(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-11-14
(45)【発行日】2023-11-22
(54)【発明の名称】細胞培養方法及びマイクロファイバ
(51)【国際特許分類】
C12N 5/07 20100101AFI20231115BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20231115BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231115BHJP
【ＦＩ】
C12N5/07
C12M1/00 A
C12N5/10
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2020120604
(22)【出願日】2020-07-14
(62)【分割の表示】P 2015233256の分割
【原出願日】2015-11-30
(65)【公開番号】P2020171317
(43)【公開日】2020-10-22
【審査請求日】2020-08-06
【審判番号】
【審判請求日】2022-05-26
(73)【特許権者】
【識別番号】801000049
【氏名又は名称】一般財団法人生産技術研究奨励会
(74)【代理人】
【識別番号】100116207
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 俊明
(74)【代理人】
【識別番号】100096426
【弁理士】
【氏名又は名称】川合 誠
(72)【発明者】
【氏名】竹内 昌治
(72)【発明者】
【氏名】興津 輝
(72)【発明者】
【氏名】池田 和弘
【合議体】
【審判長】福井 悟
【審判官】飯室 里美
【審判官】牧野 晃久
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１１／０４６１０５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】ＩＫＥＤＡ Ｋ． ｅｔ ａｌ．，３Ｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｉＰＳＣｓ ｉｎ ｈｙｄｒｏｇｅｌ ｃｏｒｅ－ｓｈｅｌｌ ｍｉｃｒｏｆｉｂｅｒｓ，ＭＥＭＳ ２０１５， Ｅｓｔｏｒｉｌ， ＰＯＲＴＵＧＡＬ，２０１５年０１月，ｐ．４６３－４６４
【文献】池田 和弘 他，コアシェルマイクロファイバをもちいたマウスｉＰＳ細胞のフィーダーフィリー三次元培養法，日本分子生物学会 第３７回日本分子生物学会年会，２０１４年，［３Ｐ－０６０９］
【文献】ＡＭＩＭＯＴＯ Ｎ． ｅｔ ａｌ．，ＴＩＳＳＵＥ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ： Ｐａｒｔ Ａ，２０１１年，Ｖｏｌ．１７ Ｎｏ．１５，ｐ．２０７１－２０７８
【文献】ＣＬＡＡＳＳＥＮ Ｄ． Ａ． ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００９年，７６，ｐ．７２２－７３２
【文献】友田 紀一郎，多能性幹細胞：Ｎａｉｖｅ型とＰｒｉｍｅｄ型多能性，生化学，２０１８年，第９０巻第２号，ｐ．１８７－１９１
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
C12N5/00
ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＣＡｐｌｕｓ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞培養方法であって、（ａ）プライム型多能性幹細胞を含むコア部分と、該コア部分を被覆する管状のアルギン酸ゲルを有するシェル部分とを備えるマイクロファイバを製造する工程と、
（ｂ）ＲＯＣＫ阻害剤を添加した培地中で、前記プライム型多能性幹細胞を前記マイクロファイバの内部で培養し、分化多能性を維持した状態で前記プライム型多能性幹細胞の断面形状及び外径が前記マイクロファイバによって制御された細胞塊になるまで増殖させ、凝集させる工程と、
を含む、細胞培養方法。
【請求項2】
前記プライム型多能性幹細胞は、ヒトｉＰＳ細胞であり、培養開始時の前記ヒトｉＰＳ細胞の密度は、１×１０7 〔ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〕以上である請求項１に記載の細胞培養方法。
【請求項3】
前記マイクロファイバを溶融し、前記プライム型多能性幹細胞を回収する工程を更に含む請求項１又は２に記載の細胞培養方法。
【請求項4】
回収された前記プライム型多能性幹細胞を内部に含むマイクロファイバを製造することによって、前記プライム型多能性幹細胞を内部に含むマイクロファイバを継代する工程を更に含む請求項３に記載の細胞培養方法。
【請求項5】
前記プライム型多能性幹細胞を内部に含むマイクロファイバを凍結して、前記プライム型多能性幹細胞をマイクロファイバ内で保存する工程を更に含む請求項１～４のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
【請求項6】
前記プライム型多能性幹細胞を内部に含むマイクロファイバを分化誘導培地内で培養することによって、前記プライム型多能性幹細胞をマイクロファイバ内で分化誘導する工程を更に含む請求項１～５のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
【請求項7】
プライム型多能性幹細胞を含むコア部分と、該コア部分を被覆する管状のアルギン酸ゲルを有するシェル部分とを備えるマイクロファイバであって、前記プライム型多能性幹細胞は、ＲＯＣＫ阻害剤を添加した培地中で前記マイクロファイバの内部で培養され、分化多能性が維持された状態で、前記プライム型多能性幹細胞の断面形状及び外径が前記マイクロファイバによって制御された細胞塊を形成している、マイクロファイバ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、細胞培養方法及びマイクロファイバに関するものである。
【背景技術】
【0002】
従来、ヒトｉＰＳ細胞等のｉＰＳ細胞は、無限の増殖能と、すべての体細胞に分化し得る能力を有するので、再生医療等に使用される細胞ソースとして期待されているが、再生医療等に使用するためにはｉＰＳ細胞が大量に必要となり、そのためには三次元培養系が向いていると言われている。そこで、細胞の三次元培養方法が提案されている（例えば、特許文献１及び２並びに非特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【文献】特許第５６３３０７７号公報
【文献】特許第５６７４４４２号公報
【非特許文献】
【0004】
【文献】Kazuhiro Ikeda, Teru Okitsu, Hiroaki Onoe, and Shoji Takeuchi,“3D Culture of Mouse IPSCS in Hydrogel Core-Shell Microfibers”MEMS 2015, Estoril, PORTUGAL, 18-22 January, 2015, pp.463-464.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
しかしながら、前記従来の細胞培養方法では、ヒトｉＰＳ細胞等のプライム型多能性幹細胞を安定的に効率よく増殖させることは、困難であった。
【0006】
ここでは、前記従来の細胞培養方法の問題点を解決して、マイクロファイバ内でプライム型多能性幹細胞を培養することによって、プライム型多能性幹細胞を安定的かつ大量に増殖させることができる細胞培養方法及びマイクロファイバを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
そのために、細胞培養方法においては、プライム型多能性幹細胞を含むコア部分と、該コア部分を被覆する管状のアルギン酸ゲルを有するシェル部分とを備えるマイクロファイバを製造する工程と、ＲＯＣＫ阻害剤を添加した培地中で、前記プライム型多能性幹細胞を前記マイクロファイバの内部で培養し、分化多能性を維持した状態で前記プライム型多能性幹細胞の断面形状及び外径が前記マイクロファイバによって制御された細胞塊になるまで増殖させ、凝集させる工程とを含む。
【0009】
更に他の細胞培養方法においては、さらに、前記プライム型多能性幹細胞は、ヒトｉＰＳ細胞であり、培養開始時の前記ヒトｉＰＳ細胞の密度は、１×１０7 〔ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〕以上である。
【0010】
更に他の細胞培養方法においては、さらに、前記マイクロファイバを溶融し、前記プライム型多能性幹細胞を回収する工程を更に含む。
【0011】
更に他の細胞培養方法においては、さらに、回収された前記プライム型多能性幹細胞を内部に含むマイクロファイバを製造することによって、前記プライム型多能性幹細胞を内部に含むマイクロファイバを継代する工程を更に含む。
【0012】
更に他の細胞培養方法においては、さらに、前記プライム型多能性幹細胞を内部に含むマイクロファイバを凍結して、前記プライム型多能性幹細胞をマイクロファイバ内で保存する工程を更に含む。
【0013】
更に他の細胞培養方法においては、さらに、前記プライム型多能性幹細胞を内部に含むマイクロファイバを分化誘導培地内で培養することによって、前記プライム型多能性幹細胞をマイクロファイバ内で分化誘導する工程を更に含む。
【0014】
また、マイクロファイバにおいては、プライム型多能性幹細胞を含むコア部分と、該コア部分を被覆する管状のアルギン酸ゲルを有するシェル部分とを備えるマイクロファイバであって、前記プライム型多能性幹細胞は、ＲＯＣＫ阻害剤を添加した培地中で前記マイクロファイバの内部で培養され、分化多能性が維持された状態で、前記プライム型多能性幹細胞の断面形状及び外径が前記マイクロファイバによって制御された細胞塊を形成している。
【発明の効果】
【0015】
本開示によれば、プライム型多能性幹細胞を安定的に効率よく増殖させることができる。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】本実施の形態における製造直後の中空マイクロファイバを示す写真である。
【図2】本実施の形態におけるＲＯＣＫ阻害剤の添加の有無による結果を示す写真である。
【図3】本実施の形態におけるＤａｙ４の中空マイクロファイバとその生存率を示す写真である。
【図4】本実施の形態における３種類のヒトｉＰＳ細胞を示す写真である。
【図5】本実施の形態における低細胞密度の中空マイクロファイバを示す写真である。
【図6】本実施の形態におけるヒトｉＰＳ細胞の回収工程を示す写真である。
【図7】本実施の形態におけるＤａｙ４のヒトｉＰＳ細胞の生存率を示すグラフである。
【図8】本実施の形態におけるヒトｉＰＳ細胞の増殖率を示すグラフである。
【図9】本実施の形態におけるＤａｙ４のヒトｉＰＳ細胞の増殖率とコラーゲンゲル濃度及び細胞密度との関係を示すグラフである。
【図10】本実施の形態におけるヒトｉＰＳ細胞の増殖率と培養日数との関係を示すグラフである。
【図11】本実施の形態におけるヒトｉＰＳ細胞の増殖率と継代のタイミングとの関係を示すグラフである。
【図12】本実施の形態における４日おきに継代を繰り返して培養したヒトｉＰＳ細胞の増殖率と培養日数との関係を示すグラフである。
【図13】本実施の形態における１ヶ月以上培養されたヒトｉＰＳ細胞の核型を示す写真である。
【図14】本実施の形態における１ヶ月以上培養されたヒトｉＰＳ細胞の未分化マーカーを示す写真である。
【図15】本実施の形態における分化誘導中の中空マイクロファイバを示す写真である。
【図16】本実施の形態におけるヒトｉＰＳ細胞の自発的な空洞化を示す写真である。
【図17】本実施の形態における１ヶ月以上培養後、分化誘導されたヒトｉＰＳ細胞が三胚葉に分化することを示す写真である。
【図18】本実施の形態におけるヒトｉＰＳ細胞が三次元分化誘導されることを外胚葉マーカー免疫染色で示す写真である。
【図19】本実施の形態における凍結保存された後に解凍されたヒトｉＰＳ細胞を示す写真である。
【図20】本実施の形態における凍結保存された後に解凍されたヒトｉＰＳ細胞の生存率を示すグラフである。
【図21】本実施の形態における凍結保存された後に解凍されたヒトｉＰＳ細胞が増殖することを示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【0017】
以下、実施の形態について図面を参照しながら詳細に説明する。
【0018】
図１は本実施の形態における製造直後の中空マイクロファイバを示す写真である。
【0019】
本実施の形態において、中空マイクロファイバは、コア部分と該コア部分を被覆する鞘状のシェル（被覆）部分とを備え、前記コア部分が中空なものであるが、該コア部分に流体、ゲル等が充填されたものをも含むものである。具体的には、特許文献１に記載されたマイクロファイバと同様のものであって、高強度ハイドロゲルで被覆されたマイクロゲルファイバを含むものである。該マイクロゲルファイバは、典型的には、アルギン酸ゲル、マトリゲル、コラーゲンゲル等のゲルであるコア部分と、高強度ハイドロゲルを含むシェル部分とを含むコア・シェル構造を有している。
【0020】
なお、本実施の形態における中空マイクロファイバの場合、コア部分は、必ずしもゲルである必要はなく、液体培地等の粘性の低い流体であってもよい。また、前記シェル部分は、高強度ハイドロゲルやコート剤による被覆が多層に形成されている多層被覆であってもよい。例えば、２種類以上の異なる強度を有する高強度ハイドロゲルで２層以上の被覆が形成されていてもよい。
【0021】
さらに、前記中空マイクロファイバの内径、すなわち、シェル部分の内径は、例えば、１００〔ｎｍ〕～１０００〔μｍ〕程度であるが、かかる数値範囲に限定されるものではない。また、前記中空マイクロファイバの断面形状は、円形が望ましいが、楕円形でもよいし、四角形や五角形等の多角形であってもよい。さらに、前記中空マイクロファイバの長さは、例えば、数〔ｍｍ〕～数十〔ｍ〕程度であるが、かかる数値範囲に限定されるものではない。さらに、前記中空マイクロファイバの外径、すなわち、シェル部分の外径は、例えば、２００〔ｎｍ〕～２０００〔μｍ〕程度であるが、かかる数値範囲に限定されるものではない。
【0022】
また、本実施の形態において、前記中空マイクロファイバ内で培養される細胞は、プライム型多能性幹細胞である。該プライム型多能性幹細胞には、例えば、ウシｉＰＳ細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞等、マウス、ラットなどのげっ歯類を除く全てのｉＰＳ細胞及びＥＳ細胞が含まれるが、図に示される実験例において使用されたプライム型多能性幹細胞は、ヒトｉＰＳ細胞であり、より具体的には、４０９Ｂ２：エピソーマルベクターによる樹立細胞、４５４Ｅ２：センダイウイルスベクターによる樹立細胞、及び、ＴｋＤＮ３－４：ウイルスベクターによる樹立細胞の３種類のヒトｉＰＳ細胞である。
【0023】
本実施の形態における実験例では、まず、ヒトｉＰＳ細胞を内部に含む中空マイクロファイバが製造された。該中空マイクロファイバの製造方法は、特許文献１に記載されたマイクロファイバの製造方法に従っている。具体的には、特許文献１の「発明の詳細な説明」において段落「００３７」以降に示された「実施例」中で段落「００４１」に記載されている例３の製造方法に従っているが、以下の（ａ）～（ｃ）の点で異なっている。
（ａ）Ｑcoreを２５〔μＬ／ｍｉｎ〕とし、Ｑshell を７５〔μＬ／ｍｉｎ〕とした点
（ｂ）コア部分の流体に含まれる細胞をヒトｉＰＳ細胞とし、その密度を１×１０6 ～１×１０8 〔ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〕とした点
（ｃ）コア部分の流体として、コラーゲンゲル（細胞外マトリクス（ＥＣＭ））、アルギン酸ゲル（細胞外マトリクスを含まない）、マトリゲル（人工基底膜マトリックス）、及び、液体培地（ゲルを含まない）を使用した点
このような製造方法に従って製造された直後の中空マイクロファイバであって、ヒトｉＰＳ細胞が内部（コア部分）に含まれる中空マイクロファイバ、すなわち、ヒトｉＰＳ細胞ファイバの写真が図１に示されている。
（ａ）Ｑcoreを２５〔μＬ／ｍｉｎ〕とし、Ｑshell を７５〔μＬ／ｍｉｎ〕とした点
（ｂ）コア部分の流体に含まれる細胞をヒトｉＰＳ細胞とし、その密度を１×１０6 ～１×１０8 〔ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〕とした点
（ｃ）コア部分の流体として、コラーゲンゲル（細胞外マトリクス（ＥＣＭ））、アルギン酸ゲル（細胞外マトリクスを含まない）、マトリゲル（人工基底膜マトリックス）、及び、液体培地（ゲルを含まない）を使用した点
このような製造方法に従って製造された直後の中空マイクロファイバであって、ヒトｉＰＳ細胞が内部（コア部分）に含まれる中空マイクロファイバ、すなわち、ヒトｉＰＳ細胞ファイバの写真が図１に示されている。
【0024】
図１において、第１行（上段）は、ヒトｉＰＳ細胞の密度が１×１０7 〔ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〕であるものを示し、第２行（下段）は、ヒトｉＰＳ細胞の密度が１×１０8 〔ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〕であるものを示している。また、左側から順に、第１列は内部に、ヒトｉＰＳ細胞とともに、アルギン酸ゲルが収容されたものを示し、第２列は内部に、ヒトｉＰＳ細胞とともに、液体培地が収容されたものを示し、第３列は内部に、ヒトｉＰＳ細胞とともに、マトリゲルが収容されたものを示し、第４列は内部に、ヒトｉＰＳ細胞とともに、コラーゲンゲルが収容されたものを示している。なお、本実施の形態において示される例において、コラーゲンは、株式会社高研が販売するＡｔｅｌｏＣｅｌｌ（Ｒ）の細胞培養用コラーゲン酸性溶液Ｉ－ＰＣ（ウシＩ型コラーゲン）５〔ｍｇ／ｍＬ〕を使用した（使用時には、中性化するために４〔ｍｇ／ｍＬ〕にし、更に培地で希釈することで１～４〔ｍｇ／ｍＬ〕にする。）。
【0025】
続いて、実験例では、ヒトｉＰＳ細胞の培養が行われた。
【0026】
図２は本実施の形態におけるＲＯＣＫ阻害剤の添加の有無による結果を示す写真、図３は本実施の形態におけるＤａｙ４の中空マイクロファイバとその生存率を示す写真、図４は本実施の形態における３種類のヒトｉＰＳ細胞を示す写真、図５は本実施の形態における低細胞密度の中空マイクロファイバを示す写真である。
【0027】
ヒトｉＰＳ細胞が内部に収容された中空マイクロファイバは、プラスチック等の皿状の容器に収容された培地に浸され、これにより、ヒトｉＰＳ細胞の培養が行われた。
【0028】
培養において使用された培地には、その作成直後に、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ－２７６３２）が添加された。図２には、ＲＯＣＫ阻害剤が添加された場合（左側）、及び、ＲＯＣＫ阻害剤が添加されなかった場合（右側）の、ヒトｉＰＳ細胞ファイバの写真が示されている。ＲＯＣＫ阻害剤が添加された場合には、中空マイクロファイバ内でヒトｉＰＳ細胞が増殖して凝集したことが示されている。一方、ＲＯＣＫ阻害剤が添加されなかった場合には、細胞死が高頻度で発生し、ヒトｉＰＳ細胞は増殖しなかった。
【0029】
培養の結果、中空マイクロファイバ内でヒトｉＰＳ細胞同士が凝集して接着し、俵型の細胞塊や、紐状の細胞塊が形成された。このように、ヒトｉＰＳ細胞同士が凝集して形成された細胞塊の断面形状及び直径乃至外径は、中空マイクロファイバの内部の断面形状及び内径によって規定される。すなわち、前記細胞塊の断面形状及び直径は、中空マイクロファイバによって制御される。そして、前記細胞塊に対し、中空マイクロファイバ内に収容された状態のままで、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄアッセイ（生細胞を緑に染色し、死細胞を赤に染色するアッセイ）が行われた。これにより、すべてのヒトｉＰＳ細胞ファイバにおいて、高い割合でヒトｉＰＳ細胞が生存していることが確認された。したがって、過剰な凝集に起因する細胞死を避けつつ、ヒトｉＰＳ細胞を高い増殖率で増殖させることができた、と言える。
【0030】
図３には、培養開始から４日後（Ｄａｙ４）のヒトｉＰＳ細胞ファイバの写真が示されている。図３において、図１と同様に、第１行は、培養開始時のヒトｉＰＳ細胞の密度が１×１０7 〔ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〕であるものを示し、第２行は、培養開始時のヒトｉＰＳ細胞の密度が１×１０8 〔ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〕であるものを示している。また、左側から順に、第１列は内部に、ヒトｉＰＳ細胞とともに、アルギン酸ゲルが収容されたものを示し、第２列は内部に、ヒトｉＰＳ細胞とともに、液体培地が収容されたものを示し、第３列は内部に、ヒトｉＰＳ細胞とともに、マトリゲルが収容されたものを示し、第４列は内部に、ヒトｉＰＳ細胞とともに、コラーゲンゲルが収容されたものを示している。
【0031】
また、４０９Ｂ２：エピソーマルベクターによる樹立細胞、４５４Ｅ２：センダイウイルスベクターによる樹立細胞、及び、ＴｋＤＮ３－４：ウイルスベクターによる樹立細胞の３種類のヒトｉＰＳ細胞のすべてについて、培養されたことが確認された。図４には、培養された３種類のヒトｉＰＳ細胞ファイバの写真（左側から順に、４０９Ｂ２、４５４Ｅ２及びＴｋＤＮ３－４の写真）が示されている。
【0032】
なお、中空マイクロファイバ内に収容されるヒトｉＰＳ細胞の密度が低密度である場合、具体的には、培養開始時のヒトｉＰＳ細胞の密度が１×１０6 〔ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〕以下の場合には、図５に示されるように、ヒトｉＰＳ細胞は、増殖せずに死んでしまった。図５には、培養開始時のヒトｉＰＳ細胞の密度が１×１０6 〔ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〕の場合における培養開始直後（Ｄａｙ０）及び１２日後（Ｄａｙ１２）のヒトｉＰＳ細胞ファイバの写真（左側から順に、Ｄａｙ０及びＤａｙ１２の写真）が示されている。
【0033】
このように、実験例において、ヒトｉＰＳ細胞は、中空マイクロファイバ内で培養され、増殖し、凝集する。これにより、ヒトｉＰＳ細胞が凝集した俵型や紐状の細胞塊であって、断面形状及び外径が中空マイクロファイバによって制御された細胞塊を形成することができた。
【0034】
続いて、実験例では、培養されたヒトｉＰＳ細胞の回収が行われた。なお、これ以降に示される実験例においては、１種類のヒトｉＰＳ細胞、すなわち、４０９Ｂ２のみが使用されている。これは、４０９Ｂ２は、京都大学で樹立された一般的なヒトｉＰＳ細胞であって、ゲノムへの遺伝子挿入がないのでヒト受精卵から樹立されるヒトＥＳ細胞に近く、ヒト多能性幹細胞全般のモデルになるからである。
【0035】
図６は本実施の形態におけるヒトｉＰＳ細胞の回収工程を示す写真、図７は本実施の形態におけるＤａｙ４のヒトｉＰＳ細胞の生存率を示すグラフ、図８は本実施の形態におけるヒトｉＰＳ細胞の増殖率を示すグラフ、図９は本実施の形態におけるＤａｙ４のヒトｉＰＳ細胞の増殖率とコラーゲンゲル濃度及び細胞密度との関係を示すグラフである。
【0036】
中空マイクロファイバ内で培養されたヒトｉＰＳ細胞を回収する場合、図６に示されるように、アルギン酸リアーゼによって中空マイクロファイバのシェル部分を構成するアルギン酸ゲルを溶かし、ヒトｉＰＳ細胞が凝集した俵型や紐状の細胞塊を回収した。すなわち、中空マイクロファイバを溶融して細胞塊を回収した。続いて、アキュターゼによって回収した細胞塊において、細胞同士の結合を乖離させた。図６には、左側から順に、中空マイクロファイバ内で培養されたヒトｉＰＳ細胞の写真、アルギン酸リアーゼによる５〔ｍｉｎ〕の処理の後に中空マイクロファイバのシェル部分を構成するアルギン酸ゲルが溶けた状態のヒトｉＰＳ細胞の細胞塊の写真、及び、アキュターゼ（細胞乖離ならばアキュターゼでなくてもよい）による５〔ｍｉｎ〕の処理の後に細胞同士の結合が乖離したヒトｉＰＳ細胞の写真が示されている。
【0037】
このようにして回収されたヒトｉＰＳ細胞の生存率は、図７に示されるように、９０〔％〕前後と高いことが確認された。図７においては、縦軸に培養開始から４日後（Ｄａｙ４）のヒトｉＰＳ細胞の生存率が示され、横軸にコア部分の種類毎のヒトｉＰＳ細胞の密度が示されている。コア部分の種類、すなわち、ヒトｉＰＳ細胞とともに中空マイクロファイバ内に収容されたものの種類は、左側から順に、アルギン酸ゲル（Ａｌｇ）、液体培地（Ｈｏｌｌｏｗ）、マトリゲル（ＭＧ）及びコラーゲンゲル（Ｃｏｌ）である。また、培養開始時のヒトｉＰＳ細胞の密度は、コア部分の各種類毎に、１×１０7 〔ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〕及び１×１０8 〔ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〕である。
【0038】
また、図８に示されるように、コア部分の種類がコラーゲンゲルである場合に、ヒトｉＰＳ細胞の増殖率が高くなることが確認された。図８においては、縦軸には、Ｄａｙ０を１とした場合の増殖倍率が示され、横軸には、図７と同様に、コア部分の種類毎のヒトｉＰＳ細胞の密度が示されている。
【0039】
そこで、図９に示されるように、中空マイクロファイバ内に収容されたコラーゲンゲルの濃度の変化に対応するヒトｉＰＳ細胞の増殖率の変化が確認された。図９においては、縦軸には、図８と同様に、Ｄａｙ０を１とした場合の増殖倍率が示され、横軸には、ヒトｉＰＳ細胞の密度毎のコラーゲンゲルの濃度が示されている。培養開始時のヒトｉＰＳ細胞の密度は、左側から順に、１×１０7 〔ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〕及び１×１０8 〔ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〕である。また、コラーゲンゲルの濃度は、ヒトｉＰＳ細胞の密度毎に、０〔ｍｇ／ｍＬ〕、１〔ｍｇ／ｍＬ〕及び４〔ｍｇ／ｍＬ〕である。なお、コラーゲンゲルの濃度が０〔ｍｇ／ｍＬ〕という状態は、コア部分の種類が液体培地（Ｈｏｌｌｏｗ）である状態と同じである。
【0040】
図９に示されるように、コラーゲンゲルの濃度が０～４〔ｍｇ／ｍＬ〕の範囲において、ヒトｉＰＳ細胞の増殖が確認された。また、コラーゲンゲルの濃度が１〔ｍｇ／ｍＬ〕である場合に増殖率が最も高くなることが確認された。
【0041】
続いて、実験例では、ヒトｉＰＳ細胞ファイバからヒトｉＰＳ細胞ファイバへの継代が行われた。
【0042】
図１０は本実施の形態におけるヒトｉＰＳ細胞の増殖率と培養日数との関係を示すグラフ、図１１は本実施の形態におけるヒトｉＰＳ細胞の増殖率と継代のタイミングとの関係を示すグラフ、図１２は本実施の形態における４日おきに継代を繰り返して培養したヒトｉＰＳ細胞の増殖率と培養日数との関係を示すグラフ、図１３は本実施の形態における１ヶ月以上培養されたヒトｉＰＳ細胞の核型を示す写真、図１４は本実施の形態における１ヶ月以上培養されたヒトｉＰＳ細胞の未分化マーカーを示す写真である。
【0043】
ヒトｉＰＳ細胞ファイバからヒトｉＰＳ細胞ファイバへの継代は、図６に示されるような回収工程によって回収されたヒトｉＰＳ細胞を希釈し、新たな中空マイクロファイバ内に封入することにより、行われた。この場合、中空マイクロファイバ内に、ヒトｉＰＳ細胞とともに、収容されたものは、１〔ｍｇ／ｍＬ〕のコラーゲンゲルである。
【0044】
図１０に示されるように、増殖されたヒトｉＰＳ細胞の細胞数は、Ｄａｙ１で一旦低下した後、Ｄａｙ２で初期細胞数にまで復帰し、Ｄａｙ４で大きく上昇し、Ｄａｙ６で最大となることが確認された。図１０においては、縦軸には、Ｄａｙ０を１とした場合の増殖倍率が示され、横軸には、増殖開始からの経過日数が示されている。
【0045】
そこで、最適な継代のタイミングが、Ｄａｙ４以降の範囲で検討された。そして、図１１に示されるように、Ｄａｙ４以降では継代後の増殖率が低下することが判明したので、最適な継代のタイミングはＤａｙ４である、と判断された。図１１においては、縦軸には、Ｄａｙ０を１とした場合の増殖倍率が示され、横軸には、継代のタイミング毎の継代前の増殖期間及び継代後の増殖期間が示されている。継代のタイミング毎の継代前の増殖期間及び継代後の増殖期間は、左側から順に、継代のタイミングがＤａｙ４の場合にＤａｙ０～４及びＤａｙ４～８、継代のタイミングがＤａｙ６の場合にＤａｙ０～６及びＤａｙ６～１２、継代のタイミングＤａｙ８の場合にＤａｙ０～８及びＤａｙ８～１６である。また、黒地のバーグラフは継代前の増殖率を示し、白地のバーグラフは継代後の増殖率を示している。
【0046】
そして、このような継代を繰り返すことによって、図１２に示されるように、長期に亘り、具体的には、１ヶ月以上の期間に亘り、効率的にヒトｉＰＳ細胞の増殖が行われることが確認された。図１２においては、縦軸には、Ｄａｙ０を１とした場合の増殖倍率が示され、横軸には、増殖開始からの経過日数が示されている。
【0047】
また、このような継代を繰り返し、長期に亘って、具体的には、５４日に亘って培養されたヒトｉＰＳ細胞の核型の写真が、図１３に示されている。これにより、５４日に亘って培養されたヒトｉＰＳ細胞が正常な核型を示すことが確認された。
【0048】
さらに、図１４には、１ヶ月以上に亘って培養されたヒトｉＰＳ細胞の未分化マーカーの写真が示されている。なお、図１４において、左側の縦１列に並んだ写真は、ＲＴ－ＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応））による未分化マーカーを示し、右側の縦２列に並んだ写真は、ＩＣＣ及びＡＰ（アルカリホスターゼ）染色による未分化マーカーを示している。これにより、１ヶ月以上に亘って培養されたヒトｉＰＳ細胞において、未分化マーカーの発現が維持されていることが確認された。
【0049】
続いて、実験例では、長期に亘って培養されたヒトｉＰＳ細胞の分化誘導培地での培養が行われた。
【0050】
図１５は本実施の形態における分化誘導中の中空マイクロファイバを示す写真、図１６は本実施の形態におけるヒトｉＰＳ細胞の自発的な空洞化を示す写真、図１７は本実施の形態における１ヶ月以上培養後、分化誘導されたヒトｉＰＳ細胞が三胚葉に分化することを示す写真、図１８は本実施の形態におけるヒトｉＰＳ細胞が三次元分化誘導されることを外胚葉マーカー免疫染色で示す写真、図１９は本実施の形態における凍結保存された後に解凍されたヒトｉＰＳ細胞を示す写真、図２０は本実施の形態における凍結保存された後に解凍されたヒトｉＰＳ細胞の生存率を示すグラフ、図２１は本実施の形態における凍結保存された後に解凍されたヒトｉＰＳ細胞が増殖することを示す写真である。
【0051】
前述のような継代によって１ヶ月以上に亘って培養されたヒトｉＰＳ細胞は、中空マイクロファイバ内に収容されたままで、分化誘導培地（２０〔％〕のＦＳＢ（ウシ胎児血清）を含むＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地））内で培養することによって、図１５に示されるように、中空マイクロファイバの形状のままで分化誘導することができることが確認された。また、図１６に示されるように、内部が自発的な空洞化（内皮細胞系の分化と考えられる）を行うことがあることも確認された。
【0052】
さらに、図１７及び１８に示されるように、分化誘導されたヒトｉＰＳ細胞が三胚葉のマーカーを示すことが確認され、当初のヒトｉＰＳ細胞と同様に生体のいずれの細胞にも分化することができる能力、すなわち、分化多能性（Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）を示すことが確認された。なお、図１７には、左側から順に、外胚葉のＴｕｊ１マーカー、中胚葉のαＳＭＡマーカー及び内胚葉のＡＦＰマーカーの写真が示されている。また、図１８には、三次元的な外胚葉（神経）マーカーの写真が示されている。
【0053】
ところで、従来の細胞培養方法によって培養されたヒトｉＰＳ細胞は、培養皿から剥がした後に遠心処理を施してペレットにし、細胞保存液に懸濁して凍結する必要がある。これに対して、この実験例で培養されたヒトｉＰＳ細胞は、中空マイクロファイバ内に収容されたままで直接細胞保存液に浸し、凍結することによって保存することができた。図１９には、このようにして凍結して保存された中空マイクロファイバ内に収容されたままのヒトｉＰＳ細胞を融解（解凍）した状態の写真が示されている。なお、図１９に示されるのは、融解直後の状態である。
【0054】
また、このようにして融解されたヒトｉＰＳ細胞の生存率は、図２０に示されるように、従来の細胞培養方法によって培養され、凍結され、融解されたヒトｉＰＳ細胞の生存率と同等であることが確認された。図２０において、縦軸には、凍結前を１とした場合の生存率が示され、２Ｄとして、従来の細胞培養方法によって培養され、凍結され、融解されたヒトｉＰＳ細胞の生存率が示され、３Ｄとして、この実験例で培養され、中空マイクロファイバ内に収容されたままで凍結され、融解されたヒトｉＰＳ細胞の生存率が示されている。
【0055】
さらに、このようにして凍結して保存された中空マイクロファイバ内に収容されたままで融解されたヒトｉＰＳ細胞は、そのまま培養されることで増殖することが確認された。図２１には、このようにして培養されて増殖した中空マイクロファイバ内に収容されたままのヒトｉＰＳ細胞の写真が示されている。なお、図２１に示されるのは、融解から４日後の状態である。
【0056】
このように、本実施の形態における中空マイクロファイバを用いた細胞培養方法は、プライム型多能性幹細胞を内部に含む中空マイクロファイバを製造する工程と、プライム型多能性幹細胞を中空マイクロファイバの内部で培養し、増殖させ、凝集させる工程と、を含む方法である。
【0057】
これにより、プライム型多能性幹細胞を容易に、短時間で、高い増殖率で増殖させることができるとともに、過剰な凝集に起因する細胞死を避けることができる。
【0058】
また、凝集したプライム型多能性幹細胞は、断面形状及び外径が中空マイクロファイバによって制御された細胞塊となる。したがって、細胞塊の形状及び大きさを容易に制御することができ、過剰な凝集に起因する細胞死を避けつつ、プライム型多能性幹細胞を高い増殖率で増殖させることができる。
【0059】
さらに、プライム型多能性幹細胞は、コラーゲンゲルとともに、中空マイクロファイバの内部に収容される。この場合、極めて高い増殖率で、プライム型多能性幹細胞を増殖させることができる。
【0060】
さらに、中空マイクロファイバを用いた細胞培養方法は、中空マイクロファイバを溶融し、プライム型多能性幹細胞を回収する工程を更に含む方法である。したがって、増殖させ、凝集させたプライム型多能性幹細胞を、容易に、効率的に回収することができる。
【0061】
さらに、プライム型多能性幹細胞は、凝集した状態で回収された後、細胞同士の結合が乖離される。したがって、回収されたプライム型多能性幹細胞を各種の用途で容易に利用することができる。
【0062】
さらに、中空マイクロファイバを用いた細胞培養方法は、回収されたプライム型多能性幹細胞を内部に含む中空マイクロファイバを製造することによって、プライム型多能性幹細胞を内部に含む中空マイクロファイバを継代する工程を更に含む方法である。これにより、プライム型多能性幹細胞を長期間に亘って効率的に増殖させることができ、大量に増殖させることができる。
【0063】
さらに、中空マイクロファイバを用いた細胞培養方法は、プライム型多能性幹細胞を内部に含む中空マイクロファイバを凍結して、プライム型多能性幹細胞を中空マイクロファイバ内で保存する工程を更に含む方法である。これにより、プライム型多能性幹細胞を容易に保存することができるとともに、必要なときに、容易に再利用することができる。
【0064】
さらに、中空マイクロファイバを用いた細胞培養方法は、プライム型多能性幹細胞を内部に含む中空マイクロファイバを培地に浸して、プライム型多能性幹細胞を中空マイクロファイバ内で分化誘導する工程を更に含む方法である。これにより、プライム型多能性幹細胞を各種の細胞に容易に分化誘導することができる。
【0065】
なお、本明細書の開示は、好適で例示的な実施の形態に関する特徴を述べたものである。ここに添付された特許請求の範囲内及びその趣旨内における種々の他の実施の形態、修正及び変形は、当業者であれば、本明細書の開示を総覧することによって、当然に考え付くことである。
【産業上の利用可能性】
【0066】
本開示は、細胞培養方法及びマイクロファイバに適用することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
