特許 7385471 ＰＨＩ６内部対照組成物、装置、および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-11-14

(45)【発行日】2023-11-22

(54)【発明の名称】ＰＨＩ６内部対照組成物、装置、および方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6848 20180101AFI20231115BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20231115BHJP

   C12N 7/00 20060101ALI20231115BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20231115BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6848 Z ZNA

C12M1/00 A

C12N7/00

C12N15/09 Z

【請求項の数】 13

(21)【出願番号】P 2019519265

(86)(22)【出願日】2017-10-10

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2019-10-17

(86)【国際出願番号】 EP2017075725

(87)【国際公開番号】W WO2018069267

(87)【国際公開日】2018-04-19

【審査請求日】2020-09-14

【審判番号】

【審判請求日】2022-05-06

(31)【優先権主張番号】62/406,166

(32)【優先日】2016-10-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】591003013

【氏名又は名称】エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー

【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ－ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100092624

【弁理士】

【氏名又は名称】鶴田 準一

(74)【代理人】

【識別番号】100114018

【弁理士】

【氏名又は名称】南山 知広

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100108903

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 和広

(72)【発明者】

【氏名】ナンシー シェーンブルナー

(72)【発明者】

【氏名】クワム セファ

(72)【発明者】

【氏名】ティエン ユイ

(72)【発明者】

【氏名】ワン ファンニエン

(72)【発明者】

【氏名】カレン ワン

【合議体】

【審判長】上條 肇

【審判官】藤井 美穂

【審判官】高堀 栄二

(56)【参考文献】

【文献】特表２００２－５１４９０５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１２－０５５３１１（ＪＰ，Ａ）

【文献】Ｌａｂ ｏｎ ａ ｃｈｉｐ， ２０１６，Ｖｏｌ．１６， ｐｐ．１９９－２０７

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

C12N 15/00

ＪＳＴｐｌｕｓ／ＪＭＥＤｐｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＣＡＰｌｕｓ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

キレート剤および保存剤を含み、ｐＨ７～９で核酸増幅反応に適した緩衝液に懸濁された未改変Ｐｈｉ６バクテリオファージを含む内部対照として使用するための組成物であって、前記未改変Ｐｈｉ６バクテリオファージが、１０００～１，０００，０００コピー／ｍｌの濃度で存在する、前記組成物。

【請求項2】

前記緩衝液が、クエン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリシン緩衝液、ＰＩＰＥＳ、またはＨＥＰＥＳから選択される、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

ＢＳＡ、ゼラチン、ポリｒＡ‐ＲＮＡ、グリセロール、アミノ酸、トレハロース、カゼイン、またはポリエチレングリコールを含む群から選択される１種以上の追加の成分をさらに含む、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項4】

前記未改変Ｐｈｉ６バクテリオファージが最大４×１０^５ｃｐ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項5】

前記キレート剤がＥＤＴＡおよびＥＧＴＡから選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項6】

前記保存剤が、アジ化ナトリウムおよびプロクリン３００から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項7】

（ａ）１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のアジ化ナトリウム、２５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、およびそれらに含まれる最大４×１０^５ｃｐ／ｍｌの未改変Ｐｈｉ６バクテリオファージ、または、
（ｂ）１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のアジ化ナトリウム、１％のゼラチン、およびそれらに含まれる最大４×１０^５ｃｐ／ｍｌの未改変Ｐｈｉ６バクテリオファージ、または、
（ｃ）１０ｍＭのトリス、ｐＨ ８．０、０．１ ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のアジ化ナトリウム、および２０ｍｇ／ｌのポリｒＡ‐ＲＮＡ、およびそれらに含まれる最大４×１０^５ｃｐ／ｍｌの未改変Ｐｈｉ６バクテリオファージ、または、
（ｄ）１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のアジ化ナトリウム、２０ｍｇ／ｌのポリｒＡ‐ＲＮＡ、４０％のグリセロール、およびそれらに含まれる最大４×１０^５ｃｐ／ｍｌの未改変Ｐｈｉ６バクテリオファージ
を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項8】

０日目と、４５℃で最大２８日間経過後とのΔＣｔが５～７以下である、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項9】

０日目と、１回以上の凍結融解サイクル後とのΔＣｔが５～７以下である、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項10】

‐ 少なくとも１つの増幅可能な標的核酸配列を含む核酸試料を提供し、
‐ 前記核酸試料を請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物と接触させ、かつ
‐ 増幅反応を開始できる酵素を用いて前記標的核酸配列を増幅すること
を含み、ここで未改変Ｐｈｉ６バクテリオファージ由来の未改変Ｐｈｉ６ＲＮＡが、定性及び／又は定量的核酸検出において、ＲＮＡ標準として逆転写され、及び／又は増幅される、核酸増幅法。

【請求項11】

前記核酸試料がＲＮＡであり、また、
‐ 逆転写を開始できる酵素を用いて前記標的核酸配列を逆転写すること、
をさらに含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記標的核酸配列を逆転写および増幅することが、逆転写および／または増幅反応を開始できる複数種の酵素の組み合わせを用いて、または逆転写および増幅反応を開始できる酵素を用いて実施される、請求項１１の方法。

【請求項13】

（ａ）試料分注品を受け入れるように作られた試料導入口、
（ｂ）請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物を含む内部対照区画、および、
（ｃ）試薬調製、標的の濃縮、阻害物質の除去、核酸抽出、逆転写、増幅、およびリアルタイム検出を含む核酸分析の１つ以上の工程をそれぞれ実行するように構成された、１つ以上の追加区画を備えた核酸分析領域、
を備える、試料中の核酸分析を実施するように構成された装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

核酸増幅法に使用するために、Ｐｈｉ６バクテリオファージを含む組成物が開示される。核酸増幅法を実施するように構成された試料処理装置およびキット（用具一式）も開示され、この装置および／またはキットはＰｈｉ６内部対照組成物を含む。

【背景技術】

【0002】

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、リガーゼ連鎖反応法、ポリメラーゼ・リガーゼ連鎖反応法、間隙‐ＬＣＲ（Gap-LCR）法、修復連鎖反応法、３ＳＲ法、ＮＡＳＢＡ法、鎖置換増幅（ＳＤＡ）法、転写媒介増幅（ＴＭＡ）法およびＱβ‐増幅法など、核酸を増幅するための様々な方法が開発されている。これらの方法はそれぞれ一連の複雑で繊細な工程を含み、また正確で定性分析および／または定量分析には、各工程における変動を注意深く制御することが必要である。管理標準を正確に較正し、それらが分析手順の厳密さに耐えられることも重要である。

【0003】

個人の病気感染を確認する等、生物試料中の核酸の定性的検出は極めて重要であり、そのためには偽陰性および偽陽性の結果を最小限に抑える必要がある。従って、検出用混合物には定性的な内部対照用の核酸が添加されることがある。さらに、生物試料中のウイルスの核酸配列を定量することは、患者のウイルス量、すなわちある時点における所与の患者が保持するウイルス粒子の総量を評価するための重要な手段である。慢性感染症では、ウイルス量はウイルス複製と免疫介入による宿主クリアランスの極めて動的な平衡の関数である。ウイルス量は、診断時のウイルス複製の程度を評価するために使用でき、それは患者の疾患進行および予後の評価を提供する。また、病気の早い段階で抗ウイルス治療の効果を監視し、抗ウイルス治療の変更による影響の迅速な評価にも使用できる。

【0004】

臨床診断に適した核酸の多くはリボ核酸であり、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）、セントルイス脳炎ウイルス（ＳＬＥＶ）、インフルエンザウイルス、ノロウイルスなどのＲＮＡウイルスに由来する核酸である。したがって、試料中の標的核酸の特性を反映させるためにＲＮＡからなる内部対照核酸を使用することが有利となる。ＲＮＡは、アルカリやリボ核酸分解酵素などの影響に対する特有の感受性のためにＤＮＡよりも分解しやすいので、一般にＲＮＡからなる内部対照核酸は外装粒子として提供される。外装ＲＮＡ（Armored RNA（登録商標）、ａＲＮＡ）技術は、バクテリオファージタンパク質の保護用外装で核酸を包むことで、前記核酸を安定化し核酸分解酵素による分解から保護する。（外装ＲＮＡは、米国テキサス州オースティンのAmbion,Inc、およびCenetron Diagnostics LLCによって開発され、米国特許第５，６７７，１２４号、第５，９１９，６２５号および第５，９３９，２６２号に含まれる）。前記ａＲＮＡ構築物は分析中に完全に処理され、常温で安定であり、また比較的ＲＮａｓｅ耐性を持つ。しかし、高温ではａＲＮＡ構築物は急速に分解し分析できなくなる。前記構築物を含む製品の有効期限を延ばすため、製品の出荷後は４℃で貯蔵するため高コストである。それゆえ、定性的および／または定量的核酸検出法で使用するための耐熱性、核酸分解酵素耐性ＲＮＡ標準が必要とされる。

【発明の概要】

【0005】

本明細書で提供されるのは、定性的および／または定量的核酸検出法で使用するための耐熱性、核酸分解酵素耐性ＲＮＡ標準組成物である。本明細書に記載の組成物は、３０℃で１１０日まで、特に４５℃で２８日まで熱的に安定である。したがって本開示は、キレート剤および保存剤を含み、場合によりＢＳＡ、ゼラチン、ポリｒＡ‐ＲＮＡ、グリセロール、アミノ酸、トレハロース、カゼイン、またはポリエチレングリコールから選択される１種以上の追加の成分を含む、ｐＨ７～９の核酸増幅反応に適した緩衝液に懸濁した、Ｐｈｉ６バクテリオファージを含む組成物を提供する。

【0006】

一側面では、キレート剤および保存剤を含む、ｐＨ７～９で核酸増幅反応に適した緩衝液に懸濁した、Ｐｈｉ６を含む組成物を提供する。実施形態によっては、前記緩衝液は、クエン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリシン緩衝液、ＰＩＰＥＳ、またはＨＥＰＥＳから選択される。特定の実施形態によっては、前記緩衝液はトリシン緩衝液である。実施形態によっては、前記組成物は、さらにＢＳＡ、ゼラチン、ポリｒＡ‐ＲＮＡ、グリセロール、アミノ酸、トレハロース、カゼイン、またはポリエチレングリコールを含む群から選択される１種以上の追加の成分を含む。実施形態によっては、前記１種以上の追加の成分は、０～２５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、０～１．０％のゼラチン、０～２０ｍｇ／ｌのポリｒＡ‐ＲＮＡ、または０～４０％のグリセロールから選択される。特定の実施形態によっては、前記１種以上の追加の成分は最大４０％のグリセロールを含む。実施形態によっては、前記Ｐｈｉ６は最大４×１０^５ｃｐ／ｍｌの濃度を含む。実施形態によっては、前記キレート剤はＥＤＴＡおよびＥＧＴＡから選択される。特定の実施形態では、前記組成物は０．０１～１．０ｍＭのＥＤＴＡを含む。特定の実施形態では、前記組成物は０．１０ｍＭのＥＤＴＡを含む。実施形態によっては、保存剤はアジ化ナトリウムおよびプロクリン３００から選択される。特定の実施形態では、前記組成物は０．０１～１．０ｍＭのアジ化ナトリウムを含む。特定の実施形態では、前記組成物は０．０５％のアジ化ナトリウムを含む。

【0007】

実施形態によっては、組成物は以下を含む。（ａ）１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のアジ化ナトリウム、および２５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ中に、最大４×１０^５ｃｐ／ｍｌのＰｈｉ６を含む。または（ｂ）１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のアジ化ナトリウム、および１％のゼラチン中に、４×１０^５ｃｐ／ｍｌのＰｈｉ６を含む。または（ｃ）１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のアジ化ナトリウム、および２０ｍｇ／ｌのポリｒＡ‐ＲＮＡ中に、最大４×１０^５ｃｐ／ｍｌのＰｈｉ６を含む。または（ｄ）１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のアジ化ナトリウム、２０ｍｇ／ｌのポリｒＡ‐ＲＮＡ、および４０％のグリセロール中に、最大４×１０^５ｃｐ／ｍｌのＰｈｉ６を含む。

【0008】

実施形態によっては、前記組成物は４５℃で最大２８日間熱的に安定である。実施形態によっては、前記組成物は３０℃で最大１１０日間、熱的に安定である。実施形態によっては、０日目と４５℃で最大２８日経過後とのΔＣｔは５～７未満である。実施形態によっては、０日目と１回以上の凍結融解サイクル後とのΔＣｔは、５～７未満である。

【0009】

別の側面では、少なくとも１種の増幅可能な標的核酸配列を含む核酸試料を備え、前記核酸試料を上記の実施形態のいずれか１つの組成物と接触させ、そして、増幅反応を開始できる酵素を用いて前記標的核酸配列を増幅することを含む、核酸増幅のための方法が提供される。

【0010】

実施形態によっては、前記核酸試料はＲＮＡであり、逆転写を開始できる酵素を用いて前記標的核酸配列を逆転写する方法をさらに含む。

【0011】

実施形態によっては、前記標的核酸配列の逆転写および増幅は、逆転写および／または増幅反応を開始できる複数の酵素の組み合わせ、または逆転写および増幅反応を開始できる酵素を用いて実施される。実施形態によっては、Ｐｈｉ６バクテリオファージは、定性的および／または定量的核酸検出によっては、ＲＮＡ標準として逆転写および／または増幅される。実施形態によっては、Ｐｈｉ６バクテリオファージは、標的核酸と同じ反応内で逆転写および／または増幅される。実施形態によっては、核酸試料内の標的核酸配列の量は、あらかじめ測定されたＰｈｉ６バクテリオファージの量に基づいて測定される。実施形態によっては、核酸増幅法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。実施形態によっては、核酸増幅法は連結した逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ‐ＰＣＲ）である。実施形態によっては、前記核酸試料は、血漿、全血、尿、糞便、粘液、およびそれらの組み合わせに由来する。実施形態によっては、核酸増幅法はウイルス量分析である。特定の実施形態では、核酸増幅法はウイルス量分析であり、ここで試料はＲＮＡウイルスである。特定の実施形態によっては、ＲＮＡウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）、セントルイス脳炎ウイルス（ＳＬＥＶ）、インフルエンザウイルス、またはノロウイルスである。

【0012】

別の側面では、試料中の核酸分析を実施するように構成された装置が提供され、前記装置は以下を備える。
（ａ）試料分注品（aliquot）を受け入れるように作られた試料導入口。
（ｂ）上記の実施形態のいずれか１種の組成物を含む内部対照区画。および、
（ｃ）試薬調製、標的の濃縮、阻害物質の除去、核酸抽出、逆転写、増幅、およびリアルタイム検出を含む前記核酸分析の１つ以上の工程をそれぞれ実行するように構成された１つ以上の追加区画を備えた核酸分析領域。

【0013】

実施形態によっては、核酸分析はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であるか、またはそれを含む。実施形態によっては、核酸増幅法は、連結した逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ‐ＰＣＲ）であるか、またはそれを含む。実施形態によっては、前記試料は血漿、全血、尿、糞便、粘液、およびそれらの組み合わせを含む。実施形態によっては、試料はユニバーサルトランスポート培地（ＵＴＭ^TM）に懸濁する。実施形態によっては、前記分析はウイルス量分析である。特定の実施形態では、前記分析はウイルス量分析であり、ここで試料はＲＮＡウイルスである。特定の実施形態によっては、ＲＮＡウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）、セントルイス脳炎ウイルス（ＳＬＥＶ）、インフルエンザウイルス、またはノロウイルスである。特定の実施形態では、試料中のウイルス量分析を実施するように構成された装置が提供され、この装置は、試料分注品を受け入れるように作られた試料導入口、本明細書に記載の組成物を含む内部対照区画、および試薬調製、標的の濃縮、阻害物質の除去、核酸抽出、増幅、およびリアルタイム分析を含む１つまたは複数の工程のＰＣＲ分析をそれぞれ実行するように構成された１つまたは複数の追加の区画を備えたＰＣＲ分析領域を備える。

【0014】

また、定性的および／または定量的核酸検出法におけるＲＮＡ標準として、Ｐｈｉ６バクテリオファージを使用することが提供される。本明細書では、定性的および／または定量的核酸検出方法におけるＲＮＡ標準としてＰｈｉ６バクテリオファージを使用することが提供され、このＰｈｉ６バクテリオファージは、キレート剤と防腐剤を含みｐＨ７～９の間で核酸増幅反応に適した緩衝液に懸濁される。また、前記緩衝液がクエン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリシン緩衝液、ＰＩＰＥＳ、またはＨＥＰＥＳ、特にトリシン緩衝液から選択されることが提供される。また、前記緩衝液がＢＳＡ、ゼラチン、ポリｒＡ‐ＲＮＡ、グリセロール、アミノ酸、トレハロース、カゼイン、またはポリエチレングリコールを含む群から選択される１種または複数の追加の成分をさらに含むことが提供される。また、前記１種以上の追加成分が、０～２５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、０～１．０％のゼラチン、０～２０ｍｇ／ｌのポリｒＡ‐ＲＮＡ、または０～４０％のグリセロールから選択され、特に前記１種以上の追加成分が最大４０％のグリセロールを含むことが提供される。また、前記Ｐｈｉ６が最大４×１０^５ｃｐ／ｍｌの濃度で含まれることが提供される。また、前記キレート剤がＥＤＴＡおよびＥＧＴＡから選択されることが提供される。また、前記組成物が０．０１～１．０ｍＭのＥＤＴＡ、特に０．１０ｍＭのＥＤＴＡを含むことが提供される。また、前記防腐剤がアジ化ナトリウムおよびプロクリン３００から選択されることが提供される。また、前記組成物が０．０１～１．０ｍＭアジ化ナトリウム、特に０．０５％のアジ化ナトリウムを含むことが提供される。また、前記緩衝液は、
（ａ）１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％アジ化ナトリウム、および２５ｍｇ／ｍｌＢＳＡ中に、最大４×１０^５ｃｐ／ｍｌのＰｈｉ６を含み、または、
（ｂ）１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％アジ化ナトリウム、および１％ゼラチン中に、４×１０^５ｃｐ／ｍｌのＰｈｉ６を含み、または、
（ｃ）１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％アジ化ナトリウム、および２０ｍｇ／ｌポリｒＡ‐ＲＮＡ中に、最大４×１０^５ｃｐ／ｍｌのＰｈｉ６を含み、または、
（ｄ）１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％アジ化ナトリウム、２０ｍｇ／ｌポリｒＡ‐ＲＮＡ、および４０％グリセロール中に、最大４×１０^５ｃｐ／ｍｌのＰｈｉ６を含む、
ことが提供される。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】Ｐｈｉ６バクテリオファージの構造を示す。

【図2】本明細書に記載の組成物とともに使用できる試料処理装置を示す。

【図3】外装ＲＮＡ組成物の高温における経時的な分解を示す。

【図4a】Ｐｈｉ６組成物の高温における経時的な熱安定性を示す。

【図4b】Ｐｈｉ６組成物の高温における経時的な熱安定性を示す。

【発明を実施するための形態】

【0016】

（定義）
本明細書中で他に定義しない限り、本明細書中で使用する科学的・技術的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。さらに、文脈によって他に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。 冠詞「１つ（ａ）」および「１つ（ａｎ）」は、本明細書では冠詞の文法上の目的語の１つまたは１つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用する。例として、「１つの要素」は１つの要素または２つ以上の要素を意味する。

【0017】

用語「検出する（detect）」、「検出すること（detecting）」、「検出（detection）」、および同様の用語は、程度、量、水準、または何かが発生する確率と同様に、工程またはその存在もしくは不在を発見または決定することを広く指すために用いられる。例えば、標的核酸配列に関して使用する場合の「検出する」という用語は、その存在、不在、水準または量、ならびにその配列の存在または不在の可能性または蓋然性の発見または決定を意味する。当然のことであるが、表現「存在または不在を検出すること」、「存在または不在の検出」および関連表現は定性的および定量的検出を含む。

【0018】

用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドのポリマー（例えば、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド）を指し、天然の核酸（アデノシン、グアニジン、シトシン、ウラシルおよびチミジン）、非天然の核酸、および修飾された核酸を含む。この用語は、ポリマーの長さ（例えば、モノマーの数）によって制限されない。核酸は１本鎖でも２本鎖でもよく、一般に５’‐３’ホスホジエステル結合を含むが、場合によって、ヌクレオチド類似体は他の結合を有してもよい。モノマーは典型的にはヌクレオチドと呼ばれる。「非天然ヌクレオチド」または「修飾ヌクレオチド」という用語は、修飾窒素を含む塩基、糖またはリン酸基を含むか、またはその構造中に非天然部分を有するヌクレオチドを指す。非天然ヌクレオチドの例には、ジデオキシヌクレオチド、ビオチン化、アミノ化、脱アミノ化、アルキル化、ベンジル化および蛍光団標識されたヌクレオチドが含まれる。

【0019】

核酸増幅の１つの方法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であり、その方法は米国特許第４，６８３，２０２号、第４，６８３，１９５号、第４，８００，１５９号、および第４，９６５，１８８号に開示されている。一般的に、ＰＣＲは選択した核酸鋳型（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）に結合する２つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを使用する。核酸分析に有用なプライマーは、標的核酸の核酸配列内の核酸合成の開始点として作用するオリゴヌクレオチドを含む。プライマーは制限酵素分解物から通常の方法で精製、または合成的に製造できる。プライマーは増幅効率を最大化するために１本鎖であることが好ましいが、プライマーは２本鎖でもよい。２本鎖プライマーは最初に変性させる、つまり鎖を分離処理する。２本鎖核酸を変性する１つの方法は加熱である。「熱安定性ポリメラーゼ」は熱的に安定であるポリメラーゼ酵素であり、つまり、それは鋳型に相補的なプライマー伸長物の形成を触媒し、２本鎖鋳型核酸を変性させるのに必要な時間高温にさらされる際不可逆的に変性しない酵素である。一般に、合成は各プライマーの３’末端で開始し、鋳型鎖に沿って５’から３’方向に進む。熱安定性ポリメラーゼは、例えば、テルムス・フラブス(Thermus flavus)、テルムス・ルーバー(T. ruber)、テルムス・テルモフィルス(T. thermophilus)、テルムス・アクアティクス(T. aquaticus)、テルムス・ラクテウス(T. lacteus)、テルムス・ルベンス(T. rubens)、バチルス・ステアロテルモフィルス(Bacillus stearothermophilus)、またはメタノテルムス・フェルウィドゥス(Methanothermus fervidus)から単離される。とはいえ、酵素を補充する条件であれば熱的に安定ではないポリメラーゼもＰＣＲ分析に使用できる。

【0020】

鋳型核酸が２本鎖の場合、それをＰＣＲで鋳型として使用する前に２本の鎖の分離が必要である。鎖の分離は、物理的、化学的または酵素的手段を含む任意の適切な変性方法で達成できる。核酸の鎖を分離する１つの方法は、核酸がほぼ変性するまで（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％を超える変性）核酸を加熱することを含む。鋳型核酸の変性に必要な加熱条件は、例えば、緩衝塩の濃度、変性させる核酸長およびヌクレオチド組成に依存すると考えられるが、一般的には約９０℃～約１０５℃の範囲で、温度および核酸長などの反応の特徴に応じた時間で行う。一般的に、変性は約５秒から９分の間行われる。各ポリメラーゼをそのような高温に長時間さらして機能的な酵素を失う危険性を除くため、変性工程は短いことが好ましい。特定の実施形態では、変性工程は最大３０秒、例えば最大２０秒、最大１０秒、最大５秒、または、特に約５秒である。

【0021】

２本鎖鋳型核酸が熱で変性されると、反応混合物を標的核酸の標的配列に対する各プライマーのアニーリングを促進する温度まで冷却することができる。アニーリング温度は好ましくは約３５℃～約７０℃、さらに好ましくは約４５℃～約６５℃、さらに好ましくは約５０℃～約６０℃、さらに好ましくは約５５℃～約５８℃である。アニーリングの時間は、約１０秒～約１分（例えば、約２０秒～約５０秒、約３０秒～約４０秒）でよい。これに関連し、それぞれの分析の包括性を高めるために異なるアニーリング温度の使用が有利となる場合がある。つまり、これは比較的低いアニーリング温度でプライマーが１塩基だけ適合しない配列を有する標的にも結合する可能性があることを意味し、従ってある配列の変異体も増幅することができる。これは、例えば特定の有機体が検出すべき既知または未知の遺伝的変異を持つ場合などに望ましい。一方、比較的高いアニーリング温度は、より特異性が高くなるという利点がある。何故なら、より高い温度では、正確に一致しない標的配列に対してプライマーが結合する確率が連続的に減少するからである。両者の現象から利益を得るため、本発明の実施形態によっては、上述の工程は異なる温度でアニールすることを含み、好ましくは最初に低い温度、次に高い温度でアニールすることを含むことが好ましい。例えば、最初の培養が５５℃で約５サイクル行われる場合、正確に一致しない標的配列を（予備的に）増幅できる。次いで、実験の大部分で高い特異性を提供するような、例えば５８℃で約４５サイクル行うことができる。このように、特異性は比較的高いままで、潜在的に重要な遺伝的変異体は見逃されない。

【0022】

次いで、ポリメラーゼ活性を促進または最適化する温度に反応混合物を調整する、つまり、アニールしたプライマーから伸長反応が起こり、分析する核酸に相補的な生成物が生成するのに十分な温度に調整する。前記温度は、核酸鋳型にアニールした各プライマーから伸長産物を合成するのに十分な温度にすべきだが、伸長産物が相補的鋳型から変性するほど高くすべきでない（例えば、伸長反応の温度は一般に約４０℃～８０℃の範囲である（例えば、約５０℃～約７０℃、約６０℃））。伸長反応の時間は、約１０秒～約５分、好ましくは約１５秒～２分、さらに好ましくは約２０秒～約１分、さらに好ましくは約２５秒～約３５秒でよい。新たに合成した鎖は、反応の次の工程で使用できる二本鎖分子を形成する。鎖の分離、アニーリング、および伸長反応の工程は、標的核酸に対応する増幅産物を必要量合成するまで、必要に応じて何度も繰り返すことができる。反応における制限因子は、反応中に存在するプライマー、熱安定性酵素、およびヌクレオシド三リン酸エステルの量である。繰り返し工程（すなわち、変性、アニーリング、および伸長反応）は、好ましくは少なくとも１回繰り返される。検出に利用する場合、繰り返し工程の数は例えば試料の性質に依存すると考えられる。試料が核酸の複雑な混合物である場合、検出に十分な標的配列を増幅するためにはさらに繰り返し工程が必要になると考えられる。一般に、繰り返し工程は少なくとも約２０回繰り返されるが、４０、６０、さらには１００回繰り返してもよい。

【0023】

ＰＣＲ分析は、アニーリングおよび伸長反応の工程が同じ工程（一段階ＰＣＲ）、または別々の工程（二段階ＰＣＲ）で実施できる。例えばＺ０５ＤＮＡポリメラーゼのような適切な酵素を用いて、同一の物理的・化学的条件でアニーリングと伸長反応を同時に実施することは、各繰り返し工程における追加工程の時間を節約し、またアニーリングと伸長反応の間で温度調整する必要性を排除するという利点をもたらす。従って、一段階ＰＣＲは各分析の全体的な複雑さを軽減する。

【0024】

一般に、結果を得るまでの時間を短縮し、可能な限り早期の診断につながるので、全体的な増幅はより短い時間で達成されることが好ましい。

【0025】

本明細書中に記載の標準の使用を含む他の好ましい核酸増幅法としては、限定されないが、リガーゼ連鎖反応法（LCR、Wu D. Y. and Wallace R. B., Genomics 4 (1989) 560-69、およびBarany F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 189-193）、ポリメラーゼ・リガーゼ連鎖反応法（Barany F., PCR Methods and Applic. 1 (1991) 5-16）、間隙‐ＬＣＲ法（WO 90/01069）、修復連鎖反応法（EP 0439182 A2）、３ＳＲ法（Kwoh D.Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 1173-1177、Guatelli J.C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 1874-1878、WO 92/08808）、およびＮＡＳＢＡ法（US 5,130,238）が含まれる。また、さらに本明細書中に記載の標準は以下の方法、鎖置換増幅（ＳＤＡ）法、転写媒介増幅（ＴＭＡ）法、およびＱβ‐増幅法（総説については、例えば、Whelen A. C. and Persing D. H., Annu. Rev. Microbiol. 50 (1996) 349-373、Abramson R. D. and Myers T. W., Curr Opin Biotechnol 4 (1993) 41-47を参照）に使用できる。

【0026】

用語「プライマー（primer）」は、適切な条件で核酸ポリメラーゼによるポリヌクレオチド鎖合成の開始点として作用する短い核酸（オリゴヌクレオチド）を示す。一般的に、ポリヌクレオチド合成および増幅反応は、適切な緩衝液、ｄＮＴＰおよび／またはｒＮＴＰ、および１種または複数の任意の補因子を含み、適切な温度で実施される。一般的に、プライマーは、標的配列に対して少なくとも実質的に相補的な１か所以上の標的ハイブリダイズ領域を含む。一般的に、この領域は約１５～約４０ヌクレオチド長である。「プライマー対（primer pair）」とは、標的配列の反対の鎖に相補的であり、標的配列を増幅するように設計された順方向プライマーおよび逆方向プライマー（５’および３’プライマーと呼ばれることもある）を示す。順方向および逆方向プライマーは、標的配列上で互いに増幅可能な距離、例えば約１０～５０００ヌクレオチド、または約２５～５００ヌクレオチド以内に配置される。

【0027】

本明細書中で使用される場合、「プローブ（probe）」とは、特異的な対象である標的生体分子に選択的に結合することができる任意の分子を意味し、例えば、プローブは目的の核酸配列に結合、捕捉またはハイブリダイズする。

【0028】

「相補的」または「相補性」という用語は、ポリヌクレオチド中の核酸が第二のポリヌクレオチド中の別の核酸と塩基対を形成する能力を示す。例えば、配列５’‐Ａ‐Ｇ‐Ｔ‐３’（ＲＮＡの場合５’‐Ａ‐Ｇ‐Ｕ‐３’）は配列３’‐Ｔ‐Ｃ‐Ａ‐５’（ＲＮＡの場合３’‐Ｕ‐Ｃ‐Ａ‐５’）と相補的である。相補性は、一部の核酸のみ塩基対により一致する部分的なものか、または全ての核酸が塩基対により一致する完全なものでもよい。プローブまたはプライマーは標的配列と少なくとも部分的に相補的であれば、標的配列に対して「特異的」であると見なされる。条件によるが、標的配列に対する相補性の程度は、一般的には、プライマーなどの短い核酸のほうが（例えば、８０％超、９０％超、９５％超、またはそれ以上）長い配列よりも高い。

【0029】

用語「増幅条件」または同様の表現は、本明細書中で上記するように、プライマーのハイブリダイゼーションおよび鋳型依存的伸長反応を可能にする核酸増幅反応（例えば、ＰＣＲ増幅）における条件を示す。「アンプリコン（amplicon）」という用語は、標的核酸配列の全てまたは断片を含み、任意の適切な増幅法による試験管内増幅の産物として形成される核酸分子を示す。様々なＰＣＲ条件は、PCR Strategies (Innis et al., 1995, Academic Press, San Diego, CA) at Chapter 14、PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications (Innis et al., Academic Press, NY, 1990)に記載されている。

【0030】

「試料」または「生物試料」という用語は、個体由来の核酸を含む、または含むと推定される任意の組成物を示す。この用語は、細胞、組織、または血液から精製または分離された成分、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、無細胞試料、または細胞分解物を含む。一実施形態では、試料は全血試料である。本明細書中で使用する場合、「全血試料」は血漿または血小板などの成分が除去されていない身体から採取した血液を含む。一般的に、試料は抗凝固剤の添加以外には修飾されない。また、試料は他の種類の生物試料、例えば、血漿、血清、血液成分（軟膜）、および乾燥血斑を示すこともある。また、試料は細胞株を含む個体から得られた細胞の試験管内培養物の構成要素および成分を含んでもよい。さらに、生物試料のさらに具体的な例は、糞便、粘膜スワブ、組織吸引物、組織均質化物、細胞培養物および細胞培養上清（真核生物および原核生物の細胞培養物を含む）、尿、唾液、痰、および脳脊髄試料を含む。

【0031】

本明細書に記載の内部対照組成物は、標的核酸の量の決定に用いる基準となる「定量標準核酸」として働くことができる。この目的のために、定量標準核酸は、標的核酸と共に全ての試料調製工程で処理される。さらに、定量標準核酸は同一の反応混合物内において前記分析法で処理される。それは、標的核酸の存在下または非存在下の両方において、直接的または間接的に検出可能なシグナルを生成しなければならない。この目的のために、定量標準核酸の濃度は、例えば標的濃度が非常に高い場合でも、感度を妨害せず検出可能なシグナルを生成するために各試験で最適化しなければならない。各分析の検出限界（ＬＯＤ、下記参照）に関し、「定量標準核酸」の濃度範囲は、２０～５０００×ＬＯＤ、特に２０～１０００×ＬＯＤ、そして具体的には２０～５０００×ＬＯＤである。反応混合物中の定量標準核酸の最終濃度は、達成された定量測定の範囲に依存する。

【0032】

「検出限界」すなわち「ＬＯＤ」は、試料中の核酸の検出可能な最低量または濃度を意味する。低い「ＬＯＤ」は高感度に対応し、逆も同様である。通常「ＬＯＤ」は単位「ｃｐ／ｍｌ」によって表され、特に核酸がウイルス核酸である場合には、「ｃｐ／ｍｌ」またはＩＵ／ｍｌのいずれかによって表される。「ｃｐ／ｍｌ」は「１ミリリットル当たりの複製数」を意味し、「複製（copy）」は各核酸の複製である。ＩＵ／ｍｌは「国際単位／ｍｌ」を表し、ＷＨＯ規格を示す。

【0033】

ある組成物が「熱的に安定」であるとは、それが中程度の熱に耐えられる場合、例えば、繰り返し回数（サイクル数）の閾値（Ｃｔ）を著しく損失せずに３７～６０℃の温度で２００日間耐えられる場合を示す。リアルタイムＰＣＲでは、蛍光シグナルが蓄積することで陽性反応を検出し、Ｃｔ値は蛍光シグナルが閾値、つまりシグナルが背景水準を上回る点を超えるのに必要なサイクル数として定義される。Ｃｔは試料中の標的核酸の量に反比例する。ΔＣｔは、関心対象の配列のＣｔと内部対照のＣｔの差に対応する。一実施形態では、本明細書に記載の内部対照組成物のΔＣｔは、４５℃で最大２８日間１～３以下であり、より具体的にはΔＣｔは４５℃で最大２８日間１以下である。さらに、本明細書に記載の組成物は、－８０℃～４℃の１回以上の凍結融解サイクル後に熱的に安定である。

【0034】

（組成）
バクテリオファージΦ６（Ｐｈｉ６）は、分節ゲノムおよびエンベロープを有する２本鎖ＲＮＡウイルスである。ａＲＮＡのような１本鎖ＲＮＡゲノムとは異なり、Ｐｈｉ６はタンパク質キャプシドと脂質膜の２層の保護層を有する。これを図１に示す。

【0035】

Ｐｈｉ６は、核酸増幅分析における使用に適した任意の培地中に製剤化できる。一実施形態では、最大約４×１０^５ｃｐ／ｍｌの凍結乾燥Ｐｈｉ６が適切な緩衝液、例えばクエン酸基剤、グリシン基剤、トリシン基剤の緩衝液、ならびにＰＩＰＥＳ、およびＨＥＰＥＳにｐＨ７～９で懸濁される。核酸増幅法ではリン酸緩衝液は避けるべきである。特定の実施形態では、緩衝剤は例えば５～２０ｍＭ、具体的には８～１２．５ｍＭ、そして特に１０ｍＭ、およびｐＨ７～９、具体的にはｐＨ８のトリス‐ＨＣｌである。

【0036】

また、前記製剤はキレート剤、例えばＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ、および保存剤、例えばＮａＮ_３またはプロクリン３００を含んでもよい。特定の実施形態では、前記製剤はＥＤＴＡおよびＮａＮ_３を含む。一実施形態では、キレート剤は０．０１～１．０ｍＭのＥＤＴＡ、例えば０．１ｍＭのＥＤＴＡであり、防腐剤は０．０１～１．０ｍＭのアジ化ナトリウム、例えば０．０５％のＮａＮ_３である。

【0037】

１種以上の追加成分を前記製剤に含んでもよく、限定されないが、０～２５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０～３％のゼラチン、０～１００ｍｇ／ｌのポリＲＮＡ、０～４０％のグリセロール、０～２５ｍｇ／ｍｌの例えばグルタミン等のアミノ酸、トレハロース、カゼイン、５～４０％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などを含んでもよい。

【0038】

特定の実施形態では、内部対照の保存液は１０００～１，０００，０００ｃｐ／ｍｌの凍結乾燥Ｐｈｉ６、より具体的には１００，０００～７５０，０００ｃｐを含むことができる。
表１は、適切なＰｈｉ６製剤の非限定的な例を提示する。

【表1】

【0039】

Ｐｈｉ６組成物は、４５℃で最大２８日間、５０℃で最大１４日間、および３０℃で最大１１０日間安定である。さらに、前記製剤は１回以上の凍結融解サイクル、例えば－８０℃～４℃の間で耐性がある。

【0040】

（分析システムおよび試料処理装置）
本明細書に記載の対照材料は、任意の手動の増幅分析法、または自動化された核酸増幅システムもしくは試料調製システムで使用できる。一実施形態では、対照材料は、限定されないが、the cobas（登録商標） 6800/8800 System、the cobas（登録商標） 4800 System、the cobas（登録商標） AmpliPrep Instrument、the cobas（登録商標） LIAT（登録商標） System、the cobas（登録商標） p630 Instrument、the cobas（登録商標） s201 System、the cobas（登録商標） TaqMan（登録商標） 48 Analyzer、the cobas（登録商標） TaqMan（登録商標） Analyzer、the LightCycler（登録商標） 1536 System、the LightCycler（登録商標） 2.0 System、the LightCycler（登録商標） 480 System、the LightCycler（登録商標） 96 System、the MagNA Pure 96 System、the MagNA Pure Compact System、the MagNA Pure LC 2.0 System、または、the FLOW Solution （例として、www.molecular.roche.com/systemsを参照）を含む、任意の適切な市販のＰＣＲ機器および／または試料調製システムで使用できる。

【0041】

特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、核酸増幅技術を実施するように構成した試料処理装置で使用される。生物試料から抽出した核酸は、上記方法のいずれかを用いて核酸を増幅することでさらに処理できる。特定の実施形態では、有機体から抽出した核酸はＲＮＡであり、それらの処理は、ＴｔｈポリメラーゼとＴａｑポリメラーゼ、または逆転写酵素とＴａｑポリメラーゼなどの酵素の組み合わせを用いた、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ － ＰＣＲ）法を含む。実施形態によっては、切れ目の入った環状核酸プローブをＴ４ＤＮＡリガーゼまたはAmpligase^TMおよびガイド核酸を使用して環状化し、続いて、試験管内選択工程の後に閉環状プローブの形成を検出できる。そのような検出は、当業者に公知の酵素を使用して、ＰＣＲ、ＴＭＡ、ＲＣＡ、ＬＣＲ、ＮＡＳＢＡまたはＳＤＡＲによって実施することができる。例示的な実施形態において、核酸の増幅は、蛍光標識核酸プローブまたはＤＮＡ挿入色素、ならびに核酸増幅の間の蛍光強度の増加を検出できる分子分析装置の光度計または電荷結合素子を用いて、リアルタイムで検出することができる。これらの蛍光標識プローブは、当業者に周知の検出機構（すなわち、TaqMan^TM、molecular beacons^TM、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）プローブ、scorpion^TMプローブ）を使用し、一般的に、特定の核酸の合成または存在を検出するため、蛍光消光と蛍光消光の解除またはレポーター分子間の蛍光エネルギー移動を利用する。

【0042】

一実施形態では、本明細書に開示されている組成物は、微視的尺度から巨視的尺度の流路、反応室、保存容器、検出および処理領域を内蔵する装置で使用される。前記装置は、例えば、米国特許第６，４４０，７２５号、米国特許第６，７８３，９３４号、米国特許第６，８１８，１８５号、米国特許第６，９７９，４２４号、米国特許第８，５８０，５５９号 、および米国特許第８，９４０，５２６号に記載され、Cepheid Corp., Idaho Technology, Inc.、および／またはBiofire Diagnostics, Inc.などから入手可能な装置である、カートリッジ、装置、容器、またはパウチ（小袋）でもよい。

【0043】

例えば、前記装置は、米国特許出願公開第２０１００００５６３８３号の図１に示すように、細胞分解領域、核酸調製領域、第一段階増幅領域、第二段階増幅領域を含む内蔵型核酸分析用パウチでよい。前記パウチは、様々な大きさの様々な流路および膨出部（blister）を備え、試料が系および様々な領域を通って流れ、それに従って処理されるように配置している。試料処理は、パウチ内に配置されたさまざまな膨出部で起きる。処理領域内および処理領域間で試料を移動させる多数の流路が設けられている一方、試料に流体および試薬を送達し、または試料からそのような流体および試薬を除去する他の流路が設けられている。パウチ内の液体は、圧力、例えば空気圧によって膨出部間を移動する。この特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、組成物を収容するように構成され、組成物が試料処理の流れに組み込まれ、それに従って処理されるように１つまたは他の流路および膨出部と流体連結するように構成された内部対照区画に提供される。

【0044】

別の例では、装置は米国特許第９，３２２，０５２号の図３～図５および図９に記載されているような内蔵型核酸分析カートリッジでよい。カートリッジは、とりわけ、試料導入口を通して導入した流体試料を保持する試料室、洗浄溶液を保持する洗浄室、分解試薬を保持する試薬室、分解室、使用済み試料および洗浄液を受け入れる廃棄室、中和剤を保持する中和剤室、およびマスターミックス（例えば、増幅試薬および蛍光プローブ）を保持し、試薬およびプローブを流体試料から分離した検体と混合するマスターミックス室、反応容器、および検出室を含む複数の反応室を備える。この実施形態では、本明細書に記載の組成物は、組成物を収容するように構成され、１つまたは他の流路および膨出部と流体連結するように構成された内部対照区画内に提供される。

【0045】

特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、米国特許第７，７１８，４２１号に記載されたような試料処理装置で実施される。米国特許第７，７１８，４２１号に記載されたような分割化装置は、生物試料を受け取り、保管、処理、かつ／または分析する簡便な容器を備える。特定の実施形態では、分割化装置は複数の処理工程を含む試料処理手順を容易にする。特定の実施形態では、試料は試料装置に収集してもよく、次いで装置は装置およびその内容物を操作して試料を処理する分析装置内に配置される。

【0046】

特定の実施形態は、破断可能なシールで区画に分割されている可撓性装置を含む。個々の区画は、試料を処理する様々な試薬および緩衝剤を含むことができる。保持器具及び駆動装置は、様々な組み合わせ、および様々なタイミングで装置に加えられ、流体の動きを指示し、かつ破断可能なシールを破ることができる。この破断可能なシールを破ることで、内部装置の表面が流体の流れを実質的に妨げることがないようにできる。一実施形態では、生物試料の流れは、処理が進行するにつれて装置の遠位端に向けてもよく、一方、廃液の流れは、試料があった装置の開口部に向かって反対方向に動かしてもよい。最初に試料注入口は固定機構を備えた蓋によって、場合によっては恒久的に密閉することができ、廃液室を蓋の内部に配置して保存用の廃液を受け取ることができる。この方法の大きな利点は、未処理試料が接触した表面と処理済み試料が接触しないことである。その結果、未処理試料に存在する微量の反応抑制剤が装置の壁を覆っても、処理済み試料を汚染する可能性は低い。

【0047】

試料処理装置を図２に示し、それは１６、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、および／または１９０などの複数の区画に構成され、圧縮によって実質的に平らになっている透明な可撓性装置１０を含むことができる。一実施形態では、装置は少なくとも２つの区画を有することができる。一実施形態では、装置は少なくとも３つの区画を有することができる。可撓性装置は、約２～１０５℃における操作上の機能性、試料、標的および試薬との適合性、低い気体透過性、最小の蛍光特性、および／または圧縮および屈曲を繰り返すサイクル中の弾力性を提供できる。装置は様々な材料で作られてよく、限定されない例としてポリプロピレンまたはポリエチレンなどのポリオレフィン、ポリウレタン、ポリオレフィン共重合体、および／または適切な特性を提供する他の材料が含まれる。

【0048】

例示的な実施形態では、１種以上の試薬を乾燥物および／または液体として装置区画内に保存できる。試薬が乾燥物で保存できる実施形態では、溶液を隣接する区画に保存し、試薬溶液の再構成を容易にすることができる。一般的な試薬の例は、分解試薬、溶出緩衝液、洗浄緩衝液、ＤＮａｓｅ阻害剤、ＲＮａｓｅ阻害剤、プロテイナーゼ阻害剤、キレート剤、中和剤、カオトロピック塩溶液、洗剤、界面活性剤、抗凝固剤、発芽溶液、イソプロパノール、エタノール溶液、抗体、核酸プローブ、ペプチド核酸プローブ、およびホスホチオエート核酸プローブを含む。試薬の１種がカオトロピック塩溶液である実施形態では、好ましい成分は、グアニジニウムイソシアネート、またはグアニジニウム塩酸塩、またはそれらの組み合わせである。実施形態によっては、試料が投入される開口部に対して試薬が装置内に貯蔵される順序は、試験管を使用する方法で試薬が使用される順序を反映する。好ましい実施形態では、試薬は試料の予め選択された成分に特異的に結合できる物質を含む。例えば、物質は核酸に特異的に結合してもよく、または核酸プローブが特定の塩基配列を有する核酸に特異的に結合してもよい。

【0049】

装置区画からの信号のリアルタイム検出は、ブロック４９０などのブロックに接続する光度計、分光計、ＣＣＤなどの感知器４９２（図２）を使用することで達成できる。例示的な実施形態では、駆動装置３９２によって圧力が装置区画１９０に加えられ、装置区画１９０の形状を適切に定めることができる。信号の方式は、蛍光のような特定の波長の光の強度、スペクトル、および／または細胞の画像または量子ドットのような人工要素でよい。蛍光検出のため、光学系からの励起光を用いて反応を照射し、放出光を光度計で検出できる。特定の波長を有する複数の信号を検出するために、専用の検出回線または分光計で異なる波長の信号を直列または並列に検出できる。

【0050】

（キット）
実施形態によっては、本明細書に記載の組成物は、キット（用具一式）またはその構成要素に含まれる。本明細書中で意図するキットは、本明細書中に記載されるような標的核酸配列を特異的に増幅、捕捉、標識化／変換または検出するための少なくとも１つの装置を含む任意の製品（例えば、包装物または容器）を含み、本明細書に記載の組成物は、装置に含まれるか、または別個のキット構成要素、バイアルまたは容器として提供される。さらに、キットは取扱説明書、補充試薬、対照材料、および／または本明細書に記載の増幅方法またはその工程で使用される構成要素または部品を含むことができる。１つ以上のキット構成要素を別個の構成要素、例えば一緒に包装された別個のバイアルまたは容器としてキットに含めることができ、または１つ以上のキット構成要素を同じバイアルまたは容器内のキットに含めることができる。

【0051】

そのようなキットは、試料調製手順の間に使用される構成要素、例えば、９６穴または３８４穴型の微量滴定プレート、または例えばEppendorf, Hamburg, Germanyにより製造される通常の試験管、および本明細書に記載の対照材料を用いた核酸増幅を実施するための他の全ての試薬を含むことができる。また、キットは核酸に対する親和性を有する固体支持体、例えばシリカ表面を有する材料を含むことができる。一実施形態では、固体支持体は、例えば磁性ガラス粒子を含む。さらに、または追加的に、キットはプロテアーゼ試薬、および例えば細胞の分解を可能にするカオトロピック剤、洗剤またはアルコールまたはそれらの混合物を含む分解緩衝液を含むことができる。キットのこれらの構成要素は、試験管または保存容器中に別々に提供してもよい。構成要素の性質に応じて、これらは単一の試験管または保存容器に入れて提供してもよい。

【0052】

さらに、つまり追加的に、前記キットは核酸が結合する際の磁性ガラス粒子の洗浄工程に適した洗浄溶液を含むことができる。この洗浄溶液は、緩衝溶液中にエタノールおよび／またはカオトロピック剤を含んでもよく、または上記のようにエタノールおよび／またはカオトロピック剤を含まないｐＨが酸性の溶液を含んでもよい。洗浄溶液または他の溶液は、使用前に希釈しなければならない保存溶液として提供されることが多い。

【0053】

さらに、前記キットは磁性ガラス粒子に結合した核酸を溶出するための溶離剤または溶出緩衝液、すなわち溶液または緩衝液（例えば、１０ｍＭ トリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）または純水を含んでもよい。さらに、核酸の精製に使用する追加の試薬または緩衝溶液があってもよい。

【0054】

特定の実施形態では、前記キットは、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を含む。また、キットは逆転写酵素活性を有する酵素を含んでもよい。別の実施形態では、キットは、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性および逆転写酵素活性を有するポリメラーゼ酵素を含む。

【0055】

（方法および使用）
本明細書に記載の組成物は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）、セントルイス脳炎ウイルス（ＳＬＥＶ）、インフルエンザウイルス、ノロウイルスなどを含むがこれらに限定されない任意のウイルス病原体を分析するために使用できる。また、組成物は他の形態のＲＮＡ、例えば、非ウイルス性生物（例えば、ヒト、細菌など）由来のｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを検出するためにも使用できる。特定の実施形態では、組成物を使用して、ＨＩＶ‐１およびＨＩＶ‐２を含むＨＩＶの任意の病原性株、ならびにその任意の群または亜型、ならびに肝炎またはサイトメガロウイルスを検出できる。例えば、組成物はＨＩＶ‐１のＭ群、Ｎ群、Ｏ群、Ｐ群、およびそれらの組み合わせを分析する分析法に使用できる。特定の例では、組成物はＨＩＶ‐１のＭ群および／またはＯ群、および任意に選択される１種または複数のさらなるＨＩＶ‐１の群を分析するために使用される。これらの組成物は、亜型Ａ、Ａ１、Ａ２、ＣＲＦ１９、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、ＣＲＦ０２＿ＡＧ、Ｈ、ＣＲＦ０４＿ｃｐｘ、Ｊ、Ｋ、およびこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されないＨＩＶ‐１の１種以上の亜型を分析するためにも使用できる。 さらに、この方法はＨＩＶ‐２、Ａ～Ｈ群、特にＨＩＶ‐２Ａ群およびＢ群の検出にも使用できる。さらに、Ａ型、Ｂ型またはＣ型を含むがこれらに限定されない肝炎も本明細書に記載の組成物を使用して分析でき、特にＢ型またはＣ型肝炎を本明細書に記載の組成物を使用して分析できる。

【実施例】

【0056】

（実施例１）
（試料処理装置における全血からのウイルスＲＮＡの単離および検出）
ＲＮＡの単離および配列検出は、可剥性シールで分割され、かつ事前に充填された試薬を含む９つの区画を有する可撓性装置と、その中に収納された廃液保存容器を有する蓋を含む管１（図２）で達成される。装置の１つの区画または小区分から他所への流体の流れは、装置の１つ以上の区画または小区分内に動作可能に接続した１つ以上の駆動装置および保持器具が選択的に係合することで本明細書に記載のように制御される。装置の第１区画は全血試料を受け入れることができる。装置の追加的な区画は以下の構成要素を以下の順序で含む。

【表2】

【0057】

ウイルスＲＮＡの分離と検出のため、１００μｌの全血を第１区画に充填する。次に、装置の蓋を閉め、cobas（登録商標） LIAT（登録商標） Analyzer (Roche Molecular Systems, Pleasanton, CAから入手可能）に挿入される。試料処理は以下の工程を含むことができる。
（１）試料分解。第１の保持器具を除く全ての保持器具は装置上で閉められている。第１区画と動作可能に接続した駆動装置を用いて血液量を区画内で約１００μｌに保持するように調整した後、関連する区画の保持器具を用いて第１区画を閉じる。第２区画と動作可能に接続した駆動装置は、全体的または部分的に、第２区画の第１小区分を圧縮して可剥性シールを破り、対照材料と試料を混合する。第１小区分と動作可能に接続した駆動装置は、小区分を交互に圧縮して対照材料と試料を混合することができる。その区画／小区分内の関連する駆動装置および保持器具を係合させることで、試料は第３区画に移動し、試料が下流の試料と混合するのを防ぐために保持器具が第３区画の上で閉められ、次に第４区画に移動して試料と分解緩衝液を混合する。第３区画と第４区画の混合物を５０℃で２分間培養する。
（２）核酸の捕捉。分解培養後、駆動装置はそれらが対応する区画を交互に圧縮し、混合物を室温で２分間攪拌および培養し、ＤＮＡが粒子に結合するのを促進する。次に、区画に近い磁気源により磁場を発生させ、懸濁溶液中の粒子を捕捉する。駆動装置は、区画を交互に圧縮して粒子を捕獲することができる。駆動装置および保持器具は連続的に開閉され、未結合の試料および廃液を廃液保存容器に移動させる。
（３）洗浄。捕捉工程に続き、洗浄工程を行うことで、粒子および今後試料処理に用いる区画から残留組織片および反応抑制剤を除去する。希釈を利用した洗浄をエタノール洗浄緩衝液で行い、薄層流を利用した洗浄をＭＥＳ洗浄緩衝液で行う。最初に保持器具と駆動装置が開き、次に駆動装置が閉じてエタノール緩衝液が第５区画に移動し、保持器具を閉める。磁場を止め、駆動装置および少なくとも１つの隣接する駆動装置でそれらの対応する区画を交互に圧縮し、粒子を再懸濁する流れを生成する。次に磁場を発生させ、実質的に全ての粒子を捕捉し、液体を廃液保存容器に移動する。最初の洗浄が完了した後、ＭＥＳ洗浄緩衝液をある区画から別の区画に移動させ、対応する駆動装置および保持器具を順次稼働および開放して緩衝液を操作し、流路を通る洗浄緩衝液が実質的に層流になるようにする。洗浄が完了すると、駆動装置および保持器具が閉じられ、実質的に全ての廃液が廃液保存容器に移動する。
（４）核酸の溶出。溶出緩衝液は、前述と同様の手順で第７区画から移動する。磁場を切り、粒子を第４区画と第５区画の間の流れによって溶出緩衝液中に再懸濁する。粒子懸濁液を定常流または撹拌条件のもと９５℃・２分間培養する。磁場を発生させ、実質的に全ての粒子を固定化し、溶出した核酸溶液を稼働装置および保持器具を順次開閉して第７区画に移動させる。駆動装置で第７区画を圧縮し、溶出した核酸溶液の容量を４０μｌに調整し、次いで保持器具を装置に対して閉じてＤＮＡ抽出工程を完了することができる。
（５）核酸の増幅および検出。次いで、核酸溶液を第８区画に移動させ、３７℃で１分間ＵＮＧ２８０と共に混合および培養し、生物試料中に存在する可能性がある、あらゆる混入ＰＣＲ産物を分解する。培養後、温度を９５℃に上げて核酸およびＵＮＧを２分間変性させる。次に、核酸溶液を第９区画に移し、ＲＴ‐ＰＣＲ試薬と６５℃で１０分間混合した後、６０℃で培養してホットスタートＰＣＲを開始する。９５℃で２秒間、および６０℃で１５秒間を５０回繰り返す典型的な２温度増幅分析は、第８区画を９５℃、第９区画を６０℃に設定し、関連する駆動装置を開閉して反応混合液を区画間で交互に移動させることで実施できる。９５℃で２秒間、６０℃で１０秒間、および７２℃で１０秒間を５０回繰り返す典型的な３温度増幅分析は、第７区画を９５℃、第８区画を７２℃、および第９区画を６０℃に設定し、関連する駆動装置を開閉して反応混合液を区画間で交互に移動させることで実施できる。第９室に光学的に接続した光度計などの検出素子は、レポーター色素に由来するリアルタイムの蛍光発光を装置壁の一部を通して監視できる。分析完了後、試験結果が報告される。

【0058】

（実施例２）
（LightCycler 480を用いた試料中のウイルスＲＮＡの単離および検出）
HIV‐1M (50000cp/ml、Roche)の試料を、LightCycler 480 (Roche Molecular Systems)を用いて分析する。試料調製のため、以下の試薬、ReservCyt（Thin Prepから入手可能）、K3 EDTA Plasma、およびPCR neg.（Rocheから入手可能）を希釈剤として使用する。

【0059】

試料をK3 EDTA Plasma中で最終濃度１００ｃｐ／ｍｌに希釈し、一晩保存する（血漿希釈液は－６０℃～－９０℃、PreservCyt希釈液は２～８℃で保存する）。

【0060】

試料（５００μｌ）および希釈剤（３５０μｌ）を手動で深いウェルプレートに加え、三重分析のために各試料を３つの異なるウェルに分注する。５０μｌの内部対照核酸（Ｐｈｉ６対照組成物であり、最大４×１０^５ｃｐ／ｍｌの新たに培養したＰｈｉ６、１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％アジ化ナトリウム、２０ｍｇ／ｌポリｒＡ‐ＲＮＡ、４０％グリセロールを含む）を手動で分注する。試料調製は、米国特許第８，６０９，３４０号の図１に示される方法（その開示全体が参照により本明細書に組み入れられる）に従う作業手順に従って、以下の試薬を使用してHamilton Star (Hamilton, Bonaduz, CH)で行われる。

【表3】

【0061】

最終工程の後、Hamilton Star装置の処理ヘッドは、増幅試薬を含有するそれぞれのマスターミックス（Ｍｍｘ）を各ウェルに添加し（例えば、米国特許第８，６０９，３４０号に開示されているＭｍｘ）、単離した核酸を含む溶液とＭｍｘを混合後、得られた各混合物を微量滴定プレートの対応するウェルに移し増幅を実施する。

【0062】

増幅および検出のため、微量滴定プレートは自動プレート密封機で密封され、プレートはLightCycler 480に移される。以下を特徴とするＰＣＲが使用される。

【表4】

【表5】

【0063】

ＰＣＲサイクルは２つの測定に分けられ、両方の測定は一段階設定（アニーリングと伸長反応を組み合わせる）で行う。１回目に５５℃で５サイクル行い、わずかに適合しない標的配列を予備増幅し包括性を向上させ、一方、２回目の測定の４５サイクルはアニーリング／伸長温度を５８℃にすることで特異性の向上を提供する。

【0064】

（実施例３）
（外装ＲＮＡの熱安定性の評価）
外装ＲＮＡ（ａＲＮＡ）の熱安定性を試験するため、さまざまなロットのｐＥＦ０７０ ａＲＮＡについて耐性試験を実施した（以下のロット、ＰＤ６７０１、ＲＤ４６７５、ＲＤ４６７６、およびＳＶ６６１０を試験した）。所定の濃度で各ロットを分注したものを、ある範囲の温度（４～４５℃）で長期間保管した。結果を図３に示す。０日目は４つのロットすべてのＣｔが約３２．５を示し、時間経過および高い温度で、測定可能なＣｔは急速に低下し、４５℃・４週間で試験した４つのロットのうち３つで完全に失われた。

【0065】

（実施例４）
（Ｐｈｉ６組成物の熱安定性の評価）
Ｐｈｉ６の熱安定性を試験するため、異なる緩衝液中の精製Ｐｈｉ６の培養物について耐性試験を実施した。簡単に説明すると、完全に処理を制御した所定濃度の分注品を、ある範囲の温度（４～４５℃）で長期間保存し、性能（複製数の維持）について評価した。性能はｑＰＣＲにおけるＣｔおよび振幅測定で測定した。

【0066】

濃度設定のため、Ｐｈｉ６を連続希釈して動的領域を作成し、Ｃｔおよび振幅をcobas（登録商標） LIAT（登録商標） analyzerで計算した（ｎ＝３）。プライマー‐プローブ配列および熱サイクル条件の用例を以下に提供する。

【表6】

【表7】

【0067】

Ｃｔが約２９．５～３０．０のものを使用し、表１に提供する各緩衝剤組成物にＰｈｉ６を連続希釈した。ＲＮＡに基づくcobas（登録商標）分析用に、各緩衝液中のＰｈｉ６をＣｔ範囲に希釈した後、各緩衝液の条件で使い捨て滅菌分注品を作製した。次に、これらの使い捨て分注品を４℃、３０℃、３７℃、および４５℃に設定した温度監視可能な培養器に保管した。

【0068】

結果を図４（ａ）に示す（下図はＣｔ、上図は振幅）。試験結果は、トリス緩衝液を使用すると、Ｐｈｉ６バクテリオファージが現在の標準的なａＲＮＡよりもかなり安定であることを示している。加えて、最大４０％のグリセロールの添加は、本加速保管試験においてＰｈｉ６製剤の熱安定性をさらに改善した（図４（ｂ）参照）。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4a】

【図4b】

【配列表】

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