▶ ピーアールジー エスアンドテック インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-11-16
(45)【発行日】2023-11-27
(54)【発明の名称】新規な化合物の筋萎縮性側索硬化症の予防、改善または治療用途
(51)【国際特許分類】
C07D 493/04 20060101AFI20231117BHJP
A61K 31/37 20060101ALI20231117BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231117BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20231117BHJP
A61P 39/06 20060101ALI20231117BHJP
A23L 33/10 20160101ALI20231117BHJP
C12N 9/02 20060101ALN20231117BHJP
【ＦＩ】
C07D493/04 CSP
A61K31/37
A61P43/00 111
A61P25/00
A61P39/06
A23L33/10
C12N9/02
【請求項の数】
6
(21)【出願番号】P 2022525112
(86)(22)【出願日】2020-10-30
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-01-05
(86)【国際出願番号】 KR2020015014
(87)【国際公開番号】W WO2021086101
(87)【国際公開日】2021-05-06
【審査請求日】2022-05-18
(31)【優先権主張番号】10-2019-0136458
(32)【優先日】2019-10-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2019-0154520
(32)【優先日】2019-11-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2020-0142053
(32)【優先日】2020-10-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】519379835
【氏名又は名称】ピーアールジー エスアンドテック インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＰＲＧ Ｓ＆ＴＥＣＨ ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(74)【代理人】
【識別番号】230118913
【弁護士】
【氏名又は名称】杉村 光嗣
(74)【代理人】
【識別番号】100181847
【弁理士】
【氏名又は名称】大島 かおり
(72)【発明者】
【氏名】パク ポムチュン
【審査官】長谷川 莉慧霞
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１７／０１２９９０４（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１４／００３９０１０（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１２／１６７０８６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Kyeong LEE et al.，Synthesis of (S)-(+)-decursin and its analogues as potent inhibitors of melanin formation in B16 murine melanoma cells，European Journal of Medicinal Chemistry，2010年12月，Vol. 45, No. 12，pp.5567-5575，DOI:10.1016/j.ejmech.2010.09.006
【文献】Li LI et al.，Protective Effects of Decursin and Decursinol Angelate against Amyloid β-Protein-Induced Oxidative Stress in the PC12 Cell Line: The Role of Nrf2 and Antioxidant Enzymes，Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry，2011年03月23日，Vol. 75, No. 3，pp. 434-442，DOI:10.1271/bbb.100606
【文献】Linda K. MCLOON et al.，Wnt and Extraocular Muscle Sparing in Amyotrophic Lateral Sclerosis，Investigative Opthalmology & Visual Science，2014年09月02日，Vol. 55, No. 9，pp. 5482-5496，DOI: 10.1167/iovs.14-14886
【文献】Jee-Hyun LEE et al.，Synthesis and evaluation of (+)-decursin derivatives as inhibitors of the Wnt/β-catenin pathway，Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，2016年08月，Vol. 26, No. 15，pp.3529-3532，DOI: 10.1016/j.bmcl.2016.06.029
【文献】Li YU et al.，Wnt Signaling is Altered by Spinal Cord Neuronal Dysfunction in Amyotrophic Lateral Sclerosis Transgenic Mice，Neurochemical Research，2013年06月20日，Vol. 38, No. 9，pp.1904-1913，DOI: 10.1007/s11064-013-1096-y
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｄ
Ａ６１Ｋ
Ａ６１Ｐ
Ａ２３Ｌ
Ｃ１２Ｎ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記化学式１で表される化合物、その水化物またはその塩：【化1】
【化2】
【化3】
【請求項2】
前記化合物は、（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル３－（４－ヒドロキシ－３－メトキシフェニル）プロパン酸、
（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル（Ｅ）－３－（ピリジン－４－イル）アクリレート、
（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル３－（４－アセトキシ－３－メトキシフェニル）プロパン酸からなる群から選択されたことを特徴とする、請求項１に記載の化合物、その水化物またはその塩。
【請求項3】
下記化学式２：【化4】
前記化学式２において、
ｎは、０～１の整数、
Ｘは、
【化5】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、それぞれ同一または異なり、水素、（Ｃ１～Ｃ４）アルキル、（Ｃ１～Ｃ４）アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、シアノまたは（Ｃ１～Ｃ４）アルキルカルボキシから選択され、
スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）の凝集及びミスフォールディングを抑制することを特徴とする、筋萎縮性側索硬化症の予防または治療用薬学組成物。
【請求項4】
前記化合物は、（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル（Ｅ）－３－（４－ヒドロキシ－３－メトキシフェニル）アクリレート、
（Ｓ，Ｅ）－７－（（３－（４－ヒドロキシ－３－メトキシフェニル）アリル）オキシ）－８，８－ジメチル－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－２－オン、
（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル３－（４－ヒドロキシ－３－メトキシフェニル）プロパン酸、
（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル（Ｅ）－３－（３，４－ジメトキシフェニル）アクリレート、
（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル３－（３，４－ジメトキシフェニル）プロパン酸、
（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル（Ｅ）－３－（ピリジン－４－イル）アクリレート、
（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル（Ｅ）－３－（３－ヒドロキシフェニル）アクリレート、
（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル（Ｅ）－３－（４－フルオロフェニル）アクリレート、
（Ｓ，Ｅ）－７－（（３－（４－フルオロフェニル）アリル）オキシ）－８，８－ジメチル－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－２－オン、
（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル（Ｅ）－３－（３－アセトキシフェニル）アクリレート、
（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル３－（４－アセトキシ－３－メトキシフェニル）プロパン酸、
（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル（Ｅ）－３－（４－アセトキシ－３－メトキシフェニル）アクリレート、
（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル（Ｅ）－３－（３，４－ジフルオロフェニル）アクリレート、及び（Ｓ，Ｅ）－７－（（３－（３－メトキシ－４－ニトロフェニル）アリル）オキシ）－８，８－ジメチル－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－２－オンからなる群から選択されたことを特徴とする、請求項３に記載の筋萎縮性側索硬化症の予防または治療用薬学組成物。
【請求項5】
下記化学式２：【化6】
前記化学式２において、
ｎは、０～１の整数、
Ｘは、
【化7】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、それぞれ同一または異なり、水素、（Ｃ１～Ｃ４）アルキル、（Ｃ１～Ｃ４）アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、シアノまたは（Ｃ１～Ｃ４）アルキルカルボキシから選択され、
スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）の凝集及びミスフォールディングを抑制することを特徴とする、筋萎縮性側索硬化症の予防または改善用健康機能食品組成物。
【請求項6】
前記化合物は、（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル（Ｅ）－３－（４－ヒドロキシ－３－メトキシフェニル）アクリレート、
（Ｓ，Ｅ）－７－（（３－（４－ヒドロキシ－３－メトキシフェニル）アリル）オキシ）－８，８－ジメチル－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－２－オン、
（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル３－（４－ヒドロキシ－３－メトキシフェニル）プロパン酸、
（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル（Ｅ）－３－（３，４－ジメトキシフェニル）アクリレート、
（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル３－（３，４－ジメトキシフェニル）プロパン酸、
（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル（Ｅ）－３－（ピリジン－４－イル）アクリレート、
（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル（Ｅ）－３－（３－ヒドロキシフェニル）アクリレート、
（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル（Ｅ）－３－（４－フルオロフェニル）アクリレート、
（Ｓ，Ｅ）－７－（（３－（４－フルオロフェニル）アリル）オキシ）－８，８－ジメチル－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－２－オン、
（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル（Ｅ）－３－（３－アセトキシフェニル）アクリレート、
（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル３－（４－アセトキシ－３－メトキシフェニル）プロパン酸、
（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル（Ｅ）－３－（４－アセトキシ－３－メトキシフェニル）アクリレート、
（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル（Ｅ）－３－（３，４－ジフルオロフェニル）アクリレート、及び（Ｓ，Ｅ）－７－（（３－（３－メトキシ－４－ニトロフェニル）アリル）オキシ）－８，８－ジメチル－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－２－オンからなる群から選択されたことを特徴とする、請求項５に記載の筋萎縮性側索硬化症の予防または改善用健康機能食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、新規な化合物の筋萎縮性側索硬化症の予防、改善または治療用途に関する。
【背景技術】
【0002】
筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ；ＡＬＳ）は、致命的な神経退行性疾患であって、脊髄内の細胞死によって運動ニューロンが選択的に消失される。約１０～２０％の患者が遺伝的パターン（家族性ＡＬＳ、ｆａｍｉｌｉａｌ ＡＬＳ；ｆＡＬＳ）を示し、残りは、孤発性ＡＬＳ（ｓｐｏｒａｄｉｃ ＡＬＳ；ｓＡＬＳ）に分類される。一部の遺伝子が、家族性ＡＬＳのＡＬＳ－関連遺伝子座位で知られ、そのうち、ＳＯＤ１は、ｆＡＬＳで初めて明らかになった遺伝子である。ｆＡＬＳ関連遺伝子が、ｓＡＬＳ発病にも作用すると推測されるが、現在までｓＡＬＳに対する正確な原因は明らかになっていない。また、ＡＬＳは、臨床症状によって典型的なＡＬＳと痴呆とを伴ったＡＬＳ及び非典型的なＡＬＳに分類される。実際に、ＳＯＤ１の突然変異は、典型的なＡＬＳを誘発し、Ｃ９ｏｒｆ７２は、痴呆を伴ったＡＬＳと関連している。
【0003】
ＡＬＳの重要な特徴の１つは、進行性疾患であって、神経細胞死が神経連結を通じて伝播されるという点である。実に、アルツハイマー及びパーキンソン病も類似した表現型を示す。前記特徴と関連して、プリオン類似伝播機転（ｐｒｉｏｎ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）が提起され、これは、ミスフォールディングされた（ｍｉｓｆｏｌｄｅｄ）タンパク質が正常タンパク質を異常タンパク質に変形させるということである。実際に、突然変異アミロイドβ（Ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ；Ａβ）は、正常Ａβを異常Ａβに変形させることができる。最近、突然変異またはミスフォールディングされたＳＯＤ１も、疾病が進行する過程で分泌され、伝播されると報告された。しかし、ＡＬＳ疾患治療剤をターゲットとしたＳＯＤ１凝集及びミスフォールディング（ｍｉｓｆｏｌｄｉｎｇ）抑制剤については多くの研究が進められていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明は、新規な化合物の筋萎縮性側索硬化症の予防、改善または治療用途に関する。
【課題を解決するための手段】
【0005】
前記目的を果たすために、本発明は、下記化学式１で表される化合物、その水化物またはその塩を提供する。
【0006】
【化1】
【0007】
前記化学式１において、
が単一結合である時、Ｘは、ＣＨであり、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ異なり、（Ｃ１～Ｃ４）アルコキシ、ヒドロキシまたは（Ｃ１～Ｃ４）アルキルカルボキシから選択され、
【0008】
【0009】
また、本発明は、下記化学式２で表される化合物、その水化物またはその塩を含む筋萎縮性側索硬化症の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【0010】
【化2】
【0011】
前記化学式２において、
【0012】
【0013】
ｎは、０～１の整数、
【0014】
Ｘは、ＣＨまたはＮであり、
【0015】
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ同一または異なり、水素、（Ｃ１～Ｃ４）アルキル、（Ｃ１～Ｃ４）アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、シアノまたは（Ｃ１～Ｃ４）アルキルカルボキシから選択される。
【0016】
また、本発明は、前記化学式２で表される化合物、その水化物またはその塩を含む筋萎縮性側索硬化症の予防または改善用健康機能食品組成物を提供する。
【発明の効果】
【0017】
本発明は、新規な化合物の筋萎縮性側索硬化症の予防、改善または治療用途に関するものであって、本発明者らは、ＡＬＳ疾患においてＳＯＤ１凝集が重要な原因の１つであるという点を明らかにし、ＴＤＰ－４３または細胞内ストレスの調節抑制によるＷＴ－ＳＯＤ１の凝集が、ｓＡＬＳの原因になるという可能性を提示した。また、本発明者らは、ＳＯＤ１凝集及びミスフォールディング抑制剤として、新たな化合物であるＰＲＧ－Ａ－０１（ＳＬＣ－Ｂ０３６）を探し出した。前記化合物は、ＡＬＳモデルマウスで筋肉弱化及び運動障害に対する保護効果を示した。組織学的分析の結果、ＰＲＧ－Ａ－０１（ＳＬＣ－Ｂ０３６）処理によって脊髄内神経が保持された。また、本発明者らは、さらに最適化された薬物可能な候補化合物（ＰＲＧ－Ａ－０４）を得た。結論的に、本発明の化合物は、ＡＬＳ疾患に対する治療剤としての開発に有用に活用されうる。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】突然変異ＳＯＤ１が、ＷＴ（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ；野生型；正常型）－ＳＯＤ１凝集を促進させるという結果を示す図面である。Ａ．突然変異ＳＯＤ１ｓが、ＷＴ－ＳＯＤ１凝集を誘導するという結果を示す。Ｂ．生体外試験（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で突然変異ＳＯＤ１ｓは、ＳＯＤ１凝集を促進させるという結果を示す。Ｃ．ＥＲ－ストレスは、ＷＴ－ＳＯＤ１凝集を誘導するという結果を示す。Ｄ．低酸素条件は、ＳＯＤ１凝集及びミスフォールディングを促進するという結果を示す。
【図3】ミスフォールディングされたＳＯＤ１凝集に対する化合物抑制剤のスクリーニング結果を示す図面である。Ａ．化合物スクリーニングに対する代表グラフを示す。陰性対照群（－；赤色線）は、突然変異ＳＯＤ１なしに反応させ、陽性対照群（＋；青色線）は、化合物なしに突然変異ＳＯＤ１で反応させた。Ｂ．ＰＲＧ－Ａ－０１が、ＳＯＤ１凝集を抑制させるという結果を示す。Ｃ．ＰＲＧ－Ａ－０１は、容量による突然変異ＳＯＤ１凝集遮断効果を示すという結果を示す。
【図4】ミスフォールディングされたＳＯＤ１凝集に対する化合物抑制剤のスクリーニング結果を示す図面である。Ａ．化合物をスクリーニングするＥＬＩＳＡシステムに対する模式図を示す。Ｂ．ＳＯＤ１発現に対する化合物の効果を示す。Ｃ．未変性ゲル分析（ｎａｔｉｖｅ ｇｅｌ ａｎａｌｙｓｉｓ）を用いて、ＳＯＤ１凝集に対する化合物の効果を試験した結果を示す。Ｄ．ＰＲＧ－Ａ－０１の化学構造を示す。Ｅ．ＰＲＧ－Ａ－０１は、細胞毒性がないという結果を示す。
【図5】ＰＲＧ－Ａ－０１が、ＳＯＤ１凝集及びミスフォールディングを遮断するという結果を示す図面である。Ａ．ＴＤＰ－４３過発現によって誘導されたＳＯＤ１凝集が、ＰＲＧ－Ａ－０１処理で抑制される結果を示す。Ｂ．ＴＤＰ－４３過発現を通じて誘導されたＳＯＤ１凝集が、ＰＲＧ－Ａ－０１によって減少する結果を示す。Ｃ．ＰＲＧ－Ａ－０１が、ＳＯＤ１の多量体形成を遮断するという結果を示す。Ｄ．ＰＲＧ－Ａ－０１は、ＳＯＤ１のミスフォールディングの形成を減少させるという結果を示す。Ｅ．ＰＲＧ－Ａ－０１の容量によるミスフォールディングＳＯＤ１抑制効果を示す。Ｆ．ＰＲＧ－Ａ－０１は、突然変異ＳＯＤ１のミスフォールディングを抑制するという結果を示す。
【図6】ＰＲＧ－Ａ－０１が、ＳＯＤ１凝集及びミスフォールディングを遮断するという結果を示す図面である。Ａ．ＴＤＰ－４３過発現は、ＷＴ－ＳＯＤ１凝集を誘導するという結果を示す。Ｂ．突然変異ＳＯＤ１は、ＴＤＰ４３の細胞内分布（ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）に影響を与えるという結果を示す。Ｃ．ＰＲＧ－Ａ－０１は、低酸素ストレスによって誘導されたＳＯＤ１の凝集を遮断するという結果を示す。
【図7】ＡＬＳマウスモデルでＰＲＧ－Ａ－０１の生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）効果を確認した結果である。Ａ．ＰＲＧ－Ａ－０１投与実験に対する模式図を示す。Ｂ．ＡＬＳマウスモデルで握力（ｇｒｉｐ ｓｔｒｅｎｇｔｈ）の測定結果を示す（１２週齢からＰＲＧ－Ａ－０１投与）。Ｃ．ビデオファイル内マウスのスナップショットを示す。Ｄ．ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ－Ｔｇマウス脊髄の組織学的分析の結果を示す。Ｅ．ＰＲＧ－Ａ－０１の作用機転に対する簡単な模式図を示す。
【図8】ＰＲＧ－Ａ－０１の生体内効果を示す図面である。Ａ及びＢ．雄（Ａ）及び雌（Ｂ）ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ－Ｔｇ ＡＬＳモデルマウスで前足の握力の測定結果を示す。Ｃ．行動実験の模式図を示す。Ｄ．ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ－Ｔｇ ＡＬＳモデルマウスのＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存曲線を示す。Ｅ．ＰＲＧ－Ａ－０１の薬物動態学的（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ；ＰＫ）分析の結果を示す。
【図9】ＰＲＧ－Ａ－０１の最適化結果を示す図面である。Ａ及びＢ．ＭＴＴ分析を通じた細胞毒性の測定結果を示す。Ｃ．ＳＯＤ１凝集に対する未変性ゲル分析の結果を示す。Ｄ．ＳＯＤのＩＦ染色結果を示す。Ｅ．ＡＬＳ治療候補化合物であるＰＲＧ－Ａ－０４の化学構造を示す。
【図10】ＰＲＧ－Ａ－０２（Ａ）、ＰＲＧ－Ａ－０３（Ｂ）及びＰＲＧ－Ａ－０４（Ｃ）の薬物動態学的分析の結果を示す図面である。
【図11】ＡＬＳモデルマウスでＰＲＧ－Ａ化合物の効果を示す図面である。Ａ．マウスのスナップショットを示す。Ｂ．ＰＲＧ－Ａ－０４の優れた効果を示す。Ｃ．ＰＲＧ－Ａ－０１、ＰＲＧ－Ａ－０２及びＰＲＧ－Ａ－０３のＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存曲線の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0019】
これにより、本発明者らは、ＳＯＤ１タンパク質の伝播（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）またはＷＴ－ＳＯＤ１と突然変異／ミスフォールディングされたＳＯＤ１との相互作用を遮断することが、ＡＬＳ疾患をターゲットとする治療剤になると判断し、本発明を完成した。
【0020】
本発明は、下記化学式１で表される化合物、その水化物またはその塩を提供する。
【0021】
【化1】
【0022】
前記化学式１において、
が単一結合である時、Ｘは、ＣＨであり、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ異なり、（Ｃ１～Ｃ４）アルコキシ、ヒドロキシまたは（Ｃ１～Ｃ４）アルキルカルボキシから選択され、
【0023】
【0024】
望ましくは、前記化合物は、
が単一結合である時、Ｘは、ＣＨであり、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ異なり、（Ｃ１～Ｃ４）アルコキシ、ヒドロキシまたは（Ｃ１～Ｃ４）アルキルカルボキシから選択され、
が二重結合である時、Ｘは、Ｎであり、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ水素であるが、これらに限定されるものではない。
【0025】
より望ましくは、前記化合物は、（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル３－（４－ヒドロキシ－３－メトキシフェニル）プロパン酸［（Ｓ）－８，８－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２－ｏｘｏ－７，８－ｄｉｈｙｄｒｏ－２Ｈ，６Ｈ－ｐｙｒａｎｏ［３，２－ｇ］ｃｈｒｏｍｅｎ－７－ｙｌ３－（４－ｈｙｄｒｏｘｙ－３－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｒｏｐａｎｏａｔｅ；ＳＮＵ－Ｃ４］、（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル（Ｅ）－３－（ピリジン－４－イル）アクリレート［（Ｓ）－８，８－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２－ｏｘｏ－７，８－ｄｉｈｙｄｒｏ－２Ｈ，６Ｈ－ｐｙｒａｎｏ［３，２－ｇ］ｃｈｒｏｍｅｎ－７－ｙｌ（Ｅ）－３－（ｐｙｒｉｄｉｎ－４－ｙｌ）ａｃｒｙｌａｔｅ；ＳＮＵ－Ｃ９］、（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル３－（４－アセトキシ－３－メトキシフェニル）プロパン酸［（Ｓ）－８，８－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２－ｏｘｏ－７，８－ｄｉｈｙｄｒｏ－２Ｈ，６Ｈ－ｐｙｒａｎｏ［３，２－ｇ］ｃｈｒｏｍｅｎ－７－ｙｌ３－（４－ａｃｅｔｏｘｙ－３－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｒｏｐａｎｏａｔｅ；ＳＮＵ－Ｃ１５］からなる群から選択されうるが、これらに限定されるものではない。
【0026】
また、本発明は、下記化学式２で表される化合物、その水化物またはその塩を含む筋萎縮性側索硬化症の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【0027】
【化2】
【0028】
前記化学式２において、
が、単一結合または二重結合であり、
ｎは、０～１の整数、
Ｘは、ＣＨまたはＮであり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ同一または異なり、水素、（Ｃ１～Ｃ４）アルキル、（Ｃ１～Ｃ４）アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、シアノまたは（Ｃ１～Ｃ４）アルキルカルボキシから選択される。
ｎは、０～１の整数、
Ｘは、ＣＨまたはＮであり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ同一または異なり、水素、（Ｃ１～Ｃ４）アルキル、（Ｃ１～Ｃ４）アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、シアノまたは（Ｃ１～Ｃ４）アルキルカルボキシから選択される。
【0029】
望ましくは、前記化合物は、
が単一結合である時、ｎは、１であり、Ｘは、ＣＨであり、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ同一または異なり、（Ｃ１～Ｃ４）アルコキシ、ヒドロキシまたは（Ｃ１～Ｃ４）アルキルカルボキシから選択されうるが、これらに限定されるものではない。
【0030】
望ましくは、前記化合物は、
が二重結合である時、ｎは、０～１の整数、Ｘは、ＣＨまたはＮであり、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ同一または異なり、水素、（Ｃ１～Ｃ４）アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、ニトロまたは（Ｃ１～Ｃ４）アルキルカルボキシから選択されうるが、これらに限定されるものではない。
【0031】
より望ましくは、前記化合物は、（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル（Ｅ）－３－（４－ヒドロキシ－３－メトキシフェニル）アクリレート［（Ｓ）－８，８－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２－ｏｘｏ－７，８－ｄｉｈｙｄｒｏ－２Ｈ，６Ｈ－ｐｙｒａｎｏ［３，２－ｇ］ｃｈｒｏｍｅｎ－７－ｙｌ（Ｅ）－３－（４－ｈｙｄｒｏｘｙ－３－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ａｃｒｙｌａｔｅ；ＰＲＧ－Ａ－０１；ＳＬＣ－Ｂ０３６］、（Ｓ，Ｅ）－７－（（３－（４－ヒドロキシ－３－メトキシフェニル）アリル）オキシ）－８，８－ジメチル－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－２－オン［（Ｓ，Ｅ）－７－（（３－（４－ｈｙｄｒｏｘｙ－３－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ａｌｌｙｌ）ｏｘｙ）－８，８－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－７，８－ｄｉｈｙｄｒｏ－２Ｈ，６Ｈ－ｐｙｒａｎｏ［３，２－ｇ］ｃｈｒｏｍｅｎ－２－ｏｎｅ；ＰＲＧ－Ａ－０２］、（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル３－（４－ヒドロキシ－３－メトキシフェニル）プロパン酸［（Ｓ）－８，８－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２－ｏｘｏ－７，８－ｄｉｈｙｄｒｏ－２Ｈ，６Ｈ－ｐｙｒａｎｏ［３，２－ｇ］ｃｈｒｏｍｅｎ－７－ｙｌ３－（４－ｈｙｄｒｏｘｙ－３－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｒｏｐａｎｏａｔｅ；ＳＮＵ－Ｃ４］、（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル（Ｅ）－３－（３，４－ジメトキシフェニル）アクリレート［（Ｓ）－８，８－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２－ｏｘｏ－７，８－ｄｉｈｙｄｒｏ－２Ｈ，６Ｈ－ｐｙｒａｎｏ［３，２－ｇ］ｃｈｒｏｍｅｎ－７－ｙｌ（Ｅ）－３－（３，４－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ａｃｒｙｌａｔｅ；ＳＮＵ－Ｃ５］、（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル３－（３，４－ジメトキシフェニル）プロパン酸［（Ｓ）－８，８－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２－ｏｘｏ－７，８－ｄｉｈｙｄｒｏ－２Ｈ，６Ｈ－ｐｙｒａｎｏ［３，２－ｇ］ｃｈｒｏｍｅｎ－７－ｙｌ３－（３，４－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｒｏｐａｎｏａｔｅ；ＳＮＵ－Ｃ７］、（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル（Ｅ）－３－（ピリジン－４－イル）アクリレート［（Ｓ）－８，８－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２－ｏｘｏ－７，８－ｄｉｈｙｄｒｏ－２Ｈ，６Ｈ－ｐｙｒａｎｏ［３，２－ｇ］ｃｈｒｏｍｅｎ－７－ｙｌ（Ｅ）－３－（ｐｙｒｉｄｉｎ－４－ｙｌ）ａｃｒｙｌａｔｅ；ＳＮＵ－Ｃ９］、（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル（Ｅ）－３－（３－ヒドロキシフェニル）アクリレート［（Ｓ）－８，８－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２－ｏｘｏ－７，８－ｄｉｈｙｄｒｏ－２Ｈ，６Ｈ－ｐｙｒａｎｏ［３，２－ｇ］ｃｈｒｏｍｅｎ－７－ｙｌ（Ｅ）－３－（３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ａｃｒｙｌａｔｅ；ＳＮＵ－Ｃ１０］、（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル（Ｅ）－３－（４－フルオロフェニル）アクリレート［（Ｓ）－８，８－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２－ｏｘｏ－７，８－ｄｉｈｙｄｒｏ－２Ｈ，６Ｈ－ｐｙｒａｎｏ［３，２－ｇ］ｃｈｒｏｍｅｎ－７－ｙｌ（Ｅ）－３－（４－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ａｃｒｙｌａｔｅ；ＳＮＵ－Ｃ１１；ＰＲＧ－Ａ－０３］、（Ｓ，Ｅ）－７－（（３－（４－フルオロフェニル）アリル）オキシ）－８，８－ジメチル－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－２－オン［（Ｓ，Ｅ）－７－（（３－（４－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ａｌｌｙｌ）ｏｘｙ）－８，８－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－７，８－ｄｉｈｙｄｒｏ－２Ｈ，６Ｈ－ｐｙｒａｎｏ［３，２－ｇ］ｃｈｒｏｍｅｎ－２－ｏｎｅ；ＳＮＵ－Ｃ１３］、（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル（Ｅ）－３－（３－アセトキシフェニル）アクリレート［（Ｓ）－８，８－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２－ｏｘｏ－７，８－ｄｉｈｙｄｒｏ－２Ｈ，６Ｈ－ｐｙｒａｎｏ［３，２－ｇ］ｃｈｒｏｍｅｎ－７－ｙｌ（Ｅ）－３－（３－ａｃｅｔｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ａｃｒｙｌａｔｅ；ＳＮＵ－Ｃ１４］、（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル３－（４－アセトキシ－３－メトキシフェニル）プロパン酸［（Ｓ）－８，８－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２－ｏｘｏ－７，８－ｄｉｈｙｄｒｏ－２Ｈ，６Ｈ－ｐｙｒａｎｏ［３，２－ｇ］ｃｈｒｏｍｅｎ－７－ｙｌ３－（４－ａｃｅｔｏｘｙ－３－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｒｏｐａｎｏａｔｅ；ＳＮＵ－Ｃ１５］、（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル（Ｅ）－３－（４－アセトキシ－３－メトキシフェニル）アクリレート［（Ｓ）－８，８－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２－ｏｘｏ－７，８－ｄｉｈｙｄｒｏ－２Ｈ，６Ｈ－ｐｙｒａｎｏ［３，２－ｇ］ｃｈｒｏｍｅｎ－７－ｙｌ（Ｅ）－３－（４－ａｃｅｔｏｘｙ－３－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ａｃｒｙｌａｔｅ；ＳＮＵ－Ｃ１７］、（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル（Ｅ）－３－（３，４－ジフルオロフェニル）アクリレート［（Ｓ）－８，８－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２－ｏｘｏ－７，８－ｄｉｈｙｄｒｏ－２Ｈ，６Ｈ－ｐｙｒａｎｏ［３，２－ｇ］ｃｈｒｏｍｅｎ－７－ｙｌ（Ｅ）－３－（３，４－ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ａｃｒｙｌａｔｅ；ＳＮＵ－Ｃ１８］、及び（Ｓ，Ｅ）－７－（（３－（３－メトキシ－４－ニトロフェニル）アリル）オキシ）－８，８－ジメチル－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－２－オン［（Ｓ，Ｅ）－７－（（３－（３－ｍｅｔｈｏｘｙ－４－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）ａｌｌｙｌ）ｏｘｙ）－８，８－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－７，８－ｄｉｈｙｄｒｏ－２Ｈ，６Ｈ－ｐｙｒａｎｏ［３，２－ｇ］ｃｈｒｏｍｅｎ－２－ｏｎｅ；ＰＲＧ－Ａ－０４］からなる群から選択されうるが、これらに限定されるものではない。
【0032】
より望ましくは、前記薬学組成物は、スーパーオキシドジスムターゼ１（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ １；ＳＯＤ１）の凝集及びミスフォールディングを抑制することができる。
【0033】
本発明の薬学組成物は、有効成分の以外に薬剤学的に適し、生理学的に許容される補助剤を使用して製造可能であり、前記補助剤としては、賦形剤、崩壊剤、甘味剤、結合剤、被覆剤、膨張剤、潤滑剤、滑沢剤または香味剤などの可溶化剤を使用することができる。本発明の薬学組成物は、投与のために、有効成分の以外にさらに薬剤学的に許容可能な担体を１種以上含んで薬学組成物として望ましく製剤化することができる。液状溶液で製剤化される組成物において、許容可能な薬剤学的担体としては、滅菌及び生体に適したものであって、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれらの成分のうち、１成分以上を混合して使用し、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤を付加的に添加して、水溶液、懸濁液、乳濁液のような注射用剤型、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤で製剤化することができる。
【0034】
本発明の薬学組成物の薬剤の製剤形態は、顆粒剤、散剤、被覆錠、錠剤、カプセル剤、坐剤、シロップ、汁、懸濁剤、乳剤、点滴剤または注射可能な液剤及び活性化合物の徐放性製剤などになりうる。本発明の薬学組成物は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、胸骨内、経皮、鼻側内、吸入、局所、直腸、経口、眼球内または皮内経路を通じて通常の方式で投与することができる。本発明の薬学組成物の有効成分の有効量は、疾患の予防または治療時に要求される量を意味する。したがって、疾患の種類、疾患の重症度、組成物に含有された有効成分及び他の成分の種類及び含量、剤型の種類及び患者の年齢、体重、一般健康状態、性別及び食餌、投与時間、投与経路及び組成物の分泌率、治療期間、同時使われる薬物を含めた多様な因子によって調節される。これに制限されるものではないが、例えば、大人の場合、１日１回ないし数回投与時に、本発明の組成物は、１日１回ないし数回投与時に、０．０１ｎｇ／ｋｇ～１０ｇ／ｋｇの容量で投与することができる。
【0035】
また、本発明は、下記化学式２で表される化合物、その水化物またはその塩を含む筋萎縮性側索硬化症の予防または改善用健康機能食品組成物を提供する。
【0036】
【化2】
【0037】
前記化学式２において、
が、単一結合または二重結合であり、
ｎは、０～１の整数、
Ｘは、ＣＨまたはＮであり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ同一または異なり、水素、（Ｃ１～Ｃ４）アルキル、（Ｃ１～Ｃ４）アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、シアノまたは（Ｃ１～Ｃ４）アルキルカルボキシから選択される。
ｎは、０～１の整数、
Ｘは、ＣＨまたはＮであり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ同一または異なり、水素、（Ｃ１～Ｃ４）アルキル、（Ｃ１～Ｃ４）アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、シアノまたは（Ｃ１～Ｃ４）アルキルカルボキシから選択される。
【0038】
望ましくは、前記化合物は、
が単一結合である時、ｎは、１であり、Ｘは、ＣＨであり、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ同一または異なり、（Ｃ１～Ｃ４）アルコキシ、ヒドロキシまたは（Ｃ１～Ｃ４）アルキルカルボキシから選択されうるが、これらに限定されるものではない。
【0039】
望ましくは、前記化合物は、
が二重結合である時、ｎは、０～１の整数、Ｘは、ＣＨまたはＮであり、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ同一または異なり、水素、（Ｃ１～Ｃ４）アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、ニトロまたは（Ｃ１～Ｃ４）アルキルカルボキシから選択されうるが、これらに限定されるものではない。
【0040】
より望ましくは、前記化合物は、（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル（Ｅ）－３－（４－ヒドロキシ－３－メトキシフェニル）アクリレート［ＰＲＧ－Ａ－０１；ＳＬＣ－Ｂ０３６］、（Ｓ，Ｅ）－７－（（３－（４－ヒドロキシ－３－メトキシフェニル）アリル）オキシ）－８，８－ジメチル－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－２－オン［ＰＲＧ－Ａ－０２］、（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル３－（４－ヒドロキシ－３－メトキシフェニル）プロパン酸［ＳＮＵ－Ｃ４］、（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル（Ｅ）－３－（３，４－ジメトキシフェニル）アクリレート［ＳＮＵ－Ｃ５］、（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル３－（３，４－ジメトキシフェニル）プロパン酸［ＳＮＵ－Ｃ７］、（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル（Ｅ）－３－（ピリジン－４－イル）アクリレート［ＳＮＵ－Ｃ９］、（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル（Ｅ）－３－（３－ヒドロキシフェニル）アクリレート［ＳＮＵ－Ｃ１０］、（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル（Ｅ）－３－（４－フルオロフェニル）アクリレート［ＳＮＵ－Ｃ１１；ＰＲＧ－Ａ－０３］、（Ｓ，Ｅ）－７－（（３－（４－フルオロフェニル）アリル）オキシ）－８，８－ジメチル－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－２－オン［ＳＮＵ－Ｃ１３］、（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル（Ｅ）－３－（３－アセトキシフェニル）アクリレート［ＳＮＵ－Ｃ１４］、（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル３－（４－アセトキシ－３－メトキシフェニル）プロパン酸［ＳＮＵ－Ｃ１５］、（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル（Ｅ）－３－（４－アセトキシ－３－メトキシフェニル）アクリレート［ＳＮＵ－Ｃ１７］、（Ｓ）－８，８－ジメチル－２－オキソ－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－７－イル（Ｅ）－３－（３，４－ジフルオロフェニル）アクリレート［ＳＮＵ－Ｃ１８］、及び（Ｓ，Ｅ）－７－（（３－（３－メトキシ－４－ニトロフェニル）アリル）オキシ）－８，８－ジメチル－７，８－ジヒドロ－２Ｈ，６Ｈ－ピラノ［３，２－ｇ］クロメン－２－オン［ＰＲＧ－Ａ－０４］からなる群から選択されうるが、これらに限定されるものではない。
【0041】
本発明の健康機能食品組成物は、有機酸、リン酸塩、抗酸化剤、乳糖カゼイン、デキストリン、ブドウ糖、砂糖及びソルビトールからなる群から選択される１つ以上の添加剤をさらに含みうる。有機酸は、これに制限されるものではないが、クエン酸、フマル酸、アジピン酸、乳酸またはリンゴ酸であり、リン酸塩は、これに制限されるものではないが、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、酸性ピロリン酸塩またはポリリン酸塩（重合リン酸塩）であり、抗酸化剤は、これに制限されるものではないが、ポリフェノール、カテキン、α‐トコフェロール、ローズマリー抽出物、甘草抽出物、キトサン、タンニン酸またはフィチン酸などの天然抗酸化剤である。
【0042】
本発明のさらに他の具体例において、前記健康機能食品は、前記有効成分の以外にもさまざまな栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤及び天然風味剤などの風味剤、着色剤及び充填剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使われる炭酸化剤などを含有することができる。また、本発明の一実施例による食品組成物は、天然果汁、果汁飲料及び野菜飲料の製造のための果肉を含有することができる。
【0043】
本発明の一実施例によれば、健康機能食品の剤型は、これに制限されるものではないが、固形、粉末、顆粒、錠剤、カプセル、液相または飲料の形態である。
【0044】
また、前記健康機能食品は、これに制限されるものではないが、お菓子類、糖類、アイスクリーム製品類、乳加工品、食肉製品、魚肉製品、豆腐類またはコンニャク類、食用油脂類、麺類、茶類、飲料類、特殊栄養食品、健康補助食品、調味食品、氷、人参剤品類、キムチ漬け食品、乾布類、フルーツ、野菜、フルーツまたは野菜の乾燥製品、切断製品、果汁、野菜ジュース、これらの混合ジュース、チップ類、麺類、畜産加工食品、水産加工食品、乳加工食品、発酵乳食品、豆類食品、穀類食品、微生物発酵食品、製菓製パン、味付け類、肉加工類、酸性飲料水、甘草類、ハーブ類などの食品の製造に使われる。
【0045】
以下、本発明の理解を助けるために、実施例を挙げて詳細に説明する。但し、下記の実施例は、当業者に本発明をより完全に説明するために提供されるものであり、本発明の内容を例示するものであり、本発明の範囲が、下記の実施例に限定されるものではない。
【0046】
下記の実験例は、本発明によるそれぞれの実施例に共通して適用される実験例を提供するためである。
【0047】
＜実験例＞
【0048】
１．マウス
実験は、大韓民国の釜山大学校で承認した動物政策によって実験室動物管理評価及び認証協会承認施設で行った。Ｂ６ＳＪＬ－Ｔｇ（ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ）マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｓｔｏｃｋ Ｎｏ：００２７２６）から購入した。あらゆるマウスは、温度及び光調節条件下で保持させ（２０～２３℃、明暗周期１２ｈｒ－１２ｈｒ）、滅菌された食べ物及び水を提供した。
実験は、大韓民国の釜山大学校で承認した動物政策によって実験室動物管理評価及び認証協会承認施設で行った。Ｂ６ＳＪＬ－Ｔｇ（ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ）マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｓｔｏｃｋ Ｎｏ：００２７２６）から購入した。あらゆるマウスは、温度及び光調節条件下で保持させ（２０～２３℃、明暗周期１２ｈｒ－１２ｈｒ）、滅菌された食べ物及び水を提供した。
【0049】
２．生体内薬物処理及び組織学的分析
ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスは、１２週齢または１４週齢のマウスにビヒクル（ＤＭＳＯ）、ＳＬＣ－Ｂ０３６（１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ）を６週間毎週２回腹腔注射を通じて投与した。対照群マウスは、同じ条件で処理した。組織学的分析のために、マウスは、１８週に犠牲させた。マウス切開後、基本的な組織加工手続きによって４％パラホルムアルデヒドを使用して脊髄を４８時間固定させ、パラフィンブロックに包埋させた。Ｌｅｉｃａ ｍｉｃｒｏｔｏｍｅで包埋された組織（脊髄の頚椎部位）を５μｍに切断し、接着コーティングスライド（Ｍａｒｉｅｎｆｅｌｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｇｌａｓｓｗａｒｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に移した。脱パラフィン化及び再水和後に、脊髄神経の数を確認するために、スライドをヘマトキシリン及びエオシンで染色させた。
ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスは、１２週齢または１４週齢のマウスにビヒクル（ＤＭＳＯ）、ＳＬＣ－Ｂ０３６（１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ）を６週間毎週２回腹腔注射を通じて投与した。対照群マウスは、同じ条件で処理した。組織学的分析のために、マウスは、１８週に犠牲させた。マウス切開後、基本的な組織加工手続きによって４％パラホルムアルデヒドを使用して脊髄を４８時間固定させ、パラフィンブロックに包埋させた。Ｌｅｉｃａ ｍｉｃｒｏｔｏｍｅで包埋された組織（脊髄の頚椎部位）を５μｍに切断し、接着コーティングスライド（Ｍａｒｉｅｎｆｅｌｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｇｌａｓｓｗａｒｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に移した。脱パラフィン化及び再水和後に、脊髄神経の数を確認するために、スライドをヘマトキシリン及びエオシンで染色させた。
【0050】
３．運動遂行測定
行動実験のために、握力測定器（ｇｒｉｐ ｓｔｒｅｎｇｔｈ ｍｅｔｅｒ）を用いて２週ごとに握力を確認した。マウスは、前足でテンションバー（ｔｅｎｓｉｏｎ ｂａｒ）を握らせた後、バーを放すまでしっぽを徐々に引っ張った。マウスの運動性、呼吸及び四肢麻痺を確認するために、投与終了時点に映像分析を行った（１８～２０週）。
行動実験のために、握力測定器（ｇｒｉｐ ｓｔｒｅｎｇｔｈ ｍｅｔｅｒ）を用いて２週ごとに握力を確認した。マウスは、前足でテンションバー（ｔｅｎｓｉｏｎ ｂａｒ）を握らせた後、バーを放すまでしっぽを徐々に引っ張った。マウスの運動性、呼吸及び四肢麻痺を確認するために、投与終了時点に映像分析を行った（１８～２０週）。
【0051】
４．細胞培養及び試薬
ＨＥＫ２９３細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）から購入し、１０％ウシ胎児血清及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンが含まれたＤＭＥＭ液体培地で３７℃、５％ ＣＯ２で保持させた。ＳＫ－Ｎ－ＳＨ細胞は、Ｋｏｒｅａｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｂａｎｋ（ＫＣＬＢ、Ｓｅｏｕｌ、Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）から購入し、１０％ウシ胎児血清、１％抗生剤、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、３００ｍｇ／Ｌ Ｌ－Ｇｌｕが含まれたＭＥＭ培地で保持させた。ヒト線維芽細胞（９歳女性）は、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ（Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）から購入し、１５％ ＦＢＳ、２ｍＭ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、抗生剤が除外された２６ｍＭ ＨＥＰＥＳが含まれたＥＭＥＭで保持させた。タプシガルギン（Ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）（ＥＲ ｃａｌｃｉｕｍ ｓｃａｖｅｎｇｅｒ：ＣＡＳ ６７５２６－９５－８）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。ＣｏＣｌ２（ｈｙｐｏｘｉａ－ｉｎｄｕｃｅｒ：Ｃ８６６１）は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ、ＵＳＡ）から購入した。
ＨＥＫ２９３細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）から購入し、１０％ウシ胎児血清及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンが含まれたＤＭＥＭ液体培地で３７℃、５％ ＣＯ２で保持させた。ＳＫ－Ｎ－ＳＨ細胞は、Ｋｏｒｅａｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｂａｎｋ（ＫＣＬＢ、Ｓｅｏｕｌ、Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）から購入し、１０％ウシ胎児血清、１％抗生剤、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、３００ｍｇ／Ｌ Ｌ－Ｇｌｕが含まれたＭＥＭ培地で保持させた。ヒト線維芽細胞（９歳女性）は、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ（Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）から購入し、１５％ ＦＢＳ、２ｍＭ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、抗生剤が除外された２６ｍＭ ＨＥＰＥＳが含まれたＥＭＥＭで保持させた。タプシガルギン（Ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）（ＥＲ ｃａｌｃｉｕｍ ｓｃａｖｅｎｇｅｒ：ＣＡＳ ６７５２６－９５－８）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。ＣｏＣｌ２（ｈｙｐｏｘｉａ－ｉｎｄｕｃｅｒ：Ｃ８６６１）は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ、ＵＳＡ）から購入した。
【0052】
５．化合物スクリーニング
化合物スクリーニングのために、本発明者らは、ＥＬＩＳＡ分析システムを適用した。ＷＴ－ＳＯＤ１と突然変異ＳＯＤ１との結合抑制剤を選別するために、本発明者らは、０．５％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ；ＰＦＡ）を使用して、ＷＴ－ＳＯＤ１組換えタンパク質を９６ウェルプレート上に固定させた。プレートを乾燥させ、リン酸緩衝食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）で洗浄した後、最終濃度５０μｍの化合物を反応させた後、突然変異ＳＯＤ１－ＧＳＴ（Ａ４Ｖ、Ｇ３７Ｒ、Ｇ８５Ｒ、Ｇ９３Ａ）タンパク質を添加した。２時間反応後、９６ウェルプレートをＰＢＳで洗浄し、非特異的反応（ｎｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎ）の防止のために、３％スキムミルクで遮断させた。プレートは、ａｎｔｉ－ＧＳＴ ａｎｔｉｂｏｄｙ（１：１０，０００で希釈）で１時間反応させた後、ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ－ＨＲＰ（１：５０，０００で希釈）で１時間反応させた。２回洗浄した後、プレートは、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ；ＴＭＢ）溶液（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）で３０分間、停止液（１Ｎ Ｈ２ＳＯ４）で３０分間反応させた。最終的に、本発明者らは、ＥＬＩＳＡ ｒｅａｄｅｒ（４５０ｎｍの吸光度）を使用して数値を分析した。陰性対照群（－；赤色線）は、突然変異ＳＯＤ１なしに反応させ、陽性対照群（＋；青色線）は、化合物なしに突然変異ＳＯＤ１で反応させた。
化合物スクリーニングのために、本発明者らは、ＥＬＩＳＡ分析システムを適用した。ＷＴ－ＳＯＤ１と突然変異ＳＯＤ１との結合抑制剤を選別するために、本発明者らは、０．５％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ；ＰＦＡ）を使用して、ＷＴ－ＳＯＤ１組換えタンパク質を９６ウェルプレート上に固定させた。プレートを乾燥させ、リン酸緩衝食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）で洗浄した後、最終濃度５０μｍの化合物を反応させた後、突然変異ＳＯＤ１－ＧＳＴ（Ａ４Ｖ、Ｇ３７Ｒ、Ｇ８５Ｒ、Ｇ９３Ａ）タンパク質を添加した。２時間反応後、９６ウェルプレートをＰＢＳで洗浄し、非特異的反応（ｎｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎ）の防止のために、３％スキムミルクで遮断させた。プレートは、ａｎｔｉ－ＧＳＴ ａｎｔｉｂｏｄｙ（１：１０，０００で希釈）で１時間反応させた後、ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ－ＨＲＰ（１：５０，０００で希釈）で１時間反応させた。２回洗浄した後、プレートは、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ；ＴＭＢ）溶液（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）で３０分間、停止液（１Ｎ Ｈ２ＳＯ４）で３０分間反応させた。最終的に、本発明者らは、ＥＬＩＳＡ ｒｅａｄｅｒ（４５０ｎｍの吸光度）を使用して数値を分析した。陰性対照群（－；赤色線）は、突然変異ＳＯＤ１なしに反応させ、陽性対照群（＋；青色線）は、化合物なしに突然変異ＳＯＤ１で反応させた。
【0053】
６．組換えタンパク質
組換えタンパク質を製造するために、ｐＧＥＸ－４Ｔ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＴＥＶプロテアーゼ切断サイトを追加して作った改良ベクターである、ｐＧＥＸ－ＴＥＶ ｖｅｃｔｏｒのＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩサイトにヒトＳＯＤ１（ＷＴ、Ａ４Ｖ、Ｇ３７Ｒ、Ｇ８５Ｒ、Ｇ９３Ａ）を結合させた。組換えタンパク質は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ；Ｅ．ｃｏｌｉ）ｓｔｒａｉｎ ＢＬ２１（ＤＥ３）でＧＳＴ－融合タンパク質で発現させた。前記タンパク質は、グルタチオン－親和クロマトグラフィーで精製した。
組換えタンパク質を製造するために、ｐＧＥＸ－４Ｔ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＴＥＶプロテアーゼ切断サイトを追加して作った改良ベクターである、ｐＧＥＸ－ＴＥＶ ｖｅｃｔｏｒのＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩサイトにヒトＳＯＤ１（ＷＴ、Ａ４Ｖ、Ｇ３７Ｒ、Ｇ８５Ｒ、Ｇ９３Ａ）を結合させた。組換えタンパク質は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ；Ｅ．ｃｏｌｉ）ｓｔｒａｉｎ ＢＬ２１（ＤＥ３）でＧＳＴ－融合タンパク質で発現させた。前記タンパク質は、グルタチオン－親和クロマトグラフィーで精製した。
【0054】
７．ウェスタンブロット分析
ＳＤＳ－ＰＡＧＥのために、ＲＩＰＡ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ－４０、０．１％ ＳＤＳ及び１０％ ｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）と、Ｎａｔｉｖｅ－ＰＡＧＥのために、ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．３％ ＮＰ－４０）を使用して細胞からタンパク質を抽出した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥまたはＮａｔｉｖｅ－ＰＡＧＥによってサンプルを分離し、ＰＶＤＦメンブレンに移した。ブロットされたメンブレンは、３％スキムミルクが含まれたＴＢＳＴ ｂｕｆｆｅｒで１時間遮断させ、特定抗体と反応させた。反応した抗体は、ＥＣＬ及びＸ－ｒａｙフィルム露出によって検出した。本発明に使われた抗体は、次の通りである：ｐａｎ－ＳＯＤ１（ＧＴＸ１００５５４）は、Ｇｅｎｅｔｅｘ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）から購入した。ミスフォールディングされたＳＯＤ１特異抗体（Ｂ８Ｈ１０）は、ＭｅｄｉＭａｂｓ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｃａｎａｄａ）から購入した。Ａｃｔｉｎ（ｓｃ－１６１６）、ＧＳＴ（ｓｃ－１３８）、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；ｓｃ－８０３６）は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入した。ＴＤＰ－４３ ａｎｔｉｂｏｄｙ（１０７８２－２－ＡＰ）は、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ（Ｒｏｓｅｍｏｎｔ、ＩＬ、ＵＳＡ）から購入した。Ａｎｔｉ－ＦＬＡＧ（Ｓｉｇｍａ；Ｆ３１６５）は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ、ＵＳＡ）から購入し、ＨＲＰ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ、ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ及びｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ｇｏａｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）は、２次抗体として使われた。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥのために、ＲＩＰＡ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ－４０、０．１％ ＳＤＳ及び１０％ ｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）と、Ｎａｔｉｖｅ－ＰＡＧＥのために、ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．３％ ＮＰ－４０）を使用して細胞からタンパク質を抽出した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥまたはＮａｔｉｖｅ－ＰＡＧＥによってサンプルを分離し、ＰＶＤＦメンブレンに移した。ブロットされたメンブレンは、３％スキムミルクが含まれたＴＢＳＴ ｂｕｆｆｅｒで１時間遮断させ、特定抗体と反応させた。反応した抗体は、ＥＣＬ及びＸ－ｒａｙフィルム露出によって検出した。本発明に使われた抗体は、次の通りである：ｐａｎ－ＳＯＤ１（ＧＴＸ１００５５４）は、Ｇｅｎｅｔｅｘ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）から購入した。ミスフォールディングされたＳＯＤ１特異抗体（Ｂ８Ｈ１０）は、ＭｅｄｉＭａｂｓ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｃａｎａｄａ）から購入した。Ａｃｔｉｎ（ｓｃ－１６１６）、ＧＳＴ（ｓｃ－１３８）、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；ｓｃ－８０３６）は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入した。ＴＤＰ－４３ ａｎｔｉｂｏｄｙ（１０７８２－２－ＡＰ）は、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ（Ｒｏｓｅｍｏｎｔ、ＩＬ、ＵＳＡ）から購入した。Ａｎｔｉ－ＦＬＡＧ（Ｓｉｇｍａ；Ｆ３１６５）は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ、ＵＳＡ）から購入し、ＨＲＰ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ、ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ及びｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ｇｏａｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）は、２次抗体として使われた。
【0055】
８．ドットブロット分析
ミスフォールディングされたＳＯＤ１発現を検出するために、ＳＯＤ１ベクターで形質注入された細胞を化合物で２４時間処理した。反応後、細胞を界面活性剤無溶解緩衝液で溶解させた後、Ｂｉｏ－Ｄｏｔ ＳＦ Ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ａｐｐａｒａｔｕｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて細胞融解物をニトロセルロースメンブレン上に固定させた。ペプチド反応の場合、ＳＯＤ１組換えタンパク質を化合物で１時間反応させた後、サンプルをメンブレン上にローディングした。各メンブレンは、ＴＢＳで洗浄し、非特異的反応の防止のために、３％スキムミルクで遮断させた。遮断後、メンブレンは、ミスフォールディングされたＳＯＤ１またはＡｃｔｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ（１％スキムミルクを含むＴＢＳＴ内１：８，０００）で３０分間反応させ、以後、２次抗体（ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ－ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、１％スキムミルク遮断緩衝液内１：５０，０００）で３０分間反応させた。タンパク質に反応した抗体は、ＥＣＬ及びＸ－ｒａｙフィルム露出によって検出した。Ａｃｔｉｎは、ローディング対照群として使われた。
ミスフォールディングされたＳＯＤ１発現を検出するために、ＳＯＤ１ベクターで形質注入された細胞を化合物で２４時間処理した。反応後、細胞を界面活性剤無溶解緩衝液で溶解させた後、Ｂｉｏ－Ｄｏｔ ＳＦ Ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ａｐｐａｒａｔｕｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて細胞融解物をニトロセルロースメンブレン上に固定させた。ペプチド反応の場合、ＳＯＤ１組換えタンパク質を化合物で１時間反応させた後、サンプルをメンブレン上にローディングした。各メンブレンは、ＴＢＳで洗浄し、非特異的反応の防止のために、３％スキムミルクで遮断させた。遮断後、メンブレンは、ミスフォールディングされたＳＯＤ１またはＡｃｔｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ（１％スキムミルクを含むＴＢＳＴ内１：８，０００）で３０分間反応させ、以後、２次抗体（ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ－ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、１％スキムミルク遮断緩衝液内１：５０，０００）で３０分間反応させた。タンパク質に反応した抗体は、ＥＣＬ及びＸ－ｒａｙフィルム露出によって検出した。Ａｃｔｉｎは、ローディング対照群として使われた。
【0056】
９．免疫蛍光染色
カバースリップ状細胞は、ＰＢＳで洗浄し、４％ ＰＦＡで３０分間常温で固定させた後、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００／ＰＢＳで１０分間浸透させた。細胞を遮断溶液（ＰＢＳ内ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ １：５００希釈）で１時間処理した後、細胞をａｎｔｉ－ｐａｎ ＳＯＤ１（１：４００希釈）、ミスフォールディングされたＳＯＤ１（Ｂ８Ｈ１０；遮断溶液内１：２００希釈）で一晩中４℃で反応させた。最終的に、細胞をＦＩＴＣ及びローダミン結合２次抗体で４℃で６時間反応させた。核は、４，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（４，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ；ＤＡＰＩ）で染色し、小胞体（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ；ＥＲ）は、ＥＲ－Ｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ｄｙｅを使用して１０分間染色した。細胞は、ＰＢＳで３回洗浄し、以後、カバースリップをマウンティング溶液［Ｈ－５５０１；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）］でマウンティングし、蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）で分析した。
カバースリップ状細胞は、ＰＢＳで洗浄し、４％ ＰＦＡで３０分間常温で固定させた後、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００／ＰＢＳで１０分間浸透させた。細胞を遮断溶液（ＰＢＳ内ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ １：５００希釈）で１時間処理した後、細胞をａｎｔｉ－ｐａｎ ＳＯＤ１（１：４００希釈）、ミスフォールディングされたＳＯＤ１（Ｂ８Ｈ１０；遮断溶液内１：２００希釈）で一晩中４℃で反応させた。最終的に、細胞をＦＩＴＣ及びローダミン結合２次抗体で４℃で６時間反応させた。核は、４，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（４，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ；ＤＡＰＩ）で染色し、小胞体（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ；ＥＲ）は、ＥＲ－Ｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ｄｙｅを使用して１０分間染色した。細胞は、ＰＢＳで３回洗浄し、以後、カバースリップをマウンティング溶液［Ｈ－５５０１；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）］でマウンティングし、蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）で分析した。
【0057】
１０．ベクターの形質注入
ＧＦＰ－ＳＯＤ１（ＷＴ、Ｇ８５Ｒ、Ｇ９３Ａ）、ｎｏｎ－ｔａｇｇｅｄ ＳＯＤ１（ＷＴ、Ａ４Ｖ、Ｇ３７Ｒ、Ｇ８５Ｒ、Ｇ９３Ａ）、ｔｄＴｏｍａｔｏ－ＴＤＰ４３発現ベクターは、Ａｄｄｇｅｎｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）から購入した。形質注入は、Ｊｅｔ－ＰＥＩ ｒｅａｇｅｎｔ（ＪｅｔＰＥＩ；Ｐｏｌｙｐｌｕｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ＵＳＡ）を使用して製造者のプロトコルによって行った。簡単に説明すれば、ベクターは、１５０ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液内ＪｅｔＰＥＩ ｒｅａｇｅｎｔで混合した後、混合物を１５分間反応させた。混合物を無血清培地内細胞に添加して４時間反応させた。反応後、細胞を１０％ ＦＢＳが添加された培養培地に取り替えた。
ＧＦＰ－ＳＯＤ１（ＷＴ、Ｇ８５Ｒ、Ｇ９３Ａ）、ｎｏｎ－ｔａｇｇｅｄ ＳＯＤ１（ＷＴ、Ａ４Ｖ、Ｇ３７Ｒ、Ｇ８５Ｒ、Ｇ９３Ａ）、ｔｄＴｏｍａｔｏ－ＴＤＰ４３発現ベクターは、Ａｄｄｇｅｎｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）から購入した。形質注入は、Ｊｅｔ－ＰＥＩ ｒｅａｇｅｎｔ（ＪｅｔＰＥＩ；Ｐｏｌｙｐｌｕｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ＵＳＡ）を使用して製造者のプロトコルによって行った。簡単に説明すれば、ベクターは、１５０ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液内ＪｅｔＰＥＩ ｒｅａｇｅｎｔで混合した後、混合物を１５分間反応させた。混合物を無血清培地内細胞に添加して４時間反応させた。反応後、細胞を１０％ ＦＢＳが添加された培養培地に取り替えた。
【0058】
１１．細胞生存率の測定
細胞生存率を確認するために、細胞を０．５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（４７５９８９；Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）溶液で３７℃で４時間反応させた。残余溶液を除去し、ＰＢＳで洗浄した後、沈殿物を２００μｌ ＤＭＳＯに溶かし、５４０ｎｍで吸光度を測定して定量化した。
細胞生存率を確認するために、細胞を０．５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（４７５９８９；Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）溶液で３７℃で４時間反応させた。残余溶液を除去し、ＰＢＳで洗浄した後、沈殿物を２００μｌ ＤＭＳＯに溶かし、５４０ｎｍで吸光度を測定して定量化した。
【0059】
＜実施例＞
本発明者らは、ＧＦＰ－ＷＴ－ＳＯＤ１が発現された細胞内に突然変異ＳＯＤ１を形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させた。細胞質内ＷＴ－ＳＯＤ１は、突然変異タイプに関係なく突然変異ＳＯＤ１によって凝集された（図１のＡ及び図２）。また、ＷＴ－ＳＯＤ１タンパク質と突然変異組換えＳＯＤ１タンパク質との相互作用をＮａｔｉｖｅ－ＰＡＧＥを通じて確認した結果、突然変異ＳＯＤ１の処理によってＷＴ－ＳＯＤ１が凝集されると表われた（図１のＢ；Ｇ９３Ａ－反応は、過度に大きな凝集によってゲル内に移動していない）。次いで、本発明者らは、細胞ストレスによるＷＴ－ＳＯＤ１の凝集を確認した。ＡＬＳは、運動ニューロンに特異的な疾患であり、Ｃａ２＋は、ニューロン機能だけではなく、筋肉収縮においても重要なので、本発明者らは、ＳＯＤ１凝集に対するＴｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ（ＥＲカルシウム除去剤）の効果を試験した。Ｔｈａｐｓｉｇａｒｉｇｉｎの処理は、確実に突然変異ＳＯＤ１ｓだけではなく、ＷＴ－ＳＯＤ１の凝集も促進させた（図１のＣ）。また、本発明者らは、ＣｏＣｌ２（低酸素－誘導剤）によるＳＯＤ１の凝集及びミスフォールディングされたＳＯＤ１の増加を確認した（図１のＤ；ＣｏＣｌ２－処理細胞では、赤色信号が増加した）。一方、ＳＯＤ１は、酵素活性のために、Ｃｕ／Ｚｎイオンを使用することでも知られている。これにより、本発明者らは、ＳＯＤ１凝集においてＣｕ／Ｚｎイオンが欠乏した条件がＳＯＤ１凝集に及ぼす効果を確認した。図２で示すように、ＴＰＥＮ（Ｚｎ２＋ｃｈｅｌａｔｏｒ）及びＡＴＮ－２２４（Ｃｕ２＋ｃｈｅｌａｔｏｒ）は、ＷＴ－ＳＯＤ１の凝集を誘導した。前記結果は、ＳＯＤ１が遺伝的突然変異なしに細胞ストレス条件によって凝集されるか、ミスフォールディングされた形態に転換され、また、ＳＯＤ１のミスフォールディングが孤発性ＡＬＳの原因になりうるということを裏付ける。
本発明者らは、ＧＦＰ－ＷＴ－ＳＯＤ１が発現された細胞内に突然変異ＳＯＤ１を形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させた。細胞質内ＷＴ－ＳＯＤ１は、突然変異タイプに関係なく突然変異ＳＯＤ１によって凝集された（図１のＡ及び図２）。また、ＷＴ－ＳＯＤ１タンパク質と突然変異組換えＳＯＤ１タンパク質との相互作用をＮａｔｉｖｅ－ＰＡＧＥを通じて確認した結果、突然変異ＳＯＤ１の処理によってＷＴ－ＳＯＤ１が凝集されると表われた（図１のＢ；Ｇ９３Ａ－反応は、過度に大きな凝集によってゲル内に移動していない）。次いで、本発明者らは、細胞ストレスによるＷＴ－ＳＯＤ１の凝集を確認した。ＡＬＳは、運動ニューロンに特異的な疾患であり、Ｃａ２＋は、ニューロン機能だけではなく、筋肉収縮においても重要なので、本発明者らは、ＳＯＤ１凝集に対するＴｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ（ＥＲカルシウム除去剤）の効果を試験した。Ｔｈａｐｓｉｇａｒｉｇｉｎの処理は、確実に突然変異ＳＯＤ１ｓだけではなく、ＷＴ－ＳＯＤ１の凝集も促進させた（図１のＣ）。また、本発明者らは、ＣｏＣｌ２（低酸素－誘導剤）によるＳＯＤ１の凝集及びミスフォールディングされたＳＯＤ１の増加を確認した（図１のＤ；ＣｏＣｌ２－処理細胞では、赤色信号が増加した）。一方、ＳＯＤ１は、酵素活性のために、Ｃｕ／Ｚｎイオンを使用することでも知られている。これにより、本発明者らは、ＳＯＤ１凝集においてＣｕ／Ｚｎイオンが欠乏した条件がＳＯＤ１凝集に及ぼす効果を確認した。図２で示すように、ＴＰＥＮ（Ｚｎ２＋ｃｈｅｌａｔｏｒ）及びＡＴＮ－２２４（Ｃｕ２＋ｃｈｅｌａｔｏｒ）は、ＷＴ－ＳＯＤ１の凝集を誘導した。前記結果は、ＳＯＤ１が遺伝的突然変異なしに細胞ストレス条件によって凝集されるか、ミスフォールディングされた形態に転換され、また、ＳＯＤ１のミスフォールディングが孤発性ＡＬＳの原因になりうるということを裏付ける。
【0060】
もし、ＳＯＤ１凝集がＡＬＳ疾患の原因であれば、ＳＯＤ１凝集遮断は、薬物開発において可能性がある戦略の１つである。実に、ミスフォールディングされたＳＯＤ１に対する中和抗体は、ＳＯＤ１動物モデルで優れた効果を示した。それを証明するために、本発明者らは、ＥＬＩＳＡに基づいた化合物スクリーニングシステムを構築した。本発明者らは、ミスフォールディングされたＳＯＤ１とＷＴ－ＳＯＤ１との結合に対する選択的結合抑制剤を探し出すために、ＥＬＩＳＡプレートにＷＴ－ＳＯＤ１を固定させ、ＧＳＴタギングになった突然変異ＳＯＤ１ｓ（Ａ４Ｖ、Ｇ３７Ｒ、Ｇ８５Ｒ、Ｇ９３Ａ）と反応させた（図４のＡ）。以前に本発明者らは、類似したスクリーニングを行い、化合物ライブラリーを確保した。前記化合物ライブラリーを使用して、本発明者らは、各化合物の抑制効果を測定した（図３のＡ）。ＳＯＤ１は、二量体形成後、スーパーオキシドを除去するので、本発明者らは、過度に強い結合抑制剤（ＳＬＣ－Ｂ０３５など）は除去し、突然変異に特異的な化合物（ＳＬＣ－Ｂ０４０またはＢ０３６など）を選択した（図３のＡ）。前記化合物は、ＳＯＤ１発現には影響を及ぼしていない（図４のＢ）。次いで、本発明者らは、未変性ゲル分析を通じて、選択された化合物のＳＯＤ１凝集に対する効果を確認し（図４のＣ）、最初のヒット化合物としてＳＬＣ－Ｂ０３６を選択した（図４のＤ）。実際に、前記化合物は、容量依存的方式で突然変異ＳＯＤ１の凝集を遮断することができた（図３のＢ及び図３のＣ）。その上に、前記化合物は、正常ヒト線維芽細胞で細胞毒性効果を示していない（図４のＥ）。以後、ＳＬＣ－Ｂ０３６は、ＰＲＧ－Ａ－０１と再名付けた。
【0061】
次いで、本発明者らは、ＷＴ－ＳＯＤ１の凝集に対する化合物の効果を確認した。最近、ＴＤＰ－４３の過発現または欠乏が、ＳＯＤ１ミスフォールディングを誘導することができると報告されている。本発明者らも、免疫蛍光法分析を通じてＴＤＰ－４３過発現によるＷＴ－ＳＯＤ１の凝集を確認することができた（図５のＡ及び図６のＡ）。また、ＳＯＤ１突然変異は、細胞質（Ｆ２ ｆｒａｃｔｉｏｎ）及び不溶性（Ｆ４ ｆｒａｃｔｉｏｎ）ＴＤＰ４３タンパク質を増加させたが、これは、ＴＤＰ－４３とＳＯＤ１とがＡＬＳの発病と関連しているということを意味する（図６のＢ）。ＰＲＧ－Ａ－０１の処理は、ＴＤＰ－４３だけではなく、ＳＯＤ１の凝集を減少させることができた（図５のＡ）。また、未変性ゲル分析の結果から、ＰＲＧ－Ａ－０１の処理によるＳＯＤ１及びＴＤＰ４３凝集の減少を確認した（図５のＢ）。グルタルアルデヒドを使用した交差結合実験（ｃｒｏｏｓｓ－ｌｉｎｋｉｎｇ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）の結果、ＰＲＧ－Ａ－０１の抑制効果は、さらに明らかに表われた。交差結合を通じて形成されたＳＯＤ１及びＴＤＰ－４３の多量体サイズに該当するバンドは、ＰＲＧ－Ａ－０１処理によって弱くなった（図５のＣ）。ＰＲＧ－Ａ－０１が、ＳＯＤ１のミスフォールディングの形成を遮断できるか否かを調べるために、本発明者らは、ドットブロット分析を行った。ＷＴ－または突然変異ＳＯＤ１で形質注入された細胞融解物を吸入器に移してミスフォールディングＳＯＤ１に特異的な抗体と反応させた。化合物が処理された細胞で、バンド強度は、明らかに減少した（図５のＤ）。また、本発明者らは、Ｇ９３Ａ形質注入された細胞融解物で、ＰＲＧ－Ａ－０１処理によってミスフォールディングされたＳＯＤ１の容量依存的減少を確認することができた（図５のＥ）。ＰＲＧ－Ａ－０１とＳＯＤ１－Ｇ９３Ａとを反応すれば、ミスフォールディングに特異的な抗体が突然変異ＳＯＤ１を認知することができなかったが（図５のＦ）、これは、ＰＲＧ－Ａ－０１がタンパク質構造を変えてミスフォールディングされたＳＯＤ１をＷＴ－ＳＯＤ１形態に正すことができるということを示唆する。また、本発明者らは、低酸素ストレスがＳＯＤ１ミスフォールディングを誘導することができるということを明らかにしたので、低酸素条件でＰＲＧ－Ａ－０１の効果を確認した。ＣｏＣｌ２で誘導されたミスフォールディングＳＯＤ１の信号伝達は、ＰＲＧ－Ａ－０１処理によって減少したが（図６のＣ）、これは、ＰＲＧ－Ａ－０１がＳＯＤ１ミスフォールディングによる病気の誘発を抑制するということを示す。
【0062】
化合物の生体内効果を確認するために、本発明者らは、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ－ＴｇマウスモデルにＰＲＧ－Ａ－０１をｉ．ｐで週２回投与した（図７のＡ）。ＰＲＧ－Ａ－０１の処理は、筋肉強度の減少を遅らせることができた。野生型マウスと比較して、ＰＲＧ－Ａ－０１の処理されたマウスは、約７０％の筋肉強度を保持した（図７のＢ）。逆に、ビヒクル処理されたマウスは、４０％以下の筋肉強度を示した（図７のＢ）。また、ＰＲＧ－Ａ－０１の遅い処理（１４週齢に開始）にも拘らず、筋肉機能に優れた効果を示した（図８のＡ及び図８のＢ）。しかも、ＰＲＧ－Ａ－０１は、容量依存的効果を示したが、１０ｍｇ／ｋｇ投与よりも２０ｍｇ／ｋｇ投与がさらに効果的であった（図８のＡ及び図８のＢ）。行動観測は、非常に印象的な結果を示したが、１４週齢投与にも拘らず（表現型は、１４週齢に開始）、ＰＲＧ－Ａ－０１処理されたマウスは、１７週齢でも依然として運動能力を有していた（図７のＣ及び図８のＣ）。前記効果は、性別と無関係に観測することができた。逆に、ビヒクル処理されたマウスは、立ち上がることができず、自己呼吸に問題を示した。組織学的分析の結果、頚椎の脊髄神経生存率は、ＰＲＧ－Ａ－０１処理されたマウスに高かった（図７のＤ）。逆に、ビヒクル処理されたマウス脊髄では、ほとんどの神経が消えた（図７のＤ）。但し、ＰＲＧ－Ａ－０１は、寿命を単に１０日延長させた（図８のＤ）。これと関連して、本発明者らは、生体内システムにおいてＰＲＧ－Ａ－０１の半減期が非常に短いと予測している。実際に、ＰＲＧ－Ａ－０１は、身体内で３０分内に迅速に消えたが、血液内で過度に迅速に消えて薬物動態学（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ；ＰＫ）データが得られなかった（図８のＥ）。
【0063】
速い分解を克服するために、本発明者らは、ＰＲＧ－Ａ－０１関連誘導体を製作し、これらの化合物の効果を確認した（表１）。新たに合成された化合物のうちから、ＰＲＧ－Ａ－０２、ＰＲＧ－Ａ－０３及びＰＲＧ－Ａ－０４は、ＰＲＧ－Ａ－０１と類似しているか、さらに優れた効果を示した。実際に、前記化合物は、神経（図９のＡ）及び正常線維芽細胞（図９のＢ）で細胞毒性は表わさながった。また、本発明者らは、ｎｏｎ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｇｅｌ（図９のＣ）及びＩＦ分析（図９のＤ）を通じてＳＯＤ１凝集に対する前記化合物の効果を確認した。本発明の細胞基盤分析及び試験管内分析によって、３個の化合物（ＰＲＧ－Ａ－０２、ＰＲＧ－Ａ－０３及びＰＲＧ－Ａ－０４）を選択し、ＰＫを分析した。ただＰＲＧ－Ａ－０４のみが適切なＰＫプロファイルを示したので（図１０）、本発明者らは、ＡＬＳ治療候補化合物としてＰＲＧ－Ａ－０４を選択した。
【0064】
生体内分析で、本発明者らは、ＰＲＧ－Ａ－０４処理群だけではなく、ＰＲＧ－Ａ－０２及びＰＲＧ－Ａ－０３投与群から優れた効果を確認することができた（図１１のＡ及び図１１のＢ）。より面白い結果は、ＡＬＳモデルマウスの寿命がＰＫプロファイルによって増えたという点である（図１１のＣ及び図１１のＤ）。たとえ本発明者らは、ＰＲＧ－Ａ－０４の寿命データが得られなかったとしても、他の化合物に比べて明らかに寿命が延長されるということを予測することができる。
【0065】
【表1】
【0066】
本発明で使用した化合物の化学構造及びＮＭＲデータは、次の通りである。
【0067】
（Ｓ，Ｅ）－７－（（３－（４－ｈｙｄｒｏｘｙ－３－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ａｌｌｙｌ）ｏｘｙ）－８，８－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－７，８－ｄｉｈｙｄｒｏ－２Ｈ，６Ｈ－ｐｙｒａｎｏ［３，２－ｇ］ｃｈｒｏｍｅｎ－２－ｏｎｅ（ＰＲＧ－Ａ－０２）
【0068】
【0069】
１Ｈ ＮＭＲ：ＥＷ１５７３１－１６４－Ｐ１Ｄ４（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）
δ７．５８（ｄ、Ｊ＝１２Ｈｚ、１Ｈ）、７．１６（ｓ、１Ｈ）、６．９０－６．８６（ｍ、３Ｈ）、６．７８（ｓ、１Ｈ）、６．５１（ｄ、Ｊ＝１６Ｈｚ、１Ｈ）、６．２２（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）、６．１４－６．１０（ｍ、１Ｈ）、５．６５（ｓ、１Ｈ）、４．３２－４．３０（ｍ、１Ｈ）、４．２２－４．２０（ｍ、１Ｈ）、３．９１（ｓ、３Ｈ）、３．６１－３．５８（ｍ、１Ｈ）、３．１１－３．０５（ｍ、１Ｈ）、３．８９－３．８７（ｍ、１Ｈ）、１．４３（ｓ、３Ｈ）、１．３６（ｓ、３Ｈ）。
δ７．５８（ｄ、Ｊ＝１２Ｈｚ、１Ｈ）、７．１６（ｓ、１Ｈ）、６．９０－６．８６（ｍ、３Ｈ）、６．７８（ｓ、１Ｈ）、６．５１（ｄ、Ｊ＝１６Ｈｚ、１Ｈ）、６．２２（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）、６．１４－６．１０（ｍ、１Ｈ）、５．６５（ｓ、１Ｈ）、４．３２－４．３０（ｍ、１Ｈ）、４．２２－４．２０（ｍ、１Ｈ）、３．９１（ｓ、３Ｈ）、３．６１－３．５８（ｍ、１Ｈ）、３．１１－３．０５（ｍ、１Ｈ）、３．８９－３．８７（ｍ、１Ｈ）、１．４３（ｓ、３Ｈ）、１．３６（ｓ、３Ｈ）。
【0070】
（Ｓ）－８，８－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２－ｏｘｏ－７，８－ｄｉｈｙｄｒｏ－２Ｈ，６Ｈ－ｐｙｒａｎｏ［３，２－ｇ］ｃｈｒｏｍｅｎ－７－ｙｌ３－（４－ｈｙｄｒｏｘｙ－３－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｒｏｐａｎｏａｔｅ（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ ４；ＳＮＵ－Ｃ４）
【0071】
【0072】
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ ｐｐｍ ７．５９（ｄ、１Ｈ）、７．０６（ｓ、１Ｈ）、６．８２－６．７３（ｍ、２Ｈ）、６．６４－６．５７（ｍ、２Ｈ）、６．２４（ｄ、Ｊ＝９．５Ｈｚ、１Ｈ）、５．４４（ｂｒ．ｓ、１Ｈ）、５．０１（ｔ、Ｊ＝４．６Ｈｚ、１Ｈ）、３．７９（ｓ、３Ｈ）、３．０９（ｄｄｄ、Ｊ＝１７．２、４．７、１．２Ｈｚ、１Ｈ）、２．８５（ａｐｐ．ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、２Ｈ）、２．７０－２．５９（ｍ、３Ｈ）、１．３１（ｓ、３Ｈ）、１．２９（ｓ、３Ｈ）。
ＨＲＭＳ：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２４Ｈ２５Ｏ７＋［Ｍ＋Ｈ］＋４２５．１５９５、ｆｏｕｎｄ ２８６．１６５２。
ＨＲＭＳ：Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２４Ｈ２５Ｏ７＋［Ｍ＋Ｈ］＋４２５．１５９５、ｆｏｕｎｄ ２８６．１６５２。
【0073】
（Ｓ）－８，８－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２－ｏｘｏ－７，８－ｄｉｈｙｄｒｏ－２Ｈ，６Ｈ－ｐｙｒａｎｏ［３，２－ｇ］ｃｈｒｏｍｅｎ－７－ｙｌ（Ｅ）－３－（３，４－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ａｃｒｙｌａｔｅ（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ ５；ＳＮＵ－Ｃ５）
【0074】
【0075】
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ ｐｐｍ ７．６７－７．５５（ｍ、２Ｈ）、７．１８（ｓ、１Ｈ）、７．０８（ｄ、Ｊ＝８．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．０２（ｓ、１Ｈ）、６．８８－６．８１（ｍ、２Ｈ）、６．２８（ｄ、Ｊ＝１６．０Ｈｚ、１Ｈ）、６．２４（ｄ、Ｊ＝９．４Ｈｚ、１Ｈ）、５．２０（ａｐｐ．ｔ、Ｊ＝４．６Ｈｚ、１Ｈ）、３．９１（ｓ、３Ｈ）、３．８９（ｓ、３Ｈ）、３．２５（ｄｄ、Ｊ＝１７．３、４．８Ｈｚ、１Ｈ）、２．９４（ｄｄ、Ｊ＝１７．３、４．５Ｈｚ、１Ｈ）、１．４５（ｓ、３Ｈ）、１．３９（ｓ、３Ｈ）。
【0076】
（Ｓ）－８，８－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２－ｏｘｏ－７，８－ｄｉｈｙｄｒｏ－２Ｈ，６Ｈ－ｐｙｒａｎｏ［３，２－ｇ］ｃｈｒｏｍｅｎ－７－ｙｌ３－（３，４－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｒｏｐａｎｏａｔｅ（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ ７；ＳＮＵ－Ｃ７）
【0077】
【0078】
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ ｐｐｍ ７．５９（ｄ、Ｊ＝９．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．０７（ｓ、１Ｈ）、６．８３－６．６３（ｍ、４Ｈ）、６．２４（ｄ、Ｊ＝９．６Ｈｚ、１Ｈ）、５．０３（ａｐｐ．ｔ、Ｊ＝４．８Ｈｚ、１Ｈ）、３．８４（ｓ、３Ｈ）、３．８０（ｓ、３Ｈ）、３．１１（ｄｄ、Ｊ＝１７．３、４．６Ｈｚ、１Ｈ）、２．８７（ｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、２Ｈ）、２．６９（ｄｄ、Ｊ＝１７．２、４．６Ｈｚ、１Ｈ）、２．６３（ａｐｐ．ｔｄ、Ｊ＝７．３、１．９Ｈｚ、２Ｈ）、１．３１（ｓ、３Ｈ）、１．３０（ｓ、３Ｈ）。
【0079】
（Ｓ）－８，８－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２－ｏｘｏ－７，８－ｄｉｈｙｄｒｏ－２Ｈ，６Ｈ－ｐｙｒａｎｏ［３，２－ｇ］ｃｈｒｏｍｅｎ－７－ｙｌ（Ｅ）－３－（ｐｙｒｉｄｉｎ－４－ｙｌ）ａｃｒｙｌａｔｅ（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ ９；ＳＮＵ－Ｃ９）
【0080】
【0081】
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ ｐｐｍ ８．７２－８．５９（ｍ、２Ｈ）、７．６０（ｄ、１Ｈ）、７．５７（ｄ、１Ｈ）、７．３６－７．３０（ｍ、２Ｈ）、７．１８（ｓ、１Ｈ）、６．８３（ｓ、１Ｈ）、６．５８（ｄ、Ｊ＝１６．０Ｈｚ、１Ｈ）、６．２４（ｄ、Ｊ＝９．４Ｈｚ、１Ｈ）、５．２１（ａｐｐ．ｔ、Ｊ＝４．６Ｈｚ、１Ｈ）、３．２６（ｄｄｄ、Ｊ＝１７．２、４．８、１．２Ｈｚ、１Ｈ）、３．００－２．８９（ｍ、１Ｈ）、１．４４（ｓ、３Ｈ）、１．３９（ｓ、３Ｈ）。
【0082】
（Ｓ）－８，８－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２－ｏｘｏ－７，８－ｄｉｈｙｄｒｏ－２Ｈ，６Ｈ－ｐｙｒａｎｏ［３，２－ｇ］ｃｈｒｏｍｅｎ－７－ｙｌ（Ｅ）－３－（３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ａｃｒｙｌａｔｅ（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ １０；ＳＮＵ－Ｃ１０）
【0083】
【0084】
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ２Ｃｌ２、４００ＭＨｚ）：δ ｐｐｍ ７．６４－７．５５（ｍ、２Ｈ）、７．２５（ａｐｐ．ｔ、Ｊ＝７．９Ｈｚ、１Ｈ）、７．２１（ｓ、１Ｈ）、７．１３－７．０６（ｍ、１Ｈ）、７．００－６．９５（ｍ、１Ｈ）、６．８６（ｄｄｄ、Ｊ＝８．１、２．６、１．０Ｈｚ、１Ｈ）、６．７８（ｓ、１Ｈ）、６．４０（ｄ、Ｊ＝１５．９Ｈｚ、１Ｈ）、６．１８（ｄ、Ｊ＝９．５Ｈｚ、１Ｈ）、５．１８（ａｐｐ．ｔ、Ｊ＝４．８Ｈｚ、１Ｈ）、３．２５（ｄｄｄ、Ｊ＝１７．３、４．９、１．２Ｈｚ、１Ｈ）、２．９４（ｄｄ、Ｊ＝１７．３、４．７Ｈｚ、１Ｈ）、１．４２（ｓ、３Ｈ）、１．３８（ｓ、３Ｈ）、１．２５（ｂｒｓ、１Ｈ）。
【0085】
（Ｓ）－８，８－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２－ｏｘｏ－７，８－ｄｉｈｙｄｒｏ－２Ｈ，６Ｈ－ｐｙｒａｎｏ［３，２－ｇ］ｃｈｒｏｍｅｎ－７－ｙｌ（Ｅ）－３－（４－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ａｃｒｙｌａｔｅ（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ １１；ＳＮＵ－Ｃ１１；ＰＲＧ－Ａ－０３）
【0086】
【0087】
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ２Ｃｌ２、４００ＭＨｚ）：δ ｐｐｍ ７．６６－７．５５（ｍ、２Ｈ）、７．５５－７．４６（ｍ、２Ｈ）、７．１８（ｓ、１Ｈ）、７．１１－７．０１（ｍ、２Ｈ）、６．７６（ｓ、１Ｈ）、６．３５（ｄ、Ｊ＝１６．０Ｈｚ、１Ｈ）、６．１６（ｄ、Ｊ＝９．５Ｈｚ、１Ｈ）、５．１７（ａｐｐ．ｔ、Ｊ＝４．７Ｈｚ、１Ｈ）、３．２３（ｄｄｄ、Ｊ＝１７．３、４．８、１．２Ｈｚ、１Ｈ）、２．９２（ｄｄ、Ｊ＝１７．３、４．７Ｈｚ、１Ｈ）、１．４０（ｓ、３Ｈ）、１．３６（ｓ、３Ｈ）。
【0088】
（Ｓ，Ｅ）－７－（（３－（４－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ａｌｌｙｌ）ｏｘｙ）－８，８－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－７，８－ｄｉｈｙｄｒｏ－２Ｈ，６Ｈ－ｐｙｒａｎｏ［３，２－ｇ］ｃｈｒｏｍｅｎ－２－ｏｎｅ（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ １３；ＳＮＵ－Ｃ１３）
【0089】
【0090】
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ ｐｐｍ ７．５７（ｄ、Ｊ＝９．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．３８－７．２９（ｍ、２Ｈ）、７．１６（ｓ、１Ｈ）、７．０６－６．９３（ｍ、２Ｈ）、６．７７（ｓ、１Ｈ）、６．５５（ｄ、Ｊ＝１５．８Ｈｚ、１Ｈ）、６．２５－６．１３（ｍ、２Ｈ）、４．３３（ｄｄｄ、Ｊ＝１２．８、５．８、１．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．１９（ｄｄｄ、Ｊ＝１２．８、６．３、１．４Ｈｚ、１Ｈ）、３．５８（ｄｄ、Ｊ＝７．４、５．０Ｈｚ、１Ｈ）、３．０８（ｄｄ、Ｊ＝１６．４、５．０Ｈｚ、１Ｈ）、２．８５（ｄｄｄ、Ｊ＝１６．４、７．４、１．１Ｈｚ、１Ｈ）、１．４２（ｓ、３Ｈ）、１．３５（ｓ、３Ｈ）。
【0091】
（Ｓ）－８，８－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２－ｏｘｏ－７，８－ｄｉｈｙｄｒｏ－２Ｈ，６Ｈ－ｐｙｒａｎｏ［３，２－ｇ］ｃｈｒｏｍｅｎ－７－ｙｌ（Ｅ）－３－（３－ａｃｅｔｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ａｃｒｙｌａｔｅ（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ １４；ＳＮＵ－Ｃ１４）
【0092】
【0093】
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ ｐｐｍ ７．６３（ｄ、Ｊ＝１６．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．５９（ｄ、Ｊ＝９．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．４２－７．３３（ｍ、２Ｈ）、７．２５－７．２２（ｍ、１Ｈ）、７．１７（ｓ、１Ｈ）、７．１１（ａｐｐ．ｄｔ、Ｊ＝７．４、２．１Ｈｚ、１Ｈ）、６．８３（ｓ、１Ｈ）、６．４０（ｄ、Ｊ＝１６．０Ｈｚ、１Ｈ）、６．２４（ｄ、Ｊ＝９．５Ｈｚ、１Ｈ）、５．１９（ａｐｐ．ｔ、Ｊ＝４．７Ｈｚ、１Ｈ）、３．２４（ｄｄｄ、Ｊ＝１７．２、４．７、１．２Ｈｚ、１Ｈ）、２．９３（ｄｄ、Ｊ＝１７．２、４．５Ｈｚ、１Ｈ）、２．３０（ｓ、３Ｈ）、１．４３（ｓ、３Ｈ）、１．３９（ｓ、３Ｈ）。
【0094】
（Ｓ）－８，８－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２－ｏｘｏ－７，８－ｄｉｈｙｄｒｏ－２Ｈ，６Ｈ－ｐｙｒａｎｏ［３，２－ｇ］ｃｈｒｏｍｅｎ－７－ｙｌ３－（４－ａｃｅｔｏｘｙ－３－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｒｏｐａｎｏａｔｅ（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ １５；ＳＮＵ－Ｃ１５）
【0095】
【0096】
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ ｐｐｍ ７．５８（ｄ、Ｊ＝９．５、０．８Ｈｚ、１Ｈ）、７．１０（ｓ、１Ｈ）、６．８７（ｄｄ、Ｊ＝７．９、１．１Ｈｚ、１Ｈ）、６．７７（ｄ、１Ｈ）、６．７４－６．６５（ｍ、２Ｈ）、６．２３（ｄｄ、Ｊ＝９．５、２．２Ｈｚ、１Ｈ）、５．０２（ａｐｐ．ｔ、Ｊ＝４．７Ｈｚ、１Ｈ）、３．７４（ｄ、Ｊ＝１．２Ｈｚ、３Ｈ）、３．１０（ｄｄｄ、Ｊ＝１７．２、４．８、１．１Ｈｚ、１Ｈ）、２．９０（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．７２－２．６０（ｍ、３Ｈ）、２．３０（ｄ、Ｊ＝１．３Ｈｚ、３Ｈ）、１．３１（ｓ、３Ｈ）、１．３０（ｓ、３Ｈ）。
【0097】
（Ｓ）－８，８－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２－ｏｘｏ－７，８－ｄｉｈｙｄｒｏ－２Ｈ，６Ｈ－ｐｙｒａｎｏ［３，２－ｇ］ｃｈｒｏｍｅｎ－７－ｙｌ（Ｅ）－３－（４－ａｃｅｔｏｘｙ－３－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ａｃｒｙｌａｔｅ（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ １７；ＳＮＵ－Ｃ１７）
【0098】
【0099】
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ２Ｃｌ２、６００ＭＨｚ）：δ ｐｐｍ ７．６７－７．５６（ｍ、２Ｈ）、７．２１（ｓ、１Ｈ）、７．１４－７．０９（ｍ、２Ｈ）、７．０３（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）、６．７８（ｓ、１Ｈ）、６．４１（ｄ、Ｊ＝１６．０Ｈｚ、１Ｈ）、６．１９（ｄ、Ｊ＝９．５Ｈｚ、１Ｈ）、５．２０（ａｐｐ．ｔ、Ｊ＝４．７Ｈｚ、１Ｈ）、３．８２（ｓ、３Ｈ）、３．２６（ｄｄｄ、Ｊ＝１７．３、４．８、１．２Ｈｚ、１Ｈ）、２．９５（ｄｄ、Ｊ＝１７．３、４．５Ｈｚ、１Ｈ）、２．２７（ｓ、３Ｈ）、１．４３（ｓ、３Ｈ）、１．３８（ｓ、３Ｈ）。
【0100】
（Ｓ）－８，８－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２－ｏｘｏ－７，８－ｄｉｈｙｄｒｏ－２Ｈ，６Ｈ－ｐｙｒａｎｏ［３，２－ｇ］ｃｈｒｏｍｅｎ－７－ｙｌ（Ｅ）－３－（３，４－ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ａｃｒｙｌａｔｅ（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ １８；ＳＮＵ－Ｃ１８）
【0101】
【0102】
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ ｐｐｍ ７．６２－７．５３（ｍ、２Ｈ）、７．３２（ｄｄｄ、Ｊ＝１１．１、７．６、２．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．２４－７．１１（ｍ、３Ｈ）、６．８３（ｓ、１Ｈ）、６．３３（ｄ、Ｊ＝１６．０、１Ｈ）、６．２４（ｄ、Ｊ＝９．４Ｈｚ、１Ｈ）、５．１９（ａｐｐ．ｔ、Ｊ＝４．７Ｈｚ、１Ｈ）、３．２５（ｄｄｄ、Ｊ＝１７．４、４．８、１．１Ｈｚ、１Ｈ）、２．９３（ｄｄ、Ｊ＝１７．４、４．５Ｈｚ、１Ｈ）、１．４３（ｓ、３Ｈ）、１．３９（ｓ、３Ｈ）。
【0103】
（Ｓ，Ｅ）－７－（（３－（３－ｍｅｔｈｏｘｙ－４－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）ａｌｌｙｌ）ｏｘｙ）－８，８－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－７，８－ｄｉｈｙｄｒｏ－２Ｈ，６Ｈ－ｐｙｒａｎｏ［３，２－ｇ］ｃｈｒｏｍｅｎ－２－ｏｎｅ（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ １９；ＰＲＧ－Ａ－０４）
【0104】
【0105】
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ ｐｐｍ ７．８５（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ）、７．５７（ｄ、Ｊ＝９．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．１６（ｓ、１Ｈ）、７．０５－６．９７（ｍ、２Ｈ）、６．７８（ｓ、１Ｈ）、６．６０（ａｐｐ．ｄｔ、Ｊ＝１５．９、１．７Ｈｚ、１Ｈ）、６．４０（ａｐｐ．ｄｔ、Ｊ＝１５．９、５．５Ｈｚ、１Ｈ）、６．２２（ｄ、Ｊ＝９．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．３９（ｄｄｄ、Ｊ＝１３．６、５．４、１．７Ｈｚ、１Ｈ）、４．２４（ｄｄｄ、Ｊ＝１３．４、５．５、１．６Ｈｚ、１Ｈ）、３．９７（ｓ、３Ｈ）、３．５９（ｄｄ、Ｊ＝７．１、４．９Ｈｚ、１Ｈ）、３．１１（ｄｄ、Ｊ＝１６．７、４．９Ｈｚ、１Ｈ）、２．８７（ｄｄ、Ｊ＝１６．７、７．２Ｈｚ、１Ｈ）、１．４３（ｓ、３Ｈ）、１．３８（ｓ、３Ｈ）。
【0106】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳しく記述したところ、当業者にとって、このような具体的な記述は、単に望ましい実施形態に過ぎず、これにより、本発明の範囲が制限されるものではないという点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、特許請求の範囲とそれらの等価物とによって定義される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】