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特許7387357淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を検出するためのプライマーセット、淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価するためのプライマーセット、及びそれらの使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-11-17
(45)【発行日】2023-11-28
(54)【発明の名称】淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を検出するためのプライマーセット、淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価するためのプライマーセット、及びそれらの使用
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/689 20180101AFI20231120BHJP
C12Q 1/6844 20180101ALI20231120BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20231120BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20231120BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20231120BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/689 Z ZNA
C12Q1/6844 Z
C12N15/11 Z
G01N33/53 M
C12N15/09 Z
【請求項の数】
6
(21)【出願番号】P 2019175273
(22)【出願日】2019-09-26
(65)【公開番号】P2021048812
(43)【公開日】2021-04-01
【審査請求日】2022-09-22
(73)【特許権者】
【識別番号】522371259
【氏名又は名称】早川 直
(74)【代理人】
【識別番号】100107766
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠重
(74)【代理人】
【識別番号】100070150
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠彦
(74)【代理人】
【識別番号】100107515
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 浩一
(72)【発明者】
【氏名】前田 卓哉
(72)【発明者】
【氏名】早川 直
(72)【発明者】
【氏名】樽本 憲人
(72)【発明者】
【氏名】今井 一男
(72)【発明者】
【氏名】酒井 純
(72)【発明者】
【氏名】村上 孝
(72)【発明者】
【氏名】前▲崎▼ 繁文
(72)【発明者】
【氏名】大西 真
(72)【発明者】
【氏名】志牟田 健
(72)【発明者】
【氏名】早川 智
【審査官】伊達 利奈
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１８－５１８１８０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００３－０５２３９１（ＪＰ，Ａ）
【文献】Antimicrobial agents and chemotherapy，1995年02月，Vol. 39, No. 2，p.561-563
【文献】Journal of clinical microbiology，2017年08月16日，Vol. 55, No. 11，p.3201-3209
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／００
Ｃ１２Ｎ １５／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ループ介在等温増幅法（ＬＡＭＰ法）により、淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を検出するためのプライマーセットであって、下記（ｉ）～（ｉｖ）のプライマーを含むことを特徴とするプライマーセット：（ｉ） 下記配列番号：１で表される塩基配列からなるプライマー：
・ ５’－ＣＧＧＣＧＡＣＧＴＣＡＴＣＧＧＴＡＡ－３’（配列番号：１）
（ｉｉ） 下記配列番号：２で表される塩基配列からなるプライマー：
・ ５’－ＡＧＡＴＴＴＴＣＧＣＣＡＴＧＣＧＧＡＴＴ－３’（配列番号：２）
（ｉｉｉ） 下記配列番号：１０～１２、１４、及び１５のいずれかで表される塩基配列からなるプライマー：
・ ５’－ＣＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＧＣＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＧＴＣ－３’（配列番号：１０）
・ ５’－ＣＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＧＣＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＣＴＣ－３’（配列番号：１１）
・ ５’－ＣＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＧＣＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＡＴＣ－３’（配列番号：１２）
・ ５’－ＣＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＧＣＣＡＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＧＴＣ－３’（配列番号：１４）
・ ５’－ＣＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＧＣＣＡＣＣＡＣＧＧＣＧＡＧＴＣ－３’（配列番号：１５）
（ｉｖ） 下記配列番号：１３で表される塩基配列からなるプライマー：
・ ５’－ＧＴＧＣＴＧＡＴＡＧＡＣＧＧＡＣＡＧＧＧＣＧＧＴＡＴＡＧＣＧＣＡＴＧＧＣＴＧＣ－３’（配列番号：１３）。
【請求項2】
淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を検出する方法であって、
請求項１に記載のプライマーセットを用いて、試料中の核酸を鋳型として、ＬＡＭＰ法によってＤＮＡの増幅反応を行う増幅反応工程と、
前記増幅反応工程において、増幅産物が得られた場合は、淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異が無く、増幅産物が得られなかった場合は、淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異が有ると評価する評価工程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項3】
ＬＡＭＰ法により、淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価するためのプライマーセットであって、下記（ｉ）～（ｉｖ）のプライマーを含むことを特徴とするプライマーセット：
（ｉ） 下記配列番号：１で表される塩基配列からなるプライマー：
・ ５’－ＣＧＧＣＧＡＣＧＴＣＡＴＣＧＧＴＡＡ－３’（配列番号：１）
（ｉｉ） 下記配列番号：２で表される塩基配列からなるプライマー：
・ ５’－ＡＧＡＴＴＴＴＣＧＣＣＡＴＧＣＧＧＡＴＴ－３’（配列番号：２）
（ｉｉｉ） 下記配列番号：１０～１２、１４、及び１５のいずれかで表される塩基配列からなるプライマー：
・ ５’－ＣＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＧＣＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＧＴＣ－３’（配列番号：１０）
・ ５’－ＣＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＧＣＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＣＴＣ－３’（配列番号：１１）
・ ５’－ＣＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＧＣＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＡＴＣ－３’（配列番号：１２）
・ ５’－ＣＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＧＣＣＡＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＧＴＣ－３’（配列番号：１４）
・ ５’－ＣＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＧＣＣＡＣＣＡＣＧＧＣＧＡＧＴＣ－３’（配列番号：１５）
（ｉｖ） 下記配列番号：１３で表される塩基配列からなるプライマー：
・ ５’－ＧＴＧＣＴＧＡＴＡＧＡＣＧＧＡＣＡＧＧＧＣＧＧＴＡＴＡＧＣＧＣＡＴＧＧＣＴＧＣ－３’（配列番号：１３）。
【請求項4】
淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価する方法であって、
請求項３に記載のプライマーセットを用いて、試料中の核酸を鋳型として、ＬＡＭＰ法によってＤＮＡの増幅反応を行う増幅反応工程と、
前記増幅反応工程において、増幅産物が得られた場合は、淋菌がフルオロキノロンに対する感受性を有し、増幅産物が得られなかった場合は、淋菌がフルオロキノロンに対する感受性を有さないと評価する評価工程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項5】
ＬＡＭＰ法により、淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を検出するためのキットであって、
請求項１に記載のプライマーセットを含むことを特徴とするキット。
【請求項6】
ＬＡＭＰ法により、淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価するためのキットであって、
請求項３に記載のプライマーセットを含むことを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ループ介在等温増幅法（Ｌｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＬＡＭＰ法）により、淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を検出するためのプライマーセット、淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を検出する方法、ＬＡＭＰ法により、淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価するためのプライマーセット、淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価する方法、ＬＡＭＰ法により、淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を検出するためのキット、及びＬＡＭＰ法により、淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価するためのキットに関する。
【背景技術】
【0002】
性感染症（Ｓｅｘｕａｌｌｙ Ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ； ＳＴＩ）の１つである淋菌感染症は、フルオロキノロンを含む様々な抗菌薬に耐性を獲得した薬剤耐性株が世界中で爆発的に広がっており、患者にとって大きな脅威となっている。その一方で、臨床現場において薬剤感受性検査を行い、最適な抗菌薬治療を選択することは極めて困難な状況である。
【0003】
現在の培養法並びにＰＣＲ法による検査では、淋菌の同定及び薬剤感受性情報が判定できるまでに長い時間を要する。具体的には、培養法では淋菌の分離培養に１日～２日が必要であり、薬剤感受性検査には最短でも更に１日必要である。また、ＰＣＲ法では遺伝子の抽出・増幅に３時間～４時間を必要とし、増幅産物のシーケンス解析には通常１日～２日を必要とする。
【0004】
これまでに、簡易的な遺伝子抽出と特異的プライマーにより淋菌を迅速に検出する方法として、ＬＡＭＰ法を用いた遺伝子検査が提案されている（例えば、非特許文献１～２参照）。しかしながら、前記提案では、フルオロキノロンに対する感受性に関わる遺伝子変異の有無を区別してＬＡＭＰ反応を引き起こし、フルオロキノロン感受性淋菌とフルオロキノロン耐性淋菌とを区別して検出することは不可能であった。
【0005】
そのため、淋菌感染症を迅速に診断し、同時にフルオロキノロンに対する感受性に基づいた治療を開始することは技術的に困難であり、ほぼ全ての症例で、耐性化が進行するセフトリアキソンによる治療が盲目的に実施されているのが現状である。
【0006】
また、淋菌感染症を含めたＳＴＩは小規模医療機関で診断・治療される機会が多いことからも、迅速かつ簡易的に病原体を検出し、その薬剤に対する感受性を同時に判定できる迅速検査技術の開発が急務である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【文献】Ｌｉｕ ＭＬ， Ｘｉａ Ｙ， Ｗｕ ＸＺ， Ｈｕａｎｇ ＪＱ， Ｇｕｏ ＸＧ． Ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ｐｏｒＡ ｐｓｅｕｄｏｇｅｎｅ： ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｒｅｌｉａｂｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｇｏｎｏｒｒｈｅａ． ＡＭＢ Ｅｘｐｒｅｓｓ． ２０１７ Ｄｅｃ；７（１）：４８．
【文献】Ｅｄｗａｒｄｓ Ｔ， Ｂｕｒｋｅ ＰＡ， Ｓｍａｌｌｅｙ ＨＢ， Ｇｉｌｌｉｅｓ Ｌ， Ｈｏｂｂｓ Ｇ． Ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ｉｎ ｕｒｉｎｅ ｓａｍｐｌｅｓ ａｎｄ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｓｓａｙ ｔｏ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｕｒｅａ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２０１４ Ｊｕｎ；５２（６）：２１６３－５．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、迅速かつ簡易的に淋菌を検出し、淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無、及び淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を判定することができるプライマーセット、淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を検出する方法及び検出用キット、並びに淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価する方法及び評価用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、前記目的を達成するべく鋭意検討を行った結果、特定のプライマーセットを用いたＬＡＭＰ法により、フルオロキノロン感受性淋菌でのみＬＡＭＰ反応が陽性となり、淋菌の同定と、フルオロキノロンに対する耐性関連遺伝子の有無及びフルオロキノロンに対する感受性の有無とを迅速かつ同時に判定できることを知見した。
【0010】
前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ ＬＡＭＰ法により、淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を検出するためのプライマーセットであって、下記（ｉ）～（ｉｖ）のプライマーを含むことを特徴とするプライマーセットである。
（ｉ） 下記配列番号：１で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列からなるプライマー：
・ ５’－ＣＧＧＣＧＡＣＧＴＣＡＴＣＧＧＴＡＡ－３’（配列番号：１）
（ｉｉ） 下記配列番号：２で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列からなるプライマー：
・ ５’－ＡＧＡＴＴＴＴＣＧＣＣＡＴＧＣＧＧＡＴＴ－３’（配列番号：２）
（ｉｉｉ） 下記式（１）で表されるプライマー：
・ ５’－（Ａ）－（Ｂ）－（Ｃ）－３’（式（１））
前記式（１）中、前記（Ａ）は、下記配列番号：３で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列を表し、前記（Ｂ）は、塩基数０～５０の任意の塩基配列を表し、前記（Ｃ）は、（ｃ－１）下記配列番号：４で表される塩基配列における３’末端の塩基と、前記３’末端の塩基から５’末端方向の３番目の塩基を保持し、かつ下記配列番号：４で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列、（ｃ－２）下記配列番号：５で表される塩基配列における３’末端の塩基と、前記３’末端の塩基から５’末端方向の３番目の塩基を保持し、かつ下記配列番号：５で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列、及び（ｃ－３）下記配列番号：６で表される塩基配列における３’末端の塩基と、前記３’末端の塩基から５’末端方向の３番目の塩基を保持し、かつ下記配列番号：６で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列のいずれかを表す。
・ ５’－ＣＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＧＣＣＡ－３’（配列番号：３）
・ ５’－ＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＧＴＣ－３’（配列番号：４）
・ ５’－ＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＣＴＣ－３’（配列番号：５）
・ ５’－ＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＡＴＣ－３’（配列番号：６）
（ｉｖ） 下記式（２）で表されるプライマー：
・ ５’－（Ｄ）－（Ｅ）－（Ｆ）－３’（式（２））
前記式（２）中、前記（Ｄ）は、下記配列番号：７で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列を表し、前記（Ｅ）は、塩基数０～５０の任意の塩基配列を表し、前記（Ｆ）は、下記配列番号：８で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列を表す。
・ ５’－ＧＴＧＣＴＧＡＴＡＧＡＣＧＧＡＣＡＧＧＧＣ－３’（配列番号：７）
・ ５’－ＧＧＴＡＴＡＧＣＧＣＡＴＧＧＣＴＧＣ－３’（配列番号：８）
＜２＞ 淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を検出する方法であって、
前記＜１＞に記載のプライマーセットを用いて、試料中の核酸を鋳型として、ＬＡＭＰ法によってＤＮＡの増幅反応を行う増幅反応工程と、
前記増幅反応工程において、増幅産物が得られた場合は、淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異が無く、増幅産物が得られなかった場合は、淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異が有ると評価する評価工程とを含むことを特徴とする方法である。
＜３＞ ＬＡＭＰ法により、淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価するためのプライマーセットであって、下記（ｉ）～（ｉｖ）のプライマーを含むことを特徴とするプライマーセットである。
（ｉ） 下記配列番号：１で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列からなるプライマー：
・ ５’－ＣＧＧＣＧＡＣＧＴＣＡＴＣＧＧＴＡＡ－３’（配列番号：１）
（ｉｉ） 下記配列番号：２で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列からなるプライマー：
・ ５’－ＡＧＡＴＴＴＴＣＧＣＣＡＴＧＣＧＧＡＴＴ－３’（配列番号：２）
（ｉｉｉ） 下記式（１）で表されるプライマー：
・ ５’－（Ａ）－（Ｂ）－（Ｃ）－３’（式（１））
前記式（１）中、前記（Ａ）は、下記配列番号：３で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列を表し、前記（Ｂ）は、塩基数０～５０の任意の塩基配列を表し、前記（Ｃ）は、（ｃ－１）下記配列番号：４で表される塩基配列における３’末端の塩基と、前記３’末端の塩基から５’末端方向の３番目の塩基を保持し、かつ下記配列番号：４で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列、（ｃ－２）下記配列番号：５で表される塩基配列における３’末端の塩基と、前記３’末端の塩基から５’末端方向の３番目の塩基を保持し、かつ下記配列番号：５で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列、及び（ｃ－３）下記配列番号：６で表される塩基配列における３’末端の塩基と、前記３’末端の塩基から５’末端方向の３番目の塩基を保持し、かつ下記配列番号：６で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列のいずれかを表す。
・ ５’－ＣＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＧＣＣＡ－３’（配列番号：３）
・ ５’－ＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＧＴＣ－３’（配列番号：４）
・ ５’－ＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＣＴＣ－３’（配列番号：５）
・ ５’－ＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＡＴＣ－３’（配列番号：６）
（ｉｖ） 下記式（２）で表されるプライマー：
・ ５’－（Ｄ）－（Ｅ）－（Ｆ）－３’（式（２））
前記式（２）中、前記（Ｄ）は、下記配列番号：７で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列を表し、前記（Ｅ）は、塩基数０～５０の任意の塩基配列を表し、前記（Ｆ）は、下記配列番号：８で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列を表す。
・ ５’－ＧＴＧＣＴＧＡＴＡＧＡＣＧＧＡＣＡＧＧＧＣ－３’（配列番号：７）
・ ５’－ＧＧＴＡＴＡＧＣＧＣＡＴＧＧＣＴＧＣ－３’（配列番号：８）。
＜４＞ 淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価する方法であって、
前記＜３＞に記載のプライマーセットを用いて、試料中の核酸を鋳型として、ＬＡＭＰ法によってＤＮＡの増幅反応を行う増幅反応工程と、
前記増幅反応工程において、増幅産物が得られた場合は、淋菌がフルオロキノロンに対する感受性を有し、増幅産物が得られなかった場合は、淋菌がフルオロキノロンに対する感受性を有さないと評価する評価工程とを含むことを特徴とする方法である。
＜５＞ ＬＡＭＰ法により、淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を検出するためのキットであって、
前記＜１＞に記載のプライマーセットを含むことを特徴とするキットである。
＜６＞ ＬＡＭＰ法により、淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価するためのキットであって、
前記＜３＞に記載のプライマーセットを含むことを特徴とするキットである。
＜１＞ ＬＡＭＰ法により、淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を検出するためのプライマーセットであって、下記（ｉ）～（ｉｖ）のプライマーを含むことを特徴とするプライマーセットである。
（ｉ） 下記配列番号：１で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列からなるプライマー：
・ ５’－ＣＧＧＣＧＡＣＧＴＣＡＴＣＧＧＴＡＡ－３’（配列番号：１）
（ｉｉ） 下記配列番号：２で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列からなるプライマー：
・ ５’－ＡＧＡＴＴＴＴＣＧＣＣＡＴＧＣＧＧＡＴＴ－３’（配列番号：２）
（ｉｉｉ） 下記式（１）で表されるプライマー：
・ ５’－（Ａ）－（Ｂ）－（Ｃ）－３’（式（１））
前記式（１）中、前記（Ａ）は、下記配列番号：３で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列を表し、前記（Ｂ）は、塩基数０～５０の任意の塩基配列を表し、前記（Ｃ）は、（ｃ－１）下記配列番号：４で表される塩基配列における３’末端の塩基と、前記３’末端の塩基から５’末端方向の３番目の塩基を保持し、かつ下記配列番号：４で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列、（ｃ－２）下記配列番号：５で表される塩基配列における３’末端の塩基と、前記３’末端の塩基から５’末端方向の３番目の塩基を保持し、かつ下記配列番号：５で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列、及び（ｃ－３）下記配列番号：６で表される塩基配列における３’末端の塩基と、前記３’末端の塩基から５’末端方向の３番目の塩基を保持し、かつ下記配列番号：６で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列のいずれかを表す。
・ ５’－ＣＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＧＣＣＡ－３’（配列番号：３）
・ ５’－ＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＧＴＣ－３’（配列番号：４）
・ ５’－ＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＣＴＣ－３’（配列番号：５）
・ ５’－ＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＡＴＣ－３’（配列番号：６）
（ｉｖ） 下記式（２）で表されるプライマー：
・ ５’－（Ｄ）－（Ｅ）－（Ｆ）－３’（式（２））
前記式（２）中、前記（Ｄ）は、下記配列番号：７で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列を表し、前記（Ｅ）は、塩基数０～５０の任意の塩基配列を表し、前記（Ｆ）は、下記配列番号：８で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列を表す。
・ ５’－ＧＴＧＣＴＧＡＴＡＧＡＣＧＧＡＣＡＧＧＧＣ－３’（配列番号：７）
・ ５’－ＧＧＴＡＴＡＧＣＧＣＡＴＧＧＣＴＧＣ－３’（配列番号：８）
＜２＞ 淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を検出する方法であって、
前記＜１＞に記載のプライマーセットを用いて、試料中の核酸を鋳型として、ＬＡＭＰ法によってＤＮＡの増幅反応を行う増幅反応工程と、
前記増幅反応工程において、増幅産物が得られた場合は、淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異が無く、増幅産物が得られなかった場合は、淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異が有ると評価する評価工程とを含むことを特徴とする方法である。
＜３＞ ＬＡＭＰ法により、淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価するためのプライマーセットであって、下記（ｉ）～（ｉｖ）のプライマーを含むことを特徴とするプライマーセットである。
（ｉ） 下記配列番号：１で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列からなるプライマー：
・ ５’－ＣＧＧＣＧＡＣＧＴＣＡＴＣＧＧＴＡＡ－３’（配列番号：１）
（ｉｉ） 下記配列番号：２で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列からなるプライマー：
・ ５’－ＡＧＡＴＴＴＴＣＧＣＣＡＴＧＣＧＧＡＴＴ－３’（配列番号：２）
（ｉｉｉ） 下記式（１）で表されるプライマー：
・ ５’－（Ａ）－（Ｂ）－（Ｃ）－３’（式（１））
前記式（１）中、前記（Ａ）は、下記配列番号：３で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列を表し、前記（Ｂ）は、塩基数０～５０の任意の塩基配列を表し、前記（Ｃ）は、（ｃ－１）下記配列番号：４で表される塩基配列における３’末端の塩基と、前記３’末端の塩基から５’末端方向の３番目の塩基を保持し、かつ下記配列番号：４で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列、（ｃ－２）下記配列番号：５で表される塩基配列における３’末端の塩基と、前記３’末端の塩基から５’末端方向の３番目の塩基を保持し、かつ下記配列番号：５で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列、及び（ｃ－３）下記配列番号：６で表される塩基配列における３’末端の塩基と、前記３’末端の塩基から５’末端方向の３番目の塩基を保持し、かつ下記配列番号：６で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列のいずれかを表す。
・ ５’－ＣＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＧＣＣＡ－３’（配列番号：３）
・ ５’－ＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＧＴＣ－３’（配列番号：４）
・ ５’－ＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＣＴＣ－３’（配列番号：５）
・ ５’－ＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＡＴＣ－３’（配列番号：６）
（ｉｖ） 下記式（２）で表されるプライマー：
・ ５’－（Ｄ）－（Ｅ）－（Ｆ）－３’（式（２））
前記式（２）中、前記（Ｄ）は、下記配列番号：７で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列を表し、前記（Ｅ）は、塩基数０～５０の任意の塩基配列を表し、前記（Ｆ）は、下記配列番号：８で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列を表す。
・ ５’－ＧＴＧＣＴＧＡＴＡＧＡＣＧＧＡＣＡＧＧＧＣ－３’（配列番号：７）
・ ５’－ＧＧＴＡＴＡＧＣＧＣＡＴＧＧＣＴＧＣ－３’（配列番号：８）。
＜４＞ 淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価する方法であって、
前記＜３＞に記載のプライマーセットを用いて、試料中の核酸を鋳型として、ＬＡＭＰ法によってＤＮＡの増幅反応を行う増幅反応工程と、
前記増幅反応工程において、増幅産物が得られた場合は、淋菌がフルオロキノロンに対する感受性を有し、増幅産物が得られなかった場合は、淋菌がフルオロキノロンに対する感受性を有さないと評価する評価工程とを含むことを特徴とする方法である。
＜５＞ ＬＡＭＰ法により、淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を検出するためのキットであって、
前記＜１＞に記載のプライマーセットを含むことを特徴とするキットである。
＜６＞ ＬＡＭＰ法により、淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価するためのキットであって、
前記＜３＞に記載のプライマーセットを含むことを特徴とするキットである。
【発明の効果】
【0011】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、迅速かつ簡易的に淋菌を検出し、淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無、及び淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を判定することができるプライマーセット、淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を検出する方法及び検出用キット、並びに淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価する方法及び評価用キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【発明を実施するための形態】
【0013】
（淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を検出するためのプライマーセット）
本発明の、ＬＡＭＰ法により、淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を検出するためのプライマーセット（以下、「変異検出用プライマーセット」と称することがある。）は、下記（ｉ）～（ｉｖ）のプライマーを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
本発明の、ＬＡＭＰ法により、淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を検出するためのプライマーセット（以下、「変異検出用プライマーセット」と称することがある。）は、下記（ｉ）～（ｉｖ）のプライマーを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
【0014】
＜ＬＡＭＰ法＞
ＬＡＭＰ法は、４種類～６種類のプライマーを用いて、等温反応により標的遺伝子を増幅し、反応液の濁度によって標的遺伝子の存在を検出する遺伝子増幅法である（例えば、国際公開第２０００／０２８０８２号参照）。ＬＡＭＰ法は、等温反応であることから簡単な装置で実施することができ、また、肉眼で結果を判断することができることから、臨床検査で使用することも可能である。
ＬＡＭＰ法は、４種類～６種類のプライマーを用いて、等温反応により標的遺伝子を増幅し、反応液の濁度によって標的遺伝子の存在を検出する遺伝子増幅法である（例えば、国際公開第２０００／０２８０８２号参照）。ＬＡＭＰ法は、等温反応であることから簡単な装置で実施することができ、また、肉眼で結果を判断することができることから、臨床検査で使用することも可能である。
【0015】
ＬＡＭＰ法では、２本鎖の鋳型核酸の塩基配列に６つの領域を規定し、これらの領域の塩基配列に基づいてプライマーを設計する。より具体的には、鋳型核酸の一方の鎖の３’末端側から５’末端側方向に、順にＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという領域と、同一鎖の５’末端側から３’末端側方向に、順にＢ３、Ｂ２、Ｂ１という領域をそれぞれ規定する。そして、これらの領域の塩基配列に基づいて、ＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマーと呼ばれる４種類のプライマーを設計する。
【0016】
前記ＦＩＰプライマーは、前記Ｆ２ｃ領域と相補的な塩基配列であるＦ２領域の塩基配列を３’末端側に持ち、５’末端側にＦ１ｃ領域の塩基配列と同じ塩基配列を持つように設計する。
前記Ｆ３プライマーは、前記Ｆ３ｃ領域と相補的な塩基配列であるＦ３領域の塩基配列を持つように設計する。
前記ＢＩＰプライマーは、前記Ｂ２領域の塩基配列を３’末端側に持ち、５’末端側に前記Ｂ１領域と相補的な塩基配列であるＢ１ｃ領域の塩基配列を持つように設計する。
前記Ｂ３プライマーは、前記Ｂ３領域の塩基配列を持つように設計する。
前記Ｆ３プライマーは、前記Ｆ３ｃ領域と相補的な塩基配列であるＦ３領域の塩基配列を持つように設計する。
前記ＢＩＰプライマーは、前記Ｂ２領域の塩基配列を３’末端側に持ち、５’末端側に前記Ｂ１領域と相補的な塩基配列であるＢ１ｃ領域の塩基配列を持つように設計する。
前記Ｂ３プライマーは、前記Ｂ３領域の塩基配列を持つように設計する。
【0017】
ＬＡＭＰ法においては、上記したＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマーの４種類のプライマーに加えて、ＬＦプライマー、ＬＢプライマーと呼ばれるプライマー（以下、「ループプライマー」と称することがある。）を用いることができる。
前記ＬＦプライマーは、前記Ｆ１ｃ領域と相補的な塩基配列であるＦ１領域と、前記Ｆ２領域との間の塩基配列に相補的な塩基配列を持つように設計する。前記ＬＢプライマーは、前記Ｂ１領域と、前記Ｂ２領域との間の塩基配列に相補的な塩基配列を持つように設計する。これらのプライマーを追加で用いることにより、ＬＡＭＰ法による核酸増幅における核酸合成の起点が増加し、反応時間の短縮と検出感度の上昇が可能となる。前記ＬＦプライマー、前記ＬＢプライマーは、例えば、設計支援ソフト（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｉｍｅｒｅｘｐｌｏｒｅｒ．ｊｐ／）などを利用して設計することができる。
前記ＬＦプライマーは、前記Ｆ１ｃ領域と相補的な塩基配列であるＦ１領域と、前記Ｆ２領域との間の塩基配列に相補的な塩基配列を持つように設計する。前記ＬＢプライマーは、前記Ｂ１領域と、前記Ｂ２領域との間の塩基配列に相補的な塩基配列を持つように設計する。これらのプライマーを追加で用いることにより、ＬＡＭＰ法による核酸増幅における核酸合成の起点が増加し、反応時間の短縮と検出感度の上昇が可能となる。前記ＬＦプライマー、前記ＬＢプライマーは、例えば、設計支援ソフト（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｉｍｅｒｅｘｐｌｏｒｅｒ．ｊｐ／）などを利用して設計することができる。
【0018】
本明細書において、ＬＡＭＰ法は、ＲＴ－ＬＡＭＰ（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－Ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法を含む意味で用いられる。ＲＴ－ＬＡＭＰ法においては、逆転写反応と、ＬＡＭＰ反応とを同時に行うことによって、ＲＮＡを鋳型として核酸の増幅を行う。
【0019】
＜淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異＞
淋菌のフルオロキノロンに対する耐性は、主にＤＮＡジャイレースのサブユニットＡ（ｇｙｒＡ）をコードする遺伝子（アクセッション番号：Ｕ０８８１７．１（ＧｅｎｅＢａｎｋ）における８３番目のアミノ酸（Ｓｅｒ）をコードする塩基配列（ＴＣＣ）及び８７番目のアミノ酸（Ａｓｐ）をコードする塩基配列（ＧＡＣ）のミスセンス変異により生じることが報告されている（Ｄｅｇｕｃｈｉ Ｔ ｅｔ ａｌ． Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ， １９９５）。しかも、国内分離株のほぼ全ては、８３番目のアミノ酸（Ｓｅｒ）をコードする塩基配列（ＴＣＣ）における遺伝子変異（一塩基変異）により生じる（Ｓｅｒ（ＴＣＣ）→Ｐｈｅ（ＴＴＣ））。
以上の事実を鑑み、本発明では、上記した８３番目のアミノ酸（Ｓｅｒ）をコードする塩基配列（ＴＣＣ）を含む遺伝子領域を増幅することができるプライマーセットを設計し、かつ上記した８３番目のアミノ酸（Ｓｅｒ）をコードする塩基配列（ＴＣＣ）における２番目の塩基である「Ｃ」の遺伝子変異（一塩基変異）の有無を精緻に区別してＬＡＭＰ反応を引き起こす系を開発した。
本発明のプライマーセットを用いたＬＡＭＰ反応によれば、フルオロキノロン感受性淋菌（８３番目のアミノ酸がＳｅｒ（ＴＣＣ））でのみＬＡＭＰ反応が陽性となり、淋菌の同定と、淋菌のフルオロキノロンに対する感受性を迅速かつ同時に判定することができる。
淋菌のフルオロキノロンに対する耐性は、主にＤＮＡジャイレースのサブユニットＡ（ｇｙｒＡ）をコードする遺伝子（アクセッション番号：Ｕ０８８１７．１（ＧｅｎｅＢａｎｋ）における８３番目のアミノ酸（Ｓｅｒ）をコードする塩基配列（ＴＣＣ）及び８７番目のアミノ酸（Ａｓｐ）をコードする塩基配列（ＧＡＣ）のミスセンス変異により生じることが報告されている（Ｄｅｇｕｃｈｉ Ｔ ｅｔ ａｌ． Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ， １９９５）。しかも、国内分離株のほぼ全ては、８３番目のアミノ酸（Ｓｅｒ）をコードする塩基配列（ＴＣＣ）における遺伝子変異（一塩基変異）により生じる（Ｓｅｒ（ＴＣＣ）→Ｐｈｅ（ＴＴＣ））。
以上の事実を鑑み、本発明では、上記した８３番目のアミノ酸（Ｓｅｒ）をコードする塩基配列（ＴＣＣ）を含む遺伝子領域を増幅することができるプライマーセットを設計し、かつ上記した８３番目のアミノ酸（Ｓｅｒ）をコードする塩基配列（ＴＣＣ）における２番目の塩基である「Ｃ」の遺伝子変異（一塩基変異）の有無を精緻に区別してＬＡＭＰ反応を引き起こす系を開発した。
本発明のプライマーセットを用いたＬＡＭＰ反応によれば、フルオロキノロン感受性淋菌（８３番目のアミノ酸がＳｅｒ（ＴＣＣ））でのみＬＡＭＰ反応が陽性となり、淋菌の同定と、淋菌のフルオロキノロンに対する感受性を迅速かつ同時に判定することができる。
【0020】
＜（ｉ）のプライマー＞
前記（ｉ）のプライマー（以下、「Ｆ３プライマー」と称することがある。）は、下記配列番号：１で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列からなるプライマーである。
・ ５’－ＣＧＧＣＧＡＣＧＴＣＡＴＣＧＧＴＡＡ－３’（配列番号：１）
前記（ｉ）のプライマー（以下、「Ｆ３プライマー」と称することがある。）は、下記配列番号：１で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列からなるプライマーである。
・ ５’－ＣＧＧＣＧＡＣＧＴＣＡＴＣＧＧＴＡＡ－３’（配列番号：１）
【0021】
前記（ｉ）のプライマーとしては、前記配列番号：１で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列からなるプライマーであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記配列同一性が少なくとも８０％の塩基配列からなるプライマーが好ましく、前記配列同一性が少なくとも８５％の塩基配列からなるプライマーがより好ましく、前記配列同一性が少なくとも９０％の塩基配列からなるプライマーが更に好ましく、前記配列同一性が少なくとも９５％の塩基配列からなるプライマーが特に好ましい。前記好ましい態様であると、増幅効率と反応の特異性がより優れる点で、有利である。
【0022】
本明細書において、対象の配列における塩基と同一でない部分の塩基としては、対象の配列において、置換、欠失、挿入、又は付加したものが挙げられ、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、置換、欠失、挿入、又は付加の位置及び塩基の数としても、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【0023】
＜（ｉｉ）のプライマー＞
前記（ｉｉ）のプライマー（以下、「Ｂ３プライマー」と称することがある。）は、下記配列番号：２で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列からなるプライマーである。
・ ５’－ＡＧＡＴＴＴＴＣＧＣＣＡＴＧＣＧＧＡＴＴ－３’（配列番号：２）
前記（ｉｉ）のプライマー（以下、「Ｂ３プライマー」と称することがある。）は、下記配列番号：２で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列からなるプライマーである。
・ ５’－ＡＧＡＴＴＴＴＣＧＣＣＡＴＧＣＧＧＡＴＴ－３’（配列番号：２）
【0024】
前記（ｉｉ）のプライマーとしては、前記配列番号：２で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列からなるプライマーであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記配列同一性が少なくとも８０％の塩基配列からなるプライマーが好ましく、前記配列同一性が少なくとも８５％の塩基配列からなるプライマーがより好ましく、前記配列同一性が少なくとも９０％の塩基配列からなるプライマーが更に好ましく、前記配列同一性が少なくとも９５％の塩基配列からなるプライマーが特に好ましい。前記好ましい態様であると、増幅効率と反応の特異性がより優れる点で、有利である。
【0025】
＜（ｉｉｉ）のプライマー＞
前記（ｉｉｉ）のプライマー（以下、「ＦＩＰプライマー」と称することがある。）は、下記式（１）で表されるプライマーである。
・ ５’－（Ａ）－（Ｂ）－（Ｃ）－３’（式（１））
前記（ｉｉｉ）のプライマー（以下、「ＦＩＰプライマー」と称することがある。）は、下記式（１）で表されるプライマーである。
・ ５’－（Ａ）－（Ｂ）－（Ｃ）－３’（式（１））
【0026】
前記式（１）中、前記（Ａ）は前記Ｆ１ｃ領域に該当し、下記配列番号：３で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列を表す。
・ ５’－ＣＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＧＣＣＡ－３’（配列番号：３）
・ ５’－ＣＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＧＣＣＡ－３’（配列番号：３）
【0027】
前記（Ａ）の塩基配列としては、前記配列番号：３で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記配列同一性が少なくとも８０％の塩基配列が好ましく、前記配列同一性が少なくとも８５％の塩基配列がより好ましく、前記配列同一性が少なくとも９０％の塩基配列が更に好ましく、前記配列同一性が少なくとも９５％の塩基配列が特に好ましい。前記好ましい態様であると、増幅効率と反応の特異性がより優れる点で、有利である。
【0028】
前記式（１）中、前記（Ｂ）は、塩基数０～５０の任意の塩基配列を表す。
【0029】
前記式（１）中、前記（Ｃ）は前記Ｆ２領域に該当し、下記（ｃ－１）～（ｃ－３）で表される塩基配列のいずれかを表す。これらの中でも、増幅効率と反応の特異性がより優れる点で、（ｃ－１）で表される塩基配列が好ましい。
【0030】
（ｃ－１） 下記配列番号：４で表される塩基配列における３’末端の塩基と、前記３’末端の塩基から５’末端方向の３番目の塩基（３’末端の塩基を１番目とする。）を保持し、かつ下記配列番号：４で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列。
・ ５’－ＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＧＴＣ－３’（配列番号：４）
上記配列番号：４において下線を付した塩基は、上記した保持される塩基を表す。
・ ５’－ＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＧＴＣ－３’（配列番号：４）
上記配列番号：４において下線を付した塩基は、上記した保持される塩基を表す。
【0031】
前記（ｃ－１）の塩基配列としては、前記配列番号：４で表される塩基配列における３’末端の塩基と、前記３’末端の塩基から５’末端方向の３番目の塩基を保持し、かつ前記配列番号：４で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記配列同一性が少なくとも８０％の塩基配列が好ましく、前記配列同一性が少なくとも８５％の塩基配列がより好ましく、前記配列同一性が少なくとも９０％塩基配列が更に好ましく、前記配列同一性が少なくとも９５％の配列同一性を有する塩基配列が特に好ましい。前記好ましい態様であると、増幅効率と反応の特異性がより優れる点で、有利である。
【0032】
前記（ｃ－１）は、前記配列番号：４で表される塩基配列であることが、増幅効率と反応の特異性がより優れる点で、好ましい。
【0033】
（ｃ－２） 下記配列番号：５で表される塩基配列における３’末端の塩基と、前記３’末端の塩基から５’末端方向の３番目の塩基（３’末端の塩基を１番目とする。）を保持し、かつ下記配列番号：５で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列
・ ５’－ＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＣＴＣ－３’（配列番号：５）
上記配列番号：５において下線を付した塩基は、上記した保持される塩基を表す。
・ ５’－ＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＣＴＣ－３’（配列番号：５）
上記配列番号：５において下線を付した塩基は、上記した保持される塩基を表す。
【0034】
前記（ｃ－２）の塩基配列としては、前記配列番号：５で表される塩基配列における３’末端の塩基と、前記３’末端の塩基から５’末端方向の３番目の塩基を保持し、かつ前記配列番号：５で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記配列同一性が少なくとも８０％の塩基配列が好ましく、前記配列同一性が少なくとも８５％の塩基配列がより好ましく、前記配列同一性が少なくとも９０％塩基配列が更に好ましく、前記配列同一性が少なくとも９５％の配列同一性を有する塩基配列が特に好ましい。前記好ましい態様であると、増幅効率と反応の特異性がより優れる点で、有利である。
【0035】
前記（ｃ－２）は、前記配列番号：５で表される塩基配列であることが、増幅効率と反応の特異性がより優れる点で、好ましい。
【0036】
（ｃ－３）下記配列番号：６で表される塩基配列における３’末端の塩基と、前記３’末端の塩基から５’末端方向の３番目の塩基（３’末端の塩基を１番目とする。）を保持し、かつ下記配列番号：６で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列
・ ５’－ＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＡＴＣ－３’（配列番号：６）
上記配列番号：６において下線を付した塩基は、上記した保持される塩基を表す。
・ ５’－ＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＡＴＣ－３’（配列番号：６）
上記配列番号：６において下線を付した塩基は、上記した保持される塩基を表す。
【0037】
前記（ｃ－３）の塩基配列としては、前記配列番号：６で表される塩基配列における３’末端の塩基と、前記３’末端の塩基から５’末端方向の３番目の塩基を保持し、かつ前記配列番号：６で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記配列同一性が少なくとも８０％の塩基配列が好ましく、前記配列同一性が少なくとも８５％の塩基配列がより好ましく、前記配列同一性が少なくとも９０％塩基配列が更に好ましく、前記配列同一性が少なくとも９５％の配列同一性を有する塩基配列が特に好ましい。前記好ましい態様であると、増幅効率と反応の特異性がより優れる点で、有利である。
【0038】
前記（ｃ－３）は、前記配列番号：６で表される塩基配列であることが、増幅効率と反応の特異性がより優れる点で、好ましい。
【0039】
前記（ｃ－１）～（ｃ－３）の塩基配列における３’末端の塩基は、フルオロキノロン感受性菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸（Ｓｅｒ）をコードする塩基配列である「ＴＣＣ」における第２塩基の「Ｃ」に対応する。なお、フルオロキノロン耐性菌では、前記８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列が「ＴＴＣ」であり、アミノ酸がＰｈｅとなる。
【0040】
前記（ｃ－１）～（ｃ－３）の塩基配列における３’末端の塩基から５’末端方向の３番目の塩基は、フルオロキノロンに対する感受性の有無に関わらず、「Ｔ」であるが、前記「Ｔ」を異なる塩基に置換することにより、フルオロキノロン耐性淋菌ではＬＡＭＰ反応の進行を阻止することができ、フルオロキノロン感受性淋菌で極めて特異的に増幅するＬＡＭＰ反応系とすることができる。
【0041】
前記（ｉｉｉ）のプライマーの中でも、増幅効率と反応の特異性がより優れる点で、下記配列番号：１０で表される塩基配列からなるプライマー、下記配列番号：１１で表される塩基配列からなるプライマー、下記配列番号：１２で表される塩基配列からなるプライマーが好ましく、下記配列番号：１０で表される塩基配列からなるプライマーがより好ましい。
・ ５’－ＣＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＧＣＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＧＴＣ－３’（配列番号：１０）
・ ５’－ＣＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＧＣＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＣＴＣ－３’（配列番号：１１）
・ ５’－ＣＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＧＣＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＡＴＣ－３’（配列番号：１２）
・ ５’－ＣＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＧＣＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＧＴＣ－３’（配列番号：１０）
・ ５’－ＣＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＧＣＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＣＴＣ－３’（配列番号：１１）
・ ５’－ＣＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＧＣＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＡＴＣ－３’（配列番号：１２）
【0042】
＜（ｉｖ）のプライマー＞
前記（ｉｖ）のプライマー（以下、「ＢＩＰプライマー」と称することがある。）は、下記式（２）で表されるプライマーである。
・ ５’－（Ｄ）－（Ｅ）－（Ｆ）－３’（式（２））
前記（ｉｖ）のプライマー（以下、「ＢＩＰプライマー」と称することがある。）は、下記式（２）で表されるプライマーである。
・ ５’－（Ｄ）－（Ｅ）－（Ｆ）－３’（式（２））
【0043】
前記式（２）中、前記（Ｄ）は前記Ｂ１ｃ領域に該当し、下記配列番号：７で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列を表す。
・ ５’－ＧＴＧＣＴＧＡＴＡＧＡＣＧＧＡＣＡＧＧＧＣ－３’（配列番号：７）
・ ５’－ＧＴＧＣＴＧＡＴＡＧＡＣＧＧＡＣＡＧＧＧＣ－３’（配列番号：７）
【0044】
前記（Ｄ）の塩基配列としては、前記配列番号：７で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記配列同一性が少なくとも８０％の塩基配列が好ましく、前記配列同一性が少なくとも８５％の塩基配列がより好ましく、前記配列同一性が少なくとも９０％の塩基配列が更に好ましく、前記配列同一性が少なくとも９５％の塩基配列が特に好ましい。前記好ましい態様であると、増幅効率と反応の特異性がより優れる点で、有利である。
【0045】
前記式（２）中、前記（Ｅ）は、塩基数０～５０の任意の塩基配列を表す。
【0046】
前記式（２）中、前記（Ｆ）は前記Ｂ２領域に該当し、下記配列番号：８で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列を表す。
・ ５’－ＧＧＴＡＴＡＧＣＧＣＡＴＧＧＣＴＧＣ－３’（配列番号：８）。
・ ５’－ＧＧＴＡＴＡＧＣＧＣＡＴＧＧＣＴＧＣ－３’（配列番号：８）。
【0047】
前記（Ｆ）の塩基配列としては、前記配列番号：８で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記配列同一性が少なくとも８０％の塩基配列が好ましく、前記配列同一性が少なくとも８５％の塩基配列がより好ましく、前記配列同一性が少なくとも９０％の塩基配列が更に好ましく、前記配列同一性が少なくとも９５％の塩基配列が特に好ましい。前記好ましい態様であると、増幅効率と反応の特異性がより優れる点で、有利である。
【0048】
前記（ｉｖ）のプライマーの中でも、増幅効率と反応の特異性がより優れる点で、下記配列番号：１３で表される塩基配列からなるプライマーが好ましい。
・ ５’－ＧＴＧＣＴＧＡＴＡＧＡＣＧＧＡＣＡＧＧＧＣＧＧＴＡＴＡＧＣＧＣＡＴＧＧＣＴＧＣ－３’（配列番号：１３）
・ ５’－ＧＴＧＣＴＧＡＴＡＧＡＣＧＧＡＣＡＧＧＧＣＧＧＴＡＴＡＧＣＧＣＡＴＧＧＣＴＧＣ－３’（配列番号：１３）
【0049】
＜その他の構成＞
前記その他の構成としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＬＦプライマー、ＬＢプライマーなどが挙げられる。
前記その他の構成としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＬＦプライマー、ＬＢプライマーなどが挙げられる。
【0050】
上記した各プライマーの製造方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、一般的なＤＮＡ合成機で合成する方法などが挙げられる。
【0051】
前記プライマーセットにおける各プライマーの量比としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【0052】
本発明の変異検出用プライマーセットによれば、淋菌に高い特異性を有し、迅速かつ簡易的に淋菌を検出し、淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を、ＬＡＭＰ法により検出することができる。
【0053】
（淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を検出する方法）
本発明の淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を検出する方法（以下、「変異検出方法」と称することがある。）は、増幅反応工程と、評価工程とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
本発明の淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を検出する方法（以下、「変異検出方法」と称することがある。）は、増幅反応工程と、評価工程とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【0054】
＜増幅反応工程＞
前記増幅反応工程は、上記した本発明の変異検出用プライマーセットを用いて、試料中の核酸を鋳型として、ＬＡＭＰ法によってＤＮＡの増幅反応を行う工程である。
前記増幅反応工程は、上記した本発明の変異検出用プライマーセットを用いて、試料中の核酸を鋳型として、ＬＡＭＰ法によってＤＮＡの増幅反応を行う工程である。
【0055】
－試料－
前記試料としては、鋳型となる核酸を含有する試料であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、尿、尿道分泌物、膣分泌物等の泌尿器又は生殖器由来の検体などが挙げられる。また、前記検体を熱処理したものや、前記検体から抽出した核酸を試料としてもよい。
前記核酸を抽出する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
前記試料としては、鋳型となる核酸を含有する試料であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、尿、尿道分泌物、膣分泌物等の泌尿器又は生殖器由来の検体などが挙げられる。また、前記検体を熱処理したものや、前記検体から抽出した核酸を試料としてもよい。
前記核酸を抽出する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
【0056】
－増幅反応－
前記増幅反応は、前記試料、前記プライマーセット、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、基質であるｄＮＴＰ等を含む反応液を等温でインキュベートし、実施することができる。
前記増幅反応は、前記試料、前記プライマーセット、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、基質であるｄＮＴＰ等を含む反応液を等温でインキュベートし、実施することができる。
【0057】
前記増幅反応の反応液に含まれる成分及びその組成としては、特に制限はなく、公知のＬＡＭＰ反応に用いられる成分を適宜選択して用いることができる。前記反応液の調製には、市販のキットを使用してもよい。
【0058】
前記増幅反応の温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、６０℃～６５℃などが挙げられる。これらの中でも、増幅効率が優れる点で、６４℃が好ましい。
【0059】
前記増幅反応の時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１５分間～６０分間が好ましく、３０分間～６０分間がより好ましい。前記好ましい範囲内であると、非特異反応の出現を低減することができる点で、有利である。
【0060】
＜評価工程＞
前記評価工程は、前記増幅反応工程において、増幅産物が得られた場合は、淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異が無く、増幅産物が得られなかった場合は、淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異が有ると評価する工程である。
前記評価工程は、前記増幅反応工程において、増幅産物が得られた場合は、淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異が無く、増幅産物が得られなかった場合は、淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異が有ると評価する工程である。
【0061】
－増幅産物－
前記増幅反応工程において、増幅産物が得られたか否かを判断する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、反応後の反応液を肉眼で観察し、反応液の白濁が確認された場合に増幅産物が得られたと判断する方法、反応後の反応液の濁度を測定し、濁度（吸光度）が上がった場合に増幅産物が得られたと判断する方法、反応液にＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ等の蛍光インターカレーターを加え、ＵＶ照射下で核酸の増幅を示す発光が確認された場合に増幅産物が得られたと判断する方法などが挙げられる。
前記増幅反応工程において、増幅産物が得られたか否かを判断する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、反応後の反応液を肉眼で観察し、反応液の白濁が確認された場合に増幅産物が得られたと判断する方法、反応後の反応液の濁度を測定し、濁度（吸光度）が上がった場合に増幅産物が得られたと判断する方法、反応液にＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ等の蛍光インターカレーターを加え、ＵＶ照射下で核酸の増幅を示す発光が確認された場合に増幅産物が得られたと判断する方法などが挙げられる。
【0062】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記試料を調製する試料調製工程などが挙げられる。
前記試料を調製する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記試料を調製する試料調製工程などが挙げられる。
前記試料を調製する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
【0063】
本発明の変異検出方法によれば、淋菌に高い特異性を有し、迅速かつ簡易的に淋菌を検出し、淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を、ＬＡＭＰ法により検出することができる。
【0064】
（ＬＡＭＰ法により、淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を検出するためのキット）
本発明の、ＬＡＭＰ法により、淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を検出するためのキット（以下、「変異検出用キット」と称することがある。）は、上記した本発明の変異検出用プライマーセットを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
本発明の、ＬＡＭＰ法により、淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を検出するためのキット（以下、「変異検出用キット」と称することがある。）は、上記した本発明の変異検出用プライマーセットを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
【0065】
＜変異検出用プライマーセット＞
前記変異検出用プライマーセットは、上記した本発明の変異検出用プライマーセットであり、好ましい態様も同様である。
前記変異検出用プライマーセットは、上記した本発明の変異検出用プライマーセットであり、好ましい態様も同様である。
【0066】
＜その他の構成＞
前記その他の構成としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、基質であるｄＮＴＰ、陰性コントロール、陽性コントロール、ＤＮＡ抽出試薬などが挙げられる。
前記その他の構成としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、基質であるｄＮＴＰ、陰性コントロール、陽性コントロール、ＤＮＡ抽出試薬などが挙げられる。
【0067】
前記ＤＮＡポリメラーゼとしては、特に制限はなく、通常ＬＡＭＰ法で用いられているものを使用することができ、例えば、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。前記鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼとは、鋳型ＤＮＡに相補的なＤＮＡ鎖を合成していく過程で、伸長方向に２本鎖領域があった場合に、その鎖を解離しながら相補鎖合成を継続することができるＤＮＡポリメラーゼである。
【0068】
前記ＤＮＡポリメラーゼの具体例としては、例えば、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ（Ｅｘｏ－）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ・フラグメント、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（Ｅｘｏ－）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｚ－Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。
【0069】
本発明の変異検出用キットによれば、淋菌に高い特異性を有し、迅速かつ簡易的に淋菌を検出し、淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を、ＬＡＭＰ法により検出することができる。
【0070】
（淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価するためのプライマーセット）
本発明の、ＬＡＭＰ法により、淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価するためのプライマーセット（以下、「フルオロキノロン感受性評価用プライマーセット」と称することがある。）は、下記（ｉ）～（ｉｖ）のプライマーを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
本発明の、ＬＡＭＰ法により、淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価するためのプライマーセット（以下、「フルオロキノロン感受性評価用プライマーセット」と称することがある。）は、下記（ｉ）～（ｉｖ）のプライマーを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
【0071】
＜ＬＡＭＰ法＞
前記ＬＡＭＰ法は、上記した本発明の変異検出用プライマーセットの＜ＬＡＭＰ法＞の項目に記載したものと同様である。
前記ＬＡＭＰ法は、上記した本発明の変異検出用プライマーセットの＜ＬＡＭＰ法＞の項目に記載したものと同様である。
【0072】
＜淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無＞
前記淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無は、上記した本発明の変異検出用プライマーセットの＜淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異＞の項目に記載したように、主にＤＮＡジャイレースのサブユニットＡ（ｇｙｒＡ）をコードする遺伝子における８３番目のアミノ酸（Ｓｅｒ）をコードする塩基配列（ＴＣＣ）及び８７番目のアミノ酸（Ａｓｐ）をコードする塩基配列（ＧＡＣ）のミスセンス変異により生じることが報告されており、国内分離株のほぼ全ては、８３番目のアミノ酸（Ｓｅｒ）をコードする塩基配列（ＴＣＣ）における遺伝子変異（一塩基変異）により生じる（Ｓｅｒ（ＴＣＣ）→Ｐｈｅ（ＴＴＣ））。
前記淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無は、上記した本発明の変異検出用プライマーセットの＜淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異＞の項目に記載したように、主にＤＮＡジャイレースのサブユニットＡ（ｇｙｒＡ）をコードする遺伝子における８３番目のアミノ酸（Ｓｅｒ）をコードする塩基配列（ＴＣＣ）及び８７番目のアミノ酸（Ａｓｐ）をコードする塩基配列（ＧＡＣ）のミスセンス変異により生じることが報告されており、国内分離株のほぼ全ては、８３番目のアミノ酸（Ｓｅｒ）をコードする塩基配列（ＴＣＣ）における遺伝子変異（一塩基変異）により生じる（Ｓｅｒ（ＴＣＣ）→Ｐｈｅ（ＴＴＣ））。
【0073】
前記フルオロキノロン（「フルオロキノロン系薬剤」と称することもある。）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、シプロフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、レボフロキサシン、モキシフロキサシンなどが挙げられる。
【0074】
本明細書において、「淋菌がフルオロキノロンに対して感受性を有する」とは、フルオロキノロンによる殺菌作用（有効性）が認められることをいい、「淋菌がフルオロキノロンに対して感受性を有さない（耐性を有する）」とは、フルオロキノロンによる殺菌作用が認められないことをいう。
【0075】
＜（ｉ）のプライマー＞
前記（ｉ）のプライマーは、上記した本発明の変異検出用プライマーセットの＜（ｉ）のプライマー＞の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
前記（ｉ）のプライマーは、上記した本発明の変異検出用プライマーセットの＜（ｉ）のプライマー＞の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
【0076】
＜（ｉｉ）のプライマー＞
前記（ｉｉ）のプライマーは、上記した本発明の変異検出用プライマーセットの＜（ｉｉ）のプライマー＞の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
前記（ｉｉ）のプライマーは、上記した本発明の変異検出用プライマーセットの＜（ｉｉ）のプライマー＞の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
【0077】
＜（ｉｉｉ）のプライマー＞
前記（ｉｉｉ）のプライマーは、上記した本発明の変異検出用プライマーセットの＜（ｉｉｉ）のプライマー＞の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
前記（ｉｉｉ）のプライマーは、上記した本発明の変異検出用プライマーセットの＜（ｉｉｉ）のプライマー＞の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
【0078】
＜（ｉｖ）のプライマー＞
前記（ｉｖ）のプライマーは、上記した本発明の変異検出用プライマーセットの＜（ｉｖ）のプライマー＞の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
前記（ｉｖ）のプライマーは、上記した本発明の変異検出用プライマーセットの＜（ｉｖ）のプライマー＞の項目に記載したものと同様であり、好ましい態様も同様である。
【0079】
＜その他の構成＞
前記その他の構成としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した本発明の変異検出用プライマーセットの＜その他の構成＞の項目に記載したものと同様のものなどが挙げられる。
前記その他の構成としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した本発明の変異検出用プライマーセットの＜その他の構成＞の項目に記載したものと同様のものなどが挙げられる。
【0080】
上記した各プライマーの製造方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、一般的なＤＮＡ合成機で合成する方法などが挙げられる。
【0081】
前記プライマーセットにおける各プライマーの量比としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【0082】
本発明のフルオロキノロン感受性評価用プライマーセットによれば、淋菌に高い特異性を有し、迅速かつ簡易的に淋菌を検出し、淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を、ＬＡＭＰ法により判定することができる。
【0083】
（淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価する方法）
本発明の淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価する方法（以下、「フルオロキノロン感受性評価方法」と称することがある。）は、増幅反応工程と、評価工程とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
本発明の淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価する方法（以下、「フルオロキノロン感受性評価方法」と称することがある。）は、増幅反応工程と、評価工程とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【0084】
＜増幅反応工程＞
前記増幅反応工程は、上記した本発明のフルオロキノロン感受性評価用プライマーセットを用いて、試料中の核酸を鋳型として、ＬＡＭＰ法によってＤＮＡの増幅反応を行う工程であり、上記した本発明の変異検出方法の＜増幅反応工程＞の項目に記載したものと同様にして行うことができ、好ましい態様も同様である。
前記増幅反応工程は、上記した本発明のフルオロキノロン感受性評価用プライマーセットを用いて、試料中の核酸を鋳型として、ＬＡＭＰ法によってＤＮＡの増幅反応を行う工程であり、上記した本発明の変異検出方法の＜増幅反応工程＞の項目に記載したものと同様にして行うことができ、好ましい態様も同様である。
【0085】
＜評価工程＞
前記評価工程は、前記増幅反応工程において、増幅産物が得られた場合は、淋菌がフルオロキノロンに対する感受性を有し、増幅産物が得られなかった場合は、淋菌がフルオロキノロンに対する感受性を有さない（耐性を有する）と評価する工程である。
前記評価工程は、前記増幅反応工程において、増幅産物が得られた場合は、淋菌がフルオロキノロンに対する感受性を有し、増幅産物が得られなかった場合は、淋菌がフルオロキノロンに対する感受性を有さない（耐性を有する）と評価する工程である。
【0086】
－増幅産物－
前記増幅反応工程において、増幅産物が得られたか否かを判断する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した本発明の変異検出方法の＜増幅反応工程＞の項目に記載したものと同様にして行うことができる。
前記増幅反応工程において、増幅産物が得られたか否かを判断する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した本発明の変異検出方法の＜増幅反応工程＞の項目に記載したものと同様にして行うことができる。
【0087】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した本発明の変異検出方法の＜その他の工程＞の項目に記載したものと同様の工程などが挙げられる。
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した本発明の変異検出方法の＜その他の工程＞の項目に記載したものと同様の工程などが挙げられる。
【0088】
本発明のフルオロキノロン感受性評価方法によれば、淋菌に高い特異性を有し、迅速かつ簡易的に淋菌を検出し、淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を、ＬＡＭＰ法により判定することができる。
【0089】
（ＬＡＭＰ法により、淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価するためのキット）
本発明の、ＬＡＭＰ法により、淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価するためのキット（以下、「フルオロキノロン感受性評価用キット」と称することがある。）は、上記した本発明のフルオロキノロン感受性評価用プライマーセットを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
本発明の、ＬＡＭＰ法により、淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価するためのキット（以下、「フルオロキノロン感受性評価用キット」と称することがある。）は、上記した本発明のフルオロキノロン感受性評価用プライマーセットを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
【0090】
＜フルオロキノロン感受性評価用プライマーセット＞
前記フルオロキノロン感受性評価用プライマーセットは、上記した本発明のフルオロキノロン感受性評価用プライマーセットであり、好ましい態様も同様である。
前記フルオロキノロン感受性評価用プライマーセットは、上記した本発明のフルオロキノロン感受性評価用プライマーセットであり、好ましい態様も同様である。
【0091】
＜その他の構成＞
前記その他の構成としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した本発明の変異検出用キットの＜その他の構成＞の項目に記載したものと同様のものなどが挙げられる。
前記その他の構成としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した本発明の変異検出用キットの＜その他の構成＞の項目に記載したものと同様のものなどが挙げられる。
【0092】
本発明のフルオロキノロン感受性評価用キットによれば、淋菌に高い特異性を有し、迅速かつ簡易的に淋菌を検出し、淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を、ＬＡＭＰ法により判定することができる。
【実施例】
【0093】
以下、試験例を挙げて本発明を説明するが、本発明は、以下の試験例に何ら限定されるものではない。
【0094】
（試験例１：淋菌検出用プライマーの検討）
＜試験例１－１＞
ＮＣＢＩのゲノム・データベースにおける、淋菌のゲノム・データベースのシーケンス情報をもとにプライマーを設計した。具体的には、淋菌に配列特異的であり、フルオロキノロンの耐性化に関連するｇｙｒＡ遺伝子のキノロン耐性決定領域（Ｑｕｉｎｏｌｏｎｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ－Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎｓ ； ＱＲＤＲ）が標的となるように、プライマーを設計した。プライマーの設計には、ＤＮＡジャイレースのサブユニットＡ（ｇｙｒＡ）遺伝子における配列保存領域を明らかにし、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｖ５（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｉｍｅｒｅｘｐｌｏｒｅｒ．ｊｐ）を用いておよそ１２０のプライマーセットの候補を選定した。
＜試験例１－１＞
ＮＣＢＩのゲノム・データベースにおける、淋菌のゲノム・データベースのシーケンス情報をもとにプライマーを設計した。具体的には、淋菌に配列特異的であり、フルオロキノロンの耐性化に関連するｇｙｒＡ遺伝子のキノロン耐性決定領域（Ｑｕｉｎｏｌｏｎｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ－Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎｓ ； ＱＲＤＲ）が標的となるように、プライマーを設計した。プライマーの設計には、ＤＮＡジャイレースのサブユニットＡ（ｇｙｒＡ）遺伝子における配列保存領域を明らかにし、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｖ５（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｉｍｅｒｅｘｐｌｏｒｅｒ．ｊｐ）を用いておよそ１２０のプライマーセットの候補を選定した。
【0095】
前記プライマーセットの候補の中から、最も優れた増幅効率と、反応の特異性を有するプライマーセットを選別するため、以下のようにしてＬＡＭＰ法を行った。
具体的には、Ｆ１ｃ領域及びＢ１ｃ領域の５’末端、並びにＦ２領域及びＢ２領域の３’末端塩基のｄＧ値が最も低い組合せから順にプライマーセットを試作した。
そして、淋菌標準株（国立研究開発法人理化学研究所バイオリソース研究センターより譲渡、株名：Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（Ｚｏｐｆ １８８５） Ｔｒｅｖｉｓａｎ １８８５、菌株番号 ＪＣＭ ｎｏ． ２８８５）から、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて抽出したＤＮＡを鋳型ＤＮＡに用い、ＬＡＭＰ反応によるＤＮＡの検出感度が１ｐｇ／μＬ若しくはそれ以上となる組合せのプライマーセットを発見できるまで、候補プライマーセットの試作を継続した。
この際、ＬＡＭＰ反応には「Ｌｏｏｐａｍｐ（登録商標） ＤＮＡ増幅試薬キット」（栄研化学株式会社製）を使用し、前記キットの添付文書にしたがって各プライマー濃度を調整した。反応温度は推奨温度である６５℃とし、増幅産物の有無は濁度測定装置「ＬｏｏｐＡｍｐ ＬＡ－２００」（栄研化学株式会社製）を使用し、反応時間６０分間の観察時間で増幅産物の有無を判定した。
具体的には、Ｆ１ｃ領域及びＢ１ｃ領域の５’末端、並びにＦ２領域及びＢ２領域の３’末端塩基のｄＧ値が最も低い組合せから順にプライマーセットを試作した。
そして、淋菌標準株（国立研究開発法人理化学研究所バイオリソース研究センターより譲渡、株名：Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（Ｚｏｐｆ １８８５） Ｔｒｅｖｉｓａｎ １８８５、菌株番号 ＪＣＭ ｎｏ． ２８８５）から、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて抽出したＤＮＡを鋳型ＤＮＡに用い、ＬＡＭＰ反応によるＤＮＡの検出感度が１ｐｇ／μＬ若しくはそれ以上となる組合せのプライマーセットを発見できるまで、候補プライマーセットの試作を継続した。
この際、ＬＡＭＰ反応には「Ｌｏｏｐａｍｐ（登録商標） ＤＮＡ増幅試薬キット」（栄研化学株式会社製）を使用し、前記キットの添付文書にしたがって各プライマー濃度を調整した。反応温度は推奨温度である６５℃とし、増幅産物の有無は濁度測定装置「ＬｏｏｐＡｍｐ ＬＡ－２００」（栄研化学株式会社製）を使用し、反応時間６０分間の観察時間で増幅産物の有無を判定した。
【0096】
上記の結果、最も優れた増幅効率と、反応の特異性を有するプライマーセットとして、以下のもの（以下、「プライマーセット－１」と称することがある。）が得られた。
＜Ｆ３プライマー＞
５’－ＣＧＧＣＧＡＣＧＴＣＡＴＣＧＧＴＡＡ－３’（配列番号：１）
＜Ｂ３プライマー＞
５’－ＡＧＡＴＴＴＴＣＧＣＣＡＴＧＣＧＧＡＴＴ－３’（配列番号：２）
＜ＦＩＰプライマー＞
５’－ＣＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＧＣＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＴＴＣ－３’（配列番号：９）
配列番号：９中、下線がない部分はＦ１ｃ領域を表し、下線を付した部分はＦ２領域を表す。
＜ＢＩＰプライマー＞
・ ５’－ＧＴＧＣＴＧＡＴＡＧＡＣＧＧＡＣＡＧＧＧＣＧＧＴＡＴＡＧＣＧＣＡＴＧＧＣＴＧＣ－３’（配列番号：１３）
配列番号：１３中、下線がない部分はＢ１ｃ領域を表し、下線を付した部分はＢ２領域を表す。
＜Ｆ３プライマー＞
５’－ＣＧＧＣＧＡＣＧＴＣＡＴＣＧＧＴＡＡ－３’（配列番号：１）
＜Ｂ３プライマー＞
５’－ＡＧＡＴＴＴＴＣＧＣＣＡＴＧＣＧＧＡＴＴ－３’（配列番号：２）
＜ＦＩＰプライマー＞
５’－ＣＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＧＣＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＴＴＣ－３’（配列番号：９）
配列番号：９中、下線がない部分はＦ１ｃ領域を表し、下線を付した部分はＦ２領域を表す。
＜ＢＩＰプライマー＞
・ ５’－ＧＴＧＣＴＧＡＴＡＧＡＣＧＧＡＣＡＧＧＧＣＧＧＴＡＴＡＧＣＧＣＡＴＧＧＣＴＧＣ－３’（配列番号：１３）
配列番号：１３中、下線がない部分はＢ１ｃ領域を表し、下線を付した部分はＢ２領域を表す。
【0097】
また、ＬＡＭＰ反応の至適温度について、上記と同じ鋳型ＤＮＡと、前記プライマーセット－１を用い、ＬＡＭＰ反応時間を６０分間に設定し、様々な反応温度（６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、又は６５℃）による増幅を確認したところ、６４℃で最も高い増幅効率が得られることを確認した。
【0098】
＜試験例１－２＞
フルオロキノロン感受性淋菌（３株、国立感染症研究所より入手。）から、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ （キアゲン社製）を用いてＤＮＡを抽出した。
フルオロキノロン感受性淋菌（３株、国立感染症研究所より入手。）から、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ （キアゲン社製）を用いてＤＮＡを抽出した。
【0099】
前記抽出したＤＮＡを１ｎｇ／μＬ、１００ｐｇ／μＬ、１０ｐｇ／μＬ、１ｐｇ／μＬ、１００ｆｇ／μＬ、１０ｆｇ／μＬ、１ｆｇ／μＬまで段階希釈したものを鋳型ＤＮＡとし、プライマーとして前記プライマーセット－１を用いて、以下のようにしてＬＡＭＰ反応を行い、前記プライマーセット－１を用いた場合の検出感度を検証した。
ＬＡＭＰ反応には「Ｌｏｏｐａｍｐ（登録商標） ＤＮＡ増幅試薬キット」（栄研化学株式会社製）を使用し、前記キットの添付文書にしたがって各プライマー濃度を調整した。反応温度は６４℃とし、増幅産物の有無は濁度測定装置「ＬｏｏｐＡｍｐ ＬＡ－２００」（栄研化学株式会社製）を使用し、反応時間６０分間の観察時間で増幅産物の有無を判定した。
ＬＡＭＰ反応には「Ｌｏｏｐａｍｐ（登録商標） ＤＮＡ増幅試薬キット」（栄研化学株式会社製）を使用し、前記キットの添付文書にしたがって各プライマー濃度を調整した。反応温度は６４℃とし、増幅産物の有無は濁度測定装置「ＬｏｏｐＡｍｐ ＬＡ－２００」（栄研化学株式会社製）を使用し、反応時間６０分間の観察時間で増幅産物の有無を判定した。
【0100】
結果を図１Ａに示す。図１Ａ中、「●」は鋳型ＤＮＡの量が１ｎｇ／反応の場合、「▲」は鋳型ＤＮＡの量が１００ｐｇ／反応の場合、「■」は鋳型ＤＮＡの量が１０ｐｇ／反応の場合、「◆」は鋳型ＤＮＡの量が１ｐｇ／反応の場合、「○」は鋳型ＤＮＡの量が１００ｆｇ／反応の場合、「△」は鋳型ＤＮＡの量が１０ｆｇ／反応の場合、「□」は鋳型ＤＮＡの量が１ｆｇ／反応の場合、「×」はネガティブコントロール（鋳型ＤＮＡなし）の場合の結果を示す。
図１Ａの結果から、前記プライマーセット－１を用いた場合には、淋菌ＤＮＡの量が１ｐｇまでの場合に検出が可能であることが確認できた。
図１Ａの結果から、前記プライマーセット－１を用いた場合には、淋菌ＤＮＡの量が１ｐｇまでの場合に検出が可能であることが確認できた。
【0101】
＜試験例１－３＞
前記プライマーセット－１の＜ＦＩＰプライマー＞の塩基配列は、上述したように、下記配列番号：９で表されるものである。下記配列番号：９で表される塩基配列の３’末端（伸長末端）の「Ｃ」は、淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸であるＳｅｒをコードする塩基配列（ＴＣＣ）の第２塩基に一致する。
前記第２塩基の「Ｃ」は、多くのフルオロキノロン耐性菌において、「Ｔ」に置換されることが知られている。なお、「Ｔ」に置換された場合（ＴＴＣ）には、アミノ酸がＳｅｒからＰｈｅに変わる。
この場合、フルオロキノロン耐性菌の塩基配列と、下記配列番号：９で表されるＦＩＰプライマーの塩基配列とがミスマッチとなり、ＬＡＭＰ法において、フルオロキノロン耐性菌での増幅効率の低下が懸念される。
５’－ＣＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＧＣＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＴＴＣ－３’（配列番号：９）
前記プライマーセット－１の＜ＦＩＰプライマー＞の塩基配列は、上述したように、下記配列番号：９で表されるものである。下記配列番号：９で表される塩基配列の３’末端（伸長末端）の「Ｃ」は、淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸であるＳｅｒをコードする塩基配列（ＴＣＣ）の第２塩基に一致する。
前記第２塩基の「Ｃ」は、多くのフルオロキノロン耐性菌において、「Ｔ」に置換されることが知られている。なお、「Ｔ」に置換された場合（ＴＴＣ）には、アミノ酸がＳｅｒからＰｈｅに変わる。
この場合、フルオロキノロン耐性菌の塩基配列と、下記配列番号：９で表されるＦＩＰプライマーの塩基配列とがミスマッチとなり、ＬＡＭＰ法において、フルオロキノロン耐性菌での増幅効率の低下が懸念される。
５’－ＣＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＧＣＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＴＴＣ－３’（配列番号：９）
【0102】
そこで、前記第２塩基の「Ｃ」が「Ｔ」に置換されたフルオロキノロン耐性淋菌（３株、国立感染症研究所より入手。）から抽出したＤＮＡを鋳型とした以外は、前記＜試験例１－２＞と同様にして、ＬＡＭＰ法を行った。
【0103】
結果を図１Ｂに示す。図１Ｂ中、「●」は鋳型ＤＮＡの量が１ｎｇ／反応の場合、「▲」は鋳型ＤＮＡの量が１００ｐｇ／反応の場合、「■」は鋳型ＤＮＡの量が１０ｐｇ／反応の場合、「◆」は鋳型ＤＮＡの量が１ｐｇ／反応の場合、「○」は鋳型ＤＮＡの量が１００ｆｇ／反応の場合、「△」は鋳型ＤＮＡの量が１０ｆｇ／反応の場合、「□」は鋳型ＤＮＡの量が１ｆｇ／反応の場合、「×」はネガティブコントロール（鋳型ＤＮＡなし）の場合の結果を示す。
図１Ｂの結果から、前記ＦＩＰプライマーの伸長末端の塩基が異なる（即ち、フルオロキノロン耐性変異が生じている）ことにより、各鋳型ＤＮＡ濃度において増幅効率が若干低下するものの、フルオロキノロン感受性淋菌と同様に淋菌ＤＮＡの量が１ｐｇまでの場合に検出が可能であることが確認できた。つまり、前記プライマーセット－１を用いることで、フルオロキノロン感受性に関係なく、淋菌ＤＮＡの量が１ｐｇまでの場合に検出が可能であることを確認した。
図１Ｂの結果から、前記ＦＩＰプライマーの伸長末端の塩基が異なる（即ち、フルオロキノロン耐性変異が生じている）ことにより、各鋳型ＤＮＡ濃度において増幅効率が若干低下するものの、フルオロキノロン感受性淋菌と同様に淋菌ＤＮＡの量が１ｐｇまでの場合に検出が可能であることが確認できた。つまり、前記プライマーセット－１を用いることで、フルオロキノロン感受性に関係なく、淋菌ＤＮＡの量が１ｐｇまでの場合に検出が可能であることを確認した。
【0104】
（試験例２：フルオロキノロン耐性淋菌検出用プライマーの検討）
前記試験例１の結果から、ＦＩＰプライマーの伸長末端での配列特異性は決して高くはないといえる。一方、ＦＩＰプライマーの配列の特異性を顕著に向上できれば、前記ＦＩＰプライマーの伸長末端の塩基と異なる場合（即ち、フルオロキノロン耐性菌の場合）には、ＬＡＭＰ反応が阻止され増幅産物が生じず、淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無や、淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価する方法として活用できるのではないかと考えられた。
前記試験例１の結果から、ＦＩＰプライマーの伸長末端での配列特異性は決して高くはないといえる。一方、ＦＩＰプライマーの配列の特異性を顕著に向上できれば、前記ＦＩＰプライマーの伸長末端の塩基と異なる場合（即ち、フルオロキノロン耐性菌の場合）には、ＬＡＭＰ反応が阻止され増幅産物が生じず、淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無や、淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価する方法として活用できるのではないかと考えられた。
【0105】
＜試験例２－１＞
前記プライマーセット－１におけるＦＩＰプライマーの３’末端から５’末端方向における３番目の塩基「Ｔ」に対して人為的にミスマッチ塩基を導入した以下の３種類のＦＩＰプライマーを作製し、ＬＡＭＰ法による増幅の特異性が向上するか否かを検証した。
・ ５’－ＣＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＧＣＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＧＴＣ－３’（配列番号：１０）
・ ５’－ＣＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＧＣＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＣＴＣ－３’（配列番号：１１）
・ ５’－ＣＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＧＣＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＡＴＣ－３’（配列番号：１２）
配列番号：１０～１２中の下線を付した塩基は、前記ミスマッチ塩基を表す。
前記プライマーセット－１におけるＦＩＰプライマーの３’末端から５’末端方向における３番目の塩基「Ｔ」に対して人為的にミスマッチ塩基を導入した以下の３種類のＦＩＰプライマーを作製し、ＬＡＭＰ法による増幅の特異性が向上するか否かを検証した。
・ ５’－ＣＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＧＣＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＧＴＣ－３’（配列番号：１０）
・ ５’－ＣＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＧＣＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＣＴＣ－３’（配列番号：１１）
・ ５’－ＣＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＧＣＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＡＴＣ－３’（配列番号：１２）
配列番号：１０～１２中の下線を付した塩基は、前記ミスマッチ塩基を表す。
【0106】
＜試験例１－２＞又は＜試験例１－３＞と同様にして、フルオロキノロン感受性淋菌又はフルオロキノロン耐性淋菌からＤＮＡを抽出した。前記抽出したＤＮＡを１ｎｇ／μＬ、１００ｐｇ／μＬ、１０ｐｇ／μＬ、１ｐｇ／μＬまで段階希釈したものを鋳型ＤＮＡとした。
プライマーセットとして、前記プライマーセット－１におけるＦＩＰプライマーを前記配列番号：１０～１２のいずれかに変更したものを用いた。
上記した鋳型ＤＮＡ及びプライマーセットを用い、ＬＡＭＰ反応の時間を９０分間とした以外は、前記＜試験例１－２＞と同様にして、ＬＡＭＰ法を行った。
プライマーセットとして、前記プライマーセット－１におけるＦＩＰプライマーを前記配列番号：１０～１２のいずれかに変更したものを用いた。
上記した鋳型ＤＮＡ及びプライマーセットを用い、ＬＡＭＰ反応の時間を９０分間とした以外は、前記＜試験例１－２＞と同様にして、ＬＡＭＰ法を行った。
【0107】
結果を図２Ａ～２Ｆに示す。ＦＩＰプライマーとして、前記配列番号：１０で表される塩基配列のプライマー（塩基置換：Ｔ→Ｇ）を用いた結果を図２Ａ（感受性菌）及び図２Ｂ（耐性菌）に、前記配列番号：１１で表される塩基配列のプライマー（塩基置換：Ｔ→Ｃ）を用いた結果を図２Ｃ（感受性菌）及び図２Ｄ（耐性菌）に、前記配列番号：１２で表される塩基配列のプライマー（塩基置換：Ｔ→Ａ）を用いた結果を図２Ｅ（感受性菌）及び図２Ｆ（耐性菌）に示す。また、図２Ａ～２Ｆ中、「●」は鋳型ＤＮＡの量が１ｎｇ／反応の場合、「▲」は鋳型ＤＮＡの量が１００ｐｇ／反応の場合、「■」は鋳型ＤＮＡの量が１０ｐｇ／反応の場合、「◆」は鋳型ＤＮＡの量が１ｐｇ／反応の場合、「×」はネガティブコントロール（鋳型ＤＮＡなし）の場合の結果を示す。
【0108】
図２Ａ～２Ｆの結果から、ＦＩＰプライマーの３’末端の塩基の２塩基上流の塩基「Ｔ」を他の塩基に置換することで、前記３’末端の塩基に変異を有するフルオロキノロン耐性淋菌のＤＮＡでは、ＬＡＭＰ反応が顕著に阻害されることを確認した。更に、ＦＩＰプライマーの３’末端の塩基の２塩基上流の塩基「Ｔ」を「Ｇ」に置換した場合（配列番号：１０で表される塩基配列）に、最も効果的にＬＡＭＰ反応が抑制され、ＦＩＰプライマーの末端特異性を向上させる効果が強いことを明らかにした。
したがって、ＦＩＰプライマーの３’末端の塩基の２塩基上流の塩基「Ｔ」を他の塩基に置換することで、ＬＡＭＰ法による増幅産物の有無により、淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無や、淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価できることが示された。
したがって、ＦＩＰプライマーの３’末端の塩基の２塩基上流の塩基「Ｔ」を他の塩基に置換することで、ＬＡＭＰ法による増幅産物の有無により、淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無や、淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価できることが示された。
【0109】
以上の結果をふまえ、前記プライマーセット－１におけるＦＩＰプライマーを前記配列番号：１０で表される塩基配列のＦＩＰプライマー（ＦＩＰプライマーの３’末端の塩基から２塩基上流の塩基「Ｔ」を、人為的に「Ｇ」に置換したもの）に代えたものを「プライマーセット－２」とし、以下の更なる検証を行った。
【0110】
＜試験例２－２＞
前記プライマーセット－２を用いた場合のＬＡＭＰ反応の検証を以下のようにして実施した。
前記プライマーセット－２を用いた場合のＬＡＭＰ反応の検証を以下のようにして実施した。
【0111】
＜試験例１－２＞又は＜試験例１－３＞と同様にして、フルオロキノロン感受性淋菌又はフルオロキノロン耐性淋菌からＤＮＡを抽出した。前記抽出したＤＮＡを１ｎｇ／μＬ、１００ｐｇ／μＬ、１０ｐｇ／μＬ、１ｐｇ／μＬ、１００ｆｇ／μＬ、１０ｆｇ／μＬ、１ｆｇ／μＬまで段階希釈したものを鋳型ＤＮＡとした。
プライマーセットとして、前記プライマーセット－２を用いた。
上記した鋳型ＤＮＡ及びプライマーセットを用いた以外は、前記＜試験例１－２＞と同様にして、ＬＡＭＰ法を行った。
プライマーセットとして、前記プライマーセット－２を用いた。
上記した鋳型ＤＮＡ及びプライマーセットを用いた以外は、前記＜試験例１－２＞と同様にして、ＬＡＭＰ法を行った。
【0112】
結果を図２Ｇ～２Ｈに示す。図２Ｇはフルオロキノロン感受性淋菌、図２Ｈはフルオロキノロン耐性淋菌のＤＮＡを鋳型とした場合の結果を示す。図２Ｇ～２Ｈ中、「●」は鋳型ＤＮＡの量が１ｎｇ／反応の場合、「▲」は鋳型ＤＮＡの量が１００ｐｇ／反応の場合、「■」は鋳型ＤＮＡの量が１０ｐｇ／反応の場合、「◆」は鋳型ＤＮＡの量が１ｐｇ／反応の場合、「○」は鋳型ＤＮＡの量が１００ｆｇ／反応の場合、「△」は鋳型ＤＮＡの量が１０ｆｇ／反応の場合、「□」は鋳型ＤＮＡの量が１ｆｇ／反応の場合、「×」はネガティブコントロール（鋳型ＤＮＡなし）の場合の結果を示す。
【0113】
図２Ｇ～２Ｈの結果から、フルオロキノロン感受性淋菌のＤＮＡを鋳型とした場合には、淋菌ＤＮＡの量が１ｐｇまでの場合に検出できており、前記プライマーセット－１を用いた場合の検出感度と同様であった。一方、フルオロキノロン耐性淋菌のＤＮＡを鋳型とした場合には、ＬＡＭＰ反応が顕著に抑制され、６０分間の反応時間では、まったく増幅がみられなかった。
以上の結果からも、ＦＩＰプライマーの３’末端の塩基の２塩基上流の塩基「Ｔ」を置換することで、ＬＡＭＰ法による増幅産物の有無により、淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無や、淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価できることが示された。
以上の結果からも、ＦＩＰプライマーの３’末端の塩基の２塩基上流の塩基「Ｔ」を置換することで、ＬＡＭＰ法による増幅産物の有無により、淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無や、淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価できることが示された。
【0114】
＜試験例２－３＞
前記ＦＩＰプライマーの末端特異性の向上に、前記ＦＩＰプライマーの３’末端側の配列構造が寄与していることを明らかにするため、ＦＩＰプライマーの構成要素中のＦ２領域の５’末端側の塩基に変異（欠失）を導入した場合に、反応特異性がどのように影響を受けるのかを以下のようにして検証した。
前記ＦＩＰプライマーの末端特異性の向上に、前記ＦＩＰプライマーの３’末端側の配列構造が寄与していることを明らかにするため、ＦＩＰプライマーの構成要素中のＦ２領域の５’末端側の塩基に変異（欠失）を導入した場合に、反応特異性がどのように影響を受けるのかを以下のようにして検証した。
【0115】
ＦＩＰプライマーの構成要素中のＦ２領域の５’末端側の塩基に変異（欠失）を導入したＦＩＰプライマーを２種類作製した。配列番号：１０で表される塩基配列のＦＩＰプライマーと併せて以下に示す。
・ ５’－ＣＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＧＣＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＧＴＣ－３’（配列番号：１０）
・ ５’－ＣＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＧＣＣＡＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＧＴＣ－３’（配列番号：１４）
・ ５’－ＣＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＧＣＣＡＣＣＡＣＧＧＣＧＡＧＴＣ－３’（配列番号：１５）
配列番号：１０、１４、及び１５中、下線を付した部分は、Ｆ２領域を示す。配列番号：１０で表される塩基配列と比較して、配列番号：１４で表される塩基配列では、Ｆ２領域の５’末端側の塩基が２塩基欠失しており、配列番号：１５で表される塩基配列では、Ｆ２領域の５’末端側の塩基が４塩基欠失している。
・ ５’－ＣＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＧＣＣＡＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＧＴＣ－３’（配列番号：１０）
・ ５’－ＣＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＧＣＣＡＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＧＴＣ－３’（配列番号：１４）
・ ５’－ＣＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＧＣＣＡＣＣＡＣＧＧＣＧＡＧＴＣ－３’（配列番号：１５）
配列番号：１０、１４、及び１５中、下線を付した部分は、Ｆ２領域を示す。配列番号：１０で表される塩基配列と比較して、配列番号：１４で表される塩基配列では、Ｆ２領域の５’末端側の塩基が２塩基欠失しており、配列番号：１５で表される塩基配列では、Ｆ２領域の５’末端側の塩基が４塩基欠失している。
【0116】
＜試験例１－２＞又は＜試験例１－３＞と同様にして、フルオロキノロン感受性淋菌又はフルオロキノロン耐性淋菌からＤＮＡを抽出した。前記抽出したＤＮＡを１ｎｇ／μＬ、１００ｐｇ／μＬ、１０ｐｇ／μＬ、１ｐｇ／μＬまで段階希釈したものを鋳型ＤＮＡとした。
プライマーセットとして、前記プライマーセット－２、前記プライマーセット－２におけるＦＩＰプライマーを前記配列番号：１４で表される塩基配列のＦＩＰプライマーに代えたプライマーセット（以下、「プライマーセット－２－Ａ」と称することがある。）、又は前記プライマーセット－２におけるＦＩＰプライマーを前記配列番号：１５で表される塩基配列のＦＩＰプライマーに代えたプライマーセット（以下、「プライマーセット－２－Ｂ」と称することがある。）を用いた。
上記した鋳型ＤＮＡ及びプライマーセットを用い、反応時間を６０分間又は９０分間とした以外は、前記＜試験例１－２＞と同様にして、ＬＡＭＰ法を行った。
プライマーセットとして、前記プライマーセット－２、前記プライマーセット－２におけるＦＩＰプライマーを前記配列番号：１４で表される塩基配列のＦＩＰプライマーに代えたプライマーセット（以下、「プライマーセット－２－Ａ」と称することがある。）、又は前記プライマーセット－２におけるＦＩＰプライマーを前記配列番号：１５で表される塩基配列のＦＩＰプライマーに代えたプライマーセット（以下、「プライマーセット－２－Ｂ」と称することがある。）を用いた。
上記した鋳型ＤＮＡ及びプライマーセットを用い、反応時間を６０分間又は９０分間とした以外は、前記＜試験例１－２＞と同様にして、ＬＡＭＰ法を行った。
【0117】
結果を図２Ｉ～２Ｎに示す。図２Ｉ～２Ｋはフルオロキノロン感受性淋菌、図２Ｌ～Ｎはフルオロキノロン耐性淋菌のＤＮＡを鋳型とした場合の結果を示し、図２Ｉ及び２Ｌは「プライマーセット－２」、図２Ｊ及び図２Ｍは「プライマーセット－２－Ａ」、図２Ｋ及び２Ｎは「プライマーセット－２－Ｂ」を使用した場合の結果を示す。図２Ｉ～２Ｎ中、「●」は鋳型ＤＮＡの量が１ｎｇ／反応の場合、「▲」は鋳型ＤＮＡの量が１００ｐｇ／反応の場合、「■」は鋳型ＤＮＡの量が１０ｐｇ／反応の場合、「◆」は鋳型ＤＮＡの量が１ｐｇ／反応の場合の結果を示す。
【0118】
図２Ｉ～２Ｋの結果から、Ｆ２領域の５’末端側に変異が導入されたプライマーを用いた場合でも、ＬＡＭＰ反応が可能であることが確認された。なお、Ｆ２領域の５’末端側の欠失塩基数が多くなるにつれてＬＡＭＰ反応の増幅効率が低下し、フルオロキノロン感受性淋菌に対する検出感度がそれぞれ、１ｐｇ（プライマーセット－２）、１００ｐｇ（プライマーセット－２－Ａ）、１ｎｇ（プライマーセット－２－Ｂ）と低下していた。以上の結果は、前記プライマーセット－２を用いたＬＡＭＰ反応系が、ＱＲＤＲを標的とした様々なＬＡＭＰプライマーセットの候補配列から、理論的に、そして実際の反応性の観察をもとに最大の増幅効率を発揮できる組み合わせを選別したことに由来すると考えられた。
【0119】
図２Ｌ～２Ｎの結果から、Ｆ２領域の５’末端側の配列の変化に関わらず、淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における置換（ＴＣＣ→ＴＴＣ）の存在により、いずれのＦＩＰプライマーを用いた場合でも、ＬＡＭＰ反応において、顕著に増幅が阻害されていることが確認された。
【0120】
以上の結果は、前記プライマーセット－２において鍵となるＦＩＰプライマーの配列構造は、ＦＩＰプライマーの３’末端におけるミスマッチ変異と共に、前記３’末端から５’末端方向における３番目の塩基「Ｔ」に対して導入した置換変異であることを示している。
【0121】
（試験例３：淋菌に特異的であることの検証）
本発明のプライマーセットを用いたＬＡＭＰ反応が淋菌に特異的であることを検証するために、以下に示したヒトへの病原性をもつ細菌から抽出したＤＮＡを鋳型として、ＬＡＭＰ反応性の有無を検証した。
＜細菌＞
以下の各菌はナショナルバイオリソースより譲渡を受けた標準菌株である。カッコ内は、ＪＮＢＰ番号を表す。
・ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（０５２５２）
・ Ｓ． ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（０５３４０）
・ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ（０５６５３）
・ Ｓ． ｐｙｏｇｅｎｅｓ（０５６９８）
・ Ｓ． ａｇａｌａｃｔｉａｅ（０５５２１）
・ Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（０５６８１）
・ Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（０２７７５）
・ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ（０６９３４）
・ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｏｒ ｂａｕｍａｎｉｉ（０１１１２）
・ Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ（０１４４３）
・ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（０２０１９）
・ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（０４２１１）
・ Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ（０４１６６）
・ Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ（０３１０４）
・ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ（０１７５４）
・ Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ（０５４８８）
・ Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆａｒｍｅｒｉ（０１５６８）
・ Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ（０５０５１）
・ Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ（０１９２２）
・ Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ（０２８６０）
・ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ（０３９２５）
・ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（臨床分離株）
・ Ｍ． ｍｉｃｒｏｔｉ（０３８２８）
・ Ｍ． ｋａｎｓａｓｉｉ（０３４６３）
・ Ｍ． ａｖｉｕｍ（０３１７９）
・ Ｍ． ｇｏｒｄｏｎａｅ（０３３２６）
・ Ｍ． ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ（０３３７０）
・ Ｍ． ｍａｒｉｎｕｍ（０３５３７）
・ Ｍ． ｃｈｅｌｏｎａｅ（０３２３１）
・ Ｍ． ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ（０３２８２）
・ Ｍ． ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ（０３６１１）
本発明のプライマーセットを用いたＬＡＭＰ反応が淋菌に特異的であることを検証するために、以下に示したヒトへの病原性をもつ細菌から抽出したＤＮＡを鋳型として、ＬＡＭＰ反応性の有無を検証した。
＜細菌＞
以下の各菌はナショナルバイオリソースより譲渡を受けた標準菌株である。カッコ内は、ＪＮＢＰ番号を表す。
・ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（０５２５２）
・ Ｓ． ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（０５３４０）
・ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ（０５６５３）
・ Ｓ． ｐｙｏｇｅｎｅｓ（０５６９８）
・ Ｓ． ａｇａｌａｃｔｉａｅ（０５５２１）
・ Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（０５６８１）
・ Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（０２７７５）
・ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ（０６９３４）
・ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｏｒ ｂａｕｍａｎｉｉ（０１１１２）
・ Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ（０１４４３）
・ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（０２０１９）
・ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（０４２１１）
・ Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ（０４１６６）
・ Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ（０３１０４）
・ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ（０１７５４）
・ Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ（０５４８８）
・ Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆａｒｍｅｒｉ（０１５６８）
・ Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ（０５０５１）
・ Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ（０１９２２）
・ Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ（０２８６０）
・ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ（０３９２５）
・ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（臨床分離株）
・ Ｍ． ｍｉｃｒｏｔｉ（０３８２８）
・ Ｍ． ｋａｎｓａｓｉｉ（０３４６３）
・ Ｍ． ａｖｉｕｍ（０３１７９）
・ Ｍ． ｇｏｒｄｏｎａｅ（０３３２６）
・ Ｍ． ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ（０３３７０）
・ Ｍ． ｍａｒｉｎｕｍ（０３５３７）
・ Ｍ． ｃｈｅｌｏｎａｅ（０３２３１）
・ Ｍ． ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ（０３２８２）
・ Ｍ． ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ（０３６１１）
【0122】
＜試験例１－２＞又は＜試験例１－３＞と同様にして、上記した各細菌からＤＮＡを抽出した。前記抽出したＤＮＡを１ｎｇ／μＬとしたものを鋳型ＤＮＡとした。
プライマーセットとして、前記プライマーセット－２を用いた。
上記した鋳型ＤＮＡ及びプライマーセットを用いた以外は、前記＜試験例１－２＞と同様にして、ＬＡＭＰ法を行った。
プライマーセットとして、前記プライマーセット－２を用いた。
上記した鋳型ＤＮＡ及びプライマーセットを用いた以外は、前記＜試験例１－２＞と同様にして、ＬＡＭＰ法を行った。
【0123】
その結果、すべての菌株由来のＤＮＡにおいて増幅反応はみられず、交差反応は認めなかった。したがって、本発明のプライマーセットを用いたＬＡＭＰ反応が淋菌に特異的であることが確認された。
【0124】
（試験例４：淋菌の臨床分離株を用いた検証）
本発明のプライマーセットを用いたＬＡＭＰ反応が淋菌の臨床分離株から抽出したＤＮＡでも利用できることを検証するために、国立感染症研究所 細菌第一室において分離され、保管される国内淋菌株（フルオロキノロン感受性菌２０株、フルオロキノロン耐性菌１９株）から抽出したＤＮＡを鋳型として、ＬＡＭＰ反応性の有無を検証した。
本発明のプライマーセットを用いたＬＡＭＰ反応が淋菌の臨床分離株から抽出したＤＮＡでも利用できることを検証するために、国立感染症研究所 細菌第一室において分離され、保管される国内淋菌株（フルオロキノロン感受性菌２０株、フルオロキノロン耐性菌１９株）から抽出したＤＮＡを鋳型として、ＬＡＭＰ反応性の有無を検証した。
【0125】
＜試験例１－２＞又は＜試験例１－３＞と同様にして、各淋菌株からＤＮＡを抽出した。前記抽出したＤＮＡを１ｎｇ／μＬとしたものを鋳型ＤＮＡとした。
プライマーセットとして、前記プライマーセット－２を用いた。
上記した鋳型ＤＮＡ及びプライマーセットを用いた以外は、前記＜試験例１－２＞と同様にして、ＬＡＭＰ法を行った。
プライマーセットとして、前記プライマーセット－２を用いた。
上記した鋳型ＤＮＡ及びプライマーセットを用いた以外は、前記＜試験例１－２＞と同様にして、ＬＡＭＰ法を行った。
【0126】
その結果、すべてのフルオロキノロン感受性菌において増幅反応を認めた一方で、フルオロキノロン耐性菌では、増幅反応がいずれも認められなかった。したがって、本発明のプライマーセットを用いたＬＡＭＰ反応は、臨床分離株にも適用することができ、実用性を有することが確認された。
【0127】
（試験例５：淋菌を検出する既存のＬＡＭＰ法との検出感度の比較）
淋菌を検出する既存のＬＡＭＰ法として、グルタミンシンテターゼ遺伝子（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｇｅｎｅ）におけるオープンリーディングフレーム１（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ １：ＯＲＦ１）を標的とするＬＡＭＰ法が報告されている（Ｅｄｗａｒｄｓ Ｔ， Ｂｕｒｋｅ ＰＡ， Ｓｍａｌｌｅｙ ＨＢ， Ｇｉｌｌｉｅｓ Ｌ， Ｈｏｂｂｓ Ｇ． Ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ｉｎ ｕｒｉｎｅ ｓａｍｐｌｅｓ ａｎｄ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｓｓａｙ ｔｏ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｕｒｅａ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２０１４ Ｊｕｎ；５２（６）：２１６３－５．以下、「参考文献１」と称することがある。）。
そこで、前記＜試験例１－２＞と同様にして抽出したフルオロキノロン感受性菌のＤＮＡを鋳型ＤＮＡとし、本発明のＬＡＭＰ反応系との比較を行った。
淋菌を検出する既存のＬＡＭＰ法として、グルタミンシンテターゼ遺伝子（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｇｅｎｅ）におけるオープンリーディングフレーム１（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ １：ＯＲＦ１）を標的とするＬＡＭＰ法が報告されている（Ｅｄｗａｒｄｓ Ｔ， Ｂｕｒｋｅ ＰＡ， Ｓｍａｌｌｅｙ ＨＢ， Ｇｉｌｌｉｅｓ Ｌ， Ｈｏｂｂｓ Ｇ． Ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ｉｎ ｕｒｉｎｅ ｓａｍｐｌｅｓ ａｎｄ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｓｓａｙ ｔｏ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｕｒｅａ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２０１４ Ｊｕｎ；５２（６）：２１６３－５．以下、「参考文献１」と称することがある。）。
そこで、前記＜試験例１－２＞と同様にして抽出したフルオロキノロン感受性菌のＤＮＡを鋳型ＤＮＡとし、本発明のＬＡＭＰ反応系との比較を行った。
【0128】
鋳型ＤＮＡは、前記抽出したＤＮＡを１ｎｇ／μＬ、１００ｐｇ／μＬ、１０ｐｇ／μＬ、１ｐｇ／μＬまで段階希釈したものを使用した。
前記鋳型ＤＮＡと、前記参考文献１に記載のプライマーセットとを用い、反応温度を前記参考文献１に記載の６３℃とした以外は、前記＜試験例１－２＞と同様にして、ＬＡＭＰ法を行った。
前記鋳型ＤＮＡと、前記参考文献１に記載のプライマーセットとを用い、反応温度を前記参考文献１に記載の６３℃とした以外は、前記＜試験例１－２＞と同様にして、ＬＡＭＰ法を行った。
【0129】
結果を図３に示す。図３中、「●」は鋳型ＤＮＡの量が１ｎｇ／反応の場合、「▲」は鋳型ＤＮＡの量が１００ｐｇ／反応の場合、「■」は鋳型ＤＮＡの量が１０ｐｇ／反応の場合、「◆」は鋳型ＤＮＡの量が１ｐｇ／反応の場合の結果を示す。
【0130】
図３の結果から、本発明のＬＡＭＰ反応系の検出感度は、前記参考文献１に記載のグルタミンシンテターゼ遺伝子におけるＯＲＦ１を標的とするＬＡＭＰ反応より検出感度が優れていることが確認され、本発明の方法の臨床応用の可能性が示唆された。
【0131】
本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
＜１＞ ＬＡＭＰ法により、淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を検出するためのプライマーセットであって、下記（ｉ）～（ｉｖ）のプライマーを含むことを特徴とするプライマーセットである。
（ｉ） 下記配列番号：１で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列からなるプライマー：
・ ５’－ＣＧＧＣＧＡＣＧＴＣＡＴＣＧＧＴＡＡ－３’（配列番号：１）
（ｉｉ） 下記配列番号：２で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列からなるプライマー：
・ ５’－ＡＧＡＴＴＴＴＣＧＣＣＡＴＧＣＧＧＡＴＴ－３’（配列番号：２）
（ｉｉｉ） 下記式（１）で表されるプライマー：
・ ５’－（Ａ）－（Ｂ）－（Ｃ）－３’（式（１））
前記式（１）中、前記（Ａ）は、下記配列番号：３で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列を表し、前記（Ｂ）は、塩基数０～５０の任意の塩基配列を表し、前記（Ｃ）は、（ｃ－１）下記配列番号：４で表される塩基配列における３’末端の塩基と、前記３’末端の塩基から５’末端方向の３番目の塩基を保持し、かつ下記配列番号：４で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列、（ｃ－２）下記配列番号：５で表される塩基配列における３’末端の塩基と、前記３’末端の塩基から５’末端方向の３番目の塩基を保持し、かつ下記配列番号：５で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列、及び（ｃ－３）下記配列番号：６で表される塩基配列における３’末端の塩基と、前記３’末端の塩基から５’末端方向の３番目の塩基を保持し、かつ下記配列番号：６で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列のいずれかを表す。
・ ５’－ＣＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＧＣＣＡ－３’（配列番号：３）
・ ５’－ＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＧＴＣ－３’（配列番号：４）
・ ５’－ＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＣＴＣ－３’（配列番号：５）
・ ５’－ＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＡＴＣ－３’（配列番号：６）
（ｉｖ） 下記式（２）で表されるプライマー：
・ ５’－（Ｄ）－（Ｅ）－（Ｆ）－３’（式（２））
前記式（２）中、前記（Ｄ）は、下記配列番号：７で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列を表し、前記（Ｅ）は、塩基数０～５０の任意の塩基配列を表し、前記（Ｆ）は、下記配列番号：８で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列を表す。
・ ５’－ＧＴＧＣＴＧＡＴＡＧＡＣＧＧＡＣＡＧＧＧＣ－３’（配列番号：７）
・ ５’－ＧＧＴＡＴＡＧＣＧＣＡＴＧＧＣＴＧＣ－３’（配列番号：８）
＜２＞ 前記（ｉｉｉ）の式（１）で表されるプライマーにおける（Ｃ）が、（ｃ－１）前記配列番号：４で表される塩基配列における３’末端の塩基と、前記３’末端の塩基から５’末端方向の３番目の塩基を保持し、かつ前記配列番号：４で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列である前記＜１＞に記載のプライマーセットである。
＜３＞ 前記（ｉｉｉ）の式（１）で表されるプライマーにおける（Ｃ）が、前記配列番号：４で表される塩基配列である前記＜２＞に記載のプライマーセットである。
＜４＞ 淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を検出する方法であって、
前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のプライマーセットを用いて、試料中の核酸を鋳型として、ＬＡＭＰ法によってＤＮＡの増幅反応を行う増幅反応工程と、
前記増幅反応工程において、増幅産物が得られた場合は、淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異が無く、増幅産物が得られなかった場合は、淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異が有ると評価する評価工程とを含むことを特徴とする方法である。
＜５＞ ＬＡＭＰ法により、淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価するためのプライマーセットであって、下記（ｉ）～（ｉｖ）のプライマーを含むことを特徴とするプライマーセットである。
（ｉ） 下記配列番号：１で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列からなるプライマー：
・ ５’－ＣＧＧＣＧＡＣＧＴＣＡＴＣＧＧＴＡＡ－３’（配列番号：１）
（ｉｉ） 下記配列番号：２で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列からなるプライマー：
・ ５’－ＡＧＡＴＴＴＴＣＧＣＣＡＴＧＣＧＧＡＴＴ－３’（配列番号：２）
（ｉｉｉ） 下記式（１）で表されるプライマー：
・ ５’－（Ａ）－（Ｂ）－（Ｃ）－３’（式（１））
前記式（１）中、前記（Ａ）は、下記配列番号：３で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列を表し、前記（Ｂ）は、塩基数０～５０の任意の塩基配列を表し、前記（Ｃ）は、（ｃ－１）下記配列番号：４で表される塩基配列における３’末端の塩基と、前記３’末端の塩基から５’末端方向の３番目の塩基を保持し、かつ下記配列番号：４で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列、（ｃ－２）下記配列番号：５で表される塩基配列における３’末端の塩基と、前記３’末端の塩基から５’末端方向の３番目の塩基を保持し、かつ下記配列番号：５で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列、及び（ｃ－３）下記配列番号：６で表される塩基配列における３’末端の塩基と、前記３’末端の塩基から５’末端方向の３番目の塩基を保持し、かつ下記配列番号：６で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列のいずれかを表す。
・ ５’－ＣＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＧＣＣＡ－３’（配列番号：３）
・ ５’－ＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＧＴＣ－３’（配列番号：４）
・ ５’－ＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＣＴＣ－３’（配列番号：５）
・ ５’－ＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＡＴＣ－３’（配列番号：６）
（ｉｖ） 下記式（２）で表されるプライマー：
・ ５’－（Ｄ）－（Ｅ）－（Ｆ）－３’（式（２））
前記式（２）中、前記（Ｄ）は、下記配列番号：７で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列を表し、前記（Ｅ）は、塩基数０～５０の任意の塩基配列を表し、前記（Ｆ）は、下記配列番号：８で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列を表す。
・ ５’－ＧＴＧＣＴＧＡＴＡＧＡＣＧＧＡＣＡＧＧＧＣ－３’（配列番号：７）
・ ５’－ＧＧＴＡＴＡＧＣＧＣＡＴＧＧＣＴＧＣ－３’（配列番号：８）
＜６＞ 前記（ｉｉｉ）の式（１）で表されるプライマーにおける（Ｃ）が、（ｃ－１）前記配列番号：４で表される塩基配列における３’末端の塩基と、前記３’末端の塩基から５’末端方向の３番目の塩基を保持し、かつ前記配列番号：４で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列である前記＜５＞に記載のプライマーセットである。
＜７＞ 前記（ｉｉｉ）の式（１）で表されるプライマーにおける（Ｃ）が、前記配列番号：４で表される塩基配列である前記＜５＞に記載のプライマーセットである。
＜８＞ 淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価する方法であって、
前記＜５＞から＜７＞のいずれかに記載のプライマーセットを用いて、試料中の核酸を鋳型として、ＬＡＭＰ法によってＤＮＡの増幅反応を行う増幅反応工程と、
前記増幅反応工程において、増幅産物が得られた場合は、淋菌がフルオロキノロンに対する感受性を有し、増幅産物が得られなかった場合は、淋菌がフルオロキノロンに対する感受性を有さないと評価する評価工程とを含むことを特徴とする方法である。
＜９＞ ＬＡＭＰ法により、淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を検出するためのキットであって、
前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のプライマーセットを含むことを特徴とするキットである。
＜１０＞ ＬＡＭＰ法により、淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価するためのキットであって、
前記＜５＞から＜７＞のいずれかに記載のプライマーセットを含むことを特徴とするキットである。
＜１＞ ＬＡＭＰ法により、淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を検出するためのプライマーセットであって、下記（ｉ）～（ｉｖ）のプライマーを含むことを特徴とするプライマーセットである。
（ｉ） 下記配列番号：１で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列からなるプライマー：
・ ５’－ＣＧＧＣＧＡＣＧＴＣＡＴＣＧＧＴＡＡ－３’（配列番号：１）
（ｉｉ） 下記配列番号：２で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列からなるプライマー：
・ ５’－ＡＧＡＴＴＴＴＣＧＣＣＡＴＧＣＧＧＡＴＴ－３’（配列番号：２）
（ｉｉｉ） 下記式（１）で表されるプライマー：
・ ５’－（Ａ）－（Ｂ）－（Ｃ）－３’（式（１））
前記式（１）中、前記（Ａ）は、下記配列番号：３で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列を表し、前記（Ｂ）は、塩基数０～５０の任意の塩基配列を表し、前記（Ｃ）は、（ｃ－１）下記配列番号：４で表される塩基配列における３’末端の塩基と、前記３’末端の塩基から５’末端方向の３番目の塩基を保持し、かつ下記配列番号：４で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列、（ｃ－２）下記配列番号：５で表される塩基配列における３’末端の塩基と、前記３’末端の塩基から５’末端方向の３番目の塩基を保持し、かつ下記配列番号：５で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列、及び（ｃ－３）下記配列番号：６で表される塩基配列における３’末端の塩基と、前記３’末端の塩基から５’末端方向の３番目の塩基を保持し、かつ下記配列番号：６で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列のいずれかを表す。
・ ５’－ＣＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＧＣＣＡ－３’（配列番号：３）
・ ５’－ＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＧＴＣ－３’（配列番号：４）
・ ５’－ＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＣＴＣ－３’（配列番号：５）
・ ５’－ＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＡＴＣ－３’（配列番号：６）
（ｉｖ） 下記式（２）で表されるプライマー：
・ ５’－（Ｄ）－（Ｅ）－（Ｆ）－３’（式（２））
前記式（２）中、前記（Ｄ）は、下記配列番号：７で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列を表し、前記（Ｅ）は、塩基数０～５０の任意の塩基配列を表し、前記（Ｆ）は、下記配列番号：８で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列を表す。
・ ５’－ＧＴＧＣＴＧＡＴＡＧＡＣＧＧＡＣＡＧＧＧＣ－３’（配列番号：７）
・ ５’－ＧＧＴＡＴＡＧＣＧＣＡＴＧＧＣＴＧＣ－３’（配列番号：８）
＜２＞ 前記（ｉｉｉ）の式（１）で表されるプライマーにおける（Ｃ）が、（ｃ－１）前記配列番号：４で表される塩基配列における３’末端の塩基と、前記３’末端の塩基から５’末端方向の３番目の塩基を保持し、かつ前記配列番号：４で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列である前記＜１＞に記載のプライマーセットである。
＜３＞ 前記（ｉｉｉ）の式（１）で表されるプライマーにおける（Ｃ）が、前記配列番号：４で表される塩基配列である前記＜２＞に記載のプライマーセットである。
＜４＞ 淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を検出する方法であって、
前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のプライマーセットを用いて、試料中の核酸を鋳型として、ＬＡＭＰ法によってＤＮＡの増幅反応を行う増幅反応工程と、
前記増幅反応工程において、増幅産物が得られた場合は、淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異が無く、増幅産物が得られなかった場合は、淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異が有ると評価する評価工程とを含むことを特徴とする方法である。
＜５＞ ＬＡＭＰ法により、淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価するためのプライマーセットであって、下記（ｉ）～（ｉｖ）のプライマーを含むことを特徴とするプライマーセットである。
（ｉ） 下記配列番号：１で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列からなるプライマー：
・ ５’－ＣＧＧＣＧＡＣＧＴＣＡＴＣＧＧＴＡＡ－３’（配列番号：１）
（ｉｉ） 下記配列番号：２で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列からなるプライマー：
・ ５’－ＡＧＡＴＴＴＴＣＧＣＣＡＴＧＣＧＧＡＴＴ－３’（配列番号：２）
（ｉｉｉ） 下記式（１）で表されるプライマー：
・ ５’－（Ａ）－（Ｂ）－（Ｃ）－３’（式（１））
前記式（１）中、前記（Ａ）は、下記配列番号：３で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列を表し、前記（Ｂ）は、塩基数０～５０の任意の塩基配列を表し、前記（Ｃ）は、（ｃ－１）下記配列番号：４で表される塩基配列における３’末端の塩基と、前記３’末端の塩基から５’末端方向の３番目の塩基を保持し、かつ下記配列番号：４で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列、（ｃ－２）下記配列番号：５で表される塩基配列における３’末端の塩基と、前記３’末端の塩基から５’末端方向の３番目の塩基を保持し、かつ下記配列番号：５で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列、及び（ｃ－３）下記配列番号：６で表される塩基配列における３’末端の塩基と、前記３’末端の塩基から５’末端方向の３番目の塩基を保持し、かつ下記配列番号：６で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列のいずれかを表す。
・ ５’－ＣＧＣＡＴＡＧＣＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＧＣＣＡ－３’（配列番号：３）
・ ５’－ＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＧＴＣ－３’（配列番号：４）
・ ５’－ＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＣＴＣ－３’（配列番号：５）
・ ５’－ＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＧＡＡＴＣ－３’（配列番号：６）
（ｉｖ） 下記式（２）で表されるプライマー：
・ ５’－（Ｄ）－（Ｅ）－（Ｆ）－３’（式（２））
前記式（２）中、前記（Ｄ）は、下記配列番号：７で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列を表し、前記（Ｅ）は、塩基数０～５０の任意の塩基配列を表し、前記（Ｆ）は、下記配列番号：８で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列を表す。
・ ５’－ＧＴＧＣＴＧＡＴＡＧＡＣＧＧＡＣＡＧＧＧＣ－３’（配列番号：７）
・ ５’－ＧＧＴＡＴＡＧＣＧＣＡＴＧＧＣＴＧＣ－３’（配列番号：８）
＜６＞ 前記（ｉｉｉ）の式（１）で表されるプライマーにおける（Ｃ）が、（ｃ－１）前記配列番号：４で表される塩基配列における３’末端の塩基と、前記３’末端の塩基から５’末端方向の３番目の塩基を保持し、かつ前記配列番号：４で表される塩基配列と少なくとも７５％の配列同一性を有する塩基配列である前記＜５＞に記載のプライマーセットである。
＜７＞ 前記（ｉｉｉ）の式（１）で表されるプライマーにおける（Ｃ）が、前記配列番号：４で表される塩基配列である前記＜５＞に記載のプライマーセットである。
＜８＞ 淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価する方法であって、
前記＜５＞から＜７＞のいずれかに記載のプライマーセットを用いて、試料中の核酸を鋳型として、ＬＡＭＰ法によってＤＮＡの増幅反応を行う増幅反応工程と、
前記増幅反応工程において、増幅産物が得られた場合は、淋菌がフルオロキノロンに対する感受性を有し、増幅産物が得られなかった場合は、淋菌がフルオロキノロンに対する感受性を有さないと評価する評価工程とを含むことを特徴とする方法である。
＜９＞ ＬＡＭＰ法により、淋菌のＤＮＡジャイレースのサブユニットＡの８３番目のアミノ酸をコードする塩基配列における変異の有無を検出するためのキットであって、
前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のプライマーセットを含むことを特徴とするキットである。
＜１０＞ ＬＡＭＰ法により、淋菌のフルオロキノロンに対する感受性の有無を評価するためのキットであって、
前記＜５＞から＜７＞のいずれかに記載のプライマーセットを含むことを特徴とするキットである。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図2G】
【図2H】
【図2I】
【図2J】
【図2K】
【図2L】
【図2M】
【図2N】
【図3】
【配列表】