、すなわち、精子をＢＧＰ－１５および／またはその誘導体に曝露し、さらに生殖補助の方法でＢＧＰ－１５および／またはその誘導体に曝される精子を使用する方法を提供する。
【0021】
本開示の特定の実施形態は、本明細書に記載の生殖補助方法を使用して産生される動物を提供する。
【0022】
本開示の特定の実施形態は、インビトロ受精方法を提供し、この方法はインビトロで精子をＢＧＰ－１５および／またはその誘導体に曝露し、卵母細胞をＢＧＰ－１５および／またはその誘導体に曝露した精子と受精させることを含む。
【0023】
本開示の特定の実施形態は、精子の質を改善するためのキットまたは製品を提供し、このキットまたは製品は、精子への曝露のためのＢＧＰ－１５および／またはその誘導体を含む。
【0024】
本開示の特定の実施形態は、生殖補助技術において使用するためのキットまたは製品を提供し、そのキットまたは製品は、精子への曝露のためのＢＧＰ－１５および／またはその誘導体を含む。
【0025】
本開示の特定の実施形態は、卵母細胞に精子を受精させるためのインビトロ受精培地であって、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体を含む培地を提供する。
【0026】
本開示の特定の実施形態は、精子のためのインビトロ受精培地であって、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体を含む培地を提供する。
【0027】
本開示の特定の実施形態は、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体を含む精子調製用培地を提供する。
【0028】
本開示の特定の実施形態は精子を凍結する方法を提供し、その方法は精子を凍結する前、間、後のいずれか一つ以上の時に、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体に曝露することを含む。
【0029】
本開示の特定の実施形態は、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体を含む精子凍結用培地を提供する。
【0030】
本開示の特定の実施形態は精子の質を改善するための薬剤をスクリーニングする方法を提供し、この方法は、精子の質を改善するためのＢＧＰ－１５の誘導体の能力を決定すること、および精子の質を改善するための薬剤として誘導体を同定することを含む。
【0031】
他の特定の実施形態が本明細書に開示される。
【図面の簡単な説明】
【0032】
特定の実施形態は、以下の図面によって例示される。以下の説明は特定の実施形態を説明することのみを目的としており、説明に関して限定することを意図していないことを理解されたい。
【図1】図１は精子機能回復に対するＢＧＰ－１５のインビトロ処置の影響を示す。精子を、「若齢」（～６週齢）または「高齢」（～１歳）の雄マウスの精巣上体および精管から収集し、対照培地（未処置）または１０μＭのＢＧＰ－１５を含有する培地中で１時間、インビトロで受精能獲得（成熟）させた。その後、精子を若齢雌マウス由来の卵母細胞の体外受精に用い、推定接合子の生育を評価した。Ａ)ＩＶＦ後２４時間に卵割を完了した推定接合子の割合。Ｂ)５日目までに胚盤胞の生育を完了した２細胞胚の割合。Ｃ)孵化を開始した胚盤胞の割合。高齢マウスからの精子を用いた胎芽の発育マイルストーンはそれぞれ悪くなったが、各発育パラメータは「高齢」精子のＢＧＰ－１５を用いたインビトロの１時間処置によって改善された。処置群あたりＮ＝６～１２匹。分析は、各年齢群内で未処置群とＢＧＰ－１５処置群を比較する対応のあるｔ検定と、若齢群と高齢群を比較する対応のないｔ検定によった。
【図2】図2は、精子機能の回復に対するＢＧＰ－１５でのインビボ処置の影響を示す。「若齢」（～６週齢）または「高齢」（～１歳）の雄マウスは、「未処置」とするかまたはＢＧＰ－１５（１５ｍｇ／ｋｇ）を１日１回４日間腹腔内投与した。最後の注入から約１２時間後に精巣上体および精管から精子を採取し、若齢雌マウス由来の卵母細胞の体外受精に用い、推定接合子の生育を評価した。Ａ)ＩＶＦ後２４時間に卵割を完了した推定接合子の割合。Ｂ)５日目までに胚盤胞の生育を完了した２細胞胚の割合。Ｃ)孵化を開始した胚盤胞の割合。高齢マウスの精子を用いて受胎した胚では各生育マイルストーンは悪くなったが、「高齢」マウスをＢＧＰ－１５で処置することにより、各生育パラメータが改善された。Ｎ＝１投与群あたり１匹のマウス。
【図3】図３は、高齢の雄では妊娠数が少ないことを示している。(Ａ)若齢および高齢の雄マウスはいずれも、若齢（６～８週齢）の雌とペアにした場合、同程度の交配率（コイタ数）を有することが観察された。(Ｂ)しかし、若齢の雄と比較して、高齢の雄では交尾後１８．５日目に妊娠数の有意な減少が観察された。データは平均値として示す。統計解析はＦｉｓｈｅｒの直接確率検定（Ｐ＝０．００４； ９５% CI: １．７５，１９．１４; N=２５（若齢），３３（高齢）雄。
【図4】図４は、高齢の雄は小さなより健康でない子孫をつくることを示す。(Ａ)妊娠を生じさせた高齢の雄マウスは、胎芽の生育の１８．５日目に若齢の雄の胎仔よりも軽い胎仔を種付けすることがわかった。(Ｂ)また、高齢の雄からの胎仔では胎盤が小さかった。(Ｃ)出生後１日目に、より高齢の雄によって作られた新生仔は、より若齢の雄によって作られた新生仔よりも軽かった。(Ｄ)より高齢の雄によってつくられた新生仔は、より若齢の雄によって作られた新生仔よりも高い新生仔死亡率（すなわち、出生後２１日目の離乳前の死亡）を経験した。データは、平均値±ＳＥＭとして示す。統計分析は、線形混合モデル（Ａ、Ｂ、Ｃ）または対応のないスチューデントｔ－検定（Ｄ）のいずれかによった。
【図5】図５は、ＢＧＰ－１５による精子のインビトロ処置を示す。実験計画のグラフ表示。生殖能力が証明された繁殖雄マウスを獲得し、少なくとも１２ヶ月齢まで老化させ、次いでそれらを「若齢対照」と比較した。生殖能力は自然交配の若齢雌との交配により評価した。妊娠を生じた若齢雄（すなわち、妊娠可能であった）、および妊娠を生じなかった高齢雄（すなわち、低受胎であった）を、体外受精（ＩＶＦ）および胚の産生のための精子ドナーとして選択した。体外受精（ＩＶＦ）当日、精子を採取し、半数を精子受精能獲得中にＢＧＰ－１５で１時間処置した。ＩＶＦの直前に、アリコートを用いて、精液分析および精子の質アッセイ、すなわち、精子数、生存率、形態、運動性（進行性運動性を含む）、ミトコンドリア活性および透明帯結合能、を行った。
【図6】図６は、ＢＧＰ－１５が高齢雄における精子運動性を増加させることを示す。受精能獲得後の精液の分析では高齢の雄は精子数（Ａ）が低かったが、生存率（Ｂ）および形態学的に正常な精子（Ｃ）の割合は正常であった。総運動性（Ｄ）および進行性運動性（Ｅ）も低下した。ＢＧＰ－１５処置は精子数、生存率または形態に影響を及ぼさなかったが、高齢雄由来の精子における総（Ｄ）および進行性運動性（Ｅ）の両方を増加させた。データは、平均値±ＳＥＭとして示す。統計解析は、対応のある(若齢未処置 vs 若齢処置済、高齢未処置 vs 高齢処置済)または対応のない(若齢 vs 高齢)スチューデントのｔ検定のいずれかとした。
【図7】図７は、ＢＧＰ－１５処置が高齢雄における精子ミトコンドリア膜電位（ＭＭＰ）を増加させることを示す。(Ａ)ＪＣ－１染色精子の代表的な画像は、低ＭＭＰ(上部）または高ＭＭＰ(下部）のいずれかで染色された。(Ｂ)ＪＣ－１染色精子のフローサイトメトリー分析。高齢雄では、ＢＧＰ－１５は高いＭＭＰ(Ｃ)を示す生存精子の割合を増加させる。データは、平均値± ＳＥＭとして示す。統計解析は、対応のある(若齢未処置 vs 若齢処置済、高齢未処置 vs 高齢処置済)または対応のない(若齢 vs 高齢)スチューデントのｔ検定のいずれかとした。
【図8】図８は、ＢＧＰ－１５が高齢雄において透明帯結合能を改善することを示す。ビスベンズアミドＤＮＡ染色（Ａ）を用いた精子の透明帯結合能の評価ではＭＩＩ卵母細胞の透明帯に結合している高齢雄由来の精子は少なかったが、これらはＢＧＰ－１５処置により増加した（Ｂ）。データは、平均値±ＳＥＭとして示す。統計解析は、対応のある(若齢未処置 vs 若齢処置済、高齢未処置 vs 高齢処置済)または対応のない(若齢 vs 高齢)スチューデントのｔ検定のいずれかとした。
【図9】図９は、高齢雄が着床前胚の生育が途絶していることを示している。ＩＶＦ後の着床前胚の経時的イメージングの形態動態解析の結果、若齢雄と比較して、高齢雄は２細胞（Ａ）までの時間が長く、胚盤胞崩壊（Ｂ）の頻度が高かった。データは、平均値±ＳＥＭとして示す。統計解析は対応のないスチューデントのｔ検定とした。
【図10】図１０は、ＢＧＰ－１５による精子の体外処置後に改善された発育を呈する高齢雄由来の着床前胚を示す。(Ａ)高齢の雄ではＩＶＦ後２日目（ｈＣＧ注射後４６時間）に初回切断（２細胞）に達した推定接合子の割合が若齢（未処置および処置）の雄と比較して減少したが、高齢の精子をＢＧＰ－１５で処置した場合、２細胞率が改善した。(Ｂ)また、高齢雄ではＩＶＦ後５日目（ｈＣＧ注入後１１２時間）に胚盤胞期に達した２細胞胎芽の割合の低下が認められ、精子のＢＧＰ－１５処置により改善された。(Ｃ)ＩＶＦ後５日目の孵化胚盤胞率は高齢雄由来の胚盤胞では低下したが、ＢＧＰ－１５による精子の処置により改善した。データは、平均値±ＳＥＭとして示す。統計解析は、対応のある(若齢未処置 vs 若齢処置済、高齢未処置 vs 高齢処置済)または対応のない(若齢 vs 高齢)スチューデントのｔ検定のいずれかとした。
【図11】図１１は、ＢＧＰ－１５を保有する男性のマウスのインビボ処置を示している。実験計画のグラフ表示。生殖能力が証明された繁殖雄マウスを獲得し、少なくとも１２ヶ月齢まで老化させ、次いで「若齢対照」と比較した。生殖能力は自然交配の若齢雌との交配により評価した。妊娠を生じた若齢雄（すなわち、妊娠可能であった）、および妊娠を生じなかった高齢雄（すなわち、低受胎であった）を、体外受精（ＩＶＦ）および胎芽の産生のための精子ドナーとして選択した。雄の半数にＢＧＰ－１５（１５ｍｇ／ｋｇ）をＩＶＦ前４日間毎日腹腔内注射（ＩＰ）した。雄の生殖能力の評価と同時に、若齢雌のグループをホルモン刺激して排卵させ、それらの卵丘－卵母細胞複合体を採取した。これらのＣＯＣは、全処置群の精子を用いて受精した。受精培地で４時間インキュベートした後、推定接合子について前核の有無を評価し、さらにインビトロで５日間培養した。２細胞期および胚盤胞期について、それぞれＩＶＦ後２日目および５日目に生育を評価した。
【図12】図１２は、ＢＧＰ－１５が高齢雄由来の精子における精子形態およびミトコンドリア膜電位（ＭＭＰ）を改善することを示す。ＢＧＰ－１５によるインビボ処置は高齢雄において精子数（Ａ）、生存率（Ｂ）または運動性（Ｄ、Ｅ）に有意な影響を及ぼさなかったが、驚くべきことに、ＭＭＰ(Ｆ)が高い精子集団と同様に形態学的に正常な精子（Ｃ）の割合を増加させた。データは、平均値±ＳＥＭとして示す。統計解析は対応のないスチューデントのｔ検定とした。
【図13】図１３は、ＢＧＰ－１５による高齢雄のインビボ処置後の着床前胎芽生育の改善を示す。(Ａ)未処置の高齢雄は未処置の若齢雄と比較して、ＩＶＦ後２日目（ｈＣＧ注射後４６時間）に最初の切断（２細胞）に到達した推定接合子の割合が減少したが、ＢＧＰ－１５で処置した高齢雄では２細胞率が改善した。(Ｂ)未処置の高齢雄はまた、ＩＶＦ後５日目（ｈＣＧ注射後１１２時間）に胚盤胞期に達した２細胞胎芽の割合の減少を示し、これはＢＧＰ－１５処置を受けたそれらでも改善された。(Ｃ)ＩＶＦ後５日目の孵化率は、全ての群で同様であった。データは、平均値± ＳＥＭとして示す。統計解析は対応のないスチューデントのｔ検定とした。
【図14】図１４は、ＢＧＰ－１５がヒト精子における運動性を増加させることを示す。(Ａ)３０分間のＢＧＰ－１５処置は純粋な精液サンプル（精漿を含む）からの精子の運動性に影響を及ぼさなかったが、同じドナーからの洗浄サンプル（精漿を除去）からの精子の運動性を増加させた。２４時間（Ｂ）または４８時間（Ｃ）で洗浄サンプルからの精子運動性に対するＢＧＰ－１５処置の効果はなかった。生存率（または膜不透過性）は純粋なサンプルからの精子のＢＧＰ－１５処置によって影響されなかったが、生存率はＢＧＰ－１５処置の３０分後（Ｄ）、同じドナーからの洗浄サンプルからの精子において減少した。２４時間（Ｅ）または４８時間（Ｆ）で洗浄サンプルからの精子活力に対するＢＧＰ－１５処置の効果はなかった。データは、平均値±ＳＥＭとして示す。統計解析は対スチューデントのｔ検定とした。
【図15】図１５は、ＢＧＰ－１５がヒト精子のＤＮＡ損傷を減少させることを示す。（A）未処置および処置サンプル中のＤＮＡ酸化損傷マーカー８－オキソ－２’－デオキシグアノシン（８ＯＨｄＧ）の定量は洗浄が精子８ＯＨｄＧレベルを増加させたが、これは同じドナーからの純粋および洗浄サンプルの両方からの精子中で３０分間のＢＧＰ－１５処置後に減少したことを示した。（B）DAPI DNA染色を用いたＨＡＬＯアッセイによるＤＮＡ断片化の定量は、洗浄が精子ＤＮＡ断片化を増加させ、ＢＧＰ－１５処置によって減少したことを示した。（C）クロマチン構造損傷マーカークロモマイシンＡ３（ＣＭＡ３）の定量化は洗浄中に精子ＣＭＡ３レベルを増加させたが、ＢＧＰ－１５の影響はなかったことを示した。２４時間および４８時間でのＤＮＡ損傷分析は、精子ＤＮＡ ８ＯｈｄＧ(Ｄ、Ｇ）、断片化（Ｅ、Ｈ）またはＣＭＡ３（Ｆ、Ｉ）レベルに対するＢＧＰ－１５処置の影響をそれぞれ示さなかった。データは、平均値±ＳＥＭとして示す。統計解析は対スチューデントのｔ検定とした。
【図16】図１６は、洗浄による精子選択が高齢男性における精子の活力を低下させることを示す。洗浄による精液サンプル中の精漿除去後の精液分析では若齢（<40歳)男性と高齢(>４０歳）男性の間で精子数（Ａ）および運動性（Ｂ）が類似していたが、高齢男性（Ｃ）では生存率（膜不透過性）が有意に低下した。純粋なサンプルと洗浄されたサンプルにおける精子活力の比較は洗浄が若齢男性（Ｄ）において効果を有さないが、高齢男性（Ｅ）において精子活力を低減させることを示した。データは、平均値±ＳＥＭとして示す。統計解析は対スチューデントのｔ検定とした。
【図17】図１７は、ＢＧＰ－１５が高齢男性における精子運動性を改善することを示す。(Ａ)洗浄もＢＧＰ－１５処置も若齢男性（<40歳)の精子運動性に影響しなかったが、(B)高齢男性(>４０歳）では洗浄は精子運動性を低下させたが、ＢＧＰ－１５による３０分処置で増加した。データは、平均値±ＳＥＭとして示す。統計解析は2元配置分散分析および多重比較事後検定とした。
【図18】図１８は、ＢＧＰ－１５が酸化ストレスによって引き起こされるＤＮＡ損傷から精子を保護することを示している。若齢男性（＜４０歳）からの精子を、増加用量のＨ２Ｏ２（０、０．０６２５ｎＭ、０．１２５ｎＭおよび０．２５０ｎＭ）と共にインキュベートし、ＢＧＰ－１５（１０μM）で１時間処置または未処置のいずれかを行った。精子運動性（Ａ）および生存率（Ｂ）は、Ｈ２Ｏ２処置によって無効にされた。(Ｃ)ＤＮＡ酸化損傷マーカー８－オキソ－２’－デオキシグアノシン（８ＯＨｄＧ）の定量は、Ｈ２Ｏ２処置が用量依存的に精子酸化損傷を増加させる一方、ＢＧＰ－１５の添加はＤＮＡ酸化損傷の蓄積を阻止することを示した。データは、平均値±ＳＥＭとして示す。統計解析は2元配置分散分析および多重比較事後検定によった。
【発明を実施するための形態】
【0033】
本開示は、精子の質を改善するための方法および、精子の質を改善するために被験体を処置するための方法、ならびに生殖補助技術における改善された質を有する精子の使用に関する。
【0034】
本開示は、少なくとも部分的にはＢＧＰ－１５および／またはその誘導体がインビトロおよびインビボにおける精子の質を向上させるという認識に基づいており、特に高齢の患者からの精子について、ＢＧＰ－１５で処置された精子から産生される胎芽の発育能力を向上させる結果を有する。
【0035】
本開示の特定の実施形態は、精子の質を改善する方法を提供する。
【0036】
本開示の特定の実施形態は精子の質を改善する方法、すなわち、精子をＢＧＰ－１５および／またはその誘導体に曝露し、それによって精子の質を改善する方法を提供する。
【0037】
本明細書で使用される「精子」という用語は雄性生殖細胞または精子を指し、１つ以上の精子を含む。
【0038】
特定の実施形態において、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体は、ＢＧＰ－１５（ｏ－［３－ピぺリジノ－２－オキシ－１－プロピル］－ニコチンアミドキシム）：
【0039】
【化1】
【0040】
ＢＧＰ－１５は、市販されており（典型的には適切な塩として）、または当技術分野で公知の方法によって合成することができる。ＢＧＰ－１５の市販ソースの例としては、Sigma－Aldrich(製品#B４８１３ＳＩＧＭＡ）とCayman Chemicals(製品#１７５０３）が挙げられる。
【0041】
特定の実施形態では、ＢＧＰ－１５の誘導体がプロプラノロール、ビモクロモール、アリモクロマール、ＮＧ－９４、イロキサナジン、および／または前述のいずれかの薬学的に許容される誘導体、プロドラッグ、溶媒和物、塩、互変異性体、立体異性体、および／またはラセミ体を含む。プロプラノロール、ビモクロモール、アリモクロモール、ＮＧ－９４、イロキサナジンの化学構造は以下の通りである：
【0042】
【化2】
【0043】
プロプラノロール（ＣＡＳ＃３１８－９８－９）は、当該分野で公知の方法によって合成され得るか、またはLGM Pharma(USA)から商業的に入手され得る。ビモクロモ－ル（（３Ｚ）－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－ピペリジン－１－イルプロポキシ）ピリジン－３－カルボキシイミドイルクロリド）は、例えば、ハンガリー特許第２０７９８８号（１９８８）に記載されているような、当技術分野で公知の方法によって合成することができる。アリモクロモル（３－［クロロ（｛［（２Ｒ）－２－ヒドロキシ－３－（ピペリジン－１－イル）プロポキシ］イミノ｝）メチル］ピリジン－１－イウム－１－オラート）は、例えば、国際公開第０１７９１７４号パンフレット又はTetrahedron: Asymmetr. 2012, 23: 1564－1570に記載されているように、当技術分野で公知の方法によって合成することができる。ＮＧ－０９４は、当該分野で公知の方法によって合成され得る。イロキサナジンは当技術分野で公知の方法によって合成することができ、３６０Regentから市販されている。
【0044】
特定の実施形態において、精子の質は受精能力を含む。特定の実施形態では、受精能力が卵母細胞を受精させる能力、接合子を産生する能力、および／または精子から産生される胎芽の発生能を含む。
【0045】
特定の実施形態において、精子の質は、その種についての最適時間枠（「オン時間」）内に卵割受精を完了した接合子を産生する能力、その種についての最適時間枠（「オン時間」）内に２つの細胞胎芽が胚盤胞の生育を完了する能力、および／または胚盤胞が孵化を開始する能力の１つまたは複数を含む。
【0046】
特定の実施形態において、精子の質は、ＤＮＡ完全性を含む。ＤＮＡ完全性の尺度の例には、ＤＮＡへの損傷、ＤＮＡの断片化、ＤＮＡの切断およびＤＮＡの立体構造が含まれる。アッセイはＤＮＡ完全性を評価するために当技術分野で公知であり、例えば、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介ｄＵＴＰニック末端標識アッセイ（ＴＵＮＥＬ）およびin situニックトランスレーション（ＩＳＮＴ）などの、実際のＤＮＡ鎖切断を検出するために損傷部位にプローブを組み込むことによってＤＮＡ断片化を直接測定するアッセイ、ならびに特定の条件下でより容易に変性する断片化ＤＮＡの特性を利用するアッセイを含む。精子クロマチン分散（ＳＣＤ）、単細胞ゲル電気泳動（ＳＣＧＥ）またはコメットアッセイ、精子クロマチン構造アッセイ（ＳＣＳＡ）、アクリジンオレンジ染色は、精子ＤＮＡが変性処置に供され得、次いでＤＮＡ損傷が定量される例である。
【0047】
特定の実施形態では、精子の質が精子を凍結／凍結保存する能力である。
【0048】
特定の実施形態では、精子が低減した受精能および／または低減した精子の質に関連する状態になっているか、または感受性であるドナーに由来する。
【0049】
特定の実施形態では、精子は高齢ドナー由来である。特定の実施形態では、精子が高齢ドナー由来である。特定の実施形態において、精子は、低減した受精能に関連する老化状態になっているか、またはそれに感受性であるドナーに由来する。特定の実施形態では、精子が肥満または過体重ドナー由来である。
【0050】
特定の実施形態では、精子が４０歳を超える年齢を有するドナーに由来する。特定の実施形態では、精子が４５歳を超える年齢を有するドナーに由来する。
【0051】
特定の実施形態では、精子が喫煙または喫煙したドナー由来である。特定の実施形態では、精子が喫煙に関連する低減した受精能に関連する状態になっているか、または感受性であるドナーに由来する。
【0052】
特定の実施形態において、精子は、補助的な生殖方法または技術において使用される。
【0053】
生殖補助技術の例としては、人工受精（子宮内受精としても知られる）、体外受精（ＩＶＦ）、配偶子卵管内移植（ＧＩＦＴ）、卵母細胞および精子の卵管内への配置、接合子卵管内移植（ＺＩＦＴ）、卵管胚移植（ＴＥＴ）、腹腔卵母細胞および精子移植（ＰＯＳＴ）、細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）、精巣精子抽出（ＴＥＳＥ）、顕微外科的精巣上体精子吸引（ＭＥＳＡ）などがある。
【0054】
生殖補助技術は、例えば、Textbook of Assisted Reproduction: Laboratory and Clinical Perspectives(２００３)Editors Gardner、ＤＫ.Weissman、Ａ．Howies、ＣＭ．、Shoham、Z. Martin Dunits Ltd、Ltd、London、UK；およびGordon、I（２００３) Laboratory Production of Cattle Embryos 2nd Edition CABI Publishing, Oxon, UK.のような先行技術で知られている。
【0055】
特定の実施形態において、この方法は、インビトロ受精（ＩＶＦ）、細胞質内精子注射（ＩＣＳＩ）または子宮内受精（ＩＵＩ）において使用するための精子を産生するために使用される。
【0056】
ヒトおよび動物の両方において生殖補助技術を実施するための方法は、当該分野で公知である。
【0057】
本明細書で使用される「暴露」または「暴露する」などの用語の「暴露」およびその変形体には、インビトロ暴露、エクソビボ暴露またはインビボ暴露を含む。暴露の例には、液体媒体中の薬剤に暴露すること、活性薬剤に変化または代謝されるプレ薬剤に暴露すること、または標的薬剤の発現を誘導する１つの薬剤に暴露することが含まれる。
【0058】
一定の実施形態において、この方法は質を改善するために、インビトロでの精子をＢＧＰ－１５および／またはその誘導体に曝露するために使用される。
【0059】
特定の実施形態では、精子はインビトロである。
【0060】
特定の実施形態では、精子は精液またはその希釈形態で存在する。
【0061】
特定の実施形態では、精子は適切な培地中にある。特定の実施形態において、精子は、適切な培地中で希釈される。
【0062】
特定の実施形態では、精子が運動性、生存率、活力、能力、増加した若しくはより高いＤＮＡ完全性、または低減した若しくは低いＤＮＡ品質などの特定の特徴について強化される。
【0063】
特定の実施形態において、精子は例えば、密度勾配遠心分離によって、スイムアップ技術によって、またはフローサイトメトリーによって選別される。精子を選別するための方法は、当該分野で公知である。
【0064】
特定の実施形態では、精子は精子調製培地中に存在する。精子調製培地は当該分野で公知であり、そして商業的に入手可能である。特定の実施形態では、精子は精子洗浄媒体中に存在する。
【0065】
特定の実施形態において、精子は受精前、受精中、および／または受精後に、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体に曝露される。特定の実施形態において、精子は成熟前、成熟中、および／または成熟後に、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体に曝露される。
【0066】
特定の実施形態では、精子がインビトロ受精（ＩＶＦ）培地中に存在する。ＩＶＦ媒体は当技術分野で公知であり、市販されている。
【0067】
特定の実施形態では、精子が凍結または凍結保存培地中に存在する。凍結／凍結保存培地は当該分野で公知であり、そして商業的に入手可能である。
【0068】
特定の実施形態において、この方法は、精子を、１μｍ～１００μＭ、２μｍ～１００μＭ、５μｍ～１００μＭ、１０μｍ～１００μＭ、２０μｍ～１００μＭ、５０μｍ～１００μＭ、１μｍ～５０μＭ、２μｍ～１００μＭ、５μｍ～５０μＭ、１０μｍ～５０μＭ、２０μｍ～５０μＭ、１μｍ～２０μＭ、２μｍ～２０μＭ、５μｍ～１０μＭ、１μｍ～５μＭ、２μｍ～５μＭ、または１μｍ～２μＭの範囲の濃度で、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体に曝露する工程を包含する。他の範囲も考えられる。
【0069】
特定の実施形態において、この方法は、精子を、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体を含む培地に曝露することを包含する。特定の実施形態において、この方法は、精子を、１μｍ～１００μＭ、２μｍ～１００μＭ、５μｍ～１００μＭ、１０μｍ～１００μＭ、２０μｍ～１００μＭ、５０μｍ～１００μＭ、１μｍ～５０μＭ、２μｍ～１００μＭ、５μｍ～５０μＭ、１０μｍ～５０μＭ、２０μｍ～５０μＭ、１μｍ～２０μＭ、２μｍ～２０μＭ、５μｍ～１０μＭ、１μｍ～５μＭ、２μｍ～５μＭ、または１μｍ～２μＭの範囲の濃度のＢＧＰ－１５および／またはその誘導体を含む培地に曝露する工程を包含する。他の範囲も考えられる。
【0070】
特定の実施形態において、精子はＢＧＰ－１５および／またはその誘導体に、２４時間以下、１８時間以下、１２時間以下、６時間以下、５時間以下、４時間以下、３時間以下、２時間以下、または１時間以下曝露される。
【0071】
精子の質を評価するための方法は、当該分野で公知である。
【0072】
特定の実施形態では、精子の質の評価が精子の受精能力を評価することを含む。特定の実施形態では、精子の質の評価が卵母細胞を受精させる精子の能力、および／または卵母細胞を受精させる精子から産生される胎芽の発生能を評価することを含む。特定の実施形態において、精子の質の評価は、卵割を「オンタイム」で完了した接合子を産生する精子の能力、胚盤胞生育を「オンタイム」で完了する２細胞胎芽を産生する精子の能力、および孵化を開始する胚盤胞を産生する精子の能力を評価することを含む。
【0073】
特定の実施形態では、精子の質の評価がＤＮＡ完全性またはＤＮＡ品質を評価することを含む。
【0074】
特定の実施形態では、精子の質の評価が胎芽の健康、発育能力および／または出生後の適応度などの、精子から産生された胎芽の１つまたは複数の特徴を評価することを含む。このような特徴を評価する方法は、当該分野で公知である。
【0075】
特定の実施形態では、この方法が精子の質を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７０％改善することを含む。
【0076】
一定の実施形態において、この方法は品質を改善するために、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体の被験体中の精子を曝露するために使用される。特定の実施形態において、精子は、被験体においてインビボである。ＢＧＰ－１５及び／又はその誘導体の曝露方法をここに説明する。
【0077】
特定の実施形態では、被験体が低減した受精能力を有する精子を有する。特定の実施形態では、被験体が低減した受精能になっているか、またはそれに感受性である。特定の実施形態では、被験体が低減した生殖能力に関連する疾患、状態または状態になっているか、または感受性である。特定の実施形態では、被験体がＤＮＡ完全性またはＤＮＡ品質が低下した精子を有する。
【0078】
特定の実施形態では、被験体が高齢または高齢の被験体である。特定の実施形態では、被験体が４０歳を超える年齢を有する。特定の実施形態では、被験体が４５歳を超える年齢を有する。
【0079】
特定の実施形態では、被験体が肥満または過体重の被験体である。
【0080】
特定の実施形態では、被験体は喫煙するか、または喫煙していた。
【0081】
特定の実施形態では、この方法が被験体における精子の質を改善し、それによって、被験体が適切な女性被験体において成功した妊娠を産生する（または産生する可能性が増大する）ことを可能にする。特定の実施形態において、該方法は被験体における精子の質を改善し、それによって、被験体が、適切な女性被験体において、自然手段による成功した妊娠を産生する（または産生する可能性が増大する）ことを可能にする。特定の実施形態において、この方法は被験体における精子の質を改善し、それによって、被験体が、補助された生殖技術を利用して、成功した妊娠を産生する（または産生する可能性を増加させる）ことを可能にする。特定の実施形態において、この方法は、産生される子孫の質を改善する。
【0082】
特定の実施形態では、被験体はヒト被験体である。
【0083】
特定の実施形態では、被験体が家畜動物（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ）、家畜（例えば、イヌまたはネコ）および他の種類の動物（例えば、サル、ウサギ、マウス、ラットおよび実験動物、ならびに野生生物種）のような動物対象である。
【0084】
特定の実施形態では、精子をＢＧＰ－１５および／またはその誘導体に曝露することはＢＧＰ－１５および／またはその誘導体を被験体に投与することを含む。特定の実施形態では、被験体によって産生される精子の質が改善される。特定の実施形態では、インビトロ受精目的のために被験体によって産生される精子の質が改善される。
【0085】
特定の実施形態では、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体を被験体に投与して、１μＭ～１００μＭ、５μＭ～１００μＭ、１０μＭ～１００μＭ、５０μＭ～１００μＭ、１μＭ～５０μＭ、５μＭ～５０μＭ、１０μＭ～５０μＭ、１μＭ～１０μＭ、５μＭ～１０μＭ、または１μＭ～５μＭの範囲の血液または血漿濃度を提供する。他の範囲も考えられる。
【0086】
特定の実施形態では、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体が１μｇ／ｋｇ～１０００ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ～１0ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ～１ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ～１００μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ～１0μｇ／ｋｇ、１0μｇ／ｋｇ～１０００mｇ／ｋｇ、１0μｇ／ｋｇ～１００mｇ／ｋｇ、１０μg／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ～１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ～１００μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ～１００μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ～１０００ｍｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ～１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ～１０００ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ～１０００ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、および１００ｍｇ／ｋｇ～１０００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の一つで被検体へ投与される。他の範囲も考えられる。
【0087】
特定の実施形態において、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体は、１日１回、２回、１日複数回、または連続的に投与される。他の投与レジメンも考えられる。適切な投与期間を選択することができる。
【0088】
特定の実施形態では、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体が少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、または少なくとも４週間の期間、被験体に投与される。特定の実施形態では、投与は連続期間である。他の投与期間も考えられる。
【0089】
特定の実施形態では、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体が１μｇ／ｋｇ／日～１０００ｍｇ／ｋｇ／日、１μｇ／ｋｇ／日～１００ｍｇ／ｋｇ／日、１μｇ／ｋｇ／日～１０ｍｇ／ｋｇ／日、１μｇ／ｋｇ／日～１ｍｇ／ｋｇ／日、１μｇ／ｋｇ／日～１００μｇ／ｋｇ／日、１μｇ／ｋｇ／日～１０μｇ／ｋｇ／日、１０μｇ／ｋｇ／日～１０００ｍｇ／ｋｇ／日、１０μｇ／ｋｇ／日～１００ｍｇ／ｋｇ／日、１０μｇ／ｋｇ／日～１０ｍｇ／ｋｇ／ｋｇ／日、１０μｇ／ｋｇ／日～１ｍｇ／ｋｇ／日、１０μｇ／ｋｇ／日～１００μｇ／ｋｇ／日、１０μｇ／ｋｇ／日～１０００μｇ／ｋｇ／日、１００μｇ／ｋｇ／日～１００ｍｇ／ｋｇ／日、１００μｇ／ｋｇ／日～１０ｍｇ／ｋｇ／日、１００μｇ／ｋｇ／日～１ｍｇ／ｋｇ／日、１ｍｇ／ｋｇ／日～１０００ｍｇ／ｋｇ／日、１ｍｇ／ｋｇ／日～１００ｍｇ／ｋｇ／日、１ｍｇ／ｋｇ／日～１０ｍｇ／ｋｇ／日、１０ｍｇ／ｋｇ／日～１０００ｍｇ／ｋｇ／日、１０ｍｇ／ｋｇ／日～１００ｍｇ／ｋｇ／日、１００ｍｇ／ｋｇ／日～１０００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の一つで被検体へ投与される。他の範囲も考えられる。
【0090】
ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体は、適切な形態で被験体に投与され得る。この点に関して、用語「投与する」または「与える」は、被験体の体内に有効量の所望の薬剤を形成する薬剤を投与すること、またはプロドラッグもしくは誘導体を投与することを含む。
この用語は全身性である投与経路（例えば、静脈内注射のような注射、錠剤、丸剤、カプセル、または全身投与に有用な他の投薬形態での経口による）、および局所性である投与経路（例えば、クリーム、溶液、ペースト、洗口剤のような溶液を含む軟膏、局所経口投与）を含む。他の投与経路も考えられる。
この用語は全身性である投与経路（例えば、静脈内注射のような注射、錠剤、丸剤、カプセル、または全身投与に有用な他の投薬形態での経口による）、および局所性である投与経路（例えば、クリーム、溶液、ペースト、洗口剤のような溶液を含む軟膏、局所経口投与）を含む。他の投与経路も考えられる。
【0091】
特定の実施形態において、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体は経口投与される。特定の実施形態において、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体は、静脈内に投与される。特定の実施形態では、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体が静脈内注射などの注射によって投与される。特定の実施形態において、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体は、噴霧投与によって、エアロゾル投与によって、または肺に点滴注入されることによって投与される。他の形態／投与経路も考えられる。
【0092】
ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体は単独で投与されてもよく、または、例えば、薬剤の活性を増強、安定化または維持する他の処置剤および／または薬剤との混合物で供給されてもよい。特定の実施形態では、投与ビヒクル（例えば、丸剤、錠剤、インプラント、注射溶液など）が使用され、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体および追加の薬剤の両方を含有する。
【0093】
本明細書に記載される方法はまた、併用療法を含んでもよい。この点に関して、被験体は本明細書に記載されるように、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体と併せて、別の薬物または処置様式を処置または与えられ得る。この併用療法は、被験体が最初に一方で処置され、次いで他方で処置されるか、または２つ以上の処置様式が同時に与えられる連続療法であり得る。
【0094】
「同時投与」又は「同時投与」とは、一度に２つ以上の処置薬を一緒に投与することをいい、２つ以上の処置薬は単一の剤形又は「組み合わせ投薬単位」に同時製剤化することができ、又は別々に製剤化し、その後、典型的には静脈内投与又は経口投与のために組み合わせ投薬単位に組み合わせることができる。
【0095】
被験体に投与される場合、薬剤の処置上有効な投薬量は、利用される特定の薬剤、投与様式、その状態、および重症度、ならびに処置される被験体に関連する様々な身体的要因に依存して変化し得る。投与量は、投与経路、および投与される薬剤および投与される任意の他の薬剤の性質によって変化することが予想される。特定の実施形態では、方法がＢＧＰ－１５および／またはその誘導体の用量を漸増させること、および／または反復用量を被験体に投与することを含む。
【0096】
特定の実施形態において、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体は経口投与される。特定の実施形態において、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体は、静脈内に投与される。特定の実施形態では、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体が静脈内注射などの注射によって投与される。特定の実施形態において、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体は、非経口的に投与される。特定の実施形態において、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体は、エアロゾル投与によるような、肺への直接導入によって、噴霧投与によって、および肺に点滴注入されることによって投与される。特定の実施形態において、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体は、移植によって投与される。特定の実施形態では、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体が皮下注射、関節内、直腸内、鼻腔内、眼内、膣内、または経皮によって投与される。投与の方法は、当該分野で公知である。
【0097】
「静脈内投与」とは、物質を直接静脈内に投与することである。
【0098】
「経口投与」とは、物質を口から摂取する投与経路であり、経腸投与と同様に頬部、口唇下及び舌下投与を含む。処置薬の経口投与のための典型的な形態には、錠剤またはカプセルの使用が含まれる。
【0099】
特定の実施形態では、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体が連続放出製剤として投与される。
【0100】
特定の実施形態では、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体が即時放出製剤として投与される。用語「即時放出製剤」は、短期間にわたって体内で処置薬を迅速に放出するように設計された製剤である。即時放出製剤は、当技術分野で公知である。
【0101】
特定の実施形態において、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体は、徐放性製剤として投与される。用語「持続放出製剤」は、長期間にわたって体内で処置薬を徐々に放出するように設計された製剤である。持続放出製剤は、当技術分野で公知である。
【0102】
特定の実施形態では、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体が薬学的に許容される塩として投与される。この点に関して、「薬学的に許容される塩」という用語は、製薬産業において一般に使用される酸付加塩または金属錯体を指す。金属錯体としては、亜鉛、鉄などが挙げられる。薬学的に許容される塩の製造に使用することができる適切な酸としては、限定されるものではないが、酢酸、２，２－ジクロロ酢酸、アシル化アミノ酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸、Ｌ－アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、アセタミド安息香酸、ホウ酸、（＋）－カンホリック酸、カンフルスルホン酸、（＋）－（ｌＳ）カンフルスルホン酸、カプリン酸、カプロン酸、カプリル酸、ケイ皮酸、クエン酸、シクラミン酸、シクロヘキサンスルファミン酸、ドデシル硫酸、エタン１，２－ジスルホン酸、エタンスルホン酸、2－ヒドロキシエタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、ガラクチン酸、ゲンシティン酸、グルコヘプトン酸、Ｄ－グルコン酸、Ｄ－グルクロン酸、馬尿酸、Ｌ－グルタミン酸、オキソ－グルタル酸、グリコール酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、（＋）－Ｌ－乳酸、（±）－ＤＬ－乳酸、ラウリン酸、ラクトビオン酸、マレイン酸、（－）－Ｌ－リンゴ酸、 （±）－ＤＬ－マンデル酸、メタンスルホン酸、ナフタレン－２－スルホン酸、メタンスルホン酸、ナフタレン－２－スルホン酸、１－ヒドロキシ－２－ナフトエ酸、ナフタレン－１，５－ジスルホン酸、１－ヒドロキシ－２－ナフトイック酸、ニコチン酸、硝酸、オレイン酸、オロチン酸、オロチン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、過塩素酸、リン酸、Ｌ－ピログルタミン酸、サッカリン酸、サリチル酸、４－アミノサリチル酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、硫酸、タンニン酸、（＋）－Ｌ－酒石酸、チオシアン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、ウンデシレン酸、スベリン酸、吉草酸等が挙げられる。
【0103】
薬学的に許容される塩の製造に使用することができる適切な塩基としては、限定されるものではないが、水酸化マグネシウム、水酸化カリウム、水酸化亜鉛、または水酸化ナトリウムなどの無機塩基；ならびにＬ－アルギニン、ベンザチン、コリン、デアノール、ジエタノールアミン、ジメチルアミン、ジプロピルアミン、２－（ジエチルアミノ）－エタノール、エチルアミン、イソプロピルアミン、Ｎ－メチル－グルカミン、ヒドラバミン、イミダゾール、Ｌ－リジン、モルホリン、４－（２－ヒドロキシエチル）－モルホリン、メチルアミン、ピぺリジン、ピペラジン、プロピルアミン、ピロリジン、ｌ－（２－ヒドロキシエチル）－ピロリジン、キノリン、イソキノリン、第二級アミン、トリエタノールアミン、トリエチルアミン、Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミン、２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）１，３－プロパンジオール、トロメタミン等を含む第一級、第二級、第三級、第四級、脂肪族および芳香族アミンのような有機塩基が挙げられる。
【0104】
インビボ精子の質を評価するための方法は、当該分野で公知である。
【0105】
特定の実施形態では、精子の質の評価が適切な女性被験体が妊娠する速度を評価することを含む。
【0106】
特定の実施形態では、精子の質の評価が被験体から精子を得ること、および精子の受精能力を評価することを含む。特定の実施形態では、精子の質の評価が被験体から精子を得ること、および卵母細胞を受精させる精子の能力、および／または精子から産生される胎芽の発生能を評価することを含む。特定の実施形態において、精子の質の評価は、被験体から精子を得ること、および受精後の適切なタイミングで卵割を完了した接合子を産生する精子の能力、適切な時間枠内に胚盤胞生育を完了する２細胞胎芽を産生する精子の能力、および孵化を開始する胚盤胞を産生する精子の能力を評価することを含む。特定の実施形態では、精子の質の評価がＤＮＡ完全性および／またはＤＮＡ品質を評価することを含む。特定の実施形態では、精子の質の評価がミトコンドリア活性を評価することを含む。特定の実施形態では、精子の質の評価が精子運動性を評価することを含む。
【0107】
特定の実施形態において、この方法は、精子の質を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％または少なくとも５００％改善する。
【0108】
特定の実施形態において、この方法は被験体における精子の質の低下を防止および／または処置するために、低減した受精能を有する被験体を処置するために、または精子の質を改善するために被験体を処置するために使用される。特定の実施形態では、本方法が本明細書に記載の状態または様子を防止または処置するために使用される。
【0109】
本開示の特定の実施形態は、精子を本明細書に記載のＢＧＰ－１５および／またはその誘導体に曝露することによって産生される分離された精子を提供する。
【0110】
特定の実施形態において、分離された精子は、インビトロでＢＧＰ－１５および／またはその誘導体に曝露された精子である。
【0111】
精子をインビトロでＢＧＰ－１５および／またはその誘導体に曝露するための方法は、本明細書に記載される通りである。このように処置された精子は例えば、生殖補助技術において使用され得る。精子は例えば、直接使用され得るか、またはさらなる処置、分離または富化に供され得る。
【0112】
特定の実施形態において、分離された精子は、インビボでＢＧＰ－１５および／またはその誘導体に曝露された被験体から分離された精子である。
特定の実施形態では、分離された精子がＢＧＰ－１５および／またはその誘導体に曝露された被験体から分離された精子である。
特定の実施形態では、分離された精子がＢＧＰ－１５および／またはその誘導体に曝露された被験体から分離された精子である。
【0113】
精子をインビボでＢＧＰ－１５および／またはその誘導体に曝露するための方法は、本明細書に記載される通りである。精子は例えば、直接使用され得るか、またはさらなる処置、分離または富化に供され得る。
【0114】
特定の実施形態では、そのように処置された精子(インビトロおよび／またはインビボで暴露された）が改善された発生能を有する胎芽を産生するために使用される。
【0115】
特定の実施形態において、分離された精子は、生殖補助方法において使用される。生殖補助技術は、本明細書に記載される通りである。特定の実施形態において、このように分離された精子は、改善された発生能を有する胎芽を産生するために使用される。
【0116】
本開示の特定の実施形態は本明細書に記載されるように、改善された質を有する精子を使用することを含む、生殖を補助する方法を提供する。
【0117】
本開示の特定の実施形態は、本明細書に記載の分離された精子を使用することを含む、補助された生殖の方法を提供する。
【0118】
本開示の特定の実施形態は、本明細書に記載の方法を使用して、精子の質を改善するために被験体を処置する方法を提供する。
【0119】
本開示の特定の実施形態は精子の質を改善するために被験体を処置する方法を提供し、この方法は有効量のＢＧＰ－１５および／またはその誘導体を被験体に投与し、それによって被験体における精子の質を改善することを含む。
【0120】
本開示の特定の実施形態は、本明細書に記載の方法を使用して、被験体において低減した精子の質を処置する方法を提供する。
【0121】
本開示の特定の実施形態は被験体において低減した精子の質を処置する方法を提供し、この方法は有効量のＢＧＰ－１５および／またはその誘導体を被験体に投与し、そしてそれによって被験体を処置することを包含する。
【0122】
本開示の特定の実施形態は、精子の質を改善するためのＢＧＰ－１５および／またはその誘導体の使用を提供する。
【0123】
本開示の特定の実施形態は、精子の質を改善するための組成物において、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体の使用を提供する。
【0124】
特定の実施形態では、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体が１μｍ～１００μＭ、２μｍ～１００μＭ、５μｍ～１００μＭ、１０μｍ～１００μＭ、２０μｍ～１００μＭ、５０μｍ～１００μＭ、１μｍ～５０μＭ、２μｍ～１００μＭ、２μｍ～１００μＭ、５μｍ～５０μＭ、１０μｍ～５０μＭ、２０μｍ～５０μＭ、１μｍ～２０μＭ、２μｍ～２０μＭ、５μｍ～１０μＭ、１μｍ～５μＭ、２μｍ～５μＭ、または１μｍ～２μＭの範囲の濃度で組成物中で使用される。他の濃度範囲も考えられる。
【0125】
特定の実施形態では、組成物は精子調製培地である。精子調製培地は当該分野で公知であり、そして商業的に入手可能である。例えば、精子調製培地は、精液の収集、精子の洗浄および／または精子の分離のために使用され得る。
【0126】
特定の実施形態では、組成物がインビトロ受精培地である。ＩＶＦ媒体は当技術分野で公知であり、市販されている。
【0127】
特定の実施形態では、組成物が精子凍結または凍結保存培地である。精子凍結または凍結保存培地は当該分野で公知であり、そして商業的に入手可能である。
【0128】
本開示の特定の実施形態は、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体を含む精子調製培地を提供する。ＢＧＰ－１５および誘導体は、本明細書に記載されるとおりである。
【0129】
特定の実施形態では、精子調製培地が１μｍ～１００μＭ、２μｍ～１００μＭ、５μｍ～１００μＭ、１０μｍ～１００μＭ、２０μｍ～１００μＭ、５０μｍ～１００μＭ、１μｍ～１００μＭ、１μｍ～５０μＭ、２μｍ～１００μＭ、５μｍ～５０μＭ、１０μｍ～５０μＭ、２０μｍ～５０μＭ、１μｍ～２０μＭ、２μｍ～２０μＭ、５μｍ～１０μＭ、１μｍ～５μＭ、２μｍ～５μＭ、または１μｍ～２μＭの範囲の濃度のＢＧＰ－１５および／またはその誘導体を含む。他の範囲も考えられる。
【0130】
本開示の特定の実施形態は精子を調製する方法を提供し、この方法は、精子を本明細書に記載の精子調製培地に曝露することを含む。精子調製のための方法は、当該分野で公知である。
【0131】
本開示の特定の実施形態は、精子のためのインビトロ受精培地であって、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体を含む培地を提供する。ＢＧＰ－１５および誘導体は、本明細書に記載されるとおりである。
【0132】
特定の実施形態において、インビトロ受精培地は、１μｍ～１００μＭ、２μｍ～１００μＭ、５μｍ～１００μＭ、１０μｍ～１００μＭ、２０μｍ～１００μＭ、５０μｍ～１００μＭ、１μｍ～５０μＭ、２μｍ～１００μＭ、２μｍ～１００μＭ、５μｍ～５０μＭ、１０μｍ～５０μＭ、２０μｍ～５０μＭ、１μｍ～２０μＭ、２μｍ～２０μＭ、５μｍ～１０μＭ、１μｍ～５μＭ、２μｍ～５μＭ、または１μｍ～２μＭの範囲のＢＧＰ－１５および／またはその誘導体の濃度を含む。他の範囲も考えられる。
【0133】
ＩＶＦ培地は当技術分野で知られており、典型的には以下の成分を含む：塩化カルシウム；硫酸ゲンタマイシン；グルコース；ヒト（または動物）アルブミン溶液；硫酸マグネシウム；塩化カリウム；重炭酸ナトリウム；塩化ナトリウム；リン酸ナトリウム；ピルビン酸ナトリウム；および合成血清代用品。
【0134】
本開示の特定の実施形態はインビトロ受精の方法を提供し、この方法は、精子を本明細書に記載のインビトロ受精培地に曝露する工程を包含する。インビトロ受精のための方法は、当該分野で公知である。
【0135】
本開示の特定の実施形態は、精子凍結または凍結保護培地であって、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体を含む培地を提供する。ＢＧＰ－１５および誘導体は、本明細書に記載されるとおりである。
【0136】
特定の実施形態では、精子凍結または凍結保護培地が１μｍ～１００μＭ、２μｍ～１００μＭ、５μｍ～１００μＭ、１０μｍ～１００μＭ、２０μｍ～１００μＭ、５０μｍ～１００μＭ、１μｍ～５０μＭ、２μｍ～１００μＭ、５μｍ～５０μＭ、１０μｍ～５０μＭ、２０μｍ～５０μＭ、１μｍ～２０μＭ、２μｍ～２０μＭ、５μｍ～１０μＭ、１μｍ～５μＭ、２μｍ～５μＭ、または１μｍ～２μＭの範囲のＢＧＰ－１５および／またはその誘導体の濃度を含む。他の範囲も考えられる。
【0137】
本開示の特定の実施形態は精子を凍結する方法を提供し、この方法は、精子を、本明細書中に記載される精子凍結または凍結保護培地に曝露する工程を包含する。精子を凍結または凍結保護するための方法は、当該分野で公知である。
【0138】
本開示の特定の実施形態は精子を凍結する方法を提供し、その方法は精子を凍結する前、間、後のいずれかまたはいずれかの時に、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体に曝露することを含む。ＢＧＰ－１５および誘導体は、本明細書に記載されるとおりである。
【0139】
本開示の特定の実施形態は、ＢＧＰ－１５及び／又はその誘導体を含む医薬品組成物又は医薬品を提供する。薬剤または医薬組成物は本明細書に記載されるように、被験体を処置する方法において使用されてもよい。
【0140】
本開示の特定の実施形態は、有効量のＢＧＰ－１５および／またはその誘導体を含む、精子の質を改善するための医薬組成物を提供する。ＢＧＰ－１５および誘導体は、本明細書に記載されるとおりである。
【0141】
特定の実施形態において、医薬組成物は、薬学的に受容可能なキャリアおよび／または適切な賦形剤をさらに含む。
【0142】
特定の実施形態において、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体は、０．１μＭ～３０μＭ、０．５μＭ～３０μＭ、５μＭ～３０μＭ、１０μＭ～３０μＭ、２０μＭ～３０μＭ、０．１μＭ～２０μＭ、０．5μＭ～２０μＭ、１μＭ～２０μＭ、５μＭ～２０μＭ、１０μＭ～２０μＭ、１０μＭ、０．１μＭ～１０μＭ、０．１μＭ～１０μＭ、０．5μＭ～１０μＭ、１μＭ～１０μＭ、５μＭ～１０μＭ、０．１μＭ～５μＭ、０．５μＭ～５μＭ、１μＭ～５μＭ、または０．１μＭ～０．５μＭの範囲の濃度で、血液または血漿中に存在するよう、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体は医薬組成物中に存在する。他の範囲も考えられる。
【0143】
特定の実施形態において、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体は、医薬組成物中において、被検体に対してＢＧＰ－１５および／またはその誘導体は、以下の選択された範囲：１μｇ／ｋｇ～１０００ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ～１ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ～１００μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ～１０μｇ／ｋｇ、１0μｇ／ｋｇ～１０００mｇ／ｋｇ、１0μｇ／ｋｇ～１００mｇ／ｋｇ、１0μｇ／ｋｇ～１０mｇ／ｋｇ、１0μｇ／ｋｇ～１mｇ／ｋｇ、１0μｇ／ｋｇ～１０μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ～１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ～１００μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ～１０００ｍｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ～１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ～１０００ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ～１０００ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、および１００ｍｇ／ｋｇ～１０００ｍｇ／ｋｇ体重、で存在するよう投与される。他の範囲も考えられる。
【0144】
一定の実施形態において、ＢＧＰ－１５及び／又はその誘導体は以下の選択された範囲のいずれかの範囲の量で、被験体にＢＧＰ－１５及び／又はその誘導体を提供するように、医薬品組成物に存在する:０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ～５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ～５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ～５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ～１ｍｇ／ｋｇまたは０．５ｍｇ／ｋｇ～１ｍｇ／ｋｇ。他の範囲も考えられる。
【0145】
特定の実施形態では、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体が以下の選択された範囲の量で被験体に投与するためのＢＧＰ－１５および／またはその誘導体の量を提供するように医薬組成物中に存在する：１μｇ／ｋｇ／日～１０００ｍｇ／ｋｇ／日、１μｇ／ｋｇ／日～１００ｍｇ／ｋｇ／日；１μｇ／ｋｇ／日～１０ｍｇ／ｋｇ／日；１μｇ／ｋｇ／日～１０μｇ／ｋｇ／日；１０μｇ／ｋｇ／日～１０００ｍｇ／ｋｇ／日、１０μｇ／ｋｇ／日～１００ｍｇ／ｋｇ／日；１０μｇ／ｋｇ／日～１００ｍｇ／ｋｇ／日；１０μｇ／ｋｇ／日～１０ｍｇ／ｋｇ／ｋｇ／日；１０μｇ／ｋｇ／日～１ｍｇ／ｋｇ／日；１０μｇ／ｋｇ／日～１００μｇ／ｋｇ／日；１０μｇ／ｋｇ／日～１０００ｍｇ／ｋｇ／日、１００μｇ／ｋｇ／日～１００ｍｇ／ｋｇ／日、１００μｇ／ｋｇ／日～１０ｍｇ／ｋｇ／日、１００μｇ／ｋｇ／日～１ｍｇ／ｋｇ／日、１００μｇ／ｋｇ／日～１０ｍｇ／ｋｇ／日、１ｍｇ／ｋｇ／日～１０００ｍｇ／ｋｇ／日、１ｍｇ／ｋｇ／日～１００ｍｇ／ｋｇ／日、１ｍｇ／ｋｇ／日～１０ｍｇ／ｋｇ／日、１０ｍｇ／ｋｇ／日～１０００ｍｇ／ｋｇ／日、１０ｍｇ／ｋｇ／日～１００ｍｇ／ｋｇ／日、１００ｍｇ／ｋｇ／日～１０００ｍｇ／ｋｇ／日。他の範囲も考えられる。
【0146】
特定の実施形態において、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体は、以下の選択された範囲の量で被験体に投与するためのＢＧＰ－１５および／またはその誘導体の量を提供するように医薬組成物中に存在する：０．１ｍｇ／ｋｇ／日～１０ｍｇ／ｋｇ／日、０．５ｍｇ／ｋｇ／日～１０ｍｇ／ｋｇ／日、１ｍｇ／ｋｇ／日～１０ｍｇ／ｋｇ／日、５ｍｇ／ｋｇ／日～１０ｍｇ／ｋｇ／日、０．１ｍｇ／ｋｇ／日～５ｍｇ／ｋｇ／日、０．５ｍｇ／ｋｇ／日～５ｍｇ／ｋｇ／日、１ｍｇ／ｋｇ／日～５ｍｇ／ｋｇ／日、０．１ｍｇ／ｋｇ／日～１ｍｇ／ｋｇ／日、または０．５ｍｇ／ｋｇ／日～１ｍｇ／ｋｇ／日。他の範囲も考えられる。
【0147】
特定の実施形態では、医薬組成物が静脈内投与、気管内投与、噴霧投与、エアロゾル化投与、肺への点滴注入、経口投与、非経口投与、インプラント、皮下注射、関節内、直腸内、鼻腔内、眼内、膣内、または経皮のうちの１つ以上による被験体への配送に適している。
他の投与経路も考えられる。
他の投与経路も考えられる。
【0148】
特定の実施形態では、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体には医薬組成物を被験体に投与するのに適した薬学的に許容される担体が提供される。担体は、投与経路、送達される薬剤、および薬剤の送達の時間経過を含む様々な考慮事項に基づいて選択され得る。用語「薬学的に受容可能なキャリア」は、実質的に不活性な固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、賦形剤、カプセル化材料、または任意の型の製剤補助剤をいう。薬学的に受容可能なキャリアの例は、生理食塩水である。他の生理学的に受容可能なキャリアおよびそれらの処方は、当該分野で公知である。薬学的に許容される担体として働くことができる材料の幾つかの例には、コーンスターチおよびショ糖などの糖；セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロース、エチルセルロースおよび酢酸セルロース；粉末トラガカント；ゼラチン；タルク；ココアバターおよび坐剤ワックスなどの賦形剤；ピーナッツ油、綿実油などの油；ベニバナ油；オリーブ油；トウモロコシ油および大豆油などのグリコール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；TWEEN８０などの洗浄剤；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；発熱物質を含まない水；等張食塩水；リンゲル液；ならびに他の非毒性適合性潤滑剤、ならびに着色剤が含まれる。剥離剤、コーティング剤、甘味料、香料、防腐剤および酸化防止剤も存在し得る。
【0149】
特定の実施形態では、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体が薬学的に許容される賦形剤と共に提供される。
【0150】
例えば、錠剤の形態で使用するための適切な賦形剤には、錠剤コアおよび以下のようなフィルムコートを有する錠剤が含まれる：錠剤コア－トウモロコシデンプン、プレゼラチン化デンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、ポビドン、グリセロールジベヘネート、ステアリン酸マグネシウム；フィルムコート－ヒプロメロース、グリセロールトリアセテート、タルク、二酸化チタン（Ｅ１７１）、酸化鉄黄色（Ｅ１７２）、酸化鉄赤色（Ｅ１７２）、エチルセルロース。他の賦形剤も考えられる。
【0151】
例えば、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体を有する錠剤は、トウモロコシデンプン、プレゼラチン化デンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、ポビドン、グリセロールジベヘネート、およびステアリン酸マグネシウム、ならびにヒプロメロース、グリセロールトリアセテート、タルク、二酸化チタン（Ｅ１７１）、酸化鉄イエロー（Ｅ１７２）、酸化鉄レッド（Ｅ１７２）、およびエチルセルロースを有するフィルムコートを有する水和物および錠剤コアとしての薬剤の量を含み得る。
【0152】
特定の実施形態において、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体は、薬学的に受容可能な塩として投与され得るか、または薬学的組成物中に存在し得る。
【0153】
特定の実施形態において、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体は、薬学的に受容可能な水和物として投与され得るか、または薬学的組成物中に存在し得る。水和物は親化合物（例えば、薬物または賦形剤の無水物）および水の両方を含有する固体付加物である。
【0154】
特定の実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物が活性物質の活性を増強、安定化、または維持する他の処置薬および／または薬剤を含む。
【0155】
本明細書に記載される経口製剤は、錠剤、カプセル、口腔形態、トローチ、ロゼンジおよび経口液体、懸濁液または溶液を含む、任意の従来使用される経口形態を含み得る。カプセルは活性化合物と不活性充填剤および／または希釈剤（例えば、薬学的に許容されるデンプン（例えば、トウモロコシ、ジャガイモまたはタピオカデンプン）、糖、人工甘味料、粉末セルロース（例えば、結晶性および微結晶性セルロース）、粉、ゼラチン、ガムなど）との混合物を含み得る。有用な錠剤製剤は従来の圧縮、湿式造粒化または乾式造粒化方法によって作製することができ、薬学的に許容される希釈剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、表面改質剤（界面活性剤を含む）、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム、微結晶セルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、アルギン酸、アラビアゴム、キサンタンガム、クエン酸ナトリウム、複合ケイ酸塩、炭酸カルシウム、グリシン、デキストリン、スクロース、ソルビトール、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、ラクトース、カオリン、マンニトール、塩化ナトリウム、タルク、乾燥デンプンおよび粉末糖を含む懸濁化剤または安定化剤を利用することができる。表面改質剤には、非イオン性およびアニオン性表面改質剤が含まれる。表面改質剤の代表的な例としてはポロキサマー１８８、塩化ベンザルコニウム、ステアリン酸カルシウム、セトステアリルアルコール、セトマクロゴール乳化ワックス、ソルビタンエステル、コロイドル二酸化ケイ素、リン酸塩、ドデシル硫酸ナトリウム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、およびトリエタノールアミンが挙げられるが、これらに限定されない。経口製剤はペプチドの吸収を変化させるために、標準遅延製剤または時間放出製剤を利用してもよい。経口製剤はまた、必要に応じて適切な可溶化剤または乳化剤を含有する、水またはフルーツジュース中の活性成分を投与することからなってもよい。経口製剤は当技術分野で公知であり、当業者によって製剤化することができる。
【0156】
特定の実施形態では、医薬組成物をエアロゾルの形態で気道に直接投与することが望ましい場合がある。エアロゾル形態の投与のための製剤は当該分野で公知であり、そして当業者によって製剤化され得る。
【0157】
特定の実施形態において、組成物はまた、非経口的に（例えば、関節空間に直接）または腹腔内に投与され得る。例えば、非イオン化形態または薬理学的に許容される塩としての薬剤の溶液または懸濁液を、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製することができる。また分散剤はグリセリン、液体ポリエチレングリコール及びその油中の混合物中で製造し得る。貯蔵および使用の通常の条件下では、これらの調製物が典型的には微生物の増殖を防ぐための防腐剤を含有する。非経口製剤は当技術分野で公知であり、当業者によって製剤化することができる。
【0158】
特定の実施形態において、組成物はまた、注射によって投与され得る。注射可能な使用に適した医薬形態には、無菌の水溶液または分散液、および無菌の注射可能な溶液または分散液を即座に調製するための無菌の粉末が含まれる。担体は例えば、水、等張食塩水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール）、それらの適切な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒体であり得る。注射可能な製剤は当技術分野で公知であり、当業者によって製剤化されてもよい。
【0159】
特定の実施形態では、医薬組成物はまた、静脈内投与されてもよい。静脈内投与に適した組成物は当技術分野で公知であり、当業者によって製剤化され得る。例えば、等張生理食塩水は、アンタゴニストを含有する静脈内組成物において使用され得る。
【0160】
特定の実施形態において、医薬組成物はまた、経皮的に投与されてもよい。経皮投与は、身体の表面、および上皮および粘膜組織を含む身体通路の内層を横切るすべての投与を含むと理解される。このような投与は、本明細書中に記載されるような活性剤、またはその薬学的に受容可能な塩を使用して、ローション、クリーム、フォーム、パッチ、懸濁液、溶液、および坐薬（直腸および膣）中で実施され得る。
【0161】
経皮投与はまた、活性化合物と、活性化合物に対して不活性であり、皮膚に対して無毒であり、皮膚を介した血流への全身吸収のための薬剤の送達を可能にする担体とを含有する経皮パッチの使用によって達成され得る。担体はクリーム、軟膏、ペースト、ゲルおよび閉塞性デバイスのような多くのいずれの形態でもよい。クリームおよび軟膏は粘稠液体または水中油型あるいは油中水型いずれかの半固形エマルジョンでもよい。活性成分を含有する石油または親水性石油中に分散された吸収性粉末からなるペーストも好適であり得る。種々の閉塞デバイス（例えば、担体を有するかまたは有さない活性成分を含むリザーバを覆う半透膜、または活性成分を含むマトリックス）が、血流中に活性成分を放出するために使用され得る。経皮製剤は当技術分野で知られており、当業者によって製剤化することができる。
【0162】
特定の実施形態では、医薬組成物はまた、坐剤によって投与されてもよい。坐剤製剤は、坐剤の融点を変えるためのワックスの添加の有無にかかわらず、ココアバターを含む従来の材料、およびグリセリンから作製され得る。種々の分子量のポリエチレングリコールのような水溶性坐剤基剤も使用することができる。坐剤製剤は当技術分野で公知であり、当業者によって製剤化することができる。
【0163】
薬剤または医薬組成物への投与および／または処方に関連して使用するのに適した、追加の多数の種々の賦形剤、剤形、分散剤など。製剤は公知であり、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences、17th ed、Mack Publishing Company、Easton、Pa、1985に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0164】
本開示の特定の実施形態は、本明細書に記載の医薬組成物を被験体に投与することによって被験体を処置する方法を提供する。
【0165】
本開示の特定の実施形態は精子の質を改善するために被験体を処置する方法を提供し、この方法は、本明細書に記載の医薬組成物を被験体に投与することを含む。
【0166】
本開示の特定の実施形態は被験体において低減した精子の質を処置する方法を提供し、この方法は、本明細書中に記載されるような医薬組成物を被験体に投与する工程を包含する。
【0167】
本開示の特定の実施形態はＢＧＰ－１５及び／又はその誘導体に曝される精子を使用することにより、未処置体の発育能力を向上させる方法を提供する。ＢＧＰ－１５および誘導体は、本明細書に記載されるとおりである。
【0168】
本開示の特定の実施形態は卵母細胞を受精させた精子によって産生された胎芽の発育能力を向上させる方法、すなわち精子をＢＧＰ－１５および／またはその誘導体に曝露する方法を提供し、それによって胎芽の発育能力を向上させる方法を提供する。ＢＧＰ－１５および誘導体は、本明細書に記載されるとおりである。
【0169】
特定の実施形態では、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体がＢＧＰ－１５、プロプラノロール、ビモクロモール、アリモクロマール、ＮＧ－９４、イロキサナジン、および／または前述のいずれかの薬学的に許容される誘導体、プロドラッグ、溶媒和物、塩、互変異性体、立体異性体、またはラセミ体のうちの１つ以上を含む。
【0170】
一定の実施形態において、ＢＧＰ－１５及び／又はその誘導体はＢＧＰ－１５から成る。
【0171】
本明細書で使用される「発育能力」という用語は（i）卵母細胞が胎芽を産生する能力および／または可能性（例えば、卵母細胞の受精時に、または単為生殖活性化などの他の機構によって）、（ii）卵母細胞が胎芽の形成時に胚盤胞製造を通って進行する能力、可能性、および速度のうちの１つ以上、ならびに（iii）卵母細胞からの胎芽の産生時に達成される胎芽の質（例えば、形態学的および／または生化学的評価によって決定される）のうちの１つ以上を含む。
【0172】
発生能を決定するための方法は、当該分野で公知である。
【0173】
例えば、精子に暴露された卵母細胞から産生された胎芽が胚盤胞生育を進行させる能力は、改善され得、かつ／または胚盤胞生育を進行させる能力の増加、受精率の増加、胚盤胞生育を進行させる可能性の増加、２細胞胎芽を形成する速度の増加、４細胞胎芽を形成する速度の増加、胚盤胞を形成する速度の増加、胚盤胞を形成する速度の増加、胚盤胞生育を進行させる速度の増加、および胚盤胞ハッチングの速度の増加の１つまたは複数を有することができる。
【0174】
特定の実施形態において、この方法は、卵母細胞をインビトロで精子に曝露する工程を包含する。
【0175】
特定の実施形態において、この方法は、卵母細胞をインビボで精子に曝露する工程を包含する。
【0176】
精子、および精子のドナーは、本明細書に記載されるとおりである。
【0177】
本開示の特定の実施形態は、ＢＧＰ－１５及び／又はその誘導体に曝される精子を用いた生殖補助の方法を提供する。ＢＧＰ－１５および誘導体は、本明細書に記載されるとおりである。
【0178】
本開示の特定の実施形態は精子を用いた生殖補助の方法、すなわち、精子をＢＧＰ－１５および／またはその誘導体に曝露し、さらに生殖補助の方法でＢＧＰ－１５および／またはその誘導体に曝される精子を使用する方法を提供する。ＢＧＰ－１５および誘導体は、本明細書に記載されるとおりである。
【0179】
生殖補助技術は、本明細書に記載される通りである。
【0180】
特定の実施形態では、生殖補助技術がインビトロ受精を含む。特定の実施形態では、生殖補助技術が人工受精を含む。
【0181】
特定の実施形態では、精子が老齢ドナーまたは高齢ドナー由来である。特定の実施形態では、精子が４０歳を超える年齢を有するドナーに由来する。特定の実施形態では、精子が４５歳を超える年齢を有するドナーに由来する。特定の実施形態では、精子が肥満または過体重ドナー由来である。特定の実施形態において、精子は、喫煙していたか、または喫煙したドナー被験体由来である。
【0182】
特定の実施形態では、精子は受精能が低下した被験体由来である。特定の実施形態において、精子は、低減した受精能に関連する疾患、状態または状態になっているか、または感受性である被験体に由来する。
【0183】
特定の実施形態において、精子は、インビトロでＢＧＰ－１５および／またはその誘導体に曝露される。ＢＧＰ－１５及び／又はその誘導体への精子のインビトロ暴露法は、本明細書に記載のとおりである。
【0184】
特定の実施形態において、精子は、インビボでＢＧＰ－１５および／またはその誘導体に曝露される。被検体にＢＧＰ－１５および／またはその誘導体を投与することによって、インビボで精子をＢＧＰ－１５および／またはその誘導体に曝露する方法は、本明細書に記載される通りである。
【0185】
特定の実施形態において、この方法は、ヒトにおける補助複製技術である。
【0186】
特定の実施形態において、この方法は、動物における生殖補助である。
【0187】
本開示の特定の実施形態は、本明細書に記載の生殖補助技術によって産生される分離胎芽を提供する。特定の実施形態では、分離された胎芽は動物胎芽である。
【0188】
本開示の特定の実施形態は、本明細書に記載されるような生殖補助技術を使用して産生される動物を提供する。
【0189】
本開示の特定の実施形態は、人工受精の方法を提供し、その方法は、インビトロで精子をＢＧＰ－１５および／またはその誘導体に曝露し、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体に曝露した精子を被検体に人工受精させることを含む。
【0190】
本開示の特定の実施形態は、人工受精の方法を提供し、その方法は、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体に暴露された被検体から精子を得、被検体に精子を人工受精させることを含む。
【0191】
本開示の特定の実施形態は、インビトロ受精方法を提供し、その方法は、インビトロで精子をＢＧＰ－１５および／またはその誘導体に曝露し、卵母細胞をＢＧＰ－１５および／またはその誘導体に曝露した精子と受精させることを含む。
【0192】
本開示の特定の実施形態は、インビトロ受精方法を提供し、その方法は、ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体に暴露した被検体から精子を入手し、卵母細胞に精子を受精させることを含む。
【0193】
ＩＶＦはインビトロでの卵母細胞の受精に関し、ここで、卵母細胞は被験体から分離され、典型的には、卵母細胞の受精を可能にするために、精子を有する液体培地中でインキュベートされる。精子による卵母細胞の受精は卵母細胞の成熟がＩＶＦ手順におけるその後の工程の成功を最大にするのに十分な段階にあるように、卵母細胞収集工程の後、一般に２４時間を超えるが、通常は６０時間以内に起こると考えられる。
【0194】
本開示の特定の実施形態は、本明細書に記載の方法を実施するためのキットまたは製品を提供する。
【0195】
キットまたは製品は、本明細書に記載されるような１つ以上の試薬および／または成分、ならびに／または本明細書に記載されるような方法を実施するための説明書を含み得る。
【0196】
特定の実施形態では、キットまたは製品が精子の質を改善するために使用される。
【0197】
本開示の特定の実施形態は、精子の質を改善するためのキットまたは製品であって、精子への曝露のためのＢＧＰ－１５および／またはその誘導体を含むキットまたは製品を提供する。ＢＧＰ－１５および誘導体は、本明細書に記載されるとおりである。
【0198】
例えば、キットまたは製品は、適切な形態のＢＧＰ－１５および／またはその誘導体、ならびに精子を処置するために組み合わせるための精子調製培地（またはその成分）を含み得る。
【0199】
特定の実施形態において、キットまたは製品は、生殖補助技術において使用される。
【0200】
本開示の特定の実施形態は、精子への曝露のためのＢＧＰ－１５および／またはその誘導体を含む、生殖補助技術において使用するためのキットまたは製品を提供する。ＢＧＰ－１５および誘導体は、本明細書に記載されるとおりである。
【0201】
本開示の特定の実施形態は、組み合わせ製品を提供する。
【0202】
本開示の特定の実施形態は、以下を含む組み合わせ製品を提供する：
（i）精子調製培地；
（ii）ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体；ならびに
任意選択で、精子調製培地中のＢＧＰ－１５および／またはその誘導体に精子を曝露するための説明書。
（i）精子調製培地；
（ii）ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体；ならびに
任意選択で、精子調製培地中のＢＧＰ－１５および／またはその誘導体に精子を曝露するための説明書。
【0203】
本開示の特定の実施形態は、以下を含む組み合わせ製品を提供する：
（i）ＩＶＦ培地；
（ii）ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体；ならびに
任意選択で、ＩＶＦ培地におけるＢＧＰ－１５および／またはその誘導体の使用説明書。
（i）ＩＶＦ培地；
（ii）ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体；ならびに
任意選択で、ＩＶＦ培地におけるＢＧＰ－１５および／またはその誘導体の使用説明書。
【0204】
本開示の特定の実施形態は、以下を含む組み合わせ製品を提供する：
（i）精子凍結培地；
（ii）ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体；ならびに
任意選択で、精子凍結培地中で精子をＢＧＰ－１５および／またはその誘導体に曝露するための説明書。
（i）精子凍結培地；
（ii）ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体；ならびに
任意選択で、精子凍結培地中で精子をＢＧＰ－１５および／またはその誘導体に曝露するための説明書。
【0205】
本開示の特定の実施形態は、精子の質を改善する薬剤をスクリーニングするための方法を提供する。
【0206】
本開示の特定の実施形態は精子の質を改善するための薬剤をスクリーニングする方法を提供し、この方法は、精子の質を改善するためのＢＧＰ－１５の誘導体の能力を決定すること、および精子の質を改善するための薬剤として前記誘導体を同定することを含む。精子の質を決定するための方法は、本明細書に記載される通りである。
【0207】
特定の実施形態では、この方法が精子の質を改善するインビトロでの前記誘導体の能力を決定することを含む。精子をインビトロで薬剤に曝露するための方法は、本明細書に記載される通りである。
【0208】
特定の実施形態では、本方法が動物精子を使用して、前記誘導体の精子の質を改善する能力を評価することを含む。
【0209】
特定の実施形態では、本方法がヒト精子を使用して、前記誘導体の精子の質を改善する能力を評価することを含む。
【0210】
特定の実施形態において、この方法は、精子の質を改善するインビボでの前記誘導体の能力を決定する工程を包含する。被検体の精子を薬剤に曝露する方法は、本明細書に記載されている通りである。
【0211】
特定の実施形態において、この方法は、インビボでの精子の質を改善する前記誘導体の能力を評価するための、動物被験体または動物モデルの使用を包含する。
【0212】
特定の実施形態では、前記誘導体がプロプラノロール、ビモクロモール、アリモクロマール、ＮＧ－９４、またはイロキサナジンのうちの１つの誘導体を含む。
【0213】
特定の実施形態では、前記誘導体が置換誘導体を含む。
【0214】
特定の実施形態では、前記誘導体が改変された官能基を含む。
【実施例】
【0215】
本開示は、以下の実施例によってさらに記載される。以下の説明は特定の実施形態を説明することのみを目的としており、上記の説明に関して限定することを意図していないことを理解されたい。
【0216】
実施例１ ＢＧＰ－１５を用いた体内精子の処置は高齢マウスの精子機能を回復する
前臨床研究では、インビトロでのＢＧＰ－１５処置が加齢により負の影響を受けた精子の質を改善できるかどうかを検討した。「高齢」（＞１２ヶ月）または「若齢」（＜６ヶ月）のいずれかで、ＢＧＰ－１５（またはビークル）で処置されたＣ５７ＢＬ６のマウスから精子を採取し、若齢雌マウスの卵母細胞の受精に使用し、胎芽の発育評価をした。
前臨床研究では、インビトロでのＢＧＰ－１５処置が加齢により負の影響を受けた精子の質を改善できるかどうかを検討した。「高齢」（＞１２ヶ月）または「若齢」（＜６ヶ月）のいずれかで、ＢＧＰ－１５（またはビークル）で処置されたＣ５７ＢＬ６のマウスから精子を採取し、若齢雌マウスの卵母細胞の受精に使用し、胎芽の発育評価をした。
【0217】
材料および方法：化学物質は特に断らない限り、Sigma－Aldrich（StLouis、MO、USA）から購入した。ＢＧＰ－１５（Ｎ－Gene Research Laboratoriesによって提供されている）のストック濃度（１ｍＭ）を、使用前にMilliQ水中で調製した。
【0218】
すべての実験手順は、Adelaide Animal Ethics Committeeによって承認され、科学的目的のための動物のケアおよび使用のためのオーストラリア行動規範に従って実施された。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、University of Adelaide Laboratory Animal ServicesまたはAnimal Resources Centre(WA)から入手し、１４：１０時間の明：暗サイクル下で、食物および水への自由なアクセスを伴って動物施設に収容した。雄マウスは若齢（<6か月齢)または高齢(>１２か月齢）であり、生殖能力が証明された。各雄マウスは精子採取の４～７日前に、若齢（６～８週齢）の自然交配雌マウスに「時間交配」した。雄マウスを頚椎脱臼により安楽死させ、両精巣上体尾部を切開してＩＶＦ用精子を分離した。
【0219】
ＩＶＦ用の卵母細胞を作製するために、雌マウス（６～８週齢）に、Pregnant Mare Serum Gonadotropin(PMSG; National Hormone and Peptide Program、Torrance、CA、USA)の１２ｇ体重あたり５ＩＵ(国際単位）を腹腔内(i.p.)注射し、４８時間後に０．１ｍＬの０．９％生理食塩水中に各１２ｇ体重あたり５IU(hCG; Merck、Sharp and Dohme)を注射して排卵させた。雌マウスを、ｈＣＧの１５時間後に頸部脱臼により人道的に殺し、卵管から得たＣＯＣを１％ウシ胎仔血清(FCS)(Life Technologies、Invitrogen、Carlsbad、CA、USA)を補充したＨＥＰＥＳ緩衝必須培地（ＭＥＭ）処置培地(Life Technologies、Invitrogen、Carlsbad、CA、USA)中に収集し、使用前に３７℃に予備加温した。
【0220】
各マウスからの１つの精巣上体尾部および精管を、１０μMのＢＧＰ－１５を含有するか否かを問わず、５００μＬの温かい（３７℃）受精培地中に無作為に置いた。次いで、精液および精子を含む精細管の内容物を培地中に抽出し、残りの組織を廃棄した。精子を培地中に放置し、インキュベーターに入れて、３７℃、６%CO２、５%O２、窒素残部で１時間キャパシテーションした。受精能獲得後、精子を含有する１０μＬの受精培地を各９０μＬの受精に添加した（下記参照）。
【0221】
α－ＭＥＭ取扱培地中に収集された排卵ＣＯＣを、新鮮なα－ＭＥＭ取扱培地中で洗浄し、次いで、精子での受精前に、温めた（３７℃）クック洗浄培地(Cook Medical、Queensland、Australia)に移した。受精、洗浄および胎芽培養培地は、それぞれCook MedicalからのResearch Vitro Fertilisation、Research Vitro WashおよびResearch Vitro Cleaveであった。
それぞれの処置群からの１０μＬの受精能獲得精子（３５，０００精子／ｍＬ）を、洗浄したＣＯＣ（１滴あたり１５～２０ＣＯＣ）を含有する９０μＬの受精液滴に添加し、続いて、６%CO２、５%O２、窒素残部の大気中、３７℃で４時間共インキュベートした。
それぞれの処置群からの１０μＬの受精能獲得精子（３５，０００精子／ｍＬ）を、洗浄したＣＯＣ（１滴あたり１５～２０ＣＯＣ）を含有する９０μＬの受精液滴に添加し、続いて、６%CO２、５%O２、窒素残部の大気中、３７℃で４時間共インキュベートした。
【0222】
次に、推定接合子を収集し、クック切断培地に移した。接合子から透明帯に付着したままの精子を取り除き、６%CO２、５%O２、窒素残部の大気下、３７℃で５日間、２０μＬ当たり２０個の胎芽の濃度で成長させた。
【0223】
２日目に受精を評価し、胎芽を最初の卵割のためにスコア化した。次いで、２細胞胎芽を、新鮮な２０μＬのクック切断培地（１０～１５胎芽／滴）に移し、そして５%CO２、５%O２、窒素残部の大気中３７℃で培養した。胎芽を５日目まで培養し、胚盤胞形成および孵化状態について評価した。胎芽形態は、次の基準を用いて適切に発育した（オンタイム）と分類した；２日目、２細胞期および５日目の胎芽、胚盤胞または孵化胚盤胞。発育率は２日目に卵母細胞の開始数からオンタイム発育基準を満たす胚の割合として評価し、５日目の発育は、２細胞胚からオンタイム発育基準を満たす胎芽の割合として評価した。
【0224】
統計解析
全てのデータを、分析前に分布の正常性について試験した。全ての測定値は、平均±ＳＥＭとして報告される。統計的有意性は、Windows対してGraphPad Prism v００８(GraphPad Software、La Jolla、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、スチューデントのｔ検定によって示されるように決定した。
全てのデータを、分析前に分布の正常性について試験した。全ての測定値は、平均±ＳＥＭとして報告される。統計的有意性は、Windows対してGraphPad Prism v００８(GraphPad Software、La Jolla、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、スチューデントのｔ検定によって示されるように決定した。
【0225】
データを図１に示し、これは、精子機能の回復に対するＢＧＰ－１５でのインビトロ処置の効果を示す。精子を、「若齢」（６週齢）または「高齢」（１歳）である雄マウスの精巣上体および精管から収集し、対照培地（未処置）または１０μM ＢＧＰ－１５を含有する培地において、インビトロで１時間、受精能獲得（成熟）させた。その後、若齢雌マウス由来の卵母細胞の体外受精に精子を用い、推定接合子の生育を以下のように評価した：
Ａ）ＩＶＦ後２４時間に卵割を完了した推定接合子の割合;
Ｂ）５日目までに胚盤胞の生育を完了した２細胞胎芽の割合；および
Ｃ）孵化を開始した胚盤胞の割合。
投与群あたりＮ＝６～１２匹。
分析は、各年齢群内で未処置群とＢＧＰ－１５処置群を比較する対応のあるｔ検定と、若齢群と高齢群を比較する対応のないｔ検定とした。
Ａ）ＩＶＦ後２４時間に卵割を完了した推定接合子の割合;
Ｂ）５日目までに胚盤胞の生育を完了した２細胞胎芽の割合；および
Ｃ）孵化を開始した胚盤胞の割合。
投与群あたりＮ＝６～１２匹。
分析は、各年齢群内で未処置群とＢＧＰ－１５処置群を比較する対応のあるｔ検定と、若齢群と高齢群を比較する対応のないｔ検定とした。
【0226】
ＩＶＦ後２４時間の完全卵割に対する接合子のパーセンテージに関するデータについては、ＢＧＰ－１５による処置後に卵割を完了した胎芽を生成するために、高齢ドナーからの精子の７０％以上の改善があった。また、ＢＧＰ－１５は若齢ドナー由来の精子の胚卵割率をわずかに増加させた。
【0227】
５日目までに胚盤胞生育を完了する２細胞胎芽のパーセンテージに関するデータについては、ＢＧＰ－１５処置後に胚盤胞生育を完了する胎芽を生成するために、高齢ドナーからの精子の７０％以上の改善があった。また、ＢＧＰ－１５は若齢ドナー由来の精子における胚盤胞生育率をわずかに増加させた。
【0228】
孵化を開始した胚盤胞のパーセンテージに関するデータについては、ＢＧＰ－１５処置後に孵化を開始する胎芽を生成するために、高齢ドナーからの精子の５０％以上の改善があった。また、ＢＧＰ－１５は若齢ドナー由来の精子における胚盤胞生育率を６０％以上増加させた。
【0229】
高齢のマウスからの精子を用いて生まれた胎芽ではそれぞれの生育のマイルストーンが損なわれたが、ＢＧＰ－１５を用いて「古い」精子を体外で１時間処置することによって、各発育パラメータは改善された。
【0230】
実施例２ ＢＧＰ－１５を用いたインビボ処置は、より高齢のマウスの精子機能を回復する
実験では、インビボでのＢＧＰ－１５処置が加齢により負の影響を受けた精子の質を改善できるかどうかを調べた。「高齢」（＞１２ヶ月）または「若齢」（＜６ヶ月）のいずれかであったＣ５７ＢＬ６の雄マウスを、ＢＧＰ－１５（またはビヒクル）で処置し、その後に、精子の採取、若齢雌マウスの卵母細胞の受精、胎芽生育の評価を行った。
実験では、インビボでのＢＧＰ－１５処置が加齢により負の影響を受けた精子の質を改善できるかどうかを調べた。「高齢」（＞１２ヶ月）または「若齢」（＜６ヶ月）のいずれかであったＣ５７ＢＬ６の雄マウスを、ＢＧＰ－１５（またはビヒクル）で処置し、その後に、精子の採取、若齢雌マウスの卵母細胞の受精、胎芽生育の評価を行った。
【0231】
材料及び方法
化学物質は特に断らない限り、Sigma-Aldrich(StLouis、ＭＯ、USA）から購入した。ＢＧＰ－１５（Ｎ－Gene Research Laboratoriesから販売されている）のストック濃度（１ｍＭ）を、使用前にMilliQ水中で調製した。
化学物質は特に断らない限り、Sigma-Aldrich(StLouis、ＭＯ、USA）から購入した。ＢＧＰ－１５（Ｎ－Gene Research Laboratoriesから販売されている）のストック濃度（１ｍＭ）を、使用前にMilliQ水中で調製した。
【0232】
すべての実験手順は、Adelaide Animal Ethics Committeeによって承認され、科学的目的のための動物のケアおよび使用のためのオーストラリア行動規範に従って実施された。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、University of Adelaide Laboratory Animal ServicesまたはAnimal Resources Centre(WA)から入手し、１４：１０時間の明：暗サイクル下で、食物および水への自由なアクセスを伴って動物施設に収容した。
【0233】
雄マウスは若齢（<6か月齢)または高齢(>１２か月齢）であり、生殖能力が証明された。各雄マウスは精子採取の４～７日前に、若齢（６～８週齢）の自然交配雌マウスに「時間交配」した。雄マウスを頚椎脱臼により安楽死させ、両精巣上体尾部を切開してＩＶＦ用精子を分離した。
【0234】
ＩＶＦ用の卵母細胞を作製するために、雌マウス（６～８週齢）に、Pregnant Mare Serum Gonadotropin(PMSG; National Hormone and Peptide Program、Torrance、CA、USA)の１２ｇ体重あたり５ＩＵ(国際単位）を腹腔内（i．p．）注射し、４８時間後に０．１ｍＬの０．９％生理食塩水中に各１２ｇ体重あたり５IU(hCG; Merck、Sharp and Dohme）を注射して排卵させた。雌マウスを、ｈＣＧおよび卵管から得たＣＯＣの１５時間後に頸部脱臼により人道的に殺し、１％ウシ胎仔血清(FCS)(Life Technologies、Invitogen、Carlsbad、CA、USA)を補充したＨＥＰＥＳ緩衝必須培地（ＭＥＭ）処置培地(Life Technologies、Invitogen、Carlsbad、CA、USA)中に収集し、使用前に３７℃に予備加温した。
【0235】
インビボＢＧＰ－１５処置実験のために、雄を時間交配させ、次いで精子収集の前に４日間、０．９%NaCl溶液中の１５ｍｇ／Ｋｇ体重のＢＧＰ－１５のＩＰ注射を受けた。次いで、先に記載されたように、インビトロ受精のために使用するために精子を収集し、能力を与えた。
【0236】
α－ＭＥＭ処置培地に採取した排卵ＣＯＣを新鮮なα－ＭＥＭ処置培地で洗浄し、次に加温（３７℃）Cook洗浄培地（Cook Medical、Queensland、Australia)に移した後、精子で受精させた。受精、洗浄および胚培養培地は、Research Vitro Fertilisation、Research Vitro WashおよびResearch Vitro Cleave(それぞれ、Cook Medical(Queensland、Australia))であった。洗浄したＣＯＣ（１滴当たり１５～２０ＣＯＣ）を含有する９０μＬの受精滴に、それぞれの処置群からの１０μＬの活性化精子（３５，０００精子／ｍＬ）を添加し、続いて、６%CO２、５%O２、窒素残部の大気中、３７℃で４時間共インキュベートした。
【0237】
次に、推定接合子を収集し、Cook切断培地に移した。接合子は未だ透明帯に付着した精子を清掃し、６%CO２、５%O２、窒素残部の雰囲気中、２０μＬあたり２０個の濃度で、３７℃で５日間成長させた。
【0238】
２日目に受精を評価し、胎芽を最初の卵割のためにスコア化した。次いで、２細胞胎芽を、新鮮な２０μＬのクック切断培地（１０～１５胎芽／滴）に移し、そして５%CO２、５%O２、窒素残部の大気中３７℃で培養した。胎芽を５日目まで培養し、胚盤胞形成および孵化状態について評価した。胎芽形態は、次の基準を用いて適切に発育した（オンタイム）と分類した；２日目、２細胞期および５日目の胎芽、胚盤胞または孵化胚盤胞。発育率は２日目に卵母細胞の開始数からオンタイム発育基準を満たす胎芽の割合として評価し、５日目の発育は、２細胞胎芽からオンタイム発育基準を満たす胎芽の割合として評価した。
【0239】
データを図２に示し、これは、精子機能の回復に対するＢＧＰ－１５でのインビボ処置の効果を示す。「若齢」（６週齢）または「高齢」（１歳）の雄マウスは、「未処置」であるか、またはＢＧＰ－１５（１５ｍｇ／ｋｇ）を１日１回４日間腹腔内投与した。最終注入から約１２時間後に精巣上体および精管から精子を採取し、若齢雌マウス由来の卵母細胞の体外受精および推定接合子の生育に用いた：Ａ）ＩＶＦ後２４時間に卵割を完了した推定接合子の割合; B)５日目までに胚盤胞生育を完了した２細胞胎芽の割合；およびＣ）孵化を開始した胚盤胞の割合。Ｎ＝１投与群あたり１匹のマウス。
【0240】
ＩＶＦ後２４時間の完全卵割に対する接合子の割合に関するデータについては、未処置の高齢雄と比較して、ＢＧＰ－１５による処置後に卵割を完了する胎芽を生成するための高齢ドナーからの精子の５００％以上の改善があった。また、ＢＧＰ－１５は、未処置雄と比較して、若齢処置ドナー由来の精子において３０％卵割率を増加させた。
【0241】
５日目までに胚盤胞生育を完了する２細胞胎芽のパーセンテージに関するデータについては、ＢＧＰ－１５処置後に胚盤胞生育を完了した胎芽を生成するために、無処置を受けた高齢ドナーと比較して、高齢ドナーからの精子の広範な改善が認められた。
【0242】
孵化を開始した胚盤胞の割合に関するデータについては、ＢＧＰ－１５処置後に、高齢ドナー由来の精子が孵化胚盤胞を生成する能力に大幅な改善が認められた。また、ＢＧＰ－１５は、未処置の若齢ドナー由来の精子と比較して、若齢ドナー由来の精子における胚盤胞生育から孵化までを１００％以上増加させた。
【0243】
高齢マウスの精子を用いて受胎した胎芽では各生育マイルストーンが損なわれたが、「高齢」マウスをＢＧＰ－１５で処置することにより、各生育パラメータが改善された。
【0244】
実施例３ 高齢マウスは妊娠回数が少なく、出生仔数が少なく、新生仔死亡率が高い
雄マウスを自然交配雌（１：１比）と交配させ、受胎状態を評価した。ペアリングの１６～１８時間後に雌の膣交尾栓の有無を調べたところ、交尾が成功したことが示された。次いで雌を雄から分離し、妊娠の徴候または同腹仔の出現をチェックするために約３週間飼育した。雄マウスは、生殖能力（交配が確認された後に妊娠を生じた場合）または低生殖能力（交配が確認された後に妊娠を生じなかった場合）に分類された。妊娠可能な雄によって産生された妊娠は、子供の表現型のさらなる研究のために選択された。胎仔生育を分析するために、妊娠雌を胎齢１８．５日に頚椎脱臼により安楽死させ、胎仔を採取した。生存胎仔数と子宮角における位置を記録した。胎仔を胚外組織から分離し、温リン酸塩生理食塩水緩衝液（ＰＢＳ）中で３７℃で洗浄し、次いで測定し、秤量した。それらの胎盤も分離し、洗浄し、秤量した。新生仔の生育を分析するために、妊娠した雌の一部を出産させた。出生後（生後）１日目に、同腹仔数および生存可能な新生仔数を記録するとともに、測定および体重を測定した。生存仔数は、生後２１～２４日の離乳まで記録した。
雄マウスを自然交配雌（１：１比）と交配させ、受胎状態を評価した。ペアリングの１６～１８時間後に雌の膣交尾栓の有無を調べたところ、交尾が成功したことが示された。次いで雌を雄から分離し、妊娠の徴候または同腹仔の出現をチェックするために約３週間飼育した。雄マウスは、生殖能力（交配が確認された後に妊娠を生じた場合）または低生殖能力（交配が確認された後に妊娠を生じなかった場合）に分類された。妊娠可能な雄によって産生された妊娠は、子供の表現型のさらなる研究のために選択された。胎仔生育を分析するために、妊娠雌を胎齢１８．５日に頚椎脱臼により安楽死させ、胎仔を採取した。生存胎仔数と子宮角における位置を記録した。胎仔を胚外組織から分離し、温リン酸塩生理食塩水緩衝液（ＰＢＳ）中で３７℃で洗浄し、次いで測定し、秤量した。それらの胎盤も分離し、洗浄し、秤量した。新生仔の生育を分析するために、妊娠した雌の一部を出産させた。出生後（生後）１日目に、同腹仔数および生存可能な新生仔数を記録するとともに、測定および体重を測定した。生存仔数は、生後２１～２４日の離乳まで記録した。
【0245】
【0246】
図４は高齢マウスはより小さな子供を持ち、より高い新生仔死亡率を持つことを示している。
【0247】
高齢マウスの妊娠では、胎仔はＥ１８．５で０．１４ｇ（１０％）軽く（図４Ａ）、胎盤はＥ１８．５で０．０１ｇ軽かった（１０％）（図４Ｂ）。高齢マウスによる同腹仔では、新生仔は０．６ｇ軽く（図４Ｃ）、離乳前の仔の死亡率は１４％増加した（図４Ｄ）。
【0248】
これらの研究は高齢の雄マウスの表現型が高齢の男性の表現型を模倣すること、すなわち、それらが不良な生殖能力と不良な新生仔転帰を有することを示す。
【0249】
実施例４ ＢＧＰ－１５によるインビトロ処置は精子数、生存率または形態を変化させないが、高齢雄由来の精子の運動性を改善する
生殖能力評価（実施例３の技法に記載のとおり）の後、生殖能力のある若齢雄（若齢対照）および生殖能力の低い高齢雄を本研究のために選択した。雄マウスは精子分析および胎芽の体外産生のために精液の採取の４～７日前に交配した。マウスを頚椎脱臼により安楽死させ、精巣上体尾部と精管の両方を採取した。各対の１つを、１０μMのＢＧＰ－１５を含有するかまたは含有しないCOOK Research vitro受精培地Ｋ－ＲＶＦＥ－５０(COOK MEDICAL、ＱＬＤ、Australia）中に無作為に配置した。次いで、精液および精子を含む生殖管の内容物を培地中に抽出し、組織を廃棄した。精子は、３７℃／６%CO２／５%O２で１時間キャパシテーションしたままにした。
生殖能力評価（実施例３の技法に記載のとおり）の後、生殖能力のある若齢雄（若齢対照）および生殖能力の低い高齢雄を本研究のために選択した。雄マウスは精子分析および胎芽の体外産生のために精液の採取の４～７日前に交配した。マウスを頚椎脱臼により安楽死させ、精巣上体尾部と精管の両方を採取した。各対の１つを、１０μMのＢＧＰ－１５を含有するかまたは含有しないCOOK Research vitro受精培地Ｋ－ＲＶＦＥ－５０(COOK MEDICAL、ＱＬＤ、Australia）中に無作為に配置した。次いで、精液および精子を含む生殖管の内容物を培地中に抽出し、組織を廃棄した。精子は、３７℃／６%CO２／５%O２で１時間キャパシテーションしたままにした。
【0250】
精子数、生存率、形態および運動性は、世界保健機関（ＷＨＯ）ガイドライン（各試料について計数した１００個の精子）に従い実施した。精子数は、血球計数器(Neubauer Brightline、Livingstone International、NSW、Australia）で計数することによって決定した。エオシンで１：１に染色したサンプルについて、光学顕微鏡を用いて、処置群に対して盲検下で精子生存率を評価し、１群あたり１００個の精子を生存可能（染色されていない）または生存不能（染色された）のいずれかとして分類した。生存率は生存精子のパーセンテージで表した。精子運動性を光学顕微鏡下で評価し、１群１００個の精子を進行性運動性、非進行性運動性または非運動性のいずれかに分類した。次に、運動性を総運動性（進行性および非進行性運動精子）または前進運動性（進行性運動精子のみ）で表した。精子形態の評価のために、各群１００個の精子を正常または異常（尾または頭部欠損）に分類した。形態は、形態学的に正常な精子のパーセンテージで表す。全てのサンプルを、各分析について光学顕微鏡を用いて処置群に対して盲検化して評価した。
【0251】
次に、高齢マウスの雄精子パラメータが、ＩＶＦ前の精子の処置で改善できるか、あるいはＢＧＰ－１５を用いて受胎前の高齢雄マウスの処置で改善できるかを検討した。研究プロトコールを図５に示す。
【0252】
その結果は図６のとおりであり、解析の結果、高齢の雄では精子数は有意に少なかったが、生存率および形態学的に正常な精子の割合は同程度であった。さらに、それらの運動性も有意に減少した。ＢＧＰ－１５によるインビトロ処置は精子数、生存率または形態を修正しなかったが、処置は高齢雄由来の精子の運動性（総運動性および進行性運動性の両方）を１０％改善した。
【0253】
実施例５ インビトロＢＧＰ－１５処置は、精子ミトコンドリア膜電位（ＭＭＰ）を増加させる
精子の運動性は、ミトコンドリア機能に関連付けられており、したがって、精子ミトコンドリア膜電位（ＭＭＰ）は製造業者の説明書に従って、ＪＣ－１電位差計色素（１Ｈ－ベンズイミダゾリウム、５，６－ジクロロ－２－［３－（５，６－ジクロロ－１，３－ジエチル－１，３－ジヒドロ－２Ｈ－ベンズイミダゾール－２－イリデン）－１，３－ジエチル－、ヨウ化物、（Ｅ）４７７２９－６３－５; ThermoFisher Scientific、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して、ＦＡＣＳによって、低ＭＭＰおよび高ＭＭＰを有する個々の生細胞を同定および定量するために、生細胞蛍光アッセイを使用して試験された。簡潔には、約１００万個の細胞を、受精培地中の５μMのＪＣ－１作業溶液と共に３７℃で１５分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。全てのサンプルについて、精子集団を光散乱測定に基づいてゲート制御した。生存精子画分は、死細胞のみに浸透する蛍光色素であるヨウ化プロピジウム（ＰＩ）生／死染色（Sigma－Aldrich、MI、USA）を用いて検出した。ＰＩ染色細胞のフローサイトメトリー取得は赤色蛍光（～６１７ｎｍ）についてはＰＥ－Ｃｙ７を介して行われ、ＪＣ－１染色細胞の取得は緑色（～５２５ｎｍ）についてはＦＩＴＣを介して、赤色／橙色蛍光（～５９０）についてはＰＥを介して行われた。各実験について、少なくとも１０，０００個の細胞を試験した。全ての実験は、FACSCANTO II Flow Cytometry System(BD Biosciences、NSW、Australia)で行った。
精子の運動性は、ミトコンドリア機能に関連付けられており、したがって、精子ミトコンドリア膜電位（ＭＭＰ）は製造業者の説明書に従って、ＪＣ－１電位差計色素（１Ｈ－ベンズイミダゾリウム、５，６－ジクロロ－２－［３－（５，６－ジクロロ－１，３－ジエチル－１，３－ジヒドロ－２Ｈ－ベンズイミダゾール－２－イリデン）－１，３－ジエチル－、ヨウ化物、（Ｅ）４７７２９－６３－５; ThermoFisher Scientific、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して、ＦＡＣＳによって、低ＭＭＰおよび高ＭＭＰを有する個々の生細胞を同定および定量するために、生細胞蛍光アッセイを使用して試験された。簡潔には、約１００万個の細胞を、受精培地中の５μMのＪＣ－１作業溶液と共に３７℃で１５分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。全てのサンプルについて、精子集団を光散乱測定に基づいてゲート制御した。生存精子画分は、死細胞のみに浸透する蛍光色素であるヨウ化プロピジウム（ＰＩ）生／死染色（Sigma－Aldrich、MI、USA）を用いて検出した。ＰＩ染色細胞のフローサイトメトリー取得は赤色蛍光（～６１７ｎｍ）についてはＰＥ－Ｃｙ７を介して行われ、ＪＣ－１染色細胞の取得は緑色（～５２５ｎｍ）についてはＦＩＴＣを介して、赤色／橙色蛍光（～５９０）についてはＰＥを介して行われた。各実験について、少なくとも１０，０００個の細胞を試験した。全ての実験は、FACSCANTO II Flow Cytometry System(BD Biosciences、NSW、Australia)で行った。
【0254】
次に、ＭＭＰは精子運動性の調節因子として定義されており、げっ歯類とヒトの両方で精子の質と受精能に関連していることから、若齢および高齢マウス由来の精子におけるミトコンドリア膜電位を比較することを試みた。
【0255】
結果を図７に示す。ＪＣ－１ＭＭＰ染料を用いて染色した精子細胞の実施例で、高ＭＭＰは赤色である（図７Ａ）。緑色のＭＭＰが低い精子集団および青色のＭＭＰが高い精子集団のフローサイトメトリー分析の実施例を図７Ｂに示す。本発明者らは多数の雄の青色部分を定量し（図７Ｃ）、ＭＭＰ濃度は雄群間で差がなかったにもかかわらず、処置後の高齢雄由来の精子で有意に増加し、それらの運動性の増加が少なくとも部分的に高いＭＭＰによって説明されることを示した。
【0256】
実施例６ 高齢の雄の精子は透明帯に結合することが少ない
精子が透明帯に結合し、卵母細胞を受精させる能力を評価するために、成熟卵丘卵母細胞複合体（ＣＯＣ）を、ＰＭＳＧの腹腔内注射による過排卵後１５時間で６週齢の雌Ｃ５７ＢＬマウスから採取し、４８時間後にｈＣＧを行った。ＣＯＣ（実験雄当たりＮ＝１０）を、８０μＬ滴のＣＯＯＫリサーチビトロ受精培地Ｋ－ＲＶＦＥ－５０(COOK MEDICAL、ＱＬＤ、Australia）に、３７℃／６%CO２／５%O２で入れた。卵母細胞は、ＢＧＰ－１５で処置されたかどうかに関わらない精子サンプルのアリコートで受精させ、配偶子を４時間共インキュベートした。この時点で、卵母細胞透明帯への精子結合を、ビスベンズイミドＤＮＡ染色（２５μｇ／ｍＬ）中で５分間インキュベートし、続いて紫外線下で画像化することによって評価した。透明帯に結合した精子の数は、精子核を計数して評価した。
精子が透明帯に結合し、卵母細胞を受精させる能力を評価するために、成熟卵丘卵母細胞複合体（ＣＯＣ）を、ＰＭＳＧの腹腔内注射による過排卵後１５時間で６週齢の雌Ｃ５７ＢＬマウスから採取し、４８時間後にｈＣＧを行った。ＣＯＣ（実験雄当たりＮ＝１０）を、８０μＬ滴のＣＯＯＫリサーチビトロ受精培地Ｋ－ＲＶＦＥ－５０(COOK MEDICAL、ＱＬＤ、Australia）に、３７℃／６%CO２／５%O２で入れた。卵母細胞は、ＢＧＰ－１５で処置されたかどうかに関わらない精子サンプルのアリコートで受精させ、配偶子を４時間共インキュベートした。この時点で、卵母細胞透明帯への精子結合を、ビスベンズイミドＤＮＡ染色（２５μｇ／ｍＬ）中で５分間インキュベートし、続いて紫外線下で画像化することによって評価した。透明帯に結合した精子の数は、精子核を計数して評価した。
【0257】
次に、本発明者らはこれらの実施例に示すように、ビスベンズイミド核染色を用いて、高齢雄からの精子が、若齢雌からのＭＩＩ卵母細胞の透明帯に結合する能力を調査した。結果を図８に示す。
【0258】
本発明者らは高齢雄ではゾナ結合能が有意に低下したが、ＢＧＰ－１５処置後には増加したことを見出した。
【0259】
実施例７ ＢＧＰ－１５は、高齢雄における胎芽生育を救援する
胎芽の体外産生のための卵母細胞を収集するために、雌マウスはホルモン誘導卵巣過剰刺激を受けた。簡潔には、動物が５ＩＵ／１２ｇの体重の用量で、無菌０．９％生理食塩水中のPregnant Mare Serum Gonadotropin(PMSG; National Hormone and Peptide Program、Torrence、USA)の腹腔内（ＩＰ）注射を受け、その後、４８時間後に、５ＩＵ／１２ｇの体重の用量で、無菌０．９％生理食塩水中のhuman chronic Gonadotropin(hCG; Pregnyl、Merck Sharp & Dohme Pty Ltd、Australia）の２回目のＩＰ注射を受けた。次いで、マウスをｈＣＧ注射後１４時間で頚椎脱臼により人道的に殺し、排卵した卵丘－卵母細胞複合体（ＣＯＣ）を卵管から採取し、体外受精により胎芽を作製するために使用した。簡潔には、ＣＯＣをResearch Vitro Wash Medium(COOK Medical、QLD、Australia)中で２回洗浄し、次いで、１：１０（１０μＬ：１００μＬ）濃度の精子を含むResearch Vitro Fertilisation Medium(COOK Medical)中に置いた。精巣上体および精管から精子サンプルを以前に採取し、６%CO２、５%O２中３７℃でリサーチビトロ受精培地中で１時間キャパシテートさせた。４時間後、推定接合子を回収し、洗浄し、６%CO２、５%O２中３７℃で胚盤胞期までのインビトロ胎芽培養のためのResearch Vitro Wash Mediumリサーチビトロクリーブ培地（１０接合子／２０μＬ滴; COOK Medical）に入れた。接合子はPrimovision time－lapse system(Vitrolife Pty Ltd、Boteborg、Sweden)を用いたreal-Time imagingにより記録し、細胞分裂と有害事象（不均等な細胞分裂、複数の核の存在、胞胚腔虚脱）の頻度を含む生育マイルストーンの詳細な解析を行った。各個体雄からの胎芽は、分析を通して分離されたままにした。
胎芽の体外産生のための卵母細胞を収集するために、雌マウスはホルモン誘導卵巣過剰刺激を受けた。簡潔には、動物が５ＩＵ／１２ｇの体重の用量で、無菌０．９％生理食塩水中のPregnant Mare Serum Gonadotropin(PMSG; National Hormone and Peptide Program、Torrence、USA)の腹腔内（ＩＰ）注射を受け、その後、４８時間後に、５ＩＵ／１２ｇの体重の用量で、無菌０．９％生理食塩水中のhuman chronic Gonadotropin(hCG; Pregnyl、Merck Sharp & Dohme Pty Ltd、Australia）の２回目のＩＰ注射を受けた。次いで、マウスをｈＣＧ注射後１４時間で頚椎脱臼により人道的に殺し、排卵した卵丘－卵母細胞複合体（ＣＯＣ）を卵管から採取し、体外受精により胎芽を作製するために使用した。簡潔には、ＣＯＣをResearch Vitro Wash Medium(COOK Medical、QLD、Australia)中で２回洗浄し、次いで、１：１０（１０μＬ：１００μＬ）濃度の精子を含むResearch Vitro Fertilisation Medium(COOK Medical)中に置いた。精巣上体および精管から精子サンプルを以前に採取し、６%CO２、５%O２中３７℃でリサーチビトロ受精培地中で１時間キャパシテートさせた。４時間後、推定接合子を回収し、洗浄し、６%CO２、５%O２中３７℃で胚盤胞期までのインビトロ胎芽培養のためのResearch Vitro Wash Mediumリサーチビトロクリーブ培地（１０接合子／２０μＬ滴; COOK Medical）に入れた。接合子はPrimovision time－lapse system(Vitrolife Pty Ltd、Boteborg、Sweden)を用いたreal-Time imagingにより記録し、細胞分裂と有害事象（不均等な細胞分裂、複数の核の存在、胞胚腔虚脱）の頻度を含む生育マイルストーンの詳細な解析を行った。各個体雄からの胎芽は、分析を通して分離されたままにした。
【0260】
本発明者らは高齢男性由来の精子が低品質のマーカーを提示するが、運動性、ミトコンドリア活性および帯結合能がＢＧＰ－１５によるインビトロ処置により改善されることを示した。雄の生殖能力の評価と同時に、若齢雌のグループをホルモン刺激し、それらの卵丘－卵母細胞複合体を採取した。これらのＣＯＣは、全処置群の精子を用いて受精した。
【0261】
受精培地で４時間インキュベートした後、推定される接合子について前核の有無を評価し、５日間インビトロで培養した。この間に、経時イメージング技術を用いて胎芽生育を記録した。２細胞期および胚盤胞期について、それぞれＩＶＦ後２日目および５日目に生育を評価した。
【0262】
その結果は図９のとおりであり、高齢の雄マウスでは、受精胎芽の初回卵割までの時間が遅く、拡張期および孵化前の胚盤胞崩壊の頻度が高いことを特徴とする着床前胎芽生育が乱れている。
【0263】
実施例８ ＢＧＰ－１５は、高齢雄における胎芽生育を救援する
胎芽の体外産生のための卵母細胞を収集するために、雌マウスはホルモン誘導卵巣過剰刺激を受けた。簡潔には、動物が５ＩＵ／１２ｇの体重の用量で、無菌０．９％生理食塩水中のPregnant Mare Serum Gonadotropin(PMSG; National Hormone and Peptide Program、Torrence、USA）の腹腔内（ＩＰ）注射を受け；その後、４８時間後に、５ＩＵ／１２ｇの体重の用量で、無菌０．９％生理食塩水中のhuman chronic Gonadotropin(hCG; Pregnyl、Merck Sharp & Dohme Pty Ltd、Australia）の２回目のＩＰ注射を受けた。次いで、マウスをｈＣＧ注射後１４時間で頚椎脱臼により人道的に殺し、排卵した卵丘－卵母細胞複合体（ＣＯＣ）を卵管から採取し、体外受精により胎芽を作製するために使用した。簡潔には、ＣＯＣをResearch Vitro Wash Medium(COOK Medical、）中で２回洗浄し、次いで、１：１０（１０μＬ：１００μＬ）濃度の精子を含むResearch Vitro Fertilisation Medium(COOK Medical)中に置いた。精巣上体および精管から精子サンプルを以前に採取し、６％CO２、５%O２中３７℃でリサーチビトロ受精培地中で１時間キャパシテートさせた。４時間後、推定接合子を回収し、洗浄し、６%CO２、５%O２中３７℃で胚盤胞期までのインビトロ胎芽培養のためのリサーチビトロクリーブ培地（１０接合子／２０μＬ滴; COOK Medical）に入れた。胎芽のオンタイム生育を、２日目（最初の卵割）、および５日目（胚盤胞形成および孵化状態）におけるそれらの生育段階を評価することによって分析した。各個体雄からの胎芽は、分析を通して分離されたままにした。
胎芽の体外産生のための卵母細胞を収集するために、雌マウスはホルモン誘導卵巣過剰刺激を受けた。簡潔には、動物が５ＩＵ／１２ｇの体重の用量で、無菌０．９％生理食塩水中のPregnant Mare Serum Gonadotropin(PMSG; National Hormone and Peptide Program、Torrence、USA）の腹腔内（ＩＰ）注射を受け；その後、４８時間後に、５ＩＵ／１２ｇの体重の用量で、無菌０．９％生理食塩水中のhuman chronic Gonadotropin(hCG; Pregnyl、Merck Sharp & Dohme Pty Ltd、Australia）の２回目のＩＰ注射を受けた。次いで、マウスをｈＣＧ注射後１４時間で頚椎脱臼により人道的に殺し、排卵した卵丘－卵母細胞複合体（ＣＯＣ）を卵管から採取し、体外受精により胎芽を作製するために使用した。簡潔には、ＣＯＣをResearch Vitro Wash Medium(COOK Medical、）中で２回洗浄し、次いで、１：１０（１０μＬ：１００μＬ）濃度の精子を含むResearch Vitro Fertilisation Medium(COOK Medical)中に置いた。精巣上体および精管から精子サンプルを以前に採取し、６％CO２、５%O２中３７℃でリサーチビトロ受精培地中で１時間キャパシテートさせた。４時間後、推定接合子を回収し、洗浄し、６%CO２、５%O２中３７℃で胚盤胞期までのインビトロ胎芽培養のためのリサーチビトロクリーブ培地（１０接合子／２０μＬ滴; COOK Medical）に入れた。胎芽のオンタイム生育を、２日目（最初の卵割）、および５日目（胚盤胞形成および孵化状態）におけるそれらの生育段階を評価することによって分析した。各個体雄からの胎芽は、分析を通して分離されたままにした。
【0264】
ＩＶＦおよびインビトロ培養後、２日目の２細胞胎芽および５日目の胚盤胞胚の割合は、より高齢の父親で減少した。結果を図１０に示す。
【0265】
受精能獲得中の精子のＢＧＰ－１５処置後、２日目の２細胞胎芽および５日目の胚盤胞および孵化胚盤胞胚の割合は、より高齢の父親で改善された。
【0266】
実施例９ インビボＢＧＰ－１５は、高齢雄において精子形態およびＭＭＰを改善する
インビトロ処置は精子の質と胎芽生育を改善したので、インビボで使用した場合、それが精子の質と生育能を改善するかどうかを次に試験した。
インビトロ処置は精子の質と胎芽生育を改善したので、インビボで使用した場合、それが精子の質と生育能を改善するかどうかを次に試験した。
【0267】
次に、本発明者らは、ＩＶＦの前に４日間毎日ＢＧＰ－１５で妊娠を生じなかった高齢雄の幾つかを処置した同様の実験的アプローチを設計した。プロトコルを図１１に示す。
【0268】
生殖能力評価（実施例３の技法に記載されている）の後、生殖能力のある若齢雄（若齢対照）および生殖能力の低い高齢男性を本研究のために選択した。雄マウスは、精液分析および胎芽の体外産生のための精子ドナーとしての使用の５～７日前に交配させた。高齢雄の半数は、精液採取の前に４日間、１５ｍｇ／ＫｇのＢＧＰ－１５の毎日の腹腔内注射を受けた。マウスを頸椎脱臼により安楽死させ、精巣上体尾部と精管の両方を採取し、COOK Research vitro受精培地Ｋ－ＲＶＦＥ－５０(COOK MEDICAL、ＱＬＤ、オ－ストラリア）に入れた。次いで、精液および精子を含む生殖管の内容物を培地中で抽出し、組織を除去した。精子は、３７℃／６%CO２／５%O２で１時間キャパシテ－ションしたままにした。
【0269】
精子数、生存率、形態および運動性は、世界保健機関（ＷＨＯ）ガイドライン（各試料について計数した１００個の精子）に従い実施した。精子数は、血球計数器(Neubauer Brightline、Livingstone International、NSW、Australia）で計数することによって決定した。精子生存率を、光学顕微鏡下でエオシンで１：１に染色された盲検試料で評価し、１群あたり１００個の精子を生存可能または生存不能のいずれかとして分類した。生存率は生存精子のパーセンテージで表した。精子運動性を光学顕微鏡下で評価し、１群１００個の精子を進行性運動性、非進行性運動性または非運動性のいずれかに分類した。次に、運動性を総運動性（進行性および非進行性運動精子）または前進運動性（進行性運動精子のみ）で表した。精子形態の評価のために、各群１００個の精子を正常または異常（尾または頭部欠損）に分類した。形態は、形態学的に正常な精子のパーセンテージで表す。すべての検体について、各解析のために光学顕微鏡下で処置群を盲検化して評価した。
【0270】
胎芽の体外産生のための卵母細胞を収集するために、雌マウスはホルモン誘導卵巣過剰刺激を受けた。簡潔には、動物が５ＩＵ／１２ｇの体重の用量で、無菌０．９％生理食塩水中のPregnant Mare Serum Gonadotropin(PMSG; National Hormone and Peptide Program、Torrence、USA）の腹腔内（ＩＰ）注射を受け；その後、４８時間後に、５ＩＵ／１２ｇの体重の用量で、無菌０．９％生理食塩水中のhuman chronic Gonadotropin(hCG; Pregnyl、Merck Sharp & Dohme Pty Ltd、Australia）の２回目のＩＰ注射を受けた。次いで、マウスをｈＣＧ注射後１４時間で頚椎脱臼により人道的に殺し、排卵した卵丘－卵母細胞複合体（ＣＯＣ）を卵管から採取し、体外受精により胎芽を作製するために使用した。簡潔には、ＣＯＣをResearch Vitro Wash Medium(COOK Medical、ＱＬＤ、Australia）中で２回洗浄し、次いで、１：１０（１０μＬ：１００μＬ）濃度の精子を含むResearch Vitro Fertilisation Medium(COOK Medical)中に置いた。精巣上体および精管から精子サンプルを以前に採取し、６%CO２、５%O２中３７℃でResearch Vitro Fertilisation培地中で１時間キャパシテートさせた。４時間後、推定接合子を回収し、洗浄し、６% O２、５%O２中３７℃で胚盤胞期までのインビトロ胎芽培養のためのリサーチビトロクリーブ培地（１０接合子／２０μＬ滴;COOKMedical）に入れた。胎芽のオンタイム生育を、２日目（最初の卵割）、および５日目（胚盤胞形成および孵化状態）におけるそれらの生育段階を評価することによって分析した。
【0271】
膜電位（ＭＭＰ）を、ＪＣ－１電位差染料（１Ｈ－ベンズイミダゾリウム、５，６－ジクロロ－２－［３－（５，６－ジクロロ－１，３－ジエチル－１，３－ジヒドロ－２Ｈ－ベンズイミダゾール－２－イリデン）－１－プロペニル］－１，３－ジエチル－、ヨウ化物、（Ｅ）４７７２９－６３－５; ThermoFisher Scientific、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して、ＦＡＣＳにより、低および高ＭＭＰを有する生細胞蛍光アッセイを使用して試験した。簡潔には、約１００万個の細胞を、受精培地中の５μMのＪＣ－１作業溶液と共に３７℃で１５分間インキュベ－トした。次いで、細胞を洗浄し、フロ－サイトメトリ－によって分析した。全てのサンプルについて、精子集団を光散乱測定に基づいてゲ－ト制御した。生存精子画分は、死細胞のみに浸透する蛍光色素であるヨウ化プロピジウム（ＰＩ）生／死染色（Sigma－Aldrich、MI、USA）を用いて検出した。ＰＩ染色細胞のフロ－サイトメトリ－取得は赤色蛍光（～６１７ｎｍ）についてはＰＥ－Ｃｙ７を介して行われ、ＪＣ－１染色細胞の取得は緑色（～５２５ｎｍ）についてはＦＩＴＣを介して、赤色／橙色蛍光（～５９０）についてはＰＥを介して行われた。各実験について、少なくとも１０，０００個の細胞を試験した。全ての実験は、FACSCANTO II Flow Cytometry System(BD Biosciences、ＮＳＷ、Australia）で行った。
【0272】
その結果を図１２に示す。ＢＧＰ－１５を用いたインビボ処置は高齢の雄では精子数、生存率または運動性に有意な影響を及ぼさなかったが、驚くべきことに形態学的に正常な精子の割合を増加させたことから、精子形成に影響を及ぼしている可能性が示唆される。また、ＭＭＰが高い精子集団も増加した。
【0273】
本発明者らは、ＩＶＦ前の処置が若齢雄と同様のレベルまで高齢雄における胎芽生育を救済したことを明らかにした。高齢雄の２細胞胎芽および胚盤胞の生育は、若齢雄マウス由来の胎芽と同等のレベルまで増加した。この発見は、ＢＧＰ－１５を用いたインビボ処置において、高齢男性における潜在的繁殖能力を回復できることを示している（図１３）。
【0274】
結論として、本発明者らは、年齢が精子の質と発育能に負の影響を与え、これらは高齢マウスで妊娠を産生できないことと関連することを示した。しかし、ＢＧＰ－１５による処置は精子の質を改善し、ＩＶＦ後の胎芽生育を救済することから、年齢に関連する不妊症または他の型の男性の亜受精能を処置するための潜在的な処置法であり得ることを示唆している。
【0275】
実施例１０ ヒト精子に対するインビトロでのＢＧＰ－１５処置
Fertility SA (南オーストラリア）の男性被検体は、処置には過剰な精液サンプルを提供することに同意した。これらの放棄されたサンプルを使用して、ヒト精子に対するＢＧＰ－１５の効果を試験した。試料量、精子数、生存率、形態および運動性は、世界保健機関（ＷＨＯ）ガイドライン（各試験の各試料について計数した１００個の精子）に従い実施した。精子を精子希釈液中で１：２０に希釈し、次いで、血球計(Neubauer Brightline、Livingstone International、NSW、Australia)を使用して、１ｍＬ当たりの精子の数を計数するために１０μＬを使用した。精子生存率を、光学顕微鏡下でエオシンで１：１に染色されたサンプルについて、処置群に対して盲検化して評価し、１群あたり１００個の精子を生存（非染色）または非生存（染色）のいずれかとして分類した。生存率は総精子に対する割合で表した。精子運動性を光学顕微鏡下で評価し、１群１００個の精子を進行性運動性、非進行性運動性または非運動性のいずれかに分類した。次に、運動性を総運動性（進行性および非進行性運動精子）または前進運動性（進行性運動精子のみ）で表した。精子形態の評価のために、各群１００個の精子を正常または異常（尾または頭部欠損）に分類した。形態は、形態学的に正常な精子のパーセンテージで表す。全てのサンプルを、各分析について光学顕微鏡を用いて処置群に対して盲検化して評価した。
Fertility SA (南オーストラリア）の男性被検体は、処置には過剰な精液サンプルを提供することに同意した。これらの放棄されたサンプルを使用して、ヒト精子に対するＢＧＰ－１５の効果を試験した。試料量、精子数、生存率、形態および運動性は、世界保健機関（ＷＨＯ）ガイドライン（各試験の各試料について計数した１００個の精子）に従い実施した。精子を精子希釈液中で１：２０に希釈し、次いで、血球計(Neubauer Brightline、Livingstone International、NSW、Australia)を使用して、１ｍＬ当たりの精子の数を計数するために１０μＬを使用した。精子生存率を、光学顕微鏡下でエオシンで１：１に染色されたサンプルについて、処置群に対して盲検化して評価し、１群あたり１００個の精子を生存（非染色）または非生存（染色）のいずれかとして分類した。生存率は総精子に対する割合で表した。精子運動性を光学顕微鏡下で評価し、１群１００個の精子を進行性運動性、非進行性運動性または非運動性のいずれかに分類した。次に、運動性を総運動性（進行性および非進行性運動精子）または前進運動性（進行性運動精子のみ）で表した。精子形態の評価のために、各群１００個の精子を正常または異常（尾または頭部欠損）に分類した。形態は、形態学的に正常な精子のパーセンテージで表す。全てのサンプルを、各分析について光学顕微鏡を用いて処置群に対して盲検化して評価した。
【0276】
ヒト精液サンプルを２つに分け、一方の半分を無傷のまま（純粋な精液）にし、他方の半分を遠心洗浄した（洗浄精液）。洗浄は１ｍｇ／ｍｌのポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を含有し、２９０～３１０ｍＯｓｍｏ／ｋｇの浸透圧を有するBiggers、Whitten and Whittingham(ＢＷＷ)の細胞培地中で、５００ｇで１０分間行って、精漿を除去した。精子細胞を含むペレットを、１ｍＬの温かいＢＷＷ／ＰＶＡ培地に穏やかに再懸濁した。精子数、生存率および運動性を、先に記載したように評価した。この後、純粋な試料および洗浄した試料の両方をさらに半分に分割し、１０μMのＢＧＰ－１５で処置したか、または処置しなかった。３０分間のインキュベーション後、細胞をＢＷＷ／ＰＶＡ中で洗浄し、次いで以下のアッセイに分けた: MitoSox Red(MSR)、膜電位（ＪＣ－１およびＴＭＲＭ）、８－オキソグアニン（８ＯＨｄＧ）、クロモマイシンＡ３（ＣＭＡ３）および精子クロマチン分散試験（ＳＣＤ／Ｈａｌｏ）（これらは、以下にさらに記載される）。
【0277】
フローサイトメトリー分析は、４８８ｎｍアルゴンレーザーを用いてＦＡＣＳ－Canto IIフローサイトメーター(Becton Dickinson、ＣＡ）で行った。前方散乱および側方散乱測定を行って散乱プロットを作成し、これを用いて、いかなる混入細胞または破片も除いて、精子細胞のみをゲート制御した。各サンプルについて合計１０，０００の事象を記録した。全てのデータは、BD FACSDiva Software(Becton Dickinson)を用いて分析した。
【0278】
材料: MitoSox Red(# M３６００８）、SYTOX Green Nucleic Acid Stain(# S７０２０）、Live/dead Fixable Far red dead cell stain kit(# L１０１２０）、ＪＣ－１（Ｔ３１６８）およびAlexa Fluor ４８８ヤギ抗マウスIgG(# A１１００１）は、Life Technologies、now Thermo Fisher(Waltham、ＭＡ、ＵＳＡ）からのものである。ＤＮＡ／ＲＮＡ損傷抗体（ＮＢ１１０－９６８７８）はNovus Biologicals(Littleton、ＣＯ、ＵＳＡ）から供給され、Chromomycin A３（＃２３０７５２）はCalbiochem、now Merck Millipore(Burlington, MA、ＵＳＡ）から供給される。DAPI (# D９５４２）、過塩素酸テトラメチルローダミンメチルエステル(# T５４２８）およびＢＷＷ培地試薬は、Sigma Aldrich(Sigma Chemical Co、StLouis、MO、USA)からのものである。
【0279】
ミトコンドリアＲＯＳ産生アッセイ(Mitosox Red):細胞を、光から保護しながら、３７℃で１５分間、MitoSOX Red(MSR)(２μＭ）およびSytox Green(０．０５μＭ）で染色した。
これに続いて、５００ｇで５分間遠心分離し、フローサイトメトリー分析のためにＢＷＷ／ＰＶＡに再懸濁した。
これに続いて、５００ｇで５分間遠心分離し、フローサイトメトリー分析のためにＢＷＷ／ＰＶＡに再懸濁した。
【0280】
ミトコンドリア膜電位（ＭＭＰ）アッセイ（ＪＣ－１）：細胞を、光から遮蔽した、ＪＣ－１（２μM）およびLive/dead Fixable Far red dead cell stain kitを用いて３７℃で１５分間染色した。これに続いて、５００ｇで５分間遠心分離し、フローサイトメトリー分析のためにＢＷＷ／ＰＶＡに再懸濁した。ミトコンドリア膜電位（ＭＭＰ）アッセイ（ＴＭＲＭ）：細胞を、暗所で３７℃で３０分間、過塩素酸テトラメチルローダミンメチルエステル(ＴＭＲＭ)(２５ ｎＭ）および活力染色Sytox Green(０．０５μＭ）で染色した。これに続いて、５００ｇで５分間遠心分離し、フローサイトメトリー分析のためにＢＷＷ／ＰＶＡに再懸濁した。
【0281】
ＤＮＡ損傷アッセイ（８ＯＨｄＧ）：細胞を５００ｇで遠心分離し、脱凝縮緩衝液（ＰＢＳ中の２mM DL－ジチオトレイト－ルおよび０．５% Triton X－１００）中に室温で１０分間再懸濁した。細胞を４％パラホルムアルデヒド中で１５分間、４℃で固定した。次いで、細胞を、１．５％ヤギ血清／ＰＢＳを使用して室温で１時間ブロックし、次いで、ＤＮＡ／ＲＮＡ損傷抗体(Novus Biologicals、ＮＢ１１０－９６８７８）と共に４℃で一晩インキュベートした。二次抗体は、Alexa Fluor ４８８色素に結合したヤギαマウスであった。細胞を、蛍光顕微鏡下で、８ＯＨｄＧ染色について陽性または非陽性としてカウントした。
【0282】
ＤＮＡ損傷アッセイ（ＣＭＡ３）：ヒト精子を２％パラホルムアルデヒド中４℃で１５分間固定した。細胞を５００ｇで遠心分離し、０．２％トリトンで１５分間室温で浸透させた。細胞を５００ｇで５分間遠心分離し、細胞ペレットをMc’Ilvaines緩衝液（８２ｍＬの０．２mol/L Na２ＨＰＯ４および１０mmol/L MgCl２と混合した１８ｍＬの０．１ｍｏｌ／Ｌクエン酸、ｐＨ７．０）に再懸濁した。ＣＭＡ３をMc’Ilvaines緩衝液に０．２５ｍｇ／ｍＬの濃度まで溶解した。精子細胞のクロマチンを、暗所、室温で２０分間、ＣＭＡ３と共にインキュベートすることによって標識した。細胞を、５００ｇで５分間遠心分離し、細胞ペレットをMc’Ilvaines緩衝液に再懸濁することによってMc’Ilvaines緩衝液で洗浄した後、標識細胞を蛍光顕微鏡で計数した。
【0283】
ＤＮＡ損傷アッセイ（ＨＡＬＯ）：ヒト精子を液体窒素中で凍結し、室温で解凍した。細胞を１％低融点アガロースと混合して、３７℃で０．７％のアガロースの最終濃度とした。細胞－アガロース混合物を、０．６５％標準アガロースで予めコーティングしたスライド上に置いた。スライドを４℃で４分間固化させた。カバースリップを注意深く除去し、スライドを酸変性溶液（０．０８N HCL)中に室温で７分間水平に置いた。次いで、スライドを、中和および溶解溶液１（０．４M Tris、０．８M DTT、１% SDS、および５０mM EDTA、ｐＨ ７）中で１０分間、室温でインキュベートし、次いで、中和および溶解溶液２（０．４M Tris、２M NaCl、および１%SDS、ｐＨ７．５）中で５分間、室温でインキュベートした。その後、スライドをＴｒｉｓ－ボラート－ＥＤＴＡバッファー（０．０９M Tris－borateおよび０．００２M EDTA、ｐＨ７．５）で２分間洗浄し、常温および空気乾燥時にそれぞれ２分間、７０％、９０％および１００％エタノールで乾燥させた。スライドをＤＡＰＩ(１／２０００）で１０分間室温で染色した。スライドを蛍光顕微鏡下で「ハロー」または「ノーハロー」について計数した。
【0284】
分析に使用した被験者のニート精液サンプルの特性を表１に示す。
【0285】
【0286】
ＲＯＳを含むミトコンドリアプロフィールに影響は観察されなかった（データは示さず）。
【0287】
表２は、年齢に基づく分析のために使用された被験体の整理した精液サンプルの特性を示す。
【0288】
【表2】
【0289】
また、ＢＧＰ－１５がヒト精子のＤＮＡ損傷を防ぐことも分かった（図１５）。これは、ＤＮＡ損傷の３つの異なるアッセイ：８－ＯＨｄｇ検出、ＤＮＡ断片化（ハロ）アッセイおよびクロモマイシンＡ３染色を用いて実証された。
【0290】
【0291】
「若齢通常の」精子を用いて、我々はインビトロで（Ｈ２Ｏ２を用いて）ＲＯＳを誘発し、ＢＧＰ－１５に何らかの保護効果があるかどうかをテストした。
【0292】
１時間のＢＧＰ－１５処置は、Ｈ２Ｏ２濃度の増加に対するＤＮＡ障害を防止した。
精子細胞を精漿から分離するために遠心分離を使用する精子選択方法（例えば、洗浄）はＤＮＡ損傷を増加させながら、精子の活力および運動性に影響を及ぼす。
精子細胞を精漿から分離するために遠心分離を使用する精子選択方法（例えば、洗浄）はＤＮＡ損傷を増加させながら、精子の活力および運動性に影響を及ぼす。
【0293】
ＢＧＰ－１５による３０分間のインビトロ処置は高齢男性からの洗浄精子における運動性を改善し、一方、純粋試料および洗浄試料の両方におけるＤＮＡ損傷も低減した。
さらに、１時間のＢＧＰ－１５との同時インキュベーションは、インビトロでの酸化ストレスに対する酸化的損傷から精子ＤＮＡを保護し得る。
実施例１１ ＢＧＰ－１５を含む精子調製用媒体
実施例１は、精子の能力獲得を可能にする培地中でのＢＧＰ－１５の使用についての実験的サポートを提供する。
さらに、１時間のＢＧＰ－１５との同時インキュベーションは、インビトロでの酸化ストレスに対する酸化的損傷から精子ＤＮＡを保護し得る。
実施例１１ ＢＧＰ－１５を含む精子調製用媒体
実施例１は、精子の能力獲得を可能にする培地中でのＢＧＰ－１５の使用についての実験的サポートを提供する。
【0294】
典型的には、精子の受精能獲得は生殖補助技術に必須であるため、精子は射精後できるだけ早く精漿から分離され、受精能獲得を支持することができる培地中に置かれる。
【0295】
ヒト生殖補助技術については、精子の調製および使用方法が例えば、Lars Bjorndahl、David Mortimer、Christopher LRBarratt、Jose Antonio Castilla、Roelof Menkveld、Ulrik Kvist、Juan GAlvarez、Trine BHaugen; Cambridge University Pressによる「A Practical Guide to Basic Laboratory Andrology」２０１０の第７章に記載されている。
【0296】
本明細書中に記載されるＢＧＰ－１５および／またはその誘導体は、精液収集のための培地に添加され得るか、または生殖補助技術における使用のためのヒト精子を調製し得る。
【0297】
ＢＧＰ－１５を含有する培地を利用する精子調製方法を以下に記載する。
【0298】
典型的には、ヒト血清アルブミンまたは合成血清置換物を含有する重炭酸緩衝化培地を利用する培養培地が使用される。例えば、Origioから入手可能なSperm Preparation Medium(カタログ番号１０６９００１０Ａ）を使用し得、そしてＢＧＰ－１５を１０μM ＢＧＰ－１５の濃度に添加し得る。
【0299】
精子洗浄および運動性生存精子の分離のための手順はスイムアップ方法によるか、または密度勾配方法（例えば、SupraSperm（登録商標）密度勾配方法(Origio Ref １０９１／１０９２／１０９７）によるかのいずれかであり得る。
【0300】
この手技は、不妊症の原因が男性であれ女性であれ、女性の体外受精処置に適した精子を作製するために用いられることがある。
【0301】
組成：ＢＧＰ－１５（例、１０μＭ）；合成血清置換(USA: ART補充）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）；グルコース；ピルビン酸ナトリウム；生理的塩；重炭酸ナトリウム; HEPESおよび硫酸ゲンタマイシン１０μｇ／ｍｌ。
【0302】
技法：使用前に３７℃で５～６％ＣＯ2中で最低２時間精子調製培地を平衡化する。
収集後すぐに、精液試料を室温で完全に混合する。混合工程が完了した後、精子濃度および運動性を（顕微鏡下で）評価すべきである。１～２ｍｌの予め平衡化した精子調製培地の下の管中の液化精液の層０．５～１ｍｌ。３７℃のＣＯ２中で３０～６０分間インキュベートする。泳ぎ上げた後、上部の０．２～１ｍｌを吸引し、精子濃度および運動性について評価する。精子数が低すぎる場合、次の０．５ｍｌも含まれる。プールは一緒に吸引する。吸引された精子培地のさらなる濃縮が必要な場合、５ｍｌの精子調製培地をプールされた吸引物に添加し、混合し、そして４００ｇで１０分間遠心分離する。上清を吸引し、残りのペレットを適切な容量の予め平衡化した精子調製培地に再懸濁する。
収集後すぐに、精液試料を室温で完全に混合する。混合工程が完了した後、精子濃度および運動性を（顕微鏡下で）評価すべきである。１～２ｍｌの予め平衡化した精子調製培地の下の管中の液化精液の層０．５～１ｍｌ。３７℃のＣＯ２中で３０～６０分間インキュベートする。泳ぎ上げた後、上部の０．２～１ｍｌを吸引し、精子濃度および運動性について評価する。精子数が低すぎる場合、次の０．５ｍｌも含まれる。プールは一緒に吸引する。吸引された精子培地のさらなる濃縮が必要な場合、５ｍｌの精子調製培地をプールされた吸引物に添加し、混合し、そして４００ｇで１０分間遠心分離する。上清を吸引し、残りのペレットを適切な容量の予め平衡化した精子調製培地に再懸濁する。
【0303】
この組成物および方法は、下位受精能になっているか、低品質の精子になっているか、または４０歳を超える年齢であるドナーからの精子の質を改善するために特に適切であり得る。
【0304】
上記の試薬および／または方法を実施するための説明書を利用するキットおよび／または製品を製造することができる。
【0305】
実施例１２ ＢＧＰ－１５を含むＩＶＦ媒体
卵母細胞の受精に適したヒトＩＶＦ培地におけるＢＧＰ－１５および／またはその誘導体の使用も考えられる。
卵母細胞の受精に適したヒトＩＶＦ培地におけるＢＧＰ－１５および／またはその誘導体の使用も考えられる。
【0306】
Origio (Universal IVF Medium、カタログ番号１０３０／１０３１）から市販されており、ＢＧＰ－１５（１０μＭ）を含有するUniversal IVF培地などのヒトＩＶＦ培地を利用することができる。このような培地は未処置精子を有する卵母細胞の受精に使用され得、得られた胎芽は２～８細胞段階まで培養される。
【0307】
組成：合成血清置換(USA: ART Supplement)、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、生理的塩、グルコース、ピルビン酸ナトリウム、重炭酸ナトリウムおよび硫酸ゲンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）；ならびにＢＧＰ－１５（例、１０μＭ）。
【0308】
方法：使用前に３７℃で５～６％ＣＯ２中で最低２時間培地を平衡化する。通常通り卵母細胞を回収し、精子を準備する。精子は例えば実施例１１に記載されるように、ＢＧＰ－１５を有する媒体を使用するか、またはＢＧＰ－１５を有さない媒体を使用して調製することができる。ＢＧＰ－１５を含んだ均衡前ＩＶＦ媒体で、卵母細胞(０日）を受精する。ＩＣＳＩが必要な場合は、ＢＧＰ－１５を含む加温前保持媒体への注入を行う。１６～２０時間（１日目）に、前核の形成についてチェックし、次いで、注意深く洗浄し、そして接合子を、新鮮な５０μｌのマイクロドロップまたは０．５ｍｌのウェル／液体パラフィンで覆われたUniversal IVF培地の皿に移す。胎芽は、１ウェルあたり最大４個まで、単独または複数で培養する。２日目または３日目の胎芽移植。胎芽を調製し、そして２０～３０μｌの予め平衡化した移植培地または新鮮なUniversal IVF培地中で子宮に移す。使用前に、選択された移送媒体で移送カテーテルをフラッシュする。
【0309】
上記の方法を実施するための試薬および／または説明書を利用するキットおよび／または製品を製造することができる。
【0310】
実施例１３：精子の凍結保存
ヒト精子の凍結を補助するためのＢＧＰ－１５および／またはその誘導体の使用もまた意図される。ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体の曝露によって、本明細書の実施例で例示された精子の改善により、冷凍保留能力を向上させた精子が製造されると考えられる。
ヒト精子の凍結を補助するためのＢＧＰ－１５および／またはその誘導体の使用もまた意図される。ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体の曝露によって、本明細書の実施例で例示された精子の改善により、冷凍保留能力を向上させた精子が製造されると考えられる。
【0311】
市販のCryosperm凍結培地(Origio Cryosperm;製品番号１１０１）のようなヒト精子凍結培地であって、ＢＧＰ－１５（例えば、１０μＭ）を含有するものを利用することができる。このような培地は精子の質の維持を補助するために、精子の凍結のために使用され得る。
【0312】
組成：グリセロール、ラフィノース、グルコース、ピルビン酸ナトリウム；乳酸ナトリウム、生理的塩；アミノ酸；重炭酸ナトリウム；HEPES；硫酸ゲンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）；ＢＧＰ－１５（１０μＭ）。
【0313】
方法：
Ａ．凍結。精液試料および凍結培地の両方が室温にあることを確保し、凍結培地で精液を１：１（ｖ／ｖ）希釈する。培地は１滴ずつ精液に添加されるべきであり、溶液は、培地の各添加後に注意深く混合されるべきである。混合物を室温で最低１０分間放置する。希釈した精液をストローまたはクライオチューブに装填し、製造業者の推奨に従って密封する。ストローを水平に３０分間、液体窒素の表面のすぐ上に懸濁する。クライオチューブは、ケーンに取り付けられ、期間経過、液体窒素の表面の上に吊り下げられるべきである。ストローまたは凍結管を液体窒素に移し、－１９６℃で保存する。
Ｂ．解凍。ストローまたはクライオチューブを室温で５分間加温する。ストローまたは冷凍チューブを開き、解凍した精子を取り出す。直ちに、密度勾配またはスイムアップ手順によって精子を調製する。
Ａ．凍結。精液試料および凍結培地の両方が室温にあることを確保し、凍結培地で精液を１：１（ｖ／ｖ）希釈する。培地は１滴ずつ精液に添加されるべきであり、溶液は、培地の各添加後に注意深く混合されるべきである。混合物を室温で最低１０分間放置する。希釈した精液をストローまたはクライオチューブに装填し、製造業者の推奨に従って密封する。ストローを水平に３０分間、液体窒素の表面のすぐ上に懸濁する。クライオチューブは、ケーンに取り付けられ、期間経過、液体窒素の表面の上に吊り下げられるべきである。ストローまたは凍結管を液体窒素に移し、－１９６℃で保存する。
Ｂ．解凍。ストローまたはクライオチューブを室温で５分間加温する。ストローまたは冷凍チューブを開き、解凍した精子を取り出す。直ちに、密度勾配またはスイムアップ手順によって精子を調製する。
【0314】
上記の方法を実施するための試薬および／または説明書を利用するキットおよび／または製品を製造することができる。
【0315】
実施例１４ 低減した生殖能力を有する男性被験体の処置
ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体の静注用の組成は精子の質が低下した男性被験体への注射用に、等強性塩酸の適量の薬剤の処置効果のある量を組み合わせて調製することができる。例えば、２０ｍｇ／ｋｇの用量のＢＧＰ－１５を、８週間、１日１回、被験体に静脈内投与することができる。
ＢＧＰ－１５および／またはその誘導体の静注用の組成は精子の質が低下した男性被験体への注射用に、等強性塩酸の適量の薬剤の処置効果のある量を組み合わせて調製することができる。例えば、２０ｍｇ／ｋｇの用量のＢＧＰ－１５を、８週間、１日１回、被験体に静脈内投与することができる。
【0316】
あるいは、例えば、カプセル中の２つの１００ｍｇのＢＧＰ－１５を、８週間、低減した生殖能力を有する男性被験体に１日２回経口投与してもよい。
【0317】
投与後、男性被験者をモニターする。投与の有効性は、運動性（総及び進行性）、生存性、形態、ミトコンドリア活性、ＤＮＡ完全性及び胎芽生育能を支持する能力のようなパラメータを評価することによることができる。
【0318】
上記手順は男性被験者の生殖能力を改善し、また、生殖補助技術に使用するために被験者から分離された精子の質を改善することが予想される。
【0319】
本開示は特定の実施形態を参照して説明されてきたが、本開示は多くの他の形態で具現化され得ることが理解されるのであろう。また、本明細書に記載された開示は、特に記載されたもの以外の変形および修正が可能であることも理解されるのであろう。本開示は、すべてのそのような変形および修正を含むことを理解されたい。本開示はまた、本明細書で言及される、または本明細書に示されている、個別または集合的な工程、特徴、組成および化合物のすべて、および工程または特徴のいずれか２つ以上の組み合わせのすべてを含む。
【0320】
また、本明細書で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は文脈がすでに別段の指示をしない限り、複数の態様を含むことに留意されたい。
【0321】
本明細書を通じて、文脈が別途必要としない限り、「含む」または「含んでいる」のようなバリエーションは、要素または完全体を含めることを意味するものであり、要素または完全体を除外することを意味するものではないと理解されるべきである。
【0322】
本明細書における先行技術への言及は、この先行技術がいずれかの国の技術常識の一部を構成することを認めるものではなく、また、それを示唆するような形式であってはならない。
【0323】
本明細書で使用される主題の見出しは、読者の参照を容易にするためにのみ含まれ、開示または特許請求の範囲全体にわたって見出される主題を限定するために使用されるべきではない。主題の見出しは、クレームの範囲又はクレームの限定を解釈する際に使用すべきではない。
【0324】
本明細書で提供される説明は、共通の特徴および特徴を共有し得る幾つかの実施形態に関連する。１つの実施形態の１つまたは複数の特徴は、他の実施形態の１つまたは複数の特徴と組み合わせることができることを理解されたい。さらに、実施形態の単一の特徴または特徴の組み合わせは、追加の実施形態を構成することができる。
【0325】
本明細書に記載される全ての方法は本明細書に別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で提供される任意のおよびすべての例、または例示的な言語（例えば、「のような」）の使用は単に例示的な実施形態をより明確にすることを意図したものであり、別段の請求がない限り、請求される発明の範囲を限定するものではない。本明細書中のいかなる言語も、請求項に記載されていない要素を必須として示すものと解釈されるべきではない。
【0326】
将来の特許出願は本出願に基づいて、例えば、本出願から優先権を主張することによって、分割の地位を主張することによって、および／または継続の地位を主張することによって、提出することができる。以下の特許請求の範囲は、例としてのみ提供されるものであり、そのような将来の適用において特許請求され得るものの範囲を限定することを意図するものではないことを理解されたい。また、当該クレームは、本開示の理解を限定する（又は他の理解を除外する）ものとみなされるべきではない。特徴は後日、例示的な特許請求の範囲に追加されてもよいし、省略されてもよい。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】