特許 7384668 細胞傷害性Ｔ細胞枯渇用組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-11-13

(45)【発行日】2023-11-21

(54)【発明の名称】細胞傷害性Ｔ細胞枯渇用組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20231114BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20231114BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20231114BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20231114BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20231114BHJP

【ＦＩ】

A61K39/395 N ZNA

A61P37/02

A61P43/00 111

C07K16/28

C12N15/13

【請求項の数】 24

(21)【出願番号】P 2019547003

(86)(22)【出願日】2018-10-04

(86)【国際出願番号】 JP2018037139

(87)【国際公開番号】W WO2019070013

(87)【国際公開日】2019-04-11

【審査請求日】2021-09-24

(31)【優先権主張番号】P 2017194945

(32)【優先日】2017-10-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】307010166

【氏名又は名称】第一三共株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100146581

【弁理士】

【氏名又は名称】石橋 公樹

(74)【代理人】

【識別番号】100113583

【弁理士】

【氏名又は名称】北野 範子

(74)【代理人】

【識別番号】100161160

【弁理士】

【氏名又は名称】竹元 利泰

(74)【代理人】

【識別番号】100119622

【弁理士】

【氏名又は名称】金原 玲子

(72)【発明者】

【氏名】六笠 隆太

(72)【発明者】

【氏名】清澤 直樹

(72)【発明者】

【氏名】山田 真之亮

【審査官】山村 祥子

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１６－５１６６８１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１０－５２６０５２（ＪＰ，Ａ）

【文献】特許第６８６５７５８（ＪＰ，Ｂ２）

【文献】松崎順子, LAG-3分子の基礎と臨床応用, 最新医学, 2015, 70(3):360-365

【文献】化学と生物，1999年，Vol. 37, No. 3，177-184

【文献】Dokkyo Journal of Medical Science，2008年，35(1)，T99-T112

【文献】Proc. Natl. Acad. Sci. USA，1997年，Vol. 94，pp. 5744－5749

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

Ａ６１Ｐ

Ｃ０７Ｋ １６／００

Ｃ１２Ｎ １５／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記（ｉ）乃至（ｖｉｉ）記載の性質を有する抗ＬＡＧ－３抗体又はその結合断片を含む、細胞傷害性Ｔ細胞枯渇用組成物であって、細胞傷害性Ｔ細胞が、ＣＤ２８陰性ＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＣＤ２８陰性ＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＣＤ５７陽性ＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＣＤ５７陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞よりなる群から選択され、且つ、ＬＡＧ－３陽性である、該組成物：
（ｉ）イン・ビトロＡＤＣＣ活性を有する；
（ｉｉ）該細胞傷害性Ｔ細胞に対してｄｅｐｌｅｔｉｏｎ活性を奏する；
（ｉｉｉ）ヒト活性化Ｔ細胞に結合する；
（ｉｖ）ヒトＬＡＧ－３のドメイン３に結合する；
（ｖ）該抗体又はその結合断片存在下で、ヒトＬＡＧ－３とヒト主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ分子は結合する；
（ｖｉ）該抗体又はその結合断片存在下で、ヒトＬＡＧ－３はヒトＴ細胞抑制機能を奏する；及び
（ｖｉｉ）ヒトＬＡＧ－３に対する解離定数が１×１０ ^－９ Ｍ以下である。

【請求項2】

免疫抑制剤抵抗性の細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患の治療又は予防に使用される、請求項１記載の組成物。

【請求項3】

免疫抑制剤がステロイドである、請求項２記載の組成物。

【請求項4】

免疫抑制剤がカルシニューリン阻害剤である、請求項２記載の組成物。

【請求項5】

該抗体又はその結合断片が、キメラ抗体、ヒト化抗体若しくはヒト抗体又はその結合断片である、請求項１乃至４のいずれか一つに記載の組成物。

【請求項6】

該抗体又はその結合断片が、配列番号５０又は図６５で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５１又は図６６で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２及び配列番号５２又は図６７で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖、ならびに、配列番号４７又は図６２で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号４８又は図６３で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２及び配列番号４９又は図６４で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖、を含んでなる、請求項１乃至５のいずれか一つに記載の組成物。

【請求項7】

該抗体又はその結合断片が、ヒト化抗体又はその結合断片である、請求項６記載の組成物。

【請求項8】

該抗体又はその結合断片が、配列番号２８又は図４３で示されるアミノ酸配列において、第６８番の位置に相当するアミノ酸がＧｌｙであるか又はＡｌａに置換され、第１０３番の位置に相当するアミノ酸がＡｓｎであるか又はＡｓｐに置換されてなるアミノ酸配列を含む重鎖、並びに、配列番号３２又は図４７で示されるアミノ酸配列において、第２１番の位置に相当するアミノ酸がＡｓｐであるか又はＡｓｎに置換され、第３１番の位置に相当するアミノ酸がＬｅｕであるか又はＭｅｔに置換され、第３３番の位置に相当するアミノ酸がＡｌａであるか又はＩｌｅに置換され、第４１番の位置に相当するアミノ酸がＩｌｅであるか又はＭｅｔに置換され、第５８番の位置に相当するアミノ酸がＧｌｎであるか又はＬｙｓに置換され、第６３番の位置に相当するアミノ酸がＡｌａであるか又はＳｅｒに置換され、第８０番の位置に相当するアミノ酸がＳｅｒであるか又はＡｓｐに置換され、第８５番の位置に相当するアミノ酸がＳｅｒであるか又はＧｌｙに置換され、第８７番の位置に相当するアミノ酸がＳｅｒであるか又はＴｙｒに置換され、第９８番の位置に相当するアミノ酸がＬｅｕであるか又はＶａｌに置換され、第１０３番の位置に相当するアミノ酸がＰｈｅであるか又はＡｌａに置換され、第１０５番の位置に相当するアミノ酸がＴｈｒであるか又はＰｈｅに置換され、第１２４番の位置に相当するアミノ酸がＶａｌであるか又はＬｅｕに置換され、１２６番の位置に相当するアミノ酸がＩｌｅであるか又はＬｅｕに置換されてなるアミノ酸配列を含む軽鎖、を含んでなる、請求項７記載の組成物。

【請求項9】

下記［ｉ］乃至［ｘ］よりなる群から選択される軽鎖可変領域のアミノ酸配列及び重鎖可変領域のアミノ酸配列を含む、請求項７又は８記載の組成物：
［ｉ］軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３４（図４９）の第２１番アミノ酸乃至第１２９番アミノ酸からなり、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３０（図４５）の第２０番アミノ酸乃至第１４０番アミノ酸からなる；
［ｉｉ］軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３２（図４７）の第２１番アミノ酸乃至第１２９番アミノ酸からなり、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２８（図４３）の第２０番アミノ酸乃至第１４０番アミノ酸からなる；
［ｉｉｉ］軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３６（図５１）の第２１番アミノ酸乃至第１２９番アミノ酸をからなり、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３０（図４５）の第２０番アミノ酸乃至第１４０番アミノ酸からなる；
［ｉｖ］軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３４（図４９）の第２１番アミノ酸乃至第１２９番アミノ酸からなり、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２８（図４３）の第２０番アミノ酸乃至第１４０番アミノ酸からなる；
［ｖ］軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３６（図５１）の第２１番アミノ酸乃至第１２９番アミノ酸からなり、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２８（図４３）の第２０番アミノ酸乃至第１４０番アミノ酸からなる；
［ｖｉ］軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３８（図５３）の第２１番アミノ酸乃至第１２９番アミノ酸からなり、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２８（図４３）の第２０番アミノ酸乃至第１４０番アミノ酸からなる；
［ｖｉｉ］軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号４０（図５５）の第２１番アミノ酸乃至第１２９番アミノ酸からなり、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２８（図４３）の第２０番アミノ酸乃至第１４０番アミノ酸からなる；
［ｖｉｉｉ］軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３２（図４７）の第２１番アミノ酸乃至第１２９番アミノ酸からなり、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３０（図４５）の第２０番アミノ酸乃至第１４０番アミノ酸からなる；
［ｉｘ］軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３８（図５３）の第２１番アミノ酸乃至第１２９番アミノ酸からなり、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３０（図４５）の第２０番アミノ酸乃至第１４０番アミノ酸からなる；及び、
［ｘ］軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号４０（図５５）の第２１番アミノ酸乃至第１２９番アミノ酸からなり、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３０（図４５）の第２０番アミノ酸乃至第１４０番アミノ酸からなる。

【請求項10】

該抗体又はその結合断片の、軽鎖が配列番号３２、３４、３６、３８及び４０からなる群より選択されるアミノ酸配列の第２１番アミノ酸乃至第２３４番アミノ酸からなるアミノ酸配列を含み、重鎖が配列番号２８及び３０からなる群より選択されるアミノ酸配列の第２０番アミノ酸乃至第４７０番アミノ酸からなるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列のカルボキシル末端において１乃至数個のアミノ酸が欠失してなるアミノ酸配列を含む、請求項７又は８記載の組成物。

【請求項11】

該抗体又はその結合断片が、下記［ｉ］乃至［ｘ］よりなる群から選択されるか、又は、下記［ｉ］乃至［ｘ］よりなる群から選択される一つに記載の抗体又はその結合断片に含まれる軽鎖を含み、且つ、当該抗体又はその結合断片に含まれる重鎖のアミノ酸配列のカルボキシル末端において１乃至数個のアミノ酸が欠失してなるアミノ酸配列を有する重鎖を含む、請求項７乃至１０のいずれか一つに記載の組成物：
［ｉ］配列番号３０（図４５）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３４（図４９）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
［ｉｉ］配列番号２８（図４３）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３２（図４７）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
［ｉｉｉ］配列番号３０（図４５）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３６（図５１）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
［ｉｖ］配列番号２８（図４３）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３４（図４９）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
［ｖ］配列番号２８（図４３）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３６（図５１）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
［ｖｉ］配列番号２８（図４３）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３８（図５３）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
［ｖｉｉ］配列番号２８（図４３）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号４０（図５５）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
［ｖｉｉｉ］配列番号３０（図４５）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３２（図４７）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
［ｉｘ］配列番号３０（図４５）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３８（図５３）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；及び、
［ｘ］配列番号３０（図４５）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号４０（図５５）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片。

【請求項12】

下記（ｉ）又は（ｉｉ）記載の性質を有する抗体又はその結合断片を含んでなる、請求項１又は６記載の組成物：
（ｉ）請求項１１の［ｉ］乃至［ｘ］のいずれか一つに記載の抗体又はその結合断片が認識するヒトＬＡＧ－３のドメイン３上の部位に結合する；
（ｉｉ）請求項１１の［ｉ］乃至［ｘ］のいずれか一つに記載の抗体又はその結合断片と、ヒトＬＡＧ－３のドメイン３への結合において競合する。

【請求項13】

他の医薬と組み合わせて使用される、請求項１乃至１２のいずれか一つに記載の組成物。

【請求項14】

下記（ｉ）乃至（ｖｉｉ）記載の性質を有する抗ＬＡＧ－３抗体又はその結合断片を含む、ＣＤ２８陰性ＣＤ４陽性、ＣＤ２８陰性ＣＤ８陽性、ＣＤ５７陽性ＣＤ４陽性、及び／又は、ＣＤ５７陽性ＣＤ８陽性の細胞傷害性Ｔ細胞枯渇用組成物：
（ｉ）イン・ビトロＡＤＣＣ活性を有する；
（ｉｉ）該細胞傷害性Ｔ細胞に対してｄｅｐｌｅｔｉｏｎ活性を奏する；及び、
（ｉｉｉ）ヒト活性化Ｔ細胞に結合する；
（ｉｖ）該抗体又はその結合断片存在下で、ヒトＬＡＧ－３とヒト主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ分子は結合する；
（ｖ）該抗体又はその結合断片存在下で、ヒトＬＡＧ－３はヒトＴ細胞抑制機能を奏する；
（ｖｉ）ヒトＬＡＧ－３のドメイン３に結合する；
；及び
（ｖｉｉ）ヒトＬＡＧ－３に対する解離定数が１×１０ ^－９ Ｍ以下である。

【請求項15】

ＣＤ２８陰性ＣＤ４陽性、ＣＤ２８陰性ＣＤ８陽性、ＣＤ５７陽性ＣＤ４陽性、及び／又は、ＣＤ５７陽性ＣＤ８陽性が、細胞傷害性Ｔ細胞又はその細胞膜画分を含む生物学的サンプルについて判定されることを特徴とする、請求項１４記載の組成物。

【請求項16】

該生物学的サンプルが、細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患に罹患しているか又は罹患を回避することが望ましい個体に由来することを特徴とする、請求項１５記載の組成物。

【請求項17】

細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患が、特発性肺線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、多発性硬化症、バセドウ病、強直性脊椎炎、扁平部炎、喘息、関節リウマチ、多発性筋炎・皮膚筋炎、封入体筋炎、急性冠症候群、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、強皮症、クローン病、潰瘍性大腸炎、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、シェーグレン症候群、ヴェゲナー肉芽腫症、乾癬、２型糖尿病、宿主対移植片反応、慢性Ｂ型肝炎、及び／又は、サルコイドーシスである、請求項１６記載の組成物。

【請求項18】

細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患がＬＡＧ－３陽性である、請求項１６又は１７に記載の組成物。

【請求項19】

細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患が免疫抑制剤抵抗性である、請求項１６乃至１８のいずれか一つに記載の組成物。

【請求項20】

免疫抑制剤がステロイドである、請求項１９記載の組成物。

【請求項21】

免疫抑制剤がカルシニューリン阻害剤である、請求項１９記載の組成物。

【請求項22】

該抗体又はその結合断片が、キメラ抗体、ヒト化抗体若しくはヒト抗体又はその結合断片である、請求項１４乃至２１のいずれか一つに記載の組成物。

【請求項23】

該抗体又はその結合断片が、低フコース形態にある、請求項１４乃至２２のいずれか一つに記載の組成物。

【請求項24】

イン・ビボでＬＡＧ－３陽性細胞数を低減させる、請求項２３記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗体、その結合断片等を含む細胞傷害性Ｔ細胞枯渇用組成物、細胞傷害性Ｔ細胞枯渇のための抗体、その結合断片等の使用、抗体、その結合断片等を投与する工程を含む傷害性細胞Ｔ細胞の枯渇方法等に関する。

【背景技術】

【0002】

Ｔリンパ球（Ｔ細胞）は、免疫応答において中心的な役割を果たしている細胞であり、多様な抗原に対処するため、生体内には１０００万ないし１０億クローンともいわれる種々の抗原特異性を持ったＴ細胞が存在している。体内に抗原が侵入すると、そのような膨大なＴ細胞のレパートリーのうちのごく限られた抗原特異的なクローンのみが増殖・活性化し、サイトカイン産生や細胞傷害活性などを介して生体防御に働く。自己免疫疾患においては、何らかの自己の抗原に対する異常な免疫応答が引き金となって、種々の病態が形成されると考えられている。このような状況においても、抗原特異性を有さない大部分の他のクローンは、増殖・活性化されず休止状態にある。そのため、活性化Ｔ細胞のみを選択的に除去することができれば、他の抗原特異性を有する大部分のＴ細胞に影響を与えることなく、特異的に免疫を抑制することが可能になり、自己免疫疾患、移植物の拒絶、アレルギー性疾患等に対する有用な治療法あるいは予防法となりうる。一方、制御性Ｔ細胞など免疫系を負に制御するＴ細胞が主に活性化している状況では、これを除去することで、悪性腫瘍、慢性感染症等に対する有用な治療法あるいは予防法となりうる。

【0003】

ＬＡＧ－３（ＣＤ２２３）は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する１回膜貫通型の分子であり、活性化Ｔ細胞にほぼ選択的に発現することが知られている分子である(非特許文献１)。ラット同種異系心臓移植モデルに、ラットＬＡＧ－３分子に対する補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有するウサギ抗血清を投与すると、移植片中のＬＡＧ－３陽性細胞が減少し、移植片が拒絶されるまでの期間が若干延長することが報告されている(非特許文献２)。また、ヒヒに交差性を有し、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を示す抗ヒトＬＡＧ－３キメラ抗体Ａ９Ｈ１２が、その用量反応性は不明確ながら、ヒヒの遅延型過敏反応を抑制すること（非特許文献３）、そのヒト化体が作製されたこと（特許文献２）も報告されている。

【0004】

ＬＡＧ－３は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子に結合することで、Ｔ細胞に何らかの抑制性のシグナルを伝達し、Ｔ細胞の機能を負に制御することが知られている(非特許文献１)。ＬＡＧ－３とＭＨＣクラスＩＩ分子の結合には、ＬＡＧ－３の細胞外の４つの免疫グロブリン様ドメインのうち、Ｎ末端のドメイン１および２が重要であると考えられており(非特許文献４)、またこのＬＡＧ－３を介したＴ細胞機能の抑制は、ＰＤ－１分子などを介した他のＴ細胞機能を抑制するシグナルと協同的に発揮されることも報告されている(非特許文献５)。実際、ＬＡＧ－３のＴ細胞抑制機能を阻害することによって免疫細胞の働きを活発にし、がん細胞を攻撃する新たながん治療法の開発が近年盛んに行われている(非特許文献６および７)。そのため、ＡＤＣＣ活性などによりＬＡＧ－３陽性細胞を除去するＬＡＧ－３抗体、言い換えれば、ＬＡＧ－３陽性細胞を枯渇（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）させるＬＡＧ－３抗体を自己免疫疾患に適用する場合、ＬＡＧ－３本来のＴ細胞抑制機能を阻害する活性を有さない抗体である方が、免疫系が異常に活性化されて自己免疫疾患がかえって悪化してしまうリスクがなく、より望ましいと考えられる。上述のＣＤＣ活性を有する抗ラットＬＡＧ－３ウサギ抗血清およびＡＤＣＣ活性を示す抗ヒトＬＡＧ－３キメラ抗体Ａ９Ｈ１２（ＩＭＰ７３１：特許文献１及び２）はいずれも、ＬＡＧ－３陽性細胞の除去は完全ではなく(非特許文献２および３)、除去され残ったＴ細胞の異常な反応による副反応の可能性及び自己免疫疾患の抑制に対する負の影響が想定される。

【0005】

Ｔ細胞サブセットのうち、ＣＤ４＋（陽性）ＣＤ２８－（陰性）Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ２８－Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ５７＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ５７＋Ｔ細胞はパーフォリン、グランザイムＢなどを高発現する細胞傷害性のＴ細胞群である（非特許文献１２、非特許文献１３）。ステロイド薬剤は免疫系疾患の治療に広く用いられているが、喘息や慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）のような免疫系疾患ではステロイド難治性の患者集団が存在する（非特許文献１４）。近年、ある種の自己免疫疾患においては、前述のような細胞傷害性Ｔ細胞が病態に関与する主な炎症系細胞のひとつとして報告されている（非特許文献１２, 非特許文献１５）。細胞傷害性Ｔ細胞は高い細胞傷害作用を有する一方、ステロイド処置による抗炎症作用あるいはアポトーシス誘導への耐性が報告されている（非特許文献１６）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【文献】米国特許出願公開２０１１／００７０２３８Ａ１号

【文献】国際公開２０１４／１４０１８０号

【非特許文献】

【0007】

【文献】トリーベル、エフ（Ｔｒｉｅｂｅｌ，Ｆ．）、ラグ３：・レビュレーター・オブーティー・セル・アンド・ディーシー・レスポンシズ・アンド・イッツ・ユース・イン・セラピューティック・ヴァクシネーション（ＬＡＧ－３： ａ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ Ｔ－ｃｅｌｌ ａｎｄ ＤＣ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｕｓｅ ｉｎ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．）、トレンズ・イン・イムノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、２００３年１２月刊；２４巻（１２号）：６１９－２２ページ

【文献】ハウデブルグ，ティー他（Ｈａｕｄｅｂｏｕｒｇ，Ｔ． ｅｔ ａｌ．）、ディプリーション・オブ・ラグ３・ポジティブ・セルズ・イン・カーディアック・アログラフト・リヴィール・ゼア・ロール・イン・リジェクション・アンド・トレランス（Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ＬＡＧ－３ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃａｒｄｉａｃ ａｌｌｏｇｒａｆｔ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈｅｉｒ ｒｏｌｅ ｉｎ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ．）、トランスプランテーション（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）、２００７年１２月刊；８４巻（１１号）：１５００－０６ページ

【文献】ハウデブルグ，ティー他（Ｈａｕｄｅｂｏｕｒｇ，Ｔ． ｅｔ ａｌ．）、アンチボディー－メディエイテッド・ディプリーション・オブ・リンフォサイト－アクティベーション・ジーン－３（ラグ３（＋））－アクティベーテッド・Ｔ・リンフォサイツ・プリベンツ・ディレイータイプ・ハイパーセンシティティヴィティ・イン・ノン・ヒューマン・プライメイティーズ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ－ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｇｅｎｅ－３ （ＬＡＧ－３（＋） ）－ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｄｅｌａｙｅｄ－ｔｙｐｅ ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ）、クリニカル・エクスペリメンタル・イムノロジー（Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）２０１１年５月刊；１６４巻（２号）：２６５－７４ページ

【文献】ヒュアード，ビー他（Ｈｕａｒｄ， Ｂ． ｅｔ ａｌ．）、キャラクタリゼーション・オブ・ザ・メイジャー・ヒストコンパティビリティー・コンプレックス・クラス・ツー・バインディング・サイト・オン・ラグ３・プロテイン（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｌａｓｓ ＩＩ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｏｎ ＬＡＧ－３ ｐｒｏｔｅｉｎ）、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー・エス・エー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）、１９９７年５月２７日刊；９４巻（１１号）：５７４４－４９ページ

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【文献】メソン－レメトレ，エル（Ｍａｃｏｎ－Ｌｅｍａｉｔｒｅ，Ｌ）及びトリーベル，エフ（Ｔｒｉｅｂｅｌ，Ｆ）、ザ・ネガティブ・レギュラトリー・ファンクション・オブ・ザ・リンフォサイト－アクティベーション３・ジーン・コーレセプター（シーディー３３４）オン・ヒューマン・ティー・セルズ（Ｔｈｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ－ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｇｅｎｅ－３ ｃｏ－ｒｅｃｅｐｔｏｒ （ＣＤ２２３） ｏｎ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ）、イミュノロジー（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、２００５年６月刊；１１５巻（２号）：１７０－０８ページ

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【文献】ミラー，スティーブン・ディー他（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｄ．ｅｔ ａｌ．）、エクスペリメンタル・オートイミューン・エンセファロミエリティス・イン・ザ・マウス（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ）、カレント・プロトコールズ・イン・イミュノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、チャプター１５（ＵＮＩＴ １５．１）、ワイリー（Ｗｉｌｅｙ）、２０１０年刊：１５．１．１－１５．１．２０ページ

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【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

細胞傷害性Ｔ細胞を枯渇させるための組成物等を提供すること。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明は、
（１）
下記（ｉ）乃至（ｉｉｉ）記載の性質を有する抗ＬＡＧ－３抗体又はその結合断片を含む、細胞傷害性Ｔ細胞枯渇用組成物：
（ｉ）イン・ビトロＡＤＣＣ活性を有する；
（ｉｉ）低フコース形態で、イン・ビボでＬＡＧ－３陽性細胞数を低減させる；及び、
（ｉｉｉ）ヒト活性化Ｔ細胞に結合する、
（２）
細胞傷害性Ｔ細胞が、パーフォリン陽性Ｔ細胞、グランザイムＢ陽性Ｔ細胞、ＣＤ２８陰性ＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＣＤ２８陰性ＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＣＤ５７陽性ＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＣＤ５７陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞よりなる群から選択される、（１）記載の組成物、
（３）
細胞傷害性Ｔ細胞がＬＡＧ－３陽性である、（１）又は（２）に記載の組成物、
（４）
抗ＬＡＧ－３抗体又はその結合断片が、ヒトＬＡＧ－３のドメイン３に結合し、下記（ｉ）乃至（ｉｉｉ）記載の性質を有する、（１）乃至（３）のいずれか一つに記載の組成物：
（ｉ）低フコース形態で、イン・ビボで実験的自己免疫性脳脊髄炎を抑制する；
（ｉｉ）該抗体又はその結合断片存在下で、ヒトＬＡＧ－３とヒト主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ分子は結合する；及び
（ｉｉｉ）該抗体又はその結合断片存在下で、ヒトＬＡＧ－３はヒトＴ細胞抑制機能を奏する、
（５）
免疫抑制剤抵抗性の細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患の治療又は予防に使用される、（１）乃至（４）のいずれか一つに記載の組成物、
（６）
免疫抑制剤がステロイドである、（５）記載の組成物、
（７）
免疫抑制剤がカルシニューリン阻害剤である、（５）又は（６）記載の組成物、
（８）
該抗体又はその結合断片が、キメラ抗体、ヒト化抗体若しくはヒト抗体又はその結合断片である、（１）乃至（７）のいずれか一つに記載の組成物、
（９）
該抗体又はその結合断片が、配列番号５０又は図６５で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５１又は図６６で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２及び配列番号５２又は図６７で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖、ならびに、配列番号４７又は図６２で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号４８又は図６３で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２及び配列番号４９又は図６４で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖、を含んでなる、（４）記載の組成物、
（１０）
該抗体又はその結合断片が、ヒト化抗体又はその結合断片である、（９）記載の組成物、
（１１）
該抗体又はその結合断片が、配列番号２８又は図４３で示されるアミノ酸配列において、第６８番の位置に相当するアミノ酸がＧｌｙであるか又はＡｌａに置換され、第１０３番の位置に相当するアミノ酸がＡｓｎであるか又はＡｓｐに置換されてなるアミノ酸配列を含む重鎖、並びに、配列番号３２又は図４７で示されるアミノ酸配列において、第２１番の位置に相当するアミノ酸がＡｓｐであるか又はＡｓｎに置換され、第３１番の位置に相当するアミノ酸がＬｅｕであるか又はＭｅｔに置換され、第３３番の位置に相当するアミノ酸がＡｌａであるか又はＩｌｅに置換され、第４１番の位置に相当するアミノ酸がＩｌｅであるか又はＭｅｔに置換され、第５８番の位置に相当するアミノ酸がＧｌｎであるか又はＬｙｓに置換され、第６３番の位置に相当するアミノ酸がＡｌａであるか又はＳｅｒに置換され、第８０番の位置に相当するアミノ酸がＳｅｒであるか又はＡｓｐに置換され、第８５番の位置に相当するアミノ酸がＳｅｒであるか又はＧｌｙに置換され、第８７番の位置に相当するアミノ酸がＳｅｒであるか又はＴｙｒに置換され、第９８番の位置に相当するアミノ酸がＬｅｕであるか又はＶａｌに置換され、第１０３番の位置に相当するアミノ酸がＰｈｅであるか又はＡｌａに置換され、第１０５番の位置に相当するアミノ酸がＴｈｒであるか又はＰｈｅに置換され、第１２４番の位置に相当するアミノ酸がＶａｌであるか又はＬｅｕに置換され、１２６番の位置に相当するアミノ酸がＩｌｅであるか又はＬｅｕに置換されてなるアミノ酸配列を含む軽鎖、を含んでなる、（１０）記載の組成物、
（１２）
該抗体又はその結合断片の、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３２、３４、３６、３８及び４０からからなる群より選択されるアミノ酸配列の第２１番アミノ酸乃至第１２９番アミノ酸を含み、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２８及び３０からなる群より選択されるアミノ酸配列の第２０番アミノ酸乃至第１４０番アミノ酸を含む、（１０）又は（１１）記載の組成物、
（１３）
該抗体又はその結合断片の、軽鎖のアミノ酸配列が配列番号３２、３４、３６、３８及び４０からからなる群より選択されるアミノ酸配列の第２１番アミノ酸乃至第２３４番アミノ酸を含み、重鎖のアミノ酸配列が配列番号２８及び３０からなる群より選択されるアミノ酸配列の第２０番アミノ酸乃至第４７０番アミノ酸を含む、（１０）乃至（１２）のいずれか一つに記載の組成物、
（１４）
該抗体又はその結合断片が、下記［ｉ］乃至［ｘ］よりなる群から選択される、（１０）乃至（１３）のいずれか一つに記載の組成物：
［ｉ］配列番号３０（図４５）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３４（図４９）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
［ｉｉ］配列番号２８（図４３）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３２（図４７）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
［ｉｉｉ］配列番号３０（図４５）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３６（図５１）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
［ｉｖ］配列番号２８（図４３）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３４（図４９）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
［ｖ］配列番号２８（図４３）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３６（図５１）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
［ｖｉ］配列番号２８（図４３）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３８（図５３）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
［ｖｉｉ］配列番号２８（図４３）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号４０（図５５）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
［ｖｉｉｉ］配列番号３０（図４５）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３２（図４７）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
［ｉｘ］配列番号３０（図４５）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３８（図５３）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；及び、
［ｘ］配列番号３０（図４５）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号４０（図５５）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片、
（１５）
該抗体又はその結合断片の有する軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のアミノ酸配列と、それぞれ９５％以上同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と重鎖可変領域を有する抗体又はその結合断片を含んでなる、（１４）記載の組成物、
（１６）
該抗体又はその結合断片の有する軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列又はそれに相補的なヌクレオチド配列を有する第１の核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする第２の核酸分子が含むヌクレオチド配列によりコードされる軽鎖可変領域アミノ酸配列、および、該抗体又はその結合断片の有する重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列又はそれに相補的なヌクレオチド配列を有する第３の核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする第４の核酸分子が含むヌクレオチド配列によりコードされる重鎖可変領域アミノ酸配列、を含む抗体又はその結合断片を含んでなる、（１４）記載の組成物、
（１７）
下記（ｉ）又は（ｉｉ）記載の性質を有する抗体又はその結合断片を含んでなる、（１４）記載の組成物：
（ｉ）該抗体又はその結合断片が認識するヒトＬＡＧ－３のドメイン３上の部位に結合する；
（ｉｉ）該抗体又はその結合断片と、ヒトＬＡＧ－３のドメイン３への結合において競合する、
（１８）
該抗体又はその結合断片が、低フコース形態にある、（１）乃至（１７）のいずれか一つに記載の組成物、
（１９）
該抗体又はその結合断片が、そのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子若しくは該核酸分子を含むベクターを含む細胞、又は、該抗体又はその結合断片を生産する細胞を培養する工程を含んでなる、該抗体又はその結合断片の製造方法により得られる、（１）乃至（１８）のいずれか一つに記載の組成物、
（２０）
該抗体又はその結合断片存在下で、ヒトＬＡＧ－３はヒトＴ細胞抑制機能を奏しない、（１）乃至（３）のいずれか一つに記載の組成物、
（２１）
該抗体又はその結合断片存在下で、ヒトＬＡＧ－３とヒト主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ分子は結合しない、（１）乃至（３）及び（２０）のいずれか一つに記載の組成物、
（２２）
該抗体又はその結合断片が、低フコース形態にある、（２０）又は（２１）に記載の組成物、
（２３）
細胞傷害性Ｔ細胞枯渇に使用される、下記（ｉ）乃至（ｉｉｉ）記載の性質を有する抗ＬＡＧ－３抗体又はその結合断片：
（ｉ）イン・ビトロＡＤＣＣ活性を有する；
（ｉｉ）低フコース形態で、イン・ビボでＬＡＧ－３陽性細胞数を低減させる；及び、
（ｉｉｉ）ヒト活性化Ｔ細胞に結合する、
（２４）
細胞傷害性Ｔ細胞枯渇のための、下記（ｉ）乃至（ｉｉｉ）記載の性質を有する抗ＬＡＧ－３抗体又はその結合断片の使用：
（ｉ）イン・ビトロＡＤＣＣ活性を有する；
（ｉｉ）低フコース形態で、イン・ビボでＬＡＧ－３陽性細胞数を低減させる；及び、
（ｉｉｉ）ヒト活性化Ｔ細胞に結合する、
（２５）
下記（ｉ）乃至（ｉｉｉ）記載の性質を有する抗ＬＡＧ－３抗体又はその結合断片を投与することを含む、細胞傷害性Ｔ細胞を枯渇させる方法：
（ｉ）イン・ビトロＡＤＣＣ活性を有する；
（ｉｉ）低フコース形態で、イン・ビボでＬＡＧ－３陽性細胞数を低減させる；及び、
（ｉｉｉ）ヒト活性化Ｔ細胞に結合する、
（２６）
他の医薬と組み合わせて使用される、（１）乃至（２２）のいずれか一つに記載の組成物、
（２７）
下記（ｉ）乃至（ｉｉｉ）記載の性質を有する抗ＬＡＧ－３抗体又はその結合断片を含む、 パーフォリン陽性、グランザイムＢ陽性、ＣＤ２８陰性ＣＤ４陽性、ＣＤ２８陰性ＣＤ８陽性、ＣＤ５７陽性ＣＤ４陽性、及び／又は、ＣＤ５７陽性ＣＤ８陽性の細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患の治療用又は予防用医薬組成物：
（ｉ）イン・ビトロＡＤＣＣ活性を有する；
（ｉｉ）低フコース形態で、イン・ビボでＬＡＧ－３陽性細胞数を低減させる；及び、
（ｉｉｉ）ヒト活性化Ｔ細胞に結合する、
（２８）
パーフォリン陽性、グランザイムＢ陽性、ＣＤ２８陰性ＣＤ４陽性、ＣＤ２８陰性ＣＤ８陽性、ＣＤ５７陽性ＣＤ４陽性、及び／又は、ＣＤ５７陽性ＣＤ８陽性が、細胞傷害性Ｔ細胞又はその細胞膜画分を含む生物学的サンプルについて判定されることを特徴とする、（２７）記載の医薬組成物、
（２９）
該生物学的サンプルが、細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患に罹患しているか又は罹患を回避することが望ましい個体に由来することを特徴とする、（２８）記載の医薬組成物、
（３０）
細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患が、特発性肺線維症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、多発性硬化症、バセドウ病、強直性脊椎炎、扁平部炎、喘息、関節リウマチ、多発性筋炎・皮膚筋炎、封入体筋炎、急性冠症候群、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、強皮症、クローン病、潰瘍性大腸炎、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、シェーグレン症候群、ヴェゲナー肉芽腫症、乾癬、２型糖尿病、宿主対移植片反応、慢性Ｂ型肝炎、及び／又は、サルコイドーシスである、（２７）乃至（２９）のいずれか一つに記載の医薬組成物、
（３１）
細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患がＬＡＧ－３陽性である、（２７）乃至（３０）のいずれか一つに記載の医薬組成物、
（３２）
抗ＬＡＧ－３抗体又はその結合断片が、ヒトＬＡＧ－３のドメイン３に結合し、下記（ｉ）乃至（ｉｉｉ）記載の性質を有する、（２７）乃至（３１）のいずれか一つに記載の医薬組成物：
（ｉ）低フコース形態で、イン・ビボで実験的自己免疫性脳脊髄炎を抑制する；
（ｉｉ）該抗体又はその結合断片存在下で、ヒトＬＡＧ－３とヒト主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ分子は結合する；及び
（ｉｉｉ）該抗体又はその結合断片存在下で、ヒトＬＡＧ－３はヒトＴ細胞抑制機能を奏する、
（３３）
細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患が免疫抑制剤抵抗性である、（２７）乃至（３２）のいずれか一つに記載の医薬組成物、
（３４）
免疫抑制剤がステロイドである、（３３）記載の医薬組成物、
（３５）
免疫抑制剤がカルシニューリン阻害剤である、（３３）又は（３４）記載の医薬組成物、
（３６）
該抗体又はその結合断片が、キメラ抗体、ヒト化抗体若しくはヒト抗体又はその結合断片である、（２７）乃至（３５）のいずれか一つに記載の医薬組成物、
（３７）
該抗体又はその結合断片が、配列番号５０で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号５１で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２及び配列番号５２で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む軽鎖、ならびに、配列番号４７で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号４８で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２及び配列番号４９で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む重鎖、を含んでなる、（２７）乃至（３６）のいずれか一つに記載の医薬組成物、
（３８）
該抗体又はその結合断片が、ヒト化抗体又はその結合断片である、（３７）記載の医薬組成物、
（３９）
該抗体又はその結合断片が、配列番号２８で示されるアミノ酸配列において、第６８番の位置に相当するアミノ酸がＧｌｙであるか又はＡｌａに置換され、第１０３番の位置に相当するアミノ酸がＡｓｎであるか又はＡｓｐに置換されてなるアミノ酸配列を含む重鎖、並びに、配列番号３２で示されるアミノ酸配列において、第２１番の位置に相当するアミノ酸がＡｓｐであるか又はＡｓｎに置換され、第３１番の位置に相当するアミノ酸がＬｅｕであるか又はＭｅｔに置換され、第３３番の位置に相当するアミノ酸がＡｌａであるか又はＩｌｅに置換され、第４１番の位置に相当するアミノ酸がＩｌｅであるか又はＭｅｔに置換され、第５８番の位置に相当するアミノ酸がＧｌｎであるか又はＬｙｓに置換され、第６３番の位置に相当するアミノ酸がＡｌａであるか又はＳｅｒに置換され、第８０番の位置に相当するアミノ酸がＳｅｒであるか又はＡｓｐに置換され、第８５番の位置に相当するアミノ酸がＳｅｒであるか又はＧｌｙに置換され、第８７番の位置に相当するアミノ酸がＳｅｒであるか又はＴｙｒに置換され、第９８番の位置に相当するアミノ酸がＬｅｕであるか又はＶａｌに置換され、第１０３番の位置に相当するアミノ酸がＰｈｅであるか又はＡｌａに置換され、第１０５番の位置に相当するアミノ酸がＴｈｒであるか又はＰｈｅに置換され、第１２４番の位置に相当するアミノ酸がＶａｌであるか又はＬｅｕに置換され、１２６番の位置に相当するアミノ酸がＩｌｅであるか又はＬｅｕに置換されてなるアミノ酸配列を含む軽鎖、を含んでなる、（３８）記載の医薬組成物、
（４０）
該抗体又はその結合断片の、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３２、３４、３６、３８及び４０からからなる群より選択されるアミノ酸配列の第２１番アミノ酸乃至第１２９番アミノ酸を含み、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２８及び３０からなる群より選択されるアミノ酸配列の第２０番アミノ酸乃至第１４０番アミノ酸を含む、（３８）又は（３９）記載の医薬組成物、
（４１）
該抗体又はその結合断片の、軽鎖のアミノ酸配列が配列番号３２、３４、３６、３８及び４０からからなる群より選択されるアミノ酸配列の第２１番アミノ酸乃至第２３４番アミノ酸を含み、重鎖のアミノ酸配列が配列番号２８及び３０からなる群より選択されるアミノ酸配列の第２０番アミノ酸乃至第４７０番アミノ酸を含む、（３８）乃至（４０）のいずれか一つに記載の医薬組成物、
（４２）
該抗体又はその結合断片が、下記［ｉ］乃至［ｘ］よりなる群から選択される、（３８）乃至（４１）のいずれか一つに記載の医薬組成物：
［ｉ］配列番号３０（図４５）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３４（図４９）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
［ｉｉ］配列番号２８（図４３）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３２（図４７）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
［ｉｉｉ］配列番号３０（図４５）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３６（図５１）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
［ｉｖ］配列番号２８（図４３）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３４（図４９）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
［ｖ］配列番号２８（図４３）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３６（図５１）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
［ｖｉ］配列番号２８（図４３）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３８（図５３）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
［ｖｉｉ］配列番号２８（図４３）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号４０（図５５）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
［ｖｉｉｉ］配列番号３０（図４５）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３２（図４７）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；
［ｉｘ］配列番号３０（図４５）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号３８（図５３）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片；及び、
［ｘ］配列番号３０（図４５）のアミノ酸番号２０乃至４７０からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号４０（図５５）のアミノ酸番号２１乃至２３４からなるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体又はその結合断片、
（４３）
該抗体又はその結合断片の有する軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のアミノ酸配列と、それぞれ９５％以上同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と重鎖可変領域を有する抗体又はその結合断片を含んでなる、（４２）記載の医薬組成物、
（４４）
該抗体又はその結合断片の有する軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列又はそれに相補的なヌクレオチド配列を有する第１の核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする第２の核酸分子が含むヌクレオチド配列によりコードされる軽鎖可変領域アミノ酸配列、および、該抗体又はその結合断片の有する重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列又はそれに相補的なヌクレオチド配列を有する第３の核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする第４の核酸分子が含むヌクレオチド配列によりコードされる重鎖可変領域アミノ酸配列、を含む抗体又はその結合断片を含んでなる、（４２）記載の医薬組成物、
（４５）
下記（ｉ）又は（ｉｉ）記載の性質を有する抗体又はその結合断片を含んでなる、（４２）記載の医薬組成物：
（ｉ）該抗体又はその結合断片が認識するヒトＬＡＧ－３のドメイン３上の部位に結合する；
（ｉｉ）該抗体又はその結合断片と、ヒトＬＡＧ－３のドメイン３への結合において競合する、
（４６）
該抗体又はその結合断片が、低フコース形態にある、（２７）乃至（４５）のいずれか一つに記載の医薬組成物、
（４７）
該抗体又はその結合断片が、そのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子若しくは該核酸分子を含むベクターを含む細胞、又は、該抗体又はその結合断片を生産する細胞を培養する工程を含んでなる、該抗体又はその結合断片の製造方法により得られる、（２７）乃至（４６）のいずれか一つに記載の医薬組成物。
（４８）
該抗体又はその結合断片存在下で、ヒトＬＡＧ－３はヒトＴ細胞抑制機能を奏しない、（２７）乃至（３１）のいずれか一つに記載の医薬組成物、
（４９）
該抗体又はその結合断片存在下で、ヒトＬＡＧ－３とヒト主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ分子は結合しない、（２７）乃至（３１）及び（４８）のいずれか一つに記載の医薬組成物、
（５０）
該抗体又はその結合断片が、低フコース形態にある、（４８）又は（４９）に記載の医薬組成物、
（５１）
他の医薬と組み合わせて使用される、（２７）乃至（５０）のいずれか一つに記載の医薬組成物、
（５２）
パーフォリン陽性、グランザイムＢ陽性、ＣＤ２８陰性ＣＤ４陽性、ＣＤ２８陰性ＣＤ８陽性、ＣＤ５７陽性ＣＤ４陽性、及び／又は、ＣＤ５７陽性ＣＤ８陽性の細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患に罹患しているか又は罹患を回避することが望ましい個体に（１）乃至（２２）のいずれか一つに記載の組成物、又は（２７）乃至（５１）のいずれか一つに記載の医薬組成物を投与する工程を含む、細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患を治療又は予防する方法、
（５３）
細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患が、免疫抑制剤抵抗性である、（５２）記載の方法、
（５４）
免疫抑制剤がステロイドである、（５３）記載の方法、
（５５）
免疫抑制剤がカルシニューリン阻害剤である、（５３）又は（５４）記載の方法、
（５６）
細胞傷害性Ｔ細胞又はその細胞膜画分を含む生物学的サンプルについて、パーフォリン陽性、グランザイムＢ陽性、ＣＤ２８陰性ＣＤ４陽性、ＣＤ２８陰性ＣＤ８陽性、ＣＤ５７陽性ＣＤ４陽性、及び／又は、ＣＤ５７陽性ＣＤ８陽性か否かを判定する工程を含む、（５２）乃至（５５）のいずれか一つに記載の方法、
（５７）
該生物学的サンプルが、細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患に罹患しているか又は罹患を回避することが望ましい個体に由来する、（５６）記載の方法、
等に関する。

【発明の効果】

【0010】

本発明の提供する組成物は、細胞傷害性Ｔ細胞を枯渇させるので、細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患（後述）の治療及び／又は予防に使用され得る。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】ラット抗ＬＡＧ－３抗体（ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９およびｒＬＡ１２６４）のＬＡＧ－３を発現するヒトＰＨＡ ｂｌａｓｔに対する結合活性をフローサイトメトリー法により検証した図。縦軸はフローサイトメトリー法により測定された平均蛍光強度を示す。

【図2】ラット抗ＬＡＧ－３抗体（ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９およびｒＬＡ１２６４）のＡＤＣＣ活性を示した図。ヒトＬＡＧ－３発現２９３Ｔ-ｌａｃＺ細胞を標的細胞、ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として用いた。

【図3】図３Ａは、ラット抗ＬＡＧ－３抗体（ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９およびｒＬＡ１２６４）のＬＡＧ－３／ＭＨＣクラスＩＩ結合試験における阻害活性を示した図。Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌとしてはラットＩｇＧ２ｂを、Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌとしては別途作製したＬＡＧ－３のドメイン１を認識するラット抗ＬＡＧ－３抗体をそれぞれ用いた。抗体はいずれも１０μｇ／ｍＬで評価した。図３Ｂは、公知の抗体であるヒトキメラ化抗ＬＡＧ－３抗体ＩＭＰ７３１がＬＡＧ－３／ＭＨＣクラスＩＩ結合試験において阻害活性を示すことを表した図。市販のマウス抗ヒトＬＡＧ－３抗体である１７Ｂ４も、阻害活性を示した。

【図4】ラット抗ＬＡＧ－３抗体（ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９およびｒＬＡ１２６４）の２９３Ｔ－ｈＬＡＧ－３／Ｒａｊｉ細胞接着試験における阻害活性を示した図。Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌとしてはラットＩｇＧ２ｂを、Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌとしては実施例２）－６で作製したＬＡＧ－３のドメイン１を認識するラット抗ＬＡＧ－３抗体（クローン６Ｄ７）をそれぞれ用いた。抗体はいずれも１０μｇ／ｍＬで評価した。

【図5】図５Ａは、ラット抗ＬＡＧ－３抗体（ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２およびｒＬＡ２２５）のヒトＬＡＧ－３結合エピトープをフローサイトメトリー法により検証した図。縦軸はフローサイトメトリー法により測定された平均蛍光強度を示す。Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌとして用いた抗ＦＬＡＧ抗体の結合もあわせて示す。抗体はいずれも１０μｇ／ｍＬで評価した。 図５Ｂは、先行技術の抗体であるヒトキメラ化抗ＬＡＧ－３抗体ＩＭＰ７３１のヒトＬＡＧ－３結合エピトープをフローサイトメトリー法により検証した図。縦軸はフローサイトメトリー法により測定された平均蛍光強度を示す。Ａｎｔｉｓｅｒｕｍは、実施例１）－１の免疫したラットから得た抗血清を５００倍希釈で使用した。他の抗体はいずれも１０μｇ／ｍＬで評価した。６Ｄ７は、実施例２）－６で作製したＬＡＧ－３のドメイン１を認識するラット抗ＬＡＧ－３抗体である。

【図6】ヒトキメラ化抗ＬＡＧ－３抗体ｃＬＡ２１２のヒトＬＡＧ－３発現２９３Ｔ-ｌａｃＺ細胞に対する結合活性をフローサイトメトリー法により検証した図。縦軸はフローサイトメトリー法により測定された平均蛍光強度を示す。

【図7】ヒト化抗ＬＡＧ－３抗体の結合能を解離定数として示す図。

【図8】１０種類のヒト化抗ＬＡＧ－３抗体およびヒトキメラ化抗ＬＡＧ－３抗体ｃＬＡ２１２のヒトＬＡＧ－３発現２９３Ｔ-ｌａｃＺ細胞に対する結合活性をフローサイトメトリー法により検証した図。縦軸はフローサイトメトリー法により測定された平均蛍光強度を示す。

【図9】１０種類のヒト化抗ＬＡＧ－３抗体およびヒトキメラ化抗ＬＡＧ－３抗体ｃＬＡ２１２のＡＤＣＣ活性を示した図。ヒトＬＡＧ－３発現２９３Ｔ-ｌａｃＺ細胞を標的細胞、ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として用いた。

【図10】ヒト化抗ＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ２およびヒトキメラ化抗ＬＡＧ－３抗体ＩＭＰ７３１のＬＡＧ－３のＴ細胞抑制機能に対する影響を検討した図。各々の抗体存在下でヒトＰＢＭＣをＳＥＢで４日間刺激した際の培養上清へのＩＬ－２産生を測定した。抗体はいずれも１０μｇ／ｍＬで評価した。

【図11】ヒト化抗ＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２のヒトＬＡＧ－３発現２９３Ｔ-ｌａｃＺ細胞に対する結合活性をフローサイトメトリー法により検証した図。縦軸はフローサイトメトリー法により測定された平均蛍光強度を示す。

【図12】ヒト化抗ＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２のＡＤＣＣ活性を示した図。ヒトＬＡＧ－３発現２９３Ｔ-ｌａｃＺ細胞を標的細胞、ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として用いた。

【図13】ヒトＬＡＧ－３／ヒトＦｃγＲＩＩＩＡダブルトランスジェニックマウスにおけるヒトＬＡＧ－３の発現が、マウスＬＡＧ－３の発現と一致していることを示す図。ヒトＬＡＧ－３／ヒトＦｃγＲＩＩＩＡダブルトランスジェニックマウス（Ｔｇ）およびコントロールの野生型マウス（Ｎｏｎ－Ｔｇ）の末梢血から得た白血球をＣｏｎ Ａで刺激して得た活性化Ｔ細胞におけるヒトおよびマウスＬＡＧ－３の発現をフローサイトメトリー法（多重染色）により検討した。解析のためにＣＤ３陽性Ｔ細胞にゲートをかけた結果を示す。なおグラフの４分割は、ヒトおよびマウスＬＡＧ－３に対する染色抗体を含まないサンプルを用いて設定した。

【図14】ヒト化抗ＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２のｉｎ ｖｉｖｏにおけるＬＡＧ－３発現細胞に対するｄｅｐｌｅｔｉｏｎ活性を示した図。縦軸は、ヒトＬＡＧ－３／ヒトＦｃγＲＩＩＩＡダブルトランスジェニックマウスに抗体およびＣｏｎ Ａを投与した２日後の末梢血のＴ細胞におけるヒトＬＡＧ－３陽性率を表す。抗体は３０ｍｇ／ｋｇの用量で、Ｃｏｎ Ａ投与の直前に腹腔内投与した。

【図15】ヒト化抗ＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２がｉｎ ｖｉｖｏにおいて自己免疫疾患モデルを抑制する活性を有することを示す図。ヒトＬＡＧ－３／ヒトＦｃγＲＩＩＩＡダブルトランスジェニックマウスにＥＡＥを誘導し、ヒト化抗ＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２あるいはコントロール抗体を投与したマウスにおけるＥＡＥの臨床スコアを経時的に示す。抗体はいずれも３０ｍｇ／ｋｇの用量で感作日およびその７日後に静脈内投与した。

【図16】ｒＬＡ２０４抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号１）

【図17】ｒＬＡ２０４抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号２）

【図18】ｒＬＡ２０４抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号３）

【図19】ｒＬＡ２０４抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号４）

【図20】ｒＬＡ２１２抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号５）

【図21】ｒＬＡ２１２抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号６）

【図22】ｒＬＡ２１２抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号７）

【図23】ｒＬＡ２１２抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号８）

【図24】ｒＬＡ２２５抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号９）

【図25】ｒＬＡ２２５抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１０）

【図26】ｒＬＡ２２５抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号１１）

【図27】ｒＬＡ２２５抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１２）

【図28】ｒＬＡ８６９抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号１３）

【図29】ｒＬＡ８６９抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１４）

【図30】ｒＬＡ８６９抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号１５）

【図31】ｒＬＡ８６９抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１６）

【図32】ｒＬＡ１２６４抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号１７）

【図33】ｒＬＡ１２６４抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１８）

【図34】ｒＬＡ１２６４抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号１９）

【図35】ｒＬＡ１２６４抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号２０）

【図36】ヒト軽鎖分泌シグナル及びヒトκ鎖定常領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号２１）

【図37】ヒト重鎖分泌シグナル及びヒトＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号２２）

【図38】ｃＬＡ２１２抗体の重鎖のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号２３）

【図39】ｃＬＡ２１２抗体の重鎖のアミノ酸配列（配列番号２４）

【図40】ｃＬＡ２１２抗体の軽鎖のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号２５）

【図41】ｃＬＡ２１２抗体の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号２６）

【図42】ｈＬＡ２１２抗体の重鎖Ｈ２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号２７）

【図43】ｈＬＡ２１２抗体の重鎖Ｈ２のアミノ酸配列（配列番号２８）

【図44】ｈＬＡ２１２抗体の重鎖Ｈ３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号２９）

【図45】ｈＬＡ２１２抗体の重鎖Ｈ３のアミノ酸配列（配列番号３０）

【図46】ｈＬＡ２１２抗体の軽鎖Ｌ１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号３１）

【図47】ｈＬＡ２１２抗体の軽鎖Ｌ１のアミノ酸配列（配列番号３２）

【図48】ｈＬＡ２１２抗体の軽鎖Ｌ２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号３３）

【図49】ｈＬＡ２１２抗体の軽鎖Ｌ２のアミノ酸配列（配列番号３４）

【図50】ｈＬＡ２１２抗体の軽鎖Ｌ３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号３５）

【図51】ｈＬＡ２１２抗体の軽鎖Ｌ３のアミノ酸配列（配列番号３６）

【図52】ｈＬＡ２１２抗体の軽鎖Ｌ４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号３７）

【図53】ｈＬＡ２１２抗体の軽鎖Ｌ４のアミノ酸配列（配列番号３８）

【図54】ｈＬＡ２１２抗体の軽鎖Ｌ５のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号３９）

【図55】ｈＬＡ２１２抗体の軽鎖Ｌ５のアミノ酸配列（配列番号４０）

【図56】ｒＬＡ２０４抗体の重鎖ＣＤＲＨ１のアミノ酸配列（配列番号４１）

【図57】ｒＬＡ２０４抗体の重鎖ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列（配列番号４２）

【図58】ｒＬＡ２０４抗体の重鎖ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（配列番号４３）

【図59】ｒＬＡ２０４抗体の軽鎖ＣＤＲＬ１のアミノ酸配列（配列番号４４）

【図60】ｒＬＡ２０４抗体の軽鎖ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列（配列番号４５）

【図61】ｒＬＡ２０４抗体の軽鎖ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（配列番号４６）

【図62】ｒＬＡ２１２抗体の重鎖ＣＤＲＨ１のアミノ酸配列（配列番号４７）

【図63】ｒＬＡ２１２抗体の重鎖ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列（配列番号４８）

【図64】ｒＬＡ２１２抗体の重鎖ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（配列番号４９）

【図65】ｒＬＡ２１２抗体の軽鎖ＣＤＲＬ１のアミノ酸配列（配列番号５０）

【図66】ｒＬＡ２１２抗体の軽鎖ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列（配列番号５１）

【図67】ｒＬＡ２１２抗体の軽鎖ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（配列番号５２）

【図68】ｒＬＡ２２５抗体の重鎖ＣＤＲＨ１のアミノ酸配列（配列番号５３）

【図69】ｒＬＡ２２５抗体の重鎖ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列（配列番号５４）

【図70】ｒＬＡ２２５抗体の重鎖ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（配列番号５５）

【図71】ｒＬＡ２２５抗体の軽鎖ＣＤＲＬ１のアミノ酸配列（配列番号５６）

【図72】ｒＬＡ２２５抗体の軽鎖ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列（配列番号５７）

【図73】ｒＬＡ２２５抗体の軽鎖ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（配列番号５８）

【図74】ｒＬＡ８６９抗体の重鎖ＣＤＲＨ１のアミノ酸配列（配列番号５９）

【図75】ｒＬＡ８６９抗体の重鎖ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列（配列番号６０）

【図76】ｒＬＡ８６９抗体の重鎖ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（配列番号６１）

【図77】ｒＬＡ８６９抗体の軽鎖ＣＤＲＬ１のアミノ酸配列（配列番号６２）

【図78】ｒＬＡ８６９抗体の軽鎖ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列（配列番号６３）

【図79】ｒＬＡ８６９抗体の軽鎖ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（配列番号６４）

【図80】ｒＬＡ１２６４抗体の重鎖ＣＤＲＨ１のアミノ酸配列（配列番号６５）

【図81】ｒＬＡ１２６４抗体の重鎖ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列（配列番号６６）

【図82】ｒＬＡ１２６４抗体の重鎖ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（配列番号６７）

【図83】ｒＬＡ１２６４抗体の軽鎖ＣＤＲＬ１のアミノ酸配列（配列番号６８）

【図84】ｒＬＡ１２６４抗体の軽鎖ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列（配列番号６９）

【図85】ｒＬＡ１２６４抗体の軽鎖ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（配列番号７０）

【図86】プライマーＲＧ２ＡＲ３（配列番号７１）

【図87】プライマーＲＫＲ５（配列番号７２）

【図88】プライマー３．３－Ｆ１（配列番号７３）

【図89】プライマー３．３－Ｒ１（配列番号７４）

【図90】プライマー２１２Ｈ－Ｆ（配列番号７５）

【図91】プライマー２１２Ｈ－Ｒ（配列番号７６）

【図92】プライマー２１２Ｌ－Ｆ（配列番号７７）

【図93】プライマー２１２Ｌ－Ｒ（配列番号７８）

【図94】オリゴヌクレオチドＬＡＧ－３－Ｈ１（配列番号７９）

【図95】オリゴヌクレオチドＬＡＧ－３－Ｈ２（配列番号８０）

【図96】オリゴヌクレオチドＬＡＧ－３－Ｈ３（配列番号８１）

【図97】オリゴヌクレオチドＬＡＧ－３－Ｈ４（配列番号８２）

【図98】オリゴヌクレオチドＬＡＧ－３－Ｈ５（配列番号８３）

【図99】オリゴヌクレオチドＬＡＧ－３－Ｈ６（配列番号８４）

【図100】ヒトＬＡＧ－３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号８５）

【図101】ヒトＬＡＧ－３のアミノ酸配列（配列番号８６）

【図102】ヒト活性化ＣＤ８Ｔ細胞において、ヒトＬＡＧ－３の発現がパーフォリンの発現と相関していることを示す図。ヒトＰＢＭＣをＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８で刺激した細胞におけるＬＡＧ－３およびパーフォリンの発現をフローサイトメトリー法（多重染色）により検討した。解析のためにＣＤ３陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞にゲートをかけた結果を示す。なおグラフの４分割は、ヒトＬＡＧ－３およびヒトパーフォリンに対する染色抗体を含まないサンプル（左端の図）を用いて設定した。

【図103】ヒト活性化ＣＤ８Ｔ細胞において、ＣＤ２８陰性細胞の多くがＬＡＧ－３を発現していることを示す図。ヒトＰＢＭＣをＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８で刺激した細胞におけるＬＡＧ－３およびＣＤ２８の発現をフローサイトメトリー法（多重染色）により検討した。解析のためにＣＤ３陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞にゲートをかけた結果を示す。なおグラフの４分割は、ヒトＬＡＧ－３およびヒトＣＤ２８に対する染色抗体を含まないサンプル（左端の図）を用いて設定した。

【図104】ヒト活性化ＣＤ８Ｔ細胞において、ＣＤ５７陽性細胞の多くがＬＡＧ－３を発現していることを示す図。ヒトＰＢＭＣをＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８で刺激した細胞におけるＬＡＧ－３およびＣＤ５７の発現をフローサイトメトリー法（多重染色）により検討した。解析のためにＣＤ３陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞にゲートをかけた結果を示す。なおグラフの４分割は、ヒトＬＡＧ－３およびヒトＣＤ５７に対する染色抗体を含まないサンプル（左端の図）を用いて設定した。

【図105】ＬＡＧ－３抗体がパーフォリン陽性ＣＤ８Ｔ細胞を選択的にｄｅｐｌｅｔｅすることを示す図。ヒトＰＢＭＣを、ヒト化抗ＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２、タクロリムス（Ｔａｃ）、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）の存在下で、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８で４日間刺激し、得られた細胞をフローサイトメトリー法（多重染色）により解析した。二人のドナー由来のＰＢＭＣを用いた結果を示す（ＰＢＭＣ１およびＰＢＭＣ２）。図１０５ＡはトータルのＴ細胞数を、図１０５Ｂはパーフォリン陽性ＣＤ８Ｔ細胞数をそれぞれ示す。

【図106】ＬＡＧ－３抗体がＣＤ２８陰性Ｔ細胞をｄｅｐｌｅｔｅすることを示す図。ヒトＰＢＭＣを、ヒト化抗ＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２（最終濃度１０、１、０．１μｇ／ｍＬ）、コントロール抗体（最終濃度１０μｇ／ｍＬ）、タクロリムス（Ｔａｃ）、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）の存在下で、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８で４日間刺激し、得られた細胞をフローサイトメトリー法（多重染色）により解析した。二人のドナー由来のＰＢＭＣを用いた結果を示す（ＰＢＭＣ１およびＰＢＭＣ２）。図１０６ＡはＣＤ２８陰性ＣＤ４Ｔ細胞数を、図１０６ＢはＣＤ２８陰性ＣＤ８Ｔ細胞数をそれぞれ示す。

【図107】ＬＡＧ－３抗体がＣＤ５７陽性Ｔ細胞をｄｅｐｌｅｔｅすることを示す図。ヒトＰＢＭＣを、ヒト化抗ＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２（最終濃度１０、１、０．１μｇ／ｍＬ）、コントロール抗体（最終濃度１０μｇ／ｍＬ）、タクロリムス（Ｔａｃ）、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）の存在下で、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８で４日間刺激し、得られた細胞をフローサイトメトリー法（多重染色）により解析した。二人のドナー由来のＰＢＭＣを用いた結果を示す（ＰＢＭＣ１およびＰＢＭＣ２）。図１０７ＡはＣＤ５７陽性ＣＤ４Ｔ細胞数を、図１０７ＢはＣＤ５７陽性ＣＤ８Ｔ細胞数をそれぞれ示す。

【発明を実施するための形態】

【0012】

１．定義
本発明において、「遺伝子」とは、蛋白質のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列が含まれる核酸分子またはその相補鎖を意味し、例えば、蛋白質のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列またはその配列に相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ等は「遺伝子」の意味に含まれる。かかる遺伝子は一本鎖、二本鎖又は三本鎖以上のヌクレオチドであり、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖の会合体、一本のヌクレオチド鎖上にリボヌクレオチド（ＲＮＡ）とデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）が混在するもの及びそのようなヌクレオチド鎖を含む二本鎖又は三本鎖以上のヌクレオチドも「遺伝子」の意味に含まれる。本発明の「ＬＡＧ－３遺伝子」としては、例えば、ＬＡＧ－３蛋白質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が含まれるＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ等をあげることができる。

【0013】

本発明において、「ヌクレオチド」と「核酸」及び「核酸分子」は同義であり、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プローブ、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プライマー等もそれらの意味に含まれる。かかるヌクレオチドは一本鎖、二本鎖又は三本以上の鎖からなるヌクレオチドであり、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖の会合体、一本のヌクレオチド鎖上にリボヌクレオチド（ＲＮＡ）とデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）が混在するもの及びそのようなヌクレオチド鎖を含む二本鎖又は三本以上の鎖の会合体も「ヌクレオチド」の意味に含まれる。

【0014】

本発明において、「ポリペプチド」、「ペプチド」および「蛋白質」は同義である。

【0015】

本発明において、「抗原」を「免疫原」の意味に用いることがある。

【0016】

本発明において、「細胞」には、動物個体に由来する各種細胞、継代培養細胞、初代培養細胞、細胞株、組換え細胞及び微生物等も含まれる。

【0017】

本発明においては、ＬＡＧ－３と結合する抗体及びＬＡＧ－３を認識する抗体を、いずれも「抗ＬＡＧ－３抗体」と表記するか又は「ＬＡＧ－３抗体」と略記することがある。抗ＬＡＧ－３抗体には、モノクローナル抗体、キメラ化抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体等が含まれる。

【0018】

本発明における「抗体の結合断片」とは、元の抗体が奏する機能の少なくとも一部を奏する抗体断片を意味する。「抗体の結合断片」としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’、一本鎖免疫グロブリン等をあげることができるが、それらに限定されるものではない。かかる抗体の結合断片は、抗体蛋白質の全長分子をパパイン、ペプシン等の酵素で処理することによって得られたものに加え、組換え遺伝子を用いて適当な宿主細胞において産生された組換え蛋白質であってもよい。

【0019】

本発明において、抗体が結合する「部位」、すなわち抗体が認識する「部位」とは、抗体が結合又は認識する抗原上の部分ペプチド又は部分高次構造を意味する。本発明においては、かかる部位のことをエピトープ、抗体の結合部位とも呼ぶ。抗ＬＡＧ－３抗体が結合又は認識するＬＡＧ－３蛋白質上の部位としては、ＬＡＧ－３蛋白質上の部分ペプチド又は部分高次構造等を例示することができる。

【0020】

抗体分子の重鎖及び軽鎖にはそれぞれ３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ：Ｃｏｍｐｌｅｍｅｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）があることが知られている。相補性決定領域は、超可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）とも呼ばれ、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域内にあって、一次構造の変異性が特に高い部位であり、重鎖及び軽鎖のポリペプチド鎖の一次構造上において、通常、それぞれ３ヶ所に分離している。本発明においては、抗体の相補性決定領域について、重鎖の相補性決定領域を重鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３と表記し、軽鎖の相補性決定領域を軽鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３と表記する。これらの部位は立体構造の上で相互に近接し、結合する抗原に対する特異性を決定している。重鎖可変領域アミノ酸配列中のＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３以外の部分をフレームワーク（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ Ｒｅｇｉｏｎ：以下ＦＲ）と呼び、アミノ末端からＣＤＲＨ１の手前まで、ＣＤＲＨ１の次からＣＤＲＨ２の手前まで、ＣＤＲＨ２の次からＣＤＲＨ３の手前まで、及び、ＣＤＲＨ３の次からカルボキシル末端までを、それぞれＦＲＨ１乃至ＦＲＨ４と呼ぶ。同様に、軽鎖可変領域アミノ酸配列中のＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３以外の部分もＦＲであり、アミノ末端からＣＤＲＬ１の手前まで、ＣＤＲＬ１の次からＣＤＲＬ２の手前まで、ＣＤＲＬ２の次からＣＤＲＬ３の手前まで、及び、ＣＤＲＬ３の次からカルボキシル末端までを、それぞれＦＲＬ１乃至ＦＲＬ４と呼ぶ。すなわち、重鎖及び軽鎖の可変領域（のアミノ酸配列）においては、ＦＲＨ１－ＣＤＲＨ１－ＦＲＨ２－ＣＤＲＨ２－ＦＲＨ３－ＣＤＲＨ３－ＦＲＨ４及びＦＲＬ１－ＣＤＲＬ１－ＦＲＬ２－ＣＤＲＬ２－ＦＲＬ３－ＣＤＲＬ３－ＦＲＬ４の順でアミノ末端側からカルボキシル末端に向けて連続的に並んでいる。

【0021】

本発明において、「抗体変異体」とは、元の抗体が有するアミノ酸配列においてアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入（以下、「変異」と総称する）してなるアミノ酸配列を有し、且つＬＡＧ－３蛋白質に結合するポリペプチドを意味する。かかる抗体変異体における変異アミノ酸の数は、１個、１乃至２個、１乃至３個、１乃至４個、１乃至５個、１乃至６個、１乃至７個、１乃至８個、１乃至９個、１乃至１０個、１乃至１２個、１乃至１５個、１乃至２０個、１乃至２５個、１乃至３０個、１乃至４０個又は１乃至５０個である。かかる抗体変異体も本発明の「抗体」に包含される。

【0022】

本発明において、「１乃至数個」における「数個」とは、３乃至１０個を指す。

【0023】

本発明においてＬＡＧ－３抗体が奏する活性・性質としては、例えば、生物的活性、理化学的性質等を挙げることができ、具体的には、各種生物活性、抗原やエピトープに対する結合活性、製造や保存時における安定性、熱安定性等をあげることができる。

【0024】

本発明において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、５×ＳＳＣを含む溶液中で６５℃にてハイブリダイゼーションを行い、ついで２×ＳＳＣ－０．１％ＳＤＳを含む水溶液中で６５℃にて２０分間、０．５×ＳＳＣ－０．１％ＳＤＳを含む水溶液中で６５℃にて２０分間、ならびに、０．２×ＳＳＣ－０．１％ＳＤＳを含む水溶液中で６５℃にて２０分間、それぞれ洗浄する条件又はそれと同等の条件でハイブリダイズすることを意味する。ＳＳＣとは１５０ｍＭＮａＣｌ－１５ｍＭクエン酸ナトリウムの水溶液であり、ｎ×ＳＳＣはｎ倍濃度のＳＳＣを意味する。

【0025】

本発明において「細胞傷害」とは、何らかの形で、細胞に病理的な変化をもたらすことを指し、直接的な外傷にとどまらず、ＤＮＡの切断や塩基の二量体の形成、染色体の切断、細胞分裂装置の損傷、各種酵素活性の低下などあらゆる細胞の構造や機能上の損傷を意味する。

【0026】

本発明において「細胞傷害活性」とは上記細胞傷害を引き起こすことを意味する。

【0027】

本発明において「抗体依存性細胞傷害活性」とは、「ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ（ＡＤＣＣ）活性」を指し、ＮＫ細胞等が抗体を介して標的細胞を傷害する作用活性を意味する。

【0028】

本発明において、「宿主対移植片反応」とは、臓器移植後に観察される被移植者の免疫亢進状態およびこれによる移植臓器の傷害をいう。

【0029】

本発明において、「移植片対宿主病」とは、造血細胞移植後の移植細胞による被移植者への免疫的攻撃によって発症する症状をいう。

【0030】

本発明において、「ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ」、「枯渇」および「除去」は同義であり、相互に置き換え可能であり、細胞傷害活性等により、特定の細胞群に含まれる細胞の数が減少した状態又は増加していない状態をいう。同様に「ｄｅｐｌｅｔｅ」、「枯渇させる」および「除去する」は同義であり、相互に置き換え可能であり、細胞傷害活性等により、特定の細胞群に含まれる細胞の数を減少させるか又は増加させないことをいう。

【0031】

本発明において、「細胞傷害性Ｔ細胞」とは、特定の細胞群に含まれる細胞に対し細胞傷害性を有するＴ細胞を意味し、例えば、ＣＤ４＋（陽性）ＣＤ２８－（陰性）Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ２８－Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ５７＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ５７＋Ｔ細胞、パーフォリン＋Ｔ細胞、グランザイムＢ＋Ｔ細胞等のＴ細胞サブセットをあげることができる。細胞傷害性Ｔ細胞は、喘息及び重症喘息（以下まとめて「喘息」という）や慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）等の免疫系疾患や自己免疫疾患に関与する主要な炎症系細胞の一つとして報告されており（非特許文献１２, 非特許文献１５）、高い細胞傷害作用を有する一方、ステロイド処置による抗炎症作用あるいはアポトーシス誘導への耐性が報告されている（非特許文献１６）

【0032】

２．抗原蛋白質
（２－１）特性
ＬＡＧ－３蛋白質（以下単に「ＬＡＧ－３」とも記す）は膜貫通型受容体蛋白質で、免疫グロブリン様ドメイン（ＩｇＤ１乃至４）から成るリガンド結合部位を含む細胞外領域、Ｉ型１回膜貫通領域、および細胞内領域から構成されている。ＬＡＧ－３はＣＤ２２３と同義である。

【0033】

本発明において、ＬＡＧ－３は脊椎動物由来、好適には哺乳動物由来であり、より好適にはヒト由来である。
ＬＡＧ－３蛋白質は以下の性質を有する。
（ｉ）抗原提示細胞上の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子に結合する。
（ｉｉ）ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合して、当該分子を発現するＴ細胞に抑制性のシグナルを伝達し、該Ｔ細胞の機能を負に制御する。
（ｉｉｉ）本発明においてＬＡＧ－３蛋白質は、次の（ａ）乃至（ｄ）のいずれか一つに記載のアミノ酸配列（以下、「ＬＡＧ－３アミノ酸配列」という）を含んでなるか、ＬＡＧ－３アミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなるか、またはＬＡＧ－３アミノ酸配列からなる：
（ａ）配列番号８６（図１０１）で示されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号８６（図１０１）で示されるアミノ酸配列と８０％以上、８２％以上、８４％以上、８６％以上、８８％以上、９０％以上、９２％以上、９４％以上、９６％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を示し且つＭＨＣクラスＩＩ分子結合活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号８６（図１０１）で示されるアミノ酸配列において１乃至５０個、１乃至４５個、１乃至４０個、１乃至３５個、１乃至３０個、１乃至２５個、１乃至２０個、１乃至１５個、１乃至１０個、１乃至８個、１乃至６個、１乃至５個、１乃至４個、１乃至３個、１若しくは２個、または１個のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入してなり且つＭＨＣクラスＩＩ分子結合活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列；及び、
（ｄ）配列番号８６（図１０１）で示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド（核酸分子）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド（核酸分子）の有するヌクレオチド配列によりコードされ、且つ、ＭＨＣクラスＩＩ分子結合活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列。

【0034】

（ｂ）乃至（ｄ）記載のいずれか一つに記載のポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ分子結合活性に加え、ＬＡＧ－３の有する他の活性を有していてもよい。
（ｉｖ）ＬＡＧ－３蛋白質は、脊椎動物、好適には哺乳動物、より好適にはマウス、ラット等のげっ歯類及びヒト、より一層好適にはヒト、ラット又はマウスの、ＬＡＧ－３を発現している細胞、組織又は癌組織、かかる組織由来の細胞、かかる細胞の培養物等より得ることができる。
ＬＡＧ－３は、生体内では炎症部位の活性化Ｔ細胞等に発現が認められ、正常組織の細胞においてはほとんど発現していないか又は発現レベルが非常に低い。

【0035】

ＬＡＧ－３蛋白質は天然型（非組換型）及び組換え型のいずれであってもよい。また、担体やタグなど他のペプチドや蛋白質との融合物もＬＡＧ－３蛋白質の意味に含まれる。さらに、ＰＥＧ等のポリマー付加を含む化学修飾、及び／又は、糖鎖修飾を含む生物学的修飾がなされたものもＬＡＧ－３蛋白質の意味に含まれる。また、ＬＡＧ－３蛋白質断片もＬＡＧ－３蛋白質の意味に含まれる。ＬＡＧ－３蛋白質断片のうち上記（ｉ）及び／又は（ｉｉ）記載の性質を具備したものをＬＡＧ－３蛋白質結合断片と呼ぶ。

【0036】

（２－２）抗原遺伝子
本発明においてＬＡＧ－３遺伝子は、次の（ａ）乃至（ｃ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列（以下、「ＬＡＧ－３遺伝子配列」という）を含んでなるか、ＬＡＧ－３遺伝子配列を含むヌクレオチド配列からなるか、またはＬＡＧ－３遺伝子配列からなる：
（ａ）配列番号８６（図１０１）で示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号８６（図１０１）で示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド（核酸分子）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし且つＭＨＣクラスＩＩ分子結合活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（核酸分子）が有するヌクレオチド配列；及び
（ｃ）配列番号８６（図１０１）で示されるアミノ酸配列において１乃至５０個、１乃至４５個、１乃至４０個、１乃至３０個、１乃至２５個、１乃至２０個、１乃至１５個、１乃至１０個、１乃至８個、１乃至６個、１乃至５個、１乃至４個、１乃至３個、１若しくは２個、または１個の塩基が置換、欠失、付加または挿入してなるアミノ酸配列をコードし且つＭＨＣクラスＩＩ分子結合活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。

【0037】

（ｂ）又は（ｃ）記載のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ分子結合活性に加え、ＬＡＧ－３の有する他の活性を有していてもよい。

【0038】

ＬＡＧ－３遺伝子の発現及び発現量の測定は、ＬＡＧ－３遺伝子の転写産物及びＬＡＧ－３蛋白質のいずれを指標としてもよく、前者はＲＴ－ＰＣＲ法、ノーザンブロット・ハイブリダーゼーション法等により、後者はフローサイトメトリー、ウエスタンブロッティング法、免疫組織染色法等の免疫アッセイ法等により、それぞれ測定することができる。

【0039】

（２－３）抗原蛋白質の調製
ＬＡＧ－３蛋白質は、動物組織（体液を含む）、該組織由来の細胞もしくは該細胞培養物からの精製及び単離、遺伝子組換え、インビトロ翻訳、化学合成等により調製することができる。
（２－３－１）非組換型ＬＡＧ－３の精製、単離
非組換型ＬＡＧ－３蛋白質は、ＬＡＧ－３を発現している細胞より精製、単離することができる。ＬＡＧ－３を発現している細胞としては（２－１）の（ｉｖ）記載のものを例示することができるが、非組換型ＬＡＧ－３蛋白質の由来はそれらに限定されるものではない。

【0040】

かかる組織、細胞、細胞培養物等からの精製・単離は当業者に周知の分画、クロマトグラフィー等の手法を組み合わせることにより行うことができる。
（２－３－２）組換型ＬＡＧ－３蛋白質の調製
ＬＡＧ－３蛋白質は、組換型としても調製することができる。すなわち、ＬＡＧ－３蛋白質又はＬＡＧ－３蛋白質断片のアミノ酸配列をコードする遺伝子を宿主細胞に導入し、かかる細胞の培養物からＬＡＧ－３蛋白質を回収することができる。また、アミノ末端（Ｎ末）及び／又はカルボキシ末端（Ｃ末）が天然型と同一の分子のみならず、分泌シグナル、細胞内局在化シグナル、アフィニティー精製用タグ、パートナーペプチドとの融合蛋白質として発現させることもできる。かかる組換え細胞培養物からのＬＡＧ－３蛋白質の精製、単離は、（２－３－１）記載の非組換型ＬＡＧ－３蛋白質の精製、単離に記載の分画、クロマトグラフィー等の操作を適宜組み合わせることにより行うことができる。また、ＬＡＧ－３蛋白質含有溶液は、ゲルろ過やＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ等の濃縮装置でバッファー交換及び／又は濃縮することができる。

【0041】

（２－３－３）インビトロ翻訳
ＬＡＧ－３蛋白質はインビトロ翻訳によっても調製することができる。かかる翻訳法としては、転写及び翻訳に必要な酵素、基質並びにエネルギー物質を含む無細胞翻訳系を利用した方法であれば特に限定されるものではないが、例えば、ロシュ・ダイアグノスティックス社製のラピッドトランスレーションシステム（ＲＴＳ）を利用する方法をあげることができる。
（２－３－４）化学合成
ＬＡＧ－３蛋白質は化学合成によっても調製することができる。化学合成法としては、例えば、Ｆｍｏｃ合成法、Ｂｏｃ合成法などのペプチド固相合成法をあげることができる。

【0042】

３．抗体
（３－１）抗体の分類
本発明においてＬＡＧ－３抗体は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体のいずれであってもよい。モノクローナル抗体としては、非ヒト動物由来の抗体（非ヒト動物抗体）、ヒト由来の抗体（ヒト抗体）、キメラ化抗体（「キメラ抗体」ともいう）、ヒト化抗体等をあげることができる。

【0043】

非ヒト動物抗体としては、哺乳類、鳥類等の脊椎動物に由来する抗体等をあげることができる。哺乳類由来の抗体としては、マウス抗体、ラット抗体等げっ歯類由来の抗体等をあげることができる。鳥類由来の抗体としては、ニワトリ抗体等をあげることができる。抗ヒトＬＡＧ－３ラットモノクローナル抗体としては、例えば、ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、４ＬＡ８６９、ｒＬＡ１２６４等をあげることができるが、それらに限定されない。

【0044】

キメラ化抗体としては、非ヒト動物抗体由来の可変領域とヒト抗体（ヒト免疫グロブリン）定常領域とを結合してなる抗体等をあげることができるが、それに限定されるものではない。非ヒト動物抗体由来の可変領域とヒト抗体定常領域が結合してなるキメラ化抗体としては、前述のラットモノクローナル抗体ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、４ＬＡ８６９又はｒＬＡ１２６４由来の重鎖及び軽鎖可変領域、ならびに、ヒト重鎖及び軽鎖定常領域を有するもの（それぞれ「ｃＬＡ２０４」、「ｃＬＡ２１２」、「ｃＬＡ２２５」、「ｃＬＡ８６９」又は「ｃＬＡ１２６４」と呼ぶ）等をあげることができる。

【0045】

ヒト化抗体としては、非ヒト動物抗体の可変領域中のＣＤＲをヒト抗体（ヒト免疫グロブリンの可変領域）に移植したもの、ＣＤＲに加え非ヒト動物抗体のＦＲの配列も一部ヒト抗体に移植したもの、それらのいずれかの非ヒト動物抗体由来の１つ又は２つ以上のアミノ酸をヒト型又は他のアミノ酸で置換したもの等をあげることができるが、それらに限定されるものではない。非ヒト動物抗体の可変領域中のＣＤＲとしては、前述のｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９又はｒＬＡ１２６４由来の重鎖可変領域中のＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３および軽鎖可変領域中のＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３を例示することができ、ｒＬＡ２１２由来の重鎖可変領域中のＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３および軽鎖可変領域中のＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３を含むヒト化抗体としては、ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ１乃至Ｈ２／Ｌ５、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ１乃至Ｈ３／Ｌ５、ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２等をあげることができる。

【0046】

ヒト抗体としては、ＬＡＧ－３蛋白質を認識する抗体であれば特に限定されるものではないが、ＬＡＧ－３抗体のＣＤＲを有する抗体と同一の部位に結合するヒト抗体、前述の非ヒト動物抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体等のいずれか一つとＬＡＧ－３上で同一の部位に結合するヒト抗体、かかるいずれかの抗体とＬＡＧ－３への結合において競合する抗体等を例示することができる。

【0047】

本発明における抗体は、ＬＡＧ－３に結合する活性を有していれば、複数の異なる抗体に由来する部分から構成される抗体であってもよく、例えば、複数の異なる抗体間で重鎖及び／又は軽鎖を交換したもの、重鎖及び／又は軽鎖の全長を交換したもの、可変領域のみ又は定常領域のみを交換したもの、ＣＤＲの全部又は一部のみを交換したもの等をあげることができる。キメラ化抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、異なるＬＡＧ－３抗体に由来してもよい。ヒト化抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域中のＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３並びにＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３は、２種又はそれ以上のＬＡＧ－３抗体に由来してもよい。ヒト抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域中のＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３並びにＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３は、２種又はそれ以上のＬＡＧ－３抗体が有するＣＤＲの組合せであってもよい。そのような複数の異なる抗体に由来する部分から構成される抗体又はその結合断片は、以下に記される（３－２）および（３－３）、好適にはそれらに加えて（３－４）、より好適にはそれらに加えて（３－５）、より一層好適には（３－２）乃至（３－８）全て、に記載の性質、機能、活性等をそれぞれ有する。

【0048】

モノクローナル抗体のアイソタイプは特に限定されるものではないが、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等のＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２等のＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等をあげることができ、好適にはＩｇＧおよびＩｇＭを挙げることができる。モノクローナル抗体のアイソタイプ及びサブクラスは、例えば、オクテルロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）法、Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏ－ｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ：以下、「ＥＬＩＳＡ」という)法、Ｒａｄｉｏ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（以下、「ＲＩＡ」という）法等で決定することができる、市販の同定用のキット（マウスタイパーキット：バイオラッド社製、ＲＡＴ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＩＳＯＴＹＰＩＮＧ ＴＥＳＴ ＫＩＴ：ｓｅｒｏｔｅｃ社 等）も利用することができる。

【0049】

（３－２）抗体の結合特異性
本発明においてＬＡＧ－３抗体はＬＡＧ－３蛋白質を認識する。言い換えれば、ＬＡＧ－３抗体はＬＡＧ－３蛋白質に結合する。かかる抗体は「抗ＬＡＧ－３抗体」とも表記される。また、本発明に使用される好適な抗体はＬＡＧ－３蛋白質を特異的に認識する。言い換えれば、本発明に使用される好適な抗体はＬＡＧ－３蛋白質に特異的に結合する（以上、まとめて抗体の「ＬＡＧ－３結合活性という）。さらに、本発明に使用されるより好適な抗体はＬＡＧ－３蛋白質の細胞外領域に特異的に結合し、より一層好適な抗体はＬＡＧ－３蛋白質の有する免グロブリン様ドメイン（以下、「Ｉｇ様ドメイン」という）に特異的に結合し、さらにより一層好適な抗体はかかるＩｇ様ドメイン３に特異的に結合する。

【0050】

本発明において「特異的な認識」、すなわち「特異的な結合」とは、非特異的な吸着ではない結合を意味する。結合が特異的であるか否かの判定基準としては、例えば、解離定数（Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｃｏｎｓｉｔａｎｔ：以下、「ＫＤという」）をあげることができる。本発明に使用される好適な抗体のＬＡＧ－３蛋白質に対するＫＤ値は１×１０－５以下、５×１０－６以下、２×１０－６以下または１×１０－６以下、より好適には５×１０－７以下、２×１０－７以下または１×１０－７以下、より一層好適には５×１０－８以下、２×１０－８以下または１×１０－８以下、さらにより一層好適には５×１０－９以下、２×１０－９以下または１×１０－９以下、最適には５×１０－１０以下、２×１０－１０以下または１×１０－１０以下である。

【0051】

本発明における抗原と抗体の結合は、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（以下、「ＳＰＲ」という）解析法等により測定または判定することができる。ＳＰＲ解析に用いる機器としては、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ（ＧＥヘルスケア社製）、ＰｒｏｔｅＯｎＴＭ（ＢｉｏＲａｄ社製）、ＳＰＲ－ＮａｖｉＴＭ（ＢｉｏＮａｖｉｓ社製）、ＳｐｒｅｅｔａＴＭ（Ｔｅｘａｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）、ＳＰＲｉ－ＰｌｅｘＩＩＴＭ（ホリバ社製）、Ａｕｔｏｌａｂ ＳＰＲＴＭ（Ｍｅｔｒｏｈｍ社製）等を例示することができる。細胞表面上に発現している抗原と抗体との結合は、フローサートメトリー法、Ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡ法等により測定することができる。

【0052】

（３－３）抗体の細胞傷害活性
本発明に使用される抗ＬＡＧ－３抗体は、そのある態様において、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有し、好適にはイン・ビトロでＡＤＣＣ活性を有し、より好適にはＬＡＧ－３を発現するＴ細胞に対してＡＤＣＣ活性を有する。本発明に使用される抗ＬＡＧ－３抗体は、ＡＤＣＣ活性に加え、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性及び／又は抗体依存性細胞媒介食活性（ＡＤＣＰ）活性を有していてもよい。本発明においては「イン・ビトロのＡＤＣＣ活性」を単に「ＡＤＣＣ活性」ということがある。

【0053】

ＡＤＣＣ活性は公知の方法により測定することができる。ＡＤＣＣ活性の測定には、目的とする抗原を発現する細胞（標的細胞）と、その標的細胞を殺傷するエフェクター細胞が用いられる。エフェクター細胞はＦｃγ受容体を介して、標的細胞に結合した抗体のＦｃ領域を認識する。Ｆｃγ受容体から伝達されるシグナルにより、エフェクター細胞が標的細胞を殺傷する。ヒト由来のＦｃ領域を有する抗体のＡＤＣＣ活性を測定する場合、エフェクター細胞としてヒトＮＫ細胞が用いられる。ヒトＮＫ細胞はヒト末梢血単核球（ＰＭＢＣ)から公知の方法により調製することができる。あるいはＰＢＭＣをそのままエフェクター細胞として用いることもできる。

【0054】

（３－４）抗体のイン・ビボＬＡＧ－３陽性細胞数低減活性
本発明においてＬＡＧ－３抗体は、そのある態様において、ＬＡＧ－３陽性細胞数を低減させ、好適にはイン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）でＬＡＧ－３陽性細胞数を低減させ、より好適には低フコース形態で、イン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）でＬＡＧ－３陽性細胞数を低減させる。

【0055】

ＬＡＧ－３陽性細胞には、ＬＡＧ－３を強制発現させた細胞、刺激によりＬＡＧ－３発現が誘導された細胞等が含まれるが、ＬＡＧ－３を発現している細胞であればそれらに限定されない。

【0056】

ＬＡＧ－３陽性細胞数は定法、例えば、フローサイトメトリーによりカウントすることができる。

【0057】

本発明において「低フコース形態」とは、（ｉ）ある抗体又はその結合断片に結合しているＮ－グリコシド結合複合型糖鎖中のフコース（フコース残基）の量が、元（親）の抗体又はその結合断片に結合しているＮ－グリコシド結合複合型糖鎖中のフコース（フコース残基）の量より少い形態、（ｉｉ）ある抗体又はその結合断片に結合しているＮ－グリコシド結合複合型糖鎖中のフコース（フコース残基）の量が、天然において抗体又はその結合断片に結合しているＮ－グリコシド結合複合型糖鎖中のフコース（フコース残基）の量より少ない形態、又は（ｉｉｉ）ある抗体若しくはその結合断片に結合しているＮ－グリコシド結合複合型糖鎖中のフコース（フコース残基）又はフコース（フコース残基）を含む糖鎖が、物理的又は化学的な分析（好適には質量分析）において検出限界以下である形態、を意味する。ある改変された抗体又はその結合断片に結合しているＮ－グリコシド結合複合型糖鎖中のフコース（フコース残基）の量が、かかる改変前と比較して少ない場合、かかる改変された抗体又はその結合断片は「低フコース形態」にあると解される。後述するヒト化抗体の修飾体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２も、低フコース形態にある抗体の一態様である。低フコース形態にある抗体又は結合断片は、低フコース形態にないものに比して、Ｆｃγ受容体ＩＩＩＡに対する親和性が高く、ＡＤＣＣ活性が強い。

【0058】

（３－５）抗体のイン・ビボ実験的自己免疫性脳脊髄炎抑制活性
本発明においてＬＡＧ－３抗体は、そのある態様において、脳脊髄炎抑制活性を有し、好適にはイン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で実験的自己免疫性脳脊髄炎抑制活性を有し、より好適には低フコース形態で、イン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で実験的自己免疫性脳脊髄炎抑制活性を有する。

【0059】

本発明において、実験的自己免疫性脳脊髄炎は、中枢神経のミエリン構成タンパク質の１つであるＭＯＧ（Ｍｙｅｌｉｎ Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）由来のペプチドをＦｒｅｕｎｄ‘ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔと共にマウスに注射することにより惹起する脳脊髄炎を意味する 。

【0060】

実験的自己免疫性脳脊髄炎抑制活性は、麻痺の程度を反映した臨床スコアを経日的に観察することで測定することができる。臨床スコアは、例えば以下のように設定することができる： スコア０：無症状、スコア１：尾の脱力、スコア２：歩行異常・正向反射消失、スコア３：後肢麻痺、スコア４：前肢の部分麻痺、スコア５：死亡または安楽殺。

【0061】

（３－６）抗体のヒト活性化Ｔ細胞結合活性
本発明においてＬＡＧ－３抗体は、そのある態様において、ヒト活性化Ｔ細胞に結合し、好適にはＬＡＧ－３陽性ヒト活性化Ｔ細胞に結合する。
抗体と活性化ヒト活性化Ｔ細胞の結合は、例えば、フローサイトメトリー法により測定又は検出することができる。

【0062】

（３－７）抗体の存在下でヒトＬＡＧ－３とヒトＭＨＣクラスＩＩ分子は結合する
本発明のある態様では、抗体の存在下において、ヒトＬＡＧ－３とヒトＭＨＣクラスＩＩ分子は結合することができるか、又は、本発明においてＬＡＧ－３抗体は、ヒトＬＡＧ－３とヒトＭＨＣクラスＩＩ分子の結合を阻害しない。

【0063】

ＬＡＧ－３分子の細胞外領域とＩｇＧのＦｃ部分の融合タンパク質の、内因性にＭＨＣクラスＩＩ分子を高発現するＲａｊｉ細胞への結合は、例えば、フローサイトメトリー法により測定又は検出することで評価することができる。

【0064】

（３－８）抗体の存在下でヒトＬＡＧ－３はヒトＴ細胞抑制機能を奏する
また他の態様において、本発明におけるＬＡＧ－３抗体の存在下で、ヒトＬＡＧ－３はヒトＴ細胞抑制機能を奏する。

【0065】

本発明において「Ｔ細胞抑制機能」とは、Ｔ細胞を刺激した際に産生されるサイトカイン量の減少又は抑制を意味する。

【0066】

ヒトＬＡＧ－３によるＴ細胞抑制機能は、例えばヒトＴ細胞を刺激してＬＡＧ－３発現を誘導した際に産生されるサイトカインを定量することにより測定することができる。

【0067】

本発明において、ヒトＴ細胞の刺激は、特に限定されないが、例えば、特異抗原、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体の組合せ、スーパー抗原、別のドナー由来の細胞による刺激、好適にはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ Ｂ、ＭＨＣの異なる別のドナー由来の細胞による刺激等をあげることができる。
サイトカインとしては、例えば、活性化Ｔ細胞から産生されるサイトカイン、好適には各種インターローキンおよびインターフェロン、より好適にはインターロイキン２（ＩＬ－２）およびインターフェロンγ等をあげることができる。

【0068】

（３－９）モノクローナル抗体
本発明は抗ＬＡＧ－３モノクローナル抗体及びその結合断片を提供する。モノクローナル抗体には、ラット抗体、マウス抗体、ウサギ抗体、ニワトリ抗体、魚類抗体等の非ヒト動物由来のモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、それらの結合断片、それらの修飾体等が含まれる。このうち、ラットモノクローナル抗体の例としては、ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９、ｒＬＡ１２６４等をあげることができる。

【0069】

ｒＬＡ２０４は実施例１に記載の方法により得られた抗ヒトＬＡＧ－３ラットモノクローナル抗体である。ｒＬＡ２０４の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号１（図１６）に、アミノ酸配列は配列番号２（図１７）に記載されている。ｒＬＡ２０４の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号３（図１８）に、アミノ酸配列は配列番号４（図１９）に記載されている。ｒＬＡ２０４のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列は配列番号４１（図５６）に、ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列は配列番号４２（図５７）に、ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列は配列番号４３（図５８）に、ＣＤＲＬ１のアミノ酸配列は配列番号４４（図５９）に、ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列は配列番号４５（図６０）に、ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列は配列番号４６（図６１）にそれぞれ記載されている。

【0070】

ｒＬＡ２１２は実施例１に記載の方法により得られた抗ヒトＬＡＧ－３ラットモノクローナル抗体である。ｒＬＡ２１２の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号５（図２０）に、アミノ酸配列は配列番号６（図２１）に記載されている。ｒＬＡ２１２の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号７（図２２）に、アミノ酸配列は配列番号８（図２３）に記載されている。ｒＬＡ２１２のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列は配列番号４７（図６２）に、ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列は配列番号４８（図６３）に、ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列は配列番号４９（図６４）に、ＣＤＲＬ１のアミノ酸配列は配列番号５０（図６５）に、ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列は配列番号５１（図６６）に、ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列は配列番号５２（図６７）にそれぞれ記載されている。

【0071】

ｒＬＡ２２５は実施例１に記載の方法により得られた抗ヒトＬＡＧ－３ラットモノクローナル抗体である。ｒＬＡ２２５の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号９（図２４）に、アミノ酸配列は配列番号１０（図２５）に記載されている。ｒＬＡ２２５の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号１１（図２６）に、アミノ酸配列は配列番号１２（図２７）に記載されている。ｒＬＡ２２５のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列は配列番号５３（図６８）に、ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列は配列番号５４（図６９）に、ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列は配列番号５５（図７０）に、ＣＤＲＬ１のアミノ酸配列は配列番号５６（図７１）に、ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列は配列番号５７（図７２）に、ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列は配列番号５８（図７３）に記載されている。

【0072】

ｒＬＡ８６９は実施例１に記載の方法により得られた抗ヒトＬＡＧ－３ラットモノクローナル抗体である。ｒＬＡ８６９の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号１３（図２８）に、アミノ酸配列は配列番号１４（図２９）に記載されている。ｒＬＡ８６９の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号１５（図３０）に、アミノ酸配列は配列番号１６（図３１）に記載されている。ｒＬＡ８６９のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列は配列番号５９（図７４）に、ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列は配列番号６０（図７５）に、ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列は配列番号６１（図７６）に、ＣＤＲＬ１のアミノ酸配列は配列番号６２（図７７）に、ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列は配列番号６３（図７８）に、ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列は配列番号６４（図７９）に記載されている。

【0073】

ｒＬＡ１２６４は実施例１に記載の方法により得られた抗ヒトＬＡＧ－３ラットモノクローナル抗体である。ｒＬＡ１２６４の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号１７（図３２）に、アミノ酸配列は配列番号１８（図３３）に記載されている。ｒＬＡ１２６４の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号１９（図３４）に、アミノ酸配列は配列番号２０（図３５）に記載されている。ｒＬＡ１２６４のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列は配列番号６５（図８０）に、ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列は配列番号６６（図８１）に、ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列は配列番号６７（図８２）に、ＣＤＲＬ１のアミノ酸配列は配列番号６８（図８３）に、ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列は配列番号６９（図８４）に、ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列は配列番号７０（図８５）に記載されている。

【0074】

他の抗ヒトＬＡＧ－３モノクローナル抗体としては、抗ヒトＬＡＧ－３マウス抗体Ａ９Ｈ１２（ＷＯ２００８／１３２６０１参照）等を例示することができる。

【0075】

本発明において、抗体変異体には、好適には、蛋白質の分解もしくは酸化に対する感受性の低下、生物活性の改善、抗原結合能の改善、又は理化学的性質もしくは機能的性質の付与等がなされている。そのような抗体変異体の例として、抗体の有するアミノ酸配列において１又は２以上、好適には１乃至数個のアミノ酸が保存的アミノ酸置換されたアミノ酸配列を有する抗体をあげることができる。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸側鎖に関連のあるアミノ酸グループ内で生じる置換である。

【0076】

好適なアミノ酸グループは、以下のとおりである：酸性グループ＝アスパギン酸、グルタミン酸；塩基性グループ＝リジン、アルギニン、ヒスチジン；非極性グループ＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および非帯電極性ファミリー＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。他の好適なアミノ酸グループは次のとおりである：脂肪族ヒドロキシグループ＝セリン及びスレオニン；アミド含有グループ＝アスパラギン及びグルタミン；脂肪族グループ＝アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；並びに芳香族グループ＝フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン。かかる抗体変異体におけるアミノ酸置換は、元（親）の抗体が有する抗原結合活性を低下させない範囲で行うのが好ましい。

【0077】

蛋白質中に含まれるアスパラギン酸は、そのＣ末側に連結するアミノ酸が小さい側鎖を有する場合は異性化によりイソアスパラギン酸に変換され易く、一方で、アスパラギンの場合は脱アミド化によりアスパラギン酸に変換され易く、さらに異性化によりイソアスパラギン酸に変換される可能性がある。そのような異性化や脱アミド化が進めば、蛋白質の安定性に影響が生じ得る。そこで、かかる異性化や脱アミド化を回避するために、蛋白質中のアスパラギン酸やアスパラギンあるいはそれらに隣接するアミノ酸等を他のアミノ酸で置換することができる。かかるアミノ酸置換がなされた抗体変異体は、元の抗体が有する抗原結合活性を保持していることが好ましい。

【0078】

本発明のｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９、ｒＬＡ１２６４又はＡ９Ｈ１２が有するアミノ酸配列において保守的アミノ酸置換がなされたアミノ酸配列を有する抗体変異体、ならびに、ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９、ＬＡ１２６４又はＡ９Ｈ１２は由来のＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３及びＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３のいずれかのアミノ酸配列において保守的アミノ酸変異がなされたアミノ酸配列を有する該ＣＤＲを含むマウス抗体、ラット抗体、キメラ化抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体等も本発明に包含される。

【0079】

本発明のｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９、ｒＬＡ１２６４又はＡ９Ｈ１２由来のＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３及びＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３のいずれか１つ又は２つ以上のアミノ酸配列において１乃至数個、好適には１乃至３個、より好適には１又は２個、最適には１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されてなるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３及びＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３を含む抗体の変異体であって、且つヒトＬＡＧ－３に結合するものは、本発明における抗体の変異体に包含される。
また、複数の抗体に由来するＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３を有する抗体も、抗体変異体に含まれる。そのような変異体の例として、ＣＤＲＨ３のみある抗体に由来し、ＣＤＲＨ１及びＣＤＲＨ２ならびにＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３は別の抗体に由来する抗体変異体をあげることができる。
本発明においては抗体変異体も「抗体」に包含される。
本発明における抗体の定常領域としては、特に限定されるものではないが、細胞傷害性Ｔ細胞枯渇のためのＬＡＧ－３抗体としては、好適にはヒト抗体のものが使用される。ヒト抗体の重鎖定常領域としては、例えば、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４、Ｃμ、Ｃδ、Ｃα１、Ｃα２、Ｃε等をあげることができる。ヒト抗体の軽鎖定常領域としては、例えば、Ｃκ、Ｃλ等をあげることができる。

【0080】

（３－１０）キメラ抗体
本発明に使用される抗ＬＡＧ－３キメラ化抗体又はその結合断片は、（３－２）および（３－３）、好適にはそれらに加えて（３－４）、より好適にはそれらに加えて（３－５）、より一層好適には（３－２）乃至（３－８）全て、に記載の性質、機能、活性等をそれぞれ有する。
本発明のラット－ヒトキメラ化抗体として例示されるｃＬＡ２１２の重鎖ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列ならびに軽鎖ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、配列番号２３、２４、２５及び２６（図３８、３９、４０及び４１）にそれぞれ示される。重鎖のヌクレオチド配列におけるヌクレオチド番号１乃至５７、ならびに、重鎖のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号１乃至１９は、シグナル配列であり、通常大部分の成熟重鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列にはそれぞれ含まれない。同様に、軽鎖のヌクレオチド配列におけるヌクレオチド番号１乃至６０、ならびに、軽鎖のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号１乃至２０は、シグナル配列であり、通常大部分の成熟軽鎖のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列にはそれぞれ含まれない。

【0081】

ラット－ヒトキメラ抗体であるｃＬＡ２０４、ｃＬＡ２２５、ｃＬＡ８６９及びｃＬＡ１２６４については他の箇所に記載されている。

【0082】

本発明の他のキメラ抗体としては、抗ヒトＬＡＧ－３マウス抗体Ａ９Ｈ１２のマウス－ヒト・キメラ体であるＩＭＰ７３１（キメラ型Ａ９Ｈ１２：ＷＯ２００８／１３２６０１参照）等を例示することができる。

【0083】

（３－１１）抗体の結合断片
本発明に使用される抗体は一つの態様として、抗ＬＡＧ－３抗体の結合断片であってよい。抗体の結合断片とは、該抗体の有する機能の少なくとも一部を保持する断片を意味する。かかる抗体の機能としては、一般的には、抗原結合活性、抗原の活性を調節する活性、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性等を挙げることができる。本発明に使用される好適な抗ＬＡＧ－３抗体の結合断片は、（３－２）および（３－３）、好適にはそれらに加えて（３－４）、より好適にはそれらに加えて（３－５）、より一層好適には（３－２）乃至（３－８）全て、に記載の性質、機能、活性等をそれぞれ有する。
抗体の結合断片としては、該抗体の有する活性の少なくとも一部を保持している該抗体の断片であれば特に限定されないが、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、重鎖及び軽鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）、ｄｉａｂｏｄｙ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、線状抗体、及び抗体断片より形成された多特異性抗体、Ｆ（ａｂ’）２を還元条件下で処理した抗体の可変領域の一価の断片であるＦａｂ’等をあげることができるが、それらに限定されるものではない。リンカー部分を保有するｓｃＦｖのように、抗体の断片以外の部分を含む分子も、抗体の結合断片の意味に包含される。

【0084】

抗体蛋白質のアミノ末端及び／又はカルボキシ末端のアミノ酸が１乃至数個又はそれ以上を欠失してなり、且つ該抗体の有する機能の少なくとも一部を保持している分子も、抗体の結合断片の意味に包含される。例えば、哺乳類培養細胞で生産される抗体の重鎖のカルボキシル末端のリジン残基が欠失することが知られており（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，７０５：１２９－１３４（１９９５））、また、同じく重鎖カルボキシル末端のグリシン、リジンの２アミノ酸残基が欠失し、新たにカルボキシル末端に位置するプロリン残基がアミド化されることが知られている（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６０：７５－８３（２００７））。しかし、これらの重鎖配列の欠失及び修飾は、抗体の抗原結合能及びエフェクター機能（補体の活性化や抗体依存性細胞傷害作用など）には影響を及ぼさない。そのような抗体の結合断片の修飾体も、抗体もしくはその結合断片、又はその修飾体（後述）に包含される。

【0085】

本発明において、抗体又はその結合断片は、少なくとも２種類の異なる抗原に対して特異性を有する多特異性抗体であってもよい。多特異性抗体は、２種類の異なる抗原に結合する二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）に限定されず、３種以上の異なる抗原に対して特異性を有する抗体も本発明の「多特異性抗体」の意味に包含される。

【0086】

本発明の多特異性抗体は、全長抗体又はその結合断片であってもよい（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）。二重特異性抗体は２種類の抗体の重鎖と軽鎖（ＨＬ対）を結合させて作製することもできる。また、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを２種類以上融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製することによっても、得ることができる（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８３）３０５，ｐ．５３７－５３９）。多特異的抗体も同様の方法により調製することができる。

【0087】

本発明におけるＬＡＧ－３抗体の一つの態様は、一本鎖抗体（以下、「ｓｃＦｖ」という）である。ｓｃＦｖは、抗体の重鎖Ｖ領域と軽鎖Ｖ領域とをポリペプチドのリンカーで連結することにより得られる（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ．２６９－３１５（１９９４）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５），２３，ｐ．１１２６－１１３６）。また、２つのｓｃＦｖをポリペプチドリンカーで結合させて作製されるＢｉｓｃＦｖを二重特異性抗体として使用することができる。さらに３つ以上のｓｃＦｖよりＭｕｌｔｉｓｃＦｖも多特異性抗体として使用することができる。

【0088】

本発明では、抗体の重鎖及び軽鎖の全長配列を適切なリンカーを用いて連結した一本鎖イムノグロブリン（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）が含まれる（Ｌｅｅ，Ｈ－Ｓ，ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９９）３６，ｐ．６１－７１；Ｓｈｉｒｒｍａｎｎ，Ｔ．ｅｔ．ａｌ．，ｍＡｂｓ（２０１０），２，（１）ｐ．１－４）。このような一本鎖イムノグロブリンは二量体化することによって、本来は四量体である抗体と類似した構造と活性を保持することが可能である。また、本発明において、抗体は、単一の重鎖可変領域を有し、軽鎖配列を有さない抗体であってもよい。このような抗体は、単一ドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｓｄＡｂ）又はナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）と呼ばれており、抗原結合能が保持されていることが報告されている（Ｍｕｙｌｄｅｍａｎｓ Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．（１９９４）７（９），１１２９－３５，Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ Ｃ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９３）３６３（６４２８）４４６－８）。これらの抗体も、抗体の機能性断片の意味に包含される。

【0089】

（３－１２）ヒト化抗体およびヒト抗体
本発明はその一つの態様において、ヒト化抗体又はその結合断片を提供する。

【0090】

本発明に使用される好適なヒト化抗ＬＡＧ－３抗体又はその結合断片は、（３－２）および（３－３）、好適にはそれらに加えて（３－４）、より好適にはそれらに加えて（３－５）、より一層好適には（３－２）乃至（３－８）全て、に記載の性質、機能、活性等をそれぞれ有する。

【0091】

本発明に使用される好適なヒト化抗体の例としては、以下のＡ乃至Ｆに記載するように、ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９、ｒＬＡ１２６４、Ａ９Ｈ１２又はＨ５Ｌ７の重鎖のＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３および軽鎖のＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３を有するヒト化抗体等をあげることができる。

【0092】

（Ａ．ｒＬＡ２０４抗体の重鎖のＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３および軽鎖のＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３を有するヒト化抗体）
本発明のヒト化抗ＬＡＧ－３抗体又はその結合断片としては、例えば、配列番号４１（図５６）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号４２（図５７）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号４３（図５８）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む可変領域を有する重鎖、並びに、配列番号４４（図５９）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号４５（図６０）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号４６（図６１）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む可変領域を有する軽鎖からなり、ＬＡＧ－３蛋白質を認識するヒト化抗体もしくはその結合断片、またはその変異体等をあげることができる。

【0093】

（Ｂ．ｒＬＡ２１２抗体の重鎖のＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３および軽鎖のＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３を有するヒト化抗体）
また、他のヒト化抗ＬＡＧ－３抗体又はその結合断片としては、例えば、配列番号４７（図６２）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号４８（図６３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号４９（図６４）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む可変領域を有する重鎖、並びに、配列番号５０（図６５）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５１（図６６）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号５２（図６７）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む可変領域を有する軽鎖からなり、ＬＡＧ－３蛋白質を認識するヒト化抗体もしくはその結合断片、またはその変異体等をあげることができる。

【0094】

（Ｃ．ｒＬＡ２２５抗体の重鎖のＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３および軽鎖のＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３を有するヒト化抗体）
さらに、他のヒト化抗ＬＡＧ－３抗体又はその結合断片としては、例えば、配列番号５３（図６８）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号５４（図６９）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号５５（図７０）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む可変領域を有する重鎖、並びに、配列番号５６（図７１）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５７（図７２）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号５８（図７３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む可変領域を有する軽鎖からなり、ＬＡＧ－３蛋白質を認識するヒト化抗体もしくはその結合断片、またはその変異体等をあげることができる。

【0095】

（Ｄ．ｒＬＡ８６９抗体の重鎖のＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３および軽鎖のＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３を有するヒト化抗体）
さらに、他のヒト化抗ＬＡＧ－３抗体又はその結合断片としては、例えば、配列番号５９（図７４）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号６０（図７５）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号６１（図７６）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む可変領域を有する重鎖、並びに、配列番号６２（図７７）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号６３（図７８）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号６４（図７９）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む可変領域を有する軽鎖からなり、ＬＡＧ－３蛋白質を認識するヒト化抗体もしくはその結合断片、またはその変異体等をあげることができる。

【0096】

（Ｅ．ｒＬＡ１２６４抗体の重鎖のＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３および軽鎖のＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３を有するヒト化抗体）
さらに、他のヒト化抗ＬＡＧ－３抗体又はその結合断片としては、例えば、配列番号６５（図８０）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号６６（図８１）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号６７（図８２）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む可変領域を有する重鎖、並びに、配列番号６８（図８３）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号６９（図８４）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号７０（図８５）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む可変領域を有する軽鎖からなり、ＬＡＧ－３蛋白質を認識するヒト化抗体もしくはその結合断片、またはその変異体等をあげることができる。

【0097】

（Ｆ．Ａ９Ｈ１２抗体又はＨ５Ｌ７抗体の重鎖のＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３および軽鎖のＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３を有するヒト化抗体）
Ａ９Ｈ１２抗体又はＨ５Ｌ７抗体に含まれるＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３を含み、ＬＡＧ－３蛋白質を認識するヒト化抗体もしくはその結合断片、またはその変異体等をあげることができる。

【0098】

本発明に使用される好適なヒト化抗体には、上記Ａ乃至Ｆ記載のものが含まれ、より好適なヒト化抗体の例としてはｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ１乃至ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ５、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ１乃至ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ５及びｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２（下の［ｉ］乃至［ｘ］参照）並びにＩＭＰ７３１のヒト化体であるＨ５Ｌ７、Ｈ１Ｌ７、Ｊ７Ｌ７、Ｈ４Ｌ７、Ｊ１１Ｌ７、Ｈ２Ｌ７、Ｊ１３Ｌ７、Ｈ７Ｌ７、Ｊ０Ｌ７、Ｈ０Ｌ７及びＨ５Ｌ７ＢＷ（特許文献２）等を挙げることができるが、それらに限定されるものではなく、例えば、ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ１乃至ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ５、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ１乃至ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ５、ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２、Ｈ５Ｌ７及びＨ５Ｌ７ＢＷのいずれか一つのヒト化抗体の重鎖可変領域を含む重鎖、ならびに、ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ１乃至ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ５、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ１乃至ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ５、ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２、Ｈ５Ｌ７及びＨ５Ｌ７ＢＷのいずれか一つのヒト化抗体の軽鎖可変領域を含む軽鎖、を含んでなる抗体も、本発明に使用されるより好適なヒト化抗体に含まれる。

【0099】

［ｉ］
［ｉの１］ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ２は実施例６において得られたヒト化抗体である。当該抗体の重鎖のヌクレオチド配列は配列番号２９（図４４）のヌクレオチド番号５８乃至１４１０（うち可変領域は５８乃至４２０）を、アミノ酸配列は配列番号３０（図４５）のアミノ酸番号２０乃至４７０（うち可変領域は２０乃至１４０）を、軽鎖のヌクレオチド配列は配列番号３３（図４８）のヌクレオチド番号６１乃至７０２（うち可変領域は６１乃至３８７）を、アミノ酸配列は配列番号３４（図４９）のアミノ酸番号２１乃至２３４（うち可変領域は２１乃至１２９）を、それぞれ含んでいる。該抗体は本発明の細胞傷害性Ｔ細胞枯渇用組成物、細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患の治療又は予防の方法、治療又は予防のための使用等に適した物性（データ示さず）、（３－２）、及び（３－３）記載のＬＡＧ－３結合活性及びイン・ビトロＡＤＣＣ活性を有し且つ（３－８）記載の性質すなわち該抗体存在下でヒトＬＡＧ－３はヒトＴ細胞抑制機能を奏し（実施例参照）、（３－４）乃至（３－７）記載の活性、性質等を有していることは、例えば、実施例記載の方法により評価することができる。

【0100】

［ｉの２］ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２は、実施例８において得られた、糖鎖修飾が調節されたヒト化抗体であり、低フコース形態にあるｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ２の一つである。当該抗体の重鎖のヌクレオチド配列は配列番号２９（図４４）のヌクレオチド番号５８乃至１４１０（うち可変領域は５８乃至４２０）を、アミノ酸配列は配列番号３０（図４５）のアミノ酸番号２０乃至４７０（うち可変領域は２０乃至１４０）を、軽鎖のヌクレオチド配列は配列番号３３（図４８）のヌクレオチド番号６１乃至７０２（うち可変領域は６１乃至３８７）を、アミノ酸配列は配列番号３４（図４９）のアミノ酸番号２１乃至２３４（うち可変領域は２１乃至１２９）を、それぞれ含んでいる。該抗体は本発明の細胞傷害性Ｔ細胞枯渇用組成物、細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患の治療又は予防の方法、治療又は予防のための使用等に適した物性（データ示さず）、（３－２）乃至（３－６）記載のＬＡＧ－３結合活性、イン・ビトロＡＤＣＣ活性、ＬＡＧ３－陽性細胞数低減活性、実験的自己免疫性脳脊髄炎抑制活性及びヒト活性化Ｔ細胞結合活性を有し且つ（３－７）記載の性質すなわち該抗体の存在下でヒトＬＡＧ－３とヒトＭＨＣクラスＩＩ分子は結合し（実施例参照）、（３－８）記載の性質すなわち該抗体存在下でヒトＬＡＧ－３はヒトＴ細胞抑制機能を奏することは、例えば、実施例記載の方法により評価することができる。

【0101】

［ｉｉ］ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ１は実施例６において得られたヒト化抗体である。当該抗体の重鎖のヌクレオチド配列は配列番号２７（図４２）のヌクレオチド番号５８乃至１４１０（うち可変領域は５８乃至４２０）を、アミノ酸配列は配列番号２８（図４３）のアミノ酸番号２０乃至４７０（うち可変領域は２０乃至１４０）を、軽鎖のヌクレオチド配列は配列番号３１（図４６）のヌクレオチド番号６１乃至７０２（うち可変領域は６１乃至３８７）を、アミノ酸配列は配列番号３２（図４７）のアミノ酸番号２１乃至２３４（うち可変領域は２１乃至１２９）を、それぞれ含んでいる。該抗体は本発明の組成物、治療又は予防等に適した物性（データ示さず）、（３－２）及び（３－３）記載のＬＡＧ－３結合活性及びイン・ビトロＡＤＣＣ活性を有し（実施例参照）、（３－４）乃至（３－８）記載の活性、性質等を有していることは、例えば、実施例記載の方法により評価することができる。

【0102】

［ｉｉｉ］ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ３は実施例６において得られたヒト化抗体である。当該抗体の重鎖のヌクレオチド配列は配列番号２９（図４４）のヌクレオチド番号５８乃至１４１０（うち可変領域は５８乃至４２０）を、アミノ酸配列は配列番号３０（図４５）のアミノ酸番号２０乃至４７０（うち可変領域は２０乃至１４０）を、軽鎖のヌクレオチド配列は配列番号３５（図５０）のヌクレオチド番号６１乃至７０２（うち可変領域は６１乃至３８７）を、アミノ酸配列は配列番号３６（図５１）のアミノ酸番号２１乃至２３４（うち可変領域は２１乃至１２９）を、それぞれ含んでいる。該抗体は本発明の組成物、治療又は予防等に適した物性（データ示さず）、（３－２）及び（３－３）記載のＬＡＧ－３結合活性及びイン・ビトロＡＤＣＣ活性を有し（実施例参照）、（３－４）乃至（３－８）記載の活性、性質等を有していることは、例えば、実施例記載の方法により評価することができる。

【0103】

［ｉｖ］ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ２は実施例６において得られたヒト化抗体である。当該抗体の重鎖のヌクレオチド配列は配列番号２７（図４２）のヌクレオチド番号５８乃至１４１０（うち可変領域は５８乃至４２０）を、アミノ酸配列は配列番号２８（図４３）のアミノ酸番号２０乃至４７０（うち可変領域は２０乃至１４０）を、軽鎖のヌクレオチド配列は配列番号３３（図４８）のヌクレオチド番号６１乃至７０２（うち可変領域は６１乃至３８７）を、アミノ酸配列は配列番号３４（図４９）のアミノ酸番号２１乃至２３４（うち可変領域は２１乃至１２９）を、それぞれ含んでいる。該抗体は本発明の組成物、治療又は予防等に適した物性（データ示さず）、（３－２）及び（３－３）記載のＬＡＧ－３結合活性及びイン・ビトロＡＤＣＣ活性を有し（実施例参照）、（３－４）乃至（３－８）記載の活性、性質等を有していることは、例えば、実施例記載の方法により評価することができる。

【0104】

［ｖ］ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ３は実施例６において得られたヒト化抗体である。当該抗体の重鎖のヌクレオチド配列は配列番号２７（図４２）のヌクレオチド番号５８乃至１４１０（うち可変領域は５８乃至４２０）を、アミノ酸配列は配列番号２８（図４３）のアミノ酸番号２０乃至４７０（うち可変領域は２０乃至１４０）を、軽鎖のヌクレオチド配列は配列番号３５（図５０）のヌクレオチド番号６１乃至７０２（うち可変領域は６１乃至３８７）を、アミノ酸配列は配列番号３６（図５１）のアミノ酸番号２１乃至２３４（うち可変領域は２１乃至１２９）を、それぞれ含んでいる。該抗体は本発明の組成物、治療又は予防等に適した物性（データ示さず）、（３－２）及び（３－３）記載のＬＡＧ－３結合活性及びイン・ビトロＡＤＣＣ活性を有し（実施例参照）、（３－４）乃至（３－８）記載の活性、性質等を有していることは、例えば、実施例記載の方法により評価することができる。

【0105】

［ｖｉ］ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ４は実施例６において得られたヒト化抗体である。当該抗体の重鎖のヌクレオチド配列は配列番号２７（図４２）のヌクレオチド番号５８乃至１４１０（うち可変領域は５８乃至４２０）を、アミノ酸配列は配列番号２８（図４３）のアミノ酸番号２０乃至４７０（うち可変領域は２０乃至１４０）を、軽鎖のヌクレオチド配列は配列番号３７（図５２）のヌクレオチド番号６１乃至７０２（うち可変領域は６１乃至３８７）を、アミノ酸配列は配列番号３８（図５３）のアミノ酸番号２１乃至２３４（うち可変領域は２１乃至１２９）を、それぞれ含んでいる。該抗体は本発明の組成物、治療又は予防等に適した物性（データ示さず）、（３－２）及び（３－３）記載のＬＡＧ－３結合活性及びイン・ビトロＡＤＣＣ活性を有し（実施例参照）、（３－４）乃至（３－８）記載の活性、性質等を有していることは、例えば、実施例記載の方法により評価することができる。

【0106】

［ｖｉｉ］ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ５は実施例６において得られたヒト化抗体である。当該抗体の重鎖のヌクレオチド配列は配列番号２７（図４２）のヌクレオチド番号５８乃至１４１０（うち可変領域は５８乃至４２０）を、アミノ酸配列は配列番号２８（図４３）のアミノ酸番号２０乃至４７０（うち可変領域は２０乃至１４０）を、軽鎖のヌクレオチド配列は配列番号３９（図５４）のヌクレオチド番号６１乃至７０２（うち可変領域は６１乃至３８７）を、アミノ酸配列は配列番号４０（図５５）のアミノ酸番号２１乃至２３４（うち可変領域は２１乃至１２９）を、それぞれ含んでいる。該抗体は本発明の組成物、治療又は予防等に適した物性（データ示さず）、（３－２）及び（３－３）記載のＬＡＧ－３結合活性及びイン・ビトロＡＤＣＣ活性を有し（実施例参照）、（３－４）乃至（３－８）記載の活性、性質等を有していることは、例えば、実施例記載の方法により評価することができる。

【0107】

［ｖｉｉｉ］ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ１は実施例６において得られたヒト化抗体である。当該抗体の重鎖のヌクレオチド配列は配列番号２９（図４４）のヌクレオチド番号５８乃至１４１０（うち可変領域は５８乃至４２０）を、アミノ酸配列は配列番号３０（図４５）のアミノ酸番号２０乃至４７０（うち可変領域は２０乃至１４０）を、軽鎖のヌクレオチド配列は配列番号３１（図４６）のヌクレオチド番号６１乃至７０２（うち可変領域は６１乃至３８７）を、アミノ酸配列は配列番号３２（図４７）のアミノ酸番号２１乃至２３４（うち可変領域は２１乃至１２９）を、それぞれ含んでいる。該抗体は本発明の組成物、治療又は予防等に適した物性（データ示さず）、（３－２）及び（３－３）記載のＬＡＧ－３結合活性及びイン・ビトロＡＤＣＣ活性を有し（実施例参照）、（３－４）乃至（３－８）記載の活性、性質等を有していることは、例えば、実施例記載の方法により評価することができる。

【0108】

［ｉｘ］ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ４は実施例６において得られたヒト化抗体である。当該抗体の重鎖のヌクレオチド配列は配列番号２９（図４４）のヌクレオチド番号５８乃至１４１０（うち可変領域は５８乃至４２０）を、アミノ酸配列は配列番号３０（図４５）のアミノ酸番号２０乃至４７０（うち可変領域は２０乃至１４０）を、軽鎖のヌクレオチド配列は配列番号３７（図５２）のヌクレオチド番号６１乃至７０２（うち可変領域は６１乃至３８７）を、アミノ酸配列は配列番号３８（図５３）のアミノ酸番号２１乃至２３４（うち可変領域は２１乃至１２９）を、それぞれ含んでいる。該抗体は本発明の組成物、治療又は予防等に適した物性（データ示さず）、（３－２）及び（３－３）記載のＬＡＧ－３結合活性及びイン・ビトロＡＤＣＣ活性を有し（実施例参照）、（３－４）乃至（３－８）記載の活性、性質等を有していることは、例えば、実施例記載の方法により評価することができる。

【0109】

［ｘ］ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ５は実施例６において得られたヒト化抗体である。当該抗体の重鎖のヌクレオチド配列は配列番号２９（図４４）のヌクレオチド番号５８乃至１４１０（うち可変領域は５８乃至４２０）を、アミノ酸配列は配列番号３０（図４５）のアミノ酸番号２０乃至４７０（うち可変領域は２０乃至１４０）を、軽鎖のヌクレオチド配列は配列番号３９（図５４）のヌクレオチド番号６１乃至７０２（うち可変領域は６１乃至３８７）を、アミノ酸配列は配列番号４０（図５５）のアミノ酸番号２１乃至２３４（うち可変領域は２１乃至１２９）を、それぞれ含んでいる。該抗体は本発明の組成物、治療又は予防等に適した物性（データ示さず）、（３－２）及び（３－３）記載のＬＡＧ３－結合活性及びイン・ビトロＡＤＣＣ活性を有し（実施例参照）、（３－４）乃至（３－８）記載の活性、性質等を有していることは、例えば、実施例記載の方法により評価することができる。

【0110】

上記［ｉ］乃至［ｘ］等において、（３－４）及び（３－５）記載の活性は、好適には低フコース形態において評価することができる。
本発明において「物性」とは、本発明に使用される抗体及びその結合断片等のモノとしての安定性を意味し、公知の指標を用いて評価することができる。モノとしての安定性として熱安定性、保存安定性等をあげることができ、それらの指標としてはサーモグラムから導き出されるＴｍ値、保存条件下又は加速劣化条件下での抗原結合活性の変化又は経時的変化等をあげることができる。

【0111】

また、ｈＬＡ２１２抗体＿Ｈ４／Ｌ２を実施例１０のヒトＬＡＧ－３／ヒトＦｃγＲＩＩＩＡダブルトランスジェニックマウスに単回投与したところ、体重減少、その他の顕著な毒性所見は認められなかった。このように本発明に使用される抗体は、細胞傷害性Ｔ細胞枯渇、細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患（他の箇所で定義されている）の治療または予防等に適した安全性を具備していることが望ましい。
上述の、本発明に使用される好適なヒト化抗ＬＡＧ－３抗体及びその結合断片のうち、より一層好適なものはｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ２、ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ１、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ３、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ６、ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２、Ｈ５Ｌ７およびＨ５Ｌ７ＢＷである。

【0112】

本発明に使用されるより好適なヒト化抗ＬＡＧ－３抗体の範囲に含まれるｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ１乃至Ｈ２／Ｌ５、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ１乃至Ｈ３／Ｌ５、ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２、Ｈ５Ｌ７及びＨ５Ｌ７ＢＷ等は、重鎖のアミノ酸配列のうちＦＲＬ１乃至ＦＲＬ４において、１乃至数個、好適には１又は２個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列からなる重鎖、並びに、軽鎖のアミノ酸配列のうちＦＲＨ１乃至ＦＲＨ４において、１個以上、好適には１乃至１４個のうち任意の個数のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列からなる軽鎖、を含むことができる。

【0113】

かかるヒト化抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ１乃至Ｈ２／Ｌ５、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ１乃至Ｈ３／Ｌ５、ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２等のより好適な軽鎖においては、ＦＲＬ１の第１番アミノ酸すなわち成熟可変領域の第１番アミノ酸（配列番号３２又は図４７の第２１番の位置に相当するアミノ酸）がＡｓｐ又はＡｓｎであり、ＦＲＬ１の第１１番アミノ酸すなわち成熟可変領域の第１１番アミノ酸（配列番号３２又は図４７の第３１番の位置に相当するアミノ酸）がＬｅｕ又はＭｅｔであり、ＦＲＬ１の第１３番アミノ酸すなわち成熟可変領域の第１３番アミノ酸（配列番号３２又は図４７の第３３番の位置に相当するアミノ酸）がＡｌａ又はＩｌｅであり、ＦＲＬ１の第２１番アミノ酸すなわち成熟可変領域の第２１番アミノ酸（配列番号３２又は図４７の第４１番の位置に相当するアミノ酸）がＩｌｅ又はＭｅｔであり、ＦＲＬ２の第４番アミノ酸すなわち成熟可変領域の第３８番アミノ酸（配列番号３２又は図４７の第５８番の位置に相当するアミノ酸）がＧｌｎ又はＬｙｓであり、ＦＲＬ２の第９番アミノ酸すなわち成熟可変領域の第４３番アミノ酸（配列番号３２又は図４７の第６３番の位置に相当するアミノ酸）がＡｌａ又はＳｅｒであり、ＦＲＬ３の第４番アミノ酸すなわち成熟可変領域の第６０番アミノ酸（配列番号３２又は図４７の第８０番の位置に相当するアミノ酸）がＳｅｒ又はＡｓｐであり、ＦＲＬ３の第９番アミノ酸すなわち成熟可変領域の第６５番アミノ酸（配列番号３２又は図４７の第８５番の位置に相当するアミノ酸）がＳｅｒ又はＧｌｙであり、ＦＲＬ３の第１１番アミノ酸すなわち成熟可変領域の第６７番アミノ酸（配列番号３２又は図４７の第８７番の位置に相当するアミノ酸）がＳｅｒ又はＴｙｒであり、ＦＲＬ３の第２２番アミノ酸すなわち成熟可変領域の第７８番アミノ酸（配列番号３２又は図４７の第９８番の位置に相当するアミノ酸）がＬｅｕ又はＶａｌであり、ＦＲＬ３の第２７番アミノ酸すなわち成熟可変領域の第８３番アミノ酸（配列番号３２又は図４７の第１０３番の位置に相当するアミノ酸）がＰｈｅ又はＡｌａであり、ＦＲＬ３の第２９番アミノ酸すなわち成熟可変領域の第８５番アミノ酸（配列番号３２又は図４７の第１０５番の位置に相当するアミノ酸）がＴｈｒ又はＰｈｅであり、ＦＲＬ４の第７番アミノ酸すなわち成熟可変領域の第１０４番アミノ酸（配列番号３２又は図４７の第１２４番の位置に相当するアミノ酸）がＶａｌ又はＬｅｕであり、ＦＲＬ４の第９番アミノ酸すなわち成熟可変領域の第１０６番アミノ酸（配列番号３２又は図４７の第１２６番の位置に相当するアミノ酸）がＩｌｅ又はＬｅｕである。

【0114】

かかるヒト化抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ１乃至Ｈ２／Ｌ５、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ１乃至Ｈ３／Ｌ５、ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２等のより好適な重鎖においては、ＦＲＨ２の第１４番アミノ酸すなわち成熟可変領域の第４９番アミノ酸（配列番号２８又は図４３の第６８番の位置に相当するアミノ酸）がＧｌｙ又はＡｌａであり、ＦＲＨ３の第２５番アミノ酸すなわち成熟可変領域の第８４番アミノ酸（配列番号２８又は図４３の第１０３番の位置に相当するアミノ酸）がＡｓｎ又はＡｓｐである。

【0115】

本発明のｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９、ｒＬＡ１２６４、ｃＬＡ２０４、ｃＬＡ２１２、ｃＬＡ２２５、ｃＬＡ８６９、ｒＬＡ１２６４及びＡ９Ｈ１２、並びに、ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ１乃至ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ５、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ１乃至ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ５、ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２、Ｈ５Ｌ７及びＨ５Ｌ７ＢＷのいずれか一つに記載の抗体の重鎖及び／又は軽鎖の全長又は可変領域のアミノ酸配列とそれぞれ８０％以上、８２％以上、８４％以上、８６％以上、８８％以上、９０％以上、９２％以上、９４％以上、９６％以上、９８％以上又は９９％以上の同一なアミノ酸配列を含む重鎖及び／又は軽鎖を含み、且つＬＡＧ－３に結合する抗体又はその結合断片も、本発明に包含される。かかる配列同一性は、好適には９４％以上、より好適には９６％以上、より一層好適には９８％以上、最適には９９％以上である。また、それらの抗体又はその結合断片は、（３－２）および（３－３）、好適にはそれらに加えて（３－４）、より好適にはそれらに加えて（３－５）、より一層好適には（３－２）乃至（３－８）全て、に記載の性質、機能、活性等をそれぞれ有する。

【0116】

二種類のアミノ酸配列間の同一性あるいは相同性は、Ｂｌａｓｔ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．２．２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，Ａｌｅｊａｎｄｒｏ Ａ．Ｓｃｈaｆｆｅｒ， Ｊｉｎｇｈｕｉ Ｚｈａｎｇ， Ｚｈｅｎｇ Ｚｈａｎｇ， Ｗｅｂｂ Ｍｉｌｌｅｒ， ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９９７），「Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２）のデフォルトパラメーターを使用することによって決定することができる。Ｂｌａｓｔ ａｌｇｏｒｉｔｈｍは、例えば、インターネットでhttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/にアクセスすることによっても使用することができる。

【0117】

本発明のｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９、ｒＬＡ１２６４、ｃＬＡ２０４、ｃＬＡ２１２、ｃＬＡ２２５、ｃＬＡ８６９、ｃＬＡ１２６４及びＡ９Ｈ１２、並びに、ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ１乃至ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ５、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ１乃至ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ５、ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２、Ｈ５Ｌ７及びＨ５Ｌ７ＢＷのいずれか一つに記載の抗体の重鎖及び／又は軽鎖の全長又は可変領域のアミノ酸配列においてそれぞれ１乃至５０個、１乃至４５個、１乃至４０個、１乃至３５個、１乃至３０個、１乃至２５個、１乃至２０個、１乃至１５個、１乃至１０個、１乃至８個、１乃至６個、１乃至５個、１乃至４個、１乃至３個、１若しくは２個、または１個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入してなるアミノ酸配列を含む重鎖及び／又は軽鎖を含み、且つＬＡＧ－３に結合する抗体又はその結合断片も、本発明に包含される。かかるアミノ酸変異は好適には置換であり、変異されるアミノ酸の個数は好適には１乃至５個、より好適には１乃至４個、より一層好適には１乃至３個、さらにより一層好適には１乃至２個、最適には１個である。また、それらの抗体又はその結合断片は、（３－２）、および（３－３）、好適にはそれらに加えて（３－４）、より好適にはそれらに加えて（３－５）、より一層好適には（３－２）乃至（３－８）全て、に記載の性質、機能、活性等をそれぞれ有する。

【0118】

本発明のｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９、ｒＬＡ１２６４、ｃＬＡ２０４、ｃＬＡ２１２、ｃＬＡ２２５、ｃＬＡ８６９、ｃＬＡ１２６４及びＡ９Ｈ１２、並びに、ｈｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ１乃至ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ５、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ１乃至ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ５、ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２、Ｈ５Ｌ７及びＨ５Ｌ７ＢＷのいずれか一つに記載の抗体の重鎖及び／又は軽鎖の全長又は可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するヌクレオチドとそれぞれストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチドの有するヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む重鎖及び／又は軽鎖を含み、且つＬＡＧ－３に結合する抗体又はその結合断片も、本発明に包含される。それらの抗体又はその結合断片は、（３－２）および（３－３）、好適にはそれらに加えて（３－４）、より好適にはそれらに加えて（３－５）、より一層好適には（３－２）乃至（３－８）全て、に記載の性質、機能、活性等をそれぞれ有する。

【0119】

本発明は別の一つの態様において、ヒト抗体又はその結合断片を提供する。ヒト抗体又はその結合断片は、ＬＡＧ－３に結合するヒト由来の抗体又はその結合断片であれば特に限定されるものではないが、（３－２）および（３－３）、好適にはそれらに加えて（３－４、より好適にはそれらに加えて（３－５）、より一層好適には（３－２）乃至（３－８）全て、に記載の性質、機能、活性等をそれぞれ有する。

【0120】

（３－１３）エピトープに結合する抗体
本発明に使用される抗体と「同一の部位に結合する抗体」も本発明に使用することができる。ある抗体と「同一の部位に結合する抗体」とは、該抗体が認識する抗原分子上の部位に結合する他の抗体を意味する。第一抗体が結合する抗原分子上の部分ペプチド又は部分立体構造に第二抗体が結合すれば、第一抗体と第二抗体は同一の部位に結合すると判定することができる。また、第一抗体の抗原に対する結合に対して第二抗体が競合する、すなわち、第二抗体が第一抗体と抗原の結合を妨げることを確認することによって、具体的な結合部位のペプチド配列又は立体構造が決定されていなくても、第一抗体と第二抗体が同一の部位に結合すると判定することができる。さらに、第一抗体と第二抗体が同一の部位に結合し、且つ第一抗体がＡＤＣＣ活性などの効果を有する場合、第二抗体も同様の活性を有する蓋然性は極めて高い。従って、第一の抗ＬＡＧ－３抗体の結合する部位に第二の抗ＬＡＧ－３抗体が結合すれば、第一抗体と第二抗体がＬＡＧ－３蛋白質上の同一の部位に結合すると判定することができる。また、第一の抗ＬＡＧ－３抗体のＬＡＧ－３蛋白質への結合に対して第二の抗ＬＡＧ－３抗体が競合することを確認できれば、第一抗体と第二抗体がＬＡＧ－３蛋白質上の同一の部位に結合する抗体と判定することができる。

【0121】

本発明においては、モノクローナル抗体が認識するＬＡＧ－３蛋白質上の部位に結合する抗体も、本発明に使用可能な抗体に含まれる。そのような抗体及びその結合断片は、（３－２）および（３－３）、好適にはそれらに加えて（３－４）、より好適にはそれらに加えて（３－５）、より一層好適には（３－２）乃至（３－８）全て、に記載の性質、機能、活性等をそれぞれ有する。

【0122】

抗体の結合部位は、免疫アッセイ法など当業者に周知の方法により決定することができる。例えば、抗原のアミノ酸配列をＣ末またはＮ末から適宜削ってなる一連のペプチドを作製し、それらに対する抗体の反応性を検討し、大まかな認識部位を決定した後に、さらに短いペプチドを合成してそれらのペプチドへの抗体の反応性を検討することにより、結合部位を決定することができる。抗原断片ペプチドは、遺伝子組換、ペプチド合成等の技術を用いて調製することができる。

【0123】

抗体が抗原の部分高次構造に結合又は認識している場合、かかる抗体の結合部位は、Ｘ線構造解析を用いて、当該抗体に隣接する抗原上のアミノ酸残基を特定することにより決定することができる。例えば、抗体又はその断片および抗原又はその断片を結合させて結晶化し、構造解析を行うことにより、抗体と相互作用距離を有する抗原上のアミノ酸残基を特定することができる。相互作用距離は８Å以下であり、好適には６Å以下であり、より好適には４Å以下である。そのような抗体との相互作用距離を有するアミノ酸残基は１つまたはそれ以上で抗体の抗原結合部位（エピトープ）を構成し得る。かかるアミノ酸残基が２つ以上の場合、各アミノ酸は一次配列上で互いに隣接していなくてもよい。

【0124】

本発明におけるＬＡＧ－３抗体のエピトープは、ヒトＬＡＧ－３又はそのアミノ酸配列中に存在する。かかるエピトープに結合するか、かかるエプトープへの結合において本発明に使用される抗体と競合するか、または、かかるアミノ酸残基と相互作用距離を有する抗体、その結合断片またはその修飾体も、本発明に使用可能な抗体、その結合断片またはその修飾体に包含される。

【0125】

（３－１４）抗体の修飾体
本発明は、抗体又はその結合断片の修飾体を含む組成物を提供する。抗体又はその結合断片の修飾体とは、抗体又はその結合断片に化学的又は生物学的な修飾が施されてなるものを意味する。化学的な修飾体には、アミノ酸骨格への化学部分の結合、Ｎ－結合またはＯ－結合炭水化物鎖の化学修飾体等が含まれる。生物学的な修飾体には、翻訳後修飾（例えば、Ｎ－結合またはＯ－結合 への糖鎖付加、Ｎ末またはＣ末のプロセッシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化）されたもの、原核生物宿主細胞を用いて発現させることによりＮ末にメチオニン残基が付加したもの等が含まれる。また、抗体または抗原の検出または単離を可能にするために標識されたもの、例えば、酵素標識体、蛍光標識体、アフィニティ標識体もかかる修飾物の意味に含まれる。このような抗体又はその結合断片の修飾物は、元の抗体又はその結合断片の安定性および血中滞留性の改善、抗原性の低減、かかる抗体又は抗原の検出又は単離等に有用である。

【0126】

化学的修飾体に含まれる化学部分としては、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール等の水溶性ポリマーを例示することができる。

【0127】

生物学的な修飾体としては、酵素処理や細胞処理等により修飾が施されたもの、遺伝子組換えによりタグ等他のペプチドが付加された融合体、ならびに内因性又は外来性の糖鎖修飾酵素を発現する細胞を宿主として調製されたもの等をあげることができる。

【0128】

抗体又はその結合断片に結合している糖鎖修飾を調節すること（グリコシル化、脱フコース化等）によって、抗体依存性細胞傷害活性を増強することが可能である。抗体の糖鎖修飾の調節技術としては、例えば、ＷＯ９９／５４３４２、ＷＯ００／６１７３９、ＷＯ０２／３１１４０等に記載された方法が知られているが、これらに限定されるものではない。本発明においては、抗体の修飾体には当該糖鎖修飾が調節された抗体も含まれる。

【0129】

かかる修飾は、抗体またはその結合断片における任意の位置に、または所望の位置において施されてもよく、１つ又は２つ以上の位置に同一又は２種以上の異なる修飾がなされてもよい。

【0130】

本発明において「抗体断片の修飾体」は「抗体の修飾体の断片」をもその意味に含むものである。

【0131】

本発明においては抗体の修飾体、その結合断片の修飾体を、単に「抗体」、「抗体の結合断片」と呼ぶことがある。
前述の通り、ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２は実施例８において得られた、糖鎖修飾が調節されたヒト化抗体である。該ヒト化抗体も、本発明に使用可能な抗体に包含される。

【0132】

以上のような本発明に使用可能な抗体、その結合断片、及びその修飾体は、好適には、本発明の細胞傷害性Ｔ細胞枯渇用組成物、細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患の治療又は予防の方法、治療又は予防のための使用等に適した物性、体内動態、血中滞留性、安全性等を有する。

【0133】

（３－１５）細胞傷害性Ｔ細胞に対するｄｅｐｌｅｔｉｏｎ活性
細胞傷害性Ｔ細胞枯渇用に供し得るＬＡＧ－３抗体は、好適には、ＬＡＧ－３発現細胞に対してＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＰ活性などの細胞傷害活性を示す抗体であり、より好適には、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＰ活性が増強されたＬＡＧ－３抗体である。低フコース化、脱フコース化（ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）等によりＡＤＣＣ活性が増強されたＬＡＧ－３抗体、すなわち低フコース形態にあるＬＡＧ－３抗体としては、例えば、ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２、Ｈ５Ｌ７ＢＷ等をあげることができる。

【0134】

ＬＡＧ－３抗体が奏する細胞傷害性Ｔ細胞に対するｄｅｐｌｅｔｉｏｎ活性は、当該分野で公知のアッセイに基づいて評価することができ、イン・ビトロのアッセイとしては実施例１３及び１４記載のもの、イン・ビボのアッセイとしては実施例１１－１）記載のものを、それぞれ例示することができるが、それらに限定されない。

【0135】

４．抗体の製造方法
（４－１）ハイブリドーマを用いる方法
抗ＬＡＧ－３抗体は、コーラーとミルスタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ （１９７５）２５６，ｐ．４９５－４９７、Ｋｅｎｎｅｔ，Ｒ．ｅｄ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｐ．３６５－３６７，Ｐｒｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８０））に従って、ＬＡＧ－３蛋白質又はその可溶型フォームで免疫した動物の脾臓より抗ＬＡＧ－３抗体の産生細胞を単離し、該細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイブリドーマを樹立し、かかるハイブリドーマの培養物からモノクローナル抗体を取得することができる。

【0136】

（４－１－１）抗原の調製
抗ＬＡＧ－３抗体を作製するための抗原は、本発明の他の部分に記載された天然型または組換え型のＬＡＧ－３蛋白質の調製法等に従って、取得することができる。そのようにして調製し得る抗原としては、ＬＡＧ－３蛋白質若しくはその少なくとも６個の連続した部分アミノ酸配列を含むことからなるＬＡＧ－３蛋白質断片、またはそれらに任意のアミノ酸配列や担体が付加された誘導体等（以下、まとめて「ＬＡＧ－３抗原」とよぶ：「ＬＡＧ－３蛋白質」と同義）を挙げることができる。

【0137】

組換え型ＬＡＧ－３抗原は、ＬＡＧ－３抗原の有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が含まれる遺伝子を宿主細胞に導入し、該細胞の培養物から該抗原を回収することにより、調製することができる。かかる組換型抗原は、免疫グロブリンのＦｃ領域など他の蛋白質との融合蛋白質であってもよい。また、ＬＡＧ－３抗原のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が含まれる遺伝子をイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）翻訳系により無細胞系において得られるＬＡＧ－３抗原も組換え型ＬＡＧ－３抗原に含まれる。非組換型ＬＡＧ－３抗原は、ＬＡＧ－３を発現している細胞等から精製、単離することができる。

【0138】

その存在下でもＬＡＧ－３のＴ細胞機能抑制機能が発揮される、あるいはＬＡＧ－３のＴ細胞機能抑制機能を抑制又は阻害しない抗ＬＡＧ－３モノクローナル抗体を取得するために、好適な免疫原として、例えば、免疫グロブリン様ドメイン１及び２を欠失させたＬＡＧ－３変異体を用いることができる。

【0139】

（４－１－２）抗ＬＡＧ－３モノクローナル抗体の製造
モノクローナル抗体の製造は、通常、下記のような工程を経る。
（ａ）抗原を調製する工程、
（ｂ）抗体産生細胞を調製する工程、
（ｃ）骨髄腫細胞（以下、「ミエローマ」という）を調製する工程、
（ｄ）抗体産生細胞とミエローマとを融合させる工程、
（ｅ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマ群を選別する工程、及び
（ｆ）単一細胞クローンを得る工程（クローニング）。

【0140】

必要に応じてさらに、（ｇ）ハイブリドーマの培養工程、ハイブリドーマを移植した動物の飼育工程等、（ｈ）モノクローナル抗体の生物活性の測定工程・判定工程等が加わる。

【0141】

以下、モノクローナル抗体の作製法を上記工程に沿って詳述するが、該抗体の作製法はこれに制限されず、例えば脾細胞以外の抗体産生細胞を使用することもできる。

【0142】

（ａ）抗原の精製
前記（２－３）記載のＬＡＧ－３蛋白質の調製法に準ずる。

【0143】

（ｂ）抗体産生細胞を調製する工程
工程（ａ）で得られた抗原と、フロインドの完全又は不完全アジュバント、又はカリミョウバンのような助剤とを混合し、免疫原として実験動物に免疫する。実験動物は公知のハイブリドーマ作製法に用いられる動物を支障なく使用することができる。具体的には、たとえばマウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ等を使用することができる。ただし、摘出した抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞の入手容易性等の観点から、マウス又はラットを被免疫動物とするのが好ましい。

【0144】

また、実際に使用するマウス及びラットの系統は特に制限はなく、マウスの場合には、例えば、Ａ、ＡＫＲ、ＢＡＬＢ／ｃ、ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｊ、ＢＤＰ、ＢＡ、ＣＥ、Ｃ３Ｈ、５７ＢＬ、Ｃ５７ＢＬ、Ｃ５７Ｌ、ＤＢＡ、ＦＬ、ＨＴＨ、ＨＴ１、ＬＰ、ＮＺＢ、ＮＺＷ、ＲＦ、Ｒ ＩＩＩ、ＳＪＬ、ＳＷＲ、ＷＢ、１２９等が、ラットの場合には、例えば、Ｗｉｓｔａｒ、Ｌｏｗ、Ｌｅｗｉｓ、Ｓｐｒａｑｕｅ、Ｄａｗｅｌｅｙ、ＡＣＩ、ＢＮ、Ｆｉｓｃｈｅｒ等を用いることができる。

【0145】

これらのマウス及びラットは例えば日本クレア、日本チャ－ルスリバー、等実験動物飼育販売業者より入手することができる。

【0146】

このうち、後述のミエローマ細胞との融合適合性を勘案すれば、マウスではＢＡＬＢ／ｃ系統が、ラットではＷｉｓｔａｒ及びＬｏｗ系統が被免疫動物として特に好ましい。

【0147】

また、抗原のヒトとマウスでの相同性を考慮し、自己抗体を除去する生体機構を低下させたマウス、すなわち自己免疫疾患マウスを用いることも好ましい。

【0148】

なお、これらマウス又はラットの免疫時の週齢は、好ましくは５乃至１２週齢、さらに好ましくは６乃至８週齢である。

【0149】

ＬＡＧ－３蛋白質で動物を免疫するには、例えば、Ｗｅｉｒ， Ｄ．Ｍ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．Ｉ．ＩＩ．ＩＩＩ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８７）、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ａｎｄ Ｍａｙｅｒ，Ｍ．Ｍ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃｈａｒｌｅｓ Ｃ Ｔｈｏｍａｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ Ｓｐｉｇｆｉｅｌｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ（１９６４） 等の方法を用いることができる。

【0150】

抗体価の測定法としては、例えば、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法等の免疫アッセイを挙げることができるが、それらの方法に限定されるものではない。

【0151】

免疫された動物から分離された脾臓細胞又はリンパ球に由来する抗体産生細胞は、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６，ｐ．４９５，；Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．（１９７７）６，ｐ．５１１，；Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７７），２６６，ｐ．５５０，；Ｗａｌｓｈ，Ｎａｔｕｒｅ，（１９７７）２６６，ｐ．４９５，）等の公知の方法に従って調製することができる。

【0152】

脾臓細胞の場合には、脾臓を細切して細胞をステンレスメッシュで濾過した後、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）等に浮遊させて抗体産生細胞を分離する一般的方法を採用することができる。

【0153】

（ｃ）ミエローマを調製する工程
細胞融合に用いるミエローマ細胞には特段の限定はなく、公知の細胞株から適宜選択して用いることができるが、融合細胞からハイブリドーマを選択する際の利便性を考慮して、その選択手続が確立しているＨＧＰＲＴ（Ｈｉｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ－ｇｕａｎｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）欠損株、すなわちマウス由来のＸ６３－Ａｇ８（Ｘ６３）、ＮＳ１－ＡＮＳ／１（ＮＳ１）、Ｐ３Ｘ６３－Ａｇ８．Ｕｌ（Ｐ３Ｕｌ）、Ｘ６３－Ａｇ８．６５３（Ｘ６３．６５３）、ＳＰ２／０－Ａｇ１４（ＳＰ２／０）、ＭＰＣ１１－４５．６ＴＧ１．７（４５．６ＴＧ）、ＦＯ、Ｓ１４９／５ＸＸＯ、ＢＵ．１等、ラット由来の２１０．ＲＳＹ３．Ａｇ．１．２．３（Ｙ３）等、ヒト由来のＵ２６６ＡＲ（ＳＫＯ－００７）、ＧＭ１５００・ＧＴＧ－Ａ１２（ＧＭ１５００）、ＵＣ７２９－６、ＬＩＣＲ－ＬＯＷ－ＨＭｙ２（ＨＭｙ２）、８２２６ＡＲ／ＮＩＰ４－１（ＮＰ４１）等を用いるのが好ましい。これらのＨＧＰＲＴ欠損株は例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ）等から入手することができる。

【0154】

これらの細胞株は、適当な培地、例えば８－アザグアニン培地［ＲＰＭＩ－１６４０培地にグルタミン、２－メルカプトエタノール、ゲンタマイシン、及びウシ胎児血清（以下「ＦＢＳ」という）を加えた培地に８－アザグアニンを加えた培地］、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ；以下「ＩＭＤＭ」という）、又はダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ；以下「ＤＭＥＭ」という）で継代培養するが、細胞融合の３乃至４日前に正常培地［例えば、１０％ ＦＢＳを含むＡＳＦ１０４培地（味の素（株）社製）］で継代培養し、融合当日に２×１０７以上の細胞数を確保しておく。

【0155】

（ｄ）抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合させる工程
抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合は、公知の方法（Ｗｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．Ｉ．ＩＩ．ＩＩＩ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８７）、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ａｎｄ Ｍａｙｅｒ，Ｍ．Ｍ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃｈａｒｌｅｓ Ｃ Ｔｈｏｍａｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ Ｓｐｉｇｆｉｅｌｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ（１９６４）等）に従い、細胞の生存率を極度に低下させない程度の条件下で実施することができる。例えば、ポリエチレングリコール等の高濃度ポリマー溶液中で抗体産生細胞とミエローマ細胞とを混合する化学的方法、電気的刺激を利用する物理的方法等を用いることができる。

【0156】

（ｅ）目的とする抗体を産生するハイブロドーマ群を選別する工程
細胞融合により得られるハイブリドーマの選択方法は特に制限はないが、通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン）選択法（Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６，ｐ．４９５；Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７７）２６６，ｐ．５５０）が用いられる。この方法は、アミノプテリンで生存し得ないＨＧＰＲＴ欠損株のミエローマ細胞を用いてハイブリドーマを得る場合に有効である。すなわち、未融合細胞及びハイブリドーマをＨＡＴ培地で培養することにより、アミノプテリンに対する耐性を持ち合わせたハイブリドーマのみを選択的に残存させ、かつ増殖させることができる。

【0157】

（ｆ）単一細胞クローンを得る工程（クローニング）
ハイブリドーマのクローニング法としては、例えば、メチルセルロース法、軟アガロース法、限界希釈法等の公知の方法を用いることができるが（例えば、Ｂａｒｂａｒａ， Ｂ．Ｍ． ａｎｄ Ｓｔａｎｌｅｙ， Ｍ．Ｓ．：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９８０）参照）、好適には限界希釈法である。

【0158】

（ｇ）ハイブリドーマの培養工程、ハイブリドーマを移植した動物の飼育工程
選択されたハイブリドーマを培養することにより、モノクローナル抗体を産生することができるが、好適には所望のハイブリドーマをクローニングしてから抗体の産生に供する。

【0159】

かかるハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体は、該ハイブリドーマの培養物から回収することができる。また、該モノクローナル抗体遺伝子が導入された細胞の培養物から組換え抗体として回収することもできる。さらに、同系統のマウス（例えば、上記のＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｊ）、あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内にハイブリドーマを注射し、該ハイブリド－マを増殖させることにより、その腹水から回収することもできる。
（ｈ）モノクローナル抗体の生物活性の測定工程・判定工程
各種生物試験を目的に応じて選択し、適用することができる。

【0160】

（４－２）細胞免疫法
天然型のＬＡＧ－３蛋白質を発現する細胞、組換え型ＬＡＧ－３蛋白質またはその断片を発現する細胞等を免疫原として使用することにより、前記のハイブリドーマ法により抗ＬＡＧ－３抗体を調製することができる。
ＬＡＧ－３を発現している細胞は、1×１０５乃至1×１０９個、好適には1×１０6乃至1×１０8個、より好適には０．５乃至２×１０7個、より一層好適には１×１０７個を１回の免疫に用いるが、ＬＡＧ－３蛋白質の発現量に応じて免疫に供する細胞数を変えることができる。かかる免疫源は、一般的には腹腔内に投与するが、皮内等に投与することもできる。ハイブリドーマの作製手法としては（４－１－２）記載の方法を適用することができる。

【0161】

（４－３）遺伝子組換え
本発明に使用される抗体は、その重鎖アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が含まれるヌクレオチド（重鎖ヌクレオチド）及びその軽鎖アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が含まれるヌクレオチド（軽鎖ヌクレオチド）、又は、かかる重鎖ヌクレオチドが挿入されたベクター及び軽鎖ヌクレオチドが挿入されたベクターを宿主細胞に導入し、該細胞を培養した後その培養物からかかる抗体を回収することにより調製することができる。一つのベクターに重鎖ヌクレオチド及び軽鎖ヌクレオチドが挿入されていてもよい。

【0162】

宿主細胞としては、原核細胞又は真核細胞を用いることができる。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真核微生物を用いることができる。

【0163】

動物細胞としては、例えば、哺乳類由来の細胞、すなわち、サル由来のＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ， Ｙ． Ｃｅｌｌ（１９８１）２３，ｐ．１７５－１８２、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５０）、マウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ－１６５８）、マウスＮＳ０細胞株（ＥＣＡＣＣ）、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－６１）、そのジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（ＣＨＯｄｈｆｒ－：Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８０）７７，ｐ．４１２６－４２２０）、ＣＨＯＫ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）、ニワトリ等鳥類由来の細胞、昆虫由来の細胞等を挙げることができる。

【0164】

また、抗体等の蛋白質の糖鎖修飾を調節するよう改変された細胞も宿主として用いることができる。例えば、抗体のＦｃ領域に結合するＮ－グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ－アセチルグルコサミンに結合しているフコースを減らすかまたは無くすよう改変されたＣＨＯ細胞を用いて抗体等を発現させれば、低フコース化又は脱フコース化した抗体（抗体の修飾体とも呼ぶ）を調製することが可能である（ＷＯ００／６１７３９号、ＷＯ０２／３１１４０号等）。

【0165】

真核微生物としては、例えば、酵母等をあげることができる。

【0166】

原核細胞としては、例えば、大腸菌、枯草菌等をあげることができる。

【0167】

抗体（各種動物由来のモノクローナル抗体、ラット抗体、マウス抗体、キメラ化抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体等）を分泌させるためのシグナルペプチドとしては、当該抗体と同種、同タイプ及び同サブタイプの抗体の分泌シグナル、ならびに、当該抗体自体の分泌シグナルに限定されるものではなく、他のタイプもしくはサブタイプの抗体の分泌シグナル、または、他の真核生物種もしくは原核生物由来の蛋白質の分泌シグナルであれば、任意のものを選択して利用することができる。

【0168】

（４－４）ヒト化抗体のデザイン法および調製法
ヒト化抗体としては、非ヒト動物抗体のＣＤＲのみがヒト由来の抗体に組込まれ抗体（Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２１，ｐ．５２２－５２５参照）、ＣＤＲ移植法によりＣＤＲの配列に加え一部のフレームワークのアミノ酸残基もヒト抗体に移植した抗体（ＷＯ９０／０７８６１号、ＵＳ６９７２３２３号公報参照）、それらのいずれかにおける非ヒト動物抗体の１つまたは２つ以上のアミノ酸がヒト型のアミノ酸で置換されてなる抗体等を挙げることができるが、それらに限定されるものではない。

【0169】

（４－５）ヒト抗体の調製法
本発明に使用可能な抗体としては、さらに、ヒト抗体を挙げることができる。抗ＬＡＧ－３ヒト抗体とは、ヒト由来の抗体のアミノ酸配列からなる抗ＬＡＧ－３抗体を意味する。抗ＬＡＧ－３ヒト抗体は、ヒト抗体の重鎖と軽鎖の遺伝子を含むヒトゲノムＤＮＡ断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法（Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９７）１６，ｐ．１３３－１４３，； Ｋｕｒｏｉｗａ，Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９８）２６，ｐ．３４４７－３４４８；Ｙｏｓｈｉｄａ， Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ａｓｐｅｃｔｓ ｖｏｌ．１０，ｐ．６９－７３（Ｋｉｔａｇａｗａ， Ｙ．，Ｍａｔｕｄａ，Ｔ．ａｎｄ Ｉｉｊｉｍａ，Ｓ．ｅｄｓ．），Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９９．；Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０００）９７，ｐ．７２２－７２７等を参照。）によって取得することができる。

【0170】

ヒト抗体産生動物は、具体的には、非ヒト哺乳動物の内在性免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の遺伝子座が破壊され、代わりに酵母人工染色体（Ｙｅａｓｔ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，ＹＡＣ）ベクターなどを介してヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の遺伝子座が導入された組換え動物、それらの動物同士を掛け合わせることにより作り出された組換え動物のいずれであってもよい。

【0171】

また、遺伝子組換え技術により、そのようなヒト抗体の重鎖及び軽鎖の各々をコードするｃＤＮＡ、好ましくは該ｃＤＮＡを含むベクターにより真核細胞を形質転換し、遺伝子組換えヒトモノクローナル抗体を産生する形質転換細胞を培養することにより、この抗体を培養上清中から得ることもできる。

【0172】

ここで、宿主としては例えば真核細胞、好ましくはＣＨＯ細胞、リンパ球やミエローマ等の哺乳動物細胞を用いることができる。

【0173】

また、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得する方法（Ｗｏｒｍｓｔｏｎｅ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ．ａｌ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ＆ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ．（２００２）４３（７），ｐ．２３０１－２３０８；Ｃａｒｍｅｎ，Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ ｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ（２００２），１（２），ｐ．１８９－２０３；Ｓｉｒｉｗａｒｄｅｎａ，Ｄ．ｅｔ．ａｌ．，Ｏｐｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ（２００２）１０９（３），ｐ．４２７－４３１等参照。）も知られている。

【0174】

例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージ表面に発現させて、抗原に結合するファージを選択するファージディスプレイ法（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５），２３，（９），ｐ．１１０５－１１１６）を用いることができる。

【0175】

抗原に結合することで選択されたファージの遺伝子を解析することによって、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。

【0176】

抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を有する発現ベクターを作製し、適当な宿主に導入して発現させることによりヒト抗体を取得することができる（ＷＯ９２／０１０４７，ＷＯ９２／２０７９１，ＷＯ９３／０６２１３，ＷＯ９３／１１２３６，ＷＯ９３／１９１７２，ＷＯ９５／０１４３８，ＷＯ９５／１５３８８、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９４）１２，ｐ．４３３－４５５、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）２３（９），ｐ．１１０５－１１１６）。

【0177】

（４－６）抗体の結合断片の調製法
一本鎖抗体を作成する方法は当技術分野において周知である（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号、米国特許第５，２６０，２０３号、米国特許第５，０９１，５１３号、米国特許第５，４５５，０３０号等を参照）。このｓｃＦｖにおいて、重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、コンジュゲートを作らないようなリンカー、好ましくはポリペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８），８５，ｐ．５８７９－５８８３）。ｓｃＦｖにおける重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、同一の抗体に由来してもよく、別々の抗体に由来してもよい。

【0178】

可変領域を連結するポリペプチドリンカーとしては、例えば１２乃至１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。

【0179】

ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体の重鎖又は重鎖可変領域をコードするＤＮＡ、及び軽鎖又は軽鎖可変領域をコードするＤＮＡのうち、それらの配列のうちの全部又は所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにポリペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、及びその両端が各々重鎖、軽鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合わせて増幅することにより得られる。

【0180】

ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを用いて、該ＤＮＡを含有する発現ベクター、及び該発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を常法に従って調製することができ、また、その宿主細胞を培養することにより、常法に従ってかかる培養物から該ｓｃＦｖを回収することができる。

【0181】

その他の抗体の結合断片も、前記の方法に準じて該結合断片をコードする遺伝子を取得して細胞に導入し、該細胞の培養物から該結合断片を回収することにより、得ることができる。

【0182】

抗体は、多量化して抗原に対する親和性を高めたものであってもよい。多量化する抗体としては、１種類の抗体であっても、同一の抗原の複数のエピトープを認識する複数の抗体であってもよい。抗体を多量化する方法としては、ＩｇＧ ＣＨ３ドメインと２つのｓｃＦｖとの結合、ストレプトアビジンとの結合、へリックス－ターン－へリックスモチーフの導入等を挙げることができる。

【0183】

抗体は、アミノ酸配列が異なる複数種類の抗ＬＡＧ－３抗体の混合物、すなわちポリクローナル抗体であってもよい。ポリクローナル抗体としては、例えば、ＣＤＲの一部又は全部が異なる複数種類の抗体の混合物を挙げることができる。そのようなポリクローナル抗体は、異なる抗体の産生細胞を混合培養し、該培養物から回収することができる（ＷＯ２００４／０６１１０４号）。また、別個に調製した抗体を混合することも可能である。さらに、ポリクローナル抗体の一つの態様である抗血清は、動物を所望の抗原で免疫し、定法に従って、該動物から血清を回収することにより調製することができる。

【0184】

抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。

【0185】

抗体は、更にこれらの抗体と他の薬剤がコンジュゲートを形成しているもの（Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）でもよい。このような抗体の例としては、該抗体が放射性物質や薬理作用を有する化合物と結合している物を挙げることができる（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）２３，ｐ．１１３７－１１４６）。

【0186】

なお、（３－１１）、（３－１４）、（４－６）等に例示又は記載されるような抗体、その結合断片、それらの修飾物は、「抗体又はその結合断片を含む分子」とも呼ばれる。

【0187】

（４－７）抗体の精製
得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。

【0188】

例えばクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ，Ｄａｎｉｅｌ Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８））が、これらに限定されるものではない。

【0189】

クロマトグラフィーとしては、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる。

【0190】

これらのクロマトグラフィーは、ＨＰＬＣやＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。

【0191】

アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラム、抗原カラム等をあげることができる。

【0192】

プロテインＡカラムとしては、例えば、Ｈｙｐｅｒ Ｄ（ポール社製、，ＰＯＲＯＳ（アプライドシステムズ社製），Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．（ＧＥヘルスケア社製）等が挙げられる。

【0193】

また抗原を固定化した担体を用いて、抗原への結合性を利用して抗体を精製することも可能である。

【0194】

(４－８)抗体をコードするヌクレオチド・組換ベクター・組換細胞
抗体もしくはその結合断片またはその修飾体をコードするヌクレオチド（「抗体遺伝子」という）、該遺伝子が挿入された組換えベクター、該遺伝子又はベクターが導入された細胞（「抗体遺伝子導入細胞」という）、その他抗体もしくは結合断片またはその修飾体を産生する細胞（「抗体産生細胞」という）も本発明の組成物を調製するために使用される。

【0195】

抗体遺伝子は、好適には、次の（ａ）乃至（ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列（以下、「抗体遺伝子配列」という）を含んでなるか、抗体遺伝子配列を含むヌクレオチド配列からなるか、または抗体遺伝子配列からなる：
（ａ）ラット抗体ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５，ｒＬＡ８６９、及びｒＬＡ１２６４並びにマウス抗体Ａ９Ｈ１２、それらの重鎖及び軽鎖の定常領域をヒト抗体のもので置き換えたキメラ体であるｃＬＡ２０４、ｃＬＡ２１２、ｃＬＡ２２５、ｃＬＡ８６９、ｃＬＡ１２６４及びキメラ型Ａ９Ｈ１２（ＩＭＰ７３１）、ならびに、それらのヒト化体であるｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ１乃至ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ５、ＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ１乃至ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ５、Ｈ５Ｌ７及びＨ５Ｌ７ＢＷのいずれか一つの抗体の重鎖アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と軽鎖アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の組合せ；
（ｂ）ラット抗体ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５，ｒＬＡ８６９及びｒＬＡ１２６４並びにマウス抗体Ａ９Ｈ１２、それらの重鎖及び軽鎖の定常領域をヒト抗体のもので置き換えたキメラ体であるｃＬＡ２０４、ｃＬＡ２１２、ｃＬＡ２２５、ｃＬＡ８６９、ｃＬＡ１２６４及びキメラ型Ａ９Ｈ１２（ＩＭＰ７３１）、ならびに、それらのヒト化体であるｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ１乃至ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ５、ＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ１乃至ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ５、Ｈ５Ｌ７及びＨ５Ｌ７ＢＷのいずれか一つの抗体のＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３を含む重鎖のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列とＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３を含む軽鎖のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の組合せ；
（ｃ）ラット抗体ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５，ｒＬＡ８６９及びｒＬＡ１２６４並びにマウス抗体Ａ９Ｈ１２、それらの重鎖及び軽鎖の定常領域をのヒト抗体のもので置き換えたキメラ体であるｃＬＡ２０４、ｃＬＡ２１２、ｃＬＡ２２５、ｃＬＡ８６９及びｃＬＡ１２６４及びキメラ型Ａ９Ｈ１２（ＩＭＰ７３１）、ならびに、それらのヒト化体であるｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ１乃至ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ５、ＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ１乃至ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ５、Ｈ５Ｌ７及びＨ５Ｌ７ＢＷのいずれか一つの抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列を含む重鎖アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む軽鎖アミノ酸配列コードするヌクレオチド配列の組合せ；
（ｄ）（ａ）乃至（ｃ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなるヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし且つＬＡＧ－３に結合する抗体のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；および、
（ｅ）（ａ）乃至（ｃ）のいずれか一つに記載のアミノ酸配列において１乃至５０個、１乃至４５個、１乃至４０個、１乃至３０個、１乃至２５個、１乃至２０個、１乃至１５個、１乃至１０個、１乃至８個、１乃至６個、１乃至５個、１乃至４個、１乃至３個、１若しくは２個、または１個の塩基が置換、欠失、付加及び／又は挿入してなるアミノ酸配列をコードし且つＬＡＧ－３に結合する抗体のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｄ）又は（ｅ）記載のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を有する抗体は、（３－２）および（３－３）、好適にはそれらに加えて（３－４）、より好適にはそれらに加えて（３－５）、より一層好適には（３－２）乃至（３－８）全て、に記載の性質、機能、活性等をそれぞれ有する。

【0196】

ただし、抗体遺伝子は、上記（ａ）乃至（ｅ）記載のものに限定されない。

【0197】

本発明における抗体もしくはその結合断片又はその修飾体は、（４－３）記載のように、抗体遺伝子導入細胞を培養する工程、および、その培養物から抗体もしくはその結合断片又はその修飾体を回収する工程、を含む、抗体もしくはその結合断片又はその修飾体の製造方法により得ることができる。

【0198】

５．組成物
本発明は抗ＬＡＧ－３抗体もしくはその結合断片またはその修飾体を含む細胞傷害性Ｔ細胞枯渇用組成物を提供する。

【0199】

本発明の組成物は、細胞傷害性Ｔ細胞の関わる疾患（以下、「細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患」という）に対する医療において、好適には、免疫抑制剤抵抗性の細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患に対する医療において、細胞傷害性Ｔ細胞を枯渇させることにより、臨床上のベネフィットをもたらし得る。かかる疾患としては、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ：非特許文献１６）、多発性硬化症（非特許文献１５）、バセドウ病 (Ｓｕｎ，Ｚ. ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ.、２００８年；第２８巻（５号）：４６４－４７２ページ)、強直性脊椎炎（Ｓｃｈｉｒｍｅｒ，Ｍ. ｅｔ ａｌ.、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｒｅｓ.、２００２年；第４巻（１号）：７１－７６ページ）,、扁平部炎 (Ｐｅｄｒｏｚａ－Ｓｅｒｅｓ，Ｍ. ｅｔ ａｌ,、Ｂｒ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ.、２００７年； 第９１巻（１０号）：１３９３－１３９８ページ)、喘息（Ｈａｍｚａｏｕｉ，Ａ. ｅｔ ａｌ.、Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ．Ｉｎｆｌａｍｍ.、２００５年；３号：１６０－１６６ページ）、関節リウマチ（Ｗａｎｇ，ＥＣ. ｅｔ ａｌ.、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｒｈｅｕｍ．、１９９７年；第４０巻（２号）：２３７－２４８ページ：Ｓｃａｒｓｉ，Ｍ. ｅｔ ａｌ.、Ｊ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ.、２０１０年；第３７巻（５号）：９１１－９１６ページ）、多発性筋炎・皮膚筋炎（Ｆａｓｔｈ，ＡＥ. ｅｔ ａｌ.、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ.、２００９年；第１８３号（７巻）：４７９２－４７９９ページ）、封入体筋炎（Ｋｅｌｌｅｒ, ＣＷ. ｅｔ ａｌ.、Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｎｅｕｒｏｌ.、２０１７年；第４巻（６号）：４２２－４４５ページ）、急性冠症候群（非特許文献１５）、全身性エリテマトーデス（Ｚａｂｉｎｓｋａ ｅｔ ａｌ． ２０１６， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ．１０５８１６５）、ループス腎炎（Ｚａｂｉｎｓｋａ ｅｔ ａｌ． ２０１６， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ．１０５８１６５）、強皮症（Ｌｉ ｅｔ ａｌ． ２０１７， Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ． １３７（５）：１０４２－１０５０）、クローン病（Ｄａｉ ｅｔ ａｌ． ２０１７， Ｃｌｉｎ Ｒｅｓ Ｈｅｐａｔｏｌ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ． ４１（６）：６９３－７０２）、潰瘍性大腸炎（Ｄａｉ ｅｔ ａｌ． ２０１７， Ｃｌｉｎ Ｒｅｓ Ｈｅｐａｔｏｌ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ． ４１（６）：６９３－７０２）、再生不良性貧血（Ｋｏｏｋ ｅｔ ａｌ． ２００１， Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ． ２９（１１）：１２７０－７）、骨髄異形成症候群（Ｋｏｏｋ ｅｔ ａｌ． ２００１， Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ． ２９（１１）：１２７０－７）、シェーグレン症候群（Ｓｍｏｌｅｎｓｋａ ｅｔ ａｌ． ２０１２， Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２７８（１－２）：１４３－５１）、ヴェゲナー肉芽腫症（Ｌａｍｐｒｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ． ２００１， Ｔｈｏｒａｘ． ５６（１０）：７５１－７）、乾癬（Ｌｉｍａ ｅｔ ａｌ． ２０１５， Ｂｒ Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ． １７３（４）：９９８－１００５）、２型糖尿病（Ｇｉｕｂｉｌａｔｏ ｅｔ ａｌ． ２０１１， Ｅｕｒ Ｈｅａｒｔ Ｊ． ３２（１０）：１２１４－２６）、宿主対移植片反応（Ｍｅｎｄｅｓ ｅｔ ａｌ． ２００８， Ｃｌｉｎｉｃｓ （Ｓａｏ Ｐａｕｌｏ）． ６３（５）：６６７－７６）、慢性Ｂ型肝炎（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２００９， Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｎｖｅｓｔ． ２００９；３８（５）：４３４－４６）、サルコイドーシス（Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ． ２００５， Ｓａｒｃｏｉｄｏｓｉｓ Ｖａｓｃ Ｄｉｆｆｕｓｅ Ｌｕｎｇ Ｄｉｓ． ２２（１）：１３－９）等を例示することができる。すなわち、本発明の組成物は、好適には、免疫抑制剤抵抗性のＣＯＰＤ、免疫抑制剤抵抗性のバセドウ病、免疫抑制剤抵抗性の強直性脊椎炎、免疫抑制剤抵抗性の扁平部炎、免疫抑制剤抵抗性の喘息、免疫抑制剤抵抗性の関節リウマチ、免疫抑制剤抵抗性の多発性筋炎・皮膚筋炎、免疫抑制剤抵抗性の封入体筋炎、免疫抑制剤抵抗性の急性冠症候群、免疫抑制剤抵抗性の全身性エリテマトーデス、免疫抑制剤抵抗性のループス腎炎、免疫抑制剤抵抗性の強皮症、免疫抑制剤抵抗性のクローン病、免疫抑制剤抵抗性の潰瘍性大腸炎、免疫抑制剤抵抗性の再生不良性貧血、免疫抑制剤抵抗性の骨髄異形成症候群、免疫抑制剤抵抗性のシェーグレン症候群、免疫抑制剤抵抗性のヴェゲナー肉芽腫症、免疫抑制剤抵抗性の乾癬、免疫抑制剤抵抗性の２型糖尿病、免疫抑制剤抵抗性の宿主対移植片反応、免疫抑制剤抵抗性の慢性Ｂ型肝炎、免疫抑制剤抵抗性のサルコイドーシス等（以下まとめて「免疫抑制剤抵抗性の細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患」という）の治療又は予防に有用である。

【0200】

細胞傷害性Ｔ細胞と細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患については、例えば、次の報告がなされている：特発性肺線維症では、ＣＤ４＋ＣＤ２８－Ｔ細胞数と予後悪化の間に相関が報告されている（Ｇｉｌａｎｉ ｅｔ．ａｌ．、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１０、５（１）：ｅ８９５９）；強直性脊椎炎では、疾患重症度と血中ＣＤ８＋ＣＤ２８－Ｔ細胞数に相関がある（Ｓｃｈｉｒｍｅｒ，Ｍ. ｅｔ ａｌ.、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｒｅｓ.、２００２年；第４巻（１号）：７１－７６ページ）；全身性エリテマトーデスとループス腎炎については、ＣＤ８＋ＣＤ２８－Ｔ細胞が増悪に関与することが示唆された（Ｚａｂｉｎｓｋａ ｅｔ ａｌ． ２０１６， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ．１０５８１６５）；強皮症については、ＣＤ８＋ＣＤ２８－Ｔ細胞が初期ステージ病態に関与することが示唆された（Ｌｉ ｅｔ ａｌ． ２０１７， Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ． １３７（５）：１０４２－１０５０）；多発性筋炎・皮膚筋炎については、ＣＤ２８－Ｔ細胞が病態に関与している（Ｆａｓｔｈ，ＡＥ. ｅｔ ａｌ.、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ.、２００９年；第１８３号（７巻）：４７９２－４７９９ページ）；封入体筋炎については、ＣＤ２８－Ｔ細胞が病態に関与している（Ｐａｎｄｙａ ｅｔ ａｌ． ２０１０， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ． ６２（１１）：３４５７－６６）；クローン病及び潰瘍性大腸炎は、ＣＤ８＋ＣＤ２８－Ｔ細胞割合が増加すると予後不良（Ｄａｉ ｅｔ ａｌ． ２０１７， Ｃｌｉｎ Ｒｅｓ Ｈｅｐａｔｏｌ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ． ４１（６）：６９３－７０２）；再生不良性貧血及び骨髄異形成症候群では、患者のＣＤ８＋ＣＤ２８－Ｔ細胞数が増加している（Ｋｏｏｋ ｅｔ ａｌ． ２００１， Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ． ２９（１１）：１２７０－７）；多発性硬化症については、ＣＤ４＋ＣＤ２８－Ｔ細胞数が予後の予測因子となる（Ｐｅｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ． ２０１７， Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：１１６０）；シェーグレン症候群については、ＣＤ８＋ＣＤ２８－Ｔ細胞数と重症度に相関が見られる（Ｓｍｏｌｅｎｓｋａ ｅｔ ａｌ． ２０１２， Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２７８（１－２）：１４３－５１）；ヴェゲナー肉芽腫症については、ＣＤ２８－Ｔ細胞が病態に関与している（Ｌａｍｐｒｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ． ２００１， Ｔｈｏｒａｘ． ５６（１０）：７５１－７）；乾癬については、ＣＤ４＋ＣＤ２８－Ｔ細胞が病態に関与している（Ｌｉｍａ ｅｔ ａｌ． ２０１５， Ｂｒ Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ． １７３（４）：９９８－１００５）；２型糖尿病については、ＣＤ４＋ＣＤ２８－Ｔ細胞が病態に関与している（Ｇｉｕｂｉｌａｔｏ ｅｔ ａｌ． ２０１１， Ｅｕｒ Ｈｅａｒｔ Ｊ． ３２（１０）：１２１４－２６）；バセドウ病 においては、ＣＤ２８－Ｔ細胞数が増加している(Ｓｕｎ，Ｚ. ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ.、２００８年；第２８巻（５号）：４６４－４７２ページ)；宿主対移植片反応については、ＣＤ８＋ＣＤ２８－Ｔ細胞数と発症に相関が見られる（Ｍｅｎｄｅｓ ｅｔ ａｌ． ２００８， Ｃｌｉｎｉｃｓ （Ｓａｏ Ｐａｕｌｏ）． ６３（５）：６６７－７６）；喘息においては、ＣＤ８＋ＣＤ２８－Ｔ細胞数が増加している（Ｈａｍｚａｏｕｉ，Ａ. ｅｔ ａｌ.、Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ．Ｉｎｆｌａｍｍ.、２００５年；３号：１６０－１６６ページ）；慢性Ｂ型肝炎については、ＣＤ４＋ＣＤ２８－Ｔ細胞が病態に関与している（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２００９， Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｎｖｅｓｔ． ２００９；３８（５）：４３４－４６）；サルコイドーシスにおいては、ＣＤ４＋ＣＤ２８－ Ｔ ｃｅｌｌ数が増加している（Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ． ２００５， Ｓａｒｃｏｉｄｏｓｉｓ Ｖａｓｃ Ｄｉｆｆｕｓｅ Ｌｕｎｇ Ｄｉｓ． ２２（１）：１３－９）。

【0201】

免疫抑制剤抵抗性については、例えば、次の報告がなされている：Ａｂａｔａｃｅｐｔ抵抗性の関節リウマチではＣＤ８＋ＣＤ２８－Ｔ細胞が多い（Ｓｃａｒｓｉ ｅｔ ａｌ． ２０１１， Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ． ３８（１０）：２１０５－１１）；ＣＯＰＤでは、ステロイド耐性にＣＤ８＋ＣＤ２８－ Ｔ細胞が関与している（非特許文献１６）。

【0202】

本発明において、免疫抑制剤とは、自己免疫疾患の治療等に用いられる、免疫系に対して抑制的に作用する薬剤を意味し、葉酸代謝拮抗剤、カルシニューリン阻害剤、副腎皮質ステロイド剤（単に「ステロイド」ともいう）、抗胸腺細胞グロブリン剤、核酸代謝拮抗剤、核酸合成阻害剤、細胞表面抗原を標的とする生物製剤、またはサイトカインもしくはサイトカイン受容体を標的とする生物製剤等を含む。具体的には、葉酸代謝拮抗剤であるＭｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ、カルシニューリン阻害剤であるＣｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ、Ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ、副腎皮質ステロイド剤であるＭｅｔｈｙｌｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ、Ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ、Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、核酸合成阻害剤であるＣｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ、Ａｚａｔｈｉｏｐｒｉｎｅ、抗胸腺細胞グロブリン剤であるＺｅｔｂｕｌｉｎ、Ｌｙｍｐｈｏｇｌｏｂｕｌｉｎｅ、Ｔｈｙｍｏｇｌｏｂｕｌｉｎ、核酸代謝拮抗剤であるＭｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ ｍｏｆｅｔｉｌ、細胞表面抗原を標的とする生物製剤であるＡｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、Ａｂａｔａｃｅｐｔ、Ｄｅｎｏｓｕｍａｂ、サイトカインあるいはサイトカイン受容体を標的とする生物製剤であるＡｄａｌｉｍｕｍａｂ、Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ、Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ、Ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ、Ｓ１ＰＲ１（スフィンゴシン－１－リン酸受容体１つ）アゴニストであるフィンゴリモド等を例示することができる。

【0203】

本発明において、免疫抑制剤抵抗性とは、上記のような免疫抑制剤による治療によっても疾患のコントロールが十分にできていない状態を指し、上記のような免疫抑制剤による治療で、無効あるいは効果不十分の場合、疾患の再発を起こす場合、副作用によって当該薬剤による治療が困難になる場合、等を含む。
本発明において、疾患の治療または予防には、かかる疾患、好適にはＬＡＧ－３蛋白質を発現している個体におけるかかる疾患の発症の予防、増悪化又は進行の抑制又は阻害、かかる疾患に罹患した個体が呈する一つ又は二つ以上の症状の軽減、増悪化若しくは進行の抑制または寛解、二次性疾患の治療又は予防等が含まれるが、それらに限定されるものではない。

【0204】

本発明は抗ＬＡＧ－３抗体もしくはその結合断片またはその修飾体を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、好適には、細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患の治療及び／又は治療に適用され得、より好適には、パーフォリン陽性、グランザイムＢ陽性、ＣＤ２８陰性ＣＤ４陽性、ＣＤ２８陰性ＣＤ８陽性、ＣＤ５７陽性ＣＤ４陽性、及び／又は、ＣＤ５７陽性ＣＤ８陽性であり、より一層好適には、パーフォリン陽性、グランザイムＢ陽性、ＣＤ２８陰性ＣＤ４陽性、ＣＤ２８陰性ＣＤ８陽性、ＣＤ５７陽性ＣＤ４陽性、及び／又は、ＣＤ５７陽性ＣＤ８陽性が、細胞傷害性Ｔ細胞又はその細胞膜画分を含む生物学的サンプルについて判定されることを特徴とし、さらにより一層好適には、該生物学的サンプルが、細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患に罹患しているか又は罹患を回避することが望ましい個体に由来するか又は該個体に由来することを特徴とする。かかる生物学的サンプルは、好適には、病変部位に由来するか又は病変部位から採取された、細胞傷害性Ｔ細胞を含むサンプルであり、より好適には、病変部位に浸潤している細胞傷害性Ｔ細胞を含むサンプルである。

【0205】

本発明の医薬組成物により治療又は予防され得る細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患は、好適には、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、多発性硬化症、バセドウ病、強直性脊椎炎、扁平部炎、喘息、関節リウマチ、多発性筋炎・皮膚筋炎、封入体筋炎、急性冠症候群、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、強皮症、クローン病、潰瘍性大腸炎、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、シェーグレン症候群、ヴェゲナー肉芽腫症、乾癬、２型糖尿病、宿主対移植片反応、慢性Ｂ型肝炎、及び／又は、サルコイドーシスである。

【0206】

また、本発明の医薬組成物により治療又は予防され得る細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患は、好適には、ＬＡＧ－３陽性であり、より好適には、細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患に罹患しているか又は罹患を回避することが望ましい個体に由来する生物学的サンプルについてＬＡＧ－３陽性と判定された該疾患である。かかる生物学的サンプルは、好適には、病変部位に由来するか又は病変部位から採取された、細胞傷害性Ｔ細胞を含むサンプルであり、より好適には、病変部位に浸潤している細胞傷害性Ｔ細胞を含むサンプルである。

【0207】

さらに、本発明の組成物又は医薬組成物は、細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患の治療又は予防の方法において、個体に投与され得る。すなわち本発明は、パーフォリン陽性、グランザイムＢ陽性、ＣＤ２８陰性ＣＤ４陽性、ＣＤ２８陰性ＣＤ８陽性、ＣＤ５７陽性ＣＤ４陽性、及び／又は、ＣＤ５７陽性ＣＤ８陽性の細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患に罹患しているか又は罹患を回避することが望ましい個体に、本発明の組成物又は医薬組成物を投与する工程を含む、細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患を治療又は予防する方法をも提供する。「罹患を回避することが望ましい」の範囲には、予防又は予防的処置の対象となる、予防又は予防的処置を施されるべき、予防又は予防的処置が予定される、も含まれる。「予防」の範囲には、発症、再発又は症状悪化の予防等が含まれ、治療等により症状が改善されたか又は寛解した個体に、その状態の維持又は再発予防の目的で、本発明の組成物又は医薬組成物を投与する場合を例示することができる。また、本発明においては、疾患、病態又は症状の悪化又は進行を遅らせることも「治療又は予防」の範囲に包含される。

【0208】

本発明の組成物又は医薬組成物には、治療または予防に有効な量の抗ＬＡＧ－３抗体又は該抗体の結合断片と薬学上許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤及び／又は補助剤を含有せしめることができる。

【0209】

「治療または予防に有効な量」とは、特定の疾患、投与形態および投与径路につき治療又は予防効果を奏する量を意味し、「薬理学的に有効な量」と同義である。

【0210】

本発明の組成物又は医薬組成物には、ｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、無菌性、該組成物又はそれに含まれる抗体の安定性、溶解性、徐放性、吸収性、浸透性、剤型、強度、性状、形状等を変化させたり、維持したり、保持したりするための物質（以下、「製剤用の物質」という）を含有せしめることができる。製剤用の物質としては、薬理学的に許容される物質であれば特に限定されるものではない。例えば、非毒性又は低毒性であることは、製剤用の物質が好適に具備する性質である。

【0211】

製剤用の物質として、例えば、以下のものをあげることができるが、これらに限定されるものではない； グリシン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン等のアミノ酸類、抗菌剤、アスコルビン酸、硫酸ナトリウム又は亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤、リン酸、クエン酸、ホウ酸バッファー、炭酸水素ナトリウム、トリス－塩酸（Ｔｒｉｓ－Ｈｃｌ）溶液等の緩衝剤、マンニトールやグリシン等の充填剤、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤、カフェイン、ポリビニルピロリジン、β－シクロデキストリンやヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン等の錯化剤、グルコース、マンノース又はデキストリン等の増量剤、単糖類、二糖類やグルコース、マンノースやデキストリン等の他の炭水化物、着色剤、香味剤、希釈剤、乳化剤やポリビニルピロリジン等の親水ポリマー、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン、塩化ベンズアルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロレキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素等の防腐剤、グリセリン、プロピレングリコール又はポリエチレングリコール等の溶媒、マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール、懸濁剤、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルビテート２０やポリソルビテート８０等ポリソルビテート、トリトン（ｔｒｉｔｏｎ）、トロメタミン（ｔｒｏｍｅｔｈａｍｉｎｅ）、レシチン又はコレステロール等の界面活性剤、スクロースやソルビトール等の安定化増強剤、塩化ナトリウム、塩化カリウム、マンニトールやソルビトール等の弾性増強剤、輸送剤、希釈剤、賦形剤、及び／又は薬学上の補助剤。

【0212】

これらの製剤用の物質の添加量は、抗ＬＡＧ－３抗体もしくはその結合断片またはその修飾体の重量に対して０．００１乃至１０００倍、好適には０．０１乃至１００倍、より好適には０．１乃至１０倍である。

【0213】

抗ＬＡＧ－３抗体もしくはその結合断片またはその修飾体をリポソーム中に含有せしめたイムノリポソーム、抗体とリポソームとが結合してなる抗体修飾体（米国特許第６２１４３８８号等）を含有する組成物又は医薬組成物も、本発明の組成物又は医薬組成物に含まれる。

【0214】

賦形剤や担体は、通常液体又は固体であり、注射用の水、生理食塩水、人工脳脊髄液、その他の、経口投与又は非経口投与用の製剤に用いられる物質であれば特に限定されない。生理食塩水としては、中性のもの、血清アルブミンを含むもの等をあげることができる。

【0215】

緩衝剤としては、組成物又は医薬組成物の最終ｐＨが７．０乃至８．５になるように調製されたＴｒｉｓバッファー、同じく４．０乃至５．５になるように調製された酢酸バッファー、同じく５．０乃至８．０になるように調製されたクエン酸バッファー、同じく５．０乃至８．０になるように調製されたヒスチジンバッファー等を例示することができる。

【0216】

本発明の組成物又は医薬組成物は、固体、液体、懸濁液等である。凍結乾燥製剤をあげることができる。凍結乾燥製剤を成型するには、スクロース等の賦形剤を用いることができる。

【0217】

本発明の組成物又は医薬組成物の投与径路としては、経腸投与、局所投与及び非経口投与のいずれでもよく、例えば、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与、経皮投与、骨内投与、関節内投与等をあげることができる。

【0218】

かかる組成物又は医薬組成物の組成は、投与方法、抗体のＬＡＧ－３蛋白質結合親和性等に応じて決定することができる。抗ＬＡＧ－３抗体もしくはその結合断片またはその修飾体のＬＡＧ－３蛋白質に対する親和性が高いほど（ＫＤ値が低いほど）、少ない投与量でその薬効を発揮し得る。

【0219】

抗ＬＡＧ－３抗体の投与量は、薬理学的に有効な量であれば限定されず、個体の種、疾患の種類、症状、性別、年齢、持病、該抗体のＬＡＧ－３蛋白質結合親和性又はその生物活性、その他の要素に応じて適宜決定することができるが、通常、０．０１乃至１０００ｍｇ／ｋｇ、好適には０．１乃至１００ｍｇ／ｋｇを、１乃至１８０日間に１回、又は１日２回若しくは３回以上投与することができる。

【0220】

組成物又は医薬組成物の形態としては、注射剤（凍結乾燥製剤、点滴剤を含む）、坐剤、経鼻型吸収製剤、経皮型吸収製剤、舌下剤、カプセル、錠剤、軟膏剤、顆粒剤、エアーゾル剤、丸剤、散剤、懸濁剤、乳剤、点眼剤、生体埋め込み型製剤等を例示することができる。

【0221】

抗ＬＡＧ－３抗体もしくはその結合断片またはその修飾体を有効成分として含む組成物又は医薬組成物は、他の医薬と同時に又は別個に投与することができる。例えば、他の医薬を投与した後に抗ＬＡＧ－３抗体又は該抗体の結合断片を有効成分として含む組成物又は医薬組成物を投与するか、かかる組成物又は医薬組成物を投与した後に、他の医薬を投与するか、または、当該組成物又は医薬組成物と他の医薬とを同時に投与してもよい。

【0222】

本発明の組成物又は医薬組成物と組み合わせて使用される他の医薬としては、例えば、葉酸代謝拮抗剤、カルシニューリン阻害剤、副腎皮質ステロイド剤、抗胸腺細胞グロブリン剤、核酸代謝拮抗剤、核酸合成阻害剤、細胞表面抗原を標的とする生物製剤、またはサイトカインもしくはサイトカイン受容体を標的とする生物製剤等を挙げることができ、それらは自己免疫疾患及び／又は移植物の拒絶の治療又は予防のために好適である。それら他の医薬としては、葉酸代謝拮抗剤であるＭｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ、カルシニューリン阻害剤であるＣｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ、Ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ、副腎皮質ステロイド剤であるはＭｅｔｈｙｌｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ、Ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ、核酸合成阻害剤であるＣｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ、Ａｚａｔｈｉｏｐｒｉｎｅ、抗胸腺細胞グロブリン剤であるＺｅｔｂｕｌｉｎ、Ｌｙｍｐｈｏｇｌｏｂｕｌｉｎｅ、Ｔｈｙｍｏｇｌｏｂｕｌｉｎ、核酸代謝拮抗剤であるＭｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ ｍｏｆｅｔｉｌ、細胞表面抗原を標的とする生物製剤であるＡｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、Ａｂａｔａｃｅｐｔ、Ｄｅｎｏｓｕｍａｂ、サイトカインあるいはサイトカイン受容体等を標的とする生物製剤であるＡｄａｌｉｍｕｍａｂ、Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ、Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ、Ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ、抗Ｏｒａｉ１抗体等を例示することができる。また、本発明の組成物又は医薬組成物は、大量免疫グロブリン静注療法（ＩＶＩｇ）、血漿交換療法などと併用して自己免疫疾患及び／又は移植物の拒絶の治療又は予防に使用することもできる。それら他の医薬及び療法は、自己免疫疾患及び移植物の拒絶以外の疾患の治療又は予防においても本発明の組成物と組み合わせることができる。

【0223】

悪性腫瘍の治療又は予防において本発明の組成物又は医薬組成物と組み合わせることができる医薬及び療法としては、抗がん剤、例えば、各種分子標的薬、化学療法剤、放射線療法、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体をはじめとする各種がん免疫療法剤等を挙げることができる。

【0224】

これらの他の医薬及び療法は、１種類の場合もあり、２、３あるいはそれ以上の種類を投与するか又は受けることもできる。それらをまとめて本発明の医薬組成物と「他の医薬との併用」又は「他の医薬との組み合わせ」と呼び、ＬＡＧ－３抗体、その結合断片若しくはその修飾体に加えて他の医薬を含むか又は他の療法と組み合わせて使用される本発明の組成物も「他の医薬との併用」又は「他の医薬との組み合わせ」の態様として本発明に含まれる。

【0225】

本発明は細胞傷害性Ｔ細胞を枯渇させる方法、細胞傷害性Ｔ細胞を枯渇させるための若しくは細胞傷害性Ｔ細胞枯渇用組成物又は医薬組成物を調製するためのＬＡＧ－３抗体の使用、細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患の治療または予防のためのＬＡＧ－３抗体の使用、細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患の治療または予防のためのＬＡＧ－３抗体、細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患の治療または予防に使用されるＬＡＧ－３抗体、をも提供する。ＬＡＧ－３抗体を含む細胞傷害性Ｔ細胞枯渇用キット、細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患の治療用または予防用キットも本発明に含まれる。

【実施例】

【0226】

以下、実施例において本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。

【0227】

なお、下記実施例において遺伝子操作に関する各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．著，Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓより１９８９年発刊）に記載の方法及びその他の当業者が使用する実験書に記載の方法により行うか、または、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って行った。

【0228】

実施例１．ラット抗ヒトＬＡＧ－３抗体の作製
１）－１ 免疫
ヒトＬＡＧ－３（配列番号８６：図１０１）の細胞外の４つの免疫グロブリン様ドメインのうちＮ末端から１および２番目（２３－２６２番の領域）を欠失させた変異体をｐｃＤＮＡ３．１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）にクローニングした発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１－ｈＬＡＧ－３＿Ｄ３Ｄ４を、ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｇｉｇａ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用い大量調製した。ＷＫＹ/Ｉｚｍラットの雌（日本エスエルシー社）両足下腿部をＨｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ（Ｓｉｇｍａ社）にて前処理後、同部位にｐｃＤＮＡ３．１－ｈＬＡＧ－３＿Ｄ３Ｄ４を筋注した。続けて、ＥＣＭ８３０（ＢＴＸ社）を使用し、２ニードル電極を用いて、同部位にインビボエレクトロポレーションを実施した。二週間に一度、同様のインビボエレクトロポレーションを合計３あるいは５回繰り返した後、ラットのリンパ節を採取しハイブリドーマ作製に用いた。

【0229】

１）－２ ハイブリドーマ作製
リンパ節細胞あるいは脾臓細胞とマウスミエローマＳＰ２／０－ａｇ１４細胞とをＨｙｂｒｉｍｕｎｅ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｙｔｏ Ｐｕｌｓｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて電気細胞融合し、ＣｌｏｎａＣｅｌｌ－ＨＹ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ Ｄ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に希釈して培養した。出現したハイブリドーマコロニーを回収することでモノクローンハイブリドーマを作製した。回収された各ハイブリドーマコロニーを培養し、得られたハイブリドーマ培養上清用いて抗ＬＡＧ－３抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングを行った。

【0230】

１）－３ Ｃｅｌｌ－ＥＬＩＳＡ法による抗体スクリーニング
ＨＥＫ２９３細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、ｐｃＤＮＡ３．１にヒトあるいはカニクイザルのＬＡＧ－３をクローニングして作製した発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１／ｈＬＡＧ－３およびｐｃＤＮＡ３．１／ｃｙｎｏＬＡＧ－３）もしくはコントロールのプラスミドを導入し、９６穴マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）にて、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した。培養上清を除去後、ハイブリドーマ培養上清を添加し、４℃で１時間静置した。ウェル中の細胞を５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで１回洗浄後、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで５００倍に希釈したＡｎｔｉ－Ｒａｔ ＩｇＧ－Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｒａｂｂｉｔ（Ｓｉｇｍａ社製）を加えて、４℃で１時間静置した。ウェル中の細胞を５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで５回洗浄した後、ＯＰＤ発色液（ＯＰＤ溶解液（０．０５ Ｍ クエン酸３ナトリウム、０．１Ｍ リン酸水素２ナトリウム・１２水 ｐＨ４．５）にｏ－フェニレンジアミン二塩酸塩（和光純薬社製）、Ｈ２Ｏ２をそれぞれ０．４ｍｇ／ｍＬ、０．６％（ｖ／ｖ）になるように溶解）を２５μＬ／ウェルで添加した。時々攪拌しながら発色反応を行い、１Ｍ ＨＣｌを２５μＬ／ウェルを添加して発色反応を停止させた後、プレートリーダー（ＥＮＶＩＳＩＯＮ：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で４９０ｎｍの吸光度を測定した。細胞膜表面上に発現するＬＡＧ－３に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択するため、ＬＡＧ－３遺伝子を含まないコントロールのプラスミドを導入したＨＥＫ２９３細胞と比較し、ＬＡＧ－３発現ベクター導入ＨＥＫ２９３細胞の方でより高い吸光度を示す培養上清を産生するハイブリドーマを抗ＬＡＧ－３抗体産生陽性として選択した。

【0231】

１）－４ フローサイトメトリーによる抗体スクリーニング
実施例１）－３のＣｅｌｌ－ＥＬＩＳＡで陽性と判定されたハイブリドーマが産生する抗体が、より生理的なＬＡＧ－３発現細胞であるＰＨＡ（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）活性化ヒトＴ細胞（ＰＨＡ ｂｌａｓｔ）に結合することを、フローサイトメトリー法によりさらに確認した。ヒトＰＢＭＣを２μｇ／ｍＬのＰＨＡ（Ｓｉｇｍａ社製）で３日間刺激した細胞に対しハイブリドーマ培養上清を加えて懸濁し、４℃で３０分間反応させた。ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．１％アジ化ナトリウム）で洗浄した後、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ－ｎｅａｒ－ＩＲ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｄｙｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＦＡＣＳバッファーで２００倍に希釈したＡｎｔｉ－Ｒａｔ ＩｇＧ ＰＥ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）等の二次抗体を加えて懸濁し、４℃で３０分間静置した。ＦＡＣＳバッファーで洗浄した後、１ないし２％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメーター（ＣａｎｔｏＩＩ：ＢＤ社製あるいはＦＣ５００：ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ社製）で検出を行った。データ解析はＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ社製）で行った。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ－ｎｅａｒ－ＩＲ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｄｙｅ陽性の死細胞をゲートで除外した後、生細胞の蛍光強度のヒストグラムを作成した。

【0232】

１）－５ ＡＤＣＣアッセイによるスクリーニング
１）－５－１ 標的細胞の作製
ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５－ＧＷ／ｌａｃＺ、およびＶｉｒａＰｏｗｅｒＴＭ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社）を添付プロトコールに従って２９３ＦＴ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にトランスフェクションすることにより、β－ガラクトシダーゼ遺伝子を発現する組み換えレンチウイルスを作製した。得られた組み換えレンチウイルスをＶｉｒａＰｏｗｅｒ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のプロトコールに従って２９３Ｔ細胞に感染させ、１０μｇ／ｍＬのブラストサイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）でウイルス感染細胞を選択することにより、β－ガラクトシダーゼの安定発現株を取得した。このβ－ラクトシダーゼを安定発現する２９３Ｔ細胞（以下２９３Ｔ-ｌａｃＺと表記）に、ヒトＬＡＧ－３全長の発現プラスミドをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて導入し、１日間培養した後、ＴｒｙｐＬＥｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて剥離・回収した。５％ ＦＢＳを含むフェノールレッド不含ＲＰＭＩ１６４０（以下「ＡＤＣＣ用培地」と略す）にて２回洗浄し、生細胞数をトリパンブルー色素排除試験にて計測し、ＡＤＣＣ用培地で１×１０５ 細胞／ｍｌになるよう再懸濁したものを標的細胞として用いた。

【0233】

１）－５－２ エフェクター細胞の調製
ヒト末梢血からフィコール遠心分離にてＰＢＭＣを分離し、ＡＤＣＣ用培地にて生細胞密度で１．２×１０６ 細胞／ｍＬになるように懸濁したものを、エフェクター細胞として使用した。

【0234】

１）－５－３ ＡＤＣＣアッセイ
ハイブリドーマ培養上清５０μＬ／ウェルを含む９６穴Ｕ底マイクロプレートに、１）－５－１の標的細胞を５０μＬ／ウェル添加し、４℃で３０分間静置した。ＡＤＣＣ用培地１５０μＬ／ウェルを添加して撹拌した後、室温で１２００ｒｐｍ×５分間遠心し、上清２００μＬ／ウェルを除いた。そこに、１)－５－２のエフェクター細胞を１２５μＬ／ウェル添加し、室温で１２００ｒｐｍ×５分間遠心の後、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で一晩培養した。翌日、上清５０μＬを黒色プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に回収し、β－Ｇｌｏアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）溶液５０μＬを添加し、発光量をプレートリーダー（ＥＮＶＩＳＩＯＮ：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）で測定した。ＡＤＣＣ活性による細胞溶解率は次式で算出した。

【0235】

細胞溶解率（％）＝（Ａ－Ｂ）／（Ｃ－Ｂ）×１００
Ａ：サンプルウェルのカウント
Ｂ：自然放出（抗体非添加ウェル）カウントの平均値（ｎ＝３）。抗体添加時にＡＤＣＣ用培地を５０μＬ添加した。それ以外はサンプルウェルと同様の操作を行った。
Ｃ：最大放出（標的細胞を界面活性剤で溶解させたウェル）カウントの平均値（ｎ＝３）。抗体添加時およびエフェクター細胞添加時にＡＤＣＣ用培地を５０μＬおよび７５μＬそれぞれ添加した。測定時には、細胞を含むウェルに１７５μｌのβ－Ｇｌｏアッセイシステム溶液を添加して混和し、そのうち１００μｌ分を黒色プレートに加えて測定を実施した。

【0236】

１）－６ ＬＡＧ－３／ＭＨＣクラスＩＩ結合試験によるスクリーニング
既報（非特許文献８）に準じて実施した。すなわち、９６穴Ｕ底マイクロプレートに１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０で２５ｎＭに希釈したＬＡＧ－３－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を２０μＬ／ウェル加え、そこにハイブリドーマ培養上清２０μＬ／ウェルを加えて撹拌し、４℃で２０分間静置した。そこに内因性にＭＨＣクラスＩＩ分子を高発現するＲａｊｉ細胞を１０μＬ／ウェル（２．５×１０５ 細胞／ウェル）添加して撹拌し、４℃でさらに３０分間静置した。細胞をＰＢＳもしくはＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した後、ＦＡＣＳバッファーで２００倍に希釈したＡｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ＰＥ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を加えて懸濁し、４℃で２０分間静置した。細胞をＰＢＳもしくはＦＡＣＳバッファーで洗浄した後、１ないし２％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメーター（ＣａｎｔｏＩＩ：ＢＤ社製あるいはＦＣ５００：ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ社製）で検出を行った。データ解析はＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ社製）で行い、阻害率は次式で算出した。

【0237】

阻害率（％）＝１００－（Ａ－Ｂ）／（Ｃ－Ｂ）×１００

【0238】

Ａ：サンプルウェルの平均蛍光強度
Ｂ：バックグラウンドの平均蛍光強度。ＬＡＧ－３－Ｆｃおよび抗体添加時に培地をそれぞれ２０μＬ添加した。それ以外はサンプルウェルと同様の操作を行った。
Ｃ：最大結合の平均蛍光強度。抗体添加時に培地を２０μＬ添加した。

【0239】

１）－７ モノクローナル抗体の精製
ラット抗ヒトＬＡＧ－３モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養上清から精製した。すなわち、まずＰＢＳで平衡化したＰｒｏｔｅｉｎＧカラム（ＧＥヘルスケア社製）にハイブリドーマの培養上清をアプライした。ＰＢＳでカラムを洗浄した後、０．１ Ｍグリシン/塩酸水溶液（ｐＨ２．７）で溶出し、抗体の含まれる画分を集めた。集めた画分に１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を加えてｐＨ７．０～７．５に調製した後に、Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ＵＦ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅ ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（分画分子量ＵＦ３０Ｋ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製）にてＰＢＳへのバッファー置換を行うとともに抗体の濃縮を行い、抗体濃度を２ｍｇ／ｍＬ以上に調製した。最後にＭｉｎｉｓａｒｔ－Ｐｌｕｓ ｆｉｌｔｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製）でろ過し、精製サンプルとした。

【0240】

実施例２．ラット抗ヒトＬＡＧ－３抗体（ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９およびｒＬＡ１２６４）のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価
２）－１ 取得ラット抗ＬＡＧ－３抗体（ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９およびｒＬＡ１２６４）のヒト活性化Ｔ細胞への結合性
実施例１）－７に記載の方法により、精製したラット抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９およびｒＬＡ１２６４の、ヒト活性化Ｔ細胞への結合性を検討した。図１に示すとおり、これらのラット抗ヒトＬＡＧ－３抗体はいずれもｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化ヒトＴ細胞として調製したＰＨＡ ｂｌａｓｔに濃度依存的に結合した。

【0241】

２）－２ 取得ラット抗ＬＡＧ－３抗体（ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９およびｒＬＡ１２６４）のＡＤＣＣ活性
精製したラット抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９およびｒＬＡ１２６４のＡＤＣＣ活性を、以下の方法により検討した。抗体溶液５０μＬ／ウェルを含む９６穴Ｕ底マイクロプレートに、実施例１）－５－１の標的細胞（以下、２９３Ｔ－ｌａｃＺ／ｈＬＡＧ－３細胞と記載）を５０μＬ／ウェル添加し、４℃で３０分間静置した。そこに、実施例１)－５－２のように調製したエフェクター細胞（ただし、２×１０６ 細胞／ｍＬになるように懸濁したもの）を７５μＬ／ウェル添加し、室温で１２００ｒｐｍ×５分間遠心の後、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で一晩培養した。翌日、上清５０μＬを黒色プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に回収し、β－Ｇｌｏアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）溶液５０μＬを添加し、発光量をプレートリーダー（ＥＮＶＩＳＩＯＮ：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）で測定した。ＡＤＣＣ活性による細胞溶解率は次式で算出した。

【0242】

細胞溶解率（％）＝（Ａ－Ｂ）／（Ｃ－Ｂ）×１００
Ａ：サンプルウェルのカウント
Ｂ：自然放出（抗体非添加ウェル）カウントの平均値（ｎ＝３）。抗体添加時にＡＤＣＣ用培地を５０μＬ添加した。それ以外はサンプルウェルと同様の操作を行った。
Ｃ：最大放出（標的細胞を界面活性剤で溶解させたウェル）カウントの平均値（ｎ＝３）。抗体添加時およびエフェクター細胞添加時にＡＤＣＣ用培地を５０μＬおよび７５μＬそれぞれ添加した。測定時には、細胞を含むウェルに１７５μｌのβ－Ｇｌｏアッセイシステム溶液を添加して混和し、そのうち１００μｌ分を黒色プレートに加えて測定を実施した。

【0243】

図２に示すとおり、これらのラット抗ヒトＬＡＧ－３抗体はいずれも、ヒトＬＡＧ－３発現細胞に対して濃度依存的なｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣ活性を示した。これに対して、ヒトＬＡＧ－３遺伝子をトランスフェクトしてない２９３Ｔ－ｌａｃＺ細胞に対しては、これらの抗体はＡＤＣＣ活性を示さず、作用は特異的であった。

【0244】

２）－３ 取得ラット抗ＬＡＧ－３抗体（ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９およびｒＬＡ１２６４）のＬＡＧ－３／ＭＨＣクラスＩＩ結合試験における阻害活性の検討

【0245】

実施例１）－６に記載のＬＡＧ－３／ＭＨＣクラスＩＩ結合試験により、精製した抗ＬＡＧ－３抗体（ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９およびｒＬＡ１２６４）が、ＬＡＧ－３とそのリガンドと報告されているＭＨＣクラスＩＩ分子の結合を阻害する活性を有するか検討した。その結果、図３Ａに示すとおりこれら５クローンの抗体はいずれも、ＬＡＧ－３／ＭＨＣクラスＩＩ結合試験においてほとんど阻害活性を示さず、ＬＡＧ－３のＴ細胞抑制機能発揮に必要と考えられているＭＨＣクラスＩＩ分子との結合に影響を与えないことが明らかになった。これに対して図３Ｂに示すとおり、先行技術の抗体であるヒトキメラ化抗ＬＡＧ－３抗体ＩＭＰ７３１（特許文献１）は、ＬＡＧ－３／ＭＨＣクラスＩＩ結合試験において濃度依存的に強力な阻害活性を示した。

【0246】

２）－４ 取得ラット抗ＬＡＧ－３抗体（ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９およびｒＬＡ１２６４）の２９３Ｔ－ｈＬＡＧ－３／Ｒａｊｉ細胞接着試験における阻害活性の検討
実施例２）－３に記載のＬＡＧ－３／ＭＨＣクラスＩＩ結合試験においては、ＬＡＧ－３－Ｆｃへの抗ＬＡＧ－３抗体の結合に伴う立体障害によって、Ｒａｊｉ細胞へのＬＡＧ－３－Ｆｃの結合を検出するための二次抗体Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ＰＥ ｃｏｎｊｕｇａｔｅの結合が阻害され、実際には抗体がＬＡＧ－３／ＭＨＣクラスＩＩ結合を直接阻害していないにも関わらず見かけ上、低い蛍光強度を示す可能性を完全には排除できない。そこで検出用の二次抗体を使用しない評価系として、以下のような２９３Ｔ－ｈＬＡＧ－３／Ｒａｊｉ細胞接着試験系を構築し、抗体の評価を行った。

【0247】

２９３Ｔ細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、ヒトＬＡＧ－３発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１／ｈＬＡＧ－３を導入し、ＢｉｏＣｏａｔ Ｐｏｌｙ－Ｄ－Ｌｙｓｉｎｅコート９６穴マイクロプレート（ＢＤ社製）に播種して一晩培養した。一方、Ｒａｊｉ細胞を培地（１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０）中で蛍光色素のＢＣＥＣＦ－ＡＭ（Ｄｏｊｉｎｄｏ社製、１０μＭで使用）で３７℃にて１時間標識し、洗浄後、１．６×１０６ 細胞／ｍＬになるように培地に懸濁した。トランスフェクション後一晩培養した細胞（２９３Ｔ－ｈＬＡＧ－３細胞）の培地を除去し、５０μＬ／ウェルの培地および２５μＬ／ウェルの抗体溶液を加え、３７℃で３０分間プレインキュベーションした。その後、ＢＣＥＣＦ－ＡＭ標識したＲａｊｉ細胞を２５μＬ／ウェル加えて、９００ｒｐｍで３０秒間遠心した後、３７℃で１時間インキュベーションした。反応後、培地で２ないし３回ウェルを洗浄して非接着細胞を除き、０．１％ＮＰ－４０を含むＴｒｉｓバッファー（２５ｍＭ、ｐＨ８．０）１００μＬ／ウェルで細胞を溶解し、ウェルの蛍光強度をプレートリーダー（ＥＮＶＩＳＩＯＮ：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）で測定した。阻害率は次式で算出した。

【0248】

阻害率（％）＝１００－（Ａ－Ｂ）／（Ｃ－Ｂ）×１００
Ａ：サンプルウェルの蛍光強度
Ｂ：バックグラウンドの蛍光強度。Ｒａｊｉ細胞および抗体添加時に培地を添加した。それ以外はサンプルウェルと同様の操作を行った。
Ｃ：最大結合の蛍光強度。抗体添加時に培地を添加した。

【0249】

その結果、図４に示すとおり精製ラット抗ＬＡＧ－３抗体ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９およびｒＬＡ１２６４はいずれも、２９３Ｔ－ｈＬＡＧ－３／Ｒａｊｉ細胞接着試験においてほとんど阻害活性を示さず、ＬＡＧ－３のＴ細胞抑制機能発揮に必要と考えられているＭＨＣクラスＩＩ分子との結合に影響を与えないことがさらに支持された。これに対して先行技術の抗体であるヒトキメラ化抗ＬＡＧ－３抗体ＩＭＰ７３１（特許文献１）は、本試験において１０μｇ／ｍＬの濃度で阻害率９０％と強力な阻害活性を示した。

【0250】

２）－５ 取得ラット抗ＬＡＧ－３抗体（ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９およびｒＬＡ１２６４）のエピトープの同定
ラット抗ＬＡＧ－３抗体ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９およびｒＬＡ１２６４は、ＬＡＧ－３の細胞外領域に存在する４つの免疫グロブリン様ドメインのうちＮ末端から１および２番目（以下、それぞれドメイン１および２と表記）を欠失させた変異体を免疫原として作製した抗体であることから、残るＮ末端から３および４番目（以下、それぞれドメイン３および４と表記）のいずれのドメインにこれらの抗体が結合するのかを明らかにする目的で、ドメイン３と４、あるいはドメイン４のみを発現させた細胞に対する取得ラット抗ＬＡＧ－３抗体の結合をフローサイトメトリーにより検討した。

【0251】

Ｎ末端にＦＬＡＧタグ配列（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）を付加したヒトＬＡＧ－３のドメイン３以下（２６３－５２５）あるいはドメイン４以下（３５３－５２５）の発現プラスミド（いずれもｐｃＤＮＡ３．１にクローニング）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入し、１日間培養した後に回収して、実施例１）－４に記載の方法でフローサイトメトリーにより、抗体の結合性を検討した。その結果、図５Ａに示すとおり、精製ラット抗ＬＡＧ－３抗体ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２およびｒＬＡ２２５はいずれも、ドメイン３および４を含むコンストラクトを発現させた細胞には結合したのに対し、ドメイン４のみを含むコンストラクトを発現させた細胞には結合しなかった。これら結果から、取得ラット抗ＬＡＧ－３抗体ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２およびｒＬＡ２２５はいずれも、ＬＡＧ－３細胞外領域に存在する４つの免疫グロブリン様ドメインのうちドメイン３に結合することが明らかになった。

【0252】

ハイブリドーマ培養上清を用いた同様の実験から、取得ラット抗ＬＡＧ－３抗体ｒＬＡ８６９およびｒＬＡ１２６４も、ドメイン３に結合することが明らかになっている。

【0253】

同様の方法で先行技術の抗体であるヒトキメラ化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ＩＭＰ７３１の結合ドメインを検討した結果を図５Ｂに示す。図５Ａの２種類のコンストラクトに加えて、Ｎ末端にＦＬＡＧタグ配列（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）を付加したヒトＬＡＧ－３のドメイン２以下（ヒトＬＡＧ－３アミノ酸配列／配列番号８６、図１０１のアミノ酸番号１７３－５２５）、およびヒトＬＡＧ－３の全長の発現プラスミドも用いた（いずれもｐｃＤＮＡ３．１を用いて構築；ヒトＬＡＧ－３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は配列番号８５、図１００に記載されている）。ＩＭＰ７３１および実施例２）－６で作製したラット抗ヒトＬＡＧ－３抗体クローン６Ｄ７はいずれも、全長のヒトＬＡＧ－３を発現した細胞には結合したものの、ドメイン１を欠いた変異体（ＦＬＡＧ－Ｄ２Ｄ３Ｄ４、ＦＬＡＧ－Ｄ３Ｄ４、ＦＬＡＧ－Ｄ４）には結合せず、ドメイン１に結合することが明らかになった。すなわち、ＬＡＧ－３細胞外領域に存在する４つの免疫グロブリン様ドメインのうちドメイン３に結合する取得ラット抗ＬＡＧ－３抗体ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９およびｒＬＡ１２６４は、ドメイン１に結合するＩＭＰ７３１とは異なるエピトープを認識することが明らかになった。

【0254】

２）－６ 精製ＬＡＧ－３タンパク質を免疫原としたラット抗ヒトＬＡＧ－３抗体の取得
実施例１）－１とは別の免疫方法として、精製ＬＡＧ－３タンパク質を免疫原としてラット抗ヒトＬＡＧ－３抗体の取得を行った。ヒトＬＡＧ－３の細胞外領域（１－４５０）のＣ末端にＨｉｓタグを付加したタンパク質をＦｒｅｕｎｄ‘ｓ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ（和光純薬社製）と混合（体積比で１：２）してエマルジョンにしたものを８週齢のＷＫＹ/Ｉｚｍラットの雌（日本エスエルシー社）の尾根部に１匹あたり２００μｇ投与した。３週間後に抗原タンパク質のみを尾根部に１匹あたり２００μｇ投与し、さらにその２週間後にリンパ節を採取し、実施例１）－２の方法によりハイブリドーマを作製した。実施例１）－３および１）－４などの方法でスクリーニングを行い、得られたモノクローナル抗体のエピトープを実施例２）－５の方法によって解析したところ、評価したクローンの５８％がＬＡＧ－３細胞外領域に存在する４つの免疫グロブリン様ドメインのうちドメイン１に、２６％がドメイン２に結合し、Ｎ末端に近い部分に対するモノクローナル抗体が優先的に取得されたことが明らかになった。その中で、フローサイトメトリーでヒト活性化Ｔ細胞（ＰＨＡ ｂｌａｓｔ）に強く結合するクローンの多くは、クローン６Ｄ７を含め、ＬＡＧ－３のドメイン１に結合し、それらはいずれも実施例２）－３に記載のＬＡＧ－３／ＭＨＣクラスＩＩ結合試験で強い阻害活性を示した。この結果は、ＬＡＧ－３とＭＨＣクラスＩＩ分子の結合には、ＬＡＧ－３の細胞外の４つの免疫グロブリン様ドメインのうち、Ｎ末端のドメイン１および２が重要であるというこれまでの知見(非特許文献４)とよく一致するものであり、ＬＡＧ－３とＭＨＣクラスＩＩ分子の結合を阻害しない、すなわちＬＡＧ－３のＴ細胞抑制機能を阻害しない抗体を取得するためには、実施例１）－１のような免疫方法の工夫をしてモノクローナル抗体を作製する必要があることを示している。

【0255】

実施例３．ラット抗ヒトＬＡＧ－３抗体（ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９およびｒＬＡ１２６４）の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列の決定
３）－１ ｒＬＡ２０４の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列の決定
３）－１－１ ｒＬＡ２０４産生ハイブリドーマからのｔｏｔａｌ ＲＮＡの調製
ｒＬＡ２０４の可変領域を含むｃＤＮＡを増幅するため、ｒＬＡ２０４産生ハイブリドーマよりＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製した。

【0256】

３）－１－２ ｃＤＮＡ（５’－ＲＡＣＥ－Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ）の合成
ｃＤＮＡ（５’－ＲＡＣＥ－Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ）の合成は実施例３）－１－１で調製したｔｏｔａｌ ＲＮＡの約１μｇを用い、ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて実施した。

【0257】

３）－１－３ ５’－ＲＡＣＥ ＰＣＲによるｒＬＡ２０４の重鎖可変領域を含むｃＤＮＡの増幅と配列の決定
ｒＬＡ２０４の重鎖遺伝子の可変領域のｃＤＮＡをＰＣＲで増幅するためのプライマーとして、ＵＰＭ （Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ａ Ｍｉｘ：ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔに付属）、及び
５’－ＣＴＣＣＡＧＡＧＴＴＣＣＡＧＧＴＣＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＧＣ－３’（ＲＧ２ＡＲ３；配列番号７１）の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。ＵＰＭはＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に付属のものを使用し、ＲＧ２ＡＲ３はデータベースのラット重鎖の定常領域の配列から設計した。

【0258】

このプライマーの組み合わせと、実施例３）－１－２で合成したｃＤＮＡ（５’－ＲＡＣＥ－Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ）を鋳型とした５’－ＲＡＣＥ ＰＣＲによりｒＬＡ２０４の重鎖の可変領域を含むｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲは、ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅとしてＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ社）を用い、ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のマニュアルに従い、タッチダウンＰＣＲプログラムで実施した。

【0259】

５’－ＲＡＣＥ ＰＣＲで増幅した重鎖の可変領域を含むｃＤＮＡをＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製後、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてクローニングし、クローニングした重鎖の可変領域を含むｃＤＮＡのヌクレオチド配列のシークエンス解析を実施した。

【0260】

シークエンスプライマーとして、データベースのラット重鎖の定常領域の配列から設計した
５’－ＣＴＣＣＡＧＡＧＴＴＣＣＡＧＧＴＣＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＧＣ－３’（ＲＧ２ＡＲ３；配列番号７１）の配列を有するオリゴヌクレオチド、及びＮＵＰ （Ｎｅｓｔｅｄ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ａ：ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔに付属）を用いた。

【0261】

決定されたｒＬＡ２０４の重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１に示し、アミノ酸配列を配列番号２に示した。

【0262】

３）－１－４ ５’－ＲＡＣＥ ＰＣＲによるｒＬＡ２０４の軽鎖可変領域を含むｃＤＮＡの増幅と配列の決定
ｒＬＡ２０４の軽鎖遺伝子の可変領域のｃＤＮＡをＰＣＲで増幅するためのプライマーとして、ＵＰＭ （Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ａ Ｍｉｘ：ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔに付属）、及び
５’－ＴＣＡＧＴＡＡＣＡＣＴＧＴＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＡＴＣＴＣ－３’（ＲＫＲ５；配列番号７２）の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。ＵＰＭはＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に付属のものを使用し、ＲＫＲ５はデータベースのラット軽鎖の定常領域の配列から設計した。

【0263】

このプライマーの組み合わせと、実施例３）－１－２で合成したｃＤＮＡ（５’－ＲＡＣＥ－Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ）を鋳型とした５’－ＲＡＣＥ ＰＣＲによりｒＬＡ２０４の軽鎖の可変領域を含むｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲは、ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅとしてＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ社）を用い、ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のマニュアルに従い、タッチダウンＰＣＲプログラムで実施した。

【0264】

５’－ＲＡＣＥ ＰＣＲで増幅した軽鎖の可変領域を含むｃＤＮＡをＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製後、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてクローニングし、クローニングした軽鎖の可変領域を含むｃＤＮＡのヌクレオチド配列のシークエンス解析を実施した。

【0265】

シークエンスプライマーとして、データベースのラット軽鎖の定常領域の配列から設計した
５’－ＴＣＡＧＴＡＡＣＡＣＴＧＴＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＡＴＣＴＣ－３’（ＲＫＲ５；配列番号７２）の配列を有するオリゴヌクレオチド、及びＮＵＰ （Ｎｅｓｔｅｄ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ａ：ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔに付属）を用いた。

【0266】

決定されたｒＬＡ２０４の軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号３に示し、アミノ酸配列を配列番号４に示した。

【0267】

３）－２ ｒＬＡ２１２の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列の決定
実施例３）－１と同様の方法で配列を決定した。

【0268】

決定されたｒＬＡ２１２の重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号５に示し、アミノ酸配列を配列番号６に示した。軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号７に示し、アミノ酸配列を配列番号８に示した。

【0269】

３）－３ ｒＬＡ２２５の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列の決定
実施例３）－１と同様の方法で配列を決定した。

【0270】

決定されたｒＬＡ２２５の重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号９に示し、アミノ酸配列を配列番号１０に示した。軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１１に示し、アミノ酸配列を配列番号１２に示した。

【0271】

３）－４ ｒＬＡ８６９の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列の決定
実施例３）－１と同様の方法で配列を決定した。

【0272】

決定されたｒＬＡ８６９の重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１３に示し、アミノ酸配列を配列番号１４に示した。軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１５に示し、アミノ酸配列を配列番号１６に示した。

【0273】

３）－５ ｒＬＡ１２６４の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列の決定
実施例３）－１と同様の方法で配列を決定した。

【0274】

決定されたｒＬＡ１２６４の重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１７に示し、アミノ酸配列を配列番号１８に示した。軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１９に示し、アミノ酸配列を配列番号２０に示した。

【0275】

実施例４．ヒトキメラ化抗ヒトＬＡＧ－３抗体（ｃＬＡ２１２）の作製
４）－１ キメラ及びヒト化抗体軽鎖発現ベクターｐＣＭＡ－ＬＫの構築
プラスミドｐｃＤＮＡ３．３－ＴＯＰＯ／ＬａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を制限酵素ＸｂａＩ及びＰｍｅＩで消化して得られる約５．４ｋｂのフラグメントと、配列番号２１に示すヒト軽鎖分泌シグナル及びヒトκ鎖定常領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて結合して、ｐｃＤＮＡ３．３／ＬＫを作製した。

【0276】

ｐｃＤＮＡ３．３／ＬＫを鋳型として、下記プライマーセットでＰＣＲを行い、得られた約３．８ｋｂのフラグメントをリン酸化後セルフライゲーションすることによりＣＭＶプロモーターの下流にシグナル配列、クローニングサイト、及びヒト軽鎖定常領域を持つ、キメラ及びヒト化抗体軽鎖発現ベクターｐＣＭＡ－ＬＫを構築した。
プライマーセット
５’－ＴＡＴＡＣＣＧＴＣＧＡＣＣＴＣＴＡＧＣＴＡＧＡＧＣＴＴＧＧＣ－３’（３．３－Ｆ１；配列番号７３）
５’－ＧＣＴＡＴＧＧＣＡＧＧＧＣＣＴＧＣＣＧＣＣＣＣＧＡＣＧＴＴＧ－３’（３．３－Ｒ１；配列番号７４）

【0277】

４）－２ キメラ及びヒト化抗体ＩｇＧ１タイプ重鎖発現ベクターｐＣＭＡ－Ｇ１の構築
ｐＣＭＡ－ＬＫをＸｂａＩ及びＰｍｅＩで消化して軽鎖分泌シグナル及びヒトκ鎖定常領域を取り除いたＤＮＡ断片と、配列番号２２に示すヒト重鎖シグナル配列及びヒトＩｇＧ１定常領域のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて結合して、ＣＭＶプロモーターの下流にシグナル配列、クローニングサイト、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域をもつキメラ及びヒト化抗体ＩｇＧ１タイプ重鎖発現ベクターｐＣＭＡ－Ｇ１を構築した。

【0278】

４）－３ ｃＬＡ２１２重鎖発現ベクターの構築
実施例３）－２で得られたｒＬＡ２１２の重鎖の可変領域を含むｃＤＮＡをテンプレートとして、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ社）と下記のプライマーセットで重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を増幅し、キメラ及びヒト化ＩｇＧ１タイプ重鎖発現ベクターｐＣＭＡ－Ｇ１を制限酵素ＢｌｐＩで切断した箇所にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて挿入することにより、ｃＬＡ２１２重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ－Ｇ１／ｃＬＡ２１２」と命名した。ｃＬＡ２１２重鎖のヌクレオチド配列を配列番号２３に示し、アミノ酸配列を配列番号２４に示した。
ｃＬＡ２１２重鎖用プライマーセット
５’－ＣＣＡＧＡＴＧＧＧＴＧＣＴＧＡＧＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧ－３’（２１２Ｈ－Ｆ；配列番号７５）
５’－ＣＴＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＡＣＴＧＴＧＡＣＣＡＴＧＡＣＴＣＣＴＴＧＧＣＣＣＣＡＧ－３’（２１２Ｈ－Ｒ；配列番号７６）

【0279】

４）－４ ｃＬＡ２１２軽鎖発現ベクターの構築
実施例３）－２で得られたｒＬＡ２１２の軽鎖の可変領域を含むｃＤＮＡをテンプレートとして、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ社）と下記のプライマーセットで軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを含むＤＡＮ断片を増幅し、キメラ及びヒト化軽鎖発現汎用ベクターｐＣＭＡ－ＬＫを制限酵素ＢｓｉＷＩで切断した箇所にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて挿入することにより、ｃＬＡ２１２の軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ－ＬＫ／ｃＬＡ２１２」と命名した。ｃＬＡ２１２の軽鎖のヌクレオチド配列を配列番号２５に示し、アミノ酸配列を配列番号２６に示した。
ｃＬＡ２１２軽鎖用プライマーセット
５’－ＡＴＣＴＣＣＧＧＣＧＣＧＴＡＣＧＧＣＡＡＣＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＣＡＡＡＴＣＣ－３’（２１２Ｌ－Ｆ；配列番号７７）
５’－ＧＧＡＧＧＧＧＧＣＧＧＣＣＡＣＡＧＣＣＣＧＴＴＴＣＡＧＴＴＣＣＡＧＣＴＣＧＧＴＣＣＣＡＧＣ－３’（２１２Ｌ－Ｒ；配列番号７８）

【0280】

４）－５ ｃＬＡ２１２の生産
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）はマニュアルに従い、継代、培養をおこなった。対数増殖期の１．２×１０９個のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を３Ｌ Ｆｅｒｎｂａｃｈ Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ Ｆｌａｓｋ（ＣＯＲＮＩＮＧ社）に播種し、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で希釈して２．０×１０６細胞／ｍｌに調製したのちに、３７℃、８％ＣＯ２インキュベーター内で９０ｒｐｍで１時間振とう培養した。Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ ＃２４７６５）１．８ｍｇをＯｐｔｉ－Ｐｒｏ ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）２０ｍｌに溶解し、次にＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ Ｘｔｒａ（ＴａＫａＲａ社）を用いて調製したＨ鎖発現ベクター（０．２４ｍｇ）及びＬ鎖発現ベクター（０．３６ｍｇ）を２０ｍｌのＯｐｔｉ－Ｐｒｏ ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に添加した。Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ／Ｏｐｔｉ－Ｐｒｏ ＳＦＭ混合液２０ｍｌに、発現ベクター／Ｏｐｔｉ－Ｐｒｏ ＳＦＭ混合液２０ｍｌを加え穏やかに攪拌し、さらに５分間放置した後にＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞に添加した。３７℃、８％ＣＯ２インキュベーターで４時間、９０ｒｐｍで振とう培養後に６００ｍｌのＥＸ－ＣＥＬＬ ＶＰＲＯ培地（ＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、１８ｍｌのＧｌｕｔａＭＡＸ Ｉ（ＧＩＢＣＯ社）、及び３０ｍｌのＹｅａｓｔｏｌａｔｅ Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｅ（ＧＩＢＣＯ社）を添加し、３７℃、８％ＣＯ２インキュベーターで７日間、９０ｒｐｍで振とう培養して得られた培養上清をＤｉｓｐｏｓａｂｌｅ Ｃａｐｓｕｌｅ Ｆｉｌｔｅｒ （Ａｄｖａｎｔｅｃ ＃ＣＣＳ－０４５－Ｅ１Ｈ）でろ過した。

【0281】

ｐＣＭＡ－Ｇ１／ｃＬＡ２１２とｐＣＭＡ－ＬＫ／ｃＬＡ２１２との組合せによって取得されたｒＬＡ２１２のヒトキメラ抗体を「ｃＬＡ２１２」と命名した。

【0282】

４）－６ ｃＬＡ２１２の精製
実施例４）－５で得られた培養上清から抗体をｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィー（４－６℃下）で精製した。ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィー精製後のバッファー置換工程は４－６℃下で実施した。最初に培養上清をＰＢＳで平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ（ＧＥヘルスケア社製）が充填されたカラムにアプライした。培養液がカラムに全て入ったのち、カラム容量２倍以上のＰＢＳでカラムを洗浄した。次に２Ｍアルギニン塩酸塩溶液（ｐＨ４．０）で溶出し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を透析（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅ）によりＨＢＳｏｒ（２５ｍＭ ヒスチジン／５％ ソルビトール、ｐＨ６．０）への液置換を行った。最後にＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ＵＦ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅ ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（分画分子量ＵＦ１０Ｋ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社，４℃下）にて濃縮し、ＩｇＧ濃度を２ｍｇ／ｍｌ以上に調製し精製サンプルとした。最後にＭｉｎｉｓａｒｔ－Ｐｌｕｓ ｆｉｌｔｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）でろ過し、精製サンプルとした。

【0283】

４）－７ ヒトキメラ化抗ＬＡＧ－３抗体（ｃＬＡ２１２）の抗原結合活性
２９３Ｔ－ｌａｃＺ細胞（実施例１）－５－１に記載）に対し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、ヒトＬＡＧ－３の発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１－ｈＬＡＧ－３を導入し、一日間培養した後、フローサイトメトリーに使用した。フローサイトメトリーは、実施例１）－４に記載の方法に準じて行い、ただし二次抗体はＦＡＣＳバッファーで２００倍に希釈したＡｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ＰＥ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を使用した。図６に示すように、ヒトキメラ化抗ＬＡＧ－３抗体ｃＬＡ２１２は、濃度依存的にヒトＬＡＧ－３発現２９３Ｔ－ｌａｃＺ細胞に結合し、キメラ化によっても結合活性を保持していることが明らかになった。

【0284】

実施例５．ラット抗ヒトＬＡＧ－３抗体（ｒＬＡ２１２）のヒト化バージョン（ｈＬＡ２１２）の設計
５－１ ラット抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｒＬＡ２１２のヒト化体デザイン
５）－１－１ ｒＬＡ２１２の可変領域の分子モデリング
ｒＬＡ２１２の可変領域の分子モデリングは、ホモロジーモデリングとして公知の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０３，１２１－１５３，（１９９１））によって実行された。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３５，Ｄ３０１－Ｄ３０３（２００７））に登録されているヒト免疫グロブリンの可変領域の１次配列（Ｘ線結晶構造から誘導される三次元構造が入手可能である）を、実施例３）－２で決定されたｒＬＡ２１２の可変領域と比較した。結果として２ＧＨＷと２ＡＲＪがｒＬＡ２１２の重鎖と軽鎖の可変領域に対して最も高い配列同一性を有するとして選択された。フレームワーク領域の三次元構造は、ｒＬＡ２１２の重鎖及び軽鎖に対応する２ＧＨＷと２ＡＲＪの座標を組み合わせて、「フレームワークモデル」を得ることによって作製された。次いで、それぞれのＣＤＲについての代表的なコンホメーションがフレームワークモデルに組み込まれた。最後に、エネルギーの点でｒＬＡ２１２の可変領域の可能性のある分子モデルを得るために、不利な原子間接触を除くためのエネルギー計算を行った。上記手順を、市販のタンパク質立体構造解析プログラムＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ社製）を用いて行った。

【0285】

５）－１－２ ヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２に対するアミノ酸配列の設計
ヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２の構築を、ＣＤＲグラフティング（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，１００２９－１００３３（１９８９））として一般的に公知の方法によって行った。アクセプター抗体は、フレームワーク領域内のアミノ酸同一性に基づいて選択された。

【0286】

ｒＬＡ２１２のフレームワーク領域の配列を、ＫＡＢＡＴ ｅｔ ａｌ． （Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））において既定されるヒトのサブグループ・コンセンサス配列やＧｅｒｍｌｉｎｅ配列のフレームワーク領域と比較した。結果として、重鎖についてはヒトｇａｍｍａ鎖サブグループ３のコンセンサス配列が、軽鎖についてはヒトｋａｐｐａ鎖サブグループ１のコンセンサス配列が、そのフレームワーク領域において高い配列同一性に有することに起因して、アクセプターとして選択された。アクセプターについてのフレームワーク領域のアミノ酸残基を、ｒＬＡ２１２についてのアミノ酸残基と整列させ、異なるアミノ酸が使用される位置を同定した。これらの残基の位置は、実施例５）－１－１で構築されたｒＬＡ２１２の三次元モデルを使用して分析され、そしてアクセプター上にグラフティングされるべきドナー残基が、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，１００２９－１００３３（１９８９））によって与えられる基準によって選択された。選択された幾つかのドナー残基をアクセプター抗体に移入することによって、ヒト化ｈＬＡ２１２の配列を以下の実施例に記載されるように構築した。

【0287】

５）－２ ｒＬＡ２１２重鎖のヒト化
５）－２－１ ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ２タイプ重鎖
配列番号２４に示されるキメラｃＬＡ２１２の重鎖のうち可変領域部分のアミノ酸番号１６目のアルギニンをグリシンに、アミノ酸番号１９目のリジンをアルギニンに、アミノ酸番号４２目のスレオニンをグリシンに、アミノ酸番号４３目のアルギニンをリジンに、アミノ酸番号４９目のアラニンをグリシンに、アミノ酸番号８４目のアスパラギン酸をアスパラギンに、アミノ酸番号８８目のセリンをアラニンに、アミノ酸番号９３目のスレオニンをバリンに、アミノ酸番号１１５目のバリンをスレオニンに、アミノ酸番号１１６目のメチオニンをロイシンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈＬＡ２１２重鎖を「ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ２タイプ重鎖」（「ｈＬＡ２１２＿Ｈ２」と呼ぶこともある）と命名した。

【0288】

ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ２タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２８に記載されている。配列番号２８のアミノ酸配列の１乃至１９番目のアミノ酸残基からなる配列、２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる配列、１４１乃至４７０番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域、重鎖定常領域に相当する。配列番号２８のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２７に記載されている。配列番号２７のヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなる配列、５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなる配列、４２１乃至１４１０番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域配列、重鎖定常領域配列をコードしている。配列番号２７のヌクレオチド配列及び配列番号２８のアミノ酸配列は、それぞれ図４２及び４３にも記載されている。

【0289】

５）－２－２ ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ３タイプ重鎖
配列番号２４に示されるキメラｃＬＡ２１２の重鎖のうち可変領域部分のアミノ酸番号１６目のアルギニンをグリシンに、アミノ酸番号１９目のリジンをアルギニンに、アミノ酸番号４２目のスレオニンをグリシンに、アミノ酸番号４３目のアルギニンをリジンに、アミノ酸番号８８目のセリンをアラニンに、アミノ酸番号９３目のスレオニンをバリンに、アミノ酸番号１１５目のバリンをスレオニンに、アミノ酸番号１１６目のメチオニンをロイシンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈＬＡ２１２重鎖を「ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ３タイプ重鎖」（「ｈＬＡ２１２＿Ｈ３」と呼ぶこともある）と命名した。

【0290】

ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ３タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３０に記載されている。配列番号３０のアミノ酸配列の１乃至１９番目のアミノ酸残基からなる配列、２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる配列、１４１乃至４７０番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域、重鎖定常領域に相当する。配列番号３０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２９に記載されている。配列番号２９のヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなる配列、５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなる配列、４２１乃至１４１０番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域配列、重鎖定常領域配列をコードしている。配列番号２９のヌクレオチド配列及び配列番号３０のアミノ酸配列は、それぞれ図４４及び４５にも記載されている。

【0291】

５）－３ ｒＬＡ２１２軽鎖のヒト化
５）－３－１ ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ１タイプ軽鎖
配列番号２６に示されるキメラｃＬＡ２１２の軽鎖のうち可変領域部分のアミノ酸番号１目のアスパラギンをアスパラギン酸に、アミノ酸番号３目のバリンをグルタミンに、アミノ酸番号９目のリジンをセリンに、アミノ酸番号１１目のメチオニンをロイシンに、アミノ酸番号１３目のイソロイシンをアラニンに、アミノ酸番号２１目のメチオニンをイソロイシンに、アミノ酸番号２２目のアスパラギンをスレオニンに、アミノ酸番号３８目のリジンをグルタミンに、アミノ酸番号４３目のセリンをアラニンに、アミノ酸番号６０目のアスパラギン酸をセリンに、アミノ酸番号６３目のスレオニンをセリンに、アミノ酸番号６５目のグリシンをセリンに、アミノ酸番号６７目のチロシンをセリンに、アミノ酸番号７６目のアスパラギンをセリンに、アミノ酸番号７８目のバリンをロイシンに、アミノ酸番号８０目のアラニンをプロリンに、アミノ酸番号８３目のアラニンをフェニルアラニンに、アミノ酸番号８５目のフェニルアラニンをスレオニンに、アミノ酸番号１００目のアラニンをグルタミンに、アミノ酸番号１０３目のグルタミン酸をリジンに、アミノ酸番号１０４目のロイシンをバリンに、アミノ酸番号１０６目のロイシンをイソロイシンに、アミノ酸番号１０９目のアラニンをスレオニンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈＬＡ２１２軽鎖を「ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ１タイプ軽鎖」（「ｈＬＡ２１２＿Ｌ１」と呼ぶこともある）と命名した。

【0292】

ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ１タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３２に記載されている。配列番号３２のアミノ酸配列の１乃至２０番目のアミノ酸残基からなる配列、２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる配列、１３０乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号３２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３１に記載されている。配列番号３１のヌクレオチド配列の１乃至６０番目のヌクレオチドからなる配列、６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなる配列、３８８乃至７０２番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域配列、軽鎖定常領域配列をコードしている。配列番号３１のヌクレオチド配列及び配列番号３２のアミノ酸配列は、それぞれ図４６及び４７にも記載されている。

【0293】

５）－３－２ ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ２タイプ軽鎖
配列番号２６に示されるキメラｃＬＡ２１２の軽鎖のうち可変領域部分のアミノ酸番号１目のアスパラギンをアスパラギン酸に、アミノ酸番号３目のバリンをグルタミンに、アミノ酸番号９目のリジンをセリンに、アミノ酸番号１１目のメチオニンをロイシンに、アミノ酸番号１３目のイソロイシンをアラニンに、アミノ酸番号２１目のメチオニンをイソロイシンに、アミノ酸番号２２目のアスパラギンをスレオニンに、アミノ酸番号３８目のリジンをグルタミンに、アミノ酸番号６０目のアスパラギン酸をセリンに、アミノ酸番号６３目のスレオニンをセリンに、アミノ酸番号６５目のグリシンをセリンに、アミノ酸番号７６目のアスパラギンをセリンに、アミノ酸番号７８目のバリンをロイシンに、アミノ酸番号８０目のアラニンをプロリンに、アミノ酸番号８３目のアラニンをフェニルアラニンに、アミノ酸番号８５目のフェニルアラニンをスレオニンに、アミノ酸番号１００目のアラニンをグルタミンに、アミノ酸番号１０３目のグルタミン酸をリジンに、アミノ酸番号１０４目のロイシンをバリンに、アミノ酸番号１０６目のロイシンをイソロイシンに、アミノ酸番号１０９目のアラニンをスレオニンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈＬＡ２１２軽鎖を「ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ２タイプ軽鎖」（「ｈＬＡ２１２＿Ｌ２」と呼ぶこともある）と命名した。

【0294】

ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ２タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３４に記載されている。配列番号３４のアミノ酸配列の１乃至２０番目のアミノ酸残基からなる配列、２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる配列、１３０乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号３４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３３に記載されている。配列番号３３のヌクレオチド配列の１乃至６０番目のヌクレオチドからなる配列、６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなる配列、３８８乃至７０２番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域配列、軽鎖定常領域配列をコードしている。配列番号３３のヌクレオチド配列及び配列番号３４のアミノ酸配列は、それぞれ図４８及び４９にも記載されている。

【0295】

５）－３－３ ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ３タイプ軽鎖
配列番号２６に示されるキメラｃＬＡ２１２の軽鎖のうち可変領域部分のアミノ酸番号３目のバリンをグルタミンに、アミノ酸番号９目のリジンをセリンに、アミノ酸番号１１目のメチオニンをロイシンに、アミノ酸番号１３目のイソロイシンをアラニンに、アミノ酸番号２１目のメチオニンをイソロイシンに、アミノ酸番号２２目のアスパラギンをスレオニンに、アミノ酸番号６３目のスレオニンをセリンに、アミノ酸番号７６目のアスパラギンをセリンに、アミノ酸番号７８目のバリンをロイシンに、アミノ酸番号８０目のアラニンをプロリンに、アミノ酸番号８３目のアラニンをフェニルアラニンに、アミノ酸番号１００目のアラニンをグルタミンに、アミノ酸番号１０３目のグルタミン酸をリジンに、アミノ酸番号１０４目のロイシンをバリンに、アミノ酸番号１０６目のロイシンをイソロイシンに、アミノ酸番号１０９目のアラニンをスレオニンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈＬＡ２１２軽鎖を「ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ３タイプ軽鎖」（「ｈＬＡ２１２＿Ｌ３」と呼ぶこともある）と命名した。

【0296】

ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ３タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３６に記載されている。配列番号３６のアミノ酸配列の１乃至２０番目のアミノ酸残基からなる配列、２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる配列、１３０乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号３６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３５に記載されている。配列番号３５のヌクレオチド配列の１乃至６０番目のヌクレオチドからなる配列、６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなる配列、３８８乃至７０２番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域配列、軽鎖定常領域配列をコードしている。配列番号３５のヌクレオチド配列及び配列番号３６のアミノ酸配列は、それぞれ図５０及び５１にも記載されている。

【0297】

５）－３－４ ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ４タイプ軽鎖
配列番号２６に示されるキメラｃＬＡ２１２の軽鎖のうち可変領域部分のアミノ酸番号１目のアスパラギンをアスパラギン酸に、アミノ酸番号３目のバリンをグルタミンに、アミノ酸番号９目のリジンをセリンに、アミノ酸番号２２目のアスパラギンをスレオニンに、アミノ酸番号６０目のアスパラギン酸をセリンに、アミノ酸番号６３目のスレオニンをセリンに、アミノ酸番号６５目のグリシンをセリンに、アミノ酸番号６７目のチロシンをセリンに、アミノ酸番号７６目のアスパラギンをセリンに、アミノ酸番号８０目のアラニンをプロリンに、アミノ酸番号８３目のアラニンをフェニルアラニンに、アミノ酸番号８５目のフェニルアラニンをスレオニンに、アミノ酸番号１００目のアラニンをグルタミンに、アミノ酸番号１０３目のグルタミン酸をリジンに、アミノ酸番号１０９目のアラニンをスレオニンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈＬＡ２１２軽鎖を「ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ４タイプ軽鎖」（「ｈＬＡ２１２＿Ｌ４」と呼ぶこともある）と命名した。

【0298】

ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ４タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３８に記載されている。配列番号３８のアミノ酸配列の１乃至２０番目のアミノ酸残基からなる配列、２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる配列、１３０乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号３８のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３７に記載されている。配列番号３７のヌクレオチド配列の１乃至６０番目のヌクレオチドからなる配列、６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなる配列、３８８乃至７０２番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域配列、軽鎖定常領域配列をコードしている。配列番号３７のヌクレオチド配列及び配列番号３８のアミノ酸配列は、それぞれ図５２及び５３にも記載されている。

【0299】

５）－３－５ ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ５タイプ軽鎖
配列番号２６に示されるキメラｃＬＡ２１２の軽鎖のうち可変領域部分のアミノ酸番号３目のバリンをグルタミンに、アミノ酸番号９目のリジンをセリンに、アミノ酸番号２２目のアスパラギンをスレオニンに、アミノ酸番号６３目のスレオニンをセリンに、アミノ酸番号７６目のアスパラギンをセリンに、アミノ酸番号８０目のアラニンをプロリンに、アミノ酸番号１００目のアラニンをグルタミンに、アミノ酸番号１０３目のグルタミン酸をリジンに、アミノ酸番号１０９目のアラニンをスレオニンに、置き換えることを伴い設計されたヒト化ｈＬＡ２１２軽鎖を「ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ５タイプ軽鎖」（「ｈＬＡ２１２＿Ｌ５」と呼ぶこともある）と命名した。

【0300】

ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ５タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号４０に記載されている。配列番号４０のアミノ酸配列の１乃至２０番目のアミノ酸残基からなる配列、２１乃至１２９番目のアミノ酸残基からなる配列、１３０乃至２３４番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号４０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３９に記載されている。配列番号３９のヌクレオチド配列の１乃至６０番目のヌクレオチドからなる配列、６１乃至３８７番目のヌクレオチドからなる配列、３８８乃至７０２番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域配列、軽鎖定常領域配列をコードしている。配列番号３９のヌクレオチド配列及び配列番号４０のアミノ酸配列は、それぞれ図５４及びｂ５５にも記載されている。

【0301】

５）－４ 重鎖及び軽鎖の組み合わせによるヒト化ｈＬＡ２１２の設計
ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ２タイプ重鎖及びヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ１タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ１」（「ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ１」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ２タイプ重鎖及びヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ２タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ２」（「ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ２」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ２タイプ重鎖及びヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ３タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ３」（「ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ３」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ２タイプ重鎖及びヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ４タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ４」（「ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ４」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ２タイプ重鎖及びヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ５タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ５」（「ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ５」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ３タイプ重鎖及びヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ１タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ１」（「ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ１」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ３タイプ重鎖及びヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ２タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ２」（「ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ２」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ３タイプ重鎖及びヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ３タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ３」（「ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ３」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ３タイプ重鎖及びヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ４タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ４」（「ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ４」と呼ぶこともある）と命名した。ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ３タイプ重鎖及びヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｌ５タイプ軽鎖からなる抗体を設計し「ヒト化ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ５」（「ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ５」と呼ぶこともある）と命名した。以上により設計した抗体は、実施例６に準じて作製し、実施例７及び実施例８に準じて評価することができる。

【0302】

実施例６．ヒトキメラ化抗ＬＡＧ－３抗体ｃＬＡ２１２のヒト化抗体（ｈＬＡ２１２）の発現および精製
６）－１ ｈＬＡ２１２の重鎖発現ベクターの構築
６）－１－１ ｈＬＡ２１２＿Ｈ２タイプ重鎖発現ベクターの構築
配列番号２７に示すｈＬＡ２１２＿Ｈ２のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３６乃至４３７に示されるｈＬＡ２１２＿Ｈ２の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社 Ｓｔｒｉｎｇｓ ＤＮＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）。合成したＤＮＡ断片を、キメラ及びヒト化抗体ＩｇＧ１タイプ重鎖発現ベクターｐＣＭＡ－Ｇ１を制限酵素ＢｌｐＩで切断した箇所にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて挿入することによりｈＬＡ２１２＿Ｈ２発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｈ２」と命名した。

【0303】

６）－１－２ ｈＬＡ２１２＿Ｈ３タイプ重鎖発現ベクターの構築
配列番号２９に示すｈＬＡ２１２＿Ｈ３のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３６乃至４３７に示されるｈＬＡ２１２＿Ｈ２の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社 Ｓｔｒｉｎｇｓ ＤＮＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）。実施例６）－１－１と同様の方法でｈＬＡ２１２＿Ｈ３発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｈ３」と命名した。

【0304】

６）－２ ｈＬＡ２１２の軽鎖発現ベクターの構築
６）－２－１ ｈＬＡ２１２＿Ｌ１タイプ軽鎖発現ベクターの構築
配列番号３１に示すｈＬＡ２１２＿Ｌ１のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３７乃至４０２に示されるｈＬＡ２１２＿Ｌ１の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社 Ｓｔｒｉｎｇｓ ＤＮＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）。合成したＤＮＡ断片を、キメラ及びヒト化抗体軽鎖発現ベクターｐＣＭＡ－ＬＫを制限酵素ＢｓｉＷＩで切断した箇所にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて挿入することによりｈＬＡ２１２＿Ｌ１発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｌ１」と命名した。

【0305】

６）－２－２ ｈＬＡ２１２＿Ｌ２タイプ軽鎖発現ベクターの構築
配列番号３３に示すｈＬＡ２１２＿Ｌ２のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３７乃至４０２に示されるｈＬＡ２１２＿Ｌ２の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社 Ｓｔｒｉｎｇｓ ＤＮＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）。実施例６）－２－１と同様の方法でｈＬＡ２１２＿Ｌ２発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｌ２」と命名した。

【0306】

６）－２－３ ｈＬＡ２１２＿Ｌ３タイプ軽鎖発現ベクターの構築
配列番号３５に示すｈＬＡ２１２＿Ｌ３のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３７乃至４０２に示されるｈＬＡ２１２＿Ｌ３の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社 Ｓｔｒｉｎｇｓ ＤＮＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）。実施例６）－２－１と同様の方法でｈＬＡ２１２＿Ｌ３発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｌ３」と命名した。

【0307】

６）－２－４ ｈＬＡ２１２＿Ｌ４タイプ軽鎖発現ベクターの構築
配列番号３７に示すｈＬＡ２１２＿Ｌ４のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３７乃至４０２に示されるｈＬＡ２１２＿Ｌ４の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社 Ｓｔｒｉｎｇｓ ＤＮＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）。実施例６）－２－１と同様の方法でｈＬＡ２１２＿Ｌ４発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｌ４」と命名した。

【0308】

６）－２－５ ｈＬＡ２１２＿Ｌ５タイプ軽鎖発現ベクターの構築
配列番号３９に示すｈＬＡ２１２＿Ｌ５のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３７乃至４０２に示されるｈＬＡ２１２＿Ｌ５の可変領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社 Ｓｔｒｉｎｇｓ ＤＮＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）。実施例６）－２－１と同様の方法でｈＬＡ２１２＿Ｌ５発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｌ５」と命名した。

【0309】

６）－３ ｈＬＡ２１２抗体の調製
６）－３－１ ｈＬＡ２１２抗体の生産
実施例４）－５と同様の方法で生産した。すなわち、ｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｈ２とｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｌ１との組合せによって、ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ１を取得した。ｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｈ２とｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｌ２との組合せによって、ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ２を取得した。ｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｈ２とｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｌ３の組合せによって、ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ３を取得した。ｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｈ２とｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｌ４との組合せによって、ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ４を取得した。ｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｈ２とｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｌ５との組合せによって、ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ５を取得した。ｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｈ３とｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｌ１との組合せによって、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ１を取得した。ｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｈ３とｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｌ２との組合せによって、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ２を取得した。ｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｈ３とｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｌ３の組合せによって、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ３を取得した。ｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｈ３とｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｌ４との組合せによって、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ４を取得した。ｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｈ３とｐＣＭＡ／ｈＬＡ２１２＿Ｌ５との組合せによって、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ５を取得した。
６）－３－２ ｈＬＡ２１２抗体の精製
６）－３－１で得られた培養上清を、実施例４）－６と同様の方法で精製した。

【0310】

実施例７．ヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体（ｈＬＡ２１２）のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価
７）－１ ヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体（ｈＬＡ２１２）のＢｉａｃｏｒｅによる抗原結合活性測定
ヒトＬＡＧ－３の細胞外の４つの免疫グロブリン様ドメインのうちＮ末端から３および４番目（２６３－４５０番の領域）の部分のＣ末端にＨｉｓタグを付加したタンパク質ＬＡＧ－３＿Ｄ３Ｄ４－Ｈｉｓを、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に発現させた。得られた培養上清をバッファー置換（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）し、ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム（ＧＥヘルスケア社）さらにＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム（ＧＥヘルスケア社）を用いて、ヒトＬＡＧ－３＿Ｄ３Ｄ４－Ｈｉｓタンパク質を精製した。最終バッファーはＰＢＳとした。

【0311】

抗体と抗原（ＬＡＧ－３＿Ｄ３Ｄ４－Ｈｉｓ）との解離定数測定は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥヘルスケア社）を使用し、固定化した抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅ ｋｉｔ、ＧＥヘルスケア社）に抗体をリガンドとして捕捉（キャプチャー）し、抗原をアナライトとして測定するキャプチャー法にて行った。抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体は、センサーチップＣＭ５（ＧＥヘルスケア社）へアミンカップリング法にて約１０００ＲＵを目標に共有結合させた。リファレンスセルにも同様に固定化した。ランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ，３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０）を用いた。抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体を固定化したチップ上に、抗体を約１分間添加した後、抗原の希釈系列溶液（０．０６－２０ｎＭ）を流速９０μｌ／分で３００秒間添加し、引き続き３６００秒間の解離相をモニターした。再生溶液として、３Ｍ塩化マグネシウム溶液を流速１０μｌ／分で３０秒間添加した。データの解析には、分析ソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ｖｅｒｓｉｏｎ １．０）の１：１結合モデルを用いて、結合速度定数ｋａ、解離速度定数ｋｄ及び解離定数（ＫＤ；ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ）を算出した。解離定数は図７に示されている。

【0312】

７）－２ ヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体（ｈＬＡ２１２）のフローサイトメトリーによるヒトＬＡＧ－３発現細胞への結合性の検討
２９３Ｔ－ｌａｃＺ細胞（実施例１）－５－１に記載）に対し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、ヒトＬＡＧ－３の発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１／ｈＬＡＧ－３を導入し、一日間培養した後、フローサイトメトリーに使用した。フローサイトメトリーは、実施例１）－４に記載の方法に準じて行い、ただし二次抗体はＦＡＣＳバッファーで２００倍に希釈したＡｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ＰＥ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を使用した。図８に示すように、１０クローンのヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体（ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ１、ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ２、ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ３、ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ４、ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ５、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ１、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ２、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ３、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ４、およびｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ５）はいずれも、ヒトキメラ化抗ＬＡＧ－３抗体ｃＬＡ２１２と同程度に、濃度依存的なヒトＬＡＧ－３発現２９３Ｔ－ｌａｃＺ細胞に対する結合性を示し、ヒト化によっても結合活性を保持していることが明らかになった。

【0313】

７）－３ ヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体（ｈＬＡ２１２）のＡＤＣＣ活性
実施例２）－２に記載の方法により、ヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体（ｈＬＡ２１２）のＡＤＣＣ活性を検討した。その結果、図９に示すように、１０クローンのヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体（ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ１、ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ２、ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ３、ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ４、ｈＬＡ２１２＿Ｈ２／Ｌ５、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ１、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ２、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ３、ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ４、およびｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ５）はいずれも、ヒトキメラ化抗ＬＡＧ－３抗体ｃＬＡ２１２とほぼ同程度に、濃度依存的なヒトＬＡＧ－３発現２９３Ｔ－ｌａｃＺ細胞に対するＡＤＣＣ活性を示し、ヒト化によってもＡＤＣＣ活性を保持していることが明らかになった。

【0314】

７）－４ ヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ２のＬＡＧ－３のＴ細胞抑制機能に対する影響の検討
ＬＡＧ－３は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合することで、Ｔ細胞に何らかの抑制性のシグナルを伝達し、Ｔ細胞の機能を負に制御することが知られている(非特許文献１)。ＬＡＧ－３とＭＨＣクラスＩＩ分子の結合には、ＬＡＧ－３の細胞外の４つの免疫グロブリン様ドメインのうち、Ｎ末端のドメイン１および２が重要であると考えられている(非特許文献４)。実施例１の方法で取得した５クローンのラット抗ヒトＬＡＧ－３抗体（ｒＬＡ２０４、ｒＬＡ２１２、ｒＬＡ２２５、ｒＬＡ８６９およびｒＬＡ１２６４）はいずれもドメイン３を認識し、ＬＡＧ－３／ＭＨＣクラスＩＩ結合試験および２９３Ｔ－ｈＬＡＧ－３／Ｒａｊｉ細胞接着試験で阻害活性を示さなかったのに対し、先行技術の抗体であるヒトキメラ化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ＩＭＰ７３１はドメイン１を認識し、ＬＡＧ－３／ＭＨＣクラスＩＩ結合試験および２９３Ｔ－ｈＬＡＧ－３／Ｒａｊｉ細胞接着試験で強力な阻害活性を示したことを実施例２において明らかにした。これらの結果から、実施例１の方法で取得したクローンおよびそれに由来するヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体はＬＡＧ－３本来のＴ細胞抑制機能に影響を与えないのに対し、ＩＭＰ７３１はそれを阻害することが想定された。このことを実験的に確かめるために、既報（非特許文献９）に準じて、ヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ２の、ＬＡＧ－３のＴ細胞抑制機能に対する影響を検討した。ヒト末梢血からフィコール遠心分離にて分離したＰＢＭＣを、２×１０５ 細胞／ウェルで９６穴マイクロプレートに播種し、抗体を添加した後、３７℃で３０分間プレインキュベーションした。そこにＳＥＢ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ Ｂ、Ｓｉｇｍａ社製）を最終濃度1 ng/mLになるように加え、４日間培養したときの培養上清中のＩＬ－２濃度をＨｕｍａｎ ＩＬ－２ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｋｉｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）により定量した。その結果、図１０に示すように、作製したヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ２はほとんどＩＬ－２産生に影響を与えなかったのに対し、ＩＭＰ７３１はＩＬ－２産生を増加させた。すなわち、当初の予測どおり、作製したヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ２はＬＡＧ－３のＴ細胞抑制機能に影響を与えないのに対し、ＩＭＰ７３１はこれを阻害することで、逆に免疫系を活性化してしまうリスクがあることが明らかになった。

【0315】

実施例８．糖鎖修飾が調節されたヒト化抗体の調製
配列番号３０（図４５）で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２０乃至４７０を含む重鎖、および、配列番号３４（図４９）で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１乃至２３４を含む軽鎖を含んでなるヒト化抗体を、公知の方法に従って、該抗体蛋白質に結合する糖鎖修飾を脱フコース化することにより調節し、得られた抗体をｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２と命名した。当該修飾体を質量分析に供したところ、フコースを含有するＨ鎖のピークは検出限界以下であった。本発明においては、ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２のように糖鎖修飾が調節された抗体も「抗体」または「抗体の修飾体」と呼ぶ。

【0316】

実施例９．ヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価
９）－１ ヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２のＬＡＧ－３発現細胞に対する結合活性
実施例７）－２に記載の方法によりヒトＬＡＧ－３を発現させた２９３Ｔ-ｌａｃＺ細胞に対する、ヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２の結合をフローサイトメトリーにより検討した。その結果、図１１に示すように、ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２の濃度依存的な結合が観察された。

【0317】

９）－２ ヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２のｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣ活性
実施例７）－２に記載の方法により、ヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２のｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣ活性を評価した。その結果、図１２に示すように、ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２はヒトＬＡＧ－３発現２９３Ｔ-ｌａｃＺ細胞に対して濃度依存的なＡＤＣＣ活性を示した。これに対し、ヒトＬＡＧ－３を発現させていない２９３Ｔ-ｌａｃＺ細胞に対しては、ＡＤＣＣ活性を示さなかった。

【0318】

実施例１０．ヒトＬＡＧ－３／ヒトＦｃγＲＩＩＩＡダブルトランスジェニックマウスの作製
ヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２は、実施例９に示すようにヒトＬＡＧ－３には結合するものの、げっ歯類のＬＡＧ－３には交差しないことが明らかになっている。そこでｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２のｉｎ ｖｉｖｏでの評価を可能にするため、ヒトＬＡＧ－３をマウスＬＡＧ－３の発現調節機構を利用して生理的に発現させたＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｔｒｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）トランスジェニックマウスを作製することとした。また、ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２のような糖鎖修飾の調節によってＡＤＣＣ活性が増強されるためには、ヒトＦｃγＩＩＩＡが必要であり（Ｊｕｎｔｔｉｌａ，Ｔ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．７０（Ｎｏ．１１）：ｐｐ４４８１－９（２０１０））、既報（非特許文献１０）に準じてヒトＦｃγＲＩＩＩＡ遺伝子を含むＢＡＣもあわせて導入することとした。

【0319】

１０）－１ Ｒｅｄ／ＥＴ反応を用いた組換えＢＡＣ発現ベクターのコンストラクション
大腸菌内での能動型相同組み換え反応 であるＲｅｄ／ＥＴ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｚｈａｎｇ Ｙ ｅｔ ａｌ， Ａ ｎｅｗ ｌｏｇｉｃ ｆｏｒ ＤＮＡ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ Ｅ．Ｃｏｌｉ．， Ｎａｔｕｒｅ ２０ （１９９８） １２３－１２８） を利用して、ヒトＬＡＧ－３ ＲｅｃＢＡＣの組換えＢＡＣクローンを構築した。

【0320】

ヒトＬＡＧ－３およびマウスＬＡＧ－３遺伝子座をそれぞれ含むＢＡＣゲノムクローン、ＲＰ１１－１０１Ｆ２１およびＲＰ２３－３０Ｏ１を入手した。下の表に示したように、ヒトＬＡＧ－３遺伝子のイントロン５の配列、ヒトＬＡＧ－３遺伝子の翻訳開始コドンから終止コドンまでのゲノムＤＮＡ配列の両端の配列、およびマウスＢＡＣクローンのＬＡＧ－３遺伝子の翻訳開始コドンから終止コドンまでのゲノムＤＮＡ配列の３’側末端、５’側末端を大腸菌内での能動型相同組み換え反応のためのキー配列とした。

【0321】

ＬＡＧ－３－Ｈ１ ヒトＬＡＧ－３遺伝子の開始コドン付近の配列
［５’］ＡＴＧＴＧＧＧＡＧＧＣＴＣＡＧＴＴＣＣＴＧＧＧＣＴＴＧＣＴＧＴＴＴＣ［３’］（配列番号７９）
ＬＡＧ－３－Ｈ２ ヒトＬＡＧ－３遺伝子の終止コドン付近の配列
［５’］ＧＣＣＣＧＡＧＣＣＣＧＡＧＣＣＣＧＡＧＣＣＧＧＡＧＣＡＧＣＴＣＴＧＡ［３’］（配列番号８０）
ＬＡＧ－３－Ｈ３ Ｒｐｓｌ－ｋａｎ挿入サイト、５’側
［５’］ＧＡＧＴＡＴＧＴＧＴＴＧＡＣＴＧＧＴＴＧＡＴＡＡＣＴＡＴＣＧ［３’］（配列番号８１）
ＬＡＧ－３－Ｈ４ Ｒｐｓｌ－ｋａｎ挿入サイト、３’側
［５’］ＧＣＣＡＴＧＡＣＡＧＡＴＴＡＧＣＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＧＣＡＣ ［３’］（配列番号８２）
ＬＡＧ－３－Ｈ５ マウスＬＡＧ－３遺伝子の５’ＵＴＲ
［５’］ＣＡＧＧＡＣＣＴＴＴＴＴＣＴＡＡＣＣＴＣＣＣＴＴＧＧＡＧＧＧＣＴＧＧＧＧＡＧＧＣＣＣＧＧＧＣＣＡＴＡＧＡＧＧＡＧ［３’］（配列番号８３）
ＬＡＧ－３－Ｈ６ マウスＬＡＧ－３遺伝子の３’ＵＴＲ
［５’］ＣＣＴＧＧＡＧＣＣＧＡＧＧＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＧＴＣＴＣＡＧＣＡＧＣＴＣＣＧＣＣＣＧＣＣＣＧＣＣＣＧＣＣＣＧＣＣ［３’］（配列番号８４）

【0322】

まず、ヒトＢＡＣクローンのＬＡＧ－３遺伝子のイントロン５にポジティブ／ネガティブセレクションマーカーカセット（Ｒｐｓｌ－ｋａｎ）を挿入するために、ＬＡＧ－３－Ｈ３配列、Ｒｐｓｌ－ｋａｎ、およびＬＡＧ－３－Ｈ４配列をタンデムにつないだＤＮＡフラグメントを、ＬＡ－Ｔａｑ（タカラバイオ）を用いたＰＣＲにより構築した（ＬＡＧ－３ Ｒｐｓｌ－Ｋａｎブレークインフラグメント）。Ｒｅｄ／ＥＴ反応の能力を有した大腸菌株に、ＬＡＧ－３遺伝子座を含むヒトＢＡＣクローンとＬＡＧ－３ Ｒｐｓｌ－Ｋａｎブレークインフラグメントを導入し、このホスト大腸菌内でＲｅｄ／ＥＴ反応を誘導し、クロラムフェニコール耐性、かつカナマイシン耐性のコロニーをピックアップすることにより、ＬＡＧ－３ Ｒｐｓｌ－ｋａｎブレークインフラグメントをＬＡＧ－３遺伝子座のイントロン５に挿入した組み換えＢＡＣクローンをスクリーニングした（ヒトＬＡＧ－３ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）。そして、このヒトＬＡＧ－３ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ から、Ｒｐｓｌ－ｋａｎカセットを挿入したヒトＬＡＧ－３遺伝子のゲノムＤＮＡ配列をプラスミドベクターにサブクローニングするため、Ｈ２－Ｈ６－ＳａｃＢｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ－Ｈ５－Ｈ１をタンデムにつないだＤＮＡカセットを構築した（ＬＡＧ－３ プレトランスファープラスミド）。上記と同様の方法で、Ｒｅｄ／ＥＴ反応の能力を有する大腸菌株に、ヒトＬＡＧ－３ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅとともに、直鎖化したＬＡＧ－３プレトランスファープラスミドを導入し、このホスト大腸菌内でＲｅｄ／ＥＴ反応を誘導してアンピシリンおよびカナマイシン耐性コロニーをピックアップすることにより、Ｒｐｓｌｋａｎカセットを挿入したヒトＬＡＧ－３遺伝子のゲノムＤＮＡ配列を持つプラスミドをスクリーニングした（ヒトＬＡＧ－３ トランスファープラスミド）。

【0323】

次に、制限酵素反応により、このヒトＬＡＧ－３ トランスファープラスミドから、マウスゲノム配列に由来するＨ５配列とＨ６配列を両端に持ち、Ｒｐｓｌ－ｋａｎカセットを挿入したヒトＬＡＧ－３遺伝子のゲノムＤＮＡ配列をプラスミドベクターから切り出した（ヒトＬＡＧ－３ トランスファーフラグメント）。上記と同様の方法で、Ｒｅｄ／ＥＴ反応の能力を有する大腸菌株に、マウスＬＡＧ－３ＢＡＣクローンとともに、ヒトＬＡＧ－３ トランスファーフラグメントを導入し、このホスト大腸菌内でＲｅｄ／ＥＴ反応を誘導してクロラムフェニコール、およびカナマイシン耐性コロニーをピックアップすることにより、マウスＬＡＧ－３遺伝子の翻訳開始コドンから停止コドンまでのゲノムＤＮＡ配列を、ヒトＬＡＧ－３ トランスファーフラグメントの翻訳開始コドンから停止コドンまでのゲノムＤＮＡ配列と正確に置換したマウスＬＡＧ－３／ヒトＬＡＧ－３遺伝子の組換えＢＡＣクローンをスクリーニングした（マウスＬＡＧ－３／ヒトＬＡＧ－３ ＲｅｃＢＡＣＩｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）。

【0324】

最後に、ヒトＬＡＧ－３遺伝子座のイントロン５配列をＰＣＲで増幅し、ネガティブセレクションによりヒトＬＡＧ－３遺伝子のイントロン５に挿入したＲｐｓｌ－Ｋａｎを除去するためのＤＮＡ配列とした（ヒトＬＡＧ－３ リペアーフラグメント）。上記と同様の方法で、Ｒｅｄ／ＥＴ反応の能力を有する大腸菌株にマウスＬＡＧ－３／ヒトＬＡＧ－３ ＲｅｃＢＡＣ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅとともに、ヒトＬＡＧ－３ リペアーフラグメントを導入し、このホスト大腸菌内でＲｅｄ／ＥＴ反応を誘導してクロラムフェニコール、およびストレプトマイシン耐性コロニーをピックアップすることにより、マウスＬＡＧ－３遺伝子の翻訳開始コドンから停止コドンまでのゲノムＤＮＡ配列を、ヒトＬＡＧ－３遺伝子の翻訳開始コドンから停止コドンまでのゲノムＤＮＡ配列と正確に置換したマウスＬＡＧ－３／ヒトＬＡＧ－３遺伝子の組換えＢＡＣクローンの構築を行なった（ヒトＬＡＧ－３ ＲｅｃＢＡＣ）。シークエンス解析により、Ｒｅｄ／ＥＴ反応で接合したＨ１～Ｈ６のゲノムＤＮＡ配列を確認した。

【0325】

１０）－２ 高純度ＢＡＣ ＤＮＡフラグメントの精製
ヒトＬＡＧ－３ ＲｅｃＢＡＣ遺伝子発現コンストラクトである組換えＢＡＣクローンにより形質転換したＤＨ１０Ｂセルを、クロラムフェニコールを含むＬＢアガー培地上でクローニングし、そのシングルコロニーをピックアップして液体培地で一昼夜震盪培養した。

【0326】

ヒトＬＡＧ－３ ＲｅｃＢＡＣ遺伝子発現コンストラクトを、一部改変した阿部らの方法（Ｅｘｐ Ａｎｉｍ． ２００４ ５３（４）：３１１－２０．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＢＡＣ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ ｌｏｃｕｓ． Ａｂｅ Ｋ， Ｈａｚａｍａ Ｍ， Ｋａｔｏｈ Ｈ， Ｙａｍａｍｕｒａ Ｋ， Ｓｕｚｕｋｉ Ｍ．）に従い、ヒトＬＡＧ－３ ＲｅｃＢＡＣ組換えＢＡＣクローンをプラスミド抽出キット（マッキリーナーゲル社、Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ ＢＡＣ１００キット）を用いて精製し、ＰＩ－ＳｃｅＩを加えて３７℃、１６時間反応させてダイジェスチョンを行った。

【0327】

直鎖化したヒトＬＡＧ－３ ＲｅｃＢＡＣ組換えＢＡＣクローンを１％ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ アガロースゲル（タカラバイオ）にアプライし、パルスフィールド電気泳動装置（バイオラッド、ＣＨＥＦ ＤＲ－ＩＩ）により、６ ｖ／ｃｍ、０．１－４０ ｓｅｃ、１５ｈｒ、１４℃の条件で電気泳動を行った。サンプルの一部をガイドマーカーとしてＵＶトランスイルミネーターにより可視化することによって、アガロースゲル中に分離した直鎖化したヒトＬＡＧ－３ ＲｅｃＢＡＣ組換えＢＡＣクローンをＵＶ照射することなく、カミソリで切り出した。得られた長鎖ＤＮＡ断片を電気溶出法によりアガロースゲルから抽出し、マイクロインジェクション用に調製したＴＥバッファーで、４℃、２時間透析した。精製したＤＮＡ断片をパルスフィールド電気泳動にアプライして、より長鎖ＤＮＡ断片が分断することなく高度に精製されていることを確認するとともに、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（旭テクノグラス社）によりそのＤＮＡ濃度を決定した。このＤＮＡ断片の溶液を０．５ ｎｇ／μｌになるように希釈してトランスジェニックマウス作出用の発現コンストラクトの溶液を調製した。

【0328】

１０－３）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ マウス胚マイクロインジェクション
雌性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ マウスにＰＭＳＧおよびｈＣＧを投与して過排卵を誘起し、同系統の雄性マウスと交配した後、受精卵を採取した。

【0329】

マイクロマニュピレーターを用いて、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ マウスの前核期胚の雄性核に、精製したヒトＬＡＧ－３ ＲｅｃＢＡＣ／ヒトＦｃγＲ ＢＡＣ発現コンストラクトを直接注入した。このＤＮＡ注入胚を偽妊娠誘起した受胚雌マウスの卵管に移植した。

【0330】

１０－４）ファウンダーのサザンスクリーニング
ヒトＬＡＧ－３ ＲｅｃＢＡＣ／ヒトＦｃγＲ ＢＡＣ発現コンストラクトを注入したＣ５７ＢＬ／６Ｊ マウス受精卵から自然分娩により得た産子を、離乳まで保育した。ヒトＬＡＧ－３ ＲｅｃＢＡＣ／ヒトＦｃγＲ ＢＡＣトランスジェニックマウス、ファウンダー候補個体を３週令で離乳し、個体識別のための耳標をつけた後に、尾部組織を生検して解析に供するまで－８０℃に保管した。

【0331】

－８０℃で保存しておいたヒトＬＡＧ－３ ＲｅｃＢＡＣ／ヒトＦｃγＲ ＢＡＣトランスジェニックマウスの候補個体の尾部組織を室温で融解し、１％ＳＤＳ（和光純薬）、１ ｍｇ／ｍｌアクチナーゼＥ（科研製薬）および０．１５ ｍｇ／ｍｌプロテナーゼＫ（メルク）を含むライシスバッファーを加え、５５℃で１６時間震盪して組織を可溶化した。フェノール抽出、およびフェノール／クロロフォルム抽出を行って、組織から可溶化したゲノムＤＮＡに結合するタンパク質を除去した。ゲノムＤＮＡに混在するＲＮＡをＲＮａｓｅ Ａ（Ｓｉｇｍａ社）により分解した後、イソプロパノール沈澱により高分子ゲノムＤＮＡを析出した。析出したゲノムＤＮＡを７０％エタノールで洗浄して風乾した後、５０μｌのＴＥに再溶解した。

【0332】

各検体から調製したゲノムＤＮＡ溶液のＤＮＡ濃度を吸光法により決定し、各検体のＤＮＡ濃度の値からＤＮＡ５μｇに相当するゲノムＤＮＡ溶液の容量を算出した。

【0333】

各検体から調製したゲノムＤＮＡ、陽性対照ＤＮＡ（マイクロインジェクションに使用した発現コンストラクトを加えたコントロールマウスのゲノムＤＮＡ）、および陰性対照ＤＮＡ（コントロールマウスのゲノムＤＮＡ）に制限酵素を加えて、３７℃、１６時間の反応を行った。生成したゲノムＤＮＡの断片をイソプロパノール沈澱により析出し、７０％エタノールで洗浄して風乾した後、ＴＥに再溶解した。これらのゲノムＤＮＡ断片を１．２％のアガロースゲルにアプライして電気泳動し、アガロースゲル中に分離したゲノムＤＮＡ断片をＵＶトランスイルミネーターにより可視化し、スケールとともに写真撮影した。

【0334】

このアガロースゲルを０．２５Ｎ塩酸に浸して１０分間緩やかに震盪した後、０．４Ｎ水酸化ナトリウムに浸してさらに１０分間緩やかに震盪した。０．４Ｎ水酸化ナトリウムを用いたキャピラリー法により、アガロースゲル中に分離したゲノムＤＮＡ断片を、室温で１６時間、ナイロンメンブレン （Ｈｙｂｏｎｄ－ＸＬ；ＧＥヘルスケア社）にトランスファーした。ゲノムＤＮＡ断片をトランスファーしたナイロンメンブレンを２×ＳＳＣに浸して１０分間緩やかに震盪した後に風乾し、ハイブリダイゼーションに用いるまで室温で保存した。

【0335】

ＤＮＡラベル化キット（Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ；ＧＥヘルスケア社）を用いて、ランダムプライム法によりＤＮＡフラグメントを ［３２Ｐ］ラベルした。セファデックススピンカラム（ＰｒｏｂｅＱｕａｎｔ Ｇ－５０ Ｍｉｃｒｏ Ｃｏｌｕｍｎｓ；ＧＥヘルスケア社）を用いて［３２Ｐ］ラベル化したフラグメントを精製し、［３２Ｐ］ラベル化プローブとした。

【0336】

ゲノムＤＮＡ断片をトランスファーしたナイロンメンブレンをハイブリダイゼーションバッファーに入れて、６５℃で１時間プレインキュベートした。その後、９５℃、５分間加熱し、直後に５分間氷冷し変性した［３２Ｐ］ラベル化プローブを加えて、６５℃で４時間インキュベートした。インキュベーション終了後にナイロンメンブレンを取り出し、０．１％ ＳＤＳ、０．５×ＳＳＣで６５℃で約１５分間洗浄した。サーベイメーターでメンブレンに結合したプローブに由来する放射活性をモニターし、放射活性がほぼ一定になるまでこの洗浄を繰り返した。

【0337】

洗浄したメンブレンをサランラップ（登録商標）で覆い、暗室内でＸ線フィルム（ＢｉｏＭａｘ ＭＳ； コダック）を重ねてオートラジオグラフィーカセットに入れた。４℃で１週間感光した後にＸ線フィルムを現像した。ヒトＬＡＧ－３ ＲｅｃＢＡＣ／ヒトＦｃγＲ ＢＡＣ発現コンストラクトに由来する特異的なシグナルをオートラジオグラフィーで検出し、［３２Ｐ］ラベル化プローブとのハイブリダイゼーションによる特異的なシグナルをもたらす個体を、ヒトＬＡＧ－３ ＲｅｃＢＡＣ／ヒトＦｃγＲ ＢＡＣトランスジェニックマウス、ファウンダー個体として同定した。

【0338】

１０－５）Ｆ１マウスの作出および繁殖
ファウンダー個体の後代動物を得てジェノタイピングを行ない、Ｔｇマウスの系統化をおこなった。サザン解析で同定したＴｇマウス・ファウンダーと野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを体外受精または自然交配し、Ｆ１個体を作出した。ジェノタイピングによりＦ１個体にトランスジーンを伝達し、系統化できたラインを、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスとの体外受精または自然交配による繁殖に供し、ジェノタイピングによりヒトＬＡＧ－３およびヒトＦｃγＲＩＩＩＡがいずれもヘテロで導入されているマウスを実験に使用した。

【0339】

１０－６）ヒトＬＡＧ－３／ヒトＦｃγＲＩＩＩＡダブルトランスジェニックマウスのフェノタイプの確認
取得したヒトＬＡＧ－３／ヒトＦｃγＲＩＩＩＡダブルトランスジェニックマウスにおける導入した遺伝子の発現をフローサイトメトリー法により検討した。マウスの尾静脈から末梢血をヘパリン処理ヘマトクリット毛細管に採血し、ＰｈａｒｍＬｙｓｅ（ＢＤ社製）により赤血球を溶血して白血球を得た。その一部をフローサイトメトリー法によるヒトＦｃγＲＩＩＩＡの発現解析に使用し、残りについてはＬＡＧ－３の発現を誘導するため２μｇ／ｍＬ Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ（Ｃｏｎ Ａ：Ｓｉｇｍａ社）を含む培地で３日間刺激して活性化Ｔ細胞を得た。後者について、ＰＥ標識抗マウスＬＡＧ－３抗体（ＢＤ社製）、ＡＴＴＯ６４７標識抗ヒトＬＡＧ－３抗体（ＥｎｚｏＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ社製）、ＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ３抗体（ＢＤ社製）、およびＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ－ｎｅａｒ－ＩＲ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｄｙｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を加えて懸濁し、４℃で３０分間静置した。なお、ネガティブ集団の位置の同定に使用するために、ＰＥ標識抗マウスＬＡＧ－３抗体およびＡＴＴＯ６４７標識抗ヒトＬＡＧ－３抗体を含まないコントロールも作製し、同様に処理した。ＦＡＣＳバッファーで洗浄した後、１％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメーター（ＣａｎｔｏＩＩ：ＢＤ社製）で検出を行った。データ解析はＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ社製）で行った。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ－ｎｅａｒ－ＩＲ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｄｙｅ陽性の死細胞をゲートで除外した後、生細胞を解析対象とした。その結果、図１３に示すとおり、コントロールの野生型マウス由来のＣｏｎ Ａ活性化Ｔ細胞には、マウスＬＡＧ－３の発現のみが認められヒトＬＡＧ－３の発現は認められなかったのに対し、ヒトＬＡＧ－３／ヒトＦｃγＲＩＩＩＡダブルトランスジェニックマウス由来のＣｏｎ Ａ活性化Ｔ細胞にはマウスＬＡＧ－３およびヒトＬＡＧ－３の発現がいずれも認めら、しかも個々の細胞を表すドットプロットのドットはほぼ対角線上に分布していた。なお、活性化させていない休止状態のＴ細胞にはマウスＬＡＧ－３およびヒトＬＡＧ－３いずれの発現もほとんど認められなかった。これらの結果から、作製したヒトＬＡＧ－３／ヒトＦｃγＲＩＩＩＡダブルトランスジェニックマウスにおいては、ＢＡＣトランスジェニックという手法を用いることで当初計画したように、ヒトＬＡＧ－３が内因性のマウスＬＡＧ－３の発現パターンにしたがって発現することが明らかになった。また、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡについては、作製したヒトＬＡＧ－３／ヒトＦｃγＲＩＩＩＡダブルトランスジェニックマウスの末梢血ＮＫ細胞（ＣＤ３－ＤＸ５＋）の約４７％に発現が認められ、既報（非特許文献１０）と同様の結果が確認された。

【0340】

実施例１１．ヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２のｉｎ ｖｉｖｏ評価
１１－１）ヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２のＬＡＧ－３陽性細胞除去活性
実施例１０のヒトＬＡＧ－３／ヒトＦｃγＲＩＩＩＡダブルトランスジェニックマウスを用いて、取得したヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２がｉｎ ｖｉｖｏにおいてＬＡＧ－３陽性細胞を除去する活性を有するかを検討した。ヒトＬＡＧ－３／ヒトＦｃγＲＩＩＩＡダブルトランスジェニックマウスの腹腔内にヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２（３０ｍｇ／ｋｇ）あるいは溶媒を投与した直後に、ポリクローナルなＴ細胞活性化作用を有するＣｏｎ Ａ（Ｓｉｇｍａ社製）を１５ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与した。その２日後に採血した血液からＰｈａｒｍＬｙｓｅ（ＢＤ社製）により赤血球を溶血して白血球を得、フローサイトメトリーに使用した。白血球をＦｃＢｌｏｃｋ（ＢＤ社製）と反応させた後、ＰＥ標識抗マウスＬＡＧ－３抗体（ＢＤ社製）、ＡＴＴＯ６４７標識抗ヒトＬＡＧ－３抗体（ＥｎｚｏＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ社製）、ＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ３抗体（ＢＤ社製）、およびＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ－ｎｅａｒ－ＩＲ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｄｙｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を加えて懸濁し、４℃で３０分間静置した。なお、ネガティブ集団の位置の同定に使用するために、ＰＥ標識抗マウスＬＡＧ－３抗体およびＡＴＴＯ６４７標識抗ヒトＬＡＧ－３抗体を含まないコントロールも作製し、同様に処理した。ＦＡＣＳバッファーで洗浄した後、１％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメーター（ＣａｎｔｏＩＩ：ＢＤ社製）で検出を行った。データ解析はＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ社製）で行った。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ－ｎｅａｒ－ＩＲ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｄｙｅ陽性の死細胞をゲートで除外した後、生細胞を解析対象とした。ＣＤ３陽性Ｔ細胞におけるヒトＬＡＧ－３陽性率を算出したところ、図１４に示すとおり、無処置のヒトＬＡＧ－３／ヒトＦｃγＲＩＩＩＡダブルトランスジェニックマウスの末梢血Ｔ細胞においてはヒトＬＡＧ－３陽性細胞がほとんど認められなかったのに対し、ポリクローナルなＴ細胞活性化作用を有するＣｏｎ Ａ投与により、抗体非投与群では末梢血Ｔ細胞のうち平均２４％がヒトＬＡＧ－３陽性となった。これに対し、ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２を投与したＣｏｎ Ａ投与マウスでは、末梢血Ｔ細胞におけるヒトＬＡＧ－３陽性率が著明に低下していた。同様の傾向は、脾臓におけるＴ細胞、およびＣｏｎ Ａを投与した翌日の末梢血Ｔ細胞でも認められており、またマウスＬＡＧ－３および他の活性化マーカーであるＣＤ６９の陽性率でみても同様の結果であった。これらの結果から、取得したヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２がｉｎ ｖｉｖｏにおいてＬＡＧ－３陽性細胞を除去する活性を有することが明らかになった。

【0341】

１１－２）Ｔ細胞依存性自己免疫疾患モデルに対するヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２の活性
ＬＡＧ－３陽性細胞をｉｎ ｖｉｖｏにおいて除去する活性を有するヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２が、自己免疫疾患の治療に有用であるかどうかを明らかにする目的で、代表的なＴ細胞依存性の自己免疫疾患（多発性硬化症）モデルであるＥＡＥ（実験的自己免疫性脳脊髄炎）モデル（非特許文献１１）に対する薬効を検討した。

【0342】

中枢神経のミエリンを構成するタンパク質の１つであるＭＯＧ（Ｍｙｅｌｉｎ Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）由来のペプチド（アミノ酸３５－５５、ペプチド研究所）を４ｍｇ／ｍＬの濃度で生理食塩水に溶解したものを、８ｍｇ／ｍＬのＫｉｌｌｅｄ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒａ（ＢＤ社製）を添加したＦｒｅｕｎｄ‘ｓ Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ（和光純薬社製）と等量混合してエマルジョンにした。これをＤａｙ０に、ヒトＬＡＧ－３／ヒトＦｃγＲＩＩＩＡダブルトランスジェニックマウスの両わき腹に５０μＬずつ皮下注射し、さらに生理食塩水で希釈した百日咳毒素０．２μｇを静脈内投与することでＥＡＥを誘導した。その後、ＥＡＥの臨床スコアを以下のように経日的に観察した。すなわち、スコア０：無症状、スコア１：尾の脱力、スコア２：歩行異常・正向反射消失、スコア３：後肢麻痺、スコア４：前肢の部分麻痺、スコア５：死亡または安楽殺。ヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２およびコントロール抗体は、Ｄａｙ０および７にそれぞれ３０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与した。その結果、図１５に示すように、ヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２投与群ではコントロール抗体投与群に比べて、ＥＡＥの臨床スコアの平均値が観察期間中５０％以下に抑制されていた。さらに、ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２投与群ではＥＡＥ進行に伴う体重減少も抑制されていた。これらの結果から、ＬＡＧ－３陽性細胞をｉｎ ｖｉｖｏにおいて除去する活性を有するヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２は、代表的なＴ細胞依存性の自己免疫疾患モデルであるＥＡＥを抑制することが明らかになり、ヒトの自己免疫疾患の治療薬となりうることが示された。

【0343】

実施例１２．ヒト活性化Ｔ細胞におけるＬＡＧ－３とパーフォリン、ＣＤ２８、およびＣＤ５７の発現の関係
ヒト末梢血からフィコール遠心分離にてＰＢＭＣを分離し、９６穴Ｕ底マイクロプレートに４×１０５細胞／ウェル添加した。ヒトＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社、最終濃度１００ｎｇ／ｍＬ）およびＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、４×１０５個／ウェル）を加えて４日間培養し、Ｔ細胞を活性化した。得られた細胞を回収し、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．１％アジ化ナトリウム）に懸濁した後、Ｈｕｍａｎ ＢＤ Ｆｃ Ｂｌｏｃｋ（ＢＤ社）と室温で１０分間反応させた。続いてＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ－ｎｅａｒ－ＩＲ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｄｙｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＦＡＣＳバッファーで希釈した蛍光標識抗体と４℃で３０分間反応させて細胞表面の染色を行った後、ＦＡＣＳバッファーで洗浄した。蛍光標識抗体としては、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ８抗体、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５標識抗ヒトＣＤ３抗体、ＡＰＣ標識抗ヒトＣＤ２８抗体、ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ標識抗ヒトＣＤ５７抗体（いずれもＢＤ社）、ＰＥ標識抗ヒトＣＤ２８抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）、ＰＥ標識キット（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）を用いて標識した抗ヒトＬＡＧ－３抗体およびアイソタイプコントロール抗体を種々の組み合わせで使用した。一部のサンプルについてはさらに、ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢＤ社）およびＡＰＣ標識抗ヒトパーフォリン抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて、細胞内のパーフォリンの染色も行った。洗浄後の細胞は、１％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメーター（ＢＤ社製ＣａｎｔｏＩＩあるいはＭｉｌｔｅｎｙｉ社製ＭＡＣＳＱｕａｎｔＸ）で検出を行った。データ解析はＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ社製）で行った。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ－ｎｅａｒ－ＩＲ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｄｙｅ陽性の死細胞をゲートで除外した後、生細胞のみについてさらにＣＤ３陽性ＣＤ８陽性のＣＤ８Ｔ細胞にゲートをかけて解析した。

【0344】

ＬＡＧ－３と細胞内のパーフォリンの発現の関係を解析した結果を図１０２に示す。右端の図において細胞集団がほぼ対角線上に分布していることから、ヒト活性化ＣＤ８Ｔ細胞においては、ＬＡＧ－３と細胞内のパーフォリンの発現はほぼパラレルになっていることが明らかになった。なおこのとき、ＰＥ標識したＬＡＧ－３抗体のアイソタイプコントロール（中央の図）では非標識のサンプル（左端の図）とほとんど変わらない横軸方向の蛍光強度の分布を示していたことから、ヒトＬＡＧ－３の染色の特異性が確認された。

【0345】

図１０３は、ＬＡＧ－３とＣＤ２８の発現の関係を解析した結果を示す。右端の図において、ＣＤ２８陽性の細胞ではＬＡＧ－３陽性の細胞は５０％未満であったのに対し、ＣＤ２８陰性の細胞ではＣＤ２８陽性の細胞に比べて細胞集団が全体的にＬＡＧ－３陽性側にシフトしておりかつ割合としては２／３の細胞がＬＡＧ－３陽性となっていたことから、ヒト活性化ＣＤ８Ｔ細胞においては、ＣＤ２８陽性細胞に比較するとＣＤ２８陰性細胞でよりＬＡＧ－３の発現が認められることが明らかになった。

【0346】

図１０４は、ＬＡＧ－３とＣＤ５７の発現の関係を解析した結果を示す。右端の図において、ＣＤ５７陰性の細胞のうち４２％の細胞がＬＡＧ－３陽性であったのに対し、ＣＤ５７陽性の細胞ではＣＤ５７陰性細胞に比べて細胞集団が全体的にＬＡＧ－３陽性側に大きくシフトしておりかつ割合としては７９％の細胞がＬＡＧ－３陽性となっていたことから、ヒト活性化ＣＤ８Ｔ細胞においては、ＣＤ５７陰性細胞に比較するとＣＤ５７陽性細胞でよりＬＡＧ－３の発現が認められることが明らかになった。

【0347】

実施例１３．ＬＡＧ－３抗体のパーフォリン陽性ＣＤ８Ｔ細胞に対する作用
実施例１２の実験系における、ヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２、カルシニューリン阻害薬であるタクロリムス、コルチコステロイドであるデキサメタゾンの作用を検討した。ヒトＰＢＭＣを、ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２（最終濃度１０μｇ／ｍＬ）、コントロールヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、最終濃度１０μｇ／ｍＬ）、タクロリムス（Ｆｏｃｕｓ社、最終濃度１０ ｎＭ）、およびデキサメタゾン（ＥＮＺＯ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、最終濃度１ μＭ）と３７℃で３０分間プレインキュベーションした後、実施例１２のようにＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８で４日間培養し、得られた細胞をフローサイトメトリーに供した。なお、これらの抗体および化合物の濃度は、既報（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，ＤＪ ｅｔ ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９１年；第７３巻（３号）：３１６－３２１ページ：Ｂｒｕｎｅｔｔｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、１９９８年；第２８５巻（２号）：９１５－９１９ペーシ゛）等に基づき、最大の薬効を示すと考えられる濃度に設定した。

【0348】

結果を図１０５に示す。図１０５Ａのように、ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２およびタクロリムスを添加した場合はコントロールと比較して、培養後のトータルのＴ細胞数はわずかに減少しており、デキサメタゾンを添加した場合はコントロールとほとんど変わらなかった。当アッセイは二人のドナー由来のＰＢＭＣで実施し、同様の傾向が見られた（ＰＢＭＣ１およびＰＢＭＣ２）。

【0349】

これに対しパーフォリン陽性ＣＤ８Ｔ細胞数については、図１０５Ｂに示すように、ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２によってコントロールと比較して著明に減少していた。一方、タクロリムスを添加した場合はコントロールとほとんど差がなく、デキサメタゾンを添加した場合は、ＰＢＭＣ１ではコントロールよりも増加しており、ＰＢＭＣ２ではコントロールと同レベルであった。これらの結果から、ヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２は、Ｔ細胞全体への影響に比べてパーフォリン陽性ＣＤ８Ｔ細胞を選択的にｄｅｐｌｅｔｉｏｎすること、およびカルシニューリン阻害薬であるタクロリムスならびにコルチコステロイドであるデキサメタゾンにはそのような作用が認められないことが明らかになった。なお、データは示さないが、ヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２は、グランザイム陽性ＣＤ８Ｔ細胞数も減少させた。

【0350】

実施例１４．ＬＡＧ－３抗体のＣＤ２８陰性Ｔ細胞およびＣＤ５７陽性Ｔ細胞に対する作用
実施例１３のアッセイ系におけるＣＤ２８陰性Ｔ細胞およびＣＤ５７陽性Ｔ細胞に対する、ヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２、カルシニューリン阻害薬であるタクロリムス、コルチコステロイドであるデキサメタゾンの作用を検討した。ヒトＰＢＭＣを、ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２（最終濃度１０、１、および０．１μｇ／ｍＬ）、コントロールヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、最終濃度１０μｇ／ｍＬ）、タクロリムス（Ｆｏｃｕｓ社、最終濃度１０ ｎＭ）、およびデキサメタゾン（ＥＮＺＯ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、最終濃度１ μＭ）と３７℃で３０分間プレインキュベーションした後、実施例１２のようにＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８で４日間培養し、得られた細胞をフローサイトメトリーに供した。なお、生細胞のうち、ＣＤ３陽性ＣＤ８陰性の画分をＣＤ４Ｔ細胞、ＣＤ３陽性ＣＤ８陽性の画分をＣＤ８Ｔ細胞とそれぞれして解析した。

【0351】

ＣＤ２８陰性Ｔ細胞に対する作用を解析した結果を図１０６に示す。ＣＤ２８陰性ＣＤ８Ｔ細胞については、図１０６Ｂのように、実施例１３のパーフォリン陽性ＣＤ８Ｔ細胞の場合と同様に、ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２によって著明にその数が低下していた。この作用はｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２の濃度依存的であり、二人のドナー由来のいずれのＰＢＭＣを用いた場合にも同様の結果であった。これに対し、タクロリムスおよびデキサメタゾンを添加した場合には、ＬＡＧ－３抗体で認められたような著明なＣＤ２８陰性ＣＤ８Ｔ細胞数の低下は認められなかった。また図１０６Ａのように、ＣＤ２８陰性ＣＤ４Ｔ細胞についても、ＣＤ２８陰性ＣＤ８Ｔ細胞ほど顕著ではないものの、ＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２によりその細胞数の低下が認められ、タクロリムスおよびデキサメタゾンはほとんど効果を示さないかむしろ増加させた。

【0352】

ＣＤ５７陽性Ｔ細胞に対する作用を解析した結果を図１０７に示す。ＣＤ５７陽性ＣＤ８Ｔ細胞については、図１０７Ｂのように、実施例１３のパーフォリン陽性ＣＤ８Ｔ細胞および上記のＣＤ２８陰性ＣＤ８Ｔ細胞の場合と同様に、ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２によって著明にその数が低下していた。この作用はｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２の濃度依存的であり、二人のドナー由来のいずれのＰＢＭＣを用いた場合にも同様の結果であった。これに対し、タクロリムスおよびデキサメタゾンを添加した場合には、ＬＡＧ－３抗体で認められたような著明なＣＤ５７陽性ＣＤ８Ｔ細胞数の低下は認められなかった。また図１０７Ａのように、ＣＤ５７陽性ＣＤ４Ｔ細胞についても、ＣＤ５７陽性ＣＤ８Ｔ細胞ほど顕著ではないものの、ＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ４／Ｌ２によりその細胞数の低下が認められ、タクロリムスおよびデキサメタゾンにはそのような効果はほとんど認められなかった。

【0353】

また、低フコース形態にはないヒト化抗ヒトＬＡＧ－３抗体ｈＬＡ２１２＿Ｈ３／Ｌ２、抗ヒトＬＡＧ－３マウス－ヒトキメラ抗体Ａ９Ｈ１２、および抗ヒトＬＡＧ－３ラット－ヒトキメラ化抗体ｃＬＡ２１２は、低フコース形態にあるｈＬＡ２１２＿Ｈ４ ／Ｌ２と比較して弱いものの、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞数およびＣＤ５７陽性Ｔ細胞数を低下させる傾向を示した（データ示さず）。

【0354】

これらの結果から、抗ＬＡＧ－３抗体は、細胞傷害性で免疫系疾患におけるステロイド抵抗性に関わるとされるＣＤ２８陰性Ｔ細胞およびＣＤ５７陽性Ｔ細胞を枯渇させること、並びに、かかるＴ細胞枯渇活性は低フコース化により増強されることが明らかになり、免疫抑制剤抵抗性の細胞傷害性Ｔ細胞関連疾患の医療における有望な細胞傷害性Ｔ細胞枯渇薬となる可能性が示された。

【産業上の利用可能性】

【0355】

本発明の組成物は細胞傷害性Ｔ細胞枯渇に有用である。

【配列表フリーテキスト】

【0356】

配列番号１：ｒＬＡ２０４抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（図１６）
配列番号２：ｒＬＡ２０４抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（図１７）
配列番号３：ｒＬＡ２０４抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（図１８）
配列番号４：ｒＬＡ２０４抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（図１９）
配列番号５：ｒＬＡ２１２抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（図２０）
配列番号６：ｒＬＡ２１２抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（図２１）
配列番号７：ｒＬＡ２１２抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（図２２）
配列番号８：ｒＬＡ２１２抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（図２３）
配列番号９：ｒＬＡ２２５抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（図２４）
配列番号１０：ｒＬＡ２２５抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（図２５）
配列番号１１：ｒＬＡ２２５抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（図２６）
配列番号１２：ｒＬＡ２２５抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（図２７）
配列番号１３：ｒＬＡ８６９抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（図２８）
配列番号１４：ｒＬＡ８６９抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（図２９）
配列番号１５：ｒＬＡ８６９抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（図３０）
配列番号１６：ｒＬＡ８６９抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（図３１）
配列番号１７：ｒＬＡ１２６４抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（図３２）
配列番号１８：ｒＬＡ１２６４抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（図３３）
配列番号１９：ｒＬＡ１２６４抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（図３４）
配列番号２０：ｒＬＡ１２６４抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（図３５）
配列番号２１：ヒト軽鎖分泌シグナル及びヒトκ鎖定常領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（図３６）
配列番号２２：ヒト重鎖分泌シグナル及びヒトＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（図３７）
配列番号２３：ｃＬＡ２１２抗体の重鎖のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（図３８）
配列番号２４：ｃＬＡ２１２抗体の重鎖のアミノ酸配列（図３９）
配列番号２５：ｃＬＡ２１２抗体の軽鎖のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（図４０）
配列番号２６：ｃＬＡ２１２抗体の軽鎖のアミノ酸配列（図４１）
配列番号２７：ｈＬＡ２１２抗体の重鎖Ｈ２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（図４２）
配列番号２８：ｈＬＡ２１２抗体の重鎖Ｈ２のアミノ酸配列（図４３）
配列番号２９：ｈＬＡ２１２抗体の重鎖Ｈ３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（図４４）
配列番号３０：ｈＬＡ２１２抗体の重鎖Ｈ３のアミノ酸配列（図４５）
配列番号３１：ｈＬＡ２１２抗体の軽鎖Ｌ１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（図４６）
配列番号３２：ｈＬＡ２１２抗体の軽鎖Ｌ１のアミノ酸配列（図４７）
配列番号３３：ｈＬＡ２１２抗体の軽鎖Ｌ２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（図４８）
配列番号３４：ｈＬＡ２１２抗体の軽鎖Ｌ２のアミノ酸配列（図４９）
配列番号３５：ｈＬＡ２１２抗体の軽鎖Ｌ３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（図５０）
配列番号３６：ｈＬＡ２１２抗体の軽鎖Ｌ３のアミノ酸配列（図５１）
配列番号３７：ｈＬＡ２１２抗体の軽鎖Ｌ４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（図５２）
配列番号３８：ｈＬＡ２１２抗体の軽鎖Ｌ４のアミノ酸配列（図５３）
配列番号３９：ｈＬＡ２１２抗体の軽鎖Ｌ５のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（図５４）
配列番号４０：ｈＬＡ２１２抗体の軽鎖Ｌ５のアミノ酸配列（図５５）
配列番号４１：ｒＬＡ２０４抗体の重鎖ＣＤＲＨ１のアミノ酸配列（図５６）
配列番号４２：ｒＬＡ２０４抗体の重鎖ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列（図５７）
配列番号４３：ｒＬＡ２０４抗体の重鎖ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（図５８）
配列番号４４：ｒＬＡ２０４抗体の軽鎖ＣＤＲＬ１のアミノ酸配列（図５９）
配列番号４５：ｒＬＡ２０４抗体の軽鎖ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列（図６０）
配列番号４６：ｒＬＡ２０４抗体の軽鎖ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（図６１）
配列番号４７：ｒＬＡ２１２抗体の重鎖ＣＤＲＨ１のアミノ酸配列（図６２）
配列番号４８：ｒＬＡ２１２抗体の重鎖ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列（図６３）
配列番号４９：ｒＬＡ２１２抗体の重鎖ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（図６４）
配列番号５０：ｒＬＡ２１２抗体の軽鎖ＣＤＲＬ１のアミノ酸配列（図６５）
配列番号５１：ｒＬＡ２１２抗体の軽鎖ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列（図６６）
配列番号５２：ｒＬＡ２１２抗体の軽鎖ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（図６７）
配列番号５３：ｒＬＡ２２５抗体の重鎖ＣＤＲＨ１のアミノ酸配列（図６８）
配列番号５４：ｒＬＡ２２５抗体の重鎖ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列（図６９）
配列番号５５：ｒＬＡ２２５抗体の重鎖ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（図７０）
配列番号５６：ｒＬＡ２２５抗体の軽鎖ＣＤＲＬ１のアミノ酸配列（図７１）
配列番号５７：ｒＬＡ２２５抗体の軽鎖ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列（図７２）
配列番号５８：ｒＬＡ２２５抗体の軽鎖ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（図７３）
配列番号５９：ｒＬＡ８６９抗体の重鎖ＣＤＲＨ１のアミノ酸配列（図７４）
配列番号６０：ｒＬＡ８６９抗体の重鎖ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列（図７５）
配列番号６１：ｒＬＡ８６９抗体の重鎖ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（図７６）
配列番号６２：ｒＬＡ８６９抗体の軽鎖ＣＤＲＬ１のアミノ酸配列（図７７）
配列番号６３：ｒＬＡ８６９抗体の軽鎖ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列（図７８）
配列番号６４：ｒＬＡ８６９抗体の軽鎖ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（図７９）
配列番号６５：ｒＬＡ１２６４抗体の重鎖ＣＤＲＨ１のアミノ酸配列（図８０）
配列番号６６：ｒＬＡ１２６４抗体の重鎖ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列（図８１）
配列番号６７：ｒＬＡ１２６４抗体の重鎖ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（図８２）
配列番号６８：ｒＬＡ１２６４抗体の軽鎖ＣＤＲＬ１のアミノ酸配列（図８３）
配列番号６９：ｒＬＡ１２６４抗体の軽鎖ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列（図８４）
配列番号７０：ｒＬＡ１２６４抗体の軽鎖ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（図８５）
配列番号７１：プライマーＲＧ２ＡＲ３（図８６）
配列番号７２：プライマーＲＫＲ５（図８７）
配列番号７３：プライマー３．３－Ｆ１（図８８）
配列番号７４：プライマー３．３－Ｒ１（図８９）
配列番号７５：プライマー２１２Ｈ－Ｆ（図９０）
配列番号７６：プライマー２１２Ｈ－Ｒ（図９１）
配列番号７７：プライマー２１２Ｌ－Ｆ（図９２）
配列番号７８：プライマー２１２Ｌ－Ｒ（図９３）
配列番号７９：オリゴヌクレオチドＬＡＧ－３－Ｈ１（図９４）
配列番号８０：オリゴヌクレオチドＬＡＧ－３－Ｈ２（図９５）
配列番号８１：オリゴヌクレオチドＬＡＧ－３－Ｈ３（図９６）
配列番号８２：オリゴヌクレオチドＬＡＧ－３－Ｈ４（図９７）
配列番号８３：オリゴヌクレオチドＬＡＧ－３－Ｈ５（図９８）
配列番号８４：オリゴヌクレオチドＬＡＧ－３－Ｈ６（図９９）
配列番号８５：ヒトＬＡＧ－３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（図１００）
配列番号８６：ヒトＬＡＧ－３のアミノ酸配列（図１０１）

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47】

【図48】

【図49】

【図50】

【図51】

【図52】

【図53】

【図54】

【図55】

【図56】

【図57】

【図58】

【図59】

【図60】

【図61】

【図62】

【図63】

【図64】

【図65】

【図66】

【図67】

【図68】

【図69】

【図70】

【図71】

【図72】

【図73】

【図74】

【図75】

【図76】

【図77】

【図78】

【図79】

【図80】

【図81】

【図82】

【図83】

【図84】

【図85】

【図86】

【図87】

【図88】

【図89】

【図90】

【図91】

【図92】

【図93】

【図94】

【図95】

【図96】

【図97】

【図98】

【図99】

【図100】

【図101】

【図102】

【図103】

【図104】

【図105】

【図106】

【図107】

【配列表】

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