特許 7385263 メモリー様ＮＫ細胞の大規模治療的製造方法および組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-11-14

(45)【発行日】2023-11-22

(54)【発明の名称】メモリー様ＮＫ細胞の大規模治療的製造方法および組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0783 20100101AFI20231115BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20231115BHJP

【ＦＩ】

C12N5/0783

C12N15/62 Z

【請求項の数】 10

(21)【出願番号】P 2019523674

(86)(22)【出願日】2017-11-08

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2019-11-21

(86)【国際出願番号】 US2017060614

(87)【国際公開番号】W WO2018089476

(87)【国際公開日】2018-05-17

【審査請求日】2020-11-05

【審判番号】

【審判請求日】2022-11-11

(31)【優先権主張番号】15/345,965

(32)【優先日】2016-11-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】510170730

【氏名又は名称】ユニバーシティ オブ セントラル フロリダ リサーチ ファウンデーション，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(72)【発明者】

【氏名】コピク，アリシャ ジェイ．

(72)【発明者】

【氏名】イガラシ，ロバート ワイ．

(72)【発明者】

【氏名】オイヤー，ジェレミア エル．

(72)【発明者】

【氏名】アルトメア，デボラ

【合議体】

【審判長】福井 悟

【審判官】藤井 美穂

【審判官】高堀 栄二

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１６／０６９６０７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃａ， ２０１４， Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ２０５７９６ （ｐｐ．１－１８）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

C12N1/00-7/08

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０／ＪＭＥＤＰｌｕｓ（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ）少なくとも１つのＮＫ細胞をＩＬ－１２、ＩＬ－１５およびＩＬ－１８と６時間接触させることによってＮＫ細胞を予備活性化するステップと、
ｂ）ステップａ）の予備活性化ＮＫ細胞を、膜結合型ＩＬ－２１を発現するフィーダー細胞から調製した形質膜（ＰＭ）粒子（ＰＭ２１粒子）と接触させることにより増殖させて、増殖されたメモリー様ＮＫ細胞を得るステップと、
ｃ）前記増殖されたメモリー様ＮＫ細胞を１、２、３、４または５日間休止させるステップと、
を含む、メモリー様ＮＫ細胞の数を増加させるためのインビトロまたはエキソビボの方法。

【請求項2】

前記ＮＫ細胞が末梢血単核球の非選択集団から得られる、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ＰＭ２１粒子が４－１ＢＢＬをさらに含むものである、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記膜結合型ＩＬ－２１が膜挿入ペプチドと連結されており、前記膜挿入ペプチドがヒトＦｃ、ＧＰＩ、膜貫通Ｔ細胞受容体またはｐＨＬＩＰを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記膜結合型ＩＬ－２１が前記膜挿入ペプチドと連結されたペプチドは、脂質二重層に対して親和性を有する膜挿入が可能なペプチドを含み、前記ペプチドがＩｇＧ、ＣＤ４、またはそれらの組み合わせのセグメントを含む、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

膜挿入ペプチドに連結した前記膜結合型ＩＬ－２１が、組換えＤＮＡによりコードされた融合タンパク質である、請求項４に記載の方法。

【請求項7】

ステップａ）の前記予備活性化ＮＫ細胞を、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４５、または６０日間、前記ＰＭ２１粒子と接触させる、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

ＮＫ細胞の供給源がＮＫ細胞前駆体供給源であり、前記ＮＫ細胞前駆体供給源が臍帯血、誘導多能性幹細胞、および胚性幹細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記予備活性化ＮＫ細胞がＰＭ２１粒子と２回以上接触される、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記予備活性化ＮＫ細胞がＰＭ２１粒子と２回以上接触され、ＰＭ２１粒子と接触させるステップが７日ごとに生じる、請求項１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

遺伝子型的にＨＬＡ適合同胞からの造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）は、血液癌悪性腫瘍および骨髄不全症候群の患者における長期生存率を改善している。毎年、１万人以上の米国人が生命に関わる病気に罹患しており、治癒の唯一の希望は、血縁関係のないドナーまたは臍帯血の単位からの骨髄移植である。しかし、同種幹細胞移植により恩恵を受け得る患者の７０％超が、適合同胞ドナーを有していない。こうした状況が、治療を遅らせ、部分的に不適合ドナーの最適使用に満たない適合に頼る必要があり、このため、最終的に、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、移植片不全、および再発の発生率の上昇につながり、これらのすべてが患者の生存率を劇的に低下させる。

【0002】

移植プロセスの期間、費用面での財政的、精神的および健康的な負担により、さらなる制限が課される。したがって、血縁関係のないドナーからのＨＳＣＴの適用は、このプロセスに耐えることができる適切な社会経済的支援を受けた若く健康的な患者に限られている。残存する癌細胞を根絶することができないために、再発率が高いことから、さらなる課題が提起されている。ＨＳＣＴは治療効果があると考えられているが、癌の再発率は驚くほどである。従って、好ましくは適合ドナーを必要とせずに、より効果的であると考えられる新規の、より標的化された免疫療法が必要とされている。１９９０年代には、ＨＳＣＴ後の急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の再発を治療するためのドナーリンパ球注入（ＤＬＩ）が導入された。このアプローチは、元のドナーのリンパ球を、再発性疾患を有するＡＭＬ患者へ投与することから構成されたものであった。しかし、臨床上の利益は、限られており、腫瘍負荷がより少ない少数の患者で観察されたのみであり、多くの場合、Ｔ細胞媒介ＧＶＨＤにより結果がさらに悪化した。

【0003】

ドナーリンパ球注入による移植片対腫瘍（ＧＶＴ）作用の大部分は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に起因し得る。ドナー血液から単離したＮＫ細胞を注入することで、ＧＶＨＤを引き起こすことなく有益なＧＶＴ作用を生み出すことができた。前臨床および臨床データにより、いかなるＧＶＨＤも伴わずに完全寛解に至るＮＫ細胞の注入の有効性が示されている。このように、自家移植と組み合わせて、または独立した治療としてのＮＫ細胞の注入は、適合ドナーを有さず、再発を経験しているか、または移植の資格がない患者にとって革新的であり、かつ潜在的に非常に効果的な代替法となる。しかしながら、これらのＮＫ細胞治療は、治療的治療を提供するのに十分な数のＮＫ細胞の増殖に対する需要を生み出す。したがって、メモリー様ＮＫ細胞数を増加させることを目的とした新規であり、かつ改良された方法論に対する大きな必要性がある。

【0004】

開示された方法および組成物のさらなる利点は、部分的には以下の説明に示され、部分的にはその説明から理解されるか、または開示された方法および組成物の実施によって習得され得る。開示された方法および組成物の利点は、添付の特許請求の範囲において特に指摘された要素および組み合わせによって実現され、達成されるであろう。前述の一般的な説明および以下の詳細な説明は両方とも例示的かつ説明的なものにすぎず、特許請求される本発明を限定するものではないことを理解されたい。

【発明の概要】

【0005】

本出願は、一般に、メモリーナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む組成物および方法に関する。より具体的には、本出願は、癌細胞、ウイルス感染細胞、および特定の免疫細胞を攻撃および死滅させることができるメモリーナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のインビボ、エクスビボ、またはインビトロでの刺激および増殖に関する。

【0006】

本明細書に開示されているのは、ａ）少なくとも１つのＮＫ細胞を少なくとも１つ以上の刺激性サイトカインと接触させることによってＮＫ細胞を予備活性化することと、ｂ）ステップａ）の予備活性化ＮＫ細胞を、ＮＫ細胞エフェクター剤を含む小胞と接触させる（例えば、ＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、またはＦＣ２１フィーダー細胞と接触させること）ことによって、ステップａ）の予備活性化ＮＫ細胞を増殖させることと、を含む、メモリー様ＮＫ細胞の数を増加させるための方法である。いくつかの態様では、予備活性化ステップａ）および／または増殖ステップｂ）後に洗浄すること、および／または増殖ステップｂ）後にメモリー様ＮＫ細胞を休止することをさらに含む、メモリー様ＮＫ細胞の数を増加させるための方法である。さらに他の態様では、本明細書に開示されるのは、増殖ステップおよび予備活性化ステップを逆転させる方法であって、この方法は、ＮＫ細胞エフェクター剤を含む小胞と細胞を接触させること（例えば、ＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、またはＦＣ２１フィーダー細胞と接触させること）によってＮＫ細胞を増殖させること、およびその後、細胞を少なくとも１つ以上の刺激性サイトカインと接触させることにより、増殖ＮＫ細胞を予備活性化することを含む。

【0007】

本明細書に開示されている一態様は、メモリー様ＮＫ細胞の数を増加させるための方法であって、この方法では、開示されている方法において使用するためのＮＫ細胞が末梢血単核細胞の選択されていない集団から得られる。

【0008】

少なくとも１つ以上の刺激性サイトカインが、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＩＬ－１８からなる群から選択される、前述の態様のいずれかに記載の方法も開示されている。一態様では、本方法は、ＮＫ細胞を３つの刺激性サイトカインと接触させることを含み得る。

【0009】

また、ＮＫ細胞をインビトロ、インビボ、またはエキソビボでＩＬ－１２、ＩＬ－１５、またはＩＬ－１８と接触させる、前述の態様のいずれかに記載の方法も開示される。

【0010】

ＮＫ細胞を、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、３６、４８、６０、または７２時間、１つ以上の刺激性サイトカインと接触させる、前述の態様のいずれかに記載の方法も開示される。

【0011】

ＮＫ細胞を４－１ＢＢＬ、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＩＬ－７、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＵＬＢＰ２、ＩＣＡＭ－１、２Ｂ４、ＢＣＭ１／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＣＣＲ７、ＤＡＰ１２、およびＤＡＰ１０からなる群から選択されるサイトカインと接触させることをさらに含む、前述の態様のいずれかに記載の方法も開示される。

【0012】

一態様では、ＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、またはＦＣ２１フィーダー細胞が、膜挿入ペプチドに連結した１つ以上の刺激性ペプチドを含む方法が本明細書に開示されている。

【0013】

膜挿入サイトカインが脂質二重層に対して親和性を有する膜挿入が可能な融合ペプチドを含み、この融合ペプチドがＩＧ４、ＣＤ４、またはそれらの組み合わせのセグメントを含む、前述の態様のいずれかに記載の方法も開示される。

【0014】

膜挿入ペプチドが、ヒトＦｃ、ＧＰＩ、膜貫通Ｔ細胞受容体、またはｐＨＬＩＰを含む、前述の態様のいずれかに記載の方法も開示されている。

【0015】

１つ以上の刺激性ペプチドが、４－１ＢＢＬ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－７、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＵＬＢＰ２、ＩＣＡＭ－１、２Ｂ４、ＢＣＭ１／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、Ｊａｇｇｅｄ１、Ｊａｇｇｅｄ２、デルタ様１（Ｄｌｌ１）、デルタ様３（Ｄｌｌ３）、デルタ様４（Ｄｌｌ４）、Ｐｒｅｆ－１、ＤＮＥＲ、Ｊｅｄｉ、ＳＯＭ－１１、ｗｉｎｇｌｅｓｓ、ＣＣＮ３、ＭＡＧＰ２、ＭＡＧＰ１、ＴＳＰ２、ＹＢ－１、ＥＧＦＬ７、ＣＣＲ７、ＤＡＰ１２、およびＤＡＰ１０からなる群から選択される、前述の態様のいずれかに記載の方法も開示される。

【0016】

膜挿入ペプチドに連結した１つ以上の刺激性サイトカインが、組換えＤＮＡによってコードされる融合タンパク質である、前述の態様のいずれかに記載の方法も開示される。

【0017】

ＮＫ細胞をインビトロ、インビボ、またはエキソビボでＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、またはＦＣ２１フィーダー細胞と接触させる、前述の態様のいずれかに記載の方法も開示される。

【0018】

ステップａ）のＮＫ細胞を、ＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、またはＦＣ２１フィーダー細胞と１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０日間接触させる、前述の態様のいずれかに記載の方法も開示される。

【0019】

一態様では、本明細書に開示されるのは、細胞が少なくとも１、２、３、４、または５日間休止されたメモリー様ＮＫ細胞である方法である。

【0020】

一態様では、本明細書に開示されるのは、１つ以上のサイトカインおよびＮＫ細胞エフェクター剤を含む１つ以上の小胞を含むメモリー様ＮＫ細胞の数を増加させるためのキットである。

【0021】

１つ以上のサイトカインが、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＩＬ－１８からなる群から選択される、前述の態様のいずれかに記載のキットも開示される。

【0022】

ＮＫ細胞エフェクター剤を含む１つ以上の小胞が、ＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、またはＦＣ２１フィーダー細胞である、前述の態様のいずれかに記載のキットも開示される。

【0023】

ＮＫ細胞エフェクター剤が、４－１ＢＢＬ、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－７、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＵＬＢＰ２、ＩＣＡＭ－１、２Ｂ４、ＢＣＭ１／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、Ｊａｇｇｅｄ１、Ｊａｇｇｅｄ２、デルタ様１（Ｄｌｌ１）、デルタ様３（Ｄｌｌ３）、デルタ様４（Ｄｌｌ４）、Ｐｒｅｆ－１、ＤＮＥＲ、Ｊｅｄｉ、ＳＯＭ－１１、ｗｉｎｇｌｅｓｓ、ＣＣＮ３、ＭＡＧＰ２、ＭＡＧＰ１、ＴＳＰ２、ＹＢ－１、ＥＧＦＬ７、ＣＣＲ７、ＤＡＰ１２、およびＤＡＰ１０からなる群から選択される、前述の態様のいずれかに記載のキットも開示される。

【0024】

本明細書に組み込まれてその一部を構成している添付の図面は、いくつかの実施形態を示しており、その説明と共に開示された組成物および方法を示す。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】ＰＭ２１粒子、Ｋ５６２－ｍｂ２１フィーダー細胞（ＦＣ２１細胞）との接触、ならびにＩＬ１２、ＩＬ１５、およびＩＬ１８による予備活性化、およびその後のＰＭ２１粒子との接触後のメモリーＮＫ細胞の増殖の増加を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0026】

本発明の化合物、組成物、物品、装置、および／もしくは方法が開示および記載される前に、それらは、他に特定されない限り、特定の合成方法もしくは特定の組換えバイオテクノロジー方法、または他に特定されない限り、特定の試薬に限定されず、当然のことながら変化し得ることが理解される。本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図するものではないこともまた理解されるべきである。

【0027】

Ａ．定義
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「医薬担体」への言及は、２つ以上のそのような担体の混合物などを含む。

【0028】

本明細書では、範囲は、「約」１つの特定の値から、および／または「約」別の特定の値までとして表現することができる。このような範囲が表されるとき、別の実施形態は、１つの特定の値からおよび／または他の特定の値までを含む。同様に、先行詞「約」を使用して値が近似値として表される場合、その特定の値は別の実施形態を形成することが理解されよう。範囲の各々の終点は、他の終点と関係があっても、他の終点とは無関係であっても、重要であることがさらに理解されよう。本明細書に開示された複数の値があり、各値がまた、その値自体に加えて「約」その特定の値として本明細書に開示されることもまた理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、「約１０」も開示される。当業者によって適切に理解されるように、ある値が開示される場合、その値「以下」、「その値以上」およびそれらの値の間の可能な範囲もまた開示されることも理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、「１０以下」および「１０以上」も開示される。本出願全体において、データは複数の異なる形式で提供され、このデータは終点および開始点、データ点の任意の組み合わせの範囲を表すこともまた理解される。例えば、特定のデータ点「１０」および特定のデータ点１５が開示されている場合、１０超および１５超、１０以上および１５以上、１０未満および１５未満、１０以下および１５以下ならびに１０および１５は、１０から１５の間と同様に開示されているとみなされることが理解される。２つの特定の単位間の各単位もまた開示されていることも理解される。例えば、１０および１５が開示されている場合、１１、１２、１３、および１４も開示されている。

【0029】

本明細書および添付の特許請求の範囲では、以下の意味を有すると定義されるべきいくつかの用語に言及する：

【0030】

「任意の」または「任意により」は、後に記載される事象または状況が発生しても発生しなくてもよいこと、およびその説明がその事象または状況が発生している場合と発生していない場合を含むことを意味する。

【0031】

以下の実施例は、本明細書に請求される化合物、組成物、物品、装置および／または方法がどのようにして製造および評価されるか、完全な開示および説明を当業者に提供するために記載され、これらは、純粋に例示的であることを意図しており、本開示を限定することを意図するものではない。数（例えば、量、温度など）に関して正確さを確実にするための努力がなされてきたが、いくらかの誤差および偏差が考慮されるべきである。特に別に示さない限り、部は重量部であり、温度は℃であるか、または周囲温度であり、圧力は大気圧または大気圧付近である。

【0032】

本出願を通して、様々な刊行物が参照されている。これらの刊行物の全体の開示は、これが関連する最新技術をより完全に記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。開示された参考文献はまた、その参考文献が依拠している文章中で論じられている、それらに含まれる材料について、本明細書中で参考として個々にかつ具体的に組み込まれる。

【0033】

Ｂ．メモリー様ＮＫ細胞を増殖させる方法
ヒトＮＫ細胞は、ＣＤ５６またはＣＤ１６の発現およびＴ細胞受容体（ＣＤ３）が存在しないことによって定義される末梢血リンパ球のサブセットである。ＮＫ細胞は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）－クラスＩ分子を欠く標的細胞を感知して、死滅させる。ＮＫ細胞活性化受容体としては、とりわけ、天然の細胞傷害性受容体（ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４およびＮＫｐ４６）、ならびにレクチン様受容体ＮＫＧ２ＤおよびＤＮＡＭ－１が挙げられる。これらのリガンドは、ストレスを受けた、形質転換された、または感染した細胞上で発現するが、正常細胞上には発現せず、正常細胞をＮＫ細胞の殺傷に対して抵抗性にするものである。ＮＫ細胞の活性化は、キラー免疫グロブリン（Ｉｇ）様受容体（ＫＩＲ）、ＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４、白血球Ｉｇ様受容体－１（ＬＩＲ－１）などの阻害受容体を介して負に調節される。１つの阻害受容体の関与は、標的の溶解を妨げるのに十分であり得る。そのため、ＮＫ細胞は、多くのストレス誘導リガンド、および少数のＭＨＣクラスＩリガンドを発現する細胞を効率的に標的とする。

【0034】

ＮＫ細胞の注入は、血液癌（急性骨髄性白血病または多発性骨髄腫など）ならびにいくつかの固形腫瘍（例えば、脳腫瘍、ユーイング肉腫および横紋筋肉腫）など、ＮＫ細胞の溶解に感受性の高い癌を有する患者に対する治療選択肢である。また、機能性ＮＫ細胞の数が増加することで、とりわけリンパ腫、結腸直腸癌、肺癌、および乳癌など、いくつかの癌の治療に使用される治療用抗体の有効性を著しく高め得る。しかしながら、これらのタイプの個別化治療は、非常に費用を要し、典型的な抗体含有レジメンは数万ドルの費用を要する。さらに、既存の方法の予想される有効性は、免疫不全の癌患者においては、免疫細胞の関与が欠如するために、多くの場合、達成されることはない。

【0035】

治療方法として有効であるためには、有効な治療用量に達するＮＫ細胞の増殖度を達成することが望ましい。しかし、これまでの研究では、ＮＫ細胞の増殖は、いくつかの分裂、および老化に達し、増殖を停止している細胞に限定されていることが示されており、このことは、テロメア短縮の観察結果と一致している。これらの方法により、効率的なインビトロＮＫ細胞増殖が可能になるが、生存しているフィーダー細胞を必要とするために、この方法論を大規模のＧＭＰ設備および能力を有さない臨床設定に移すことは困難になる。また、患者に注入されたＮＫ細胞は、フィーダーによる継続的な刺激がないために分裂を停止する可能性が高い。さらに、患者に再注入したときに意図したとおりに機能するインビトロ培養ＮＫ細胞の能力に関する情報は、依然として不足している。現在、ＩＬ－２の投与は、インビボにおいてＮＫ細胞を増殖させる唯一のＦＤＡ承認方法である。しかしながら、この研究で使用されたリンパ枯渇および高用量のＩＬ－２に必要とされる集中的なコンディショニングレジメンは、結果として、有意な毒性および長期の入院をもたらし、また多くの場合、ＮＫ細胞におけるインビボ増殖が低下した。さらに、ＩＬ－２を全身投与することにより、ＮＫ細胞の数および機能を抑制する制御性Ｔ細胞の増殖をもたらし、それによって患者におけるそれらの持続性および効率が制限される。そのため、ＮＫ細胞のインビボまたはエクスビボにおける増殖のための代替的アプローチが必要とされている。ＩＬ－１５は現在、ＩＬ－２投与の代替アプローチとして第Ｉ相臨床試験で試験されているが、前臨床所見に基づいて、体系的に投与された場合に、有意な毒性を有することが依然として予想される。従って、これらの方法は両方とも、患者に対して有意な毒性を有し、また制御性Ｔ細胞などのＴ細胞の増殖を誘導し、ＮＫ細胞の持続性が短くなる（平均して２１日未満）。

【0036】

上記のように、ＮＫ細胞免疫療法の有効性は、患者に投与された、またはインビボ増殖による注入後に到達したＮＫ細胞の用量に依存する。現在利用可能な技術は、患者において治療効果を達成するのに必要とされるレベルのＮＫ細胞の増殖を達成することができないことによって制限されている。より単純な臨床増殖プロトコルが存在していないことは、ＮＫ細胞をベースとした免疫療法の進歩および広範な普及に対する大きな障壁である。現在のエクスビボ増殖プロトコルでは、白血病由来のフィーダー／刺激細胞株上に発現する活性化リガンドと高用量のサイトカインとの組み合わせを使用しており、これは、ほとんどの施設における臨床設定への移行に重大な不利益をもたらし、直接インビボ増殖には適していない。本明細書に記載のエキソソームなどの粒子技術の使用では、刺激細胞を必要とせず、そのため方法論が単純化され、直接的かつ選択的なインビボ増殖が可能になる。さらに、本明細書に開示される方法により、メモリー様ＮＫ細胞の数が増大する。本明細書中で使用される場合、「メモリー様ＮＫ細胞」は、サイトカインまたは腫瘍の再刺激の際に再活性化され得るという特徴を有するＮＫ細胞に関する。したがって、一態様では、本明細書に開示されているのは、ａ）少なくとも１つのＮＫ細胞を少なくとも１つ以上の刺激性サイトカインと接触させることによってＮＫ細胞を予備活性化することと、ｂ）細胞を、ＮＫ細胞エフェクター剤を含む１つ以上の小胞と接触させることによって、ステップａ）の予備活性化ＮＫ細胞を増殖させることと、を含む、メモリー様ＮＫ細胞の数を増加させるための方法である。

【0037】

ＮＫ細胞の増殖が起こる必要がある、または活性化の前にこの増殖が起こることが望まれる状況があり得ることが理解され、本明細書において企図される。従って、本明細書に開示されているのは、増殖ステップと予備活性化ステップとを逆転させる方法であって、これにより、この方法は、ＮＫ細胞エフェクター剤を含む小胞と細胞を接触させること（例えば、ＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、またはＦＣ２１フィーダー細胞と接触させること）により、ＮＫ細胞を増殖させること、および細胞を少なくとも１つ以上の刺激性サイトカインと接触させることにより、増殖したＮＫ細胞を予備活性化することを含むようになる。要するに、本明細書に開示されているのは、メモリー様ＮＫ細胞の数を増加させるための方法であって、この方法は、ａ）細胞を、ＮＫ細胞エフェクター剤を含む１つ以上の小胞と接触させることによりＮＫ細胞を増殖させることと、ｂ）ＮＫ細胞を少なくとも１つ以上の刺激性サイトカインと接触させることにより、ステップａ）の増殖ＮＫ細胞を予備活性化することと、を含む。

【0038】

開示された方法は、少なくとも１つのＮＫ細胞を少なくとも１つ以上の刺激性サイトカイン（例えば、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、および／またはＩＬ－１８）と接触させることによってＮＫ細胞の予備活性化を得る。したがって、一態様では、本明細書では、１つ以上のＮＫ細胞を２つまたは３つの刺激性サイトカインと接触させることなど、１つ以上のＮＫ細胞をＩＬ－１２、ＩＬ－１５および／またはＩＬ－１８、またはこれらの任意の組み合わせを含む群から選択される１つ以上の刺激性サイトカインと接触させることによって、ＮＫ細胞を予備活性化することを含むメモリー様ＮＫ細胞の数を増加させる方法が開示される。例えば、本明細書に具体的に開示されているのは、予備活性化ステップがＮＫ細胞をＩＬ－１２；ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－１２およびＩＬ－１５；ＩＬ－１２およびＩＬ－１８；ＩＬ－１５およびＩＬ－１８；またはＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＩＬ－１８と接触させることを含む方法である。一態様では、ＮＫ細胞の数を増加させる開示された方法は、ＮＫ細胞を、４－１ＢＢＬ、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＩＬ－７、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＵＬＢＰ２、ＩＣＡＭ－１、２Ｂ４、ＢＣＭ１／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ１５５、ノッチリガンド（例えばＣＤ１１２、Ｊａｇｇｅｄ１、Ｊａｇｇｅｄ２、デルタ様１（Ｄｌｌ１）、デルタ様３（Ｄｌｌ３）、デルタ様４（Ｄｌｌ４）、Ｐｒｅｆ－１、ＤＮＥＲ、Ｊｅｄｉ、ＳＯＭ－１１、ｗｉｎｇｌｅｓｓ、ＣＣＮ３、ＭＡＧＰ２、ＭＡＧＰ１、ＴＳＰ２、ＹＢ－１、およびＥＧＦＬ７など）、ＣＣＲ７、ＤＡＰ１２、ならびに／またはＤＡＰ１０からなる群から選択される１つ以上のサイトカインと接触させることをさらに含み得る。

【0039】

予備活性化期間（すなわち、ＮＫ細胞と刺激性サイトカイン（例えば、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、および／またはＩＬ－１８）との間の接触期間）は、所望のＮＫ細胞の予備活性化を達成するのに必要な任意の時間長であり得ると理解され、本明細書において企図される。例えば、接触は、短くて１分、長くて７日間ほどでもよい（例えば、ＮＫ細胞をＩＬ－１２、ＩＬ－１５、および／またはＩＬ－１８の存在下で７日間培養する）。一態様では、本明細書に開示されているのは、１つ以上のＮＫ細胞をＩＬ－１２、ＩＬ－１５、および／またはＩＬ－１８と５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、３６、または４８時間接触させることによってＮＫ細胞を予備活性化することを含む、メモリー様ＮＫ細胞の数を増加させる方法である。培養物中のサイトカインの半減期は、所望の接触時間より短くてもよいことが理解され、本明細書において企図される。したがって、本明細書に開示するのは、１つ以上のＮＫ細胞を、接触時間以内に各々、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２時間ごと（例えば、各々、２４時間の接触時間以内に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２時間ごと）、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、および／またはＩＬ－１８と接触させる方法である。

【0040】

ＮＫ細胞を接触および活性化および／または増殖するための、１つ以上のＮＫ細胞エフェクター剤（すなわち、刺激性ペプチド、サイトカイン、および／または接着分子）を含む原形質膜（ＰＭ）粒子、エキソソーム（ＥＸ）、またはフィーダー細胞（ＦＣ）の使用により、サイトカインの毒性に関連する多くの障害を克服している。ＮＫ細胞活性化剤および刺激性ペプチドの例としては、４１ＢＢＬ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１、ＩＬ－１８、ＭＩＣＡ、ＬＦＡ－１、２Ｂ４、ＢＣＭ／ＳＬＡＭＦ２、ＣＣＲ７および／または他のホーミング受容体が挙げられるが、これらに限定されない。サイトカインの例としては、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１、およびＩＬ－１８が挙げられるが、これらに限定されない。接着分子の例としては、ＬＦＡ－１、ＭＩＣＡ、ＢＣＭ／ＳＬＡＭＦ２が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、原形質膜（ＰＭ）粒子、フィーダー細胞（ＦＣ）、またはエキソソーム（ＥＸ）は、膜結合ＩＬ－２１を発現するフィーダー細胞（それぞれＦＣ２１細胞、ＰＭ２１粒子、およびＥＸ２１エキソソーム）から調製された。膜結合ＩＬ－２１発現ＦＣ２１細胞、ＰＭ２１粒子、およびＥＸ２１エキソソームは、これらに限定されないが、４１ＢＢＬ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＭＩＣＡ、ＬＦＡ－１、２Ｂ４、ＢＣＭ／ＳＬＡＭＦ２、ＣＣＲ７（例えば、ＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、または４１ＢＢＬおよび膜結合インターロイキン－２１を発現するＦＣ細胞）が挙げられるが、これらに限定されない追加の１つ以上の活性化剤、刺激性ペプチド、サイトカイン、および／または接着分子をさらに含み得る。したがって、一態様では、本明細書に開示されているのは、ａ）少なくとも１つのＮＫ細胞を少なくとも１つ以上の刺激性サイトカインと接触させることによってＮＫ細胞を予備活性化することと、ｂ）細胞を、ＮＫ細胞エフェクター剤を含む少なくとも１つの小胞と接触させることによって、ステップａ）の予備活性化ＮＫ細胞を増殖させることとを含み、ＮＫ細胞エフェクター剤を含む小胞は、ＰＭ２１粒子、ＥＸ２１粒子、および／またはＦＣ２１フィーダー細胞のうちの１つ以上の任意の組み合わせである、メモリー様ＮＫ細胞の数を増加させる方法である。例えば、本明細書に開示されているのは、他のステップの中でも特に、ステップａ）の予備活性化ＮＫ細胞を、ＮＫ細胞エフェクター剤を含む少なくとも１つの小胞と細胞を接触させることによって増大させることを含み、ＮＫ細胞エフェクター剤を含む小胞は、ＰＭ２１粒子；ＥＸ２１エキソソーム；ＦＣ２１フィーダー細胞；ＰＭ２１粒子およびＥＸ２１エキソソーム；ＰＭ２１粒子およびＦＣ２１フィーダー細胞；ＥＸ２１エキソソームおよびＦＣ２１フィーダー細胞；またはＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、およびＦＣ２１フィーダー細胞を含む、メモリーＮＫ細胞の数を増加させる方法である。

【0041】

いくつかの態様では、ＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、またはＦＣ２１フィーダー細胞のエフェクター剤は、膜挿入ペプチド（例えば、Ｆｃ、ＧＰＩ、膜貫通Ｔ細胞受容体、またはｐＨＬＩＰ）に連結した１つ以上の刺激性ペプチドを含む。膜挿入ペプチドは、膜への挿入を促進する分子であり得る。膜挿入ペプチドは、脂質二重層に対して親和性を有するＣＤ４またはＩｇＧのセグメントを含み得る。さらに、代替的膜挿入ペプチドは、ヒトＦｃ、ＧＰＩ、膜貫通Ｔ細胞受容体、またはｐＨＬＩＰを含み得る。膜自己挿入ペプチドは、細胞膜に挿入することが知られている任意のペプチドであり得る。膜自己挿入ペプチドコンジュゲートの使用に応じて、特定の膜自己挿入ペプチドが他のものよりも優れた選択となり得る。当業者であれば、異なる状況下で、どのような膜自己挿入ペプチドが理想的であるかを理解するであろう。例えば、インビボでの使用のためには、ｐＨＬＩＰ膜自己挿入ペプチドが好適であり得る。ｐＨＬＩＰ膜自己挿入ペプチドは、低ｐＨ条件下においてのみ膜に挿入される。したがって、ｐＨＬＩＰコンジュゲートは、通常の生理的条件下において細胞膜に挿入されることはない。しかし、腫瘍環境は、通常の生理学的条件よりも酸性であることから、ｐＨＬＩＰコンジュゲートは、腫瘍環境への注入時に、腫瘍細胞の細胞膜に挿入することができる。腫瘍環境にこのように挿入することで、腫瘍領域においてＮＫ細胞の活性化が可能になる。したがって、ｐＨＬＩＰを使用することで、ランダムな細胞膜への望ましくない挿入を防ぐ。

【0042】

膜挿入ペプチドは、様々な方法で１つ以上の刺激性ペプチドに連結させることができ、ペプチドを連結させるための技術は、当技術分野において周知である。刺激性ペプチドに連結した膜挿入ペプチドはまた、膜挿入ペプチドコンジュゲートとも呼ばれ得る。いくつかの態様では、膜挿入ペプチドに連結した１つ以上の刺激性ペプチドは、組換えＤＮＡによってコードされている融合タンパク質を含み得、このような融合タンパク質は細菌細胞中で産生され得る。ある実施形態では、融合タンパク質は、リポソームまたは細胞膜に固定するための疎水性ペプチド、ＧＰＩ、またはヒトＦｃなどの親油性分子にコンジュゲートまたは連結した１つ以上の刺激性ペプチドからなることができる。これらの融合タンパク質のためのｃＤＮＡベクターは、細菌（大腸菌）、昆虫、または哺乳動物細胞における発現を可能にする発現プラスミドにライゲートされ得る。ある実施形態では、ｃＤＮＡベクターは、ＦＬＡＧまたはＨＩＳタグ化されていてもよい。細菌細胞は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載されているものなどの標準的なＣａＣｌトランスフェクション方法を用いてトランスフェクトしてもよい。細菌細胞もＬＢ培地中で培養することができ、細胞を採取し、Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓを用いて溶解させ得る。目的のタンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーによって溶解物から精製することができる。パルミチン酸コンジュゲートプロテインＡおよび精製Ｆｃ融合タンパク質は、４℃で１：２（ｗ／ｗ）を混合することによって文献に記載されているようにコンジュゲートすることができる。次いで、コンジュゲートを腫瘍内に直接注射してもよく、またはリポソームに組み込んでもよい。

【0043】

連結の種類および連結方法は、当業者に公知である。本明細書中で使用される場合、用語「連結する」とは、ペプチドまたはタンパク質などの別の分子実体にコンジュゲート、結合、またはそうでなければ連携されている膜自己挿入ペプチドを指す。例えば、刺激性ペプチドに連結した膜挿入ペプチドは、膜挿入ペプチドがジスルフィド結合を介して別のタンパク質に連結している融合タンパク質であり得る。連結またはコンジュゲートは、膜自己挿入ペプチドとＮＫ細胞エフェクター剤との間に化学的連携があることを意味し得る。

【0044】

いくつかの態様では、インサイチュ自己集合のために、１つ以上の刺激性ペプチドが膜自己挿入ペプチドまたはＧＰＩアンカーに連結され得る。例えば、４１－ＢＢＬおよびＩＬ－２１は、酸性条件下でそれ自身を細胞膜に挿入するｐＨＬＩＰペプチドに連結され得、それによって腫瘍の近位にある細胞への刺激リガンドの固定が可能になる。刺激性ペプチド４１ＢＢＬ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１、ＢＣＭ／ＳＬＡＭＦ２、ＣＣＲ７および／または他のホーミング受容体は、細菌細胞中で産生され得るか、または市販の供給源から購入されてもよく、これらのタンパク質のｃＤＮＡベクターは、細菌（大腸菌）、昆虫、または哺乳動物細胞での発現が可能になるｐＴｒｉＥＸ発現プラスミドに任意によりライゲートされ得る。ｃＤＮＡベクターは、ＦＬＡＧまたはＨＩＳタグの発現をコードしてもよい。細菌細胞は、標準的なＣａＣｌトランスフェクション方法を用いてトランスフェクトすることができ、またＬＢ培地上で培養することができる。細胞は、採取し、フレンチプレスを用いて溶解することができ、次いで目的のタンパク質をアフィニティークロマトグラフィーによって溶解物から精製してもよい。

【0045】

いくつかの実施形態では、ｐＨＬＩＰは、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル化学を用いた固相ペプチド合成によって調製することができ、生成物は逆相クロマトグラフィーによってＣ１８カラムで精製することができる。次いで、ｐＨＬＩＰは、ベンゾフェノン－４－ヨードアセトアミドなどの架橋剤と共にインキュベートすることによって、刺激性ヒトタンパク質リガンドにコンジュゲートさせることができる。数回洗浄後、コンジュゲートさせたｐＨＬＩＰタンパク質を培地（例えば、食塩水）に再懸濁し、腫瘍内または静脈内に注射することができる。前述の文献のエビデンスに基づき、かつ実験結果に示されているように、そのような改変腫瘍細胞の表面上における、ＮＫ細胞とＩＬ－２１および４１－ＢＢＬなどの刺激性リガンドとの相互作用は、インサイチュＮＫ細胞の増殖を刺激し、かつ癌に対する細胞傷害応答を誘発し得る。この種類の刺激アプローチは、酸性ｐＨ下で腫瘍細胞にインサイチュで挿入するＮＫ刺激性リガンドを低用量のＩＬ－２を単独で、またはＮＫ細胞と一緒に、患者の腹腔内に注射することができる卵巣癌などの固形腫瘍の治療に使用できる。ＮＫ細胞などの高レベルのＦＣγｌＩＩ Ｒ（ＣＤ１６）を発現する細胞傷害性リンパ球が、治療用抗体による癌治療の有効性にとって極めて重要であるという強力なエビデンスが存在する。したがって、このアプローチは、治療用抗体と組み合わせて使用することもできる。

【0046】

予備活性化ＮＫ細胞（すなわち、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、および／またはＩＬ－１８などのサイトカインと接触したＮＫ細胞）とＮＫ細胞エフェクター剤を含む小胞（すなわち、ＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、および／またはＦＣ２１フィーダー細胞）との間の接触時間が、メモリー様ＮＫ細胞の所望の増殖を達成するのに必要な任意の時間長であってもよいことが理解され、本明細書において企図される。例えば、接触は、短くて１分、長くて６０日間ほどでもよい（例えば、ＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、および／またはＦＣ２１フィーダー細胞の存在下で７日間ＮＫ細胞を培養する）。一態様では、予備活性化ＮＫ細胞とＮＫ細胞エフェクター剤を含む小胞との間の接触は、約６日～約６０日であってもよく、より好ましくは接触は約６日～約４０日であってもよい。また、本明細書には、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、３２日、３３日、３４日、３５日、３６日、３７日、３８日、３９日、４０日、４１日、４２日、４３日、４４日、４５日、４６日、４７日、４８日、４９日、５０日、５１日、５２日、５３日、５４日、５５日、５６日、５７日、５８日、５９日、６０日、６１日、６２日、６３日、６４日、６５日、６６日、６７日、６８日、６９日、７０日、７１日、または７２日間、予備活性化ＮＫ細胞をＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、および／またはＦＣ２１フィーダー細胞と接触させることを含む、メモリー様ＮＫ細胞の数を増加させる方法も開示される。いくつかの例において、予備活性化ＮＫ細胞とＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、および／またはＦＣ２１フィーダー細胞との複数回の接触が望まれ得、また使用され得ることが理解され、本明細書において企図される。例えば、予備活性化ＮＫ細胞は、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、０日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、または２１日ごとに１回、ＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、および／またはＦＣ２１フィーダー細胞と接触させることができる。したがって、一態様において、本明細書に開示されているのは、予備活性化ＮＫ細胞を、ＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、および／またはＦＣ２１フィーダー細胞と２回以上接触させることを含む、メモリー様ＮＫ細胞の数を増加させる方法であって、接触は、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、０日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、または２１日ごとに生じる。

【0047】

一態様では、原形質膜粒子、フィーダー細胞、またはエキソソームは、ＮＫ細胞を刺激するフィーダー細胞から精製することができる。本明細書に開示される、原形質膜粒子またはエキソソームを作製する際に使用するための、請求される発明において使用するためのＮＫ細胞刺激フィーダー細胞は、照射された自己もしくは同種末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または非照射自己またはＰＢＭＣ、ＲＰＭＩ８８６６、ＨＦＷＴ、Ｋ５６２、膜結合型ＩＬ－１５および４１ＢＢＬでトランスフェクトしたＫ５６２細胞、膜結合型ＩＬ－２１および４１ＢＢＬでトランスフェクトしたＫ５６２細胞、または膜結合型ＩＬ－２１および４１ＢＢＬでトランスフェクトしたＫ５６２細胞、またはＥＢＶ－ＬＣＬのいずれかであり得る。いくつかの態様において、ＮＫ細胞フィーダー細胞は、膜結合型ＩＬ－２１および４１ＢＢＬでトランスフェクトされたＫ５６２細胞、または膜結合型ＩＬ－１５および４１ＢＢＬでトランスフェクトされたＫ５６２細胞であり得る。

【0048】

予備活性化ステップにおける特定の刺激性サイトカインの使用は、予備活性化ＮＫ細胞を増殖させるために使用されるＮＫ細胞エフェクター剤を含む小胞に影響を与えるものではないことが理解され、本明細書において企図される。したがって、サイトカインおよび小胞の任意の組み合わせは、開示された方法において使用され得る。例えば、本明細書に特に開示されるのは、メモリー様ＮＫ細胞の数を増加させるための方法であって、ａ）少なくとも１つのＮＫ細胞を少なくとも１つ以上の刺激性サイトカインと接触させることによってＮＫ細胞を予備活性化することと、ｂ）細胞を、ＮＫ細胞エフェクター剤を含む１つ以上の小胞と接触させることによって（例えば、ＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、またはＦＣ２１フィーダー細胞と接触させる）、ステップａ）の予備活性化ＮＫ細胞を増殖させるステップと、を含み、１つ以上の刺激性サイトカインは、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、および／またはＩＬ－１８であり、１つ以上の小胞は、ＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、および／またはＦＣ２１フィーダー細胞である。例えば、本明細書において開示されるのは、ＩＬ－１２およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１５およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１８およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１２およびＥＸ２１エキソソーム、ＩＬ－１５およびＥＸ２１エキソソーム；ＩＬ－１８およびＥＸ２１エキソソーム；ＩＬ－１２およびＦＣ２１フィーダー細胞；ＩＬ－１５およびＦＣ２１フィーダー細胞；ＩＬ－１８およびＦＣ２１フィーダー細胞；ＩＬ－１２、ＩＬ１５、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１２、ＩＬ１５、およびＥＸ２１エキソソーム；ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、およびＥＸ２１エキソソーム；ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、およびＥＸ２１エキソソーム；ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、およびＥＸ２１エキソソーム；ＩＬ－１２、ＩＬ１５、およびＦＣ２１フィーダー細胞；ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、およびＦＣ２１フィーダー細胞；ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、およびＦＣ２１フィーダー細胞；ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、およびＦＣ２１フィーダー細胞；ＩＬ－１２、ＥＸ２１エキソソーム、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１５、ＥＸ２１エキソソーム、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１８、ＥＸ２１エキソソーム、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１２、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１５、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１８、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１２、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＥＸ２１エキソソーム；ＩＬ－１５、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＥＸ２１エキソソーム；ＩＬ－１８、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＥＸ２１エキソソーム；ＩＬ－１２、ＦＣ２１フィーダー細胞、ＰＭ２１粒子、およびＥＸ２１エキソソーム；ＩＬ－１５、ＦＣ２１フィーダー細胞、ＰＭ２１粒子、およびＥＸ２１エキソソーム；ＩＬ－１８、ＦＣ２１フィーダー細胞、ＰＭ２１粒子、およびＥＸ２１エキソソーム；ＩＬ－１２、ＩＬ１５、ＥＸ２１エキソソーム、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＥＸ２１エキソソーム、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＥＸ２１エキソソーム、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＥＸ２１エキソソーム、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１２、ＩＬ１５、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１２、ＩＬ１５、ＥＸ２１エキソソーム、およびＦＣ２１フィーダー細胞；ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＥＸ２１エキソソーム、およびＦＣ２１フィーダー細胞；ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＥＸ２１エキソソーム、およびＦＣ２１フィーダー細胞；ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＥＸ２１エキソソーム、およびＦＣ２１フィーダー細胞；ＩＬ－１２、ＥＸ２１エキソソーム、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１５、ＥＸ２１エキソソーム、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１８、ＥＸ２１エキソソーム、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１２、ＩＬ１５、ＥＸ２１エキソソーム、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＥＸ２１エキソソーム、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＥＸ２１エキソソーム、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＰＭ２１粒子；ならびにＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＥＸ２１エキソソーム、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＰＭ２１粒子を含む方法である。

【0049】

メモリーＮＫ細胞の数を増加させる開示された方法の各ステップは、インビトロ、インビボ、またはエキソビボで起こり得ることが理解され、本明細書において企図される。すなわち、１つ以上のサイトカインによるＮＫ細胞の予備活性化は、インビトロ、インビボ、またはエキソビボで起こり得る。同様に、予備活性化ＮＫ細胞とＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、および／またはＦＣ２１フィーダー細胞との接触は、インビトロ、インビボ、またはエキソビボで起こり得る。また、メモリー様ＮＫ細胞の休止は、ＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、および／またはＦＣ２１フィーダー細胞の存在下で起こり得る。追加的に、ステップがインビトロ、エクスビボ、またはインビボのいずれで起こるかは、特定のステップの前後のステップとは完全に無関係であることが理解される。例えば、予備活性化はインビトロまたはエクスビボで起こり得るが、予備活性化ＮＫ細胞とＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、および／またはＦＣ２１フィーダー細胞との接触はインビボで起こる。代替的には、予備活性化、ＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、および／またはＦＣ２１フィーダー細胞との接触、および休止は、すべてインビトロまたはエクスビボで起こり得る。追加的に、予備活性化ＮＫ細胞は、同種移植手順、半合致移植手順またはインビボ免疫療法手順において、ＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、および／またはＦＣ２１フィーダー細胞と接触させることができる。いくつかの態様では、同種移植、半合致移植またはインビボ免疫療法におけるＮＫ刺激エキソソームの使用が、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を引き起こすことはない

【0050】

一態様では、開示された方法は、選択されていない末梢血単核球の集団から得られたＮＫ細胞など、任意のドナー供給源から得られたＮＫ細胞と共に使用され得ることが本明細書において企図される。いくつかの例において、メモリー様ＮＫ細胞の数を増加させるための開示されたキットにおいて使用されるＮＫ細胞のためのドナー源はまた、ＮＫ細胞のためのレシピエントであり得る。したがって、ＮＫ細胞は、自己由来のものであってもよい。他の例において、ＮＫ細胞のためのドナー供給源は、半合致または同種ドナーの供給源であってもよい。一態様では、ＮＫ細胞の供給源は、ＮＫ細胞前駆細胞が見出され得る任意の供給源（これらに限定されないが、誘導多能性幹細胞および胚性幹細胞などの臍帯血もしくは幹細胞供給源、またはあらゆる初期段階のＮＫ細胞前駆細胞など）であり得る。

【0051】

休止期間は、ＮＫ細胞が腫瘍に再導入されるか、または腫瘍部位でサイトカインによって再刺激されるときに、迅速かつ活発なＩＦＮ－γの産生が可能になることによって、結果として生じるメモリー様ＮＫ細胞に利益をもたらし得ることが理解される。サイトカインの再刺激時または腫瘍に導入された後の腫瘍部位での迅速かつ活発なＩＦＮ－γの産生を有する値は３倍であり、１）ＮＫ細胞が、エフェクター分子を使い果たすことはない（ＩＦＮ－γおよびグランザイムの両方）、２）ＮＫ細胞は循環中においてより長く持続する、および３）ＩＦＮ－γの増加による抗腫瘍作用が腫瘍を標的とし、全身性炎症が少ない。したがって、一態様において、本明細書で開示されるのは、増殖ステップｂ）の後に、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、または２１日間メモリー様ＮＫ細胞を休止させることをさらに含む、メモリー様ＮＫ細胞の数を増加させる方法である。

【0052】

一態様では、ステップ間またはステップ後に細胞を洗浄することによって、サイトカインおよび／またはＮＫ細胞エフェクター剤粒子への曝露をより正確に制御すること、または開示される方法の後続ステップの汚染もしくはメモリー様ＮＫ細胞の使用を防ぐことができることは理解されよう。洗浄は、これに限定されないが、遠心分離し、許容される洗浄液に再懸濁し、その後最後に培地に再懸濁し、培養液を簡単に流し出した後、許容可能な媒体で１回以上すすぐサイクルなど、当技術分野において許容される任意の様式で起こり得、洗浄は、培養温度、室温、または冷洗浄（例えば、氷上または冷蔵遠心分離機）で行われる。洗浄は、血清（例えば、ウシ胎児血清）の有無にかかわらず、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはＮＫ細胞を培養するための任意の適切な培地（例えば、ＣＥＬＬＧＲＯ（登録商標）ＧＭＰ培地、Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、最小必須培地（ＭＥＭ）、イーグルＭＥＭ（ＥＭＥＭ））、Ｘ－ＶＩＶＯ ２０（商標）など）で達成され得る。したがって、一態様では、本明細書において開示されるのは、ＮＫ細胞の数を増加させる方法であって、ａ）少なくとも１つのＮＫ細胞を少なくとも１つ以上の刺激性サイトカインと接触させることによってＮＫ細胞を予備活性化することと、ｂ）細胞を、ＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、またはＦＣ２１フィーダー細胞と接触させることによって、ステップａ）の予備活性化ＮＫ細胞を増殖させることと、を含み、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＩＬ－１８による予備活性化後にＮＫ細胞を洗浄すること、および／またはＮＫ細胞エフェクター剤を含む１つ以上の小胞（すなわち、ＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、および／またはＦＣ２１フィーダー細胞）による増殖後ＮＫ細胞を洗浄することをさらに含む。

【0053】

開示された方法は、代替的方法によって達成された数を著しく超えて、メモリー様ＮＫ細胞の数の驚くべき増加をもたらす。図１に示すように、刺激性サイトカインによる予備活性化とそれに続くＰＭ２１粒子との接触による予備活性化細胞の増殖は、１５日間で１０，０００倍を超えてＮＫ細胞の数を増大させた。これは、Ｋ５６２－ｍｂ２１フィーダー細胞による増殖に対して８倍の増加、またはＰＭ２１粒子単独による増殖に対して１００倍の増加である。したがって、一態様では、本明細書において開示されているのは、メモリー様ＮＫセルの数を増加させる方法であり、この方法は、少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８日以内に、ＮＫ細胞の少なくとも５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、または１５０００倍の増加をもたらす。一態様では、増加は、フィーダー細胞の増殖またはＰＭ２１粒子単独に対するものであり得る。したがって、開示された方法は、単独でのＫ５６２フィーダー細胞刺激増殖に対して、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５倍の増加をもたらし得、単独でのＰＭ２１粒子刺激増殖に対して、少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００、１１０、１２０、１２５、１３０、１４０、１５０、１７５、または２００倍の増加をもたらし得ることが理解され、本明細書において企図される。

【0054】

Ｃ．組成物
開示された組成物を調製するために使用される成分、ならびに本明細書に開示された方法において使用される組成物自体が開示される。これらおよび他の材料は本明細書に開示されており、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などが開示されている場合、これらの化合物の各々の多様な個々および集団の組み合わせおよび順列の具体的参照は、明示的に開示されていないことがあり、それぞれが本明細書において具体的に企図され、記載されていることが理解される。例えば、特定のサイトカイン（例えば、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、またはＩＬ－１８）、ＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、またはＦＣ２１フィーダー細胞が開示され、論じられている場合、およびサイトカイン（例えば、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、またはＩＬ－１８）、ＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、またはＦＣ２１フィーダー細胞などの複数の分子に対してなされ得るいくつかの修飾が論じられている場合、特に企図されるのは、サイトカイン（例えば、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、またはＩＬ－１８）、ＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、またはＦＣ２１フィーダー細胞の各々およびあらゆる組み合わせおよび順列、ならびに具体的に逆であることが示されない限り可能な修飾である。したがって、あるクラスの分子Ａ、Ｂ、およびＣが開示されている場合、ならびにあるクラスの分子Ｄ、Ｅ、およびＦならびに組み合わせ分子Ａ～Ｄの例が開示されている場合、それぞれが個別に列挙されていなくても、それぞれは個別にかつ集合的にＡ～Ｅ、Ａ～Ｆ、Ｂ～Ｄ、Ｂ～Ｅ、Ｂ～Ｆ、Ｃ～Ｄ、Ｃ～Ｅ、およびＣ～Ｆの組み合わせが開示されていると見なされることを意味することが企図される。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせもまた開示されている。したがって、例えば、Ａ～Ｅ、Ｂ～Ｆ、およびＣ～Ｅのサブグループは開示されていると見なされる。この概念は、開示された組成物を製造および使用する方法におけるステップを含むがこれらに限定されない、本出願のすべての態様に適用される。したがって、実行することができる様々な追加のステップが存在する場合、これらの追加のステップの各々は、開示された方法の任意の特定の実施形態または実施形態の組み合わせを用いて実行され得ることが理解される。

【0055】

メモリー様ＮＫ細胞の数を増加させる開示された方法は、例えば、ＰＭ２１粒子、ＦＣ２１フィーダー細胞、および／またはＥＸ２１エキソソームなど、ＮＫ細胞エフェクター剤を含む小胞と組み合わせて１つ以上のサイトカイン（例えば、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、および／またはＩＬ－１８）を利用する。開示された方法で利用される構成要素を、開示された方法を容易に実行できるパッケージで提供することが有利であることが理解され、本明細書において企図される。

【0056】

したがって、一態様では、本明細書に開示されるのは、１つ以上のサイトカイン（例えば、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５および／またはＩＬ－１８）およびＮＫ細胞エフェクター剤を含む１つ以上の小胞を含むメモリー様ＮＫ細胞の数を増加させるためのキットである。一態様では、小胞は、ＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、および／またはＦＣ２１フィーダー細胞であり得る。例えば、開示されたキットは、ＩＬ－１２およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１５およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１８およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１２およびＥＸ２１エキソソーム、ＩＬ－１５およびＥＸ２１エキソソーム；ＩＬ－１８およびＥＸ２１エキソソーム；ＩＬ－１２およびＦＣ２１フィーダー細胞；ＩＬ－１５およびＦＣ２１フィーダー細胞；ＩＬ－１８およびＦＣ２１フィーダー細胞；ＩＬ－１２、ＩＬ１５、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１２、ＩＬ１５、およびＥＸ２１エキソソーム；ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、およびＥＸ２１エキソソーム；ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、およびＥＸ２１エキソソーム；ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、およびＥＸ２１エキソソーム；ＩＬ－１２、ＩＬ１５、およびＦＣ２１フィーダー細胞；ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、およびＦＣ２１フィーダー細胞；ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、およびＦＣ２１フィーダー細胞；ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、およびＦＣ２１フィーダー細胞；ＩＬ－１２、ＥＸ２１エキソソーム、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１５、ＥＸ２１エキソソーム、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１８、ＥＸ２１エキソソーム、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１２、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１５、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１８、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１２、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＥＸ２１エキソソーム；ＩＬ－１５、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＥＸ２１エキソソーム；ＩＬ－１８、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＥＸ２１エキソソーム；ＩＬ－１２、ＦＣ２１フィーダー細胞、ＰＭ２１粒子、およびＥＸ２１エキソソーム；ＩＬ－１５、ＦＣ２１フィーダー細胞、ＰＭ２１粒子、およびＥＸ２１エキソソーム；ＩＬ－１８、ＦＣ２１フィーダー細胞、ＰＭ２１粒子、およびＥＸ２１エキソソーム；ＩＬ－１２、ＩＬ１５、ＥＸ２１エキソソーム、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＥＸ２１エキソソーム、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＥＸ２１エキソソーム、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＥＸ２１エキソソーム、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１２、ＩＬ１５、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１２、ＩＬ１５、ＥＸ２１エキソソーム、およびＦＣ２１フィーダー細胞；ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＥＸ２１エキソソーム、およびＦＣ２１フィーダー細胞；ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＥＸ２１エキソソーム、およびＦＣ２１フィーダー細胞；ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＥＸ２１エキソソーム、およびＦＣ２１フィーダー細胞；ＩＬ－１２、ＥＸ２１エキソソーム、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１５、ＥＸ２１エキソソーム、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１８、ＥＸ２１エキソソーム、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１２、ＩＬ１５、ＥＸ２１エキソソーム、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＥＸ２１エキソソーム、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＥＸ２１エキソソーム、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＰＭ２１粒子；またはＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＥＸ２１エキソソーム、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＰＭ２１粒子を含み得る。

【0057】

小胞（例えば、ＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、および／またはＦＣ２１フィーダー細胞）に含まれるＮＫ細胞エフェクター剤は、４－１ＢＢＬ、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＩＬ－７、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＵＬＢＰ２、ＩＣＡＭ－１、２Ｂ４、ＢＣＭ１／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、Ｊａｇｇｅｄ１、Ｊａｇｇｅｄ２、デルタ様１（Ｄｌｌ１）、デルタ様３（Ｄｌｌ３）、デルタ様４（Ｄｌｌ４）、Ｐｒｅｆ－１、ＤＮＥＲ、Ｊｅｄｉ、ＳＯＭ－１１、ｗｉｎｇｌｅｓｓ、ＣＣＮ３、ＭＡＧＰ２、ＭＡＧＰ１、ＴＳＰ２、ＹＢ－１、ＥＧＦＬ７、ＣＣＲ７、ＤＡＰ１２、およびＤＡＰ１０からなるＮＫ細胞エフェクター剤の群から選択され得ることが理解され、本明細書において企図される。

【0058】

開示されたキットは、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、および／またはＩＬ－１８に加えてサイトカインを含み得ることが理解され、本明細書において企図される。したがって、一態様においては、４－１ＢＢＬ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－７、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＵＬＢＰ２、ＩＣＡＭ－１、２Ｂ４、ＢＣＭ１／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、Ｊａｇｇｅｄ１、Ｊａｇｇｅｄ２、デルタ様１（Ｄｌｌ１）、デルタ様３（Ｄｌｌ３）、デルタ様４（Ｄｌｌ４）、Ｐｒｅｆ－１、ＤＮＥＲ、Ｊｅｄｉ、ＳＯＭ－１１、ｗｉｎｇｌｅｓｓ、ＣＣＮ ３、ＭＡＧＰ２、ＭＡＧＰ１、ＴＳＰ２、ＹＢ－１、ＥＧＦＬ７、ＣＣＲ７、ＤＡＰ１２、およびＤＡＰ１０をさらに含むＮＫ細胞の数を増加させるためのキットである。

【0059】

一態様において、開示されたキットは、末梢血単核細胞の非選択集団から得られたＮＫ細胞など、ドナー供給源から得られたＮＫ細胞と共に使用され得ることが本明細書において企図される。いくつかの例において、メモリー様ＮＫ細胞の数を増加させるための開示されたキットにおいて使用されるＮＫ細胞のためのドナー源はまた、ＮＫ細胞のためのレシピエントであり得る。したがって、ＮＫ細胞は、自己由来のものであってもよい。他の例において、ＮＫ細胞のためのドナー供給源は、半合致または同種ドナーの供給源であってもよい。

【0060】

キット中にＮＫ細胞を提供することが有益である例が存在することが本明細書においてさらに企図される。したがって、一態様では、ＮＫ細胞またはＮＫ細胞株をさらに含むメモリー様ＮＫ細胞の数を増加させるためのキットが本明細書に開示されている。

本出願は例えば以下の発明も提供する。
[１] ａ）少なくとも１つのＮＫ細胞を少なくとも１つ以上の刺激性サイトカインと接触させることによってＮＫ細胞を予備活性化することと、ｂ）ステップａ）の予備活性化ＮＫ細胞を、ＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、またはＦＣ２１フィーダー細胞と接触させることにより増殖させることと、を含む、メモリー様ＮＫ細胞の数を増加させるための方法。
[２] 前記ＮＫ細胞が末梢血単核球の非選択集団から得られる、上記[１]に記載の方法。
[３] 前記少なくとも１つ以上の刺激性サイトカインが、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＩＬ－１８からなる群から選択される、上記[１]に記載の方法。
[４] 前記ＮＫ細胞を３つの刺激性サイトカインと接触させることを含む、上記[３]に記載の方法。
[５] 前記ＮＫ細胞を４－１ＢＢＬ、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＵＬＢＰ２、ＩＣＡＭ－１、２Ｂ４、ＢＣＭ１／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、Ｊａｇｇｅｄ１、Ｊａｇｇｅｄ２、デルタ様１（Ｄｌｌ１）、デルタ様３（Ｄｌｌ３）、デルタ様４（Ｄｌｌ４）、Ｐｒｅｆ－１、ＤＮＥＲ、Ｊｅｄｉ、ＳＯＭ－１１、ｗｉｎｇｌｅｓｓ、ＣＣＮ３、ＭＡＧＰ２、ＭＡＧＰ１、ＴＳＰ２、ＹＢ－１、ＥＧＦＬ７、ＣＣＲ７、ＤＡＰ１２、およびＤＡＰ１０からなる群から選択されるサイトカインと接触させることをさらに含む、上記[３]に記載の方法。
[６] 前記ＮＫ細胞を、インビトロ、インビボ、またはエキソビボで前記ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、またはＩＬ－１８と接触させる、上記[１]に記載の方法。
[７] 前記ＮＫ細胞を、約６～約２４時間の間、前記１つ以上の刺激性サイトカインと接触させる、上記[１]に記載の方法。
[８] 前記ＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、またはＦＣ２１フィーダー細胞が、膜挿入ペプチドに連結した１つ以上の刺激性ペプチドを含む、上記[１]に記載の方法。
[９] 前記膜挿入サイトカインが、脂質二重層に対して親和性を有する膜挿入が可能な融合ペプチドを含み、前記融合ペプチドがＩＧ４、ＣＤ４、またはそれらの組み合わせのセグメントを含む、上記[８]に記載の方法。
[１０] 膜挿入ペプチドに連結した前記１つ以上の刺激性サイトカインが、組換えＤＮＡによりコードされた融合タンパク質である、上記[８]に記載の方法。
[１１] 前記膜挿入ペプチドが、ヒトＦｃ、ＧＰＩ、膜貫通Ｔ細胞受容体、またはｐＨＬＩＰを含む、上記[８]に記載の方法。
[１２] 前記１つ以上の刺激性ペプチドが、４－１ＢＢＬ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＵＬＢＰ２、ＩＣＡＭ－１、２Ｂ４、ＢＣＭ１／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、Ｊａｇｇｅｄ１、Ｊａｇｇｅｄ２、デルタ様１（Ｄｌｌ１）、デルタ様３（Ｄｌｌ３）、デルタ様４（Ｄｌｌ４）、Ｐｒｅｆ－１、ＤＮＥＲ、Ｊｅｄｉ、ＳＯＭ－１１、ｗｉｎｇｌｅｓｓ、ＣＣＮ３、ＭＡＧＰ２、ＭＡＧＰ１、ＴＳＰ２、ＹＢ－１、ＥＧＦＬ７、ＣＣＲ７、ＤＡＰ１２、およびＤＡＰ１０からなる群から選択される、上記[８]に記載の方法。
[１３] 前記ＮＫ細胞を、インビトロ、インビボ、またはエキソビボで前記ＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、またはＦＣ２１フィーダー細胞と接触させる、上記[１]に記載の方法。
[１４] ステップａの前記ＮＫ細胞を、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４５、または６０日間、ＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、またはＦＣ２１フィーダー細胞と接触させる、上記[１]に記載の方法。
[１５] ステップｂ）の後に前記増殖メモリー様ＮＫ細胞を休止させることをさらに含む、上記[１]に記載の方法。
[１６] 前記細胞がメモリー様ＮＫ細胞であり、少なくとも１、２、３、４、５日間／１、２、３、４、５日以下の間休止している、上記[１５]に記載の方法。
[１７] ＮＫ細胞の供給源がＮＫ細胞前駆体供給源であり、前記ＮＫ細胞前駆体供給源が臍帯血、誘導多能性幹細胞、および胚性幹細胞からなる群から選択される、上記[１]に記載の方法。
[１８] １つ以上のサイトカインおよびＮＫ細胞エフェクター剤を含む１つ以上の小胞を含むメモリー様ＮＫ細胞の数を増加させるためのキット。
[１９] 前記１つ以上のサイトカインが、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＩＬ－１８からなる群から選択される、上記[１８]に記載のキット。
[２０] ＮＫ細胞エフェクター剤を含む前記１つ以上の小胞が、ＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、またはＦＣ２１フィーダー細胞である、上記[１８]に記載のキット。
[２１] 前記ＮＫ細胞エフェクター剤が、－１ＢＢＬ、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＵＬＢＰ２、ＩＣＡＭ－１、２Ｂ４、ＢＣＭ１／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、Ｊａｇｇｅｄ１、Ｊａｇｇｅｄ２、デルタ様１（Ｄｌｌ１）、デルタ様３（Ｄｌｌ３）、デルタ様４（Ｄｌｌ４）、Ｐｒｅｆ－１、ＤＮＥＲ、Ｊｅｄｉ、ＳＯＭ－１１、ｗｉｎｇｌｅｓｓ、ＣＣＮ３、ＭＡＧＰ２、ＭＡＧＰ１、ＴＳＰ２、ＹＢ－１、ＥＧＦＬ７、ＣＣＲ７、ＤＡＰ１２、およびＤＡＰ１０からなる群から選択される、上記[２０]に記載のキット。

【図1】