特許 7385603 組換えＡＡＶ生成のためのアニオン交換クロマトグラフィー

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-11-14

(45)【発行日】2023-11-22

(54)【発明の名称】組換えＡＡＶ生成のためのアニオン交換クロマトグラフィー

(51)【国際特許分類】

   C12N 7/02 20060101AFI20231115BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20231115BHJP

   C07K 1/18 20060101ALI20231115BHJP

   C07K 14/075 20060101ALI20231115BHJP

   C07K 1/22 20060101ALI20231115BHJP

   C12N 5/071 20100101ALN20231115BHJP

【ＦＩ】

C12N7/02

C12N7/01

C07K1/18

C07K14/075

C07K1/22

C12N5/071

【請求項の数】 19

(21)【出願番号】P 2020568998

(86)(22)【出願日】2019-06-13

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-10-11

(86)【国際出願番号】 US2019037013

(87)【国際公開番号】W WO2019241535

(87)【国際公開日】2019-12-19

【審査請求日】2022-06-10

(31)【優先権主張番号】62/684,835

(32)【優先日】2018-06-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】518278029

【氏名又は名称】リジェネクスバイオ インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100102118

【弁理士】

【氏名又は名称】春名 雅夫

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100205707

【弁理士】

【氏名又は名称】小寺 秀紀

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(72)【発明者】

【氏名】チャン クレール ジー．

(72)【発明者】

【氏名】レビン ジェフリー

(72)【発明者】

【氏名】ザファール サラ

(72)【発明者】

【氏名】ゲルナー フランツ エム．

【審査官】太田 雄三

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１８－５０７７０７（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１７／１００６７６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１７／１００６７４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１７／１６０３６０（ＷＯ，Ａ２）

【文献】国際公開第２０１７／１６０７０４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２００３－５１８３８０（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１７／１００７０４（ＷＯ，Ａ２）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ ７／００

Ｃ０７Ｋ １／００

Ｃ０７Ｋ １４／００

Ｃ１２Ｎ ５／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

アニオン交換クロマトグラフィー中における、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子とウイルス凝集体との分離を改善するための方法であって、
（ａ）ｒＡＡＶ粒子及びウイルス凝集体を含むフィード組成物を、アニオン交換クロマトグラフィー媒体に、前記ｒＡＡＶ粒子が前記クロマトグラフィー媒体に結合するのを可能にする条件下で接触させること、
（ｂ）直線勾配を用いて前記クロマトグラフィー媒体から前記ｒＡＡＶ粒子を溶出すること、ならびに
（ｃ）溶出された前記ｒＡＡＶ粒子を含む溶出液を回収すること
を含み、
以下：
ａ．前記フィード組成物が、約０．５ｍＭから約５ｍＭの間のＭｇ^２＋濃度を有すること、
ｂ．前記フィード組成物が、約０．５ｍＭから約５ｍＭの間のＫ^＋濃度を有すること、及び
ｃ．前記フィード組成物が、約６．５から約１０．５の間のｐＨを有すること、
によって特徴づけられる、前記方法。

【請求項2】

以下：
ｄ．前記溶出することが、０．１ＣＶ／分から５ＣＶ／分の間の流量で行われること、及び
ｅ．前記直線塩勾配が、約５から約１００ＣＶの間の体積を含むこと
によって特徴づけられる、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記フィード組成物が、約８．２から約９．５の間のｐＨを有することによって特徴づけられる、請求項１または請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記アニオン交換クロマトグラフィー媒体が、４級アミン官能基を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

前記アニオン交換クロマトグラフィー媒体が、モノリスアニオン交換クロマトグラフィーである、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記直線塩勾配が、約０から５００ｍＭの間のＮａＣｌを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

溶出することの前に、結合した前記ｒＡＡＶ粒子を含む前記クロマトグラフィー媒体を洗浄することをさらに含み、洗浄緩衝液が、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＭｇ^２＋を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

溶出することの前に、結合した前記ｒＡＡＶ粒子を含む前記クロマトグラフィー媒体を洗浄することをさらに含み、洗浄緩衝液が、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＫ^＋を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

溶出することの前に、結合した前記ｒＡＡＶ粒子を含む前記クロマトグラフィー媒体を洗浄することをさらに含み、洗浄緩衝液が、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＭｇ^２＋及び約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＫ^＋を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

溶出することの前に、結合した前記ｒＡＡＶ粒子を含む前記クロマトグラフィー媒体を洗浄することをさらに含み、洗浄緩衝液が、８ｍＭのＭｇＣｌ_２及び２．５ｍＭのＫＣｌを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

前記フィード組成物を前記アニオン交換クロマトグラフィー媒体に接触させる前に、前記アニオン交換クロマトグラフィー媒体が、８ｍＭのＭｇＣｌ_２及び２．５ｍＭのＫＣｌを含む緩衝液で平衡化されている、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

前記ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５、及びＡＡＶ－１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶからのカプシドタンパク質を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

前記ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ－８またはＡＡＶ－９血清型のカプシドタンパク質を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

前記Ｍｇ^２＋がＭｇＣｌ_２である、および／または前記Ｋ^＋がＫＣｌである、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

ｒＡＡＶ粒子の収率が少なくとも約８０％である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項16】

前記溶出液中の前記ウイルスカプシドの少なくとも約５０％がｒＡＡＶ粒子である、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項17】

組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を、ｒＡＡＶ粒子及び不純物を含むフィード組成物から単離するための方法であって、
（ａ）前記フィード組成物を、アニオン交換クロマトグラフィー媒体に、前記ｒＡＡＶ粒子が前記クロマトグラフィー媒体に結合するのを可能にする条件下で接触させること、
（ｂ）直線勾配を用いて前記クロマトグラフィー媒体から前記ｒＡＡＶ粒子を溶出すること、及び
（ｃ）溶出された前記ｒＡＡＶ粒子を含む溶出液を回収すること
を含み、
（ｉ）前記不純物が、空のウイルスカプシド、充填不完全なウイルスカプシド、及び／またはウイルス凝集体を含み、
（ｉｉ）前記方法が、以下：
ａ．前記フィード組成物が、約０．５ｍＭから約５ｍＭの間のＭｇ^２＋濃度を有すること、
ｂ．前記フィード組成物が、約０．５ｍＭから約５ｍＭの間のＫ^＋濃度を有すること、及び
ｃ．前記フィード組成物が、約６．５から約１０．５の間のｐＨを有すること
によって特徴づけられ、
任意で前記方法が、以下：
ｄ．前記溶出することが、０．１ＣＶ／分から５ＣＶ／分の間の流量で行われること、及び
ｅ．前記直線塩勾配が、約５から約１００ＣＶの間の体積を含むこと
のうちの１つ以上によってさらに特徴づけられる、前記方法。

【請求項18】

アニオン交換クロマトグラフィー中における、空のまたは充填不完全な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子と完全ｒＡＡＶ粒子との分離を改善するための方法であって、
（ａ）空のｒＡＡＶ粒子、充填不完全なｒＡＡＶ粒子、及び完全ｒＡＡＶ粒子を含むフィード組成物を、アニオン交換クロマトグラフィー媒体に、前記ｒＡＡＶ粒子が前記クロマトグラフィー媒体に結合するのを可能にする条件下で接触させること、
（ｂ）直線勾配を用いて前記クロマトグラフィー媒体から前記ｒＡＡＶ粒子を溶出すること、ならびに
（ｃ）溶出された前記ｒＡＡＶ粒子を含む溶出液を回収すること
を含み、
前記方法が、以下：
ａ．前記フィード組成物が、約０．５ｍＭから約５ｍＭの間のＭｇ^２＋濃度を有すること、
ｂ．前記フィード組成物が、約０．５ｍＭから約５ｍＭの間のＫ^＋濃度を有すること、及び
ｃ．前記フィード組成物が、約６．５から約１０．５の間のｐＨを有すること
によって特徴づけられ、
任意で前記方法が、以下：
ｄ．前記溶出することが、０．１ＣＶ／分から５ＣＶ／分の間の流量で行われること、及び
ｅ．前記直線塩勾配が、約５から約１００ＣＶの間の体積を含むこと
のうちの１つ以上によってさらに特徴づけられる、前記方法。

【請求項19】

前記フィード組成物が、約８．２から約９．５の間のｐＨを有することによって特徴づけられる、請求項１７または請求項１８に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年６月１４日出願の米国仮出願第６２／６８４，８３５号の優先権を主張し、当該出願の全体は本明細書に援用される。

【背景技術】

【0002】

背景
組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベースベクターは、現在最も広く使用されている開発中の遺伝子療法製品である。ｒＡＡＶベクター系の使用が好まれる理由は、部分的には、野生型ウイルスに関連する疾患がないこと、ＡＡＶの形質導入が非分裂細胞にも分裂細胞にも可能であること、及び臨床試験で結果的に長期のロバストな導入遺伝子発現が観察されていることによるものであり、このことは、遺伝子療法の適応症における送達の大きな可能性を示している。加えて、種々の天然及び組換えｒＡＡＶベクター血清型は、種々の組織、器官、及び細胞を特異的に標的とし、ベクターに対する任意の既存の免疫を回避するのに役立ち、そのためＡＡＶベース遺伝子療法の治療応用を拡大する。

【0003】

ただし、ＡＡＶベース遺伝子療法を後期臨床段階及び商業的使用により広く採用できるようになる前には、ＧＭＰに準拠して大規模に機能的ｒＡＡＶ粒子を精製するための新たな方法を開発する必要がある。ウイルスベクターの下流処理に関して研究開発人員が直面する課題の１つは、混入する密接に関連する分子種、例えば、不活性のベクター形態（空の及び充填不完全なウイルスカプシド（生成物関連不純物）、ヘルパーウイルス、ならびに細胞膜小胞を含む）から機能的なウイルス粒子を効率的に分離するのを確実にすることである。生成物関連不純物（例えば、空のまたは充填不完全なカプシド）が機能的なｒＡＡＶ粒子と共有する構造表面の類似性を考慮すると、現在説明されている精製手順を用いて分離することは困難であり、場合によっては不可能であるため、これらの混入物の除去は重大な課題を提起する。治療用組成物中に空の及び充填不完全なカプシドが存在すると、事前に設定された数の導入遺伝子コピーを送達するように設計されている単一の単位用量内で、免疫原性の可能性があるカプシドタンパク質の量が増加するため、生成物関連不純物の除去は非常に重要である。組成物中の空のカプシド及び充填不完全なカプシドを低減することにより、導入遺伝子コピーの単位用量を少量のカプシドタンパク質と共に送達し、それにより、患者がＡＡＶ粒子に対し有害な免疫反応を起こす可能性を低減することができる。したがって、ｒＡＡＶ粒子を単離するためのＧＭＰ準拠処理が必要とされている。

【発明の概要】

【0004】

概要
１つの態様において、本開示は、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子及び不純物（例えば、空の／充填不完全なウイルスカプシドまたはウイルス凝集体）を含むフィード組成物（例えば、ｒＡＡＶアフィニティークロマトグラフィーカラムの溶出液）からｒＡＡＶ粒子を単離するための方法を提供し、これは、当該組成物をアニオン交換クロマトグラフィー樹脂（例えば、４級アミンリガンドを含むモノリスアニオン交換クロマトグラフィー樹脂またはＡＥＸ樹脂）に接触させ、単離されたｒＡＡＶ粒子を含む生成物組成物を回収することによって行われる。

【0005】

別の態様において、本開示は、アニオン交換クロマトグラフィー中における、空のまたは充填不完全な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子と、完全ｒＡＡＶ粒子との分離を改善するための方法を提供し、これは、空の、充填不完全な、及び完全ｒＡＡＶ粒子を含むフィード組成物をアニオン交換クロマトグラフィー樹脂（例えば、４級アミンリガンドを含むＡＥＸ樹脂）に接触させ、単離されたｒＡＡＶ粒子を含む生成物組成物を回収することによって行われる。

【0006】

別の態様において、本開示は、アニオン交換クロマトグラフィー中における、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子とウイルス凝集体との間の分離を改善するための方法を提供し、これは、ｒＡＡＶ粒子及びウイルス凝集体を含むフィード組成物をアニオン交換クロマトグラフィー樹脂（例えば、４級アミンリガンドを含むＡＥＸ樹脂）に接触させ、単離されたｒＡＡＶ粒子を含む生成物組成物を回収することによって行われる。

【0007】

いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、上流処理、例えば、細胞培養物の収集、（例えば、遠心分離もしくは深層濾過による）収集した細胞培養物の清澄化、接着細胞培養物の細胞上清、タンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、無菌濾過、またはこれらの任意の組合せ（複数可）、を含む方法により、フィード組成物を産生することを含む。いくつかの実施形態において、上流処理は遠心分離を含まない。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法はさらに、下流処理ステップ、例えば、タンジェンシャルフロー濾過、カチオン交換クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、及び／または無菌濾過、あるいはこれらの任意の組合せ（複数可）によって生成物組成物を処理することを包含する。さらなる実施形態において、当該方法は、上流処理及び下流処理を含む。上流及び／または下流処理は、単独でも様々な組合せでも使用することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、細胞培養物または細胞培養物上清の収集、深層濾過による収集した細胞培養物の清澄化、第１の無菌濾過、第１のタンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、４級アミンリガンドを用いたモノリスアニオン交換クロマトグラフィーまたはＡＥＸクロマトグラフィー）、第２のタンジェンシャルフロー濾過、及び第２の無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、細胞培養物の収集、深層濾過による収集した細胞培養物または細胞培養物上清の清澄化、第１の無菌濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、４級アミンリガンドを用いたモノリスアニオン交換クロマトグラフィーまたはＡＥＸクロマトグラフィー）、タンジェンシャルフロー濾過、及び第２の無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、深層濾過による収集した細胞培養物または細胞培養物上清の清澄化、第１の無菌濾過、第１のタンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、４級アミンリガンドを用いたモノリスアニオン交換クロマトグラフィーまたはＡＥＸクロマトグラフィー）、第２のタンジェンシャルフロー濾過、及び第２の無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、深層濾過による収集した細胞培養物または細胞培養物上清の清澄化、第１の無菌濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、４級アミンリガンドを用いたモノリスアニオン交換クロマトグラフィーまたはＡＥＸクロマトグラフィー）、タンジェンシャルフロー濾過、及び第２の無菌濾過を含む。

【0008】

いくつかの実施形態において、本開示は以下を提供する。
［１．］組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を、ｒＡＡＶ粒子及び不純物を含むフィード組成物から単離するための方法であって、
（ａ）前記フィード組成物を、アニオン交換クロマトグラフィー媒体に、ｒＡＡＶ粒子が前記クロマトグラフィー媒体に結合するのを可能にする条件下で接触させること、
（ｂ）直線勾配を用いて前記クロマトグラフィー媒体から前記ｒＡＡＶ粒子を溶出すること、及び
（ｃ）溶出された前記ｒＡＡＶ粒子を含む溶出液を回収すること
を含み、
（ｉ）前記不純物が、空のウイルスカプシド、充填不完全なウイルスカプシド、及び／またはウイルス凝集体を含み、
（ｉｉ）前記方法が、以下：
ａ．前記フィード組成物が、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＭｇ２＋濃度を有すること、
ｂ．前記フィード組成物が、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＫ＋濃度を有すること、
ｃ．前記フィード組成物が、約６．５から約１０．５の間のｐＨを有すること、
ｄ．前記溶出することが、０．１ＣＶ／分から５ＣＶ／分の間の流量で行われること、及び
ｅ．前記直線塩勾配が、約５から約１００ＣＶの間の体積を含むこと
のうちの１つ以上によって特徴づけられる、方法。
［２．］以下：
ａ．前記フィード組成物が、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＭｇ２＋濃度を有すること、
ｂ．前記フィード組成物が、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＫ＋濃度を有すること、
ｃ．前記フィード組成物が、約６．５から約１０．５の間のｐＨを有すること、
ｄ．前記溶出することが、０．１ＣＶ／分から５ＣＶ／分の間の流量で行われること、及び
ｅ．前記直線塩勾配が、約５から約１００ＣＶの間の体積を含むこと
のうちの２つ以上によって特徴づけられる、［１］に記載の方法。
［３．］以下：
ａ．前記フィード組成物が、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＭｇ２＋濃度を有すること、
ｂ．前記フィード組成物が、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＫ＋濃度を有すること、及び
ｃ．前記フィード組成物が、約６．５から約１０．５の間のｐＨを有すること
によって特徴づけられる、［１］に記載の方法。
［４．］以下：
ａ．前記フィード組成物が、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＭｇ２＋濃度を有すること、
ｂ．前記フィード組成物が、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＫ＋濃度を有すること、
ｃ．前記フィード組成物が、約６．５から約１０．５の間のｐＨを有すること、
ｄ．前記溶出することが、０．１ＣＶ／分から５ＣＶ／分の間の流量で行われること、及び
ｅ．前記直線塩勾配が、約５から約１００ＣＶの間の体積を含むこと
によって特徴づけられる、［１］に記載の方法。
［５．］
ａ．前記フィード組成物が、約０．５ｍＭから約１０ｍＭの間のＭｇ２＋濃度を有し、
ｂ．前記フィード組成物が、約０．５ｍＭから約１０ｍＭの間のＫ＋濃度を有し、
ｃ．前記フィード組成物が、約７．０から約１０．２の間のｐＨを有し、
ｄ．前記溶出することが、０．２ＣＶ／分から５ＣＶ／分の間の流量で行われる、
［１］～［４］のいずれか１つに記載の方法。
［６．］アニオン交換クロマトグラフィー中における、空のまたは充填不完全な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子と完全ｒＡＡＶ粒子との分離を改善するための方法であって、
（ａ）空のｒＡＡＶ粒子、充填不完全なｒＡＡＶ粒子、及び完全ｒＡＡＶ粒子を含むフィード組成物を、アニオン交換クロマトグラフィー媒体に、前記ｒＡＡＶ粒子が前記クロマトグラフィー媒体に結合するのを可能にする条件下で接触させること、
（ｂ）直線勾配を用いて前記クロマトグラフィー媒体から前記ｒＡＡＶ粒子を溶出すること、ならびに
（ｃ）溶出された前記ｒＡＡＶ粒子を含む溶出液を回収すること
を含み、
以下：
ａ．前記フィード組成物が、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＭｇ２＋濃度を有すること、
ｂ．前記フィード組成物が、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＫ＋濃度を有すること、
ｃ．前記フィード組成物が、約６．５から約１０．５の間のｐＨを有すること、
ｄ．前記溶出することが、０．１ＣＶ／分から５ＣＶ／分の間の流量で行われること、及び
ｅ．前記直線塩勾配が、約５から約１００ＣＶの間の体積を含むこと
のうちの１つ以上によって特徴づけられる、前記方法。
［７．］アニオン交換クロマトグラフィー中における、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子とウイルス凝集体との分離を改善するための方法であって、
（ａ）ｒＡＡＶ粒子及びウイルス凝集体を含むフィード組成物を、アニオン交換クロマトグラフィー媒体に、前記ｒＡＡＶ粒子が前記クロマトグラフィー媒体に結合するのを可能にする条件下で接触させること、
（ｂ）直線勾配を用いて前記クロマトグラフィー媒体から前記ｒＡＡＶ粒子を溶出すること、ならびに
（ｃ）溶出された前記ｒＡＡＶ粒子を含む溶出液を回収すること
を含み、
以下：
ａ．前記フィード組成物が、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＭｇ２＋濃度を有すること、
ｂ．前記フィード組成物が、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＫ＋濃度を有すること、
ｃ．前記フィード組成物が、約６．５から約１０．５の間のｐＨを有すること、
ｄ．前記溶出することが、０．１ＣＶ／分から５ＣＶ／分の間の流量で行われること、及び
ｅ．前記直線塩勾配が、約５から約１００ＣＶの間の体積を含むこと
のうちの１つ以上によって特徴づけられる、前記方法。
［８．］以下：
ａ．前記フィード組成物が、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＭｇ２＋濃度を有すること、
ｂ．前記フィード組成物が、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＫ＋濃度を有すること、
ｃ．前記フィード組成物が、約６．５から約１０．５の間のｐＨを有すること、
ｄ．前記溶出することが、０．１ＣＶ／分から５ＣＶ／分の間の流量で行われること、及び
ｅ．前記直線塩勾配が、約５から約１００ＣＶの間の体積を含むこと
のうちの２つ以上によって特徴づけられる、［６］または［７］に記載の方法。
［９．］以下：
ａ．前記フィード組成物が、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＭｇ２＋濃度を有すること、
ｂ．前記フィード組成物が、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＫ＋濃度を有すること、
ｃ．前記フィード組成物が、約６．５から約１０．５の間のｐＨを有すること、
ｄ．前記溶出することが、０．２ＣＶ／分から５ＣＶ／分の間の流量で行われること、及び
ｅ．前記直線塩勾配が、約５から約１００ＣＶの間の体積を含むこと
によって特徴づけられる、［６］または［７］に記載の方法。
［１０．］以下：
ａ．前記フィード組成物が、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＭｇ２＋濃度を有すること、
ｂ．前記フィード組成物が、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＫ＋濃度を有すること、及び
ｃ．前記フィード組成物が、約６．５から約１０．５の間のｐＨを有すること
によって特徴づけられる、［６］または［７］に記載の方法。
［１１．］以下：
ａ．前記フィード組成物が、約０．５ｍＭから約１０ｍＭの間のＭｇ２＋濃度を有すること、
ｂ．前記フィード組成物が、約０．５ｍＭから約１０ｍＭの間のＫ＋濃度を有すること、及び
ｃ．前記フィード組成物が、約６．５から約１０．５の間のｐＨを有すること
によって特徴づけられる、［６］または［７］に記載の方法。
［１２．］前記アニオン交換クロマトグラフィー媒体が、４級アミン官能基を含む、［１］～［１１］のいずれか１つに記載の方法。
［１３．］前記アニオン交換クロマトグラフィー媒体が、モノリスアニオン交換クロマトグラフィーである、［１］～［１１］のいずれか１つに記載の方法。
［１４．］前記アニオン交換クロマトグラフィー媒体が、４級アミン官能基を含むモノリスアニオン交換クロマトグラフィーである、［１］～［１１］のいずれか１つに記載の方法。
［１５．］前記直線塩勾配が、約０から５００ｍＭの間のＮａＣｌを含む、［１］～［１４］のいずれか１つに記載の方法。
［１６．］前記直線塩勾配が、約０から２００ｍＭの間のＮａＣｌを含む、［１］～［１４］のいずれか１つに記載の方法。
［１７．］溶出することの前に、結合した前記ｒＡＡＶ粒子を含む前記クロマトグラフィー媒体を洗浄することをさらに含む、［１］～［１６］のいずれか１つに記載の方法。
［１８．］溶出することの前に、結合した前記ｒＡＡＶ粒子を含む前記クロマトグラフィー媒体を洗浄することをさらに含み、洗浄緩衝液が、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＭｇ２＋を含む、［１］～［１６］のいずれか１つに記載の方法。
［１９．］溶出することの前に、結合した前記ｒＡＡＶ粒子を含む前記クロマトグラフィー媒体を洗浄することをさらに含み、洗浄緩衝液が、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＫ＋を含む、［１］～［１６］のいずれか１つに記載の方法。
［２０．］溶出することの前に、結合した前記ｒＡＡＶ粒子を含む前記クロマトグラフィー媒体を洗浄することをさらに含み、洗浄緩衝液が、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＭｇ２＋及び約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＫ＋を含む、［１］～［１６］のいずれか１つに記載の方法。
［２１．］溶出することの前に、結合した前記ｒＡＡＶ粒子を含む前記クロマトグラフィー媒体を洗浄することをさらに含み、洗浄緩衝液が、８ｍＭのＭｇＣｌ２及び２．５ｍＭのＫＣｌを含む、［１］～［１６］のいずれか１つに記載の方法。
［２２．］前記フィード組成物を前記アニオン交換クロマトグラフィー媒体に接触させる前に、前記アニオン交換クロマトグラフィー媒体が、８ｍＭのＭｇＣｌ２及び２．５ｍＭのＫＣｌを含む緩衝液で平衡化されている、［１］～［２１］のいずれか１つに記載の方法。
［２３．］前記ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５、及びＡＡＶ－１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶからのカプシドタンパク質を含む、［１］～［２２］のいずれか１つに記載の方法。
［２４．］前記ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ－８またはＡＡＶ－９血清型のカプシドタンパク質を含む、［１］～［２２］のいずれか１つに記載の方法。
［２５．］前記フィード組成物が、約８．２から約９．５の間のｐＨを有する、［１］～［２４］のいずれか１つに記載の方法。
［２６．］前記ｒＡＡＶ粒子がＡＡＶ－８血清型のカプシドタンパク質を含み、前記フィード組成物が８．２から８．６の間のｐＨを有する、または前記ｒＡＡＶ粒子がＡＡＶ－９血清型のカプシドタンパク質を含み、前記フィード組成物が９．１から９．５の間のｐＨを有する、［１］～［２２］のいずれか１つに記載の方法。
［２７．］前記溶出することが、０．５ＣＶ／分から１．２５ＣＶ／分の間の流量で行われる、［１］～［２６］のいずれか１つに記載の方法。
［２８．］前記直線塩勾配が、約３０から約７０ＣＶの間の体積中０～２００ｍＭのＮａＣｌを含む、［１］～［２７］のいずれか１つに記載の方法。
［２９．］前記ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ－８またはＡＡＶ－９血清型のカプシドタンパク質を含み、前記方法が、以下：
ａ．前記フィード組成物が、約０．５ｍＭから約１０ｍＭの間のＭｇ２＋濃度を有すること、
ｂ．前記フィード組成物が、約０．５ｍＭから約１０ｍＭの間のＫ＋濃度を有すること、
ｃ．前記ｒＡＡＶ粒子がＡＡＶ－８血清型のカプシドタンパク質を含み、前記フィード組成物が８．２から８．６の間のｐＨを有すること、または前記ｒＡＡＶ粒子がＡＡＶ－９血清型のカプシドタンパク質を含み、前記フィード組成物が９．１から９．５の間のｐＨを有すること、
ｄ．前記溶出することが、１．２５ＣＶ／分から０．５ＣＶ／分の間の流量で行われること、及び
ｅ．前記直線塩勾配が、約３０から約７０ＣＶの間の体積を含むこと
のうちの２つ以上によって特徴づけられる、［１］～［２２］のいずれか１つに記載の方法。
［３０．］前記ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ－８またはＡＡＶ－９血清型のカプシドタンパク質を含み、
ａ．前記フィード組成物が、約０．５ｍＭから約１０ｍＭの間のＭｇ２＋濃度を有し、
ｂ．前記フィード組成物が、約０．５ｍＭから約１０ｍＭの間のＫ＋濃度を有し、
ｃ．前記ｒＡＡＶ粒子がＡＡＶ－８血清型のカプシドタンパク質を含み、前記フィード組成物が８．２から８．６の間のｐＨを有するか、または前記ｒＡＡＶ粒子がＡＡＶ－９血清型のカプシドタンパク質を含み、前記フィード組成物が９．１から９．５の間のｐＨを有し、
ｄ．前記溶出することが、１．２５ＣＶ／分から０．５ＣＶ／分の間の流量で行われ、及び
ｅ．前記直線塩勾配が、約３０ＣＶから約７０ＣＶの間の体積を含む、
［１］～［２２］のいずれか１つに記載の方法。
［３１．］前記塩勾配が、０～２００ｍＭのＮａＣｌを含む、［２９］または［３０］に記載の方法。
［３２．］前記フィード組成物が、２．５ｍＭのＭｇ２＋濃度を有する、［１］～［３１］のいずれか１つに記載の方法。
［３３．］前記フィード組成物が、１ｍＭのＭｇ２＋濃度を有する、［１］～［３１］のいずれか１つに記載の方法。
［３４．］前記フィード組成物が、１ｍＭのＫ＋濃度を有する、［１］～［３３］のいずれか１つに記載の方法。
［３５．］前記ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ－８血清型のカプシドタンパク質を含み、前記フィード組成物が、約８．４のｐＨを有する、［１］～［３４］のいずれか１つに記載の方法。
［３６．］前記ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ－９血清型のカプシドタンパク質を含み、前記フィード組成物が、約９．３のｐＨを有する、［１］～［３４］のいずれか１つに記載の方法。
［３７．］前記溶出することが、約０．５ＣＶ／分の流量で行われる、［１］～［３６］のいずれか１つに記載の方法。
［３８．］前記直線塩勾配が、約５０ＣＶの体積中０～２００ｍＭのＮａＣｌを含む、［１］～［３７］のいずれか１つに記載の方法。
［３９．］前記直線塩勾配が、約６０ＣＶの体積中０～２００ｍＭのＮａＣｌを含む、［１］～［３７］のいずれか１つに記載の方法。
［４０．］前記Ｍｇ２＋がＭｇＣｌ２である、［１］～［３９］のいずれか１つに記載の方法。
［４１．］前記Ｋ＋がＫＣｌである、［１］～［４０］のいずれか１つに記載の方法。
［４２．］前記モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体が、メタクリレート、アガロースベース材料、セルロース、アクリルアミド、ポリスチレンジビニルベンゼン、またはシリカベース材料を含む、［１］～［４１］のいずれか１つに記載の方法。
［４３．］前記モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体が、グリシジルメタクリレート－エチレンジメタクリレートまたはスチレン－ジビニルベンゼンポリマーを含む、［１］～［４１］のいずれか１つに記載の方法。
［４４．］前記モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体が、グリシジルメタクリレート－エチレンジメタクリレートポリマーを含む、［４３］に記載の方法。
［４５．］前記モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体が、９５０ｎｍ～１１５０ｎｍの平均細孔半径を有する、［１］～［４４］のいずれか１つに記載の方法。
［４６．］前記モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体が、６００ｎｍ～７５０ｎｍの平均細孔半径を有する、［１］～［４４］のいずれか１つに記載の方法。
［４７．］ｒＡＡＶ粒子の収率が少なくとも約４０％である、［１］～［４６］のいずれか１つに記載の方法。
［４８．］ｒＡＡＶ粒子の収率が少なくとも約５０％である、［１］～［４６］のいずれか１つに記載の方法。
［４９．］ｒＡＡＶ粒子の収率が少なくとも約６０％である、［１］～［４６］のいずれか１つに記載の方法。
［５０．］ｒＡＡＶ粒子の収率が少なくとも約７０％である、［１］～［４６］のいずれか１つに記載の方法。
［５１．］ｒＡＡＶ粒子の収率が少なくとも約７５％である、［１］～［４６］のいずれか１つに記載の方法。
［５２．］ｒＡＡＶ粒子の収率が少なくとも約８０％である、［１］～［４６］のいずれか１つに記載の方法。
［５３．］ｒＡＡＶ粒子の収率が少なくとも約８５％である、［１］～［４６］のいずれか１つに記載の方法。
［５４．］ｒＡＡＶ粒子の収率が少なくとも約９０％である、［１］～［４６］のいずれか１つに記載の方法。
［５５．］ｒＡＡＶ粒子の収率が少なくとも約９５％である、［１］～［４６］のいずれか１つに記載の方法。
［５６．］前記不純物が、空のまたは充填不完全なウイルスカプシドを含み、前記方法が、前記空のまたは充填不完全なウイルスカプシドから前記ｒＡＡＶ粒子を分離する、［１］～［５５］のいずれか１つに記載の方法。
［５７．］前記溶出液中の前記ウイルスカプシドの少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％がｒＡＡＶ粒子である、［１］～［５６］のいずれか１つに記載の方法。
［５８．］前記溶出液中の前記ウイルスカプシドの少なくとも約４０％がｒＡＡＶ粒子である、［１］～［５６］のいずれか１つに記載の方法。
［５９．］前記溶出液中の前記ウイルスカプシドの少なくとも約５０％がｒＡＡＶ粒子である、［１］～［５６］のいずれか１つに記載の方法。
［６０．］前記溶出液中の前記ウイルスカプシドの少なくとも約６０％がｒＡＡＶ粒子である、［１］～［５６］のいずれか１つに記載の方法。
［６１．］前記溶出液中の前記ウイルスカプシドの少なくとも約７０％がｒＡＡＶ粒子である、［１］～［５６］のいずれか１つに記載の方法。
［６２．］前記溶出液中の前記ウイルスカプシドの少なくとも約８０％がｒＡＡＶ粒子である、［１］～［５６］のいずれか１つに記載の方法。
［６３．］前記溶出液中の前記ウイルスカプシドの少なくとも約９０％がｒＡＡＶ粒子である、［１］～［５６］のいずれか１つに記載の方法。
［６４．］前記溶出液中の前記ウイルスカプシドの少なくとも約９５％がｒＡＡＶ粒子である、［１］～［５６］のいずれか１つに記載の方法。
［６５．］前記溶出液中の前記ウイルスカプシドの少なくとも約９７％がｒＡＡＶ粒子である、［１］～［５６］のいずれか１つに記載の方法。
［６６．］前記溶出液中の前記ウイルスカプシドの少なくとも約９８％がｒＡＡＶ粒子である、［１］～［５６］のいずれか１つに記載の方法。
［６７．］前記溶出液中の前記ウイルスカプシドの少なくとも約９９％がｒＡＡＶ粒子である、［１］～［５６］のいずれか１つに記載の方法。
［６８．］前記フィード組成物が、以下：
（ａ）前記ｒＡＡＶ粒子を含む細胞培養物、細胞溶解物、細胞上清、またはこれらの組み合わせを含む出発組成物を準備すること、
（ｂ）前記出発組成物を深層濾過によって清澄化して、清澄化された出発組成物を生成すること、
（ｃ）前記清澄化された出発組成物をタンジェンシャルフロー濾過によって濃縮して、濃縮された濾液を生成すること、
（ｄ）前記濃縮された濾液をアフィニティークロマトグラフィー媒体に接触させること、及び
（ｅ）前記アフィニティークロマトグラフィー媒体から前記ｒＡＡＶ粒子を回収して、前記フィード組成物を生成すること
によって生成される、［１］～［６７］のいずれか１つに記載の方法。
［６９．］前記フィード組成物が、以下：
（ａ）前記ｒＡＡＶ粒子を含む細胞培養物、細胞溶解物、細胞上清、またはこれらの組み合わせを含む出発組成物を準備すること、
（ｂ）前記清澄化された出発組成物をタンジェンシャルフロー濾過によって濃縮して、濃縮された濾液を生成すること、
（ｃ）前記濃縮された濾液をアフィニティークロマトグラフィー媒体に接触させること、及び
（ｄ）前記アフィニティークロマトグラフィー媒体から前記ｒＡＡＶ粒子を回収して、前記フィード組成物を生成すること
によって生成される、［１］～［６７］のいずれか１つに記載の方法。
［７０．］前記出発組成物が細胞培養物を含み、前記細胞培養物が浮遊培養物または接着細胞培養物である、［６８］または［６９］に記載の方法。
［７１．］前記浮遊培養物が、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３由来細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、ＥＢ６６細胞、またはＳＦ－９細胞の培養物を含む、［７０］に記載の方法。
［７２．］前記浮遊培養物が、ＨＥＫ２９３細胞の培養物を含む、［７１］に記載の方法。
［７３．］前記出発組成物が、哺乳類細胞または昆虫細胞の培養物を含む、［６８］～［７０］のいずれか１つに記載の方法。
［７４．］前記出発組成物が、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３由来細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、ＥＢ６６細胞、またはＳＦ－９細胞の培養物を含む、［６８］～［７０］のいずれか１つに記載の方法。
［７５．］前記出発組成物が、約２０リットルから約２０，０００リットルの間の体積を有する、［６８］～［７４］のいずれか１つに記載の方法。
［７６．］前記出発組成物が、約２０リットルから約５，０００リットルの間の体積を有する、［６８］～［７４］のいずれか１つに記載の方法。
［７７．］前記出発組成物が、約５０リットルから約２０，０００リットルの間の体積を有する、［６８］～［７４］のいずれか１つに記載の方法。
［７８．］前記出発組成物が、約５０リットルから約５，０００リットルの間の体積を有する、［６８］～［７４］のいずれか１つに記載の方法。
［７９．］前記出発組成物が、約１００リットルから約３，０００リットルの間の体積を有する、［６８］～［７４］のいずれか１つに記載の方法。
［８０．］前記出発組成物が、約５００リットルから約３，０００リットルの間の体積を有する、［６８］～［７４］のいずれか１つに記載の方法。
［８１．］前記出発組成物が、約１，５００リットルから約２，５００リットルの間の体積を有する、［６８］～［７４］のいずれか１つに記載の方法。
［８２．］前記出発組成物が、約２，０００リットルの体積を有する、［８１］に記載の方法。
［８３．］前記出発組成物が、約１０００リットルの体積を有する、［８１］に記載の方法。
［８４．］［１］～［８３］のいずれか１つに記載の方法によって生成される、単離された組換えアデノ随伴ウイルス粒子を含む、組成物。

【0009】

いくつかの実施形態において、当該方法は、［１］～［５５］のいずれか１つに記載の方法に従って使用されるｒＡＡＶ粒子を含む出発組成物を調製するための上流処理を含む。さらなる実施形態において、上流処理は、細胞培養物または細胞培養上清の収集、（例えば、遠心分離または深層濾過による）収集した細胞培養物または細胞培養上清の清澄化、タンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、無菌濾過のうちの少なくとも１つである。さらなる実施形態において、上流処理は、細胞培養物または細胞培養上清の収集物の添加、（例えば、遠心分離または深層濾過による）収集した細胞培養物または細胞培養上清の清澄化、タンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、無菌濾過のうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つを含む。いくつかの実施形態において、上流処理は、出発組成物の遠心分離を含まない。

【0010】

追加の実施形態において、方法は、［１］～［５５］のいずれか１つに記載の方法に従って回収したアニオン交換クロマトグラフィー媒体からのｒＡＡＶ含有溶出液のさらなる下流処理を含む。いくつかの実施形態において、さらなる下流処理は、タンジェンシャルフロー濾過、カチオン交換クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、または無菌濾過のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態において、さらなる下流処理は、タンジェンシャルフロー濾過、カチオン交換クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、または無菌濾過のうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つを含む。いくつかの実施形態において、さらなる下流処理は、タンジェンシャルフロー濾過を含む。いくつかの実施形態において、さらなる下流処理は、無菌濾過を含む。さらなる実施形態において、さらなる下流処理は、タンジェンシャルフロー濾過及び無菌濾過を含む。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1A】ＡＡＶ８－Ａ精製用ＡＥＸ樹脂のスクリーニング。試験した樹脂は、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標）ＱＡである。

【図1B】ＡＡＶ８－Ａ精製用ＡＥＸ樹脂のスクリーニング。試験した樹脂は、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅである。

【図1C】ＡＡＶ８－Ａ精製用ＡＥＸ樹脂のスクリーニング。試験した樹脂は、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＴＭＡＥ（Ｍ）である。

【図1D】ＡＡＶ８－Ａ精製用ＡＥＸ樹脂のスクリーニング。試験した樹脂は、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）Ｇｉｇａｃａｐ Ｑ－６５０Ｍである。

【図1E】ＡＡＶ８－Ａ精製用ＡＥＸ樹脂のスクリーニング。試験した樹脂は、ＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱである。

【図2A】緩衝剤、ｐＨ、及び溶出勾配が、生成物関連不純物からのＡＡＶ８－Ａ完全粒子の分離に及ぼす影響。ビストリスプロパンｐＨ１０．２を用いたクロマトグラフィー実行結果が示されている。

【図2B】緩衝剤、ｐＨ、及び溶出勾配が、生成物関連不純物からのＡＡＶ８－Ａ完全粒子の分離に及ぼす影響。トリスｐＨ８．８を用いたクロマトグラフィー実行結果が示されている。

【図2C】緩衝剤、ｐＨ、及び溶出勾配が、生成物関連不純物からのＡＡＶ８－Ａ完全粒子の分離に及ぼす影響。トリスｐＨ８．２を用いたクロマトグラフィー実行結果が示されている。

【図3A】緩衝液にＭｇ^２＋及びＫ^＋を含めると、ＡＥＸクロマトグラフィー分離能及びＡＡＶ８－Ａ収率が増加する。Ｍｇ^２＋及びＫ^＋を使用しないクロマトグラフィー実行結果が示されている。

【図3B】緩衝液にＭｇ^２＋及びＫ^＋を含めると、ＡＥＸクロマトグラフィー分離能及びＡＡＶ８－Ａ収率が増加する。１ｍＭのＭｇ^２＋を用いたクロマトグラフィー実行結果が示されている。

【図3C】緩衝液にＭｇ^２＋及びＫ^＋を含めると、ＡＥＸクロマトグラフィー分離能及びＡＡＶ８－Ａ収率が増加する。２．５ｍＭのＭｇ^２＋及び１ｍＭのＫ^＋を用いたクロマトグラフィー実行結果が示されている。

【図4A】Ｍｇ^２＋及びＫ^＋を含む緩衝系は、４級アミンを含む様々なＡＥＸクロマトグラフィー樹脂中の生成物関連不純物からＡＡＶ８－Ｂ完全粒子を良好に分離する。ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（商標）ＱＡ（ＢＩＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）を用いたクロマトグラフィー実行結果が示されている。

【図4B】Ｍｇ^２＋及びＫ^＋を含む緩衝系は、４級アミンを含む様々なＡＥＸクロマトグラフィー樹脂中の生成物関連不純物からＡＡＶ８－Ｂ完全粒子を良好に分離する。Ｐｏｒｏｓ ＸＱ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いたクロマトグラフィー実行結果が示されている。

【図4C】Ｍｇ^２＋及びＫ^＋を含む緩衝系は、４級アミンを含む様々なＡＥＸクロマトグラフィー樹脂中の生成物関連不純物からＡＡＶ８－Ｂ完全粒子を良好に分離する。Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｑ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いたクロマトグラフィー実行結果が示されている。

【図5】８０ｍＬのＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標）ＱＡカラムを用いた、ＡＡＶ８－Ａ ＡＥＸクロマトグラフィーにおける５０Ｌの細胞浮遊培養までのスケールアップ。

【図6】８０ｍＬのＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標）ＱＡカラムを用いた、ＡＡＶ８－Ｂ ＡＥＸクロマトグラフィーにおける６０Ｌの細胞浮遊培養までのスケールアップ。

【図7】８０ｍＬのＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標）ＱＡカラムを用いた、ＡＡＶ８－Ｃ ＡＥＸクロマトグラフィーにおける５０Ｌの細胞浮遊培養までのスケールアップ。

【図8A】ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標）ＱＡカラムを用いたＡＡＶ９精製。２．５ｍＭのＭｇ^２＋及び１ｍＭのＫ^＋の添加なしのクロマトグラフィー実行結果が示されている。

【図8B】ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標）ＱＡカラムを用いたＡＡＶ９精製。１ｍＭのＭｇ２^＋及び１ｍＭのＫ^＋を伴ったクロマトグラフィーの実行結果が示されている。

【発明を実施するための形態】

【0012】

詳細な説明
いくつかの実施形態において、本開示は、ＡＥＸクロマトグラフィーを用いて不純物（例えば、空のウイルスカプシドまたはウイルス凝集体）を含むフィード組成物からｒＡＡＶ粒子を単離するための方法と、ＡＥＸクロマトグラフィー中における空の／充填不完全な粒子からの完全ｒＡＡＶウイルス粒子の分離を改善するための方法と、ＡＥＸクロマトグラフィー中におけるウイルス凝集体からの完全ｒＡＡＶウイルス粒子の分離を改善するための方法とを提供する。いくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィー媒体は、４級アミンリガンドを含む。いくつかの実施形態において、当該方法は、アニオン交換クロマトグラフィー媒体を使用する。いくつかの実施形態において、当該方法の生成物は、例えば、タンジェンシャルフロー濾過及び無菌濾過による、単離されたｒＡＡＶ粒子を生成するためのさらなる下流処理に適している。説明される方法は、遺伝子療法用途で使用するためのｒＡＡＶ粒子集団の単離に関するＧＭＰ規制要件と一致する、柔軟で費用効果が高く商業的にスケーラブルなプロセスを提供する。本明細書で説明される方法は、限定されるものではないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５、及びＡＡＶ－１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６を含めた任意のｒＡＡＶ血清型、ならびにこれらの派生物、修飾物、またはシュードタイプに適している。いくつかの実施形態において、当該方法は、ｒＡＡＶ－８粒子を単離するために使用される。いくつかの実施形態において、当該方法は、ｒＡＡＶ－８派生物粒子、ｒＡＡＶ－８修飾物粒子、またはｒＡＡＶ－８シュードタイプ粒子を単離するために使用される。いくつかの実施形態において、当該方法は、ｒＡＡＶ－９粒子を単離するために使用される。いくつかの実施形態において、当該方法は、ｒＡＡＶ－９派生物粒子、ｒＡＡＶ－９修飾物粒子、またはｒＡＡＶ－９シュードタイプ粒子を単離するために使用される。

【0013】

本明細書で開示される方法は、いくつかの重要な利点を提供する。本明細書で開示される方法のウイルス収率増加により、治療用ＡＡＶ組成物の工業規模生産のコストが大幅に削減される。ウイルス収率が５％増加すれば、それに応じて、ＡＡＶ粒子の生成に必要な消耗品のコストだけでなく、工業用ウイルス精製施設の建設に関連する設備投資のコストも低減することができる。本明細書で開示される方法により、より安全に治療用ＡＡＶ調製物が生成される。本開示の方法によって、空の／充填不完全なカプシド及びウイルス凝集体からの機能的な完全ｒＡＡＶ粒子の分離が改善される。空の／充填不完全なカプシドがより効率的に除去されるため、本明細書で開示される方法によって生成される治療用ＡＡＶ製剤は、機能的ＡＡＶ粒子の１つの単位薬用量中により少ないカプシドタンパク質を含む。ＡＡＶカプシドタンパク質に対する免疫反応は、ＡＡＶ媒介遺伝子療法に潜在的に備わる副作用である。機能性ＡＡＶ粒子の単位薬用量中のカプシドタンパク質を低減することにより、本明細書で開示される方法は、カプシドタンパク質に対する免疫反応の可能性を低減することによって治療用ｒＡＡＶ製剤の安全性を高める。

【0014】

定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的用語及び科学的用語は、本開示が関連する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本開示の方法の理解を容易にするため、以下に複数の用語及び表現を定義する。

【0015】

例えば、組成物中の成分の量、組成物中の成分の濃度、流量、ｒＡＡＶ粒子収率、フィード体積、塩濃度、類似の値、及びこれらの範囲を修飾し、本明細書で提供される方法で用いられる「約」とは、例えば、濃縮物もしくは使用溶液を作製するために使用される典型的な測定及び取扱い手順によって；これらの手順における偶発性のエラーによって；組成物の作製もしくは方法の実行に用いられる製造、供給源、もしくは成分の純度の違いによって；及び類似の考慮事項によって生じ得る、数値的量のバリエーションを意味する。「約」という用語は、特定の初期濃度を有する組成物または混合物が経年変化することによって相違する量も包含する。「約」という用語は、特定の初期濃度を有する組成物または混合物を混合または処理することによって相違する量も包含する。「約」という用語で修飾されているかどうかにかかわらず、請求項は、その量の等価物を含む。いくつかの実施形態において、「約」という用語は、示された数または範囲よりも約１０～２０％多いまたは少ない範囲を意味する。さらなる実施形態において、「約」とは、示された数または範囲のプラスマイナス１０％を意味する。例えば、「約１０％」は９％～１１％の範囲を示す。

【0016】

「ＡＡＶ」とはアデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）の省略形であり、このウイルス自体またはその修飾物、派生物、もしくはシュードタイプを意味するように使用することができる。当該用語は、別段に要求される場合を除いて、全てのサブタイプ、ならびに天然の形態及び組換え形態両方を包含する。省略形「ｒＡＡＶ」とは、組換えアデノ随伴ウイルスを意味する。「ＡＡＶ」という用語は、１型ＡＡＶ（ＡＡＶ－１）、２型ＡＡＶ（ＡＡＶ－２）、３型ＡＡＶ（ＡＡＶ－３）、４型ＡＡＶ（ＡＡＶ－４）、５型ＡＡＶ（ＡＡＶ－５）、６型ＡＡＶ（ＡＡＶ－６）、７型ＡＡＶ（ＡＡＶ－７）、８型ＡＡＶ（ＡＡＶ－８）、９型ＡＡＶ（ＡＡＶ－９）、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、及びヒツジＡＡＶ、ならびにこれらの修飾物、派生物、またはシュードタイプを含む。「霊長類ＡＡＶ」は霊長類に感染するＡＡＶを意味し、「非霊長類ＡＡＶ」は非霊長類哺乳動物に感染するＡＡＶを意味し、「ウシＡＡＶ」はウシ哺乳動物に感染するＡＡＶを意味する、などとなる。

【0017】

ＡＡＶ粒子に適用される「組換え」とは、ＡＡＶ粒子が、本質的にＡＡＶ粒子とは異なるＡＡＶ粒子コンストラクトをもたらす１つ以上の手順の生成物であることを意味する。

【0018】

組換えアデノ随伴ウイルス粒子「ｒＡＡＶ粒子」とは、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質と、異種ポリヌクレオチド（すなわち、野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド、例えば、哺乳類細胞に送達される導入遺伝子）を含むカプシド化ポリヌクレオチドｒＡＡＶベクターとから構成されるウイルス粒子を意味する。ｒＡＡＶ粒子は、任意の修飾物、派生物、またはシュードタイプを含めた任意のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、もしくはＡＡＶ－１０、またはこれらの派生体／修飾物／シュードタイプ）とすることができる。このようなＡＡＶ血清型及び派生物／修飾物／シュードタイプ、ならびにこのような血清型／派生物／修飾物／シュードタイプを生成する方法は、当技術分野で知られている（例えば、Ａｓｏｋａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０（４）：６９９－７０８（２０１２）を参照）。

【0019】

「空のカプシド」または「空の粒子」とは、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質を含み、ただしポリヌクレオチド（人工ゲノム）の全部または一部が欠如しているビリオンを意味する。空のカプシドは、例えば、異種ポリヌクレオチド（例えば、哺乳類細胞に送達される導入遺伝子、すなわち野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含むインタクトなｒＡＡＶベクターを含まない。

【0020】

本開示のｒＡＡＶ粒子は、任意の血清型、または血清型の任意の組合せ（例えば、２つ以上の血清型を含む（例えば、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ８、及びｒＡＡＶ９粒子のうちの２つ以上を含む）ｒＡＡＶ粒子集団）とすることができる。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ｒＡＡＶ４、ｒＡＡＶ５、ｒＡＡＶ６、ｒＡＡＶ７、ｒＡＡＶ８、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ１０、もしくはその他のｒＡＡＶ粒子、またはこれらの２つ以上の組合せである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶ８またはｒＡＡＶ９粒子である。

【0021】

いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５、及びＡＡＶ－１６からなる群より選択される血清型、またはこれらの派生物、修飾物、もしくはシュードタイプのＡＡＶカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、またはこれらの派生物、修飾物、もしくはシュードタイプの血清型のＡＡＶカプシドタンパク質を有する。

【0022】

「不純物」または「混入物」という用語は、任意の外来または好ましくない分子を意味し、これには、開示される方法を用いて１つ以上の外来または望ましくない分子から分離されているｒＡＡＶ粒子を含む試料中に存在し得る生物学的高分子、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、１つ以上の宿主細胞タンパク質、エンドトキシン、脂質、及び１つ以上の添加物が含まれる。「不純物」または「混入物」という用語はさらに、生成物関連の不純物、例えば、不活性のベクター形態、空のウイルスカプシド、凝集したウイルス粒子またはカプシド、ミスフォールドしたウイルスカプシド、分解したウイルス粒子をさらに包含する。いくつかの実施形態において、不純物には、空のウイルスカプシドまたはウイルス凝集体が含まれる。加えて、このような不純物には、本開示の方法のうちの１つ以上の前に生じ得るステップで使用される任意の試薬が含まれ得る。不純物は、本質的に可溶性の場合も不溶性の場合もある。不溶性の不純物としては、ｒＡＡＶ粒子を含む試料中に存在し、浮遊粒子または固体である、望ましくないまたは好ましくない実体が挙げられる。例示的な不溶性の不純物としては、限定されるものではないが、凝集ウイルス粒子またはカプシド、全細胞、細胞フラグメント、及び細胞デブリが挙げられる。可溶性の不純物としては、ｒＡＡＶ粒子を含む試料中に存在し、不溶性の不純物ではない、望ましくないまたは好ましくない実体が挙げられる。例示的な可溶性の不純物としては、限定されるものではないが、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質ウイルス、エンドトキシン、及び細胞培養培地構成成分が挙げられる。

【0023】

「細胞培養物」という用語は、接着してまたは浮遊液中で成長させる細胞、バイオリアクター、ローラーボトル、ハイパースタック、ミクロスフェア、マクロスフェア、フラスコなどに加えて、上清または浮遊液自体の構成成分を意味し、このような構成成分としては、限定されるものではないが、ｒＡＡＶ粒子、細胞、細胞デブリ、細胞混入物、コロイド粒子、生体分子、宿主細胞タンパク質、核酸、及び脂質、及び凝集剤が挙げられる。また、バイオリアクターなどの大規模アプローチ（浮遊培養物、及び撹拌バイオリアクター内のマイクロキャリアまたはマクロキャリアに付着して成長させる付着細胞が含まれる）も「細胞培養物」という用語に包含される。タンパク質の大規模生産及び小規模生産いずれのための細胞培養手順も、本開示に包含される。

【0024】

「溶解物」または「細胞溶解物」という用語は、破裂した細胞壁及び／または細胞膜を有する細胞から主になる組成物を意味する。溶解物は、１つ以上の細胞構成成分を除去するために分画されている場合もあれば分画されていない場合もある。

【0025】

「細胞上清」または「細胞培養物上清」という用語は、付着細胞培養物または細胞浮遊培養物の細胞材料から分離することができる培地浮遊液中の液体培地及び細胞外構成成分を意味する。概して、培養中の細胞から分泌された物質は、細胞上清から精製することができる。場合によっては、ＡＡＶ粒子を上清中に分泌させ、細胞の溶解を伴ってまたは伴わずにそこから精製することができる。例えば、Ｃｌｅｍｅｎｔ，Ｎ．ａｎｄ Ｇｒｉｅｇｅｒ，Ｊ．Ｃ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ － Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（２０１６）３，１６００２；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｍ．２０１６．２及び米国特許出願公開第２００６／００４０１３７号（２０１６年２月１１日発行）を参照（両方の文献が参照により本明細書に援用される）。

【0026】

「清澄化された液体培地」または「清澄化された出発組成物」という用語は、本明細書では、哺乳類、細菌、または酵母細胞から実質的に遊離している（例えば、少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、または９９％遊離している）、哺乳類、細菌、または酵母の細胞培養物から得られる細胞培養上清などの液体培地を意味するように使用される。

【0027】

「フィード組成物」という用語は、フィルターまたはクロマトグラフィーマトリックスにロード、通過、または適用される、ｒＡＡＶ粒子の供給源を意味する。本開示に包含されるフィードとしては、生成培養収集物と、本開示の方法に包含される以前のクロマトグラフィーステップから単離された材料とが挙げられ、ここで材料は、以前のステップからのフロースルーとして存在したか、以前のステップで結合及び溶出されたか、以前のステップの空洞体積中に存在したか、またはｒＡＡＶ粒子の精製中に得られる任意の画分中に存在したかのいずれかである。このようなフィードは、１つ以上の不純物または混入物を含み得る。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子を含む供給物はさらに、生成物関連の不純物、例えば、空のウイルスカプシド、凝集したウイルス粒子もしくはカプシド、ミスフォールドしたウイルスカプシド、分解したウイルス粒子、及び／または損傷したｒＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子を含むフィードはさらに、宿主細胞混入物、ヘルパーウイルス混入物、及び／または細胞培養混入物を含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞混入物は、宿主細胞ＤＮＡ、プラスミド、または宿主細胞タンパク質を含む。追加の実施形態において、ヘルパーウイルス混入物は、アデノウイルス粒子、アデノウイルスＤＮＡ、アデノウイルスタンパク質、バキュロウイルス粒子、バキュロウイルスＤＮＡ、またはバキュロウイルスタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養混入物は、培地構成成分、血清アルブミン、またはその他の血清タンパク質を含む。追加の実施形態において、細胞培養混入物は、培地構成成分を含む。

【0028】

「濾過物」または「スループット」という用語は専門用語であり、フィルター（例えば、深層フィルター、プレフィルター、ウイルスフィルター、またはタンジェンシャルフローフィルター）から放出される、検出可能な量のｒＡＡＶを含む流体を意味する。

【0029】

本明細書で使用する場合、「精製すること」、「精製」、「分離する」、「分離すること」、「分離」、「単離する」、「単離すること」、または「単離」という用語は、ターゲット生成物と１つ以上の不純物とを含む試料からのｒＡＡＶ粒子に対する純度の程度を高めることを意味する。典型的には、ターゲット生成物の純度の程度は、試料から少なくとも１つの不純物を（完全にまたは不完全に）除去することによって高められる。いくつかの実施形態において、試料中のｒＡＡＶの純度の程度は、本明細書で説明される方法を使用することにより、試料から１つ以上の不純物を（完全にまたは不完全に）除去することによって増加する。

【0030】

「モノリスクロマトグラフィーカラム」または「モノリスクロマトグラフィー媒体」という用語は専門用語であり、固定相としての３次元マクロポーラス構造、すなわちモノリスを含むクロマトグラフィーカラムを意味する。モノリスとは、高多孔質材料の連続体（例えば、多孔質モノリシックメタクリレートベースポリマー）であり、モノマー溶液の重合によって作製することができる。モノリスは、ポリスチレン、多糖類、ポリメタクリレート、及びその他の合成ポリマーから開発されたものである。モノリスは、規定の直径を有する相互接続フローチャネルを含む。これらのチャネル内でのターゲット分子の物質移動は、移動相の対流の流れによって決定される。モノリス基質に対するリガンド（例えば、４級アンモニウム、ＤＥＡＥ）の添加は、クロマトグラフィーカラムを産生するための十分に開発された様々な技法によって遂行することができる。非限定的なモノリスクロマトグラフィーカラムとしては、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（商標）ディスポーザブルプレパッククロマトグラフィーモノリシックカラム、ＣＩＭａｃ（商標）アナリティカルカラム、ＣＩＭ（登録商標）ラインモノリシックカラム、ＵＮＯ（登録商標）モノリスカラム、及びＣｈｒｏｍｏｌｉｔｈ（登録商標）モノリシックＨＰＬＣカラムが挙げられる。非限定的なモノリスクロマトグラフィー樹脂としては、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（商標）ＱＡ－１アドバンストコンポジットカラム（４級アミン）、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（商標）ＤＥＡＥ－１アドバンストコンポジットカラム（ジエチルアミノ）、ＣＩＭ（登録商標）ＱＡディスク（４級アミン）、ＣＩＭ（登録商標）ＤＥＡＥ、ＣＩＭ（登録商標）ＥＤＡディスク（エチレンジアミノ）、ＵＮＯ（登録商標）モノリスアニオン交換カラムが挙げられる。

【0031】

「平均細孔半径」または「平均細孔サイズ」という用語は、モノリシックまたはその他の任意のクロマトグラフィーカラムにおけるクロマトグラフィー樹脂または多孔質材料の細孔サイズを言い表す専門用語である。いくつかの実施形態において、球形の細孔の平均サイズは「平均細孔直径」または「平均細孔半径」である。いくつかの実施形態において、非球形の細孔の平均サイズは「平均最大寸法」を意味する。いくつかの実施形態において、細孔のサイズ分布は、窒素ガスの吸脱着等温線を使用し、Ｂａｒｒｅｔｔ、Ｊｏｙｎｅｒ、及びＨａｌｅｎｄａアルゴリズム（Ｅ．Ｐ．Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｌ．Ｇ．Ｊｏｙｎｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｈ．Ｈａｌｅｎｄａ，Ｊ．Ａｍｅｒ． Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７３，３７３，１９５１）の方式でケルビン方程式を適用することにより、決定することができる。いくつかの実施形態において、細孔のサイズ分布は、市販の統計解析ソフトウェアパッケージを用いてモノリス切片の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を解析して細孔サイズの分布を調べることにより、またはＳＥＭ画像内のスケールを用いて手動で細孔直径を測定することにより、決定することができる。例えば、Ｊｕｎｇｒｅｕｔｈｍａｙｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，１４２５：１４１－１４９（２０１５）を参照。いくつかの実施形態において、「平均細孔サイズ」または「平均細孔半径」は、測定した２０個の細孔の平均直径を計算することによって決定することができる。

【0032】

「深層フィルター」という用語は専門用語であり、その３次元構造内でかつ表面上にとどまらず不純物及び／または混入物を捕捉する多孔質濾過媒体を含むフィルターを意味する。深層フィルター清澄化媒体は、典型的には、セルロースの繊維床、湿潤強度樹脂結合剤、及び無機フィルター助剤（例えば、珪藻土）の材料から構成されている。樹脂結合剤は、湿潤引張強度の付与、不純物を結合するための吸着電荷の提供、及びフィルター構成成分の脱落の最小化に役立つ。珪藻土はフィルターに高い表面積をもたらし、吸着特性に寄与する。深層フィルター媒体は、アブソリュートフィルターとは異なり、フィルター媒体全体にわたって粒子を保持する。深層フィルターは、フィルター内で混入物または不純物を保持し、目詰まりする前に比較的多くの量を保持できることを特徴とする。深層フィルター構造としては、多層、多重膜、単層、または樹脂材料を挙げることができる。深層フィルターの非限定的な例としては、ＣＵＮＯ（登録商標）ＺｅｔａＰＬＵＳ（登録商標）Ｄｅｌｉｐｉｄフィルター、ＣＵＮＯ（登録商標）Ｅｍｐｈａｚｅ ＡＥＸフィルター、ＣＵＮＯ（登録商標）３０／６０ＺＡフィルター、ＣＵＮＯ（登録商標）９０ＺＢ０８Ａフィルター、ＣＵＮＯ（登録商標）ＤＥＬＩ０８Ａ Ｄｅｌｉｐｉｄフィルター、及びＣＵＮＯ（登録商標）ＤＥＬＩＰ０８Ａ Ｄｅｌｉｐｉｄ ｐｌｕｓフィルター（３Ｍ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，Ｍｉｎｎ．）、Ｃｌａｒｉｓｏｌｖｅ（登録商標）グレード６０ＨＸ、４０ＭＳ、２０ＭＳ、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣグレードＣＯＨＣ、ＤＯＨＣ、Ａ１ＨＣ、Ｂ１ＨＣ、ＸＯＨＣ、ＦＯＨＣ、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣＰｒｏグレードＤＯＳＰ、ＣＯＳＰ、及びＸＯＳＰ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅフィルター（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，Ｍａｓｓ．）、及びＳａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）二層フィルターカートリッジが挙げられる。

【0033】

「タンジェンシャルフロー濾過」や「ＴＦＦ」（クロスフロー精密濾過とも呼ばれる）などは専門用語であり、溶質を含む溶液が限外濾過膜及び低分子量を接線方向に通過させ、圧力を印加することによって塩及び溶質を通過させる濾過モードを意味する。

【0034】

本開示及び請求項で使用する場合、単数形「ａ」「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈による明確な別段の定めがない限り、複数形を含む。

【0035】

諸実施形態が「～を含む」という語を用いて本明細書で説明されている場合は常に、「～からなる」及び／または「本質的に～からなる」という観点から説明されている別の類似の実施形態も提供されるものと理解されたい。また、諸実施形態が「本質的に～からなる」という語を用いて本明細書で説明されている場合は常に、「～からなる」という観点から説明されている別の類似の実施形態も提供されるものと理解されたい。

【0036】

「及び／または」という用語は、本明細書で「Ａ及び／またはＢ」などの表現で使用される場合、Ａ及びＢの両方、ＡまたはＢ、Ａ（単独）、ならびにＢ（単独）を含むように意図されている。同様に、「及び／または」という用語は、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」のような表現で使用される場合、以下の実施形態の各々を包含するように意図されている：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）。

【0037】

本開示の実施形態がマルクーシュグループまたはその他の代替のグループに関して説明される場合、本開示の方法は、全体として挙げられたグループ全体を包含するだけでなく、グループの各メンバーも個別に包含し、メイングループの全ての可能なサブグループも包含し、さらにグループメンバーの１つ以上不在のメイングループも包含する。また、本開示の方法は、本開示の方法におけるグループメンバーのいずれかの１つ以上が明示的に除外されることも想定している。

【0038】

アニオン交換クロマトグラフィーによるｒＡＡＶ精製の方法
いくつかの実施形態において、本開示は、不純物を含むフィード組成物からｒＡＡＶ粒子を単離するための方法であって、フィード組成物を、アニオン交換クロマトグラフィー媒体に、ｒＡＡＶ粒子がクロマトグラフィー媒体に結合するのを可能にする条件下で接触させること、クロマトグラフィー媒体からｒＡＡＶ粒子を溶出すること、ならびに単離されたｒＡＡＶ粒子を含む溶出液を回収することを含み、不純物が、空のまたは充填不完全なウイルスカプシドまたはウイルス凝集体を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－８もしくはＡＡＶ－９血清型、またはこれらの派生物もしくは修飾物のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィー媒体は、モノリスクロマトグラフィー媒体である。いくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィー媒体は、４級アミン官能基を含む。いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー材料は、４級アミンを含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＭｇ^２＋、Ｃａ^２＋、またはＺｎ^２＋を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．５ｍＭから約１０ｍＭの間のＭｇ^２＋、Ｃａ^２＋、またはＺｎ^２＋を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＭｇ^２＋を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．５ｍＭから約１０ｍＭの間のＭｇ^２＋を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約１ｍＭから約２．５ｍＭの間のＭｇ^２＋を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＫ^＋、Ｒｂ^＋、またはＣｓ^＋を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．５ｍＭから約１０ｍＭの間のＫ^＋、Ｒｂ^＋、またはＣｓ^＋を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＫ^＋を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．５ｍＭから約１０ｍＭの間のＫ^＋を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、１ｍＭのＫ^＋を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約７．０から約１０．２の間、約８．２から約８．６の間、または約９．１から約９．５の間のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－８血清型、またはその派生物もしくは修飾物のカプシドタンパク質を含み、フィード組成物は、約８．２から約８．６の間のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－９血清型、またはその派生物もしくは修飾物のカプシドタンパク質を含み、フィード組成物は、約９．１から約９．５の間のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、溶出は、約０．２ＣＶ／分から約５ＣＶ／分の間の流量で行われる。いくつかの実施形態において、溶出は、約０．５ＣＶ／分から約１．２５ＣＶ／分の間の流量で行われる。いくつかの実施形態において、溶出は、直線塩勾配によって行われる。いくつかの実施形態において、直線塩勾配は、約３０から約７０ＣＶの間の体積中に０から５００ｍＭのＮａＣｌを含む。

【0039】

いくつかの実施形態において、本開示は、アニオン交換クロマトグラフィー中における組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子とウイルス凝集体との間の分離を改善するための方法であって、ｒＡＡＶ粒子及びウイルス凝集体を含むフィード組成物を、アニオン交換クロマトグラフィー媒体に、ｒＡＡＶ粒子がクロマトグラフィー媒体に結合するのを可能にする条件下で接触させること、クロマトグラフィー媒体からｒＡＡＶ粒子を溶出すること、ならびに単離されたｒＡＡＶ粒子を含む溶出液を回収することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－８もしくはＡＡＶ－９血清型、またはこれらの派生物もしくは修飾物のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィー媒体は、モノリスクロマトグラフィー媒体である。いくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィー媒体は、４級アミン官能基を含む。いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー材料は、４級アミンを含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＭｇ^２＋、Ｃａ^２＋、またはＺｎ^２＋を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．５ｍＭから約１０ｍＭの間のＭｇ^２＋、Ｃａ^２＋、またはＺｎ^２＋を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＭｇ^２＋を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．５ｍＭから約１０ｍＭの間のＭｇ^２＋を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約１ｍＭから約２．５ｍＭの間のＭｇ^２＋を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＫ^＋、Ｒｂ^＋、またはＣｓ^＋を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．５ｍＭから約１０ｍＭの間のＫ^＋、Ｒｂ^＋、またはＣｓ^＋を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＫ^＋を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．５ｍＭから約１０ｍＭの間のＫ^＋を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、１ｍＭのＫ^＋を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約７．０から約１０．２の間、約８．２から約８．６の間、または約９．１から約９．５の間のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－８血清型、またはその派生物もしくは修飾物のカプシドタンパク質を含み、フィード組成物は、約８．２から約８．６の間のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－９血清型、またはその派生物もしくは修飾物のカプシドタンパク質を含み、フィード組成物は、約９．１から約９．５の間のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、溶出することは、約０．２ＣＶ／分から約５ＣＶ／分の間の流量で行われる。いくつかの実施形態において、溶出することは、約０．５ＣＶ／分から約１．２５ＣＶ／分の間の流量で行われる。いくつかの実施形態において、溶出は、直線塩勾配によって行われる。いくつかの実施形態において、直線塩勾配は、約５から約１００ＣＶの間の体積中に０から５００ｍＭのＮａＣｌを含む。

【0040】

いくつかの実施形態において、本開示は、アニオン交換クロマトグラフィー中における組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子とウイルス凝集体との間の分離を改善するための方法であって、ｒＡＡＶ粒子及びウイルス凝集体を含むフィード組成物を、アニオン交換クロマトグラフィー媒体に、ｒＡＡＶ粒子がクロマトグラフィー媒体に結合するのを可能にする条件下で接触させること、クロマトグラフィー媒体からｒＡＡＶ粒子を溶出すること、ならびに単離されたｒＡＡＶ粒子を含む溶出液を回収することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－８もしくはＡＡＶ－９血清型、またはこれらの派生物もしくは修飾物のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィー媒体は、モノリスクロマトグラフィー媒体である。いくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィー媒体は、４級アミン官能基を含む。いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、４級アミンを含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＭｇ^２＋、Ｃａ^２＋、またはＺｎ^２＋を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．５ｍＭから約１０ｍＭの間のＭｇ^２＋、Ｃａ^２＋、またはＺｎ^２＋を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＭｇ^２＋を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．５ｍＭから約１０ｍＭの間のＭｇ^２＋を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約１ｍＭから約２．５ｍＭの間のＭｇ^２＋を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＫ^＋、Ｒｂ^＋、またはＣｓ^＋を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．５ｍＭから約１０ｍＭの間のＫ^＋、Ｒｂ^＋、またはＣｓ^＋を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＫ^＋を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．５ｍＭから約１０ｍＭの間のＫ^＋を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、１ｍＭのＫ^＋を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約７．０から約１０．２の間、約８．２から約８．６の間、または約９．１から約９．５の間のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－８血清型、またはその派生物もしくは修飾物のカプシドタンパク質を含み、フィード組成物は、約８．２から約８．６の間のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－９血清型、またはその派生物もしくは修飾物のカプシドタンパク質を含み、フィード組成物は、約９．１から約９．５の間のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、溶出することは、約０．２ＣＶ／分から約５ＣＶ／分の間の流量で行われる。いくつかの実施形態において、溶出することは、約０．５ＣＶ／分から約１．２５ＣＶ／分の間の流量で行われる。いくつかの実施形態において、溶出は、直線塩勾配によって行われる。いくつかの実施形態において、直線塩勾配は、約５から約１００ＣＶの間の体積中に０から５００ｍＭのＮａＣｌを含む。

【0041】

いくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィー媒体は、強アニオン交換媒体である。いくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィー媒体は、弱アニオン交換媒体である。

【0042】

いくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィー媒体は、４級アンモニウムリガンドを含む。いくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィー媒体は、４級ポリエチレンイミンを含む。いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、ジエチルアミノエタノール（ＤＥＡＥ）リガンドを含む。４級アンモニウムリガンドを含むクロマトグラフィー媒体の例としては、限定されるものではないが、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（商標）ＱＡ（ＢＩＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）、Ｐｏｒｏｓ ＸＱ及びＨＱ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｑ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、及びＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＧｉｇａＣａｐ Ｑ－６５０Ｍ（Ｔｏｓｈｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）が挙げられる。

【0043】

いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、ジエチルアミノエタノール（ＤＥＡＥ）リガンドを含む。

【0044】

いくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィー媒体は、メタクリレート、アガロースベース材料、セルロース、アクリルアミド、ポリスチレンジビニルベンゼン，またはシリカベース材料を含む。

【0045】

いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、メタクリレート、アガロースベース材料、セルロース、アクリルアミド、ポリスチレンジビニルベンゼン、またはシリカベース材料を含む。いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、メタクリレートまたはポリスチレンジビニルベンゼンを含む。いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、メタクリレートを含む。

【0046】

いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、グリシジルメタクリレート－エチレンジメタクリレートポリマーまたはスチレン－ジビニルベンゼンポリマーを含む。いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、グリシジルメタクリレート－エチレンジメタクリレートポリマーを含む。

【0047】

いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、約４００ｎｍから約１５００ｎｍの間の平均細孔半径を有する。いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、約４００ｎｍから約９００ｎｍの間の平均細孔半径を有する。いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、約６００ｎｍ～約７５０ｎｍの平均細孔半径を有する。いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、約８００ｎｍから約１３００ｎｍの間の平均細孔半径を有する。いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、約９５０ｎｍ～約１１５０ｎｍの平均細孔半径を有する。

【0048】

いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、約０．８μｍから約３μｍの間の平均細孔直径を有する。いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、約０．８μｍから約２μｍの間の平均細孔直径を有する。いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、約２μｍ～約１．５μｍの平均細孔直径を有する。いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、約１．５μｍから約２．５μｍの間の平均細孔直径を有する。いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、約１．９μｍ～約２．４μｍの平均細孔直径を有する。いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、約０．８μｍの平均細孔直径を有する。いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、約１μｍの平均細孔直径を有する。いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、約１．５μｍの平均細孔直径を有する。いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、約２μｍの平均細孔直径を有する。いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、約２．５μｍの平均細孔直径を有する。

【0049】

いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、４級アンモニウムリガンドを含む。いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、ジエチルアミノエタノール（ＤＥＡＥ）リガンドを含む。

【0050】

いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、メタクリレート、４級アンモニウムリガンドを含み、約９５０ｎｍ～約１１５０ｎｍの平均細孔半径を有する。いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、グリシジルメタクリレート－エチレンジメタクリレートポリマー、４級アンモニウムリガンドを含み、約９５０ｎｍ～約１１５０ｎｍの平均細孔半径を有する。いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、メタクリレート、４級アンモニウムリガンドを含み、約６００ｎｍ～７５０ｎｍの平均細孔半径を有する。いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、グリシジルメタクリレート－エチレンジメタクリレートポリマー、４級アンモニウムリガンドを含み、約６００ｎｍ～７５０ｎｍの平均細孔半径を有する。いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、メタクリレート、４級アンモニウムリガンドを含み、約１．５μｍの平均細孔直径を有する。いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、グリシジルメタクリレート－エチレンジメタクリレートポリマー、４級アンモニウムリガンドを含み、約２μｍの平均細孔直径を有する。

【0051】

いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（商標）ＱＡ－１アドバンストコンポジットカラム（４級アミン）、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（商標）ＤＥＡＥ－１アドバンストコンポジットカラム（ジエチルアミノ）、ＣＩＭ（登録商標）ＱＡディスク（４級アミン）、ＣＩＭ（登録商標）ＤＥＡＥ、及びＣＩＭ（登録商標）ＥＤＡディスク（エチレンジアミノ）からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（商標）ＱＡ－１アドバンストコンポジットカラム（４級アミン）である。いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、ＣＩＭ（登録商標）ＱＡディスク（４級アミン）である。

【0052】

いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５、及びＡＡＶ－１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５、及びＡＡＶ－１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６カプシドタンパク質の派生物、修飾物、またはシュードタイプであるカプシドタンパク質を含む。

【0053】

いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－８及びＡＡＶ－９から選択されるＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－８のＡＡＶカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－９のＡＡＶカプシド血清型を有する。

【0054】

いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－８またはＡＡＶ－９カプシドタンパク質の派生物、修飾物、またはシュードタイプであるカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－８カプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上同一、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％同一のＡＡＶ－８カプシドタンパク質を有する、カプシドタンパク質を含む。

【0055】

いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子組成物は、ＡＡＶ－９カプシドタンパク質の派生物、修飾物、またはシュードタイプであるカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物中のｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－９カプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上同一、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％同一のＡＡＶ－９カプシドタンパク質を有する、カプシドタンパク質を含む。

【0056】

追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、モザイクカプシドを含む。追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、シュードタイプのｒＡＡＶ粒子を含む。追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、２つ以上のＡＡＶカプシド血清型のカプシドタンパク質キメラを含むカプシドを含む。

【0057】

いくつかの実施形態において、フィード組成物は、１価カチオンを含む。様々な１価カチオンが存在し、また当業者に知られており、例えば、リチウム（Ｌｉ^＋）、ナトリウム（Ｎａ^＋）、カリウム（Ｋ^＋）、ルビジウム（Ｒｂ^＋）、セシウム（Ｃｓ^＋）、及びフランシウム（Ｆｒ^＋）、ならびにこれらの組合せが挙げられる。当業者は、カチオンが塩形態で存在し得、例えば、カリウム塩（例えば、ＫＣｌ）を水溶液に入れるとカリウムカチオンが生じ得ることを理解するであろう。したがって、本明細書で使用される場合、「１価カチオンの添加」という表現は、荷電状態でのカチオンの添加を包含するだけでなく、本発明のフィード組成物に導入すると１価カチオンを生じる塩またはその他の化合物の添加も包含する。いくつかの実施形態において、１価カチオンはカリウム（Ｋ^＋）である。

【0058】

いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．１ｍＭから約５０ｍＭの間の１価カチオンを含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間の１価カチオンを含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．２ｍＭから約５０ｍＭの間の１価カチオンを含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．２ｍＭから約５０ｍＭの間のＫ^＋を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．５ｍＭから約１０ｍＭの間のＫ^＋を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＫ^＋を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．５ｍＭから約１０ｍＭの間のＲｂ^＋を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＲｂ^＋を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．５ｍＭから約１０ｍＭの間のＣｓ^＋を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＣｓ^＋を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約１ｍＭのＫ^＋を含む。いくつかの実施形態において、Ｋ^＋は、塩化カリウムまたは酢酸カリウムである。いくつかの実施形態において、Ｋ^＋は、塩化カリウムである。

【0059】

いくつかの実施形態において、フィード組成物は、２価カチオンを含む。様々な２価カチオンが存在し、かつ当業者に知られており、例えば、カルシウムカチオン（Ｃａ^２＋）、マグネシウムカチオン（Ｍｇ^２＋）、銅カチオン（Ｃｕ^２＋）、コバルトカチオン（Ｃｏ^２＋）、マンガンカチオン（Ｍｎ^２＋）、ニッケルカチオン（Ｎｉ^２＋）、亜鉛カチオン（Ｚｎ^２＋）、及びこれらの組合せが挙げられる。当業者は、カチオンが塩形態で存在し得、例えば、マグネシウム塩（例えば、ＭｇＣｌ_２）を水溶液に入マグネシウムカチオンが生じ得ることを理解するであろう。したがって、本明細書で使用される場合、「２価カチオンの添加」という表現は、荷電状態でのカチオンの添加を包含するだけでなく、本発明の組成物に導入すると２価カチオンを生じる塩またはその他の化合物の添加も包含する。いくつかの実施形態において、２価カチオンは、Ｍｇ^２＋、Ｍｎ^２＋、Ｃｕ^２＋、Ｚｎ^２＋、もしくはこれらの塩（例えば、ＭｇＣｌ_２、ＭｎＣｌ_２、ＣｕＣｌ_２、及びＺｎＣｌ_２）、またはこれらのカチオンもしくは塩のうちの１つ以上の組合せである。いくつかの実施形態において、２価カチオンは、Ｍｇ^２＋、Ｃａ^２＋、Ｚｎ^２＋、もしくはこれらの塩（例えば、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、及びＺｎＣｌ_２）、またはこれらのカチオンもしくは塩のうちの１つ以上の組合せである。

【0060】

いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．１ｍＭから約５０ｍＭの間の２価カチオンを含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間の２価カチオンを含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．２ｍＭから約５０ｍＭの間の２価カチオンを含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．２ｍＭから約５０ｍＭの間のＭｇ^２＋を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＭｇ^２＋を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．５ｍＭから約１０ｍＭの間のＭｇ^２＋を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．５ｍＭから約５ｍＭの間のＭｇ^２＋を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約１ｍＭのＭｇ^２＋を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約１ｍＭのＭｇ^２＋を含む。いくつかの実施形態において、Ｍｇ^２＋は、塩化マグネシウムである。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＣａ^２＋を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＺｎ^２＋を含む。

【0061】

いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．１ｍＭから約５０ｍＭの間の１価カチオン及び約０．１ｍＭから約５０ｍＭの間の２価カチオンを含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間の１価カチオン及び約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間の２価カチオンを含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．２ｍＭから約５０ｍＭの間の１価カチオン及び約０．２ｍＭから約５０ｍＭの間の２価カチオンを含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間のＫ^＋及び約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間の２価のＭｇ^２＋を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．２ｍＭから約５０ｍＭの間のＫ^＋及び約０．２ｍＭから約５０ｍＭの間のＭｇ^２＋を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．５ｍＭから約１０ｍＭの間のＫ^＋及び約０．５ｍＭから約１０ｍＭの間のＭｇ^２＋を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．５ｍＭから約５ｍＭの間のＫ^＋及び約０．５ｍＭから約５ｍＭの間のＭｇ^２＋を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約１ｍＭのＫ^＋及び約１ｍＭのＭｇ^２＋を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約１ｍＭのＫ^＋及び約２．５ｍＭのＭｇ^２＋を含む。

【0062】

いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－８のＡＡＶカプシド血清型を含み、フィード組成物は、約１ｍＭのＫ^＋及び約２．５ｍＭのＭｇ^２＋を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－９のＡＡＶカプシド血清型を含み、フィード組成物は、約１ｍＭのＫ^＋及び約１ｍＭのＭｇ^２＋を含む。

【0063】

いくつかの実施形態において、フィード組成物は、緩衝剤を含む。いくつかの実施形態において、平衡緩衝液、洗浄緩衝液、及び溶出緩衝液は、緩衝剤を含む。いくつかの実施形態において、緩衝剤は、トリス（例えば、トリスＨＣｌ）、ビス－トリスプロパン、ヘペス、またはリン酸緩衝液である。いくつかの実施形態において、緩衝剤は、トリス（例えば、トリスＨＣｌ）である。

【0064】

いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約０．０１％から約０．５％の間の非イオン性界面活性剤をさらに含む。いくつかの実施形態において、平衡緩衝液、洗浄緩衝液、及び溶出緩衝液は、約０．０１％から約０．５％の非イオン性界面活性剤を含む。医薬的に許容される非イオン性界面活性剤としては、限定されるものではないが、ポロキサマー１８８、ポロキサマー４０７、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、プルロニックＦ－６８、またはＢＲＩＪ ３５が挙げられる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される製剤は、ポロキサマー１８８、ポロキサマー４０７、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、プルロニックＦ－６８、ＢＲＩＪ ３５、またはこれらの組合せを含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、プルロニックＦ－６８を含む。

【0065】

いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約６．５から約１０．５の間のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約７．０から約１０．２の間のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約８．２から約９．５の間のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約８．２から約８．６の間のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約９．１から約９．５の間のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約８．４のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、約９．３のｐＨを有する。

【0066】

いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－８のＡＡＶカプシド血清型を含み、フィード組成物は、約８．２から約８．６の間のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－９のＡＡＶカプシド血清型を含み、フィード組成物は、約９．１から約９．５の間のｐＨを有する。

【0067】

いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－８のＡＡＶカプシド血清型を含み、フィード組成物は、約８．４のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－９のＡＡＶカプシド血清型を含み、フィード組成物は、約９．３のｐＨを有する。

【0068】

いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－８のＡＡＶカプシド血清型を含み、フィード組成物は、約１ｍＭのＫ^＋及び約２．５ｍＭのＭｇ^２＋を含み、約８．４のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－９のＡＡＶカプシド血清型を含み、フィード組成物は、約１ｍＭのＫ^＋及び約１ｍＭのＭｇ^２＋を含み、約９．３のｐＨを有する。

【0069】

当業者は、アニオン交換クロマトグラフィーが、複数の緩衝組成物を含む緩衝系の使用、例えば、フィード組成物のロード前にクロマトグラフィー樹脂を平衡化するための平衡緩衝液と、フィード組成物のロード後にクロマトグラフィー媒体から結合していない不純物を洗浄するための洗浄緩衝液と、クロマトグラフィー媒体から結合した材料（結合したｒＡＡＶ粒子を含む）を溶出するための溶出緩衝液とを含む緩衝系の使用を包含し得ることを理解する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、平衡緩衝液、洗浄緩衝液、及び溶出緩衝液のうちの１つ以上を含む緩衝系を使用する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、平衡緩衝液、洗浄緩衝液、及び溶出緩衝液のうちの２つ以上を含む緩衝系を使用する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、平衡緩衝液、洗浄緩衝液、及び溶出緩衝液を使用する。

【0070】

いくつかの実施形態において、緩衝系の各メンバーは、約０．２ｍＭから約５０ｍＭの間の１価カチオン及び約０．２ｍＭから約５０ｍＭの間の２価カチオンを含み、８．２から８．６の間または９．１から９．５の間のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、緩衝系の各メンバーは、約０．２ｍＭから約５０ｍＭの間のＫ^＋及び約０．２ｍＭから約５０ｍＭの間のＭｇ^２＋を含み、８．２から８．６の間または９．１から９．５の間のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、緩衝系の各メンバーは、約０．５ｍＭから約１０ｍＭのＫ^＋及び約０．５ｍＭから約１０ｍＭのＭｇ^２＋を含み、８．２から８．６の間または９．１から９．５の間のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、緩衝系の各メンバーは、約０．５ｍＭから約５ｍＭの間のＫ^＋及び約０．５ｍＭから約５ｍＭの間のＭｇ^２＋を含み、８．２から８．６の間または９．１から９．５の間のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、緩衝系の各メンバーは、約１ｍＭのＫ^＋及び約２．５ｍＭのＭｇ^２＋を含み、８．２から８．６の間または９．１から９．５の間のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、緩衝系の各メンバーは、約１ｍＭのＫ^＋及び約１ｍＭのＭｇ^２＋を含み、８．２から８．６の間または９．１から９．５の間のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、緩衝系の各メンバーは、約１ｍＭのＫ^＋及び約２．５ｍＭのＭｇ^２＋を含み、約８．４のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、緩衝系の各メンバーは、約１ｍＭのＫ^＋及び約１ｍＭのＭｇ^２＋を含み、約９．３のｐＨを有する。

【0071】

いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－８のＡＡＶカプシド血清型を含み、緩衝系の各メンバーは、約１ｍＭのＫ^＋及び約２．５ｍＭのＭｇ^２＋を含み、緩衝系の各メンバーは、約８．４のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－９のＡＡＶカプシド血清型を含み、緩衝系の各メンバーは、約１ｍＭのＫ^＋及び約１ｍＭのＭｇ^２＋を含み、緩衝系の各メンバーは、約９．３のｐＨを有する。

【0072】

いくつかの実施形態において、本開示の方法は、アニオン交換クロマトグラフィー媒体を平衡緩衝液を用いて平衡化することを含む。いくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィー媒体は、ロードする前に、フィード組成物とほぼ同じ２価カチオン濃度、１価カチオン濃度、及びｐＨを含む緩衝液を使用して平衡化される。いくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィー媒体は、ロードする前に、フィード組成物とほぼ同じＭｇ^２＋濃度、Ｋ^＋濃度、及びｐＨを含む緩衝液を使用して平衡化される。いくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィー媒体は、クロマトグラフィーカラムである。クロマトグラフィーカラムは、当技術分野で知られている任意の方法を使用して平衡化することができる。例えば、アニオン交換クロマトグラフィーカラムは、カラムを１０カラム体積（ＣＶ）の平衡緩衝液を用いて洗浄することにより、平衡化することができる。

【0073】

フィード組成物をアニオン交換クロマトグラフィー媒体に接触させることは、当技術分野で知られている任意の方法を用いて、フィード組成物をアニオン交換クロマトグラフィー媒体（例えば、モノリスアニオン交換クロマトグラフィーカラム）にロードすることを含む。

【0074】

いくつかの実施形態において、本開示の方法は、結合したｒＡＡＶ粒子を含むアニオン交換クロマトグラフィー媒体（例えば、モノリスカラム）を洗浄緩衝液を用いて洗浄して、結合していない不純物を除去することを含む。いくつかの実施形態において、洗浄緩衝液は、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間の２価カチオン及び約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間の１価カチオンを含む。いくつかの実施形態において、洗浄緩衝液は、フィード組成物とほぼ同じ２価カチオン濃度、１価カチオン濃度、及びｐＨを含む。いくつかの実施形態において、洗浄緩衝液は、約０．１ｍＭから約２０ｍＭのＭｇ^２＋を含む。いくつかの実施形態において、洗浄緩衝液は、約０．１ｍＭから約２０ｍＭのＫ^＋を含む。いくつかの実施形態において、洗浄緩衝液は、約０．１ｍＭから約２０ｍＭのＭｇ^２＋及び約０．１ｍＭから約２０ｍＭのＫ^＋を含む。いくつかの実施形態において、洗浄緩衝液は、８ｍＭのＭｇ^２＋（例えば、ＭｇＣｌ_２）及び２．５ｍＭのＫ^＋（例えば、ＫＣｌ）を含む。いくつかの実施形態において、洗浄緩衝液は、フィード組成物とほぼ同じＭｇ^２＋濃度、Ｋ^＋濃度、及びｐＨを含む。いくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィー媒体は、約５ＣＶから３０ＣＶの間の洗浄緩衝液を用いて洗浄される。

【0075】

いくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィー媒体（例えば、モノリスカラム）に結合したｒＡＡＶ粒子は、勾配を用いて溶出される。いくつかの実施形態において、勾配は、塩勾配である。いくつかの実施形態において、勾配は、直線塩勾配である。いくつかの実施形態において、直線塩勾配は、約０ｍＭから約５００ｍＭの間のＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態において、直線塩勾配は、約５ｍＭから約５００ｍＭの間のＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態において、直線塩勾配は、約５ｍＭから約２００ｍＭの間のＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態において、直線塩勾配は、約１０ｍＭから約２００ｍＭの間のＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態において、直線塩勾配は、約１０ｍＭから約１２０ｍＭの間のＮａＣｌを含む。

【0076】

いくつかの実施形態において、直線塩勾配は、約５ＣＶから約１００ＣＶの間の体積でアニオン交換クロマトグラフィー媒体（例えば、モノリスカラム）に適用される。いくつかの実施形態において、直線塩勾配は、約２０ＣＶから約８０ＣＶの間の体積で適用される。いくつかの実施形態において、直線塩勾配は、約３０ＣＶから約７０ＣＶの間の体積で適用される。いくつかの実施形態において、直線塩勾配は、約４０ＣＶから約６０ＣＶの間の体積で適用される。いくつかの実施形態において、直線塩勾配は、約４０ＣＶの体積で適用される。いくつかの実施形態において、直線塩勾配は、約５０ＣＶの体積で適用される。いくつかの実施形態において、直線塩勾配は、約６０ＣＶの体積で適用される。

【0077】

いくつかの実施形態において、直線塩勾配は、約０．２ＣＶ／分から約５ＣＶ／分の間の流量でアニオン交換クロマトグラフィー媒体（例えば、モノリスカラム）に適用される。いくつかの実施形態において、直線塩勾配は、約０．５ＣＶ／分から約１．２５ＣＶ／分の間の流量でアニオン交換クロマトグラフィー媒体に適用される。

【0078】

いくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィー媒体（例えば、モノリスカラム）に結合したｒＡＡＶ粒子は、約１０ｍＭから約２００ｍＭの間のＮａＣｌを含む直線塩勾配で溶出され、このとき、勾配は約４０ＣＶから約６０ＣＶの間の体積で適用される。いくつかの実施形態において、直線塩勾配は、約４０ＣＶの体積で適用される。いくつかの実施形態において、直線塩勾配は、約５０ＣＶの体積で適用される。いくつかの実施形態において、直線塩勾配は、約６０ＣＶの体積で適用される。いくつかの実施形態において、直線塩勾配は、約０．５ＣＶ／分から約１．２５ＣＶ／分の間の流量でアニオン交換クロマトグラフィー媒体に適用される。

【0079】

いくつかの実施形態において、フィード組成物は、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶＸアフィニティー樹脂、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ９アフィニティー樹脂、またはＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ８アフィニティー樹脂を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製されたｒＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、ＡＶＢ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製されたｒＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、例えば、ＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＥまたはＨｅｐａｒｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂を用いたヘパリンアフィニティークロマトグラフィーによって精製されたｒＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態において、フィード組成物は、アフィニティークロマトグラフィーによって生成される組成物、例えば溶出液を含む。いくつかの実施形態において、アフィニティークロマトグラフィーによって生成される組成物、例えば溶出液は、アニオン交換クロマトグラフィー媒体（例えば、モノリスカラム）に接触させる前に処理される。いくつかの実施形態において、前処理は、塩を添加することを含む。いくつかの実施形態において、前処理は、Ｋ^＋塩またはＭｇ^２＋塩を添加することを含む。いくつかの実施形態において、前処理は、Ｋ^＋塩及びＭｇ^２＋塩を添加することを含む。

【0080】

いくつかの実施形態において、前処理は、約０．２ｍＭから約５０ｍＭの間の最終濃度までＫ^＋塩を添加することを含む。いくつかの実施形態において、前処理は、約０．５ｍＭから約１０ｍＭの間の最終濃度までＫ^＋塩を添加することを含む。いくつかの実施形態において、前処理は、約１ｍＭの最終濃度までＫ^＋塩を添加することを含む。いくつかの実施形態において、前処理は、約０．２ｍＭから約５０ｍＭの間の最終濃度までＭｇ^２＋塩を添加することを含む。いくつかの実施形態において、前処理は、約０．５ｍＭから約１０ｍＭの間の最終濃度までＭｇ^２＋塩を添加することを含む。いくつかの実施形態において、前処理は、約１ｍＭの最終濃度までＭｇ^２＋塩を添加することを含む。いくつかの実施形態において、前処理は、約２．５ｍＭの最終濃度までＭｇ^２＋塩を添加することを含む。いくつかの実施形態において、塩は、ＫＣｌである。いくつかの実施形態において、塩は、ＭｇＣｌ_２である。いくつかの実施形態において、前処理は、約０．５ｍＭから約１０ｍＭのＫ^＋及び約０．５ｍＭから約１０ｍＭのＭｇ^２＋を含むロード希釈緩衝液を加えることを含む。いくつかの実施形態において、ロード希釈緩衝液は、約２ｍＭのＫ^＋及び約５ｍＭのＭｇ^２＋を含む。いくつかの実施形態において、ロード希釈緩衝液は、約１ｍＭのＫ^＋及び約２．５ｍＭのＭｇ^２＋を含む。いくつかの実施形態において、ロード希釈緩衝液は、約２ｍＭのＫ^＋及び約２ｍＭのＭｇ^２＋を含む。いくつかの実施形態において、ロード希釈緩衝液は、約１ｍＭのＫ^＋及び約１ｍＭのＭｇ^２＋を含む。

【0081】

いくつかの実施形態において、前処理は、ｐＨを調整することを含む。いくつかの実施形態において、前処理は、ｐＨを調整することを含む。いくつかの実施形態において、前処理は、ｐＨを約７．０から約１０．２の間に調整することを含む。いくつかの実施形態において、前処理は、ｐＨを約８．６から約９．５の間に調整することを含む。いくつかの実施形態において、前処理は、ｐＨを約８．２から約８．６の間、または約９．１から約９．５の間に調整することを含む。いくつかの実施形態において、前処理は、ｐＨを約８．４に調整することを含む。いくつかの実施形態において、前処理は、ｐＨを約９．３に調整することを含む。いくつかの実施形態において、アフィニティークロマトグラフィーによって生成される組成物、例えば溶出液は、アニオン交換クロマトグラフィー媒体（例えば、モノリスカラム）に接触させる前に前処理されない。

【0082】

いくつかの実施形態において、フィード組成物は、アフィニティークロマトグラフィーによって生成される組成物、例えば、溶出液を含み、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－８のＡＡＶカプシド血清型を含み、前処理は、Ｋ^＋塩を約１ｍＭの最終濃度まで添加すること、Ｍｇ^２＋塩を約２．５ｍＭの最終濃度まで添加すること、及びｐＨを約８．４に調整することを含む。

【0083】

いくつかの実施形態において、フィード組成物は、アフィニティークロマトグラフィーによって生成される組成物、例えば、溶出液を含み、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－９のＡＡＶカプシド血清型を含み、前処理は、Ｋ^＋塩を約１ｍＭの最終濃度まで添加すること、Ｍｇ^２＋塩を約１ｍＭの最終濃度まで添加すること、及びｐＨを約９．３に調整することを含む。

【0084】

いくつかの実施形態において、不純物は、生成物関連の不純物、例えば、不活性のベクター形態、空のまたは充填不完全なウイルスカプシド、凝集したウイルス粒子またはカプシド、ミスフォールドしたウイルスカプシド、分解したウイルス粒子を含む。いくつかの実施形態において、不純物は、空のウイルスカプシド及び凝集したウイルス粒子またはカプシドを含む。

【0085】

いくつかの実施形態において、提供される方法は、単離されたｒＡＡＶ粒子及び不純物を分離する。いくつかの実施形態において、単離されたｒＡＡＶ粒子は、約９０％未満の空のウイルスカプシドを含む。いくつかの実施形態において、単離されたｒＡＡＶ粒子は、約８０％未満の空のウイルスカプシドを含む。いくつかの実施形態において、単離されたｒＡＡＶ粒子は、約７０％未満の空のウイルスカプシドを含む。いくつかの実施形態において、単離されたｒＡＡＶ粒子は、約６０％未満の空のウイルスカプシドを含む。いくつかの実施形態において、単離されたｒＡＡＶ粒子は、約５０％未満の空のウイルスカプシドを含む。いくつかの実施形態において、単離されたｒＡＡＶ粒子は、約４０％未満の空のウイルスカプシドを含む。いくつかの実施形態において、単離されたｒＡＡＶ粒子は、約３０％未満の空のウイルスカプシドを含む。いくつかの実施形態において、単離されたｒＡＡＶ粒子は、約２０％未満の空のウイルスカプシドを含む。いくつかの実施形態において、単離されたｒＡＡＶ粒子は、約１５％未満の空のウイルスカプシドを含む。いくつかの実施形態において、単離されたｒＡＡＶ粒子は、約１０％未満の空のウイルスカプシドを含む。いくつかの実施形態において、単離されたｒＡＡＶ粒子は、約９％未満の空のウイルスカプシドを含む。いくつかの実施形態において、単離されたｒＡＡＶ粒子は、約８％未満の空のウイルスカプシドを含む。いくつかの実施形態において、単離されたｒＡＡＶ粒子は、約７％未満の空のウイルスカプシドを含む。いくつかの実施形態において、単離されたｒＡＡＶ粒子は、約６％未満の空のウイルスカプシドを含む。いくつかの実施形態において、単離されたｒＡＡＶ粒子は、約５％未満の空のウイルスカプシドを含む。いくつかの実施形態において、単離されたｒＡＡＶ粒子は、約４％未満の空のウイルスカプシドを含む。いくつかの実施形態において、単離されたｒＡＡＶ粒子は、約３％未満の空のウイルスカプシドを含む。いくつかの実施形態において、単離されたｒＡＡＶ粒子は、約２％未満の空のウイルスカプシドを含む。いくつかの実施形態において、単離されたｒＡＡＶ粒子は、約１％未満の空のウイルスカプシドを含む。

【0086】

いくつかの実施形態において、溶出液中のウイルスカプシドの少なくとも約１０％は、インタクトなｒＡＡＶ粒子である。いくつかの実施形態において、溶出液中のウイルスカプシドの少なくとも約２０％は、インタクトなｒＡＡＶ粒子である。いくつかの実施形態において、溶出液中のウイルスカプシドの少なくとも約３０％は、インタクトなｒＡＡＶ粒子である。いくつかの実施形態において、溶出液中のウイルスカプシドの少なくとも約４０％は、インタクトなｒＡＡＶ粒子である。いくつかの実施形態において、溶出液中のウイルスカプシドの少なくとも約５０％は、インタクトなｒＡＡＶ粒子である。いくつかの実施形態において、溶出液中のウイルスカプシドの少なくとも約６０％は、インタクトなｒＡＡＶ粒子である。いくつかの実施形態において、溶出液中のウイルスカプシドの少なくとも約７０％は、インタクトなｒＡＡＶ粒子である。いくつかの実施形態において、溶出液中のウイルスカプシドの少なくとも約８０％は、インタクトなｒＡＡＶ粒子である。いくつかの実施形態において、溶出液中のウイルスカプシドの少なくとも約９０％は、インタクトなｒＡＡＶ粒子である。いくつかの実施形態において、溶出液中のウイルスカプシドの少なくとも約９５％は、インタクトなｒＡＡＶ粒子である。いくつかの実施形態において、溶出液中のウイルスカプシドの少なくとも約９７％は、インタクトなｒＡＡＶ粒子である。いくつかの実施形態において、溶出液中のウイルスカプシドの少なくとも約９８％は、インタクトなｒＡＡＶ粒子である。いくつかの実施形態において、溶出液中のウイルスカプシドの少なくとも約９９％は、インタクトなｒＡＡＶ粒子である。

【0087】

いくつかの実施形態において、単離されたｒＡＡＶ粒子は、約２０％未満の凝集したウイルス粒子またはカプシドを含む。いくつかの実施形態において、単離されたｒＡＡＶ粒子は、約１５％未満の凝集したウイルス粒子またはカプシドを含む。いくつかの実施形態において、単離されたｒＡＡＶ粒子は、約１０％未満の凝集したウイルス粒子またはカプシドを含む。いくつかの実施形態において、単離されたｒＡＡＶ粒子は、約９％未満の凝集したウイルス粒子またはカプシドを含む。いくつかの実施形態において、単離されたｒＡＡＶ粒子は、約８％未満の凝集したウイルス粒子またはカプシドを含む。いくつかの実施形態において、単離されたｒＡＡＶ粒子は、約７％未満の凝集したウイルス粒子またはカプシドを含む。いくつかの実施形態において、単離されたｒＡＡＶ粒子は、約６％未満の凝集したウイルス粒子またはカプシドを含む。いくつかの実施形態において、単離されたｒＡＡＶ粒子は、約５％未満の凝集したウイルス粒子またはカプシドを含む。いくつかの実施形態において、単離されたｒＡＡＶ粒子は、約４％未満の凝集したウイルス粒子またはカプシドを含む。いくつかの実施形態において、単離されたｒＡＡＶ粒子は、約３％未満の凝集したウイルス粒子またはカプシドを含む。いくつかの実施形態において、単離されたｒＡＡＶ粒子は、約２％未満の凝集したウイルス粒子またはカプシドを含む。いくつかの実施形態において、単離されたｒＡＡＶ粒子は、約１％未満の凝集したウイルス粒子またはカプシドを含む。

【0088】

提供される方法は、ｒＡＡＶを顕著に損失することなく、単離されたｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子の収率は、少なくとも約４０％である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子の収率は、少なくとも約５０％である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子の収率は、少なくとも約６０％である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子の収率は、少なくとも約７０％である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子の収率は、少なくとも約７５％である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子の収率は、少なくとも約８０％である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子の収率は、少なくとも約８５％である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子の収率は、少なくとも約９０％である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子の収率は、少なくとも約９５％である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子の収率は、少なくとも約９６％である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子の収率は、少なくとも約９７％である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子の収率は、少なくとも約９８％である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子の収率は、少なくとも約９９％である。１つの実施形態において、収率は、ゲノムコピー（ＧＣ）収率である。

【0089】

いくつかの実施形態において、クロマトグラフィー緩衝液（例えば、フィード組成物、平衡緩衝液、ロード希釈緩衝液、洗浄緩衝液、溶出緩衝液）に１価カチオン（Ｋ^＋、Ｒｂ^＋、またはＣｓ^＋）及び２価カチオン（例えば、Ｍｇ^２＋、Ｃａ^２＋、またはＺｎ^２＋）を含めることで、ｒＡＡＶ粒子の収率が増加する。いくつかの実施形態において、クロマトグラフィー緩衝液に１価カチオン（Ｋ^＋、Ｒｂ^＋、またはＣｓ^＋）及び２価カチオン（例えば、Ｍｇ^２＋、Ｃａ^２＋、またはＺｎ^２＋）を含めることで、ゲノムコピー（ＧＣ）収率が約５％から３５％の間だけ増加する。いくつかの実施形態において、収率は、約１０％から約３０％の間だけ増加する。いくつかの実施形態において、収率は約１０％だけ増加する。いくつかの実施形態において、収率は約１５％だけ増加する。いくつかの実施形態において、収率は約２０％だけ増加する。いくつかの実施形態において、収率は約２５％だけ増加する。いくつかの実施形態において、収率は約３０％だけ増加する。

【0090】

いくつかの実施形態において、クロマトグラフィー緩衝液（例えば、フィード組成物、平衡緩衝液、ロード希釈緩衝液、洗浄緩衝液、溶出緩衝液）にＫ^＋及びＭｇ^２＋を含めることで、ｒＡＡＶ粒子の収率が増加する。いくつかの実施形態において、クロマトグラフィー緩衝液にＫ^＋及びＭｇ^２＋を含めることで、ゲノムコピー（ＧＣ）の収率が約５％から３５％の間だけ増加する。いくつかの実施形態において、収率は、約１０％から約３０％の間だけ増加する。いくつかの実施形態において、収率は約１０％だけ増加する。いくつかの実施形態において、収率は約１５％だけ増加する。いくつかの実施形態において、収率は約２０％だけ増加する。いくつかの実施形態において、収率は約２５％だけ増加する。いくつかの実施形態において、収率は約３０％だけ増加する。

【0091】

ｒＡＡＶ粒子
提供される方法は、任意の単離された組換えＡＡＶ粒子の生成で使用するのに適している。そのため、本開示の方法によるフィード組成物中のｒＡＡＶは、当技術分野で知られている任意の血清型、修飾、もしくは派生物、またはこれらの任意の組合せ（例えば、２つ以上の血清型を含む（例えば、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ８、及びｒＡＡＶ９粒子のうちの２つ以上を含む）ｒＡＡＶ粒子集団）とすることができる。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７，ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５、及びＡＡＶ－１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６、または他のｒＡＡＶ粒子、あるいはこれらのうちの２つ以上の組合せである。

【0092】

いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５、及びＡＡＶ－１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６、またはこれらの派生物、修飾物、もしくはシュードタイプから選択されるＡＡＶ血清型からのカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５、及びＡＡＶ－１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ｒＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶカプシド血清型のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上同一である、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち最大１００％同一である、カプシドタンパク質を含む。

【0093】

いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５、及びＡＡＶ－１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６、またはこれらの派生物、修飾物、もしくはシュードタイプから選択されるＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５、及びＡＡＶ－１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶカプシド血清型のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上同一である、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち最大１００％同一である、カプシドタンパク質を含む。

【0094】

いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、Ｚｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１２（６）：１０５６－１０６８（参照によりその全体が援用される）で説明されているように、Ａｎｃ８０またはＡｎｃ８０Ｌ６５のカプシドを含む。ある特定の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第９，１９３，９５６号、第９４５８５１７号、及び第９，５８７，２８２号、ならびに米国特許出願公開第２０１６／０３７６３２３号（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）で説明されているように、アミノ酸挿入物：ＬＧＥＴＴＲＰまたはＬＡＬＧＥＴＴＲＰのうちの１つを有するカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第９，１９３，９５６号、第９，４５８，５１７号、及び第９，５８７，２８２号、ならびに米国特許出願公開第２０１６／０３７６３２３号（これらの各々は、参照によりその全体が明細書に援用される）で説明されているように、ＡＡＶ．７ｍ８のカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第９，５８５，９７１号で開示されている任意のＡＡＶカプシド、例えばＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第９，８４０，７１９号及びＷＯ２０１５／０１３３１３（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている任意のＡＡＶカプシド、例えば、ＡＡＶ．Ｒｈ７４及びＲＨＭ４－１を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＷＯ２０１４／１７２６６９（参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている任意のＡＡＶカプシド、例えばＡＡＶ ｒｈ．７４を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、Ｇｅｏｒｇｉａｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２３：８５７－８６２及びＧｅｏｒｇｉａｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２５：４５０（これらの各々は、参照によりその全体が援用される）で説明されているように、ＡＡＶ２／５のカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＷＯ２０１７／０７０４９１（参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている任意のＡＡＶカプシド、例えばＡＡＶ２ｔＹＦを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、Ｐｕｚｚｏ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ． Ｍｅｄ．２９（９）：４１８で説明されているようなＡＡＶＬＫ０３またはＡＡＶ３Ｂのカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第８，６２８，９６６号、第ＵＳ８，９２７，５１４号、第ＵＳ９，９２３，１２０号、及びＷＯ２０１６／０４９２３０で開示されている任意のＡＡＶカプシド、例えば、ＨＳＣ１、ＨＳＣ２、ＨＳＣ３、ＨＳＣ４、ＨＳＣ５、ＨＳＣ６、ＨＳＣ７、ＨＳＣ８、ＨＳＣ９、ＨＳＣ１０、ＨＳＣ１１、ＨＳＣ１２、ＨＳＣ１３、ＨＳＣ１４、ＨＳＣ１５、またはＨＳＣ１６を含む（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）。

【0095】

いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、以下の特許及び特許出願（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）：米国特許第７，２８２，１９９号、第７，９０６，１１１号、第８，５２４，４４６号、第８，９９９，６７８号、第８，６２８，９６６号、第８，９２７，５１４号、第８，７３４，８０９号、第ＵＳ９，２８４，３５７号、第９，４０９，９５３号、第９，１６９，２９９号、第９，１９３，９５６号、第９４５８５１７、及び第９，５８７，２８２号、米国特許出願公開第２０１５／０３７４８０３号、第２０１５／０１２６５８８号、第２０１７／００６７９０８号、第２０１３／０２２４８３６号、第２０１６／０２１５０２４号、第２０１７／００５１２５７号、ならびに国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３４７９９号、第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５３３３５のいずれかで開示されているＡＡＶカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、以下の特許及び特許出願（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）のいずれかで開示されているＡＡＶカプシドのＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上同一である、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち最大１００％同一であるカプシドタンパク質を有する：米国特許第７，２８２，１９９号、第７，９０６，１１１号、第８，５２４，４４６号、第８，９９９，６７８号、第８，６２８，９６６号、第８，９２７，５１４号、第８，７３４，８０９号、第ＵＳ９，２８４，３５７号、第９，４０９，９５３号、第９，１６９，２９９号、第９，１９３，９５６号、第９４５８５１７号、及び第９，５８７，２８２号、米国特許出願公開第２０１５／０３７４８０３号、第２０１５／０１２６５８８号、第２０１７／００６７９０８号、第２０１３／０２２４８３６号、第２０１６／０２１５０２４号、第２０１７／００５１２５７、ならびに国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３４７９９号、第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５３３３５号。

【0096】

いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、国際特許出願公開第ＷＯ２００３／０５２０５１号（例えば、配列番号２を参照）、第ＷＯ２００５／０３３３２１号（例えば、配列番号１２３及び８８を参照）、第ＷＯ０３／０４２３９７号（例えば、配列番号２、８１、８５、及び９７を参照）、第ＷＯ２００６／０６８８８８号（例えば、配列番号１及び３～６を参照）、第ＷＯ２００６／１１０６８９号（例えば、配列番号５～３８を参照）、第ＷＯ２００９／１０４９６４号（例えば、配列番号１～５、７、９、２０、２２、２４、及び３１を参照）、第ＷＯ２０１０／１２７０９７号（例えば、配列番号５～３８を参照）、ならびに第ＷＯ２０１５／１９１５０８号（例えば、配列番号８０～２９４を参照）、ならびに米国特許出願公開第２０１５００２３９２４号（例えば、配列番号１、５～１０を参照）（これらの各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されているカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、以下で開示されているＡＡＶカプシドのＶＰ１、ＶＰ２及び／またはＶＰ３配列に対し、少なくとも８０％以上同一、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％同一であるカプシドタンパク質を有する：国際特許出願公開第ＷＯ２００３／０５２０５１号（例えば、配列番号２を参照）、第ＷＯ２００５／０３３３２１号（例えば、配列番号１２３及び８８を参照）、第ＷＯ０３／０４２３９７号（例えば、配列番号２、８１、８５、及び９７を参照）、第ＷＯ２００６／０６８８８８号（例えば、配列番号１及び３～６を参照）、第ＷＯ２００６／１１０６８９号（例えば、配列番号５～３８を参照）、第ＷＯ２００９／１０４９６４号（例えば、配列番号１～５、７、９、２０、２２、２４、及び３１を参照）、第ＷＯ２０１０／１２７０９７号（例えば、配列番号５～３８を参照）、ならびに第ＷＯ２０１５／１９１５０８号（例えば、配列番号８０～２９４を参照）、ならびに米国特許出願公開第２０１５００２３９２４号（例えば、配列番号１、５～１０を参照）。

【0097】

ＡＡＶベースウイルスベクターの核酸配列、ならびに組換えＡＡＶ及びＡＡＶカプシドを作製する方法は、例えば、以下で教示されている：米国特許第７，２８２，１９９号、第７，９０６，１１１号、第８，５２４，４４６号、第８，９９９，６７８号、第８，６２８，９６６号、第８，９２７，５１４号、第８，７３４，８０９号、第ＵＳ９，２８４，３５７号、第９，４０９，９５３号、第９，１６９，２９９号、第９，１９３，９５６号、第９４５８５１７号、及び第９，５８７，２８２号、米国特許出願公開第２０１５／０３７４８０３号、第２０１５／０１２６５８８号、第２０１７／００６７９０８号、第２０１３／０２２４８３６号、第２０１６／０２１５０２４号、第２０１７／００５１２５７号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３４７９９号、第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５３３３５号、第ＷＯ２００３／０５２０５１号、第ＷＯ２００５／０３３３２１号、第ＷＯ０３／０４２３９７号、第ＷＯ２００６／０６８８８８号、第ＷＯ２００６／１１０６８９号、第ＷＯ２００９／１０４９６４号、第ＷＯ２０１０／１２７０９７号、及び第ＷＯ２０１５／１９１５０８号、ならびに米国特許出願公開第２０１５００２３９２４号。

【0098】

提供される方法は、導入遺伝子をコードする組換えＡＡＶの生成で使用するのに適している。いくつかの実施形態において、本明細書では、抗ＶＥＧＦ ＦａｂをコードするｒＡＡＶウイルスベクターが提供される。具体的な実施形態において、本明細書では、抗ＶＥＧＦ ＦａｂをコードするｒＡＡＶ８ベースウイルスベクターが提供される。より具体的な実施形態において、本明細書では、ラニビズマブをコードするｒＡＡＶ８ベースウイルスベクターが提供される。いくつかの実施形態において、本明細書では、イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）をコードするｒＡＡＶウイルスベクターが提供される。具体的な実施形態において、本明細書では、ＩＤＵＡをコードするｒＡＡＶ９ベースウイルスベクターが提供される。いくつかの実施形態において、本明細書では、イズロン酸２－スルファターゼ（ＩＤＳ）をコードするｒＡＡＶウイルスベクターが提供される。具体的な実施形態において、本明細書では、ＩＤＳをコードするｒＡＡＶ９ベースウイルスベクターが提供される。いくつかの実施形態において、本明細書では、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）をコードするｒＡＡＶウイルスベクターが提供される。具体的な実施形態において、本明細書では、ＬＤＬＲをコードするｒＡＡＶ８ベースウイルスベクターが提供される。いくつかの実施形態において、本明細書では、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）タンパク質をコードするｒＡＡＶウイルスベクターが提供される。具体的な実施形態において、本明細書では、ＴＰＰをコードするｒＡＡＶ９ベースウイルスベクターが提供される。

【0099】

追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、シュードタイプＡＡＶカプシドを含む。いくつかの実施形態において、シュードタイプＡＡＶカプシドは、ｒＡＡＶ２／８またはｒＡＡＶ２／９シュードタイプＡＡＶカプシドである。シュードタイプｒＡＡＶ粒子を生成し使用するための方法は、当技術分野で知られている（例えば、Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５：７６６２－７６７１（２００１）；Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４：１５２４－１５３２（２０００）；Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８：１５８－１６７（２００２）；及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ． Ｇｅｎｅｔ．１０：３０７５－３０８１，（２００１）を参照）。

【0100】

追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、２つ以上のＡＡＶカプシド血清型のキメラであるカプシドタンパク質を含むカプシドを含む。いくつかの実施形態において、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５、及びＡＡＶ－１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶ血清型からの２つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質のキメラである。

【0101】

ある特定の実施形態において、１本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）を使用することができる。ある特定の実施形態において、自己相補的ベクター、例えばｓｃＡＡＶを使用することができる（例えば、Ｗｕ，２００７，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１８（２）：１７１－８２；ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ，２００１，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．８，Ｎｕｍｂｅｒ １６：１２４８－１２５４；ならびに米国特許第６，５９６，５３５号、第７，１２５，７１７号、及び第７，４５６，６８３号（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）を参照）。

【0102】

いくつかの実施形態において、清澄化されたフィード中のｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－８またはＡＡＶ－９から選択されるＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－１、またはその派生物、修飾物、もしくはシュードタイプのＡＡＶカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－４、またはその派生物、修飾物、もしくはシュードタイプのＡＡＶカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－５、またはその派生物、修飾物、もしくはシュードタイプのＡＡＶカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－８、またはその派生物、修飾物、もしくはシュードタイプのＡＡＶカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－９、またはその派生物、修飾物、もしくはシュードタイプのＡＡＶカプシド血清型を有する。

【0103】

いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－８またはＡＡＶ－９カプシドタンパク質の派生物、修飾物、またはシュードタイプであるカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－８カプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上同一、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％同一のＡＡＶ－８カプシドタンパク質を有する、カプシドタンパク質を含む。

【0104】

いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－９カプシドタンパク質の派生物、修飾物、またはシュードタイプであるカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－９カプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上同一、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％同一のＡＡＶ－８カプシドタンパク質を有する、カプシドタンパク質を含む。

【0105】

追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は，モザイクカプシドを含む。モザイクＡＡＶ粒子は、ＡＡＶの異なる血清型からのウイルスカプシドタンパク質の混合物から構成される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５、及びＡＡＶ－１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ならびにＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択される血清型のカプシドタンパク質を含むモザイクカプシドを含む。

【0106】

いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶｒｈ．８、及びＡＡＶｒｈ．１０から選択される血清型のカプシドタンパク質を含むモザイクカプシドを含む。

【0107】

追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、シュードタイプｒＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態において、シュードタイプｒＡＡＶ粒子は、（ａ）ＡＡＶ ＩＴＲを含む核酸ベクターと、（ｂ）ＡＡＶｘ（例えば、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５、及びＡＡＶ－１６）に由来するカプシドタンパク質から構成されるカプシドとを含む。追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５、及びＡＡＶ－１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質から構成されるシュードタイプｒＡＡＶ粒子を含む。追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－８カプシドタンパク質を含むシュードタイプｒＡＡＶ粒子を含む。追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－９カプシドタンパク質から構成されるシュードタイプｒＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態において、シュードタイプｒＡＡＶ８またはｒＡＡＶ９粒子は、ｒＡＡＶ２／８またはｒＡＡＶ２／９シュードタイプ粒子である。シュードタイプｒＡＡＶ粒子を生成し使用するための方法は当技術分野で知られている（例えば、Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５：７６６２－７６７１（２００１）；Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４：１５２４－１５３２（２０００）；Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８：１５８－１６７（２００２）；及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ． Ｇｅｎｅｔ．１０：３０７５－３０８１，（２００１）を参照）。

【0108】

追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、２つ以上のＡＡＶカプシド血清型のキメラであるカプシドタンパク質を含むカプシドを含む。さらなる実施形態において、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５、及びＡＡＶ－１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ｒＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶ血清型からの２つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質のキメラである。さらなる実施形態において、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶｒｈ．８、及びＡＡＶｒｈ．１０から選択されるＡＡＶ血清型からの２つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質のキメラである。

【0109】

いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－８カプシドタンパク質と、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５、及びＡＡＶ－１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶ血清型からの１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質とのキメラである、ＡＡＶカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－８カプシドタンパク質と、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶｒｈ．８、及びＡＡＶｒｈ．１０から選択されるＡＡＶ血清型からの１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質とのキメラである、ＡＡＶカプシドタンパク質を含む。

【0110】

いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－９カプシドタンパク質と、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５、及びＡＡＶ－１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択される１つ以上のＡＡＶカプシド血清型のカプシドタンパク質とのキメラである、ＡＡＶカプシドタンパク質を含む。

【0111】

いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－９カプシドタンパク質と、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．８、及びＡＡＶｒｈ．１０から選択される１つ以上のＡＡＶカプシド血清型のカプシドタンパク質とのキメラである、ＡＡＶカプシドタンパク質を含む。

【0112】

ｒＡＡＶを分離するための方法
本明細書で開示されるアニオン交換クロマトグラフィー樹脂（例えば、４級アミン配位子を含むモノリスアニオン交換クロマトグラフィー樹脂またはＡＥＸクロマトグラフィー樹脂）を用いた精製方法（例えば、［１］～［５５］のいずれか１つの方法）は、ｒＡＡＶ粒子を単離するための上流処理、下流処理、または上流及び下流処理と組み合わせて使用することができる。

【0113】

本開示の方法（例えば、［１］～［５５］のいずれか１つの方法）に従って調製されたアニオン交換クロマトグラフィー樹脂（例えば、４級アミンリガンドを含むモノリスアニオン交換クロマトグラフィー樹脂またはＡＥＸクロマトグラフィー樹脂）を用いてｒＡＡＶ粒子を単離する方法のためのフィード組成物は、当技術分野で知られている方法を用いて産生することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるｒＡＡＶ粒子を単離する方法は、上流処理、例えば、細胞培養物（例えば、細胞培養物上清もしくは細胞溶解物または両方）の収集、（例えば、遠心分離または深層濾過による）収集した細胞培養物または細胞培養物上清の清澄化、タンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、無菌濾過、あるいはこれらの任意の組合せ（複数可）を含む方法により、フィード組成物を産生することを含む。いくつかの実施形態において、上流処理は、細胞培養物または細胞培養上清の収集、（例えば、遠心分離または深層濾過による）収集した細胞培養物または細胞培養物上清の清澄化、タンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、無菌濾過のうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つを含む。いくつかの実施形態において、上流処理は、細胞培養物または細胞培養上清の収集、（例えば、深層濾過による）収集した細胞培養物または細胞培養上清の清澄化、無菌濾過、タンジェンシャルフロー濾過、及びアフィニティークロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態において、上流処理は、収集した細胞培養物または細胞培養物上清の清澄化、無菌濾過、タンジェンシャルフロー濾過、及びアフィニティークロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態において、上流処理は、深層濾過による収集した細胞培養物または細胞培養物上清の清澄化、無菌濾過、タンジェンシャルフロー濾過、及びアフィニティークロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物または細胞培養物上清の清澄化は、無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、上流処理は遠心分離を含まない。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－８血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－９血清型のカプシドタンパク質を含む。

【0114】

本開示の方法（例えば、［１］～［５５］のいずれか１つの方法）に従って生成されて単離されたｒＡＡＶ粒子を含むアニオン交換クロマトグラフィー樹脂（例えば、モノリスカラム）からの溶出液はさらに、当技術分野で知られている方法を用いて処理することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるｒＡＡＶ粒子を単離する方法は、下流処理、例えば、タンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、及び疎水相互作用クロマトグラフィーを含む方法により、溶出液を処理することを含む。いくつかの実施形態において、下流処理は、タンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、または無菌濾過のうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つを含む。いくつかの実施形態において、下流処理は、タンジェンシャルフロー濾過を含む。いくつかの実施形態において、下流処理は、無菌濾過を含む。さらなる実施形態において、下流処理は、タンジェンシャルフロー濾過及び無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－８血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－９血清型のカプシドタンパク質を含む。

【0115】

いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるｒＡＡＶ粒子を単離する方法は、細胞培養物または細胞培養物上清の収集、（例えば、深層濾過による）収集した細胞培養物または細胞培養物上清の清澄化、第１の無菌濾過、第１のタンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、４級アミンリガンドを用いたモノリスアニオン交換クロマトグラフィーまたはＡＥＸクロマトグラフィー）、第２のタンジェンシャルフロー濾過、及び第２の無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるｒＡＡＶ粒子を単離する方法は、細胞培養物または細胞培養物上清の収集、（例えば、深層濾過による）収集した細胞培養物または細胞培養物上清の清澄化、第１の無菌濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、４級アミンリガンドを用いたモノリスアニオン交換クロマトグラフィーまたはＡＥＸクロマトグラフィー）、タンジェンシャルフロー濾過、及び第２の無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるｒＡＡＶ粒子を単離する方法は、収集した細胞培養物または細胞培養物上清の清澄化、第１の無菌濾過、第１のタンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、４級アミンリガンドを用いたモノリスアニオン交換クロマトグラフィーまたはＡＥＸクロマトグラフィー）、第２のタンジェンシャルフロー濾過、及び第２の無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるｒＡＡＶ粒子を単離する方法は、収集した細胞培養物または細胞培養物上清の清澄化、第１の無菌濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、４級アミンリガンドを用いたモノリスアニオン交換クロマトグラフィーまたはＡＥＸクロマトグラフィー）、タンジェンシャルフロー濾過、及び第２の無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるｒＡＡＶ粒子を単離する方法は、深層濾過による収集した細胞培養物または細胞培養物上清の清澄化、第１の無菌濾過、第１のタンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、４級アミンリガンドを用いたモノリスアニオン交換クロマトグラフィーまたはＡＥＸクロマトグラフィー）、第２のタンジェンシャルフロー濾過、及び第２の無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるｒＡＡＶ粒子を単離する方法は、深層濾過による収集した細胞培養物または細胞培養物上清の清澄化、第１の無菌濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、４級アミンリガンドを用いたモノリスアニオン交換クロマトグラフィーまたはＡＥＸクロマトグラフィー）、タンジェンシャルフロー濾過、及び第２の無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、当該方法は、遠心分離を含まない。いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物または細胞培養物上清の清澄化は、無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－８血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ－９血清型のカプシドタンパク質を含む。

【0116】

ｒＡＡＶ粒子の生成方法については、形質移入、安定細胞株生成、及び感染性ハイブリッドウイルス生成系（アデノウイルス－ＡＡＶハイブリッド、ヘルペスウイルス－ＡＡＶハイブリッド、及びバキュロウイルス－ＡＡＶハイブリッドを含む）を含めた多数の方法が当技術分野で知られている。ｒＡＡＶウイルス粒子を生成するためのｒＡＡＶ生成培養物はいずれも、（１）好適な宿主細胞（バキュロウイルス系の場合では、例えば、ヒト由来細胞株（例えば、ＨｅＬａ、Ａ５４９、またはＨＥＫ２９３細胞及びその派生物（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞））、哺乳類細胞株（例えば、Ｖｅｒｏ）、または昆虫由来細胞株（例えば、ＳＦ－９）を含む）；（２）野生型もしくは変異型アデノウイルス（例えば、温度感受性アデノウイルス）、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、またはヘルパー機能を提供するプラスミドコンストラクトによって提供される、好適なヘルパーウイルス機能；（３）ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子ならびに遺伝子産物；（４）ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する導入遺伝子（例えば、治療用導入遺伝子）；ならびに（５）ｒＡＡＶ生成を支持するための好適な培地及び培地構成成分を必要とする。当技術分野で知られている好適な培地をｒＡＡＶベクターの生成に使用することができる。このような培地としては、限定されるものではないが、変法イーグル培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、及び米国特許第６，７２３，５５１号（参照によりその全体が本明細書に援用される）で説明されているようなＳｆ－９００ ＩＩ ＳＦＭ培地を含めたＨｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ及びＪＲＨが生産する培地が挙げられる。

【0117】

ｒＡＡＶ生成培養物は、利用されている特定の宿主細胞に適した様々な条件下で（広い温度範囲にわたり、様々な長さの時間で、など）ルーチン的に成長させることができる。当技術分野で知られているように、ｒＡＡＶ生成培養物は、好適な付着依存性容器（例えば、ローラーボトル、中空繊維フィルター、マイクロキャリア、及び充填床または流動床バイオリアクター）中で培養することができる付着依存性培養物を含む。また、ｒＡＡＶベクター生成培養物には、様々な方法（例えば、スピナーフラスコ、撹拌槽型バイオリアクター、及びディスポーザブルシステム（例えば、ウェーブバッグシステム））で培養することができる、浮遊適応性宿主細胞（例えば、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、Ｖｅｒｏ、及びこれらの派生物）ならびにＳＦ－９細胞も含まれ得る。ｒＡＡＶ粒子を生成するための多数の浮遊培養物が当技術分野で知られており、これには例えば、米国特許第６，９９５，００６号、第９，７８３，８２６号、及び米国特許出願公開第２０１２０１２２１５５号（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている培養物が含まれる。

【0118】

組換えＡＡＶ粒子は、インタクトな宿主細胞から培地中へのｒＡＡＶ粒子放出を引き起こすことが当技術分野で知られている条件下で細胞が培養されることを条件に、宿主細胞を含むｒＡＡＶ生成培養物を収集することにより、またはｒＡＡＶ生成培養物から消費培地を収集することにより、ｒＡＡＶ生成培養物から収集することができる。また、組換えＡＡＶ粒子は、生成培養物の宿主細胞を溶解することによってｒＡＡＶ生成培養物から収集することもできる。細胞を溶解する好適な方法も当技術分野で知られており、例えば、複数の凍結／解凍サイクル、超音波処理、マイクロ流動化、ならびに化学物質（例えば、界面活性剤及び／またはプロテアーゼ）による処理が挙げられる。

【0119】

いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ生成培養物は、高密度細胞培養物を含む。いくつかの実施形態において、培養物は、約１×１０Ｅ＋０６細胞／ｍｌから約３０×１０Ｅ＋０６細胞／ｍｌの間の総細胞密度を有する。いくつかの実施形態において、細胞の約５０％超が生細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３由来細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞）、Ｖｅｒｏ細胞、またはＳＦ－９細胞である。さらなる実施形態において、細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。さらなる実施形態において、細胞は、浮遊培養での増殖に適応したＨＥＫ２９３細胞である。

【0120】

提供される方法の追加の実施形態において、ｒＡＡＶ生成培養物は、ｒＡＡＶ粒子を含む浮遊培養物を含む。ｒＡＡＶ粒子を生成するための多数の浮遊培養物が当技術分野で知られており、これには例えば、米国特許第６，９９５，００６号、第９，７８３，８２６号、及び米国特許出願公開第２０１２０１２２１５５号（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている培養物が含まれる。いくつかの実施形態において、浮遊培養物は、哺乳類細胞または昆虫細胞の培養物を含む。いくつかの実施形態において、浮遊培養物は、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３由来細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞）、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＥＢ６６細胞、ＢＳＣ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＬＬＣ－ＭＫ細胞、ＣＶ－１細胞、ＣＯＳ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＲＡＦ細胞、ＲＫ細胞、ＴＣＭＫ－１細胞、ＬＬＣＰＫ細胞、ＰＫ１５細胞、ＬＬＣ－ＲＫ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＢＨＫ－２１細胞、ＮＳ－１細胞、ＭＲＣ－５細胞、ＷＩ－３８細胞、ＢＨＫ細胞、３Ｔ３細胞、２９３細胞、ＲＫ細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、ニワトリ胚細胞、またはＳＦ－９細胞の培養物を含む。いくつかの実施形態において、浮遊培養物は、ＨＥＫ２９３細胞の培養物を含む。

【0121】

本明細書で開示される方法のいくつかの実施形態において、（例えば、商業的製造プロセス中に）大量の細胞培養物または細胞培養物上清フィードが存在してもよい。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、ｒＡＡＶ粒子を含む大量の細胞培養物または細胞培養物上清フィードの処理に適している。「大量」という用語は、ｒＡＡＶ粒子の商業的及び／または工業的生産に関連する量を意味する。いくつかの実施形態において、「大量」という用語は、約２０リットルから約２００００リットルの間、約５０リットルから約２００００リットルの間、約１００リットルから約２００００リットルの間、約５００リットルから約２００００リットルの間、約１０００リットルから約２００００リットルの間、約２０リットルから約５０００リットルの間、約５０リットルから約５０００リットルの間、約１００リットルから約３０００リットルの間、約５００リットルから約３０００リットルの間、約１５００リットルから約２５００リットルの間を意味する。いくつかの実施形態において、「大量」という用語は、約２０００リットルを意味する。いくつかの実施形態において、「大量」という用語は、約２００リットルを意味する。いくつかの実施形態において、「大量」という用語は、約５００リットルを意味する。いくつかの実施形態において、「大量」という用語は、約１０００リットルを意味する。いくつかの実施形態において、「大量」という用語は、約１５００リットルを意味する。いくつかの実施形態において、「大量」という用語は、約２０００リットルを意味する。いくつかの実施形態において、「大量」という用語は、約２５００リットルを意味する。いくつかの実施形態において、「大量」という用語は、約３０００リットルを意味する。いくつかの実施形態において、「大量」という用語は、約５０００リットルを意味する。いくつかの実施形態において、「大量」という用語は、約１００００リットルを意味する。いくつかの実施形態において、「大量」という用語は、約１５０００リットルを意味する。いくつかの実施形態において、「大量」という用語は、約２００００リットルを意味する。いくつかの実施形態において、「大容量」という用語は、約１０リットルから１０００リットルの間、約１０リットルから１００リットルの間、約２０リットルから５００リットルの間、約５０リットルから５００リットルの間、約１００リットルから１０００リットルの間、または約１００リットルから５００リットルの間を意味する。

【0122】

収集時に、ｒＡＡＶ生成培養物は、以下のうちの１つ以上を含むことができる：（１）宿主細胞タンパク質；（２）宿主細胞ＤＮＡ；（３）プラスミドＤＮＡ；（４）ヘルパーウイルス；（５）ヘルパーウイルスタンパク質；（６）ヘルパーウイルスＤＮＡ；ならびに（７）培地構成成分（例えば、血清タンパク質、アミノ酸、トランスフェリン、及び他の低分子量タンパク質を含む）。ｒＡＡＶ生成培養物はさらに、生成物関連不純物、例えば、不活性なベクター形態、空のウイルスカプシド、凝集したウイルス粒子またはカプシド、ミスフォールドしたウイルスカプシド、分解されたウイルス粒子を含むことができる。

【0123】

いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ生成培養物収集物は、宿主細胞デブリを除去するように清澄化される。いくつかの実施形態において、生成培養物収集物は、一連の深層フィルターによる濾過によって清澄化される。また、清澄化は、当技術分野で知られている他の様々な標準的技法により、例えば、遠心分離、または当技術分野で知られている０．２ｍｍ以上の細孔サイズの任意の酢酸セルロースフィルターによる濾過により、達成することができる。いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物または細胞培養物上清の清澄化は、無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、生成培養物収集物は、遠心分離によって清澄化される。いくつかの実施形態において、生成培養物収集物の清澄化は、遠心分離を含まない。

【0124】

いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物または細胞培養物上清は、濾過を用いて清澄化される。いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物または細胞培養物上清の清澄化は、深層濾過を含む。いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物または細胞培養物上清の清澄化はさらに、深層濾過及び無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物または細胞培養物上清は、１つ以上の異なる濾過媒体を含むフィルタートレインを用いて清澄化される。いくつかの実施形態において、フィルタートレインは、１つの深層濾過媒体を含む。いくつかの実施形態において、フィルタートレインは、１つ以上の深層濾過媒体を含む。いくつかの実施形態において、フィルタートレインは、２つの深層濾過媒体を含む。いくつかの実施形態において、フィルタートレインは、１つの無菌濾過媒体を含む。いくつかの実施形態において、フィルタートレインは、２つの深層濾過媒体及び１つの無菌濾過媒体を含む。いくつかの実施形態において、深層フィルター媒体は、多孔質深層フィルターである。いくつかの実施形態において、フィルタートレインは、Ｃｌａｒｉｓｏｌｖｅ（登録商標）２０ＭＳ、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）Ｃ０ＨＣ、及び無菌グレード濾過媒体を含む。いくつかの実施形態において、フィルタートレインは、Ｃｌａｒｉｓｏｌｖｅ（登録商標）２０ＭＳ、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）Ｃ０ＨＣ、及びＳａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）２ ＸＬＧ ０．２μｍを含む。いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物または細胞培養物上清は、深層フィルターに接触させる前に前処理される。いくつかの実施形態において、前処理は、収集した細胞培養物または細胞培養物上清に塩を添加することを含む。いくつかの実施形態において、前処理は、収集した細胞培養物または細胞培養物上清に化学凝集剤を添加することを含む。いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物または細胞培養物上清は、深層フィルターに接触させる前に前処理されない。

【0125】

いくつかの実施形態において、生成培養物収集物は、２０１９年４月２７日に出願された“ＳＣＡＬＡＢＬＥ ＣＬＡＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＰＲＯＣＥＳＳ ＦＯＲ ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ ＡＡＶ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ”という表題の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／２９５３９（参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている濾過によって清澄化される。

【0126】

いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ生成培養物収集物は、生成培養物中に存在する高分子量ＤＮＡを消化するようにヌクレアーゼ（例えば、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標））またはエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ由来のエンドヌクレアーゼ）で処理される。ヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼ消化は、当技術分野で知られている標準的な条件下でルーチン的に実施することができる。例えば、ヌクレアーゼ消化は、周囲温度から３７℃までの範囲の温度の、例えば、最終濃度１～１００Ｕ／ｍＬのベンゾナーゼ（登録商標）で、３０分～数時間の間実施される。

【0127】

無菌濾過は、無菌グレードフィルター媒体を用いた濾過を包含する。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、０．２または０．２２μｍの細孔フィルターである。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）を含む。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を含む。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、親水性の不均一な二重層設計を有する。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、０．８μｍのプレフィルター及び０．２μｍの最終フィルター膜の親水性の不均一な二重層設計を有する。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、１．２μｍのプレフィルター及び０．２μｍの最終フィルター膜の親水性の不均一な二重層設計を有する。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、０．２または０．２２μｍの細孔フィルターである。さらなる実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、０．２μｍの細孔フィルターである。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）２ ＸＬＧ ０．２μｍ、Ｄｕｒａｐｏｒｅ（商標）ＰＶＤＦ膜０．４５μｍ、またはＳａｒｔｏｇｕａｒｄ（登録商標）ＰＥＳ １．２μｍ＋０．２μｍの名目孔径の組合せである。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）２ ＸＬＧ ０．２μｍである。

【0128】

いくつかの実施形態において、清澄化されたフィードは、クロマトグラフィー媒体、例えば、アフィニティークロマトグラフィー媒体に適用される前に、タンジェンシャルフロー濾過（「ＴＦＦ」）を介して濃縮される。ＴＦＦ限外濾過を用いたウイルスの大規模用濃度は、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６０９－６１５（１９９３）で説明されている。清澄化フィードのＴＦＦ濃度により、技術的に管理可能な量の清澄化フィードをクロマトグラフィーにかけることが可能になり、また、長い再循環時間を必要とせずにカラムをより合理的にサイジングすることが可能になる。いくつかの実施形態において、清澄化されたフィードは、少なくとも２倍から少なくとも１０倍の間で濃縮される。いくつかの実施形態において、清澄化されたフィードは、少なくとも１０倍から少なくとも２０倍の間で濃縮される。いくつかの実施形態において、清澄化されたフィードは、少なくとも２０倍から少なくとも５０倍の間で濃縮される。いくつかの実施形態において、清澄化されたフィードは、約２０倍に濃縮される。また、当業者は、透析濾過を介して清澄化されたフィードから小分子不純物（例えば、培地成分、血清アルブミン、または他の血清タンパク質を含む細胞培養不純物）を除去するためにＴＦＦが使用されてもよいことも認識するであろう。いくつかの実施形態において、清澄化されたフィードは、小分子不純物を除去するために透析濾過に供される。いくつかの実施形態において、透析濾過は、約３から約１０の間の透析濾過体積の緩衝液を使用することを含む。いくつかの実施形態において、透析濾過は、約５の透析濾過体積の緩衝液を使用することを含む。また、当業者は、精製処理における次のステップを実施する前に緩衝液の交換が望ましい場合における精製プロセスの任意のステップでＴＦＦが使用されてもよいことも認識するであろう。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される清澄化されたフィードからｒＡＡＶを単離するための方法は、緩衝液を交換するためのＴＦＦの使用を含む。

【0129】

アフィニティークロマトグラフィーを使用して、組成物からｒＡＡＶ粒子を単離することができる。いくつかの実施形態において、アフィニティークロマトグラフィーを使用して、清澄化されたフィードからｒＡＡＶ粒子を単離する。いくつかの実施形態において、アフィニティークロマトグラフィーを使用して、タンジェンシャルフロー濾過に供されて清澄化されたフィードからｒＡＡＶ粒子を単離する。好適なアフィニティークロマトグラフィー媒体は当技術分野で知られており、限定されるものではないが、ＡＶＢ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶＸアフィニティー樹脂、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ９アフィニティー樹脂、及びＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ８アフィニティー樹脂が挙げられる。いくつかの実施形態において、アフィニティークロマトグラフィー媒体は、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ９アフィニティー樹脂である。いくつかの実施形態において、アフィニティークロマトグラフィー媒体は、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ８アフィニティー樹脂である。いくつかの実施形態において、アフィニティークロマトグラフィー媒体は、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶＸアフィニティー樹脂である。

【0130】

追加の実施形態において、本開示は、本明細書で開示される方法によって生成される、単離された組換えｒＡＡＶ粒子を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、組成物は、医薬的に許容される担体を含む医薬組成物である。

【0131】

本明細書で使用する場合、「医薬的に許容される」という用語は、１つ以上の投与経路、ｉｎ ｖｉｖｏ送達または接触に適した、生物学的に許容される製剤、気体、液体、もしくは固体、またはこれらの混合物を意味する。「医薬的に許容される」組成物は、生物学的または他の点で望ましくないものではない材料であり、例えば、この材料は、実質的な望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく対象に投与することができる。したがって、このような医薬組成物は、例えば、本開示の方法に従って単離されたｒＡＡＶを対象に投与する際に使用することができる。このような組成物としては、医薬投与またはｉｎ ｖｉｖｏでの接触または送達と適合性である、溶媒（水性または非水性）、溶液（水性または非水性）、エマルジョン（例えば、水中油または油中水）、懸濁液、シロップ、エリキシル、分散及び懸濁媒体、コーティング、等張性及び吸収の促進剤または遅延剤が挙げられる。水性及び非水性の溶媒、溶液、及び懸濁液は、懸濁剤及び増粘剤を含むことができる。このような医薬的に許容される担体としては、錠剤（コーティングされたまたはコーティングされていない）、カプセル（ハードまたはソフト）、マイクロビーズ、粉末、顆粒、及び結晶が挙げられる。補足活性化合物（例えば、防腐剤、抗微生物剤、抗ウイルス剤、及び抗真菌剤）も、組成物に組み込むことができる。医薬組成物は、本明細書で記載のように、または当業者に知られているように、特定の投与経路または送達経路と適合性であるように製剤化することができる。したがって、医薬組成物には、様々な経路による投与に適した担体、希釈剤、または賦形剤が含まれる。本発明のｒＡＡＶ粒子ならびに方法及び使用に適切な医薬組成物及び送達系は、当技術分野で知られている（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２００３）２０ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）１８ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．；Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ（１９９６）１２ｔｈ ｅｄ．，Ｍｅｒｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ，Ｎ．Ｊ．；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｓｏｌｉｄ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ（１９９３），Ｔｅｃｈｎｏｎｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ｐａ．；Ａｎｓｅｌ ａｎｄ Ｓｔｏｋｌｏｓａ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（２００１）１１ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．；及びＰｏｚｎａｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ （１９８０），Ｒ．Ｌ．Ｊｕｌｉａｎｏ，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．２５３－３１５を参照）。

【0132】

いくつかの実施形態において、組成物は、医薬単位用量である。「単位用量」とは、治療される対象のための単位薬用量として適した物理的に別々の単位を意味する。各単位は、任意選択で医薬担体（賦形剤、希釈剤、ビヒクル、または充填剤）と共に所定の量を含み、１回以上の用量で投与されたときに所望の効果（例えば、予防または治療効果）をもたらすように計算される。単位剤形は、例えば、アンプル及びバイアル内にあってもよく、これらは液体組成物、またはフリーズドライもしくは凍結乾燥状態の組成物を含むことができ、例えば、無菌液体担体をｉｎ ｖｉｖｏでの投与または送達の前に添加してもよい。個々の単位剤形は、多回用量キットまたは容器に含めることができる。組換えベクター（例えば、ＡＡＶ）配列、プラスミド、ベクターゲノム、及び組換えウイルス粒子、ならびにこれらの医薬組成物は、投与を容易にし、投薬量を均一にするために、単一または複数の単位用量形態でパッケージ化することができる。いくつかの実施形態において、組成物は、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５、及びＡＡＶ－１６から選択されるＡＡＶカプシド血清型からのＡＡＶカプシドタンパク質を含む、ｒＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシド血清型は、ＡＡＶ－８である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシド血清型は、ＡＡＶ－９である。

【実施例】

【0133】

実施例１．ＡＡＶ８精製用ＡＥＸ樹脂のスクリーニング。
凝集体、ミスフォールドした粒子、空のカプシド、充填不完全なカプシドを含めた処理関連不純物からｒＡＡＶ粒子を分離することが可能な大規模で高収率の精製ステップを開発するために、複数のＡＥＸ樹脂を試験した。空の／充填不完全なカプシド及びウイルス凝集体から機能的ｒＡＡＶ粒子を分離することは、溶媒アクセス可能なこれらの実体の外部の構造的類似性が高レベルであることを考慮すれば、とりわけ困難である。それと同時に、機能的ｒＡＡＶ粒子から空のカプシド及び充填不完全なカプシドを分離することは、より安全でより効果的な治療用ＡＡＶ組成物を製造するために不可欠である。試験した樹脂は、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標）ＱＡ、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＴＭＡＥ（Ｍ）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）Ｇｉｇａｃａｐ Ｑ－６５０Ｍ、及びＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱであった。

【0134】

ｒＡＡＶをＨＥＫ２９３ベースプロセスで生成した。ｒＡＡＶを含む細胞培養物上清を収集し、深層濾過によって清澄化し、遠心分離は使用しなかった。清澄化した培養物をタンジェンシャルフロー濾過を使用して濃縮し、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶＸ樹脂を用いたアフィニティー精製に供してｒＡＡＶ粒子を単離した。アフィニティー精製した組成物を使用してＡＥＸ樹脂を試験した。ＡＥＸクロマトグラフィーを標準的なプロトコルに従って実施した。簡潔に説明すると、ＡＥＸカラムを約０．６Ｌ細胞培養物当量／ＡＥＸ樹脂ｍＬの割合でロードした。カラム容量（ＣＶ）は１～約２ｍＬとした。トリスｐＨ８．４緩衝液を全ての相に使用した。ロード及び溶出は１５０ｃｍ／時間の流量で行った。ただし、例外としてＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＴＭＡＥ（Ｍ）では９０ｃｍ／時間の流量を使用し、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標）ＱＡでは０．５～１．２５ＣＶ／分の流量を使用した。カラムは、５～１５ｍＭのＮａＣｌで開始し３０～６０ＣＶにわたって１２０～２００ｍＭのＮａＣｌに達する、浅い直線ＮａＣｌ勾配で溶出した。カラム性能をクロマトグラム及びピーク面積解析に基づいて評価した。ＡＡＶ８－Ａウイルスで得られた結果（例えば、導入遺伝子Ａを運搬するＡＡＶ８）を図１Ａ～１Ｅに示す。ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標）ＱＡは、ｒＡＡＶ粒子と処理関連不純物（空のカプシド及び凝集またはミスフォールドした粒子）とを高分解能で複数のピークに分離する（図１Ａ）。Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬでは、ｒＡＡＶ粒子と不純物との分解能が低下した（図１Ｂ）。また、実行ごとにばらつく難点もあった。Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＴＭＡＥ（Ｍ）では、限定的に生成物関連不純物から完全ＡＡＶ８－Ａが分離された（図１Ｃ）。Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）Ｇｉｇａｃａｐ Ｑ－６５０Ｍでは、不純物の分解能が低く、ｒＡＡＶ粒子の収率が低かった（図１Ｄ）。ＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＨＱでは、限定的に生成物関連不純物から完全ＡＡＶ８－Ａが分離された（図１Ｅ）。ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標）ＱＡでは、他の試験した樹脂（４級アミンリガンドを含む化学的に類似した他の樹脂を含む）よりも驚くほど良好に、機能的ｒＡＡＶ粒子から空の／充填不完全なカプシドが分離された。これらの結果に基づき、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標）ＱＡがさらなる試験用に選定された。

【0135】

実施例２．緩衝液構成成分、ｐＨ、及び勾配プロファイルが生成物関連不純物からのＡＡＶ８分離に及ぼす影響。
さらなる実験は、緩衝液構成成分、ｐＨ、及び勾配プロファイルが生成物関連不純物からのＡＡＶ８－Ａ分離に及ぼす影響を試験するため、１ｍＬのＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標）ＱＡモノリスカラムで、アフィニティークロマトグラフィーで精製したＡＡＶ８－Ａ調製物を用いて実施した。ＡＡＶ８－Ａを精製する間のクロマトグラフィー緩衝液にはｐＨ８．４±０．２の２５ｍＭトリスが最適であり、ＡＡＶ８－ＡのＡＥＸ培地への緊密な結合と、ＡＡＶの安定性を損なうことなく生成物関連不純物から完全ＡＡＶを良好に分離することとを確実にした（図２）。

【0136】

クロマトグラフィー緩衝液にＭｇＣｌ_２及びＫＣｌを含めることで、クロマトグラフィー分解能及びＡＡＶ８－Ａの収率が増加した（図３）。アフィニティークロマトグラフィーによって精製したＡＡＶ８－Ａを、ＭｇＣｌ_２／ＫＣｌを伴わない、または１ｍＭのＭｇＣｌ２を伴う、または２．５ｍＭのＭｇＣｌ_２及び１ｍＭのＫＣｌを伴う、ロード希釈緩衝液（２５ｍＭのトリス、０．００１％のＰＦ－６８、ｐＨ８．８）で希釈した。平衡緩衝液は、ＭｇＣｌ_２／ＫＣｌを伴わない、または１ｍＭのＭｇＣｌ_２を伴う、または２．５ｍＭのＭｇＣｌ_２及び１ｍＭのＫＣｌを伴う、２５ｍＭのトリス、５ｍＭのＮａＣｌ ｐＨ８．４とし、溶出緩衝液は、ＭｇＣｌ_２／ＫＣｌを伴わない、または１ｍＭのＭｇＣｌ_２を伴う、または２．５ｍＭのＭｇＣｌ_２及び１ｍＭのＫＣｌを伴う、２５ｍＭのトリス、２００ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８．４とした。１９ｍＭのＮａＣｌから１６２ｍＭのＮａＣｌまでの直線ＮａＣｌ濃度勾配を６０ＣＶにわたり送達させてカラムを溶出した。１ｍＭのＭｇＣｌ_２を伴うクロマトグラフィー緩衝液は、生成物関連不純物からの完全ＡＡＶ８－Ａ粒子の分離が改善されたことを示した。Ｍｇ^２＋により、メインピークのフロントにおける空の／充填不完全なＡＡＶカプシドからの分離、及びメインピークのテールにおける凝集／ミスフォールドした粒子からの分離が改善された。クロマトグラフィー緩衝液に２．５ｍＭのＭｇ^２＋を含めることで、ＡＡＶ８－Ａ生成物のピーク面積が１３％増加し、ＧＣステップ収率が７６％から８５％に増加した。空の／充填不完全なＡＡＶカプシドからの分離の改善は、「フロント」におけるＧＣ力価低下に反映されている（１．９％対１．５０％）。一方、凝集／ミスフォールドした粒子からの分離の改善は、「テール」における収率ＧＣ力価低下に反映されている（９．３９％対４．７１％）。図３。いずれの場合においても、フロント画分及びテール画分における収率ＧＣ力価低下は、機能的ｒＡＡＶ粒子を含む主要画分における収率ＧＣ力価増加を意味する。Ｍｇ^２＋に加えてＫ^＋を導入することで、さらに収率が改善した。クロマトグラフィー緩衝液に２．５ｍＭのＭｇＣｌ_２及び１ｍＭのＫＣｌを含めることで、ＡＡＶ８－Ａ生成物のピーク面積が１５％増加し、ＧＣステップ収率が７６％から９１％に増加した。Ｋ^＋が存在することで、「フロント」におけるＧＣ力価低下により反映されているように、空の／充填不完全なＡＡＶカプシドからの分離がさらに改善された。「フロント」におけるＧＣ力価は、Ｋ^＋もＭｇ２^＋もなしの場合の１．９％から、Ｍｇ２^＋のみの場合は１．５％、Ｋ^＋及びＭｇ２^＋ありの場合は１．４２％となった。試験条件のうち、生成物関連不純物からの最良な完全ＡＡＶ８－Ａ分離、及び最良の生成物収率は、いかなるＭｇ^２＋もＫ^＋も含まない緩衝液（図３のクロマトグラフィー実行Ａ）と比較すると、クロマトグラフィーランニング緩衝液中で２．５ｍＭのＭｇＣｌ_２及び１ｍＭのＫＣｌを含む最適な緩衝系（トリス）及びｐＨ（ｐＨ８．４）を使用し、より低速の流量を使用し、生成物溶出に浅い直線ＮａＣｌ濃度勾配を適用することにより達成された（図３のクロマトグラフィー実行Ｃ）。

【0137】

実施例３．緩衝系にＭｇ^２＋及びＫ^＋を含めることにより、ＡＥＸクロマトグラフィーにおける空の／充填不完全なカプシド及びウイルス凝集体からの完全ＡＡＶ粒子分離が改善される。
４級アミンリガンドを含む複数のＡＥＸクロマトグラフィー樹脂について、Ｍｇ^２＋及びＫ^＋を含む緩衝液系を使用した際の空の／充填不完全なカプシド及び凝集体から完全ＡＡＶ粒子を分離する能力を試験した。図４。ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（商標）ＱＡ（ＢＩＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）、Ｐｏｒｏｓ ＸＱ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、及びＳａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｑ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）ＡＥＸ媒体を使用して、ＡＡＶ８－Ｂウイルス（例えば、導入遺伝子Ｂを運搬するＡＡＶ８）を精製した。ＡＡＶ８－Ｂウイルスを細胞培養物上清から収集し、実施例１での説明とほぼ同様にＰｏｒｏｓ ＡＡＶＸアフィニティーカラムで精製した。アフィニティー精製したＡＡＶ８－Ｂウイルスを２０ｍＭのトリスＨＣｌ緩衝液（任意選択で２ｍＭのＭｇＣｌ_２、２．５ｍＭのＫＣｌ、及び「粘着」を防止するための０．００１％プルロニックを含む）で希釈し、平衡／洗浄緩衝液（２５ｍＭのトリスＨＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ_２、２．５ｍＭのＫＣｌ ｐＨ８．４）で予め平衡化したＡＥＸカラムにロードした。カラムを平衡化／洗浄緩衝液で洗浄し、続いて漸増ＮａＣｌ濃度の直線勾配によって溶出した。試験した３つの樹脂は全て、完全ＡＡＶ８－Ｂ粒子を含むメインピークと、空の／充填不完全なカプシドを含むフロントピークと、凝集したウイルスを含むテールとの間を良好に分離した。Ｍｇ^２＋及びＫ^＋を含む緩衝系を用いたＡＡＶ８－Ｂで観察された分離（図４）は、Ｍｇ^２＋及びＫ^＋を含まない緩衝系を用いたＡＡＶ８－Ａの４級アミンＡＥＸカラムで観察された分離（図１Ａ、Ｂ、Ｄ、及びＥ）と比較して顕著に優れていた。

【0138】

実施例４．ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標）ＱＡ ＡＥＸクロマトグラフィーを用いたＡＡＶ８粒子の大規模精製。
ＡＡＶ８－Ａを、実施例１で説明されているように５０Ｌの細胞培養物上清から単離し、実施例２で説明されているようにトリスｐＨ８．４、２．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、及び１ｍＭのＫＣｌ、低速の流量、ならびに浅い直線ＮａＣｌ濃度勾配を含む緩衝系を用いた８０ｍＬのＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標）ＱＡモノリスカラムを用いてさらに精製した。８０ｍＬのＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標）ＱＡカラムまでスケールアップしたＡＥＸクロマトグラフィー法により、アフィニティー精製したＡＡＶ８－Ａは、３つの画分またはピーク：空のウイルスカプシドを含む第１またはフロントピーク（２８０ｎｍの吸光度＞２６０ｎｍの吸光度）；完全ＡＡＶ８－Ａ粒子及び最小限の生成物関連不純物を含む第２またはメジャーピーク（２６０ｎｍの吸光度＞２８０ｎｍの吸光度）；様々な生成物関連不純物（例えば、凝集、ミスフォールド、または分解したＡＡＶ粒子）の混合物を含む第３またはテールピークに分離された（図５）。６回の実行からのＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標）ＱＡクロマトグラフィー処理における平均ＡＡＶ８－Ａゲノムコピー（ＧＣ）収率は９２％であった。

【0139】

６０Ｌの浮遊細胞培養物上清から収集したＡＡＶ８－Ｂ粒子を、実施例１での説明とほぼ同様に、Ｐｏｒｏｓ ＡＡＶＸアフィニティークロマトグラフィーカラムで精製した。アフィニティー精製した調製物を２０ｍＭのトリスＨＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＫＣｌ、及び０．００１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ ｐＨ８．８で１２倍に希釈し、平衡化／洗浄緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、８．０ｍＭのＭｇＣｌ２、２．５ｍＭのＫＣｌ ｐＨ８．８）で事前に平衡化した８０ｍＬのＣＩＭ ＱＡカラムにロードした。カラムに結合したＡＡＶ８－Ｂを漸増ＮａＣｌ濃度の直線勾配によって溶出した。ＡＡＶ８－Ｂ粒子を、Ａ２６０及びＡ２８０吸収値に基づいて収集した。Ａ２６０／Ａ２８０＞１．１（フロント）で始まり最大ピークの２５％に達するＡ２８０で終わる画分をプールした。図６。プールした溶出画分を、０．２Ｍのトリス－ＨＣｌ、０．０１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ ＰＦ－６８、ｐＨ７．２±０．２を添加することにより中和した。ＣＩＭ ＱＡカラム精製のＧＣ収率は７７％であった。分析的超遠心分離によって示されたように、単離された粒子の７８％は完全ＡＡＶであった。ＣＩＭ ＱＡカラムステップでは、Ａ２８０値に基づく評価において、不純物の６４％が除去された。

【0140】

５０Ｌの浮遊細胞培養物上清から収集したＡＡＶ８－Ｃ粒子（例えば、導入遺伝子Ｃを含むＡＡＶ８粒子）を、実施例１での説明とほぼ同様に、Ｐｏｒｏｓ ＡＡＶＸアフィニティークロマトグラフィーカラムで精製した。アフィニティー精製した調製物を２０ｍＭのトリスＨＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＫＣｌ、及び０．００１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ ｐＨ８．８で１２倍に希釈し、平衡化／洗浄緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、８．０ｍＭのＭｇＣｌ２、２．５ｍＭのＫＣｌ ｐＨ８．８）で事前に平衡化した８０ｍＬのＣＩＭ ＱＡカラムにロードした。カラムに結合したＡＡＶ８－Ｂを漸増ＮａＣｌ濃度の直線勾配によって溶出した。ＡＡＶ８－Ｂ粒子を、Ａ２６０及びＡ２８０吸収値に基づいて収集した。Ａ２６０／Ａ２８０＞１．０（フロント）で始まり最大ピークの２０％に達するＡ２８０で終わる画分をプールした。図７。プールした溶出画分を、０．２Ｍのトリス－ＨＣｌ、０．０１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ ＰＦ－６８、ｐＨ７．２±０．２を添加することにより中和した。ＣＩＭ ＱＡカラム精製のＧＣ収率は１００％であった。分析的超遠心分離によって示されたように、単離された粒子の５１％は完全ＡＡＶであり、３０％は不完全ＡＡＶであった。ＣＩＭ ＱＡカラムステップでは、Ａ２８０値に基づく評価において、不純物の６５％が除去された。

【0141】

実施例５．ＡＥＸクロマトグラフィーによるＡＡＶ９精製。
実施例１で説明されている処理を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製されたＡＡＶ９ウイルスを、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標）ＱＡカラムを使用するアニオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製した。試料を、１ｍＭのＭｇＣｌ_２及び１ｍＭのＫＣｌを伴うまたは伴わないＡＥＸロード希釈緩衝液（２５ｍＭのトリス、０．００１％のＰＦ－６８、ｐＨ１０．０）で希釈した。平衡化緩衝液は、１ｍＭのＭｇＣｌ_２及び１ｍＭのＫＣｌを伴うまたは伴わない２５ｍＭトリス、３ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ９．３であり、溶出緩衝液は、１ｍＭのＭｇＣｌ_２及び１ｍＭのＫＣｌを伴うまたは伴わない２５ｍＭのトリス、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ９．３であった。９ｍＭのＮａＣｌから１２１ｍＭのＮａＣｌまでの直線ＮａＣｌ濃度勾配を５０ＣＶにわたり送達させてＡＡＶ９粒子を溶出した。クロマトグラフィー緩衝液に１ｍＭのＭｇＣｌ_２及び１ｍＭのＫＣｌを含めることで、ＡＡＶ９生成物のピーク面積が１２％増加し、ＧＣステップ収率が７６％から７９％に増加した（図８）。

【0142】

本開示の方法は、現在最も実用的で好ましい実施形態であると考えられるものと共に説明してきたが、本開示に包含される方法は、開示された実施形態に限定されるべきではなく、逆に、添付の請求項の趣旨及び範囲に含まれる様々な変更及び同等のアレンジを網羅するように意図されていることを理解されたい。

【0143】

本明細書で引用された全ての刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、及びアクセッション番号／データベースの配列（ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の両方を含む）は、各々の個別の刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、またはアクセッション番号／データベースの配列が、具体的かつ個別に参照によって援用されるのと同程度に、あらゆる目的において、参照によりこれらの全体が本明細書に援用される。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】