特許7384672Ｃ末端ＣＤＮＦ断片及びＣ末端ＭＡＮＦ断片、それらを含む医薬組成物、並びにそれらの使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-11-13
(45)【発行日】2023-11-21
(54)【発明の名称】Ｃ末端ＣＤＮＦ断片及びＣ末端ＭＡＮＦ断片、それらを含む医薬組成物、並びにそれらの使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20231114BHJP
C07K 14/475 20060101ALI20231114BHJP
A61K 38/22 20060101ALI20231114BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20231114BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20231114BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20231114BHJP
A61P 25/14 20060101ALI20231114BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20231114BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12 ZNA
C07K14/475
A61K38/22
A61P25/00
A61P25/28
A61P25/16
A61P25/14
A61K48/00
【請求項の数】
28
(21)【出願番号】P 2019560290
(86)(22)【出願日】2018-05-04
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-06-25
(86)【国際出願番号】 FI2018050332
(87)【国際公開番号】W WO2018202957
(87)【国際公開日】2018-11-08
【審査請求日】2021-04-21
(31)【優先権主張番号】20175392
(32)【優先日】2017-05-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FI
(73)【特許権者】
【識別番号】518073457
【氏名又は名称】ヘルシンギン ユリオピスト
【氏名又は名称原語表記】ＨＥＬＳＩＮＧＩＮ ＹＬＩＯＰＩＳＴＯ
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(74)【代理人】
【識別番号】230118913
【弁護士】
【氏名又は名称】杉村 光嗣
(74)【代理人】
【識別番号】100181272
【弁理士】
【氏名又は名称】神 紘一郎
(72)【発明者】
【氏名】マート サーマ
(72)【発明者】
【氏名】ミッコ アイラバアラ
(72)【発明者】
【氏名】メリャ ヴティライネン
(72)【発明者】
【氏名】リイン ユ
(72)【発明者】
【氏名】マリア リンダール
【審査官】伊達 利奈
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１３／０３４８０５（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１：ＭＰＡＭＫＩＣＥＫＬ ＫＫＬＤＳＱＩＣＥＬ ＫＹＥＫＴＬＤＬＡＳ ＶＤＬＲＫＭＲＶＡＥ ＬＫＱＩＬＨＳＷＧＥ ＥＣＲＡＣＡＥＫＴＤ ＹＶＮＬＩＱＥＬＡＰ ＫＹＡＡＴＨＰＫＴＥ Ｌ
に記載の配列、又は配列番号１の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列の５６～６１個の連続アミノ酸残基からなるＣＤＮＦポリペプチドの断片であり、前記断片は、配列番号１の位置７８～８１のＥＲ残留シグナルＫＴＥＬと配列番号１の位置５２～５５のＣＸＸＣモチーフを含み、Ｘは任意のアミノ酸であり、前記断片は細胞膜透過性ペプチドであり、神経細胞に対する保護効果を有する、医薬として使用するためのＣＤＮＦポリペプチドの断片。
【請求項2】
配列番号１の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する前記配列が、配列番号３：ＭＰＡＭＫＩＣＥＫＬ ＫＫＬＤＳＱＩＣＥＬ ＫＹＥＫＴＬＤＬＡＳ ＶＤＬＲＫＭＲＶＡＥ ＬＫＱＩＬＨＳＷＧＥ ＥＣＸＸＣＡＥＫＴＤ ＹＶＮＬＩＱＥＬＡＰ ＫＹＡＡＴＨＰＫＴＥ Ｌ
の配列であって、Ｘは任意のアミノ酸である配列の５６～６１個の連続アミノ酸残基からなる、請求項１に記載の断片。
【請求項3】
配列番号１の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する前記配列が、配列番号１の位置５２～５５に配列ＣＫＧＣを含む、請求項２に記載の断片。
【請求項4】
配列番号４：ＫＹＥＫＴＬＤＬＡＳ ＶＤＬＲＫＭＲＶＡＥ ＬＫＱＩＬＨＳＷＧＥ ＥＣＲＡＣＡＥＫＴＤ ＹＶＮＬＩＱＥＬＡＰ ＫＹＡＡＴＨＰＫＴＥ Ｌ
の配列、又は配列番号４の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の断片。
【請求項5】
配列番号１の配列と１００％の配列同一性を有する配列を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の断片。
【請求項6】
配列番号１の位置８１にＣ末端アミノ酸Ｌを含む、請求項２～５のいずれか一項に記載の断片。
【請求項7】
Ｃ末端のアミド化及びＮ末端のアセチル化からなる群から選択される酵素分解から前記断片を保護する修飾を更に含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の断片。
【請求項8】
検出可能な化学的又は生化学的部分に更に結合している、請求項１～７のいずれか一項に記載の断片。
【請求項9】
細胞透過性ペプチドであり、ヒト血液脳関門を透過することができる、請求項１～８のいずれか一項に記載の断片。
【請求項10】
請求項１～９のいずれか一項に記載の断片と、生理学的に許容される担体、緩衝液、賦形剤、防腐剤、及び安定剤のうちの少なくとも１つとを含む、医薬組成物。
【請求項11】
静脈内投与、末梢投与、腹腔内、皮下、くも膜下腔内、脳室内、鼻腔内、経皮、脳内、筋肉内、眼内、又は動脈内投与のための、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項12】
前記断片が、Ｃ末端のアミド化及びＮ末端のアセチル化からなる群から選択される酵素分解から前記断片を保護する修飾を含む、請求項１０又は１１に記載の医薬組成物。
【請求項13】
前記断片が、検出可能な化学的又は生化学的部分に結合している、請求項１０又は１１に記載の医薬組成物。
【請求項14】
医薬として使用するための、請求項１０～１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項15】
変性疾患又は障害の治療に使用するための、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項16】
前記変性疾患又は障害が、アルツハイマー病、パーキンソン病、多系統萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭葉変性症、レビー小体型認知症、軽度認知障害、ハンチントン病、外傷性脳損傷、薬物中毒、及び脳卒中からなる群から選択される中枢神経系（ＣＮＳ）疾患である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項17】
Ｉ型又はＩＩ型糖尿病の治療に使用するための、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項18】
網膜色素変性症等の網膜障害の治療に使用するための、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項19】
配列番号１：ＭＰＡＭＫＩＣＥＫＬ ＫＫＬＤＳＱＩＣＥＬ ＫＹＥＫＴＬＤＬＡＳ ＶＤＬＲＫＭＲＶＡＥ ＬＫＱＩＬＨＳＷＧＥ ＥＣＲＡＣＡＥＫＴＤ ＹＶＮＬＩＱＥＬＡＰ ＫＹＡＡＴＨＰＫＴＥ Ｌ
に記載の配列、又は配列番号１の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列の５６～６１個の連続アミノ酸残基からなるＣＤＮＦポリペプチドの断片の使用であり、前記断片は、配列番号１の位置７８～８１のＥＲ残留シグナルＫＴＥＬと配列番号１の位置５２～５５のＣＸＸＣモチーフを含み、Ｘは任意のアミノ酸である、変性疾患又は障害の治療のための医薬を製造するためのＣＤＮＦポリペプチドの断片の使用。
【請求項20】
前記断片が、配列番号１の配列と１００％の配列同一性を有する配列を有する、請求項１９に記載の使用。
【請求項21】
前記変性疾患が神経変性疾患である、請求項１９又は２０に記載の使用。
【請求項22】
前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、多系統萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭葉変性症、レビー小体型認知症、軽度認知障害、ハンチントン病、外傷性脳損傷、薬物中毒、及び脳卒中からなる群から選択される中枢神経系（ＣＮＳ）疾患である、請求項２１に記載の使用。
【請求項23】
前記ＣＮＳ疾患がパーキンソン病である、請求項２２に記載の使用。
【請求項24】
前記変性疾患がＩ型又はＩＩ型糖尿病である、請求項１９又は２０に記載の使用。
【請求項25】
前記変性疾患が筋萎縮性側索硬化症である、請求項２１に記載の使用。
【請求項26】
前記変性疾患が網膜色素変性症等の網膜障害である、請求項２１に記載の使用。
【請求項27】
前記断片が、静脈内投与、腹腔内、皮下、くも膜下腔内、脳室内、鼻腔内、経皮、脳内、筋肉内、眼内、又は動脈内投与により投与されるか、又は、ウイルス発現ベクターを介して投与される、請求項１９～２６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項28】
前記静脈内投与が末梢投与である、請求項２７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生物活性タンパク質断片及び細胞膜透過性ペプチドの分野、並びに神経栄養因子及び小胞体（ＥＲ）に位置するタンパク質の分野に関し、より具体的には、中枢神経系疾患、糖尿病、及び網膜障害等の変性疾患又は障害の治療分野に関する。
【背景技術】
【0002】
神経栄養因子である脳ドーパミン神経栄養因子（ＣＤＮＦ）及び中脳星状細胞由来神経栄養因子（ＭＡＮＦ）（非特許文献１、非特許文献２）は、現在、パーキンソン病（ＰＤ）の６－ＯＨＤＡモデルのラットの治療に最も効率的なタンパク質である。両因子は、毒素の前に適用された場合、パーキンソン病の６－ＯＨＤＡ誘発性の行動症状及び組織学的症状を強力に防止する（非特許文献３、非特許文献４）。更に重要なことに、いずれの因子による後治療（即ち、６－ＯＨＤＡ誘発後の治療）も、パーキンソン病の６－ＯＨＤＡ誘発性症状が既に広範囲に及んでいる段階で適用すると、正常な運動行動及び線条体のドーパミン作動性神経支配を効果的に回復させた（非特許文献３、非特許文献５）。ＣＤＮＦは、パーキンソン病のマウス及びアカゲザルのＭＰＴＰモデルにおいてもドーパミンニューロンを保護及び修復する。サルＭＰＴＰモデル及び重症げっ歯類６－ＯＨＤＡモデルにおいて、ＣＤＮＦは、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）よりも、黒質緻密部（ＳＮＰｃ）のドーパミンニューロンの回復及び運動行動の回復において効率的である（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７）。これらの因子に対するニューロン保護の背後にあるメカニズムは完全には明らかではないが、これらは、抗アポトーシス経路を促進する古典的な生存の活性化に加えて、酸化ストレス及びＥＲストレスを緩和し、ＥＲストレス誘導アポトーシス細胞死を抑制することを目的とする小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）経路を調節することが示唆されている（非特許文献８、非特許文献２、非特許文献９）。糖尿病、並びにパーキンソン病、アルツハイマー病（ＡＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、及びハンチントン病（ＨＤ）等の神経変性疾患を含む多くの病態生理学的状態及び変性疾患は、ＥＲストレス及びＵＰＲ経路の活性化の引き金となるタンパク質の誤った折り畳み及び凝集に関連している。従って、ＣＤＮＦ及びＭＡＮＦの効果は、様々な中枢神経系疾患において示されている（特許文献１、特許文献２、及び非特許文献１０）。また、ＣＤＮＦ及びＭＡＮＦは、全てではないがほとんどのＣＮＳ疾患及び損傷の病態生理に関与する神経炎症を抑制する（非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３）。
【0003】
更に、特許文献３は、機能的ＭＡＮＦ遺伝子を天然にコード及び発現する遺伝子に対する破壊された対立遺伝子を含む遺伝子組み換え非ヒト動物を開示しており、当該動物は、破壊された非機能的ＭＡＮＦ遺伝子により、膵臓ベータ細胞量の漸進的な生後減少を示す。また、１型又は２型糖尿病の膵臓内治療で使用するためのＭＡＮＦ若しくはＣＤＮＦポリペプチド又はその機能的断片の有効量を送達する遺伝子治療ベクターも提案されている。更に、非特許文献８は、ＭＡＮＦタンパク質が膵臓ベータ細胞の増殖及び生存に不可欠であり、それによりベータ細胞の保護及び再生の治療候補となることを開示している。
【0004】
特許文献４は、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、脳卒中、末梢神経障害、てんかん、糖尿病、又は薬物中毒の治療に使用するための、配列ＣＸＸＣを含む４～４０アミノ酸の長さの細胞透過性ＭＡＮＦ又はＣＤＮＦペプチドを開示している。
【0005】
ＣＤＮＦ及びＭＡＮＦの構造研究により、これらのタンパク質はサポシン様Ｎ末端ドメイン（非特許文献１４）とＳＡＰ様Ｃ末端（非特許文献１５）の２つのドメインで構成されることが示されている。ＣＸＸＣモチーフ（ヒトＭＡＮＦの残基１４９～１５２、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００６００１．３）は、ドメインのヘリカルコアの外側にあるループ領域のＣ末端ドメイン（Ｃ－ＭＡＮＦ）に位置し、システインはジスルフィド結合で結合している（非特許文献１５）。ＣＤＮＦの対応するモチーフは、同じ位置にある（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１０２５１２５．２）。Ｃ－ＭＡＮＦは、交感神経ニューロン内で発現すると、インビトロで強力な抗アポトーシス性を示すことが示されている（非特許文献１５）。非特許文献１６には、ＭＡＮＦ及びＣＤＮＦの構造的及び機能的決定因子の特徴が開示されている。
【0006】
選択的透過性を備えた細胞膜は、細胞内膜が内部コンパートメント内で行うのと同様にして、サイトゾルと細胞外環境との間の分子交換を制御する。このため、しばしば細胞膜は、多くの分子、特に、完全長タンパク質等の高分子量分子の細胞内送達に対する困難な障害となる。そのような障壁を通る高分子量分子の能動輸送には、脂質二重層を透過することが可能な特定の担体が必要となることが多い。細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、一般に、５～３０アミノ酸長のペプチド（又はペプチド内のモチーフ）であり、細胞膜を透過するその能力ゆえに、タンパク質、プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、リポソーム、及び抗がん剤を細胞内に送達するために広く使用されている（非特許文献１７、非特許文献１８、非特許文献１９、非特許文献２０）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【文献】国際公開第２００９／１３３２４７号
【文献】国際公開第２００７／０６８８０３号
【文献】国際公開第２０１４／１９１６３０号
【文献】国際公開第２０１３／０３４８０５号
【文献】欧州特許第１９６９００３号明細書
【文献】国際公開第２０１６／０５７５７９号
【文献】米国特許第３７７３９１９号明細書
【文献】欧州特許第５８４８１号明細書
【非特許文献】
【0008】
【文献】Lindholm, P., and M. Saarma. 2010. Novel CDNF/MANF family of neurotrophic factors. Dev. Neurobiol. 70:360-371.
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【文献】Voutilainen, M.H., S. Back, E. Porsti, L. Toppinen, L. Lindgren, P. Lindholm, J. Peranen, M. Saarma, and R.K. Tuominen. 2009. Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor is neurorestorative in rat model of Parkinson's disease. J.Neurosci. 29:9651-9659. doi: 10.1523/JNEUROSCI.0833-09.2009.
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【文献】Voutilainen MH, De Lorenzo F, Stepanova P, Back S, Yu LY, Lindholm P, Porsti E, Saarma M, Mannisto PT, Tuominen RK 2017 Evidence for an Additive Neurorestorative Effect of Simultaneously Administered CDNF and GDNF in Hemiparkinsonian Rats: Implications for Different Mechanism of Action. eNeuro. Mar 13;4(1)
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【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明において、ＣＤＮＦタンパク質のＣ末端断片は、インビトロ及びインビボでＥＲストレスを受けた交感神経ニューロン及びドーパミン作動性ニューロンを驚くほど保護し、また、完全長ＣＤＮＦとは対照的に、インビボで神経細胞膜及び血液脳関門を透過することが可能なことを発見した。
【0010】
従って、本発明の目的は、配列番号１：
ＭＰＡＭＫＩＣＥＫＬ ＫＫＬＤＳＱＩＣＥＬ ＫＹＥＫＴＬＤＬＡＳ ＶＤＬＲＫＭＲＶＡＥ ＬＫＱＩＬＨＳＷＧＥ ＥＣＲＡＣＡＥＫＴＤ ＹＶＮＬＩＱＥＬＡＰ ＫＹＡＡＴＨＰＫＴＥ Ｌ
に記載の配列、又は配列番号１の配列と少なくとも９０％の相同性又は配列同一性を好ましくは有する配列の少なくとも５０個の連続アミノ酸残基からなるＣ末端ＣＤＮＦ断片を提供することである。
ＭＰＡＭＫＩＣＥＫＬ ＫＫＬＤＳＱＩＣＥＬ ＫＹＥＫＴＬＤＬＡＳ ＶＤＬＲＫＭＲＶＡＥ ＬＫＱＩＬＨＳＷＧＥ ＥＣＲＡＣＡＥＫＴＤ ＹＶＮＬＩＱＥＬＡＰ ＫＹＡＡＴＨＰＫＴＥ Ｌ
に記載の配列、又は配列番号１の配列と少なくとも９０％の相同性又は配列同一性を好ましくは有する配列の少なくとも５０個の連続アミノ酸残基からなるＣ末端ＣＤＮＦ断片を提供することである。
【0011】
また、本発明は、Ｃ末端ＣＤＮＦ断片と、生理学的に許容される担体、緩衝液、賦形剤、防腐剤、及び安定化剤のうちの少なくとも１つとを含む医薬組成物を提供する。
【0012】
更に、本発明の結果は、中枢神経系（ＣＮＳ）疾患、糖尿病、又は網膜疾患を含む変性疾患又は障害の治療に使用するための上記Ｃ末端ＣＤＮＦ断片を提供し、上記ＣＮＳ疾患は、好ましくは、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病及びその他のアミロイド病、多系統萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭葉変性症、レビー小体型認知症、軽度認知障害、外傷性脳損傷、末梢神経損傷、嗜癖、及び脳卒中からなる群から選択される。
【0013】
また、本発明は、ＭＡＮＦのＣ末端断片（Ｃ-ＭＡＮＦ）が、成熟ＭＡＮＦタンパク質とは対照的に、ドーパミンニューロンの細胞膜を透過することができ、培養中のニューロンを保護することを示す。
【0014】
従って、本発明の別の目的は、配列番号２：
ＩＣＥＫＬＫＫＫＤＳ ＱＩＣＥＬＫＹＤＫＱ ＩＤＬＳＴＶＤＬＫＫ ＬＲＶＫＥＬＫＫＩＬ ＤＤＷＧＥＴＣＫＧＣ ＡＥＫＳＤＹＩＲＫＩ ＮＥＬＭＰＫＹＡＰＫ ＡＡＳＡＲＴＤＬ
に記載の配列、又は配列番号２の配列と少なくとも９０％の相同性又は配列同一性を好ましくは有する配列の少なくとも５０個の連続アミノ酸残基からなり、静脈内又は末梢投与、腹腔内、皮下、鼻腔内、経皮、筋肉内、眼内、又は動脈内投与により投与される、中枢神経系（ＣＮＳ）疾患を含む変性疾患又は障害の治療に使用するためのＣ末端ＭＡＮＦ断片を提供することである。
ＩＣＥＫＬＫＫＫＤＳ ＱＩＣＥＬＫＹＤＫＱ ＩＤＬＳＴＶＤＬＫＫ ＬＲＶＫＥＬＫＫＩＬ ＤＤＷＧＥＴＣＫＧＣ ＡＥＫＳＤＹＩＲＫＩ ＮＥＬＭＰＫＹＡＰＫ ＡＡＳＡＲＴＤＬ
に記載の配列、又は配列番号２の配列と少なくとも９０％の相同性又は配列同一性を好ましくは有する配列の少なくとも５０個の連続アミノ酸残基からなり、静脈内又は末梢投与、腹腔内、皮下、鼻腔内、経皮、筋肉内、眼内、又は動脈内投与により投与される、中枢神経系（ＣＮＳ）疾患を含む変性疾患又は障害の治療に使用するためのＣ末端ＭＡＮＦ断片を提供することである。
【0015】
また、上記Ｃ末端ＭＡＮＦ断片と、生理学的に許容される担体、緩衝液、賦形剤、及び安定剤のうちの少なくとも１つとを含み、静脈内又は末梢投与、腹腔内、皮下、鼻腔内、経皮、筋肉内、眼内、又は動脈内投与により投与される、中枢神経系（ＣＮＳ）疾患を含む変性疾患又は障害の治療に使用するための医薬組成物を提供する。
【0016】
本発明の更なる目的は、配列番号２：
ＩＣＥＫＬＫＫＫＤＳ ＱＩＣＥＬＫＹＤＫＱ ＩＤＬＳＴＶＤＬＫＫ ＬＲＶＫＥＬＫＫＩＬ ＤＤＷＧＥＴＣＫＧＣ ＡＥＫＳＤＹＩＲＫＩ ＮＥＬＭＰＫＹＡＰＫ ＡＡＳＡＲＴＤＬ
に記載の配列、又は配列番号２の配列と少なくとも９０％の相同性又は配列同一性を好ましくは有する配列の少なくとも５０個の連続アミノ酸残基からなり、１型又は２型糖尿病又は網膜疾患の治療に使用するためのＣ末端ＭＡＮＦ断片を提供することである。
ＩＣＥＫＬＫＫＫＤＳ ＱＩＣＥＬＫＹＤＫＱ ＩＤＬＳＴＶＤＬＫＫ ＬＲＶＫＥＬＫＫＩＬ ＤＤＷＧＥＴＣＫＧＣ ＡＥＫＳＤＹＩＲＫＩ ＮＥＬＭＰＫＹＡＰＫ ＡＡＳＡＲＴＤＬ
に記載の配列、又は配列番号２の配列と少なくとも９０％の相同性又は配列同一性を好ましくは有する配列の少なくとも５０個の連続アミノ酸残基からなり、１型又は２型糖尿病又は網膜疾患の治療に使用するためのＣ末端ＭＡＮＦ断片を提供することである。
【0017】
また、本発明は、Ｃ末端ＭＡＮＦ断片と、生理学的に許容される担体、緩衝液、賦形剤、防腐剤、及び安定剤のうちの少なくとも１つとを含み、１型又は２型糖尿病又は網膜疾患の治療に使用するための医薬組成物を提供する。
【0018】
本発明の上記及びその他の利点及び利益は、添付の特許請求の範囲に特徴として記載された手法で達成される。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】（Ａ）ＣＤＮＦは、２つのドメイン：Ｎ末端ドメイン及びＣ末端ドメインを有する。Ｎ末端ドメインは、酸化リン脂質に結合することができ（及び少なくともＭＡＮＦ Ｎ末端ドメインは、３－Ｏ－スルホガラクトシルセラミドとしても知られる脂質スルファチドにも結合、非特許文献２１参照）、サポシン様ドメインである。Ｃ末端ドメインは、Ｃ－Ｘ－Ｘ－Ｃ（即ち、Ｃ－Ｒ－Ａ－Ｃ）配列及びＣ末端ＥＲ残留シグナルＫＴＥＬを有し、ＳＡＰＬＩＰ様ドメインである。ＣＤＮＦをインビトロでタンパク質分解的に切断し、これら２つのドメインを生成することができ。（Ｂ）ＭＡＮＦ及びＣＤＮＦの構造の概略図。黒い縦棒は、８つの保存されたシステイン残基の位置を示す。
【図2】プラスミドから発現したＣＤＮＦ及びＣＤＮＦのＣ末端断片は、ＥＲストレスを受けた上頸神経節（ＳＣＧ）交感神経ニューロンを救出する。実験において、神経成長因子（１０ｎｇ／ｍＬのＮＧＦ）を培地に加えた際に、７日齢ラット／マウスからのＳＣＧニューロンに、ＣＤＮＦを発現する指示プラスミド、ＣＤＮＦのＣ末端断片（Ｃ－ＣＤＮＦ）を発現する指示プラスミド、コントロールプラスミドＰＣＲ３．１、及びポジティブコントロールをマイクロインジェクションした。翌日、２μＭのツニカマイシン（ＴＭ）を添加してＥＲストレス誘導細胞死を引き起こし、次いで３日後に、生きている蛍光ニューロンをカウントした。結果を初期のニューロンに対する割合として示す。
【図3】ＣＤＮＦ及びＣＤＮＦ断片タンパク質は、細胞質にマイクロインジェクションされると、ＥＲストレスを受けたＳＣＧニューロンを救出する。実験において、出生後１日齢のマウスからＳＣＧニューロンを調製し、７日間培養した後、組み換えヒトＣＤＮＦ又はＣ－ＣＤＮＦタンパク質をそれぞれ注入した。翌日、ツニカマイシン（２μＭ）を添加し、３日後に生きている蛍光ニューロンをカウントした。結果を初期のニューロンに対する割合として示す。
【図4】ＭＡＮＦのＣ末端断片（Ｃ－ＭＡＮＦ）は、培養中のドーパミン作動性ニューロンを保護する。胎生１３日（Ｅ１３）のＮＭＲＩマウスの中脳底の解離培養物を、Ｃ－ＭＡＮＦ、ＧＤＮＦ（ポジティブコントロール）を培地に添加して、又はコントロールとして成長因子なしで、９６ウェルプレート上で５日間成長させた。その後、培養物をチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）について染色した。画像をＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ（商標）でスキャンし、免疫陽性ニューロンをＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒ及びＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒ解析ソフトウェアでカウントした。データを、ＧＤＮＦ保持ＴＨ陽性ニューロンに対する割合として表す。
【図5】ＣＤＮＦのＣ末端断片（Ｃ－ＣＤＮＦ）は、インビトロでドーパミン作動性ニューロンを保護する。Ｅ１３．５ ＮＭＲＩマウスの中脳底の解離培養物を、ＣＤＮＦ又はＣＤＮＦ断片を所定の濃度で培地に添加して、９６ウェルプレート上で５日間成長させた。ＧＤＮＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）で、又は神経栄養因子なしで培養したドーパミンニューロンをコントロールとした。培養物をチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）について免疫染色し、画像をＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ（商標）でスキャンした。ＴＨ陽性ニューロンを、ＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒ及びＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒ解析ソフトウェアでカウントし、ＧＤＮＦ保持ニューロンに対する割合として表した。
【図6】ＣＤＮＦのＣ末端断片（Ｃ－ＣＤＮＦ）及びＭＡＮＦのＣ末端断片（Ｃ－ＭＡＮＦ）は、ドーパミンニューロン及びＰＣ６細胞の細胞膜を透過する。Ａ．１２５Ｉ－Ｃ－ＣＤＮＦは、１２５Ｉ－ＣＤＮＦとは異なり、インビトロでＥ１４ドーパミンニューロンに効率的に取り込まれ、Ｃ－ＣＤＮＦの細胞透過性を示す。培養中のＥ１４ドーパミンニューロンを３０，０００ｃｐｍのヨウ素化ＣＤＮＦ又はＣ－ＣＤＮＦと共に３７℃で２時間インキュベートした。次に、細胞を氷上に置き、０．２Ｍ酢酸、０．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ２．８）で洗浄し、ガンマカウンターでカウントした。細胞内の放射能を測定した。Ｂ．１２５Ｉ－Ｃ－ＣＤＮＦ及び１２５Ｉ－Ｃ－ＭＡＮＦは、完全長ヨウ素化ＣＤＮＦとは異なり、ラットＰＣ６細胞の細胞膜を透過する。成長因子の添加前に３時間、タプシガルギンあり又はなしで処理したＰＣ６細胞に、ヨウ素化ＣＤＮＦ又はＣ－ＣＤＮＦ及びＣ－ＭＡＮＦを適用した。内在化を３７℃で９０分間行った。細胞を氷上に置いた後、０．２Ｍ酢酸、０．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ２．８）で洗浄し、ガンマカウンターを用いて細胞内の放射能を測定した。
【図7】
１２５Ｉ－ＣＤＮＦ、１２５Ｉ－Ｃ-ＣＤＮＦ、及び１２５Ｉ－Ｃ－ＭＡＮＦの血液脳関門透過。１２５Ｉ－ＣＤＮＦ、１２５Ｉ－Ｃ-ＣＤＮＦ、及び１２５Ｉ－Ｃ－ＭＡＮＦをラットに皮下注射した。２時間後にラットにＰＢＳを灌流し、脳を解剖した。脳内の放射能をガンマカウンターで分析した。データを平均±ＳＥＭで示す。＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、事後比較及びその後の一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）。
【図8】ＰＤのラット６－ＯＨＤＡモデルにおける損傷後２、４、６、及び８週間の累積回転数。ＣＤＮＦ、Ｎ末端ＣＤＮＦ断片（Ｎ－ＣＤＮＦ）、Ｃ－ＣＤＮＦ、又はビヒクル（ＰＢＳ）を、６－ＯＨＤＡ損傷の２週間後にラットの脳に線条体内注射した。Ｃ－ＣＤＮＦは、６－ＯＨＤＡ損傷ラットのアンフェタミン誘発回転の累積量を大幅に減らすため、神経機能の回復において完全長ＣＤＮＦよりも有効である。データを平均±ＳＥＭで示す。一元配置分散分析の後、Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ事後検定、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図9】ＭＡＮＦの短い４アミノ酸長のＣ末端断片（ＭＡＮＦ４）は、当該ペプチドを６－ＯＨＤＡ損傷の２週間後から線条体に注入し、アンフェタミン誘発回転数を損傷後１、４、６、８、１０、及び１２週間（Ａ）又は累積的（Ｂ）に測定する場合、パーキンソン病のラット６－ＯＨＤＡモデルにおいて有効ではない。ＧＤＮＦをポジティブコントロールとして使用した。
【図10】Ｃ末端ＭＡＮＦ断片（Ｃ－ＭＡＮＦ）は、マウスのベータ細胞の増殖を刺激する。マウスの膵島を胎盤性ラクトゲン、Ｃ－ＭＡＮＦ、又はＭＡＮＦと共に５日間インビトロで培養した後のベータ細胞へのＣｌｉｃｋ ＥｄＵの取り込み（ｎ＝３ウェル／ポイント）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図11】Ｃ－ＣＤＮＦでの処理は、ＡＬＳのスーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）１マウスモデルの臨床スコアに優れた効果を発揮する。ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスに、１３週齢で、Ｃ－ＣＤＮＦ（３．７５μｇ）又はＰＢＳを脳室内に単回注射した。（Ａ）雌動物の臨床状態。Ｃ－ＣＤＮＦ処理ＳＯＤ１マウスは、ＰＢＳ処理マウスよりも統計的に有意に優れた臨床スコアを示したことから、Ｃ－ＣＤＮＦ処理は症状の発症を遅らせる。（Ｂ）バランス、協調、筋力をロータロッドで分析した。加速度４～４０ｒｐｍ、カットオフ時間４分。落下までの時間（秒）を左側に示す。ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａ雌。Ｃ－ＣＤＮＦ処理は、ＰＢＳ処理マウスと比較して、ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスの運動行動を改善する。
【図12】ＳＯＤ１－Ｇ９３ＡマウスＡＬＳモデルにおける１．５μｇ／２４時間のＣ－ＣＤＮＦの４週間長期脳室内注入の効果。（Ａ）体重の相対的な変化、性別の分類なし。１２週（ミニポンプの設置前）をベースラインとして示す。１８週と１９週とで体重における処理間の有意差が検出された（ｐ＜０．０５、両側不対ｔ検定）。（Ｂ）４週間の長期脳室内Ｃ－ＣＤＮＦ注入は、ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスのロータロッド能力により測定される運動協調を改善する。ロータロッド試験では、加速度４～４０ｒｐｍ、カットオフ時間４分を用いた。Ｃ－ＣＤＮＦ処理とＰＢＳ処理との差は、１３週から１９週まで有意だった（ｐ＜０．０１、反復測定ＡＮＯＶＡ）。
【図13】皮下注射したＣ－ＣＤＮＦは、脳虚血のラットモデルにおいて梗塞体積を減少させる。Ｃ－ＣＤＮＦ（５０μｇ）を、遠位中大脳動脈閉塞の３０～５０分前及び再灌流直後に１００μＬの容量で投与した。Ｃ－ＣＤＮＦ処理は、大脳皮質の吻側部分から測定した梗塞体積を減少させる（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定ｐ＜０．０５）。Ｃ－ＣＤＮＦ処理ラットでは、ビヒクル処理ラットよりも損傷が約５０％小さかった。ＰＢＳをコントロールとして用いた。＊はＰ＜０．０５を示す。値は、ＰＢＳに対するパーセンテージとしての平均値±ＳＥＭ、ｎ＝８～９で表す。体系的に投与したＣ－ＣＤＮＦは、血圧及び心拍数に影響しない。血圧及び心拍数の変化は、損傷体積の変化を引き起こすことがよく知られているため、このデータは、Ｃ－ＣＤＮＦが直接的な神経保護効果を有することを示唆している。
【図14】Ｃ－ＣＤＮＦ及びＣ－ＭＡＮＦの配列アライメント及び比較。両神経栄養因子のＣ末端構造は、３つのαヘリックスモチーフ（ヘリックス１、２、３）を含む。
【図15】野生型マウスに皮下注射したＣ－ＣＤＮＦの効果。オープンフィールド実験の結果。種々の用量のＣ－ＣＤＮＦの皮下投与は、自発運動に影響しない。
【図16】ハンチントン病モデルにおけるＣ－ＣＤＮＦの効果。Ａ．落下までの時間。ＱＡ＋ＰＢＳとＱＡ＋Ｃ－ＣＤＮＦとの間でｐ＝０．０１（反復測定双方向ＡＮＯＶＡ）。Ｂ．握力（左足）、３週：ＱＡ＋ＰＢＳとＱＡ＋Ｃ－ＣＤＮＦとの間でｐ＝０．００４。５週：ＱＡ＋ＰＢＳとＱＡ＋Ｃ－ＣＤＮＦとの間でｐ＝０．０２（反復測定ＡＮＯＶＡ）。成体ウィスターラットに、キノリン酸（ＱＡ）の片側線条体内注射を単回投与した。キノリン酸は、興奮毒性プロセスにより線条体ニューロンの死を誘導する毒素である。Ｃ－ＣＤＮＦは、ロータロッドと握力の両試験で運動能力を改善した。
【発明を実施するための形態】
【0020】
本発明は、神経栄養因子タンパク質ＣＤＮＦに関する。ＣＤＮＦポリペプチドは、シグナルペプチドを有する全長１８７アミノ酸の完全長ヒトＣＤＮＦ、及びシグナルペプチドを有しない全長１６１アミノ酸の成熟ヒトＣＤＮＦである（図１Ｂ参照）。
【0021】
また、本発明は、神経栄養因子タンパク質ＭＡＮＦに関する。特に重要なＭＡＮＦポリペプチドは、シグナルペプチドを有する全長１７９アミノ酸の完全長ヒトＭＡＮＦ、及びシグナルペプチドを有しない全長１５８アミノ酸の成熟ヒトＭＡＮＦである（図１Ｂ参照）。
【0022】
本明細書で用いる場合、ＣＤＮＦ又はＭＡＮＦポリペプチドに適用される用語「Ｃ末端断片」は、通常、上記ポリペプチドのＣ末端ＳＡＰ様ドメインに位置する、少なくとも約５０個の隣接又は連続アミノ酸、典型的には少なくとも約５５個の隣接又は連続アミノ酸、より典型的には少なくとも約５７個又は６０個の隣接又は連続アミノ酸を含んでいてよい（図１Ａ及び１Ｂ参照）。また、Ｃ末端断片は、６１個又は６５個の隣接又は連続アミノ酸の長さよりも長くてもよく、場合によっては７０個の隣接又は連続アミノ酸よりも長くてもよい。最も好ましくは、Ｃ末端断片は、Ｃ末端ドメインの５７～６１個又は６０～６５個の隣接又は連続アミノ酸を含む。これらのＣ末端断片は、完全なポリペプチドの生物学的活性を少なくとも部分的に保持している「機能的断片」であり、完全なポリペプチドにはない特性さえも有する場合がある。
【0023】
ＣＤＮＦ／ＭＡＮＦの天然に存在する対立遺伝子変異体に加えて、コードされたＣＤＮＦ／ＭＡＮＦポリペプチド又はそれらのＣ末端断片のアミノ酸配列に伸長、挿入、及び欠失等の変化をもたらすＣＤＮＦ／ＭＡＮＦ核酸配列への突然変異により、変化を導入することができる。ＣＤＮＦ／ＭＡＮＦポリペプチド及びそれらのＣ末端ドメインの配列において、「非必須」アミノ酸残基におけるアミノ酸置換に至る、ヌクレオチド置換を行うことができる。
【0024】
「非必須」アミノ酸残基は、ＣＤＮＦ／ＭＡＮＦの野生型配列において、その生物学的活性を変化させることなく修飾することができる残基であり、一方、「必須」アミノ酸残基は、そのような生物学的活性に必要である。例えば、本発明のＣＤＮＦ／ＭＡＮＦ分子間で保存されているアミノ酸残基は、必須であり、特に変化を受けにくいと予測される。保存的置換を行うことができるアミノ酸は、当該技術分野で周知である。
【0025】
各アミノ酸は、天然又は非天然のアミノ酸である。用語「非天然アミノ酸」は、天然アミノ酸に類似した構造を有して天然アミノ酸の構造及び反応性を模倣するという点で天然アミノ酸の同族体である、有機化合物を指す。非天然アミノ酸は、修飾されたアミノ酸及び／又はアミノ酸類似体であってもよいが、２０個の天然に存在する一般的なアミノ酸、又は希少な天然アミノ酸であるセレノシステイン又はピロリシンの１つではない。また、非天然アミノ酸は、天然アミノ酸のＤ－異性体であってもよい。適切なアミノ酸の例としては、これらに限定されないが、アラニン、アロイソロイシン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、シクロヘキシルアラニン、２，３－ジアミノプロピオン酸、４－フルオロフェニルアラニン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、ホモプロリン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、ナフチルアラニン、ノルロイシン、フェニルアラニン、フェニルグリシン、ピペコリン酸、プロリン、ピログルタミン酸、サルコシン、セリン、セレノシステイン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、それらの誘導体又は組み合わせが挙げられる。
【0026】
本発明の特定の実施形態は、少なくとも１、２、３、４、又はそれ以上の連続アミノ酸が交互にキラリティを有するＣ末端ＣＤＮＦ断片又はＣ末端ＭＡＮＦ断片を含む。本明細書で用いる場合、キラリティは、アミノ酸の「Ｄ」及び「Ｌ」異性体を指す。本発明の特定の実施形態において、少なくとも１、２、３、４、又はそれ以上の連続アミノ酸は交互にキラリティを有し、残りのアミノ酸はＬ－アミノ酸である。
【0027】
本開示において、本発明のＣ末端ＣＤＮＦ断片及びＣ末端ＭＡＮＦ断片の神経細胞への細胞取り込みが実証されている。特定の実施形態において、取り込みは、好ましくは、完全長ＣＤＮＦ又はＭＡＮＦと比較して少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２倍良好であり、特定のペプチドでは、完全長ＣＤＮＦ又はＭＡＮＦよりも１３倍も良好である。特定の実施形態において、本発明は、完全長ヒトＣＤＮＦ等のコントロールと比較して、本発明のＣ末端ＣＤＮＦ断片では細胞取り込み効率が改善したことを示す。特定の実施形態おいて、本発明は、完全長ヒトＭＡＮＦ等のコントロールと比較して、本発明のＣ末端ＭＡＮＦ断片では細胞取り込み効率が改善したことを示す。
【0028】
本明細書で用いる場合、細胞取り込み効率は、Ｃ末端ＣＤＮＦ断片又はＣ末端ＭＡＮＦ断片の細胞膜を透過する能力を指す。本発明のＣ末端ＣＤＮＦ断片又はＣ末端ＭＡＮＦ断片の細胞取り込みは、受容体又は細胞種に依存しない。
【0029】
当業者は、（ｉ）細胞種（例えば、神経細胞、内皮細胞等）に取り込まれたＣ末端ＣＤＮＦ断片又はＣ末端ＭＡＮＦ断片等の細胞透過性ペプチドの量と、（ｉｉ）同じ細胞種に取り込まれた完全長ＣＤＮＦ／ＭＡＮＦ等のコントロールペプチドの量とを比較することにより、Ｃ末端ＣＤＮＦ断片及び／又はＣ末端ＭＡＮＦ断片の取り込み効率を試験することができる。細胞取り込み効率の測定にあたり、Ｃ末端ＣＤＮＦ断片又はＣ末端ＭＡＮＦ断片等の細胞透過性ペプチドの存在下で、細胞種を特定の時間（例えば、３０分、１時間、２時間等）インキュベートし、その後、細胞に取り込まれた細胞透過性ペプチドの量を定量してもよい。それとは別に、同じ濃度のコントロールを細胞種の存在下で同じ時間インキュベートし、細胞に取り込まれた当該もう１つペプチドの量を定量する。定量は、Ｃ末端ＣＤＮＦ断片又はＣ末端ＭＡＮＦ断片等の細胞透過性ペプチドを蛍光標識し（例えば、ＦＩＴＣ色素で）、当該技術分野で周知の技術を用いて蛍光強度を測定することにより行うことができる。
【0030】
また、本発明のＣ末端ＣＤＮＦ断片及びＣ末端ＭＡＮＦ断片は、適切なコントロールと比較して、細胞、例えば、神経細胞に対して保護効果を示す。本明細書で用いる場合、保護効果とは、本発明のＣ末端ＣＤＮＦ断片又はＣ末端ＭＡＮＦ断片が、例えば、ドーパミン作動性ニューロン又はＥＲストレスを受けたニューロン細胞等の生存を促進する能力を指す。当業者は、（ｉ）細胞種（例えば、交感神経細胞又はドーパミン作動性ニューロン等）の生存に対する本発明のＣ末端ＣＤＮＦ断片又はＣ末端ＭＡＮＦ断片の用量と、（ｉｉ）同じ細胞種によるコントロールペプチドの生存レベル、又は同じ細胞種による神経栄養因子の添加なしでの生存レベルとを比較することにより、上記保護効果を試験することができる。細胞生存率の測定にあたり、本発明のＣ末端ＣＤＮＦ断片及びＣ末端ＭＡＮＦ断片の存在下で、細胞種を特定の時間（例えば、３０分、１時間、２時間等）インキュベートし、その後、細胞の細胞生存率を定量してもよい。それとは別に、同じ濃度のコントロールペプチドを細胞種の存在下で同じ時間インキュベートし、細胞による当該もう１つペプチドの細胞生存率を定量する。或いは、細胞種を神経栄養因子なしで同じ時間インキュベートし、細胞による細胞生存率を定量する。
【0031】
一実施形態において、細胞生存率の測定にあたり、細胞種に本発明のＣ末端ＣＤＮＦ断片又はＣ末端ＭＡＮＦ断片を注入し、特定の時間（例えば、３０分、１時間、２時間等）インキュベートし、その後、細胞の細胞生存率を定量してもよい。コントロール細胞には緩衝液を注入し（即ち、神経栄養因子なし）、コントロール細胞を同じ時間インキュベートし、細胞による細胞生存率を定量する。
【0032】
特定の実施形態において、本発明のＣ末端ＣＤＮＦ断片の保護効果（細胞生存率として測定）は、成長因子を加えずにインキュベートした細胞、又は成長因子を含まない緩衝液を注入した細胞と比較して、少なくとも１．０９倍、少なくとも１．２０倍、少なくとも１．２４倍、少なくとも１．８５倍、少なくとも１．９６、少なくとも２．１１倍、又は少なくとも２．２０倍である。
【0033】
一実施形態において、保護効果は、成長因子を加えずにインキュベートした細胞、又は成長因子を含まない緩衝液を注入した細胞に対して少なくとも１．０９倍である。
【0034】
一実施形態において、保護効果は、成長因子を加えずにインキュベートした細胞、又は成長因子を含まない緩衝液を注入した細胞に対して少なくとも１．２０倍である。
【0035】
一実施形態において、保護効果は、成長因子を加えずにインキュベートした細胞、又は成長因子を含まない緩衝液を注入した細胞に対して少なくとも１．２４倍である。
【0036】
一実施形態において、保護効果は、成長因子を加えずにインキュベートした細胞、又は成長因子を含まない緩衝液を注入した細胞に対して少なくとも１．８５倍である。
【0037】
一実施形態において、保護効果は、成長因子を加えずにインキュベートした細胞、又は成長因子を含まない緩衝液を注入した細胞に対して少なくとも１．９６倍である。
【0038】
一実施形態において、保護効果は、成長因子を加えずにインキュベートした細胞、又は成長因子を含まない緩衝液を注入した細胞に対して少なくとも２．１１倍である。
【0039】
一実施形態において、保護効果は、成長因子を加えずにインキュベートした細胞、又は成長因子を含まない緩衝液を注入した細胞に対して少なくとも２．２０倍である。
【0040】
特定の実施形態において、本発明のＣ末端ＭＡＮＦ断片の保護効果は、成長因子を加えずにインキュベートした細胞、又は成長因子を含まない緩衝液を注入した細胞と比較して、少なくとも１．１８倍である。
【0041】
従って、本発明は、配列番号１：
ＭＰＡＭＫＩＣＥＫＬ ＫＫＬＤＳＱＩＣＥＬ ＫＹＥＫＴＬＤＬＡＳ ＶＤＬＲＫＭＲＶＡＥ ＬＫＱＩＬＨＳＷＧＥ ＥＣＲＡＣＡＥＫＴＤ ＹＶＮＬＩＱＥＬＡＰ ＫＹＡＡＴＨＰＫＴＥ Ｌ
に記載の配列、又は配列番号１の配列と少なくとも９０％相同である配列の少なくとも５０個の連続アミノ酸残基からなるＣ末端ＣＤＮＦ断片を提供する。
ＭＰＡＭＫＩＣＥＫＬ ＫＫＬＤＳＱＩＣＥＬ ＫＹＥＫＴＬＤＬＡＳ ＶＤＬＲＫＭＲＶＡＥ ＬＫＱＩＬＨＳＷＧＥ ＥＣＲＡＣＡＥＫＴＤ ＹＶＮＬＩＱＥＬＡＰ ＫＹＡＡＴＨＰＫＴＥ Ｌ
に記載の配列、又は配列番号１の配列と少なくとも９０％相同である配列の少なくとも５０個の連続アミノ酸残基からなるＣ末端ＣＤＮＦ断片を提供する。
【0042】
また、本発明は、配列番号２：
ＩＣＥＫＬＫＫＫＤＳ ＱＩＣＥＬＫＹＤＫＱ ＩＤＬＳＴＶＤＬＫＫ ＬＲＶＫＥＬＫＫＩＬ ＤＤＷＧＥＴＣＫＧＣ ＡＥＫＳＤＹＩＲＫＩ ＮＥＬＭＰＫＹＡＰＫ ＡＡＳＡＲＴＤＬ
に記載の配列、又は配列番号２の配列と少なくとも９０％相同である配列の少なくとも５０個の連続アミノ酸残基からなるＣ末端ＭＡＮＦ断片に関する。
ＩＣＥＫＬＫＫＫＤＳ ＱＩＣＥＬＫＹＤＫＱ ＩＤＬＳＴＶＤＬＫＫ ＬＲＶＫＥＬＫＫＩＬ ＤＤＷＧＥＴＣＫＧＣ ＡＥＫＳＤＹＩＲＫＩ ＮＥＬＭＰＫＹＡＰＫ ＡＡＳＡＲＴＤＬ
に記載の配列、又は配列番号２の配列と少なくとも９０％相同である配列の少なくとも５０個の連続アミノ酸残基からなるＣ末端ＭＡＮＦ断片に関する。
【0043】
本明細書及び以下の特許請求の範囲のセクションで用いる場合、用語「断片」には、天然ペプチド（分解産物、合成的に合成したペプチド、又は組み換えペプチドのいずれか）、及び修飾ペプチドが含まれ、当該修飾ペプチドは、例えば、ペプチドをより安定にする又はより免疫原性の低いものとする修飾を有してもよい。そのような修飾としては、これらに限定されないが、環化、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、ペプチド結合修飾、骨格修飾、及び残基修飾が挙げられる。また、断片は、更に伸長、欠失、又は挿入を含んでいてもよい。
【0044】
本発明の実施形態において、断片の長さは、５０～８１アミノ酸の範囲にある。好ましくは、断片の長さは、５５～７５、５５～７０、５５～６１、６１～６５、又は６１～７０アミノ酸の範囲にある。より好ましくは、断片の長さは、５７～６１、５５～６９、５５～６８、５５～６７、５５～６６、５６～６９、５６～６８、５６～６７、５６～６１、５７～６９、５７～６８、５７～６７、５７～６１、５８～６９、５８～６８、５８～６７、５８～６１、５９～６９、５９～６８、５９～６７、５９～６１、６０～６９、６０～６８、６０～６７、６０～６６、６０～６４、６０～６３、６１～６２、６１～６３、６１～６４、６１～６５、６１～６６、又は６１～６７アミノ酸の範囲にある。例えば、好ましい断片は、少なくとも５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、又は７５個のアミノ酸からなるものとすることができる。断片は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリン等の天然に存在するアミノ酸のいずれかだけでなく、非従来型又は修飾型アミノ酸を含んでいてもよい。好ましくは、断片は、ヒトＣＤＮＦ又はＭＡＮＦタンパク質のＣ末端ドメインの配列と、少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８５％、又は８０％の相同性又は配列同一性を有する。より好ましくは、断片は、ヒトＣＤＮＦ又はＭＡＮＦタンパク質のＣ末端ドメインの配列と少なくとも８０％の相同性又は配列同一性を有する。本明細書で用いる場合、「相同性」又は「相同である」は、参照配列ともう１つの配列の少なくとも断片との間における配列類似性を指す。以下に記載のとおり、ＢＬＡＳＴでは、パーセント同一性及び類似性に基づいて配列を比較する。
【0045】
用語「同一の」又はパーセント「同一性」は、２つ以上のアミノ酸配列の文脈において、同じである２つ以上の配列又はサブ配列を指す。以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いて又は手動のアラインメント及び目視検査により測定して、比較ウィンドウ又は指定領域にわたり最大一致について比較し整列させたときに、２つの配列が特定のパーセンテージの同じであるアミノ酸残基を有する場合（即ち、特定の領域にわたり、又は、特定されない場合は配列全体にわたり、２９％の同一性、必要に応じて３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の同一性）、２つの配列は「実質的に同一」である。必要に応じて、同一性は、少なくとも約１０アミノ酸の長さである領域にわたり、或いはより好ましくは、１０、１５、２０、２５、３０、又はそれ以上のアミノ酸の長さである領域にわたり存在する。
【0046】
配列比較では、典型的には、１つの配列が参照配列として機能し、テスト配列と比較される。配列比較アルゴリズムを用いる場合、テスト配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要であれば、サブ配列の座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトプログラムパラメータを用いるか、又は、代替パラメータを指定することができる。次に、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対するテスト配列のパーセント配列同一性を算出する。２つの配列の同一性を比較する場合、配列が連続している必要はないが、ギャップがあると、全体的なパーセント同一性を低下させるペナルティを伴うだろう。
【0047】
本明細書で用いる場合、「比較ウィンドウ」は、２つの配列を最適に整列させた後、配列を連続位置の同じ数の参照配列と比較することができる、連続位置の数のいずれか１つのセグメントへの参照を含む。比較のための配列の整列方法は、ＣｌｕｓｔａｌＷ又はＦＡＳＴＡ等、当該技術分野で周知である。
【0048】
パーセント配列同一性及び配列類似性を決定するのに好適なアルゴリズムの２つの例として、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムがあり、それぞれ、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res 25(17):3389-3402及びAltschul et al. (1990) J. Mol Biol 215(3)-403-410に記載されている。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長、及び１０の期待値（Ｅ）、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff and Henikoff, (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89(22):10915-10919参照）、５０のアラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、及び両鎖の比較を用いる。短いアミノ酸配列については、ＰＡＭ３０スコアリングマトリックスを適用することができる。
【0049】
また、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計分析も実施する（例えば、Karlin and Altschul, (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90(12):5873-5877参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の尺度の１つは、２つのアミノ酸配列間の一致が偶然に生じうる確率の指標を提供する最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。
【0050】
好ましくは、配列番号１の配列と少なくとも９０％相同であるＣ末端ＣＤＮＦは、配列番号１の位置５２～５５に配列ＣＸＸＣ（式中、Ｘは任意のアミノ酸）を含む。より好ましくは、配列番号１の配列と少なくとも９０％相同である上記配列は、配列番号３：
ＭＰＡＭＫＩＣＥＫＬ ＫＫＬＤＳＱＩＣＥＬ ＫＹＥＫＴＬＤＬＡＳ ＶＤＬＲＫＭＲＶＡＥ ＬＫＱＩＬＨＳＷＧＥ ＥＣＸＸＣＡＥＫＴＤ ＹＶＮＬＩＱＥＬＡＰ ＫＹＡＡＴＨＰＫＴＥ Ｌ
（式中、Ｘは任意のアミノ酸）
の配列の少なくとも５０個の連続アミノ酸残基からなる。
ＭＰＡＭＫＩＣＥＫＬ ＫＫＬＤＳＱＩＣＥＬ ＫＹＥＫＴＬＤＬＡＳ ＶＤＬＲＫＭＲＶＡＥ ＬＫＱＩＬＨＳＷＧＥ ＥＣＸＸＣＡＥＫＴＤ ＹＶＮＬＩＱＥＬＡＰ ＫＹＡＡＴＨＰＫＴＥ Ｌ
（式中、Ｘは任意のアミノ酸）
の配列の少なくとも５０個の連続アミノ酸残基からなる。
【0051】
別の好ましい実施形態において、配列番号１の配列と少なくとも９０％相同である上記配列は、配列番号１の位置５２～５５に配列ＣＫＧＣを含む。
【0052】
最も好ましい実施形態において、上記配列は、配列番号４：
ＫＹＥＫＴＬＤＬＡＳ ＶＤＬＲＫＭＲＶＡＥ ＬＫＱＩＬＨＳＷＧＥ ＥＣＲＡＣＡＥＫＴＤ ＹＶＮＬＩＱＥＬＡＰ ＫＹＡＡＴＨＰＫＴＥ Ｌ
の配列、又は配列番号４の配列と少なくとも９０％の相同性又は配列同一性を有する配列を有する。
ＫＹＥＫＴＬＤＬＡＳ ＶＤＬＲＫＭＲＶＡＥ ＬＫＱＩＬＨＳＷＧＥ ＥＣＲＡＣＡＥＫＴＤ ＹＶＮＬＩＱＥＬＡＰ ＫＹＡＡＴＨＰＫＴＥ Ｌ
の配列、又は配列番号４の配列と少なくとも９０％の相同性又は配列同一性を有する配列を有する。
【0053】
一実施形態において、Ｃ末端ＣＤＮＦ断片は、その天然のＣ末端アミノ酸、即ち、ＥＲ残留シグナルを含まない。従って、好ましい実施形態において、断片は、配列番号１の位置７８～８１に相当するＥＲ残留シグナルＫＴＥＬを欠く。
【0054】
また、本発明は、断片が、ＦＩＴＣ標識等の検出可能な化学的又は生化学的部分に結合することができることを示す。本明細書で用いる場合、「検出可能な化学的又は生化学的部分」とは、ペプチドの検出を容易にする目的でアミノ酸配列又は検出可能な化学的又は生化学的部分を提示するタグを意味し、例えば、可視、蛍光、化学発光、又はその他の検出可能な色素；基質の存在下で検出可能な酵素、例えば、ＮＢＴ＋ＢＣＩＰとアルカリホスファターゼ、又は適切な基質とペルオキシダーゼ等；検出可能なタンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質等から選択される検出可能な分子が挙げられる。好ましくは、タグは、標的細胞への断片の透過を防止又は妨害しない。
【0055】
また、断片の安定性及び／又は細胞透過性を高めるためのＣ末端ＣＤＮＦ断片又はＣ末端ＭＡＮＦ断片のＮ末端及び／又はＣ末端修飾も好ましい。ＣＤＮＦ断片又はＭＡＮＦ断片の末端のアセチル化－アミド化（即ち、Ｎ末端アセチル化及びＣ末端アミド化）は、当該技術分野で知られている選択肢の１つである（例えば、非特許文献２２参照）．
【0056】
Ｃ末端ＣＤＮＦ断片及びＣ末端ＭＡＮＦ断片は、どちらもドーパミンニューロンを死から強力に保護するため（図４及び５参照）、特許文献１及び特許文献５等の従来技術は、断片を、アルツハイマー病、パーキンソン病（ＰＤ）、多系統萎縮症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭葉変性症、レビー小体型認知症、軽度認知障害、ハンチントン病（ＨＤ）、外傷性脳損傷、薬物中毒、及び脳卒中等の中枢神経系（ＣＮＳ）疾患の治療に用いることができることを示す。本発明を支持する更なる結果は、ＰＤモデルにおけるＣ－ＣＤＮＦの効果を示す図８、及びＡＬＳモデルにおけるＣ－ＣＤＮＦの効果を示す図１１及び１２にて提供する。また、短いＭＡＮＦペプチド（ＭＡＮＦ４）は、パーキンソン病のラット６－ＯＨＤＡモデルにおいて、神経修復のより臨床志向の設定でテストした場合、即ち、６－ＯＨＤＡの後に添加した場合、有効ではないことも重要である（図９参照）。
【0057】
ＣＮＳにおけるＣ末端ＣＤＮＦ断片又はＣ末端ＭＡＮＦ断片の効果には、ニューロンだけでなく、ミクログリア、星状細胞、及び神経幹細胞又は神経前駆細胞等のＣＮＳの他の細胞種、及び、生存の他にそれらが有する他の特性、例えば、移動、増殖、分化、及び成熟等を標的とすることが含まれる。
【0058】
図１０に示す結果は、Ｃ末端ＭＡＮＦ断片がＩ型及びＩＩ型糖尿病の治療に有効であることを裏付けている。更に、特許文献６は、ＣＤＮＦ及びＭＡＮＦが網膜障害においても活性があることを開示している。従って、本発明は、前記中枢神経系（ＣＮＳ）疾患、糖尿病、及び網膜障害の治療に関する。また、ＥＲストレス誘導アポトーシス細胞死は、罹患組織又は臓器の機能又は構造が時間とともに徐々に悪化する他の変性疾患にも寄与する（非特許文献２３参照）。そのような変性疾患の更なるいくつかの例は、加齢黄斑変性症、スタルガルト病、緑内障、網膜色素変性症、及び視神経変性；ニーマン－ピック病；アテローム性動脈硬化症；進行性核上麻痺；癌；テイ・サックス病；円錐角膜；炎症性腸疾患（ＩＢＤ）；前立腺炎；変形性関節症；骨粗鬆症；及び関節リウマチ、並びに外傷性脳損傷又は虚血再灌流損傷等のより急性の状態、例えば、心筋虚血損傷、腎虚血損傷、又は脳卒中である。従って、本発明はまた、変性疾患又は障害の治療に関する。
【0059】
治療方法では、薬学的有効量のＣ末端断片を患者に投与する。言い換えれば、本発明に係る断片は、アルツハイマー病、パーキンソン病（ＰＤ）、ＰＤの非運動症状（便秘、うつ病、及び幻覚等）、多系統萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、虚血性脳卒中、末梢神経障害、前頭側頭葉変性症、レビー小体型認知症、軽度認知障害、ハンチントン病、てんかん、外傷性脳損傷、末梢神経損傷、出血性脳卒中、又は嗜癖（例えば、コカイン、モルヒネ、アンフェタミン、又はアルコールの乱用）等の中枢神経系（ＣＮＳ）疾患及び他の神経障害、並びにＩ型及びＩＩ型糖尿病又は網膜障害を含む変性疾患又は障害の治療に用いるためのものである。より好ましくは、断片は、パーキンソン病又は筋萎縮性側索硬化症の治療に用いるためのものである。
【0060】
患者に投与するＣＤＮＦ又はＭＡＮＦのＣ末端断片の実際の投与量（例えば、有効量）は、体重、状態の重症度、治療下の疾患の種類、以前の又は同時の治療的介入、患者の特発性疾患、及び投与経路等の物理的及び生理学的要因により決定することができる。投与に対する責任を担う医師は、組成物中の活性成分（複数可）の濃度及び個々の対象に対する適当な用量（複数可）を決定することができる。
【0061】
本発明の一実施形態において、Ｃ末端ＣＤＮＦ断片又はＭＡＮＦ断片を医薬組成物に組み込むことができる。本発明のそのような組成物は、所望の純度を有するペプチドと、任意選択の生理学的に許容される担体（ナノ担体等）、賦形剤、又は安定剤（Remington's Pharmaceutical Sciences, 22nd edition, Allen, Loyd V., Jr, Ed., (2012)）とを混合することにより、凍結乾燥ケーキ又は水溶液の形態で保存用に調製する。許容される担体、賦形剤、又は安定剤は、使用する用量及び濃度でレシピエントに無害であり、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖、二糖、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又はツイーン（Ｔｗｅｅｎ）、プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【0062】
また、断片は、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合により調製したマイクロカプセル（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン－マイクロカプセル及びポリ－（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）中、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン小球体、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）中、又はマクロエマルジョン中に封入されてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences（上記参照）に開示されている。
【0063】
一実施形態において、医薬組成物は、例えば、少なくとも約０．１％の活性化合物を含むことができる。他の実施形態において、活性化合物は、例えば、ユニットの重量の約２％～約７５％、又は約２５％～約６０％、及びそこから導き出せる任意の範囲で含むことができる。
【0064】
他の非限定的な例において、医薬組成物又は製剤の用量は、投与単位あたり、約１ｎｇ／ｋｇ／体重のＣ末端ＣＤＮＦ断片又はＣ末端ＭＡＮＦ断片から、約５ｎｇ／ｋｇ／体重、約１０ｎｇ／ｋｇ／体重、約５０ｎｇ／ｋｇ／体重、約１００ｎｇ／ｋｇ／体重、約２００ｎｇ／ｋｇ／体重、約３５０ｎｇ／ｋｇ／体重、約５００ｎｇ／ｋｇ／体重、１μｇ／ｋｇ／体重、約５μｇ／ｋｇ／体重、約１０μｇ／ｋｇ／体重、約５０μｇ／ｋｇ／体重、約１００μｇ／ｋｇ／体重、約２００μｇ／ｋｇ／体重、約３５０μｇ／ｋｇ／体重、約５００μｇ／ｋｇ／体重、約１ミリグラム／ｋｇ／体重、約５ミリグラム／ｋｇ／体重、約１０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約１００ミリグラム／ｋｇ／体重、約２００ミリグラム／ｋｇ／体重、約３５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５００ミリグラム／ｋｇ／体重から、約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重のＣ末端ＣＤＮＦ断片又はＣ末端ＭＡＮＦ断片又はそれ以上まで、及びそこから導き出せる任意の範囲を含むことができる。本明細書に列挙される数字から導き出せる範囲の非限定的な例において、約５ｍｇ／ｋｇ／体重から約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５μｇ／ｋｇ／体重から約５００ミリグラム／ｋｇ／体重の範囲のＣ末端ＣＤＮＦ断片又はＣ末端ＭＡＮＦ断片等を、上記の数字に基づいて、投与することができる。
【0065】
また、本発明は、神経細胞を更に含むことができる医薬組成物を特徴とする。神経細胞は、例えば、ニューロン、神経幹細胞、又は神経前駆細胞とすることができる。
【0066】
別の実施形態において、医薬組成物は、上記で定義したＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列を含む組み換えベクター、上記で定義したＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列を含む組み換えウイルスベクター、又は上記で定義したＣ末端断片を発現する宿主細胞の治療有効量を含む。前記ウイルスベクターは、好ましくは、上記で定義したＣ末端断片をコードするポリヌクレオチドを含む、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス等のレトロウイルス、ヘルペスウイルス、及びパピローマウイルスからなる群から選択される。典型的には、組み換えベクター及び組み換えウイルスベクターは、インビトロ及びインビボの様々な系で本発明のポリヌクレオチドの発現を指示する組織特異的又は細胞種特異的プロモーターのような発現制御配列を含む。また、ベクターは、複数の系での発現に必要な調節要素を含むハイブリッドベクターであってもよい。これらの様々な調節系を含むベクターは市販されており、当業者は、本明細書で定義されるＣ末端断片をそのようなベクターに容易にクローニングすることができるだろう。本発明での使用に適した組み換えウイルスベクターの選択、Ｃ末端断片を発現するための核酸配列をベクターに挿入する方法、及び目的の細胞にウイルスベクターを送達する方法は、当該技術分野の技術の範囲内である。例えば、非特許文献２４参照。
【0067】
投与経路は、既知の方法、並びに静脈内又は末梢投与、腹腔内、皮下、くも膜下腔内、脳室内、鼻腔内、経皮、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、又は病変内手段、又は下記の徐放系による注射又は注入の一般的経路に従う。Ｃ末端断片又は当該断片を含む医薬組成物は、注入又はボーラス注射により連続的に投与することができる。一般に、その障害が許す場合、部位特異的送達用に断片を製剤化し投与するべきである。投与は連続的又は定期的に行うことができる。投与は、一定流量又はプログラム可能な流量の埋め込み型ポンプ又は定期的な注射により行うことができる。本発明は、Ｃ末端ＭＡＮＦ断片及びＣＤＮＦ断片がどちらも神経細胞膜及び血液脳関門を透過することができることを示していることから、末梢投与又は全身投与が好ましい（図６及び７参照）。他の好ましい投与経路は、皮下、くも膜下腔内、脳室内、鼻腔内、又は経皮投与である。図１３は、脳卒中を誘発したラットにおけるＣ－ＣＤＮＦタンパク質の皮下注射の効果を示す。
【0068】
徐放性製剤の好適な例としては、断片を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、造形品、例えば、フィルム又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 (1981)及びLanger, Chem. Tech., 12:98-105 (1982)に記載されるヒドロゲル、又はポリビニルアルコール、ポリラクチド（特許文献７、特許文献８）、又は非分解性エチレン－酢酸ビニル（Langer et al.上記参照）が挙げられる。
【0069】
遺伝子治療ベクターは、ペプチド断片のために、上記で定義した対応する投与様式を用いて、好ましくは、例えば、静脈内注射により、又は腹腔内、皮下、くも膜下腔内、又は脳室内投与により、対象に送達することができる。遺伝子治療ベクターの医薬製剤は、許容可能な希釈剤を含むことができ、又は遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれた徐放性マトリックスを含むことができる。
【0070】
図１４の配列アラインメントは、Ｃ末端ＣＤＮＦ及びＭＡＮＦペプチドの高い配列同一性を示している。従って、本発明者らは、本明細書に示した結果から、Ｃ末端ＭＡＮＦ断片においても、細胞膜透過及び神経細胞に対する保護効果に重要なアミノ酸配列モチーフが配列内に同様に位置することを推定する。よって、本発明は、配列番号２：
ＩＣＥＫＬＫＫＫＤＳ ＱＩＣＥＬＫＹＤＫＱ ＩＤＬＳＴＶＤＬＫＫ ＬＲＶＫＥＬＫＫＩＬ ＤＤＷＧＥＴＣＫＧＣ ＡＥＫＳＤＹＩＲＫＩ ＮＥＬＭＰＫＹＡＰＫ ＡＡＳＡＲＴＤＬ
に記載の配列、又は配列番号２の配列と少なくとも９０％の相同性又は配列同一性を有する配列の少なくとも５０個の連続アミノ酸残基からなり、静脈内又は末梢投与、腹腔内、皮下、鼻腔内、経皮、筋肉内、眼内、又は動脈内投与により投与される、中枢神経系（ＣＮＳ）疾患を含む変性疾患又は障害の治療に用いるためのＣ末端ＭＡＮＦ断片に関する。
ＩＣＥＫＬＫＫＫＤＳ ＱＩＣＥＬＫＹＤＫＱ ＩＤＬＳＴＶＤＬＫＫ ＬＲＶＫＥＬＫＫＩＬ ＤＤＷＧＥＴＣＫＧＣ ＡＥＫＳＤＹＩＲＫＩ ＮＥＬＭＰＫＹＡＰＫ ＡＡＳＡＲＴＤＬ
に記載の配列、又は配列番号２の配列と少なくとも９０％の相同性又は配列同一性を有する配列の少なくとも５０個の連続アミノ酸残基からなり、静脈内又は末梢投与、腹腔内、皮下、鼻腔内、経皮、筋肉内、眼内、又は動脈内投与により投与される、中枢神経系（ＣＮＳ）疾患を含む変性疾患又は障害の治療に用いるためのＣ末端ＭＡＮＦ断片に関する。
【0071】
図１０に示される結果に基づいて、本発明は更に、配列番号２：
ＩＣＥＫＬＫＫＫＤＳ ＱＩＣＥＬＫＹＤＫＱ ＩＤＬＳＴＶＤＬＫＫ ＬＲＶＫＥＬＫＫＩＬ ＤＤＷＧＥＴＣＫＧＣ ＡＥＫＳＤＹＩＲＫＩ ＮＥＬＭＰＫＹＡＰＫ ＡＡＳＡＲＴＤＬ
に記載の配列、又は配列番号２の配列と少なくとも９０％相同である配列の少なくとも５０個の連続アミノ酸残基からなり、１型又は２型糖尿病の治療に用いるためのＣ末端ＭＡＮＦ断片に関する。
ＩＣＥＫＬＫＫＫＤＳ ＱＩＣＥＬＫＹＤＫＱ ＩＤＬＳＴＶＤＬＫＫ ＬＲＶＫＥＬＫＫＩＬ ＤＤＷＧＥＴＣＫＧＣ ＡＥＫＳＤＹＩＲＫＩ ＮＥＬＭＰＫＹＡＰＫ ＡＡＳＡＲＴＤＬ
に記載の配列、又は配列番号２の配列と少なくとも９０％相同である配列の少なくとも５０個の連続アミノ酸残基からなり、１型又は２型糖尿病の治療に用いるためのＣ末端ＭＡＮＦ断片に関する。
【0072】
上記の全ての実施形態について、配列番号２の配列と少なくとも９０％相同である上記配列は、配列番号２の位置４７～５０に配列ＣＸＸＣ（式中、Ｘは任意のアミノ酸）を含むことが好ましい。
【0073】
より好ましくは、配列番号２の配列と少なくとも９０％相同である上記配列は、配列番号６：
ＱＩＣＥＬＫＹＤＫＱ ＩＤＬＳＴＶＤＬＫＫ ＬＲＶＫＥＬＫＫＩＬ ＤＤＷＧＥＴＣＸＸＣ ＡＥＫＳＤＹＩＲＫＩ ＮＥＬＭＰＫＹＡＰＫ ＡＡＳＡＲＴＤＬ
（式中、Ｘは任意のアミノ酸）
の配列の少なくとも５０個の連続しミノ酸残基からなる。
ＱＩＣＥＬＫＹＤＫＱ ＩＤＬＳＴＶＤＬＫＫ ＬＲＶＫＥＬＫＫＩＬ ＤＤＷＧＥＴＣＸＸＣ ＡＥＫＳＤＹＩＲＫＩ ＮＥＬＭＰＫＹＡＰＫ ＡＡＳＡＲＴＤＬ
（式中、Ｘは任意のアミノ酸）
の配列の少なくとも５０個の連続しミノ酸残基からなる。
【0074】
最も好ましくは、上記ＭＡＮＦ断片は、配列番号５：
ＫＹＤＫＱ ＩＤＬＳＴＶＤＬＫＫ ＬＲＶＫＥＬＫＫＩＬ ＤＤＷＧＥＴＣＫＧＣ ＡＥＫＳＤＹＩＲＫＩ ＮＥＬＭＰＫＹＡＰＫ ＡＡＳＡＲＴＤＬ
の配列、又は配列番号５の配列と少なくとも９０％相同である配列を有する。
ＫＹＤＫＱ ＩＤＬＳＴＶＤＬＫＫ ＬＲＶＫＥＬＫＫＩＬ ＤＤＷＧＥＴＣＫＧＣ ＡＥＫＳＤＹＩＲＫＩ ＮＥＬＭＰＫＹＡＰＫ ＡＡＳＡＲＴＤＬ
の配列、又は配列番号５の配列と少なくとも９０％相同である配列を有する。
【0075】
一実施形態において、Ｃ末端ＭＡＮＦ断片は、その天然のＣ末端アミノ酸、即ち、ＥＲ残留シグナルを含まない。従って、好ましい実施形態において、断片は、配列番号２の位置７５～７８に相当するＥＲ残留シグナルＲＴＤＬを欠く。
【0076】
Ｃ末端ＭＡＮＦ断片は、Ｃ末端ＣＤＮＦ断片について上記で述べたのと同じ方法で修飾することができる。
【0077】
更に、本発明は、Ｃ末端ＭＡＮＦ断片と、生理学的に許容される担体、緩衝液、賦形剤、及び安定剤のうちの少なくとも１つとを含む、中枢神経系（ＣＮＳ）疾患、１型又は２型糖尿病、又は網膜障害の治療に使用するための医薬組成物に関する。Ｃ末端ＭＡＮＦ断片を含む上記医薬組成物は、好ましくは患者に末梢的に投与され、従って、好ましくは末梢投与に適している。
【0078】
また、本明細書は、薬学的有効量の本明細書で定義されるＣ末端ＣＤＮＦ断片又はＣ末端ＭＡＮＦ断片が患者を投与する、中枢神経系（ＣＮＳ）疾患、Ｉ型又はＩＩ型糖尿病、又は網膜障害を含む変性疾患又は障害の治療方法に関する。好ましくは、上記断片は末梢的に投与される。
【0079】
また、本明細書は、中枢神経系（ＣＮＳ）疾患、Ｉ型又はＩＩ型糖尿病、又は網膜障害を含む変性疾患又は障害の治療用の医薬の製造のための、本明細書で定義されるＣ末端ＣＤＮＦ断片又はＣ末端ＭＡＮＦ断片の使用に関する。
【0080】
また、本発明は、配列番号４：
ＫＹＥＫＴＬＤＬＡＳ ＶＤＬＲＫＭＲＶＡＥ ＬＫＱＩＬＨＳＷＧＥ ＥＣＲＡＣＡＥＫＴＤ ＹＶＮＬＩＱＥＬＡＰ ＫＹＡＡＴＨＰＫＴＥ Ｌ
の配列、又は配列番号４の配列と少なくとも９０％の相同性又は配列同一性を有する配列を有するＣ－ＣＤＮＦ断片をコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドを提供する。
ＫＹＥＫＴＬＤＬＡＳ ＶＤＬＲＫＭＲＶＡＥ ＬＫＱＩＬＨＳＷＧＥ ＥＣＲＡＣＡＥＫＴＤ ＹＶＮＬＩＱＥＬＡＰ ＫＹＡＡＴＨＰＫＴＥ Ｌ
の配列、又は配列番号４の配列と少なくとも９０％の相同性又は配列同一性を有する配列を有するＣ－ＣＤＮＦ断片をコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドを提供する。
【0081】
更に、本発明は、上記の単離ポリヌクレオチドをコードする発現ベクター及び当該ベクターで形質転換した宿主細胞を提供する。上記単離ポリヌクレオチドを発現するのに適した組み換えベクターの選択、Ｃ－ＣＤＮＦ断片を発現するための核酸配列をベクターに挿入する方法、及び目的の細胞に組み換えベクターを送達する方法は、当該技術分野の技術の範囲内である。例えば、Tuschl, T. (2002), Nat. Biotechnol, 20: 446-448参照。
【0082】
本発明の背景を明らかにするため、特に、その実施に関する追加の詳細を提供するため、本明細書で使用される刊行物及び他の資料は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明は、本発明の範囲を限定することを意図しない以下の実施例において更に説明する。
【実施例】
【0083】
上頸神経節細胞を用いた試験
交感神経ニューロンの培養のため（非特許文献１５、非特許文献２５、非特許文献２６、非特許文献２７、非特許文献２８）、出生後（Ｐ）０～３日のマウスの上頸神経節をコラゲナーゼ（２．５ｍｇ／ｍＬ、ワージントン）、ディスパーゼ（５ｍｇ／ｍＬ、ロシュモレキュラーバイオケミカルズ）、及びトリプシン（１０ｍｇ／ｍＬ、ワージントン）を用いて３７°Ｃで４５分間消化し、シリコン処理したガラスパスツールピペットで機械的に解離した。広範なプレプレーティングにより、非神経細胞を除去した。ほぼ純粋なニューロンを、ポリオルニチン／ラミニン（シグマ）でコーティングされた３５ｍｍプラスチックディッシュにおいて、ニューロベーサル培地及びＢ２７サプリメント（インビトロジェン／ギブコ）中の小型標準マイクロアイランドで、３０ｎｇ／ｍＬのマウス神経成長因子（ＮＧＦ）（プロメガ）の存在下で５～６日間培養した。徹底的な洗浄と機能阻害抗ＮＧＦ抗体（ロシュ）の添加によりＮＧＦを除去した。ニューロンを、特別なニューロンマイクロインジェクション装置（非特許文献１５、非特許文献２５、非特許文献２６、非特許文献２７、非特許文献２９）で圧力マイクロインジェクションした（非特許文献２７、非特許文献３０）。生存分析のため、マイクロアイランド上の全てのニューロンを実験の開始時（初期数）及び終了時（３日間）にカウントし、初期に対する割（％）で表した。
交感神経ニューロンの培養のため（非特許文献１５、非特許文献２５、非特許文献２６、非特許文献２７、非特許文献２８）、出生後（Ｐ）０～３日のマウスの上頸神経節をコラゲナーゼ（２．５ｍｇ／ｍＬ、ワージントン）、ディスパーゼ（５ｍｇ／ｍＬ、ロシュモレキュラーバイオケミカルズ）、及びトリプシン（１０ｍｇ／ｍＬ、ワージントン）を用いて３７°Ｃで４５分間消化し、シリコン処理したガラスパスツールピペットで機械的に解離した。広範なプレプレーティングにより、非神経細胞を除去した。ほぼ純粋なニューロンを、ポリオルニチン／ラミニン（シグマ）でコーティングされた３５ｍｍプラスチックディッシュにおいて、ニューロベーサル培地及びＢ２７サプリメント（インビトロジェン／ギブコ）中の小型標準マイクロアイランドで、３０ｎｇ／ｍＬのマウス神経成長因子（ＮＧＦ）（プロメガ）の存在下で５～６日間培養した。徹底的な洗浄と機能阻害抗ＮＧＦ抗体（ロシュ）の添加によりＮＧＦを除去した。ニューロンを、特別なニューロンマイクロインジェクション装置（非特許文献１５、非特許文献２５、非特許文献２６、非特許文献２７、非特許文献２９）で圧力マイクロインジェクションした（非特許文献２７、非特許文献３０）。生存分析のため、マイクロアイランド上の全てのニューロンを実験の開始時（初期数）及び終了時（３日間）にカウントし、初期に対する割（％）で表した。
【0084】
交感神経ニューロンのマイクロインジェクションを、前述のように行った（非特許文献２９）。ＣＤＮＦ用のプラスミドは先に述べた。簡単に説明すれば、新生マウスＳＣＧニューロンをＮＧＦ（プロメガ）で５～６日間成長させた後、完全長（ＦＬ）－ＣＤＮＦ及びＣ－ＣＤＮＦ用の発現プラスミドを、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）用のレポータープラスミドと共に、各実験で１０ｎｇ／ｕＬのベクター濃度を用いて、核にマイクロインジェクションした。５０ｎｇ／ｕＬのプラスミド濃度でも同様の結果が得られた。タンパク質のマイクロインジェクションでは、２００ｎｇ／ｕＬのＰＢＳ中の組み換え完全長（ＦＬ）－ＣＤＮＦ、Ｃ－ＣＤＮＦタンパク質を、注入に成功したニューロンの識別を容易にする蛍光レポーターであるデキストランテキサスレッド（分子量７００００Ｄａ）（インビトロジェン、モレキュラープローブス）と共に、直接細胞質にマイクロインジェクションした。翌日、ツニカマイシン（２μＭ）を添加し、３日後に生きている蛍光ニューロンをカウントした。生きている蛍光（ＥＧＦＰを発現、又はデキストランテキサスレッドを含む）ニューロンを３日後に「盲目的に（ｂｌｉｎｄｌｙ）」カウントし、マイクロインジェクションの２～３時間後にカウントした初期の生きている蛍光ニューロンに対する割合（％）として表した。プラスミドを用いた実験を、プラスミド実験のために独立した培養で５回繰り返し、一方で４回の独立したタンパク質注入実験を行った。平均して、実験群につき５０～８０個のニューロンで注入に成功した。結果を平均±ＳＥＭで表した。各実験群のデータを、一元配置分散分析及び事後のＤｕｎｎｅｔｔのｔ検定により、コントロールプラスミドＰＣＲ３．１（ベクター）又はＰＢＳ（タンパク質注入実験において）と比較した。帰無仮説はｐ＜０．０５で棄却した。
【0085】
ＣＤＮＦ発現プラスミド
完全長（ＦＬ）又はカルボキシ末端（Ｃ）ドメインをコードする構築物を、ＴＯＰＯ／ＴＡクローニングシステム（インビトロジェン）又は制限エンドヌクレアーゼを用いて、ｐＣＲ３．１ベクター（インビトロジェン）に挿入した。ｐＣＲ３．１ベクター中の完全長ＣＤＮＦは、それぞれ５３７ｂｐ（１７９アミノ酸）及び５６１ｂｐ（１８７アミノ酸）のアミノ酸長であり、ＥＲターゲティングのためのＮ末端シグナル配列を有する。Ｃ－ＣＤＮＦは１８６ｂｐの長さであり、ＦＬ－ＣＤＮＦのアミノ酸１２７－１８７に相当する。
完全長（ＦＬ）又はカルボキシ末端（Ｃ）ドメインをコードする構築物を、ＴＯＰＯ／ＴＡクローニングシステム（インビトロジェン）又は制限エンドヌクレアーゼを用いて、ｐＣＲ３．１ベクター（インビトロジェン）に挿入した。ｐＣＲ３．１ベクター中の完全長ＣＤＮＦは、それぞれ５３７ｂｐ（１７９アミノ酸）及び５６１ｂｐ（１８７アミノ酸）のアミノ酸長であり、ＥＲターゲティングのためのＮ末端シグナル配列を有する。Ｃ－ＣＤＮＦは１８６ｂｐの長さであり、ＦＬ－ＣＤＮＦのアミノ酸１２７－１８７に相当する。
【0086】
Ｅ５１１：ｐＣＲ３．１中のヒトＣＤＮＦ／双方向ＴＯＰＯ ＴＡ。停止コドンを含む完全長ｃＤＮＡ（タグなし）。アンピシリン選択。ＤＨ５α。シーケンシングにより検証済み。
Ｅ８１１：シグナル配列を有するｐＣＲ３．１ ｈＣＤＮＦ Ｃ－ヒトＣＤＮＦ Ｃ末端配列。ＰＣＲ及びインビトロジェンＴＡクローニングシステムによりクローニング。挿入サイズ２０７ｂｐ。ＤＨ５ａ細胞に形質転換。アンピシリン選択。シーケンシングにより検証済み。
Ｅ８１１：シグナル配列を有するｐＣＲ３．１ ｈＣＤＮＦ Ｃ－ヒトＣＤＮＦ Ｃ末端配列。ＰＣＲ及びインビトロジェンＴＡクローニングシステムによりクローニング。挿入サイズ２０７ｂｐ。ＤＨ５ａ細胞に形質転換。アンピシリン選択。シーケンシングにより検証済み。
【0087】
タンパク質及びペプチド断片を発現するプラスミド
ヒト組み換えＣＤＮＦ（２６アミノ酸長のシグナル配列と１６１アミノ酸長の成熟ＣＤＮＦ配列とを有する、１８７アミノ酸からなる完全長ｐｒｅ－ＣＤＮＦ）、ヒトＮ－ＣＤＮＦ（２６アミノ酸のヒトＣＤＮＦシグナル配列と成熟ＣＤＮＦのアミノ酸１～アミノ酸１００の部分とからなる）、及びヒトＣ－ＣＤＮＦ（アミノ酸１０１からアミノ酸１６１に及ぶ成熟ＣＤＮＦのＣ末端ドメインと融合した２６アミノ酸長のＣＤＮＦシグナル配列からなる）。
ヒト組み換えＣＤＮＦ（２６アミノ酸長のシグナル配列と１６１アミノ酸長の成熟ＣＤＮＦ配列とを有する、１８７アミノ酸からなる完全長ｐｒｅ－ＣＤＮＦ）、ヒトＮ－ＣＤＮＦ（２６アミノ酸のヒトＣＤＮＦシグナル配列と成熟ＣＤＮＦのアミノ酸１～アミノ酸１００の部分とからなる）、及びヒトＣ－ＣＤＮＦ（アミノ酸１０１からアミノ酸１６１に及ぶ成熟ＣＤＮＦのＣ末端ドメインと融合した２６アミノ酸長のＣＤＮＦシグナル配列からなる）。
【0088】
ヒト組み換えＭＡＮＦ（２１アミノ酸長のシグナル配列と１５８アミノ酸長の成熟ＭＡＮＦ配列とを有する、１７９アミノ酸からなる完全長のｐｒｅ－ＭＡＮＦ）、ヒトＮ－ＭＡＮＦ（２１アミノ酸のヒトＭＡＮＦシグナル配列と成熟ＭＡＮＦのアミノ酸１～アミノ酸９５の部分とからなる）、及びヒトＣ－ＭＡＮＦ（アミノ酸９６からアミノ酸１５８に及ぶ成熟ＭＡＮＦのＣ末端ドメインと融合した２１アミノ酸長のＣＤＮＦシグナル配列からなる）。
【0089】
コドンによりｈＭＡＮＦ及びｈＣＤＮＦのｃＤＮＡ合成を最適化し、それらのドメインをジーンウィズに注文して、それぞれのｐＱＭＣＦ発現ベクターを構築した。Ｎ－ＣＤＮＦ、Ｃ－ＣＤＮＦ、Ｎ－ＭＡＮＦ、及びＣ－ＭＡＮＦ構築物は、Ｃ末端にヒスチジンタグを有した。最終ベクターでシーケンシングすることにより、ｃＤＮＡを検証した。ｈＭＡＮＦ及びｈＣＤＮＦタンパク質をＣＨＯ由来の懸濁細胞株ＣＨＯＥＢＮＡＬＴ８５により産生し、既知組成無血清培地を細胞培養に用いた。
【0090】
ＣＨＯＥＢＮＡＬＴ８５細胞に１μｇの発現プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、７００μｇ／ｍＬのＧ４１８を添加して、細胞集団を含むプラスミドを選択した。タンパク質の発現及び分泌を、トランスフェクションの４８時間後に、細胞溶解物及び上清において還元状態で分析した。
【0091】
ｈＭＡＮＦ及びｈＣＤＮＦタンパク質を、２段階イオン交換クロマトグラフィーで精製し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中にゲルろ過した。ＣＤＮＦ抗体及びＭＡＮＦ抗体（ＭＡＮＦ ４Ｅ１２－ＨＲＰ及びＣＤＮＦ－７Ｄ６－ＨＲＰ、イコサゲン タルトゥ、エストニア）を用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析の結果、使用したタンパク質の純度は９９％以上であった。
【0092】
ＣＤＮＦ及びＭＡＮＦのＣ末端ドメイン及びＮ末端ドメインをＮｉアフィニティーカラムで精製し、当該タンパク質を、抗Ｈｉｓタグマウスモノクローナル抗体（カタログ番号Ａ００１８６、ジェンスクリプト）を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングにより分析した。
産生されたタンパク質は以下の配列を有した。
産生されたタンパク質は以下の配列を有した。
【0093】
成熟ヒトＣＤＮＦ：
ＱＥＡＧＧＲＰＧＡＤＣＥＶＣＫＥＦＬＮＲＦＹＫＳＬＩＤＲＧＶＮＦＳＬＤＴＩＥＫＥＬＩＳＦＣＬＤＴＫＧＫＥＮＲＬＣＹＹＬＧＡＴＫＤＡＡＴＫＩＬＳＥＶＴＲＰＭＳＶＨＭＰＡＭＫＩＣＥＫＬＫＫＬＤＳＱＩＣＥＬＫＹＥＫＴＬＤＬＡＳＶＤＬＲＫＭＲＶＡＥＬＫＱＩＬＨＳＷＧＥＥＣＲＡＣＡＥＫＴＤＹＶＮＬＩＱＥＬＡＰＫＹＡＡＴＨＰＫＴＥＬ（配列番号７）
ＱＥＡＧＧＲＰＧＡＤＣＥＶＣＫＥＦＬＮＲＦＹＫＳＬＩＤＲＧＶＮＦＳＬＤＴＩＥＫＥＬＩＳＦＣＬＤＴＫＧＫＥＮＲＬＣＹＹＬＧＡＴＫＤＡＡＴＫＩＬＳＥＶＴＲＰＭＳＶＨＭＰＡＭＫＩＣＥＫＬＫＫＬＤＳＱＩＣＥＬＫＹＥＫＴＬＤＬＡＳＶＤＬＲＫＭＲＶＡＥＬＫＱＩＬＨＳＷＧＥＥＣＲＡＣＡＥＫＴＤＹＶＮＬＩＱＥＬＡＰＫＹＡＡＴＨＰＫＴＥＬ（配列番号７）
【0094】
ヒトＮ－ＣＤＮＦ：
ＱＥＡＧＧＲＰＧＡＤＣＥＶＣＫＥＦＬＮＲＦＹＫＳＬＩＤＲＧＶＮＦＳＬＤＴＩＥＫＥＬＩＳＦＣＬＤＴＫＧＫＥＮＲＬＣＹＹＬＧＡＴＫＤＡＡＴＫＩＬＳＥＶＴＲＰＭＳＶＨＭＰＡＭＫＩＣＥＫＬＫＫＬＤＳＱＩＣＥＬ（配列番号８）
ＱＥＡＧＧＲＰＧＡＤＣＥＶＣＫＥＦＬＮＲＦＹＫＳＬＩＤＲＧＶＮＦＳＬＤＴＩＥＫＥＬＩＳＦＣＬＤＴＫＧＫＥＮＲＬＣＹＹＬＧＡＴＫＤＡＡＴＫＩＬＳＥＶＴＲＰＭＳＶＨＭＰＡＭＫＩＣＥＫＬＫＫＬＤＳＱＩＣＥＬ（配列番号８）
【0095】
ヒトＣ－ＣＤＮＦ：
ＫＹＥＫＴＬＤＬＡＳＶＤＬＲＫＭＲＶＡＥＬＫＱＩＬＨＳＷＧＥＥＣＲＡＣＡＥＫＴＤＹＶＮＬＩＱＥＬＡＰＫＹＡＡＴＨＰＫＴＥＬ（配列番号４）
ＫＹＥＫＴＬＤＬＡＳＶＤＬＲＫＭＲＶＡＥＬＫＱＩＬＨＳＷＧＥＥＣＲＡＣＡＥＫＴＤＹＶＮＬＩＱＥＬＡＰＫＹＡＡＴＨＰＫＴＥＬ（配列番号４）
【0096】
成熟ヒトＭＡＮＦ：
ＬＲＰＧＤＣＥＶＣＩＳＹＬＧＲＦＹＱＤＬＫＤＲＤＶＴＦＳＰＡＴＩＥＮＥＬＩＫＦＣＲＥＡＲＧＫＥＮＲＬＣＹＹＩＧＡＴＤＤＡＡＴＫＩＩＮＥＶＳＫＰＬＡＨＨＩＰＶＥＫＩＣＥＫＬＫＫＫＤＳＱＩＣＥＬＫＹＤＫＱＩＤＬＳＴＶＤＬＫＫＬＲＶＫＥＬＫＫＩＬＤＤＷＧＥＴＣＫＧＣＡＥＫＳＤＹＩＲＫＩＮＥＬＭＰＫＹＡＰＫＡＡＳＡＲＴＤＬ（配列番号９）
ＬＲＰＧＤＣＥＶＣＩＳＹＬＧＲＦＹＱＤＬＫＤＲＤＶＴＦＳＰＡＴＩＥＮＥＬＩＫＦＣＲＥＡＲＧＫＥＮＲＬＣＹＹＩＧＡＴＤＤＡＡＴＫＩＩＮＥＶＳＫＰＬＡＨＨＩＰＶＥＫＩＣＥＫＬＫＫＫＤＳＱＩＣＥＬＫＹＤＫＱＩＤＬＳＴＶＤＬＫＫＬＲＶＫＥＬＫＫＩＬＤＤＷＧＥＴＣＫＧＣＡＥＫＳＤＹＩＲＫＩＮＥＬＭＰＫＹＡＰＫＡＡＳＡＲＴＤＬ（配列番号９）
【0097】
ヒトＮ－ＭＡＮＦ：
ＬＲＰＧＤＣＥＶＣＩＳＹＬＧＲＦＹＱＤＬＫＤＲＤＶＴＦＳＰＡＴＩＥＮＥＬＩＫＦＣＲＥＡＲＧＫＥＮＲＬＣＹＹＩＧＡＴＤＤＡＡＴＫＩＩＮＥＶＳＫＰＬＡＨＨＩＰＶＥＫＩＣＥＫＬＫＫＫＤＳＱＩＣＥＬ（配列番号１０）
ＬＲＰＧＤＣＥＶＣＩＳＹＬＧＲＦＹＱＤＬＫＤＲＤＶＴＦＳＰＡＴＩＥＮＥＬＩＫＦＣＲＥＡＲＧＫＥＮＲＬＣＹＹＩＧＡＴＤＤＡＡＴＫＩＩＮＥＶＳＫＰＬＡＨＨＩＰＶＥＫＩＣＥＫＬＫＫＫＤＳＱＩＣＥＬ（配列番号１０）
【0098】
ヒトＣ－ＭＡＮＦ：
ＫＹＤＫＱＩＤＬＳＴＶＤＬＫＫＬＲＶＫＥＬＫＫＩＬＤＤＷＧＥＴＣＫＧＣＡＥＫＳＤＹＩＲＫＩＮＥＬＭＰＫＹＡＰＫＡＡＳＡＲＴＤＬ（配列番号５）
ＫＹＤＫＱＩＤＬＳＴＶＤＬＫＫＬＲＶＫＥＬＫＫＩＬＤＤＷＧＥＴＣＫＧＣＡＥＫＳＤＹＩＲＫＩＮＥＬＭＰＫＹＡＰＫＡＡＳＡＲＴＤＬ（配列番号５）
【0099】
ドーパミンニューロンを用いた試験
ドーパミンニューロンを試験するため（非特許文献３１、非特許文献３２）、１３．５日齢のＮＭＲＩ系マウスの胚の腹側中脳から中脳底を切除した。組織を０．５％トリプシン（ＩＣＮバイオケミカル）を用いてインキュベートした後、大きな先端熱加工パスツールピペットを用いて機械的に解離した。ニューロンを、ポリ－Ｌ－オルニチン（シグマ））でコーティングされた９６ウェル培養プレート上で、Ｎ２サプリメント（インビトロジェン）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（インビトロジェン）を用い、ＧＤＮＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）の存在下又は非存在下で、又は種々の濃度のＣＤＮＦ、ＭＡＮＦ、Ｃ－ＣＤＮＦ、及びＣ－ＭＡＮＦポリペプチドと共に５日間成長させた。実験の開始時に、同量のニューロンを各ウェルにプレーティングした。神経栄養因子を添加しない培養物を、ネガティブコントロールとした。中脳培養物はいくつかのニューロン種を含むため、培養物を固定し、ドーパミン作動性ニューロンの特異的マーカーであるチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）（ミリポア）に対する抗体で免疫染色した。各ウェルの画像をＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ（商標）でスキャンし、免疫陽性ニューロンをＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒ及びＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒ解析ソフトウェアでカウントした。データを、ＧＤＮＦ保持ＴＨ陽性ニューロンに対する割合（％）として表す。全ての実験を、独立した培養で少なくとも３回繰り返した。結果を平均ＳＥＭで表し、有意性について一元配置分散分析及びＴｕｋｅｙの事後検定、又は２－両側Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定のいずれかによりテストした。帰無仮説はｐ≦０．０５で棄却した。
ドーパミンニューロンを試験するため（非特許文献３１、非特許文献３２）、１３．５日齢のＮＭＲＩ系マウスの胚の腹側中脳から中脳底を切除した。組織を０．５％トリプシン（ＩＣＮバイオケミカル）を用いてインキュベートした後、大きな先端熱加工パスツールピペットを用いて機械的に解離した。ニューロンを、ポリ－Ｌ－オルニチン（シグマ））でコーティングされた９６ウェル培養プレート上で、Ｎ２サプリメント（インビトロジェン）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（インビトロジェン）を用い、ＧＤＮＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）の存在下又は非存在下で、又は種々の濃度のＣＤＮＦ、ＭＡＮＦ、Ｃ－ＣＤＮＦ、及びＣ－ＭＡＮＦポリペプチドと共に５日間成長させた。実験の開始時に、同量のニューロンを各ウェルにプレーティングした。神経栄養因子を添加しない培養物を、ネガティブコントロールとした。中脳培養物はいくつかのニューロン種を含むため、培養物を固定し、ドーパミン作動性ニューロンの特異的マーカーであるチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）（ミリポア）に対する抗体で免疫染色した。各ウェルの画像をＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ（商標）でスキャンし、免疫陽性ニューロンをＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒ及びＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒ解析ソフトウェアでカウントした。データを、ＧＤＮＦ保持ＴＨ陽性ニューロンに対する割合（％）として表す。全ての実験を、独立した培養で少なくとも３回繰り返した。結果を平均ＳＥＭで表し、有意性について一元配置分散分析及びＴｕｋｅｙの事後検定、又は２－両側Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定のいずれかによりテストした。帰無仮説はｐ≦０．０５で棄却した。
【0100】
ＣＤＮＦ、Ｃ－ＣＤＮＦ、Ｃ－ＭＡＮＦのヨウ素化
ラクトペルオキシダーゼ法を用いて、ＣＤＮＦ、Ｃ－ＣＤＮＦ、及びＣ－ＭＡＮＦを１２５Ｉ－Ｎａでヨウ素化した。問題のタンパク質を３０μＬの０．２５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、１２５Ｉ－Ｎａ（１ｍＣｉ／２．８μＬ、１ｍＣｉ＝３７ｍＢｑ、ＧＥヘルスケア）と混合した。５０μｇ／ｍＬのラクトペルオキシダーゼ１０μＬと０．０５％Ｈ２Ｏ２とを加えることにより、反応を開始した。混合物を室温で２０分間インキュベートし、０．１Ｍ ＮａＩ、０．４Ｍ ＮａＣｌを含む３容量の０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を加えて反応を停止した後、２５μＬの２．５％ＢＳＡを加えた。Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５カラム（ＰＭ１０、ＧＥヘルスケア）でのゲルろ過により、遊離ヨウ素とヨウ素化タンパク質とを分離した。カラムの平衡と溶出には、１％ＢＳＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を使用した。場合によっては、ヨウ素化成長因子をＹＭ－１０ Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎカラム（ミリポア）を用いて濃縮した。１２５Ｉ標識ＣＤＮＦ、Ｃ－ＣＤＮＦ、Ｎ－ＣＤＮＦ、Ｃ-ＭＡＮＦ、及びＮ-ＭＡＮＦの比活性を、Ｗｉｚａｒｄ３ １４８０自動ガンマカウンター（パーキンエルマー、ウォラック）で測定したところ、約１０８ｃｐｍ／μｇタンパク質であった。標識タンパク質を４°Ｃに保ち、標識後３週間以内に使用した。
ラクトペルオキシダーゼ法を用いて、ＣＤＮＦ、Ｃ－ＣＤＮＦ、及びＣ－ＭＡＮＦを１２５Ｉ－Ｎａでヨウ素化した。問題のタンパク質を３０μＬの０．２５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、１２５Ｉ－Ｎａ（１ｍＣｉ／２．８μＬ、１ｍＣｉ＝３７ｍＢｑ、ＧＥヘルスケア）と混合した。５０μｇ／ｍＬのラクトペルオキシダーゼ１０μＬと０．０５％Ｈ２Ｏ２とを加えることにより、反応を開始した。混合物を室温で２０分間インキュベートし、０．１Ｍ ＮａＩ、０．４Ｍ ＮａＣｌを含む３容量の０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を加えて反応を停止した後、２５μＬの２．５％ＢＳＡを加えた。Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５カラム（ＰＭ１０、ＧＥヘルスケア）でのゲルろ過により、遊離ヨウ素とヨウ素化タンパク質とを分離した。カラムの平衡と溶出には、１％ＢＳＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を使用した。場合によっては、ヨウ素化成長因子をＹＭ－１０ Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎカラム（ミリポア）を用いて濃縮した。１２５Ｉ標識ＣＤＮＦ、Ｃ－ＣＤＮＦ、Ｎ－ＣＤＮＦ、Ｃ-ＭＡＮＦ、及びＮ-ＭＡＮＦの比活性を、Ｗｉｚａｒｄ３ １４８０自動ガンマカウンター（パーキンエルマー、ウォラック）で測定したところ、約１０８ｃｐｍ／μｇタンパク質であった。標識タンパク質を４°Ｃに保ち、標識後３週間以内に使用した。
【0101】
Ｅｌ３．５ドーパミン作動性ニューロンの内在化実験
２４ウェルプレート上で成長させたマウスの培養Ｅｌ３．５ドーパミンニューロンを、ウェルあたり３０，０００ｃｐｍのヨウ素化ＣＤＮＦ又はＣ－ＣＤＮＦと共に３７℃で２時間インキュベートした。細胞を氷に移し、０．５ｍＬの氷冷培地で１回洗浄した。次に、細胞をエッペンドルフチューブに移し、４℃で０．２Ｍ酢酸、０．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ２．８）で１回洗浄した。１０００ｇで１０分間遠心分離した後、細胞を０．５ｍＬの０．５Ｎ ＮａＯＨに溶解し、Ｗｉｚａｒｄ３ １４８０自動ガンマカウンター（パーキンエルマー、ウォラック）でカウントした。
２４ウェルプレート上で成長させたマウスの培養Ｅｌ３．５ドーパミンニューロンを、ウェルあたり３０，０００ｃｐｍのヨウ素化ＣＤＮＦ又はＣ－ＣＤＮＦと共に３７℃で２時間インキュベートした。細胞を氷に移し、０．５ｍＬの氷冷培地で１回洗浄した。次に、細胞をエッペンドルフチューブに移し、４℃で０．２Ｍ酢酸、０．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ２．８）で１回洗浄した。１０００ｇで１０分間遠心分離した後、細胞を０．５ｍＬの０．５Ｎ ＮａＯＨに溶解し、Ｗｉｚａｒｄ３ １４８０自動ガンマカウンター（パーキンエルマー、ウォラック）でカウントした。
【0102】
ラットの血液脳関門透過試験
１２５Ｉ-ＣＤＮＦ、１２５ＩＣ－ＣＤＮＦ、又は１２５ＩＣ－ＭＡＮＦ（全てのタンパク質について１０μＬ中１０６ｃｐｍ）を、成体雄ウィスターラットに皮下注射した。２時間後に動物にＰＢＳを灌流した。ガンマカウンターにより、種々の脳領域で放射能を分析した。データを平均±ＳＥＭで示す。群間の違いをＡＮＯＶＡで分析した後、Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ事後検定を行った。
１２５Ｉ-ＣＤＮＦ、１２５ＩＣ－ＣＤＮＦ、又は１２５ＩＣ－ＭＡＮＦ（全てのタンパク質について１０μＬ中１０６ｃｐｍ）を、成体雄ウィスターラットに皮下注射した。２時間後に動物にＰＢＳを灌流した。ガンマカウンターにより、種々の脳領域で放射能を分析した。データを平均±ＳＥＭで示す。群間の違いをＡＮＯＶＡで分析した後、Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ事後検定を行った。
【0103】
ＰＣ６．３細胞の内在化実験
ラットＰＣ６．３褐色細胞腫細胞を、２４ウェルプレート上で、１０％ＦＣＳ及び５％ウマ血清を含むＤＭＥＭ培養液で成長させた。細胞をＰＢＳで洗浄し、ウェルあたり３０，０００ｃｐｍのヨウ素化ＣＤＮＦ、Ｃ－ＣＤＮＦ、又はＣ－ＭＡＮＦと共に３７℃で９０分間インキュベートした。細胞を氷上に置き、０．５ｍＬの氷冷培地で１回洗浄した。次に、細胞をエッペンドルフチューブに移し、０．２Ｍ酢酸、０．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ２．８）で１回洗浄した。１０００ｇで１０分間遠心分離した後、細胞を０．５ｍＬの０．５Ｎ ＮａＯＨに溶解し、Ｗｉｚａｒｄ３ １４８０自動ガンマカウンター（パーキンエルマー、ウォラック）でカウントした。
ラットＰＣ６．３褐色細胞腫細胞を、２４ウェルプレート上で、１０％ＦＣＳ及び５％ウマ血清を含むＤＭＥＭ培養液で成長させた。細胞をＰＢＳで洗浄し、ウェルあたり３０，０００ｃｐｍのヨウ素化ＣＤＮＦ、Ｃ－ＣＤＮＦ、又はＣ－ＭＡＮＦと共に３７℃で９０分間インキュベートした。細胞を氷上に置き、０．５ｍＬの氷冷培地で１回洗浄した。次に、細胞をエッペンドルフチューブに移し、０．２Ｍ酢酸、０．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ２．８）で１回洗浄した。１０００ｇで１０分間遠心分離した後、細胞を０．５ｍＬの０．５Ｎ ＮａＯＨに溶解し、Ｗｉｚａｒｄ３ １４８０自動ガンマカウンター（パーキンエルマー、ウォラック）でカウントした。
【0104】
ＰＤのラット６－ＯＨＤＡモデルにおける神経修復試験
ＰＤの神経修復モデルでは、前述のようにラットを６－ＯＨＤＡで損傷させた（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献３３）。簡単に説明すれば、ラットに対し、イソフルラン麻酔下で、左線条体に３×２μｇの６－ＯＨＤＡを片側定位注射（１０°の角度）した（ブレグマ及び硬膜に対する座標Ａ／Ｐ ＋１．６；Ｌ／Ｍ －２．８；Ｄ／Ｖ －６、Ａ／Ｐ ０．０：Ｌ／Ｍ －４．１；Ｄ／Ｖ －５．５、及びＡ／Ｐ －１．２；Ｌ／Ｍ －４．５；Ｄ／Ｖ －５．５）。２週間後、アンフェタミン誘発回転の結果（損傷のサイズ）に基づいて、ラットを群分けした。その後、ＣＤＮＦ（１０μｇ）、Ｃ－ＣＤＮＦ（ＣＤＮＦ１０μｇと等モル）、及びＮ-ＣＤＮＦ（ＣＤＮＦ１０μｇと等モル）を、６－ＯＨＤＡと同じ座標を使用してラットに線条体内注射した。ラットを群分けした後の参照実験では、浸透圧ミニポンプを皮下に挿入し、カニューレを損傷線条体に入れた。ミニポンプによりＭＡＮＦ４（即ち、ＭＡＮＦペプチドＣＫＧＣ、特許文献４参照）、ＧＤＮＦ、又はビヒクル溶液を線条体へ２週間送達した後、ミニポンプとカニューレを取り除いた。ニューロン内部において、６－ＯＨＤＡは相乗的に作用する以下の２つの作用を有する：１）サイトゾルに蓄積し、酸化ストレスを引き起こすフリーラジカルを形成する、２）ミトコンドリア呼吸鎖複合体Ｉ及びＩＶの強力阻害剤である。ノルアドレナリン作動性ニューロンは、ＮＡＴ阻害剤デシプラミンを用いて（１５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与、６－ＯＨＤＡ注射の３０分前）、保護した。片側損傷のサイズ及び治療効果を、ＣＤＮＦ、Ｃ－ＣＤＮＦ、Ｎ－ＣＤＮＦ、及びＰＢＳ処理ラットを対象とした実験では損傷から２、４、６、及び８週間後に、ＭＡＮＦ４及びＧＤＮＦを対象とした参照実験では１、４、８、１０、及び１２週後に、アンフェタミン誘発回転行動で測定した。アンフェタミンに誘発される（２．５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）完全な（３６０°）同側及び反対側への回転数を、３０分間の馴化期間の後、１２０分間記録した。結果を損傷側への正味同側回転で表す。除外基準は、平均（正味回転数）±２×ＳＴＤＥＶとした。
ＰＤの神経修復モデルでは、前述のようにラットを６－ＯＨＤＡで損傷させた（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献３３）。簡単に説明すれば、ラットに対し、イソフルラン麻酔下で、左線条体に３×２μｇの６－ＯＨＤＡを片側定位注射（１０°の角度）した（ブレグマ及び硬膜に対する座標Ａ／Ｐ ＋１．６；Ｌ／Ｍ －２．８；Ｄ／Ｖ －６、Ａ／Ｐ ０．０：Ｌ／Ｍ －４．１；Ｄ／Ｖ －５．５、及びＡ／Ｐ －１．２；Ｌ／Ｍ －４．５；Ｄ／Ｖ －５．５）。２週間後、アンフェタミン誘発回転の結果（損傷のサイズ）に基づいて、ラットを群分けした。その後、ＣＤＮＦ（１０μｇ）、Ｃ－ＣＤＮＦ（ＣＤＮＦ１０μｇと等モル）、及びＮ-ＣＤＮＦ（ＣＤＮＦ１０μｇと等モル）を、６－ＯＨＤＡと同じ座標を使用してラットに線条体内注射した。ラットを群分けした後の参照実験では、浸透圧ミニポンプを皮下に挿入し、カニューレを損傷線条体に入れた。ミニポンプによりＭＡＮＦ４（即ち、ＭＡＮＦペプチドＣＫＧＣ、特許文献４参照）、ＧＤＮＦ、又はビヒクル溶液を線条体へ２週間送達した後、ミニポンプとカニューレを取り除いた。ニューロン内部において、６－ＯＨＤＡは相乗的に作用する以下の２つの作用を有する：１）サイトゾルに蓄積し、酸化ストレスを引き起こすフリーラジカルを形成する、２）ミトコンドリア呼吸鎖複合体Ｉ及びＩＶの強力阻害剤である。ノルアドレナリン作動性ニューロンは、ＮＡＴ阻害剤デシプラミンを用いて（１５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与、６－ＯＨＤＡ注射の３０分前）、保護した。片側損傷のサイズ及び治療効果を、ＣＤＮＦ、Ｃ－ＣＤＮＦ、Ｎ－ＣＤＮＦ、及びＰＢＳ処理ラットを対象とした実験では損傷から２、４、６、及び８週間後に、ＭＡＮＦ４及びＧＤＮＦを対象とした参照実験では１、４、８、１０、及び１２週後に、アンフェタミン誘発回転行動で測定した。アンフェタミンに誘発される（２．５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）完全な（３６０°）同側及び反対側への回転数を、３０分間の馴化期間の後、１２０分間記録した。結果を損傷側への正味同側回転で表す。除外基準は、平均（正味回転数）±２×ＳＴＤＥＶとした。
【0105】
チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）－免疫組織化学
灌流及び組織処理。神経修復試験の直後、ペントバルビタールナトリウムの過剰投与（９０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与、オリオンファーマ）によりラットに麻酔をかけ、ＰＢＳで、続いて０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中の４％パラホルムアルデヒドで心内灌流した。脳を摘出し、後固定を４時間行い、２０％スクロースを含むリン酸ナトリウム緩衝液に４℃で保存した。厚さ４０μｍの連続冠状凍結切片をスライド式ミクロトームで切り出した。他に記載されているように（非特許文献４）、免疫組織化学を行った。灌流した脳を、４℃で一晩、パラホルムアルデヒド中で後固定し、２０％スクロース中で保存した。脳を、６つの連続した厚さ４０μｍの切片にカットした。浮動性切片をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、内因性ペルオキシダーゼ活性を０．３％過酸化水素（シグマアルドリッチ）でクエンチした。抗体の非特異的結合をブロックするために、切片をブロッキング緩衝液（１×ＰＢＳ中の４％ウシ血清アルブミン及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）で１時間インキュベートした。切片を、４°Ｃで、ブロッキング緩衝液中のマウスモノクローナル抗チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）抗体（１：２，０００、カタログ番号ＭＡＢ３１８、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２２０１５２８、ミリポア、ビレリカ、マサチューセッツ州）で一晩インキュベートした後、ビオチン化二次抗体（１：２００、抗ラット又は抗マウス、ベクター、バーリンゲーム、カリフォルニア州）でインキュベートした。アビジン－ビオチン－酵素複合体（ＡＢＣキット、ベクター）で染色を増強し、色素原としての３’，３’－ジアミノベンジジンを用いてシグナルを可視化した。
灌流及び組織処理。神経修復試験の直後、ペントバルビタールナトリウムの過剰投与（９０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与、オリオンファーマ）によりラットに麻酔をかけ、ＰＢＳで、続いて０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中の４％パラホルムアルデヒドで心内灌流した。脳を摘出し、後固定を４時間行い、２０％スクロースを含むリン酸ナトリウム緩衝液に４℃で保存した。厚さ４０μｍの連続冠状凍結切片をスライド式ミクロトームで切り出した。他に記載されているように（非特許文献４）、免疫組織化学を行った。灌流した脳を、４℃で一晩、パラホルムアルデヒド中で後固定し、２０％スクロース中で保存した。脳を、６つの連続した厚さ４０μｍの切片にカットした。浮動性切片をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、内因性ペルオキシダーゼ活性を０．３％過酸化水素（シグマアルドリッチ）でクエンチした。抗体の非特異的結合をブロックするために、切片をブロッキング緩衝液（１×ＰＢＳ中の４％ウシ血清アルブミン及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）で１時間インキュベートした。切片を、４°Ｃで、ブロッキング緩衝液中のマウスモノクローナル抗チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）抗体（１：２，０００、カタログ番号ＭＡＢ３１８、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２２０１５２８、ミリポア、ビレリカ、マサチューセッツ州）で一晩インキュベートした後、ビオチン化二次抗体（１：２００、抗ラット又は抗マウス、ベクター、バーリンゲーム、カリフォルニア州）でインキュベートした。アビジン－ビオチン－酵素複合体（ＡＢＣキット、ベクター）で染色を増強し、色素原としての３’，３’－ジアミノベンジジンを用いてシグナルを可視化した。
【0106】
黒質からのＴＨ陽性細胞数
黒質緻密部（ＳＮｐｃ）のＴＨ陽性細胞について、ブレグマに対しておよそＡ／Ｐ －４．５～－６．０のＳＮｐｃにまたがる６つの切片から分析した。３ＤＨｉｓｔｅｃｈスキャナーで得られた画像から、Ｍａｔｌａｂ（ＲＲＩＤ：ｎｌｘ＿１５３８９０、マスワークス、ネイティック、マサチューセッツ州）アルゴリズムを用いて細胞をカウントした。スキャナーの解像度は、×２０ＮＡ０．８対物で０．２４μｍ／ピクセルとした。
黒質緻密部（ＳＮｐｃ）のＴＨ陽性細胞について、ブレグマに対しておよそＡ／Ｐ －４．５～－６．０のＳＮｐｃにまたがる６つの切片から分析した。３ＤＨｉｓｔｅｃｈスキャナーで得られた画像から、Ｍａｔｌａｂ（ＲＲＩＤ：ｎｌｘ＿１５３８９０、マスワークス、ネイティック、マサチューセッツ州）アルゴリズムを用いて細胞をカウントした。スキャナーの解像度は、×２０ＮＡ０．８対物で０．２４μｍ／ピクセルとした。
【0107】
線条体のＴＨ陽性神経突起の吸光度分析
線条体のＴＨ陽性神経突起の吸光度は、各ラットのブレグマに対しておよそＡ／Ｐ ＋２．２、＋０．８４、及び－０．１２の３つの線条体切片で測定した。バックグラウンドシグナルを減らすために、切片を自動スキャナー（３ＤＨｉｓｔｅｃｈ、ブダペスト、ハンガリー；ヘルシンキ大学バイオテクノロジー研究所が提供するスキャンサービス）でスキャンし、画像を１６ビットグレースケールに変換した。脳梁にはＴＨシグナルがないため、それを非特異的バックグラウンド染色の尺度として用いた。得られた画像から、面積当たりの総密度（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｄｅｎｓｉｔｉｅｓ）をＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）で分析した。データを、健側に対する割合（％）で表す。
線条体のＴＨ陽性神経突起の吸光度は、各ラットのブレグマに対しておよそＡ／Ｐ ＋２．２、＋０．８４、及び－０．１２の３つの線条体切片で測定した。バックグラウンドシグナルを減らすために、切片を自動スキャナー（３ＤＨｉｓｔｅｃｈ、ブダペスト、ハンガリー；ヘルシンキ大学バイオテクノロジー研究所が提供するスキャンサービス）でスキャンし、画像を１６ビットグレースケールに変換した。脳梁にはＴＨシグナルがないため、それを非特異的バックグラウンド染色の尺度として用いた。得られた画像から、面積当たりの総密度（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｄｅｎｓｉｔｉｅｓ）をＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）で分析した。データを、健側に対する割合（％）で表す。
【0108】
ベータ細胞増殖アッセイ
８週齢の雌の処女Ｃ５７ｂｌ６Ｒｃｃマウスから膵島を単離した。膵島を成長培地中で一晩回復させ、翌日、同数の膵島／ウェル（７０／ウェル）を胎盤性ラクトゲン（ＰＬ ５００ｎｇ／ｍＬ）、Ｃ－ＭＡＮＦ、又はＭＡＮＦで５日間処理した。培地の半分を、成長因子を含む新鮮な培地に毎日交換した。ＢｒｄＵに代わるヌクレオシド類似体Ｅｄｕ（Ｃｌｉｃｋ－ｉＴ（登録商標）Ｅｄｕ増殖キット、インビトロジェン）を、膵島採取の４８時間前に添加した。膵島をトリプシンで破壊し、細胞遠心分離機のスライドガラス上に遠心分離した。サイトスピン及び増殖細胞をＣｌｉｃｋ－ｉＴ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒアジド発色試薬で染色した後、固定し、４℃で一晩インスリン染色（モルモット１：２００、アブカム、ケンブリッジ、英国）してベータ細胞を検出した。細胞を洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（１：４００、モレキュラープローブス、ライフテクノロジーズ、カリフォルニア州、米国）と結合した二次抗体で染色した。スライドを、ＤＡＰＩ（ベクターラボラトリーズ、バーリンゲーム、カリフォルニア州、米国）を含むベクタシールドマウンティング媒体（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）でマウントした。１２個の画像（倍率１０倍）を、４０×／Ｐｌａｎ－Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ／０．９５ Ｃｏｒｒ Ｍ２７、及び６３×／Ｐｌａｎ－Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ／１．４０ Ｏｉｌ／Ｍ２７、及び４８３ ＡｘｉｏＣａｍ ＨＲｍカメラを装備した蛍光Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＩｍａｇｅｒ Ｍ２ ４８２落射蛍光顕微鏡で、ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ４ソフトウェアを用いて取得し、Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓソフトウェア（メディアサイバネティクス、ベセスダ、メリーランド州、米国）により分析し、ＤＡＰＩ陽性核の数を定量した。増殖中のベータ細胞の相対数を定量し、３～５反復／処理のウェルと比較した。
８週齢の雌の処女Ｃ５７ｂｌ６Ｒｃｃマウスから膵島を単離した。膵島を成長培地中で一晩回復させ、翌日、同数の膵島／ウェル（７０／ウェル）を胎盤性ラクトゲン（ＰＬ ５００ｎｇ／ｍＬ）、Ｃ－ＭＡＮＦ、又はＭＡＮＦで５日間処理した。培地の半分を、成長因子を含む新鮮な培地に毎日交換した。ＢｒｄＵに代わるヌクレオシド類似体Ｅｄｕ（Ｃｌｉｃｋ－ｉＴ（登録商標）Ｅｄｕ増殖キット、インビトロジェン）を、膵島採取の４８時間前に添加した。膵島をトリプシンで破壊し、細胞遠心分離機のスライドガラス上に遠心分離した。サイトスピン及び増殖細胞をＣｌｉｃｋ－ｉＴ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒアジド発色試薬で染色した後、固定し、４℃で一晩インスリン染色（モルモット１：２００、アブカム、ケンブリッジ、英国）してベータ細胞を検出した。細胞を洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（１：４００、モレキュラープローブス、ライフテクノロジーズ、カリフォルニア州、米国）と結合した二次抗体で染色した。スライドを、ＤＡＰＩ（ベクターラボラトリーズ、バーリンゲーム、カリフォルニア州、米国）を含むベクタシールドマウンティング媒体（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）でマウントした。１２個の画像（倍率１０倍）を、４０×／Ｐｌａｎ－Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ／０．９５ Ｃｏｒｒ Ｍ２７、及び６３×／Ｐｌａｎ－Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ／１．４０ Ｏｉｌ／Ｍ２７、及び４８３ ＡｘｉｏＣａｍ ＨＲｍカメラを装備した蛍光Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＩｍａｇｅｒ Ｍ２ ４８２落射蛍光顕微鏡で、ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ４ソフトウェアを用いて取得し、Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓソフトウェア（メディアサイバネティクス、ベセスダ、メリーランド州、米国）により分析し、ＤＡＰＩ陽性核の数を定量した。増殖中のベータ細胞の相対数を定量し、３～５反復／処理のウェルと比較した。
【0109】
ＡＬＳのマウスモデル
トランスジェニックＳＯＤ１ Ｇ９３Ａマウスを、この試験におけるＡＬＳのトランスジェニックマウスモデルとした。種々のヒトＳＯＤ１変異を含むトランスジェニックマウスは、進行性の神経変性及び運動ニューロン（ＭＮ）死を発症し、前臨床試験で一般的に使用され、ＦＡＬＳの病因の理解に大きく貢献している動物モデルを提供する（非特許文献３４）。トランスジェニックＳＯＤ１マウスは、常染色体優性様式で伝染するＡＬＳ様の臨床的特徴を示す。これらのマウスでは、後肢の脱力と振戦様運動が初期症状として８～１０週齢で現れ、その後、進行性の運動麻痺及び神経原性筋萎縮等の主要な症状が現れる（非特許文献３５）。これらのマウスは、その後、歩行、飲食の障害を示し、数週間以内に、通常１４～１６週齢で死亡する。グリシン９３をアラニンに変異させたヒトＳＯＤ１を保有するトランスジェニックマウスは、元々Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊａｘ．ｏｒｇ、バーハーバー、メイン州、系統Ｂ６ＳＪＬ－ＴｇＮ（ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ）から入手した。トランスジェニック発現は、ＤＮＡテールテスト及びＰＣＲで、他者が以前行った特定のオリゴヌクレオチド及び条件を用いて（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂのホームページ参照）、分析した。全ての実験において、野生型Ｂ６ＳＪＬ－ＴｇＮ（ＳＯＤ１）２Ｇｕｒをコントロールとして含めた。
トランスジェニックＳＯＤ１ Ｇ９３Ａマウスを、この試験におけるＡＬＳのトランスジェニックマウスモデルとした。種々のヒトＳＯＤ１変異を含むトランスジェニックマウスは、進行性の神経変性及び運動ニューロン（ＭＮ）死を発症し、前臨床試験で一般的に使用され、ＦＡＬＳの病因の理解に大きく貢献している動物モデルを提供する（非特許文献３４）。トランスジェニックＳＯＤ１マウスは、常染色体優性様式で伝染するＡＬＳ様の臨床的特徴を示す。これらのマウスでは、後肢の脱力と振戦様運動が初期症状として８～１０週齢で現れ、その後、進行性の運動麻痺及び神経原性筋萎縮等の主要な症状が現れる（非特許文献３５）。これらのマウスは、その後、歩行、飲食の障害を示し、数週間以内に、通常１４～１６週齢で死亡する。グリシン９３をアラニンに変異させたヒトＳＯＤ１を保有するトランスジェニックマウスは、元々Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊａｘ．ｏｒｇ、バーハーバー、メイン州、系統Ｂ６ＳＪＬ－ＴｇＮ（ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ）から入手した。トランスジェニック発現は、ＤＮＡテールテスト及びＰＣＲで、他者が以前行った特定のオリゴヌクレオチド及び条件を用いて（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂのホームページ参照）、分析した。全ての実験において、野生型Ｂ６ＳＪＬ－ＴｇＮ（ＳＯＤ１）２Ｇｕｒをコントロールとして含めた。
【0110】
ＡＬＳマウスの実験設定（セットアップ）
単回投与実験において、約１３週齢のマウスに、イソフルラン麻酔下でＰＢＳ又はＣ－ＣＤＮＦ（ＰＢＳで希釈した、完全長ＣＤＮＦ１０μｇと等モルである３．７５μｇ）を脳室内に単回注射した。その後、病気の徴候及び体重変化について、マウスを週２回評価した。評価は、マウスの運動活動を評価するように考案された、ロータロッド等のテストを含む一連の行動テストにより完了した。
単回投与実験において、約１３週齢のマウスに、イソフルラン麻酔下でＰＢＳ又はＣ－ＣＤＮＦ（ＰＢＳで希釈した、完全長ＣＤＮＦ１０μｇと等モルである３．７５μｇ）を脳室内に単回注射した。その後、病気の徴候及び体重変化について、マウスを週２回評価した。評価は、マウスの運動活動を評価するように考案された、ロータロッド等のテストを含む一連の行動テストにより完了した。
【0111】
長期注入実験において、１２週齢のＳＯＤ１マウスに、イソフルラン麻酔下で脳注入カニューレ（カテーテルチューブを介してＡｌｚｅｔ浸透圧ミニポンプに接続）を右側脳室に挿入した。Ｃ－ＣＤＮＦ（１．５μｇ／２４ｈ）を２８日間注入した。運動行動をロータロッドで評価した。マウスの臨床徴候及び体重変化を評価した。
【0112】
ＡＬＳマウスの臨床スコアリング
ジャクソン研究所からの説明書を用いてＳＯＤ１マウスの臨床スコアリングを行った。マウスを、１２週齢になった後、週に２回注意深く検査した。動物を尾の付け根でそっと持ち上げ、震え、こわばり、手足を伸ばす能力を観察することにより、採点した。臨床スコアリングは、ＡＬＳＴＤＩ（ＡＬＳセラピー開発研究所）の後肢神経スコアリングシステムに基づいた１～５段階である。
ジャクソン研究所からの説明書を用いてＳＯＤ１マウスの臨床スコアリングを行った。マウスを、１２週齢になった後、週に２回注意深く検査した。動物を尾の付け根でそっと持ち上げ、震え、こわばり、手足を伸ばす能力を観察することにより、採点した。臨床スコアリングは、ＡＬＳＴＤＩ（ＡＬＳセラピー開発研究所）の後肢神経スコアリングシステムに基づいた１～５段階である。
【0113】
ロータロッド
ロータロッドでは、マウスを回転ロッド（加速度４～４０ｒｐｍ／分）に置いた（ウゴバジレ、イタリア）。カットオフ時間を４分とした。ロータロッド試験は、マウスが１２週齢になった後、週に２回行った。
ロータロッドでは、マウスを回転ロッド（加速度４～４０ｒｐｍ／分）に置いた（ウゴバジレ、イタリア）。カットオフ時間を４分とした。ロータロッド試験は、マウスが１２週齢になった後、週に２回行った。
【0114】
脳卒中のモデルとしての中大脳動脈の遠位閉塞
オスのＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（体重２３０～２７０ｇ、エンヴィーゴ、オランダ）を実験に用いた。当該実験は、実験動物の管理と使用に関するＥＵ指令２０１０／６３／ＥＵの３Ｒ原則（現地の法律及び規制）に従って実施し、フィンランド国立動物実験委員会により承認された。全ての実験を盲検法で行い、ラットを異なる治療群にランダムに割り当てた。ラットに抱水クロラール（０．４ｇ／ｋｇ、腹腔内投与）で麻酔をかけた。皮質脳卒中を、上述ように（非特許文献３６）、遠位中大脳動脈（ｄＭＣＡ）を両側総頸動脈（ＣＣＡ）閉塞とともに６０分間閉塞することにより誘発した。簡単に説明すれば、両側ＣＣＡを特定し、腹側正中頸部切開により単離した。ラットを定位固定装置に入れ、開頭術を右半球で行った。右（ＭＣＡ）を１０－０縫合糸で結紮し、両側総頸動脈（ＣＣＡ）を非外傷性動脈クランプで６０分間結紮した。虚血の６０分後、ＭＣＡの周囲の縫合糸及びＣＣＡの動脈クリップを取り外して、再灌流障害を誘導した。麻酔から回復後、ラットをホームケージに戻した。手術中及び手術後の体温を３７℃に維持した。
オスのＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（体重２３０～２７０ｇ、エンヴィーゴ、オランダ）を実験に用いた。当該実験は、実験動物の管理と使用に関するＥＵ指令２０１０／６３／ＥＵの３Ｒ原則（現地の法律及び規制）に従って実施し、フィンランド国立動物実験委員会により承認された。全ての実験を盲検法で行い、ラットを異なる治療群にランダムに割り当てた。ラットに抱水クロラール（０．４ｇ／ｋｇ、腹腔内投与）で麻酔をかけた。皮質脳卒中を、上述ように（非特許文献３６）、遠位中大脳動脈（ｄＭＣＡ）を両側総頸動脈（ＣＣＡ）閉塞とともに６０分間閉塞することにより誘発した。簡単に説明すれば、両側ＣＣＡを特定し、腹側正中頸部切開により単離した。ラットを定位固定装置に入れ、開頭術を右半球で行った。右（ＭＣＡ）を１０－０縫合糸で結紮し、両側総頸動脈（ＣＣＡ）を非外傷性動脈クランプで６０分間結紮した。虚血の６０分後、ＭＣＡの周囲の縫合糸及びＣＣＡの動脈クリップを取り外して、再灌流障害を誘導した。麻酔から回復後、ラットをホームケージに戻した。手術中及び手術後の体温を３７℃に維持した。
【0115】
皮下Ｃ－ＣＤＮＦの神経保護効果を試験するために、５０μｇのＣ－ＣＤＮＦを、ｄＭＣＡ閉塞の３０～５０分前及び再灌流直後に、１００μＬの容量で皮下投与した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）をビヒクルコントロールとして使用した。ｄＭＣＡｏの２日後にラットを安楽死させ、２％塩化２，３，５－トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ、シグマアルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州）染色により梗塞体積を測定した。ラットを断頭し、脳を摘出し、アクリル製ラット脳ブロックを用いて厚さ２．０ｍｍの切片にスライスした。脳スライスを２％ＴＴＣ溶液（シグマ、セントルイス、ミズーリ州、米国）中で室温にて１５分間インキュベートした後、固定のため４％パラホルムアルデヒド溶液に移した。各スライスの梗塞領域をデジタルスキャナー及びＩｍａｇｅＪソフトウェアで測定した。各動物の梗塞体積を、検査した吻側脳スライスの平均スライス厚（２ｍｍ）と梗塞面積の合計との積から得た。統計分析にはＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用した。
【0116】
健常動物における皮下注射したＣ－ＣＤＮＦの効果
野生型マウスに、３週間、週に２回Ｃ－ＣＤＮＦ（０．１７ｍｇ／ｋｇ、１．７７又は１７．７ｍｇ／ｋｇ）を注射した。マウスの自発運動を、Ｃ－ＣＤＮＦ皮下注射の直後に週に１回、オープンフィールド試験で６０分間測定した。Ｃ－ＣＤＮＦ皮下注射を繰り返しても体重の変化は見られなかった。コントロール群とＣ－ＣＤＮＦの投与を受けた群との間で、行動パターンの統計的差異は検出されなかった。結果を図１５に示す。
野生型マウスに、３週間、週に２回Ｃ－ＣＤＮＦ（０．１７ｍｇ／ｋｇ、１．７７又は１７．７ｍｇ／ｋｇ）を注射した。マウスの自発運動を、Ｃ－ＣＤＮＦ皮下注射の直後に週に１回、オープンフィールド試験で６０分間測定した。Ｃ－ＣＤＮＦ皮下注射を繰り返しても体重の変化は見られなかった。コントロール群とＣ－ＣＤＮＦの投与を受けた群との間で、行動パターンの統計的差異は検出されなかった。結果を図１５に示す。
【0117】
ハンチントン病ラットモデルにおけるＣ－ＣＤＮＦの効果
成体ウィスターラットに、座標：Ａ／Ｐ ＋０．７；Ｌ／Ｍ ＋２．８；Ｄ／Ｖ －６．０へのキノリン酸（ＱＡ）２２５ｎｍｏｌの片側線条体内注射を単回投与した。キノリン酸は、興奮毒性プロセスにより線条体ニューロンの死を誘導する毒素である。２週間後、ラットに対し、同じ座標へＰＢＳ、ＣＤＮＦ（１０マイクログラム）、Ｃ－ＣＤＮＦ（等モル量のＣＤＮＦに相当する量）の線条体内注射を単回投与した。処理を開始する前に、ラットを群にランダムに分けた。ロータロッド及び握力テストを毎週行った。
成体ウィスターラットに、座標：Ａ／Ｐ ＋０．７；Ｌ／Ｍ ＋２．８；Ｄ／Ｖ －６．０へのキノリン酸（ＱＡ）２２５ｎｍｏｌの片側線条体内注射を単回投与した。キノリン酸は、興奮毒性プロセスにより線条体ニューロンの死を誘導する毒素である。２週間後、ラットに対し、同じ座標へＰＢＳ、ＣＤＮＦ（１０マイクログラム）、Ｃ－ＣＤＮＦ（等モル量のＣＤＮＦに相当する量）の線条体内注射を単回投与した。処理を開始する前に、ラットを群にランダムに分けた。ロータロッド及び握力テストを毎週行った。
【0118】
キノリン酸損傷後、ロータロッド試験及び握力試験において、Ｃ－ＣＤＮＦのみが、ＣＤＮＦとは異なり、統計的に有意に運動行動を改善し、Ｃ－ＣＤＮＦは３週間及び５週間の時点で能力を大幅に改善した。結果を図１６に示す。
【0119】
参照文献
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国際公開第２００７／０６８８０３号
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
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【図14】
【図15】
【図16】
【配列表】