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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-11-13
(45)【発行日】2023-11-21
(54)【発明の名称】抗ＣＬＬ１抗体およびその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20231114BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20231114BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20231114BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20231114BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20231114BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231114BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20231114BHJP
G01N 33/574 20060101ALI20231114BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20231114BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13 ZNA
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C07K16/28
G01N33/574 A
C12P21/08
【請求項の数】
10
(21)【出願番号】P 2022529575
(86)(22)【出願日】2020-12-22
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-10
(86)【国際出願番号】 CN2020138286
(87)【国際公開番号】W WO2022120943
(87)【国際公開日】2022-06-16
【審査請求日】2022-05-19
(31)【優先権主張番号】202011458917.8
(32)【優先日】2020-12-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】522199217
【氏名又は名称】広州百▲ジ▼基因科技有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】110002860
【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】羅 敏
(72)【発明者】
【氏名】李 光超
(72)【発明者】
【氏名】丁 ▲ブン▼
(72)【発明者】
【氏名】周 兆
(72)【発明者】
【氏名】王 学俊
【審査官】田中 晴絵
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１８－５２２５４１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１７－５３４２５６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１５－５１９３３６（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １６／００－１６／４６
Ｃ１２Ｐ ２１／０８
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗ＣＬＬ１抗体であって、
前記抗ＣＬＬ１抗体の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３で示されるＣＤＲ３を含み、且つ、前記抗ＣＬＬ１抗体の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６で示されるＣＤＲ３を含み、または
前記抗ＣＬＬ１抗体の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９で示されるＣＤＲ３を含み、且つ、前記抗ＣＬＬ１抗体の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ： １１で示されるＣＤＲ３を含み、または
前記抗ＣＬＬ１抗体の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４で示されるＣＤＲ３を含み、且つ、前記抗ＣＬＬ１抗体の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７で示されるＣＤＲ３を含む、
前記抗ＣＬＬ１抗体。
【請求項2】
前記抗ＣＬＬ１抗体の重鎖可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８で示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９で示されるアミノ酸配列を含み、または前記抗ＣＬＬ１抗体の重鎖可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０で示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１で示されるアミノ酸配列を含み、または
前記抗ＣＬＬ１抗体の重鎖可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２で示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２３で示されるアミノ酸配列を含み、または
前記抗ＣＬＬ１抗体の重鎖可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２４で示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７で示されるアミノ酸配列を含む、
請求項１に記載の抗ＣＬＬ１抗体。
【請求項3】
前記抗ＣＬＬ１抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間は、鎖間ジスルフィド結合を介して連結され、かつ、前記抗ＣＬＬ１抗体の重鎖可変領域間は、鎖間ジスルフィド結合を介して連結される、請求項１または２に記載の抗ＣＬＬ１抗体。
【請求項4】
前記抗ＣＬＬ１抗体は定常領域を更に含む、
請求項１から３のいずれか１項に記載の抗ＣＬＬ１抗体。
【請求項5】
前記抗ＣＬＬ１抗体にグリコシル化基が修飾されている、
請求項１から４のいずれか１項に記載の抗ＣＬＬ１抗体。
【請求項6】
請求項１から５のいずれか１項に記載の抗ＣＬＬ１抗体をコードするＤＮＡ断片を含む、核酸分子。
【請求項7】
請求項６に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項8】
請求項１から５のいずれか１項に記載の抗ＣＬＬ１抗体を発現する、組換え細胞。
【請求項9】
前記組換え細胞のゲノムに請求項６に記載の核酸分子が組み込まれている、請求項８に記載の組換え細胞。
【請求項10】
前記組換え細胞は、請求項７に記載の発現ベクターを含む、請求項８に記載の組換え細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本願は、生物医薬の技術分野に関し、抗ＣＬＬ１抗体およびその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｃ型レクチン様分子１（ＣＬＬ１）は、Ｃ型レクチンドメインファミリー１２のメンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）とも呼ばれ、文献およびデータベースには、ＤＣＡＬ－２、ＭＩＣＬ、ＣＤ３７１等の名称もあり、ＩＩ型膜貫通タンパク質であり、全長２６５個のアミノ酸があり、分子量が３０７６２ダルトンで、コーディング遺伝子はｃｈｒ１２：９，９５１，２６８～９，９９５，６９４（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）に位置する。現在、いくつかの主流データベースにおいて、ＣＬＬ１遺伝子の識別コードは、Ｑ５ＱＧＺ９（ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ）、３１７１３（ＨＧＮＣ）、１６０３６４（Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ）、ＥＮＳＧ０００００１７２３２２（Ｅｎｓｅｍｂｌ）、および（６１２０８８）ＯＭＩＭである。
【0003】
研究によると、ＣＬＬ１は、造血細胞に制限的に発現し、主に、末梢血および骨髄中の骨髄系に由来する細胞を含み、例えば、単核細胞、樹状細胞、顆粒球およびほとんどの急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞を含む。注意すべきことに、ＣＬＬ１が末梢血および骨髄中の骨髄細胞に大量に発現するが、末梢組織中の骨髄系に由来する細胞に発現せず、例えば、組織マクロファージおよび組織樹状細胞にＣＬＬ１がいずれも発見しないことが分かった。研究によると、ＣＬＬ１がＡＭＬ幹細胞（ＣＤ３４＋／ＣＤ３８－）およびごく一部の造血前駆細胞（ＣＤ３４＋／ＣＤ３８＋、またはＣＤ３４＋／ＣＤ３３＋）に発現するが、正常の造血幹細胞（ＣＤ３４＋／ＣＤ３８－、またはＣＤ３４＋／ＣＤ３３－）に発現しないことが更に分かった。このような特殊な発現モードにより、ＣＬＬ１は、ＡＭＬを診断して治療する潜在的な標的点になることが期待されている。
【0004】
現在、知られているヒトＣＬＬ１遺伝子は７つの転写物を含み、そのうちの５つはタンパク質をコードし、ヒトＣＬＬ１タンパク質は１種の膜受容体であり、従来構造の細胞外ドメインはＣ型レクチンドメインを有し、細胞内ドメインは免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を有し、リン酸化ＩＴＩＭは、ＳＨ２ドメインを含むホスファターゼと結合し、顆粒球および単核細胞を負調節（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）する機能を発揮する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本願は、抗ＣＬＬ１抗体およびその使用を提供し、前記抗体は、単独でおよび／または他の薬剤と合わせて癌および自己免疫疾患の治療に使用される。
【課題を解決するための手段】
【0006】
態様１において、本願は、
重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、
前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４で示されるＣＤＲ３を含み、
前記軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７で示されるＣＤＲ３を含む、
抗ＣＬＬ１抗体を提供する。
重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、
前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４で示されるＣＤＲ３を含み、
前記軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７で示されるＣＤＲ３を含む、
抗ＣＬＬ１抗体を提供する。
【0007】
いくつかの具体的な実施形態において、前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２で示されるＣＤＲ１を更に含む。
１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２で示されるＣＤＲ１を更に含む。
【0008】
いくつかの具体的な実施形態において、前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３で示されるＣＤＲ２を更に含む。
【0009】
いくつかの具体的な実施形態において、前記軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５で示されるＣＤＲ１を更に含む。
【0010】
いくつかの具体的な実施形態において、前記軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６で示されるＣＤＲ２を更に含む。
【0011】
本願において、抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ１～３と軽鎖可変領域のＣＤＲ１～３とが共に抗体の抗原に対する特異的な識別結合能力を決定し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １～６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７～１１、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２～１７を含むＣＤＲの抗体は、ＣＬＬ１タンパク質に対して著しい結合能力を有する。
【0012】
１つの具体的な実施例において、前記抗ＣＬＬ１抗体２３Ｄ７の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３で示されるＣＤＲ３を含み、
前記抗ＣＬＬ１抗体２３Ｄ７の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６で示されるＣＤＲ３を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １：ＲＹＷＭＨ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２：ＹＩＹＰＧＳＧＴＳＮＹＤＥＫＦＫＳ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３：ＥＡＲＹＴＭＤＹ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４：ＳＡＳＳＳＶＳＹＩＹ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５：ＤＴＳＮＬＡＳ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６：ＱＱＷＳＳＦＰ。
前記抗ＣＬＬ１抗体２３Ｄ７の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６で示されるＣＤＲ３を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １：ＲＹＷＭＨ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２：ＹＩＹＰＧＳＧＴＳＮＹＤＥＫＦＫＳ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３：ＥＡＲＹＴＭＤＹ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４：ＳＡＳＳＳＶＳＹＩＹ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５：ＤＴＳＮＬＡＳ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６：ＱＱＷＳＳＦＰ。
【0013】
本願において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １～３の重鎖可変領域ＣＤＲとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４～６の軽鎖可変領域ＣＤＲとを含む抗ＣＬＬ１抗体２３Ｄ７は、ＣＬＬ１タンパク質結合活性を有する。
【0014】
いくつかの具体的な実施形態において、前記抗ＣＬＬ１抗体２３Ｄ７の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８で示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ： １９で示されるアミノ酸配列を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８：
ＱＶＱＬＱＱＰＧＳＤＬＶＲＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＷＭＨＷＶＫＱＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＹＩＹＰＧＳＧＴＳＮＹＤＥＫＦＫＳＫＡＴＬＴＶＤＴＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＴＲＥＡＲＹＴＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９：
ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＩＹＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＧＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡＳＧＶＰＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＦＰＰＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ。
ＩＤ ＮＯ： １９で示されるアミノ酸配列を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８：
ＱＶＱＬＱＱＰＧＳＤＬＶＲＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＷＭＨＷＶＫＱＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＹＩＹＰＧＳＧＴＳＮＹＤＥＫＦＫＳＫＡＴＬＴＶＤＴＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＴＲＥＡＲＹＴＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９：
ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＩＹＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＧＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡＳＧＶＰＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＦＰＰＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ。
【0015】
１つの具体的な実施例において、前記抗ＣＬＬ１抗体１９Ｃ１の重鎖可変領域は、ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ： ７で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９で示されるＣＤＲ３を含み、
前記抗ＣＬＬ１抗体１９Ｃ１の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１で示されるＣＤＲ３を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７：ＳＹＷＩＥ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８：ＥＩＦＰＧＳＧＳＩＫＹＮＥＫＦＫＧ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９：ＧＧＴＹＮＤＹＳＬＦＤＹ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０：ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１：ＱＱＷＳＳＹＰ。
Ｑ ＩＤ ＮＯ： ７で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９で示されるＣＤＲ３を含み、
前記抗ＣＬＬ１抗体１９Ｃ１の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１で示されるＣＤＲ３を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７：ＳＹＷＩＥ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８：ＥＩＦＰＧＳＧＳＩＫＹＮＥＫＦＫＧ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９：ＧＧＴＹＮＤＹＳＬＦＤＹ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０：ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１：ＱＱＷＳＳＹＰ。
【0016】
本願において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７～９の重鎖可変領域ＣＤＲとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５、１０～１１の軽鎖可変領域ＣＤＲとを含む抗ＣＬＬ１抗体１９Ｃ１は、ＣＬＬ１タンパク質結合活性を有する。
【0017】
いくつかの具体的な実施形態において、前記抗ＣＬＬ１抗体１９Ｃ１の重鎖可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０で示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１で示されるアミノ酸配列を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０：
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＭＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＴＧＹＴＦＳＳＹＷＩＥＷＶＫＱＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＦＰＧＳＧＳＩＫＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＦＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＨＹＣＡＲＧＧＴＹＮＤＹＳＬＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１：
ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＲＬＬＩＦＤＴＳＮＬＡＳＧＶＰＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０：
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＭＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＴＧＹＴＦＳＳＹＷＩＥＷＶＫＱＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＦＰＧＳＧＳＩＫＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＦＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＨＹＣＡＲＧＧＴＹＮＤＹＳＬＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１：
ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＲＬＬＩＦＤＴＳＮＬＡＳＧＶＰＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ。
【0018】
１つの具体的な実施例において、前記抗ＣＬＬ１抗体２７Ｈ４の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４で示されるＣＤＲ３を含み、
前記抗ＣＬＬ１抗体２７Ｈ４の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７で示されるＣＤＲ３を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２：ＧＹＨＭＨ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３：ＲＩＮＰＹＮＧＡＡＳＨＮＱＫＦＫＤ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４：ＧＷＤＹＤＧＧＹＹＡＭＤＹ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５：ＫＳＳＱＳＬＬＹＳＤＮＱＫＮＹＬＡ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６：ＷＡＳＴＲＥＳ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７：ＱＱＹＹＴＹＰ。
前記抗ＣＬＬ１抗体２７Ｈ４の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７で示されるＣＤＲ３を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２：ＧＹＨＭＨ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３：ＲＩＮＰＹＮＧＡＡＳＨＮＱＫＦＫＤ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４：ＧＷＤＹＤＧＧＹＹＡＭＤＹ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５：ＫＳＳＱＳＬＬＹＳＤＮＱＫＮＹＬＡ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６：ＷＡＳＴＲＥＳ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７：ＱＱＹＹＴＹＰ。
【0019】
本願において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２～１４の重鎖可変領域ＣＤＲとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５～１７の軽鎖可変領域ＣＤＲとを含む抗ＣＬＬ１抗体２７Ｈ４は、ＣＬＬ１タンパク質結合活性を有する。
【0020】
いくつかの具体的な実施形態において、前記抗ＣＬＬ１抗体２７Ｈ４の重鎖可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２で示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２３で示されるアミノ酸配列を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２：
ＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＨＭＨＷＶＫＱ
ＳＨＶＫＳＬＥＷＩＧＲＩＮＰＹＮＧＡＡＳＨＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＨＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＷＤＹＤＧＧＹＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２３：
ＤＩＶＭＳＱＳＰＳＳＬＡＶＳＶＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＤＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＫＡＥＤＬＡＶＹＹＣＱＱＹＹＴＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２：
ＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＧＹＨＭＨＷＶＫＱ
ＳＨＶＫＳＬＥＷＩＧＲＩＮＰＹＮＧＡＡＳＨＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＨＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＷＤＹＤＧＧＹＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２３：
ＤＩＶＭＳＱＳＰＳＳＬＡＶＳＶＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＤＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＫＡＥＤＬＡＶＹＹＣＱＱＹＹＴＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ。
【0021】
好ましくは、抗ＣＬＬ１抗体２７Ｈ４に対してヒト化改造を行い、２７Ｈ４のフレーム領域を最適化し、取得したヒト化Ｈ２７Ｈ４抗体は、ＣＬＬ１とのより強い親和性を持ち、前記抗ＣＬＬ１抗体Ｈ２７Ｈ４の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２４で示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ： ２６またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７で示されるアミノ酸配列を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２４：
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＲＩＮＰＹＮＧＡＡＳＨＮＱＫＦＫＤＲＶＴＩＴＲＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＷＤＹＤＧＧＹＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＤＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＹＴＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６：
ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＤＮＱＫＮＹＬＡＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＱＱＹＹＴＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７：
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＤＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＴＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ。
ＮＯ： ２６またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７で示されるアミノ酸配列を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２４：
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＨＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＲＩＮＰＹＮＧＡＡＳＨＮＱＫＦＫＤＲＶＴＩＴＲＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＷＤＹＤＧＧＹＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＤＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＹＴＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６：
ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＤＮＱＫＮＹＬＡＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＱＱＹＹＴＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７：
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＤＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＴＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ。
【0022】
好ましくは、前記抗ＣＬＬ１抗体はモノマーであり、１グループの重鎖および軽鎖で形成され、前記重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間は、鎖間ジスルフィド結合を介して連結される。
【0023】
好ましくは、前記抗ＣＬＬ１抗体はポリマーであり、複数グループの重鎖および軽鎖で形成され、前記重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間は、鎖間ジスルフィド結合を介して連結され、異なる重鎖可変領域間は、鎖間ジスルフィド結合を介して連結される。
【0024】
好ましくは、前記抗ＣＬＬ１抗体は定常領域を更に含む。
【0025】
好ましくは、前記抗ＣＬＬ１抗体にグリコシル化基が修飾されている。
【0026】
態様２において、本願は、態様１に記載の抗ＣＬＬ１抗体をコードするＤＮＡ断片を含む核酸分子を提供する。
【0027】
態様３において、本願は、態様２に記載の核酸分子を含む発現ベクターを提供する。
【0028】
態様４において、本願は、態様１に記載の抗ＣＬＬ１抗体を発見する組換え細胞を提供する。
【0029】
好ましくは、前記組換え細胞のゲノムに、態様２に記載の核酸分子が組み込まれている。
【0030】
好ましくは、前記組換え細胞は態様３に記載の発現ベクターを含む。
【0031】
態様５において、本願は、
（１）抗ＣＬＬ１抗体のコード核酸をプラスミドに連結し、コンピンテントセルに転移し、培養した後、モノクローナル細胞を選抜してスクリーニングすることと、
（２）スクリーニングした陽性クローンの発現ベクターを抽出し、宿主細胞にトランスフェクションし、培養して上清を収集し、分離精製して前記抗体を取得することと、
を含む態様１に記載の抗ＣＬＬ１抗体の調製方法を提供する。
（１）抗ＣＬＬ１抗体のコード核酸をプラスミドに連結し、コンピンテントセルに転移し、培養した後、モノクローナル細胞を選抜してスクリーニングすることと、
（２）スクリーニングした陽性クローンの発現ベクターを抽出し、宿主細胞にトランスフェクションし、培養して上清を収集し、分離精製して前記抗体を取得することと、
を含む態様１に記載の抗ＣＬＬ１抗体の調製方法を提供する。
【0032】
態様６において、本願は、態様１に記載の抗ＣＬＬ１抗体を含む医薬組成物を提供する。
【0033】
好ましくは、前記医薬組成物は抗腫瘍薬を更に含む。
【0034】
好ましくは、前記医薬組成物は、医薬的に許容されるベクター、希釈剤、または賦形剤のいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせを更に含む。
【0035】
態様７において、本願は、態様１に記載の抗ＣＬＬ１抗体、態様２に記載の核酸分子、態様３に記載の発現ベクター、態様４に記載の組換え細胞、または態様６に記載の医薬組成物の、疾患検出試薬および／または疾患治療薬の調製における使用であって、
好ましくは、前記疾患は急性骨髄性白血病を含む、
使用を提供する。
好ましくは、前記疾患は急性骨髄性白血病を含む、
使用を提供する。
【0036】
態様８において、本願は、患者に有効用量の態様１に記載の抗ＣＬＬ１抗体を投与することを含む癌の治療方法を提供する。
【0037】
好ましくは、前記方法は、１種または複数種の抗腫瘍薬を抗ＣＬＬ１抗体と同時、別々、または順次投与することを更に含む。
【0038】
好ましくは、前記癌症は急性骨髄性白血病を含む。
【発明の効果】
【0039】
従来技術と比べ、本願は、以下のような有益な効果を有する。
【0040】
（１）本願の抗ＣＬＬ１抗体２３Ｄ７、２７Ｈ４、１９Ｃ１は、ＣＬＬ１に対して著しい結合能力を有し、ｃｈ２３Ｄ７、ｃｈ２７Ｈ４およびｃｈ１９Ｃ１の抗原ＣＬＬ１と結合する親和性は、それぞれ２．１９ｎＭ、３．８３ｎＭおよび１０．９ｎＭであり、対照抗体１０７５．７に相当する。
【0041】
（２）本願の抗ＣＬＬ１抗体２３Ｄ７、２７Ｈ４、１９Ｃ１は、細胞表面のＣＬＬ１タンパク質と結合することができ、結合力は抗体濃度の上昇に伴って増大する。
【0042】
（３）本願の抗体は、ヒト化改造を経た後、抗体と遊離したおよび／または細胞表面のＣＬＬ１との親和性を更に向上させる。
【0043】
（４）本願の抗体およびそのヒト化改造された抗体は、ＣＬＬ１陽性腫瘍の治療におい
て重要な応用の見通しを有する。
て重要な応用の見通しを有する。
【図面の簡単な説明】
【0044】
【図1】キメラ抗体ｃｈ２３Ｄ７、ｃｈ２７Ｈ４およびｃｈ１９Ｃ１のＦｏｒｔｅＢＩＯ評価結果である。
【図2】キメラ抗体ｃｈ２３Ｄ７、ｃｈ２７Ｈ４、ｃｈ１９Ｃ１とＣＬＬ１抗原との結合をフローサイトメーターで検出する図である。
【図3】ヒト化抗体ｈｚ２７Ｈ４とＣＬＬ１抗原との結合をフローサイトメーターで検出する図である。
【図4】抗体がＣＬＬ１と結合して２９３Ｔ細胞に一過性トランスフェクションする能力をフローサイトメーターで検出する図である。
【発明を実施するための形態】
【0045】
本願が講じた技術的手段およびその効果を更に説明するために、以下、実施例および図面を参照しながら本願について更に説明する。ここで説明する具体的な実施形態は、本願を解釈するためのものに過ぎず、本願を限定するものではないことが理解できる。
【0046】
実施例に具体的な技術または条件が明記されていないものは、本分野内の文献に記載されている技術もしくは条件、または製品の説明書に従って行われる。使用される試薬または機器におけるメーカーが明記されていないものは、いずれも正規のルートから購入可能な通常の製品である。
【0047】
実施例１ 抗体の取得
１０匹の７～８週齢のＢＡＬＢ／Ｃの健康な雌のマウスを選択し、免疫原ＣＬＬ１－ｍＦｃ（ＣＬＬ１細胞外ドメインとマウスＩｇＧ１ Ｆｃ断片との融合タンパク質、ＣＬＬ１細胞外ドメインのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２８に示すとおりである）を用いて免疫を行い、２回目の免疫を行ってから２週間後に、マウスの尾静脈から採血して血清を分離し、ＥＬＩＳＡで抗体価を検出し、抗体価が融合可能な要求に達した２匹のマウスを選択し、融合の３日前に抗原を５０μｇ／１００μＬ／匹で腹腔内に注射してショック免疫を行い、それと同時に、抗体価検出の１週間前に骨髄腫細胞ＳＰ２／０を蘇生させ、３７℃にて５％のＣＯ２インキュベーターで培養し、融合の前日に骨髄腫細胞を継代し、または新鮮な培地に交換し、細胞を最適な状態に保持させた。
１０匹の７～８週齢のＢＡＬＢ／Ｃの健康な雌のマウスを選択し、免疫原ＣＬＬ１－ｍＦｃ（ＣＬＬ１細胞外ドメインとマウスＩｇＧ１ Ｆｃ断片との融合タンパク質、ＣＬＬ１細胞外ドメインのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２８に示すとおりである）を用いて免疫を行い、２回目の免疫を行ってから２週間後に、マウスの尾静脈から採血して血清を分離し、ＥＬＩＳＡで抗体価を検出し、抗体価が融合可能な要求に達した２匹のマウスを選択し、融合の３日前に抗原を５０μｇ／１００μＬ／匹で腹腔内に注射してショック免疫を行い、それと同時に、抗体価検出の１週間前に骨髄腫細胞ＳＰ２／０を蘇生させ、３７℃にて５％のＣＯ２インキュベーターで培養し、融合の前日に骨髄腫細胞を継代し、または新鮮な培地に交換し、細胞を最適な状態に保持させた。
【0048】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２８：
ＨＶＴＬＫＩＥＭＫＫＭＮＫＬＱＮＩＳＥＥＬＱＲＮＩＳＬＱＬＭＳＮＭＮＩＳＮＫＩＲＮＬＳＴＴＬＱＴＩＡＴＫＬＣＲＥＬＹＳＫＥＱＥＨＫＣＫＰＣＰＲＲＷＩＷＨＫＤＳＣＹＦＬＳＤＤＶＱＴＷＱＥＳＫＭＡＣＡＡＱＮＡＳＬＬＫＩＮＮＫＮＡＬＥＦＩＫＳＱＳＲＳＹＤＹＷＬＧＬＳＰＥＥＤＳＴＲＧＭＲＶＤＮＩＩＮＳＳＡＷＶＩＲＮＡＰＤＬＮＮＭＹＣＧＹＩＮＲＬＹＶＱＹＹＨＣＴＹＫＫＲＭＩＣＥＫＭＡＮＰＶＱＬＧＳＴＹＦＲＥＡ。
ＨＶＴＬＫＩＥＭＫＫＭＮＫＬＱＮＩＳＥＥＬＱＲＮＩＳＬＱＬＭＳＮＭＮＩＳＮＫＩＲＮＬＳＴＴＬＱＴＩＡＴＫＬＣＲＥＬＹＳＫＥＱＥＨＫＣＫＰＣＰＲＲＷＩＷＨＫＤＳＣＹＦＬＳＤＤＶＱＴＷＱＥＳＫＭＡＣＡＡＱＮＡＳＬＬＫＩＮＮＫＮＡＬＥＦＩＫＳＱＳＲＳＹＤＹＷＬＧＬＳＰＥＥＤＳＴＲＧＭＲＶＤＮＩＩＮＳＳＡＷＶＩＲＮＡＰＤＬＮＮＭＹＣＧＹＩＮＲＬＹＶＱＹＹＨＣＴＹＫＫＲＭＩＣＥＫＭＡＮＰＶＱＬＧＳＴＹＦＲＥＡ。
【0049】
ショック免疫を行ったマウスを頸採血し、７５％のアルコールで１０ｍｉｎ消毒した後、脾臓を取り出し、結合組織を除去し、脾細胞懸濁液を調製し、脾細胞懸濁液を５０ｍＬの遠心チューブに移し、ＲＰＭＩ１６４０を３０ｍＬまで加え、１０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心し、上清を捨て、ＲＰＭＩ１６４０を３０ｍＬまで加え、細胞カウントを行い、成長状態が良好な骨髄腫細胞（生細胞数＞９５％）を５０ｍＬの遠心チューブに移し、ＲＰＭＩ１６４０を３０ｍＬまで加え、１０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心し、上清を捨て、ＲＰＭＩ１６４０を３０ｍＬまで加え、細胞カウントを行った。
【0050】
脾細胞と骨髄腫細胞とを４：１の割合で混合させ、１０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心し、上清を捨て、沈殿した細胞塊をペースト状にしてから３７℃の水浴に置き、１ｍｉｎ内に１ｍＬの融合剤を入れて均一に撹拌し、３７℃の水浴に４５～６０ｓ置き、１ｍｉｎ内にＲＰＭＩ１６４０を入れて融合剤の融合作用を終了させ、１０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心し、上清を捨てた。
【0051】
細胞を軽く均一にし、ＨＡＴを含む完全培養液を徐々に加え、細胞懸濁液を予め用意した完全培地に加え、ピペットで９６孔プレートに滴下し、各孔に１５０～２００μＬとし、３７℃にてＣＯ２のインキュベーターで培養して観察した。
【0052】
細胞融合後の初日から細胞の成長状態を観察し、培養液が汚染されていないことを確定し、７～１０日間培養した後、ＨＡＴ培養液をＨＴ培養液に交換し、３～４日間培養し続け、各孔から上清を取り出してＥＬＩＳＡ検出を行った。
【0053】
ＥＬＩＳＡのスクリーニングステップは、以下のとおりであった。
【0054】
（１）抗原の被覆：濃度５０ｎｇ／ｍＬの純抗原ｈｕｍａｎ ＣＬＬ１ ＥＣＤ－Ｈｉｓ（ヒトＣＬＬ１細胞外ドメインにＨｉｓタグが連結されている）を被覆液で希釈した後、１００μＬ取ってポリスチレン酵素結合検出プレートの各孔に入れ、４℃で一晩置いた。
【0055】
（２）ブロッキング：翌日、ＥＬＩＳＡプレートを室温にバランスさせ、ＰＢＳで３回洗浄し、各孔に１００μＬのブロッキング液を加え、室温で１時間インキュベートした後、ＰＢＳで３回洗浄し、叩いて乾燥させた。
【0056】
（３）測定待ちサンプルの添加：無菌条件で融合細胞を取って上清を培養し、３５～５０μＬ／孔でサンプルをブロッキングされたＥＬＩＳＡプレートに加え、それと同時に、ネガティブコントロール孔（細胞成長がない）およびポジティブコントロール孔（陽性血清が添加された）を設け、室温で１ｈインキュベートし、ＰＢＳＴ（０．０５％トゥイーン）で３回洗浄し、ＰＢＳで２回洗浄した。
【0057】
（４）二次抗体の添加：５０μＬ／孔の添加量で希釈された酵素標識二次抗体を加え、３７℃で３０ｍｉｎインキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、叩いて乾燥させた。
【0058】
（５）発色：二成分ＴＭＢ発色液終了液（Ｓｏｌａｒｂｉｏ、Ｃａｔ＃ＰＲ１２１０）を５０μＬ／孔で添加し、添加前に均一に混合させ、３７℃で１５～３０ｍｉｎ発色し、その後、５０μＬ／孔で終了液を加えて反応を終了させた。
【0059】
（６）値の読み取り：単波長４５０ｎＭで各孔のＯＤ値を測定し、高い順に読み取り値が高い複数のクローンを選択して次の機能のスクリーニングを行った。
【0060】
ＥＬＩＳＡ初回スクリーニングの陽性孔を選択し、合流率の高い陽性孔の細胞を２４孔プレートに継代し、更に機能実験を行い、サブクローンを行うクローン番号を確定し、限界希釈法で細胞サブクローンを行うとともに、凍結して種を保存し、具体的には、細胞クローンを希釈してから９６孔プレートに敷き、クローン毎に１つのプレートを敷き、ＨＴ培地で７～１０日間培養し、７日目以降顕微鏡で観察し、モノクローナル細胞を選択して上清をＥＬＩＳＡで更に陽性クローンをスクリーニングした。
【0061】
クローンをシーケンシングし、クローン２３Ｄ７、１９Ｃ１、２７Ｈ４のアミノ酸配列を取得し、ここで、２３Ｄ７の重鎖可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８に示すとおりであり、軽鎖可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９に示すとおりであり、１９Ｃ１の重鎖可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０に示すとおりであり、軽鎖可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１に示すとおりであり、２７Ｈ４の重鎖可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２に示すとおりであり、軽鎖可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２３に示すとおりであった。
【0062】
実施例２ 抗体の発現および精製
本実施例は、モノクローナル鑑定シーケンシング結果に基づき、特異的なプライマーを設計し、ＰＣＲで抗体２３Ｄ７、１９Ｃ１、２７Ｈ４の遺伝子を取得し、遺伝子をヒトＩｇＧ１重鎖定常領域のＦｃ断片のコーディング遺伝子の上流にクローンし、組換え真核発現ベクターを構築し、ヒト－マウスキメラ抗体発現プラスミドを取得した。
本実施例は、モノクローナル鑑定シーケンシング結果に基づき、特異的なプライマーを設計し、ＰＣＲで抗体２３Ｄ７、１９Ｃ１、２７Ｈ４の遺伝子を取得し、遺伝子をヒトＩｇＧ１重鎖定常領域のＦｃ断片のコーディング遺伝子の上流にクローンし、組換え真核発現ベクターを構築し、ヒト－マウスキメラ抗体発現プラスミドを取得した。
【0063】
前記ヒト－マウスキメラ抗体発現プラスミドを２９３Ｆ細胞に一過性トランスフェクションし、一過性発現およびアフィニティ精製により、２３Ｄ７、１９Ｃ１、２７Ｈ４を親としてのキメラ抗体ｃｈ２３Ｄ７、ｃｈ１９Ｃ１、ｃｈ２７Ｈ４を取得した。
【0064】
実施例３ 抗体の親和性試験
本実施例は、ＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性測定方法（Ｐ． Ｅｓｔｅｐら、Ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ａｎｔｉｇｅｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｂｉｎｎｉｎｇ．ＭＡｂｓ、２０１３．５（２）：２７０～２７８．）を採用してキメラ抗体ｃｈ２３Ｄ７、ｃｈ１９Ｃ１、ｃｈ２７Ｈ４に対して親和性検出を行い、対照抗体（Ａｎｔｉ－ＣＬＬ１－Ｒｅｆ）は、抗ヒトＣＬＬ－１抗体１０７５．７（特許ＵＳ８５３６３１０Ｂ２）のＶＬおよびＶＬ鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９）を選択した。
本実施例は、ＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性測定方法（Ｐ． Ｅｓｔｅｐら、Ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ａｎｔｉｇｅｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｂｉｎｎｉｎｇ．ＭＡｂｓ、２０１３．５（２）：２７０～２７８．）を採用してキメラ抗体ｃｈ２３Ｄ７、ｃｈ１９Ｃ１、ｃｈ２７Ｈ４に対して親和性検出を行い、対照抗体（Ａｎｔｉ－ＣＬＬ１－Ｒｅｆ）は、抗ヒトＣＬＬ－１抗体１０７５．７（特許ＵＳ８５３６３１０Ｂ２）のＶＬおよびＶＬ鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９）を選択した。
【0065】
簡単に言えば、ベースラインを確立するために、抗体を抗ヒトＩｇＧ捕捉（ＡＨＣ）バイオセンサに搭載し、センサを測定緩衝液内においてオフラインで３０ｍｉｎバランスさせ、オンラインで６０ｓ監視した。抗体を搭載したセンサと１００ｎＭの抗原ｈｕｍａｎ
ＣＬＬ１ ＥＣＤ－Ｈｉｓとを共に５ｍｉｎインキュベートした後、測定緩衝液内に移し、５ｍｉｎ後に解離速度を測定し、１：１の結合モデルで動力学分析を行った。
ＣＬＬ１ ＥＣＤ－Ｈｉｓとを共に５ｍｉｎインキュベートした後、測定緩衝液内に移し、５ｍｉｎ後に解離速度を測定し、１：１の結合モデルで動力学分析を行った。
【0066】
結果は、表１および図１に示すように、ｃｈ２３Ｄ７、ｃｈ２７Ｈ４およびｃｈ１９Ｃ１の抗原ＣＬＬ１と結合する親和性は、それぞれ２．１９ｎＭ、３．８３ｎＭおよび１０．９ｎＭであり、対照抗体１０７５．７の抗原ＣＬＬ１と結合する親和性は１．０８ｎＭであった。
【0067】
【表1】
【0068】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９：
ＥＮＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＮＶＩＳＳＹＶＨＷＹＱＱＲＳＧＡＳＰＫＬＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＶＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＹＳＧＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＳＬＳＬＴＣＳＶＴＧＹＳＩＴＳＡＹＹＷＮＷＩＲＱＦＰＧＮＫＬＥＷＭＧＹＩＳＹＤＧＲＮＮＹＮＰＳＬＫＮＲＩＳＩＴＲＤＴＳＫＮＱＦＦＬＫＬＮＳＶＴＴＥＤＴＡＴＹＹＣＡＫＥＧＤＹＤＶＧＮＹＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ。
ＥＮＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＮＶＩＳＳＹＶＨＷＹＱＱＲＳＧＡＳＰＫＬＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＶＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＹＳＧＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＳＬＳＬＴＣＳＶＴＧＹＳＩＴＳＡＹＹＷＮＷＩＲＱＦＰＧＮＫＬＥＷＭＧＹＩＳＹＤＧＲＮＮＹＮＰＳＬＫＮＲＩＳＩＴＲＤＴＳＫＮＱＦＦＬＫＬＮＳＶＴＴＥＤＴＡＴＹＹＣＡＫＥＧＤＹＤＶＧＮＹＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ。
【0069】
実施例４ 抗体とＨＥＫ２９３細胞におけるＣＬＬ１との結合
本実施例は、抗体ｃｈ２３Ｄ７、ｃｈ２７Ｈ４、ｃｈ１９Ｃ１とＨＥＫ２９３細胞におけるＣＬＬ１との結合をフローサイトメトリー法で検出し、ステップは以下のとおりであった。
本実施例は、抗体ｃｈ２３Ｄ７、ｃｈ２７Ｈ４、ｃｈ１９Ｃ１とＨＥＫ２９３細胞におけるＣＬＬ１との結合をフローサイトメトリー法で検出し、ステップは以下のとおりであった。
【0070】
ＰＢＳ＋５％ＢＳＡを採用してＣＬＬ１を過剰発現した５×１０５個のＨＥＫ２９３細胞を再懸濁し、４℃で３０ｍｉｎインキュベートし、異なる濃度の抗体（１μｇ／ｍＬ～０．０１μｇ／ｍＬ、１０倍段階希釈）を加え、４℃で６０ｍｉｎインキュベートし、遠心して洗浄した後、ＦＩＴＣ－標識ヒツジ抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ二次抗体（１：２００、ｓｉｇｍａ、Ｆ９５１２）を含むＰＢＳ＋５％ＢＳＡ溶液を加え、氷上で遮光して３０ｍｉｎインキュベートし、細胞を３回洗浄した後、フローサイトメトリー法で分析した。
【0071】
対照グループＣＬＬ１－ＲｅｆＡｂ（ｃｈ１０７５．７）、Ｃｅｌｌ＋二次抗体、およびＢｌａｎｋを設けた。
【0072】
結果は、図２に示すように、キメラ抗体ｃｈ２３Ｄ７、ｃｈ２７Ｈ４、ｃｈ１９Ｃ１、ｃｈ１０７５．７は、いずれもＨＥＫ２９３－ＣＬＬ１細胞と効果的に結合することができ、抗体濃度の上昇に伴い、平均蛍光強度（ＭＦＩ）も上昇した。
【0073】
実施例５ 抗体のヒト化改造
本実施例は、２７Ｈ４に対してヒト化改造を行った。簡単に言えば、２７Ｈ４抗体の遺伝子配列をヒト抗体Ｇｅｒｍｌｉｎｅデータベースと比較し、相同性が高い配列を見出したとともに、一般的に使用しないまたは小さな種類のＧｅｒｍｌｉｎｅを回避した。ヒト化テンプレートを選択した後、抗体の特定のＦＲサイトにおけるアミノ酸の出現頻度を並べ替え（ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ）、ＣＤＲ移植を行い、グリコシル化等のタンパク質修飾サイトおよび化学分解しやすいサイトの導入を回避し、ＣＤＲ移植後の配列の親和性が低下すると、復帰変異を行い、変異原則は、ＦＲ領域に対して段階的な単一サイトの変異を行うことであり、ＣＤＲ領域に修飾サイトまたは化学分解サイトが存在し、且つタンパク質の品質制御に影響を及ぼす場合、サイトに対して段階的な単一サイトの変異を行い、毎ラウンドの変異の後に、親和性（ＫＤ／Ｋｏｎ／Ｋｏｆｆ）検出を行い、最終的に取得したヒト化配列は、親和性（親と比べて３倍以内の差がある）、安定性、タンパク質の品質
（プレアルブミンＰＡ＞９０％）等の面でいずれも最適な表現を有する。
本実施例は、２７Ｈ４に対してヒト化改造を行った。簡単に言えば、２７Ｈ４抗体の遺伝子配列をヒト抗体Ｇｅｒｍｌｉｎｅデータベースと比較し、相同性が高い配列を見出したとともに、一般的に使用しないまたは小さな種類のＧｅｒｍｌｉｎｅを回避した。ヒト化テンプレートを選択した後、抗体の特定のＦＲサイトにおけるアミノ酸の出現頻度を並べ替え（ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ）、ＣＤＲ移植を行い、グリコシル化等のタンパク質修飾サイトおよび化学分解しやすいサイトの導入を回避し、ＣＤＲ移植後の配列の親和性が低下すると、復帰変異を行い、変異原則は、ＦＲ領域に対して段階的な単一サイトの変異を行うことであり、ＣＤＲ領域に修飾サイトまたは化学分解サイトが存在し、且つタンパク質の品質制御に影響を及ぼす場合、サイトに対して段階的な単一サイトの変異を行い、毎ラウンドの変異の後に、親和性（ＫＤ／Ｋｏｎ／Ｋｏｆｆ）検出を行い、最終的に取得したヒト化配列は、親和性（親と比べて３倍以内の差がある）、安定性、タンパク質の品質
（プレアルブミンＰＡ＞９０％）等の面でいずれも最適な表現を有する。
【0074】
以上の原則に基づき、ヒト化ｈｚ２７Ｈ４抗体の１本の重鎖可変領域であるｈｚ２７Ｈ４Ｈ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２４）と、３本の軽鎖可変領域であるｈｚ２７Ｈ４Ｌ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５）、ｈｚ２７Ｈ４Ｌ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６）およびｈｚ２７Ｈ４Ｌ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７）とを取得した。
【0075】
実施例６ ヒト化前後の抗体のＣＬＬ１との親和性の差のＦｏｒｔｅＢＩｏによる分析
簡単に言えば、ベースラインを確立するために、４μｇ／ｍＬの抗体を抗ヒトＩｇＧ捕捉（ＡＨＣ）バイオセンサに搭載し、センサを測定緩衝液内においてオフラインで３０ｍｉｎバランスさせ、オンラインで６０ｓ監視し、抗体を搭載したセンサと６０ｎＭの抗原ｈｕｍａｎ ＣＬＬ１ ＥＣＤ－Ｈｉｓとを共に３ｍｉｎインキュベートし、その後、測定緩衝液に移し、３ｍｉｎ後に解離速度を測定し、１：１の結合モデルで動力学分析を行った。
簡単に言えば、ベースラインを確立するために、４μｇ／ｍＬの抗体を抗ヒトＩｇＧ捕捉（ＡＨＣ）バイオセンサに搭載し、センサを測定緩衝液内においてオフラインで３０ｍｉｎバランスさせ、オンラインで６０ｓ監視し、抗体を搭載したセンサと６０ｎＭの抗原ｈｕｍａｎ ＣＬＬ１ ＥＣＤ－Ｈｉｓとを共に３ｍｉｎインキュベートし、その後、測定緩衝液に移し、３ｍｉｎ後に解離速度を測定し、１：１の結合モデルで動力学分析を行った。
【0076】
結果は、表２に示すように、３つのヒト化抗体（ｈｚ２７Ｈ４Ｈ１Ｌ１、ｈｚ２７Ｈ４Ｈ１Ｌ２およびｈｚ２７Ｈ４Ｈ１Ｌ３）は、親抗体（ｃｈ２７Ｈ４）と比べ、いずれも高い親和性を保留した。
【0077】
【表2】
【0078】
実施例７ ヒト化抗体とＣＬＬ１との結合のフローサイトメーターによる検出
本実施例は、フローサイトメトリー法で抗体ｈｚ２７Ｈ４Ｈ１Ｌ１、ｈｚ２７Ｈ４Ｈ１Ｌ２とＨＥＫ２９３細胞におけるＣＬＬ１との結合を検出し、ステップは以下のとおりであった。
本実施例は、フローサイトメトリー法で抗体ｈｚ２７Ｈ４Ｈ１Ｌ１、ｈｚ２７Ｈ４Ｈ１Ｌ２とＨＥＫ２９３細胞におけるＣＬＬ１との結合を検出し、ステップは以下のとおりであった。
【0079】
ＰＢＳ＋５％ＢＳＡを採用してＣＬＬ１を過剰発現した２×１０５個のＨＥＫ２９３細胞を再懸濁し、４℃で３０ｍｉｎインキュベートし、異なる濃度の抗体（５μｇ／ｍＬ～０．００２２８６μｇ／ｍＬ、３倍段階希釈）を加え、４℃で６０ｍｉｎインキュベートし、遠心して洗浄した後、ＦＩＴＣ－標識ヒツジ抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ二次抗体（１：２００、ｓｉｇｍａ、Ｆ９５１２）を含むＰＢＳ＋５％ＢＳＡ溶液を加え、氷上で遮光して３０ｍｉｎインキュベートし、細胞を３回洗浄した後、フローサイトメトリー法で分析し、Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェアで計算してＥＣ５０を得た。
【0080】
対照グループｃｈ２７Ｈ４、ＣＬＬ１－ＲｅｆＡｂ（ｃｈ１０７５．７）、およびＮＣ－ｈｕＩｇＧ１を設けた。
【0081】
結果は、図３、図４および表３に示すように、ｃｈ２７Ｈ４は用量依存の方式でＣＬＬ１と結合し、ＥＣ５０（ｎ＝１）は０．３５８３μｇ／ｍＬであり、ｈｚ２７Ｈ４Ｈ１Ｌ１は用量依存の方式でＣＬＬ１と結合し、ＥＣ５０値（ｎ＝１）は０．２６８１μｇ／ｍ
Ｌであり、ｈｚ２７Ｈ４Ｈ１Ｌ２は用量依存の方式でＣＬＬ１と結合し、ＥＣ５０値（ｎ＝１）は０．３２１４μｇ／ｍＬであり、ＣＬＬ１－ｒｅｆＡｂは用量依存の方式でＣＬＬ１と結合し、ＥＣ５０値（ｎ＝１）は０．２２４６μｇ／ｍＬであり、ｃｈ２７Ｈ４、ｈｚ２７Ｈ４Ｈ１Ｌ１およびｈｚ２７Ｈ４Ｈ１Ｌ２は、ＣＬＬ１－ｒｅｆＡｂに類似するＥＣ５０でヒトＣＬＬ１と結合した。
Ｌであり、ｈｚ２７Ｈ４Ｈ１Ｌ２は用量依存の方式でＣＬＬ１と結合し、ＥＣ５０値（ｎ＝１）は０．３２１４μｇ／ｍＬであり、ＣＬＬ１－ｒｅｆＡｂは用量依存の方式でＣＬＬ１と結合し、ＥＣ５０値（ｎ＝１）は０．２２４６μｇ／ｍＬであり、ｃｈ２７Ｈ４、ｈｚ２７Ｈ４Ｈ１Ｌ１およびｈｚ２７Ｈ４Ｈ１Ｌ２は、ＣＬＬ１－ｒｅｆＡｂに類似するＥＣ５０でヒトＣＬＬ１と結合した。
【0082】
【表3】
【0083】
実施例８ 抗体の特異性の膜プロテオームアレイによる評価
本実施例は、膜プロテオームアレイ（Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ａｒｒａｙ、ＭＰＡ）を採用して抗体の非標的点結合の相互作用を検証した。膜プロテオームアレイ（ＭＰＡ）は、特異的な抗体および他のリガンドを標的とするヒト膜タンパク質を分析する１つのプラットフォームであり、抗体の標的点の特異性を確定することに使用できる。
本実施例は、膜プロテオームアレイ（Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ａｒｒａｙ、ＭＰＡ）を採用して抗体の非標的点結合の相互作用を検証した。膜プロテオームアレイ（ＭＰＡ）は、特異的な抗体および他のリガンドを標的とするヒト膜タンパク質を分析する１つのプラットフォームであり、抗体の標的点の特異性を確定することに使用できる。
【0084】
約６０００個の膜タンパク質クローン（ヒト膜プロテオームの９４％以上を占める）を含むプラスミドを、それぞれＨＥＫ－２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－３２１６）またはＱＴ６細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１７０８）にトランスフェクションし、１８０００個の細胞／孔の密度で３８４孔の細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３７６４）に接種し、３６時間インキュベートした後、試験抗体を予め確定された濃度で膜プロテオームアレイマトリックスプレートに加え、フローサイトメーターで抗体ｓｃＦｖと約６０００種の膜タンパク質の発現細胞との結合状況を直接検出した。全ての標的タンパク質は、いずれも天然配座および適当な翻訳後修飾を有し、哺乳動物が発現した一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）はＶＬ－（Ｇ４Ｓ）３－ＶＨ構造であり、Ｃ末端はヒトｈＩｇＧ１－Ｆｃを融合発現し、具体的な情報は表４に示すとおりであった。
【0085】
試験結果は、図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃおよび図５Ｄに示すように、２３Ｄ７－ｓｃＦｖ－ｈＦｃ、２７Ｈ４－ｓｃＦｖ－ｈＦｃ、１９Ｃ１－ｓｃＦｖ－ｈＦｃ、Ｈｚ２７Ｈ４－ｓｃＦｖ－ｈＦｃは、いずれもＣＬＬ１標的抗原と特異的に結合することができ、ここで、ＦＣＧＲ１Ａ、ＦＣＧＲ２Ｂ、ＦＣＧＲ３ＢはＩｇＧ Ｆｃ受容体（ＩｇＧ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）であった。
【0086】
【表4】
【0087】
実施例９ 抗体親和性の表面プラズモン共鳴による測定
本実施例は、表面プラズモン共鳴技術（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、ＳＰＲ）を採用して２種のＣＬＬ－１抗原（組換えヒト由来ＣＬＬ－１、Ａｃｒｏ、商品番号：ＣＬＡ－Ｈ５２４５、ロット番号：３４１３ａ－９Ｂ８Ｆ１－ＳＱ。組換えカニクイサルＣＬＬ－１、Ａｃｒｏ、商品番号：ＣＬＡ－Ｈ５２６３、ロット番号：３７６５－２０７９Ｆ１－ＳＳ）と６つの抗体との親和性を検出して比較し、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）はＶＬ－（Ｇ４Ｓ）３－ＶＨ構造であり、Ｃ末端はヒトｈＩｇＧ１－Ｆｃを融合発現し、サンプル情報テーブルは表５に示すとおりであった。
本実施例は、表面プラズモン共鳴技術（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、ＳＰＲ）を採用して２種のＣＬＬ－１抗原（組換えヒト由来ＣＬＬ－１、Ａｃｒｏ、商品番号：ＣＬＡ－Ｈ５２４５、ロット番号：３４１３ａ－９Ｂ８Ｆ１－ＳＱ。組換えカニクイサルＣＬＬ－１、Ａｃｒｏ、商品番号：ＣＬＡ－Ｈ５２６３、ロット番号：３７６５－２０７９Ｆ１－ＳＳ）と６つの抗体との親和性を検出して比較し、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）はＶＬ－（Ｇ４Ｓ）３－ＶＨ構造であり、Ｃ末端はヒトｈＩｇＧ１－Ｆｃを融合発現し、サンプル情報テーブルは表５に示すとおりであった。
【0088】
【表5】
【0089】
（１）サンプルの配合
抗体希釈液（リガンド）：抗体を１×ＨＢＳ－ＥＰ＋ランニング緩衝液で５μｇ／ｍＬに希釈した。
組換えヒト由来ＣＬＬ－１希釈液（分析物１）：組換えヒト由来ＣＬＬ－１（２５０μｇ／ｍＬ）をランニング緩衝液で５０ｎＭに希釈し、２倍段階希釈して５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ、３．１２５ｎＭ、０ｎＭの組換えヒト由来ＣＬＬ－１希釈液を取得した。
組換えカニクイサルＣＬＬ－１希釈液（分析物２）：組換えカニクイサルＣＬＬ－１（２５０μｇ／ｍＬ）をランニング緩衝液で５０ｎＭに希釈し、２倍段階希釈して５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ、３．１２５ｎＭ、０ｎＭの組換えカニクイサルＣＬＬ－１希釈液を取得した。
抗体希釈液（リガンド）：抗体を１×ＨＢＳ－ＥＰ＋ランニング緩衝液で５μｇ／ｍＬに希釈した。
組換えヒト由来ＣＬＬ－１希釈液（分析物１）：組換えヒト由来ＣＬＬ－１（２５０μｇ／ｍＬ）をランニング緩衝液で５０ｎＭに希釈し、２倍段階希釈して５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ、３．１２５ｎＭ、０ｎＭの組換えヒト由来ＣＬＬ－１希釈液を取得した。
組換えカニクイサルＣＬＬ－１希釈液（分析物２）：組換えカニクイサルＣＬＬ－１（２５０μｇ／ｍＬ）をランニング緩衝液で５０ｎＭに希釈し、２倍段階希釈して５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ、３．１２５ｎＭ、０ｎＭの組換えカニクイサルＣＬＬ－１希釈液を取得した。
【0090】
（２）組換えヒト由来ＣＬＬ－１抗原の分析
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａチップで検出し、５μｇ／ｍＬの抗体希釈液に１０μＬ／ｍｉｎの流速で実験流路（Ｆｃ２、Ｆｃ４）を通過させ、捕捉量が約４５４ＲＵとなるように２０ｓ捕捉し、その後、流速を３０μＬ／ｍｉｎに調節し、異なる濃度の組換えヒト由来ＣＬＬ－１希釈液（０、３．１２５ｎＭ、６．２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ）を順次添加しながら、実験流路（Ｆｃ２、Ｆｃ４）およびリファレンス流路（Ｆｃ１、Ｆｃ３）の表面を通過させ、結合時間を８５ｓとし、解離時間を７０ｓとし、最後にグリシン液（Ｇｌｙｃｉｎｅ、ｐＨ＝１．５）を６０ｓ添加し、チップを再生して次のサイクルに進んだ。
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａチップで検出し、５μｇ／ｍＬの抗体希釈液に１０μＬ／ｍｉｎの流速で実験流路（Ｆｃ２、Ｆｃ４）を通過させ、捕捉量が約４５４ＲＵとなるように２０ｓ捕捉し、その後、流速を３０μＬ／ｍｉｎに調節し、異なる濃度の組換えヒト由来ＣＬＬ－１希釈液（０、３．１２５ｎＭ、６．２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ）を順次添加しながら、実験流路（Ｆｃ２、Ｆｃ４）およびリファレンス流路（Ｆｃ１、Ｆｃ３）の表面を通過させ、結合時間を８５ｓとし、解離時間を７０ｓとし、最後にグリシン液（Ｇｌｙｃｉｎｅ、ｐＨ＝１．５）を６０ｓ添加し、チップを再生して次のサイクルに進んだ。
【0091】
（３）組換えカニクイサルＣＬＬ－１抗原の分析
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａチップで検出し、５μｇ／ｍＬの抗体希釈液に１０μＬ／ｍｉｎの流速で実験流路（Ｆｃ２、Ｆｃ４）を通過させ、捕捉量が約４５４ＲＵとなるように２０
ｓ捕捉し、その後、流速を３０μＬ／ｍｉｎに調節し、異なる濃度の組換えカニクイサルＣＬＬ－１希釈液（０、３．１２５ｎＭ、６．２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ）を順次添加しながら、実験流路（Ｆｃ２、Ｆｃ４）およびリファレンス流路（Ｆｃ１、Ｆｃ３）の表面を通過させ、結合時間を８５ｓとし、解離時間を７０ｓとし、最後にグリシン液（Ｇｌｙｃｉｎｅ、ｐＨ＝１．５）を６０ｓ添加し、チップを再生して次のサイクルに進んだ。
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａチップで検出し、５μｇ／ｍＬの抗体希釈液に１０μＬ／ｍｉｎの流速で実験流路（Ｆｃ２、Ｆｃ４）を通過させ、捕捉量が約４５４ＲＵとなるように２０
ｓ捕捉し、その後、流速を３０μＬ／ｍｉｎに調節し、異なる濃度の組換えカニクイサルＣＬＬ－１希釈液（０、３．１２５ｎＭ、６．２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ）を順次添加しながら、実験流路（Ｆｃ２、Ｆｃ４）およびリファレンス流路（Ｆｃ１、Ｆｃ３）の表面を通過させ、結合時間を８５ｓとし、解離時間を７０ｓとし、最後にグリシン液（Ｇｌｙｃｉｎｅ、ｐＨ＝１．５）を６０ｓ添加し、チップを再生して次のサイクルに進んだ。
【0092】
（４）データの分析
データ分析ソフトウェアＥｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ３．１で試験結果を分析し、サンプル試験流路から収集したセンシング信号に対してリファレンス流路、サンプルブランクの二重差し引きを行い、動力学「１：１」モデルを用いてフィッティングし、各ロットのサンプルおよびｓｈＴＮＦ－αの動力学的パラメータ（ｋａ：結合速度、ｋｄ：解離速度、ｋＤ：結合解離平衡定数）を取得した。６つの抗体の、組換えヒト由来ＣＬＬ－１との結合の動力学的フィッティング結果は、表６および図６Ａに示すとおりであった。組換えカニクイサルＣＬＬ－１との結合の動力学的フィッティング結果は図６Ｂに示すとおりであった。
データ分析ソフトウェアＥｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ３．１で試験結果を分析し、サンプル試験流路から収集したセンシング信号に対してリファレンス流路、サンプルブランクの二重差し引きを行い、動力学「１：１」モデルを用いてフィッティングし、各ロットのサンプルおよびｓｈＴＮＦ－αの動力学的パラメータ（ｋａ：結合速度、ｋｄ：解離速度、ｋＤ：結合解離平衡定数）を取得した。６つの抗体の、組換えヒト由来ＣＬＬ－１との結合の動力学的フィッティング結果は、表６および図６Ａに示すとおりであった。組換えカニクイサルＣＬＬ－１との結合の動力学的フィッティング結果は図６Ｂに示すとおりであった。
【0093】
【表6】
【0094】
結果により、２３Ｄ７－ｓｃＦｖ－ｈＦｃと組換えヒト由来ＣＬＬ－１との結合親和性が低かったほか、別の５つの抗体と組換えヒト由来ＣＬＬ－１結合との親和性がいずれも１ｎＭ～６ｎＭの間にあり、６つの抗体が組換えカニクイサルＣＬＬ－１といずれも結合しなかったことを示した（図６Ｂ）。
【0095】
上記をまとめ、本願の抗ＣＬＬ１抗体２３Ｄ７、２７Ｈ４、１９Ｃ１は、ＣＬＬ１に対して著しい結合能力を有し、ヒト化改造を経た後、抗体とＣＬＬ１との親和性を更に向上させ、腫瘍の臨床診断および／または治療の面で重要な応用の見通しを有する。
【0096】
本願は、上記実施例により本願の詳細方法を説明するが、本願は上記詳細方法に限定されるものではなく、即ち、本願は上記詳細方法に依存して実施しなければならないことを意味するものではないことを、出願人より声明する。当業者であれば、本願に対するいかなる改良、本願の製品の各原料に対する等価的な置換および補助成分の追加、具体的な形態の選択等は、全て本願の保護範囲および開示範囲内に含まれることを理解すべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図6A】
【図6B】
【配列表】