特許 7386507 筋分化促進剤および筋分化促進方法および筋分化促進オリゴＤＮＡ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-11-16

(45)【発行日】2023-11-27

(54)【発明の名称】筋分化促進剤および筋分化促進方法および筋分化促進オリゴＤＮＡ

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/711 20060101AFI20231117BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20231117BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20231117BHJP

【ＦＩ】

A61K31/711 ZNA

A61K48/00

A61P21/00

【請求項の数】 6

(21)【出願番号】P 2019142724

(22)【出願日】2019-08-02

(65)【公開番号】P2021024792

(43)【公開日】2021-02-22

【審査請求日】2022-07-20

(73)【特許権者】

【識別番号】504180239

【氏名又は名称】国立大学法人信州大学

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】梅澤 公二

(72)【発明者】

【氏名】▲高▼谷 智英

【審査官】川合 理恵

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２００１／０７７３８４（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ

Ａ６１Ｐ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

３連グアニン配列と４連グアニン配列がアデニンかチミンのいずれか又は両方を含む１乃至３個の塩基を介して結合した塩基配列（配列番号２０または配列番号２１または配列番号２２）を有し、前記３連グアニン配列と前記４連グアニン配列がそれぞれ対向する立体構造を有したオリゴＤＮＡを含む筋分化促進剤であって、前記オリゴＤＮＡは、５’ＴＴＧＧＧＴＧＧＧＧＡＡ３’（配列番号８）、５’ＴＴＧＧＧＴＧＡＧＧＧＧＡＡ３’（配列番号１０）、５’ＴＴＴＧＧＧＴＧＧＧＧＡＡＡ３’（配列番号９）または５’ＴＴＴＧＧＧＴＧＡＧＧＧＧＡＡＡ３’（配列番号１１）で表される、筋分化促進剤。

【請求項2】

哺乳類もしくは鳥類の細胞または哺乳類もしくは鳥類の個体に対して適用することを特徴とする請求項１に記載の筋分化促進剤。

【請求項3】

前記細胞はマウス筋芽細胞またはニワトリ筋芽細胞またはヒト筋芽細胞であることを特徴とする請求項２に記載の筋分化促進剤。

【請求項4】

前記個体はマウスまたはニワトリまたはヒトであることを特徴とする請求項２に記載の筋分化促進剤。

【請求項5】

請求項１乃至請求項４のいずれかに記載の筋分化促進剤を使用する、哺乳類もしくは鳥類の細胞または哺乳類もしくは鳥類の個体に対する筋分化促進方法（ただし、人間を治療する方法を除く）。

【請求項6】

３連グアニン配列と４連グアニン配列がアデニンかチミンのいずれか又は両方を含む１乃至３個の塩基を介して結合した塩基配列（配列番号２０または配列番号２１または配列番号２２）を有し、前記３連グアニン配列と前記４連グアニン配列がそれぞれ対向する立体構造を有した筋分化促進オリゴＤＮＡであって、５’ＴＴＧＧＧＴＧＡＧＧＧＧＡＡ３’（配列番号１０）、５’ＴＴＴＧＧＧＴＧＧＧＧＡＡＡ３’（配列番号９）または５’ＴＴＴＧＧＧＴＧＡＧＧＧＧＡＡＡ３’（配列番号１１）で表される、筋分化促進オリゴＤＮＡ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、筋萎縮症の予防・治療、横紋筋肉腫の増殖・転移の抑制、ＥＳ・ｉＰＳ細胞もしくは体性幹細胞の筋分化誘導、筋疾患の再生医療、創薬のスクリーニングに供する骨格筋（幹）細胞の作成、食肉用家畜・家禽の飼料の添加物、食肉用家畜・家禽の骨格筋の形成・生育の促進に利用可能な筋分化促進剤および筋分化促進剤方法および筋分化促進オリゴＤＮＡに関する。

【背景技術】

【0002】

超高齢社会では、加齢性の骨格筋萎縮（サルコペニア）を主徴とするロコモティブ症候群（運動器症候群）が急増しており、日本における要支援・要介護となった原因の第一位を占めている。また、日本人の死因の第一位である癌の患者の数十％が癌悪液質（カヘキシー）を合併するが、癌悪液質による骨格筋量の減少は生命予後と強く相関する。また、死因の第２、３位を占める心血管疾患の最終病像である心不全においては、骨格筋の萎縮は予後の独立した危険因子である。さらに、糖尿病患者の一部でも糖尿病性の筋萎縮が認められる。このように、骨格筋の萎縮は、老化や多様な疾患と連動している。したがって、日本を含む超高齢社会において、筋萎縮の予防および治療法の開発は、人々の運動機能を維持し、生活の質（ＱＯＬ）を向上させ、健康寿命を延伸するために不可欠である。

【0003】

骨格筋は、衛星細胞と呼ばれる骨格筋幹細胞の増殖と分化によって、組織としての恒常性が保たれる。筋再生時には、衛星細胞は筋芽細胞と呼ばれる筋前駆細胞へと活性化される。筋芽細胞は数回の細胞分裂によって増殖した後、筋細胞へと分化する。筋細胞は互いに融合して多核の筋管を形成し、骨格筋組織を再生する。ところが老化が進行すると、筋組織中の衛星細胞の数が減少し、また、個々の衛星細胞の再生能力も低下する。衛星細胞の老化を抑制する、あるいは再生能力を活性化する機能性分子を探索・同定することは、筋萎縮症に対する新しい予防戦略の提唱につながると期待されている。

【0004】

老化防止という観点から、テロメア相同オリゴＤＮＡ（配列番号２、３）を細胞に曝露することにより、平均テロメア長を増加させる技術が開示されている（特許文献１）。また、最近では、乳酸菌ゲノム配列由来のテロメア配列を有する塩基長１８のオリゴＤＮＡ（配列番号１）を筋芽細胞に曝露することにより、骨格筋への分化を促進する技術が提案されている（特許文献２）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【文献】特表２００５－５２２５２０号公報

【文献】ＷＯ２０１８／１５１２２５

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

しかし、特許文献１の方法は現状維持に関する方法、すなわちテロメア長を維持することによる細胞の修復やＤＮＡ欠損に由来するガン化の抑制を目的としたものであり、筋分化を促進しようとするものではない。また、特許文献２のオリゴＤＮＡは、乳酸菌ゲノム配列由来ではあるが実際に商品として生産するには化学合成的な手法を用いざるを得ず、コスト的な問題があった。

【0007】

そこで本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行い、新たな知見を見出すに至った。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本開示の一態様に係る筋分化促進剤は、３連グアニン配列と４連グアニン配列がアデニンかチミンのいずれか又は両方を含む１乃至３個の塩基を介して結合した塩基配列（配列番号２０または配列番号２１または配列番号２２）を有し、前記３連グアニン配列と前記４連グアニン配列がそれぞれ対向する立体構造を有したオリゴＤＮＡを含む。

【0009】

前記オリゴＤＮＡの塩基長は８以上１６以下であってもよい。

【0010】

前記オリゴＤＮＡの塩基長は１４以下であってもよい。

【0011】

前記オリゴＤＮＡは、５’ＧＧＧＴＧＧＧＧ３’（配列番号４）または５’ＧＧＧＴＧＡＧＧＧＧ３’（配列番号５）のいずれかで表されてもよい。

【0012】

前記オリゴＤＮＡは、５’ＴＴＧＧＧＴＧＧＧＧＡＡ３’（配列番号６）または５’ＴＴＧＧＧＴＧＡＧＧＧＧＡＴ３’（配列番号７）で表されてもよい。

【0013】

前記オリゴＤＮＡは、５’ＴＴＧＧＧＴＧＧＧＧＡＡ３’（配列番号８）または５’ＴＴＧＧＧＴＧＡＧＧＧＧＡＡ３’（配列番号１０）で表されてもよい。

【0014】

前記オリゴＤＮＡは、５’ＴＴＴＧＧＧＴＧＧＧＧＡＡＡ３’（配列番号９）または５’ＴＴＴＧＧＧＴＧＡＧＧＧＧＡＡＡ３’（配列番号１１）で表されてもよい。

【0015】

前記筋分化促進剤は、哺乳類もしくは鳥類の細胞または個体に対して適用してもよい。

【0016】

前記細胞はマウス筋芽細胞またはニワトリ筋芽細胞またはヒト筋芽細胞であってもよい。

【0017】

前記個体はマウスまたはニワトリまたはヒトであってもよい。

【0018】

本開示の一態様に係る筋分化促進方法は、前記筋分化促進剤を使用する。

【0019】

本開示の一態様に係る筋分化促進オリゴＤＮＡは、３連グアニン配列と４連グアニン配列がアデニンかチミンのいずれか又は両方を含む１乃至３個の塩基を介して結合した塩基配列（配列番号２０または配列番号２１または配列番号２２）を有し、前記３連グアニン配列と前記４連グアニン配列がそれぞれ対向する立体構造を有する。

【0020】

前記筋分化促進オリゴＤＮＡの塩基長は８以上１６以下であってもよい。

【0021】

前記筋分化促進オリゴＤＮＡの塩基長は１４以下であってもよい。

【0022】

前記筋分化促進オリゴＤＮＡは、５’ＧＧＧＴＧＧＧＧ３’（配列番号４）または５’ＧＧＧＴＧＡＧＧＧＧ３’（配列番号５）のいずれかで表される塩基配列を有してもよい。

【0023】

前記筋分化促進オリゴＤＮＡは、５’ＴＴＧＧＧＴＧＧＧＧＡＡ３’（配列番号６）または５’ＴＴＧＧＧＴＧＡＧＧＧＧＡＡ３’（配列番号７）で表される塩基配列を有してもよい。

【0024】

前記筋分化促進オリゴＤＮＡは、５’ＴＴＧＧＧＴＧＧＧＧＡＡ３’（配列番号８）または５’ＴＴＧＧＧＴＧＡＧＧＧＧＡＡ３’（配列番号１０）で表されてもよい。

【0025】

前記筋分化促進オリゴＤＮＡは、５’ＴＴＴＧＧＧＴＧＧＧＧＡＡＡ３’（配列番号９）または５’ＴＴＴＧＧＧＴＧＡＧＧＧＧＡＡＡ３’（配列番号１１）で表されてもよい。

【発明の効果】

【0026】

本開示の一態様によれば、塩基長１２～１６という、さらに好ましくは塩基長１４以下という、比較的短くて安定な、化学合成に適した非テロメア型のオリゴＤＮＡを用い、筋分化を強力に促進することが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0027】

【図1】骨格筋の再生メカニズムを示す説明図

【図2】筋分化促進効果を有するテロメア型オリゴＤＮＡの構造的特徴を示す図

【図3】テロメア型オリゴＤＮＡとその変異体を投与したマウス筋芽細胞のＭＨＣ陽性細胞出現率を示すグラフ

【図4】本開示の一実施形態におけるオリゴＤＮＡの構造的特徴を示す図

【図5】本開示の一実施形態におけるオリゴＤＮＡの構造的特徴を示す図

【図6】本開示の比較例におけるオリゴＤＮＡの構造的特徴を示す図

【図7】本開示の実施例１におけるオリゴＤＮＡと比較例を投与したヒト筋芽細胞のＭＨＣシグナル強度を示すグラフ

【図8】本開示の実施例２におけるオリゴＤＮＡと比較例を投与したヒト筋芽細胞のＭＨＣシグナル強度を示すグラフ

【図9】本開示の実施例３におけるオリゴＤＮＡと比較例を投与したマウス筋芽細胞のＭＨＣ陽性細胞出現率を示すグラフ

【図10】本開示の実施例４におけるオリゴＤＮＡと比較例を投与したニワトリ筋芽細胞のＭＨＣシグナル強度を示すグラフ

【発明を実施するための形態】

【0028】

（本開示の実施形態）
以下、本開示の一態様に係る実施の形態（以下、本実施の形態）について図面を参照して詳細に説明する。

【0029】

その前に、まず骨格筋の再生メカニズムについて図１を参照しながら説明する。図１は、筋肉組織の一部に損傷もしくは劣化が生じたときの、骨格筋組織の再生および恒常性維持機構を示す説明図である。骨格筋は、衛星細胞と呼ばれる骨格筋幹細胞の増殖と分化によって、組織としての恒常性が保たれる。筋再生時には、衛星細胞は筋芽細胞と呼ばれる筋前駆細胞へと活性化される。筋芽細胞は数回の細胞分裂によって増殖した後、筋細胞へと分化する。筋細胞は互いに融合して多核の筋管を形成し、骨格筋組織を再生する。このように、筋芽細胞は骨格筋の維持・再生において中心的な役割を担っている。しかし、老化や様々な疾患によって筋芽細胞の分化能が低下することが報告されており、これが骨格筋萎縮の原因の一つと考えられていた。

【0030】

そこで、発明者らは以前、乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ＧＧのゲノム配列に由来するオリゴＤＮＡライブラリを用いて筋分化促進作用の検証実験を行った（特許文献２）。その結果、配列式１（５’ＡＧＡＴＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＴＧＡ３’）で示される１８塩基のオリゴＤＮＡ（ｉＳＮ０４）が筋芽細胞の分化を顕著に促進することが明らかとなった。なお、本実施の形態において、オリゴＤＮＡとは６から２５の塩基からなる短いＤＮＡを意味する。好ましくは９から１８の塩基からなる。また、配列式１においてＴＴＡＧＧＧはテロメア配列と呼ばれ、その繰り返し配列（ＴＴＡＧＧＧ）ｎは、真核生物の染色体の末端部に存在する。テロメアは細胞分裂すなわちＤＮＡ複製とともに短くなり、細胞の老化が進むとされる（特許文献１）。

【0031】

ｉＳＮ０４による筋芽細胞の分化促進効果については以下のように考えられる。分子シミュレーションによるｉＳＮ０４の立体構造解析（図２）ならびに塩基置換ないし欠失を導入した変異ｉＳＮ０４の活性測定（図３）から、１３～１５番目の塩基（ＧＧＧ）が分子内で近接（スタック）しており、ここが活性に必須の部位であることがわかった。

【0032】

図３の実験結果について、より詳細に説明する。ここで、図中のオリゴＤＮＡの配列において、「－」は塩基が削除され、その両端の塩基が直に結合していることを表す。本実験では、マウス骨格筋から採取した衛星細胞を初代培養して得られた筋芽細胞を用いた。コラーゲンコートした９６－ｗｅｌｌプレートに、１万個／ｗｅｌｌのマウス筋芽細胞を播種する。翌日、１０μＭのｉＳＮ０４および変異ｉＳＮ０４、または陰性対象（純水、図中Ｃｏｎｔｒｏｌ）を投与する。４８時間後に、骨格筋の最終分化マーカーであるミオシン重鎖（ＭＨＣ）の抗体を用いて免疫染色する。このとき、ＤＡＰＩ染色によって細胞核を可視化する。イメージアナライザーを用いて、細胞の染色画像の撮影と、ＭＨＣ陽性細胞の割合（ＭＨＣ陽性細胞内に存在するＤＡＰＩ陽性細胞核の数を、全てのＤＡＰＩ陽性細胞核の数で除したもの）の算出を自動的に行う。

【0033】

実験の結果、陰性対象では約２０％であるＭＨＣ陽性細胞率が、ｉＳＮ０４投与群では５０％を超えていた。このことから、ｉＳＮ０４が筋芽細胞からＭＨＣ陽性の筋細胞ないし筋管への分化を促進していることがわかる。一方、ｉＳＮ０４の１５番目のＧを削除した変異ｉＳＮ０４（Δ１５）、１４～１５番目のＧＧを削除したΔ１４－１５、１３～１５番目のＧＧＧを削除したΔ１３－１５の順に、筋分化促進活性が低下した。これらの結果から、ｉＳＮ０４の１３～１５番目のＧＧＧが筋分化促進活性に不可欠であることがわかった。

【0034】

以上のｉＳＮ０４を用いた結果から、ｉＳＮ０４の立体構造の特徴を有していれば、１８塩基より短いオリゴＤＮＡでも筋分化促進活性を発揮する可能性が考えられる。筋分化促進オリゴＤＮＡの臨床応用を考えるとき、より短い（分子量の小さい）オリゴＤＮＡの開発は、合成コストの低下や、摂取・吸収率の向上につながると期待される。また、安定性についても分子量が小さいほど有利であることが一般的に期待される。

【0035】

表１に本実施の形態におけるオリゴＤＮＡの配列（配列番号８～１５）を示す。なお、本実施形態における前記オリゴＤＮＡは一本鎖であってもよい。また、核酸分解酵素に対して耐性を高めるためにホスホジエステル結合を有するオリゴＤＮＡのリン酸基の酸素原子を硫黄原子で置換したもの（例えばホスホロチオエート結合）であってもよいが、これらに限定されない。

【表1】

【0036】

表１のオリゴＤＮＡ（ｉＭｙｏ０１～０８）の塩基配列は、上記の分子シミュレーションおよび実験結果を踏まえたものである。すなわちｉＳＮ０４の１３～１５番目のＧＧＧの立体構造の特徴を保持すべく設計されたものである。ただし、いずれのオリゴＤＮＡにもテロメア配列（ＴＴＡＧＧＧ）は含まれていない。特に、ｉＭｙｏ０１～０４は、３連グアニン配列（ＧＧＧ）と４連グアニン配列（ＧＧＧＧ）がアデニン（Ａ）かチミン（Ｔ）のいずれか又は両方を含む１乃至３個の塩基を介して結合した塩基配列を有する、という特徴を有している。当該塩基配列はＧＧＧＷＧＧＧＧ（配列番号２０）またはＧＧＧＷＷＧＧＧＧ（配列番号２１）またはＧＧＧＷＮＷＧＧＧＧ（配列番号２２）と表すこともできる。ここでＷはアデニン（Ａ）かチミン（Ｔ）を、Ｎはアデニン（Ａ）かチミン（Ｔ）かグアニン（Ｇ）かシトシン（Ｃ）のいずれかを表す。さらにｉＭｙｏ０１～０４の塩基長は８以上１６以下となっている。

【0037】

例えば、ｉＭｙｏ０１、０２はコア配列ＧＧＧＴＧＧＧＧ（配列番号４）を、ｉＭｙｏ０３、ｉＭｙｏ０４はコア配列ＧＧＧＴＧＡＧＧＧＧ（配列番号５）を有することにより、より好ましくは、ｉＭｙｏ０１、ｉＭｙｏ０２はコア配列ＴＴＧＧＧＴＧＧＧＧＡＡ（配列番号６）を、ｉＭｙｏ０３、ｉＭｙｏ０４はコア配列ＴＴＧＧＧＴＧＡＧＧＧＧＡＡ（配列番号７）をそれぞれ有することにより、筋分化促進活性に有利な構造を有していると考えられる。

【0038】

そこで、ｉＭｙｏ０３（配列番号１０）、ｉＭｙｏ０４（配列番号１１）、および比較例としてｉＭｙｏ０７（配列番号１４）の、それぞれ分子シミュレーションによる立体構造解析を行った。立体構造の算出には単純軌跡和マルチカノニカル分子動力学（ＭｃＭＤ）法（Ｊ． Ｉｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｏｍｐｕｔ． Ｃｈｅｍ．， ２０１１）を用いた。ＭｃＭＤ法は、高温から低温までを構造サンプリングすることで、効率的に室温付近における平衡状態の構造集団を求めることができる手法である。ここでは、３１０Ｋにおける構造集団を求め、解析に用いた。なお、本方法は前述のｉＳＮ０４の立体構造計算と同じである。立体構造解析の結果を、それぞれ図４、図５、図６に示す。

【0039】

各図の左側に示した立体構造（水素原子を非表示、５’末端から３’ 末端へ、塩基ごとにグラジュエ―ションを施す）は３１０Ｋにおいて最も確率の高い（最安定な）計算構造である。図４のｉＭｙｏ０３（配列番号１０）の立体構造は７～９番目ＴＧＡの部分で曲がった構造を示している。また、１番目のＴ（チミン）が曲がった部分に入り込み、全体的な立体構造の保持に働いているように見える。

【0040】

図４の右側に、ｉＭｙｏ０３分子内における各塩基間の接触確率を示す。濃い色の部分は接触確率が高く、塩基同士が近くに位置していることを表している。ｉＭｙｏ０３内では特に４番目と１１番目、５番目と１０番目、６番目と９番目、７番目と９番目の塩基同士付近が濃い色を示し、それらのペアは近くに位置している確率が高い。これは両端が接触したヘアピン様の立体構造を表している。すなわち、ｉＭｙｏ０３の立体構造的な特徴として、塩基配列の７～９番目で折れ曲がり、かつ両側の連続グアニンＧＧＧが互いに逆平行に並んで対向している可能性が高い。

【0041】

図５のｉＭｙｏ０４（配列番号１１）では、ｉＭｙｏ０３で見られたヘアピン様の特徴が明らかではない。図５中の左側において、ｉＭｙｏ０４の最安定な立体構造はヘアピン様構造を形成している。しかし、１番目のチミン（Ｔ）は曲がった部分には入り込んでいない。加えて、図５中の右側の図（ｉＭｙｏ０４内の各塩基間の接触確率）からｉＭｙｏ０３で見られた特徴が薄いことがわかる。

【0042】

図６のｉＭｙｏ０７（配列番号１４）立体構造はｉＭｙｏ０３（配列番号１０）およびｉＭｙｏ０４（配列番号１１）のものとは大きく異なる。また、右側の図（ｉＭｙｏ０７内の各塩基間の接触確率）からはヘアピン様の特徴が見られない。つまり、ｉＭｙｏ０７の立体構造的な特徴はｉＭｙｏ０３およびｉＭｙｏ０４のものとは異なり、ｉＳＮ０４とも異なることを示している。

【0043】

以上、まとめると、ｉＭｙｏ０３はヘアピン様構造の安定性が高く、かつ、ｉＳＮ０４の３連グアニン（ＧＧＧ）と同様な局所構造を保っている。ｉＭｙｏ０４はｉＭｙｏ０３に比べて構造安定性が低く、立体構造にばらつきがある。ｉＭｙｏ０７の立体構造はｉＳＮ０４、ｉＭｙｏ０３、ｉＭｙｏ０４と異なる。以上の構造的特徴は、各オリゴＤＮＡにおける筋分化促進活性効果と密接に関係している。これについては実施例で詳細に説明する。

【0044】

なお、本実施の形態におけるオリゴＤＮＡを筋分化促進剤として使用する場合、個体を構成する細胞に対しても培養液で培養された細胞に対しても適用可能である。また、前記筋分化促進剤はマウス、ヒトを含む哺乳類もしくはニワトリを含む鳥類を対象とすることができるが、これらに限定されない。さらに、本実施の形態における筋分化促進剤は、注射薬、塗布薬、錠剤、カプセル剤、シロップ、座薬等に製剤化できるが、これらに限定されない。また、前記筋分化促進剤は、経口、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、髄内、髄腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、経腸、局所、舌下または直腸手段によって投与することができるが、これらに限定されない。

【実施例】

【0045】

以下、本開示の実施例について説明する。なお、以下の実験に用いたオリゴＤＮＡのサンプル（ｉＳＮ０４（配列番号１）、ｉＳＮ１４（配列番号１６）、ｉＳＮ４５（配列番号１７）およびｉＭｙｏ０１～０８（配列番号８～１５）は、核酸分解酵素に対して耐性を高めるために、ヌクレオチド間のホスホジエステル結合をホスホロチオエート結合に置換して合成した後、ＨＰＬＣ精製したものである。
（実施例１）
図７に、市販の健常者ヒト筋芽細胞を用いた試験の結果を示す。まず、コラーゲンコートした９６－ｗｅｌｌプレートに、６千個／ｗｅｌｌのヒト筋芽細胞を播種する。翌日、３０μＭのオリゴＤＮＡまたは陰性対象（純水、図中Ｃｔｒｌ）を投与する。オリゴＤＮＡは、試験対象としてｉＭｙｏ０１～０８（配列番号８～１６）、陽性対照としてｉＳＮ０４（図中ｉＳＮ－０４）（配列番号１）、陰性対照としてｉＳＮ１４（図中ｉＳＮ－１４）（配列番号１６）およびｉＳＮ４５（図中ｉＳＮ－４５）（配列番号１７）を用いた。ｉＳＮ１４およびｉＳＮ４５は従来、筋分化促進活性を有しないことがわかっている（特許文献２）。

【0046】

４８時間後に、免疫染色によって骨格筋の最終分化マーカーであるミオシン重鎖（ＭＨＣ）の発現を定量化する。このとき、ＤＡＰＩ染色によって細胞核を可視化する。さらにイメージアナライザーを用いて、細胞の染色画像の撮影と、ＭＨＣシグナル強度（画像中のＭＨＣシグナル強度の総計を、ＤＡＰＩ陽性細胞核の数で除したもの）またはＭＨＣ陽性細胞率の算出を自動的に行った。陰性対照（純水群）とオリゴＤＮＡ投与群のＭＨＣシグナル強度の差は、Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｔｅｓｔによって検定した。結果を図７に示す。

【0047】

ｉＳＮ０４（配列番号１）、ｉＭｙｏ０１（配列番号８）、ｉＭｙｏ０３（配列番号１０）を投与した群のＭＨＣシグナル強度は、有意な差をもって純水群（Ｃｔｒｌ）のＭＨＣシグナル強度を上回っていた。すなわち、ｉＭｙｏ０１およびｉＭｙｏ０３はｉＳＮ０４と同程度にヒト筋芽細胞の分化を促進することが示された。

【0048】

（実施例２）
後日、ヒト筋芽細胞を用いた２回目の試験を、図７の実験と同様の方法で行った。結果を図８に示す。本実施例では、純水群（Ｃｔｒｌ）におけるＭＨＣシグナル強度が低く（実施例１の約１７０に対し本実施例では約６０）、ヒト筋芽細胞が分化誘導されにくい状態であったことがわかる。このような条件下においても、ｉＳＮ０４（配列番号１）およびｉＭｙｏ０３（配列番号１０）を投与した群のＭＨＣシグナル強度は、有意な差をもって純水群（Ｃｔｒｌ）のＭＨＣシグナル強度を上回った。一方、１回目の試験で筋分化促進活性を示したｉＭｙｏ０１（配列番号８）は、本２回目の試験ではＭＨＣシグナル強度を顕著には増強しなかった。以上の結果から、ｉＭｙｏ０３の筋分化促進活性はｉＳＮ０４と同程度であるが、ｉＭｙｏ０１の活性はｉＭｙｏ０３よりも劣っている可能性があると考えられる。

【0049】

（実施例３）
本実施例ではマウス筋芽細胞でのスクリーニング試験とその結果について説明する。本実施例も図７の実験と同様の方法で行った。陰性対照（純水群）とオリゴＤＮＡ投与群のＭＨＣ陽性細胞率の差を、Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｔｅｓｔによって検定した。結果を図９に示す。ｉＳＮ０４（配列番号１）、ｉＭｙｏ０３（配列番号１０）、ｉＭｙｏ０４（配列番号１１）を投与した群のＭＨＣ陽性細胞率は、有意な差をもって純水群（Ｃｔｒｌ）のＭＨＣ陽性細胞率を上回った。すなわち、ｉＭｙｏ０３およびｉＭｙｏ０４はｉＳＮ０４と同様にマウス筋芽細胞の分化を促進することが示された。

【0050】

（実施例４）
本実施例ではニワトリ筋芽細胞でのスクリーニング試験とその結果について説明する。本実施例では、ニワトリ骨格筋から採取した衛星細胞を初代培養して得られた筋芽細胞を用いた。コラーゲンコートした９６－ｗｅｌｌプレートに、５千個／ｗｅｌｌのニワトリ筋芽細胞を播種する。翌日、１０μＭのオリゴＤＮＡまたは陰性対照（純水）を投与する。４８時間後にＭＨＣを免疫染色する。このとき、ＤＡＰＩ染色によって細胞核を可視化する。イメージアナライザーを用いて、細胞の染色画像の撮影と、ＭＨＣシグナル強度の算出を自動的に行った。陰性対照（純水群）とオリゴＤＮＡ投与群のＭＨＣシグナル強度の差を、Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｔｅｓｔによって検定した。結果を図１０に示す。

【0051】

ｉＳＮ０４（配列番号１）、ｉＭｙｏ０１～０４（配列番号８～１１）を投与した群のＭＨＣシグナル強度は、有意な差をもって純水群（Ｃｔｒｌ）のＭＨＣシグナル強度を上回った。以上の結果から、ｉＭｙｏ０１～０４はｉＳＮ０４と同様にニワトリ筋芽細胞の分化を促進することが示された。

【0052】

以上、実施例１～４の結果をまとめると、ｉＳＮ０４は、ヒト、マウス、ニワトリのいずれの筋芽細胞に対しても、安定して顕著な筋分化促進活性を示した。同様に、ｉＭｙｏ０３は全ての試験において、いずれの筋芽細胞に対しても筋分化促進活性を示した。また、ｉＭｙｏ０１はヒト筋芽細胞の、ｉＭｙｏ０４はマウス筋芽細胞の分化を、それぞれ促進した。ニワトリ筋芽細胞に対しては、ｉＭｙｏ０１～０４が筋分化促進作用を示した。一方、ｉＭｙｏ０５～０８はいずれの筋芽細胞に対しても筋分化促進作用を示さなかった。

【0053】

以上の結果から、ｉＭｙｏ０３（配列番号１０）はｉＳＮ０４（配列番号１）と極めて類似した筋分化促進活性を有する、すなわちｉＭｙｏ０３（配列番号１０）とｉＳＮ０４（配列番号１）の構造はよく似た特徴を示すことが考えられる。一方で、ｉＭｙｏ０１（配列番号８）、ｉＭｙｏ０２（配列番号９）、ｉＭｙｏ０４（配列番号１１）の筋分化促進活性には種特異性があることが強く示唆された。

【0054】

以上の実験結果は、先に示した各オリゴＤＮＡの立体構造と密接に関係していると思われる。すなわち、ｉＭｙｏ０３（配列番号１０）の連続グアニン内において隣り合うグアニンＧＧＧは接触確率が高く（図４右の各塩基間接触確率）、ｉＳＮ０４（配列番号１）の連続グアニンＧＧＧ（１３～１５番目）と同様のスタック構造を形成している。つまり、ｉＳＮ０４の活性に必須のＧＧＧと同様な局所構造をｉＭｙｏ０３は有している。

【0055】

これに対し、ｉＭｙｏ０４（配列番号１１）はｉＭｙｏ０３に比べて、ヘアピン様構造の安定性が低く（図５右の各塩基間接触確率）、両者の構造に大きなばらつきがある。この構造のばらつきのため、ｉＭｙｏ０４はｉＭｙｏ０３に比べて全体的に活性が低く、種特異性が現れたことが考えられる。さらに、ｉＭｙｏ０７（配列番号１４）に至ってはヘアピン様構造状の立体構造を有しておらず、そのため活性がなかったものと考えられる。このように、筋分化促進活性に違いが現れた理由として、ｉＭｙｏシリーズの立体構造的な特徴の違いが考えられる。

【0056】

なお、オリゴＤＮＡが種特異性を示すことは珍しくなく、むしろｉＳＮ０４のように、哺乳類と鳥類を含む幅広い種の細胞に活性を示す配列の方が少ない。例えば、ＣｐＧ ＯＤＮ ２００６（配列番号１８）はマウスとヒト両方のＴｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）を活性化するが、ＣｐＧ ＯＤＮ １８２６（配列番号１９）はマウスＴＬＲ９特異的でありヒトＴＬＲ９を活性化しない、といった報告がある（Ｐｏｈａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１５）。

【0057】

恐らく、ｉＳＮ０４（配列番号１）およびｉＭｙｏ０３（配列番号１０）の共通した構造的特徴は、ヒト、マウス、ニワトリで共通する分子基盤を認識ないし標的とするのに適していると考えられる。他方、ｉＭｙｏ０１、０２、０４の構造はｉＳＮ０４やｉＭｙｏ０３と少し異なるため、その微細な差異により、動物種によっては活性を発揮しないと推測される。

【0058】

いずれの種の筋芽細胞において作用を示さなかったｉＭｙｏ０５～０８（配列番号１２～１５）は、塩基配列後半のグアニンが３連であることがｉＭｙｏ０１～０４（配列番号８～１１）とは異なる。したがって、ｉＭｙｏ０１～０４の活性には塩基配列後半の４連グアニン（ＧＧＧＧ）が重要であることが強く示唆される。ｉＭｙｏ０１～０４の４連グアニンは、ｉＳＮ０４の活性に不可欠な１３～１５番目の３連グアニンと類似の立体構造に重要であると考えられる。

【0059】

以上、本開示によれば、塩基長１２～１６のオリゴＤＮＡ、例えば塩基長１４のｉＭｙｏ０３（配列番号１０）で示されるオリゴＤＮＡにより筋分化を強力に促進することが可能となる。すなわち筋分化を強力に促進する一連のオリゴＤＮＡ群を曝露した筋芽細胞では、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）陽性の筋細胞への分化および筋管の形成が促進されることが確認された。しかも、上記オリゴＤＮＡは化学合成が可能で安定構造を有すため、将来的に大量に供給および保存ができる。

【産業上の利用可能性】

【0060】

本発明は、加齢性筋萎縮症（サルコペニア）、癌悪液質（カヘキシー）による骨格筋量の減少、糖尿病性筋萎縮症などの、加齢性、疾患性および／または代謝性の筋萎縮の予防および／または治療、筋疾患の再生医療、横紋筋肉腫の増殖および／または転移の抑制、多能性幹細胞（ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞）または体性幹細胞の筋分化誘導、創薬のスクリーニングに供する骨格筋幹細胞（衛星細胞）、骨格筋前駆細胞（筋芽細胞）および骨格筋細胞からなる群より選択される少なくとも１種の作成、食肉用家畜および／または家禽の飼料の添加物、食肉用家畜および／または家禽の骨格筋の発生、形成および／または生育の促進に利用することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

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