特許7385221IP Force 特許公報全文掲載

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医療用医薬品の分野に係る蛋白質に関する。詳細には、血液凝固に関与するフォンビルブランド因子（von Willebrand Factor：以下、「vWF」と称することがある）の特異的切断酵素（以下、「ADAMTS13」と称する）の全長もしくは部分断片の臨床分野での新規な用途に関する。具体的には、本発明は、肝障害、肝虚血/再灌流障害および肝移植の分野でのADAMTS13の全長もしくは部分断片の新規な用途

発明が解決しようとする課題[発明の詳細な説明]から抜粋

肝臓は、人体の重要な機能を司る極めて重要な臓器であり、その障害である急性・慢性肝障害、肝虚血再灌流障害、肝移植の肝機能障害および急性肝不全／劇症肝炎の有効な治療薬や診断薬が依然として切望されている。

課題を解決するための手段[発明の詳細な説明]から抜粋

肝切除や肝移植を含めた肝臓外科において、その術式を規定する最大の因子は、腫瘍側因子を除けば（残）肝機能、肝予備能であるが、現代医療における肝機能とは、肝細胞機能に他ならない。肝臓は、実質細胞（肝細胞：約60%）と非実質細胞（肝臓の類洞壁を構成する肝類洞壁細胞；肝細胞以外の血管内皮細胞、Kupffer細胞、星細胞など：約40%）に分けられるが、これまで、これら肝非実質細胞機能が、肝臓外科のみな・・・　続きを知財ポータルサイト IP Force にログインして見る

発明の効果[発明の詳細な説明]から抜粋

本発明は、ADAMTS13の全長もしくは部分断片の臨床分野での新規な用途に関するものであり、本発明に従ってADAMTS13を使用することにより、急性・慢性肝障害を迅速かつ正確に診断することが可能となり、肝障害、肝虚血/再灌流障害、肝移植後の肝機能障害および急性肝不全／劇症肝炎の有効な治療薬を提供することができる。

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この特許公報に記載されている図面[図面の簡単な説明]から抜粋

【図1】 肝細胞機能から予備能は十分高いと予想されながら、非実質細胞機能の極度の低下から肝切術後に肝不全に陥る病態も存在する。一例として図１に肝移植における冷保存/温再灌流障害を示す。冷保存6, 24時間の２群間で、血流再開後の肝逸脱酵素（＝肝細胞障害）に有意差はなかったが、ADAMTS13活性は非常に鋭敏にグラフト肝の冷保存時間に逆相関していた。これは、冷虚血再灌流は肝細胞より類洞壁細胞でより障害が強いことの査証である。
【図2】 図２は、大腸がん化学療法後の肝障害の本態が肝非実質細胞障害であることを示す図である。肝細胞障害（AST/ALTなど）も軽微で、蛋白合成能、凝固能といった肝細胞機能は正常範囲内だったが、そのADAMTS13活性はなんと正常肝の12%まで低下していた。これが現代医療ではほとんど評価されることのない肝非実質細胞障害であり、大腸癌の転移性肝腫瘍に対する肝切除後に肝機能不全を来す主因の一つである。NC:正常肝；A24:モノクロタリン投与24時間後；A48:モノクロタリン投与48時間後；T24:モノクロタリン+治療薬投与24時間後；T48:モノクロタリン+治療薬投与48時間後
【図3】 図３は、血中ADAMTS13活性が肝不全の程度（MELD: Model for End-stage Liver Disease, Child-Pugh: チャイルド分類）と逆相関する臨床データを示す図である。
【図4】 図４は、生体肝移植後早期にADAMTS13活性が著減することを示す図である。
【図5】 図５は、肝移植後のADAMTS13活性を小児と成人とで比較したデータを示す図である。
【図6】 図６は、成人例の検討でも、相対的過小グラフトではADAMTS13活性の回復がさらに遅延することを示す図である。
【図7】 図７は、肝移植後早期には、vWF活性の著増とADAMTS13活性の著減が併存することを示す図である。
【図8】 図８は、肝移植後にvWF/ADAMTS13不均衡が存在することを示す図である。
【図9】 図９は、肝虚血/再灌流障害におけるADAMTS13の役割を調べるための実験手順を示す模式図である。
【図10】 図１０Ａは、肝虚血再灌流により、vWF活性の著増とADAMTS13活性の著減が併存することを示す定量的RT-PCRの結果を示す図である。図１０Ｂは、70％部分肝虚血再灌流により、血中ADAMTS13活性値は30％前後まで低下し、24時間後においても回復してこないことを示す図である。
【図11】 図１１は、実験４群における再灌流後の血漿ADAMTS13活性（Ａ）およびIRI後の末梢血中の血小板数（Ｂ）を示す図である。末梢血血小板数は、血漿ADAMTS13活性値に比例する（血中ADAMTS13活性が高いほど、末梢血血小板数は維持される）ことが証明された。
【図12】 図１２は、肝虚血再灌流後の肝組織に対するCD42B蛍光免疫染色を示す写真である（肝組織中の血小板が赤色に蛍光濃染されている）。ADAMTS13ノックアウトマウスでは、野生型に比して肝内に多量の血小板凝集を起こしているが、組換えADAMTS13を投与することによって、ノックアウトマウスでも野生型でも肝内の血小板凝集が顕著に改善することが示されている。
【図13】 図１３左は、画像解析ソフト（Image-J, NIH, 米国）を用いて、図１２の血小板蛍光免染を定量化したものであり、ノックアウトマウスおよび野生型マウスでの多量の血小板凝縮が組換えADAMTS13を投与することによって顕著に改善することを示す図である。図１３右は、Laser Doppler Flowmeter (O2C, LEA社、ドイツ)にて計測した肝組織血流（微小循環）の計測結果を示す図である。肝組織への血小板血栓の形成に逆相関して、肝組織血流（微小循環）が改善している。
【図14】 図１４は、IRI後のトランスアミナーゼ放出（ＡおよびＢ）およびLDH放出（Ｃ）を示す図である。ADAMTS13ノックアウトマウスでは、野生型に比して肝障害が増悪しているが、組換えADAMTS13を投与することによって、ノックアウトマウスでも野生型でも肝障害が有意に改善することが示された。
【図15】 図１５は、肝虚血再灌流後の肝組織像を示す写真である。ノックアウトマウスおよび野生型マウスでの組織損傷が、共に組換えADAMTS13によって改善されている。
【図16】 図１６は、ノックアウトマウスおよび野生型マウスでの組織損傷が組換えADAMTS13によって改善されることを示す図である。
【図17】 図１７は、ADAMTS13がIRI後の炎症性サイトカイン発現（TNFα, IL-1β, IL-6, IL-10）、ケモカイン発現（CXCL-2, -10）を抑制することを示す図である。
【図18】 図１８は、ノックアウトマウスおよび野生型マウスでのマクロファージ（単核球）の浸潤が組換えADAMTS13によって改善されることを免疫組織学的に示す写真および図である。
【図19】 図１９は、ノックアウトマウスおよび野生型マウスでの好中球の浸潤が組換えADAMTS13によって改善されることを免疫組織学的に示す写真および図である。
【図20】 図２０は、ノックアウトマウスおよび野生型マウスでのアポトーシスによる細胞死が組換えADAMTS13によって減少することを免疫組織学的に示す写真および図である。
【図21】 図２１は、ラットにおける20%部分肝移植モデルの術中写真である。
【図22】 図２２は、20%部分肝移植モデルに組換えADAMTS13（W688X）を投与後のADAMTS13活性を示す図である。
【図23】 図２３は、20%部分肝移植後のLDH放出（Ａ）および血小板減少症（Ｂ）を示す図である。ADAMTS13投与群で、両者共に改善されている。
【図24】 図２４は、20%部分肝移植後のCD42B蛍光免疫染色を示す写真および図である（肝組織中の血小板が赤色に蛍光濃染されている）。20%部分肝移植モデルに組換えADAMTS13を投与することによって、移植肝内への血小板凝集が著減されている。
【図25】 図２５は、20%部分肝移植後のトランスアミナーゼ放出を示す図である。組換えADAMTS13の投与により、肝障害が有意に抑制されている。
【図26】 図２６は、20%部分肝移植モデルに組換えADAMTS13を投与することによって、病理学的にも移植肝の健常性が維持されたことを示す写真および図である。
【図27】 図２７は、血小板凝集を引き起こすvWFの移植肝 免疫組織染色を示す写真および図である。移植後の肝組織では、（本来は発現のない）vWFが類洞に過剰発現していること、また、20%部分肝移植モデルに組換えADAMTS13を投与することによって、血小板凝集の核となるvWFの発現が著減されたことが示されている。
【図28】 図２８は、20%部分肝移植モデルに組換えADAMTS13を投与することによって、サイトカイン（IL-1β, IL-6, TNFα）や血管収縮物質 (Endothelin-1) が著減されたことを示す図である。

代表図 図1本件の代表的な図

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