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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-11-13
(45)【発行日】2023-11-21
(54)【発明の名称】ウイルスベクターを調製するための組成物および方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/861 20060101AFI20231114BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20231114BHJP
C12N 15/34 20060101ALI20231114BHJP
C12N 15/35 20060101ALI20231114BHJP
C12N 15/49 20060101ALI20231114BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231114BHJP
C12N 15/864 20060101ALN20231114BHJP
【ＦＩ】
C12N15/861 Z ZNA
C12N7/01
C12N15/34
C12N15/35
C12N15/49
C12N5/10
C12N15/864 100Z
【請求項の数】
17
(21)【出願番号】P 2021545358
(86)(22)【出願日】2019-10-08
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-07
(86)【国際出願番号】 US2019055182
(87)【国際公開番号】W WO2020076820
(87)【国際公開日】2020-04-16
【審査請求日】2022-03-25
(31)【優先権主張番号】62/743,362
(32)【優先日】2018-10-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】521193315
【氏名又は名称】ナイキジェン，リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100135415
【弁理士】
【氏名又は名称】中濱 明子
(72)【発明者】
【氏名】シャオ，ウェイドン
(72)【発明者】
【氏名】ユー，シャンピン
【審査官】平林 由利子
(56)【参考文献】
【文献】特表２００２－５３４１３０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表平１０－５０７９２８（ＪＰ，Ａ）
【文献】Journal of Virology, 1996, Vol.70, No.12,pp.8459-8467
【文献】Journal of Virology, 2001, Vol.75, No.13,pp.5913-5920
【文献】Journal of Virology, 1995, Vol.69, No.11,pp.6627-6633
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｎ １／００－ ７／０８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
組換えウイルスを生成するためのカプシド形成欠損アデノウイルス（ｅｄＡｄ）であって、（１）１つ以上のカプシド形成必須タンパク質の生成の有意な減少または非生成、および／または（２）１つ以上の欠損したカプシド形成必須タンパク質の生成
をもたらす１つ以上の突然変異を有するｅｄＡｄゲノム
を含み、
前記１つ以上の突然変異は、カプシドタンパク質前駆体ｐＩＩＩａの非発現をもたらす突然変異を含み、
前記組換えウイルスはＡＡＶである、ｅｄＡｄ。
【請求項2】
１つ以上のカプシド形成必須タンパク質が、カプシドタンパク質ＩＸ、カプシド形成タンパク質ＩＶａ２、タンパク質１３．６、カプシド形成タンパク質５２Ｋ、ペントンベース（カプシドタンパク質ＩＩＩ）、コアタンパク質前駆体ｐＶＩＩ、コアタンパク質Ｖ、コアタンパク質前駆体ｐＸ、カプシドタンパク質前駆体ｐＶＩ、ヘキソン（カプシドタンパク質ＩＩ）、プロテアーゼ、ヘキソンアセンブリタンパク質１００Ｋ、タンパク質３３Ｋ、カプシド形成タンパク質２２Ｋ、カプシドタンパク質前駆体ｐＶＩＩＩ、タンパク質ＵＸＰ、およびファイバー（カプシドタンパク質ＩＶ）からなる群から選択される、請求項１に記載のｅｄＡｄ。
【請求項3】
タンパク質Ｖ、ヘキソン、Ｉｖａ２、Ｌ１－５２／５５ｋおよび／またはＬ４－２２Ｋにおける１つ以上の欠失をさらに含む、請求項２に記載のｅｄＡｄ。
【請求項4】
ファイバータンパク質における欠失をさらに含む、請求項２に記載のｅｄＡｄ。
【請求項5】
１つ以上の突然変異が、ヘキソンアセンブリタンパク質１００Ｋの欠失を含む、請求項１に記載のｅｄＡｄ。
【請求項6】
アデノウイルス初期遺伝子における１以上の欠失をさらに含む、請求項１に記載のｅｄＡｄ。
【請求項7】
アデノウイルス初期遺伝子Ｅ１における欠失を含む、請求項６に記載のｅｄＡｄ。
【請求項8】
アデノウイルス初期遺伝子Ｅ１およびＥ３における欠失を含む、請求項６に記載のｅｄＡｄ。
【請求項9】
アデノウイルス初期遺伝子Ｅ１、Ｅ３およびＥ４における欠失を含む、請求項６に記載のｅｄＡｄ。
【請求項10】
組換えＡＡＶのゲノムをコードする配列をさらに含む、請求項１に記載のｅｄＡｄ。
【請求項11】
組換えＡＡＶのゲノムが、制御配列に作動可能に連結された標的遺伝子を含む発現カセットを含み、発現カセットにＡＡＶ ＩＴＲが各末端において隣接する、請求項１０に記載のｅｄＡｄ。
【請求項12】
制御配列に機能的に（operatively）連結されたＣＲＥのコード配列をさらに含む、請求項１に記載のｅｄＡｄ。
【請求項13】
レンチウイルスのｇａｇおよびｐｏｌタンパク質のコード配列をさらに含む、請求項１に記載のｅｄＡｄ。
【請求項14】
レンチウイルスのＶＳＶ－Ｇタンパク質のコード配列をさらに含む、請求項１に記載のｅｄＡｄ。
【請求項15】
組換えウイルス（ＲＶ）を生成する方法であって、（ａ）１つ以上のｅｄＡｄを生成細胞に感染させて、感染した生成細胞を生成させる工程であって、１つ以上のｅｄＡｄは、生成細胞において、ＤＮＡ複製が可能であるが、ウイルス粒子形成は可能ではなく、１つ以上のｅｄＡｄ、または生成細胞のいずれかがＲＶゲノムを含む工程；
（ｂ）ＲＶゲノムを有するＲＶの生成を可能にする条件下で、感染した生成細胞をインキュベートする工程；および
（ｃ）ＲＶを採取する工程
を含む方法であり、
前記１つ以上のｅｄＡｄはＡＡＶゲノムを含み、該ＡＡＶゲノムはカプシドタンパク質前駆体ｐＩＩＩａの非発現をもたらす突然変異を含み、
ＲＶがＡＡＶである、方法。
【請求項16】
パッケージング細胞が、パッケージング細胞内でｅｄＡｄのカプシド形成を可能にする１つ以上の遺伝子産物を発現する、請求項１に記載のｅｄＡｄを生成するためのパッケージング細胞。
【請求項17】
１つ以上の遺伝子産物が、アデノウイルスｐＩＩＩａ遺伝子産物を含む、請求項１６に記載のパッケージング細胞。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【0001】
[0001]本出願は、２０１８年１０月９日に出願された米国仮特許出願第６２／７４３，３６２号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【0002】
[0002]本出願は、全体的に、カプシド形成欠損ヘルパーウイルスを用いて組換えウイルスベクターを生成するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【0003】
[0003]現在の組換えウイルス生成方法は、効率的な遺伝子送達用の組換えウイルスベクターを調製するためにアデノウイルスヘルパー機能をしばしば使用する。従来の方法では、トランスフェクション法を用いることが多く、その結果、最適なウイルス力価が得られず、スケールアップが困難となる。ヘルパーアデノウイルスを使用する場合、組換えベクター調製物はヘルパーウイルスで汚染される。
【発明の概要】
【0004】
[0004]したがって、カプシド形成ヘルパーウイルスまたは他の望ましくない作用で汚染されていない高力価ウイルス調製物を生成するより効率的な方法を提供する必要がある。
概要
[0005]本出願の一態様は、組換えウイルスベクターを生成するためのカプシド形成欠損アデノウイルス（ｅｄＡｄ）に関する。ｅｄＡｄは、（１）１つ以上のカプシド形成必須タンパク質の生成の有意な減少または非生成、および／または（２）１つ以上の欠損したカプシド形成必須タンパク質の生成をもたらす、そのゲノムにおける１つ以上の突然変異を含む。
概要
[0005]本出願の一態様は、組換えウイルスベクターを生成するためのカプシド形成欠損アデノウイルス（ｅｄＡｄ）に関する。ｅｄＡｄは、（１）１つ以上のカプシド形成必須タンパク質の生成の有意な減少または非生成、および／または（２）１つ以上の欠損したカプシド形成必須タンパク質の生成をもたらす、そのゲノムにおける１つ以上の突然変異を含む。
【0005】
[0006]本出願の別の態様は、本出願のｅｄＡｄの生成のためのパッケージング細胞株に関する。パッケージング細胞は、パッケージング細胞内でｅｄＡｄのカプシド形成を可能にする１つ以上の遺伝子産物を生成することができる。
【0006】
[0007]本出願の別の態様は、組換えウイルス（ＲＶ）を生成する方法に関する。本方法は、（ａ）１つ以上のｅｄＡｄを生成細胞に感染させて、感染した生成細胞を生成する工程、（ｂ）ＲＶゲノムを有するＲＶの生成を可能にする条件下で、感染した生成細胞をインキュベートする工程、および（ｃ）組換えウイルスを採取する工程を含み、ｅｄＡｄまたは生成細胞のいずれかがＲＶゲノムを含む。
【0007】
[0008]本出願の別の態様は、組換えウイルスの生成のための生成細胞に関する。生成細胞は、（ａ）組換えウイルスのゲノム、または（ｂ）組換えウイルスの生成に必要な生成物をコードする遺伝子、または（ａ）と（ｂ）の両方を含む。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1A】[0009]アデノウイルス粒子およびそれらの成分を示す図である。
【図1B】アデノウイルス粒子およびそれらの成分を示す図である。
【図1C】そこからコードされたポリペプチドを含むアデノウイルス転写ユニットを示す図である。後期ユニットは、カプシド形成欠損Ａｄ（ｅｄＡｄ）を作製するための突然変異標的を構成するタンパク質をコードする。
【図2】[0010]パッケージングコンピテントＡｄ（ｐｃＡｄ）またはｅｄＡｄによる宿主細胞の感染に関連する機能的転帰を示す概略図である。具体的には、ｐｃＡｄは感染性のパッケージングされたアデノウイルス粒子を生成し、ｅｄＡｄは生成しない。
【図3】[0011]ｗｔ（パネルＡ）および突然変異Ａｄ（ｅｄＡｄ、パネルＢ～Ｅ）ゲノムを示す概略図である。パネルＢ～Ｅの突然変異Ａｄは、ｐＩＩＩａ欠失を含み、それはそれらをカプシド形成欠損にする。ｅｄＡｄ－ｄｐ３（パネルＢ）は、野生型Ｅ１領域を有し、これは、Ｅ１ａおよびＥ１ｂ発現を伴わない宿主細胞におけるＤＮＡ複製を可能にする。ｅｄＡｄ－ｌｇおよびｅｄＡｄ－２ｇ（パネルＣおよびＤ）は、Ｅ１およびＥ３における欠失を含み、Ｅ１ａおよびＥ１ｂタンパク質を発現する２９３細胞などの細胞株においてのみそれらのＤＮＡを複製することができる。ｅｄＡｄ－２ｇはさらにｅ４欠失を有しており、パッケージング能力をさらに増加させる。ｅｄＡｄ－２ｇウイルスは、ｐＩＩＩａ発現を有する９１１Ｅ４細胞株において増殖することができる。ｅｄＡｄ－２ｇ－Ｅ１（パネルＥ）は、Ｅ３、Ｅ４およびｐＩＩＩａにおいてさらなる欠失を有するが、野生型Ｅ１領域を有する。
【図4】[0012]パネルＡ～Ｅにおいていくつかの異なるｅｄＡｄを示す概略図であり、各々は、ｐＩＩＩａ欠失を有し、それらをカプシド形成欠損性にする。さらに、各ｅｄＡｄは、所望の標的遺伝子を発現する複製欠損ＡＡＶ粒子を生成するための統合されたＡＡＶベクターを有する。ＡＡＶベクター配列は、Ａｄ Ｅ３配列（パネルＡ、Ｂ、Ｄ）またはＡｄ Ｅ１配列（パネルＣ、Ｅ）を置換するものとして示される。パネルＣのｅｄＡｄｌｇ－ＡＡＶ－ｉｌ－ｃｒｅは、ｒＡＡＶ生成に必要なヘルパー遺伝子機能のＣｒｅ媒介活性化を提供するためのＣＭＶ－Ｃｒｅ発現単位を有するＡｄ Ｅ３領域に挿入を有する。ヘルパーの発現は、ｃｒｅを媒介した欠失または逆位停止配列を介して活性化され得る。
【図5】[0013]ｅｄＡｄの生成を示す概略図である。ここで、ｅｄＡｄに欠失した構造エレメント（ｐＩＩＩａなど）は、トランスで欠失した生成物を発現するように安定に形質転換された宿主細胞によって供給される。
【図6】[0014]Ｅ１ａおよびＥ１ｂヘルパー機能を発現する宿主細胞（２９３細胞など）においてｒＡＡＶ粒子を生成させるための従来の三重プラスミドトランスフェクション法を示す概略図である。
【図7】[0015]宿主細胞を、所望の標的遺伝子を発現するように操作されたＡＡＶ ＩＴＲを有する欠損ＡＡＶゲノムを含むプラスミド、ならびに（ｒＡＡＶ生成のためのヘルパー機能を提供する）ＲｅｐおよびＣａｐを共発現するプラスミドを宿主細胞に同時トランスフェクトし、また同じ宿主細胞を、ｒＡＡＶ生成のためのヘルパー機能を提供するｗｔ ＡｄまたはｐｃＡｄに感染させる場合に、ｒＡＡＶベクターとｐｃＡｄまたはｗｔ Ａｄの生成を示す概略図である。ｗｔＡｄおよびｐｃＡｄの副産物もまた生成される。
【図8】[0016]ｅｄＡｄで宿主細胞を感染させることによるｒＡＡＶベクターの生成を示す概略図である。この場合、宿主細胞（ＨｅＬａ）は、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ発現プラスミド、ならびに所望の標的遺伝子を発現するように操作されたＡＡＶ ＩＴＲを有する欠損ＡＡＶゲノムで安定に形質転換される。Ｅ１領域を有する感染性ｅｄＡｄ－ｄｐ３を宿主細胞に適用するが、得られたｒＡＡＶはアデノウイルス汚染を受けない。
【図9】[0017]図４のパネルＣにおけるｅｄＡｄｌｇ－ＡＡＶ－ｉｌ－ＣｒｅなどのｅｄＡｄでＥ１ａ、Ｅ１ｂおよび誘導性Ｒｅｐ－ＣａｐＣａｐを発現するように安定に形質転換された２９３細胞を感染させることによるｒＡＡＶの生成を示す概略図である。この場合、ｅｄＡｄからのＣｒｅの発現は、Ｒｅｐ発現を活性化するためにＲｅｐ発現ユニットに組み込まれたイントロン／ポリＡ中のロックされた（ｌｏｘｅｄ）断片を切り出す。ｅｄＡｄはまた、所望の標的遺伝子を発現するように操作されたＡＡＶ ＩＴＲを有する欠損ＡＡＶゲノムを含む。得られたｒＡＡＶは、Ａｄ汚染を受けない。Ｃｒｅは他の発現誘導システムと置換することができる。
【図10】[0018]ＨｅｌａまたはＡ５４９宿主細胞内にｗｔ Ｅ１ａ／Ｅ１ｂ領域を有するｅｄＡｄ（ｅｄＡｄｌｇ－ＡＡＶ－Ｅ１）を感染させることによるｒＡＡＶの生成を示す概略図である。ｅｄＡｄはまた、所望の標的遺伝子を発現するように操作されたＡＡＶ ＩＴＲを有する欠損ＡＡＶゲノムを含む。ＨｅｌａおよびＡ５４９宿主細胞は、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐの発現のために安定に形質転換される。得られたｒＡＡＶは、Ａｄ汚染を受けない。
【図11】[0019]Ｅ１ａ／Ｅ１ｂ、Ｅ２、およびＥ４ヘルパー機能を提供する２９３細胞におけるＥ１ａ／Ｅ１ｂ、Ｅ２、Ｅ３、およびＥ４欠失を伴うｅｄＡｄを有するｒＡＡＶの生成を示す概略図である。ｅｄＡｄ２ｇ－ＡＡＶ－ｃｒｅ遺伝子は、ｒｅｐに組み込まれたイントロン中のロックされた断片を除去して、ｒｅｐ発現を活性化するように設計されている。ｅｄＡｄ２ｇ－ＡＡＶ／（Ｃｒｅ）はまた、所望の標的遺伝子を発現するように操作されたＡＡＶ ＩＴＲを有する欠損ＡＡＶゲノムを含む。得られたｒＡＡＶは、Ａｄ汚染を受けない。
【図12】[0020]第１世代（パネルＡ）、第２世代（パネルＢ）および第３世代（パネルＣ）のレンチウイルスベクター粒子を生成するのに必要な成分を示す概略図である。
【図13】[0021]示された３つのｅｄＡｄでＥ１ａおよびＥ１ｂを発現するように安定に形質転換された宿主細胞に感染させることによる第１世代のレンチウイルス粒子の生成を示す概略図である。得られたレンチウイルス粒子は、Ａｄ汚染を受けない。多数のアデノウイルスにコードされたエレメントのうちの１つを宿主細胞株に組み込むこともできる。この例は、ベクター生成に必要なエレメントの組み合わせを担持する唯一使用される１つのｅｄＡｄによって修飾され得て、一方、残りのエレメントは宿主細胞株に組み込まれる。
【図14】[0022]示された３つのｅｄＡｄでＥ１ａおよびＥ１ｂを発現するように安定に形質転換された宿主細胞に感染させることによる第２世代のレンチウイルス粒子の生成を示す概略図である。得られたレンチウイルス粒子は、Ａｄ汚染を受けない。多数のアデノウイルスにコードされたエレメントのうちの１つを宿主細胞株に組み込むこともできる。この例は、ベクター生成に必要なエレメントの組み合わせを担持する唯一使用される１つのｅｄＡｄによって修飾され得て、一方、残りのエレメントは宿主細胞株に組み込まれる。
【図15】[0023]レンチウイルスＥｎｖ－Ｇａｇ－Ｐｏｌ－Ｔａｔ－Ｒｅｖ遺伝子を発現するように操作されたｅｄＡｄｌｇ－ｇｅｎ２ｐｌ－ｅｎｖ粒子でＥ１ａ／Ｅ１ｂを発現するように安定に形質転換された宿主細胞を感染させることによる第２世代のレンチウイルス粒子の生成を示す概略図である。この場合、所望の導入遺伝子を発現するように操作された欠損レンチウイルスゲノムは、宿主細胞において安定に形質転換される。得られたレンチウイルス粒子は、Ａｄ汚染を受けない。この例は、ベクター生成に必要なエレメントの組み合わせを担持する唯一使用される１つのｅｄＡｄによって修飾され得て、一方、残りのエレメントは宿主細胞株に組み込まれる。
【図16】[0024]４つのｅｄＡｄを含むＴａｔ非依存性システムを有する第３世代のレンチウイルス粒子の生成を示す概略図である。この場合、Ｅ１ａ／Ｅ１ｂを発現するように安定に形質転換された宿主細胞は、示される４つのｅｄＡｄに感染される。ｅｄＡｄｌｇ導入遺伝子粒子は、効率的な核内輸送のための全レンチウイルスゲノムに存在するポリプリントラクトｃｖ．Ｙ活性配列（ｃＰＰＴ）の中央コピー、導入遺伝子の発現を駆動する内部プロモーターとしてのＭＳＣＶ ＬＴＲプロモーター（ＭＵ３）、ならびに高レベル導入遺伝子発現のためのＷＰＲＥ（Ｗ）エレメントを含む欠損レンチウイルス自己不活性化（ＳＩＮ）導入ベクターを含む。他の３つのｅｄＡｄは、レンチウイルスｇａｇ－ｐｏｌおよびｒｅｖタンパク質、ならびに水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）－Ｇエンベロープ糖タンパク質からヘルパー機能を提供するように操作される。この例は、ベクター生成に必要なエレメントの組み合わせを担持する唯一使用される１つのｅｄＡｄによって修飾され得て、一方、残りのエレメントは宿主細胞株に組み込まれる。
【図17】[0025]Ｅ１ａ／Ｅ１ｂを含む１つ以上のｅｄＡｄを除き、図１６に先に記載された４つのｅｄＡｄを含むＴａｔ非依存性システムを有する第３世代のレンチウイルス粒子の生成を示す概略図である。この場合、宿主細胞（ＨｅｌａまたはＡ５４９など）は、いかなるヘルパー機能も発現せず、代わりに、ヘルパー機能は、示されたｅｄＡｄの組み合わせ（Ｅ１ａ／Ｅ１ｂ配列の含有を示さない）によってのみ提供される。野生型Ｅ１領域を有する唯一のアデノウイルスが必要である。この例は、ベクター生成に必要なエレメントの組み合わせを担持する唯一使用される１つのｅｄＡｄによって修飾され得て、一方、残りのエレメントは宿主細胞株に組み込まれる。
【図18】[0026]示された２つのｅｄＡｄでＥ１ａおよびＥ１ｂを発現するように安定に形質転換された宿主細胞に感染させることによる第１世代のレンチウイルス粒子の生成を示す概略図である。レンチウイルスゲノムは、ここでは、宿主染色体に組み込まれている。得られたレンチウイルス粒子は、Ａｄ汚染を受けない。この例は、ベクター生成に必要なエレメントの組み合わせを担持する唯一使用される１つのｅｄＡｄによって修飾され得て、一方、残りのエレメントは宿主細胞株に組み込まれる。
【図19】[0027]Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ４を発現するように安定に形質転換された宿主細胞を、示された１つのｅｄＡｄで感染させることによる、第３世代のレンチウイルス粒子の生成を示す概略図である。レンチウイルスゲノムは、ここでは、宿主染色体に組み込まれている。得られたレンチウイルス粒子は、Ａｄ汚染を受けない。
【発明を実施するための形態】
【0009】
本開示は、ここでは、詳細に説明され、例示的な実施形態に関連してそのように行われるが、図面および添付の特許請求の範囲に示される特定の実施形態によって限定されるものではない。
【0010】
詳細な説明
[0028]参照は、添付の構造および図における例を例示する、本出願の特定の態様および例示的な実施形態について詳細になされる。本出願の態様は、方法、材料および実施例を含む例示的な実施形態とともに記載され、そのような記載は非限定的であり、本出願の範囲は、一般的に公知であるか、または本明細書に組み込まれている全ての均等物、代替物、および修飾を包含することを意図している。別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本出願が属する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。当業者は、本出願の態様および実施形態の実施において使用することができる、本明細書に記載されたものと類似または均等の多くの技術および材料を認識する。本出願の記載された態様および実施形態は、記載された方法および材料に限定されない。
[0028]参照は、添付の構造および図における例を例示する、本出願の特定の態様および例示的な実施形態について詳細になされる。本出願の態様は、方法、材料および実施例を含む例示的な実施形態とともに記載され、そのような記載は非限定的であり、本出願の範囲は、一般的に公知であるか、または本明細書に組み込まれている全ての均等物、代替物、および修飾を包含することを意図している。別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本出願が属する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。当業者は、本出願の態様および実施形態の実施において使用することができる、本明細書に記載されたものと類似または均等の多くの技術および材料を認識する。本出願の記載された態様および実施形態は、記載された方法および材料に限定されない。
【0011】
[0029]本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、内容が明確に別段の指示をしない限り、複数の指示対象を含む。
【0012】
[0030]範囲は、本明細書において、「約」１つの特定の値から、および／または「約」別の特定の値まで表され得る。このような範囲が表される場合、別の実施形態は、１つの特定の値から、および／または他の特定の値までを含む。同様に、値が近似値として表される場合、先行する「約」を使用することによって、特定の値が別の実施形態を形成することが理解される。さらに、各範囲のエンドポイントは、他のエンドポイントとの関係において、および他のエンドポイントとは独立して、有意であることが理解される。また、本明細書には多数の値が開示され、各値はまた、値自体に加えて、その特定の値を「約」として本明細書に開示されることも理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、「約１０」もまた開示される。また、値が開示される場合、「値以下」、「値以上」、および値間の可能な範囲も開示されることも、当業者によって適切に理解されるように理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、「１０以下」および「１０以上」も開示される。
【0013】
[0031]別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本出願が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使用される命名法、ならびに以下に記載される細胞培養、分子遺伝学、および核酸化学およびハイブリダイゼーションにおける実験手順は、当該技術分野において周知であり、一般に使用されるものである。組換え核酸法、ポリヌクレオチド合成、微生物培養および形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）には、標準的な技術が用いられる。一般的に、酵素反応および精製工程は、製造業者の仕様に従って実施される。技術および手順は、一般的に、本明細書全体を通じて提供される、当該技術分野における従来の方法および種々の一般的な参考文献（一般的には、参照により本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙを参照されたい）に従って実施される。単位、接頭辞、および記号は、それらのＳＩが容認される形式で示すことができる。別段の指示がない限り、核酸は５’から３’方向に左から右に書き込まれ、アミノ酸配列はそれぞれアミノからカルボキシル方向に左から右に書き込まれる。数値範囲は、範囲を定義する数値を含み、定義された範囲内の各整数を含む。アミノ酸は、それらの一般に公知である３文字記号またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名法委員会によって推奨されている１文字記号のいずれかによって、本明細書中で言及することができる。同様に、ヌクレオチドは、それらの一般的に受け入れられている一文字コードによって言及することができる。
【0014】
定義
[0032］用語「核酸」は、本明細書で使用される場合、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成（例えば、化学的に合成された）ＤＮＡを含む、ＲＮＡとＤＮＡの両方を包含する。核酸は、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖核酸は、センス鎖またはアンチセンス鎖であり得る。加えて、核酸は、環状または線状であり得る。
[0032］用語「核酸」は、本明細書で使用される場合、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成（例えば、化学的に合成された）ＤＮＡを含む、ＲＮＡとＤＮＡの両方を包含する。核酸は、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖核酸は、センス鎖またはアンチセンス鎖であり得る。加えて、核酸は、環状または線状であり得る。
【0015】
[0033]「単離された核酸」とは、ウイルスゲノム中に存在する他の核酸分子から分離された核酸を指し、通常はウイルスゲノム中の核酸の一方または両方の側に隣接する核酸を含む。用語「単離された」は、核酸に関して本明細書中で使用される場合、任意の天然に存在しない核酸配列も含む。そのような天然に存在しない配列は天然には見出されず、天然に存在するゲノム中に直ちに隣接する配列を有しないからである。
【0016】
[0034]単離された核酸は、ＤＮＡ分子であり得、但し、例えば、天然に存在するゲノム中のそのＤＮＡ分子にすぐに隣接して通常見出される核酸配列の１つが除去されるかまたは存在しないことを条件とする。したがって、単離された核酸には、限定されないが、他の配列ならびにベクター、自律複製プラスミド、ウイルス（例えば、任意のパラミクソウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、またはヘルペスウイルス）、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに取り込まれているＤＮＡとは独立して、別個の分子（例えば、化学的に合成された核酸、またはＰＣＲもしくは制限エンドヌクレアーゼ処理によって生成されたｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ断片）として存在するＤＮＡ分子が含まれる。さらに、単離された核酸は、ハイブリッド核酸または融合核酸の一部であるＤＮＡ分子などの操作された核酸を含むことができる。例えば、ｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノムライブラリー、またはゲノムＤＮＡ制限消化物を含むゲルスライス内に数百から数百万の他の核酸の間に存在する核酸は、単離された核酸とはみなされない。
【0017】
[0035]一部の実施形態では、核酸分子は、ゲノムがアデノウイルスポリペプチドをコードする配列の少なくとも１つの全部または一部を欠くことを除いて、アデノウイルスのゲノムをコードすることができる。任意の適切な分子クローニング技術（例えば、組換えまたは部位特異的突然変異誘発）を使用して、ファイバータンパク質をコードする配列、Ｖタンパク質をコードする配列、ヘキソンタンパク質をコードする配列、ペントン塩基タンパク質をコードする配列、ＶＡ ＲＮＡをコードする配列、またはピルタンパク質をコードする配列の全部または一部を欠くアデノウイルス核酸分子を生成することができる。同様に、任意の適切な分子クローニング技術（例えば、ＰＣＲ、組換え、または制限部位クローニング）を使用して、核酸配列をアデノウイルスの核酸分子に導入することができる。本明細書に提供される核酸分子は、標準的な技術によってウイルスに組み込むことができる。例えば、組換え技術を使用して、本明細書に提供される核酸分子を、プラスミドまたは他のベクター内の感染性ウイルスゲノムまたはサブゲノムに挿入することができる。場合によっては、プラスミドまたは他のベクターは、さらにルシフェラーゼまたは他のレポーター遺伝子を発現することができる。次に、ウイルスゲノムを哺乳動物細胞にトランスフェクトして、修飾されたアデノウイルスをレスキューすることができる。あるいは、修飾されたサブゲノム配列を、哺乳動物細胞がサブゲノムを無傷のゲノムに組換えて新しいウイルスを作るように、他のサブゲノム配列を有する細胞に同時トランスフェクトすることができる。
【0018】
[0036]「遺伝子導入」または「遺伝子送達」は、外来ＤＮＡを宿主細胞に挿入するための方法またはシステムを指す。遺伝子導入は、組み込まれていない導入ＤＮＡの一時的な発現、染色体外複製および導入レプリコン（例えば、エピソーム）の発現、または導入された遺伝物質の宿主細胞のゲノムＤＮＡへの組み込みをもたらすことができる。
【0019】
[0037]「ベクター」とは、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、人工染色体、ウイルス、ビリオンなど、適切な制御エレメントと結合した場合に複製することができ、細胞間で遺伝子配列を導入することができる任意の遺伝的エレメントを意味する。したがって、この用語は、クローニングおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを含む。
【0020】
[0038]「アデノ随伴ウイルス逆方向末端反復」または「ＡＡＶ ＩＴＲ」とは、ＡＡＶゲノムの各末端に見出される当該技術分野において認識された領域であって、シスでＤＮＡ複製の起点として、およびウイルスゲノムのパッケージングシグナルとしてともに機能する領域を意味する。ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ ｒｅｐコード領域とともに、哺乳動物細胞ゲノムへの２つの隣接ＩＴＲの間に介在するヌクレオチド配列からの効率的な切り出しおよびレスキュー、ならびにヌクレオチド配列の組み込みを提供する。
【0021】
[0039]ＡＡＶ ＩＴＲ領域のヌクレオチド配列は公知である。例えば、ＡＡＶ－２配列については、Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５巻、７９３～８０１頁；Ｂｅｍｓ，Ｋ．Ｉ．「Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編集）を参照されたい。本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ ＩＴＲ」は、先に引用した参考文献に示された野生型ヌクレオチド配列を有する必要はなく、例えばヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって変更することができる。さらに、ＡＡＶ ＩＴＲは、限定されないが、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、およびＡＡＶ－１３を含むいくつかのＡＡＶ血清型のいずれかに由来し得る。さらに、ＡＡＶベクター中の選択されたヌクレオチド配列に隣接する５’および３’ＩＴＲは、それらが意図したように機能する限り、すなわち、宿主細胞ゲノムまたはベクターからの目的の配列の切り出しおよびレスキューを可能にし、ＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子産物が細胞中に存在する場合に、レシピエント細胞ゲノムへの異種配列の組み込みを可能にする限り、必ずしも同一である必要はなく、または同一のＡＡＶ血清型に由来する必要も、または単離する必要もない。
【0022】
[0040]「ＡＡＶ ｒｅｐコード領域」とは、ウイルスゲノムを複製し、潜伏感染中にウイルスゲノムを宿主ゲノムに挿入するのに必要なウイルスの複製タンパク質をコードするＡＡＶゲノムの当該技術分野において認識された領域を意味する。この用語はまた、ＡＡＶ－２ ＤＮＡ複製を媒介することも公知であるヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ－６）ｒｅｐ遺伝子などのその機能的相同体を含む（Ｔｈｏｍｓｏｎら、（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０４巻、３０４～３１１頁）。ＡＡＶ ｒｅｐコード領域のさらなる記載については、例えば、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８巻、９７～１２９頁；Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５巻、７９３～８０１頁を参照されたい。ｒｅｐコード領域は、本明細書で使用される場合、上記されるＡＡＶ血清型などの任意のウイルス血清型に由来することができる。この領域は、野生型遺伝子の全てを含む必要はないが、存在するｒｅｐ遺伝子が適切なレシピエント細胞で発現された場合に十分な組み込み機能を提供する限り、例えばヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって変更され得る。
【0023】
[0041]用語「長鎖形態のＲｅｐ」とは、ＡＡＶ ｒｅｐコード領域のＲｅｐ７８およびＲｅｐ６８遺伝子産物を指し、それらの機能的相同体を含む。長鎖形態のＲｅｐは、通常、ＡＡＶ ｐ５プロモーターの指令下で発現される。
【0024】
[0042]用語「短鎖形態のＲｅｐ」とは、ＡＡＶ ｒｅｐコード領域のＲｅｐ５２およびＲｅｐ４０遺伝子産物を指し、それらの機能的相同体を含む。短鎖形態のＲｅｐは、ＡＡＶ ｐ１９プロモーターの指令下で発現される。
【0025】
[0043]「ＡＡＶキャップコード領域］とは、ウイルスゲノムをパッケージングするのに必要なウイルスのコートタンパク質をコードするＡＡＶゲノムの当該技術分野において認識された領域を意味する。キャップコード領域のさらなる記載については、例えば、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８巻、９７～１２９；Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５巻、７９３～８０１頁を参照されたい。ＡＡＶキャップコード領域は、本明細書で使用される場合、上記されるように、任意のＡＡＶ血清型に由来することができる。この領域は、野生型キャップ遺伝子の全てを含む必要はないが、例えば、遺伝子が、ＡＡＶベクターとともに宿主細胞中に存在する場合に十分なパッケージング機能を提供する限り、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって変更され得る。
【0026】
[0044]用語「ＡＡＶコード領域」とは、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐコード領域に対応する２つの主要なＡＡＶオープンリーディングフレームを含む核酸分子；例えば、野生型ＡＡＶゲノムの塩基対３１０～４，４４０と実質的に相同なヌクレオチド配列を含む核酸分子を指す。したがって、本出願の目的のために、ＡＡＶコード領域は、ＡＡＶ ｐ５プロモーター領域に対応する配列を含まず、ＡＡＶ ＩＴＲを含まない。
【0027】
[0045]「ＡＡＶベクター」とは、限定されないが、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、およびＡＡＶ－１３を含むアデノ随伴ウイルス血清型に由来するベクターを意味する。ＡＡＶベクターは、全部または一部を欠失したＡＡＶ野生型遺伝子、好ましくはｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子の１つ以上を有するが、機能的な隣接ＩＴＲ配列を保持することができる。機能的なＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンのレスキュー、複製およびパッケージングに必要である。したがって、ＡＡＶベクターは、本明細書において、ウイルスの複製およびパッケージングのためにシスで必要とされるそれらの配列（例えば、機能的ＩＴＲ）を少なくとも含むように定義される。ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列である必要はなく、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって、配列が機能的レスキュー、複製およびパッケージングを提供する限り、変更され得る。
【0028】
[0046]「ＡＡＶヘルパー機能」とは、ＡＡＶ由来のコード配列を指し、ＡＡＶ遺伝子産物を提供するために発現され得、次に、生成的ＡＡＶ複製に関してトランスで機能する。したがって、ＡＡＶヘルパー機能にはｒｅｐおよびｃａｐ領域が含まれる。ｒｅｐ発現産物は、多くの機能を有することが示され、とりわけ、ＤＮＡ複製の認識、結合およびニッキング；ＤＮＡヘリカーゼ活性；およびＡＡＶ（または他の異種）プロモーターからの転写の調整を含む。ｃａｐ発現産物は、必要なパッケージング機能を供給する。ＡＡＶヘルパー機能は、本明細書において、ＡＡＶベクターから欠失しているＡＡＶ機能をトランスで相補するために使用される。
【0029】
[0047]用語「ＡＡＶヘルパー構築物」は、全体的に、目的のヌクレオチド配列の送達のための形質導入ベクターを生成するために使用されるＡＡＶベクターから欠失させたＡＡＶ機能を提供するヌクレオチド配列を含む核酸分子を指す。ＡＡＶヘルパー構築物は、一般的に、溶解性ＡＡＶ複製に必要な欠失したＡＡＶ機能を相補するためにＡＡＶのｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子の一時的発現を提供するのに使用される；しかしながら、ヘルパー構築物はＡＡＶのＩＴＲｓを欠き、それら自身を複製することもパッケージすることもできない。ＡＡＶヘルパー構築物は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス、またはビリオンの形態であり得る。ＲｅｐとＣａｐ発現産物の両方をコードする一般的に使用されるプラスミドｐＡＡＶ／ＡｄおよびｐＩＭ２９＋４５などの多数のＡＡＶヘルパー構築物が記載されている。Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６３巻、３８２２～３８２８頁；ＭｃＣａｒｔｙら（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６５巻、２９３６～２９４５頁を参照されたい。Ｒｅｐおよび／またはＣａｐ発現産物をコードする多数の他のベクターが記載されている。例えば、米国特許第５，１３９，９４１号を参照されたい。
【0030】
[0048]用語「アクセサリー機能」は、ＡＡＶがその複製に依存する非ＡＡＶ由来のウイルスおよび／または細胞機能を指す。したがって、この用語は、ＡＡＶ複製に必要なＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質を捉え、ＡＡＶ遺伝子転写の活性化に関与する部分、ステージ特異的ＡＡＶ ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡ複製、Ｃａｐ発現産物の合成、およびＡＡＶカプシドアセンブリに関与する部分を含む。ウイルスベースのアクセサリー機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型以外）およびワクシニアウイルスなどの公知のヘルパーウイルスのいずれからも誘導することができる。
【0031】
[0049]例えば、アデノウイルス由来のアクセサリー機能が広く研究されており、アクセサリー機能に関与する多数のアデノウイルス遺伝子が同定され、部分的に特徴付けられている。具体的には、初期アデノウイルスＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ ５５Ｋ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、およびＶＡ ＲＮＡ遺伝子領域は、アクセサリー過程に関与すると考えられる。ヘルペスウイルス由来のアクセサリー機能が記載されている。例えば、Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｐｒｏｇ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．２５，１１３を参照されたい。ワクシニアウイルス由来のアクセサリー機能もまた記載されている。例えば、Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．（１９９０）、前掲；Ｓｃｈｌｅｈｏｆｅｒら（１９８６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５２巻、１１０～１１７頁を参照されたい。
【0032】
[0050]用語「アクセサリー機能ベクター」は、全体的に、アクセサリー機能を提供するヌクレオチド配列を含む核酸分子を指す。アクセサリー機能ベクターを適切な宿主細胞にトランスフェクトすることができ、次に、ベクターは、宿主細胞におけるＡＡＶビリオン生成を支持することができる。この用語から明示的に除外されるのは、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス粒子などの自然界に存在する感染性ウイルス粒子である。したがって、アクセサリー機能ベクターは、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミドまたはその天然に存在する形態から修飾されたウイルスの形態であり得る。
【0033】
[0051]「組換えウイルス」は、例えば、異種核酸構築物の粒子への付加または挿入により、遺伝的に変更されたウイルスを意味する。
[0052]「ＡＡＶビリオン」とは、完全なウイルス粒子、例えば、野生型（ｗｔ）ＡＡＶウイルス粒子（ＡＡＶキャプシドタンパク質コートを付随した直鎖状一本鎖ＡＡＶ核酸ゲノムを含む）を意味する。この点に関して、相補性センスのいずれか、すなわち「センス」または「アンチセンス」鎖のいずれかの一本鎖ＡＡＶ核酸分子をいずれか１つのＡＡＶビリオンにパッケージすることができ、両鎖は等しい感染性である。
[0052]「ＡＡＶビリオン」とは、完全なウイルス粒子、例えば、野生型（ｗｔ）ＡＡＶウイルス粒子（ＡＡＶキャプシドタンパク質コートを付随した直鎖状一本鎖ＡＡＶ核酸ゲノムを含む）を意味する。この点に関して、相補性センスのいずれか、すなわち「センス」または「アンチセンス」鎖のいずれかの一本鎖ＡＡＶ核酸分子をいずれか１つのＡＡＶビリオンにパッケージすることができ、両鎖は等しい感染性である。
【0034】
[0053]「組換えＡＡＶビリオン」または「ｒＡＡＶビリオン」は、本明細書においては、両側にＡＡＶ ＩＴＲが隣接する、目的の異種ヌクレオチド配列を封入したＡＡＶタンパク質の殻で構成される、感染性複製欠損ウイルスとして定義される。ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶベクター、ＡＡＶヘルパー機能、およびアクセサリー機能を含む適切な宿主細胞で生成される。このようにして、宿主細胞を、ＡＡＶベクター（目的の組換えヌクレオチド配列を含む）を続く遺伝子送達のために感染性組換えビリオン粒子にパッケージするのに必要なＡＡＶポリペプチドをコードすることができるようにする。
【0035】
[0054]用語「トランスフェクション」は、細胞による外来ＤＮＡの取り込みを指すために使用される。外来ＤＮＡが細胞膜の内部に導入された場合に、細胞は「トランスフェクトされる」。多数のトランスフェクション技術は、当該技術分野において一般的に公知である。例えば、Ｇｒａｈａｍら（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２巻、４５６頁；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｄａｖｉｓら（１９８６）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；Ｃｈｕら（１９８１）Ｇｅｎｅ １３巻、１９７頁を参照されたい。このような技術を使用して、ヌクレオチド組み込みベクターおよび他の核酸分子などの１つ以上の外因性ＤＮＡ部分を適切な宿主細胞に導入することができる。この用語は、化学的、電気的、およびウイルス媒介のトランスフェクション手法を捕捉する。
【0036】
[0055]用語「宿主細胞」とは、例えば、微生物、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳類細胞であって、ＡＡＶヘルパー構築物、ＡＡＶベクタープラスミド、アクセサリー機能ベクター、または他の導入ＤＮＡのレシピエントとして使用できるかまたは使用されてきたものを示す。この用語は、トランスフェクトされた元の細胞の子孫を含む。したがって、「宿主細胞」とは、本明細書で使用される場合、全体的に、外因性ＤＮＡ配列をトランスフェクトされた細胞を指す。単一の親細胞の子孫は、元の親に対して形態学上、またはゲノミックもしくは全ＤＮＡの相補性において、自然突然変異、偶発的突然変異および意図的な突然変異のために、必ずしも完全に同一でない場合があることが理解される。
【0037】
[0056]本明細書で使用される場合、用語「細胞株」は、連続または持続されたインビトロでの増殖および分裂が可能な細胞集団を指す。しばしば、細胞株は、単一の前駆細胞に由来するクローン集団である。自然発生的または誘導的変化が、このようなクローン集団の保存または導入中に核型において起こり得ることは、当該技術分野においてさらに公知である。したがって、言及された細胞株から誘導された細胞は、祖先細胞または培養物と正確に同一でない場合があり、言及された細胞株は、このような変異体を含む。
【0038】
[0057]用語「異種性」は、コード配列および制御配列などの核酸配列に関する場合、通常、互いに連結されておらず、および／または通常、特定の細胞に付随していない配列を示す。したがって、核酸構築物またはベクターの「異種」領域は、天然の他の分子と関連して見出されない、別の核酸分子内またはそれに結合した核酸のセグメントである。例えば、核酸構築物の異種領域は、天然のコード配列と関連して見出されない配列が隣接するコード配列を含むことができる。異種コード配列の別の例は、コード配列自体が天然に存在しない構築物（例えば、天然遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）である。同様に、細胞中に通常存在しない構築物で形質転換された細胞は、本出願の目的で、異種であるとみなされる。対立遺伝子バリエーションまたは天然に存在する突然変異事象は、本明細書で使用される場合、異種ＤＮＡを生じない。
【0039】
[0058]「コード配列」または特定のタンパク質を「コードする」配列は、適切な制御配列の制御下に置かれた場合に、（ＤＮＡの場合では）転写され、（ｍＲＮＡの場合では）インビトロまたはインビボでポリペプチドに翻訳される核酸配列である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドン、および３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンにより決定される。コード配列は、限定されないが、原核生物または真核生物のｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、原核生物または真核生物のＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列を含み得る。転写終結配列は、通常、コード配列に対して３’に位置する。
【0040】
[0059]「核酸」配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を指す。この用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基類似体、例えば、限定ではないが、４－アセチルシトシン、８－ヒドロキシ－Ｎ６－メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルアデニン、１－メチルシュードウラシル、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－メチルアデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、ベータ－Ｄ－マンノシルクエオシン、５’－メトキシカルボニルメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンチルアデニン、ウラシル－５－オキサロ酢酸メチルエステル、ウラシル－５オキサロ酢酸、オキシブトキソシン、シュードウラシル、クエオシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、Ｎ－ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸、シュードウラシル、２－チオシトシン、および２，６－ジアミノプリンのいずれも含む配列を捉える。
【0041】
[0060]用語ＤＮＡ「制御配列」とは、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流制御ドメイン、複製起点、内部リボソーム侵入部位（「ＩＲＥＳ」）、エンハンサーなどを集合して指し、レシピエント細胞におけるコード配列の複製、転写および翻訳を総称して提供する。選択されたコード配列が適切な宿主細胞内で複製、転写、および翻訳され得る限り、これらの制御配列の全てが常に存在する必要はない。
【0042】
[0061]用語「プロモーター領域」は、本明細書において、その通常の意味において、ＲＮＡポリメラーゼが結合し、下流（３’方向）コード配列の転写を開始するＤＮＡ制御配列を指すために使用される。
【0043】
[0062]用語「作動可能に連結された（operably linked）」とは、記載された成分が、それらの通常の機能を実行するように構成されるエレメントの配列を指す。したがって、コード配列に作動可能に連結された制御配列は、コード配列の発現を行うことができる。制御配列は、それらがその発現を指示するように機能する限り、コード配列と隣接する必要はない。したがって、例えば、介在する非翻訳ではあるが転写された配列をプロモーター配列とコード配列との間に存在させることができ、プロモーター配列はコード配列に「作動可能に連結されている」と依然としてみなすことができる。
【0044】
[0063]「単離された」とは、ヌクレオチド配列を参照する場合、示された分子が、同じタイプの他の生体高分子が実質的に存在しない状態で存在することを意味する。したがって、「特定のポリペプチドをコードする単離された核酸分子」とは、本発明のポリペプチドをコードしない他の核酸分子を実質的に含まない核酸分子を指すが、該分子は、組成物の基本的特徴に有害な影響を及ぼさない、いくつかの追加の塩基または部分を含み得る。
【0045】
[0064]特定のヌクレオチド配列が別の配列に対して「上流」、「下流」、「３’」、または「５’」であると記載されている場合のように、本出願を通じて特定の核酸分子中のヌクレオチド配列の相対的位置を記載する目的では、当該技術分野において慣用的であるように、参照されているＤＮＡ分子の「センス」鎖または「コード」鎖中の配列の位置であることが理解されるべきである。
【0046】
[0065]「相同性」とは、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド部分間の同一性のパーセントを指す。ある部分から別の部分への配列間の対応は、当該技術分野において公知である技術によって決定することができる。例えば、相同性は、配列情報を整列させ、容易に利用可能なコンピュータプログラムを使用することによって、２つのポリペプチド分子間の配列情報を直接比較することによって決定することができる。あるいは、相同性は、相同領域間で安定な二本鎖の形成を可能にする条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、続いて一本鎖特異的ヌクレアーゼによる消化、および消化断片のサイズ決定によって決定することができる。上記方法を用いて決定した場合、２つのＤＮＡまたは２つのポリペプチド配列は、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％のヌクレオチドまたはアミノ酸が所定の分子の長さにわたって一致する場合、互いに「実質的に相同」である。
【0047】
[0066]所与のポリペプチドの「機能的相同体」または「機能的同等物」は、天然ポリペプチド配列から誘導される分子、ならびに所望の結果を達成するために参照分子と同様に機能する組換え的に生成されたまたは化学的に合成されたポリペプチドを含む。したがって、ＡＡＶ Ｒｅｐ６８またはＲｅｐ７８の機能的相同体は、組み込み活性が残る限り、それらのポリペプチドの誘導体および類似体を、内部にまたはそのアミノ末端もしくはカルボキシ末端に生じる、いずれか１つのまたは複数のアミノ酸の付加、置換および／または欠失を有する誘導体および類似体を含め、包含する。
【0048】
[0067]所与のアデノウイルスヌクレオチド領域の「機能的相同体」または「機能的同等等物」は、異種アデノウイルス血清型に由来する類似の領域、別のウイルスまたは細胞源に由来するヌクレオチド領域、および所望の結果を達成するために参照ヌクレオチド領域と同様に機能する組換え的に生成されたまたは化学的に合成されたポリヌクレオチドを含む。したがって、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ遺伝子領域またはアデノウイルスＥ２Ａ遺伝子領域の機能的相同体は、このような遺伝子領域の誘導体および類似体を、相同体が、バックグラウンド上で検出可能なレベルでＡＡＶビリオン生成を支持するその固有のアクセサリー機能を提供する能力を保持する限り、領域内で生じる、いずれか１つのまたは複数のヌクレオチド塩基の付加、置換および／または欠失を有する誘導体および類似体を含め、包含する。
【0049】
[0068]用語「野生型ＡＡＶ」とは、本明細書で使用される場合、野生型とシュード野生型ＡＡＶの両方を指す。「シュード野生型ＡＡＶ」は、ＩＴＲを担持するＡＡＶベクターとｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を担持するＡＡＶヘルパーベクターとの間の相同的または非相同的な組換えのいずれかによって生成される複製可能ＡＡＶビリオンである。シュード野生型ＡＡＶは、野生型ＡＡＶ配列とは異なる核酸配列を有する。
【0050】
[0069]用語「カプシド形成必須遺伝子産物」とは、感染性アデノウイルス粒子を生成するために、アデノウイルスゲノムをカプシド化するのに不可欠なアデノウイルス遺伝子産物を指す。カプシド形成には、典型的には、「後期」アデノウイルス遺伝子産物が含まれる。例示的なカプシド形成必須アデノウイルス遺伝子産物には、カプシドタンパク質ＩＸ、カプシド形成タンパク質ＩＶ ａ２、タンパク質１３．６、カプシド形成タンパク質５２Ｋ、カプシドタンパク質前駆体ｐｌｌｌａ、ペントン塩基（カプシドタンパク質ＩＩＩ）、コアタンパク質前駆体ｐＶＩＩ、コアタンパク質Ｖ、コアタンパク質前駆体ｐＸ、カプシドタンパク質前駆体ｐＶＩ、ヘキソン（カプシドタンパク質ＩＩ）、プロテアーゼ、ヘキソンアセンブリタンパク質１００Ｋ、タンパク質３３Ｋ、カプシド形成タンパク質２２Ｋ、カプシドタンパク質前駆体ｐＶＩＩＩ、タンパク質ＵＸＰ、およびファイバー（カプシドタンパク質ＩＶ）が含まれる。
【0051】
[0070]用語「カプシド形成非必須遺伝子産物」とは、アデノウイルスゲノムをカプシド化して感染性アデノウイルス粒子を生成するのに不可欠でないアデノウイルス遺伝子産物を指す。カプシド形成非必須アデノウイルス遺伝子産物は、典型的には、アデノウイルスＥ１、Ｅ２、Ｅ３およびＥ４転写ユニットから翻訳される。したがって、カプシド形成非必須アデノウイルス遺伝子産物は、アデノウイルスＥ１転写ユニット（例えば、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ－１９Ｋ、Ｅ１Ｂ－５５Ｋ）から発現される遺伝子産物；アデノウイルスＥ２／Ｅ２Ａ転写ユニット（例えば、Ｉｖａ２、ｐｏｌ、ｐＴＰ、ＤＢＰ）から発現される遺伝子産物；アデノウイルスＥ３転写ユニット（例えば、Ｅ３ ＣＲ１アルファＯ、Ｅ３ ｇｐ１９、Ｅ３ １４．７Ｋ、Ｅ３ ＲＩＤ－ベータ）から発現される遺伝子産物；Ｅ４転写ユニット（例えば、Ｅ４ ３４Ｋ、Ｅ４ ＯＲＦ１、Ｅ４ ＯＲＦＢ、Ｅ４ ＯＲＦ３、Ｅ４ ＯＲＦ４、Ｅ４ ＯＲＦ６／７）から発現される遺伝子産物；またはそれらの組み合わせが含まれ得る。
【0052】
[0071]用語「ｅｄＡｄ」は、１つ以上のカプシド形成必須アデノウイルス遺伝子産物における１つ以上の突然変異を有するアデノウイルス突然変異体を指す。
[0072]本明細書で使用される場合、用語「異種」核酸配列は、外来種に由来する配列を指し、または同種に由来する場合、それは元の形態から実質的に修飾され得る。あるいは、細胞において通常発現されない未変化の核酸配列は、異種核酸配列である。好ましくは、異種配列はプロモーターに作動可能に連結され、キメラ遺伝子を生じさせる。異種核酸配列は、好ましくは、ウイルスＬＴＲプロモーター－エンハンサーシグナルまたは内部プロモーターのいずれかの制御下にあり、レトロウイルスＬＴＲ内に保持されたシグナルは、依然として、導入遺伝子の効率的な発現をもたらすことができる。
[0072]本明細書で使用される場合、用語「異種」核酸配列は、外来種に由来する配列を指し、または同種に由来する場合、それは元の形態から実質的に修飾され得る。あるいは、細胞において通常発現されない未変化の核酸配列は、異種核酸配列である。好ましくは、異種配列はプロモーターに作動可能に連結され、キメラ遺伝子を生じさせる。異種核酸配列は、好ましくは、ウイルスＬＴＲプロモーター－エンハンサーシグナルまたは内部プロモーターのいずれかの制御下にあり、レトロウイルスＬＴＲ内に保持されたシグナルは、依然として、導入遺伝子の効率的な発現をもたらすことができる。
【0053】
[0073]プロモーター配列は、所望の遺伝子配列と相同または異種であり得る。ウイルスまたは哺乳動物プロモーターを含む広範囲のプロモーターを利用することができる。細胞または組織特異的プロモーターを用いて、特定の細胞集団における遺伝子配列の発現を標的化することができる。本出願に適した哺乳動物およびウイルスプロモーターが当該技術分野において入手可能である。適切なプロモーターは、誘導性または条件的なプロモーターである。
【0054】
[0074]場合により、クローニング段階の間、パッケージングシグナルおよび異種クローニング部位を有する、導入ベクターと呼ばれる核酸構築物もまた、選択マーカー遺伝子を含む。マーカー遺伝子は、ベクターの存在をアッセイするために、したがって、感染および組み込みを確認するために利用される。マーカー遺伝子の存在は、挿入物を発現する宿主細胞のみの選択および増殖を確実にする。典型的な選択遺伝子は、抗生物質および他の毒性物質、例えば、ヒスチジノール、ピューロマイシン、ヒグロマイシン、ネオマイシン、メトトレキサートなど、および細胞表面マーカーに対する耐性を付与するタンパク質をコードする。
【0055】
[0075]本出願の組換えウイルスは、哺乳動物細胞に核酸配列を導入することができる。用語「核酸配列」とは、本明細書で詳細に検討されるように、任意の核酸分子、好ましくはＤＮＡを指す。核酸分子は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせを含む種々の供給源から誘導することができる。このような核酸配列は、天然に存在するイントロンを含むかまたは含まない場合があるゲノムＤＮＡを含み得る。さらに、このようなゲノムＤＮＡは、プロモーター領域、ポリＡ配列、または他の関連配列と関連して得ることができる。ゲノムＤＮＡは、当該技術分野において周知である手段によって、適切な細胞から抽出および精製され得る。あるいは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を細胞から単離し、逆転写または他の手段によってｃＤＮＡを生成するために使用することができる。
【0056】
カプシド形成欠損アデノウイルス（ｅｄＡｄ）
[0076]本出願の一態様は、組換えウイルスベクターを生成するためのカプシド形成欠損アデノウイルス（ｅｄＡｄ）に関する。一部の実施形態では、ｅｄＡｄは、（１）１つ以上のカプシド形成必須タンパク質の有意に減少した生成または非生成、および／または（２）１つ以上の欠損カプシド形成必須タンパク質の生成をもたらす、そのゲノムにおける１つ以上の突然変異を含む。このような突然変異には、関連する遺伝子におけるヌクレオチドの置換、挿入または欠失が含まれ得る。このような突然変異はまた、関連遺伝子の調節領域におけるヌクレオチドの置換、挿入または欠失を含み、これらの遺伝子の転写の下方制御または除去をもたらし得る。
[0076]本出願の一態様は、組換えウイルスベクターを生成するためのカプシド形成欠損アデノウイルス（ｅｄＡｄ）に関する。一部の実施形態では、ｅｄＡｄは、（１）１つ以上のカプシド形成必須タンパク質の有意に減少した生成または非生成、および／または（２）１つ以上の欠損カプシド形成必須タンパク質の生成をもたらす、そのゲノムにおける１つ以上の突然変異を含む。このような突然変異には、関連する遺伝子におけるヌクレオチドの置換、挿入または欠失が含まれ得る。このような突然変異はまた、関連遺伝子の調節領域におけるヌクレオチドの置換、挿入または欠失を含み、これらの遺伝子の転写の下方制御または除去をもたらし得る。
【0057】
[0077]ｅｄＡｄはまた、非許容温度ではなく許容温度でそのゲノムをパッケージングすることができる温度感受性突然変異を有するアデノウイルスのタイプを含む。したがって、このカテゴリーのｅｄＡｄの生成は許容温度で行われる。したがって、組換えベクターを生成するためのこれらのｅｄＡＤの適用は、ｅｄＡＤパッケージングを支持しないが、依然として組換えウイルスベクターの生成を促進する非許容温度で行われる。
【0058】
[0078]本明細書に記載されるアデノウイルスは、任意のアデノウイルスサブタイプであるかまたは任意の種由来であり得る。ここでは、明確さと利便性を目的として、主にヒトアデノウイルス５型を使用する。
【0059】
[0079]以下にさらに記載するように、本出願のｅｄＡｄは、他の組換えウイルスの生成に使用することができる。
[0080]図１Ａおよび１Ｂは、アデノウイルス粒子およびそれらの成分を示す。図１Ｃは、そこからコードされるポリペプチドを含むアデノウイルス転写ユニットを示す。後期転写ユニットは、カプシド形成欠損Ａｄ（ｅｄＡｄ）を作製するための突然変異標的であるタンパク質をコードする。図２に示されるように、ｅｄＡｄによる宿主細胞の感染は、アデノウイルスＤＮＡ複製を可能にするが、パッケージングされたアデノウイルス粒子をもたらさない。
[0080]図１Ａおよび１Ｂは、アデノウイルス粒子およびそれらの成分を示す。図１Ｃは、そこからコードされるポリペプチドを含むアデノウイルス転写ユニットを示す。後期転写ユニットは、カプシド形成欠損Ａｄ（ｅｄＡｄ）を作製するための突然変異標的であるタンパク質をコードする。図２に示されるように、ｅｄＡｄによる宿主細胞の感染は、アデノウイルスＤＮＡ複製を可能にするが、パッケージングされたアデノウイルス粒子をもたらさない。
【0060】
[0081]表１は、カプシド形成ウイルスゲノムを生成するのに必要な多数のアデノウイルス遺伝子産物と、それらの対応するタンパク質アクセシジョン番号を列挙する。これらのタンパク質に対応する核酸アクセション番号には、限定されないが、ＧｅｎＢａｎｋ ｇｉ番号２０９８４２、５８４７８、または２９３５２１０に記載され、および／またはＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｍ７３２６０、Ｘ１７０１６、またはＡＦ０３０１５４に注釈されたものが含まれる。
【0061】
【表1】
【0062】
[0082]カプシド形成に必要な遺伝子産物のリストには、カプシドタンパク質ＩＸ、カプシド形成タンパク質ＩＶａ２、タンパク質１３．６、カプシド形成タンパク質５２Ｋ、カプシドタンパク質前駆体ｐｌｌｌａ、ペントン塩基（カプシドタンパク質ＩＩＩ）、コアタンパク質前駆体ｐＶＩＩ、コアタンパク質Ｖ、コアタンパク質前駆体ｐＸ、カプシドタンパク質前駆体ｐＶＩ、ヘキソン（カプシドタンパク質ＩＩ）、プロテアーゼ、ヘキソンアセンブリタンパク質１００Ｋ、タンパク質３３Ｋ、カプシド形成タンパク質２２Ｋ、カプシドタンパク質前駆体ｐＶＩＩＩ、タンパク質ＵＸＰ、およびファイバー（カプシドタンパク質ＩＶ）が含まれる。本明細書で使用される場合、これらの遺伝子産物は、カプシド形成に不可欠な遺伝子産物（または「カプシド形成必須遺伝子産物」）を構成し、以下にさらに記載するように、カプシド形成に直接関連しない他のアデノウイルス遺伝子産物と区別されるべきである。加えて、本出願のｅｄＡｄは、カプシド形成に必要なシス作用性配列に突然変異を含むアデノウイルスゲノムと区別される。アデノウイルスのカプシド形成に関与するタンパク質の機能の喪失に加えて、これらのタンパク質の温度感受性突然変異もまた組換えウイルスベクターの生成に有用である。カプシド形成欠損アデノウイルスは、組換えウイルスベクター生成の３つの主要な特徴を有する：１．ｅｄＡｄの感染によるトランスフェクションは避ける。２．ｅｄＡｄゲノムを複製し、組換えベクターの生成に役立ち得る遺伝子のコピーを増やす。３．生成宿主細胞におけるパッケージ化アデノウイルスの生成を減少または除去する。複製特性は、ｅｄＡｄに必要な初期遺伝子、例えば、（Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４）を保持するか、またはこのような遺伝子を組み込んだ宿主株でそれらを用いずにｅｄＡｄを完成させることによって維持することができ；例えば、ｅｄＡｄ－ｌａｇは２９３細胞内で複製することができ；ｅｄａｄ－２ｇは９１１Ｅ４細胞株内で複製することができ；一方、ｅｄＡｄ－ｄｐ３は、パッケージ化されたアデノウイルスを生成することなく、ａｄＡｄ－ｄｐ３が感染し得る任意の細胞株で複製できる。
【0063】
[0083]一実施形態では、組換えウイルスベクターの生成のための宿主細胞は、アデノウイルスに対するレセプターを欠く。インテグリン、ＣＡＲ、ＣＤ４６、Ｃｄ８０、Ｃｄ８６および他のアデノウイルス受容体などのアデノウイルス受容体を宿主細胞中で発現させて、それらをアデノウイルス感染に適合させることができる。
【0064】
[0084]一部の実施形態では、本出願のｅｄＡｄは、１つ以上のカプシド形成必須遺伝子に突然変異を有するウイルスゲノムを含み、突然変異は、カプシド形成必須遺伝子産物の非生成、または欠損カプシド形成必須遺伝子産物の生成をもたらす。例示的な突然変異は、カプシド形成必須アデノウイルス生成物および／またはカプシド形成非必須アデノウイルス遺伝子産物のいずれかをコードする核酸配列における欠失、挿入、配列置換、および／または置換を含む。本明細書で使用される場合、置換突然変異は、温度感受性突然変異を含む。
【0065】
[0085]図３のパネルＢ～Ｄは、アデノウイルス遺伝子が欠失され、および／または他の配列、例えば導入遺伝子または欠損ウイルスゲノムで置換される程度がそれぞれ異なる種々のｅｄＡｄを示す。したがって、ｅｄＡｄゲノムは、カプシド形成と直接関連しない１つ以上のアデノウイルス遺伝子産物、すなわち「カプシド形成非必須」アデノウイルス遺伝子産物の発現を妨げる１つ以上の突然変異をさらに含むことができる。Ａｄカプシド形成非必須生成物には、例えば、アデノウイルスＥ１転写ユニット（例えば、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ－１９Ｋ、Ｅ１Ｂ－５５Ｋ）から発現されるタンパク質；アデノウイルスＥ２／Ｅ２Ａ転写ユニット（例えば、Ｉｖａ２、ｐｏｌ、ｐＴＰ、ＤＢＰ）から発現されるタンパク質；アデノウイルスＥ３転写ユニット（例えば、Ｅ３ ＣＲ１アルファ０、Ｅ３ ｇｐ１９、Ｅ３ １４．７Ｋ、Ｅ３ ＲＩＤ－ベータ）から発現されるタンパク質；およびＥ４転写ユニット（例えば、Ｅ４ ３４Ｋ、Ｅ４ ＯＲＦ１、Ｅ４ ＯＲＦＢ、Ｅ４ ＯＲＦ３、Ｅ４ ＯＲＦ４、Ｅ４ ＯＲＦ６／７）から発現されるタンパク質が含まれる。
【0066】
[0086]一実施形態では、ｅｄＡｄはＡｄ ｐＩＩＩａの発現を妨げる突然変異を含む。他の実施形態では、ｅｄＡｄは、他のカプシド形成必須タンパク質の発現を妨げる突然変異を含む。
【0067】
[0087]一部の実施形態では、ｅｄＡｄは、さらに、限定されないが、Ｅ１単独における欠失または配列置換（図４、パネルＢ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）；Ｅ３単独における欠失または配列置換（図４、パネルＡ）；Ｅ１とＥ３の両方における欠失または配列置換（図３、パネルＣ、Ｄ、および図４、パネルＢ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）；Ｅ１、Ｅ２およびＥ３における欠失（図３、パネルＤ、および図４、パネルＤおよびＥ）を含め、１つ以上のＡｄカプシド形成非必須タンパク質の発現を妨げる１つ以上の突然変異を含む。
【0068】
[0088]さらに別の実施形態では、ｅｄＡｄは、Ａｄヘキソンアセンブリタンパク質１００Ｋの発現を妨げる突然変異を含む。他の実施形態では、１００ｋ欠失を有するｅｄＡｄは、ｐＩＩＩａを妨げる突然変異を含む。さらなる実施形態では、ｅｄＡｄは、他のカプシド形成必須タンパク質の発現を妨げる突然変異を含む。ｅｄＡｄは、さらに、限定されないが、Ｅ１単独における欠失または配列置換；Ｅ３単独における欠失または配列置換；Ｅ１とＥ３の両方における欠失または配列置換；ならびにＥ１、Ｅ３およびＥ４における欠失を含め、１つ以上のＡｄカプシド形成非必須タンパク質の発現を妨げる１つ以上の突然変異を含む。
【0069】
[0089]一部の実施形態では、特定のアデノウイルス遺伝子配列は、図４のパネルＡ～Ｅに示されるように所望の標的遺伝子を発現するように操作された欠損ウイルスゲノムで置換される。特定の好ましい実施形態では、欠損ウイルスゲノムは、ＡＡＶ、またはＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２もしくはＳＩＶなどのレンチウイルス由来である。
【0070】
[0090]あるいは、またはさらに、アデノウイルス遺伝子配列は、例えば、Ｃｒｅ（例えば、図４、パネルＣを参照されたい）またはＦｌｐなどのリコンビナーゼ酵素を発現するための発現カセットで置換して、以下にさらに記載されるように、１つ以上のヘルパー遺伝子産物の活性化を提供することができる。一部の実施形態では、ｅｄＡｄ中のＡｄゲノムは、１つ以上のヘルパー機能の発現を調節するように、組換えのためのシス作用性ＤＮＡシグナル（例えば、ｌｏｘＰ、ＦＲＴなど）を含むように操作される。例えば、ｅｄＡｄ中のＡｄゲノムは、宿主細胞に安定に組み込まれたＲｅｐ－Ｃａｐ発現ユニット内のイントロン中の断片に隣接するｌｏｘＰ部位を含む「ロックされた断片」を含むように修飾することができ、その結果、ロックされた断片は、ｃｒｅ媒介性切り出しの基質として機能し、結果としてＡＡＶ Ｒｅｐ／Ｃａｐ発現の活性化をもたらす。この組換え（およびこれに伴う欠失）を容易にするために、パッケージング細胞はｅｄＡｄゲノムＤＮＡをトランスフェクトされ得るか、またはｅｄＡｄウイルス粒子に感染した生成細胞は、さらに、Ｃｒｅリコンビナーゼ（ｌｏｘＰを伴う）またはＦｌｐリコンビナーゼ（ＦＲＴを伴う）などの安定的または一時的にトランスフェクトされるリコンビナーゼを含み得る。
【0071】
[0091]別の実施形態では、ｅｄＡｄはＡｄヘキソンの発現を妨げる突然変異を含む。さらに別の実施形態では、ｅｄＡｄは、Ａｄペントンの発現を妨げる突然変異を含む。さらなる実施形態では、ｅｄＡｄは、Ａｄファイバータンパク質の発現を妨げる突然変異を含む。他の実施形態では、ｅｄＡｄは、表１に示される他のカプシド形成必須タンパク質の発現を妨げる突然変異を含む。
【0072】
[0092]一実施形態では、ｅｄＡｄは、無傷な空のカプシドを作製し、アデノウイルスゲノムのパッケージングに欠損がある欠損カプシド形成必須タンパク質を有する。別の実施形態では、ｅｄＡｄは、欠損がある空のカプシド（ｃａｐｉｄｓ）を作製し、アデノウイルスゲノムをパッケージングするのに欠損がある欠損カプシド形成必須タンパク質を有する。さらなる実施形態では、ｅｄＡｄは、カプシドを空にしない欠損カプシド形成必須タンパク質を有する。
【0073】
ｅｄＡｄを生成する方法
[0093]本出願の別の態様は、本出願のｅｄＡｄを生成する方法に関する。一部の実施形態では、本方法は、（ａ）パッケージング細胞をｅｄＡｄに感染させて感染パッケージング細胞を生成させる工程、（ｂ）ｅｄＡｄの複製を可能にする条件下で感染パッケージング細胞をインキュベートする工程、および（ｃ）再生されたｅｄＡｄを採取する工程を含み、パッケージング細胞は、パッケージング細胞内でｅｄＡｄのカプシド形成を可能にする１つ以上の遺伝子産物を生成することができる。
[0093]本出願の別の態様は、本出願のｅｄＡｄを生成する方法に関する。一部の実施形態では、本方法は、（ａ）パッケージング細胞をｅｄＡｄに感染させて感染パッケージング細胞を生成させる工程、（ｂ）ｅｄＡｄの複製を可能にする条件下で感染パッケージング細胞をインキュベートする工程、および（ｃ）再生されたｅｄＡｄを採取する工程を含み、パッケージング細胞は、パッケージング細胞内でｅｄＡｄのカプシド形成を可能にする１つ以上の遺伝子産物を生成することができる。
【0074】
[0094]一部の実施形態では、本方法は、（ａ）ｅｄＡｄゲノムをパッケージング細胞にトランスフェクトして、トランスフェクションされたパッケージング細胞を生成する工程であって、ｅｄＡｄゲノムが、１つ以上のアデノウイルスカプシド形成必須遺伝子産物の発現を妨げるか、または１つ以上の欠損アデノウイルスカプシド形成必須遺伝子産物の発現をもたらす１つ以上の突然変異を含む工程、（ｂ）感染性ｅｄＡｄ粒子の生成を可能にする条件下で、トランスフェクトされたパッケージング細胞を培養する工程、および（ｃ）感染性ｅｄＡｄ粒子を採取する工程を含み、パッケージング細胞は、パッケージング細胞内でｅｄＡｄのカプシド形成を可能にする１つ以上の機能的アデノウイルスカプシド形成必須遺伝子産物を生成することができる。
【0075】
[0095]ｅｄＡｄゲノムは、当該技術分野において周知である技術を用いて生成することができる。任意の適切な分子生物学および生化学的方法（例えば、核酸配列決定）を使用して、アデノウイルス核酸に導入された欠失の存在および位置を同定することができる。例えば、核酸は、ゲル電気泳動を用いてサイズによって分離することができ、元の核酸の長さに対して部分が除去されたことを確認することができる。場合によっては、コードされたポリペプチド（例えば、ファイバーポリペプチド）上の種々のエピトープを認識する抗体を用いて、欠失の標的となるポリペプチドの有無を検出することができる。
【0076】
[0096]一実施形態では、ｅｄＡｄは、標準分子生物学技術、例えば相同組換え、制限酵素消化（ｃａｓ９／ｇＲＮＡを含む）、ｃｒｅ媒介組換え体を用いて、ｐＦＧｌ４０、ｐＴＧ３６０２、ｐＡｄＥａｓｙ－１、ｐＡｄＥａｓｙ－２（ａｄｄｇｅｎｅから）などの選択されたアデノウイルスプラスミドから生成され、アデノウイルスゲノムにおける所望の突然変異および挿入を作製する。例えば、ｐＩＩＩａ遺伝子は、Ｍ Ｂａｒｒｙグループ（Ｃｒｏｓｂｙ ＣＭ、Ｂａｒｒｙ ＭＡ．Ｉｌｉａ ｄｅｌｅｔｅｄ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ａｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｙｃｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ． ２０１４；４６２～４６３頁：１５８－１６５．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｖｉｒｏｌ．２０１４．０５．０３０）によって以前に公開されたように相同組換えによって置換される。あるいは、設計されたｇＲＮＡおよびｃａｓ９消化を用いて、ヘキソン遺伝子を部分的に欠失させる。ＡＡＶゲノムおよび他の遺伝子は、ライゲーションによって、または適切な細菌中でｐｓｈｕｔｔｌｅベクターおよびｃｒｅリコンビナーゼを使用してアデノウイルスゲノムに導入される。得られたアデノウイルスプラスミドは、アデノウイルス複製およびパッケージングに不可欠な欠失したエレメントを供給するトランスフェクトされたプラスミドまたは組み込まれた遺伝子を用いて宿主細胞内でレスキューされる。次に、レスキューされたｅｄＡｄを、対応するパッケージング細胞株を用いて拡大する。
【0077】
ｅｄＡｄのためのパッケージング細胞株
[0097]別の態様では、本発明は、感染性ｅｄＡｄを生成するためのパッケージング細胞株を提供する。一部の実施形態では、パッケージング細胞は、宿主パッケージング細胞内でｅｄＡｄの複製およびカプシド形成を可能にする１つ以上の遺伝子産物を供給することができる。
[0097]別の態様では、本発明は、感染性ｅｄＡｄを生成するためのパッケージング細胞株を提供する。一部の実施形態では、パッケージング細胞は、宿主パッケージング細胞内でｅｄＡｄの複製およびカプシド形成を可能にする１つ以上の遺伝子産物を供給することができる。
【0078】
[0098]パッケージング細胞は、パッケージング細胞内でのｅｄＡｄのカプシド形成を可能にする１つ以上の遺伝子産物の生成のための一過性もしくは安定なトランスフェクションまたは感染によって生成することができる。パッケージング細胞は、任意の適切な細胞株から誘導することができる。本明細書に記載される方法とともに使用するための例示的な生成細胞株には、限定されないが、２９３、９１１Ｅ４、Ａ５４９、ＰＥＲ．Ｃ６、Ｈｅｌａ、ＢＨＫ、ＣＯＳおよびＣＨＯが含まれる。一部の実施形態では、パッケージング細胞は哺乳動物細胞に由来する。一部の実施形態では、パッケージング細胞は２９３細胞に由来する。別の実施形態では、パッケージング細胞はＨｅｌａ細胞に由来する。別の実施形態では、パッケージング細胞はＣＨＯ細胞に由来する。
【0079】
[0099]一部の実施形態では、パッケージング細胞は、ｅｄＡｄゲノムに欠如または欠損している必須カプシド形成遺伝子産物を発現することができるかまたは発現する。一部の実施形態では、パッケージング細胞は、ｅｄＡｄゲノムに欠如または欠損している必須カプシド形成遺伝子産物および非必須カプシド形成遺伝子産物を発現することができるかまたは発現する。
【0080】
[0100]さらに別の実施形態では、温度感受性突然変異を有するｅｄＡｄは、許容温度で増殖され得る。温度感受性突然変異の例としては、限定されないが、ヒトアデノウイルス２型の温度感受性突然変異体の単離および表現型の特徴付けに記載されるＥ３領域における欠失が挙げられる。Ｍａｒｔｉｎ ＧＲ、Ｗａｒｏｃｑｕｉｅｒ Ｒ、Ｃｏｕｓｉｎ Ｃ、Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎ ＪＣ、Ｂｏｕｌａｎｇｅｒ ＰＡ．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．１９７８ Ｎｏｖ；４１巻（２号）：３０３～１４。温度感受性（ｔｓ）変異体は、３９．５℃では増殖できないが、３３℃では正常に増殖することがある。二重感染細胞培養物における制限温度での相補性試験を用いて、それらを同定することができる。それらは、それらの可溶性カプシド抗原生成に従って表現型で特徴付けられる。それらは、可溶性ヘキソンの生成、ペントン（ペントン塩基＋ファイバー）の総量、およびウイルスをパッケージングすることからそれらを妨げる他の遺伝子に欠損がある場合がある。この特性は、ＡＡＶ生成のためのｅｄＡｄを相補することができる。
【0081】
[0101]パッケージング細胞は、トランスフェクションまたはウイルス感染によって生成され得る。一部の実施形態では、パッケージング細胞株は、ｅｄＡｄゲノムにおける１つ以上の欠損（すなわち、カプシド形成必須およびカプシド形成非必須生成物に影響する突然変異）を相補する１つ以上のアデノウイルス遺伝子産物で安定に形質転換される。
【0082】
ｅｄＡｄを用いた組換えウイルスを生成する方法
[0102]本出願の別の態様は、組換えウイルス（ＲＶ）を生成する方法に関する。本方法は、（ａ）宿主細胞を１つ以上のｅｄＡｄで感染させて、感染宿主細胞を生成させる工程、（ｂ）ＲＶゲノムを有するＲＶの生成を可能にする条件下で感染宿主細胞をインキュベートする工程、および（ｃ）組換えウイルスを採取する工程を含み、ｅｄＡｄまたは宿主細胞のいずれかがＲＶゲノムを含む。
[0102]本出願の別の態様は、組換えウイルス（ＲＶ）を生成する方法に関する。本方法は、（ａ）宿主細胞を１つ以上のｅｄＡｄで感染させて、感染宿主細胞を生成させる工程、（ｂ）ＲＶゲノムを有するＲＶの生成を可能にする条件下で感染宿主細胞をインキュベートする工程、および（ｃ）組換えウイルスを採取する工程を含み、ｅｄＡｄまたは宿主細胞のいずれかがＲＶゲノムを含む。
【0083】
[0103]ＲＶは、ＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルス、ポリオウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルス、シンドビスウイルス、アルファウイルス、アストロウイルス、コロナウイルス、オルトミクソウイルス、パポバウイルス、パラミクソウイルス、パルボウイルス、ピコマウイルス、ポックスウイルス、トガウイルス、またはその血清型を含む任意の他のウイルス、およびそれらのシュードタイプであり得る。
【0084】
[0104]一部の実施形態では、ＲＶは組換え自律パルボウイルスである。組換えパルボウイルスは、任意の自律パルボウイルスのメンバーであり得る。例示的なパルボウイルスには、マウスの微小ウイルス（ＭＶＭ）、Ｈ１、ＬｕＩＩＩ、Ｂ１９、ＣＰＶ、Ｂｏｃａウイルス、ＦＰＶおよび他が含まれる。選択されたＮＳ、ＶＰ遺伝子、誘導遺伝子（例えば、ｃｒｅ、ｔｅｔ－ｏｎ、ｔｅｔ－ｏｆｆなど）またはベクターゲノムからのエレメントの少なくとも１つを担持するｅｄＡｄを使用して、パルボウイルスの複製およびパッケージングから、ｅｄＡｄから欠失しているエレメントを供給する宿主細胞に感染させることができる。宿主細胞は、同様にアデノウイルスゲノムの複製のために欠失したアデノウイルス初期遺伝子も供給する。
【0085】
組換えＡＡＶベクターの生成
[0105]一部の実施形態では、ＲＶは組換えＡＡＶである。組換えＡＡＶは任意の血清型であり得る。例示的なＡＡＶ血清型には、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＶＡ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、およびＡＡＶ－１３が含まれる。選択されたａａｖ－ｒｅｐ－ｃａｐ、アデノウイルスＥ１、Ｅ２、もしくはＥ４；または誘導エレメント（例えば、ｃｒｅ、ｃａｓ９／ｇＲＮＡ、ｔｅｔ－ｏｎ、ｔｅｔ－ｏｆｆ）もしくはベクターゲノムからのエレメントの少なくとも１つを担持するｅｄＡｄを使用して、ＡＡＶ複製およびパッケージングから、ｅｄＡｄから欠失しているエレメントを供給する宿主細胞に感染させることができる。宿主細胞は、アデノウイルスゲノムの複製のために欠失したアデノウイルス初期遺伝子も供給する。
[0105]一部の実施形態では、ＲＶは組換えＡＡＶである。組換えＡＡＶは任意の血清型であり得る。例示的なＡＡＶ血清型には、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＶＡ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、およびＡＡＶ－１３が含まれる。選択されたａａｖ－ｒｅｐ－ｃａｐ、アデノウイルスＥ１、Ｅ２、もしくはＥ４；または誘導エレメント（例えば、ｃｒｅ、ｃａｓ９／ｇＲＮＡ、ｔｅｔ－ｏｎ、ｔｅｔ－ｏｆｆ）もしくはベクターゲノムからのエレメントの少なくとも１つを担持するｅｄＡｄを使用して、ＡＡＶ複製およびパッケージングから、ｅｄＡｄから欠失しているエレメントを供給する宿主細胞に感染させることができる。宿主細胞は、アデノウイルスゲノムの複製のために欠失したアデノウイルス初期遺伝子も供給する。
【0086】
[0106]遺伝子送達のための複製欠損ウイルス粒子を生成するための従来の方法は、プラスミドの二重または三重トランスフェクションを実施することである。例として、図６は、Ｅ１ａおよびＥ１ｂによって指定されるヘルパー機能を発現するように安定に形質転換された細胞（２９３細胞など）における感染性複製欠損ｒＡＡＶを生成するための方法を示す。１つのプラスミドは、複製のための必須シス作用配列、例えばＩＴＲまたはＬＴＲを含む欠損ウイルスゲノムを含み、目的の所望の導入遺伝子または標的遺伝子が、その発現のために隣接ＩＴＲまたは隣接ＬＴＲの間に挿入される。他のプラスミドは、ＡＡＶ Ｒｅｐ、ＡＡＶ Ｃａｐ、Ａｄ Ｅ２ａ、ＶＡＲＮＡおよびＥ４などのｒＡＡＶを生成するのに必要な他のヘルパー機能を発現するように設計される。図７は、Ａｄヘルパー機能がｗｔＡｄ（またはパッケージングコンピテントＡｄ、ｐｃＡｄ）による宿主細胞の感染によって提供される場合、回収されたウイルス粒子はｒＡＡＶとｗｔＡｄの両方を含むことを示す。
【0087】
[0107]一部の実施形態では、組換えＡＡＶベクターは、本出願のｅｄＡｄを用いて生成される。ｅｄＡｄをコードする核酸分子は、以下のアデノウイルス配列：ファイバータンパク質コード配列、Ｖタンパク質コード配列、ヘキソンコード配列、ペントン塩基コード配列、ピルタンパク質コード配列、または他の初期もしくは後期遺伝子産物コード配列のうちの少なくとも１つの全部または一部を欠くことを除いて、アデノウイルス（例えば、Ａｄ５ウイルス）の天然に存在する配列の全てを含む。ポリペプチドをコードするアデノウイルス核酸配列の例には、限定されないが、ＧｅｎＢａｎｋ ｇｉ番号２０９８４２、５８４７８、もしくは２９３５２１０に記載されたもの、および／またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ７３２６０、Ｘ１７０１６、もしくはＡＦ０３０１５４に注釈されたものが含まれる。
【0088】
[0108]一部の実施形態では、以下のポリペプチドのうちの１つ以上をコードする核酸の全部または一部の突然変異または欠失は、アデノウイルスをコードする核酸に操作される：ファイバータンパク質コード配列、Ｖタンパク質コード配列、ヘキソンをコードする配列、ペントンをコードする配列、ＶＡ ＲＮＡをコードする配列、ピルタンパク質をコードする配列、または他の初期もしくは後期遺伝子産物をコードする配列に操作される。このような欠失は、１つ以上のコードされたアミノ酸の欠失をもたらす任意の長さであり得る。例えば、アデノウイルスの核酸配列の部分は、コードされたポリペプチドが５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、またはそれを超えるアミノ酸残基を欠くように削除することができる。欠失される部分または複数の部分は、配列の長さに沿った任意の位置から除去することができる。例えば、アデノウイルス核酸配列の一部は、５’末端、３’末端、またはアデノウイルス核酸の内部領域、例えばファイバータンパク質をコードする配列、Ｖタンパク質をコードする配列、ヘキソンをコードする配列、ペントン塩基をコードする配列、ＶＡ ＲＮＡをコードする配列、ピルタンパク質をコードする配列、または他の初期もしくは後期遺伝子産物をコードする配列で除去することができる。
【0089】
[0109]任意の適切な分子生物学および生化学的方法（例えば、核酸配列決定）を使用して、アデノウイルス核酸に導入された欠失の存在および位置を同定することができる。例えば、核酸は、ゲル電気泳動を用いてサイズによって分離して、元の核酸の長さに対して部分が除去されたことを確認することができる。場合によっては、コードされたポリペプチド（例えば、ファイバーポリペプチド）上の種々のエピトープを認識する抗体を用いて、欠失の標的となるポリペプチドの有無を検出することができる。
【0090】
[0110]一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ヘルパーとしてアデノウイルスを用いて生成される。現在、ＡＡＶ生成にアデノウイルスヘルパーを用いる方法は２つある。一方は、トランスフェクション法に依存する、スケーラブルでないアデノウイルスＤＮＡの使用である。他方は、野生型（ｗｔ）アデノウイルス、またはＥ１ａ／Ｅ１ｂ領域に欠失を有するアデノウイルスの使用である。これは、ＡＡＶ調製物から除去することが非常に困難であるカプシド形成ＤＮＡによるアデノウイルスの汚染をもたらす。
【0091】
[0111]ｅｄＡｄは、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、ＶＡ ＲＮＡ、Ｅ２、Ｅ４および他のアデノウイルス遺伝子を含む、ＡＡＶ生成に必要な１つ以上のヘルパー機能を提供する。ｅｄＡｄは、ＡＡＶ複製およびパッケージングを相補するが、ｅｄＡｄ自体は、ＡＡＶ生成宿主細胞中にカプシド形成されたゲノムを有するアデノウイルスを生成しない。
【0092】
[0112]一部の実施形態では、ｅｄＡｄは、異なる条件においてＡＡＶ生成を相補することができるより多くの特徴を有するようにさらに修飾される。Ｅ１／Ｅ１ｂまたはＥ３を欠失させて、ｅｄＡｄｌｇを作製することができ、これは、ＡＡＶベクターゲノムをｅｄＡｄｌｇおよび生成システムに不可欠な他の因子に担持させることができる。例えば、ｃｒｅ、ＦＬＰおよびｃｒｉｓｐｒエレメントは、上記アデノウイルスによっても担持することができる。アデノウイルスゲノムのさらなる欠失は、他の必須エレメントを収容することができるようにする。ＡＡＶ生成に必須のこれらのエレメントは、宿主細胞に組み込むことができる。
【0093】
[0113]一部の実施形態では、ＡＡＶゲノムはｅｄＡｄへと構築される。これは一部の状況では望ましく、ｅｄＡＤが広範な複製を受けた場合、ＡＡＶゲノムコピーは劇的に増加する。ｒｅｐおよびｃａｐ発現を誘導するために重要であり得る他の遺伝子をｅｄＡｄへと構築することができる。一部の実施形態では、ＡＡＶゲノムは、ｅｄＡｄにクローンニングされる。他の実施形態では、組み込まれた宿主遺伝子を制御するために使用される遺伝子も同様にｅｄＡｄに組み込まれる。このような遺伝子には、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡまたはｃｒｉｓｐｒ酵素の他の変異体、ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナンス、および遺伝子発現を調節することができる他のタンパク質が含まれる。
【0094】
[0114]一部の実施形態では、ｅｄＡｄは、ＡＡＶベクター生成のために使用される。ＡＡＶ生成宿主細胞をｅｄＡｄに感染させる。ＡＡＶ生成に必須であるが、ｅｄＡｄによって担持されないエレメントは、トランスフェクションによってトランスに供給されるかまたは生成宿主細胞に組み込まれる。ＡＡＶ生成宿主細胞は、アデノウイルスゲノムがアデノウイルスカプシドにパッケージングされないように、ｅｄＡｄパッケージングを回復するための因子／エレメントを有さない。
【0095】
[0115]ｅｄＡｄウイルスは、異なる構成を有することができる。例えば、２９３細胞に基づく宿主細胞において、ｅｄＡｄ１ｇは、宿主細胞において供給されたときに、Ｅ１ａおよびＥ１を除去することができるため、使用することができる。対照的に、ＣＨＯに基づく宿主細胞における生成のためには、Ｅ１ａおよびＥ１ｂ領域がｅｄＡＤウイルスに含まれなければならない。
【0096】
[0116]ｒＡＡＶビリオンを生成するための宿主細胞もまた本明細書に提供される。特定の実施形態では、本発明の宿主細胞は、ＡＡＶヘルパー機能をコードする核酸を含む。ＡＡＶベクターの導入および宿主細胞におけるアクセサリー機能の発現に際して、ｒＡＡＶビリオンが生成される。特定の好ましい実施形態では、本発明の宿主細胞はまた、１つ以上のアクセサリー機能を含む。
【0097】
[0117]本発明は、さらに、このような方法によって生成されたｒＡＡＶおよびｒＡＡＶビリオンを生成するためにアクセサリー機能ベクターを使用する方法を提供する。特定の実施形態では、本発明の方法は、（１）適切な宿主細胞にＡＡＶベクターゲノムを導入する工程；（２）本発明のＡＡＶヘルパーウイルスを宿主細胞に導入する工程；（３）宿主細胞においてアクセサリー機能を発現する工程；および（４）宿主細胞を培養してｒＡＡＶビリオンを生成する工程を含む。ＡＡＶベクターおよびＡＡＶヘルパー機能ベクターは、周知の技術を用いて、連続的にまたは同時に、宿主細胞にトランスフェクトすることができる。アクセサリー機能は、宿主細胞を適切なヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、またはワクシニアウイルス）で感染させること、または１つ以上のアクセサリー機能ベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることを含む、いくつかの方法のいずれかで発現され得る。また、特定の細胞株、例えば２９３細胞が、本質的に１つ以上のアクセサリー機能を発現することもまた当該技術分野において周知である。
【0098】
[0118]本発明を用いて生成されたｒＡＡＶビリオンは、種々の研究および治療用途のために、ヒトを含む動物、または単離された動物細胞に遺伝物質を導入するために使用することができる。例えば、本発明の方法を用いて生成されたｒＡＡＶビリオンを用いて、動物においてタンパク質を発現させて、前臨床データを収集しまたは潜在的な薬物候補をスクリーニングすることができる。あるいは、ｒＡＡＶビリオンを用いて、遺伝的欠損を治癒するために、または所望の治療を実施するために遺伝物質をヒトに導入することができる。
【0099】
[0119]ｅｄＡｄを用いてパルボウイルスベクターを生成するための一般的な方法は、以下のこの方法である：ＡＡＶ ｒｅｐ＆ｃａｐまたはＡＡＶベクタープラスミドをトランスフェクトされた細胞において、ｅｄＡｄは、ＡＡＶ生成に必要なヘルパー機能を送達するために使用される。次に、ベクターは、培地中または細胞中で種々の時間に採取することができる。ｒｅｐ＆ｃａｐ機能は、宿主細胞に組み込むことができ、またはウイルスもしくは非ウイルスベクターによって送達することができる。ＡＡＶベクタープラスミドはまた、宿主細胞株に組み込まれ得るか、またはウイルスベクターによって送達され得る。１つの特定の実施形態では、ＡＡＶベクター配列はｅｄＡｄのゲノム中にある。必要に応じて、追加因子を担持する複数のｅｄＡｄはｒＡＡＶ再生のためであり得る。
【0100】
[0120]一部の実施形態では、感染性ｅｄＡｄウイルス粒子は、生成細胞株におけるＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ Ｒｅｐおよび／またはＡＡＶ Ｃａｐ）の複製のための１つ以上のヘルパー機能と共発現される。ＡＡＶの複製を容易にするために、生成細胞は、複製欠損ＡＡＶ粒子の生成のための必須ｃｖ．Ｙ活性配列、例えばＡＡＶ ＩＴＲを含むＡＡＶベクター構築物をトランスフェクトされるか、または他にはそれを含む。ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子は、生成細胞株に安定に組み込まれ得るか、またはそれらはウイルスもしくは非ウイルスベクターによって送達され得る。ＡＡＶベクタープラスミドはまた、生成細胞株に組み込むことができ、またはウイルスベクターもしくは非ウイルスベクターによって送達することができる。特定の実施形態では、ＡＡＶベクター配列は、ａｄＡｄウイルス粒子を生成するためのｅｄＡｄＤＮＡ構築物中にクローニングされる。所与のｒＡＡＶまたは複数の異なるｒＡＡＶを生成するために、複数のｅｄＡＤを使用することができる。
【0101】
[0121]特定の実施形態では、ｒＡＡＶを生成する方法は、宿主細胞をｅｄＡｄで感染させることを含み、宿主細胞は、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐを発現するように安定に形質転換され、図８に示されるように所望の標的遺伝子を発現するように操作された欠損ＡＡＶゲノムで安定に形質転換される。
【0102】
[0122]別の実施形態では、ｒＡＡＶを生成する方法は、宿主細胞をｅｄＡｄに感染させることを含み、ｅｄＡｄゲノムは、所望の標的遺伝子を発現するように操作された欠損ＡＡＶゲノムを含み、宿主細胞（例えば、ＨｅｌａまたはＡ５４９）は、図９に示されるようにＡｄ Ｅ１ａ、Ａｄ Ｅ１ｂ、ＡＡＶ Ｒｅｐ、およびＡＡＶ Ｃａｐタンパク質を発現するように安定に形質転換される。一部の実施形態では、ｅｄＡｄはｅｄＡｄ－１００ｋである。
【0103】
[0123]別の実施形態では、ｒＡＡＶを生成する方法は、宿主細胞をｅｄＡｄに感染させることを含み、ｅｄＡｄゲノムは、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するように操作された欠損ＡＡＶゲノム、および目的の所望の標的遺伝子を含み、宿主細胞は、Ａｄ Ｅ１、Ｅ２およびＥ４遺伝子で安定に形質転換され、図１１に示されるようにＡＡＶ ＲｅｐおよびＡＡＶ Ｃａｐタンパク質を発現するように安定に形質転換される。この場合、ｅｄＡｄからＣｒｅリコンビナーゼを発現させると、Ｒｅｐ－Ｃａｐ発現単位に組み込まれたイントロン内の「ロックされた断片」が切り出され、Ｒｅｐ－Ｃａｐタンパク質の発現が活性化される。ロックされた断片は、ｃｒｅ媒介性切り出しの基質として働き、ＡＡＶ Ｒｅｐ／Ｃａｐ発現の活性化をもたらす、イントロン内の断片に隣接するｌｏｘＰ部位を含む。
【0104】
[0124]本明細書に提供されるＡＡＶウイルスは、０．０１～１０６の広範囲のＭＯＩで使用することができる。ウイルスベクター生成のために他のエレメントを誘導する前後で、細胞を感染させるために使用することができる。
【0105】
他の組換えウイルス
[0125]一部の実施形態では、ＲＶは組換えレンチウイルスである。一部の実施形態では、組換えレンチウイルスは、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２またはＳＩＶである。
[0125]一部の実施形態では、ＲＶは組換えレンチウイルスである。一部の実施形態では、組換えレンチウイルスは、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２またはＳＩＶである。
【0106】
[0126]一実施形態では、ＲＶは組換えレトロウイルスである。一部の実施形態では、組換えレンチウイルスは、モロニーマウス白血病ウイルスである。
[0127]一部の実施形態では、ＲＶは組換えワクシニアウイルスである。
[0127]一部の実施形態では、ＲＶは組換えワクシニアウイルスである。
【0107】
[0128]一部の実施形態では、ＲＶは組換えヘルペスウイルスである。例示的ヘルペスウイルスには、限定されないが、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）－１、ＨＳＶ－２、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）－１、ＨＨＶ－２、ＨＨＶ－３、ＨＨＶ－４、ＨＨＶ－７、ＨＨＶ－８、および水痘帯状疱疹、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）が含まれる。
【0108】
[0129]組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）、組換えレンチウイルスおよび他のものなどの、ストック感染性複製欠損組換えウイルス粒子（ウイルスベクターとも呼ばれる）を生成するために、ｅｄＡｄは組換えウイルス（例えば、ＡＡＶ、レンチウイルスなど）由来の構造要素と組み合わせて使用され、組換えウイルスに対応する感染性ウイルス粒子を生成する。プラスミドの二重または三重トランスフェクションを伴う他の方法とは異なり、１つ以上のｅｄＡｄによる宿主細胞の感染は、より高い力価をもたらし、汚染をほとんどまたは全く生じさせないで形質導入効率を有意に増加させる。
【0109】
[0130]一部の実施形態では、生成細胞は、１つ以上のＡｄヘルパー機能、１つ以上のＡＡＶヘルパー機能、またはそれらの組み合わせを発現するように操作された核酸で安定に形質転換される。特定の実施形態では、宿主細胞は２９３細胞である。他の実施形態では、宿主細胞はＨｅｌａ細胞またはＡ５４９細胞である。
【0110】
[0131]一部の実施形態では、生成細胞は、Ａｄ Ｅ１ａおよびＡｄ Ｅ１ｂを発現するように操作された核酸で安定に形質転換される。他の実施形態では、生成細胞は、ＡＡＶ Ｒｅｐおよび／またはＡＡＶ Ｃａｐを発現するように操作された核酸で安定に形質転換される。他の実施形態では、生成細胞は、感染性レンチウイルス粒子を生成するのに不可欠な１つ以上のヘルパー機能を発現するように操作された核酸で安定に形質転換される。他の実施形態では、生成細胞は、目的の標的遺伝子を発現するように操作された欠損ウイルスゲノムで安定に形質転換される。
【0111】
[0132]一部の実施形態では、生成細胞は、複数の異なるｅｄＡｄに感染される。一実施形態では、複数におけるｅｄＡｄの各々は、１つ以上のヘルパー機能を発現する。
[0133]一実施形態では、生成細胞は、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するように操作された第１のｅｄＡｄ、およびＡＡＶ Ｒｅｐ／Ｃａｐ発現の活性化をもたらすＣｒｅ媒介切り出しの基質として機能する、イントロン中の「ロックされた断片」を含むＲｅｐ－Ｃａｐ発現ユニットを含む第２のｅｄＡｄと共感染される。
[0133]一実施形態では、生成細胞は、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するように操作された第１のｅｄＡｄ、およびＡＡＶ Ｒｅｐ／Ｃａｐ発現の活性化をもたらすＣｒｅ媒介切り出しの基質として機能する、イントロン中の「ロックされた断片」を含むＲｅｐ－Ｃａｐ発現ユニットを含む第２のｅｄＡｄと共感染される。
【0112】
[0134]別の実施形態では、１つ以上のヘルパー遺伝子は、クラスター化した規則的なインタースペースの短い回文反復／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）システムを用いて発現のために活性化することができる。このシステムにより、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ＤＮＡ中の特定の部位で正確な切断を誘導するために短鎖ＲＮＡにより誘導され得、単一のＣＲＩＳＰＲアレイ中のいくつかの配列のコード化を可能にすることにより、ゲノム中の複数の部位を編集することができる。単一のＣａｓ酵素は、標的ＤＮＡを認識するために、短鎖ＲＮＡ分子（「ガイドＲＮＡ」と呼ばれる）によってプログラムされ得る。言い換えれば、Ｃａｓ酵素は、ＣＲＩＳＰＲ媒介核酸切断の特異性を提供するためのガイドＲＮＡとして短鎖ＲＮＡ分子を用いて、特定の標的ＤＮＡに動員することができる。ｃｐｆ１、ｃａｓ１３ｅｔなどの他のｃｒｉｓｐｒシステムもまた本発明に含まれる。
【0113】
[0135]３つのＣＲＩＳＰＲタイプがあり、現在までに遺伝子の較正または破壊に最もよく用いられているタイプはＩＩ型である。例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ標的配列は、ＣＲＩＳＰＲアレイ内にクラスター化されたＤＮＡ配列から転写される。作動するために、ＣＲＩＳＰＲ標的ＲＮＡ、または前駆体ｃｒＲＮＡ（ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ）が転写され、ＲＮＡはプロセシングを受けて、ＣＲＩＳＰＲ反復に相補的な配列を有するトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の存在に依存して、個々のＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）が分離される。トランスＲＮＡがＣＲＩＳＰＲ反復とハイブリダイズした場合、二本鎖ＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼであるＲＮＡｓｅＩＩＩによるプロセシングが開始され、タンデムｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ二本鎖が形成され、これは、ゲノム工学の目的で単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）として合成的に作製することができる。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、活性化され、ｃｒＲＮＡに相補的なＤＮＡ配列に、それを切断することで特異的に応答する。標的配列は、切断されるＤＮＡ中のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる、その３’末端に、標的配列を認識するＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡには存在しない特異的配列を含まなければならない。
【0114】
[0136]天然に存在するガイドＲＮＡに加えて、合成ガイドＲＮＡをＣＲＩＳＰＲベクターに融合させることができる。バイオインフォマティクス法を用いた標的認識配列および他の必須エレメント（例えば、ヘアピンおよび足場配列）を有するガイドＲＮＡの設計が記載されている（例えば、Ｍａｌｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９巻：８２３～８２６頁（２０１３）を参照されたい）。
【0115】
[0137]一実施形態では、生成細胞は、機能的ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９タンパク質をコードする第１のｅｄＡｄと、上記のＣｒｅ／ｌｏｘシステムに類似した１つ以上のヘルパー遺伝子のＣＲＩＳＰＲ媒介活性化のための１つ以上のヘルパー遺伝子を標的とするガイドＲＮＡ配列をコードする第２のｅｄＡｄとに共感染される。
【0116】
[0138]上述の方法の変形において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、宿主配列の欠失、突然変異された宿主配列の野生型宿主配列への置換、または宿主遺伝子の標的活性化のための手段を提供するために、本出願のｅｄＡｄとともに使用され得る。この変形において、宿主細胞は、機能的ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９タンパク質を発現するように操作された欠損ウイルスゲノムを含む第１のｅｄＡｄと、宿主配列のＣＲＩＳＰＲ媒介欠失のための宿主遺伝子を標的とするガイドＲＮＡ配列、突然変異された宿主配列の野生型宿主配列への置換、または宿主遺伝子の標的活性化を含む第２のｅｄＡｄとに共感染される。
【0117】
[0139]一部の実施形態では、本出願は、非分裂細胞に感染することができる組換えレンチウイルスを生成する方法を提供し、それは、適切な生成細胞にｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ、ならびにｒｅｖおよびｔａｔによってコードされるパッケージング機能を担持する１つ以上のｅｄＡｄを感染させることを含む。例えば、第１のｅｄＡｄウイルスは、ウイルスｇａｇおよびウイルスｐｏｌをコードする核酸を提供することができ、同じｅｄＡｄまたは別のｅｄＡｄは、ウイルスｅｎｖをコードする核酸を提供して、生成細胞を生成することができる。本明細書において、導入ベクターとして同定された異種遺伝子を発現するように操作された欠損レンチウイルスベクターを、その生成細胞に導入することにより、目的の外来遺伝子を有する感染性ウイルス粒子を放出する生成細胞が得られる。
【0118】
[0140]一実施形態では、ｅｄＡｄを使用して、組換えヘルペスベクターを生成することができる。ヘルペスベクター生成のための必須遺伝子はｅｄＡｄを用いて担持され、ヘルペスベクター生成細胞に感染してヘルペスベクター生成を容易にすることができる。
【0119】
[0141]ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）相補システム。現在のＨＳＶベースの設計は、一般的に、Ｒｅｐ／ＣａｐおよびＡＡＶベクター配列を個々に保有するように設計された２つの複製欠損ＨＳＶ株を含む。当業者は、カプシド形成欠損ヘルペスが、ｒＡＡＶもしくはレンチウイルスベクターまたは他の組換えベクターを同様に生成するために用いることができることを理解することができる。カプシド形成欠損およびパッケージング欠損ヘルペスウイルスは、ヘルペス構造遺伝子における突然変異または欠失を作製することによって作ることができる。カプシド形成欠損およびパッケージング欠損ヘルペスは、本明細書に開示されるＲＶ利用方法を提供するために使用することができ、ＨＳＶベースのシステムに適合させることができる。
【0120】
[0142]上述の観点から、本出願は、高力価組換えウイルスを生成するための組成物および方法を提供する。ウイルス粒子調製物は、当該技術分野において公知である技術を使用して標的細胞に感染させるために使用することができる。したがって、本出願は、インビボでの遺伝子治療用途とエクスビボでの遺伝子治療用途の両方における使用を見出し、そこでは標的細胞が宿主から除去され、培養で形質転換され、次に宿主に戻される。
【0121】
生成細胞株
[0143]本出願の別の態様は、組換えウイルスを生成するための生成細胞に関する。生成細胞は、（ａ）組換えウイルスのゲノム、もしくは（ｂ）組換えウイルスの生成に必要な生成物をコードする遺伝子、または（ａ）と（ｂ）の両方を含む。
[0143]本出願の別の態様は、組換えウイルスを生成するための生成細胞に関する。生成細胞は、（ａ）組換えウイルスのゲノム、もしくは（ｂ）組換えウイルスの生成に必要な生成物をコードする遺伝子、または（ａ）と（ｂ）の両方を含む。
【0122】
[0144]生成細胞は、一過性もしくは安定なトランスフェクションまたは感染によって生成することができる。一部の実施形態では、生成細胞株は、（ａ）組換えウイルスのゲノム、もしくは（ｂ）組換えウイルスの生成に必要な生成物をコードする遺伝子、または（ａ）と（ｂ）の両方で安定に形質転換される。
【0123】
[0145]生成細胞は、任意の適切な細胞株から誘導することができる。本明細書に記載される方法を用いて使用するための例示的な生成細胞株には、限定されないが、２９３、９１１Ｅ４、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、Ａ５４９、ＣＨＯ、ＰＥＲ．Ｃ６およびＢＨＫが含まれる。一部の実施形態では、生成細胞は哺乳動物細胞に由来する。一部の実施形態では、生成細胞は２９３細胞に由来する。別の実施形態では、生成細胞はＨｅｌａ細胞に由来する。別の実施形態では、生成細胞はＣＨＯ細胞に由来する。
【0124】
[0146]生成細胞株は、ウイルスベクター生成のためのその対応するｅｄＡｄとともに使用される。典型的には、ｅｄＡｄからの欠失した必須初期遺伝子は、生成細胞株中の組み込まれたコピーと相補され、ｅｄＡｄはアデノウイルスゲノムを複製することができるが、カプシド形成遺伝子が欠損しているため、アデノウイルスゲノムをパッケージングすることがなおもできない。
【0125】
[0147]第２のウイルスに対応する感染性の複製欠損ウイルス粒子を生成するのに必要な第２のウイルスに対応する１つ以上のウイルス遺伝子産物。より具体的には、ｅｄＡｄによる生成細胞株の感染は、第２のウイルスに対応する感染性の複製欠損ウイルス粒子の生成をもたらす。生成細胞株がｅｄＡｄウイルス粒子に感染している場合、生成細胞株は、アデノウイルス粒子の侵入および／または複製を支持するために、許容性であるか、または遺伝的に修飾されなければならない。パッケージング細胞株を生成する方法は、当該技術分野において周知であり、さらなる検討を必要としない。
【0126】
[0148]本出願は、限定的と解釈されるべきではない以下の実施例によってさらに例証される。本出願を通じて引用された全ての参考文献、特許、および公開された特許出願の内容、ならびに図および表は、参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【0127】
実施例１：例示的なｅｄＡｄゲノム
[0149]図３、パネルＢ～Ｄおよび図４、パネルＡ～Ｅは、ｅｄＡｄゲノムのいくつかの例を示す。ｅｄＡｄゲノムは、当該技術分野において周知である標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて生成することができる。出発アデノウイルス５プラスミドに基づくｅｄＡｄは、ｐＴＧ３６０２、ｐＦＧｌ４０、ｐＡｄイージープラスミドである。ｐＩＩＩａ、ヘキソン、ペントン、ファイバーなど、欠失させるべき所望の遺伝子は、設計されたｃａｓ９／ｇＲＮＡで消化され、次に、得られた断片を自己連結により連結する。得られたプラスミドは、アデノウイルスカプシド形成遺伝子が欠失している対応する宿主細胞においてレスキューされる。ウイルスベクターのための他の成分のさらなる追加は、細菌中またはｅｄＡｄのレスキューに適合する対応する細胞株中のシャトルベクターを使用する相同組換えまたはｃｒｅ媒介組換えによって行われる。
[0149]図３、パネルＢ～Ｄおよび図４、パネルＡ～Ｅは、ｅｄＡｄゲノムのいくつかの例を示す。ｅｄＡｄゲノムは、当該技術分野において周知である標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて生成することができる。出発アデノウイルス５プラスミドに基づくｅｄＡｄは、ｐＴＧ３６０２、ｐＦＧｌ４０、ｐＡｄイージープラスミドである。ｐＩＩＩａ、ヘキソン、ペントン、ファイバーなど、欠失させるべき所望の遺伝子は、設計されたｃａｓ９／ｇＲＮＡで消化され、次に、得られた断片を自己連結により連結する。得られたプラスミドは、アデノウイルスカプシド形成遺伝子が欠失している対応する宿主細胞においてレスキューされる。ウイルスベクターのための他の成分のさらなる追加は、細菌中またはｅｄＡｄのレスキューに適合する対応する細胞株中のシャトルベクターを使用する相同組換えまたはｃｒｅ媒介組換えによって行われる。
【0128】
実施例２：ｅｄＡｄの生成
[0150]図５は、ｅｄＡｄの生成のための２つの例示的方法を示す。各ＥｄＡｄについて、ｅｄＡｄに欠失または欠損のある遺伝子が生成細胞株において発現されるように、特定の生成細胞株が作製される。
[0150]図５は、ｅｄＡｄの生成のための２つの例示的方法を示す。各ＥｄＡｄについて、ｅｄＡｄに欠失または欠損のある遺伝子が生成細胞株において発現されるように、特定の生成細胞株が作製される。
【0129】
ｅｄＡｄ－ｄ１００ｋの生成
[0151]ｅｄＡｄ－ｄ１００ｋを以下のようにして生成した：ｐＡｄイージー－１をＢａｍＨＩで消化し、Ａｄ５配列２１６９６～３５９９５を含有するサブ断片を単離し、ＢａｍＨＩでｐＵＣｌ９にサブクローニングして、ｐＵＣｌ９－Ａｄ－ＢａｍＨＩを得た。ｐＵＣ１９－Ａｄ－ＢａｍＨＩ／Ａ１００Ｋは、ｐＵＣｌ９－Ａｄ－ＢａｍＨＩから１００Ｋ遺伝子（Ａｄ５配列２４９９９～２５６８６）のＮｈｅｌ断片を除去することによって作製された。次に、１００ｋ遺伝子の欠失を含有するアデノウイルス断片は、ＢａｍＨＩを有するｐＵＣ１９－Ａｄ－ＢａｍＨＩ／Ａ１００Ｋプラスミドから放出され、ｐＡｄイージー－１の大きなＢａｍＨＩサブ断片に戻して結合させて、ｐＡｄ－イージー－ｄ１００を得た。次に、アデノウイルスｅｄＡｄ－ｄ１００ｋを細胞株２９３－１００ｋにおいてレスキューした。
[0151]ｅｄＡｄ－ｄ１００ｋを以下のようにして生成した：ｐＡｄイージー－１をＢａｍＨＩで消化し、Ａｄ５配列２１６９６～３５９９５を含有するサブ断片を単離し、ＢａｍＨＩでｐＵＣｌ９にサブクローニングして、ｐＵＣｌ９－Ａｄ－ＢａｍＨＩを得た。ｐＵＣ１９－Ａｄ－ＢａｍＨＩ／Ａ１００Ｋは、ｐＵＣｌ９－Ａｄ－ＢａｍＨＩから１００Ｋ遺伝子（Ａｄ５配列２４９９９～２５６８６）のＮｈｅｌ断片を除去することによって作製された。次に、１００ｋ遺伝子の欠失を含有するアデノウイルス断片は、ＢａｍＨＩを有するｐＵＣ１９－Ａｄ－ＢａｍＨＩ／Ａ１００Ｋプラスミドから放出され、ｐＡｄイージー－１の大きなＢａｍＨＩサブ断片に戻して結合させて、ｐＡｄ－イージー－ｄ１００を得た。次に、アデノウイルスｅｄＡｄ－ｄ１００ｋを細胞株２９３－１００ｋにおいてレスキューした。
【0130】
[0152]２９３－１００ｋ細胞の生成
[0153]細胞株２９３－１００ｋは、ＣＭＶプロモーターの制御下でｐｃＤＮＡ３（ｐｃＤＮＡ３－１００ｋ）中に化学合成された１００ｋ遺伝子をクローニングすることにより作製された。２μｇのｐｃＤＮＡ３－１００ＫプラスミドをＣｌａＩ制限酵素消化で線状化し、リポフェクタミンにより２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を６００ｐｇ／ｍｌでＧ－４１８を含むＤＭＥＭ培地中で選択した。得られたクローンをＰＣＲおよびウエスタンブロットにより確認した。２９３－１００ｋクローンは、３９℃の非許容温度で、温度感受性（ｔｓ）Ａｄ５ １００Ｋ突然変異体、Ｈ５ｔｓｌ １６（最初はＨ．Ｇｉｎｓｂｅｒｇによって作製された）の増殖を支持するその能力について確認された。
[0153]細胞株２９３－１００ｋは、ＣＭＶプロモーターの制御下でｐｃＤＮＡ３（ｐｃＤＮＡ３－１００ｋ）中に化学合成された１００ｋ遺伝子をクローニングすることにより作製された。２μｇのｐｃＤＮＡ３－１００ＫプラスミドをＣｌａＩ制限酵素消化で線状化し、リポフェクタミンにより２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を６００ｐｇ／ｍｌでＧ－４１８を含むＤＭＥＭ培地中で選択した。得られたクローンをＰＣＲおよびウエスタンブロットにより確認した。２９３－１００ｋクローンは、３９℃の非許容温度で、温度感受性（ｔｓ）Ａｄ５ １００Ｋ突然変異体、Ｈ５ｔｓｌ １６（最初はＨ．Ｇｉｎｓｂｅｒｇによって作製された）の増殖を支持するその能力について確認された。
【0131】
[0154]ｅｄＡｄ－Ｅ１－ｄ１００ｋの生成
[0155]ｅｄＡｄ－ｄ１００ｋを用いて、Ａｄ５の左アーム断片（ｃｌａＩ断片）をトランスフェクトされた１００ｋを発現するＨｅｌａ細胞に感染させた。プラークは、Ｅ１および１００ｋ欠失の存在を確認するために選択される。
[0155]ｅｄＡｄ－ｄ１００ｋを用いて、Ａｄ５の左アーム断片（ｃｌａＩ断片）をトランスフェクトされた１００ｋを発現するＨｅｌａ細胞に感染させた。プラークは、Ｅ１および１００ｋ欠失の存在を確認するために選択される。
【0132】
[0156]ｅｄＡｄ－ｄ１００ｋ－ｃｒｅの生成
[0157]ｃｒｅ遺伝子を包含するＳａｌｌ断片をｐＳｈｕｔｔｌｅＣＭＶのＳａｌｌ部位に連結し、ｐＳｈｕｔｔｌｅＣＭＶｃｒｅを生成した。ｃｒｅを担持するシャトルプラスミドをＰｍｅｌで線状化し、ｐＡｄ－イージー－ｄｌ００とともに大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＢＪ５１８３に共エレクトロポレーションした。このようにして、２つのプラスミド間の標的組換えは、細菌プラスミド内で、Ｅ１－、Ｅ３－および１００ｋ－である全長ｅｄＡｄ－ｄ１００－ｃｒｅベクターゲノムを生成した。同様に、ｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＡＡＶ－ＣＭＶｌａｃＺプラスミドをｐＡｄイージー－１と共エレクトロポレーションして、［Ｅ１－、Ｅ３－］Ａｄ－ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｌａｃＺ含有プラスミドを生成した。次に、これらのアデノウイルスを２９３－１００ｋ細胞からレスキューした。
[0157]ｃｒｅ遺伝子を包含するＳａｌｌ断片をｐＳｈｕｔｔｌｅＣＭＶのＳａｌｌ部位に連結し、ｐＳｈｕｔｔｌｅＣＭＶｃｒｅを生成した。ｃｒｅを担持するシャトルプラスミドをＰｍｅｌで線状化し、ｐＡｄ－イージー－ｄｌ００とともに大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＢＪ５１８３に共エレクトロポレーションした。このようにして、２つのプラスミド間の標的組換えは、細菌プラスミド内で、Ｅ１－、Ｅ３－および１００ｋ－である全長ｅｄＡｄ－ｄ１００－ｃｒｅベクターゲノムを生成した。同様に、ｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＡＡＶ－ＣＭＶｌａｃＺプラスミドをｐＡｄイージー－１と共エレクトロポレーションして、［Ｅ１－、Ｅ３－］Ａｄ－ＡＡＶ－ＣＭＶ－ｌａｃＺ含有プラスミドを生成した。次に、これらのアデノウイルスを２９３－１００ｋ細胞からレスキューした。
【0133】
実施例３：ｅｄＡｄを用いた組換えＡＡＶベクターの生成
[0158]ｒＡＡＶ生成のためのＩＩＩａカプシド形成欠損アデノウイルスの生成
[0159]出発物質は、全長Ａｄ５ゲノムを含むｐＴＧ３６０２である。（ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＶＩＲＯＬＯＧＹ、１９９６年７月、４８０５～４８１０頁、ＣＨＡＲＴＩＥＲら）。典型的な分子生物学的技術を用いて、Ｅ３またはＥ１およびＥ３領域を除去して、ｐＡｄ－ｄ３またはｐＡｄ－ｄ１３を得た。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ消化およびプラスミドｐＡｄ－ｄ３またはｐＡｄ－ｄ１３の自己連結を用いてプラスミドからＩＩＩａ領域を除去し、ｐｄＩＩＩａ－ｄ３（配列番号１）およびｐｄＩＩＩａ－ｄ１３（配列番号２）を得たため、ＩＩＩａ機能をアデノウイルスから除去した。得られた構築物を、２９３－ＩＩＩａにおける感染性アデノウイルスのレスキューに使用する前に配列決定によって確認した。
[0158]ｒＡＡＶ生成のためのＩＩＩａカプシド形成欠損アデノウイルスの生成
[0159]出発物質は、全長Ａｄ５ゲノムを含むｐＴＧ３６０２である。（ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＶＩＲＯＬＯＧＹ、１９９６年７月、４８０５～４８１０頁、ＣＨＡＲＴＩＥＲら）。典型的な分子生物学的技術を用いて、Ｅ３またはＥ１およびＥ３領域を除去して、ｐＡｄ－ｄ３またはｐＡｄ－ｄ１３を得た。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ消化およびプラスミドｐＡｄ－ｄ３またはｐＡｄ－ｄ１３の自己連結を用いてプラスミドからＩＩＩａ領域を除去し、ｐｄＩＩＩａ－ｄ３（配列番号１）およびｐｄＩＩＩａ－ｄ１３（配列番号２）を得たため、ＩＩＩａ機能をアデノウイルスから除去した。得られた構築物を、２９３－ＩＩＩａにおける感染性アデノウイルスのレスキューに使用する前に配列決定によって確認した。
【0134】
[0160]トランスにＩＩＩａを提供するために、Ａｄ５ ＩＩＩａ ｃＤＮＡを用いて２９３の安定な細胞株（２９３－ＩＩＩａ）を生成した。ＩＩＩａ欠失を有するＡｄ５は、２９３－ＩＩＩａ細胞におけるトランスフェクションおよび増殖によってレスキューされた。
【0135】
[0161]ｐｄＩＩＩａ－ｄ３およびｐｄＩＩＩａ－ｄ１３におけるＩＩＩａ欠失は、Ｃｒｏｓｂｙ ＣＭおよびＢａｒｒｙ ＭＡ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２０１４年８月；４６２～４６３頁：１５８－６５．ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｊ．ｖｉｒｏｌ．２０１４．０５．０３０．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｊｕｌ ２に記載されるようにＡｄ６－ＩＩＩａ欠失と類似した。
【0136】
[0162]機能試験は、Ｃｒｏｓｂｙ ＣＭおよびＢａｒｒｙ ＭＡ（前掲）により記載された同様の方法を用いた。
[0163]ＩＩＩａ欠失アデノウイルスがＡＡＶ生成にコンピテントであることを確認するために、ＡＡＶ ＩＴＲが隣接するＧＦＰ遺伝子を有するＡＡＶ発現カセットをＥ１領域内のｐＩＩＩａ－ｄ３またはｐＡｄ－ｄ１３にクローニングし（Ｅ３または他の領域を使用することができる）、２９３－ＩＩＩａ細胞株において感染性ＩＩＩａ－ｄ１３－ＡＡＶ－ＧＦＰ（配列番号３）およびＩＩＩａ－ｄ３－ＡＡＶ－ＧＦＰをレスキューした。以下の条件でＡＡＶベクターを生成した。ＩＩＩａ－ｄｌ３－ＡＡＶ－ＧＦＰウイルスＤＮＡは、感染性アデノウイルスを生成することなく、生成中に１Ｅ＋５倍増幅された。
[0163]ＩＩＩａ欠失アデノウイルスがＡＡＶ生成にコンピテントであることを確認するために、ＡＡＶ ＩＴＲが隣接するＧＦＰ遺伝子を有するＡＡＶ発現カセットをＥ１領域内のｐＩＩＩａ－ｄ３またはｐＡｄ－ｄ１３にクローニングし（Ｅ３または他の領域を使用することができる）、２９３－ＩＩＩａ細胞株において感染性ＩＩＩａ－ｄ１３－ＡＡＶ－ＧＦＰ（配列番号３）およびＩＩＩａ－ｄ３－ＡＡＶ－ＧＦＰをレスキューした。以下の条件でＡＡＶベクターを生成した。ＩＩＩａ－ｄｌ３－ＡＡＶ－ＧＦＰウイルスＤＮＡは、感染性アデノウイルスを生成することなく、生成中に１Ｅ＋５倍増幅された。
【0137】
【表2】
【0138】
[0164]ｒＡＡＶの１つの限界は、ゲノムパッケージング能力がわずか約５ｋｂであることである。特定の疾患では、ＡＡＶのパッケージング限界は、単一のＡＡＶベクターによる完全長の治療用タンパク質の送達を可能にしない。ＡＡＶのパッケージング能力によって課される限界を考慮して、二重ベクターアプローチを採用することができ、それによって導入遺伝子が２つの別々のｒＡＡＶベクターにわたって分割される。次に、これら２つのｒＡＡＶと細胞を同時感染させると、ＡＡＶのＤＮＡパッケージング限界のために、単一のＡＡＶベクターによってコードされ得ない、アセンブルしたｍＲＮＡの転写がもたらされ得る。当業者は、本開示の方法がアデノ随伴ウイルスカプシドのパッケージング能力を超える導入遺伝子を発現するためのこのような二重ベクターを生成するように適合させることができることを理解する。Ｂ５０細胞株にｐＡＡＶ－ＣＢ－ＥＧＦＰをトランスフェクトし、再利用可能なＡＡＶ－ＣＢ－ＥＧＦＰを有する細胞クローンをＢ５０－ＡＡＶ－ＣＢ－ＥＧＦＰと命名し、これはＡＡＶ ｒｅｐ＆ｃａｐ配列とＡＡＶゲノムをともに有する。次に、ｅｄＡｄ－Ｅ１－ｄ１００Ｋを用いて、ｍｏｉ１、５および１０でＢ５０－ＡＡＶ－ＣＢ－ＥＧＦＰを感染させる。
【0139】
[0165]ｅｄＡｄ－ｄ１００ｋ－ｄｐ３の生成
[0166]アデノウイルスにおける１００ｋおよびｐＩＩＩａの二重欠失を作製するために、ｐＡｄ－イージー－ｄ１００をｐＩＩＩａ遺伝子断片を放出するｃａｓ９／ｇＲＮＡで消化した。得られた大きな断片を自己連結して、ｐＡｄ－イージー－ｄ１００ｄｐ３を得た。ｅｄＡｄ－ｄ１００ｋ－ｄｐ３は、２９３－１００ｋ－ｐＩＩＩａ細胞株においてレスキューされ、増幅された。
[0166]アデノウイルスにおける１００ｋおよびｐＩＩＩａの二重欠失を作製するために、ｐＡｄ－イージー－ｄ１００をｐＩＩＩａ遺伝子断片を放出するｃａｓ９／ｇＲＮＡで消化した。得られた大きな断片を自己連結して、ｐＡｄ－イージー－ｄ１００ｄｐ３を得た。ｅｄＡｄ－ｄ１００ｋ－ｄｐ３は、２９３－１００ｋ－ｐＩＩＩａ細胞株においてレスキューされ、増幅された。
【0140】
[0167]ｅｄＡｄ－ｄ１００ｋ－ｄｐ３－ｃｒｅの生成
[0168]プラスミドｐｓｈｕｔｔｌｅ－ＣＭＶ－Ｃｒｅを作製し、ａｄ－イージーキットを用いてｐＡｄ－イージー－ｄ１００ｄｐ３との組換えに使用した。得られたアデノウイルスは、２９３－１００ｋ－ｐＩＩＩａ細胞においてレスキューされ、増幅された。
[0168]プラスミドｐｓｈｕｔｔｌｅ－ＣＭＶ－Ｃｒｅを作製し、ａｄ－イージーキットを用いてｐＡｄ－イージー－ｄ１００ｄｐ３との組換えに使用した。得られたアデノウイルスは、２９３－１００ｋ－ｐＩＩＩａ細胞においてレスキューされ、増幅された。
【0141】
[0169]ｅｄＡｄ－ｄ１００ｋ－ｄｐ３－ｃｒｅを使用したＡＡＶ生成
[0170]組み込まれたＡＡＶゲノムおよびｃｒｅ活性化可能なｒｅｐおよびｃａｐ、２９３－ｄｓＧＦＰ－１２（Ｘｉａｏ Ｘｉａｏにより提供される）を有する細胞株は、ｅｄＡｄ－ｄ１００ｋ－ｄｐ３－ｃｒｅに感染される。
[0170]組み込まれたＡＡＶゲノムおよびｃｒｅ活性化可能なｒｅｐおよびｃａｐ、２９３－ｄｓＧＦＰ－１２（Ｘｉａｏ Ｘｉａｏにより提供される）を有する細胞株は、ｅｄＡｄ－ｄ１００ｋ－ｄｐ３－ｃｒｅに感染される。
【0142】
実施例４：ｅｄＡｄを用いた組換えレンチウイルスベクターの生成
[0171]本出願はまた、非分裂細胞に感染することができる組換えレンチウイルスを生成する方法、ならびにそれらを作製する方法および手段を提供する。ウイルスは、核酸配列のインビボおよびエクスビボ導入および発現に有用である。
[0171]本出願はまた、非分裂細胞に感染することができる組換えレンチウイルスを生成する方法、ならびにそれらを作製する方法および手段を提供する。ウイルスは、核酸配列のインビボおよびエクスビボ導入および発現に有用である。
【0143】
[0172]レンチウイルスゲノムおよびプロウイルスＤＮＡは、２つのＬＴＲ配列が隣接するｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖというレトロウイルスに見られる３つの遺伝子を有する。ｇａｇ遺伝子は内部構造（マトリックス、カプシドおよびヌクレオカプシド）タンパク質をコードし、ｐｏｔ遺伝子はＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）、プロテアーゼおよびインテグラーゼをコードし、ｅｎｖ遺伝子はウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする。５’および３’ＬＴＲは、ビリオンＲＮＡの転写およびポリアデニル化を促進するのに役立つ。ＬＴＲには、ウイルス複製に必要な他のシス作用性配列が全て含まれている。レンチウイルスは、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、ｎｅｆおよびｖｐｘ（ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２および／またはＳＩＶにおいて）を含む追加の遺伝子を有する。
【0144】
[0173]ゲノムの逆転写に必要な配列（ｔＲＮＡプライマー結合部位）およびウイルスＲＮＡの粒子（Ｐｓｉ部位）への効率的なカプシド形成に必要な配列が５’ＬＴＲに隣接している。カプシド形成（または感染性ビリオンへのレトロウイルスＲＮＡのパッケージング）に必要な配列がウイルスゲノムから欠失している場合、シス欠損はゲノムＲＮＡのカプシド形成を妨げる。しかしながら、得られた突然変異体は全てのビリオンタンパク質の合成を指令することがなおできる。
【0145】
[0174]本出願は、パッケージング機能、すなわち、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ、ならびにｒｅｖおよびｔａｔを担持する１つ以上のｅｄＡｄに適切な宿主細胞を感染させることを含む、非分裂細胞に感染することができる組換えレンチウイルスを生成する方法を提供する。例えば、第１のｅｄＡｄウイルスは、ウイルスｇａｇおよびウイルスｐｏｌをコードする核酸を提供することができ、同じｅｄＡｄまたは別のｅｄＡｄは、パッケージング細胞を生成するためにウイルスｅｎｖをコードする核酸を提供することができる。本明細書において導入ベクターとして同定された異種遺伝子を提供するベクターをそのパッケージング細胞に導入すると、目的の外来遺伝子を担持する感染性ウイルス粒子を放出する生成細胞が生じる。
【0146】
[0175]本明細書に記載されるレンチウイルスベクターは、２つの発現ＨＩＶタンパク質および他方の異なるウイルスのエンベロープを含む、３つの重複しない発現構築物によってパッケージングされ得る。さらに、ＨＩＶ－１パッケージングモチーフのステム－ループ構造に寄与するｇａｇ遺伝子の部分を除いて、カプシド形成および逆転写に必要であることが公知である全てのＨＩＶ配列は、構築物には存在しない。
【0147】
[0176]ベクターのバイオセーフティを改善するための第２の戦略は、レンチウイルスゲノムの複雑さを利用する。効率的なベクターを作製するために必要なＨＩＶ－１遺伝子の最小セットが同定され、他の全てのＨＩＶリーディングフレームがシステムから除去された。除去された遺伝子の生成物は、ウイルスのライフサイクルの完了および病因にとって重要であるため、組換え体は親ウイルスの病因的特徴を獲得することはできない。ＨＩＶの４つのアクセサリー遺伝子は全て、遺伝子導入を損なうことなくパッケージング構築物から欠失させることができた。ｔａｔ遺伝子はＨＩＶ複製に重要である。ｔａｔ遺伝子産物は、公知の最も強力な転写活性化因子の１つであり、ＨＩＶ誘発性疾患の特徴である非常に高い複製率において中心的な役割を果たす。
【0148】
[0177]レトロウイルス由来のｅｎｖ遺伝子の例には、限定されないが、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶまたはＭＭＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶまたはＨＳＶ）、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭｕＭＴＶまたはＭＭＴＶ）、ギボンアペ白血病ウイルス（ＧａＬＶまたはＧＡＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）が含まれる。使用され得る他のｅｎｖ遺伝子には、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）タンパク質Ｇ（ＶＳＶ－Ｇ）、ならびに肝炎ウイルスおよびインフルエンザウイルスの遺伝子が含まれる。
【0149】
[0178]ウイルスｅｎｖ核酸配列を提供するベクターは、制御配列、例えば、プロモーターまたはエンハンサーと作動可能に関連する。制御配列は、例えば、モロニーマウス白血病ウイルスプロモーター－エンハンサーエレメント、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）エンハンサーまたはワクシニアＰ７．５プロモーターを含む、任意の真核生物プロモーターまたはエンハンサーであり得る。モロニーマウス白血病ウイルスプロモーター－エンハンサーエレメントなどの一部の場合では、プロモーター－エンハンサーエレメントは、ＬＴＲ配列内またはそれに隣接して位置する。
【0150】
[0179]好ましくは、制御配列は、ベクターが構築されているレンチウイルスに対して内因性ではないものである。したがって、ベクターがＳＩＶから作製されている場合、ＳＩＶ ＬＴＲに見出されるＳＩＶ制御配列は、ＳＩＶに由来しない制御エレメントに置換される。
【0151】
[0180]ＶＳＶ Ｃタンパク質は望ましいｅｎｖ遺伝子であるが、ＶＳＶ Ｇは組換えウイルスに広い宿主域を与えるため、ＶＳＶ Ｇは宿主細胞に有害である可能性がある。したがって、ＶＳＶ Ｇなどの遺伝子を用いる場合、ＶＳＶ Ｃの発現が必要でない場合、ＶＳＶ Ｇの発現を調節して宿主毒性を最小限に抑えることができるように、誘導性プロモーター系を用いることが好ましい。
【0152】
[0181]例えば、Ｇｏｓｓｅｎ ＆ Ｂｕｊａｒｄ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９２）８９巻：５５４７～５５５１）のテトラサイクリン制御性遺伝子発現系は、テトラサイクリンが導入された細胞から取り出された場合に、ＶＳＶ Ｇの誘導性発現を提供するために用いることができる。したがって、ｔｅｔ／ＶＰ１６トランスアクチベーターは第１のベクター上に存在し、ＶＳＶ Ｃコード配列は、別のベクター上のｔｅｔオペレーター配列によって調節されるプロモーターの下流にクローニングされる。
【0153】
[0182]このようなハイブリッドプロモーターは、導入ベクターのＬＴＲの３’Ｕ３領域の代わりに挿入することができる。このようなトランスファーベクターの使用によって生成されたベクター粒子による標的細胞の形質導入の結果として、ハイブリッドプロモーターは逆転写の５’Ｕ３領域にコピーされる。標的細胞において、このような遺伝子の条件的発現は、ｔＴＡ－の存在下、例えば、ｔＴＡを発現する適切なパッケージング細胞株の形質導入後にのみ、完全長パッケージング可能なベクター転写物を発現するように活性化され得る。
【0154】
[0183]このようなベクターを生成細胞に使用することにより、必要な場合にのみ、パッケージング可能なベクターｍＲＮＡメッセージの生成を高レベルで「オン」にすることができる。対照的に、ｔＴＡを発現しない細胞の形質導入では、ハイブリッドプロモーターは転写的にサイレントになる。このような転写サイレンスは、異種プロモーターの基本転写活性を上方制御することができることが公知であるＨＩＶ Ｔａｔタンパク質の存在下でさえ維持された。プロモーターシステムは、形質導入された細胞が野生型ＨＩＶ－１に感染したとしても、ベクターゲノムの動員の機会を著しく低減させる。
【0155】
[0184]別の実施形態は、パッケージングのコード配列と導入ベクター構築物との間の配列相同性（配列オーバーラップ）が除去されるレンチウイルスに基づくレトロウイルスベクターシステムに関する。重要なことに、このような構築物の使用によって生成されたベクター粒子は、高いレベルの形質導入ポテンシャルを保持する。このような構築物をベクター生成システムに使用することにより、組換え事象の頻度が最も著しく減少することが期待され、これは、このようなベクターシステムに関連するバイオセーフティにおける重要な進歩である。
【0156】
[0185]ｇａｇ－ｐｏｌコードｍＲＮＡ全体に、いくつかのシス作用抑制配列（ＣＲＳ）が存在することは公知である。この配列はｍＲＮＡの細胞質への輸送を妨げ、したがって、コードされたタンパク質の発現を妨げる。ＣＲＳの作用を抑制するために、ＨＩＶ－１のｍＲＮＡには、Ｒｅｖタンパク質が結合する可能性のあるＲＲＥと呼ばれる抗抑制シグナルが含まれる。次に、ＨＩＶ－ｌ ｍＲＮＡ－Ｒｅｖ複合体は効率的に細胞質に輸送され、そこで複合体は解離し、ｍＲＮＡは翻訳に利用できるようになる。
【0157】
[0186]ＧａｇおよびＧａｇ－Ｐｏｌ発現パッケージングベクターに必要な最少量のＨＩＶ配列を選択するために、少なくとも２つのアプローチが利用可能である。まず、ｇａｇ－ｐｏｌ遺伝子だけを挿入することができる。その場合、コードされたアミノ酸配列に影響を与えることなく、ＣＲＳの全部または少なくとも大部分を同定し、突然変異させる必要がある。それが達成されれば、Ｒｅｖ遺伝子はベクターシステムから除去され得る。
【0158】
[0187]第２に、最小のＲＲＥエレメントをｇａｇ－ｐｏｌ発現カセットに導入して、そのため、その配列が、得られるｍＲＮＡの一部となるようにすることができる。その場合、ＧａｇおよびＧａｇ－Ｐｏｌポリタンパク質の発現は、抗リプレッサー、Ｒｅｖタンパク質の存在を必要とする。しかしながら、Ｒｅｖタンパク質自体は、ｇａｇ－ｐｏｌ発現ベクターの一部である必要はなく、ｇａｇ－ｐｏｌ発現カセットから独立して、好ましくは、ｇａｇ－ｐｏｌ発現カセットと重複しないトランスに提供することができる。
【0159】
[0188]導入ベクターｍＲＮＡの効率的な生成にＲｅｖタンパク質が必要でないシステムでは、さらなるバイオセーフティ対策として、ｒｅｖ遺伝子およびＲＲＥエレメントをベクターシステムから除去することができる。しかしながら、このようなシステムにおいて、ｇａｇ－ｐｏｌ遺伝子の全部または一部が、相同的または非相同的組換え事象の結果としてベクターレシピエントに導入される場合、発現が起こり得る。
【0160】
[0189]対照的に、ｇａｇ－ｐｏｌ遺伝子発現がＲｅｖに依存するベクターシステムは、有益な安全性の選択肢である可能性がある。したがって、ベクターシステムを利用するＲｅｖが、全ての成分が相同配列を持たないように設計されている場合であって、万一組換えが起こり、ｇａｇ－ｐｏｌ配列のベクターレシピエントへの導入をもたらす場合、導入された組換え体が、ＲＲＥエレメントと、発現可能なＲｅｖコード配列の両方を含まなければならないため、その発現は発生する可能性は非常に少ない。
【0161】
[0190]ＨＩＶ由来ベクターへの主な関心は、分裂していない細胞およびゆっくり分裂する細胞および組織をそれらが形質導入する能力にあることを考慮して、重複しないベクターについて、細胞周期停止細胞における形質導入について試験した。ＭｏＭＬＶベクターとは対照的に、最小限のＨＩＶ由来ベクターは、分裂細胞と増殖停止細胞の両方において形質導入能を維持した。
【0162】
[0191]さらに、パッケージングベクターｇａｇ－ｐｏｌ ｍＲＮＡに存在するＨＩＶ－１ ＲＮＡエレメントが、特定の条件下で放出されたベクター粒子中への著しい量のメッセージの特異的カプシド形成をもたらすことが観察された。このエレメントは、ＨＩＶ－１主要スプライスドナー部位（ＳＤ）として機能し、少なくともヌクレオチドであるＧＡＣＵＧＧＵＧＡＧ（配列番号１）からなる。導入ベクター発現の非存在下では、ｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥパッケージング構築物によってのみ生成されたベクター粒子は、検出可能なｇａｇ－ｐｏｌＲＮＡメッセージを有しない。ベクター粒子を生成した細胞から抽出された総ＲＮＡの分析は、全ての症例で発現レベルが類似していることを示した。試験したパッケージングベクターの５’ｍＲＮＡ領域を比較した場合、上記の特定の配列が、メッセージの特定のカプシド形成を提供する決定因子であることが明らかになった。
【0163】
[0192]好ましくは、本出願の方法によって生成される組換えレンチウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の誘導体である。しかしながら、ｅｎｖは、好ましくはＨＩＶ以外のウイルスに由来する。
【0164】
[0193]本出願の方法は、一部の実施形態では、上記で検討したように、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔおよびｒｅｖなどの組換えレンチウイルスビリオンのパッケージングに必要な全ての機能を提供する、少なくとも１つのｅｄＡｄおよび最大４つのｅｄＡｄウイルスを提供する。図１３～１７を参照されたい。本明細書で述べたように、予期せぬ利益のために機能的に欠失させることができる。ベクターが組換えレンチウイルスを生成するためにパッケージング細胞株を形質転換および生成するためにベクターが使用される限り、利用されるベクターの数に制限はない。
【0165】
[0194]ｅｄＡｄベクターは生成細胞株に感染を導入し、トランスフェクションを回避するために追加のエレメントが生成細胞に組み込まれる。生成細胞株は、ベクターゲノムを含むウイルス粒子を生成する。トランスフェクションまたは感染の方法は、当業者に周知である。ｅｄＡｄウイルスの生成細胞株への感染または同時感染後、組換えウイルスを培地から回収し、当業者が使用する標準的な方法によって力価を測定する。
【0166】
[0195]生成機能が適切な生成細胞によって発現されるように構成された安定な細胞株が公知である。例えば、パッケージング細胞を記載する米国特許第５，６８６，２７９号、Ｏｒｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９６）９３巻：１１４００～１１４０６頁を参照されたい。このような安定な細胞株は、本出願の少なくとも１つのｅｄＡｄとともに使用される。
【0167】
[0196]Ｚｕｆｆｅｒｅｙら（前掲）は、ＨＩＶ－１ ｅｎｖ遺伝子を含むｐｏｌの３’配列が欠失しているレンチウイルス生成細胞について記載している。構築物は、ｔａｔおよびｒｅｖ配列を含み、３’ＬＴＲはポリＡ配列で置換される。５’ＬＴＲおよびｐｓｉ配列は、誘導可能なプロモーターなどの別のプロモーターによって置換される。例えば、ＣＭＶプロモーターまたはその誘導体を使用することができる。
【0168】
[0197]目的の生成ベクターには、レンチウイルスタンパク質発現を増強し、安全性を高めるためのパッケージング機能のさらなる変化が含まれている。例えば、ｇａｇの上流にある全てのＨＩＶ配列を除去することができる。また、ｅｎｖの下流にある配列を除去することもできる。さらに、ＲＮＡのスプライシングおよび翻訳を増強するためにベクターを修飾する工程を取ることができる。
【0169】
[0198]複製コンピテントレンチウイルスを生成する可能性がより低いｅｄＡｄを提供するために、本出願の態様は、転写機構を介してウイルス発現を促進する制御タンパク質であるｔａｔ配列が機能的に欠失されているレンチウイルスパッケージングｅｄＡｄを提供する。したがって、ｔａｔ遺伝子は、部分的もしくは全体的に欠失され得るか、または種々の点突然変異もしくは他の突然変異が、ｔａｔ配列に対してなされ得、その遺伝子を機能しなくする。当業者は、ｔａｔ遺伝子を非機能的にするために公知の技術を実施することができる。
【0170】
[0199]したがって、本出願によれば、レンチウイルスパッケージングｅｄＡｄは、ｔａｔおよび任意選択で他のレンチウイルスアクセサリー遺伝子の特異的な機能的または実際の切り出しを伴って、当業者によって決定されるプロモーターおよび他の任意のまたは必要な制御配列、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｒｅｖ、ｅｎｖまたはそれらの組み合わせを含むように作製される。
【0171】
[0200]導入ベクター構築物の５’ＬＴＲは、Ｕ３領域の転写制御エレメントの一部または全部を異種エンハンサー／プロモーターで置換することによって修飾することができる。この変化は、生成細胞における導入ベクターＲＮＡの発現を増強することができ、ＨＩＶ ｔａｔ遺伝子の非存在下でのベクター生成を可能にし、上記されるＳＩＮベクターを「レスキューする」ために３’欠失バージョンと組換えることができるＨＩＶ ＬＴＲの上流野生型コピーを除去するのに役立ち得る。したがって、５’ＬＴＲで上記の変化を含むベクター、５’ベクターは、発現を増強する配列のため、およびｔａｔを発現しないパッケージング細胞を併用して、トランスファーベクターとしての使用を見出すことができる。
【0172】
[0201]このような５’ベクターはまた、上記で検討したように３’ＬＴＲで修飾を担持して、発現が増強されただけでなく、ｔａｔを発現しないが、同様に自己不活性化することができるパッケージング細胞において使用することができる改良された導入ベクターを生成することもできる。
【0173】
[0202]ＨＩＶ ＬＴＲからの転写は、ｔａｔタンパク質のトランスアクチベーター機能に非常に依存する。しばしば生成細胞に存在するコアパッケージング構築物によって発現されるｔａｔの存在下では、ＨＩＶ ＬＴＲからのベクター転写が強く刺激される。完全長の「ウイルス」ＲＮＡがパッケージングシグナルの完全の相補物を有するとすれば、ＲＮＡは、ベクター粒子中に効率的にカプシド化され、標的細胞に導入される。生成細胞におけるパッケージングに利用可能なベクターＲＮＡの量は、感染性ベクターの生成における律速段階である。
【0174】
[0203]５’ＬＴＲのエンハンサー領域、またはエンハンサーおよびプロモーター領域は、それぞれ、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のエンハンサー、またはエンハンサーおよびプロモーターで置換され得る。ハイブリッドベクターの構築物の概略図およびコード名については、図１２を参照されたい。ＣＣＬおよびＲＲＬベクターは、５’Ｕ３領域の完全な置換を有する。
【0175】
[0204]対照レンチベクターＨＲ２および５’ハイブリッドのパネルは、ｔａｔトランスアクチベーターを提供する、トランスファーベクターをトランスフェクトされた生成細胞において、パッケージング構築物の有無で比較された。４つのキメラベクターの転写レベルは、パッケージング構築物の存在下と非存在下の両方で対照レンチベクターよりも高い。全てのキメラベクターは、導入遺伝子を標的細胞に効率的に導入し、ＲＲＬベクターは、対照ＨＲ２ベクターと同様に振る舞う。最後に、形質導入された細胞を形質導入後の初期および後期継代で調べることによって、標的細胞におけるベクターの組み込みを確認した。導入遺伝子陽性細胞の割合の減少は観察されず、ベクターが組み込まれたことを示した。
【0176】
[0205]パッケージング構築物の非存在下で生成細胞において得られた５’ＬＴＲ修飾された導入ベクターＲＮＡの高レベルの発現は、生成ベクターが機能的ｔａｔ遺伝子の非存在下で機能的であることを示す。上記で開示されたパッケージングプラスミドについて示されるようなｔａｔ遺伝子の機能的欠失は、ｔａｔタンパク質に関連する病原性活性の数を考えると、レンチウイルスベクターシステムに対してより高いレベルのバイオセーフティを付与する。したがって、有意に改良されたバイオセーフティのレンチウイルスベクターは、本明細書に記載されるｔａｔレスパッケージングベクターと併せて使用される、５’または３’末端のいずれかでＨＩＶ ＬＴＲのｄ型コピーを含まないＳＩＮ導入ベクターである。
【0177】
[0206]ウイルス上清は、トランスフェクションから４８時間後に上清の濾過などの標準的な技術を用いて採取することができる。ウイルス力価は、８ｐｇ／ｍｌポリブレン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ）の存在下で、例えば、１０６個のＮＩＨ ３Ｔ３細胞または１０５個のＨｅＬａ細胞を適切量のウイルス上清で感染させることによって決定することができる。４８時間後、形質導入効率をアッセイすることができる。
【0178】
[0207]例証のために、本発明は、ｖｓｖＯＧエンベロープの使用のみを例証する。シュードレンチウイルスベクターは、他のエンベロープウイルス由来の糖タンパク質（ＧＰ）を有するベクター粒子からなる。レンチウイルスベクターのシュードタイピングに代わるＧＰのリストが増え続けている。これらのＧＯは、ＣｒｏｎｉｎによるＣｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００５年８月；５巻（４号）：３８７～３９８頁において概説されている。追加のＧＰとしては、限定されないが、ＬＣＭＶ、ＲＲＶ、ＳｅＶ Ｆ、Ｅｂｏｌａ、Ｍａｒｂｕｒｇ、ＦＩＮ、ＪＳＲＶ、Ｒａｂｉｅｓ、Ｍｏｋｏｌａ、ＲＤ１１４、ＧＡＬＶなどが挙げられる。ＧＰは一般的に毒性があるため、ｅｄＡｄはそれを高レベル発現および相補レンチウイルス生成のために担持することができる。
【0179】
[0208]各世代のレンチウイルスベクターを生成するための例を図１３～１９に例証する。
[0209]エンベロープタンパク質と抗体または特定の細胞型の受容体を標的とするための特定のリガンドとの連結によって、組換えウイルスを標的とすることが望ましい場合がある。目的の配列（制御領域を含む）をウイルスベクターに挿入することによって、特定の標的細胞上の受容体に対するリガンドをコードする別の遺伝子とともに、例えば、ベクターはここでは、標的特異的である。レトロウイルスベクターは、例えば、糖脂質またはタンパク質を挿入することによって標的特異的に作製することができる。標的化は、しばしば、レトロウイルスベクターを標的化するために、抗体の抗原結合部分または組換え抗体型分子、例えば、一本鎖抗体を用いることによって達成される。当業者は、特定の標的へのレトロウイルスベクターの送達を達成するための特定の方法を知っているか、または過度の実験なしに容易に確認することができる。
[0209]エンベロープタンパク質と抗体または特定の細胞型の受容体を標的とするための特定のリガンドとの連結によって、組換えウイルスを標的とすることが望ましい場合がある。目的の配列（制御領域を含む）をウイルスベクターに挿入することによって、特定の標的細胞上の受容体に対するリガンドをコードする別の遺伝子とともに、例えば、ベクターはここでは、標的特異的である。レトロウイルスベクターは、例えば、糖脂質またはタンパク質を挿入することによって標的特異的に作製することができる。標的化は、しばしば、レトロウイルスベクターを標的化するために、抗体の抗原結合部分または組換え抗体型分子、例えば、一本鎖抗体を用いることによって達成される。当業者は、特定の標的へのレトロウイルスベクターの送達を達成するための特定の方法を知っているか、または過度の実験なしに容易に確認することができる。
【0180】
実施例５：タンパク質Ｖ、ヘキソン、ＩＶａ２、Ｌ１－５２／５５Ｋ、およびＬ４－２２Ｋの欠失を有するアデノウイルス
[0210]３つのウイルスコアタンパク質（Ｖ、ＶＩＩ、およびｍｕ）はウイルスＤＮＡと相互作用し、凝縮し、コアとカプシドの間の相互作用を媒介する。一連のマイナーなカプシド成分であるＩＩＩａ、ＶＩ、ＶＩＩＩ、およびＩＸは、カプシド構造および安定性に寄与する。ＩＶ ａ２タンパク質はＣＧモチーフに結合し、Ｌ４－２２Ｋタンパク質はインビトロおよびインビボでパッケージングＡリピートのＴＴＴＧモチーフに結合する。Ｌ１－５２／５５Ｋタンパク質はインビボでパッケージングドメインと会合することが見出されているだけであり、Ｌ１－５２／５５Ｋタンパク質はインビトロでＩＶ ａ２と会合する。ＩＶ ａ２およびＬ１－５２／５５Ｋタンパク質は、Ａｄ ＤＮＡのカプシドへのパッケージングに必要である。
[0210]３つのウイルスコアタンパク質（Ｖ、ＶＩＩ、およびｍｕ）はウイルスＤＮＡと相互作用し、凝縮し、コアとカプシドの間の相互作用を媒介する。一連のマイナーなカプシド成分であるＩＩＩａ、ＶＩ、ＶＩＩＩ、およびＩＸは、カプシド構造および安定性に寄与する。ＩＶ ａ２タンパク質はＣＧモチーフに結合し、Ｌ４－２２Ｋタンパク質はインビトロおよびインビボでパッケージングＡリピートのＴＴＴＧモチーフに結合する。Ｌ１－５２／５５Ｋタンパク質はインビボでパッケージングドメインと会合することが見出されているだけであり、Ｌ１－５２／５５Ｋタンパク質はインビトロでＩＶ ａ２と会合する。ＩＶ ａ２およびＬ１－５２／５５Ｋタンパク質は、Ａｄ ＤＮＡのカプシドへのパッケージングに必要である。
【0181】
[0211]Ａｄ５ Ｌ１－５２／５５Ｋタンパク質を安定に発現する新規２９３細胞株を、２９３－Ｌ１（Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１１年８月；８５巻（１５号）：７８４９～７８５５頁．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．００４６７－１１）について記載されているように、ゲネチシンで選択した後に単離する。
【0182】
[0212]Ｖ、ＩＶ ａ２、ヘキソン、およびＬ４－２２Ｋ発現についての類似の２９３細胞を生成し、２９３－Ｖ、２９３－Ｉｖａ２、２９４－Ｌ４、２９３－ヘキソンと名付けた。これらの領域に欠失を有するアデノウイルスは、ｐＡｄ－ｄ３およびｐＡｄ－ｄ１３からこれらのコード領域を最初に欠失させ、次に、感染性ウイルスを対応する細胞株からレスキューすることによって作製される。
【0183】
[0213]２９３細胞で試験した場合、Ａｄ－ｄＶはレポーター遺伝子産物を生成したが、異常になる（ｐｌａｇｕｅ）ことはなかった。適合性生成細胞株におけるＡＡＶのヘルパーとしての感染後、Ｖが欠失したウイルスゲノムは正常に複製され得る。しかしながら、子孫ビリオンはタンパク質Ｖを欠いており、最初の感染後に第２セットの細胞に能動的に感染することはできない。
【0184】
[0214]これらのアデノウイルスは、実施例Ｉに概説したようにＡＡＶ生成を支持する。
実施例６：ファイバー欠失を有するアデノウイルスはｒＡＡＶ生成を支持する
[0215]細胞受容体へのファイバータンパク質の結合は、アデノウイルスの主要な形質導入モードである。したがって、ファイバーのないＡｄ粒子は感染能を著しく低下させた。
実施例６：ファイバー欠失を有するアデノウイルスはｒＡＡＶ生成を支持する
[0215]細胞受容体へのファイバータンパク質の結合は、アデノウイルスの主要な形質導入モードである。したがって、ファイバーのないＡｄ粒子は感染能を著しく低下させた。
【0185】
[0216]Ａｄ５ファイバー発現細胞株を開発するために、Ａｄ５ファイバー配列をコドン最適化（ｃｏ）し、合成する。コドンの最適化は、タンパク質発現レベルを改善し、インビトロでの相同組換えの可能性を有意に減少させる。Ａｄ５－Ｆｉｂｅｒ－ｃｏを用いた発現断片は、Ｐｏｌｙｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて２９３細胞にトランスフェクトされる。トランスフェクションの２４時間後。ゲネチシン（０．５ｍｇ／ｍＬ）を添加した。次に、細胞株２９３－Ｆｉｂｒをウエスタンブロットにより確認する。
【0186】
[0217]ｐＡｄ－ｄ３およびｐＡｄ－ｄｌ３からファイバーを欠失させるために、特別に設計されたｃｒｉｓｐｒヌクレアーゼを用いて、ファイバー遺伝子断片を放出させ、得られた大きな断片をＤＮＡリガーゼにより再環状化してｐｄＦｉｂｒ－ｄ３およびｐｄＦｉｂｒ－ｄｌ３を得る。次に、ｐｄＦｉｂｒ－ｄ３およびｐｄＦｉｂｒ－ｄｌ３を使用して、２９３－Ｆｉｂｒ細胞株におけるウイルスＡｄ－ｄＦｉｂｒ－ｄ３およびＡｄ－ｄＦｉｂｒ－ｄｌ３をレスキューする。２９３－Ｆｉｂｒ細胞株におけるＡｄ－ｄＦｉｂｒ－ｄ３およびＡｄ－ｄＦｉｂｒ－ｄｌ３の収率は正常である。
【0187】
[0218]ＡＡＶ－ＧＦＰを有するＡｄ－ｄＦｉｂｒ－ｄ３およびＡｄ－ｄＦｉｂｒ－ｄｌ３は、２９３－Ｆｉｂｒ細胞株におけるレスキューのためにそれらを使用する前に、ＡＡＶ－ＧＦＰをｐｄＦｉｂｒ－ｄ３およびｐｄＦｉｂｒ－ｄｌ３にクローニングすることによって得る。
【0188】
[0219]試験結果は以下の通りであった：
【0189】
【表3】
【0190】
[0220]この結果は、アデノウイルス粒子を含まないＡＡＶベクターを得るためには、ファイバーがＩｌＩａなどの他の因子と結合する必要があることを示した。
[0221]したがって、本組成物および方法の幅および範囲は、上記載の例示的な実施形態のいずれかによって限定されるべきではなく、以下の特許請求の範囲およびそれらの均等物に従ってのみ定義されるべきである。
[0221]したがって、本組成物および方法の幅および範囲は、上記載の例示的な実施形態のいずれかによって限定されるべきではなく、以下の特許請求の範囲およびそれらの均等物に従ってのみ定義されるべきである。
【0191】
[0222]上載の説明は、本出願を実施する方法を当業者に教示するためのものであり、本明細書を読んだ後に当業者に明らかになる、それらの明白な修飾および変形の全てを詳細に説明することを意図したものではない。様々な実施形態が上記で説明されてきたが、このような開示は例示としてのみ提示されており、限定的なものではないことを理解されたい。さらに、以下の特許請求の範囲によって定義される本出願の範囲内に、全ての明白な修飾および変形が含まれることが意図されている。特許請求の範囲は、文脈が特に反対のことを示していない限り、そこで意図された目的を満たすのに効果的である、任意の順序で成分および工程をカバーすることを意図している。本組成物および方法の幅および範囲は、上記載の例示的な実施形態のいずれかによって限定されるべきではなく、以下の特許請求の範囲およびそれらの均等物に従ってのみ定義されるべきである。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【配列表】