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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-11-13
(45)【発行日】2023-11-21
(54)【発明の名称】体内時計活性化システム及びその制御方法
(51)【国際特許分類】
A61N 1/36 20060101AFI20231114BHJP
【ＦＩ】
A61N1/36
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2021502079
(86)(22)【出願日】2020-02-19
(86)【国際出願番号】 JP2020006509
(87)【国際公開番号】W WO2020171118
(87)【国際公開日】2020-08-27
【審査請求日】2022-12-28
(31)【優先権主張番号】P 2019028425
(32)【優先日】2019-02-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】504145342
【氏名又は名称】国立大学法人九州大学
(74)【代理人】
【識別番号】100106909
【弁理士】
【氏名又は名称】棚井 澄雄
(74)【代理人】
【識別番号】100149548
【弁理士】
【氏名又は名称】松沼 泰史
(74)【代理人】
【識別番号】100141139
【弁理士】
【氏名又は名称】及川 周
(74)【代理人】
【識別番号】100188558
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 雅人
(72)【発明者】
【氏名】松永 直哉
(72)【発明者】
【氏名】大戸 茂弘
【審査官】滝沢 和雄
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１４－１８８０１５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００６－５１１２４８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００２－０２７９８７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１８－５１００４７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０２０－５２７３８６（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１０／０３２１１４（ＷＯ，Ａ２）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｎ １／３６
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
被験体の体表面の特定位置に接して交流微弱電流刺激を与えるように構成された電極と、前記電極に接続され、交流微弱電流を発生させる電流発生部と、
前記電流発生部に接続され、前記交流微弱電流の電流値を１μＡ以上７５０μＡ以下、電流処理時間を１０分間以上６０分間以下に制御するように構成された制御部と、
を備え、
Ｐｅｒｉｏｄ１遺伝子の発現亢進作用を有する、体内時計活性化システム。
【請求項2】
前記制御部が、前記交流微弱電流の電流値を３００μＡ以上４００μＡ以下、電流処理時間を１０分間以上３０分間以下に制御するように構成されている、請求項１に記載の体内時計活性化システム。
【請求項3】
前記制御部が、前記交流微弱電流の周波数を３００Ｈｚ以上５００Ｈｚ以下に制御するように構成されている、請求項１又は２に記載の体内時計活性化システム。
【請求項4】
前記電流発生部が、ＲＦＩＤタグ、リーダライタ及び電源を含んで構成されている、請求項１～３のいずれか一項に記載の体内時計活性化システム。
【請求項5】
温度センサ又は血圧センサを更に備える、請求項１～４のいずれか一項に記載の体内時計活性化システム。
【請求項6】
前記電極が被験体の体表面の特定位置に接するように装着するための装着具を更に備える、請求項１～５のいずれか一項に記載の体内時計活性化システム。
【請求項7】
前記被験体の体表面の特定位置が、首、手首、腕、胴部、脚又は足首である、請求項１～６のいずれか一項に記載の体内時計活性化システム。
【請求項8】
請求項１～７のいずれか一項に記載の体内時計活性化システムの制御方法であって、前記制御部が、任意の時刻に交流微弱電流刺激を開始するように、前記交流微弱電流の電流処理開始時刻、電流値及び電流処理時間を設定する設定工程と、
前記電流発生部が設定された電流処理開始時刻に、設定された電流値及び電流処理時間の交流微弱電流を発生する発生工程と、
をこの順に行う制御方法。
【請求項9】
前記設定工程において、前記制御部が、外部環境における明期開始時刻からその６時間後までの間の任意の時刻に交流微弱電流刺激を開始するように、電流処理開始時刻を設定する、請求項８に記載の制御方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、体内時計活性化システム及びその制御方法に関する。
本願は、２０１９年２月２０日に、日本に出願された特願２０１９－０２８４２５号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
本願は、２０１９年２月２０日に、日本に出願された特願２０１９－０２８４２５号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【0002】
ヒトを始めとする多くの哺乳動物の生理機能には、約２４時間を周期とする概日リズムが認められ、これらのリズムは時計遺伝子と呼ばれる一連の遺伝子群が形成する転写及び翻訳のフィードバックループ機構によって制御されている。この機構は、睡眠及び覚醒のリズムのみでなく、様々な生体機能を調節しており、様々な疾患の発症や病態に関連することが指摘されている。特に高齢者において、概日リズム制御機構の破綻が、生活習慣病や認知症、がん等の各種疾患の発症や病態に関連することが指摘されている（例えば、非特許文献１等参照）。これらのことから、体内時計の活性化は高齢者の健康増進及びＱＯＬ（quality of life）の向上に大きく貢献すると考えらえている。体内時計を調整する方法として臨床応用されているものに、高照度光療法と食事制限による治療の２つが挙げられる。高照度光療法は、網膜を介した概日リズム同調機構を応用した治療法である。食事制限による治療は、カロリー制限や絶食等、食事によって体内時計を調整する治療法である。
【0003】
体内時計に影響を与える因子は複数存在するが、生体の電磁場曝露による微弱な電流刺激はメラトニンの分泌異常等の体内時計に悪影響を及ぼすことが近年明らかになっている（例えば、非特許文献２等参照）。その一方で、微弱電流刺激（microcurrent stimulation；ＭＣＳ）はメタボリックシンドロームの治療や疼痛緩和、創傷回復促進を目的として、治療としても応用されており（例えば、非特許文献３及び４等参照）、人体に対する安全性も確立されている。
【0004】
従来の体内時計を調整する方法である、高照度光療法では、毎日決まった時間に長時間強い光を見続けなければならず簡便さに欠け、さらに高齢者では光受容能が低下しており、より長時間強い光を見続けなければならない。また、食事制限による治療では、加齢による食事機能低下や口腔環境悪化、胃ろう等により高齢者では食事制限を行うことが困難となる場合が多く、十分な効果が得られない。
以上のことから、特に高齢者において、体内時計を調整する方法は乏しく、有効な治療法の開発が強く望まれている。
以上のことから、特に高齢者において、体内時計を調整する方法は乏しく、有効な治療法の開発が強く望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【文献】Kondratova AA and Kondratov RV, “Circadian clock and pathology of the ageing brain.”, Nat Rev Neurosci., Vol. 13, Issue 5, p325-335, 2012.
【文献】Zhu L at al., “Circadian rhythm sleep disorders.”, Neurol Clin., Vol. 30, Issue 4, p1167-1191, 2012.
【文献】Kondo T at al., “Mild Electrical Stimulation with Heat Shock Reduces Visceral Adiposity and Improves Metabolic Abnormalities in Subjects with Metabolic Syndrome or Type 2 Diabetes: Randomized Crossover Trials.”, EBioMedicine, Vol. 1, Issue 1, p80-89, 2014.
【文献】馬玉宝ら、「膝前十字靱帯損傷者および再建者の膝関節運動覚」、第４６回日本理学療法学術大会抄録集、Vol. 38、理学療法学Supplement、No. 2、セッションID: PI1-319、2011．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、新規の体内時計活性化システム及びその制御方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、被験体の体表面の特定位置から微弱電流刺激（ＭＣＳ）を与えることで時計遺伝子の一つであるＰｅｒｉｏｄ１（Ｐｅｒ１）遺伝子の発現を亢進し、体内時計のリズム障害を改善できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0008】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
本発明の第１態様に係る体内時計活性化システムは、被験体の体表面の特定位置に接して交流微弱電流刺激を与えるように構成された電極と、前記電極に接続され、前記交流微弱電流を発生させる電流発生部と、前記電流発生部に接続され、前記交流微弱電流の電流値を１μＡ以上７５０μＡ以下、電流処理時間を１０分間以上６０分間以下に制御するように構成された制御部と、を備える。
前記制御部が、前記交流微弱電流の電流値を３００μＡ以上４００μＡ以下、電流処理時間を１０分間以上３０分間以下に制御するように構成されていてもよい。
前記制御部が、前記交流微弱電流の周波数を３００Ｈｚ以上５００Ｈｚ以下に制御するように構成されていてもよい。
前記電流発生部が、ＲＦＩＤタグ、リーダライタ及び電源を含んで構成されてもよい。
上記第１態様に係る体内時計活性化システムは、温度センサ又は血圧センサを更に備えてもよい。
上記第１態様に係る体内時計活性化システムは、前記電極が被験体の体表面の特定位置に接するように装着するための装着具を更に備えてもよい。
前記被験体の体表面の特定位置が、首、手首、腕、胴部、脚又は足首であってもよい。
上記第１態様に係る体内時計活性化システムは、Ｐｅｒ１遺伝子の発現亢進作用を有してもよい。
本発明の第１態様に係る体内時計活性化システムは、被験体の体表面の特定位置に接して交流微弱電流刺激を与えるように構成された電極と、前記電極に接続され、前記交流微弱電流を発生させる電流発生部と、前記電流発生部に接続され、前記交流微弱電流の電流値を１μＡ以上７５０μＡ以下、電流処理時間を１０分間以上６０分間以下に制御するように構成された制御部と、を備える。
前記制御部が、前記交流微弱電流の電流値を３００μＡ以上４００μＡ以下、電流処理時間を１０分間以上３０分間以下に制御するように構成されていてもよい。
前記制御部が、前記交流微弱電流の周波数を３００Ｈｚ以上５００Ｈｚ以下に制御するように構成されていてもよい。
前記電流発生部が、ＲＦＩＤタグ、リーダライタ及び電源を含んで構成されてもよい。
上記第１態様に係る体内時計活性化システムは、温度センサ又は血圧センサを更に備えてもよい。
上記第１態様に係る体内時計活性化システムは、前記電極が被験体の体表面の特定位置に接するように装着するための装着具を更に備えてもよい。
前記被験体の体表面の特定位置が、首、手首、腕、胴部、脚又は足首であってもよい。
上記第１態様に係る体内時計活性化システムは、Ｐｅｒ１遺伝子の発現亢進作用を有してもよい。
【0009】
本発明の第２態様に係る制御方法は、上記第１態様に係る体内時計活性化システムの制御方法であって、前記制御部が、任意の時刻に交流微弱電流刺激を開始するように、前記交流微弱電流の電流処理開始時刻、電流値及び電流処理時間を設定する設定工程と、前記電流発生部が設定された電流処理開始時刻に、設定された電流値及び電流処理時間の交流微弱電流を発生する発生工程と、をこの順に行う制御方法である。
前記設定工程において、前記制御部が、外部環境における明期開始時刻からその６時間後までの間の任意の時刻に電流処理開始時刻を設定してもよい。
前記設定工程において、前記制御部が、外部環境における明期開始時刻からその６時間後までの間の任意の時刻に電流処理開始時刻を設定してもよい。
【発明の効果】
【0010】
上記態様の体内時計活性化システム及びその制御方法によれば、体内時計のリズム障害を改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1A】本発明の第１実施形態に係る体内時計活性化システムを示す斜視図である。
【図1B】ＲＦＩＤタグの一例を示す平面図及び断面図である。
【図1C】リーダライタの一例を示す斜視図である。
【図1D】ＲＦＩＤシステムの一例を示すブロック構成図である。
【図1E】本発明の第１実施形態に係る体内時計活性化システムの制御方法の一例を示すフローである。
【図2A】本発明の第２実施形態に係る体内時計活性化システムを示す斜視図である。
【図2B】装着具を備えるＲＦＩＤタグの一例を示す斜視図である。
【図2C】本発明の第２実施形態に係る体内時計活性化システムの制御方法の一例を示すフローである。
【図3A】実施例１におけるマウスアストロサイトでのＰｅｒ１遺伝子の発現に起因するルシフェラーゼ活性を示すグラフである。
【図3B】実施例１におけるマウスアストロサイトでのＰｅｒ２遺伝子の発現に起因するルシフェラーゼ活性を示すグラフである。
【図4A】実施例２における交流微弱電流の電流処理時間（０～１２０分）を変更したマウスアストロサイトでのＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。
【図4B】実施例２における交流微弱電流の電流値（１～７５０μＡ）を変更したマウスアストロサイトでのＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。
【図5】実施例３におけるマウスアストロサイトでの時計遺伝子のｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。
【図6A】実施例４の実験フローを示す図である。
【図6B】実施例４におけるトランスフェクション用ベクターに含まれるＣＲＥＢ応答配列あり又はなしのＰｅｒ１遺伝子を示す概略図である。
【図6C】実施例４におけるマウスアストロサイトでのＰｅｒ１遺伝子の発現に起因するルシフェラーゼ活性を示すグラフである。
【図7A】実施例５におけるマウスへの微弱電流刺激（ＭＣＳ）の処理開始スケジュールを示す図である。
【図7B】実施例５におけるＭＣＳの処理開始時刻（ＺＴ２～２２）を変更したマウス肝臓細胞でのＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。
【図7C】実施例５におけるＭＣＳ未処理のマウス肝臓細胞（コントロール）に対するＭＣＳの処理開始時刻（ＺＴ２～２２）を変更したマウス肝臓細胞でのＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量の比率を示すグラフである。
【図8A】実施例６におけるマウスへのＭＣＳの処理開始時刻とサンプリングスケジュールを示す図である。
【図8B】実施例６における試験開始時のＭＣＳ未処理のマウス肝臓細胞（コントロール）に対するＭＣＳ処理したマウス肝臓細胞でのＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量の比率の経時変化を示すグラフである。
【図9A】実施例６におけるマウスへのＭＣＳの処理開始時刻とサンプリングスケジュールを示す図である。
【図9B】実施例６におけるＭＣＳ未処理のマウス肝臓細胞（コントロール）に対するＭＣＳ処理したマウス肝臓細胞でのＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量の比率の経時変化を示すグラフである。
【図10A】実施例７におけるマウスへのＭＣＳの処理開始時刻とサンプリングスケジュールを示す図である。
【図10B】実施例７における各群のマウスの肝臓細胞でのＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量の経時変化を示すグラフである。
【図11A】実施例８における野生型マウスに対するＭＣＳの処理開始時刻と行動リズム解析を示す図である。
【図11B】実施例８における麻酔、除毛、及びＭＣＳ未処理の野生型マウス（未処理群）、麻酔及び除毛処理を行ったが、ＭＣＳ未処理の野生型マウス群（Ｃｏｎｔｒｏｌ群）、並びに麻酔、除毛及びＭＣＳ処理を行った野生型マウス群（ＭＣＳ群）での行動リズムを示すグラフである。
【図11C】実施例８における処理前後の未処理群、Ｃｏｎｔｒｏｌ群、及びＭＣＳ群での行動サイクル周期（時間）を示すグラフである。
【図11D】実施例８における処理前後の未処理群、Ｃｏｎｔｒｏｌ群、及びＭＣＳ群での行動サイクルのシフト時間（分）を示すグラフである。
【図12A】実施例８におけるＣｌｏｃｋ改変マウスに対するＭＣＳの処理開始時刻と行動リズム解析を示す図である。
【図12B】実施例８における麻酔、除毛、及びＭＣＳ未処理のＣｌｏｃｋ改変マウス（未処理群）、麻酔及び除毛処理を行ったが、ＭＣＳ未処理のＣｌｏｃｋ改変マウス群（Ｃｏｎｔｒｏｌ群）、並びに麻酔、除毛及びＭＣＳ処理を行ったＣｌｏｃｋ改変マウス群（ＭＣＳ群）での行動リズムを示すグラフである。
【図12C】実施例８における処理前後の未処理群、Ｃｏｎｔｒｏｌ群、及びＭＣＳ群での行動サイクル周期（時間）を示すグラフである。
【図12D】実施例８における処理前後の未処理群、Ｃｏｎｔｒｏｌ群、及びＭＣＳ群での行動サイクルのシフト時間（分）を示すグラフである。
【図13A】実施例９におけるＭＣＳ処理又は未処理の野生型マウスの肝臓細胞の核抽出液を用いた抗リン酸化ＣＲＥＢ抗体、抗ＣＲＥＢ抗体、及び抗ＲＮＡポリメラーゼ２抗体によるウエスタンブロッティングの結果を示す図である。
【図13B】実施例９におけるＭＣＳ処理又は未処理の野生型マウスの肝臓細胞の核内でのＣＲＥＢ全量に対するリン酸化ＣＲＥＢの発現量の比率の経時変化を示すグラフである。
【図14A】実施例１０における試験開始時のＭＣＳ未処理の野生型マウス肝臓細胞（コントロール）に対するＭＣＳ処理した野生型マウス肝臓細胞での肝臓の糖代謝を促進する遺伝子のｍＲＮＡ発現量の比率の経時変化を示すグラフである。
【図14B】実施例１０における試験開始時のＭＣＳ未処理のＣｌｏｃｋ改変マウス肝臓細胞（コントロール）に対するＭＣＳ処理したＣｌｏｃｋ改変マウス肝臓細胞での肝臓の糖代謝を促進する遺伝子のｍＲＮＡ発現量の比率の経時変化を示すグラフである。
【図15A】実施例１１におけるＭＣＳ処理した又はＭＣＳ未処理の野生型加齢マウスの行動リズムを示すグラフである。
【図15B】実施例１１におけるＭＣＳ処理した又はＭＣＳ未処理の野生型加齢マウスの自発運動活性（Locomotor activity）を示すグラフである。
【図16】実施例１２におけるＭＣＳ処理した又はＭＣＳ未処理の野生型加齢マウス及びＣｌｏｃｋ改変加齢マウスのパッシブアボイダンステストの結果を示すグラフである。
【図17A】実施例１３におけるＭＣＳ未処理の野生型加齢マウスに対するＭＣＳ処理した野生型加齢マウスでのＳｉｒｔ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量の比率を示すグラフである。
【図17B】実施例１３におけるＭＣＳ未処理のＣｌｏｃｋ改変加齢マウスに対するＭＣＳ処理したＣｌｏｃｋ改変加齢マウスでのＳｉｒｔ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量の比率を示すグラフである。
【図18】実施例１４におけるＭＣＳ未処理の野生型加齢マウスに対するＭＣＳ処理した野生型加齢マウスの皮膚でのアクアポリン３遺伝子のｎＲＮＡ発現量の比率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0012】
以下、本発明の一実施形態に係る（以下、「本実施形態」ともいう）体内時計活性化システム及びその制御方法について、図面を参酌しながら詳細に説明する。
【0013】
≪体内時計活性化システム≫
本実施形態の体内時計活性化システムは、電極と、電流発生部と、制御部と、を備える。
電極は、被験体の体表面の特定位置に接して交流微弱電流刺激を与えるように構成されている。電流発生部は、電極に接続されており、交流微弱電流を発生させる。制御部は、電流発生部に接続されており、交流微弱電流の電流値及び電流処理時間を一定の範囲に制御するように構成されている。
具体的には、交流微弱電流の電流値は、１μＡ以上７５０μＡ以下であり、１００μＡ以上５００μＡ以下が好ましく、３００μＡ以上４００μＡ以下がより好ましい。電流値が上記範囲内であることで、後述する実施例に示すように時計遺伝子の一つであるＰｅｒ１遺伝子の発現をより効果的に亢進することができる。なお、ここでいう電流値は、絶対値であり、電流の向きに応じてプラスであってもよく、マイナスであってもよい。
また、交流微弱電流の電流処理時間は、１０分間以上６０分間以下であり、１５分間以上３０分間以下が好ましい。電流処理時間が上記範囲内であることで、後述する実施例に示すように時計遺伝子の一つであるＰｅｒ１遺伝子の発現をより効果的に亢進することができる。
本実施形態の体内時計活性化システムは、電極と、電流発生部と、制御部と、を備える。
電極は、被験体の体表面の特定位置に接して交流微弱電流刺激を与えるように構成されている。電流発生部は、電極に接続されており、交流微弱電流を発生させる。制御部は、電流発生部に接続されており、交流微弱電流の電流値及び電流処理時間を一定の範囲に制御するように構成されている。
具体的には、交流微弱電流の電流値は、１μＡ以上７５０μＡ以下であり、１００μＡ以上５００μＡ以下が好ましく、３００μＡ以上４００μＡ以下がより好ましい。電流値が上記範囲内であることで、後述する実施例に示すように時計遺伝子の一つであるＰｅｒ１遺伝子の発現をより効果的に亢進することができる。なお、ここでいう電流値は、絶対値であり、電流の向きに応じてプラスであってもよく、マイナスであってもよい。
また、交流微弱電流の電流処理時間は、１０分間以上６０分間以下であり、１５分間以上３０分間以下が好ましい。電流処理時間が上記範囲内であることで、後述する実施例に示すように時計遺伝子の一つであるＰｅｒ１遺伝子の発現をより効果的に亢進することができる。
【0014】
また、本実施形態の体内時計活性化システムが発生する微弱電流は、交流であるため、上記に示す電流処理時間であっても、被験体の体表面に火傷等が生じることなく微弱電流を継続的に与えることができる。
具体的には、交流微弱電流の周波数は、３００Ｈｚ以上５００Ｈｚ以下が好ましく、３５０Ｈｚ以上４５０Ｈｚ以下がより好ましく、４００Ｈｚがさらに好ましい。
具体的には、交流微弱電流の周波数は、３００Ｈｚ以上５００Ｈｚ以下が好ましく、３５０Ｈｚ以上４５０Ｈｚ以下がより好ましく、４００Ｈｚがさらに好ましい。
【0015】
本明細書において、「体内時計」とは、生物の体内において約２４時間周期の概日リズム（サーカディアンリズム）を刻む機構であり、生物時計や生理時計とも呼ばれる。体内時計は、光、食事、及びメラトニン等の分泌により調節されることが知られている。また、視交叉上核や松果体等の脳に存在する中枢の体内時計は、ホルモンや交感神経等を介して末梢諸器官の体内時計を同期している。「体内時計活性化」とは、外界のリズムに合わせて体内時計の周期、位相又は振幅を調節することを意味する。本実施形態の体内時計活性化システムは、後述する実施例に示すとおり、被験体の体表面にＭＣＳを非侵襲的に与えることで、Ｐｅｒ１遺伝子の発現を亢進させて、概日リズムをリセットすることができ、乱れた概日リズムを改善することができる。すなわち、本実施形態の体内時計活性化システムは、Ｐｅｒ１遺伝子の発現亢進用システムということもできる。
また、本実施形態の体内時計活性化システムは、Ｐｅｒ１遺伝子の発現亢進に加えて、肝臓の糖代謝の促進に関連する遺伝子の発現を変容させることができる。すなわち、本実施形態の体内時計活性化システムは、肝臓の糖代謝の促進用システムということもできる。肝臓の糖代謝の促進に関連する遺伝子としては、例えば、Glucokinase （Ｇｃｋ）遺伝子、Phosphoenolpyruvate carboxykinase 1 (Ｐｃｋ１)遺伝子、Peroxisome Proliferator-Activated Receptor α (Ｐｐａｒα)遺伝子、Peroxisome Proliferator-Activated Receptor γ (Ｐｐａｒγ)遺伝子等が挙げられる。
また、本実施形態の体内時計活性化システムは、Ｐｅｒ１遺伝子の発現亢進に加えて、体内時計のリズム障害である被験体における認知記憶機能を改善することができる。すなわち、本実施形態の体内時計活性化システムは、体内時計のリズム障害である被験体における認知記憶機能改善用システムということもできる。
また、本実施形態の体内時計活性化システムは、Ｐｅｒ１遺伝子の発現亢進に加えて、抗老化遺伝子の発現を亢進させることができる。すなわち、本実施形態の体内時計活性化システムは、抗老化遺伝子の発現亢進用システムということもできる。抗老化遺伝子としては、例えば、Ｓｉｒｔ１遺伝子等が挙げられる。
また、本実施形態の体内時計活性化システムは、Ｐｅｒ１遺伝子の発現亢進に加えて、皮膚の水分量を制御しているアクアポリン３（Ａｑｐ３）遺伝子の発現を亢進させることができる。すなわち、本実施形態の体内時計活性化システムは、アクアポリン３遺伝子の発現亢進用システムということもできる。
また、本実施形態の体内時計活性化システムは、Ｐｅｒ１遺伝子の発現亢進に加えて、肝臓の糖代謝の促進に関連する遺伝子の発現を変容させることができる。すなわち、本実施形態の体内時計活性化システムは、肝臓の糖代謝の促進用システムということもできる。肝臓の糖代謝の促進に関連する遺伝子としては、例えば、Glucokinase （Ｇｃｋ）遺伝子、Phosphoenolpyruvate carboxykinase 1 (Ｐｃｋ１)遺伝子、Peroxisome Proliferator-Activated Receptor α (Ｐｐａｒα)遺伝子、Peroxisome Proliferator-Activated Receptor γ (Ｐｐａｒγ)遺伝子等が挙げられる。
また、本実施形態の体内時計活性化システムは、Ｐｅｒ１遺伝子の発現亢進に加えて、体内時計のリズム障害である被験体における認知記憶機能を改善することができる。すなわち、本実施形態の体内時計活性化システムは、体内時計のリズム障害である被験体における認知記憶機能改善用システムということもできる。
また、本実施形態の体内時計活性化システムは、Ｐｅｒ１遺伝子の発現亢進に加えて、抗老化遺伝子の発現を亢進させることができる。すなわち、本実施形態の体内時計活性化システムは、抗老化遺伝子の発現亢進用システムということもできる。抗老化遺伝子としては、例えば、Ｓｉｒｔ１遺伝子等が挙げられる。
また、本実施形態の体内時計活性化システムは、Ｐｅｒ１遺伝子の発現亢進に加えて、皮膚の水分量を制御しているアクアポリン３（Ａｑｐ３）遺伝子の発現を亢進させることができる。すなわち、本実施形態の体内時計活性化システムは、アクアポリン３遺伝子の発現亢進用システムということもできる。
【0016】
また、本実施形態の体内時計活性化システムを適用する被験体としては、特別な限定はなく、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ヒツジ、マウス、ラット、マーモセット等の哺乳動物が好ましく例示される。
【0017】
＜第１実施形態＞
図１Ａは、本発明の第１実施形態に係る体内時計活性化システムを示す斜視図である。
図１Ａに示す体内時計活性化システム１Ａは、電極と、電流発生部１００と、制御部２００とを備える。体内時計活性化システム１Ａは、マウスＸ等の被験体を飼育するための飼育容器３００を備えていてもよい。
図１Ａは、本発明の第１実施形態に係る体内時計活性化システムを示す斜視図である。
図１Ａに示す体内時計活性化システム１Ａは、電極と、電流発生部１００と、制御部２００とを備える。体内時計活性化システム１Ａは、マウスＸ等の被験体を飼育するための飼育容器３００を備えていてもよい。
【0018】
電流発生部１００は、ＲＦＩＤ（Radio Frequency Identification；電波方式認識）システムに用いられるＲＦＩＤタグ１０、リーダライタ２０及び電源３０を含んで構成されている。
【0019】
図１Ａに示すように、ＲＦＩＤタグ１０は、電極が被験体であるマウスＸの体表面の胴部に接するように貼付されている。電極が接する被験体の体表面の特定位置としては、胴部に限定されず、全身のうちいずれの位置（例えば、頭、顔、首、手首、腕、胴部（背部、腹部等）、脚、足首等）であってもよいが、ＲＦＩＤタグ１０を装着しやすい観点から、首、手首、腕、胴部、脚又は足首が好ましい。電極は、これらの位置の１か所のみに接していてもよく、２か所以上に接していてもよい。
【0020】
ＲＦＩＤタグ１０は、電池を使用せずにリーダライタからの通信により作動するパッシブＲＦＩＤタグであってもよく、電池内蔵型であり、能動的に通信を行うアクティブＲＦＩＤタグであってもよく、電池内蔵型であり、特定の信号を検知した際にアクティブＲＦＩＤタグとして機能するセミアクティブＲＦＩＤタグであってもよい。被験体がヒト以外の哺乳動物である場合には、小型且つ安価であることから、パッシブＲＦＩＤタグを用いることが好ましく、一方で、被験体がヒトである場合には、長距離通信が可能であることから、アクティブＲＦＩＤタグ又はセミアクティブＲＦＩＤタグを用いることが好ましい。
以下に示すＲＦＩＤタグ１０の詳細な説明では、主に、パッシブＲＦＩＤタグを用いた場合について説明する。
以下に示すＲＦＩＤタグ１０の詳細な説明では、主に、パッシブＲＦＩＤタグを用いた場合について説明する。
【0021】
ＲＦＩＤタグ１０とリーダライタ２０との間において、非接触による通信を行うことができ、リーダライタ２０では、ＲＦＩＤタグ１０から送信されたデータの読み取り及びＲＦＩＤタグ１０へのデータの書き込みを行う。また、リーダライタ２０を介して、電源３０から供給された電力をＲＦＩＤタグ１０に供給することができる。すなわち、図１Ａに示すように、ＲＦＩＤタグ１０が貼付されたマウスＸはリーダライタ２０上に配置されていることで、ＲＦＩＤタグ１０とリーダライタ２０との間で非接触での通信及び電力の供給が行われ、制御部２００による制御下でＭＣＳ処理を行うことができる。
ＲＦＩＤタグ１０とリーダライタ２０との間のデータの伝送方式は特別な限定はなく、例えば、電磁結合方式、電磁誘導方式、電波（ＵＨＦ）方式等が挙げられ、ＲＦＩＤタグの通信周波数（共振周波数又は動作周波数ともいう）の範囲に応じて、伝送方式は適宜選択することができる。例えば、ＲＦＩＤタグの通信周波数が５０ＫＨｚ以上３００ＫＨｚ以下の範囲である場合、電磁誘導方式によりデータの伝送及び電力の供給を行うことができる。このときの通信距離は例えば、０ｍ超７０ｃｍ以下程度である。
ＲＦＩＤタグ１０とリーダライタ２０との間のデータの伝送方式は特別な限定はなく、例えば、電磁結合方式、電磁誘導方式、電波（ＵＨＦ）方式等が挙げられ、ＲＦＩＤタグの通信周波数（共振周波数又は動作周波数ともいう）の範囲に応じて、伝送方式は適宜選択することができる。例えば、ＲＦＩＤタグの通信周波数が５０ＫＨｚ以上３００ＫＨｚ以下の範囲である場合、電磁誘導方式によりデータの伝送及び電力の供給を行うことができる。このときの通信距離は例えば、０ｍ超７０ｃｍ以下程度である。
【0022】
電流発生部を構成する電源は、図１Ａに示すように、配線用差込接続器（コンセント）３１、電気配線３２及び家庭用電源３３を含んで構成される外部より電気を供給する電気供給装置であってもよく、或いは、電池であってもよい。電源が電気供給装置である場合、例えば、ＡＣアダプター（ＡＣ／ＡＣアダプター）等を使用してもよい。また、電源が電池である場合、電池は、水銀電池又はリチウム電池等の使い捨ての電池であってもよく、ニッケル－カドミニウム電池、電気二重層コンデンサー、リチウム蓄電池等の再充電可能な蓄電池であってもよい。
【0023】
【0024】
電極１はＲＦＩＤタグ１０の被験体の体表面に接する方の面に埋め込まれており、ＲＦＩＤタグ１０のアンテナ２に電気的に接続されている。図１Ｂに示すＲＦＩＤタグ１０では、プラス及びマイナスの電極をそれぞれ１つずつ、合計２つ備える場合を例示しているが、電極の数はこれに限定されず、２つ以上であればいくつであってもよい。電極の形状及び大きさは、ＲＦＩＤタグの形状及び大きさに応じて適宜選択することができるが、例えば、円柱状の電極である場合に、直径は０．１ｃｍ以上１ｃｍ以下とすることができ、高さは０．１ｃｍ以上１．５ｃｍ以下とすることができる。
【0025】
電極の材質としては、表面電極に一般に用いられる材質であればよく、例えば、銀－塩化銀、白金、チタン、窒化チタン、カーボン、金、ガラス等が挙げられる。
【0026】
ＲＦＩＤタグ１０は、アンテナ２と、ＩＣチップ３と、保護膜４と、基材５と、粘着剤層６と、から主に構成されている。図１Ｂの断面図に示すように、ＲＦＩＤタグ１０において、アンテナ２及びＩＣチップ３は、保護膜４及び基材５の間に封入されている。ＲＦＩＤタグの形状及び大きさは、本実施形態の体内時計活性化システムの適用対象となる被験体の体長及び装着部位に応じて適宜選択することができるが、例えば、カード形状のＲＦＩＤタグである場合に、縦及び横の長さはそれぞれ０．５ｃｍ以上５ｃｍ以下とすることができ、厚みは０．１ｍｍ以上５ｍｍ以下とすることができる。
【0027】
アンテナ２は、リーダライタ２０を介して受け取った電力を電極１及びＩＣチップ３に供給し、ＩＣチップ３を動作させ、且つ、電極１から微弱電流を出力させるものである。図１Ｂに示すように、アンテナ２はＩＣチップ３の外周に配置されており、電極１及びＩＣチップ３の端子に電気的に接続されている。アンテナ２がコイル状である場合（コイルアンテナである場合）、ＩＣチップ３の外周に配置することで、コイルの直径が大きくなり、インダクタンスが増加して、通信距離の確保及びＲＦＩＤタグの小型化が可能となる。ＩＣチップ３の構成については後述する。
【0028】
保護膜４は、アンテナ２及びＩＣチップ３を保護するものである。保護膜４の材質としては、絶縁性のものであって、被験体の体表面に接触して使用した際に毒性等を示さないものであればよく、例えば、樹脂やシリコンゴム等が挙げられる。樹脂としては、例えば、ポリイミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ＡＢＳ樹脂、ポリエステル樹脂、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド（ナイロン）、ポリアセタール、ポリブチレンテレフタレート、フッ素樹脂、フェノール樹脂、ポリウレタン、エポキシ樹脂等が挙げられる。
【0029】
基材５は、その上にアンテナ２及びＩＣチップ３を配置させ、さらに保護膜４を積層することでアンテナ２及びＩＣチップ３を封入するためのものである。基材５の材質としては、上記保護膜において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【0030】
粘着剤層６は、被験体の体表面にＲＦＩＤタグを貼付するためのものである。図１Ｂでは、粘着剤層が保護膜の上面４ａの全面に亘って積層された形態を例示したが、被験体の体表面に貼付するために必要な粘着性を発揮する範囲で、保護膜の上面４ａの一部に積層されていてもよい。粘着剤層に含まれる粘着剤としては、被験体の体表面に接触して使用した際に毒性等を示さないものであればよく、例えば、スチレン－ブタジエンゴム（ＳＢＲ）、Ａ－Ｂ－Ａ型ブロック共重合体エラストマー等の固体ゴム；液体イソプレン、液体イソプレン－スチレン、液状ポリブタジエン等の液体ゴム；テルペン系、ロジン系等の天然樹脂系の粘着付与樹脂；脂肪族系、芳香族系、石油樹脂系、アルキルフェノール系、キシレン系、クマロンインデン系等の合成樹脂系の粘着付与樹脂等が挙げられる。
【0031】
図１Ｃは、リーダライタの一例を示す斜視図である。リーダライタ２０は、制御部２００と、電源３０と、電気的に接続されている。リーダライタ２０の形状及び大きさは、被験体の体表面のうち、ＲＦＩＤタグが装着された部位をリーダライタの上部に配置することができる形状及び大きさであればよく、例えば、リーダライタが板状である場合に、縦及び横の長さはそれぞれ１０ｃｍ以上１００ｃｍ以下とすることができ、厚みは０．１ｃｍ以上５ｃｍ以下とすることができる。
【0032】
図１Ｄは、ＲＦＩＤタグ１０及びリーダライタ２０を用いたＲＦＩＤシステムの一例を示すブロック構成図である。
ＩＣチップ３は、アンテナ２を介してリーダライタ２０と通信を行うための通信回路３ａと、データを記憶するための記憶回路３ｂと、これら回路を制御する制御回路３ｃとを備える。また、ＩＣチップ３はアンテナ２の端部２ａ及び２ｂと接続している。
ＩＣチップ３は、アンテナ２を介してリーダライタ２０と通信を行うための通信回路３ａと、データを記憶するための記憶回路３ｂと、これら回路を制御する制御回路３ｃとを備える。また、ＩＣチップ３はアンテナ２の端部２ａ及び２ｂと接続している。
【0033】
リーダライタ２０は、アンテナ２１と、アンテナ２１を介してＲＦＩＤタグ１０と通信を行うための通信回路２２と、アンテナ２１への印加電圧を一時的に上昇させるための昇圧回路２３と、これら回路を制御する制御回路２４と、を備える。リーダライタ２０のアンテナ２１から出力された電磁波又は電波をＲＦＩＤタグ１０のアンテナ２が受信すると、アンテナ２に誘導電流が発生して、ＩＣチップ３が作動し、電極１に電流が供給される。
【0034】
リーダライタ２０には、制御部２００が有線又は無線の通信手段を介して接続されている。リーダライタ２０は、制御部２００の指示に応じて、ＲＦＩＤタグ１０との間でデータの送受信及び電力の供給を行うための電磁波を出力するように構成されている。
【0035】
リーダライタ２０は、電磁波を出力して、ＲＦＩＤタグ１０の記録回路３ｂに記憶されているデータを読み出し、当該データを制御部２００へ送信し、また、制御部２００から受け取ったデータをＲＦＩＤタグ１０に書き込む。制御部２００は、ＲＦＩＤタグ１０から読み出したデータに基づいて、交流微弱電流の電流値、電流処理時間及び電流開始時刻の調節及び設定を行う。
【0036】
また、制御部２００は、ＯＮ／ＯＦＦスイッチ２０１と、交流微弱電流の電流値、電流処理時間及び電流開始時刻の調節及び設定を行う調節スイッチ２０２と、設定した電流値、電流処理時間及び電流開始時刻を出力する出力画面２０３と、から主に構成されている。
制御部２００の形状及び大きさは特別な限定はなく、例えば、制御部２００の形状が角柱である場合、縦（短手方向又は奥行）の長さは１ｃｍ以上１０ｃｍ以下とすることができ、横（長手方向）の長さは１０ｃｍ以上５０ｃｍ以下とすることができ、高さは１ｃｍ以上５ｃｍ以下とすることができる。
制御部２００の形状及び大きさは特別な限定はなく、例えば、制御部２００の形状が角柱である場合、縦（短手方向又は奥行）の長さは１ｃｍ以上１０ｃｍ以下とすることができ、横（長手方向）の長さは１０ｃｍ以上５０ｃｍ以下とすることができ、高さは１ｃｍ以上５ｃｍ以下とすることができる。
【0037】
次に、体内時計活性化システム１Ａの制御方法について図１Ｅに示すフローを用いて説明する。
【0038】
図１Ｅに示すように、制御部２００からデータ読み出し指示を受けると（Ｓ１及びＳ２）、リーダライタ２０は、電磁波に読み出しコマンドを含ませてＲＦＩＤタグ１０へ送信する（Ｓ３）。当該読み出しコマンドを含む電磁波を受けると、ＲＦＩＤタグ１０のアンテナ２には該電磁波に起因して誘導電流が発生し（Ｓ４）、ＲＦＩＤタグ１０のＩＣチップ３が作動され、さらに、電極１を介して被験体の体表面にＭＣＳ処理を行う（Ｓ５）。ＩＣチップ３は、読み出しコマンドに応じて記憶回路３ｂに記録しているデータを読み出し、当該データと共に、さらに、ＭＣＳ処理後の被験体から取得されたデータをリーダライタ２０へ送信する（Ｓ６）。リーダライタ２０は、受信したデータを制御部２００へ送信する（Ｓ７及びＳ８）。制御部２００は、受信したデータに基づいて交流微弱電流の電流値、電流処理時間及び電流開始時刻の調節及び設定を行う（Ｓ９及びＳ１０）。ＲＦＩＤタグ１０にデータを書き込む場合には、リーダライタ２０の電磁波に、書き込みコマンドと書き込み用のデータとを含ませればよく、ＲＦＩＤタグ１０はコマンドに応じて記憶回路３ｂにデータを書き込む。また、リーダライタ２０からＲＦＩＤタグ１０に向けて読み出しコマンドを含む電磁波を送信したときに、ＲＦＩＤタグ１０から返答がない場合には、ＲＦＩＤタグ１０は通信不能状態にあると判断することができる。
【0039】
また、一実施形態において、本発明は、設定工程と、発生工程と、をこの順に行う上記体内時計活性化システムの制御方法を提供する。
設定工程では、制御部２００が、任意の時刻に交流微弱電流刺激を開始するように、交流微弱電流の電流処理開始時刻、電流値及び電流処理時間を設定する。電流処理開始時刻としては、外部環境における明期開始時刻からその６時間後までの間の任意の時刻であることが好ましく、明期開始時刻からその４時間後までの間の任意の時刻であることがより好ましく、明期開始時刻の１時間半後から明期開始時刻の２時間半後までの間の任意の時刻であることがさらに好ましく、明期開始時刻の２時間後の時刻が特に好ましい。ここでいう「外部環境における明期開始時刻」とは、適当な長さの明期と暗期とが繰り返される完全光周期条件下である外部環境での明期の開始時刻を意味し、明期開始時刻は、日の出時刻であってもよい。例えば、午前６時から午後６時までの１２時間の明期と、午後６時から午前６時までの１２時間の暗期が繰り返される環境下では、午前６時が明期開始時刻にあたる。電流処理開始時刻の具体的な時刻としては、例えば、午前７時から午後７時までの１２時間の明期と、午後７時から午前７時までの１２時間の暗期とが繰り返される環境下では、午前７時から午前１３時までの間の任意の時刻が好ましく、午前７時から午前１１時までの間の任意の時刻がより好ましく、午前８時３０分から午前９時３０分までの間の任意の時刻がさらに好ましく、午前９時が特に好ましい。電流処理開始時刻が上記時刻の範囲内であることで、後述する実施例に示すように、Ｐｅｒ１遺伝子の発現をより効果的に亢進することができる。また、電流値及び電流処理時間は、上記において説明した範囲内とすることができる。
設定工程では、制御部２００が、任意の時刻に交流微弱電流刺激を開始するように、交流微弱電流の電流処理開始時刻、電流値及び電流処理時間を設定する。電流処理開始時刻としては、外部環境における明期開始時刻からその６時間後までの間の任意の時刻であることが好ましく、明期開始時刻からその４時間後までの間の任意の時刻であることがより好ましく、明期開始時刻の１時間半後から明期開始時刻の２時間半後までの間の任意の時刻であることがさらに好ましく、明期開始時刻の２時間後の時刻が特に好ましい。ここでいう「外部環境における明期開始時刻」とは、適当な長さの明期と暗期とが繰り返される完全光周期条件下である外部環境での明期の開始時刻を意味し、明期開始時刻は、日の出時刻であってもよい。例えば、午前６時から午後６時までの１２時間の明期と、午後６時から午前６時までの１２時間の暗期が繰り返される環境下では、午前６時が明期開始時刻にあたる。電流処理開始時刻の具体的な時刻としては、例えば、午前７時から午後７時までの１２時間の明期と、午後７時から午前７時までの１２時間の暗期とが繰り返される環境下では、午前７時から午前１３時までの間の任意の時刻が好ましく、午前７時から午前１１時までの間の任意の時刻がより好ましく、午前８時３０分から午前９時３０分までの間の任意の時刻がさらに好ましく、午前９時が特に好ましい。電流処理開始時刻が上記時刻の範囲内であることで、後述する実施例に示すように、Ｐｅｒ１遺伝子の発現をより効果的に亢進することができる。また、電流値及び電流処理時間は、上記において説明した範囲内とすることができる。
【0040】
発生工程では、電流発生部１００が、上記設定工程において設定された電流処理開始時刻に、設定された電流値及び電流処理時間の交流微弱電流を発生する。
【0041】
設定工程及び発生工程における各構成での詳細な処理フローは、図１Ｅに示すフローを用いて上記において説明したとおりである。
【0042】
＜第２実施形態＞
図２Ａは、本発明の第２実施形態に係る体内時計活性化システムを示す斜視図である。図２Ａに示す体内時計活性化システム２Ａは、飼育容器３００の代わりにイヌ用ベッド３０１を備え、装着具４０を更に備える。装着具４０の内周面４０ａ（被験体の体表面に接する方の面）には、電極１が埋め込まれたＲＦＩＤタグ１０（以下、「第１のＲＦＩＤタグ」と称する場合がある）、及び、更に温度センサ５１が埋め込まれた第２のＲＦＩＤタグ５０が配置されている。これらの点以外は、体内時計活性化システム２Ａは、図１Ａに示す体内時計活性化システム１Ａと同じである。
図２Ａは、本発明の第２実施形態に係る体内時計活性化システムを示す斜視図である。図２Ａに示す体内時計活性化システム２Ａは、飼育容器３００の代わりにイヌ用ベッド３０１を備え、装着具４０を更に備える。装着具４０の内周面４０ａ（被験体の体表面に接する方の面）には、電極１が埋め込まれたＲＦＩＤタグ１０（以下、「第１のＲＦＩＤタグ」と称する場合がある）、及び、更に温度センサ５１が埋め込まれた第２のＲＦＩＤタグ５０が配置されている。これらの点以外は、体内時計活性化システム２Ａは、図１Ａに示す体内時計活性化システム１Ａと同じである。
【0043】
装着具４０は、ＲＦＩＤタグ１０に埋め込まれている電極１が被験体の体表面の特定位置に接するように装着するためのものである。体内時計活性化システム２Ａにおいて、装着具４０は、首輪の形状であるものを例示しているが、これに限定されず、上記に例示された被験体の体表面の特定位置、好ましくは、首、手首、腕、胴部、脚又は足首に装着可能なベルト等の形状とすることができる。また、被験体の種類に応じて、装着具４０の形状は適宜選択することができ、イヌやネコ等の愛玩動物である場合には、容易に外れにくいことから、首輪であることが好ましい。
【0044】
図２Ｂは、装着具を備えるＲＦＩＤタグの一例を示す斜視図である。電極１が埋め込まれたＲＦＩＤタグ１０は装着具４０の内周面４０ａに配置されている。ＲＦＩＤタグ１０は、装着具４０の内周面４０ａ上に固定化されていてもよく、或いは、装着具４０の内部に埋め込まれており、電極１のみが内周面４０ａ上に露出するように固定化されていてもよい。ＲＦＩＤタグ１０の装着具４０への固定化の様式は、着脱可能な様式であってもよい。
【0045】
第２のＲＦＩＤタグ５０は、温度センサ５１が埋め込まれている点以外は、第１のＲＦＩＤタグ１０と同じである。温度センサ５１は第２のＲＦＩＤタグ５０のアンテナに電気的に接続している。
温度センサ５１は、被験体の体温を測定するためのものである。温度センサを備えることで、被験体の体温を経時的に測定し、体温の概日リズムを把握することができる。これにより、被験体の体内時計が整っている、又は乱れているかを判定することができる。温度センサとしては、体表面から体温を測定できる公知のものを適宜選択して用いることができる。市販の温度センサとしては、例えば、Omron Electronics Inc-EMC Div社製のD6T8L06等が挙げられる。
温度センサ５１は、被験体の体温を測定するためのものである。温度センサを備えることで、被験体の体温を経時的に測定し、体温の概日リズムを把握することができる。これにより、被験体の体内時計が整っている、又は乱れているかを判定することができる。温度センサとしては、体表面から体温を測定できる公知のものを適宜選択して用いることができる。市販の温度センサとしては、例えば、Omron Electronics Inc-EMC Div社製のD6T8L06等が挙げられる。
【0046】
次に、体内時計活性化システム２Ａの制御方法について、図２Ｃに示すフローを用いて説明する。なお、第１のＲＦＩＤタグ１０については、上記図１Ｅに示したフローと同様の方法で制御されるため、図示及び説明を省略する。また、第２のＲＦＩＤタグ５０は、第１のＲＦＩＤタグ１０と共に、或いは第１のＲＦＩＤタグと独立に制御される。
【0047】
図２Ｃに示すように、制御部２００からデータ読み出し指示を受けると（Ｓ１１及びＳ１２）、リーダライタ２０は、電磁波に読み出しコマンドを含ませて第２のＲＦＩＤタグ５０へ送信する（Ｓ１３）。当該読み出しコマンドを含む電磁波を受けると、第２のＲＦＩＤタグ５０のアンテナには該電磁波に起因して誘導電流が発生し（Ｓ１４）、第２のＲＦＩＤタグ５０のＩＣチップが作動され、さらに、温度センサを介して被験体の体表面の温度測定処理を行う（Ｓ１５）。ＩＣチップは、読み出しコマンドに応じて記憶回路に記録しているデータを読み出し、当該データと共に、さらに、温度測定処理後の被験体から取得されたデータをリーダライタ２０へ送信する（Ｓ１６）。リーダライタ２０は、受信したデータを制御部２００へ送信する（Ｓ１７及びＳ１８）。制御部２００は、受信したデータに基づいて被験体の体温の概日リズムが整っているか、或いは乱れているかの判定を行う（Ｓ１９及びＳ２０）。第２のＲＦＩＤタグ５０にデータを書き込む場合には、リーダライタ２０の電磁波に、書き込みコマンドと書き込み用のデータとを含ませればよく、第２のＲＦＩＤタグ５０はコマンドに応じて記憶回路にデータを書き込む。また、リーダライタ２０から第２のＲＦＩＤタグ５０に向けて読み出しコマンドを含む電磁波を送信したときに、第２のＲＦＩＤタグ５０から返答がない場合には、第２のＲＦＩＤタグ５０は通信不能状態にあると判断することができる。
【0048】
本実施形態の体内時計活性化システムは、図１Ａ～図１Ｄ及び図２Ａ～図２Ｂに示すものに限定されず、本発明の効果を損なわない範囲内において、図１Ａ～図１Ｄ及び図２Ａ～図２Ｂに示すものの一部の構成が変更又は削除されたものや、これまでに説明したものにさらに他の構成が追加されたものであってもよい。
【0049】
例えば、図２Ａ～図２Ｂに示す体内時計活性化システム２Ａにおいては、血圧センサが埋め込まれた第３のＲＦＩＤタグを更に備えてもよい。血圧センサは第３のＲＦＩＤタグのアンテナに電気的に接続している。
血圧センサは、被験体の血圧を測定するためのものである。血圧センサを備えることで、被験体の血圧を経時的に測定し、血圧の概日リズムを把握することができる。これにより、被験体の体内時計が整っている、又は乱れているかを判定することができる。血圧センサとしては、体表面から血圧を測定できる公知のものを適宜選択して用いることができる。市販の血圧センサとしては、例えば、Renesas Electronics社製のSmart Analog IC300、Smart Analog IC500等が挙げられる。
なお、体内時計活性化システム２Ａは、体温センサ及び血圧センサのうちいずれか一方のみを備えていてもよく、両方備えていてもよい。
血圧センサは、被験体の血圧を測定するためのものである。血圧センサを備えることで、被験体の血圧を経時的に測定し、血圧の概日リズムを把握することができる。これにより、被験体の体内時計が整っている、又は乱れているかを判定することができる。血圧センサとしては、体表面から血圧を測定できる公知のものを適宜選択して用いることができる。市販の血圧センサとしては、例えば、Renesas Electronics社製のSmart Analog IC300、Smart Analog IC500等が挙げられる。
なお、体内時計活性化システム２Ａは、体温センサ及び血圧センサのうちいずれか一方のみを備えていてもよく、両方備えていてもよい。
【0050】
また、例えば、図２Ａ～図２Ｂに示す体内時計活性化システム２Ａにおいては、表示部を更に備えてもよい。表示部としては、例えば、スマートフォンやタブレット端末等の各種携帯情報端末、コンピュータ等が挙げられる。表示部は、体温センサ又は血圧センサ等で得られたデータ（体温や血圧の経時的なデータ等）を制御部２００から受信し、表示することができる。また、表示部は、専用のアプリケーション又は回路が搭載されていることが好ましい。専用のアプリケーション又は回路が搭載されていることで、制御部２００から送信されたデータを解析し、グラフに変換して表示することや、変換されたグラフを元に、被験体の概日リズムをモニタリングすることができる。さらに、制御部２００との間での通信が可能であり、制御情報（ＭＣＳの処理開始時刻、電流値及び電流処理時間等）を設定し、制御部２００に当該制御情報を送信することができる。このような制御を可能とするため、この表示部は、各種プログラムを実行するための制御回路と、各種プログラム及び各種データが記憶される記憶回路と、各種情報を表示する表示回路と、タッチ入力を検出する入力部と、送受信部等を主体として構成されている。なお、前記入力部は、前記表示部に重ねて配置された透明のタッチスクリーン等からなり、これら表示部と入力部とによってタッチパネルを構成していてもよい。
【0051】
＜別の実施形態＞
本実施形態の体内時計活性化システムによれば、後述する実施例に示すように、体内時計のリズム障害を改善することができる。すなわち、一実施形態において、本発明は、上記体内時計活性化システムを用いた、体内時計のリズム障害の予防又は治療方法を提供する。
また、一実施形態において、本発明は、体内時計のリズム障害の予防又は治療のための、上記体内時計活性化システムを提供する。
本実施形態の体内時計活性化システムによれば、後述する実施例に示すように、体内時計のリズム障害を改善することができる。すなわち、一実施形態において、本発明は、上記体内時計活性化システムを用いた、体内時計のリズム障害の予防又は治療方法を提供する。
また、一実施形態において、本発明は、体内時計のリズム障害の予防又は治療のための、上記体内時計活性化システムを提供する。
【0052】
本実施形態の体内時計活性化システムによれば、後述する実施例に示すように、肝臓での糖代謝を促進する遺伝子の発現を変容させることができる。すなわち、一実施形態において、本発明は、上記体内時計活性化システムを用いた、肝臓での糖代謝を促進する遺伝子の発現を制御する方法を提供する。肝臓での糖代謝を促進する遺伝子としては、上述したものと同様のものが挙げられる。
【0053】
本実施形態の体内時計活性化システムによれば、後述する実施例に示すように、体内時計のリズム障害である被験体の認知記憶機能を改善することができる。すなわち、一実施形態において、本発明は、上記体内時計活性化システムを用いた、体内時計のリズム障害である被験体の認知記憶機能を改善する方法を提供する。被験体の年齢は、特に限定されないが、例えば、認知記憶機能が低下する年齢が挙げられる。例えば、被験体がヒトである場合には、通常、５０歳以上であり、好ましくは６０歳以上、より好ましくは６５歳以上、さらに好ましくは７０歳以上である。
【0054】
本実施形態の体内時計活性化システムによれば、後述する実施例に示すように、抗老化遺伝子の発現を亢進させることができる。すなわち、一実施形態において、本発明は、上記体内時計活性化システムを用いた、抗老化遺伝子の発現を亢進させる方法を提供する。抗老化遺伝子としては、上述したものと同様のものが挙げられる。
【0055】
本実施形態の体内時計活性化システムによれば、後述する実施例に示すように、皮膚のアクアポリン３遺伝子の発現を亢進させることができる。すなわち、一実施形態において、本発明は、上記体内時計活性化システムを用いた、皮膚のアクアポリン３遺伝子の発現を亢進させる方法を提供する。
【実施例】
【0056】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0057】
＜方法＞
［細胞培養］
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性野生型マウスの脳由来アストロサイトを用いた。細胞は、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Thermo Fisher Scientific, Walthan, MA, USA）、０．５％ペニシリン－ストレプトマイシン（Thermo Fisher Scientific）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Sigma Aldrich, St. Luis, MO, USA）を用いて、３７℃、５％二酸化炭素／９５％大気条件下で継代培養し、各試験に用いた。
［細胞培養］
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性野生型マウスの脳由来アストロサイトを用いた。細胞は、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Thermo Fisher Scientific, Walthan, MA, USA）、０．５％ペニシリン－ストレプトマイシン（Thermo Fisher Scientific）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Sigma Aldrich, St. Luis, MO, USA）を用いて、３７℃、５％二酸化炭素／９５％大気条件下で継代培養し、各試験に用いた。
【0058】
［実験動物］
ＩＣＲ雄性野生型マウス（以下、「野生型マウス」又は「ＷＴマウス」と略記する場合がある）（Charles River japan Inc., Kanagawa, Japan）及びＩＣＲをバックグラウンドとするＣｌｏｃｋ遺伝子改変（Ｃｌｋ／Ｃｌｋ）雄性マウス（以下、「Ｃｌｏｃｋ改変マウス」又は「Ｃｌｋ／Ｃｌｋマウス」と略記する場合がある）を温度２４℃±１℃、湿度６０±１０％、明暗周期（明期：７：００～１９：００）、自由摂食摂水の条件下で１週間飼育した後、各試験に用いた。行動解析は、行動解析装置（ニューロサイエンス社製）を用い、明暗周期（明期：７：００～１９：００）又は恒暗条件下（暗記：２４時間）で測定した。各試験における実験動物の取り扱いについては九州大学動物実験規則に従った。
ＩＣＲ雄性野生型マウス（以下、「野生型マウス」又は「ＷＴマウス」と略記する場合がある）（Charles River japan Inc., Kanagawa, Japan）及びＩＣＲをバックグラウンドとするＣｌｏｃｋ遺伝子改変（Ｃｌｋ／Ｃｌｋ）雄性マウス（以下、「Ｃｌｏｃｋ改変マウス」又は「Ｃｌｋ／Ｃｌｋマウス」と略記する場合がある）を温度２４℃±１℃、湿度６０±１０％、明暗周期（明期：７：００～１９：００）、自由摂食摂水の条件下で１週間飼育した後、各試験に用いた。行動解析は、行動解析装置（ニューロサイエンス社製）を用い、明暗周期（明期：７：００～１９：００）又は恒暗条件下（暗記：２４時間）で測定した。各試験における実験動物の取り扱いについては九州大学動物実験規則に従った。
【0059】
［培養アストロサイトに対するＭＣＳ］
３７℃、５％二酸化炭素／９５％大気条件下で培養したＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性野生型マウスの脳由来アストロサイトに対して、微弱電流刺激装置（ES530,ITO社製）の金電極を用いて一定時間電気刺激を行った。
３７℃、５％二酸化炭素／９５％大気条件下で培養したＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性野生型マウスの脳由来アストロサイトに対して、微弱電流刺激装置（ES530,ITO社製）の金電極を用いて一定時間電気刺激を行った。
【0060】
［マウス腹部に対するＭＣＳ］
ＩＣＲ雄性野生型マウス及び時計遺伝子Ｃｌｏｃｋ改変（Ｃｌｋ／Ｃｌｋ）雄性マウスに対し、吸入麻酔下で腹部及び背部のそれぞれに電極を貼付し、微弱電流刺激装置（ES530,ITO社製）を用いて、一定時間電気刺激を行った。
ＩＣＲ雄性野生型マウス及び時計遺伝子Ｃｌｏｃｋ改変（Ｃｌｋ／Ｃｌｋ）雄性マウスに対し、吸入麻酔下で腹部及び背部のそれぞれに電極を貼付し、微弱電流刺激装置（ES530,ITO社製）を用いて、一定時間電気刺激を行った。
【0061】
［Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ検出］
マウス肝臓からＲＮＡｉｓｏ（Takara bil Inc., Osaka, Japan）を用いて、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。次いで、Ｒｅｖｅｒ Ｔｒａ Ａｃｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ ｋｉｔ（Toyobo, Osaka, Japan）を用いて、ＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡをＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（Toyobo）と、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標） ９６ Ｓｙｓｔｅｍ（Roche, Basel, Switzerland）を用いて増幅し、検量線法により各遺伝子のｍＲＮＡ発現量を測定した。また、各遺伝子の発現量は、β－ａｃｔｉｎ ｍＲＮＡ発現量を測定して補正した。各遺伝子の定量に用いたプライマー配列を以下の表１に示す。
マウス肝臓からＲＮＡｉｓｏ（Takara bil Inc., Osaka, Japan）を用いて、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。次いで、Ｒｅｖｅｒ Ｔｒａ Ａｃｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ ｋｉｔ（Toyobo, Osaka, Japan）を用いて、ＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡをＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（Toyobo）と、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標） ９６ Ｓｙｓｔｅｍ（Roche, Basel, Switzerland）を用いて増幅し、検量線法により各遺伝子のｍＲＮＡ発現量を測定した。また、各遺伝子の発現量は、β－ａｃｔｉｎ ｍＲＮＡ発現量を測定して補正した。各遺伝子の定量に用いたプライマー配列を以下の表１に示す。
【0062】
【表1】
【0063】
［ルシフェラーゼアッセイ］
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性野生型マウスの脳由来アストロサイトに、Ｐｅｒｉｏｄ１（Ｐｅｒ１）遺伝子及びＰｅｒｉｏｄ２（Ｐｅｒ２）遺伝子のプロモーター下流にルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだベクターをトランスフェクションして、Ｐｅｒ１：：ｌｕｃアストロサイト及びＰｅｒ２：：ｌｕｃアストロサイトを作製した。得られたＰｅｒ１：：ｌｕｃアストロサイト及びＰｅｒ２：：ｌｕｃアストロサイトをそれぞれ３５ｍｍ細胞培養用ディッシュに１ディッシュ当たり１×１０５細胞となるように播種し、一晩３７℃のインキュベーターで培養した。培地を回収した後、２％のＦＢＳ、０．５％のペニシリン－ストレプトマイシン及び１０ｎＭのルシフェリン（Wako, Osaka, Japan）を含む、フェノールレッドフリーのＤＭＥＭに置換した。ＭＣＳを行った後、Ｐｅｒ１遺伝子及びＰｅｒ２遺伝子のプロモーター活性由来のルシフェラーゼ活性をリアルタイムモニタリングシステムＬｕｍｉＣｙｃｌｅ（Actimetrics, Wilmette, IL, USA）を用いて経時的に測定した。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性野生型マウスの脳由来アストロサイトに、Ｐｅｒｉｏｄ１（Ｐｅｒ１）遺伝子及びＰｅｒｉｏｄ２（Ｐｅｒ２）遺伝子のプロモーター下流にルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだベクターをトランスフェクションして、Ｐｅｒ１：：ｌｕｃアストロサイト及びＰｅｒ２：：ｌｕｃアストロサイトを作製した。得られたＰｅｒ１：：ｌｕｃアストロサイト及びＰｅｒ２：：ｌｕｃアストロサイトをそれぞれ３５ｍｍ細胞培養用ディッシュに１ディッシュ当たり１×１０５細胞となるように播種し、一晩３７℃のインキュベーターで培養した。培地を回収した後、２％のＦＢＳ、０．５％のペニシリン－ストレプトマイシン及び１０ｎＭのルシフェリン（Wako, Osaka, Japan）を含む、フェノールレッドフリーのＤＭＥＭに置換した。ＭＣＳを行った後、Ｐｅｒ１遺伝子及びＰｅｒ２遺伝子のプロモーター活性由来のルシフェラーゼ活性をリアルタイムモニタリングシステムＬｕｍｉＣｙｃｌｅ（Actimetrics, Wilmette, IL, USA）を用いて経時的に測定した。
【0064】
［タンパク質測定］
細胞から細胞質又は核を抽出し、ウエスタンブロッティング法を用いて、各タンパク質を測定した。一次抗体として抗ＣＲＥＢ抗体（サンタクルーズ社製）、抗リン酸化ＣＲＥＢ抗体（サンタクルーズ社製）及び抗Ｐｏｌ２抗体（Abcam）を使用した。二次抗体は、抗ウサギ抗体（Abcam）を使用した。
細胞から細胞質又は核を抽出し、ウエスタンブロッティング法を用いて、各タンパク質を測定した。一次抗体として抗ＣＲＥＢ抗体（サンタクルーズ社製）、抗リン酸化ＣＲＥＢ抗体（サンタクルーズ社製）及び抗Ｐｏｌ２抗体（Abcam）を使用した。二次抗体は、抗ウサギ抗体（Abcam）を使用した。
【0065】
［統計解析］
統計解析ソフトとして、ＪＭＰ（登録商標） Ｐｒｏ １３．０．０（SAS Institute Japan, Tokyo, Japan）を使用した。独立多群の比較には、一元配置分散析（One-way ANOVA）、二元配置分散析（Two-way ANOVA）、及びＴｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ ｐｏｓｔ－ｈｏｃ ｔｅｓｔを用いた。有意水準５％以下を有意な差とした。
統計解析ソフトとして、ＪＭＰ（登録商標） Ｐｒｏ １３．０．０（SAS Institute Japan, Tokyo, Japan）を使用した。独立多群の比較には、一元配置分散析（One-way ANOVA）、二元配置分散析（Two-way ANOVA）、及びＴｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ ｐｏｓｔ－ｈｏｃ ｔｅｓｔを用いた。有意水準５％以下を有意な差とした。
【0066】
［実施例１］
（時計遺伝子の発現量に及ぼすＭＣＳの影響）
時計遺伝子の発現リズムは、光等の刺激によるＰＥＲＩＯＤの発現上昇が起点となって同調されることが報告されている。そこで、この同調機構を担うＰｅｒ１遺伝子及びＰｅｒ２遺伝子の転写活性に及ぼすＭＣＳの影響を検討した。
Ｐｅｒ１：：ｌｕｃ及びＰｅｒ２：：ｌｕｃをそれぞれ発現させたＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性野生型マウスの脳由来アストロサイトに、電流値３００μＡ、周波数４００Ｈｚの微弱電流を１５分間与えた後、ルシフェラーゼ活性を検出した。結果を図３Ａ（Ｐｅｒ１：：ｌｕｃアストロサイト）及び図３Ｂ（Ｐｅｒ２：：ｌｕｃアストロサイト）に示す。図３Ａ及び図３Ｂでは、ＭＣＳ前（Ｂｅｆｏｒｅ ＭＣ）の細胞におけるルシフェラーゼ活性を１００としたときのＭＣＳ後（Ａｆｔｅｒ ＭＣ）のルシフェラーゼ活性を相対値で表している。
（時計遺伝子の発現量に及ぼすＭＣＳの影響）
時計遺伝子の発現リズムは、光等の刺激によるＰＥＲＩＯＤの発現上昇が起点となって同調されることが報告されている。そこで、この同調機構を担うＰｅｒ１遺伝子及びＰｅｒ２遺伝子の転写活性に及ぼすＭＣＳの影響を検討した。
Ｐｅｒ１：：ｌｕｃ及びＰｅｒ２：：ｌｕｃをそれぞれ発現させたＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性野生型マウスの脳由来アストロサイトに、電流値３００μＡ、周波数４００Ｈｚの微弱電流を１５分間与えた後、ルシフェラーゼ活性を検出した。結果を図３Ａ（Ｐｅｒ１：：ｌｕｃアストロサイト）及び図３Ｂ（Ｐｅｒ２：：ｌｕｃアストロサイト）に示す。図３Ａ及び図３Ｂでは、ＭＣＳ前（Ｂｅｆｏｒｅ ＭＣ）の細胞におけるルシフェラーゼ活性を１００としたときのＭＣＳ後（Ａｆｔｅｒ ＭＣ）のルシフェラーゼ活性を相対値で表している。
【0067】
【0068】
［実施例２］
（Ｐｅｒ１遺伝子の発現に対するＭＣＳの至適条件の検討）
次いで、ＭＣＳの条件は症状に応じて適宜決められているものの、条件の決定には施術者の経験に依拠することが多い。そこで、Ｐｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量に対する影響の大きいＭＣＳの条件（電流処理時間及び電流値）を検討した。結果を図４Ａ（電流処理時間）及び図４Ｂ（電流値）に示す。図４Ａ及び図４Ｂにおいて、ＭＣＳ未処理におけるＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を１００としたときの各条件でのＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対値で表している。また、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はＭＣＳ未処理の細胞である。
（Ｐｅｒ１遺伝子の発現に対するＭＣＳの至適条件の検討）
次いで、ＭＣＳの条件は症状に応じて適宜決められているものの、条件の決定には施術者の経験に依拠することが多い。そこで、Ｐｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量に対する影響の大きいＭＣＳの条件（電流処理時間及び電流値）を検討した。結果を図４Ａ（電流処理時間）及び図４Ｂ（電流値）に示す。図４Ａ及び図４Ｂにおいて、ＭＣＳ未処理におけるＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を１００としたときの各条件でのＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対値で表している。また、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はＭＣＳ未処理の細胞である。
【0069】
図４Ａ及び図４Ｂから、１５分間以上３０分間以上の電流処理時間、３００μＡ以上４００μＡ以下の電流値が、Ｐｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を特に増加させることが明らかとなった。この結果から、以降では、１５分間の電流処理時間、３００μＡの電流値を至適条件として試験を行った。
【0070】
［実施例３］
（時計遺伝子群のｍＲＮＡ発現量に及ぼすＭＣＳの影響）
次いで、実施例２で特定した至適条件でのＰｅｒ１遺伝子以外の時計遺伝子のｍＲＮＡ発現量に及ぼす影響を検討した。具体的には、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性野生型マウスの脳由来アストロサイトにＭＣＳ（３００μＡ、４００Ｈｚ、１５分間）を行い、ＭＣＳ終了直後の各時計遺伝子群のｍＲＮＡ発現量を、リアルタイムＰＣＲ法を用いて測定した。結果を図５に示す。図５において、ＭＣＳ未処理の各時計遺伝子のｍＲＮＡ発現量を１００としたときのＭＣＳ処理した各時計遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対値で表している。また、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はＭＣＳ未処理の細胞である。
（時計遺伝子群のｍＲＮＡ発現量に及ぼすＭＣＳの影響）
次いで、実施例２で特定した至適条件でのＰｅｒ１遺伝子以外の時計遺伝子のｍＲＮＡ発現量に及ぼす影響を検討した。具体的には、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性野生型マウスの脳由来アストロサイトにＭＣＳ（３００μＡ、４００Ｈｚ、１５分間）を行い、ＭＣＳ終了直後の各時計遺伝子群のｍＲＮＡ発現量を、リアルタイムＰＣＲ法を用いて測定した。結果を図５に示す。図５において、ＭＣＳ未処理の各時計遺伝子のｍＲＮＡ発現量を１００としたときのＭＣＳ処理した各時計遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対値で表している。また、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はＭＣＳ未処理の細胞である。
【0071】
図５から、ＭＣＳはＰｅｒ１遺伝子のみ発現を誘導し、その他の時計遺伝子には影響を及ぼさないことが明らかとなった（Ｐ＜０．０１）。
【0072】
［実施例４］
（Ｐｅｒ１遺伝子のプロモーターに存在するＣＲＥＢ結合領域を介した転写活性に及ぼすＭＣＳの影響）
ＭＣＳによるＰｅｒ１遺伝子の転写活性化の機構を解明するために、プロモーター領域の配列を探索した結果、カルシウムイオンやｃＡＭＰ等の刺激により活性化するＣＲＥＢ応答配列（配列番号１５：ＴＧＡＣＧＴＣＡ）が存在することが確認された。そこで、Ｐｅｒ１遺伝子のＣＲＥＢ応答配列を介した転写活性に及ぼすＭＣＳの影響を検討した。具体的には、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性野生型マウスの脳由来アストロサイトに、Ｐｅｒｉｏｄ１（Ｐｅｒ１）遺伝子のプロモーター下流にルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだベクターをトランスフェクションして、Ｐｅｒ１：：ｌｕｃアストロサイトを作製した後、ＭＣＳを行い、ルシフェラーゼ活性を測定した（図６Ａ参照）。このとき、ＣＲＥＢ応答配列（配列番号１５）を含むＰｅｒ１遺伝子（Ｐｅｒ１ ＣＲＥ（－１８００））と、ＣＲＥＢ応答配列を含まないＰｅｒ１遺伝子（Ｐｅｒ１（－１４００））とを使用して、Ｐｅｒ１：：ｌｕｃアストロサイトを作製した（図６Ｂ参照）。結果を図６Ｃに示す。
（Ｐｅｒ１遺伝子のプロモーターに存在するＣＲＥＢ結合領域を介した転写活性に及ぼすＭＣＳの影響）
ＭＣＳによるＰｅｒ１遺伝子の転写活性化の機構を解明するために、プロモーター領域の配列を探索した結果、カルシウムイオンやｃＡＭＰ等の刺激により活性化するＣＲＥＢ応答配列（配列番号１５：ＴＧＡＣＧＴＣＡ）が存在することが確認された。そこで、Ｐｅｒ１遺伝子のＣＲＥＢ応答配列を介した転写活性に及ぼすＭＣＳの影響を検討した。具体的には、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性野生型マウスの脳由来アストロサイトに、Ｐｅｒｉｏｄ１（Ｐｅｒ１）遺伝子のプロモーター下流にルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだベクターをトランスフェクションして、Ｐｅｒ１：：ｌｕｃアストロサイトを作製した後、ＭＣＳを行い、ルシフェラーゼ活性を測定した（図６Ａ参照）。このとき、ＣＲＥＢ応答配列（配列番号１５）を含むＰｅｒ１遺伝子（Ｐｅｒ１ ＣＲＥ（－１８００））と、ＣＲＥＢ応答配列を含まないＰｅｒ１遺伝子（Ｐｅｒ１（－１４００））とを使用して、Ｐｅｒ１：：ｌｕｃアストロサイトを作製した（図６Ｂ参照）。結果を図６Ｃに示す。
【0073】
図６Ｃから、ＭＣＳはＰｅｒ１遺伝子のプロモーター領域に存在するＣＲＥＢ応答配列を介して、Ｐｅｒ１遺伝子を発現誘導することが明らかとなった（Ｐ＜０．００１）。
【0074】
［実施例５］
（マウス肝臓に対するＭＣＳの処理開始時刻の影響）
上記のインビトロ系の試験で明らかとなったＭＣＳ条件（３００μＡ、４００Ｈｚ、１５分間）を用いて、マウス肝臓を対象としたインビボ系でのＰｅｒ１遺伝子の発現の変化を検討した。マウス肝臓において、Ｐｅｒ１遺伝子は明期前半にトラフ、暗期前半にピークとなる概日リズムを示し、時刻によってＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量は大きく異なることが知られている。Ｐｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡの発現リズムは時計遺伝子のフィードバックループを始め、いくつかの転写因子の活性化リズムによって制御されており、また、光刺激等に反応する時刻が限定されていることも報告されている。これらのことから、本発明者らは、ＭＣＳに対するＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現の応答に時刻差が生じる可能性があると考えた。Ｐｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現に最も影響の大きいＭＣＳの処理開始時刻を明らかにすることを目的として、異なる時刻（ＺＴ２［９：００］、ＺＴ６［１３：００］、ＺＴ１０［１７：００］、ＺＴ１４［２１：００］、ＺＴ１８［１：００］及びＺＴ２２［５：００］）にて野生型マウス腹部にＭＣＳを行い（図７Ａ参照）、ＭＣＳ直後の肝臓中のＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を測定した。結果を図７Ｂ及び図７Ｃに示す。図７Ｂにおいて、各条件でのＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量は、β－アクチン遺伝子のｍＲＮＡ発現量で標準化された値である。図７Ｃでは、各処理開始時刻におけるＣｏｎｔｒｏｌ（ＭＣＳ未処理の場合）でのＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を１００としたときの各処理開始時刻におけるＭＣＳ処理した場合でのＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対値で表している。図７Ｂ及び図７Ｃにおいて、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はＭＣＳ未処理のマウス群である。以下、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と称する場合がある。
（マウス肝臓に対するＭＣＳの処理開始時刻の影響）
上記のインビトロ系の試験で明らかとなったＭＣＳ条件（３００μＡ、４００Ｈｚ、１５分間）を用いて、マウス肝臓を対象としたインビボ系でのＰｅｒ１遺伝子の発現の変化を検討した。マウス肝臓において、Ｐｅｒ１遺伝子は明期前半にトラフ、暗期前半にピークとなる概日リズムを示し、時刻によってＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量は大きく異なることが知られている。Ｐｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡの発現リズムは時計遺伝子のフィードバックループを始め、いくつかの転写因子の活性化リズムによって制御されており、また、光刺激等に反応する時刻が限定されていることも報告されている。これらのことから、本発明者らは、ＭＣＳに対するＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現の応答に時刻差が生じる可能性があると考えた。Ｐｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現に最も影響の大きいＭＣＳの処理開始時刻を明らかにすることを目的として、異なる時刻（ＺＴ２［９：００］、ＺＴ６［１３：００］、ＺＴ１０［１７：００］、ＺＴ１４［２１：００］、ＺＴ１８［１：００］及びＺＴ２２［５：００］）にて野生型マウス腹部にＭＣＳを行い（図７Ａ参照）、ＭＣＳ直後の肝臓中のＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を測定した。結果を図７Ｂ及び図７Ｃに示す。図７Ｂにおいて、各条件でのＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量は、β－アクチン遺伝子のｍＲＮＡ発現量で標準化された値である。図７Ｃでは、各処理開始時刻におけるＣｏｎｔｒｏｌ（ＭＣＳ未処理の場合）でのＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を１００としたときの各処理開始時刻におけるＭＣＳ処理した場合でのＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対値で表している。図７Ｂ及び図７Ｃにおいて、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はＭＣＳ未処理のマウス群である。以下、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と称する場合がある。
【0075】
図７Ｂ及び図７Ｃから、ＺＴ２［９：００］におけるＭＣＳにより、Ｐｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量が有意に上昇することが明らかとなり（Ｐ＜０．０１）、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較した上昇率もＺＴ２［９：００］においてＭＣＳ処理したマウス群が最も高かった。
【0076】
以上の結果から、以降のインビボ系の試験では、ＺＴ２［９：００］にＭＣＳを行うこととした。
【0077】
［実施例６］
（マウス肝臓中のＰｅｒ１遺伝子の発現リズムに対する腹部ＭＣＳの影響）
インビトロ系において明らかとなったＭＣＳ条件（３００μＡ、４００Ｈｚ、１５分間）がマウス肝臓中のＰｅｒ１遺伝子の発現リズムに及ぼす影響を検討した。具体的には、ＷＴマウスの腹部に対して、ＺＴ２［９：００］にＭＣＳを行い、刺激直後（０分後）から１２０分後までのＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量の経時的変化（図８Ａ参照）を測定した。結果を図８Ｂに示す。図８Ｂでは、ＭＣＳ直後（０分後）でのＭＣＳ未処理のマウス肝臓細胞（コントロール）のＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を１００としたときの各時間経過後でのＭＣＳ処理した又は未処理のマウス肝臓細胞のＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対値で表している。
（マウス肝臓中のＰｅｒ１遺伝子の発現リズムに対する腹部ＭＣＳの影響）
インビトロ系において明らかとなったＭＣＳ条件（３００μＡ、４００Ｈｚ、１５分間）がマウス肝臓中のＰｅｒ１遺伝子の発現リズムに及ぼす影響を検討した。具体的には、ＷＴマウスの腹部に対して、ＺＴ２［９：００］にＭＣＳを行い、刺激直後（０分後）から１２０分後までのＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量の経時的変化（図８Ａ参照）を測定した。結果を図８Ｂに示す。図８Ｂでは、ＭＣＳ直後（０分後）でのＭＣＳ未処理のマウス肝臓細胞（コントロール）のＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を１００としたときの各時間経過後でのＭＣＳ処理した又は未処理のマウス肝臓細胞のＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対値で表している。
【0078】
図８Ｂから、ＭＣＳから３０分後付近でＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量が上昇しており（Ｐ＜０．０１）、その発現上昇は３０分以降も継続する傾向が認められた。
【0079】
次いで、ＭＣＳから１２０分以降（図９Ａ参照；ＺＴ２～ＺＴ２２は上記図７Ａと同様）についても肝臓中Ｐｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を測定し、その発現の概日リズムをＭＣＳ未処理のマウス群（Ｃｏｎｔｒｏｌ群）と比較した。結果を図９Ｂに示す。
【0080】
図９Ｂから、ＭＣＳ処理したマウス群（ＭＣＳ群）では、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較して、有意な発現リズムの位相前進と振幅増大が認められた。
【0081】
［実施例７］
（Ｃｌｏｃｋ改変マウスの肝臓中Ｐｅｒ１遺伝子の発現リズムに対するＭＣＳの影響）
Ｃｌｏｃｋ改変マウス（Ｃｌｋ／Ｃｌｋマウス）は、ＣＬＯＣＫ／ＢＭＡＬ１複合体の応答配列であるＥ－ｂｏｘを介した転写活性が消失しており、概日リズム障害モデルとして一般的に用いられている。また、Ｐｅｒ１遺伝子の上流には複数のＥ－ｂｏｘが存在するため、Ｃｌｋ／ＣｌｋマウスにおけるＰｅｒ１遺伝子の発現リズムの振幅は著しく低下していることが報告されている。そこで、Ｃｌｋ／Ｃｌｋマウスに対して腹部ＭＣＳを行い（図１０Ａ参照）、肝臓中Ｐｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量の概日リズムを測定した。結果を図１０Ｂに示す。図１０Ｂでは、各群のＺＴ２時点でのＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を１としたときの各群の各時刻でのＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対値で表している。また、「ＭＣＳ（Ｃｌｋ／Ｃｌｋ）」はＭＣＳ処理を行ったＣｌｋ／Ｃｌｋマウス群（ＭＣＳ群）、「Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｃｌｋ／Ｃｌｋ）」はＭＣＳ未処理のＣｌｋ／Ｃｌｋマウス群（Ｃｏｎｔｒｏｌ群）、「Ｉｎｔａｃｔ（ＷＴ）」はＭＣＳ未処理の野生型マウス群（Ｉｎｔａｃｔ群）である。
（Ｃｌｏｃｋ改変マウスの肝臓中Ｐｅｒ１遺伝子の発現リズムに対するＭＣＳの影響）
Ｃｌｏｃｋ改変マウス（Ｃｌｋ／Ｃｌｋマウス）は、ＣＬＯＣＫ／ＢＭＡＬ１複合体の応答配列であるＥ－ｂｏｘを介した転写活性が消失しており、概日リズム障害モデルとして一般的に用いられている。また、Ｐｅｒ１遺伝子の上流には複数のＥ－ｂｏｘが存在するため、Ｃｌｋ／ＣｌｋマウスにおけるＰｅｒ１遺伝子の発現リズムの振幅は著しく低下していることが報告されている。そこで、Ｃｌｋ／Ｃｌｋマウスに対して腹部ＭＣＳを行い（図１０Ａ参照）、肝臓中Ｐｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量の概日リズムを測定した。結果を図１０Ｂに示す。図１０Ｂでは、各群のＺＴ２時点でのＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を１としたときの各群の各時刻でのＰｅｒ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対値で表している。また、「ＭＣＳ（Ｃｌｋ／Ｃｌｋ）」はＭＣＳ処理を行ったＣｌｋ／Ｃｌｋマウス群（ＭＣＳ群）、「Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｃｌｋ／Ｃｌｋ）」はＭＣＳ未処理のＣｌｋ／Ｃｌｋマウス群（Ｃｏｎｔｒｏｌ群）、「Ｉｎｔａｃｔ（ＷＴ）」はＭＣＳ未処理の野生型マウス群（Ｉｎｔａｃｔ群）である。
【0082】
図１０Ｂから、ＭＣＳ群では、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較して有意な概日リズムの変化及び振幅増大が認められた。さらに、ＭＣＳ群の肝臓中Ｐｅｒ１遺伝子の発現リズムとＩｎｔａｃｔ群の肝臓中Ｐｅｒ１遺伝子の発現リズムとを比較したところ、有意差は認められなかった。
これらのことから、ＭＣＳは概日リズム障害を有するマウスのＰｅｒ１遺伝子の発現リズムを正常時と同程度まで回復させる、すなわち、Ｐｅｒ１遺伝子の発現を活性化させることが示唆された。また、当該結果は、従来の光や食事による治療法と比較して、より正常時のＰｅｒ１遺伝子の発現リズムの振幅に近い結果であり（図１０Ｂ参照）、より高い治療効果が得られていると推察された。
これらのことから、ＭＣＳは概日リズム障害を有するマウスのＰｅｒ１遺伝子の発現リズムを正常時と同程度まで回復させる、すなわち、Ｐｅｒ１遺伝子の発現を活性化させることが示唆された。また、当該結果は、従来の光や食事による治療法と比較して、より正常時のＰｅｒ１遺伝子の発現リズムの振幅に近い結果であり（図１０Ｂ参照）、より高い治療効果が得られていると推察された。
【0083】
［実施例８］
（野生型マウス及びＣｌｏｃｋ改変マウスの行動リズムに及ぼすＭＣＳの影響）
インビトロ系において明らかとなったＭＣＳ条件（３００μＡ、４００Ｈｚ、１５分間）が野生型マウス及びＣｌｏｃｋ改変マウスの行動リズムに及ぼす影響を検討した。１週間明暗条件下（明期：７：００～１９：００）で飼育後、恒暗（ＤＤ）条件下で１週間飼育したマウスを対象に麻酔下でＭＣＳを行った（図１１Ａ及び図１２Ａ参照、ＺＴ０［７：００］にＭＣＳ行った）。行動リズムを図１１Ｂ（野生型マウス）及び図１２Ｂ（Ｃｌｏｃｋ改変マウス）に示す。また、図１１Ｂ～図１１Ｄ及び図１２Ｂ～図１２Ｄにおいて、「Ｎｏｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」は麻酔、除毛及びＭＣＳ未処理のマウス群（未処理群）、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は麻酔及び除毛処理を行ったが、ＭＣＳ未処理のマウス群（Ｃｏｎｔｒｏｌ群）、「ＭＣＳ」は麻酔、除毛及びＭＣＳ処理を行ったマウス群（ＭＣＳ群）である。
（野生型マウス及びＣｌｏｃｋ改変マウスの行動リズムに及ぼすＭＣＳの影響）
インビトロ系において明らかとなったＭＣＳ条件（３００μＡ、４００Ｈｚ、１５分間）が野生型マウス及びＣｌｏｃｋ改変マウスの行動リズムに及ぼす影響を検討した。１週間明暗条件下（明期：７：００～１９：００）で飼育後、恒暗（ＤＤ）条件下で１週間飼育したマウスを対象に麻酔下でＭＣＳを行った（図１１Ａ及び図１２Ａ参照、ＺＴ０［７：００］にＭＣＳ行った）。行動リズムを図１１Ｂ（野生型マウス）及び図１２Ｂ（Ｃｌｏｃｋ改変マウス）に示す。また、図１１Ｂ～図１１Ｄ及び図１２Ｂ～図１２Ｄにおいて、「Ｎｏｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」は麻酔、除毛及びＭＣＳ未処理のマウス群（未処理群）、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は麻酔及び除毛処理を行ったが、ＭＣＳ未処理のマウス群（Ｃｏｎｔｒｏｌ群）、「ＭＣＳ」は麻酔、除毛及びＭＣＳ処理を行ったマウス群（ＭＣＳ群）である。
【0084】
図１１Ｂ～図１１Ｄ及び図１２Ｂ～図１２Ｄから、野生型マウス及びＣｌｏｃｋ改変マウス共に麻酔により行動リズムが変化したが（Ｃｏｎｔｒｏｌ群）、ＭＣＳ群では未処理群と同じ行動リズムを示した。なお、麻酔により体内時計が乱れることが知られており、臨床上でも問題となっている。
以上の結果から、ＭＣＳにより行動リズムが操作でき、また麻酔による概日リズム障害が改善されることが明らかになった。また、ＭＣＳにより、ジェットラグや夜間のシフト勤務等で生じる概日リズム障害への改善効果も期待できる。
以上の結果から、ＭＣＳにより行動リズムが操作でき、また麻酔による概日リズム障害が改善されることが明らかになった。また、ＭＣＳにより、ジェットラグや夜間のシフト勤務等で生じる概日リズム障害への改善効果も期待できる。
【0085】
［実施例９］
（マウス肝臓中のリン酸化ＣＲＥＢの発現リズムに対する腹部ＭＣＳの影響）
インビトロ系での検討により、ＭＣＳによるＰｅｒ１遺伝子の発現誘導は、Ｐｅｒ１遺伝子のプロモーター領域に存在するＣＲＥＢ応答配列を介したものであることが明らかとなった。インビボ系においても同様に、Ｐｅｒ１遺伝子の発現誘導がＣＲＥＢ応答配列を介したものであるかについて確認することを目的として、ＭＣＳ条件（３００μＡ、４００Ｈｚ、１５分間）を野生型マウスの腹部に行い、マウス肝臓中のリン酸化ＣＲＥＢ（ｐＣＲＥＢ）タンパク質の発現量を測定した。結果を図１３Ａ及び図１３Ｂに示す。図１３Ａにおいて、「ｐＣＲＥＢ」はリン酸化ＣＲＥＢ、「ＣＲＥＢ」はリン酸化及び未リン酸化ＣＲＥＢ、「ｐｏｌ２」はＲＮＡポリメラーゼＩＩである。また、図１３Ａ及び図１３Ｂにおいて、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はＭＣＳ未処理の野生型マウス群（Ｃｏｎｔｒｏｌ群）、「ＭＣＳ」はＭＣＳ処理の野生型マウス群（ＭＣＳ群）である。
（マウス肝臓中のリン酸化ＣＲＥＢの発現リズムに対する腹部ＭＣＳの影響）
インビトロ系での検討により、ＭＣＳによるＰｅｒ１遺伝子の発現誘導は、Ｐｅｒ１遺伝子のプロモーター領域に存在するＣＲＥＢ応答配列を介したものであることが明らかとなった。インビボ系においても同様に、Ｐｅｒ１遺伝子の発現誘導がＣＲＥＢ応答配列を介したものであるかについて確認することを目的として、ＭＣＳ条件（３００μＡ、４００Ｈｚ、１５分間）を野生型マウスの腹部に行い、マウス肝臓中のリン酸化ＣＲＥＢ（ｐＣＲＥＢ）タンパク質の発現量を測定した。結果を図１３Ａ及び図１３Ｂに示す。図１３Ａにおいて、「ｐＣＲＥＢ」はリン酸化ＣＲＥＢ、「ＣＲＥＢ」はリン酸化及び未リン酸化ＣＲＥＢ、「ｐｏｌ２」はＲＮＡポリメラーゼＩＩである。また、図１３Ａ及び図１３Ｂにおいて、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はＭＣＳ未処理の野生型マウス群（Ｃｏｎｔｒｏｌ群）、「ＭＣＳ」はＭＣＳ処理の野生型マウス群（ＭＣＳ群）である。
【0086】
図１３Ａ及び図１３Ｂから、ＭＣＳ処理により、核内のリン酸化ＣＲＥＢの発現リズムが変容し、その傾向はＰｅｒ１遺伝子の発現リズムと対応していた。
以上の結果から、ＭＣＳによるＰｅｒ１遺伝子の発現誘導は、ＣＲＥＢのリン酸化を介した経路が活性化することで生じる可能性が示唆された。
以上の結果から、ＭＣＳによるＰｅｒ１遺伝子の発現誘導は、ＣＲＥＢのリン酸化を介した経路が活性化することで生じる可能性が示唆された。
【0087】
時計遺伝子のフィードバックループの起点は、Ｐｅｒ１遺伝子の発現上昇であることが知られており、光照射療法等の光による応答もＰｅｒ１遺伝子の発現上昇が起点となることが報告されている。ＭＣＳ直後にＰｅｒ１遺伝子の発現上昇が認められ（図８Ｂ参照）、更にその発現がＰｅｒ１遺伝子選択的であることから（図５参照）、ＭＣＳは生体が元来持つ概日リズム制御機構と同じ経路を活性化していると推察された。
【0088】
また、ＭＣＳが時計遺伝子群に対してＰｅｒ１遺伝子選択的に作用していた理由の一つとして、Ｐｅｒ１遺伝子上流に選択的に作用する因子である、ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ応答配列結合タンパク質）が挙げられる。Ｐｅｒ１遺伝子の上流にはＣＲＥＢ応答配列が存在し、光同調によるＰｅｒ１遺伝子の発現上昇は主にＣＲＥＢ応答配列に対するリン酸化ＣＲＥＢの結合によって引き起こされることが報告されている。さらに、ＣＲＥＢのリン酸化やその上流に位置するＥＲＫ（細胞外シグナル調節キナーゼ）及びＭＡＰＫ（分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ）は、細胞内ｃＡＭＰやカルシウムイオン濃度の増加によって活性化されることが知られている。また、ＭＣＳにより、細胞内ｃＡＭＰやカルシウムイオン濃度が上昇することが報告されている。これらのことから、ＭＣＳは、細胞内ｃＡＭＰやカルシウムイオン濃度等のセカンドメッセンジャーを介したＣＲＥＢの活性化（リン酸化）により、Ｐｅｒ１遺伝子の発現を誘導し、体内時計の同調に影響を及ぼしていると推察された。
【0089】
時計遺伝子は、時計遺伝子同士のみでなく、他の遺伝子の発現にも影響を及ぼすことで、肝臓、腎臓等の各末梢組織固有の様々な生理現象に概日リズムを生じさせることが報告されている。よって、ＭＣＳによるＰｅｒ１遺伝子の発現リズムの活性化によって、肝臓に限らず様々な臓器における生理現象の概日リズムも活性化できるものと考えられる。
【0090】
よって、ＭＣＳを用いた体内時計活性化療法は、麻酔を伴う手術、老年医療、様々な疾患の予防及び治療、健康増進等の幅広い分野への応用が期待される。
【0091】
［実施例１０］
（マウス肝臓の糖代謝を促進する遺伝子の発現リズムに対するＭＣＳの影響）
インビトロ系において明らかとなったＭＣＳ条件（３００μＡ、４００Ｈｚ、１５分間）がマウス肝臓の糖代謝を促進する遺伝子の発現リズムに及ぼす影響を検討した。具体的には、７週齢の野生型マウス及びＣｌｏｃｋ改変マウスに、１回（ＺＴ２［９：００］）、ＭＣＳを行い、その後、肝臓の糖代謝の促進に関連する遺伝子（Glucokinase （Ｇｃｋ）遺伝子、Phosphoenolpyruvate carboxykinase 1 (Ｐｃｋ１)遺伝子、Peroxisome Proliferator-Activated Receptor α (Ｐｐａｒα)遺伝子、Peroxisome Proliferator-Activated Receptor γ (Ｐｐａｒγ)遺伝子）のｍＲＮＡの発現量の経時的変化を測定した。結果を図１４Ａ（野生型マウス）及び図１４Ｂ（Ｃｌｏｃｋ改変マウス）に示す。図１４Ａでは、ＭＣＳ直後（０分後）でのＭＣＳ未処理の野生型マウス肝臓細胞（コントロール群）の各遺伝子のｍＲＮＡ発現量を１００としたときの各時間経過後でのＭＣＳ処理した野生型マウス肝臓細胞（ＭＣＳ群）又は未処理の野生型マウス肝臓細胞（コントロール群）の各遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対値で表している。図１４Ｂでは、ＭＣＳ直後（０分後）でのＭＣＳ未処理のＣｌｏｃｋ改変マウス肝臓細胞（コントロール）の各遺伝子のｍＲＮＡ発現量を１００としたときの各時間経過後でのＭＣＳ処理したＣｌｏｃｋ改変マウス肝臓細胞（ＭＣＳ群）又は未処理のＣｌｏｃｋ改変マウス肝臓細胞（コントロール群）の各遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対値で表している。ｍＲＮＡ発現量の測定のためのサンプリングを、ＭＣＳから２、４、８、１２、１６、２０時間後（ＺＴ４、ＺＴ６、ＺＴ１０、ＺＴ１４、ＺＴ１８、ＺＴ２２）に行った。
（マウス肝臓の糖代謝を促進する遺伝子の発現リズムに対するＭＣＳの影響）
インビトロ系において明らかとなったＭＣＳ条件（３００μＡ、４００Ｈｚ、１５分間）がマウス肝臓の糖代謝を促進する遺伝子の発現リズムに及ぼす影響を検討した。具体的には、７週齢の野生型マウス及びＣｌｏｃｋ改変マウスに、１回（ＺＴ２［９：００］）、ＭＣＳを行い、その後、肝臓の糖代謝の促進に関連する遺伝子（Glucokinase （Ｇｃｋ）遺伝子、Phosphoenolpyruvate carboxykinase 1 (Ｐｃｋ１)遺伝子、Peroxisome Proliferator-Activated Receptor α (Ｐｐａｒα)遺伝子、Peroxisome Proliferator-Activated Receptor γ (Ｐｐａｒγ)遺伝子）のｍＲＮＡの発現量の経時的変化を測定した。結果を図１４Ａ（野生型マウス）及び図１４Ｂ（Ｃｌｏｃｋ改変マウス）に示す。図１４Ａでは、ＭＣＳ直後（０分後）でのＭＣＳ未処理の野生型マウス肝臓細胞（コントロール群）の各遺伝子のｍＲＮＡ発現量を１００としたときの各時間経過後でのＭＣＳ処理した野生型マウス肝臓細胞（ＭＣＳ群）又は未処理の野生型マウス肝臓細胞（コントロール群）の各遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対値で表している。図１４Ｂでは、ＭＣＳ直後（０分後）でのＭＣＳ未処理のＣｌｏｃｋ改変マウス肝臓細胞（コントロール）の各遺伝子のｍＲＮＡ発現量を１００としたときの各時間経過後でのＭＣＳ処理したＣｌｏｃｋ改変マウス肝臓細胞（ＭＣＳ群）又は未処理のＣｌｏｃｋ改変マウス肝臓細胞（コントロール群）の各遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対値で表している。ｍＲＮＡ発現量の測定のためのサンプリングを、ＭＣＳから２、４、８、１２、１６、２０時間後（ＺＴ４、ＺＴ６、ＺＴ１０、ＺＴ１４、ＺＴ１８、ＺＴ２２）に行った。
【0092】
【0093】
［実施例１１］
（野生型加齢マウスの行動リズムに及ぼすＭＣＳの影響）
インビトロ系において明らかとなったＭＣＳ条件（３００μＡ、４００Ｈｚ、１５分間）が野生型加齢マウスの行動に及ぼす影響を検討した。具体的には、３８週齢の野生型加齢マウスに８週間、週に１回（ＺＴ２［９：００］）にＭＣＳを行い、その後、行動解析を赤外線センサにより測定した。結果を図１５Ａ（行動リズム）及び図１５Ｂ（自発運動活性）に示す。図１５Ａ及び図１５Ｂにおいて、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はＭＣＳ未処理の野生型加齢マウス群を示し、「ＭＣＳ」は、ＭＣＳ処理した野生型加齢マウス群を示す。
（野生型加齢マウスの行動リズムに及ぼすＭＣＳの影響）
インビトロ系において明らかとなったＭＣＳ条件（３００μＡ、４００Ｈｚ、１５分間）が野生型加齢マウスの行動に及ぼす影響を検討した。具体的には、３８週齢の野生型加齢マウスに８週間、週に１回（ＺＴ２［９：００］）にＭＣＳを行い、その後、行動解析を赤外線センサにより測定した。結果を図１５Ａ（行動リズム）及び図１５Ｂ（自発運動活性）に示す。図１５Ａ及び図１５Ｂにおいて、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はＭＣＳ未処理の野生型加齢マウス群を示し、「ＭＣＳ」は、ＭＣＳ処理した野生型加齢マウス群を示す。
【0094】
図１５Ａ及び図１５Ｂから、ＭＣＳ未処理の野生型加齢マウスの行動リズムは、乱れており、周期性を失っていた。一方で、ＭＣＳ処理した野生型加齢マウスでは、周期性（約１２時間周期の活動休息リズム）が保持されていた。
【0095】
［実施例１２］
（野生型加齢マウス及びＣｌｏｃｋ改変加齢マウスの認知記憶機能に及ぼすＭＣＳの影響）
インビトロ系において明らかとなったＭＣＳ条件（３００μＡ、４００Ｈｚ、１５分間）が野生型加齢マウス及びＣｌｏｃｋ改変加齢マウスの認知記憶機能に及ぼす影響を検討した。具体的には、３８週齢の野生型加齢マウス及びＣｌｏｃｋ改変加齢マウスに８週間、週に１回（ＺＴ２［９：００］）にＭＣＳを行い、その後、パッシブアボイダンステストを行い、認知記憶機能を測定した。結果を図１６に示す。図１６において、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はＭＣＳ未処理の野生型加齢マウス群又はＣｌｏｃｋ改変加齢マウス群を示し、「ＭＣＳ」は、ＭＣＳ処理した野生型加齢マウス群又はＣｌｏｃｋ改変加齢マウス群を示す。
（野生型加齢マウス及びＣｌｏｃｋ改変加齢マウスの認知記憶機能に及ぼすＭＣＳの影響）
インビトロ系において明らかとなったＭＣＳ条件（３００μＡ、４００Ｈｚ、１５分間）が野生型加齢マウス及びＣｌｏｃｋ改変加齢マウスの認知記憶機能に及ぼす影響を検討した。具体的には、３８週齢の野生型加齢マウス及びＣｌｏｃｋ改変加齢マウスに８週間、週に１回（ＺＴ２［９：００］）にＭＣＳを行い、その後、パッシブアボイダンステストを行い、認知記憶機能を測定した。結果を図１６に示す。図１６において、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はＭＣＳ未処理の野生型加齢マウス群又はＣｌｏｃｋ改変加齢マウス群を示し、「ＭＣＳ」は、ＭＣＳ処理した野生型加齢マウス群又はＣｌｏｃｋ改変加齢マウス群を示す。
【0096】
図１６から、ＭＣＳ未処理の野生型加齢マウスの認知記憶機能は、ＭＣＳにより若干改善された。一方で、ＭＣＳ未処理のＣｌｏｃｋ改変加齢マウスの認知記憶機能は、野生型と比較し顕著に低下し、ＭＣＳにより劇的に改善した。
【0097】
［実施例１３］
（野生型加齢マウス及びＣｌｏｃｋ改変加齢マウスの抗老化遺伝子Ｓｉｒｔ１遺伝子の発現量に及ぼすＭＣＳの影響）
インビトロ系において明らかとなったＭＣＳ条件（３００μＡ、４００Ｈｚ、１５分間）が野生型加齢マウス及びＣｌｏｃｋ改変加齢マウスの抗老化遺伝子Ｓｉｒｔ１遺伝子の発現量に及ぼす影響を検討した。具体的には、３８週齢の野生型加齢マウス及びＣｌｏｃｋ改変加齢マウスに８週間、週に１回（ＺＴ２［９：００］）にＭＣＳを行い、その後、各マウスの肝臓細胞での若返りの遺伝子と呼ばれる抗老化遺伝子Ｓｉｒｔ１遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した。結果を図１７Ａ（野生型加齢マウス）及び図１７Ｂ（Ｃｌｏｃｋ改変加齢マウス）に示す。図１７Ａにおいて、「Ｉｎｔａｃｔ」とは、ＭＣＳ未処理の野生型マウス群を示し、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はＭＣＳ未処理の野生型加齢マウス群を示し、「ＭＣＳ」は、ＭＣＳ処理した野生型加齢マウス群を示す。図１７Ａでは、Ｃｏｎｔｒｏｌ群（ＭＣＳ未処理の野生型加齢マウス）の肝臓細胞でのＳｉｒｔ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を１００としたときのＭＣＳ群（ＭＣＳ処理した野生型加齢マウス）の肝臓細胞でのＳｉｒｔ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対値で表している。図１７Ｂにおいて、「Ｉｎｔａｃｔ」とは、ＭＣＳ未処理の野生型マウス群を示し、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はＭＣＳ未処理のＣｌｏｃｋ改変加齢マウス群を示し、「ＭＣＳ」は、ＭＣＳ処理したＣｌｏｃｋ改変加齢マウス群を示す。図１７Ｂでは、Ｃｏｎｔｒｏｌ群（ＭＣＳ未処理のＣｌｏｃｋ改変加齢マウス）の肝臓細胞でのＳｉｒｔ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を１００としたときのＭＣＳ群（ＭＣＳ処理したＣｌｏｃｋ改変加齢マウス）の肝臓細胞でのＳｉｒｔ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対値で表している。
（野生型加齢マウス及びＣｌｏｃｋ改変加齢マウスの抗老化遺伝子Ｓｉｒｔ１遺伝子の発現量に及ぼすＭＣＳの影響）
インビトロ系において明らかとなったＭＣＳ条件（３００μＡ、４００Ｈｚ、１５分間）が野生型加齢マウス及びＣｌｏｃｋ改変加齢マウスの抗老化遺伝子Ｓｉｒｔ１遺伝子の発現量に及ぼす影響を検討した。具体的には、３８週齢の野生型加齢マウス及びＣｌｏｃｋ改変加齢マウスに８週間、週に１回（ＺＴ２［９：００］）にＭＣＳを行い、その後、各マウスの肝臓細胞での若返りの遺伝子と呼ばれる抗老化遺伝子Ｓｉｒｔ１遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した。結果を図１７Ａ（野生型加齢マウス）及び図１７Ｂ（Ｃｌｏｃｋ改変加齢マウス）に示す。図１７Ａにおいて、「Ｉｎｔａｃｔ」とは、ＭＣＳ未処理の野生型マウス群を示し、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はＭＣＳ未処理の野生型加齢マウス群を示し、「ＭＣＳ」は、ＭＣＳ処理した野生型加齢マウス群を示す。図１７Ａでは、Ｃｏｎｔｒｏｌ群（ＭＣＳ未処理の野生型加齢マウス）の肝臓細胞でのＳｉｒｔ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を１００としたときのＭＣＳ群（ＭＣＳ処理した野生型加齢マウス）の肝臓細胞でのＳｉｒｔ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対値で表している。図１７Ｂにおいて、「Ｉｎｔａｃｔ」とは、ＭＣＳ未処理の野生型マウス群を示し、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はＭＣＳ未処理のＣｌｏｃｋ改変加齢マウス群を示し、「ＭＣＳ」は、ＭＣＳ処理したＣｌｏｃｋ改変加齢マウス群を示す。図１７Ｂでは、Ｃｏｎｔｒｏｌ群（ＭＣＳ未処理のＣｌｏｃｋ改変加齢マウス）の肝臓細胞でのＳｉｒｔ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を１００としたときのＭＣＳ群（ＭＣＳ処理したＣｌｏｃｋ改変加齢マウス）の肝臓細胞でのＳｉｒｔ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対値で表している。
【0098】
【0099】
［実施例１４］
（野生型加齢マウスの皮膚でのアクアポリン３遺伝子の発現量に及ぼすＭＣＳの影響）
インビトロ系において明らかとなったＭＣＳ条件（３００μＡ、４００Ｈｚ、１５分間）が野生型加齢マウスの皮膚でのアクアポリン３（Ａｑｐ３）遺伝子の発現量に及ぼす影響を検討した。具体的には、３８週齢の野生型加齢マウスに８週間、週に１回（ＺＴ２［９：００］）にＭＣＳを行い、その後、皮膚でのＡｑｐ３遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した。結果を図１８に示す。図１８では、Ｃｏｎｔｒｏｌ群（ＭＣＳ未処理の野生型マウス）の皮膚でのＡｑｐ３遺伝子のｍＲＮＡ発現量を１としたときのＭＣＳ群（ＭＣＳ処理した野生型マウス）の皮膚でのＡｑｐ３遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対値で表している。
（野生型加齢マウスの皮膚でのアクアポリン３遺伝子の発現量に及ぼすＭＣＳの影響）
インビトロ系において明らかとなったＭＣＳ条件（３００μＡ、４００Ｈｚ、１５分間）が野生型加齢マウスの皮膚でのアクアポリン３（Ａｑｐ３）遺伝子の発現量に及ぼす影響を検討した。具体的には、３８週齢の野生型加齢マウスに８週間、週に１回（ＺＴ２［９：００］）にＭＣＳを行い、その後、皮膚でのＡｑｐ３遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した。結果を図１８に示す。図１８では、Ｃｏｎｔｒｏｌ群（ＭＣＳ未処理の野生型マウス）の皮膚でのＡｑｐ３遺伝子のｍＲＮＡ発現量を１としたときのＭＣＳ群（ＭＣＳ処理した野生型マウス）の皮膚でのＡｑｐ３遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対値で表している。
【0100】
図１８から、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較して、ＭＣＳ群では、Ａｑｐ３遺伝子のｍＲＮＡの発現量が顕著に増加した。
【産業上の利用可能性】
【0101】
本実施形態の体内時計活性化システム及びその制御方法によれば、体内時計のリズム障害を改善することができる。
【符号の説明】
【0102】
１Ａ，２Ａ…体内時計活性化システム
１…電極
２…アンテナ
２ａ，２ｂ…アンテナの端部
３…ＩＣチップ
３ａ…通信回路
３ｂ…記憶回路
３ｃ…制御回路
４…保護膜
４ａ…保護膜の上面
５…基材
６…粘着剤層
１０…（第１の）ＲＦＩＤタグ
２０…リーダライタ
２１…アンテナ
２２…通信回路
２３…昇圧回路
２４…制御回路
３０…電源
３１…配線用差込接続器（コンセント）
３２…電気配線
３３…家庭用電源
４０…装着具
４０ａ…装着具の内周面
５０…第２のＲＦＩＤタグ
５１…温度センサ
６０…アクティブＲＦＩＤタグ
１００…電流発生部
２００…制御部
２０１…ＯＮ／ＯＦＦスイッチ
２０２…調節スイッチ
２０３…出力画面
３００…飼育容器
３０１…イヌ用ベッド
Ｘ…マウス
Ｙ…イヌ
１…電極
２…アンテナ
２ａ，２ｂ…アンテナの端部
３…ＩＣチップ
３ａ…通信回路
３ｂ…記憶回路
３ｃ…制御回路
４…保護膜
４ａ…保護膜の上面
５…基材
６…粘着剤層
１０…（第１の）ＲＦＩＤタグ
２０…リーダライタ
２１…アンテナ
２２…通信回路
２３…昇圧回路
２４…制御回路
３０…電源
３１…配線用差込接続器（コンセント）
３２…電気配線
３３…家庭用電源
４０…装着具
４０ａ…装着具の内周面
５０…第２のＲＦＩＤタグ
５１…温度センサ
６０…アクティブＲＦＩＤタグ
１００…電流発生部
２００…制御部
２０１…ＯＮ／ＯＦＦスイッチ
２０２…調節スイッチ
２０３…出力画面
３００…飼育容器
３０１…イヌ用ベッド
Ｘ…マウス
Ｙ…イヌ
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図11D】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図12D】
【図13A】
【図13B】
【図14A】
【図14B】
【図15A】
【図15B】
【図16】
【図17A】
【図17B】
【図18】
【配列表】