▶ ザ トラスティーズ オブ ダートマス カレッジの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-11-17
(45)【発行日】2023-11-28
(54)【発明の名称】神経変性疾患及び障害の治療のためのキメラ抗原受容体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20231120BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20231120BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20231120BHJP
C12N 15/86 20060101ALI20231120BHJP
C12N 15/16 20060101ALI20231120BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231120BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20231120BHJP
C07K 14/725 20060101ALI20231120BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20231120BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20231120BHJP
C07K 14/475 20060101ALI20231120BHJP
C12N 15/85 20060101ALI20231120BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20231120BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20231120BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20231120BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20231120BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20231120BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20231120BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20231120BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20231120BHJP
C12P 21/02 20060101ALN20231120BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z ZNA
C12N15/13
C12N15/12
C12N15/86 Z
C12N15/16
C12N5/10
C07K19/00
C07K14/725
C07K16/18
C07K14/47
C07K14/475
C12N15/85 Z
C12N15/867 Z
A61K35/17
A61K35/12
A61P25/00
A61P25/16
A61P25/28
A61P21/00
C12P21/08
C12P21/02 C
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2020542758
(86)(22)【出願日】2019-02-11
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-05-20
(86)【国際出願番号】 US2019017489
(87)【国際公開番号】W WO2019157440
(87)【国際公開日】2019-08-15
【審査請求日】2022-02-09
(31)【優先権主張番号】62/628,632
(32)【優先日】2018-02-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】518363945
【氏名又は名称】ザ トラスティーズ オブ ダートマス カレッジ
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】サントマン、チャールズ
(72)【発明者】
【氏名】グレーバー、デイビッド
(72)【発明者】
【氏名】クック、ジェイムズ、ダブリュー．
【審査官】牧野 晃久
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１７／０５８７５２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１５－５１３３９４（ＪＰ，Ａ）
【文献】Journal of Neuroinflammation，2012年，9，112
【文献】Journal of Neuroinflammation，2014年，11，201
【文献】Translational Research，2017年，187，53-58
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
Ａ６１Ｋ
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
（Ｉ）（ｉ）スーパーオキシドジスムターゼ－１（ＳＯＤ－１）に結合する少なくとも１つのリガンド結合部分、および（ｉｉ）少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、
（ＩＩ）脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）と、
をコードする核酸であって、
場合によっては、
（ｉ）前記少なくとも１つのリガンド結合部分は、抗体または抗原結合抗体断片を含み、
（ｉｉ）前記少なくとも１つのリガンド結合部分は、変異型ＳＯＤ－１、場合によってはＧ９３Ａ変異型ＳＯＤ－１に結合し、かつ／または
（ｉｉｉ）前記核酸は、プラスミド、ウイルス、またはレトロウイルス構築物に含まれる、前記核酸。
【請求項2】
（Ａ）前記ＢＤＮＦは、
（ｉ）場合によっては配列番号２５３の核酸配列でコードされる、配列番号５３のアミノ酸配列を含み、または
（ｉｉ）配列番号５３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ニューロンの成長および／または生存を促進することができ、ならびに／あるいは
（Ｂ）前記ＣＡＲの発現および前記ＢＤＮＦの発現は、
（Ｉ）同一の誘導または構成的プロモーターによって制御され、場合によっては、
（Ｉ－ｉ）前記ＣＡＲおよび前記ＢＤＮＦは、シスでコードされ、任意に、２つの別個の翻訳産物の生成を可能にする配列によって分離され、任意に、前記配列はＩＲＥＳエレメントまたは２Ａペプチドをコードし、さらに任意に、２Ａペプチドは、Ｔ２Ａ（これは、任意に配列番号１４のアミノ酸配列を含み、さらに任意に配列番号２１４の核酸配列によってコードされる）、Ｐ２Ａ（これは、任意に配列番号１５のアミノ酸配列を含み、さらに任意に配列番号２１５の核酸配列によってコードされる）、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａであり；または
（Ｉ－ｉｉ）前記ＣＡＲおよび前記ＢＤＮＦは、双方向性プロモーターの下でコードされる；あるいは
（ＩＩ）異なる誘導または構成的プロモーターによって制御され、場合によっては、
（ＩＩ－ｉ）前記ＣＡＲおよび前記ＢＤＮＦは同じベクターにコードされ、または
（ＩＩ－ｉｉ）前記ＣＡＲおよび前記ＢＤＮＦは別々のベクターにコードされている、請求項１に記載の核酸。
【請求項3】
前記少なくとも１つのリガンド結合部分は、
（Ａ）ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３を含む、重鎖可変領域と、
（Ｂ）ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３を含む、軽鎖可変領域と、を含み、
前記ＣＤＲ－Ｈ１、前記ＣＤＲ－Ｈ２、前記ＣＤＲ－Ｈ３、前記ＣＤＲ－Ｌ１、前記ＣＤＲ－Ｌ２および前記ＣＤＲ－Ｌ３のアミノ酸配列は、（ａ）配列番号５、（ｂ）配列番号６、または（ｃ）配列番号７に含まれる、
抗体または抗原結合抗体断片を含む、請求項１または２に記載の核酸。
【請求項4】
前記少なくとも１つのリガンド結合ドメインは、
（Ａ）ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３を含む、重鎖可変領域と、
（Ｂ）ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３を含む、軽鎖可変領域と、
を含み、
前記ＣＤＲ－Ｈ１、前記ＣＤＲ－Ｈ２、前記ＣＤＲ－Ｈ３、前記ＣＤＲ－Ｌ１、前記ＣＤＲ－Ｌ２および前記ＣＤＲ－Ｌ３のアミノ酸配列は、（ａ）配列番号５、（ｂ）配列番号６、または（ｃ）配列番号７に含まれる、
単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む、請求項１または２に記載の核酸。
【請求項5】
（ａ）前記ｓｃＦｖは、
（ａ－１）場合によっては、配列番号２０５の核酸配列によってコードされる、配列番号５のアミノ酸配列を含むか、または
（ａ－２）配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＳＯＤ－１に結合する、あるいは
（ｂ）前記ｓｃＦｖは、
（ｂ－１）場合によっては、配列番号２０６の核酸配列によってコードされる、配列番号６のアミノ酸配列を含むか、または
（ｂ－２）配列番号６と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＳＯＤ－１に結合する、あるいは
（ｃ）前記ｓｃＦｖは、
（ｃ－１）場合によっては、配列番号２０７の核酸配列によってコードされる、配列番号７のアミノ酸配列を含むか、または
（ｃ－２）は、配列番号７と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＳＯＤ－１に結合する、
請求項４に記載の核酸。
【請求項6】
前記少なくとも１つのシグナル伝達ドメインは、
（Ｉ）
（ｉ）ＣＤ３ζ由来の細胞質シグナル伝達ドメインであって、任意に、
（ｉ－１）場合によっては配列番号２１６の核酸配列によってコードされる、配列番号１６のアミノ酸配列を含むか、または
（ｉ－２）配列番号１６と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｔ細胞活性化に必要な初期シグナルを機能的に伝達することができる、
ＣＤ３ゼータ由来の細胞質シグナル伝達ドメイン、または
（ｉｉ）ＣＤ２８由来の細胞質シグナル伝達ドメイン；あるいは
（ＩＩ）
（ｉ）ＣＤ３ζ由来の細胞質シグナル伝達ドメインであって、任意に、
（ｉ－１）場合によっては配列番号２１６の核酸配列によってコードされる、配列番号１６のアミノ酸配列を含むか、または
（ｉ－２）配列番号１６と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｔ細胞活性化に必要な初期シグナルを機能的に伝達することができる、
ＣＤ３ゼータ由来の細胞質シグナル伝達ドメイン、および
（ｉｉ）ＣＤ２８、ＤＡＰ１０、またはＣＤ４４由来の細胞質シグナル伝達ドメイン、
を含み、任意に、
（Ｉ）前記ＣＡＲは、場合によっては配列番号２３１の核酸配列によってコードされる、配列番号３１のアミノ酸配列を含む、リーダー配列をさらに含み、かつ／または
（ＩＩ）前記ＣＡＲは、前記リガンド結合部分と前記少なくとも１つのシグナル伝達ドメインとの間に膜貫通（ＴＭ）ドメインをさらに含み、
任意に、前記ＴＭドメインがＣＤ２８のＴＭ領域を含み、さらに任意に、前記ＴＭドメインは、
（ｉ）場合によっては配列番号２３６の核酸配列によってコードされる、配列番号３６のアミノ酸配列を含むか、または
（ｉｉ）配列番号３６と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、膜中で熱力学的に安定であり、
任意に、前記ＣＡＲが前記リガンド結合部分と前記ＴＭドメインの間にヒンジをさらに含み、さらに任意に、前記ヒンジがＣＤ２８由来であり、任意に、
（ｉ）任意に配列番号２３２の核酸配列によってコードされる、配列番号３２のアミノ酸配列を含むか、または
（ｉｉ）配列番号３２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、可撓性を付与することができる、
請求項１～５のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項7】
前記少なくとも１つのシグナル伝達ドメインは、請求項６に記載の通りであり、
（ｉ）前記ＣＡＲは、それぞれ、場合によっては、配列番号２２４、２４０、２４１、２４２、または２４３の核酸配列によってコードされる、配列番号２４、４０、４１、４２、または４３のアミノ酸配列を含むか、または
（ｉｉ）前記ＣＡＲは、配列番号２４、４０、４１、４２、または４３と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記少なくとも１つのシグナル伝達ドメインは、細胞活性を調節するために細胞内で情報を伝達することができる、
請求項４または５に記載の核酸。
【請求項8】
（Ｉ）（ｉ）ＳＯＤ－１に結合する少なくとも１つのリガンド結合部分、および（ｉｉ）少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む、ＣＡＲをコードする少なくとも１つの核酸を含み、
（ＩＩ）ＢＤＮＦを発現するように改変されている、
組換え細胞または改変された細胞。
【請求項9】
請求項１～７の何れか１項に記載する核酸を含む、請求項８に記載の組換え細胞または改変された細胞。
【請求項10】
Ｔ調節細胞（Ｔｒｅｇ）を含むか、またはＴｒｅｇエフェクター機能を有する、請求項８または９に記載の組換えまたは改変された細胞であって、
任意に、前記組換え細胞または改変された細胞が、以下の特徴の１つまたは複数を含む、組換えまたは操作された細胞：
（ｉ）ヒト細胞を含む、
（ｉｉ）機能的ＴＣＲを発現しない、
（ｉｉｉ）ＩＬ－１０を発現する、
（ｉｖ）変異型ＳＯＤ－１に応答してＩＬ－１０を産生する、
（ｖ）変異型ＳＯＤ－１に応答して、ＧＩＴＲ、ＰＤ－１および／またはＣＴＬＡ－４のいずれか１つ以上のレベルが上昇する；および／または
（ｖｉ）任意に誘導性プロモーターの制御下で発現される自殺遺伝子を含む。
【請求項11】
（Ｉ）筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含む対象に投与された際に、
（Ａ）ＢＢＢを通過する、
（Ｂ）変異型ＳＯＤ－１を含むＡＬＳの部位で以下の特性の１つ以上を誘発する：
（ｉ）前記対象におけるマクロファージによる活性酸素種の分泌を抑制する、
（ｉｉ）マクロファージの抑制、
（ｉｉｉ）前記対象におけるマクロファージによる炎症性サイトカイン、任意選択でＴＮＦα、の分泌の抑制、
（ｉｖ）ＩＬ－１０をより多く分泌、および
（ｖ）前記対象における炎症または神経変性を抑制、
（Ｃ）前記対象の細胞を過酸化水素毒性から保護する、ならびに／あるいは
（Ｄ）神経変性疾患の進行を遅らせる、
ならびに／あるいは
（ＩＩＩ）神経変性疾患を発症するリスクのある対象者に投与された際に、ＡＬＳの発症を遅らせる、
請求項１０に記載の細胞。
【請求項12】
前記少なくとも１つのリガンド結合部分は、場合により、配列番号２０５の核酸配列によってコードされる、配列番号５のアミノ酸配列を含み、
任意に、前記ＣＡＲは、場合により、それぞれ、配列番号２２４、２４０、２４１、２４２、または２４３の核酸配列によってコードされる、配列番号２４、４０、４１、４２、または４３のアミノ酸配列を含む、
請求項１０または１１に記載の組換え細胞または改変された細胞。
【請求項13】
ＡＬＳの治療に使用するための、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の組換え細胞または改変された細胞を含む、医薬組成物。
【請求項14】
ＡＬＳの治療のための医薬の製造のための、請求項１～７のいずれか１項に記載の核酸、および／または請求項８～１２のいずれか１項に記載の組換え細胞または改変された細胞の使用。
【請求項15】
請求項１０～１２のいずれか１項に記載の１つ以上の組換え細胞または改変された細胞、および薬学的に許容される担体を含む、ＡＬＳの治療に使用するための組成物であって、任意に、
（Ａ）前記組成物は、その中に含まれる前記細胞のＢＢＢを横断する能力を促進する添加剤を含むか、または前記細胞は、前記細胞のＢＢＢを横断する能力を促進する部分添加剤と接着または複合体化されている、かつ／または
（Ｂ）前記組成物は、任意に静脈内注射、頭蓋内注射、および髄腔内注射から選択される注射による投与に適合されている、
組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、２０１８年２月９日に提出された６２／６２８，６３２に優先権を主張し、参照までに、全内容がそのまま盛り込まれている。
助成金
本出願は、２０１８年２月９日に提出された６２／６２８，６３２に優先権を主張し、参照までに、全内容がそのまま盛り込まれている。
助成金
【0002】
本出願は、国立衛生研究所（以下、「ＮＩＨ」）から授与された助成金番号Ｒ２１ ＮＳ１０２５５６に基づく政府の支援を受けて行われた。政府は本発明に対して一定の権利を有する。
シーケンスの開示
シーケンスの開示
【0003】
本出願には、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出されたシーケンスリストが含まれており、参照までに、全内容がそのままここに盛り込まれている。２０１９年２月６日に製造された前記のＡＳＣＩＩコピーは４３２５２ｏ２６１３と名付けられ、サイズは２０３，５２９バイトである。
【0004】
本開示は一般的に、新規のキメラ抗原受容体（以下、「ＣＡＲ」）、そのようなＣＡＲを符号化する核酸、及び神経変性疾患を改変するように操作されたＣＡＲ及び／またはＴｒｅｇを発現するよう改変された調節性Ｔ細胞（以下、「Ｔｒｅｇ」）を含む構成物、例えば、酸化／炎症活動を防止する分子、または神経成長因子または非古典的神経栄養因子などの神経成長／生存を促進する神経変性疾患修飾分子を発現するように工学的に改変されている。また、本開示は概して、そのような改変されたＴｒｅｇを含む組成物、並びに特に神経変性疾患及びそれに関連する症状を治療及び予防するための、そして／または特に遺伝的因子によってリスクを有する人またはそのような神経変性疾患を発症する初期徴候を示す人において、そのような神経変性疾患の発症を遅らせるための治療薬としての、使用方法に関するものである。
【背景技術】
【0005】
一般的に神経変性疾患は、ゆっくりと進行する中枢神経系（ＣＮＳ）のニューロンの喪失によって特徴付けることができ、影響を受けるＣＮＳ領域によって実行される特定の脳機能（例：記憶、運動、認知）の障害をもたらすことがよくある。これらの神経変性疾患には、例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症、ハンチントン病、及び多系統萎縮症が含まれる。神経変性疾患は通常１０年以上に及び、神経変性の実際の発症は臨床症状よりも何年も前に起こる可能性がある。
【0006】
アルツハイマー病（ＡＤ）は進行性の神経変性疾患であり、６０歳以降の記憶障害と認知症の主な原因の１つとなっている。ミクログリアが媒介する神経炎症と異常なタンパク質の凝集体及び原線維の形成と共に、前頭皮質と海馬における神経細胞の機能不全と死が、ＡＤの特徴である。高齢になるとその有病率は上昇し、米国では６５歳以上で臨床ＡＤと共存している人が４５０万人と推定されている。この数は、２０５０年までに１，３００万人以上、さらには世界で１億３千万人以上に達すると予測されている（Ｈｅｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ （２０１０－２０５０） ｅｓｔｉｍａｔｅｄ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ２０１０ ｃｅｎｓｕｓ． Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２０１３， ８０：１７７８－８３）
【0007】
散発性及び家族性のＡＤの形態は、細胞外アミロイドベータ（Ａβ）ペプチドの過剰産生及び／またはクリアランスの低下、並びにねじれたタウタンパク質繊維のニューロン内のもつれを有する。早期発症型ＡＤの遺伝性常染色体優性の遺伝的基盤には、Ａβ産生、凝集、またはクリアランスを変化させる遺伝子の変異を伴う。これらの遺伝子には、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、プレセニリン－１（ＰＳ１）、及びプレセニリン－２（ＰＳ２）が含まれる。Ａβペプチドは自己オリゴマー化して小さな凝集体となり、びまん性プラークに発展する場合がある。Ａβを単量体、オリゴマー形態、プラーク形態で結合する複数の抗体が製造されている（Ｍｏｎｔｏｌｉ－Ｇａｙａ Ｌ， Ｖｉｌｌｅｇａｓ Ｓ： Ａβ－Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ： ａ ｗｉｄｅ ｒａｎｇｅ ｏｆ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｆｏｒ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ ｄｅｓｅａｓｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ． Ｅｘｐｅｒｔ ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１６， １８：ｅ１３）。神経炎症はＡＤで発生することが知られており、Ａβプラークの近くに関連する場合、より大きな神経変性がある（Ｈｅｎｅｋａ ＭＴ， ｅｔ ａｌ．： Ｎｅｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２０１５， １４：３８８－４０５； Ｋｒｅｉｓｌ ＷＣ， ｅｔ ａｌ： Ｄｉｓｔｉｎｃｔ Ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｃｏｒｔｉｃａｌ ａｔｒｏｐｈｙ ａｎｄ ａｍｎｅｓｔｉｃ Ａｌｘｈｅｉｍｅｒ'ｓ ｄｅａｓｅｓ． Ｎｅｕｒｏｂｉａｌ． Ａｇｉｎｇ ２０１７， ５１：１３２－４０）。炎症性ミクログリア（中枢神経系の常駐マクロファージ）が神経変性や認知機能の低下に関与していることを示唆するデータがある（Ｋｒｅｉｓｌ ＷＣ ｅｔ ａｌ．： Ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔｒａｎｌｏｃａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｃｏｒｔｉｃａｌ ａｔｒｏｐｈｙ ａｎｄ ａｍｎｅｓｔｉｃ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ａｇｉｎｇ ２０１７， ５１： １３２－４０； Ｐａｏｌｉｃｅｌｌｉ ＲＣ， ｅｔ ａｌ．： ＴＤＰ４３－ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｇｌｉａ Ｐｒｏｍｏｔｅｓ Ａｍｙｌｏｉｄ Ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｂｕｔ Ａｌｓｏ Ｉｎｄｕｃｅｓ Ｓｙｎａｐｓｅ Ｌｏｓｓ． Ｎｅｕｒｏｎ ２０１７， ９５：２９７，３０８．ｅ６）。
【0008】
パーキンソン病の人は世界中に約７５０万人おり、罹患率は年齢が上がるにつれて次第に増加する（Ｈｅｂｅｒｔ ＬＥ ｅｔ ａｌ： Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ （２０１０－２０５０） ｅｓｔｉｍａｔｅｄ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ２０１０ ｃｅｎｓｕｓ． Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２０１３， ８０：１７７８－８３）。２０３０年までにＰＤと共存する人が９００万人になると予想されている。この神経変性疾患の臨床症状は、安静時の振戦、筋肉の硬直、動きの鈍さ、姿勢の不安定などがある。これらの障害は、中脳の黒質緻密部におけるドーパミン産生ニューロンの慢性死によって引き起こされる。一般的に標準的な治療は、化学的前駆体である薬剤（レボドパ）またはその固有の分解をブロックする薬剤（モノアミン酸化酵素Ｂ阻害剤）を使用して、残りのニューロンによって生成される神経伝達物質ドーパミンの量を増強することである。また、いくつかのドーパミンアゴニストもまた、ＰＤの治療における使用が承認されている。これらの３種類の薬剤は一過性の症状改善をもたらすが、ＰＤの長期転帰にはほとんど影響を与えない（Ｍｏｎｔｏｌｉｕ－Ｇｙａ Ｌ， Ｖｉｌｌｅｇａｓ Ｓ： Ａβ－Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ： ａ ｗｉｄｅ ｒａｎｇｅ ｏｆ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｆｏｒ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ． Ｅｘｐｅｒｔ ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１６，１８：ｅ１３）。ＰＤの治療戦略として考えられるのは、ドーパミンニューロンの継続的な死を防ぐことであるが、現在のところそのような治療法はない。
【0009】
ＰＤにおけるドーパミンニューロン喪失の正確な病因はよく分かっていない。中枢神経系の常在マクロファージであるミクログリアによって媒介される異常に処理されたタンパク質と炎症は、ニューロンの喪失と一致する。タンパク質α－シヌクレインを含むレビー小体は、散発性及び家族性ＰＤのドーパミンニューロンに見られる封入体である。細胞内封入体で発見されることに加えて、異常なα－シヌクレインは細胞外でも検出される（Ｅｌ－Ａｇｎａｆ ＯＭ， Ｓａｌｅｍ ＳＡ， Ｐａｌｅｏｌｏｇｏｕ ＫＥ， Ｃｕｒｒａｎ ＭＤ， Ｇｉｂｓｏｎ ＭＪ， Ｃｏｒｕｔ ＪＡ， Ｓｃｈｌｏｓｓｍａｃｈｅｒ ＭＧ， Ａｌｌｓｏｐ Ｄ： Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ａｌｐｈａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ ａｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． ＦＡＳＥＢ Ｊ ２００６， ２０：４１９－２５； Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ Ｌ， Ｃｏｕｃｈ Ｙ， Ｒｉｃｈｒｄｓｏｎ Ｊ， Ｃｏｏｐｅｒ ＪＭ， Ｗｏｏｄ ＭＪ： Ａｌｐｈａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｒｅｌｅａｓｅ ｂｙ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｔｈｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ａ ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ ２０１１１， ６９：３３７－４２； Ｔｏｋｕｄａ Ｔ， Ｑｕｅｒｅｓｈｉ ＭＭ， Ａｒｄａｈ ＭＴ， Ｖａｒｇｈｅｓｅ Ｓ， Ｓｈｅｈａｂ ＳＡ， Ｋａｓａｉ Ｔ， Ｉｓｈｉｇａｍｉ Ｎ， Ｔａｍａｏｋａ Ａ， Ｎａｋａｇａｗａ Ｍ， Ｅｌ－Ａｇｎａｆ ＯＭ： Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｌｅｖａｔｅｄ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ａｌｐｈａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ ｉｎ ＣＳＦ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２０１０， ７５：１７６６－７２）。単量体α－シヌクレインの生理学的役割はよく分かっていない。しかし、異常なα－シヌクレインオリゴマーの形成は、ＰＤの病因において重要であると考えられている。これは、タンパク質の自己凝集を引き起こし、遺伝性のＰＤを引き起こすα－シヌクレイン遺伝子の突然変異によってさらに支持されている。異常なα－シヌクレインがドーパミンニューロンの死をもたらすという１つの仮説は、有毒な神経炎症を引き起こすか、または増強することによるものである。オリゴマーα－シヌクレインフィブリルはミクログリアを活性化してフリーラジカルや炎症誘発性サイトカインを産出し、神経変性を引き起こす（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ＡＤ， Ｓｔｏｎｅ ＤＫ， Ｍｏｓｌｅｙ ＲＬ， Ｇｅｎｄｅｌｍａｎ ＨＥ： Ｎｉｔｒａｔｅｄ ｛ａｌｐｈａ｝－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ ｉｎｎｕｍｉｔｙ ａｒｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ＣＤ４＋ Ｔ ｃｅｌｌ ｓｕｂｓｅｔｓ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００９， １８２：４１３７－４９； Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ Ｌ， Ｃｏｕｃｈ Ｙ， Ｒｉｃｈｒｄｓｏｎ Ｊ， Ｃｏｏｐｅｒ ＪＭ， Ｗｏｏｄ ＭＪ： Ａｓｐｈａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｒｅｌｅａｓｅ ｂｙ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｔｈｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ａ ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ ２０１１， ６９：３３７－４２； Ｔｈｅｏｄｏｒｅ Ｓ， Ｃａｏ Ｓ， ＭｃＬｅａｎ ＰＪ， Ｓｔａｎｄａｅｒｔ ＤＧ： Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｌｐｈａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｔｒｉｇｇｅｒｓ ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｐａｋｉｎｓｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｒｏｌ ２００８， ６７：１１４９－５８； Ｚｈａｎｇ Ｗ， Ｗａｎｇ Ｔ， Ｐｅｉ Ｚ， Ｍｉｌｌｅｒ ＤＳ， Ｗｕ Ｘ， Ｂｌｏｃｋ ＭＬ， Ｗｉｌｓｏｎ Ｂ， Ｚｈａｎｇ Ｗ， Ｚｈｏｕ Ｙ， Ｈｏｎｇ ＪＳ， Ｚｈａｎｇ Ｊ： Ａｇｇｒｅｇａｔｅｄ ａｌｐｈａ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｍｉｃｒｏｇｌｉａ： ａ ｐｒｏｃｅｓｓ ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ ｄｅｓｅａｓｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． ＦＡＳＥＢ Ｊ２００５， １９：５３３－４２）。
【0010】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）患者は、脳や脊髄の進行性運動ニューロン喪失の結果として致命的な麻痺を発症する。米国ではＡＬＳの新しい症例が毎年約６，０００件あり、一般的な発症年齢は４０歳から７０歳だが、２０代の人々にも発症する可能性がある。ＡＬＳは特発性または遺伝性（１０％程度）のいずれかであり、診断後に５年以上生きる人は約２０％にすぎない。発生率が上昇しているため、効果的な治療的介入がないという状況は特に問題である（「参照、例：Ｃａｌｌｅｒ ＴＡ 他：１９９７～２００９年の米国、ニューイングランド北部における筋萎縮性側索硬化症の空間分析。Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ ２０１３年、４８：２３５～４１）。主に脳や脊髄（ミクログリア）の常駐マクロファージによって駆動する永続的な神経炎症を抑制することは、有望な治療戦略と考えられている。ただし、これらのプロセスを従来の抗炎症薬で調整するのは困難である。
【0011】
遺伝子操作されたＴ細胞による細胞療法は、様々な疾患や病状の効果的な治療法になることが実証されている。例えば、エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）は、がんの生きた薬物治療として登場している（Ｊｕｎｅ ＣＨ 他：養子細胞療法：ゴールまでの競争。Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０１５年、７：２８０ｐｓ７）。このような治療法では、Ｔ細胞は通常患者から分離され、腫瘍リガンドに対するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように改変され、腫瘍の標的殺傷及び宿主免疫の活性化のために患者に戻される。
【0012】
Ｔ調節細胞（Ｔｒｅｇ）は、固有の免疫抑制作用及び抗炎症作用を有するＴ細胞のサブセットである。Ｔｒｅｇは、定常病態下のＣＮＳで発見され、ＣＮＳの炎症領域への移行または増加するトラフィックが観察されている（Ｘｉｅ Ｌ 他：脳内調節性Ｔ細胞は、ＩＬ－１０を通じてミクログリア／マクロファージを介した炎症反応を抑制する。Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１５年、４５：１８０～９１、Ｇｏｎｇ Ｎ 他：ＨＩＶ－１脳炎のマウスモデルにおける調節性Ｔ細胞の脳内侵入。Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ ２０１１年、２３０：３３～４１）。
【発明の概要】
【0013】
本開示は一般的に、神経変性疾患または病態からなる対象者を治療する方法であって、神経変性疾患または病態の発症に関連する１つ以上の危険因子を示し、そして／またはその診断に関連する１つ以上の兆候または症状を示して、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように改変された細胞を有効量投与する方法に関するものである。少なくとも１つの（ｉ）特定の神経変性疾患に関連する神経変性の部位に発現し、前記の特定の神経変性疾患または病態に関連する異常タンパク質、及び／または（ｉｉ）特定の神経変性疾患に関連する神経変性の部位で異常発現（例えば過剰発現）しているタンパク質及び／または特定の神経変性疾患の病態に関連して、前記のＣＡＲ細胞が標的となるタンパク質を含む神経変性の部位と接触する条件で投与され、それにより異常発現または過剰発現しているタンパク質に関連する神経変性疾患または病態及び／または神経変性疾患や病態に関連する１つ以上の症状を予防、抑制または治療することができる。例示的な実施形態では、前記の神経変性の部位は中枢神経系に存在してもよく、そして／または前記の神経変性の部位は末梢神経系に存在する。例示的な実施形態では、前記のＣＡＲ発現細胞は免疫細胞を含むことがあり、前記のＣＡＲ発現免疫細胞は任意に、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞、好ましくはＦＯＸＰ３＋ＴｒｅｇなどのＴ調節細胞（Ｔｒｅｇ）からなる。例示的な実施形態では、投与される細胞は、神経変性の部位に発現する少なくとも１つの異常なタンパク質を認識するＣＡＲを含むことができる。
【0014】
一部の実施形態では、前記の投与された細胞に含まれるＣＡＲは、ＤＧ０１（配列番号：１）、ＤＧ０２（配列番号：２）、ＤＧ０３（配列番号：３）、ＤＧ０４（配列番号：４）、ＤＧ０５（配列番号：５）、ＤＧ０６（配列番号：６）、ＤＧ０７（配列番号：７）、ＤＧ０８（配列番号：８）、ＤＧ０９（配列番号：９）、ＤＧ１０（配列番号：１０）、ＤＧ１１（配列番号：１１）、及び／または前記の構成物のうち、いずれか１つ以上に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物から構成され得る。一部の実施形態では、前記の投与された細胞が以下の構成物の１つ以上を発現するように改変され得る：ＤＧ０５－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（ＤＧ０５－２８－３ζとも呼ばれる）（配列番号：２４）、ＤＧ０５－ＣＤ２８ｔｍ－ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ（ＤＧ０５－２８ｔｍ－１０－３ζとも呼ばれる）（配列番号：４０）、ＤＧ０５－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ４４－ＣＤ３ζ（ＤＧ０５－２８ｔｍ－４４－３ζとも呼ばれる）（配列番号：４１）、ＤＧ０５－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ３ζ（ＤＧ０５－２８ｔｍ－３ζとも呼ばれる）（配列番号：４２）、ＤＧ０５－ＣＤ２８（ＤＧ０５－２８とも呼ばれる）（配列番号：４３）、ＤＧ０５－ＣＤ２８ｔｍ（ＤＧ０５－２８ｔｍとも呼ばれる）（配列番号：４４）、及び／または前記のいずれか１つ以上の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性からなる構成物で、前記のいずれか１つ以上の構成物の各々が変異型ＳＯＤ１を標的とする。一部の実施形態では、前記の投与された細胞が以下のうち１つ以上を発現するように改変され得る：ＤＧ０３－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（ＤＧ０３－２８－３ζとも呼ばれる）（配列番号：２２）、ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ－ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ（ＤＧ０３－２８ｔｍ－１０－３ζとも呼ばれる）（配列番号：４５）、ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ４４－ＣＤ３ζ（ＤＧ０３－２８ｔｍ－４４－３ζとも呼ばれる）（配列番号：４６）、ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ－４－１－ＢＢ－ＣＤ３ζ（ＤＧ０３－２８ｔｍ－ＢＢ－３ζとも呼ばれる）（配列番号：４７）、ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ３ζ（ＤＧ０３－２８ｔｍ－３ζとも呼ばれる）（配列番号：４８）、ＤＧ０３－ＣＤ２８（ＤＧ０３－２８とも呼ばれる）（配列番号：４９）、ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ（ＤＧ０３－２８ｔｍとも呼ばれる）（配列番号：５０）、及び／または前記のいずれか１つ以上の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性からなる構成物で、前記のいずれか１つ以上の構成物の各々がアミロイドベータを標的とする。
【0015】
さらなる例示的な実施形態では、ＣＡＲが神経変性の部位で発現される少なくとも１つの異常なタンパク質を認識するｓｃＦｖまたはリガンドを含むことができる。例示的な実施形態では、前記の細胞は、少なくとも１つの親ニューロン因子または神経成長因子を発現するようにさらに改変されてもよく、いずれかの前記のＣＡＲ及びＮＤＭＭは同じ細胞上または異なる細胞上にある。一部の実施形態では、前記の投与された細胞は、ＮＤＭＭ Ｎｒｆ２（Ｋｅａｐ１阻害剤ペプチド）（配列番号：５１）及び／または前記の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物に改変され得る。一部の実施形態では、前記の投与された細胞は、ヒトカタラーゼ（配列番号：５２）、及び／または前記の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物に改変され得る。一部の実施形態では、前記投の与された細胞は、ＢＤＮＦ（配列番号：５３）、及び／または前記の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物に改変され得る。一部の実施形態では、前記の投与された細胞は、ＩＧＦ－１（配列番号：５４）、及び／または前記の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物に改変され得る。例示的な実施形態では、前記の細胞はさらに、ニューロンを抗酸化ストレスから抑制または保護し、そして／または神経変性部位でのニューロンの死を抑制または防止する少なくとも１つの抗酸化タンパク質を発現するように改変されていてもよく、いずれかの前記のＣＡＲ及び前記抗酸化タンパク質は、同じ細胞上にあるか、異なる細胞上にあり、さらに必要に応じて、抗酸化剤はまた、Ｔ細胞の機能または寿命を促進する。
【0016】
一部の実施形態では、投与された細胞は、処置された対象者においてｍＳＯＤ１抗原に応答して増加したＩＬ－１０のレベルを発現し得る。一部の実施形態では、投与された細胞は、処置された対象者のｍＳＯＤ１抗原に応答して、ＧＩＴＲ、ＰＤ－１、及び／またはＣＴＬＡ－４の１つ以上を含む細胞表面マーカーの増加したレベルを発現し得る。一部の実施形態では、投与された細胞は、処置された対象者のｍＳＯＤ１抗原及び／または抗ＣＤ３に応答して、スーパーオキシドの産生を抑制し得る。一部の実施形態では、投与された細胞は、処置された対象者におけるｍＳＯＤ１抗原に応答してＴＮＦ－αの産生を抑制し得る。一部の実施形態では、投与された細胞は、ＤＧ０５（配列番号：５）及び／または前記の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物に改変され得る。一部の実施形態では、投与された細胞は、以下の構成物の１つ以上を発現するように改変され得る：ＤＧ０５－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（ＤＧ０５－２８－３ζとも呼ばれる）（配列番号：２４）、ＤＧ０５－ＣＤ２８ｔｍ－ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ（ＤＧ０５－２８ｔｍ－１０－３ζとも呼ばれる）（配列番号：４０）、ＤＧ０５－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ４４－ＣＤ３ζ（ＤＧ０５－２８ｔｍ－４４－３ζとも呼ばれる）（配列番号：４１）、ＤＧ０５－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ３ζ（ＤＧ０５－２８ｔｍ－３ζとも呼ばれる）（配列番号：４２）、ＤＧ０５－ＣＤ２８（ＤＧ０５－２８とも呼ばれる）（配列番号：４３）、ＤＧ０５－ＣＤ２８ｔｍ（ＤＧ０５－２８ｔｍとも呼ばれる）（配列番号：４４）、及び／または前記の構成物のうち、いずれか１つ以上に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物から構成され得る。一部の実施形態では、投与された細胞は、処置された対象者のアミロイドベータ抗原に応答して、増加したＩＬ－１０及び／またはＩＬ－４のレベルを発現し得る。一部の実施形態では、投与された細胞は、処置された対象者のアミロイドベータ抗原及び／または抗ＣＤ３に応答して、スーパーオキシドの産生を抑制する。一部の実施形態では、投与された細胞は、処置された対象者のアミロイドベータ抗原及び／または抗ＣＤ３に応答して、ＩＬ－６の産生を抑制し得る。一部の実施形態では、投与された細胞は、処置された対象者の細胞を過酸化水素毒性から保護し得る。一部の実施形態では、投与された細胞は、ＤＧ０３（配列番号：３）、及び／または前記の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物に改変され得る。一部の実施形態では、投与された細胞は、以下のうちの１つ以上を発現するように改変され得る：ＤＧ０３－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（ＤＧ０３－２８－３ζとも呼ばれる）（配列番号：２２）、ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ－ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ（ＤＧ０３－２８ｔｍ－１０－３ζとも呼ばれる）（配列番号：４５）、ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ４４－ＣＤ３ζ（ＤＧ０３－２８ｔｍ－４４－３ζとも呼ばれる）（配列番号：４６）、ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ－４－１－ＢＢ－ＣＤ３ζ（ＤＧ０３－２８ｔｍ－ＢＢ－３ζとも呼ばれる）（配列番号：４７）、ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ３ζ（ＤＧ０３－２８ｔｍ－３ζとも呼ばれる）（配列番号：４８）、ＤＧ０３－ＣＤ２８（ＤＧ０３－２８とも呼ばれる）（配列番号：４９）、ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ（配列番号：５０）、及び／または前記の構成物のうち、いずれか１つ以上に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物から構成され得る。一部の実施形態では、投与された細胞は、処置された対象者の細胞を過酸化水素毒性から保護することができ、いずれかの前記の投与された細胞は、以下の構成物の１つ以上を発現するように改変される。ＮＤＭＭヒトカタラーゼ構成物（配列番号：５２）、ＮＤＭＭ Ｎｒｆ２（Ｋｅａｐ１阻害剤ペプチド）構成物（配列番号：５１）、ＮＤＭＭ ＢＤＮＦ構成物（配列番号：５３）、及び／またはＮＤＭＭ ＩＧＦ－１構成物（配列番号：５４）、及び／または前記の構成物のうち、いずれか１つ以上に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物から構成され得る。
【0017】
さらなる例示的な実施形態では、神経変性疾患または病態は、パーキンソン病、アルツハイマー病、プリオン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病（ＨＤ）、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、フリードライヒ失調症、レビー小体病、てんかん、脳炎、水頭症、脳卒中、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、シヌクレイン症、タウオパチー、海綿状脳症、家族性アミロイドポリニューロパチー、アミロイドーシスを伴うオランダ性遺伝性脳出血、コンゴーレッド親和性血管障害、大脳皮質基底核変性症、ピック病、進行性核上性麻痺、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、致命的な家族性不眠症、クールー病、ウシ海綿状脳症、スクレイピー、慢性消耗性疾患、アルツハイマー病のレビー小体変種、びまん性レビー小体病；レビー小体型認知症、多系統萎縮症、脳の鉄沈着タイプＩを伴う遺伝性神経変性症、びまん性レビー小体病、前頭側頭葉変性症、歯状核赤核・淡蒼球ルイ体萎縮症、ケネディ病、アレクサンダー病、コケイン症候群、アミロイドーシスを伴うアイスランド性遺伝性脳出血などの運動ニューロン病（ＭＮＤ）のうちの少なくとも１つを構成することができる。例示的な実施形態では、神経変性疾患はパーキンソン病を含むことができる。例示的な実施形態では、神経変性疾患はアルツハイマー病を含むことができる。例示的な実施形態では、神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含むことができる。例示的な実施形態では、ＣＡＲは、ヒトアミロイドベータ、アミロイドベータ１－４２、α－シヌクレイン、スーパーオキシドジスムターゼ－１（ＳＯＤ－１）、過リン酸化タウタンパク質、ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ－４３）、染色体９オープンリーディングフレーム７２（ｃ９ｏｒｆ７２）、β－シヌクレイン、γ－シヌクレイン、肉腫に融合したＲＮＡ結合タンパク質（ＦＵＳ）、ユビキチン、ユビキリン－２、ｐ６２、オプチニューリン、アタキシン－２、パーキン、セリン／スレオニンタンパク質キナーゼＰＩＮＫ１、ロイシンリッチリピートセリン／スレオニンタンパク質キナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、タンデムグルタミンリピートを伴うハンチンチン、プリオンタンパク質、トランスサイレチン、歯状核赤核・淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）タンパク質、アンドロゲン受容体、アタキシン、Ｐ／Ｑ型のカルシウムチャネルα１Ａサブユニット、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質、グリア線維性酸性タンパク質、ＤＮＡ除去修復タンパク質ＥＲＣＣ－６、生存運動ニューロンタンパク質、及びシスタチンＣの１つ以上に結合することができる。
【0018】
例示的な実施形態では、投与された細胞は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、インターロイキン－１受容体拮抗薬（ＩＬ－１ｒａ）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）、トロンボモジュリン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、タンパク質デグリカーゼＤＪ－１、メタロプロテイナーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰ）、インスリン様成長因子－１（ＩＧＦ－１）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、及び顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）から選択される、任意に少なくとも１つの親ニューロン因子、神経栄養因子、または神経成長因子が、前記のＣＡＲと同一細胞上にあるか、または異なる細胞上にあることを特徴とする。例示的な実施形態では、抗酸化タンパク質は、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ、Ｃｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ、ＨＯ－１、フェリチン、グルタチオン還元酵素、グルタチオンペルオキシダーゼ、フェリチン（Ｈ）、メタロチオネインＩ、チオレドキシン、チオレドキシン還元酵素、ペルオキシレドキシンＭＳＰ２３などのペルオキシレドキシン（Ｐｒｘ）、活動依存性神経保護剤ホメオボックス（ＡＤＮＰ）、フィコシアニン、ニューログロビン、カタラーゼ、及びＮＲＦ２から選択されるタンパク質であり、任意に少なくとも１つの抗酸化タンパク質が、前記のＣＡＲと同一細胞上にあるか、または異なる細胞上にあることを特徴とする。例示的な実施形態では、投与された細胞は、神経変性の前記の部位に存在する炎症の量を低減または安定化することができる。例示的な実施形態では、投与された細胞は、以下のうちの少なくとも１つを抑制または防止することができる：（ｉ）ミクログリア細胞の過剰活性化であり、ここで、過剰活性化というのは、（１）形態の変化、（２）炎症部位への移動、（３）ＩＬ－１などの神経毒性または炎症性サイトカインの産生、（４）神経斑またはβアミロイド沈着との相互作用、（５）神経毒性タンパク質の合成、（６）プロテアーゼ及び／または活性酸素種の分泌、（７）隣接細胞によるアミロイド産生の誘導、（８）ミエリンの破壊などのような活性化されたミクログリアに特徴的な少なくとも１つの活性または活性の増加を有するミクログリアを含む。（ｉｉ）ミクログリアの数の増加、（ｉｉｉ）神経変性部位での炎症性タンパク質または炎症性活性の産生、（ｉｖ）マクロファージ活性、（ｖ）サイトカイン、オキシダント、プロテアーゼなどのサイト内の細胞による、例えばマクロファージ及びミクログリアによる炎症性または神経毒性部分の発現、及び／または（ｖｉ）神経細胞死または神経機能障害。
【0019】
その上、本開示は一般的に、（ｉ）神経変性疾患の病態に関連する異常なタンパク質またはそのタンパク質が特定の神経変性疾患または病態に関連している神経変性の部位で、中枢神経系に異常に存在するタンパク質に結合する少なくとも１つのリガンド結合部位からなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を符号化する核酸を包含し、及び（ｉｉ）任意で少なくとも１つのシグナル伝達ドメイン、例えば共刺激ドメイン、その発現は必要に応じて、同一または異なる誘導または構成的プロモーターによって制御される。例示的な実施形態では、神経変性疾患または病態に関連するタンパク質は、ヒトアミロイドベータ、アミロイドベータ１－４２、α－シヌクレイン、スーパーオキシドジスムターゼ－１（ＳＯＤ－１）、過リン酸化タウタンパク質、ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ－４３）、染色体９オープンリーディングフレーム７２（ｃ９ｏｒｆ７２）、β－シヌクレイン、γ－シヌクレイン、肉腫に融合したＲＮＡ結合タンパク質（ＦＵＳ）、ユビキチン、ユビキリン－２、ｐ６２、オプチニューリン、アタキシン－２、パーキン、セリン／スレオニン－タンパク質キナーゼＰＩＮＫ１、ロイシンリッチリピートセリン／スレオニン－タンパク質キナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、タンデムグルタミンリピートを伴うハンチンチン、プリオンタンパク質、トランスサイレチン、歯状核赤核・淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）タンパク質、アンドロゲン受容体、アタキシン、Ｐ／Ｑ型のカルシウムチャネルα１Ａサブユニット、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質、グリア線維性酸性タンパク質、ＤＮＡ除去修復タンパク質ＥＲＣＣ－６、生存運動ニューロンタンパク質、及びシスタチンＣから選択される。さらに、例示的な実施形態では、本開示は一般的に、本明細書に記載されるようなＣＡＲを符号化する、少なくとも１つの核酸を含む組換え細胞または改変された細胞に関するものである。
【0020】
さらに、本開示は一般的に、神経変性疾患または病態からなる対象者を治療する方法であり、神経変性疾患または病態の発症に関連する１つ以上の危険因子を示し、そして／または関連する１つ以上の兆候または症状を示す対象者に有効量の細胞を投与することからなる方法に関する内容である。これは、（ｉ）特定の神経変性疾患に関連する神経変性の部位において中枢神経系に発現し、前記にある特定の神経変性疾患または病態に関連する異常なタンパク質及び／または（ｉｉ）特定の神経変性疾患に関連する神経変性の部位において、中枢神経系に異常に発現（過剰発現）しているタンパク質で、前記にある特定の神経変性疾患または病態の病理に関連しているタンパク質、そして前記の細胞を、標的タンパク質を含む神経変性部位に接触させた病態で投与することにより、神経変性疾患や神経変性疾患に伴う症状を予防、抑制、治療することができる、前記の異常または過剰に発現したタンパク質の発現が特徴であり、アルツハイマー病に関連するタンパク質である前記の標的タンパク質のうち、少なくとも１つを標的とするキメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）を発現するように改変されている。また、本開示は一般的に、神経変性疾患または病態からなる対象者を治療する方法であり、神経変性疾患または病態の発症に関連する１つ以上の危険因子を示し、そして／または関連する１つ以上の兆候または症状を示す対象者に有効量の細胞を投与することからなる方法に関する内容である。これは、（ｉ）特定の神経変性疾患に関連する神経変性の部位において中枢神経系に発現し、前記にある特定の神経変性疾患または病態に関連する異常なタンパク質、及び／または（ｉｉ）特定の神経変性疾患に関連する神経変性部位の中枢神経系に異常に発現（過剰発現）し、当該特定の神経変性疾患の病態に関連しているタンパク質を標的とした細胞を、当該特定の神経変性疾患の病態に関連した条件で投与するタンパク質であり、神経変性部位と接触することにより、タンパク質の異常または過剰発現を特徴とする、神経変性疾患または病態及び／または神経変性疾患または病態に伴う１つ以上の症状を予防、抑制、または治療することができる、前記の標的タンパク質のうち、少なくとも１つを標的とするキメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）を発現するように改変されている。これは、前記の標的タンパク質がアルツハイマー病に関連するタンパク質であり、前記のＣＡＲ発現細胞のＣＡＲがＤＧ０１（配列番号：１）、ＤＧ０２（配列番号：２）、ＤＧ０３（配列番号：３）、及び／またはＤＧ０４（配列番号：４）、及び／または前記の構成物のうち、いずれか１つ以上に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物から構成され得る。それに加えて、本開示は一般的に、神経変性疾患または病態からなる対象者を治療する方法であり、神経変性疾患または病態の発症に関連する１つ以上の危険因子を示し、そして／または関連する１つ以上の兆候または症状を示す対象者に有効量の細胞を投与することからなる方法に関する内容である。これは、（ｉ）特定の神経変性疾患に関連する神経変性の部位において中枢神経系に発現し、前記にある特定の神経変性疾患または病態に関連する異常なタンパク質、及び／または（ｉｉ）特定の神経変性疾患に関連する神経変性部位の中枢神経系に異常に発現（過剰発現）し、当該特定の神経変性疾患の病態に関連しているタンパク質を標的とした細胞を、当該特定の神経変性疾患の病態に関連した条件で投与するタンパク質であり、神経変性部位と接触することにより、前記の神経変性疾患または病態及び／または異常もしくは過剰発現するタンパク質を特徴とする、前記の神経変性疾患または病態に伴う１つ以上の症状を予防、抑制、または治療することができる前記の標的タンパク質のうち、少なくとも１つを標的とするキメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）を発現するように改変されている。これは、前記の標的タンパク質がアルツハイマー病に関連するタンパク質であり、前記のＣＡＲ発現細胞のＣＡＲがＤＧ０１（配列番号：１）、ＤＧ０２（配列番号：２）、ＤＧ０３（配列番号：３）、及び／またはＤＧ０４（配列番号：４）、及び／または前記の構成物のいずれか１つ以上に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含み、前記の細胞が１つ以上の神経変性疾患修飾分子（ＮＤＭＭ）を発現するように改変されているという特徴を持つ構成物である。
【0021】
また、本開示は一般的に、神経変性疾患または病態からなる対象者を治療する方法であり、神経変性疾患または病態の発症に関連する１つ以上の危険因子を示し、そして／または関連する１つ以上の兆候または症状を示す対象者に有効量の細胞を投与することからなる方法に関する内容である。これは、（ｉ）特定の神経変性疾患に関連する神経変性の部位において中枢神経系に発現し、前記にある特定の神経変性疾患または病態に関連する異常なタンパク質及び／または（ｉｉ）特定の神経変性疾患に関連する神経変性の部位において、中枢神経系に異常に発現（過剰発現）しているタンパク質で、前記にある特定の神経変性疾患または病態の病理に関連しているタンパク質、そして前記の細胞を、標的タンパク質を含む神経変性部位に接触させた病態で投与することにより、神経変性疾患や神経変性疾患に伴う症状を予防、抑制、治療することができる、前記の異常または過剰に発現したタンパク質の発現が特徴であり、ＡＬＳに関連するタンパク質である前記の標的タンパク質のうち、少なくとも１つを標的とするキメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）を発現するように改変されている。それに加えて、本開示は一般的に、神経変性疾患または病態からなる対象者を治療する方法であり、神経変性疾患または病態の発症に関連する１つ以上の危険因子を示し、そして／または関連する１つ以上の兆候または症状を示す対象者に有効量の細胞を投与することからなる方法に関する内容である。これは、（ｉ）特定の神経変性疾患に関連する神経変性の部位において中枢神経系に発現し、前記にある特定の神経変性疾患または病態に関連する異常なタンパク質、及び／または（ｉｉ）特定の神経変性疾患に関連する神経変性部位の中枢神経系に異常に発現（過剰発現）し、当該特定の神経変性疾患の病態に関連しているタンパク質を標的とした細胞を、当該特定の神経変性疾患の病態に関連した条件で投与するタンパク質であり、神経変性部位と接触することにより、タンパク質の異常または過剰発現を特徴とする、神経変性疾患または病態及び／または神経変性疾患または病態に伴う１つ以上の症状を予防、抑制、または治療することができる、前記の標的タンパク質のうち、少なくとも１つを標的とするキメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）を発現するように改変されている。これは、前記の標的タンパク質がＡＬＳに関連するタンパク質であり、前記のＣＡＲ発現細胞のＣＡＲがＤＧ０５（配列番号：５）、ＤＧ０６（配列番号：６）、及び／またはＤＧ０７（配列番号：７）、及び／または前記の構成物のうち、いずれか１つ以上に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物から構成され得る。また、本開示は一般的に、神経変性疾患または病態からなる対象者を治療する方法であり、神経変性疾患または病態の発症に関連する１つ以上の危険因子を示し、そして／または関連する１つ以上の兆候または症状を示す対象者に有効量の細胞を投与することからなる方法に関する内容である。これは、（ｉ）特定の神経変性疾患に関連する神経変性の部位において中枢神経系に発現し、前記にある特定の神経変性疾患または病態に関連する異常なタンパク質、及び／または（ｉｉ）特定の神経変性疾患に関連する神経変性部位の中枢神経系に異常に発現（過剰発現）し、当該特定の神経変性疾患の病態に関連しているタンパク質を標的とした細胞を、当該特定の神経変性疾患の病態に関連した条件で投与するタンパク質であり、神経変性部位と接触することにより、タンパク質の異常または過剰発現を特徴とする、神経変性疾患または病態及び／または神経変性疾患または病態に伴う１つ以上の症状を予防、抑制、または治療することができる、前記の標的タンパク質のうち、少なくとも１つを標的とするキメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）を発現するように改変されている。これは、前記の標的タンパク質がＡＬＳに関連するタンパク質であり、前記のＣＡＲ発現細胞のＣＡＲがＤＧ０５（配列番号：５）、ＤＧ０６（配列番号：６）、及び／またはＤＧ０７（配列番号：７）、及び／または前記の構成物のいずれか１つ以上に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含み、前記の細胞が１つ以上の神経変性疾患修飾分子（ＮＤＭＭ）を発現するように改変されているという特徴を持つ構成物。
【0022】
さらに、本開示は一般的に、神経変性疾患または病態からなる対象者を治療する方法であり、神経変性疾患または病態の発症に関連する１つ以上の危険因子を示し、そして／または関連する１つ以上の兆候または症状を示す対象者に有効量の細胞を投与することからなる方法に関する内容である。これは、（ｉ）特定の神経変性疾患に関連する神経変性の部位において中枢神経系に発現し、前記にある特定の神経変性疾患または病態に関連する異常なタンパク質及び／または（ｉｉ）特定の神経変性疾患に関連する神経変性の部位において、中枢神経系に異常に発現（過剰発現）しているタンパク質で、前記にある特定の神経変性疾患または病態の病理に関連しているタンパク質、そして前記の細胞を、標的タンパク質を含む神経変性部位に接触させた病態で投与することにより、神経変性疾患や神経変性疾患に伴う症状を予防、抑制、治療することができる、前記の異常または過剰に発現したタンパク質の発現が特徴であり、パーキンソン病に関連するタンパク質である前記の標的タンパク質のうち、少なくとも１つを標的とするキメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）を発現するように改変されている。それに加えて、本開示は一般的に、神経変性疾患または病態からなる対象者を治療する方法であり、神経変性疾患または病態の発症に関連する１つ以上の危険因子を示し、そして／または関連する１つ以上の兆候または症状を示す対象者に有効量の細胞を投与することからなる方法に関する内容である。これは、（ｉ）特定の神経変性疾患に関連する神経変性の部位において中枢神経系に発現し、前記にある特定の神経変性疾患または病態に関連する異常なタンパク質、及び／または（ｉｉ）特定の神経変性疾患に関連する神経変性部位の中枢神経系に異常に発現（過剰発現）し、当該特定の神経変性疾患の病態に関連しているタンパク質を標的とした細胞を、当該特定の神経変性疾患の病態に関連した条件で投与するタンパク質であり、神経変性部位と接触することにより、タンパク質の異常または過剰発現を特徴とする、神経変性疾患または病態及び／または神経変性疾患または病態に伴う１つ以上の症状を予防、抑制、または治療することができる、前記の標的タンパク質のうち、少なくとも１つを標的とするキメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）を発現するように改変されている。これは、前記の標的タンパク質がパーキンソン病に関連するタンパク質であり、前記のＣＡＲ発現細胞のＣＡＲがＤＧ０８（配列番号：８）、ＤＧ０９（配列番号：９）、ＤＧ１０（配列番号：１０）、及び／またはＤＧ１１（配列番号：１１）、及び／または前記の構成物のうち、いずれか１つ以上に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物から構成され得る。また、本開示は一般的に、神経変性疾患または病態からなる対象者を治療する方法であり、神経変性疾患または病態の発症に関連する１つ以上の危険因子を示し、そして／または関連する１つ以上の兆候または症状を示す対象者に有効量の細胞を投与することからなる方法に関する内容である。これは、（ｉ）特定の神経変性疾患に関連する神経変性の部位において中枢神経系に発現し、前記にある特定の神経変性疾患または病態に関連する異常なタンパク質、及び／または（ｉｉ）特定の神経変性疾患に関連する神経変性部位の中枢神経系に異常に発現（過剰発現）し、当該特定の神経変性疾患の病態に関連しているタンパク質を標的とした細胞を、当該特定の神経変性疾患の病態に関連した条件で投与するタンパク質であり、神経変性部位と接触することにより、タンパク質の異常または過剰発現を特徴とする、神経変性疾患または病態及び／または神経変性疾患または病態に伴う１つ以上の症状を予防、抑制、または治療することができる、前記の標的タンパク質のうち、少なくとも１つを標的とするキメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）を発現するように改変されている。これは、前記の標的タンパク質がパーキンソン病に関連するタンパク質であり、前記のＣＡＲ発現細胞のＣＡＲがＤＧ０８（配列番号：８）、ＤＧ０９（配列番号：９）、ＤＧ１０（配列番号：１０）、及び／またはＤＧ１１（配列番号：１１）、及び／または前記の構成物のいずれか１つ以上に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含み、前記の細胞が１つ以上の神経変性疾患修飾分子（ＮＤＭＭ）を発現するように改変されているという特徴を持つ構成物。
【0023】
また、本開示は一般的に、（ｉ）神経変性疾患の病態に関連する異常なタンパク質またはそのタンパク質が特定の神経変性疾患または病態に関連している神経変性の部位で、中枢神経系に異常に存在するタンパク質に結合する少なくとも１つのリガンド結合部位からなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を符号化する核酸に関連し、及び（ｉｉ）任意で少なくとも１つのシグナル伝達ドメイン、例えば共刺激シグナル伝達ドメインであり、その発現は必要に応じて、同一または異なる誘導性もしくは構成的プロモーターにより制御され、前記のタンパク質はアルツハイマー病に関連するタンパク質である。それに加えて、本開示は一般的に、（ｉ）神経変性疾患の病態に関連する異常なタンパク質またはそのタンパク質が特定の神経変性疾患または病態に関連している神経変性の部位で、中枢神経系に異常に存在するタンパク質に結合する少なくとも１つのリガンド結合部位からなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を符号化する核酸を包含し、及び（ｉｉ）任意で少なくとも１つのシグナル伝達ドメイン、例えば共刺激シグナル伝達ドメインであり、その発現は必要に応じて、同一または異なる誘導性もしくは構成的プロモーターにより制御され、前記のタンパク質はアルツハイマー病に関連するアミロイドベータの形態である。また、本開示は一般的に、（ｉ）神経変性疾患の病態に関連する異常なタンパク質またはそのタンパク質が特定の神経変性疾患または病態に関連している神経変性の部位で、中枢神経系に異常に存在するタンパク質に結合する少なくとも１つのリガンド結合部位からなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を符号化する核酸と関連し、及び（ｉｉ）任意で少なくとも１つのシグナル伝達ドメイン、例えば共刺激シグナル伝達ドメインであり、その発現は必要に応じて、同一または異なる誘導性もしくは構成的プロモーターにより制御され、前記のタンパク質はＡＬＳ疾患に関連するタンパク質である。それに加えて、本開示は一般的に、（ｉ）神経変性疾患の病態に関連する異常なタンパク質またはそのタンパク質が特定の神経変性疾患または病態に関連している神経変性の部位で、中枢神経系に異常に存在するタンパク質に結合する少なくとも１つのリガンド結合部位からなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を符号化する核酸を包含し、及び（ｉｉ）任意で少なくとも１つのシグナル伝達ドメイン、例えば共刺激シグナル伝達ドメインであり、同一または異なる誘導性もしくは構成的プロモーターにより必要に応じて制御され、前記のタンパク質は変異または異常に発現されたＳＯＤ１Ｓである。また、本開示は一般的に、（ｉ）神経変性疾患の病態に関連する異常なタンパク質またはそのタンパク質が特定の神経変性疾患または病態に関連している神経変性の部位で、中枢神経系に異常に存在するタンパク質に結合する少なくとも１つのリガンド結合部位からなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を符号化する核酸に関連し、及び（ｉｉ）任意で少なくとも１つのシグナル伝達ドメイン、例えば共刺激シグナル伝達ドメインであり、その発現は必要に応じて、同一または異なる誘導性もしくは構成的プロモーターにより制御され、前記のタンパク質はパーキンソン病に関連するタンパク質である。
【0024】
さらに、本開示は一般的に、（ｉ）神経変性疾患の病態に関連する異常なタンパク質またはそのタンパク質が特定の神経変性疾患または病態に関連している神経変性の部位で、中枢神経系に異常に存在するタンパク質に結合する少なくとも１つのリガンド結合部位からなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を符号化する核酸を包含し、及び（ｉｉ）任意で少なくとも１つのシグナル伝達ドメイン、例えば共刺激シグナル伝達ドメインであり、その発現は必要に応じて、同一または異なる誘導性もしくは構成的プロモーターにより制御され、前記のタンパク質は、パーキンソン病に関連するα－シヌクレインの形態である。また、本開示は一般的に、（ｉ）神経変性疾患の病態に関連する異常なタンパク質またはそのタンパク質が特定の神経変性疾患または病態に関連している神経変性の部位で、中枢神経系に異常に存在するタンパク質に結合する少なくとも１つのリガンド結合部位からなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を符号化する核酸と関連し、及び（ｉｉ）任意で少なくとも１つのシグナル伝達ドメイン、例えば共刺激シグナル伝達ドメインであり、その発現は必要に応じて、同一または異なる誘導性もしくは構成的プロモーターにより制御され、前記の核酸はＤＧ０１（配列番号：１）、ＤＧ０２（配列番号：２）、ＤＧ０３（配列番号：３）、及び／またはＤＧ０４（配列番号：４）、及び／または前記の構成物のうち、いずれか１つ以上に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物から構成され得る。それに加えて、本開示は一般的に、（ｉ）神経変性疾患の病態に関連する異常なタンパク質またはそのタンパク質が特定の神経変性疾患または病態に関連している神経変性の部位で、中枢神経系に異常に存在するタンパク質に結合する少なくとも１つのリガンド結合部位からなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を符号化する核酸と関連し、及び（ｉｉ）任意で少なくとも１つのシグナル伝達ドメイン、例えば共刺激シグナル伝達ドメインであり、その発現は必要に応じて、同一または異なる誘導性もしくは構成的プロモーターにより制御され、前記の核酸はＤＧ０５（配列番号：５）、ＤＧ０６（配列番号：６）、及び／またはＤＧ０７（配列番号：７）、及び／または前記の構成物のうち、いずれか１つ以上に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物から構成され得る。それに加えて、本開示は一般的に、（ｉ）神経変性疾患の病状に関連する異常なタンパク質またはそのタンパク質が特定の神経変性疾患または病態に関連している神経変性の部位で、中枢神経系に異常に存在するタンパク質に結合する少なくとも１つのリガンド結合部位からなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を符号化する核酸を包含し、及び（ｉｉ）任意で少なくとも１つのシグナル伝達ドメイン、例えば共刺激シグナル伝達ドメインであり、その発現は必要に応じて、同一または異なる誘導性もしくは構成的プロモーターにより制御され、前記の核酸はＤＧ０８（配列番号：８）、ＤＧ０９（配列番号：９）、 ＤＧ１０（配列番号：１０）、及び／またはＤＧ１１（配列番号：１１）、及び／または前記の構成物のうち、いずれか１つ以上に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物から構成され得る。
【0025】
さらに、本開示は一般的に、神経変性疾患または病態からなる対象者を治療する方法であって、神経変性疾患または病態の発症に関連する１つ以上の危険因子を示し、そして／または神経変性疾患または病態の診断に関連する１つ以上の徴候または症状を示す方法に関する内容である。キメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）またはＮＤＭＭを発現するように設計された細胞を有効量投与することからなり、ＣＡＲ及びＮＤＭＭは、（ｉ）特定の神経変性疾患に関連する神経変性の部位において中枢神経系に発現し、前記にある特定の神経変性疾患または病態に関連する異常なタンパク質、及び／または（ｉｉ）特定の神経変性疾患に関連する神経変性部位の中枢神経系に異常に発現（過剰発現）し、当該特定の神経変性疾患の病態に関連しているタンパク質を標的とした細胞を、当該特定の神経変性疾患の病態に関連した条件で投与するタンパク質であり、神経変性部位と接触することにより、タンパク質の異常または過剰発現を特徴とする、神経変性疾患または病態及び／または神経変性疾患または病態に伴う１つ以上の症状を予防、抑制、または治療することができる、前記の標的タンパク質のうち、少なくとも１つを標的とする同一細胞または異なる細胞によって発現され得る。前記の標的タンパク質は、アルツハイマー病に関連するタンパク質であり、前記の細胞は、以下のいずれか１つ以上を発現するように改変されている。ＤＧ０３（配列番号：３）、ＤＧ０３－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（ＤＧ０３－２８－３ζとも呼ばれる）（配列番号：２２）、ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ－ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ（ＤＧ０３－２８ｔｍ－１０－３ζとも呼ばれる）（配列番号：４５）、ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ４４－ＣＤ３ζ（ＤＧ０３－２８ｔｍ－４４－３ζとも呼ばれる）（配列番号：４６）、ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ－４－１－ＢＢ－ＣＤ３ζ（ＤＧ０３－２８ｔｍ－ＢＢ－３ζとも呼ばれる）（配列番号：４７）、ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ３ζ（ＤＧ０３－２８ｔｍ－３ζとも呼ばれる）（配列番号：４８）、ＤＧ０３－ＣＤ２８（ＤＧ０３－２８とも呼ばれる）（配列番号：４９）、ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ（配列番号：５０）、及び／または前記の構成物のうち、いずれか１つ以上に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物から構成され得る。その上に、本開示は一般的に、神経変性疾患または病態からなる対象者を治療する方法であって、神経変性疾患または病態の発症に関連する１つ以上の危険因子を示し、そして／または神経変性疾患または病態の診断に関連する１つ以上の徴候または症状を示す方法に関する内容である。キメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）またはＮＤＭＭを発現するように設計された細胞を有効量投与することからなり、ＣＡＲ及びＮＤＭＭは、（ｉ）特定の神経変性疾患に関連する神経変性の部位において中枢神経系に発現し、前記にある特定の神経変性疾患または病態に関連する異常なタンパク質、及び／または（ｉｉ）特定の神経変性疾患に関連する神経変性部位の中枢神経系に異常に発現（過剰発現）し、当該特定の神経変性疾患の病態に関連しているタンパク質を標的とした細胞を、当該特定の神経変性疾患の病態に関連した条件で投与するタンパク質であり、神経変性部位と接触することにより、タンパク質の異常または過剰発現を特徴とする、神経変性疾患または病態及び／または神経変性疾患または病態に伴う１つ以上の症状を予防、抑制、または治療することができる、前記の標的タンパク質のうち、少なくとも１つを標的とする同一細胞または異なる細胞によって発現され得る。前記の標的タンパク質は、ＡＬＳに関連するタンパク質であり、前記の細胞は、以下のいずれか１つ以上を発現するように改変されている。ＤＧ０５（配列番号：５）、ＤＧ０５－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（ＤＧ０５－２８－３ζとも呼ばれる）（配列番号：２４）、ＤＧ０５－ＣＤ２８ｔｍ－ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ（ＤＧ０５－２８ｔｍ－１０－３ζとも呼ばれる）（配列番号：４０）、ＤＧ０５－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ４４－ＣＤ３ζ（ＤＧ０５－２８ｔｍ－４４－３ζとも呼ばれる）（配列番号：４１）、ＤＧ０５－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ３ζ（ＤＧ０５－２８ｔｍ－３ζとも呼ばれる）（配列番号：４２）、ＤＧ０５－ＣＤ２８（ＤＧ０５－２８とも呼ばれる）（配列番号：４３）、ＤＧ０５－ＣＤ２８ｔｍ（ＤＧ０５－２８ｔｍとも呼ばれる）（配列番号：４４）、及び／または前記の構成物のうち、いずれか１つ以上に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物から構成され得る。さらに、本開示は一般的に、（ｉ）神経変性疾患の病理に関連する異常なタンパク質またはそのタンパク質が特定の神経変性疾患または病態に関連している神経変性の部位で、中枢神経系に異常に存在するタンパク質に結合する少なくとも１つのリガンド結合部位からなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を符号化する核酸に関連し、及び（ｉｉ）任意で少なくとも１つのシグナル伝達ドメイン、例えば共刺激シグナル伝達ドメインであり、及び（ｉｉｉ）さらに任意でＮＤＭＭ、その発現は必要に応じて、同一または異なる誘導性もしくは構成的プロモーターにより制御され、前記の核酸は以下のいずれか１つ以上を符号化する：ＤＧ０３－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（ＤＧ０３－２８－３ζとも呼ばれる）（配列番号：２２）、ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ－ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ（ＤＧ０３－２８ｔｍ－１０－３ζとも呼ばれる）（配列番号：４５）、ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ４４－ＣＤ３ζ（ＤＧ０３－２８ｔｍ－４４－３ζとも呼ばれる）（配列番号：４６）、ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ－４－１－ＢＢ－ＣＤ３ζ（ＤＧ０３－２８ｔｍ－ＢＢ－３ζとも呼ばれる）（配列番号：４７）、ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ３ζ（ＤＧ０３－２８ｔｍ－３ζとも呼ばれる）（配列番号：４８）、ＤＧ０３－ＣＤ２８（ＤＧ０３－２８とも呼ばれる）（配列番号：４９）、ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ（配列番号：５０）、及び／または前記の構成物のうち、いずれか１つ以上に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物から構成され得る。その上、本開示は一般的に、（ｉ）神経変性疾患の病理に関連する異常なタンパク質またはそのタンパク質が特定の神経変性疾患または病態に関連している神経変性の部位で、中枢神経系に異常に存在するタンパク質に結合する少なくとも１つのリガンド結合部位からなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を符号化する核酸に関連し、及び（ｉｉ）任意で少なくとも１つのシグナル伝達ドメイン、例えば共刺激シグナル伝達ドメインであり、及び（ｉｉｉ）さらに任意でＮＤＭＭ、その発現は必要に応じて、同一または異なる誘導性もしくは構成的プロモーターにより制御され、前記の核酸は以下の構成物のいずれか１つ以上を符号化する：ＤＧ０５－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（ＤＧ０５－２８－３ζとも呼ばれる）（配列番号：２４）、ＤＧ０５－ＣＤ２８ｔｍ－ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ（ＤＧ０５－２８ｔｍ－１０－３ζとも呼ばれる）（配列番号：４０）、ＤＧ０５－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ４４－ＣＤ３ζ（ＤＧ０５－２８ｔｍ－４４－３ζとも呼ばれる）（配列番号：４１）、ＤＧ０５－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ３ζ（ＤＧ０５－２８ｔｍ－３ζとも呼ばれる）（配列番号：４２）、ＤＧ０５－ＣＤ２８（ＤＧ０５－２８とも呼ばれる）（配列番号：４３）、及び／またはＤＧ０５－ＣＤ２８ｔｍ（ＤＧ０５－２８ｔｍとも呼ばれる）（配列番号：４４）、及び／または前記の構成物のうち、いずれか１つ以上に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物から構成され得る。
【図面の簡単な説明】
【0026】
【図1】図１は、ＣＤ２８膜貫通及びＣＤ３細胞内シグナル伝達ドメインに融合された細胞外ｓｃＦｖからなる抗Ａβ ＣＡＲの概略設計を示し、同時に発現した非機能性のトランケートされたＣＤ１９（ｔＣＤ１９）を用いて、実施例１に従った形質転換細胞の濃縮及び追跡のための方法である。
【図2A】図２Ａ～図２Ｄは、実施例１に従って、ヒトＰＢＭＣから単離されたＴｒｅｇのイン・ビトロ拡大及び表現型検証に関連するデータを示している。図２Ａは、ＣＤ４ ＋ ＣＤ２５ｈｉ Ｔｒｅｇ（Ｒ２ボックス）が、ＣＤ４及びＣＤ２５濃縮単離前のヒトＰＢＭＣの総Ｔ細胞のごく一部を表していたことを実証したデータを示している。図２Ｂは、現在のＴｒｅｇ増殖プロトコルを用いて培養した１７日後に、ＣＤ４ ＋ ＣＤ２５ｈｉが分離したＴｒｅｇが１７６０倍に増殖したことを実証したデータを示している。図２Ｃは、１７日目のＴｒｅｇが細胞内ＦｏｘＰ３を発現したことを実証するデータを提示している。図２Ｄは、ＦｏｘＰ３、トランケートされたＣＤ１９（ｔＣＤ１９）、及びＣＡＲ ｓｃＦｖが、１０日目と１１日目に形質導入されたほとんどの１７日目のＴｒｅｇで検出されたことを実証するデータを提示している。
【図2B】同上。
【図2C】同上。
【図2D】同上。
【図3A】図３Ａ～図３Ｂは、実施例１に従って、例示的に変更されたＣＡＲの機能検証に関連するデータを示している。図３Ａは、Ａβ１－４２ペプチドのオリゴマー化に関連するデータを示している。図３Ｂは、実施例１に従って、改変されたヒトＴ細胞に含まれるＣＡＲの結合特異性と機能に関連するデータを示している。
【図3B】同上。
【図7A】図７Ａ～図７Ｄは、エフェクターＴ細胞増殖の抑制（図７Ａ）、細胞内ＦｏｘＰ３の発現（図７Ｂ）、及びｔＣＤ１９＋細胞の精製（図７Ｃ－図Ｄ）を、陰性選択を使用して単離したＣＤ４＋ＣＤ１２７－ Ｔ細胞と、それに続くＣＤ２５ｈｉ細胞の陽性選択で構成されるＴｒｅｇ単離方法に従って、ＣＤ４＋ＣＤ１２７－ＣＤ２５ｈｉ Ｔｒｅｇ細胞を単離し、実施例４に記載されたような抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２多量体を実証するデータを提示している。
【図7B】同上。
【図7C】同上。
【図7D】同上。
【図8】図８は、実施例４に従って、３つの例示的な抗変異型ＳＯＤ１ ＣＡＲ（ＤＧ０５、ＤＧ０６、及びＤＧ０７という名前）に関連するデータと、ＳＯＤ１のＧ９３Ａ変異型に対する抗原特異的活性を示している。陰性対照の抗Ｂ７Ｈ６ ＣＡＲは、変異したＳＯＤ１には反応しない。
【図9】図９は、例４に従って、ヒトＰＢＭＣから単離されたＴｒｅｇの表現型検証に関連するデータを示している。ＣＤ３、ＦｏｘＰ３、ＣＤ４、トランケートされたＣＤ１９（ｔＣＤ１９）、及びプロテインＬ標識を有するＣＡＲ ｓｃＦｖが、抗変異型ＳＯＤ１ ＣＡＲ（ＤＧ０５－２８ｚ）で１０日目と１１日目に形質導入されたほとんどの１７日目のＴｒｅｇで検出された。
【図10】図１０は、例４に従って、ヒトＰＢＭＣから単離されたＴｒｅｇの表現型検証に関連するデータを示している。抗変異型ＳＯＤ１ ＣＡＲ（ＤＧ０５－２８ｚ）または抗ＡβＣＡＲ（ＤＧ０３－２８ｚ）で１０日目及び１１日目に形質導入されたほぼ１７日目のＴｒｅｇの散布図、ＣＤ４及びＦｏｘＰ３である。
【図11】図１１は、実施例５に従って、例示的な抗変異型ＳＯＤ１ ＣＡＲの抗原特異的活性を実証するデータを提示している。１７日目までにプレート結合した変異型ＳＯＤ１または可溶性オリゴマー化Ａβ１－４２に反応したＩＬ－１０産生を、抗変異型ＳＯＤ１ ＣＡＲ（ＤＧ０５－２８ｚ）または抗ＡβＣＡＲ（ＤＧ０３－２８ｚ）で１０日目及び１１日目に形質導入したＴｒｅｇである。
【図12】図１２は、実施例５に従って、例示的な抗変異型ＳＯＤ１ ＣＡＲの抗原特異的活性を実証するデータを提示している。抗変異型ＳＯＤ１ ＣＡＲ（ＤＧ０５、ＤＧ０６、及びＤＧ０７と呼ばれる）または陰性対照の抗Ｂ７Ｈ６ ＣＡＲを発現するように形質導入されたヒトＴエフェクター細胞によってプレート結合ストレプトアビジン（ＳＡ）に連結されたビオチン化した野生型または変異型ＳＯＤ１に対するＩＦＮγ産生である。
【図15】図１５は、例７に従って、例示的に改変されたＴｒｅｇの機能的活性を実証するデータを提示している。１７日目までにプレート結合したα－シヌクレイン、または可溶性オリゴマー化したα－シヌクレインまたはＡβ１－４２に対するＩＬ－１０産生を、抗α－シヌクレインＣＡＲ（ＤＧ１０－ ２８ｚ）または抗ＡβＣＡＲ（ＤＧ０３－２８ｚ）で１０日目及び１１日目に形質導入したＴｒｅｇである。
【図16A】図１６Ａ～図１６Ｂ は、異なる共刺激シグナル伝達ドメインを有する、ＣＤ３ｚｅｔａ（３ζ）刺激ドメインの有無にかかわらず、抗ｍＳＯＤ１ ＣＡＲの発現（図１６Ａ）及び機能（図１６Ｂ）を実証するデータを提示している。これは、実施例８に従ったエクス・ビボ拡大及びＣＡＲで形質導入されたヒトＴｒｅｇである。
【図16B】同上。
【図17A】図１７Ａ～図１７Ｂは、異なる共刺激シグナル伝達ドメインを有する、ＣＤ３ｚｅｔａ（３ζ）刺激ドメインの有無にかかわらず、抗Ａβ ＣＡＲの発現（図１７Ａ）及び機能（図１７Ｂ）を実証するデータを提示している。これは、実施例９に従った、エクス・ビボの拡大及びＣＡＲで形質導入されたヒトＴｒｅｇである。
【図17B】同上。
【図18】図１８は、実施例１０に従って、ＧＩＴＲやＰＤ－１、及びＣＴＬＡ－４の細胞表面発現とＩＬ－１０の産生を評価するアッセイによって示されるように、抗変異型ＳＯＤ１ ＣＡＲの抗原特異的活性を実証するデータを提示ししている。細胞表面発現マーカーに関連する６つのプロットのそれぞれについて報告された数値は上から下に、メディア、ビーズ（Ａｇなし）、及びｍＳＯＤ１ビーズに対応する。
【図19A】図１９Ａ～図１９Ｂは、実施例１１に従って、ヒトｍＳＯＤ１を発現するトランスジェニックマウス（図１９Ａ）から得られた脊髄組織外植片と前記の改変されたＴｒｅｇを共培養すること、及びヒトｍＳＯＤ１を発現するトランスジェニックマウス（図１９Ｂ）から得られた脊髄、肝臓または肺組織と改変されたＴｒｅｇを共培養することからなるアッセイによって、ＡＬＳを標的とする改変されたＴｒｅｇの機能的活性を実証するデータを提示している。脊髄組織は、非トランスジェニックマウスまたはｍＳＯＤ１トランスジェニックマウスから、疾患発生の様々な段階で収集した。１３週（参照は図１９Ａ：麻痺前）、１４週（参照は図１９Ａ：臨床発症）、１６週（参照は図１９Ａ：麻痺）、または１８週（１５％の体重減少及び後肢麻痺として定義される疾患末期週、参照は図１９Ｂ）。また、肝臓及び肺は、疾患末期のｍＳＯＤ１トランスジェニックマウスから収集された（参照は図１９Ｂ）。
【図19B】同上。
【図20A】図２０Ａ～図２０Ｂは、実施例１２に従って、アルツハイマー病を標的とする改変されたＴｒｅｇの機能的活性を示すデータを提示する。前記の改変されたＴｒｅｇは、オリゴマー化されたＡβに曝露され、次にＩＬ－１０及びＩＬ－４のｍＲＮＡレベル（図２０Ａ）そしてＩＬ－１０及びＩＬ－４のタンパク質分泌レベル（図２０Ｂ）がモニターされた。
【図20B】同上。
【図21A】図２１Ａ～図２１Ｃは、実施例１３に従って、抗変異型ＳＯＤ１ ＣＡＲの抗原特異的抗炎症活性を実証するデータを提示している。図２１Ａは、実施例１３に従って、ＰＭＡで刺激されたスーパーオキシド生成の抑制が評価されたアッセイに関連するデータを示している。図２１Ｂは、実施例１３に従って、ザイモサンで刺激されたスーパーオキシド生成の抑制が評価されたアッセイに関連するデータを示している。図２１Ｃは、実施例１３に従って、ＴＮＦ－α生成の抑制が評価されたアッセイに関連するデータを示している。
【図21B】同上。
【図21C】同上。
【図22A】図２２Ａ～図２２Ｃは、実施例１４に従って、抗ＡβＣＡＲの抗原特異的抗炎症活性を実証するデータを提示している。図２２Ａは、実施例１４に従って、ＰＭＡで刺激されたスーパーオキシド生成の抑制が評価されたアッセイに関連するデータを示している。図２２Ｂは、実施例１４に従って、ザイモサンで刺激されたスーパーオキシド生成の抑制が評価されたアッセイに関連するデータを示している。図２２Ｃは、実施例１４に従って、ＩＬ－６生成の抑制が評価されたアッセイに関連するデータを示している。
【図22B】同上。
【図22C】同上。
【図23A】図２３Ａ～図２３Ｂは、実施例１５に従って、ヒトＴｒｅｇで発現された神経変性疾患修飾分子（ＮＤＭＭ）の細胞保護活性を実証するデータを提示ししている。図２３Ａは、実施例１５に従って、Ｎｒｆ２（Ｋｅａｐ１阻害剤ペプチド）及びヒトカタラーゼのＮＤＭＭ構成物を評価したアッセイに関連するデータを示している。図２３Ｂは、実施例１５に従って、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）及びインスリン成長因子－１（ＩＧＦ－１）のＮＤＭＭ構成物を評価したアッセイに関連するデータを示している。
【図23B】同上。
【発明を実施するための形態】
【0027】
本開示は一般的に、ＣＡＲを符号化する核酸構成物の構成、特に神経変性疾患または病態を有する対象者のＣＮＳで異常に発現されるタンパク質を標的とする核酸構成物に関する内容で、そして／またはＣＮＳ部位での酸化／炎症活性を防止または抑制する特定の分子を符号化し、そして／または神経細胞の増殖／生存を促進する分子、またはＴ細胞の機能を促進する分子を符号化している。さらに、本開示は一般的に、組換え細胞または改変された細胞、特に組換えＴｒｅｇまたは改変されたＴｒｅｇ、好ましくはそのようなＣＡＲ及び／またはそのような構成物によって発現される他の分子を発現するように改変されたヒトＴｒｅｇの調製における、これらの核酸構成物の使用に関する内容である。例示的な実施形態では、これらの組換えＴｒｅｇまたは改変されたＴｒｅｇは、１つ以上のＣＡＲを発現するように改変されることがあり、前記の１つ以上のＣＡＲは、特定の神経変性疾患及び病態に関連する異なるタンパク質及び／または分子マーカーを標的とし得る。これらのＣＡＲは、ＣＤ２８－ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ、ＣＤ４４－ＣＤ３ζ、ＣＤ２８またはＣＤ３ζなどの共刺激シグナル伝達またはＴ細胞シグナル伝達部分、もしくは別の共刺激シグナル伝達またはＴ細胞シグナル伝達部分を任意でさらに含むことができる。その上、本発明による改変されたＴｒｅｇは、ＣＡＲと同一または異なる核酸構成物上にあるか、またはＣＡＲを含まない改変されたＴｒｅｇ上に発現され得る、１つ以上の神経変性疾患修飾分子（ＮＤＭＭ）を発現するよう、改変され得る 。本開示は特に、神経変性疾患及び／または神経変性疾患修飾分子（ＮＤＭＭ）を標的とする１つ以上の特定のＣＡＲを発現する改変されたＴｒｅｇ、当該改変されたＴｒｅｇを含む医薬組成物、並びにこれらの改変されたＴｒｅｇを製造及び使用する方法を意図している。また、本開示は神経変性疾患、障害、または病態、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、及びこれらの改変されたＴｒｅｇを使用する神経炎症などの対象者を治療する方法を提供する。
【0028】
本開示の別の特定した側面は、抗酸化剤、神経成長因子及び／または非古典的な神経栄養因子などの特定のタイプの神経変性疾患修飾分子（「ＮＤＭＭ」）を符号化する、外因的に導入されたポリヌクレオチドを含む改変されたＴｒｅｇの構築及び使用に関する内容である。また、本開示はこのような改変されたＴｒｅｇを生成するためのベクター、１つ以上のＣＡＲ及び／または１つ以上のＮＤＭＭを発現する、このような改変されたＴｒｅｇを含む医薬組成物、並びに特定の神経変性疾患の治療における１つ以上のＣＡＲ及び１つ以上のＮＤＭＭの組み合わせを発現する、改変されたＴｒｅｇを製造及び使用する方法を提供する。
【0029】
定義
本明細書で使用される場合、「神経変性疾患」、「神経変性障害」、及び「神経変性症状」という用語は、一般に、脳のニューロン及び／または神経系のニューロンなどの神経細胞（「神経細胞」と呼ばれる場合がある）に影響を与える任意の疾患、障害、及び／または病態を指し、神経細胞の変性または喪失に関連している。しばしば、神経変性疾患は、神経細胞の進行性の変性及び／または死をもたらし得ることがよくある。一般に、神経変性はニューロンの死を含むニューロンの構造または機能の進行性の喪失である。神経変性疾患は、運動障害（失調症と呼ばれる）、または精神機能または認知機能（認知症と呼ばれる）に問題を引き起こす可能性がある。多くの場合、神経変性は神経炎症に関連しており、実際、多くの衰弱性神経変性疾患の発症、進行、または原因は神経炎症が関与していると考えられている。従って、神経変性疾患及び神経変性障害などの用語は、神経炎症によって特徴付けられる神経疾患を包含すると理解されるべきである。このような疾患では、時には活性化ミクログリアが炎症性サイトカインを生成して広範囲の炎症に寄与することがあり、神経変性症状及び／または疾患に繋がる、及び／または引き起こす可能性がある。さらに、いくつかの神経変性疾患及び／または病態は、ミクログリア細胞の過剰活性化、ミクログリア細胞数の増加、炎症性タンパク質及び／または炎症性活性の産生、及び／またはニューロン死に関連している。このような神経変性疾患の例としては、例えばアルツハイマー病などの認知症、パーキンソン病及びその他のパーキンソン病関連疾患、プリオン病、ＡＬＳ以外の運動ニューロン疾患、ハンチントン病、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、フリードライヒ失調症、レビー小体病、てんかん、多発性硬化症、脳炎、水頭症、脳卒中、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、シヌクレイン症、タウオパチー、海綿状脳症、家族性アミロイドポリニューロパチー、アミロイドーシスを伴うオランダ性遺伝性脳出血、コンゴーレッド親和性血管障害、大脳皮質基底核変性症、ピック病、進行性核上性麻痺、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、致命的な家族性不眠症、クールー病、ウシ海綿状脳症、スクレイピー、慢性消耗性疾患、アルツハイマー病のレビー小体変種、びまん性レビー小体病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、脳の鉄沈着タイプＩを伴う遺伝性神経変性症；びまん性レビー小体病、前頭側頭葉変性症、歯状核赤核・淡蒼球ルイ体萎縮症、ケネディ病、アレクサンダー病、コケイン症候群、アミロイドーシスを伴うアイスランド性遺伝性脳出血などが挙げられる。例示的な実施形態では、神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、及び／またはＡＬＳを含むことができる。例示的な実施形態では、本明細書に記載されるような改変されたＴｒｅｇ細胞は、これらの神経変性疾患及び他の神経変性疾患を治療する方法において使用され得る。
本明細書で使用される場合、「神経変性疾患」、「神経変性障害」、及び「神経変性症状」という用語は、一般に、脳のニューロン及び／または神経系のニューロンなどの神経細胞（「神経細胞」と呼ばれる場合がある）に影響を与える任意の疾患、障害、及び／または病態を指し、神経細胞の変性または喪失に関連している。しばしば、神経変性疾患は、神経細胞の進行性の変性及び／または死をもたらし得ることがよくある。一般に、神経変性はニューロンの死を含むニューロンの構造または機能の進行性の喪失である。神経変性疾患は、運動障害（失調症と呼ばれる）、または精神機能または認知機能（認知症と呼ばれる）に問題を引き起こす可能性がある。多くの場合、神経変性は神経炎症に関連しており、実際、多くの衰弱性神経変性疾患の発症、進行、または原因は神経炎症が関与していると考えられている。従って、神経変性疾患及び神経変性障害などの用語は、神経炎症によって特徴付けられる神経疾患を包含すると理解されるべきである。このような疾患では、時には活性化ミクログリアが炎症性サイトカインを生成して広範囲の炎症に寄与することがあり、神経変性症状及び／または疾患に繋がる、及び／または引き起こす可能性がある。さらに、いくつかの神経変性疾患及び／または病態は、ミクログリア細胞の過剰活性化、ミクログリア細胞数の増加、炎症性タンパク質及び／または炎症性活性の産生、及び／またはニューロン死に関連している。このような神経変性疾患の例としては、例えばアルツハイマー病などの認知症、パーキンソン病及びその他のパーキンソン病関連疾患、プリオン病、ＡＬＳ以外の運動ニューロン疾患、ハンチントン病、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、フリードライヒ失調症、レビー小体病、てんかん、多発性硬化症、脳炎、水頭症、脳卒中、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、シヌクレイン症、タウオパチー、海綿状脳症、家族性アミロイドポリニューロパチー、アミロイドーシスを伴うオランダ性遺伝性脳出血、コンゴーレッド親和性血管障害、大脳皮質基底核変性症、ピック病、進行性核上性麻痺、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、致命的な家族性不眠症、クールー病、ウシ海綿状脳症、スクレイピー、慢性消耗性疾患、アルツハイマー病のレビー小体変種、びまん性レビー小体病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、脳の鉄沈着タイプＩを伴う遺伝性神経変性症；びまん性レビー小体病、前頭側頭葉変性症、歯状核赤核・淡蒼球ルイ体萎縮症、ケネディ病、アレクサンダー病、コケイン症候群、アミロイドーシスを伴うアイスランド性遺伝性脳出血などが挙げられる。例示的な実施形態では、神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、及び／またはＡＬＳを含むことができる。例示的な実施形態では、本明細書に記載されるような改変されたＴｒｅｇ細胞は、これらの神経変性疾患及び他の神経変性疾患を治療する方法において使用され得る。
【0030】
本明細書で使用される場合、「神経炎症」という用語は、一般的に神経組織の炎症を指す。時々、活性化ミクログリアが炎症性サイトカインを生成して広範囲の炎症に寄与することがあり、神経変性症状及び／または疾患に繋がる、及び／または引き起こす可能性がある。一部の例では、神経炎症は、感染症、外傷性脳損傷、毒性代謝物、及び／または自己免疫を含む、様々な手がかりに反応して開始される可能性がある。脳や脊髄を含む中枢神経系（ＣＮＳ）では、ミクログリアはこれらの手がかりに反応して活性化される常在の自然免疫細胞であり、一般的に活性酸素を発生させ、炎症反応のために末梢免疫細胞を動員するシグナルを放出する。また、サイトカインは神経炎症の部位に存在する可能性があり、そして／または神経炎症を引き起こす場合がある。そして一部の実施形態では、それらはミクログリアまたはマクロファージによって産生され得る。例示的な実施形態では、神経炎症は神経変性疾患、例えばアルツハイマー病、ＡＬＳ、及びパーキンソン病に関連し得る、及び／またはその間に起こり得る。
【0031】
「炎症」という用語は、様々な細胞型、タンパク質、体液性因子、及び組織によって媒介される広範な生理学的応答を指す。炎症は、免疫システムが病原体や望ましくない病態を排除するのを助けるために体内に信号を送ることができるが、不適切なレベルまたは変化した種類の炎症は、体内に多くの生理学的または免疫学的問題を引き起こす可能性がある。このような炎症は、自己免疫疾患、線維性疾患、慢性感染症、アレルギーなどの様々な疾患の病態に直接関与する可能性がある（Ｌａｒｉａ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， “Ｔｈｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｉｎ ｒｈｅｕｍａｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅｓ”， Ｊ Ｉｎｆｌａｍｍ Ｒｅｓ． ２０１６ Ｆｅｂ ９；９： ｐ．１－１１； Ｗｙｎｎ， Ｔ．Ａ．， ａｎｄ Ｒａｍａｌｉｎｇａｍ， Ｔ．Ｒ．， “Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｆｉｂｒｏｓｉｓ： ｆｉｂｒｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｆｉｂｒｏｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅｓ”， Ｎａｔ Ｍｅｄ， ２０１２ Ｊｕｌ ６；１８（７）： ｐ． １０２８－４０； Ｙａｎｇ， Ｚ．Ｐ．， Ｋｕｏ， Ｃ．Ｃ．， ａｎｄ Ｇｒａｙｓｔｏｎ， Ｊ．Ｔ， “Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｌａｍｉｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｉｎｔｒａｎａｓａｌ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ”， Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ． １９９５ Ｍａｒ；１７１（３）： ｐ． ７３６－８ ； Ｊｉａｎ， Ｚ．， ａｎｄ Ｚｈｕ， Ｌ．， “Ｕｐｄａｔｅ ｏｎ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｉｎ ａｓｔｈｍａ”， Ｊ Ａｓｔｈｍａ Ａｌｌｅｒｇｙ， ２０１６ Ｊｕｎ ３；９： ｐ． １０１－７）。また、炎症は間接的に多くの疾患の症状を悪化させたり、病因、例えば癌、肥満、代謝性疾患、及びアテローム性動脈硬化症（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ， Ｌ．Ｍ．， ａｎｄ Ｗｅｒｂ， Ｚ．， “Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ”． Ｎａｔｕｒｅ． ２００２ Ｄｅｃ １９－２６；４２０（６９１７）： ｐ． ８６０－７； Ｍｏｎｔｅｉｒｏ， Ｒ．， ａｎｄ Ａｚｅｖｅｄｏ， Ｉ．， “Ｃｈｒｏｎｉｃ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｏｂｅｓｉｔｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ”， Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ Ｉｎｆｌａｍｍ． ２０１０；２０１０； Ｌｉｂｂｙ， Ｐ．， “Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ”， Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ． ２００６ Ｆｅｂ；８３（２）： ｐ． ４５６Ｓ－４６０Ｓ）などの心血管疾患において、発症を助ける役割を果たすことができる。
【0032】
本明細書で使用される「神経変性疾患修飾分子」または「ＮＤＭＭ」という用語は、一般的に神経変性疾患、障害、または病態の症状、進行または発症を変更（低減、改善または予防）できる分子を指す。代表的な神経変性疾患には、例としてアルツハイマー病、ＡＬＳ、パーキンソン病、及びその他の神経炎症性疾患などが含まれる。そのようなＮＤＭＭ分子の例には、ＩＬ－３７、ＩＬ－１２、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＣＣＬ２、ＴＮＦＡＩＰ３及び疾患関連タンパク質の発現レベル、活性化状態、または機能を変化させることができる他の分子が含まれるが、これらに限定されない。例示的な実施形態では、ＮＤＭＭは１つ以上のサイトカインを含むことができる。他の例示的な実施形態では、ＮＤＭＭは酸化／炎症活性を防止する分子を含むことができる。他の例示的な実施形態では、ＮＤＭＭは、ニューロンの成長及び／または生存を促進する分子を含むことができる。例示的な実施形態では、ＮＤＭＭは本明細書でさらに詳細に論じるように、本発明による改変されたＴｒｅｇ、例えば、１つ以上のＣＡＲを含む、改変されたＴｒｅｇによって表現することができる。さらに、ＮＤＭＭは１つ以上の親ニューロン因子、１つ以上の抗酸化剤、１つ以上の神経成長因子、及び／または１つ以上の非古典的神経栄養因子を含むことができる。親ニューロン因子の例には、インターロイキン－１受容体拮抗薬（ＩＬ－１ｒａ）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）、トロンボモジュリン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、タンパク質デグリカーゼＤＪ－１、メタロプロテイナーゼ（ＴＩＭＰ）の組織阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。抗酸化剤の例には、ＨＯ－１、フェリチン、グルタチオン還元酵素、グルタチオンペルオキシダーゼ、フェリチン（Ｈ）、メタロチオネインＩ、チオレドキシン、チオレドキシン還元酵素、ペルオキシレドキシンＭＳＰ２３、Ｃｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、ＮＲＦ２活性、ペルオキシレドキシン（Ｐｒｘｓ）、活動依存性神経保護剤ホメオボックス（ＡＤＮＰ）、フィコシアニン、ニューログロビンなどが挙げられるが、これらに限定されない。神経成長因子の例には、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）などの古典的なニューロトロフィンが含まれるが、これらに限定されない。非古典的な神経栄養因子の非限定的な例には、インスリン様成長因子－１（ＩＧＦ－１）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、及び顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）が挙げられる。一部の実施形態では、ＮＤＭＭ発現は、例えば当該分野で公知のものを使用して、誘導性プロモーターシステムによって制御されることがあり、そして／またはＮＤＭＭの発現は、ＣＡＲ誘発性転写制御によって調節され得る。
【0033】
本明細書で使用される「５'キャップ」（ＲＮＡキャップ、ＲＮＡ ７－メチルグアノシンキャップまたはＲＮＡ ｍ７Ｇキャップとも呼ばれる）は、転写開始直後に真核生物のメッセンジャーＲＮＡの「フロント」または５'末端に付加された修飾グアニンヌクレオチドである。５'キャップは、最初に転写されたヌクレオチドにリンクされた末端基で構成されている。その存在は、リボソームによる認識とＲＮａｓｅからの保護にとって重要である。キャップの付加は転写と連動しており、それぞれが互いに影響し合うように共転写的に発生する。転写開始直後に、合成されるｍＲＮＡの５'末端は、ＲＮＡポリメラーゼに関連するキャップ合成複合体によって結合される。この酵素複合体は、ｍＲＮＡのキャッピングに必要な化学反応を触媒する。合成は、多段階の生化学反応として進行する。キャッピング部分は、ｍＲＮＡの安定性や翻訳効率などの機能を調節するように修飾できる。
【0034】
「同種」または「ドナー由来」という用語は一般的に、材料が導入または移植される個体と同一種の異なる動物に由来する任意の材料を指す。１つ以上の遺伝子座の遺伝子が同一でない場合、２つ以上の個体は互いに同種であると言われる。いくつかの側面において、同種の個体からの同種異系物質は、抗原的に相互作用するのに、十分に遺伝的に類似していない場合がある。
【0035】
本明細書で使用する「抗体」または「Ａｂ」という用語は、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子を指す。一部の実施形態では、抗原は神経変性疾患及び／または病態を含む対象者において、ニューロンにより発現されるかまたは異常に発現される分子であり得る。そのような疾患及び病態の例には、アルツハイマー病、パーキンソン病、及びＡＬＳが含まれるが、これらに限定されない。さらなる非限定的な例としては、プリオン病、ＡＬＳ以外の運動ニューロン疾患、ハンチントン病、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、フリードライヒ失調症、レビー小体病、てんかん、多発性硬化症、脳炎、水頭症、脳卒中、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、シヌクレイン症、タウオパチー、海綿状脳症、家族性アミロイドポリニューロパチー、アミロイドーシスを伴うオランダ性遺伝性脳出血；、コンゴーレッド親和性血管障害、大脳皮質基底核変性症、ピック病、進行性核上性麻痺、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、致命的な家族性不眠症、クールー症、ウシ海綿状脳症、スクレイピー、慢性消耗性疾患；アルツハイマー病のレビー小体変種、びまん性レビー小体病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、脳の鉄蓄積タイプＩを伴う遺伝性神経変性症、びまん性レビー小体病、前頭側頭葉変性症、歯状核赤核・淡蒼球ルイ体萎縮症、ケネディ病、アレクサンダー病、コケイン症候群、アミロイドーシスを伴うアイスランド性遺伝性脳出血が挙げられる。抗体は、天然源または組換え源に由来する無傷免疫グロブリンであり、無傷免疫グロブリンの免疫反応性部分であり得る。この用語は最も広い意味で使用され、無傷抗体及び機能的（抗原結合）抗体断片を含む、ポリクローナル及びモノクローナル抗体が含まれ、またフラグメント抗原結合性（Ｆａｂ）フラグメント、Ｆ（ａｂ'）２フラグメント、Ｆａｂ'フラグメント、Ｆｖフラグメント、組換えＩｇＧ（ｒＩｇＧ）フラグメントを含む一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、及び単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ｓｄＦｖ、ナノボディなど）断片などを包含する。この用語は、遺伝子操作及び／またはその他の方法で改変された免疫グロブリンの形態、例えばイントラボディ、ペプチボディ、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、及びヘテロコンジュゲート抗体、多重特異性、例えば二重特異性、抗体、ダイアボディ、トリアボディ、及びテトラボディ、タンデムｄｉ－ｓｃＦｖ、タンデムｔｒｉ－ｓｃＦｖなどを包含する。特に明記しない限り、「抗体」という用語は、その機能的抗体フラグメントを包含すると理解されるべきである。この用語はまた、ＩｇＧ及びそのサブクラス、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、及びＩｇＤを含む、任意のクラスまたはサブクラスの抗体も含まれ、無傷または全長抗体を包含する。
【0036】
「抗体フラグメント」または「Ａｂフラグメント」という用語は、無傷抗体の一部を指し、無傷抗体の抗原決定可変領域を指す。抗体フラグメントの例には、フラグメント抗原結合性（Ｆａｂ）フラグメント、Ｆ（ａｂ'）２フラグメント、Ｆａｂ'フラグメント、Ｆｖフラグメント、組換えＩｇＧ（ｒＩｇＧ）フラグメント、一本鎖抗体フラグメント、また、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ｓｄＦｖ、ナノボディなど）フラグメント、ダイアボディ、及び抗体フラグメントから形成された多重特異的抗体が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な実施形態では、抗体フラグメントは、ｓｃＦｖであり得る。
【0037】
本明細書で使用される「抗体重鎖」は、天然に存在する立体配座のすべての抗体分子に存在する２つの種類のポリペプチド鎖のうち大きい方を指す。
【0038】
本明細書で使用される「抗体軽鎖」は、天然に存在する立体配座のすべての抗体分子に存在する２つの種類のポリペプチド鎖のうちの小さい方を指す。カッパ及びラムダ軽鎖は、２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。
【0039】
本明細書で使用される「合成抗体」という用語は、例えば、本明細書に記載されるバクテリオファージによって発現される抗体などの、組換えＤＮＡ技術を使用して生成される抗体を意味する。また、この用語は抗体を符号化するＤＮＡ分子の合成によって生成され、そのＤＮＡ分子が抗体タンパク質を発現する抗体、または抗体を特定するアミノ酸配列を意味すると解釈されるべきであり、ここでＤＮＡまたはアミノ酸配列は当技術分野で入手可能であり、周知の合成ＤＮＡまたはアミノ酸配列技術を使用して得られた。
【0040】
「抗原」または「Ａｇ」という用語は、免疫応答を誘発する分子を指す。この免疫応答には、抗体産生、特定の免疫学的に適合した細胞の活性化のいずれか、またはその両方が含まれる。当技術分野の熟練者は、実質的にすべてのタンパク質またはペプチドを含むあらゆる高分子が抗原として機能し得ることを理解するであろう。さらに、抗原は組換えＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに由来し得る。従って、当技術分野の熟練者は、免疫応答を誘発するタンパク質を符号化するヌクレオチド配列または部分ヌクレオチド配列を含むあらゆるＤＮＡが、その用語が本明細書で使用される「抗原」を符号化することを理解するであろう。さらに当技術分野の熟練者は、抗原が遺伝子の全長ヌクレオチド配列によってのみ符号化される必要がないことを理解するであろう。本発明が複数の遺伝子の部分ヌクレオチド配列の使用を含むがこれらに限定されないこと、及びこれらのヌクレオチド配列が所望の応答を誘発するポリペプチドを符号化するために、様々な組み合わせで配置されることは容易に明らかである。さらに、当技術分野の熟練者は、抗原が「遺伝子」によって符号化される必要がないことを理解するであろう。抗原は生物学的サンプルから生成、合成、または由来することができ、またはポリペプチド以外の高分子であり得ることは容易に明らかである。そのような生物学的サンプルは、組織サンプル、神経組織サンプル、炎症組織サンプル、細胞、または他の生物学的成分を含む流体を含むことがあるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、抗原は神経変性疾患または病態、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、及びＡＬＳで発現される分子である。例示的な実施形態では、抗原は神経変性疾患または病態に関連する可能性がある、以下のいずれか１つ以上の形態であり得る：アミロイド－ベータ１－４２、α－シヌクレイン、スーパーオキシドジスムターゼ－１（ＳＯＤ－１）、過リン酸化タウタンパク質、ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ－４３）、染色体９オープンリーディングフレーム７２（ｃ９ｏｒｆ７２）、β－シヌクレイン、γ－シヌクレイン、肉腫に融合したＲＮＡ結合タンパク質（ＦＵＳ）、ユビキチン、ユビキリン－２、ｐ６２、オプチニューリン、アタキシン－２、パーキン、セリン／スレオニンタンパク質キナーゼＰＩＮＫ１、ロイシンリッチリピートセリン／スレオニンプロテインキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）。一部の実施形態では、抗原は神経変性疾患または病態に関連することがあり、以下のうちのいずれか１つ以上の形態であり得る：タンデムグルタミンリピートを伴うハンチントン、プリオンタンパク質、トランスサイレチン、歯状核赤核・淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）タンパク質、アンドロゲン受容体、アタキシン、Ｐ／Ｑ型のカルシウムチャネルα１Ａサブユニット、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質、グリア線維性酸性タンパク質、ＤＮＡ除去修復タンパク質ＥＲＣＣ－６、生存運動ニューロンタンパク質、シスタチンＣ．
【0041】
「抗原結合ドメイン」または「ＡＢドメイン」という用語は、特定の抗原に対して特異性を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の１つ以上の細胞外ドメインを指す。
【0042】
本明細書で使用される「アフェレーシス」という用語は、ドナーまたは患者の血液がドナーまたは患者から取り出され、選択された特定の成分を分離し、残りをドナーまたは患者の循環に戻す装置を通過することによって、例えば、再輸液によって芸術的に認識された体外プロセスを指す。従って、「アフェレーシスサンプル」の文脈では、アフェレーシスを使用して得られたサンプルを指す。
【0043】
「自家」という用語は、後で再導入される同一個人に由来するあらゆる資料を指す。
【0044】
「結合」という用語は、分子が互いに非常に接近している安定した結合をもたらす２つの分子間の引力相互作用を指す。分子結合の結果として、分子複合体が形成されることがある。この場合、成分を一緒に保持する引力は一般的に非共有結合であり、通常は共有結合よりもエネルギー的に弱い。
【0045】
「ＣＤ２８」という用語は、Ｔ細胞の活性化と生存に必要な共刺激シグナルを提供する、Ｔ細胞で発現されるタンパク質の１つである分化クラスター２８のタンパク質を指す。マウスＣＤ２８タンパク質は、ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿０３１６６８．３または刺激活性を有するそのフラグメントとの少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有している可能性がある。ヒトＣＤ２８タンパク質は、ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿００６１３０または刺激活性を有するそのフラグメントとの少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有している可能性がある。
【0046】
「ＣＤ３ゼータ」、または「ゼータ」、「ζ」、「ゼータ鎖」、「ＣＤ３－ゼータ」、「ＣＤ３ｚ」、「ＴＣＲ－ゼータ」、「ＣＤ２４７」、または「ＣＤ３ζ」という用語は、遺伝子位置１ Ｈ２．３； １ ７３．１４ ｃＭのマウスでは１番染色体上のＣＤ２４７遺伝子、及び遺伝子位置１ｑ２４．２のヒトでは１番染色体上のＣＤ２４７遺伝子によって符号化されるタンパク質である。ＣＤ３ζは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びＣＤ３（ＣＤ３γ、ＣＤ３δ及び２つのＣＤ３εから構成されるタンパク質複合体）と共に、ＴＣＲ複合体を形成する。マウスＣＤ３ζは、ＮＰ＿００１１０６８６４．１、ＮＰ＿００１１０６８６３．１、ＮＰ＿００１１０６８６２．１、またはＮＰ＿１１２４３９．１として提供されるアミノ酸配列、または非マウス種、例えばヒト、げっ歯類、サル、類人猿などに由来する同等の残基を含む場合がある。ヒトＣＤ３ζは、ＮＰ＿０００７２５またはＮＰ＿９３２１７０として提供されるアミノ酸配列、または非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿などに由来する同等の残基を含む場合がある。
【0047】
「ＣＤ３ゼータ細胞内シグナル伝達ドメイン」、あるいは「ＣＤ３ゼータＩＣＳドメイン」または「ＣＤ３ｚＩＣＳ」という用語は、ＣＤ３ゼータ鎖の細胞質ドメインからのアミノ酸残基、またはその機能的誘導体として定義され、Ｔ細胞の活性化に必要な初期シグナルを機能的に送信する。
【0048】
「４－１ＢＢ」または「ＢＢ」いう用語は、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ 番号ＡＡＡ５３１３３．１として提供されるアミノ酸配列を有するＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバー、または非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿などに由来する同等の残基を指す。一つの側面では、「４－１ＢＢ共刺激ドメイン」は、配列番号：１２として提供される配列、または非ヒト種、例えば、マウス、げっ歯類、サル、類人猿などに由来する同等の残基であり、そして／またはその配列は、配列番号：２１２の核酸によって符号化され得る。
【0049】
「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」という用語は、ポリペプチドの集合を指し、最も単純な実施形態では典型的には２個である。これは、免疫エフェクター及び／または調節細胞において発現されると、標的細胞に対する特異性を細胞に提供し、あらゆる細胞内シグナルの生成を促進する。本発明によるＣＡＲは、一般的に受容体またはリガンド結合部分、例えば、神経変性障害を含む対象者において異常に発現されるタンパク質を標的とする部分を含み、任意で、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ、ＣＤ４４－ＣＤ３ζ、ＣＤ２８－ＣＤ３ζまたは４－１ＢＢ－ＣＤ３ζなどの１つ以上の共刺激シグナル伝達またはＴ細胞シグナル伝達ドメインを含むことができる。 一部の実施形態では、ＣＡＲは、少なくとも細胞外抗原結合ドメイン（ＡＢドメイン）、膜貫通ドメイン（ＴＭドメイン）及び細胞質シグナル伝達ドメイン（本明細書では、「刺激性分子及び／または以下に定義されるような補体分子に由来する機能的シグナル伝達を含む「細胞内シグナル伝達ドメイン（ＩＣＳドメイン）とも呼ばれる）から構成されている。一部の側面では、ポリペプチドのセットは互いに隣接している。一部の実施形態では、ポリペプチドのセットは、二量体化分子の存在下でポリペプチドを互いに結合させる、例えば、ＡＢドメインをＩＣＳドメインに結合させることができる二量体化スイッチを含む。いくつかの側面において、刺激分子は、Ｔ細胞受容体複合体に関連するゼータ鎖である。いくつかの側面において、ＣＡＲの細胞質部分は、以下に定義される１つ以上の共刺激分子に由来する１つ以上の機能的シグナル伝達ドメインを含む共刺激ドメイン（ＣＳドメイン）をさらに含む。いくつかの側面において、共刺激分子は、本明細書に記載される共刺激分子、例えば、４－１ＢＢ（すなわち、ＣＤ１３７）、ＣＤ４４、ＤＡＰ１０及び／またはＣＤ２８から選択される。いくつかの側面において、ＣＡＲは細胞外ＡＢドメイン、ＴＭドメイン、及び刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む、ＩＣＳドメインからなるキメラ融合タンパク質で構成されている。いくつかの側面において、ＣＡＲは細胞外ＡＢドメイン、ＴＭドメイン、刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含むＩＣＳドメイン、及び共刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含むＣＳドメインからなるキメラ融合タンパク質で構成されている。いくつかの側面において、ＣＡＲは細胞外ＡＢドメイン、ＴＭドメイン、刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含むＩＣＳドメイン、及び２つのＣＳドメインのそれぞれが、互いに同一であるか、または異なるコスト調節分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインからなるキメラ融合タンパク質で構成されている。いくつかの側面において、ＣＡＲは細胞外ＡＢドメイン、ＴＭドメイン、刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含むＩＣＳドメイン、及び少なくとも２つのＣＳドメインのそれぞれが、同一かまたは異なる共刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質で構成されている。いくつかの側面において、ＣＡＲはＣＡＲ融合タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）に任意のリーダー配列を含む。さらに、いくつかの側面において、ＣＡＲは細胞外抗原結合ドメインのＮ末端にリーダー配列を含み、リーダー配列は、細胞処理及び細胞膜へのＣＡＲの局在化中に、抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）から任意で切断される。
【0050】
抗体に関して本明細書で使用される「競合」という用語は、第１抗体またはその抗原結合フラグメント（または一部）が、第２抗体またはその抗原結合部分と十分に類似した方法でエピトープに結合することを意味する。または第１抗体とその同族のエピトープとの結合の結果が、第２抗体の非存在下での第１抗体の結合と比較して、第２抗体の存在下で検出的にに減少することを意味する。第２抗体のそのエピトープへの結合が、第１抗体の存在下で検出的に減少する代替案は可能であるが、そうである必要はない。すなわち、第２抗体が第１抗体のそれぞれのエピトープへの結合を抑制することなく、第２抗体がそのエピトープへの結合を抑制することができる。ただし、各抗体が同族のエピトープまたはリガンドと他の抗体の結合を検出的に抑制する場合、その程度は同じか、多かれ少なかれ、抗体がそれぞれのエピトープの結合のために互いに「交差競合」すると言われている。競合する抗体と交差競合する抗体の両方が本発明に含まれる。そのような競合または交差競合が発生するメカニズム（例えば、立体障害、構造変化、または共通のエピトープまたはその一部への結合）に関係なく、当技術分野の熟練者は、本明細書に提供されている教示内容に基づいて、そのような競合抗体、及び／または交差競合抗体が包含され、本明細書に開示される方法に有用となる可能性がある。
【0051】
「相補性決定領域」及び「ＣＤＲ」という用語は、「超可変領域」または「ＨＶＲ」と同義であり、抗原特異性及び／または結合親和性を付与する抗体可変領域内のアミノ酸の非連続配列を指すことが、当技術分野で知られている。一般的に、各重鎖可変領域（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３）には３つのＣＤＲがあり、各軽鎖可変領域（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３）には３つのＣＤＲがある。「フレームワーク領域」及び「ＦＲ」は、重鎖及び軽鎖の可変領域の非ＣＤＲ部分を指すことが、当技術分野で知られている。一般的に、各完全長重鎖可変領域（ＦＲ－Ｈ１、ＦＲ－Ｈ２、ＦＲ－Ｈ３、及びＦＲ－Ｈ４）には４つのＦＲがあり、各完全長軽鎖可変領域（ＦＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３、及びＦＲ－Ｌ４）には４つのＦＲがある。
【0052】
本明細書での「共刺激分子」または「Ｔ細胞シグナル伝達部分」という用語は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによってＴ細胞による共刺激応答（増殖または特定のサイトカインの発現など）を媒介するＴ細胞上の同族結合パートナーを指すが、これに限定されない。共刺激分子は、効率的な免疫応答に寄与する抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子のことである。共刺激分子には、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、トールリガンド受容体、Ｂ７－Ｈ３、ＢＡＦＦＲ、ＢＴＬＡ、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ１９ａ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９Ｄ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ６９、ＣＤ８４、ＣＤ９６（触覚）、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ１０３、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＤＳ、ＣＲＴＡＭ、ＤＡＰ１０、ＧＡＤＳ 、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＩＡ４、ＩＣＡＭ－１、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＡＤ、ＩＴＧＡＥ、ＩＴＧＡＬ、ＩＴＧＡＭ、ＩＴＧＡＸ、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＢ２、ＩＴＧＢ７、ＫＩＲＤＳ２、ＬＡＴ、ＬＦＡ－１ 、ＬＩＧＨＴ、ＬＴＢＲ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＰＤ－１、ＰＳＧＬ１、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１ ０８）、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＰ－７６、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＶＬＡ１、ＶＬＡ－６、及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドからなる群から選択されるタンパク質が含まれるが、これらに限定されるものではない。ＣＡＲが１つ以上のＣＳドメインを含む実施形態では、各ＣＳドメインは、共刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、符号化されたＣＳドメインは、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、またはＤＡＰ１０のものである。
【0053】
「サイトカイン」という用語は、細胞シグナル伝達に関与する幅広いカテゴリーの小さなタンパク質を指す。一般的に、それらの放出はその周辺の細胞の行動に多少の影響を及ぼす。サイトカインは、免疫調節剤としてオートクリンシグナル伝達、パラクリンシグナル伝達、及び／または内分泌シグナル伝達に関与している可能性がある。サイトカインには、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、及び腫瘍壊死因子が含まれる。サイトカインは、マクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、マスト細胞などの免疫細胞や、内皮細胞、線維芽細胞、上皮細胞、様々な間質細胞など、幅広い細胞によって産生される。「ケモカイン」は、一般的に走化性の媒介に関与するサイトカインの一群である。
【0054】
「有効量」または「治療に有効な量」は、個体の疾患、病態、または障害を予防または治療するのに適切な用量を指す。治療的または予防的使用に有効な量は、例えば、治療されている疾患または障害の段階及び重症度、患者の年齢、体重、及び一般的な健康状態、及び処方する医師の判断に依存する。また、用量のサイズは、選択された活性物質、投与方法、投与のタイミング及び頻度、特定の活性物質の投与に伴った可能性のある有害な副作用の存在、性質、及び程度、並びに所望の生理学的効果によっても決定される。様々な疾患または障害は、おそらく各投与または様々な投与ラウンドで１つ以上の改変されたＴｒｅｇを使用して、複数回投与を伴う長期治療を必要とする可能性があることを当技術分野の熟練者は理解するであろう。
【0055】
「ヒンジ」、「スペーサー」、または「リンカー」という用語は、柔軟性、改善された空間構成、近接性などを付与するために、ポリペプチド構成物の２つ以上のドメインまたは一部の間に通常符号化される可変長のアミノ酸配列を指す。
【0056】
本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体、及び／または当技術分野の熟練者に知られているか、または本明細書に開示されているヒト抗体を製造するための技術のいずれかを使用して製造された抗体を意味する。ヒト抗体のこの定義には、少なくとも１つのヒト重鎖ポリペプチドまたは少なくとも１つのヒト軽鎖ポリペプチドからなる抗体が含まれる。その一例として、マウス軽鎖ポリペプチド及びヒト重鎖ポリペプチドからなる抗体が挙げられる。ヒト抗体は、当技術分野で知られている様々な技術を使用して生成することができる。一つの実施形態では、ヒト抗体はファージライブラリーから選択され、そのファージライブラリーはヒト抗体を発現する（Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １４：３０９－３１４， １９９６； Ｓｈｅｅｔｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ） ９５：６１５７－６１６２， １９９８； Ｈｏｇｅｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２７：３８１， １９９１； Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２２：５８１， １９９１）。また、ヒト抗体は、内因性遺伝子座の代わりにヒト免疫グロブリン遺伝子座がトランスジェニックに導入された動物、例えば内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されたマウスの免疫化によって製造することもできる。このアプローチは、米国特許第４，６９３，８４９号第５，５４５，８０７号、第５，５４５，８０６号、第５，５６９，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号及び第５，６６１，０１６号に記載されている。あるいは、ヒト抗体は、標的抗原に対して指示された抗体を産生するヒトＢリンパ球を不死化することによって調製することが可能である（そのようなＢリンパ球は、個体から、またはｃＤＮＡの単一細胞クローニングから回収されてもよく、またはイン・ビトロで免疫することも可能である）。例として以下を参照。Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， “Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， ｐ． ７７， １９８５； Ｂｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４７ （１）：８６－９５， １９９１、及び米国特許第５，７５０，３７３号。
【0057】
「ｉＣＡＲ」は、抑制性受容体シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体である。これらのドメインは、例えば、プロテクチンＤ１（ＰＤ１）またはＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）に基づく場合がある。一部の実施形態では、本明細書で論じられるような改変されたＴｒｅｇは、ｉＣＡＲを発現するようにさらに形質導入され得る。本明細書中で使用される場合、「免疫細胞」とは、自然免疫応答及び／または適応免疫応答の開始及び／または実行に機能的に関与する造血起源の細胞を指す。
【0058】
「内部リボソーム侵入部位」または「ＩＲＥＳ」という用語は、いくつかの真核生物及びウイルスのメッセンジャーＲＮＡ上の４０Ｓリボソームサブユニットの内部侵入を媒介するシス作用性ＲＮＡ配列を指す。ＩＲＥＳは、タンパク質合成中に５'キャップに依存しない方法で翻訳を開始できるため、１つのｍＲＮＡから２つのタンパク質を同時に発現させることができる。ＩＲＥＳ配列の詳細及びバリエーションは、Ｂｏｎｎａｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ２００３年１月１日、３１（１）：４２７～４２８に記載されている。
【0059】
本明細書で使用される「細胞内シグナル伝達ドメイン」または「ＩＣＳドメイン」という用語は、分子の細胞内部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲ、例えば１つ以上のＣＡＲを含む改変されたＴｒｅｇからなる核酸配列で形質導入された細胞の免疫調節及び／またはエフェクター機能を促進するシグナルを生成する。免疫エフェクター機能の例には、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性及びヘルパー活性が含まれる。例えば改変されたＴｒｅｇにおける免疫調節機能の例には、ＩＣＳドメインが含まれるが、これに限定されるものではなく、また、以下のものが含まれるが、これに限定されない：ＣＤ２８－ＣＤ３ゼータ、４－１ＢＢ－ＣＤ３ゼータ、Ｄａｐ１０－ＣＤ３ゼータ、ＣＤ４４－ＣＤ３ゼータ、ＣＴＬＡ－４－ＣＤ３ゼータ、ＣＤ２８、Ｄａｐ１０、４－１ＢＢ、３－ゼータ。さらなる例としては、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体タンパク質のＩＣＳドメイン、Ｆｃ受容体サブユニット、ＩＬ－２受容体サブユニット、ＣＤ３ゼータ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＦｃεＲＩ、ＤＡＰ１０、またはＤＡＰ１２を含む。
【0060】
「ＤＡＰ１０」という用語は、ヒトにおいてＨＳＣＴ遺伝子によって符号化されるタンパク質を指す。また、ＨＣＳＴ、ＫＡＰ１０、ＰＩＫ３ＡＰ、または造血細胞シグナルトランスデューサーと呼ばれることもある。一部の実施形態では、ＤＡＰ１０は、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号Ｑ９ＵＢＫ５．１で提供される配列を有し得る。
【0061】
「単離された」生物学的成分（単離されたキメラ抗原受容体、細胞、ベクター、タンパク質または核酸など）は、その環境または生物の細胞中の他の生物学的成分から実質的に分離または精製された構成要素を指す。例えば、他の染色体及びエキストラクロモゾームＤＮＡ及びＲＮＡ、タンパク質、小器官などが挙げられる。「単離された」核酸及びタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸及びタンパク質が含まれる。この用語はまた、組換え技術及び化学合成によって調製された核酸及びタンパク質も包含する。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在し得るか、または例えば、宿主細胞などの非天然環境に存在し得る。
【0062】
ｓｃＦｖの文脈で使用される「リンカー」という用語は、可変重鎖及び可変軽鎖領域を一緒に連結するために、単独または組み合わせて使用されるグリシン及び／またはセリン残基などのアミノ酸からなるペプチドリンカーを指す。一つの実施形態では、フレキシブルポリペプチドリンカーは、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーであり、アミノ酸配列ユニットＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号：１３）の１つ以上の繰り返しからなる。一つの実施形態では、フレキシブルポリペプチドリンカーは、Ｇ４Ｓ Ｘ３（配列番号：１３）とも呼ばれる（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含むがこれらに限定されない。このようなリンカーは、例えば、核酸配列（配列番号：２１３）によって符号化されてもよい。
【0063】
「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、線状または分岐状、一本鎖または二本鎖、もしくはそれらのハイブリッドであるＲＮＡまたはＤＮＡを指す。この用語には、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドも含まれる。以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子フラグメント、エクソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡシーケンス、核酸プローブ及びプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体などの修飾ヌクレオチド、ウラシル、他の糖類やフルオロリボース及びチオレートなどの連結基、並びにヌクレオチド分岐などの改変されたヌクレオチドから構成され得る。ヌクレオチドの配列は、標識化成分との共役などによって、重合後にさらに改変することができる。この定義に含まれる他のタイプの改変は、キャップ、１つ以上の天然ヌクレオチドの類似体による置換、及びポリヌクレオチドをタンパク質、金属イオン、標識成分、他のポリヌクレオチドまたは固体支持体に結合させるための手段を導入することである。ポリヌクレオチドは、化学合成によって得ることができ、または微生物に由来することができる。「遺伝子」という用語は、生物学的機能に関連するポリヌクレオチドの任意のセグメントを指すために広く使用されている。従って、遺伝子は、ゲノム配列におけるイントロン及びエクソン、またはｃＤＮＡのような符号化配列及び／またはそれらの発現に必要とされる調節配列を含む。また、例えば遺伝子は、ｍＲＮＡまたは機能的ＲＮＡを発現するか、または特定のタンパク質を符号化し、調節配列を含む核酸フラグメントを指す。
【0064】
「製薬学的に許容される担体」または「賦形剤」は、製剤化の中及び／または貯蔵を可能にするために免疫原性組成物において従来使用されている化合物または材料を指す。
【0065】
本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始するのに必要な、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列として定義される。
【0066】
「組換え」という用語は、例えば、自然界には存在しないか、天然には見られない配置で別のポリヌクレオチドに連結されている半合成または合成起源のポリヌクレオチドなどの部位を意味するか、または対応する未改変細胞によって通常は発現されないか、または発現されないポリヌクレオチドを発現するように改変された細胞を意味している場合がある。
【0067】
「ｓｃＦｖ」、「一本鎖Ｆｖ」、または「一本鎖可変フラグメント」という用語は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体フラグメント及び可変領域を含む少なくとも１つの抗体フラグメントからなる融合タンパク質を指す。軽鎖可変領域及び重鎖可変領域が、例えば合成リンカー、短いフレキシブルポリペプチドリンカーを介して、連続的に連結されており、一本鎖ポリペプチドとして発現することができ、ｓｃＦｖは特異性を保持することが特徴である。特に明記しない限り、本明細書で使用する場合、ｓｃＦｖは、ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端に関して、いずれかの順序でＶＬ及びＶＨの可変領域を有することがあり、例えばｓｃＦｖはＶＬ－リンカー－ＶＨ、またはＶＨ－リンカー－ＶＬを構成し得る。リンカーは、フレームワーク配列の一部を構成し得る。
【0068】
「配列同一性」または「配列相同性」という用語は、本明細書では互換的に使用され、両方ともに異なるポリペプチドまたは核酸の配列類似性を指す。本発明は、一般的に本明細書に開示されたポリペプチドまたは核酸配列のいずれか１つ以上に対して少なくとも９０％以上の配列相同性または同一性を有するポリペプチドまたは核酸またはそれを含む構成物で、より典型的には少なくとも９５％を有するポリペプチドまたは核酸配列を企図する。本明細書に開示されている、ポリペプチドもしくは核酸配列のうちの任意の１つ以上のものに対して、少なくとも９８％以上の配列相同性または配列同一性、または少なくとも９９％以上の配列相同性または配列同一性を有する。核酸配列とアミノ酸配列間の相同性を決定するための方法は、当技術分野の熟練者によく知られている。一般的に、そのような相同な核酸またはポリペプチドは、特定のポリペプチドまたは核酸、それを含む構成物の所望の特性を改善するため、または悪影響を及ぼさないように選択または設計される。
【0069】
「シグナルペプチド」（シグナル配列、ターゲティングシグナル、局在化シグナル、局在化シーケンス、トランジットペプチド、リーダー配列またはリーダーペプチドとも呼ばれる）は、分泌経路に向かう新規合成タンパク質の大部分のＮ末端に存在する短いペプチドである。シグナルペプチドのコアには、長いストレッチの疎水性アミノ酸が含まれている場合がある。シグナルペプチドは成熟ポリペプチドから切断されてもよいし、切断されなくてもよい。
【0070】
本明細書で使用される「リーダー配列」は、「シグナルペプチド」、「シグナル配列」、「ターゲティングシグナル」、「局在化シグナル」、「局在化配列」、「輸送ペプチド」、または当技術分野では「リーダーペプチド」とも呼ばれ、分泌経路に向かう新たに合成されたタンパク質の大部分のＮ末端に存在する短いペプチドである。シグナルペプチドのコアには、長いストレッチの疎水性アミノ酸が含まれている場合がある。シグナルペプチドは成熟ポリペプチドから切断されてもよいし、切断されなくてもよい。
【0071】
「リボソームスキップ配列」は、翻訳されるとリボソーム上の新生ポリタンパク質の切断を引き起こし、複数の遺伝子の同時発現を可能にするアミノ酸配列を指す。一つの側面では、リボソームスキップ配列は、Ｔ２Ａ配列であってよく、配列番号：１４のアミノ酸配列、またはそれを符号化するヌクレオチド配列、例えば配列番号：２１４からなる。あるいは、他の任意の２Ａ配列を使用することができる。他の２Ａ配列の例は、関連技術の文献の他の場所に見出すことができる（例えば、Ｋｉｍ， Ｊ．Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， “ Ｈｉｇｈ ｃｌｅａｖａｇｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ａ ２Ａ ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｐｏｒｃｉｎｅ ｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ－１ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ， ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ａｎｄ ｍｉｃｅ” ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２０１１；６（４）を参照）。
【0072】
「シグナル伝達ドメイン」という用語は、セカンドメッセンジャーを生成することにより、またはそのようなメッセンジャーに応答することでエフェクターとして機能することにより、規定のシグナル伝達経路を介して細胞活性を調節するために細胞内で情報を伝達することにより作用するタンパク質の機能部分を指す。シグナル伝達ドメインの例には、ＣＤ２８－ＣＤ３ζ、４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ、Ｄａｐ１０－ＣＤ３ζ、ＣＤ４４－ＣＤ３ζ、ＣＴＬＡ－４－ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、Ｄａｐ１０、４－１ＢＢ及びＣＤ３－ζが含まれるが、これに限定されない。
【0073】
「刺激分子」という用語は、免疫細胞の活性化を刺激する方法で調節する細胞質シグナル伝達配列を提供する、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞）によって発現される分子を指し、この分子は、免疫細胞シグナル伝達経路の少なくともいくつかの側面に対して刺激的な方法で免疫細胞の活性化を調節する細胞質シグナル伝達配列を提供する。一つの側面において、シグナルは例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体と抗原性ペプチドが負荷されたＭＨＣ分子との結合によって開始され、増殖、活性化、分化などを含むがこれらに限定されないＴ細胞応答の媒介につながる一次シグナルである。刺激的に作用する一次細胞質シグナル伝達配列（「一次シグナル伝達ドメイン」とも呼ばれる）は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られているシグナル伝達モチーフを含むことができる。細胞質シグナル伝達配列を含むＩＴＡＭの例としては、ＣＤ３ζ（配列番号：１６のアミノ酸配列であり、配列番号：２１６によって符号化され得る）、一般的なＦｃＲγ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃＲβ（ＦｃεＲ１ｂ）、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０、及びＤＡＰ１２に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な実施形態では、改変されたＴｒｅｇに含まれるいずれか１つ以上のＣＡＲにおける細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞内シグナル伝達配列、例えば、ＣＤ３ζの一次シグナル伝達配列を含むことができる。あるいは、非ヒトまたはマウス種、例えば、げっ歯類、サル、類人猿などからの同等の残基を利用することができる。
【0074】
「対象者」という用語は、免疫応答を誘発することができる生物（例えば、哺乳動物、ヒト）を含むことを意図している。対象者は病気を患っている場合もあるが、健康である場合もある。対象者は、当技術分野では「患者」と呼ばれることもある。
【0075】
本明細書で使用される「自殺メカニズム」または「自殺遺伝子」という用語は、本発明のＣＡＲ発現細胞が、ＣＡＲ発現細胞を投与された対象者から根絶され得るメカニズムを指す。自殺メカニズムは、例えば、誘導型カスパーゼ９（Ｂｕｄｄｅ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１３ ８（１２）：８２７４２）、コドン最適化ＣＤ２０（Ｍａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． Ｍｅｔｈ． ２０１２ ２３（６）３７６－８６）、ＣＤ３４、切断型ＥＧＦＲ（Ｗａｎｇ Ｘ， Ｃｈａｎｇ Ｗ－Ｃ， Ｗｏｎｇ ＣＷ， ｅｔ ａｌ． Ａ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ－ｅｎｃｏｄｅｄ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ， ｉｎ ｖｉｖｏ ｔｒａｃｋｉｎｇ， ａｎｄ ａｂｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｃｅｌｌｓ． Ｂｌｏｏｄ． ２０１１；１１８（５）：１２５５－１２６３． ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ－２０１１－０２－３３７３６０）、トランケートされたＣＤ１９、またはポリペプチドＲＱＲ８（Ｐｈｉｌｉｐ 他、及び参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１３１５３３９１Ａ）によって引き起こされる可能性がある。一部の実施形態では、自殺メカニズムは、本明細書で論じられる改変されたＴｒｅｇに含まれ、改変されたＴｒｅｇが対象者の系内に留まる長さまたは量を最適化し、毒性を低減または最小化し、そして／または前記の改変されたＴｒｅｇの利点を最大化する。
【0076】
本明細書で使用される「標的細胞」という用語は、細胞表面上の改変されたＴｒｅｇに含まれるＣＡＲの標的分子を発現する細胞を指す。一部の実施形態では、標的細胞はミクログリア細胞である。一部の実施形態では、標的細胞はニューロンである。一部の実施形態では、標的細胞は、神経変性疾患及び／または病態及び／または神経炎症の病態において特定の役割を有する細胞型である。一部の実施形態では、標的細胞は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ＡＬＳ、並びに本明細書で論じられる他の神経変性疾患及び病態のいずれかであるが、これらに限定されない疾患の病態において、特定の役割を果たす細胞型である。
【0077】
本明細書で使用される「標的分子」という用語は、本開示の改変されたＴｒｅｇ、例えば１つ以上のＣＡＲを含む改変されたＴｒｅｇなど、ＣＡＲまたはそれを発現する細胞によって標的化される分子を指す。本開示の改変されたＴｒｅｇに含まれるＣＡＲのＡＢドメインは、標的分子に対して結合親和性を有し得る。一部の実施形態では、標的分子は、神経変性疾患または病態に関連するアミロイドベータ１－４２の形態である。一部の実施形態では、標的分子は、神経変性疾患または病態に関連するα－シヌクレインの形態である。一部の実施形態では、標的分子は、神経変性疾患または病態に関連するスーパーオキシドジスムターゼ－１（ＳＯＤ－１）の形態である。一部の実施形態では、標的分子は、神経変性疾患及び／または病態に関連する以下のいずれかの形態であり得るが、これらに限定されない。ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ－４３）、染色体９オープンリーディングフレーム７２（ｃ９ｏｒｆ７２）、β－シヌクレイン、γ－シヌクレイン、肉腫に融合したＲＮＡ結合タンパク質（ＦＵＳ）、ユビキチン、ユビキリン－２、ｐ６２、オプチニューリン、アタキシン－２、パーキン、セリン／スレオニンタンパク質キナーゼＰＩＮＫ１、ロイシンリッチリピートセリン／スレオニンタンパク質キナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、タンデムグルタミンリピートを伴うハンチントン、プリオンタンパク質、トランスサイレチン、歯状核赤核・淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）タンパク質、アンドロゲン受容体、アタキシン、Ｐ／Ｑ型のカルシウムチャネルα１Ａサブユニット、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質、グリア線維性酸性タンパク質、ＤＮＡ除去修復タンパク質ＥＲＣＣ－６、生存運動ニューロンタンパク質及びシスタチンＣ。一部の実施形態では、標的分子は、神経変性疾患の以下の非限定的なリストのいずれかに関連する分子であり得る。アルツハイマー病、パーキンソン病、ＡＬＳ、プリオン病、ＡＬＳ以外の運動ニューロン疾患、ハンチントン病、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、フリードライヒ失調症、レビー小体病、てんかん、多発性硬化症、脳炎、水頭症、脳卒中、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、シヌクレイン症、タウオパチー、海綿状脳症、家族性アミロイドポリニューロパチー、アミロイドーシスを伴うオランダ性遺伝性脳出血、コンゴーレッド親和性血管障害、大脳皮質基底核変性症、ピック病、進行性核上性麻痺、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、致命的な家族性不眠症、クールー病、ウシ海綿状脳症、スクレイピー、慢性消耗性疾患、アルツハイマー病のレビー小体変種、びまん性レビー小体病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、脳の鉄蓄積タイプＩを伴う遺伝性神経変性症、びまん性レビー小体病、前頭側頭葉変性症、歯状核赤核・淡蒼球ルイ体萎縮症、ケネディ病、アレクサンダー病、コケイン症候群、アミロイドーシスを伴うアイスランド性遺伝性脳出血。
【0078】
「トランスフェクトされた」、「形質転換された」または「形質導入された」という用語は、外因性核酸が宿主細胞に移入または導入されるプロセスを指す。「トランスフェクトされた」、「形質転換された」または「形質導入された」細胞は、外因性核酸でトランスフェクト、形質転換または形質導入された細胞である。細胞は、一次対象者の細胞及びその子孫細胞を含む。
【0079】
「膜貫通ドメイン」または「ＴＭドメイン」という用語は、膜内で熱力学的に安定している３次元タンパク質構造を指す。これは、単一のαヘリックス、膜貫通βバレル、グラミシジンＡのβヘリックス、またはいずれか他の構造であり得る。膜貫通ヘリックスは、通常約２０個程度のアミノ酸の長さを有する。一般的には、膜貫通ドメインは、統合タンパク質としても知られる膜貫通型タンパク質の単一の膜貫通αヘリックスを意味する。
【0080】
本明細書で使用する場合、「処置」、「治療」、または「治療する」という用語は、一般に、疾患及び／または病態の発症、進行、重症度、及び／または持続期間を減少または改善するため、または疾患及び／または病態の１つ以上の症状（好ましくは、１つ以上の識別可能な症状）を改善する臨床手順を指す。疾患は、例えば神経変性疾患または病態であり得る。一部の実施形態では、「治療」の効果は、１つ以上の治療法（例えば、本明細書に記載されるような改変されたＴｒｅｇなどの１つ以上の治療薬）の投与から生じる、疾患の少なくとも１つの測定可能な物理的パラメータの改善によって評価することができる。パラメータは、例えば遺伝子発現プロファイル、疾患に冒された組織の質量、炎症関連マーカー、神経変性疾患関連マーカー、特定のサイトカインまたはケモカインもしくは他の疾患関連分子の有無であり、患者によって必ずしも識別されないものであってもよい。他の実施形態では、「処置」、「治療」、または「治療すること」は、例えば、識別可能な症状の安定化によって物理的に、もしくは例えば、物理的パラメータの安定化によって生理学的に、またはその両方によって、疾患及び／または病態の進行を抑制する結果となり得る。さらに、本明細書で使用される「治療する」及び「防止する」という用語並びにそれらから生じる語は、必ずしも１００％または完全な治癒または防止を意味するものではない。むしろ、当技術分野の一般的な熟練者が、潜在的な利益または治療効果を有すると認識する、様々な程度の治療効果または予防効果が存在する。この点で、本発明の方法は、哺乳動物における疾患及び／または病態の治療または予防効果を、任意の量及びレベルで提供することができる。さらに、本明細書に記載される方法によって提供される治療または予防は、治療または予防される疾患の１つ以上の病態または症状の治療または予防を含むことができる。また、本明細書の目的のために、「予防」は、疾患の発症、またはその症状もしくは病態の遅延を含むことができる。
【0081】
「異種」という用語は、異なる種の動物に由来する移植片を指す。
【0082】
本明細書中で使用される場合、「組換えＴｒｅｇ」または「改変されたＴｒｅｇ」という用語は、一般的にその本来の病態と比較して変化した、例えば、遺伝子改変された調節性Ｔ細胞をいう。例えば、例示的な実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、１つ以上のＣＡＲを発現するように改変され得るさらに、例示的な改変されたＴｒｅｇは、１つ以上のＮＤＭＭを発現するように改変され得る。本発明による改変されたＴｒｅｇは、例示的な実施形態では様々な疾患を治療するために使用され得る。例えば、改変されたＴｒｅｇは、特定の神経変性疾患、病態、または障害を処置する方法において使用され得る。本明細書に開示されるような改変されたＴｒｅｇで治療され得る例示的な神経変性疾患、病態、及び／または障害には、例としてＡＬＳ、アルツハイマー病、及びパーキンソン病が含まれる。さらに、例示的な実施形態では、本開示の改変されたＴｒｅｇは、ＣＮＳにおける神経炎症を治療するために使用され得る。一部の実施形態では、本開示の改変されたＴｒｅｇは、神経変性疾患及び／または病態の以下の非限定的なリストのいずれかを治療するために使用され得る。アルツハイマー病、パーキンソン病、ＡＬＳ、プリオン病、ＡＬＳ以外の運動ニューロン疾患、ハンチントン病、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、フリードライヒ失調症、レビー小体病、てんかん、多発性硬化症、脳炎、水頭症、脳卒中、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、シヌクレイン症、タウオパチー、海綿状脳症、家族性アミロイドポリニューロパチー、アミロイドーシスを伴うオランダ性遺伝性脳出血、コンゴーレッド親和性血管障害、大脳皮質基底核変性症、ピック病、進行性核上性麻痺、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、致命的な家族性不眠症、クールー病、ウシ海綿状脳症、スクレイピー、慢性消耗性疾患、アルツハイマー病のレビー小体変種、びまん性レビー小体病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、脳の鉄蓄積タイプＩを伴う遺伝性神経変性症、びまん性レビー小体病、前頭側頭葉変性症、歯状核赤核・淡蒼球ルイ体萎縮症、ケネディ病、アレクサンダー病、コケイン症候群、アミロイドーシスを伴うアイスランド性遺伝性脳出血。
【0083】
変更されたＴＲＥＧ、その構成と使用方法
本開示は一般的に、改変されたＴｒｅｇ、例えば１つ以上のキメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）及び／または１つ以上の神経変性疾患改変分子を発現するように改変されたＴｒｅｇ、前記の改変されたＴｒｅｇをからなる組成物、及び前記の改変されたＴｒｅｇを使用する方法並びに前記の改変されたＴｒｅｇに関し、特に疾患、障害、または病態、例えば神経変性疾患、障害、または病態を治療するために使用される。例示的な実施形態では、これらの改変されたＴｒｅｇは、その表面上に少なくとも１つの部分、例えば抗体、及び一般的には特定の神経変性疾患または病態、例えば、神経炎症、ＡＬＳ、アルツハイマー病、及び／またはパーキンソン病に関連するタンパク質及び／または分子マーカーに関連するタンパク質を認識するｓｃＦｖを発現するように設計されている。他の例示的な実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、酸化／炎症活性を防止し、そして／または抗酸化剤、神経成長因子及び非古典的神経栄養成長などの神経成長、機能及び／または生存を促進する特定の分子を発現するか、または発現するように改変されている。例示的な実施形態では、本発明による改変されたＴｒｅｇは、Ｔｒｅｇ表現型を維持し、そして／または少なくとも１つのＴｒｅｇエフェクター機能を維持し、理想的には、改変されていないＴｒｅｇが有する実質的にすべてのエフェクター機能を保持する。一部の例示的な実施形態では、本発明による改変されたＴｒｅｇは、神経変性及び／または神経炎症の部位に移動または移動し得る。さらなる例示的な実施形態では、本発明による改変されたＴｒｅｇは、神経変性及び／または神経炎症の部位で抗炎症活性をもたらし得る。前記の活動は、例えば（１）ミクログリア細胞の過剰活性化、（２）炎症性タンパク質／活動の生成、及び（３）神経細胞死などの、神経変性及び／または神経炎症に関連するいずれかの活動を含むことができる。改変されたＴｒｅｇを含む例示的な治療方法は、疾患の進行の減少をもたらし、そして／またはそれを必要とする患者の機能を修復及び／または改善し得る。一部の実施形態では、Ｔｒｅｇは、ドナーＰＢＭＣから単離され、使用のために、例えば、臨床使用のために拡大され得る。一部の例示的な実施形態では、ドナー細胞は同種異系であり得る。他の例示的な実施形態では、Ｔｒｅｇを導出するために使用されるドナーＰＢＭＣは、治療されるべき同一対象者から単離され得る。一部の例示的な実施形態では、単離されたＴｒｅｇは、内因性ＴＣＲの発現または機能を低減または排除するように改変され得る。一部の例示的実施形態では、単離されたＴｒｅｇは、ドナーがＭＨＣ適合性または非適合性の双方の場合があり、異なるドナーから単離されたＴｒｅｇと組み合わされ得る。一部の実施形態では、Ｔｒｅｇは場合によっては２週間の培養期間中に、最大５５０倍の数まで増加することができる。他の例示的な実施形態では、前記のＴｒｅｇは、９０％以上の純度を含む場合がある。他の例示的な実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過し得る。
本開示は一般的に、改変されたＴｒｅｇ、例えば１つ以上のキメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）及び／または１つ以上の神経変性疾患改変分子を発現するように改変されたＴｒｅｇ、前記の改変されたＴｒｅｇをからなる組成物、及び前記の改変されたＴｒｅｇを使用する方法並びに前記の改変されたＴｒｅｇに関し、特に疾患、障害、または病態、例えば神経変性疾患、障害、または病態を治療するために使用される。例示的な実施形態では、これらの改変されたＴｒｅｇは、その表面上に少なくとも１つの部分、例えば抗体、及び一般的には特定の神経変性疾患または病態、例えば、神経炎症、ＡＬＳ、アルツハイマー病、及び／またはパーキンソン病に関連するタンパク質及び／または分子マーカーに関連するタンパク質を認識するｓｃＦｖを発現するように設計されている。他の例示的な実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、酸化／炎症活性を防止し、そして／または抗酸化剤、神経成長因子及び非古典的神経栄養成長などの神経成長、機能及び／または生存を促進する特定の分子を発現するか、または発現するように改変されている。例示的な実施形態では、本発明による改変されたＴｒｅｇは、Ｔｒｅｇ表現型を維持し、そして／または少なくとも１つのＴｒｅｇエフェクター機能を維持し、理想的には、改変されていないＴｒｅｇが有する実質的にすべてのエフェクター機能を保持する。一部の例示的な実施形態では、本発明による改変されたＴｒｅｇは、神経変性及び／または神経炎症の部位に移動または移動し得る。さらなる例示的な実施形態では、本発明による改変されたＴｒｅｇは、神経変性及び／または神経炎症の部位で抗炎症活性をもたらし得る。前記の活動は、例えば（１）ミクログリア細胞の過剰活性化、（２）炎症性タンパク質／活動の生成、及び（３）神経細胞死などの、神経変性及び／または神経炎症に関連するいずれかの活動を含むことができる。改変されたＴｒｅｇを含む例示的な治療方法は、疾患の進行の減少をもたらし、そして／またはそれを必要とする患者の機能を修復及び／または改善し得る。一部の実施形態では、Ｔｒｅｇは、ドナーＰＢＭＣから単離され、使用のために、例えば、臨床使用のために拡大され得る。一部の例示的な実施形態では、ドナー細胞は同種異系であり得る。他の例示的な実施形態では、Ｔｒｅｇを導出するために使用されるドナーＰＢＭＣは、治療されるべき同一対象者から単離され得る。一部の例示的な実施形態では、単離されたＴｒｅｇは、内因性ＴＣＲの発現または機能を低減または排除するように改変され得る。一部の例示的実施形態では、単離されたＴｒｅｇは、ドナーがＭＨＣ適合性または非適合性の双方の場合があり、異なるドナーから単離されたＴｒｅｇと組み合わされ得る。一部の実施形態では、Ｔｒｅｇは場合によっては２週間の培養期間中に、最大５５０倍の数まで増加することができる。他の例示的な実施形態では、前記のＴｒｅｇは、９０％以上の純度を含む場合がある。他の例示的な実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過し得る。
【0084】
一部の実施形態では、Ｔｒｅｇは以下のように単離、拡大、及び形質導入され得る：細胞は、２段階のネガティブ及びポジティブ選択プロトコルを介してヒトＰＢＭＣから単離され得る。最初に、負の選択を使用してＣＤ４＋細胞を分離し、続いてＣＤ２５ｈｉ＋細胞の正の選択を使用してＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉ＋ Ｔｒｅｇ細胞を分離する。単離されたＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉ＋Ｔｒｅｇは、Ｔｒｅｇ増殖培地での培養で抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２マルチマーまたは抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８マルチマー（ＳＴＥＭＣＥＬＬ ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ）を用いて、ヒトＩＬ－２（３００Ｕ／ｍｌから５００Ｕ／ｍｌ）で２週間かけて活性化できる。９日目に、Ｔｒｅｇ細胞を後日使用するために凍結保存できるため、同一ドナーと調製を複数回テストして、アッセイのばらつきを評価できる。
【0085】
ＣＡＲ
さらなる例示的な態様では、改変されたＴｒｅｇは、好ましくはそれらの細胞表面で発現される１つ以上のＣＡＲを発現するように改変され得る。本発明による例示的なＣＡＲは、受容体または抗体などのリガンド結合部分、例えば、Ｔｒｅｇを使用して治療される疾患及び／または病態、例えば特定の神経変性疾患及び／または神経炎症に関連するタンパク質及び／または他の分子マーカーを認識するｓｃＦｖを含むことができる。本発明の一部の実施形態では、これらのＣＡＲは、本明細書で特定され、実施例または当技術分野で一般的に知られている他で例示されるような１つ以上の共刺激シグナル伝達またはＴ細胞シグナル伝達部分またはドメインをさらに含むことができる。本発明による改変されたＴｒｅｇによって発現されるＣＡＲによって認識され得る疾患病態に関連する、異常なタンパク質または異常に発現されるタンパク質の発現を特徴とする例示的な神経変性疾患には、例として、ＡＬＳ、アルツハイマー病、及びパーキンソン病が含まれる。改変されたＴｒｅｇで発現される場合、本明細書に記載される１つ以上のＣＡＲは、例えばサイトカイン発現などのエフェクター応答を誘発する可能性がある。例示的な実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上の特定の抗原の存在下でエフェクター応答を誘発することができる。さらに、一部の側面として、改変されたＴｒｅｇは、１つ以上のＣＡＲを含むことがあり、前記の１つ以上のＣＡＲは、刺激、例えば特定の抗原による刺激時にＩＬ－１０産生を誘発し得る。さらなる例示的な実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、１つ以上のＣＡＲを含むことがあり、前記の改変されたＴｒｅｇは、他のＴ細胞を抑制するそれらの能力を保持し得る。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは１つ以上のＣＡＲを含むことがあり、前記の改変されたＴｒｅｇは、例えばＦＯＸＰ３＋ Ｔｒｅｇなどの既知の調節及び／または抗炎症活性を有するＴ細胞のサブセット中に存在することができる。例示的な実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、１つ以上のＣＡＲを含むことがあり、前記の１つ以上のＣＡＲは、疾患のタンパク質及び／または分子マーカー、膜貫通シグナル伝達ドメイン、及び細胞質シグナル伝達ドメインを標的とすることができる、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。例示的な実施形態では、目的の疾患を標的とする１つ以上のＣＡＲを含む改変されたＴｒｅｇは、対照治療と比較して、炎症性サイトカイン産生のより大きな抑制、抗炎症性サイトカインのより高い発現、神経炎症媒介性運動ニューロン死に対するより大きな保護、及び生存率の改善をもたらす場合がある。
さらなる例示的な態様では、改変されたＴｒｅｇは、好ましくはそれらの細胞表面で発現される１つ以上のＣＡＲを発現するように改変され得る。本発明による例示的なＣＡＲは、受容体または抗体などのリガンド結合部分、例えば、Ｔｒｅｇを使用して治療される疾患及び／または病態、例えば特定の神経変性疾患及び／または神経炎症に関連するタンパク質及び／または他の分子マーカーを認識するｓｃＦｖを含むことができる。本発明の一部の実施形態では、これらのＣＡＲは、本明細書で特定され、実施例または当技術分野で一般的に知られている他で例示されるような１つ以上の共刺激シグナル伝達またはＴ細胞シグナル伝達部分またはドメインをさらに含むことができる。本発明による改変されたＴｒｅｇによって発現されるＣＡＲによって認識され得る疾患病態に関連する、異常なタンパク質または異常に発現されるタンパク質の発現を特徴とする例示的な神経変性疾患には、例として、ＡＬＳ、アルツハイマー病、及びパーキンソン病が含まれる。改変されたＴｒｅｇで発現される場合、本明細書に記載される１つ以上のＣＡＲは、例えばサイトカイン発現などのエフェクター応答を誘発する可能性がある。例示的な実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上の特定の抗原の存在下でエフェクター応答を誘発することができる。さらに、一部の側面として、改変されたＴｒｅｇは、１つ以上のＣＡＲを含むことがあり、前記の１つ以上のＣＡＲは、刺激、例えば特定の抗原による刺激時にＩＬ－１０産生を誘発し得る。さらなる例示的な実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、１つ以上のＣＡＲを含むことがあり、前記の改変されたＴｒｅｇは、他のＴ細胞を抑制するそれらの能力を保持し得る。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは１つ以上のＣＡＲを含むことがあり、前記の改変されたＴｒｅｇは、例えばＦＯＸＰ３＋ Ｔｒｅｇなどの既知の調節及び／または抗炎症活性を有するＴ細胞のサブセット中に存在することができる。例示的な実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、１つ以上のＣＡＲを含むことがあり、前記の１つ以上のＣＡＲは、疾患のタンパク質及び／または分子マーカー、膜貫通シグナル伝達ドメイン、及び細胞質シグナル伝達ドメインを標的とすることができる、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。例示的な実施形態では、目的の疾患を標的とする１つ以上のＣＡＲを含む改変されたＴｒｅｇは、対照治療と比較して、炎症性サイトカイン産生のより大きな抑制、抗炎症性サイトカインのより高い発現、神経炎症媒介性運動ニューロン死に対するより大きな保護、及び生存率の改善をもたらす場合がある。
【0086】
一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、本明細書に記載の１つ以上のＣＡＲを含むことがあり、ここで、前記のＣＡＲを符号化する配列は、シグナル配列を含むことができる。前記のシグナル配列は、前記のＣＡＲの発現中に切断されてもよいし、されなくてもよいことが理解される。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、配列番号：１ （ＤＧ０１）の配列を含む１つ以上のＣＡＲを含むことができる。１（ＤＧ０１）。これは、必要に応じて配列番号：２０１の核酸配列によって符号化され、及び／または前記の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物に改変され得る。一部の実施形態では、ＤＧ０１は、神経変性疾患または病態に関連するアミロイドベータの形態を標的とし得る。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、配列番号：１ （ＤＧ０１）の配列を含む１つ以上のＣＡＲを含むことができる。２（ＤＧ０２）。これは、必要に応じて配列番号：２０１の核酸配列によって符号化され、及び／または前記の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物に改変され得る。一部の実施形態では、ＤＧ０２は、神経変性疾患または病態に関連するアミロイドベータの形態を標的とし得る。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、配列番号３（ＤＧ０３）の配列からなる１つ以上のＣＡＲを含むことができる。これは、必要に応じて配列番号：２０３の核酸配列によって符号化され、及び／または前記の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物に改変され得る。一部の実施形態では、ＤＧ０３は、神経変性疾患または病態に関連するアミロイドベータの形態を標的とし得る。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、配列番号：１ （ＤＧ０１）の配列からなる１つ以上のＣＡＲを含むことができる。これは、必要に応じて配列番号：２０４の核酸配列によって符号化され、及び／または前記の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物に改変され得る。一部の実施形態では、ＤＧ０４は、神経変性疾患または病態に関連するアミロイドベータの形態を標的とし得る。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、配列番号：１ （ＤＧ０１）の配列からなる１つ以上のＣＡＲを含むことができる。これは、必要に応じて配列番号：２０５の核酸配列によって符号化され、及び／または前記の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物に改変され得る。一部の実施形態では、ＤＧ０５は、神経変性疾患または病態に関連するヒトスーパーオキシドムターゼの形態を標的とし得る。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、配列番号：１ （ＤＧ０１）の配列からなる１つ以上のＣＡＲを含むことができる。これは、必要に応じて配列番号：２０６の核酸配列によって符号化され、及び／または前記の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物に改変され得る。一部の実施形態では、ＤＧ０６は、神経変性疾患または病態に関連するスーパーオキシドムターゼの形態を標的とし得る。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、配列番号：１ （ＤＧ０１）の配列からなる１つ以上のＣＡＲを含むことができる。これは、必要に応じて配列番号：２０７の核酸配列によって符号化され、及び／または前記の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物に改変され得る。一部の実施形態では、ＤＧ０７は、神経変性疾患または病態に関連するスーパーオキシドムターゼの形態を標的とし得る。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、配列番号：１ （ＤＧ０１）の配列からなる１つ以上のＣＡＲを含むことができる。これは、必要に応じて配列番号：２０８の核酸配列によって符号化され、及び／または前記の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物に改変され得る。一部の実施形態では、ＤＧ０８は、神経変性疾患または病態に関連するある形態のα－シヌクレインを標的とし得る。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、配列番号：１ （ＤＧ０１）の配列からなる１つ以上のＣＡＲを含むことができる。これは、必要に応じて配列番号：２０９の核酸配列によって符号化され、及び／または前記の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物に改変され得る。一部の実施形態では、ＤＧ０９は、神経変性疾患または病態に関連するある形態のα－シヌクレインを標的とし得る。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、配列番号：１ （ＤＧ０１）の配列からなる１つ以上のＣＡＲを含むことができる。これは、必要に応じて配列番号：２０９の核酸配列によって符号化され、及び／または前記の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物に改変され得る。一部の実施形態では、ＤＧ１０は、神経変性疾患または病態に関連するある形態のα－シヌクレインを標的とし得る。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、配列番号：１ （ＤＧ０１）の配列からなる１つ以上のＣＡＲを含むことができる。これは、必要に応じて配列番号：２０９の核酸配列によって符号化され、及び／または前記の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物に改変され得る。一部の実施形態では、ＤＧ１１は、神経変性疾患または病態に関連するある形態のα－シヌクレインを標的とし得る。
【0087】
例示的な実施形態では、ＣＡＲは、表１に示される配列を含むタンパク質またはその変異体バージョンを標的とすることができる。
【表1】
【0088】
一部の実施形態では、ＣＡＲは以下の神経変性疾患のいずれか１つ以上に関連する分子マーカー、例えばタンパク質を標的とすることができる。アルツハイマー病、パーキンソン病、ＡＬＳ、プリオン病、ＡＬＳ以外の運動ニューロン疾患、ハンチントン病、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、フリードライヒ失調症、レビー小体病、てんかん、多発性硬化症、脳炎、水頭症、脳卒中、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、シヌクレイン症、タウオパチー、海綿状脳症、家族性アミロイドポリニューロパチー、アミロイドーシスを伴うオランダ性遺伝性脳出血、コンゴーレッド親和性血管障害、大脳皮質基底核変性症、ピック病、進行性核上性麻痺、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、致命的な家族性不眠症、クールー病、ウシ海綿状脳症、スクレイピー、慢性消耗性疾患、アルツハイマー病のレビー小体変種、びまん性レビー小体病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、脳の鉄蓄積タイプＩを伴う遺伝性神経変性症、びまん性レビー小体病、前頭側頭葉変性症、歯状核赤核・淡蒼球ルイ体萎縮症、ケネディ病、アレクサンダー病、コケイン症候群、アミロイドーシスを伴うアイスランド性遺伝性脳出血。
【0089】
一部の例示的な実施形態では、改変されたＴｒｅｇに含まれるＣＡＲは、アミロイドベータ１－４２を標的とし得る。他の例示的な実施形態では、改変されたＴｒｅｇに含まれるＣＡＲは、スーパーオキシドジスムターゼ－１（ＳＯＤ－１）を標的とし得る。他の例示的な実施形態では、改変されたＴｒｅｇに含まれるＣＡＲは、α－シヌクレインを標的とし得る。他の例示的な実施形態では、改変されたＴｒｅｇに含まれるＣＡＲは、以下の非限定的なリストのいずれかを標的とすることができる：高リン酸化タウタンパク質、ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ－４３）、染色体９オープンリーディングフレーム７２（ｃ９ｏｒｆ７２）、β－シヌクレイン、γ－シヌクレイン、肉腫に融合したＲＮＡ結合タンパク質（ＦＵＳ）、ユビキチン、ユビキリン－２、ｐ６２、オプチニューリン、アタキシン－２、パーキン、セリン／スレオニンタンパク質キナーゼＰＩＮＫ１、ロイシンリッチリピートセリン／スレオニンプロテインキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇに含まれるＣＡＲは、以下のいずれか１つ以上を標的とすることができる。タンデムグルタミンリピートを伴うハンチントン、プリオンタンパク質、トランスサイレチン、歯状核赤核・淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）タンパク質、アンドロゲン受容体、アタキシン、Ｐ／Ｑ型のカルシウムチャネルα１Ａサブユニット、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質、グリア線維性酸性タンパク質、ＤＮＡ除去修復タンパク質ＥＲＣＣ－６、生存運動ニューロンタンパク質、シスタチンＣ。
【0090】
他の例示的な実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、１つ以上のＣＡＲを含むことがあり、１つ以上のＣＡＲを符号化する核酸と同一または異なる核酸構成物に含まれる核酸によって符号化され得る１つ以上のシグナル伝達ドメインを、さらに含むことができる 。前記のシグナル伝達ドメインは、前記の改変されたＴｒｅｇにおける異なるエフェクター経路及び／または生存経路を活性化し、任意でサイトカイン発現に影響を及ぼし、例えば標的抗原、例えば神経変性の部位でＣＮＳで発現したような異常に発現するタンパク質のような標的抗原の存在下で、ＩＬ－１０発現を誘発し得る。
【0091】
一部の例示的な実施形態では、改変されたＴｒｅｇはシグナル伝達を有さないか、またはＴ細胞シグナル伝達が使用されてもよい（すなわち、ＣＡＲとしての抗原テザー、例えば、ＣＤ２８膜貫通のみ）。他の例示的な実施形態では、改変されたＴｒｅｇによって発現される１つ以上のＣＡＲは、例として以下を含むシグナル伝達ドメインの組み合わせ（共刺激シグナル伝達ドメイン）を含むことができる。ＣＤ２８－ＣＤ３ζ、４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ、Ｄａｐ１０－ＣＤ３ζ、ＣＤ４４－ＣＤ３ζ、ＣＴＬＡ－４－ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、Ｄａｐ１０、４－１ＢＢ、ＣＤ３－ζ。さらなる例示的な実施形態では、改変されたＴｒｅｇによって発現される共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８－ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ、ＣＤ４４－ＣＤ３ζ、４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、またはＣＤ３－ζを含むことができる。
【0092】
さらに、本発明の特定の例示的な実施形態は、タンパク質に特異的な抗体及び／または疾患に関連する他の分子マーカー及び／または疾患に関連する状態に由来する一本鎖可変フラグメントからなる１つ、またはＣＡＲを含む改変されたＴｒｅｇに関するもので、例えば、本明細書に開示される特定のｓｃＦｖ抗体配列を含むがこれに限定されない神経変性疾患及び／または神経炎症である。
【0093】
一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、ＣＡＲ ＤＧ０５－２８Ｚ（配列番号：２４、これはオプションで次の番号に符号化される。配列番号：２２４）、及び／または前記の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物に改変され得る。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、ＣＡＲ ＤＧ０６－２８Ｚ（配列番号：２５、これはオプションで次の番号に符号化される。配列番号：２２５））、及び／または前記の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物に改変され得る。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、ＣＡＲ ＤＧ０７－２８Ｚ（配列番号：２６、これはオプションで次の番号に符号化される。配列番号：２２６）、及び／または前記の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物に改変され得る。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、ＣＡＲ ＤＧ１０－２８Ｚ（配列番号：２９、これはオプションで次の番号に符号化される。配列番号：２２９）、及び／または前記の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物に改変され得る。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、ＤＧ０１－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２０、これはオプションで次の番号に符号化される。配列番号：２２０）、ＤＧ０２－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２１、これはオプションで次の番号に符号化される。配列番号：２２１）、ＤＧ０３－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２２、これはオプションで次の番号に符号化される。配列番号：２２２）、ＤＧ０４－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２３、これはオプションで次の番号に符号化される。配列番号：２２３）、及び／または前記の構成物のうち、いずれか１つ以上に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物から構成され得る。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、ＤＧ０５－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２４、これはオプションで次の番号に符号化される。配列番号：２２４）、ＤＧ０６－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２５、これはオプションで次の番号に符号化される。配列番号：２２５）、ＤＧ０７－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２６、これはオプションで次の番号に符号化される。配列番号：２２６）、及び／または前記の構成物のうち、いずれか１つ以上に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物から構成され得る。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、ＤＧ０８－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２７、これはオプションで次の番号に符号化される。配列番号：２２７）、ＤＧ０９－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２８、これはオプションで次の番号に符号化される。配列番号：２２８）、ＤＧ１０－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２９、これはオプションで次の番号に符号化される。配列番号：２２９）、ＤＧ１１－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：３０、これはオプションで次の番号に符号化される。配列番号：２３０）、及び／または前記の構成物のうち、いずれか１つ以上に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物から構成され得る。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、ＤＧ０５－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（ＤＧ０５－２８－３ζとも呼ばれる）（配列番号：２４、これはオプションで次の番号に符号化される。配列番号：２２４）、及び／または前記の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物に改変され得る。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、ＤＧ０５－ＣＤ２８ｔｍ－ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ（ＤＧ０５－２８ｔｍ－１０－３ζとも呼ばれる）（配列番号：４０、これはオプションで次の番号に符号化される。配列番号：２４０）、及び／または前記の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物に改変され得る。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、ＤＧ０５－ＣＤ２８ｔｍ－ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ（ＤＧ０５－２８ｔｍ－１０－３ζとも呼ばれる）（配列番号：４１、これはオプションで次の番号に符号化される。配列番号：２４１）、及び／または前記の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物に改変され得る。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、ＤＧ０５－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ３ζ（ＤＧ０５－２８ｔｍ－３ζとも呼ばれる）（配列番号：４２、これはオプションで次の番号に符号化される。配列番号：２４２）、及び／または前記の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物に改変され得る。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、ＤＧ０５－ＣＤ２８（ＤＧ０５－２８とも呼ばれる）（配列番号：４３、これはオプションで次の番号に符号化される。配列番号：２４３）、及び／または前記の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物に改変され得る。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、ＤＧ０５－ＣＤ２８ｔｍ（ＤＧ０５－２８ｔｍとも呼ばれる）（配列番号：４４、これはオプションで次の番号に符号化される。配列番号：２４４）、及び／または前記の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物に改変され得る。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、ＤＧ０３－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（ＤＧ０３－２８－３ζとも呼ばれる）（配列番号：２２、これはオプションで次の番号に符号化される。配列番号：２２２）、及び／または前記の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物に改変され得る。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ－ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ（ＤＧ０５－２８ｔｍ－１０－３ζとも呼ばれる）（配列番号：４５、これはオプションで次の番号に符号化される。配列番号：２４５）、及び／または前記の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物に改変され得る。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ－ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ（ＤＧ０５－２８ｔｍ－１０－３ζとも呼ばれる）（配列番号：４６、これはオプションで次の番号に符号化される。配列番号：２４６）、及び／または前記の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物に改変され得る。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ－４－１－ＢＢ－ＣＤ３ζ（ＤＧ０３－２８ｔｍ－ＢＢ－３ζとも呼ばれる）（配列番号：４７、これはオプションで次の番号に符号化される。配列番号：２４７）、及び／または前記の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物に改変され得る。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ３ζ（ＤＧ０５－２８ｔｍ－３ζとも呼ばれる）（配列番号：４８、これはオプションで次の番号に符号化される。配列番号：２４８）、及び／または前記の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物に改変され得る。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、ＤＧ０３－ＣＤ２８（ＤＧ０３－２８とも呼ばれる）（配列番号：４９、これはオプションで次の番号に符号化される。配列番号：２４９）、及び／または前記の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物に改変され得る。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ（ＤＧ０５－２８ｔｍとも呼ばれる）（配列番号：５０、これはオプションで次の番号に符号化される。配列番号：２５０）、及び／または前記の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物に改変され得る。
【0094】
さらなる例示的な実施形態では、本発明による改変されたＴｒｅｇは、例えばＣＮＳ神経変性の部位で異常に発現されるタンパク質を標的とする１つ以上のＣＡＲを発現することがあり、さらに改変されて、１つ以上のＮＤＭＭを発現し得る。あるいは、ＣＡＲを発現しない１つ以上のＮＤＭＭを発現する、改変されたＴｒｅｇが生成される。これらの改変されたＮＤＭＭ発現Ｔｒｅｇは、必要に応じて、１つ以上のＣＡＲを発現する、改変されたＴｒｅｇと組み合わされることがある。前記のＮＤＭＭは、酸化及び／または炎症活性を防止する分子を含むことができる。さらなる例示的な実施形態では、前記のＮＤＭＭは、Ｔｒｅｇで発現される場合にニューロンの成長及び／または生存を活性化し得る。例示的なＮＤＭＭは、親ニューロン因子、抗酸化剤、神経成長因子、及び／または非古典的神経栄養因子を含むことができる。抗酸化剤の例には、ＨＯ－１、フェリチン、グルタチオン還元酵素、グルタチオンペルオキシダーゼ、フェリチン（Ｈ）、メタロチオネインＩ、チオレドキシン、チオレドキシン還元酵素、ペルオキシレドキシンＭＳＰ２３、Ｃｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、ＮＲＦ２活性、ペルオキシレドキシン（Ｐｒｘｓ）、活動依存性神経保護剤ホメオボックス（ＡＤＮＰ）、フィコシアニン、ニューログロビンなどが挙げられるが、これらに限定されない。親ニューロン因子の例には、インターロイキン－１受容体拮抗薬（ＩＬ－１ｒａ）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）、トロンボモジュリン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、タンパク質デグリカーゼＤＪ－１、メタロプロテイナーゼ（ＴＩＭＰ）の組織阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な神経成長因子には、以下のような古典的なニューロトロフィンが含まれるが、これらに限定されない。脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）。例示的な非古典的神経栄養因子には、インスリン様成長因子－１（ＩＧＦ－１）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）が含まれるが、これらに限定されない。一部の例示的な実施形態では、本発明による改変されたＴｒｅｇによって発現されるＮＤＭＭは、構成プロモーターによって制御され得る。他の例示的な実施形態では、本発明による改変されたＴｒｅｇによって発現されるＮＤＭＭは、誘導性プロモーター系によって制御され得る。適切な構成プロモーター及び誘導性プロモーターの選択は、当技術分野の熟練者の十分な技能範囲内であり、そのようなプロモーターの多くは既に知っており、容易に入手可能である。さらに、前記の改変されたＴｒｅｇによる前記のＮＤＭＭの発現は、ＣＡＲ誘発性転写制御によって調節され得る。本発明の一部の実施形態では、本明細書に記載されるようなＣＡＲが発現する改変されたＴｒｅｇは、１つ以上のＮＤＭＭを符号化する外因的に導入されたポリヌクレオチドを、さらに含むことができる。一部の実施形態では、ＮＤＭＭを符号化する外因的に導入されたポリヌクレオチド及びＣＡＲ構成物は、単一のベクターを使用して細胞に導入され得る。１つのベクターがＣＡＲとＮＤＭＭの両方に使用される場合、ＣＡＲとＮＤＭＭは、ｃｉｓの同一プロモーター下のベクターに符号化される。そのような場合、ＣＡＲ及びＮＤＭＭ構成物は、２つの別々の翻訳産物、例えばＩＲＥＳ配列またはＴ２Ａ配列（配列番号：２１４によって符号化される）の生成を可能にする配列によって、分離されてもよい。
【0095】
一部の実施形態では、ＣＡＲを発現する改変されたＴｒｅｇは、ヒトカタラーゼであり得るＮＤＭＭを発現し得る。一部の実施形態では、ＣＡＲを発現する改変されたＴｒｅｇは、ヒトＮｒｆ２のＮｅｈ２ドメインであり得るＮＤＭＭを発現し得る。一部の実施形態では、ＣＡＲを発現する改変されたＴｒｅｇは、ヒトＢＤＮＦであり得るＮＤＭＭを発現し得る。一部の実施形態では、ＣＡＲ発現改変されたＴｒｅｇは、ヒトＩＧＦ－１であり得るＮＤＭＭを発現し得る。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、ＮＤＭＭ Ｎｒｆ２（Ｋｅａｐ１阻害剤ペプチド）（配列番号：５１）を発現するための構成物を含むことができる。これはオプションで次の番号に符号化される。配列番号：２５１）、及び／または前記の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物に改変され得る。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、ＮＤＭＭヒトカタラーゼ（配列番号：５２、これはオプションで次の番号に符号化される。配列番号：２５２）、及び／または前記の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物に改変され得る。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、ＮＤＭＭ ＢＤＮＦ（配列番号：５３、これはオプションで次の番号に符号化される。配列番号：２５３）、及び／または前記の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物に改変され得る。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、ＮＤＭＭ ＩＧＦ－１（配列番号：５４、これはオプションで次の番号に符号化される。配列番号：２５４）、及び／または前記の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物に改変され得る。
【0096】
あるいは、ＣＡＲ構成物及びＮＤＭＭ構成物は、２つ以上の異なるベクターを使用して細胞をトランスフェクトまたは形質導入するための別々のベクターに含まれていてもよい。
【0097】
例示的な改変されたＴｒｅｇは、パーキンソン病のタンパク質及び／または分子マーカーを標的とする改変されたＴｒｅｇを含むことができる。例示的な実施形態では、パーキンソン病を標的とする改変されたＴｒｅｇは、１つ以上のＣＡＲを含むことがあり、前記の１つ以上のＣＡＲは、α－シヌクレイン原線維を標的とし得る。一部の実施形態では、α－シヌクレインを標的とするＣＡＲは、ＤＧ０８（配列番号：８）、及び／または前記の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物に改変され得る。一部の実施形態では、α－シヌクレインを標的とするＣＡＲは、ＤＧ０９（配列番号：９）、及び／または前記の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物に改変され得る。一部の実施形態では、α－シヌクレインを標的とするＣＡＲは、ＤＧ１０（配列番号：１０）、及び／または前記の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物に改変され得る。一部の実施形態では、α－シヌクレインを標的とするＣＡＲは、ＤＧ１１（配列番号：１１）、及び／または前記の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物に改変され得る。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、ＤＧ０８－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２７）、ＤＧ０９－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２８）、ＤＧ１０－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２９）、ＤＧ１１－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：３０）、及び／または前記の構成物のいずれか１つ以上と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物で、各構成物はα－シヌクレインを標的とする。さらなる例示的な実施形態では、１つ以上のＣＡＲを含む改変されたＴｒｅｇは、１つ以上の神経毒性炎症メディエーター、例えば、活性化ミクログリアによって産生される神経毒性炎症メディエーションを標的とすることができる。前記の改変されたＴｒｅｇは、ミクログリアの活性化を減少及び／または抑制し得る。例示的な実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、ＰＤにおけるドーパミンニューロン変性の疾患部位における標的化された抗炎症及び神経保護治療活性を含む。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、α－シヌクレイン原線維が存在する部位でのみそれらの機能を媒介し得る。
【0098】
例示的な実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、パーキンソン病を標的とする１つ以上のＣＡＲ及び／または１つ以上のＮＤＭＭを含むことがあり、前記の１つ以上のＣＡＲは、ヒト及びマウスのα－シヌクレインフィブリルに対するモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬアミノ酸配列などの一本鎖可変フラグメントからなる。（例えば、クローンＮＩ ２０２．３Ｇ１２、ＮＩ ２０２．１２Ｆ４、ＮＩ ２０２．２１Ｄ１１、及びｍＡｂ４９／Ｇに由来するアミノ酸配列）。例示的な実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、前記のｓｃＦＶを含むことがあり、そしてＣＤ２８－ＣＤ３ζ ＣＡＲ、すなわち、ｓｃＦｖ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ ＣＡＲを含む構成物をさらに含むことがあり、前記のｓｃＦｖは、ヒトα－シヌクレイン原線維に特異的である。前記のｓｃＦｖからなる構成物は、ＶＨ＋ＶＬ及びＶＬ＋ＶＨ配置を含むことができる。例示的な実施形態では、ベクターは、前記のｓｃＦｖ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ ＣＡＲ構成物を含むことがあり、別個のトランケートされた（非シグナル伝達）ヒトＣＤ１９（ｔＣＤ１９）をさらに含むことができる。前記のｔＣＤ１９は、細胞モニタリング及び／または細胞精製の目的などのために、形質導入マーカーとして使用され得る。例示的な実施形態では、本明細書に記載の配列のいずれかを含むベクターは、レトロウイルス発現ベクター、例えばｐＳＦＧを含むことができる。
【0099】
さらに、例示的な実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、ＡＬＳを標的とする１つ以上のＣＡＲ及び／または１つ以上のＮＤＭＭを含むことができる。前記の改変されたＴｒｅｇは変異型ＳＯＤ１を標的とすることができ、例えば、前記の改変されたＴｒｅｇは変異型ＳＯＤ１を標的とする１つ以上のＣＡＲを含むことができる。一部の実施形態では、変異型ＳＯＤ１を標的とするＣＡＲは、ＤＧ０５（配列番号：５）、及び／または前記の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物に改変され得る。一部の実施形態では、変異型ＳＯＤ１を標的とするＣＡＲは、ＤＧ０６（配列番号：６）、及び／または前記の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物に改変され得る。一部の実施形態では、変異型ＳＯＤ１を標的とするＣＡＲは、ＤＧ０７（配列番号：７）、及び／または前記の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物に改変され得る。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、ＤＧ０５－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２４）、ＤＧ０６－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２５）、ＤＧ０７－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２６）、及び／または前記の構成物のいずれか１つ以上と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物で、各構成物は変異型ＳＯＤ１を標的とする。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、ＤＧ０５－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（ＤＧ０５－２８－３ζとも呼ばれる）（配列番号：２４）、ＤＧ０５－ＣＤ２８ｔｍ－ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ（ＤＧ０５－２８ｔｍ－１０－３ζとも呼ばれる）（配列番号：４０）、ＤＧ０５－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ４４－ＣＤ３ζ（ＤＧ０５－２８ｔｍ－４４－３ζとも呼ばれる）（配列番号：４１）、ＤＧ０５－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ３ζ（ＤＧ０５－２８ｔｍ－３ζとも呼ばれる）（配列番号：４２）、ＤＧ０５－ＣＤ２８（ＤＧ０５－２８とも呼ばれる）（配列番号：４３）、ＤＧ０５－ＣＤ２８ｔｍ（ＤＧ０５－２８ｔｍとも呼ばれる）（配列番号：４４）、及び／または前記の構成物のいずれか１つ以上と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物で、各構成物は変異型ＳＯＤ１を標的とする。
【0100】
一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、変異型ＳＯＤ１を標的とするＣＡＲを含むことがあり、一部の例示的な実施形態では、前記のＣＡＲのｓｃＦｖは、ヒトＣＤ２８ヒンジ、膜貫通、及び細胞質ドメインに融合されたＶＬのＣ末端で細胞外で発現され得る。その後、ヒトＣＤ３ζ細胞質ドメインが続き、抗変異型ＳＯＤ１－ＣＤ２８－ＣＤ３ζＣＡＲを製造する。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇに含まれるＣＡＲのｓｃＦｖは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を、例えば（Ｇ４Ｓ）３リンカーなどのリンカーと連結することによって構成され得る。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇのＣＡＲのＶＬのＣ末端は、ヒトＣＤ２８ヒンジ、膜貫通、及び細胞質ドメインと融合することができ、そしてヒトＣＤ３ζ細胞質ドメインに続いてもよい。前記の改変されたＴｒｅｇの前記のＣＡＲは、抗変異型ＳＯＤ１ ＣＡＲであり得る。前記のＣＡＲは、抗原結合、例えば変異型ＳＯＤ１の結合の際に、一次及び共刺激シグナリングの両方を誘発することができる。一部の実施形態では、ＣＡＲ共刺激ドメインは、ＣＤ３ζのみ、４－１ＢＢ、またはＣＤ２８を含むがこれらに限定されない、またはＣＤ２８－ＣＤ３ζ、ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ、またはＣＤ４４－ＣＤ３ζを含むことができる。一部の実施形態では、トランケートされた（非シグナル伝達）ヒトＣＤ１９（ｔＣＤ１９）は、２Ａ共発現系を使用することなどによって、前記のＣＡＲＳと同一ベクターで発現されることがあり、前記のｔＣＤ１９は、形質導入されたＴ細胞を追跡し、精製するための方法として機能し得る。一部の実施形態では、ＡＬＳを標的とする改変されたＴｒｅｇは、治療を必要とする患者に投与されると、脊髄に入り得る。例示的な実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、例えばＶＬＡ４、ＬＦＡ－１、ＣＣＲ６またはＣＸＣＲ３などのマーカーを含むことができる。一部の例示的な実施形態では、ＡＬＳを標的とする改変されたＣＡＲ、例えば１つ以上の抗変異型ＳＯＤ１ ＣＡＲを含む改変されたＴｒｅｇは、１つ以上のＣＡＲを発現する際にＴｒｅｇ表現型を保持し、そして／または１つ以上のＣＡＲ及び／または１つ以上のＮＤＭＭを発現する際に、少なくともいくつかのＴｒｅｇエフェクター機能を引き出す。例示的な実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、ＡＬＳタンパク質及び／または疾患の分子マーカーに応答してＩＬ－１０を発現し得る。
【0101】
一部の例示的な実施形態では、本発明による改変されたＴｒｅｇは、活性化されたミクログリア及び／またはマクロファージの抑制をもたらす可能性のある抗炎症性サイトカインを分泌し得る。前記の分泌は、ＡＬＳタンパク質及び／または変異型ＳＯＤ１などの疾患関連マーカーによる、前記の改変されたＴｒｅｇに含まれる１つ以上のＣＡＲの刺激の結果として起こり得る。一部の実施形態では、前記のサイトカインは、ＩＬ－１０、ＩＬ－４またはＴＧＦ－βを含むことができる。一部の例示的な実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、ミクログリアによる神経毒性フリーラジカル及び炎症性サイトカインの産生を低減及び／または防止し得る。一部の例示的な実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、ＡＬＳを処置する方法において使用することができ、そして前記の方法は、対照治療と比較して、以下の１つ以上の結果をもたらし得る：マクロファージ媒介性運動ニューロン死の減少、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、一酸化窒素、フリーラジカル（スーパーオキシドアニオン）の減少、ＩＬ－１０、ＩＬ－４、及びＴＧＦ－βの量の増加。
【0102】
一部の例示的な実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、変異型ＳＯＤ１と同様に、ＡＬＳの運動ニューロン上またはその近くで発現され得るＣ９ｏｒｆ７２（ｓＣ９ｏｒｆ７２）の短いアイソフォームを標的とするＣＡＲを含むことができる。例示的な実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、ｓＣ９ｏｒｆ７２を標的とするＣＡＲを含むことがあり、前記のＣＡＲは、ｓＣ９ｏｒｆ７２に対するヒトｓｃＦＶを含むことができる。一部の特定の例示的な実施形態では、ｓＣ９ｏｒｆ２７を標的とするＣＡＲは、固有のヒトαｓＣ９ｏｒｆ７２からのＶＨ及びＶＬ配列を使用する抗ｓＣ９ｏｒｆ７２ ＣＡＲを含むことができる。一部の実施形態では、各αｓＣ９ｏｒｆ７２ ｓｃＦＶの前記のＶＬｃ末端は、ヒトＣＤ２８ヒンジ、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインと融合されることがあり、その後、ヒトＣＤ３ζ細胞質ドメインが融合されて、改変されたＴｒｅｇによって構成され得る抗ｓＣ９ｏｒｆ７２ ＣＡＲを製造することができる。一部の実施形態では、非シグナル伝達のトランケートされたヒトＣＤ１９（ｔＣＤ１９）は、前記のＣＡＲを含むベクター上の形質導入マーカーとして役立つことがある。例示的な実施形態では、ｓＣ９ｏｒｆ７２を標的とする改変されたＴｒｅｇは、ミクログリアが媒介する運動ニューロン変性を抑制することがあり、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、一酸化窒素を減少させ、そして／またはＩＬ－１０を増加させることがある。ＩＬ－４、及びＴＧＦ－β（治療を必要とする患者に投与される場合など）。
【0103】
一部の例示的な実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、抗変異型ＳＯＤ１ ＣＡＲを含む改変されたＴｒｅｇなど、ＡＬＳを標的とする改変されたＴｒｅｇを含むことがあり、前記の改変されたＴｒｅｇは、脊髄実質に入り、蓄積された脊髄変異型ＳＯＤ１タンパク質を認識し、抗炎症メディエーターを生成することによって反応し得る 。前記の改変されたＴｒｅｇは、治療を必要とする患者に投与されると炎症性メディエーター（例えば、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＴＮＦ－α、ＩＬ１β、ＮＯＸ２）の発現を減少させ、抗炎症性メディエーター（例えば、ＩＬ－１０、ＩＬ－４、及びＴＧＦ－β）の発現を増加させる。さらに、ＡＬＳを標的とする改変されたＴｒｅｇ、例えば抗変異型ＳＯＤ１ ＣＡＲを含む改変されたＴｒｅｇは、ＡＬＳの治療方法で使用した場合、運動ニューロン周囲の持続性及び／または神経毒性炎症を抑制する可能性がある。
【0104】
さらに、他の例示的な実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、アルツハイマー病に関連するタンパク質及び／または分子マーカーを標的とすることができる。一部の例示的な実施形態では、前記の改変されたＴｒｅｇは、前記のタンパク質及び／またはマーカーを標的とする１つ以上のＣＡＲを含むことができる。一部の実施形態では、前記のタンパク質及び／またはマーカーは、アミロイドベータ（Ａβ）、特にオリゴマーＡβ、及び／またはねじれたタウタンパク質繊維のニューロン内のもつれを含むことができる。一部の実施形態では、アミロイドベータを標的とするＣＡＲは、ＤＧ０１（配列番号：１）、及び／または前記の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物に改変され得る。一部の実施形態では、アミロイドベータを標的とするＣＡＲは、ＤＧ０２（配列番号：２）、及び／または前記の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物に改変され得る。一部の実施形態では、アミロイドベータを標的とするＣＡＲは、ＤＧ０２（配列番号：３）、及び／または前記の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物に改変され得る。一部の実施形態では、アミロイドベータを標的とするＣＡＲは、ＤＧ０２（配列番号：４）、及び／または前記の構成物と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物に改変され得る。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、ＤＧ０１－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２０）、ＤＧ０２－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２１）、ＤＧ０３－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２２）、ＤＧ０４－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２３）、及び／または前記の構成物のいずれか１つ以上と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物で、各構成物はアミロイドベータを標的とする。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、ＤＧ０３－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（ＤＧ０３－２８－３ζとも呼ばれる）（配列番号：２２）、ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ－ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ（ＤＧ０３－２８ｔｍ－１０－３ζとも呼ばれる）（配列番号：４５）、ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ４４－ＣＤ３ζ（ＤＧ０３－２８ｔｍ－４４－３ζとも呼ばれる）（配列番号：４６）、ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ－４－１－ＢＢ－ＣＤ３ζ（ＤＧ０３－２８ｔｍ－ＢＢ－３ζとも呼ばれる）（配列番号：４７）、ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ３ζ（ＤＧ０３－２８ｔｍ－３ζとも呼ばれる）（配列番号：４８）、ＤＧ０３－ＣＤ２８（ＤＧ０３－２８とも呼ばれる）（配列番号：４９）、及び／またはＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ（ＤＧ０３－２８ｔｍとも呼ばれる）（配列番号：５０）、及び／または前記の構成物のいずれか１つ以上と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む構成物で、各構成物はアミロイドベータを標的とする。
【0105】
例示的な実施形態では、改変されたＴｒｅｇに含まれるＣＡＲは、Ａβペプチドを標的とすることができ、Ａβに対する異なる結合特異性を有する抗体、例えば、ヒト及び／またはヒト化抗体からの単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）配列を使用する抗Ａβ ＣＡＲ、例えばオリゴマーＡβを含むことができる。例示的な実施形態では、前記のｓｃＦｖは、ヒトＣＤ２８ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインに融合され、次いでヒトＣＤ３ζ細胞質ドメインが続く。前記のＣＡＲは、抗原結合及び架橋の際に、一次（ＣＤ３ζ）及び共刺激（ＣＤ２８）シグナル伝達の両方を誘発し得る。一部の実施形態では、トランケートされた（非シグナル伝達）ＣＤ１９（ｔＣＤ１９）もまた、Ｔ２Ａ共発現システムを使用することなどによって、前記のＣＡＲを含む同一ベクターで発現されることがあり、形質導入されたＴ細胞を追跡及び精製する手段として機能し得る。一部の実施形態では、抗Ａβ ＣＡＲを含む改変されたＴｒｅｇは、ＣＤ３で活性化された同種ＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖を抑制し得る。さらに一部の実施形態では、オリゴマーＡβで活性化された場合、抗Ａβ ＣＡＲを含む改変されたＴｒｅｇは、抗炎症性サイトカイン、例えばＩＬ－１０を生成する可能性がある。さらに、前記の改変されたＴｒｅｇは、炎症促進性メディエーターの産生を抑制し、例えばＩＬ－１０、ＴＧＦ－β、及びＩＬ－４抗炎症性サイトカインを分泌することなどにより、活性化ミクログリアまたはマクロファージの食作用能力を増強し得る。一部の例示的な実施形態では、オリゴマーＡβに特異的なＣＡＲを発現する本発明による改変されたＴｒｅｇは、オリゴマーＡβが蓄積する可能性がある領域において、標的抗炎症活性及び神経保護効果を有することができる。一部の例示的な実施形態では、例えばオリゴマーＡβに特異的なＣＡＲを発現する改変されたＴｒｅｇは、海馬に移動することができ、ここで、オリゴマーＡβが蓄積し得る。
【0106】
さらに、一部の例示的な実施形態では、抗Ａβ ＣＡＲを含む改変されたＴｒｅｇは、Ａβ沈着及び神経炎症の脳領域に移動及び蓄積することができ、そのような領域は海馬及び前頭皮質におけるＡβ沈着の部位を含むことができる。一部の実施形態では、アルツハイマー病を標的とするＣＡＲを含む改変されたＴｒｅｇは、前記の脳領域に蓄積することがあり、前記の領域におけるヒト抗炎症性サイトカインＩＬ－１０、ＴＧＦ－β及びＩＬ４の発現の増加を導くことがある。これらの抗炎症性サイトカインは、炎症誘発性メディエーターの発現及びミクログリア数の減少につながる可能性がある。一部の例示的な実施形態では、アルツハイマー病を標的とするＣＡＲを含む改変されたＴｒｅｇは、前記の改変されたＴｒｅｇで治療された患者の記憶機能を改善する場合がある。
【0107】
改変されたＴｒｅｇの特定の特徴及び／または改変されたＴｒｅｇにより構成され得る特定の特徴及び／または改変されたＴｒｅｇの標的により含まれることがある特定の特徴は、以下により詳細に考察される。
【0108】
ＣＡＲ
例示的な実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、上部や下部で考察されるように、神経変性疾患または病態を標的とする１つ以上のＣＡＲを含むことができる。一部の例示的な実施形態では、１つ以上のＣＡＲは、神経変性疾患または病態に関連する標的分子に結合するＡＢドメインを含むことができる。ＡＢドメインについては、以下で詳しく説明する。
例示的な実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、上部や下部で考察されるように、神経変性疾患または病態を標的とする１つ以上のＣＡＲを含むことができる。一部の例示的な実施形態では、１つ以上のＣＡＲは、神経変性疾患または病態に関連する標的分子に結合するＡＢドメインを含むことができる。ＡＢドメインについては、以下で詳しく説明する。
【0109】
抗原結合（ＡＢ）ドメイン
ＡＢドメインは、標的分子に結合するポリペプチドに由来し得る。一部の実施形態では、ポリペプチドは標的分子に結合する受容体または受容体の一部であり得る。別の実施形態では、ＡＢドメインは標的分子に結合するリガンドに由来し得る。
ＡＢドメインは、標的分子に結合するポリペプチドに由来し得る。一部の実施形態では、ポリペプチドは標的分子に結合する受容体または受容体の一部であり得る。別の実施形態では、ＡＢドメインは標的分子に結合するリガンドに由来し得る。
【0110】
別の実施形態では、ＡＢドメインは標的分子に結合する抗体（Ａｂ）またはその抗原結合フラグメントに由来し得る。Ａｂまたはその抗原結合フラグメントの例としては、モノクローナルＡｂ、単一特異性Ａｂ、多重特異性Ａｂ、ヒト化Ａｂ、四量体Ａｂ、四価Ａｂ、多特異性Ａｂ、一本鎖Ａｂ、ドメイン特異的Ａｂ、単一ドメインＡｂ（ｄＡｂ）、ドメイン削除Ａｂ、ｓｃＦｃ融合タンパク質、キメラＡｂ、合成Ａｂ、組換えＡｂ、ハイブリッドＡｂ、変異Ａｂ、ＣＤＲ移植Ａｂ、フラグメント抗原結合（Ｆａｂ）を含むＡｂフラグメント、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆａｂ'フラグメント、可変フラグメント（Ｆｖ）、一本鎖抗体フラグメント、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント、Ｆｄフラグメント、ｄＡｂフラグメント、ダイアボディ、ナノボディ、２価ナノボディ、サメ可変ＩｇＮＡＲドメイン、ＶＨＨ Ａｂ、ラクダ科Ａｂ及びミニボディが挙げられるが、これらに限定されるものではない。特定の実施形態では、ＡＢドメインは可変重鎖領域及び／またはｓｃＦＶなどの可変軽鎖領域を含む一本鎖抗体フラグメントを含む。別の特定の実施形態では、ＡＢドメインはナノボディを含む。
【0111】
単一ドメインＡｂは、抗体の重鎖可変ドメインのすべてまたは一部、または軽鎖可変ドメインのすべてまたは一部を含むＡｂフラグメントである。特定の実施形態では、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である。
【0112】
抗体フラグメントは、無傷のＡｂのタンパク質分解消化、並びに組換え宿主細胞による産生を含むがこれらに限定されない様々な技術によって製造することができる。一部の実施形態では、抗体はペプチドリンカーなどの合成リンカーによって連結された２つ以上のＡｂ領域または鎖を有するものなど、天然には存在しない配置を含むフラグメントなどの組換え生成フラグメントであり、そして／または天然の無傷のＡｂの酵素消化により生成される。いくつかの側面において、ＡｂフラグメントはｓｃＦｖである。いくつかの側面において、Ａｂフラグメントはナノボディである。
【0113】
いくつかの側面において、ＡＢドメインはＡｂまたはその抗原結合フラグメントに由来することがありその抗原結合フラグメントは、特定のエピトープ、例えば他のＡｂと類似するかまたは重複するエピトープへの結合を含む、結合特性などの１つ以上の特定の機能的特徴を有する。
【0114】
一部の実施形態では、ＡＢは標的分子に特異的なＡｂのＣＤＲ配列を含むｓｃＦｖを含む。ＣＤＲは、従来の方法を使用して決定できる。与えられたＣＤＲまたはＦＲの正確なアミノ酸配列境界は、Ｋａｂａｔ 他により記述されたものを含む、いくつかのよく知られたスキームのいずれかを使用して容易に決定することができる。（１９９１年）、「免疫学的に興味のあるタンパク質の配列」、第５版。国立衛生研究所公衆衛生局、メリーランド州、ベセスダ。（「Ｋａｂａｔ」ナンバリング方式）、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ 他、「（１９９７年）Ｊ． Ｍｏｌ。Ｂｉｏｌ。２７３、９２７～９４８（「Ｃｈｏｔｈｉａ」ナンバリング方式）、ＭａｃＣａｌｌｕｍ 他、Ｊ． Ｍｏｌ。Ｂｉｏｌ。２６２：７３２～７４５（１９９６年）、「抗体と抗原の相互作用：接触分析と結合部位の形状」、Ｊ． Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ. ２６２, ７３２～７４５（「コンタクト」ナンバリング方式）、Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ Ｐ 他、「免疫グロブリン及びＴ細胞受容体可変ドメイン及びＩｇスーパーファミリーＶ－ｌｉｋｅドメインのＩＭＧＴ固有の番号付け」Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ」２００３年１月、２７（１）：５５～７７（「ＩＭＧＴ」ナンバリング方式）、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ Ａ及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ Ａ、「免疫グロブリン可変ドメインのさらに別のナンバリング方式：自動モデリング及び分析ツール」、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ２００１年６月８日、３０９（３）：６５７～７０（「Ａｈｏ」ナンバリング方式）。
【0115】
一部の実施形態では、ＡＢドメインを含む配列は、リーダー配列またはシグナル配列をさらに含む。ＡＢドメインがｓｃＦＶを含む一部の実施形態では、リーダー配列は、ｓｃＦＶのアミノ末端に配置され得る。重鎖可変領域がＮ末端である一部の実施形態では、リーダー配列は、重鎖可変領域のアミノ末端に配置され得る。軽鎖可変領域がＮ末端である一部の実施形態では、リーダー配列は、軽鎖可変領域のアミノ末端に配置され得る。リーダー配列は、任意の適切なリーダー配列を含むことができる。本発明の一部の実施形態では、リーダー配列のアミノ酸配列は、配列番号３１に示される配列、または配列番号：２３１に示される核酸配列によって符号化される配列からなる。本発明の単離された細胞の成熟形態では、リーダー配列は存在しない場合がある。
【0116】
ヒンジ
一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、１つ以上のＣＡＲを含むことがあり、前記のＣＡＲは、ＡＢドメインとＴＭドメインとの間にヒンジ配列を含むことができる。当技術分野の通常の熟練者は、ヒンジ配列が柔軟性を促進するアミノ酸の短い配列であることを理解するであろう（例えば、Ｗｏｏｆ 他、Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４（２）：８９～９９（２００４年）を参照）。ヒンジ配列は、任意の適切な分子に由来するか、または任意の適切な分子から得られる任意の適切な配列であり得る。一部の実施形態では、ヒンジ配列の長さは、ＣＡＲの細胞外部分の所望の長さに基づいて最適化されることがあり、これは、標的分子内のエピトープの位置に基づいている可能性がある。例えば、エピトープが標的分子内の膜近位領域にある場合、より長いヒンジが最適であり得る。
一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、１つ以上のＣＡＲを含むことがあり、前記のＣＡＲは、ＡＢドメインとＴＭドメインとの間にヒンジ配列を含むことができる。当技術分野の通常の熟練者は、ヒンジ配列が柔軟性を促進するアミノ酸の短い配列であることを理解するであろう（例えば、Ｗｏｏｆ 他、Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４（２）：８９～９９（２００４年）を参照）。ヒンジ配列は、任意の適切な分子に由来するか、または任意の適切な分子から得られる任意の適切な配列であり得る。一部の実施形態では、ヒンジ配列の長さは、ＣＡＲの細胞外部分の所望の長さに基づいて最適化されることがあり、これは、標的分子内のエピトープの位置に基づいている可能性がある。例えば、エピトープが標的分子内の膜近位領域にある場合、より長いヒンジが最適であり得る。
【0117】
一部の実施形態では、ヒンジは免疫グロブリンＦｃ領域、例えば、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域、ＩｇＧ２ Ｆｃ領域、ＩｇＧ３ Ｆｃ領域、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域、ＩｇＥ Ｆｃ領域、ＩｇＭ Ｆｃ領域、またはＩｇＡ Ｆｃ領域に由来するか、またはその少なくとも一部を含むことができる。一部の実施形態では、ヒンジはそのＣＨ２及びＣＨ３ドメイン内にあるＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＡ免疫グロブリンＦｃ領域の少なくとも一部を含む。また、一部の実施形態では、ヒンジは対応する免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部を含むことができる。一部の実施形態では、ヒンジは改変された免疫グロブリンＦｃ領域、例えば、改変されたＩｇＧ１ Ｆｃ領域に由来するか、または改変されたＩｇＧ１ Ｆｃ領域、改変されたＩｇＧ２ Ｆｃ領域、改変されたＩｇＧ３ Ｆｃ領域、改変されたＩｇＧ４ Ｆｃ領域、改変されたＩｇＥ Ｆｃ領域、改変されたＩｇＭ Ｆｃ領域、または改変されたＩｇＡ Ｆｃ領域の少なくとも一部を含む。改変された免疫グロブリンＦｃ領域には、１つ以上の突然変異（例えば、点突然変異、挿入、削除、重複）があり、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）へのヒンジの結合の障害を引き起こす１つ以上のアミノ酸の置換、変更、または削除を引き起こす可能性がある。一部の側面において、改変された免疫グロブリンＦｃ領域は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲ２Ａ、ＦｃγＲ２Ｂ１、Ｆｃγ２Ｂ２、Ｆｃγ３Ａ、Ｆｃγ３Ｂ、ＦｃεＲＩ、ＦｃεＲ２、ＦｃαＲＩ、Ｆｃα／μＲ、またはＦｃＲｎを含むがこれらに限定されない、１つ以上のＦｃＲに対するヒンジの障害された結合を引き起こす１つ以上のアミノ酸置換、改変、または欠失をもたらす１つ以上の変異を有するように設計され得る。
【0118】
一部の側面において、免疫グロブリン定常領域の一部は、ＡＢドメイン、例えばｓｃＦｖまたはナノボディとＴＭドメインとの間のヒンジとして機能する。ヒンジは、ヒンジがない場合と比較して、抗原結合後のＣＡＲ発現細胞の増加した応答性を高める長さであり得る。一部の例では、ヒンジは長さが約１２個のアミノ酸であるか、または約１２個のアミノ酸以下である。例示的なヒンジには、少なくとも約１０～２２９個のアミノ酸、約１０～２００個のアミノ酸、約１０～１７５個のアミノ酸、約１０～１５０個のアミノ酸、約１０～１２５個のアミノ酸、約１０～１００個のアミノ酸、約１０～７５個のアミノ酸、約１０～５０個のアミノ酸、約１０～４０個のアミノ酸、約１０～３０個のアミノ酸、約１０～２０個のアミノ酸、または約１０～１５個のアミノ酸を有するものであって、記載された範囲のいずれかの終点の間の任意の整数からなるものを含む。一部の実施形態では、ヒンジは約１２個以下のアミノ酸、約１１９個以下のアミノ酸、または約２２９個以下のアミノ酸を有する。例示的なヒンジには、ＣＤ２８ヒンジ、ＩｇＧ４ヒンジのみ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインに連結されたＩｇＧ４ヒンジ、またはＣＨ３ドメインに連結されたＩｇＧ４ヒンジが含まれる。例示的なヒンジには、Ｈｕｄｅｃｅｋ 他に記載されているものが含まれるが、これらに限定されない。（２０１３年）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、１９：３１５３、国際特許出願公開番号 ＷＯ２０１４０３１６８７、米国特許第８，８２２，６４７号または公開アプリ番号 ＵＳ２０１４／０２７１６３５。
【0119】
一部の実施形態では、ヒンジ配列はＣＤ８α分子、ＤＡＰ１０分子、ＣＤ８ａ分子、またはＣＤ２８分子に由来する。好ましい実施形態では、ヒンジ配列はＣＤ２８に由来する。一つの実施形態では、ヒンジはヒトＣＤ２８ヒンジのアミノ酸配列（配列番号：３２）または配列番号：２３２によって符号化される配列からなる。一部の実施形態では、ヒンジは少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列番号：３２と同一のアミノ酸配列からなる。一部の実施形態では、ヒンジはマウスＣＤ２８ヒンジのアミノ酸配列（配列番号：３３）または配列番号：２３３によって符号化される配列からなる。一部の実施形態では、ヒンジは少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列番号：３３と同一のアミノ酸配列からなる。一つの実施形態では、ヒンジはヒトＣＤ２８ヒンジのアミノ酸配列（配列番号：３４）または配列番号：２３４によって符号化される配列からなる。一部の実施形態では、ヒンジは少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列番号：３４と同一のアミノ酸配列からなる。一つの実施形態では、ヒンジはヒトＤＡＰ１０ヒンジのアミノ酸配列（配列番号：３５）または配列番号：２３５によって符号化される配列からなる。一部の実施形態では、ヒンジは少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列番号：３５と同一のアミノ酸配列からなる。
【0120】
膜貫通（ＴＭ）ドメイン
一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、１つ以上のＣＡＲを含むことがあり、前記のＣＡＲは、ＴＭドメインを含むことができる。ＴＭドメインに関して、ＣＡＲは、ＣＡＲのＡＢドメインに融合されるＴＭドメインを含むように設計することができる。ヒンジ配列は、ＡＢドメインとＴＭドメインの間に挿入されてもよい。一部の実施形態では、ＣＡＲ内のドメインの１つと自然に関連付けられるＴＭドメインが使用される。一部の実施形態では、ＴＭドメインはアミノ酸置換によって選択または修飾して、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのそのようなドメインの結合を回避して、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えることができる。
一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、１つ以上のＣＡＲを含むことがあり、前記のＣＡＲは、ＴＭドメインを含むことができる。ＴＭドメインに関して、ＣＡＲは、ＣＡＲのＡＢドメインに融合されるＴＭドメインを含むように設計することができる。ヒンジ配列は、ＡＢドメインとＴＭドメインの間に挿入されてもよい。一部の実施形態では、ＣＡＲ内のドメインの１つと自然に関連付けられるＴＭドメインが使用される。一部の実施形態では、ＴＭドメインはアミノ酸置換によって選択または修飾して、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのそのようなドメインの結合を回避して、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えることができる。
【0121】
ＴＭドメインは、天然または合成ソースのいずれかに由来する。ソースが天然の場合、ドメインは膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来する可能性がある。一般的には、ＴＭドメインは統合タンパク質としても知られている膜貫通タンパク質の単一の膜貫通αヘリックスを意味する。本発明で特に使用されるＴＭドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、Ｄａｐ１０、ＣＤ４４、ＣＴＬＡ－４、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、またはＣＤ３ゼータ（配列番号：２１６によって符号化される配列番号：１６）に由来する（すなわち、少なくとも膜貫通領域からなる）ものであってもよく、そして／またはその機能的変異体を含むＴＭドメイン、例えば、その膜貫通などの構造特性の実質的な部分を保持するものでもよい。
【0122】
あるいは、ＴＭドメインは合成であってもよく、その場合にＴＭドメインは、ロイシン及びバリンなどの主に疎水性の残基を含んでいる。好ましくは、フェニルアラニン、トリプトファン及びバリンのトリプレットが、合成ＴＭドメインの両端に存在する。本発明のＴＭドメインは、膜中で熱力学的に安定している。これは、単一のαヘリックス、膜貫通βバレル、グラミシジンＡのβヘリックス、またはいずれか他の構造であり得る。膜貫通ヘリックスは、通常約２０個程度のアミノ酸の長さを有する。
【0123】
いくつかの好ましい実施形態では、ＣＡＲのＴＭドメインは、ＣＤ２８のＴＭ領域に由来し得る。一つの実施形態では、ＴＭドメインは、ヒトＣＤ２８ ＴＭのアミノ酸配列（配列番号：３６）または配列番号：２３６によって符号化される配列からなる。一部の実施形態では、ＴＭドメインは、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列番号：３６と同一のアミノ酸配列からなる。一つの実施形態では、ＴＭドメインはマウスＣＤ２８ ＴＭのアミノ酸配列（配列番号：３７）または配列番号：２３７によって符号化される配列からなる。一部の実施形態では、ＴＭドメインは、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列番号：３６と同一のアミノ酸配列からなる。一つの実施形態では、ＴＭドメインはヒトＣＤ８Ａ ＴＭのアミノ酸配列（配列番号：３８）または配列番号：２３８によって符号化される配列からなる。一部の実施形態では、ＴＭドメインは少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列番号：３８と同一のアミノ酸配列からなる。一つの実施形態では、ＴＭドメインはヒトＣＤ８Ａ ＴＭのアミノ酸配列（配列番号：３９）または配列番号：２３９によって符号化される配列からなる。一部の実施形態では、ＴＭドメインは、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列番号：３９と同一のアミノ酸配列からなる。
【0124】
必要に応じて、短いオリゴまたはポリペプチドスペーサー、好ましくは２～１０個のアミノ酸の長さが、ＣＡＲのＴＭドメインとＩＣＳドメインとの間の結合を形成し得る。グリシン－セリンダブレットは、適切なスペーサーを提供し得る。
【0125】
細胞内シグナル伝達（ＩＣＳ）ドメインと共刺激（ＣＳ）ドメイン
一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、１つ以上のＣＡＲを含むことがあり、前記のＣＡＲは、ＩＣＳ及び／またはＣＳドメインを含むことができる。ＩＣＳドメインまたはその他の細胞質ドメインは、ＣＡＲが配置された細胞の正常な機能の少なくとも１つの活性化、例えばサイトカインの分泌を誘発または誘発し得る。従って、「細胞内シグナル伝達ドメイン」または「ＩＣＳドメイン」という用語は、機能的シグナルを変換し、細胞に特定の機能を実行するように指示するタンパク質の部分を指す。通常はＩＣＳドメイン全体を使用できるが、多くの場合はチェーン全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインのトランケートされた部分が使用される限り、そのようなトランケートされた部分は、機能シグナルを変換する限り、無傷の鎖の代わりに使用されてもよい。従って、「細胞内シグナル伝達ドメイン」または「ＩＣＳドメイン」という用語は、機能シグナルを伝達するのに十分なＩＣＳドメインのトランケートされた部分を含むことを意味する。
一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、１つ以上のＣＡＲを含むことがあり、前記のＣＡＲは、ＩＣＳ及び／またはＣＳドメインを含むことができる。ＩＣＳドメインまたはその他の細胞質ドメインは、ＣＡＲが配置された細胞の正常な機能の少なくとも１つの活性化、例えばサイトカインの分泌を誘発または誘発し得る。従って、「細胞内シグナル伝達ドメイン」または「ＩＣＳドメイン」という用語は、機能的シグナルを変換し、細胞に特定の機能を実行するように指示するタンパク質の部分を指す。通常はＩＣＳドメイン全体を使用できるが、多くの場合はチェーン全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインのトランケートされた部分が使用される限り、そのようなトランケートされた部分は、機能シグナルを変換する限り、無傷の鎖の代わりに使用されてもよい。従って、「細胞内シグナル伝達ドメイン」または「ＩＣＳドメイン」という用語は、機能シグナルを伝達するのに十分なＩＣＳドメインのトランケートされた部分を含むことを意味する。
【0126】
１つのＩＣＳドメインだけで生成された信号は、細胞の完全な活性化には不十分である場合があり、二次信号または共刺激信号も必要になる場合がある。そのような場合、共刺激ドメイン（ＣＳドメイン）がＣＡＲの細胞質部分に含まれることがある。ＣＳドメインは、このような二次信号または共刺激信号を変換するドメインである。オプションで、ＣＡＲは２つ以上のＣＳドメインを含むことができる。ＣＳドメインは、ＩＣＳドメインの上流またはＩＣＳドメインの下流に配置できる。
【0127】
例えば、Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して抗原依存性の一次活性化を開始するもの（一次細胞質シグナル伝達配列）と、抗原に依存しない方法で作用して二次的または補体シグナルを提供するもの（二次細胞質シグナル伝達配列）の２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列によって媒介されると言うことができる。一次細胞質シグナル伝達配列は、ＴＣＲ複合体の一次活性化を刺激的または抑制的に調節する。刺激的に作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られている、シグナル伝達モチーフを含んでいる場合がある。そのような細胞質シグナル伝達配列は、ＣＡＲのＩＣＳまたはＣＳドメインに含まれていてもよい。
【0128】
特定の用途に使用されるＩＴＡＭを含む一次細胞質シグナル伝達配列の例としては、リンパ球受容体鎖のＩＣＳドメイン、ＴＣＲ／ＣＤ３複合タンパク質、Ｆｃ受容体サブユニット、ＩＬ－２受容体サブユニット、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＦｃεＲＩ、ＤＡＰ１０、及びＤＡＰ１２に由来するものが挙げられる。
【0129】
一部の実施形態では、ＣＡＲ内のＩＣＳドメインは、ＣＤ３ゼータに由来する細胞質シグナル伝達配列を含むことができる。一部の実施形態では、ＩＣＳドメインは配列番号：１６）のアミノ酸配列、または配列番号：２１６により符号化される配列からなる。一部の実施形態では、ＩＣＳドメインは少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列番号：１６と同一のアミノ酸配列からなる。
【0130】
様々なＣＳドメインが異なる特性を与えることが報告されている（Ｇａｃｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２３１： ２５９０-２５９８， ２０１６）。例えば、４－１ＢＢ ＣＳドメインは、一部のイン・ビボゼノグラフモデルで持続性の向上を示すことが報告されている（Ｍｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２００９；１７：１４５３－１４６４； Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１１；７１：４６１７－４６２７）。さらに、これらの異なるＣＳドメインは、異なるサイトカインプロファイルを生成し、これは次に、標的細胞を介した細胞毒性と疾患の微小環境に異なる効果をもたらす可能性がある。
【0131】
共刺激分子の例としては、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、Ｔｏｌｌリガンド受容体、Ｂ７－Ｈ３、ＢＡＦＦＲ、ＢＴＬＡ、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ１９ａ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９ 、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９Ｄ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ６９、ＣＤ８４、ＣＤ９６（触覚）、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ１０３、ＣＲＴＡＭ、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＤＳ、ＣＲＴＡＭ、ＤＡＰ１０、ＧＡＤＳ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ） 、ＩＡ４、ＩＣＡＭ－１、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＡＤ、ＩＴＧＡＥ、ＩＴＧＡＬ、ＩＴＧＡＭ、ＩＴＧＡＸ、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＢ２、ＩＴＧＢ７、ＫＩＲＤＳ２、ＬＡＴ、ＬＦＡ－１、ＬＩＧＨＴ、ＬＴＢＲ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＰＤ－１、ＰＳＧＬ１、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭＦ７、ＳＬＰ－７６、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＶＬＡ１、ＶＬＡ－ ６、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。
【0132】
ＣＡＲのＩＣＳドメインとＣＳドメインは、ランダムな順序または指定された順序で相互にリンクできる。必要に応じて、短いオリゴまたはポリペプチドリンカー、好ましくは２～１０個のアミノ酸の長さが結合を形成することができる。グリシン－セリンダブレットは、特に適切なリンカーを提供し得る。
【0133】
さらなる修正
一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、１つ以上のＣＡＲを含むことがあり、前記のＣＡＲは、さらなる修正ドメインを含むことができる。一部の実施形態では、１つ以上のＣＡＲ、それを符号化するヌクレオチド配列やベクター、及び前記のＣＡＲを符号化するヌクレオチド配列を含む細胞は、様々な特徴を提供または選択するために、さらに改変、操作、最適化、または付加され得る。これらの機能には、有効性、持続性、ターゲットの特異性、免疫原性の低下、マルチターゲティング、免疫応答の強化、拡大、成長、オフターゲット効果の低下、対象者の毒性の低下、検出、選択、ターゲティングなどが含まれるが、これらに限定されない。例えば、細胞は別のＣＡＲを発現するように、または自殺メカニズムを有するように改変されることがあり、そしてＴＣＲ及び／またはＭＨＣ分子などの内因性受容体または分子の発現を除去または変更するように改変され得る。
一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、１つ以上のＣＡＲを含むことがあり、前記のＣＡＲは、さらなる修正ドメインを含むことができる。一部の実施形態では、１つ以上のＣＡＲ、それを符号化するヌクレオチド配列やベクター、及び前記のＣＡＲを符号化するヌクレオチド配列を含む細胞は、様々な特徴を提供または選択するために、さらに改変、操作、最適化、または付加され得る。これらの機能には、有効性、持続性、ターゲットの特異性、免疫原性の低下、マルチターゲティング、免疫応答の強化、拡大、成長、オフターゲット効果の低下、対象者の毒性の低下、検出、選択、ターゲティングなどが含まれるが、これらに限定されない。例えば、細胞は別のＣＡＲを発現するように、または自殺メカニズムを有するように改変されることがあり、そしてＴＣＲ及び／またはＭＨＣ分子などの内因性受容体または分子の発現を除去または変更するように改変され得る。
【0134】
一部の実施形態では、ＣＡＲを符号化するベクターまたは核酸配列は、他の遺伝子をさらに符号化する。ベクターまたは核酸配列は、２つ以上のプラスミドの同時的トランスフェクション、複数または双方向プロモーターの使用、またはバイシストロニックまたはマルチシストロニックベクターの製造を含む多数の技術を使用して、複数の遺伝子の同時発現を可能にするように構成できる 。マルチシストロン性ベクターの構成は、ＩＲＥＳ要素または２Ａペプチド、例えばＴ２Ａ、Ｐ２Ａ（アミノ酸配列が配列番号：１５を構成してもよく、配列番号：２１５によって符号化されてもよい）、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａ（例えば、Ｋｉｍ， Ｊ．Ｈ． 他、「ヒト細胞株、ゼブラフィッシュ、マウスにおけるブタテスコウイルス１由来の２Ａペプチドの高い切断効率」、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ２０１１年、６（４）を参照）。一部の実施形態では、ＣＡＲを符号化する核酸配列またはベクターは、Ｔ２Ａリボソームスキップ配列を使用してｔＣＤ１９をさらに符号化する。一つの実施形態では、Ｔ２Ａリボソームスキップ配列は、配列番号：２１４に示される核酸配列からなる。一つの実施形態では、Ｔ２Ａリボソームスキップ配列は、配列番号：１４のアミノ酸配列を符号化する。
【0135】
本発明による改変されたＴｒｅｇに含まれるＣＡＲは、標的分子を発現する細胞に対する効力を改善するために、場合によってはさらに改変され得る。一部の実施形態では、改善された有効性は、ミクログリア細胞活性化の減少、炎症反応の減少、及び／またはニューロン死の減少によって測定され得る。一部の実施形態では、１つ以上のＣＡＲからなる改変されたＴｒｅｇは、ＣＡＲより多くをさらに含むことができる。追加のＣＡＲは、最初のＣＡＲのターゲット分子に固有の場合とそうでない場合がある。一部の実施形態では、１つ以上の追加のＣＡＲは、ＣＡＲの抑制または活性化として作用することができる。一部の側面において、一部の実施形態のＣＡＲは、刺激性または活性化ＣＡＲであり、他の側面では、それは共刺激ＣＡＲである。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、阻害性のＣＡＲをさらに含むことがある（ｉＣＡＲ、Ｆｅｄｏｒｏｖ 他、Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ。Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０１３年１２月、５（２１５）：２１５ｒａ１７２）、例えば第一のＣＡＲの標的分子以外の抗原を認識するＣＡＲなど、第一のＣＡＲを介して送達される活性化シグナルは、例えばオフターゲット効果を低減するために、阻害性ＣＡＲのそのリガンドへの結合によって、変更または改変され得る。
【0136】
ベクトルまたは構成
また、本開示はＣＡＲを符号化するものといった、ＤＮＡが挿入され得るプラスミドまたはレトロウイルス構成物のようなベクターまたは構成物を提供する。レンチウイルスなどのレトロウイルス由来のベクターは、導入遺伝子の長期的な安定した組み込みと娘細胞での増殖を可能にするため、長期的な遺伝子導入を実現するのに適したツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖細胞を形質導入できるという点で、マウス白血病ウイルスなどの腫瘍レトロウイルスに由来するベクターよりも優れている。また、免疫原性が低いという利点もある。
また、本開示はＣＡＲを符号化するものといった、ＤＮＡが挿入され得るプラスミドまたはレトロウイルス構成物のようなベクターまたは構成物を提供する。レンチウイルスなどのレトロウイルス由来のベクターは、導入遺伝子の長期的な安定した組み込みと娘細胞での増殖を可能にするため、長期的な遺伝子導入を実現するのに適したツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖細胞を形質導入できるという点で、マウス白血病ウイルスなどの腫瘍レトロウイルスに由来するベクターよりも優れている。また、免疫原性が低いという利点もある。
【0137】
要約すると、ＣＡＲを符号化する天然または合成核酸の発現は、ＣＡＲポリペプチドまたはその一部を符号化する核酸をプロモーターに機能的に連結し、構成物を発現ベクターに組み込むことにより、一般的に達成され得る。ベクターは、複製及び統合真核生物に適している可能性がある。一般的なクローニングベクターは、転写及び翻訳ターミネーター、開始配列、及び所望の核酸配列の発現の調節に有用なプロモーターを含む。
【0138】
本発明の発現構成物はまた、標準的な遺伝子送達プロトコルを使用して、核酸免疫化及び遺伝子治療のために使用され得る。遺伝子送達の方法は当技術分野で知られている。例えば、米国特許第５，３９９，３４６号、第５，５８０，８５９号、第５，５８９，４６６号、第５，３９９，３４６号、第５，５８０，８５９号、第５，５８９，４６６号、それらの全体が参照のために本明細書に組み込まれている。
【0139】
核酸は、多くのタイプのベクターにクローニングすることができる。例えば、核酸はプラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、及びコスミドを含むがこれらに限定されないベクターにクローニングすることができる。特に興味深いベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、及び配列決定ベクターなどがある。
【0140】
さらに、発現ベクターはウイルスベクターの形態で細胞に提供されてもよい。ウイルスベクター技術は当技術分野で知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ 他。（２００１年、分子クローニング：ラボマニュアル、コールドスプリングハーバーラボ、ニューヨーク）、及びその他のウイルス学や分子生物学のマニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスには、レトロウイルス、γレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルスが含まれるが、これらに限定されない。一般的に、適切なベクターは少なくとも１つの生物において機能的な複製起点、プロモーター配列、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び１つ以上の選択可能なマーカーを含む（例えば、ＷＯ０１／９６５８４、ＷＯ０１／２９０５８及び米国特許第６，３２６，１９３号）。
【0141】
哺乳動物の細胞への遺伝子導入のために、多くのウイルスベースのシステムが開発されてきた。例えば、レトロウイルスは遺伝子送達システムに便利なプラットフォームを提供する。選択した遺伝子をベクターに挿入し、当技術分野で知られている技術を使用してレトロウイルス粒子にパッケージングすることができる。次に、組換えウイルスを単離し、イン・ビボまたはエクス・ビボで対象者の細胞に送達することができる。多くのレトロウイルス系が当技術分野で知られている。一部の実施形態では、アデノウイルスベクターが使用される。多くのアデノウイルスベクターが当技術分野で知られている。一つの実施形態では、レンチウイルスベクターが使用される。
【0142】
追加のプロモーター要素、例えばエンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。一般的には、これらは開始部位の３０～１１０ ｂｐ上流の領域に位置するが、最近では多くのプロモーターが開始部位の下流にも機能的要素を含むことが示されている。多くの場合、プロモーター要素間の間隔は柔軟であり、そのため、要素が互いに反転、移動しても、プロモーター機能は維持される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターでは、活性が低下し始める前に、プロモーター要素間の間隔を５０ ｂｐまで広げることができる。プロモーターに応じて、個々の要素が協調的にまたは独立して機能して転写を活性化することができると考えられる。
【0143】
様々なプロモーター配列を使用することができ、これらに限定されないが、即時型初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＣＭＶ－アクチン－グロビンハイブリッド（ＣＡＧ）プロモーター、伸長成長因子－１α（ＥＦ－１α）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタインバーウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、及びクレアチンキナーゼプロモーターなどのヒト遺伝子プロモーターなどが挙げられる。誘導性プロモーターも使用が企図されている。誘導性プロモーターの使用は、そのような発現が望まれる場合に機能的に連結されているポリヌクレオチド配列の発現をオンし、または発現が望まれない場合に発現をオフにすることができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例には、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及びテトラサイクリンプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。
【0144】
ＣＡＲポリペプチドまたはその一部の発現を評価するために、細胞に導入される発現ベクターは、ウイルスベクターを介してトランスフェクトまたは感染させようとする細胞集団からの発現細胞の同定及び選択を容易にするために、選択可能なマーカー遺伝子またはレポーター遺伝子もしくはその両方を含むこともできる。他の側面において、選択可能なマーカーは別個のＤＮＡ上に担持され、そして同時的な導入手順において使用され得る。選択可能なマーカーとレポーター遺伝子の両方に適切な調節配列を隣接させて、宿主細胞での発現を可能にすることができる。有用な選択マーカーには、例えば、ｎｅｏなどの抗生物質耐性遺伝子が含まれる。
【0145】
一部の実施形態では、選択可能なマーカー遺伝子は、トランケートされたＣＤ１９（ｔｒＣＤ１９）を符号化する核酸配列を含む。
【0146】
レポーター遺伝子は、トランスフェクトされた可能性のある細胞を特定し、調節配列の機能を評価するために使用される。一般的に、レポーター遺伝子はレシピエントの生物または組織に存在しないか、または発現しない遺伝子であり、その発現がいくつかの容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性によって明らかにされるポリペプチドを符号化する。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後の適切な時期にアッセイされる。適切なレポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ、または緑色蛍光タンパク質遺伝子を符号化する遺伝子を含むことができる（例えば、Ｕｉ－Ｔｅｉ 他、２０００年 ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４７９：７９～８２）。 適切な発現系は知られており、既知の技術を使用して調製するか、または商業的に入手することができる。一般的に、レポーター遺伝子の最高レベルの発現を示す最小の５'フランキング領域を有する構成物は、プロモーターとして同定される。このようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子にリンクされ、プロモーター主導の転写を調節する能力のための薬剤を評価するために使用され得る。
【0147】
Ｔｒｅｇの形質導入
細胞に遺伝子を形質導入及び発現する方法は、当技術分野で知られている。発現ベクターとの関連で、ベクターは当技術分野の任意の方法により、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母、または昆虫細胞に容易に導入することができる。例えば、発現ベクターは物理的、化学的、または生物学的手段によってＴｒｅｇ細胞を宿主細胞に形質導入
細胞に遺伝子を形質導入及び発現する方法は、当技術分野で知られている。発現ベクターとの関連で、ベクターは当技術分野の任意の方法により、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母、または昆虫細胞に容易に導入することができる。例えば、発現ベクターは物理的、化学的、または生物学的手段によってＴｒｅｇ細胞を宿主細胞に形質導入
【0148】
できる
拡大及び遺伝子改変の前に、細胞の供給源は、様々な非限定的な方法を通じて対象者から得ることができる。細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位の組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び疾患部位を含む、いくつかの非限定的な供給源から得ることができる。一部の実施形態では、当技術分野の熟練者に知られている、利用可能な任意の数のＴ細胞株を使用することができる。一部の実施形態では、細胞は健康なドナーから、または神経変性疾患もしくは病態と診断された患者から得ることができる。
拡大及び遺伝子改変の前に、細胞の供給源は、様々な非限定的な方法を通じて対象者から得ることができる。細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位の組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び疾患部位を含む、いくつかの非限定的な供給源から得ることができる。一部の実施形態では、当技術分野の熟練者に知られている、利用可能な任意の数のＴ細胞株を使用することができる。一部の実施形態では、細胞は健康なドナーから、または神経変性疾患もしくは病態と診断された患者から得ることができる。
【0149】
従って、一部の実施形態における細胞は、初代細胞、例えば初代ヒト細胞である。サンプルには、対象者から直接採取された組織、体液、及びその他のサンプル、並びに分離、遠心分離、遺伝子工学（例えば、ウイルスベクターによる形質導入など）、洗浄、及び／またはインキュベーションなどの１つ以上の処理工程から得られたサンプルが含まれる。生物学的サンプルは、生物学的供給源から直接得られたサンプルでも、処理されたサンプルでもよい。生物学的サンプルには、血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿及び汗などの体液、組織及び臓器のサンプルが含まれ、これらに由来する処理済みサンプルが含まれるが、これらに限定されない。
【0150】
いくつかの側面では、細胞が由来または単離されるサンプルは、血液または血液由来のサンプルであるか、またはアフェレーシス産物であるか、もしくはそれに由来する。例示的なサンプルは、全血、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、白血球、骨髄、胸腺、組織生検、神経組織、リンパ節、腸関連リンパ組織、粘膜関連リンパ組織、脾臓、その他のリンパ組織、肝臓、肺、胃、腸、結腸、腎臓、膵臓、乳房、骨、前立腺、子宮頸部、精巣、卵巣、扁桃腺、またはその他の臓器、及び／またはそれらに由来する細胞を含む。サンプルには、細胞療法、例えば養子細胞療法の文脈において、自己由来及び同種移植源のサンプルが含まれる。
【0151】
細胞の精製
一部の実施形態では、細胞の単離は１つ以上の調製及び／または非親和性に基づく細胞分離工程を含む。一部の例において、細胞は例えば不要な成分を除去し、所望の成分を濃縮し、特定の試薬に感受性のある細胞を溶解または除去するために、１つ以上の試薬の下で洗浄、遠心分離、及び／またはインキュベートされる。一部の例では、細胞は密度、付着特性、サイズ、感度、特定の成分への耐性などの１つ以上の特性に基づいて細胞が分離される。
一部の実施形態では、細胞の単離は１つ以上の調製及び／または非親和性に基づく細胞分離工程を含む。一部の例において、細胞は例えば不要な成分を除去し、所望の成分を濃縮し、特定の試薬に感受性のある細胞を溶解または除去するために、１つ以上の試薬の下で洗浄、遠心分離、及び／またはインキュベートされる。一部の例では、細胞は密度、付着特性、サイズ、感度、特定の成分への耐性などの１つ以上の特性に基づいて細胞が分離される。
【0152】
一部の実施形態では、対象者から収集された血球は、例えば血漿画分を除去するために、及びその後の処理工程のために細胞を適切な緩衝液または培地に入れるために洗浄される。一部の実施形態では、細胞はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。一部の実施形態では、洗浄溶液はカルシウム及び／またはマグネシウム及び／または多くの、もしくはすべての二価カチオンを欠いている。一部の側面では、洗浄工程は製造業者の指示に従い、半自動化された「フロースルー」遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ ２９９１ セルプロセッサ、バクスター）で達成される。一部の側面では、洗浄工程は製造業者の指示に従い、接線流濾過（ＴＦＦ）によって達成される。一部の実施形態では、細胞は洗浄後、例えば、Ｃａ＋＋／Ｍｇ＋＋を含まないＰＢＳなどの、様々な生体適合性緩衝液に再懸濁される。特定の実施形態では、血球試料の成分が除去され、細胞が培養培地に直接再懸濁される。
【0153】
一部の実施形態では、単離方法は、表面マーカー、例えば表面タンパク質、細胞内マーカー、または核酸などの１つ以上の特定分子の細胞における発現、または存在に基づく異なる細胞型の分離を含む。一部の実施形態では、表面メーカーは、ｔｒＣＤ１９である。一部の実施形態では、そのようなマーカーに基づく分離のための任意の既知の方法を使用することができる。一部の実施形態では、分離は親和性または免疫親和性に基づく分離である。例えば、いくつかの側面における単離は、特異的に結合する抗体または結合パートナーとのインキュベーションによる、１つ以上のマーカーで、一般的には細胞表面マーカーの細胞発現または発現レベルに基づく細胞及び細胞集団の分離を含む。このようなマーカーに続いて、一般に抗体または結合パートナーに結合していない細胞から、洗浄工程及び抗体または結合パートナーに結合した細胞を分離する。
【0154】
そのような分離工程は、試薬に結合した細胞がさらなる使用のために保持される陽性選択、及び／または抗体または結合パートナーに結合していない細胞が保持される陰性選択に基づくことができる。一部の例では、両方のフラクションは、さらなる使用のために保持される。いくつかの側面では、陰性選択は、異種集団中の細胞タイプを特異的に識別する抗体が利用できない場合に特に有用であり、分離は、所望の集団以外の細胞によって発現されるマーカーに基づいて最もよく行われる。
【0155】
一部の実施形態では、複数のラウンドの分離工程が行われ、ある工程からの陽性または陰性選択されたフラクションが、後続の陽性または陰性選択などの別の分離工程にかけられる。一部の例では、単一の分離工程は、複数の抗体または結合パートナーを、陰性選択のために標的とされたマーカーに特異的なそれぞれの抗体または結合パートナーと細胞をインキュベートすることによって、複数のマーカーを同時に発現している細胞を枯渇させることができる。それと同様に、様々な細胞種で発現した複数の抗体または結合パートナーと細胞をインキュベートすることにより、複数の細胞種を同時に確実に選択できる
【0156】
一部の実施形態では、単離は陽性選択による特定の細胞集団の濃縮、または陰性選択による特定の細胞集団の枯渇により行われる。一部の実施形態では、陽性または陰性選択は、細胞上でそれぞれ比較的高いレベル（マーカーハイ）で発現または発現される（マーカー＋）１つ以上の表面マーカーに特異的に結合する１つ以上の抗体または他の結合剤を用いて細胞をインキュベートすることによって達成される。
【0157】
一部の実施形態では、Ｔｒｅｇは以下のように単離、拡大、及び形質導入され得る：細胞は、２段階のネガティブ及びポジティブ選択プロトコルを介してヒトＰＢＭＣから単離され得る。最初に、陰性選択を使用してＣＤ４＋細胞を分離し、続いてＣＤ２５ｈｉ＋細胞の正の選択を使用してＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉ＋ Ｔｒｅｇ細胞を分離する。単離されたＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉ＋Ｔｒｅｇは、Ｔｒｅｇ増殖培地での培養で抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２マルチマーまたは抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８マルチマー（ＳＴＥＭＣＥＬＬ ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ）を用いて、ヒトＩＬ－２（３００Ｕ／ｍｌから５００Ｕ／ｍｌ）で２週間かけて活性化できる。９日目に、Ｔｒｅｇ細胞を後日使用するために凍結保存できるため、同一ドナーと調製を複数回テストして、アッセイのばらつきを評価できる。
【0158】
一部の側面において、分離される細胞のサンプルまたは組成物は、常磁性ビーズ（例えば、ダイナビーズやＭＡＣＳビーズなど）の磁気応答性粒子または微粒子などの、小さな磁化可能または磁気応答性材料と共にインキュベートされる。磁気応答性材料、例えば、粒子は一般的に、陰性または陽性選択を行うことが所望され、分離することが望まれる細胞や細胞の集団上に存在する分子、例えば分子に特異的に結合する結合パートナーに直接または間接的に付着している。
【0159】
一部の実施形態では、磁性粒子またはビーズは、抗体または他の結合パートナーなどの特定の結合メンバーに結合された磁気応答性材料を含む。磁気分離法で使用される、よく知られた多くの磁気応答性材料がある。適切な磁性粒子としては、Ｍｏｌｄａｙの米国特許第４，４５２，７７３号及び欧州特許明細書４５２３４２ Ｂに記載されているものが含まれ、これらは参照のため本明細書に組み込まれる。Ｏｗｅｎの米国特許第４，７９５，６９８号、及びＬｉｂｅｒｔｉ 他、米国特許第５，２００，０８４号に記載されているようなコロイドサイズの粒子は、そのような粒子の他の例を開示している。
【0160】
インキュベーションは一般的に、抗体または結合パートナー、またはそのような抗体または結合パートナーに特異的に結合する分子、例えば二次抗体またはその他の試薬のような条件で行われ、磁性粒子またはビーズに付着し、サンプル内の細胞に存在する場合は、細胞表面分子に特異的に結合する。
【0161】
いくつかの側面において、サンプルを磁場中に置くと、磁気的に応答性または磁化可能な粒子が付着している細胞は磁石に引き寄せられ、ラベルのない細胞から分離する。陽性選択の場合、磁石に引き寄せられた細胞が保持され、陰性選択の場合、引き付けられない細胞（ラベルのない細胞）は保持される。いくつかの側面において、陽性及び陰性選択の組み合わせが同一の選択工程中に実行され、陽性及び陰性画分が保持され、さらに処理されるか、またはさらなる分離工程の対象者となる。
【0162】
一部の実施形態では、磁気応答性粒子は、一次抗体または他の結合パートナー、二次抗体、レクチン、酵素、またはストレプトアビジンでコーティングされる。一部の実施形態では、磁性粒子は、１つ以上のマーカーに特異的な一次抗体のコーティングを介して細胞に付着する。一部の実施形態では、ビーズではなく細胞は一次抗体または結合パートナーで標識され、次に細胞型特異的二次抗体または他の結合パートナー（例えば、ストレプトアビジン）でコーティングされた磁性粒子が添加される。一部の実施形態では、ストレプトアビジン被覆磁性粒子は、ビオチン化一次抗体または二次抗体と組み合わせて使用される。
【0163】
一部の実施形態では、磁気応答性粒子は、続いてインキュベート、培養及び／または操作される細胞に付着したままで、いくつかの側面において、粒子は患者への投与のために細胞に付着したままにされる。一部の実施形態では、磁化可能または磁気応答性粒子は細胞から除去される。磁化可能粒子を細胞から除去する方法は知られており、例えば競合する非標識抗体、磁化可能粒子、または切断可能リンカーに結合した抗体などの使用が含まれる。一部の実施形態では、磁化可能粒子は生分解性である。
【0164】
一部の実施形態では、単離または分離は、方法の単離、細胞調製、分離、処理、インキュベーション、培養、及び／または製剤化の工程の１つ以上を実行するシステム、デバイス、または装置を使用して実行される。いくつかの側面では、システムは、これらの工程のそれぞれを閉鎖または無菌環境で実行するために使用され、例えばエラー、ユーザーの操作及び／または汚染を最小限に抑える。一例では、システムは国際特許出願、公開番号ＷＯ２００９／０７２００３、またはＵＳ ２０１１０００３３８０ Ａ１に記載されているシステムである。
【0165】
一部の実施形態では、システムまたは装置は、統合または自己完結型システムにおいて、そして／または自動化された方法またはプログラム可能な方法で、分離、処理、エンジニアリング、及び製剤化の工程の１つ以上、例えばすべてを実行する。いくつかの側面では、システムまたは装置は、システムまたは装置と通信するコンピュータ及び／またはコンピュータプログラムを含み、これによりユーザは、処理、単離、エンジニアリング、及び製剤化の工程の様々な側面のプログラムや制御、結果を評価、及び／または調整することができる。
【0166】
一部の実施形態では、本明細書に記載の細胞集団は、複数の細胞表面マーカーで染色された細胞が流動的な流れの中で運ばれるフローサイトメトリーを介して収集され、濃縮（または枯渇）される。一部の実施形態では、本明細書に記載される細胞集団は、分取スケール（ＦＡＣＳ）ソーティングを介して収集及び濃縮（または枯渇）される。一部の実施形態では、本明細書に記載される細胞集団は、ＦＡＣＳベースの検出システムと組み合わせて微小電気機械システム（ＭＥＭＳ）チップを使用することによって収集及び濃縮（または枯渇）される（例えば、ＷＯ ２０１０／０３３１４０，Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｌａｂ Ｃｈｉｐ １０， １５６７－１５７３； ａｎｄ Ｇｏｄｉｎ ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｊ Ｂｉｏｐｈｏｔｏｎ． １（５）：３５５－３７６）。いずれの場合も、細胞を複数のマーカーで標識できるため、十分に定義されたＴ細胞のサブセットを高純度で分離できる。
【0167】
一部の実施形態では、抗体または結合パートナーは、１つ以上の検出可能なマーカーで標識され、陽性及び／または陰性選択のための分離を容易にする。例えば、分離は蛍光標識された抗体への結合に基づいてもよい。一部の例では、１つ以上の細胞表面マーカーに特異的な抗体または他の結合パートナーの結合に基づく細胞の分離は、例えば、分取スケール（ＦＡＣＳ）及び／または微小電気機械システム（ＭＥＭＳ）チップを含む蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって、例えばフローサイトメトリー検出システムと組み合わせて、流動的な流れの中で運ばれる。そのような方法は、同時に複数のマーカーに基づく陽性及び陰性選択を可能にする。
【0168】
一部の実施形態では、この方法には、赤血球を溶解することによる末梢血からの白血球の調製及びパーコールまたはフィコール勾配による遠心分離などの密度ベースの細胞分離方法を含む。
【0169】
前記の分離工程のいずれにおいても、分離は特定の細胞集団または特定のマーカーを発現する細胞の１００％の濃縮または除去をもたらす必要はない。例えば、マーカーを発現する細胞のような特定のタイプの細胞の陽性選択または濃縮は、そのような細胞の数またはパーセンテージを増加させることを指すが、マーカーを発現しない細胞の完全な不在をもたらす必要はない。同様に、マーカーを発現する細胞などの特定のタイプの細胞の陰性選択、除去、または枯渇は、そのような細胞数またはパーセンテージの減少を指すが、すべてのそのような細胞を完全に除去する必要はない。
【0170】
細胞の調製と拡大
一部の実施形態では、提供される方法は、培養、インキュベーション、栽培及び／または遺伝子工学工程を含む。例えば、いくつかの実施形態では、枯渇した細胞集団及び培養開始組成物をインキュベート及び／または操作するための方法が提供される。
一部の実施形態では、提供される方法は、培養、インキュベーション、栽培及び／または遺伝子工学工程を含む。例えば、いくつかの実施形態では、枯渇した細胞集団及び培養開始組成物をインキュベート及び／または操作するための方法が提供される。
【0171】
従って、一部の実施形態では、細胞集団は培養開始組成物中でインキュベートされる。インキュベーション及び／またはエンジニアリングは、ユニット、チャンバー、ウェル、カラム、チューブ、チューブセット、バルブ、バイアル、培養皿、バッグ、または培養または細胞を栽培するための他の容器などの培養容器で実施され得る。
【0172】
一部の実施形態では、細胞は遺伝子操作の前またはそれに関連して、インキュベート及び／または培養される。インキュベーションの工程は、培養、栽培、刺激、活性化、及び／または増殖を含むことができる。
【0173】
一部の実施形態では、組成物または細胞は、刺激条件または刺激剤がある中でインキュベートされる。そのような条件には、集団内の細胞の増殖、拡大、活性化、及び／または生存を誘導し、抗原曝露を模倣し、そして／または組換え抗原受容体の導入などの遺伝子工学のために細胞を調製するように設計された状態が含まれる。本明細書で論じる細胞は、細胞の遺伝子改変前、または後のいずれかに、例えば限定されずに、米国特許第６，３５２，６９４号第６，５３４，０５５号、第６，９０５，６８０号、第６，６９２，９６４号、第５，８５８，３５８号、第６，８８７，４６６号、第６，９０５，６８１号、第７，１４４，５７５号、第７，０６７，３１８号、第７，１７２，８６９号、第７，２３２，５６６号、第７，１７５，８４３号、第５，８８３，２２３号、第６，９０５，８７４号、第６，７９７，５１４号、第６，８６７，０４１号及び米国特許出願公開 第２００６０１２１００５号に概説される方法を使用して、活性化及び拡大することができる。条件には、特定の培地、温度、酸素含有量、二酸化炭素含有量、時間、薬剤、例えば栄養素、アミノ酸、抗生物質、イオン及び／または刺激因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組換え可溶性受容体、及び細胞を活性化するように設計されたその他の任意の薬剤のうちの１つ以上を含むことができる。
【0174】
Ｔｒｅｇは、イン・ビトロまたはイン・ビボで拡大することができる。一部の実施形態では、本発明での単離された細胞は、組織または細胞との共培養により拡大することができる。また、細胞は例えば、細胞を対象者に投与した後、対象者の血液中でイン・ビボで拡大することができる。
【0175】
一部の実施形態では、調製方法は、単離、インキュベーション、及び／または改変前または後のいずれかに、細胞を凍結、例えば、凍結保存するための工程を含む。一部の実施形態では、凍結及びその後の解凍工程により、細胞集団中の顆粒球、及びある程度の単球が除去される。一部の実施形態では、細胞は例えば、血漿及び血小板を除去するための洗浄工程の後に、凍結溶液中に懸濁される。いくつかの側面では、認識されている様々な凍結溶液及びパラメータのいずれかを使用することができる。一例では、２０％のＤＭＳＯ及び８％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むＰＢＳ、または他の適切な細胞凍結培地を使用することを含む。次に、これを培地で１：１に希釈し、ＤＭＳＯとＨＳＡの最終濃度をそれぞれ１０％と４％にする。その後に、細胞を毎分１度の速度で摂氏－８０度まで凍結し、液体窒素貯蔵タンクの気相に貯蔵する。
【0176】
本発明による改変されたＴｒｅｇの使用方法
例示的な実施形態では、神経変性疾患、病態及び／または障害の治療は、本明細書に開示されるような有効量の１つ以上の改変されたＴｒｅｇの投与を含むことができる。例示的な実施形態では、本発明に従った１種以上の改変されたＴｒｅｇ（例えば、そのようなＴｒｅｇは、異なるＣＡＲＳ及び／またはＮＤＤＭを発現するものを含むことができる）を投与することによる神経変性疾患の治療は、炎症の減少、ミクログリア細胞活性、及び／またはタンパク質及び／または分子マーカーが発現する部位（すなわち病変組織）でのニューロン損傷の減少をもたらす。例示的な実施形態では、本発明による改変されたＴｒｅｇは、治療を必要とする患者に投与されることがあり、前記の改変されたＴｒｅｇは、静脈内注射、皮下注射、腔内注射、脳室内注射、頭蓋内注射、またはくも膜下腔内注射によって投与され得る。例示的な治療方法は、一般的に有効量の１つ以上の改変されたＴｒｅｇの投与を含み、前記の改変されたＴｒｅｇを含むそのような処置は、局所炎症またはニューロン生存を調節し得る。前記の調節は、一部の実施形態では、特定の分子、例えばＮＤＭＭ、抗酸化剤、神経成長及び／または生存因子の発現によって起こり得る。
例示的な実施形態では、神経変性疾患、病態及び／または障害の治療は、本明細書に開示されるような有効量の１つ以上の改変されたＴｒｅｇの投与を含むことができる。例示的な実施形態では、本発明に従った１種以上の改変されたＴｒｅｇ（例えば、そのようなＴｒｅｇは、異なるＣＡＲＳ及び／またはＮＤＤＭを発現するものを含むことができる）を投与することによる神経変性疾患の治療は、炎症の減少、ミクログリア細胞活性、及び／またはタンパク質及び／または分子マーカーが発現する部位（すなわち病変組織）でのニューロン損傷の減少をもたらす。例示的な実施形態では、本発明による改変されたＴｒｅｇは、治療を必要とする患者に投与されることがあり、前記の改変されたＴｒｅｇは、静脈内注射、皮下注射、腔内注射、脳室内注射、頭蓋内注射、またはくも膜下腔内注射によって投与され得る。例示的な治療方法は、一般的に有効量の１つ以上の改変されたＴｒｅｇの投与を含み、前記の改変されたＴｒｅｇを含むそのような処置は、局所炎症またはニューロン生存を調節し得る。前記の調節は、一部の実施形態では、特定の分子、例えばＮＤＭＭ、抗酸化剤、神経成長及び／または生存因子の発現によって起こり得る。
【0177】
例示的な実施形態では、本発明による改変されたＴｒｅｇ、例えば、１つ以上のＣＡＲを含む改変されたＴｒｅｇは、パーキンソン病を治療する方法において使用され得る。パーキンソン病を標的とする前記の改変されたＴｒｅｇは、１つ以上のＣＡＲを含むことがあり、前記の１つ以上のＣＡＲは、α－シヌクレイン原線維を標的とし得る。一部の実施形態では、α－シヌクレインを標的とするＣＡＲは、ＤＧ０８（配列番号：８）。一部の実施形態では、α－シヌクレインを標的とするＣＡＲは、ＤＧ０９（配列番号：９）。一部の実施形態では、α－シヌクレインを標的とするＣＡＲは、ＤＧ１０（配列番号：１０）。一部の実施形態では、α－シヌクレインを標的とするＣＡＲは、ＤＧ１１（配列番号：１１）。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、ＤＧ０８－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２７）、ＤＧ０９－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２８）、ＤＧ１０－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２９）、及び／またはＤＧ１１－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：３０）を含み、各構成物はα－シヌクレインを標的とする。さらなる例示的な実施形態では、１つ以上のＣＡＲを含む改変されたＴｒｅｇは、パーキンソン病を治療するために使用されることがあり、活性化ミクログリアによって産生される神経毒性炎症メディエーションなどの１つ以上の神経毒性炎症メディエーターを標的とし得る。前記の改変されたＴｒｅｇは、ミクログリアの活性化を減少及び／または抑制し得る。例示的な実施形態では、パーキンソン病を標的とする改変されたＴｒｅｇは、ＰＤにおけるドーパミンニューロン変性の疾患部位における標的化された抗炎症及び神経保護治療活性を含む。一部の実施形態では、パーキンソン病を標的とする改変されたＴｒｅｇは、α－シヌクレイン原線維が存在する部位でのみそれらの機能を媒介し得る。
【0178】
さらに、パーキンソン病を標的とする改変されたＴｒｅｇは、パーキンソン病を治療する方法で使用することができ、前記の改変されたＴｒｅｇは、パーキンソン病を標的とする１つ以上のＣＡＲ及び／または１つ以上のＮＤＭＭを含むことができさらに、前記の１つ以上のＣＡＲは、ヒト及びマウスのα－シヌクレインフィブリルに対するモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬアミノ酸配列などの一本鎖可変フラグメントからなる。（例えば、クローンＮＩ ２０２．３Ｇ１２、ＮＩ ２０２．１２Ｆ４、ＮＩ ２０２．２１Ｄ１１、及びｍＡｂ４９／Ｇに由来するアミノ酸配列）。例示的な実施形態では、パーキンソン病を標的とする改変されたＴｒｅｇは、前記のｓｃＦＶを含むことがある、さらに、ＣＤ２８－ＣＤ３ζ ＣＡＲ、すなわち、ｓｃＦｖ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ ＣＡＲを含む構成物からなり、前記のｓｃＦＶは、ヒトα－シヌクレイン原線維に特異的である。前記のｓｃＦｖからなる構成物は、ＶＨ＋ＶＬ及びＶＬ＋ＶＨ配置を含むことができる。
【0179】
例示的な実施形態では、本発明による改変されたＴｒｅｇ、例えば１つ以上のＣＡＲを含む改変されたＴｒｅｇは、ＡＬＳを治療する方法において使用され得る。パーキンソン病を標的とする前記の改変されたＴｒｅｇは、ＡＬＳを標的とする１つ以上のＣＡＲ及び／または１つ以上のＮＤＭＭを含むことができる。前記の改変されたＴｒｅｇは変異型ＳＯＤ１を標的とすることができ、例えば、前記の改変されたＴｒｅｇは変異型ＳＯＤ１を標的とする１つ以上のＣＡＲを含むことができる。一部の実施形態では、変異型ＳＯＤ１を標的とするＣＡＲは、ＤＧ０５（配列番号：５）。一部の実施形態では、変異型ＳＯＤ１を標的とするＣＡＲは、ＤＧ０６（配列番号：６）。一部の実施形態では、変異型ＳＯＤ１を標的とするＣＡＲは、ＤＧ０７（配列番号：７）。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、ＤＧ０５－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２４）、ＤＧ０６－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２５）、及び／またはＤＧ０７－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２６）、ここで各構成物は変異型ＳＯＤ１を標的とする。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、ＤＧ０５－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（ＤＧ０５－２８－３ζとも呼ばれる）（配列番号：２４）、ＤＧ０５－ＣＤ２８ｔｍ－ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ（ＤＧ０５－２８ｔｍ－１０－３ζとも呼ばれる）（配列番号：４０）、ＤＧ０５－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ４４－ＣＤ３ζ（ＤＧ０５－２８ｔｍ－４４－３ζとも呼ばれる）（配列番号：４１）、ＤＧ０５－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ３ζ（ＤＧ０５－２８ｔｍ－３ζとも呼ばれる）（配列番号：４２）、ＤＧ０５－ＣＤ２８（ＤＧ０５－２８とも呼ばれる）（配列番号：４３）、及び／またはＤＧ０５－ＣＤ２８ｔｍ（ＤＧ０５－２８ｔｍとも呼ばれる）（配列番号：４４）、ここで各構成物は変異型ＳＯＤ１を標的とする。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、変異型ＳＯＤ１を産生する運動ニューロンの部位及び／または炎症部位で活性化され、それにより、改変されたＴｒｅｇの使用を含むＡＬＳの治療による方法において、疾患部位での炎症の減少をもたらし得る。
【0180】
一部の実施形態では、１つ以上の改変されたＴｒｅｇは、ＤＧ０５－２８－３－のいずれか１つ以上を含むことができる。 ＤＧ０５－２８ｔｍ－１０－３ζ、ＤＧ０５－２８ｔｍ－４４－３ζ、ＤＧ０５－２８ｔｍ－３ζ、及び／またはＤＧ０５－２８、並びに前記の改変されたＴｒｅｇは、ｍＳＯＤ１抗原に応答してＩＬ－１０を産生し得る。一部の実施形態では、１つ以上の改変されたＴｒｅｇは、ＤＧ０５－２８－３－のいずれか１つ以上を含むことができる。 ＤＧ０５－２８ｔｍ－１０－３ζ、ＤＧ０５－２８ｔｍ－４４－３ζ、ＤＧ０５－２８ｔｍ－３ζ、及び／またはＤＧ０５－２８、並びに前記の改変されたＴｒｅｇは、ｍＳＯＤ１に曝露されていない改変されたＴｒｅｇと比較して、ｍＳＯＤ１抗原に応答してＩＬ－１０のレベルを増加させる可能性がある。一部の実施形態では、１つ以上の改変されたＴｒｅｇはＤＧ０５－ＣＤ２８－ＣＤ３ζからなり、前記の改変されたＴｒｅｇは、ｍＳＯＤ１に応答して、ｍＳＯＤ１にさらされていない改変されたＴｒｅｇと比較して、ＧＩＴＲ、ＰＤ－１、及び／またはＣＴＬＡ－４などの細胞表面マーカーの発現の増加を含むことができる。一部の実施形態では、１つ以上の改変されたＴｒｅｇはＤＧ０５－ＣＤ２８－ＣＤ３ζからなり、前記の改変されたＴｒｅｇは、ｍＳＯＤ１に応答して、ｍＳＯＤ１抗原にさらされていない改変されたＴｒｅｇと比較して、例えば、脊髄組織に存在し得るｍＳＯＤ１抗原に応答して、ＩＬ－１０を産生することができる。一部の実施形態では、１つ以上の改変されたＴｒｅｇはＤＧ０５－ＣＤ２８－ＣＤ３ζからなり、前記の改変されたＴｒｅｇは、ｍＳＯＤ１抗原及び／または抗ＣＤ３抗体で刺激された場合、ｍＳＯＤ１抗原または抗ＣＤ３抗体で刺激されなかった改変されたＴｒｅｇと比較して、スーパーオキサイドの生成を抑制することができる。一部の実施形態では、１つ以上の改変されたＴｒｅｇは、ＤＧ０５－ＣＤ２８－ＣＤ３ζからなり、前記の改変されたＴｒｅｇは、ｍＳＯＤ１抗原で刺激された場合、ｍＳＯＤ１抗原で刺激されない改変されたＴｒｅｇと比較して、ＴＮＦ－α産生を抑制し得る。
【0181】
一部の実施形態では、ＡＬＳを標的とする改変されたＴｒｅｇは、ＡＬＳを治療する方法で使用されることがあり、変異型ＳＯＤ１を標的とするＣＡＲを含んでもよく、一部の例示的な実施形態では、前記のＣＡＲの１つ以上のｓｃＦＶは、ヒトＣＤ２８ヒンジ、膜貫通、及び細胞質ドメインに融合されたＶＬのＣ末端で細胞外で発現され得る。その後、ヒトＣＤ３ζ細胞質ドメインが続き、抗変異型ＳＯＤ１－ＣＤ２８－ＣＤ３ζＣＡＲを製造する。一部の実施形態では、ＡＬＳを標的とする本発明に従った改変されたＴｒｅｇからなるＣＡＲのｓｃＦＶは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を、例えば、（Ｇ４Ｓ）３リンカーなどのリンカーと連結することによって構成され得る。一部の実施形態では、ＡＬＳを標的とする改変されたＴｒｅｇのＣＡＲのＶＬのＣ末端は、ヒトＣＤ２８ヒンジ、膜貫通、及び細胞質ドメインと融合することができ、そしてヒトＣＤ３ζζ細胞質ドメインに続いてもよい。ＡＬＳを標的とする前記の改変されたＴｒｅｇの前記のＣＡＲは、例えば抗変異型ＳＯＤ１ ＣＡＲであり得る。前記のＣＡＲは、抗原結合、例えば変異型ＳＯＤ１の結合の際に、一次及び共刺激シグナリングの両方を誘発することができる。一部の実施形態では、Ｔｒｅｇによって発現されるＣＡＲは、ＣＤ３ζのみ、４－１ＢＢ、またはＣＤ２８からなるがこれらに限定されない共刺激ドメインを含むことができる。一部の実施形態では、トランケートされた（非シグナル伝達）ヒトＣＤ１９（ｔＣＤ１９）は、２Ａ共発現系を使用することなどによって、前記のＣＡＲと同一ベクターで発現されることがあり、前記のｔＣＤ１９は、形質導入されたＴ細胞を追跡し、精製するための方法として機能し得る。一部の実施形態では、ＡＬＳを治療する方法は、治療を必要とする患者に投与された際に、脊髄に入る可能性があるＡＬＳを標的とする、改変されたＴｒｅｇの使用を含むことができる。一部の例示的な実施形態では、ＡＬＳを標的とする改変されたＴｒｅｇは、例えば、ＶＬＡ４、ＬＦＡ－１、ＣＣＲ６、ＣＸＣＲ３またはニューロンの生存及び／または機能を促進し、そして／またはＴ細胞機能を延長する他のタンパク質のようなマーカーを含むことができる。例示的な実施形態では、ＡＬＳを標的とする改変ＣＡＲ、例えば１つ以上の抗変異型ＳＯＤ１ ＣＡＲからなる改変されたＴｒｅｇは、１つ以上のＣＡＲ及び／または１つ以上のＮＤＭＭを発現する際に、Ｔｒｅｇ表現型を保存し得る。例示的な実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、ＡＬＳを治療する方法において使用される場合、ＡＬＳタンパク質及び／または疾患の分子マーカーに応答してＩＬ－１０を発現し得る。
【0182】
さらに、本発明によるＡＬＳを治療する方法は、抗炎症性サイトカインを分泌する改変されたＴｒｅｇの使用を含むことがあり、それによって活性化されたミクログリア及び／またはマクロファージの抑制をもたらす。前記の分泌は、ＡＬＳタンパク質及び／または変異型ＳＯＤ１などの疾患関連マーカーについて、前記の改変されたＴｒｅｇによって発現される１つ以上のＣＡＲの刺激の結果として起こり得る。一部の実施形態では、前記のサイトカインは、ＩＬ－１０、ＩＬ－４、ＴＧＦ－βを含むことができる。例示的な実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、ＡＬＳを治療する方法で使用される場合、ミクログリアによる神経毒性フリーラジカル及び炎症性サイトカインの産生を低減及び／または防止し得る。一部の例示的な実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、ＡＬＳを処置する方法において使用することができ、そして前記の方法は、対照治療と比較して、以下の１つ以上をもたらし得る：マクロファージ媒介性運動ニューロン死の減少、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、一酸化窒素の減少、ＩＬ－１０、ＩＬ－４、及びＴＧＦ－βの量の増加。一部の実施形態では、ＡＬＳを治療する方法は、Ｃ９ｏｒｆ７２（ｓＣ９ｏｒｆ７２）を標的とする改変されたＴｒｅｇの使用を含むことがあり、同様の結果を達成してもよく、変異型ＳＯＤ１を標的とする改変されたＴｒｅｇの使用と同様の様式で使用され得る。
【0183】
さらに、本発明によるＡＬＳを治療するいくつかの方法は、改変されたＴｒｅｇの使用を含むことができ、前記の改変されたＴｒｅｇは抗変異型ＳＯＤ１ ＣＡＲを含む場合があり、前記の改変されたＴｒｅｇは脊髄実質に入り、蓄積された脊髄変異型ＳＯＤ１タンパク質を認識し、抗炎症メディエーターを産生することにより反応し得る。前記の改変されたＴｒｅｇは、治療を必要とする患者に投与されると炎症性メディエーター（例えば、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＴＮＦ－α、ＩＬ１β、ＮＯＸ２）の発現を減少させ、抗炎症性メディエーター（例えば、ＩＬ－１０、ＩＬ－４、及びＴＧＦ－β）の発現を増加させる。さらに、ＡＬＳを標的とする改変されたＴｒｅｇ、例えば抗変異型ＳＯＤ１ ＣＡＲを含む改変されたＴｒｅｇは、ＡＬＳの治療方法で使用した場合、運動ニューロン周囲の持続性及び／または神経毒性炎症を抑制する可能性がある。
【0184】
一部の例示的な実施形態では、改変されたＴｒｅｇ、例えば、１つ以上のＣＡＲを含む改変されたＴｒｅｇは、アルツハイマー病を治療する方法において使用されてもよい。前記の改変されたＴｒｅｇは、アルツハイマー病に関連するタンパク質及び／または分子マーカーを標的にすることができる。例示的な実施形態では、前記の改変されたＴｒｅｇは、前記のタンパク質及び／またはマーカーを標的とする１つ以上のＣＡＲを含むことができる。一部の実施形態では、前記のタンパク質及び／またはマーカーは、アミロイドベータ（Ａβ）、特にオリゴマーＡβ、及び／またはねじれたタウタンパク質繊維のニューロン内のもつれを含むことができる。一部の実施形態では、アミロイドベータを標的とするＣＡＲは、ＤＧ０２（配列番号：１）。一部の実施形態では、アミロイドベータを標的とするＣＡＲは、ＤＧ０２（配列番号：２）。一部の実施形態では、アミロイドベータを標的とするＣＡＲは、ＤＧ０２（配列番号：３）。一部の実施形態では、アミロイドベータを標的とするＣＡＲは、ＤＧ０２（配列番号：４）。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、ＤＧ０１－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２０）、ＤＧ０２－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２１）、ＤＧ０３－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２２）、及び／またはＤＧ０４－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２３）、ここで各構成物はアミロイドベータを標的とする。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、ＤＧ０３－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（ＤＧ０３－２８－３ζとも呼ばれる）（配列番号：２２）、ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ－ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ（ＤＧ０３－２８ｔｍ－１０－３ζとも呼ばれる）（配列番号：４５）、ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ４４－ＣＤ３ζ（ＤＧ０３－２８ｔｍ－４４－３ζとも呼ばれる）（配列番号：４６）、ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ－４－１－ＢＢ－ＣＤ３ζ（ＤＧ０３－２８ｔｍ－ＢＢ－３ζとも呼ばれる）（配列番号：４７）、ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ３ζ（ＤＧ０３－２８ｔｍ－３ζとも呼ばれる）（配列番号：４８）、ＤＧ０３－ＣＤ２８（ＤＧ０３－２８とも呼ばれる）（配列番号：４９）、及び／またはＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ（ＤＧ０３－２８ｔｍとも呼ばれる）（配列番号：５０）、ここで各構成物はアミロイドベータを標的とする。例示的な実施形態では、改変されたＴｒｅｇに含まれるＣＡＲは、Ａβペプチドを標的とすることができ、Ａβに対する異なる結合特異性を有する抗体、例えば、ヒト及び／またはヒト化抗体からの単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）配列を使用する抗Ａβ ＣＡＲ、例えばオリゴマーＡβを含むことができる。一部の例示的な実施形態では、前記ｓｃＦＶは、ヒトＣＤ２８ヒンジ、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインに融合され、その後にヒトＣＤ３ζ細胞質ドメインが続く。前記のＣＡＲは、抗原結合及び架橋の際に、一次（ＣＤ３ζ）及び共刺激（ＣＤ２８）シグナル伝達の両方を誘発し得る。一部の実施形態では、トランケートされた（非シグナル伝達）ＣＤ１９（ｔＣＤ１９）もまた、Ｔ２Ａ共発現システムを使用することなどによって、前記のＣＡＲを含む同一ベクターで発現されることがあり、形質導入されたＴ細胞を追跡及び精製する手段として機能し得る。一部の実施形態では、アルツハイマー病を治療する方法で使用される抗ＡβＣＡＲを含む改変されたＴｒｅｇは、ＣＤ３で活性化された同種ＣＤ８ ＋ Ｔ細胞の増殖を抑制し得る。さらに、一部の実施形態では、オリゴマーＡβで活性化された場合、抗Ａβ ＣＡＲを含む改変されたＴｒｅｇは、アルツハイマー病を治療する方法で使用される場合、抗炎症性サイトカイン、例えばＩＬ－１０を産生する可能性がある。さらに、前記の改変されたＴｒｅｇは、炎症促進性メディエーターの産生を抑制し、例えばアルツハイマー病を治療する方法で使用される場合、ＩＬ－１０、ＴＧＦ－β、及びＩＬ－４抗炎症性サイトカインを分泌することなどにより、活性化ミクログリアまたはマクロファージの食作用能力を増強することができる。一部の例示的な実施形態では、オリゴマーＡβに特異的なＣＡＲの発現を含む改変されたＴｒｅｇは、アルツハイマー病を治療する方法で使用される場合、オリゴマーＡβが蓄積する可能性のある領域において、標的抗炎症活性及び神経保護効果を有することができる。一部の例示的な実施形態では、本発明による改変されたＴｒｅｇは、アルツハイマー病を治療する方法で使用される場合、オリゴマーＡβが蓄積する可能性がある海馬に移動する可能性がある。
【0185】
一部の実施形態では、１つ以上の改変されたＴｒｅｇは、ＤＧ０３－２８－３ζ、ＤＧ０３－２８ｔｍ－１０－３ζ、ＤＧ０３－２８ｔｍ－４４－３ζ、及び／またはＤＧ０３－２８ｔｍ－ＣＤ３ζのいずれか１つ以上を含むことができ、並びに前記の改変されたＴｒｅｇは、前記のＡβ抗原に曝露されなかった改変されたＴｒｅｇと比較して、Ａβ抗原に応答してＩＬ－１０を産生することができる。一部の実施形態では、１つ以上の改変されたＴｒｅｇはＤＧ０３－ＣＤ２８－ＣＤ３ζを含むことができ、前記の改変されたＴｒｅｇは、前記のＡβ抗原に曝露されなかった改変されたＴｒｅｇと比較して、例えばＩＬ－１０及び／またはＩＬ－４のｍＲＮＡレベルによって測定され、及び／またはＥＬＩＳＡアッセイによって測定され、Ａβ抗原に応答してＩＬ－１０及び／またはＩＬ－４のレベルを増加させることができる。一部の実施形態では、１つ以上の改変されたＴｒｅｇはＤＧ０３－ＣＤ２８－ＣＤ３ζからなり、前記の改変されたＴｒｅｇは、Ａβ抗原及び／または抗ＣＤ３抗体で刺激された場合、Ａβ抗原または抗ＣＤ３抗体で刺激されなかった改変されたＴｒｅｇと比較して、スーパーオキサイドの生成を抑制することができる。一部の実施形態では、１つ以上の改変されたＴｒｅｇはＤＧ０３－ＣＤ２８－ＣＤ３からなり、前記の改変されたＴｒｅｇは、Ａβ抗原及び／または抗ＣＤ３抗体で刺激された場合、Ａβ抗原または抗ＣＤ３抗体で刺激されなかった改変されたＴｒｅｇと比較して、ＩＬ－６の産生を抑制することができる。
【0186】
さらに、一部の例示的な実施形態では、アルツハイマー病を治療する方法で使用されることがある改変されたＴｒｅｇは、抗Ａβ ＣＡＲを構成する場合があり、Ａβ沈着及び神経炎症の脳領域にトラフィック及び蓄積してもよく、そのような領域は、海馬及び前頭皮質のＡβ沈着の部位を含んでもよい。一部の実施形態では、アルツハイマー病を標的とするＣＡＲを含む改変されたＴｒｅｇは、前記の脳領域に蓄積し、アルツハイマー病を治療する方法で使用される場合、前記の領域におけるヒト抗炎症性サイトカインＩＬ－１０、ＴＧＦ－β、及びＩＬ４の発現の増加を導くことがある。これらの抗炎症性サイトカインは、炎症誘発性メディエーターの発現及びミクログリア数の減少につながる可能性がある。例示的な実施形態では、アルツハイマー病を標的とするＣＡＲを含む改変されたＴｒｅｇは、前記の改変されたＴｒｅｇで治療された患者の記憶機能を改善する場合がある。
【0187】
一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、ＮＤＭＭ Ｎｒｆ２（Ｋｅａｐ１阻害剤ペプチド）の発現のための構成物を含むことがあり、前記の改変されたＴｒｅｇは、前記の改変されたＴｒｅｇの使用を含まない治療方法と比較して、過酸化水素毒性からの細胞の保護などの細胞保護活性を示し得る。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、ＮＤＭＭヒトカタラーゼの発現のための構成物を含むことがあり、前記の改変されたＴｒｅｇは、前記の改変されたＴｒｅｇの使用を含まない治療方法と比較して、過酸化水素毒性からの細胞の保護などの細胞保護活性を示し得る。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、ＮＤＭＭ ＢＤＮＦの発現のための構成物を含むことがあり、前記の改変されたＴｒｅｇは、前記の変更されたＴｒｅｇの使用を含まない治療方法と比較して、過酸化水素毒性からの細胞の保護などの細胞保護活性を示し得る。一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、ＮＤＭＭ ＩＧＦ－１の発現のための構成物を含むことがあり、前記の改変されたＴｒｅｇは、前記の改変されたＴｒｅｇの使用を含まない治療方法と比較して、過酸化水素毒性からの細胞の保護などの細胞保護活性を示し得る。
【0188】
本発明による改変されたＴｒｅｇのさらなる治療的適用は、以下で詳細に議論される。
【0189】
治療用途
前記の方法によって得られる単離された細胞、またはそのような単離された細胞に由来する細胞株は、対象者における疾患、障害、または病態の治療における医薬品として使用することができる。一部の実施形態では、そのような薬剤は、神経変性疾患または病態を治療するために使用することができる。一部の実施形態では、前記の神経変性疾患または病態は、パーキンソン病、アルツハイマー病、またはＡＬＳの場合がある。
前記の方法によって得られる単離された細胞、またはそのような単離された細胞に由来する細胞株は、対象者における疾患、障害、または病態の治療における医薬品として使用することができる。一部の実施形態では、そのような薬剤は、神経変性疾患または病態を治療するために使用することができる。一部の実施形態では、前記の神経変性疾患または病態は、パーキンソン病、アルツハイマー病、またはＡＬＳの場合がある。
【0190】
細胞の起源
宿主細胞または細胞集団が投与される本発明の方法の目的のために、細胞は、対象者にとって異種、同種、または自己由来の細胞であり得る。一般的に、細胞は処置された対象者と比較して、自己または同種異系である。細胞が同種異系である場合、細胞は好ましくは、治療される対象者に対して相対的にＭＨＣまたはＨＬＡ組織適合性を有し、そして／または細胞の内因性ＴＣＲ及び／またはＭＨＣの発現または機能を損なうか、または除去するように改変されている。場合によっては、特に治療される対象者のＴｒｅｇが罹患しているか、そして／または治療的使用に理想的ではないいくつかの特性を有する場合、同種Ｔｒｅｇが好ましい場合がある。いくつかの実施形態では、同種のＴｒｅｇが望ましい場合があり、特に健康なドナーからＴｒｅｇｓを入手した場合には、Ｔｒｅｇｓが所望の部位、すなわちＣＮＳ内の神経変性または神経炎症の部位への移動またはトラフィックをより良くすることができるので、好ましい場合がある。
宿主細胞または細胞集団が投与される本発明の方法の目的のために、細胞は、対象者にとって異種、同種、または自己由来の細胞であり得る。一般的に、細胞は処置された対象者と比較して、自己または同種異系である。細胞が同種異系である場合、細胞は好ましくは、治療される対象者に対して相対的にＭＨＣまたはＨＬＡ組織適合性を有し、そして／または細胞の内因性ＴＣＲ及び／またはＭＨＣの発現または機能を損なうか、または除去するように改変されている。場合によっては、特に治療される対象者のＴｒｅｇが罹患しているか、そして／または治療的使用に理想的ではないいくつかの特性を有する場合、同種Ｔｒｅｇが好ましい場合がある。いくつかの実施形態では、同種のＴｒｅｇが望ましい場合があり、特に健康なドナーからＴｒｅｇｓを入手した場合には、Ｔｒｅｇｓが所望の部位、すなわちＣＮＳ内の神経変性または神経炎症の部位への移動またはトラフィックをより良くすることができるので、好ましい場合がある。
【0191】
一部の実施形態では、細胞療法、例えば養子細胞療法や養子Ｔ細胞療法は、細胞療法を受ける予定の対象者、またはそのような対象者に由来するサンプルから単離及び／または他の方法で調製される自己移植によって行われる。従って、いくつかの側面では、細胞は治療を必要とする対象者、例えば患者に由来し、単離や処理後の細胞は、同一対象者に投与される。
【0192】
一部の実施形態では、細胞療法、例えば養子細胞療法や養子Ｔ細胞療法は、細胞療法を受けるべき、または最終的に細胞療法を受けるべき対象者以外の対象者、例えば第１の対象者から細胞が単離され、及び／または別の方法で調製され、同種移植によって実施される。そのような実施形態では、細胞は次いで、同一種の異なる対象者、例えば第２の対象者に投与される。一部の実施形態では、第１及び第２の対象者は遺伝的に同一である。一部の実施形態では、第１及び第２の対象者は遺伝的に類似している。一部の実施形態では、第２の対象者は、第１の対象者と同一のＨＬＡクラスまたはスーパータイプを発現する。
【0193】
対象者
本明細書で言及される対象者は、生きている対象者であればどのようなものであってもよい。好ましい実施形態では、対象者は哺乳動物である。本明細書で言及される哺乳動物は、任意の哺乳動物であってもよい。本明細書で使用される場合、「哺乳動物」という用語は、マウス及びハムスターなどの齧歯目目の哺乳動物、並びにウサギなどのロゴモルファ目の哺乳動物を含むが、これらに限定されない任意の哺乳動物を指す。哺乳動物は、ネコ（猫）及びイヌ（犬）を含む肉食動物のものであってもよい。哺乳動物は、牛（ウシ）及び豚（ブタ）を含む偶蹄目、または馬（ウマ）を含む奇蹄目のものであってもよい。哺乳動物は、霊長類、セボイド、またはシモイド（サル）のオーダー、または類人猿（ヒト及び類人猿）のものであってもよい。
本明細書で言及される対象者は、生きている対象者であればどのようなものであってもよい。好ましい実施形態では、対象者は哺乳動物である。本明細書で言及される哺乳動物は、任意の哺乳動物であってもよい。本明細書で使用される場合、「哺乳動物」という用語は、マウス及びハムスターなどの齧歯目目の哺乳動物、並びにウサギなどのロゴモルファ目の哺乳動物を含むが、これらに限定されない任意の哺乳動物を指す。哺乳動物は、ネコ（猫）及びイヌ（犬）を含む肉食動物のものであってもよい。哺乳動物は、牛（ウシ）及び豚（ブタ）を含む偶蹄目、または馬（ウマ）を含む奇蹄目のものであってもよい。哺乳動物は、霊長類、セボイド、またはシモイド（サル）のオーダー、または類人猿（ヒト及び類人猿）のものであってもよい。
【0194】
一部の実施形態では、細胞、細胞集団、または組成物が投与される対象者は、霊長類、好ましくはヒトである。一部の実施形態では、霊長類はサルまたは類人猿である。対象者は、男性または女性のどちらでもよく、乳幼児、若年者、青年期、成人、及び老年期の対象者を含む任意の適切な年齢で可能である。一部の例では、患者または対象者は、疾患、養子細胞療法、及び／またはサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）などの毒性転帰を評価するための有効な動物モデルである。
【0195】
一部の実施形態では、対象者は例えば、別の免疫療法及び／または他の療法による治療後に、持続性または再発性疾患を有する。一部の実施形態では、投与は対象者が別の治療法に対して耐性になったにもかかわらず、対象者を効果的に治療する。一部の実施形態では、対象者は再発していないが、再発の危険性が高いなどの再発の危険性があると判断され、従って化合物または組成物は、例えば再発の可能性を低減または防止するために予防的に投与される。
【0196】
一部の実施形態では、方法は、１つ以上のＣＡＲ及び／または１つ以上のＮＤＭＭからなる改変されたＴｒｅｇ、またはその細胞を含む組成物を、神経変性疾患または状態を有するか、その危険性があるか、またはその疑いがあるかのような対象者、組織、または細胞に投与することを含む。一部の実施形態では、細胞、集団、及び組成物は、例えば養子性Ｔ細胞療法などの養子性細胞療法を介して、治療される特定の疾患または病態を有する対象者に投与される。一部の実施形態では、細胞または組成物は、疾患または病態を有するか、またはその危険性がある対象者に投与される。いくつかの側面では、方法は、それによって例えば、ミクログリア細胞を低減、抑制、または不活性化し、炎症及び／または神経炎症を低減し、そして／または神経細胞死を低減することにより、疾患または病態の１つ以上の症状を治療、改善する。
【0197】
機能的活動
一部の実施形態では、本開示は、神経変性疾患または病態で発現される標的分子に対して１つ以上のＣＡＲ及び／または１つ以上のＮＤＭＭを発現するように単離された細胞、例えばＴｒｅｇが遺伝子改変されるタイプの細胞療法を含むことがあり、改変されたＴｒｅｇ細胞は、それを必要とする対象者に注入される。このような標的分子の例としては、アミロイドベータ１－４２、スーパーオキシドジスムターゼ－１（ＳＯＤ－１）、α－シヌクレイン、過リン酸化タウタンパク質、ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ－４３）、染色体９オープンリーディングフレーム７２（ｃ９ｏｒｆ７２）、β－シヌクレイン、γ－シヌクレイン、肉腫に融合したＲＮＡ結合タンパク質（ＦＵＳ）、ユビキチン、ユビキリン－２、ｐ６２、オプチニューリン、アタキシン－２、パーキン、セリン／スレオニンタンパク質キナーゼＰＩＮＫ１、ロイシンリッチリピートセリン／スレオニンタンパク質キナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、タンデムグルタミンリピートを伴うハンチントン、プリオンタンパク質、トランスサイレチン、歯状核赤核・淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）タンパク質、アンドロゲン受容体、アタキシン、Ｐ／Ｑ型のカルシウムチャネルα１Ａサブユニット、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質、グリア線維性酸性タンパク質、ＤＮＡ除去修復タンパク質ＥＲＣＣ－６、生存運動ニューロンタンパク質、シスタチンＣが挙げられる。そのような投与は、標的分子特異的な方法で神経変性及び／または神経炎症を減少させることができる。
一部の実施形態では、本開示は、神経変性疾患または病態で発現される標的分子に対して１つ以上のＣＡＲ及び／または１つ以上のＮＤＭＭを発現するように単離された細胞、例えばＴｒｅｇが遺伝子改変されるタイプの細胞療法を含むことがあり、改変されたＴｒｅｇ細胞は、それを必要とする対象者に注入される。このような標的分子の例としては、アミロイドベータ１－４２、スーパーオキシドジスムターゼ－１（ＳＯＤ－１）、α－シヌクレイン、過リン酸化タウタンパク質、ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ－４３）、染色体９オープンリーディングフレーム７２（ｃ９ｏｒｆ７２）、β－シヌクレイン、γ－シヌクレイン、肉腫に融合したＲＮＡ結合タンパク質（ＦＵＳ）、ユビキチン、ユビキリン－２、ｐ６２、オプチニューリン、アタキシン－２、パーキン、セリン／スレオニンタンパク質キナーゼＰＩＮＫ１、ロイシンリッチリピートセリン／スレオニンタンパク質キナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、タンデムグルタミンリピートを伴うハンチントン、プリオンタンパク質、トランスサイレチン、歯状核赤核・淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）タンパク質、アンドロゲン受容体、アタキシン、Ｐ／Ｑ型のカルシウムチャネルα１Ａサブユニット、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質、グリア線維性酸性タンパク質、ＤＮＡ除去修復タンパク質ＥＲＣＣ－６、生存運動ニューロンタンパク質、シスタチンＣが挙げられる。そのような投与は、標的分子特異的な方法で神経変性及び／または神経炎症を減少させることができる。
【0198】
一部の実施形態では、改変されたＴｒｅｇは、イン・ビボで拡大でき、長期間持続することができる。
【0199】
細胞（改変されたＴｒｅｇ）が対象者（例えば、ヒト）に投与されると、いくつかの側面における改変された細胞集団の生物活性は、いくつかの既知の方法のいずれかによって測定される。評価すべきパラメーターには、例えばイメージングによるイン・ビボ、またはＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリーによるエクス・ビボでの、人工または天然のＴｒｅｇ細胞またはその他の免疫細胞の抗原への特異的結合が含まれる。
【0200】
いくつかの側面では、生物学的活性は、例えばアルツハイマー病、ＡＬＳ及びパーキンソン病などの神経変性疾患または病態に関連する症状などの疾患症状の軽減のような臨床転帰を評価することによって測定される。
【0201】
標的
本開示のＴｒｅｇは、１つ以上のＣＡＲ及び／または１つ以上のＮＤＭＭを含むことができ、本明細書に記載の標的分子（例えば、α－シヌクレイン、アミロイドβ、または変異型ＳＯＤ１）の発現を含む任意の病態、障害、または疾患を治療、予防、または診断するために使用することができる。また、本発明は、例えば以下を含むことができる神経変性疾患または病態を治療または予防する方法を企図する：アルツハイマー病、パーキンソン病、ＡＬＳ、プリオン病、ＡＬＳ以外の運動ニューロン疾患、ハンチントン病、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、フリードライヒ失調症、レビー小体病、てんかん、多発性硬化症、脳炎、水頭症、脳卒中、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、シヌクレイン症、タウオパチー、海綿状脳症、家族性アミロイドポリニューロパチー、アミロイドーシスを伴うオランダ性遺伝性脳出血、コンゴーレッド親和性血管障害、大脳皮質基底核変性症、ピック病、進行性核上性麻痺、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、致命的な家族性不眠症、クールー病、ウシ海綿状脳症、スクレイピー、慢性消耗性疾患、アルツハイマー病のレビー小体変種、びまん性レビー小体病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、脳の鉄蓄積タイプＩを伴う遺伝性神経変性症、びまん性レビー小体病、前頭側頭葉変性症、歯状核赤核・淡蒼球ルイ体萎縮症、ケネディ病、アレクサンダー病、コケイン症候群、アミロイドーシスを伴うアイスランド性遺伝性脳出血。企図される方法は、本開示による１つ以上のＣＡＲ及び／または１つ以上のＮＤＭＭを任意で含むことがある、改変されたＴｒｅｇを投与することを含む。
本開示のＴｒｅｇは、１つ以上のＣＡＲ及び／または１つ以上のＮＤＭＭを含むことができ、本明細書に記載の標的分子（例えば、α－シヌクレイン、アミロイドβ、または変異型ＳＯＤ１）の発現を含む任意の病態、障害、または疾患を治療、予防、または診断するために使用することができる。また、本発明は、例えば以下を含むことができる神経変性疾患または病態を治療または予防する方法を企図する：アルツハイマー病、パーキンソン病、ＡＬＳ、プリオン病、ＡＬＳ以外の運動ニューロン疾患、ハンチントン病、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、フリードライヒ失調症、レビー小体病、てんかん、多発性硬化症、脳炎、水頭症、脳卒中、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、シヌクレイン症、タウオパチー、海綿状脳症、家族性アミロイドポリニューロパチー、アミロイドーシスを伴うオランダ性遺伝性脳出血、コンゴーレッド親和性血管障害、大脳皮質基底核変性症、ピック病、進行性核上性麻痺、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、致命的な家族性不眠症、クールー病、ウシ海綿状脳症、スクレイピー、慢性消耗性疾患、アルツハイマー病のレビー小体変種、びまん性レビー小体病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、脳の鉄蓄積タイプＩを伴う遺伝性神経変性症、びまん性レビー小体病、前頭側頭葉変性症、歯状核赤核・淡蒼球ルイ体萎縮症、ケネディ病、アレクサンダー病、コケイン症候群、アミロイドーシスを伴うアイスランド性遺伝性脳出血。企図される方法は、本開示による１つ以上のＣＡＲ及び／または１つ以上のＮＤＭＭを任意で含むことがある、改変されたＴｒｅｇを投与することを含む。
【0202】
管理の方法
本発明の組成物は、局所治療または全身治療のどちらが望ましいかに応じて、いくつかの方法で投与することができる。養子細胞療法の場合、養子細胞療法のための細胞の投与方法は知られており、提供される方法及び組成物と組み合わせて使用することができる。例えば、養子性Ｔ細胞治療法は、Ｇｒｕｅｎｂｅｒｇ 他に対する米国特許出願公開 第２００３／０１７０２３８号に記載されている。Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇの米国特許第４，６９０，９１５号、ローゼンバーグ（２０１１年） Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ。８（１０）：５７７～８５）。参照例：Ｔｈｅｍｅｌｉ ｅｔ ａｌ． （２０１３） Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３１（１０）： ９２８－９３３； Ｔｓｕｋａｈａｒａ ｅｔ ａｌ． （２０１３） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ４３８（１）： ８４－９； Ｄａｖｉｌａ ｅｔ ａｌ． （２０１３） ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８（４）： ｅ６１３３８。
本発明の組成物は、局所治療または全身治療のどちらが望ましいかに応じて、いくつかの方法で投与することができる。養子細胞療法の場合、養子細胞療法のための細胞の投与方法は知られており、提供される方法及び組成物と組み合わせて使用することができる。例えば、養子性Ｔ細胞治療法は、Ｇｒｕｅｎｂｅｒｇ 他に対する米国特許出願公開 第２００３／０１７０２３８号に記載されている。Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇの米国特許第４，６９０，９１５号、ローゼンバーグ（２０１１年） Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ。８（１０）：５７７～８５）。参照例：Ｔｈｅｍｅｌｉ ｅｔ ａｌ． （２０１３） Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３１（１０）： ９２８－９３３； Ｔｓｕｋａｈａｒａ ｅｔ ａｌ． （２０１３） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ４３８（１）： ８４－９； Ｄａｖｉｌａ ｅｔ ａｌ． （２０１３） ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８（４）： ｅ６１３３８。
【0203】
このような投与は、局所的、非経口的、または経腸的であり得る。本発明の組成物は、通常、非経口投与に適している。本明細書で使用される場合、医薬組成物の「非経口投与」は、対象者の組織の物理的に破断し及び組織の破断による医薬組成物の投与を特徴とする任意の投与経路が含まれ、その結果、一般的には血流、筋肉、または内臓への直接投与がもたらされる。従って、非経口投与は、組成物の注射による、組成物の適用による、外科的切開による、組織貫通性の非外科的創傷による、組成物の適用などによる、医薬組成物の投与を含むが、これらに限定されない。特に、非経口投与は、皮下、腹腔内、筋肉内、胸骨内、静脈内、動脈内、くも膜下腔内、脳室内、尿道内、頭蓋内、滑膜内注射または注入、そして腎臓透析注入技術を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、本発明の組成物の非経口投与は、皮下または腹腔内投与を含む。
【0204】
非経口投与に適した医薬組成物の製剤は、一般的に、活性成分と滅菌水または滅菌等張食塩水などの薬学的に許容される担体との組み合わせからなる。そのような製剤は、ボーラス投与または連続投与に適した形態で調製、包装、または販売することができる。注射可能な製剤は、アンプルまたは防腐剤を含む複数回用量の容器などの単位投与形態で調製、包装、または販売することができる。非経口投与用の製剤には、懸濁液、溶液、油性または水性ビヒクル中の乳濁液、ペーストなどが含まれるが、これらに限定されない。そのような製剤は、懸濁剤、安定剤、または分散剤を含むがこれらに限定されない１つ以上の追加の成分を、さらに含むことができる。非経口投与用の製剤の一部の実施形態では、有効成分は、再構成された組成物の非経口投与の前に適切なビヒクル（例えば、無菌のパイロジェンフリー水）で再構成するために、乾燥した（すなわち、粉末または顆粒）形態で提供される。また、非経口製剤は塩、炭水化物及び緩衝剤（好ましくは３～９のｐＨ）などの賦形剤からなる水溶液を含むが、いくつかの用途によっては、無菌の非水溶液として、または無菌のパイロジェンフリー水のような適切なビヒクルと組み合わせて使用するための乾燥形態として、より好適に製剤化されてもよい。例示的な非経口投与形態には、無菌の水溶液、例えば水性プロピレングリコールまたはデキストロース溶液中の溶液または懸濁液が含まれる。そのような剤形は、必要に応じて適切に緩衝することができる。有用な他の非経口投与可能な製剤には、微結晶形態またはリポソーム調製物中に活性成分を含むものがある。非経口投与用の製剤は、即時放免及び／または放出調節を有するように製剤化することができる。放出調節製剤には、遅延放出、持続放出、パルス放出、制御放出、標的放出、及びプログラム放出が含まれる。
【0205】
「経口」、「経腸」、「腸内」、「経口的」、「非経口」、「非経口的」などの用語は、消化管に沿った経路または様式による個体への化合物または組成物の投与を指す。組成物の「経口」投与経路の例としては、これらに限定されないが、液体または固体形態の組成物の口からの嚥下、鼻空腸管または胃瘻チューブによる組成物の投与、組成物の十二指腸内投与、及び直腸投与、例えば消化管の下部腸管に坐剤を使用することが挙げられる。改変されたＴｒｅｇを含む処方された組成物は、注射による投与が好ましい。
【0206】
局所投与用の医薬組成物及び製剤は、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴下、坐剤、スプレー、液体、半固体物、単相組成物、多相組成物（例えば、水中油型、水中水型）発泡体、マイクロスポンジ、リポソーム、ナノエマルジョン、エアゾール発泡体、ポリマー、フラーレン、及び粉末を含むことができる。従来の医薬担体、水性、粉末または油性基剤、増粘剤などが必要、または望ましい場合がある。
【0207】
経口投与用の組成物及び製剤には、粉末または顆粒、水または非水性媒体中の懸濁液または溶液、カプセル、サシェまたは錠剤が含まれる。増粘剤、着香剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤が望ましい場合がある。
【0208】
非経口、くも膜下腔内、または脳室内投与用の組成物及び製剤は、緩衝液、希釈剤及びその他の適切な添加剤、例えばこれに限定されないが、浸透促進剤、カーダー化合物及びその他の薬学的に許容される担体または賦形剤からなる滅菌水溶液を含むことができる。
【0209】
本開示の医薬組成物には、溶液、乳濁液、及びリポソーム含有製剤が含まれるが、これらに限定されない。これらの組成物は、予め形成された液体、自己乳化固体及び自己乳化半固体を含むがこれらに限定されない、様々な成分から生成され得る。
【0210】
本開示の医薬組成物は、単位剤形で提供することが都合がよく、製薬業界でよく知られている従来の技術に従って調製することができる。そのような技術は、有効成分を医薬担体または賦形剤と組み合わせる工程を含む。一般的に、製剤は活性成分を液体担体または微粉固体担体もしくはその両方と均一かつ密接に会合させ、その後に必要に応じて、製品を成形することによって調製される。
【0211】
本開示の組成物は、これに限定されないが、錠剤、カプセル、液体シロップ、ソフトゲル、坐剤、エアロゾル、及び浣腸などの多くの可能な剤形のいずれかで処方されてもよい。また、本開示の組成物は水性、非水性または混合媒体中の懸濁液として処方されてもよい。水性懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／またはデキストランを含む、懸濁液の粘度を増加させる物質をさらに含むことができる。懸濁液は安定剤も含むことができる。
【0212】
本開示の一部の実施形態では、薬学的組成物は、泡として処方及び使用され得る。医薬フォームには、乳液、マイクロエマルジョン、クリーム、ゼリー、及びリポソームなどの製剤が含まれるが、これらに限定されない。基本的に性質は似ているが、これらの配合は最終製品の成分と一貫性が異なる。また、細胞レベルでのオリゴヌクレオチドの取り込みを増強する薬剤も、本発明の医薬及び他の組成物に添加され得る。例えば、リポフェクチン（米国特許第５，７０５，１８８号）などのカチオン性脂質、カチオン性グリセロール誘導体、及びポリリジン（ＷＯ９７／３０７３１）などのポリカチオン性分子も、オリゴヌクレオチドの細胞取り込みを増強する。
【0213】
本開示の組成物は、医薬組成物に従来から見られるその他の補助成分をさらに含むことができる。従って、例として組成物は、例えば鎮痒剤、収斂剤、局所麻酔剤または抗炎症剤などの追加の適合性のある薬学的活性物質を含むことができ、または染料、香味剤、保存剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤及び安定剤などの本発明の組成物の様々な剤形を物理的に処方するのに有用となる、追加の物質を含むことができる。しかし、そのような物質は、添加される場合に本発明の組成物の成分の生物活性を過度に妨害してはならない。製剤は、滅菌することができ、必要に応じて補助剤、例えば、潤滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与えるための塩、緩衝剤、着色剤、香料及び／または芳香族物質など、製剤の核酸と有害に相互作用しないものと混合することができる。
【0214】
本開示の改変されたＴｒｅｇの集団を含む処方物は、薬学的に受容可能な賦形剤を含むことができる。製剤に含まれる賦形剤は、例えば改変されたＴｒｅｇ、使用される改変されたＴｒｅｇの亜集団、及び投与方法に応じて、異なる目的を有するであろう。一般的に使用される賦形剤の例としては、これに限定されないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、感染用水、グリセロール、エタノール、及びそれらの組み合わせ、安定剤、可溶化剤及び界面活性剤、緩衝剤及び保存剤、等張化剤、増量剤、並びに潤滑剤が挙げられる。本開示の改変されたＴｒｅｇの集団を含む製剤は、一般的には、動物血清（例えば、ウシ血清アルブミン）などの非ヒト成分の非存在下で調製及び培養されている可能性がある。
【0215】
また、製剤または組成物は、結合分子または細胞を用いて治療される特定の適応症、疾患または病態に有用な１種以上の活性成分を含んでもよく、好ましくは、それぞれの活性が互いに悪影響を及ぼさないような、結合分子または細胞に相補的な活性を有する活性成分を含むことができる。そのような活性成分は、意図された目的に有効な量で組み合わせて適切に存在する。従って、一部の実施形態では、医薬組成物はさらに、化学療法剤、例えばアスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メトトレキサート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチンなどのような他の薬学的に活性となる薬剤または薬物を含む。
【0216】
いくつかの側面における医薬組成物は、組成物の伝達が治療されるべき部位の感作を引き起こすのに十分な時間で、その前に行われるような、徐放型、遅延放出型、及び持続放出型の伝達システムを採用することができる。多くの種類のリリースデリバリーシステムが利用可能で、すでに知られている。このようなシステムは、組成物の反復投与を回避することができ、それにより、対象者及び医師の利便性を向上させる。
【0217】
投薬
一部の実施形態における医薬組成物は、本開示の改変されたＴｒｅｇ、例えば１つ以上のＣＡＲ及び／または１つ以上のＮＤＭＭからなるＴｒｅｇを、疾患または病態、例えば神経変性疾患または病態を治療または予防するのに有効な量、例えば治療的に有効な量または予防的に有効な量で含有する。一部の実施形態における治療的または予防的有効性は、治療された対象者の定期的な評価によって監視される。数日またはそれ以上の反復投与の場合、病態に応じて、疾患症状の望ましい抑制が起こるまで治療が繰り返される。しかし、他の投与計画が有用であり、決定することができる。所望の投与量は、組成物の単回のボーラス投与、複数のボーラス投与、または連続注入投与により伝達することができる。
一部の実施形態における医薬組成物は、本開示の改変されたＴｒｅｇ、例えば１つ以上のＣＡＲ及び／または１つ以上のＮＤＭＭからなるＴｒｅｇを、疾患または病態、例えば神経変性疾患または病態を治療または予防するのに有効な量、例えば治療的に有効な量または予防的に有効な量で含有する。一部の実施形態における治療的または予防的有効性は、治療された対象者の定期的な評価によって監視される。数日またはそれ以上の反復投与の場合、病態に応じて、疾患症状の望ましい抑制が起こるまで治療が繰り返される。しかし、他の投与計画が有用であり、決定することができる。所望の投与量は、組成物の単回のボーラス投与、複数のボーラス投与、または連続注入投与により伝達することができる。
【0218】
特定の実施形態では、改変されたＴｒｅｇの文脈において、対象者は、約１０００万～約１０００億個の細胞、例えば約１００万～約５００億個の細胞（例えば、約５００万個の細胞、約２５００万個の細胞、約５０００万個の細胞、約１０億個の細胞、約５０億個の細胞、約２００億個の細胞、約３００億個の細胞、約４００億個の細胞、または前記の値のいずれか２つによって定義される範囲）、例えば約１０００万～約１，０００億細胞（例えば、約２０００万個の細胞、約３０００万個の細胞、約４０００万個の細胞、約６０００万個の細胞、約７０００万個の細胞、約８０００万個の細胞、約９０００万個の細胞、約１００億個の細胞、約２５０億個の細胞、約５００億個の細胞、約７５０億個の細胞、約９００億個の細胞、または前記の値のいずれか２つによって定義された範囲）、及び場合によっては約１億～約５００億個の細胞（例えば、約１億２０００万個の細胞、約２億５０００万個の細胞、約３億５０００万個の細胞、約４億５０００万個の細胞、約６億５，０００万個の細胞、約８億個の細胞、約９億個の細胞、約３０億個の細胞、約３００億個の細胞、約４５０億個の細胞）またはこれらの範囲内の任意の値、及び／または対象者の体重１キログラムあたりの細胞の数。例えば、一部の実施形態では、細胞または細胞集団の投与は、これらの範囲内の細胞数のすべての整数値を含む、体重１ｋｇあたり約１０３～約１０９個の細胞の投与を含むことができる。
【0219】
細胞または細胞集団は、１回以上を投与することができる。一部の実施形態では、前記の有効量の細胞を単回投与することができる。一部の実施形態では、前記の有効量の細胞は、ある期間にわたって２回以上投与することができる。投与のタイミングは、主治医の判断の範囲内であり、患者の臨床病態に依存する。細胞または細胞集団は、血液バンクまたはドナーなどの任意の供給源から入手することができる。個々の必要性は変化するが、特定の疾患または病態に対する所定の細胞型の有効量の最適範囲の決定は、当技術分野の熟練者の範疇にある。有効量は、治療的または予防的利益を提供する量を意味する。投与される投与量は、レシピエントの年齢、健康病態及び体重、もしある場合は同時治療の種類、治療の頻度及び所望の効果の性質に依存するであろう。一部の実施形態では、有効量の細胞またはそれらの細胞を含む組成物は、非経口的に投与される。一部の実施形態では、投与は静脈内投与であり得る。一部の実施形態では、投与は疾患部位への注射によって直接行うことができる。
【0220】
本開示の目的のために、投与される改変されたＴｒｅｇの量または用量は、妥当な時間枠に渡って対象者、または動物において治療的または予防的応答をもたらすのに十分であるべきである。例えば、改変されたＴｒｅｇの用量は、投与時から約２時間以上、例えば、約１２から約２４時間以上の期間で、抗原に結合するか、または疾患を検出、治療、または予防するのに十分でなければならない。特定の実施形態では、期間はさらに長くなり得る。用量は、特定の改変されたＴｒｅｇの効力及び動物（例えば、ヒト）の病態、並びに治療される動物（例えば、ヒト）の体重によって決定される。
【0221】
一部の実施形態では、本発明による改変されたＴｒｅｇは、当技術分野で知られている別の治療的介入と同時に、または任意の順序で連続的にといったように、併用治療の一部として投与される。例えば、一部の実施形態における本発明による改変されたＴｒｅｇ細胞は、抗体、核酸または小分子などの１つ以上の追加の治療剤と同時に、または任意の順序で同時に、または逐次的に別の治療介入と組み合わせて同時投与される。一部の状況において、細胞は、細胞がＢＢＢを通過する能力を促進する別の部分と同時投与される。一部の状況において、細胞は、細胞集団が１つ以上の追加の治療薬の効果を高めるように、またはその逆であるように、時間的に十分に近い別の療法と同時投与される。一部の実施形態では、細胞は、１つ以上の追加の治療剤の前に投与される。一部の実施形態では、細胞は、１つ以上の追加の治療薬の後に投与される。
【0222】
例
例１：アルツハイマー病を標的とする改変されたＴｒｅｇのためのＴｒｅｇの単離、拡大及びＣＡＲの形質導入
この実施例では、アルツハイマー病を標的とする改変されたＴｒｅｇは、ヒトＣＤ２８ヒンジ、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインに融合した細胞外ｓｃＦｖを含み、その後にヒトＣＤ３ζ細胞質ドメインが続く（図１）。 アルツハイマー病を標的とするＣＡＲには、以下が含まれる。ＤＧ０１（配列番号：１）、ＤＧ０２（配列番号：２）、ＤＧ０３（配列番号：３）、及びＤＧ０４（配列番号：４）、ＤＧ０１－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２０）、ＤＧ０２－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２１）、ＤＧ０３－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２２）、及びＤＧ０４－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２３）。アルツハイマー病を標的とする改変されたＴｒｅｇは、次のように調製される。
例１：アルツハイマー病を標的とする改変されたＴｒｅｇのためのＴｒｅｇの単離、拡大及びＣＡＲの形質導入
この実施例では、アルツハイマー病を標的とする改変されたＴｒｅｇは、ヒトＣＤ２８ヒンジ、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインに融合した細胞外ｓｃＦｖを含み、その後にヒトＣＤ３ζ細胞質ドメインが続く（図１）。 アルツハイマー病を標的とするＣＡＲには、以下が含まれる。ＤＧ０１（配列番号：１）、ＤＧ０２（配列番号：２）、ＤＧ０３（配列番号：３）、及びＤＧ０４（配列番号：４）、ＤＧ０１－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２０）、ＤＧ０２－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２１）、ＤＧ０３－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２２）、及びＤＧ０４－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２３）。アルツハイマー病を標的とする改変されたＴｒｅｇは、次のように調製される。
【0223】
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔｒｅｇは、２段階の細胞分離プロセスでヒトＰＢＭＣから分離した。第一に、製造元の指示に従って、ＭＯＪＯＳＯＲＴ（登録商標） ヒトＣＤ４ Ｔ細胞分離キット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及びＥＡＳＹＳＥＰ（登録商標） マグネット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）を使用した陰性選択により、ヒトＣＤ４ ＋細胞を分離した。第二に、ＣＤ２５ｈｉ細胞は、抗ヒトＣＤ２５ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ ＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）及びＭｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）セパレーターマグネット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を備えたＭＳカラムを使用した陽性選択により、ＣＤ４ ＋分離細胞から濃縮した。ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉ細胞を、１０％熱不活化ヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ）を添加したＴｒｅｇ増殖培地中において、１ ｘ １０６個の細胞／ｍＬで、２４ウェルの非組織培養プレートで培養した。Ｔｒｅｇ増殖培地は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン及び５０μＭ ２－ＭＥを添加した（１）Ｘ－Ｖｉｖｏ－１５または（２）ＲＰＭＩのいずれかであった。細胞のインキュベーション条件は、３７ｏＣ及び５％ ＣＯ２の加湿である。細胞を、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（登録商標）ヒトＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ細胞活性化剤（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）の２５ μＬ／１ ｘ １０６個の細胞で、培養０日目と９日目に細胞を刺激した。場合によっては、代わりにＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ Ｔ細胞活性化因子を使用することが可能である。Ｔｒｅｇ成長培地には、培養２日目から３００～５００Ｕ／ｍＬのヒトＩＬ－２（ＲｏｃｈｅからのＴｅｃｉｎ、新設にもＮＩＨから提供）が補充された。培養細胞を５日目に２５ｃｍ２の組織培養処理フラスコに移した。培養１０日目と１１日目に、細胞に２日間かけてレトロウイルスＣＡＲ構成物を形質導入した。２４ウェルの非組織培養プレートウェルを製造元の指示に従って、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ(R)（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ， Ｉｎｃ．）でプレコートし、その後１０日目に培養細胞を０．３ ｍＬのＴｒｅｇ増殖培地中に、０．３ ｘ １０６個の細胞／ウェルで添加した 。レトロウイルス上清を０．７ｍＬ／ウェルで添加し、プレートを１５００ ｒｃｆで３０ｏＣにし、１時間遠心分離を行い、次に一晩インキュベートした。翌日、培養上清０．５ｍＬを５００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２のレトロウイルス上清０．５ｍＬと交換し、細胞を再度遠心分離した後、一晩インキュベートした。翌日、細胞を１×１０６個の細胞／ｍＬで２５ｃｍ２の組織培養処理フラスコに移した。培養の１３日目に、フローサイトメトリーによって細胞上で同時形質導入された切断型ＣＤ１９のパーセンテージを測定することにより、細胞サンプルの形質導入効率を評価した。細胞の形質導入が３０％未満の場合、製造元の指示に従って、抗ＣＤ１９－ＰＥ及びＥａｓｙＳｅｐ（登録商標）リリースＰＥ陽性選択キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）を使用して、細胞を濃縮できる。細胞は、１７日目まで２日ごとに追加された新鮮なＴｒｅｇ増殖培地で培養された。
【0224】
フローサイトメトリーの工程は、以下のように進行した。
【0225】
細胞の表現型は特異的な抗体で染色することにより決定した：ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ３（クローンＯＫＴ３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ４（クローンＯＫＴ４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＰＥ標識抗ヒトＣＤ１２７（クローンＡ０１９ＤＳ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＰＥ標識抗ヒトＣＤ２５（クローンＭ－Ａ２５１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＰＥ標識抗ヒトＣＤ１９（クローンＳＪ２５Ｃ１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、またはＰＥ標識抗マウスＣＤ１９（クローン６Ｄ５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。細胞内染色には、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（登録商標）Ｆｏｘｐ３／転写因子染色バッファーセットを、ＡＰＣ抗ヒトＦｏｘ３（クローンＰＣＨ１０１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＡＰＣラットＩｇＧ２ａアイソタイプコントロール（クローンｅＢＲ２ａ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に使用した。ＣＡＲ ｓｃＦｖを直接標識するために、ビオチン化プロテインＬ（１μｇ／ｍＬ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）に続いて、ストレプトアビジン－ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用した。ｓｃＦｖベースのＣＡＲを標識するその他の試薬には、ＦＩＴＣ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ'）２特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、ＰＥ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ'）２フラグメント抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、またはＰＥ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ'）２フラグメント抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を含むことができる。細胞は、ＡＣＣＵＲＩ（登録商標）Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、アナーバー、ミシガン、米国）を使用して分析した。
【0226】
図２Ａ－図２Ｄは、前記のように、ヒトＰＢＭＣから分離されたＴｒｅｇのイン・ビトロでの拡大及び表現型検証に関連するデータを示している。図２Ａは、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉ Ｔｒｅｇ（Ｒ２ボックス）が、ＣＤ４及びＣＤ２５濃縮単離前のヒトＰＢＭＣの総Ｔ細胞のごく一部を表していたことを示している。図２Ｂは、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉから分離されたＴｒｅｇが、現在のＴｒｅｇ増殖プロトコルを用いて培養した１７日後に、１７６０倍に増殖したことを示している。図２Ｃは、１７日目のＴｒｅｇが細胞内ＦｏｘＰ３を発現したことを示している。図２Ｄは、ＦｏｘＰ３、トランケートされたＣＤ１９（ｔＣＤ１９）、及びＣＡＲ ｓｃＦｖが、１０日目と１１日目に形質導入されたほとんどの１７日目のＴｒｅｇで検出されたことを示している。
【0227】
アミロイドベータを標的とするＣＡＲは、以下のように機能的に検証された。Ａβ１－４２ペプチドのオリゴマー化は、ＰＢＳでの７日間のインキュベーションの間に発生する可能性があり、この例では、時間の関数として大きなオリゴマーの比率が増加したことが、図３Ａに示されている。ＣＡＲ抗原特異的活性をテストするために、ＤＧ０３－２８ζ抗ＡβＣＡＲ（配列番号：２２）を発現するように形質導入された総エフェクターＴ細胞（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔｅｆｆ細胞）を使用した。これらのＣＡＲ Ｔ細胞がより大きな凝集体のより高い比率のＡβオリゴマーに曝露された際にＩＦＮ－γのより高い分泌量が確認されたが、抗原なしではほとんど応答が生じなかった（図３Ｂ）。これは、ＣＡＲがＡβへの結合特異性を保持し、オリゴマー化された抗原がＣＡＲ Ｔ細胞を活性化することを実証した（図３Ｂ）。
【0228】
例２：アルツハイマー病を標的とする例示的な改変されたＴｒｅｇを用いたＴｒｅｇ抑制アッセイ
実施例１に記載されるように、ＣＡＲを含む改変されたＴｒｅｇは、１２，５００～４００，０００個の細胞／０．１ｍＬ／ウェル間の連続希釈で、Ｔｒｅｇ増殖培地中の９６ウェルＶ底プレートをコーティングした。同種ＰＢＭＣは、製造元の指示に従ってＣｅｌｌＴｒａｃｅ（登録商標）ＣＦＳＥ細胞増殖キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、事前に標識した。ＣＳＦＥ標識ＰＢＭＣは、抗ＣＤ３（１ｕｇ／ｍＬ、クローンＨＩＴ３ａ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）の有無にかかわらず刺激され、プレートされたＴｒｅｇまたはＴｒｅｇのないウェルに添加された。７２時間後、細胞をヒトＣｏｈｎｓフラクション（１ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）を使用してブロックし、ＣＳＦＥのＣＤ８＋細胞発現のフローサイトメーター分析のために、ＡＰＣ抗ＣＤ８（クローンＲＴＡ－Ｔ８、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色した。ＣＦＳＥは細胞分裂ごとに削減できるため、分裂した細胞のＣＦＳＥ値を小さくすることができる。ＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖の抑制率（％）を、抗ＣＤ３ ｍＡｂを含む刺激を受けたＰＢＭＣのコントロールウェルと比較して決定した。
実施例１に記載されるように、ＣＡＲを含む改変されたＴｒｅｇは、１２，５００～４００，０００個の細胞／０．１ｍＬ／ウェル間の連続希釈で、Ｔｒｅｇ増殖培地中の９６ウェルＶ底プレートをコーティングした。同種ＰＢＭＣは、製造元の指示に従ってＣｅｌｌＴｒａｃｅ（登録商標）ＣＦＳＥ細胞増殖キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、事前に標識した。ＣＳＦＥ標識ＰＢＭＣは、抗ＣＤ３（１ｕｇ／ｍＬ、クローンＨＩＴ３ａ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）の有無にかかわらず刺激され、プレートされたＴｒｅｇまたはＴｒｅｇのないウェルに添加された。７２時間後、細胞をヒトＣｏｈｎｓフラクション（１ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）を使用してブロックし、ＣＳＦＥのＣＤ８＋細胞発現のフローサイトメーター分析のために、ＡＰＣ抗ＣＤ８（クローンＲＴＡ－Ｔ８、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色した。ＣＦＳＥは細胞分裂ごとに削減できるため、分裂した細胞のＣＦＳＥ値を小さくすることができる。ＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖の抑制率（％）を、抗ＣＤ３ ｍＡｂを含む刺激を受けたＰＢＭＣのコントロールウェルと比較して決定した。
【0229】
前記のＴｒｅｇ抑制アッセイの結果を図４に示す。図４は、ＤＧ０３－２８ｚを含む１７日目の抗ＡβＣＡＲ Ｔｒｅｇの比率の増加が、共培養されたＣＤ３刺激同種ＰＢＭＣにおけるＣＳＦＥ標識ＣＤ８＋細胞の増殖を抑制したことを示している。
【0230】
例３：アルツハイマー病を標的とする抗原刺激改変Ｔｒｅｇ
可溶性抗原による刺激のために、１７日目のＣＡＲ Ｔｒｅｇを、ＩＬ－２を含まないＴｒｅｇ増殖培地中において５０，０００細胞／ウェルで、コーティングされていない９６ウェル組織培養プレートをコーティング、した。Ａβ１－４２またはα－シヌクレインは、ＰＢＳ中で４０μＭ、３７ｏＣで１週間、毎日攪拌しながらインキュベートすることにより、プレオリゴマー化した。オリゴマー化したＡβ１－４２を０．１ｍＬのＴｒｅｇ増殖培地中のＴｒｅｇに加え、無細胞上清を２４時間及び７２時間でヒトＩＬ－１０ ＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）のために収集した。プレート結合抗原による刺激のために、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、４ｏＣで一晩、ＰＢＳ中のＡβ１－４２、ｗｔＳＯＤ１、変異型ＳＯＤ１、またはα－シヌクレインでコーティングした。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、１７日目のＣＡＲ ＴｒｅｇをＩＬ－２を含まないＴｒｅｇ増殖培地中において、５０，０００細胞／ウェルで抗原被覆９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに加えた。無細胞上清を、２４時間及び７２時間にヒトＩＬ－１０ ＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）用に収集した。または、ＰＢＳ中のストレプトアビジンを４ｏＣで一晩、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、未結合のストレプトアビジンを洗浄した後、ビオチン化抗原を適用した。抗原刺激のための別の代替方法は、抗原でコーティングされたナノメートルまたはマイクロメートルサイズのポリスチレンビーズ、例えばストレプトアビジン共役ビーズに連結されたビオチン化抗原を使用することができる。
可溶性抗原による刺激のために、１７日目のＣＡＲ Ｔｒｅｇを、ＩＬ－２を含まないＴｒｅｇ増殖培地中において５０，０００細胞／ウェルで、コーティングされていない９６ウェル組織培養プレートをコーティング、した。Ａβ１－４２またはα－シヌクレインは、ＰＢＳ中で４０μＭ、３７ｏＣで１週間、毎日攪拌しながらインキュベートすることにより、プレオリゴマー化した。オリゴマー化したＡβ１－４２を０．１ｍＬのＴｒｅｇ増殖培地中のＴｒｅｇに加え、無細胞上清を２４時間及び７２時間でヒトＩＬ－１０ ＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）のために収集した。プレート結合抗原による刺激のために、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、４ｏＣで一晩、ＰＢＳ中のＡβ１－４２、ｗｔＳＯＤ１、変異型ＳＯＤ１、またはα－シヌクレインでコーティングした。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、１７日目のＣＡＲ ＴｒｅｇをＩＬ－２を含まないＴｒｅｇ増殖培地中において、５０，０００細胞／ウェルで抗原被覆９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに加えた。無細胞上清を、２４時間及び７２時間にヒトＩＬ－１０ ＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）用に収集した。または、ＰＢＳ中のストレプトアビジンを４ｏＣで一晩、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、未結合のストレプトアビジンを洗浄した後、ビオチン化抗原を適用した。抗原刺激のための別の代替方法は、抗原でコーティングされたナノメートルまたはマイクロメートルサイズのポリスチレンビーズ、例えばストレプトアビジン共役ビーズに連結されたビオチン化抗原を使用することができる。
【0231】
図５は、２４時間イン・ビトロでオリゴマーＡβにより刺激されたＤＧ０３－２８ｚからなる抗ＡβＣＡＲ Ｔｒｅｇが、ＩＬ－１０を産生したことを示している。Ｐ＜０．００１ 研究のｔテストによる。
【0232】
例４：ＡＬＳを標的とする改変されたＴｒｅｇのためのＴｒｅｇの単離、拡大及びＣＡＲの形質導入
この実施例では、ＡＬＳを標的とする改変されたＴｒｅｇは、ヒト可変重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）配列を使用する抗変異型ＳＯＤ１ ＣＡＲを含んでいる。抗変異型ＳＯＤ１ ｓｃＦｖは、Ｖ ＬのＣ末端をヒトＣＤ２８ヒンジ、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインに融合させて細胞外に発現し、続いてヒトＣＤ３ζ細胞質ドメインに融合させて、抗変異型ＳＯＤ１－ＣＤ２８－ＣＤ３ζＣＡＲ（図 ６）を製造した。 このＣＡＲは、抗原が結合すると、一次シグナル伝達と共刺激シグナル伝達の両方をトリガーする。トランケートされた（非シグナル伝達）ヒトまたはマウスＣＤ１９（ｔＣＤ１９）も、２Ａ共発現システムを使用して同一ベクターで発現し、形質導入されたＴ細胞を追跡及び精製する方法として機能する。ＡＬＳをターゲットとする改変されたＴｒｅｇは、次のように調製される。ＡＬＳをターゲットとするＣＡＲには、以下が含まれる。ＤＧ０５（配列番号：５）、ＤＧ０６（配列番号：６）、ＤＧ０７（配列番号：７）、ＤＧ０５－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２４）、ＤＧ０６－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２５）、及びＤＧ０７－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２６）。
この実施例では、ＡＬＳを標的とする改変されたＴｒｅｇは、ヒト可変重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）配列を使用する抗変異型ＳＯＤ１ ＣＡＲを含んでいる。抗変異型ＳＯＤ１ ｓｃＦｖは、Ｖ ＬのＣ末端をヒトＣＤ２８ヒンジ、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインに融合させて細胞外に発現し、続いてヒトＣＤ３ζ細胞質ドメインに融合させて、抗変異型ＳＯＤ１－ＣＤ２８－ＣＤ３ζＣＡＲ（図 ６）を製造した。 このＣＡＲは、抗原が結合すると、一次シグナル伝達と共刺激シグナル伝達の両方をトリガーする。トランケートされた（非シグナル伝達）ヒトまたはマウスＣＤ１９（ｔＣＤ１９）も、２Ａ共発現システムを使用して同一ベクターで発現し、形質導入されたＴ細胞を追跡及び精製する方法として機能する。ＡＬＳをターゲットとする改変されたＴｒｅｇは、次のように調製される。ＡＬＳをターゲットとするＣＡＲには、以下が含まれる。ＤＧ０５（配列番号：５）、ＤＧ０６（配列番号：６）、ＤＧ０７（配列番号：７）、ＤＧ０５－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２４）、ＤＧ０６－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２５）、及びＤＧ０７－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２６）。
【0233】
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔｒｅｇは、２段階の細胞分離プロセスでヒトＰＢＭＣから分離した。第一に、製造元の指示に従って、ＭＯＪＯＳＯＲＴ（登録商標） ヒトＣＤ４ Ｔ細胞分離キット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及びＥＡＳＹＳＥＰ（登録商標） マグネット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）を使用した陰性選択により、ヒトＣＤ４ ＋細胞を分離した。第二に、ＣＤ２５ｈｉ細胞は、抗ヒトＣＤ２５ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ ＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）及びＭｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）セパレーターマグネット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を備えたＭＳカラムを使用した陽性選択により、ＣＤ４ ＋分離細胞から濃縮した。ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉ細胞を、１０％熱不活化ヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ）を添加したＴｒｅｇ増殖培地中において、１ ｘ １０６個の細胞／ｍＬで、２４ウェル非組織培養プレートで培養した。Ｔｒｅｇ増殖培地は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン及び５０μＭ ２－ＭＥを添加した（１）Ｘ－Ｖｉｖｏ－１５または（２）ＲＰＭＩのいずれかであった。細胞のインキュベーション条件は、３７ｏＣ及び５％ ＣＯ２の加湿である。細胞を、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（登録商標）ヒトＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ細胞活性化剤（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）の２５ μＬ／１ ｘ １０６個の細胞で、培養０日目と９日目に細胞を刺激した。場合によっては、代わりにＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ Ｔ細胞活性化因子を使用することが可能である。Ｔｒｅｇ成長培地には、培養２日目から３００～５００Ｕ／ｍＬのヒトＩＬ－２（ＲｏｃｈｅからのＴｅｃｉｎ、新設にもＮＩＨから提供）が補充された。培養細胞を５日目に２５ｃｍ２の組織培養処理フラスコに移した。培養１０日目と１１日目に、細胞に２日間かけてレトロウイルスＣＡＲ構成物を形質導入した。２４ウェルの非組織培養プレートウェルを製造元の指示に従って、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（R）（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ， Ｉｎｃ．）でプレコートし、その後１０日目に培養細胞を０．３ ｍＬのＴｒｅｇ増殖培地中に、０．３ ｘ １０６個の細胞／ウェルで添加した 。レトロウイルス上清を０．７ｍＬ／ウェルで添加し、プレートを１５００ ｒｃｆで３０ｏＣにし、１時間遠心分離を行い、次に一晩インキュベートした。翌日、培養上清０．５ｍＬを５００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２のレトロウイルス上清０．５ｍＬと交換し、細胞を再度遠心分離した後、一晩インキュベートした。翌日、細胞を１×１０６個の細胞／ｍＬで２５ｃｍ２の組織培養処理フラスコに移した。培養の１３日目に、フローサイトメトリーによって細胞上で同時形質導入された切断型ＣＤ１９のパーセンテージを測定することにより、細胞サンプルの形質導入効率を評価した。細胞の形質導入が３０％未満の場合、製造元の指示に従って、抗ＣＤ１９－ＰＥ及びＥａｓｙＳｅｐ（登録商標）リリースＰＥ陽性選択キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）を使用して、細胞を濃縮できる。細胞は、１７日目まで２日ごとに追加された新鮮なＴｒｅｇ増殖培地で培養された。
【0234】
フローサイトメトリーの工程は、以下のように進行した。
【0235】
細胞の表現型は特異的な抗体で染色することにより決定した：ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ３（クローンＯＫＴ３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ４（クローンＯＫＴ４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＰＥ標識抗ヒトＣＤ１２７（クローンＡ０１９ＤＳ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＰＥ標識抗ヒトＣＤ２５（クローンＭ－Ａ２５１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＰＥ標識抗ヒトＣＤ１９（クローンＳＪ２５Ｃ１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、またはＰＥ標識抗マウスＣＤ１９（クローン６Ｄ５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。細胞内染色には、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（登録商標）Ｆｏｘｐ３／転写因子染色バッファーセットを、ＡＰＣ抗ヒトＦｏｘ３（クローンＰＣＨ１０１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＡＰＣラットＩｇＧ２ａアイソタイプコントロール（クローンｅＢＲ２ａ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に使用した。ＣＡＲ ｓｃＦｖを直接標識するために、ビオチン化プロテインＬ（１μｇ／ｍＬ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）に続いて、ストレプトアビジン－ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用した。ｓｃＦｖベースのＣＡＲを標識するその他の試薬には、ＦＩＴＣ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ'）２特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、ＰＥ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ'）２フラグメント抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、またはＰＥ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ'）２フラグメント抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を含むことができる。細胞は、ＡＣＣＵＲＩ（登録商標）Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、アナーバー、ミシガン、米国）を使用して分析した。
【0236】
あるいは、対照ＣＡＲ ＴＺ４７－２８ｚ ＣＡＲについては、形質導入を以下のように進行した。細胞は、２つの工程の陰性及び陽性選択プロトコルを介してヒトＰＢＭＣから単離された。第一に、陰性選択を使用してＣＤ４＋ＣＤ１２７－ Ｔ細胞を分離し、続いてＣＤ２５＋細胞の陽性選択を使用してＣＤ４＋ＣＤ１２７－ＣＤ２５＋ Ｔｒｅｇ細胞を分離した。単離されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－ Ｔｒｅｇは、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２コーティングビーズ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ）で、ヒトＩＬ－２を含む２週間の培養により活性化された。９日目に、Ｔｒｅｇ細胞は後日使用するために凍結保存されたため、同一ドナーと調製を複数回テストし、アッセイのばらつきを評価できる。このプロトコルを使用して、最初の１ ｘ １０８全体のＰＢＭＣから５ ｘ １０８ Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋、ＣＤ１２７－、ＣＤ２５＋、ＦｏｘＰ３＋）を生成することが可能であった。
【0237】
ＣＡＲ形質導入のために、９日間増殖したＴｒｅｇ細胞を解凍し、免疫培養活性化ビーズで４８時間刺激した。Ｔｒｅｇは、反射コーティングされたプレート（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．）において、抗変異型ＳＯＤ１ ＣＡＲまたは陰性対照ＣＡＲ及びｔＣＤ１９またはｔＣＤ１９ベクターのみを用いたスピン接種によって形質導入された。形質導入されたｔＣＤ１９＋細胞は、形質導入の３日後に磁気ビーズ選択（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）を使用して精製された。この方法により、抗Ｂ７Ｈ６ ＣＡＲ及びｔＣＤ１９で形質導入された拡張Ｔｒｅｇが、Ｔｒｅｇ表現型を保持することが示された。エフェクターＴ細胞増殖の抑制（図７Ａ）、及び細胞の大部分は細胞内ＦｏｘＰ３を発現した（図７Ｂ）。ｔＣＤ１９＋細胞の精製により、最大９５％の純度が得られた（図図７Ｃ７Ｄ）。図７Ａについて、ヒトＰＢＭＣから単離されたＣＤ４＋ＣＤ１２７－ＣＤ２５＋細胞及び拡張したイン・ビトロは、ＣＳＦＥ標識Ｔエフェクター細胞（Ｔｅｆｆ）のＣＤ３刺激増殖の抑制によって示されるように、Ｔｒｅｇ様機能を有していた。図７Ｂについて、ＣＤ４＋ＣＤ１２７－ＣＤ２５＋の単離及び拡張した細胞は、細胞内ＴｒｅｇマーカーＦｏｘＰ３に陽性であった。図７Ｃ－図７Ｄについて、切断されたＣＤ１９（ｔＣＤ１９）レトロウイルスによる単離されたＴｒｅｇの形質導入後、ＣＤ４＋細胞の１７％がｔＣＤ１９を発現し（図７Ｃ）、及びｔＣＤ１９精製後、ソートされた細胞の９５％がｔＣＤ１９＋であった（図７Ｄ）。
【0238】
すべてのエフェクターＴ細胞（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞）を使用して、４０ｎｇ／ｍＬの可溶性ＯＫＴ３及び１００ｕ／ｍＬのＩＬ－２で刺激されたヒトＰＢＭＣに由来し、培養２日目及び３日目にレトロネクチンでコーティングされたウェルにスピン導入し、培養８日目に使用した３つの抗変異型ＳＯＤ１ ＣＡＲ（ＤＧ０５、ＤＧ０６、及びＤＧ０７）は、Ｂ７Ｈ６をターゲットとする抗Ｂ７Ｈ６（ＴＺ４７）ＣＡＲ Ｔ細胞と同一の、Ｇ９３Ａ変異型ＳＯＤ１に対する抗原特異的活性を示した（図８）。 抗変異型ＳＯＤ１ ＣＡＲのＤＧ０５及びＤＧ０６が開発された２つのヒト抗体は、ＡＬＳ変異を有するヒトＳＯＤ１に対して選択的であった。
【0239】
図９は、前記のように、ヒトＰＢＭＣから単離されたＴｒｅｇの表現型検証に関連するデータを示している。図９は、ヒトＴｒｅｇｓで発現されたＤＧ０５－２８Ｚ（配列番号：２４）が、フローサイトメトリーに基づくアッセイを使用して以下のマーカーが陽性であると示している：ＦｏｘＰ３、ＣＤ４、ＣＤ３、形質導入マーカー トランケートされたＣＤ１９（ｔＣＤ１９）、及びＣＡＲをビオチン化プロテインＬ及びストレプトアビジン－ＰＥで標識することにより、陽性であることを示している。さらに、抗変異型ＳＯＤ１ ＣＡＲ ＤＧ０５－２８ｚを発現する改変されたＴｒｅｇｓは、異なる標的（ＤＧ０３－２８ｚ（配列番号：２２））を標的とするＣＡＲを発現する、Ｔｒｅｇｓと同一の表現型を有していた（図１０）。
【0240】
例５：ＡＬＳを標的とする改変されたＴｒｅｇの機能活性
ヒトＴｒｅｇｓで発現した抗変異型ＳＯＤ１ ＣＡＲ ＤＧ０５－２８ｚ（配列番号：２４）を用いたＩＬ－１０ ＥＬＩＳＡデータを以下に示している。図１１は、抗変異型ＳＯＤ１ ＣＡＲ Ｔｒｅｇｓ ＤＧ０５－２８ｚが、培地単独と比較して、ウェル表面に変異型ＳＯＤ１をコーティングした（プレート結合）ウェルで培養した場合に、ＩＬ－１０を産生することを示している。さらに、図１１は、抗変異型ＳＯＤ１ ＣＡＲ Ｔｒｅｇが可溶性オリゴマー化Ａβ１－４２に応答してＩＬ－１０を生成しなかったのに対し、抗ＡβＣＡＲ Ｔｒｅｇは可溶性オリゴマー化Ａβ１－４２に応答してＩＬ－１０を生成したことを示している。
ヒトＴｒｅｇｓで発現した抗変異型ＳＯＤ１ ＣＡＲ ＤＧ０５－２８ｚ（配列番号：２４）を用いたＩＬ－１０ ＥＬＩＳＡデータを以下に示している。図１１は、抗変異型ＳＯＤ１ ＣＡＲ Ｔｒｅｇｓ ＤＧ０５－２８ｚが、培地単独と比較して、ウェル表面に変異型ＳＯＤ１をコーティングした（プレート結合）ウェルで培養した場合に、ＩＬ－１０を産生することを示している。さらに、図１１は、抗変異型ＳＯＤ１ ＣＡＲ Ｔｒｅｇが可溶性オリゴマー化Ａβ１－４２に応答してＩＬ－１０を生成しなかったのに対し、抗ＡβＣＡＲ Ｔｒｅｇは可溶性オリゴマー化Ａβ１－４２に応答してＩＬ－１０を生成したことを示している。
【0241】
図１２は、ヒトエフェクターＴ細胞で発現されたＤＧ０５－２８ｚ（配列番号：２４）及びＤＧ０６－２８ｚ（配列番号：２５）抗変異型ＳＯＤ１ ＣＡＲが、前記のプレート結合ストレプトアビジンに連結されたｗｔＳＯＤ１に対して、相対的にビオチン化された変異型ＳＯＤ１に応答してＩＦＮ－γを産生したことを実証している。ＤＧ０７－２８ｚ（配列番号：２６）と呼ばれる３第三の抗変異型ＳＯＤ１ ＣＡＲは、ヒトＴエフェクター細胞で発現させた場合、変異型ＳＯＤ１と比較してｗｔＳＯＤ１に反応してより多くのＩＦＮ－γを産生した。
【0242】
抗変異型ＳＯＤ１ ＣＡＲ ＤＧ０５－２８ｚを発現する改変されたＴｒｅｇを含むＩＬ－１０を産生するアッセイは、抗ＳＯＤ１ ＣＡＲ Ｔｒｅｇが変異型及び野生型のＳＯＤ１に応答可能であると期待できることを実証したが、それは表面（例えば、組織培養プレート）上で凝集または結合した場合にのみである。前記のようにヒトＴエフェクター細胞で発現したＤＧ０５－２８ｚ及びＤＧ０６－２８ｚ抗変異型ＳＯＤ１ ＣＡＲのデータに基づくと、ＣＡＲはｗｔＳＯＤ１と比較して、凝集またはプレート結合した変異型ＳＯＤ１に対してより選択的であると期待できる。
【0243】
改変されたＴｒｅｇレギュレーターの機能は、イン・ビトロでのＴエフェクター細胞の増殖抑制によって評価された。Ｔｅｆｆのソースは、ＣＳＦＥ標識された同種ＰＢＭＣであった。ＣＡＲを含む改変されたＴｒｅｇは、１２，５００～４００，０００個の細胞／０．１ｍＬ／ウェル間の連続希釈で、Ｔｒｅｇ増殖培地中の９６ウェルＶ底プレートをコーティングした。同種ＰＢＭＣは、製造元の指示に従ってＣｅｌｌＴｒａｃｅ（登録商標）ＣＦＳＥ細胞増殖キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、事前に標識した。ＣＳＦＥ標識ＰＢＭＣは、抗ＣＤ３（１ｕｇ／ｍＬ、クローンＨＩＴ３ａ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）の有無にかかわらず刺激され、プレートされたＴｒｅｇまたはＴｒｅｇのないウェルに添加された。７２時間後、細胞をヒトＣｏｈｎｓフラクション（１ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）を使用してブロックし、ＣＳＦＥのＣＤ８＋細胞発現のフローサイトメーター分析のために、ＡＰＣ抗ＣＤ８（クローンＲＴＡ－Ｔ８、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色した。ＣＦＳＥは細胞分裂ごとに削減できるため、分裂した細胞のＣＦＳＥ値を小さくすることができる。ＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖の抑制率（％）を、抗ＣＤ３ ｍＡｂを含む刺激を受けたＰＢＭＣのコントロールウェルと比較して決定した。ＣＳＦＥ標識ＰＢＭＣにおけるＴｅｆｆのＣＤ８サブセットの増殖は、７２時間後に測定されたか、または抗変異型ＳＯＤ１ ＣＡＲ Ｔｒｅｇと共培養された。ＣＡＲ ＴｒｅｇをＴｒｅｇでＰＢＭＣと共培養した。０．１３：１、０．５：１、及び２：１でのＰＢＭＣ比（図１３）。
【0244】
例６：パーキンソン病を標的とする改変されたＴｒｅｇのためのＴｒｅｇの単離、拡大、及びＣＡＲの形質導入
この実施例では、パーキンソン病を標的とする改変されたＴｒｅｇは、ヒト可変重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）配列を使用する抗α－シヌクレインＣＡＲを含んでいる。抗α－シヌクレインｓｃＦｖは、Ｖ ＬのＣ末端がヒトＣＤ２８ヒンジ、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインに融合させて細胞外に発現し、続いてヒトＣＤ３ζ細胞質ドメインが抗α－シヌクレイン－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ ＣＡＲ（図１４）を製造する。 このＣＡＲは、抗原が結合すると、一次シグナル伝達と共刺激シグナル伝達の両方をトリガーする。トランケートされた（非シグナル伝達）ヒトＣＤ１９（ｔＣＤ１９）も、２Ａ共発現システムを使用して同一ベクターで発現し、形質導入されたＴ細胞を追跡及び精製する方法として機能する。パーキンソン病を標的とするＣＡＲには、以下が含まれる。ＤＧ０８（配列番号：８）、ＤＧ０９（配列番号：９）、ＤＧ１０（配列番号：１０）、ＤＧ１１（配列番号：１１）、ＤＧ０８－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２７）、ＤＧ０９－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２８）、ＤＧ１０－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２９）、及びＤＧ１１－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：３０）。パーキンソン病を標的とする改変されたＴｒｅｇは、次のように調製される。
この実施例では、パーキンソン病を標的とする改変されたＴｒｅｇは、ヒト可変重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）配列を使用する抗α－シヌクレインＣＡＲを含んでいる。抗α－シヌクレインｓｃＦｖは、Ｖ ＬのＣ末端がヒトＣＤ２８ヒンジ、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインに融合させて細胞外に発現し、続いてヒトＣＤ３ζ細胞質ドメインが抗α－シヌクレイン－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ ＣＡＲ（図１４）を製造する。 このＣＡＲは、抗原が結合すると、一次シグナル伝達と共刺激シグナル伝達の両方をトリガーする。トランケートされた（非シグナル伝達）ヒトＣＤ１９（ｔＣＤ１９）も、２Ａ共発現システムを使用して同一ベクターで発現し、形質導入されたＴ細胞を追跡及び精製する方法として機能する。パーキンソン病を標的とするＣＡＲには、以下が含まれる。ＤＧ０８（配列番号：８）、ＤＧ０９（配列番号：９）、ＤＧ１０（配列番号：１０）、ＤＧ１１（配列番号：１１）、ＤＧ０８－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２７）、ＤＧ０９－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２８）、ＤＧ１０－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２９）、及びＤＧ１１－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：３０）。パーキンソン病を標的とする改変されたＴｒｅｇは、次のように調製される。
【0245】
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔｒｅｇは、２段階の細胞分離プロセスでヒトＰＢＭＣから分離した。第一に、製造元の指示に従って、ＭＯＪＯＳＯＲＴ（登録商標） ヒトＣＤ４ Ｔ細胞分離キット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及びＥＡＳＹＳＥＰ（登録商標） マグネット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）を使用した陰性選択により、ヒトＣＤ４ ＋細胞を分離した。第二に、ＣＤ２５ｈｉ細胞は、抗ヒトＣＤ２５ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ ＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）及びＭｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）セパレーターマグネット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を備えたＭＳカラムを使用した陽性選択により、ＣＤ４ ＋分離細胞から濃縮した。ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉ細胞を、１０％熱不活化ヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ）を添加したＴｒｅｇ増殖培地中において、１ ｘ １０６個の細胞／ｍＬで、２４ウェル非組織培養プレートで培養した。Ｔｒｅｇ増殖培地は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン及び５０μＭ ２－ＭＥを添加した（１）Ｘ－Ｖｉｖｏ－１５または（２）ＲＰＭＩのいずれかであった。細胞のインキュベーション条件は、３７ｏＣ及び５％ ＣＯ２の加湿である。細胞を、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（登録商標）ヒトＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ細胞活性化剤（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）の２５ μＬ／１ ｘ １０６個の細胞で、培養０日目と９日目に細胞を刺激した。場合によっては、代わりにＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ Ｔ細胞活性化因子を使用することが可能である。Ｔｒｅｇ成長培地には、培養２日目から３００～５００Ｕ／ｍＬのヒトＩＬ－２（ＲｏｃｈｅからのＴｅｃｉｎ、新設にもＮＩＨから提供）が補充された。培養細胞を５日目に２５ｃｍ２の組織培養処理フラスコに移した。培養１０日目と１１日目に、細胞に２日間かけてレトロウイルスＣＡＲ構成物を形質導入した。２４ウェルの非組織培養プレートウェルを製造元の指示に従って、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ(R)（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ， Ｉｎｃ．）でプレコートし、その後１０日目に培養細胞を０．３ ｍＬのＴｒｅｇ増殖培地中に、０．３ ｘ １０６個の細胞／ウェルで添加した 。レトロウイルス上清を０．７ｍＬ／ウェルで添加し、プレートを１５００ ｒｃｆで３０ｏＣにし、１時間遠心分離を行い、次に一晩インキュベートした。翌日、培養上清０．５ｍＬを５００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２のレトロウイルス上清０．５ｍＬと交換し、細胞を再度遠心分離した後、一晩インキュベートした。翌日、細胞を１×１０６個の細胞／ｍＬで２５ｃｍ２の組織培養処理フラスコに移した。培養の１３日目に、フローサイトメトリーによって細胞上で同時形質導入された切断型ＣＤ１９のパーセンテージを測定することにより、細胞サンプルの形質導入効率を評価した。細胞の形質導入が３０％未満の場合、製造元の指示に従って、抗ＣＤ１９－ＰＥ及びＥａｓｙＳｅｐ（登録商標）リリースＰＥ陽性選択キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）を使用して、細胞を濃縮できる。細胞は、１７日目まで２日ごとに追加された新鮮なＴｒｅｇ増殖培地で培養された。
【0246】
例７：パーキンソン病を標的とする改変されたＴｒｅｇの機能活性
パーキンソン病を標的とする改変されたＴｒｅｇの機能活性は、ウェル表面にα－シヌクレインをコーティングしたウェル（プレート結合）と、可溶性オリゴマー化α－シヌクレインと培地のみを用いたウェルで、可溶性抗原による刺激のために、１７日目のＣＡＲ Ｔｒｅｇを、ＩＬ－２を含まないＴｒｅｇ増殖培地中において５０，０００細胞／ウェルで、コーティングされていない９６ウェル組織培養プレートをコーティングした。Ａβ１－４２またはα－シヌクレインは、ＰＢＳ中で４０μＭ、３７ｏＣで１週間、毎日攪拌しながらインキュベートすることにより、プレオリゴマー化した。オリゴマー化α－シヌクレインを０．１ｍＬのＴｒｅｇ増殖培地中のＴｒｅｇに加え、無細胞上清を２４時間及び７２時間でヒトＩＬ－１０ ＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）のために収集した。プレート結合抗原による刺激のために、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、４ｏＣで一晩、ＰＢＳ中のＡβ１－４２、ｗｔＳＯＤ１、変異型ＳＯＤ１、またはα－シヌクレインでコーティングした。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、１７日目のＣＡＲ ＴｒｅｇをＩＬ－２を含まないＴｒｅｇ増殖培地中において、５０，０００細胞／ウェルで抗原被覆９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに加えた。無細胞上清を、２４時間及び７２時間にヒトＩＬ－１０ ＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）用に収集した。または、ＰＢＳ中のストレプトアビジンを４ｏＣで一晩、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、未結合のストレプトアビジンを洗浄した後、ビオチン化抗原を適用した。抗原刺激のための別の代替方法は、抗原でコーティングされたナノメートルまたはマイクロメートルサイズのポリスチレンビーズ、例えばストレプトアビジン共役ビーズに連結されたビオチン化抗原を使用することができる。図１５は、抗α－シヌクレインＣＡＲ Ｔｒｅｇｓが、ウェル表面にα－シヌクレインをコーティングしたウェル（プレート結合）と、可溶性オリゴマー化したα－シヌクレインを培地のみの場合と比較して、ウェルで培養した場合にＩＬ－１０を生成することを実証したデータを示している。さらに図１５が示すように、抗α－シヌクレインＣＡＲ Ｔｒｅｇは可溶性オリゴマー化Ａβ１－４２に応答してＩＬ－１０を生成しなかったのに対し、抗ＡβＣＡＲ Ｔｒｅｇは可溶性オリゴマー化Ａβ１－４２に応答してＩＬ－１０を生成し、従って、Ｔｒｅｇ上のＣＡＲの抗原特異性を示しした。
パーキンソン病を標的とする改変されたＴｒｅｇの機能活性は、ウェル表面にα－シヌクレインをコーティングしたウェル（プレート結合）と、可溶性オリゴマー化α－シヌクレインと培地のみを用いたウェルで、可溶性抗原による刺激のために、１７日目のＣＡＲ Ｔｒｅｇを、ＩＬ－２を含まないＴｒｅｇ増殖培地中において５０，０００細胞／ウェルで、コーティングされていない９６ウェル組織培養プレートをコーティングした。Ａβ１－４２またはα－シヌクレインは、ＰＢＳ中で４０μＭ、３７ｏＣで１週間、毎日攪拌しながらインキュベートすることにより、プレオリゴマー化した。オリゴマー化α－シヌクレインを０．１ｍＬのＴｒｅｇ増殖培地中のＴｒｅｇに加え、無細胞上清を２４時間及び７２時間でヒトＩＬ－１０ ＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）のために収集した。プレート結合抗原による刺激のために、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、４ｏＣで一晩、ＰＢＳ中のＡβ１－４２、ｗｔＳＯＤ１、変異型ＳＯＤ１、またはα－シヌクレインでコーティングした。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、１７日目のＣＡＲ ＴｒｅｇをＩＬ－２を含まないＴｒｅｇ増殖培地中において、５０，０００細胞／ウェルで抗原被覆９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに加えた。無細胞上清を、２４時間及び７２時間にヒトＩＬ－１０ ＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）用に収集した。または、ＰＢＳ中のストレプトアビジンを４ｏＣで一晩、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、未結合のストレプトアビジンを洗浄した後、ビオチン化抗原を適用した。抗原刺激のための別の代替方法は、抗原でコーティングされたナノメートルまたはマイクロメートルサイズのポリスチレンビーズ、例えばストレプトアビジン共役ビーズに連結されたビオチン化抗原を使用することができる。図１５は、抗α－シヌクレインＣＡＲ Ｔｒｅｇｓが、ウェル表面にα－シヌクレインをコーティングしたウェル（プレート結合）と、可溶性オリゴマー化したα－シヌクレインを培地のみの場合と比較して、ウェルで培養した場合にＩＬ－１０を生成することを実証したデータを示している。さらに図１５が示すように、抗α－シヌクレインＣＡＲ Ｔｒｅｇは可溶性オリゴマー化Ａβ１－４２に応答してＩＬ－１０を生成しなかったのに対し、抗ＡβＣＡＲ Ｔｒｅｇは可溶性オリゴマー化Ａβ１－４２に応答してＩＬ－１０を生成し、従って、Ｔｒｅｇ上のＣＡＲの抗原特異性を示しした。
【0247】
例８：ＡＬＳを標的とする改変されたＴｒｅｇの発現と機能活性
この例では、異なる共刺激シグナル伝達ドメインを有し、またＣＤ３－ゼータ（「ＣＤ３ζ」）刺激ドメインの有無にかかわらず、抗ｍＳＯＤ１ ＣＡＲの発現と機能を、エクス・ビボで拡張及びＣＡＲで形質導入したヒトＴｒｅｇにより評価した。抗ｍＳＯＤ１ ｓｃＦｖ ＤＧ０５及びＣＤ２８膜貫通ドメイン（「２８ｔｍ」）はすべての構成物中に存在し、マウス切断型ＣＤ１９は同一構成物上のＣＡＲを含むベクターに存在した。ＣＤ３－ゼータ（「ＣＤ３ζ」）ドメインは、共刺激ドメインＣＤ２８（「２８」）、ＤＡＰ１０（「１０」）、またはＣＤ４４（「４４」）に結合され、以下の抗ｍＳＯＤ１ ＣＡＲを生成した。ＤＧ０５－２８－３ζ（配列番号：２４）、ＤＧ０５－２８ｔｍ－１０－３ζ（配列番号：４０）、及びＤＧ０５－２８ｔｍ－４４－３ζ（配列番号：４１）。さらに、刺激ドメインまたは共刺激ドメインを持たないＣＤ２８膜貫通ドメイン（「ＣＤ２８ｔｍ」）からなる抗ｍＳＯＤ１ ＣＡＲを製造した（ＤＧ０５－２８ｔｍ、配列番号：４４）、３ζドメインを有するＣＤ２８共刺激ドメインからなるＣＤ２８膜貫通ドメインを持たない抗ｍＳＯＤ１ ＣＡＲを製造した（ＤＧ０５－２８ｔｍ－３ζ、配列番号：４２）、そして、３ 'ドメインを持たないＣＤ２８共刺激ドメインからなる抗ｍＳＯＤ１ ＣＡＲを製造した（ＤＧ０５－２８、配列番号：４３）。
この例では、異なる共刺激シグナル伝達ドメインを有し、またＣＤ３－ゼータ（「ＣＤ３ζ」）刺激ドメインの有無にかかわらず、抗ｍＳＯＤ１ ＣＡＲの発現と機能を、エクス・ビボで拡張及びＣＡＲで形質導入したヒトＴｒｅｇにより評価した。抗ｍＳＯＤ１ ｓｃＦｖ ＤＧ０５及びＣＤ２８膜貫通ドメイン（「２８ｔｍ」）はすべての構成物中に存在し、マウス切断型ＣＤ１９は同一構成物上のＣＡＲを含むベクターに存在した。ＣＤ３－ゼータ（「ＣＤ３ζ」）ドメインは、共刺激ドメインＣＤ２８（「２８」）、ＤＡＰ１０（「１０」）、またはＣＤ４４（「４４」）に結合され、以下の抗ｍＳＯＤ１ ＣＡＲを生成した。ＤＧ０５－２８－３ζ（配列番号：２４）、ＤＧ０５－２８ｔｍ－１０－３ζ（配列番号：４０）、及びＤＧ０５－２８ｔｍ－４４－３ζ（配列番号：４１）。さらに、刺激ドメインまたは共刺激ドメインを持たないＣＤ２８膜貫通ドメイン（「ＣＤ２８ｔｍ」）からなる抗ｍＳＯＤ１ ＣＡＲを製造した（ＤＧ０５－２８ｔｍ、配列番号：４４）、３ζドメインを有するＣＤ２８共刺激ドメインからなるＣＤ２８膜貫通ドメインを持たない抗ｍＳＯＤ１ ＣＡＲを製造した（ＤＧ０５－２８ｔｍ－３ζ、配列番号：４２）、そして、３ 'ドメインを持たないＣＤ２８共刺激ドメインからなる抗ｍＳＯＤ１ ＣＡＲを製造した（ＤＧ０５－２８、配列番号：４３）。
【0248】
この実施例の改変されたＴｒｅｇは、実施例４に一般的に記載されるように、単離、拡大、及び形質導入された。より具体的には、実施例４に記載されるように、１７日目のＣＡＲ ＴｒｅｇをヒトＰＢＭＣから調製した。次の抗ｍＳＯＤ１ ＣＡＲを備えたＰＧ１３レトロウイルスが使用された：ＤＧ０５－２８－３ζ（配列番号：２４）、ＤＧ０５－２８ｔｍ－１０－３ζ（配列番号：４０）、ＤＧ０５－２８ｔｍ－４４－３ζ（配列番号：４１）、ＤＧ０５－２８ｔｍ－３ζ（配列番号：４２）、ＤＧ０５－２８（配列番号：４３）、及びＤＧ０５－２８ｔｍ（配列番号：４４）。
【0249】
この実施例のフローサイトメトリーアッセイは、以下のように進行した。ＣＡＲで形質導入されたＴｒｅｇの割合は、ＣＡＲ ｓｃＦｖをビオチン化プロテインＬ（１μｇ／ｍＬ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、ピスカタウェイ、ニュージャージー、米国）で直接標識し、続いてストレプトアビジン－ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、サンディエゴ、カリフォルニア、米国）で標識することにより測定した。細胞は、ＡＣＣＵＲＩ（登録商標）Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、アナーバー、ミシガン、米国）を使用して分析した。ストレプトアビジン－ＰＥのみで染色された細胞は、非特異的バックグラウンドシグナルのしきい値として使用された（以下を参照 図１６Ａ、６つのフローサイトメトリーパネルの赤い縦線）。
【0250】
プレート結合抗原によるＣＡＲ Ｔｒｅｇ活性化を含むこの実施例のアッセイは、以下のように行われた。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ中の１０μｇ／ｍＬの精製変異型ＳＯＤ１タンパク質５０μＬ／ウェルで４℃で一晩コーティングし、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、その後０．１ｍＬ／ウェルのＸ－ＶＩＶＯ（登録商標）－１５ ＋ １０％ヒト血清でブロックした。ｍＳＯＤ１タンパク質でコーティングされていないウェルをコントロールするために培地を加えた。ＣＡＲ Ｔｒｅｇを５０，０００個の細胞／０．２ｍＬ／ウェルで加え、６時間インキュベートした。細胞を９６ウェルの細胞培養プレートウェルに移し、さらに１８時間インキュベートした。無細胞培地をヒトＩＬ－１０ ＥＬＩＳＡ用に収集した（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、サンディエゴ、カリフォルニア、米国）。
【0251】
ここで図１６Ａを参照。プロテインＬ染色を利用したフローサイトメトリーの結果は、ヒトＴｒｅｇｓ上でＣＡＲ構成物ＤＧ０５－２８－３ζ、ＤＧ０５－２８ｔｍ－１０－３ζ、ＤＧ０５－２８ｔｍ－４４－３ζ、ＤＧ０５－２８ｔｍ－３ζ、ＤＧ０５－２８及びＤＧ０５－２８ｔｍが発現していることが確認された。
【0252】
ここで図１６Ｂを参照。ＤＧ０５－２８－３ζ、ＤＧ０５－２８ｔｍ－１０－３ζ、ＤＧ０５－２８ｔｍ－４４－３ζ、ＤＧ０５－２８ｔｍ－３ζ、ＤＧ０５－２８ではなくＤＧ０５－２８は、ｍＳＯＤ１抗原（ＥＬＩＳＡ）に反応してＩＬ－１０を産生した。図１６Ｂについて、ｎｓ＝重要ではない。＊＊＝ ｐ＜ ０．０１、＊＊＊＝ｐ＜ ０．００１ 研究のｔテストによる（ｎ＝ ３）。
【0253】
例９：アルツハイマー病を標的とする改変されたＴｒｅｇの機能的活動
この例では、異なる共刺激シグナル伝達ドメインを有し、ＣＤ３－ゼータ（３ζ）刺激ドメインの有無にかかわらず、抗ＡβＣＡＲの発現と機能を、エクス・ビボで拡張及びＣＡＲで形質導入したヒトＴｒｅｇにより評価した。抗ＡβｓｃＦｖ ＤＧ０３及びＣＤ２８膜貫通（「２８ｔｍ」）ドメインはすべての構成物中に存在し、マウス切断型ＣＤ１９も同一構成物上のＣＡＲで発現された。ＣＤ３ゼータ（「３ζ」）は、ＣＤ２８（「２８」）、ＤＡＰ１０（「１０」）、ＣＤ４４（「４４」）、４－１ＢＢ（「ＢＢ」）の共刺激ドメインに結合され、以下の抗ＡβＣＡＲを産出した：ＤＧ０３－２８－３ζ（配列番号：２２）、ＤＧ０３－２８ｔｍ－１０－３ζ（配列番号：４５）、ＤＧ０３－２８ｔｍ－４４－３ζ（配列番号：４６）、及びＤＧ０３－２８ｔｍ－ＢＢ－３ζ（配列番号：４７）。さらに、刺激ドメインまたは共刺激ドメインを持たないＣＤ２８膜貫通ドメインからなる抗ＡβＣＡＲを製造した（ＤＧ０３－２８ｔｍ（配列番号：５０））、ＣＤ３ζドメインを有する共刺激ドメインがないＣＤ２８膜貫通ドメインからなる抗ＡβＣＡＲを製造した（ＤＧ０３－２８ｔｍ－３ζ（配列番号：４８））、そして、ＣＤ２８膜貫通ドメイン及びＣＤ２８共刺激ドメインからなるが、ＣＤ３ζドメインを含まない抗Ａβ ＣＡＲを製造した（ＤＧ０３－２８（配列番号：４９））。
この例では、異なる共刺激シグナル伝達ドメインを有し、ＣＤ３－ゼータ（３ζ）刺激ドメインの有無にかかわらず、抗ＡβＣＡＲの発現と機能を、エクス・ビボで拡張及びＣＡＲで形質導入したヒトＴｒｅｇにより評価した。抗ＡβｓｃＦｖ ＤＧ０３及びＣＤ２８膜貫通（「２８ｔｍ」）ドメインはすべての構成物中に存在し、マウス切断型ＣＤ１９も同一構成物上のＣＡＲで発現された。ＣＤ３ゼータ（「３ζ」）は、ＣＤ２８（「２８」）、ＤＡＰ１０（「１０」）、ＣＤ４４（「４４」）、４－１ＢＢ（「ＢＢ」）の共刺激ドメインに結合され、以下の抗ＡβＣＡＲを産出した：ＤＧ０３－２８－３ζ（配列番号：２２）、ＤＧ０３－２８ｔｍ－１０－３ζ（配列番号：４５）、ＤＧ０３－２８ｔｍ－４４－３ζ（配列番号：４６）、及びＤＧ０３－２８ｔｍ－ＢＢ－３ζ（配列番号：４７）。さらに、刺激ドメインまたは共刺激ドメインを持たないＣＤ２８膜貫通ドメインからなる抗ＡβＣＡＲを製造した（ＤＧ０３－２８ｔｍ（配列番号：５０））、ＣＤ３ζドメインを有する共刺激ドメインがないＣＤ２８膜貫通ドメインからなる抗ＡβＣＡＲを製造した（ＤＧ０３－２８ｔｍ－３ζ（配列番号：４８））、そして、ＣＤ２８膜貫通ドメイン及びＣＤ２８共刺激ドメインからなるが、ＣＤ３ζドメインを含まない抗Ａβ ＣＡＲを製造した（ＤＧ０３－２８（配列番号：４９））。
【0254】
この実施例の改変されたＴｒｅｇは、実施例４に一般的に記載されるように、単離、拡大、及び形質導入された。より具体的には、実施例１に記載されるように、１７日目のＣＡＲ ＴｒｅｇをヒトＰＢＭＣから調製した。次の抗ＡβＣＡＲを備えたＰＧ１３レトロウイルスが使用された：ＤＧ０３－２８－３ζ（配列番号：２２）、ＤＧ０３－２８ｔｍ－１０－３ζ（配列番号：４５）、ＤＧ０３－２８ｔｍ－４４－３ζ（配列番号：４６）、ＤＧ０３－２８ｔｍ－ＢＢ－３ζ（配列番号：４７）、ＤＧ０３－２８ｔｍ－３ζ（配列番号：４８）、ＤＧ０３－２８（配列番号：４９）、及びＤＧ０３－２８ｔｍ（配列番号：５０）。
【0255】
この実施例のフローサイトメトリーアッセイは、以下のように進行した。ＣＡＲで形質導入されたＴｒｅｇの割合は、ＰＥ抗マウスＣＤ１９（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、サンディエゴ、カリフォルニア、米国）を用いて共発現させたマウス切断型ＣＤ１９を間接的に標識することで測定した。細胞は、ＡＣＣＵＲＩ（登録商標）Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、アナーバー、ミシガン、米国）を使用して分析した。非染色細胞を使用して、非特異的バックグラウンドシグナルのしきい値を設定した（以下を参照。図１７Ａ、７つのフローサイトメトリーパネルの赤い縦線）。
【0256】
この実施例のオリゴマー化Ａβは、以下のように調製された。２００μＭのＰＢＳ中のＡβ１－４２ペプチドを、ＰＢＳ中３７℃で７日間インキュベートした。オリゴマー化Ａβを４０ μＭに希釈し、等分して－２０℃で保存した。
【0257】
プレート結合オリゴマー化ＡβによるＣＡＲ Ｔｒｅｇ活性化を含むこの実施例のアッセイは、以下のように行われた。ＣＡＲ Ｔｒｅｇは、Ｘ－ＶＩＶＯ（登録商標）－１５ ＋ １０％ヒト血清（１００ ｎＭＡβの有無にかかわらず）中で組織培養処理された９６ウェルプレートに、５０，０００個の細胞／０．２ ｍＬ／ウェルで、コーティングし、２４時間インキュベートした。無細胞培地をヒトＩＬ－１０ ＥＬＩＳＡ用に収集した（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、サンディエゴ、カリフォルニア、米国）。
【0258】
ここで図１７Ａを参照。ｍｓＣＤ１９染色を利用したフローサイトメトリーの結果は、は、ヒト Ｔｒｅｇｓ 上ではＤＧ０３－２８－３ζ、ＤＧ０３－２８ｔｍ－１０－３ζ、ＤＧ０３－２８ｔｍ－４４－３ζ、ＤＧ０３－２８ｔｍ－ＢＢ－３ζ、ＤＧ０３－２８ｔｍ－３ζ、ＤＧ０３－２８及びＤＧ０３－２８ｔｍの各ＣＡＲの構成物が発現していることが確認された。
【0259】
ここで図１７Ｂを参照。ＤＧ０３－２８－３ζ、ＤＧ０３－２８ｔｍ－１０－３ζ、ＤＧ０３－２８ｔｍ－４４－３ζ、及びＤＧ０３－２８ｔｍ－ＣＤ３ζを産生したが、ＤＧ０３－２８ｔｍ－ＢＢ－３ζ、ＤＧ０３－２８及びＤＧ０３－２８ｔｍは、プレート結合したオリゴマー化Ａβ抗原（ＥＬＩＳＡ）に応答してＩＬ－１０を産生しなかった。図１７Ｂについて、ｎｓ＝重要ではない。 ＊＝ ｐ ＜ ０．０５、＊＊＊＝ｐ ＜ ０．００１ 研究のｔテストによる（ｎ＝ ３）。
【0260】
例１０：ＡＬＳを標的とする改変されたＴｒｅｇの機能活性
この実施例では、抗変異型ＳＯＤ１ ＣＡＲの抗原特異的活性は、一般的に実施例５に記載された手順に従って評価された。エクス・ビボを拡張し、抗ｍＳＯＤ１ ＣＡＲＤＧ０５－２８－３ζ（配列番号：２４）を発現するように改変したヒトＴｒｅｇｓを、直径６．０μｍまたは０．６μｍのポリスチレンビーズ（ＡＬＳ患者の中枢神経系で発現するｍＳＯＤ１の凝集体を模倣するために使用される）で予めコーティングしたものと共培養し、ＧＩＴＲ、ＰＤ－１、及びＣＴＬＡ－４の細胞表面発現に対する効果を監視した（以下を参照。図１８）。 さらに、ＩＬ－１０の産生をＥＬＩＳＡアッセイを実施することにより評価した（以下を参照。図１８）。 ＡＬＳを標的とする抗ｍＳＯＤ１ ＣＡＲには、ＤＧ０５－２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２４）からなる改変Ｔｒｅｇｓを含んでいた。
この実施例では、抗変異型ＳＯＤ１ ＣＡＲの抗原特異的活性は、一般的に実施例５に記載された手順に従って評価された。エクス・ビボを拡張し、抗ｍＳＯＤ１ ＣＡＲＤＧ０５－２８－３ζ（配列番号：２４）を発現するように改変したヒトＴｒｅｇｓを、直径６．０μｍまたは０．６μｍのポリスチレンビーズ（ＡＬＳ患者の中枢神経系で発現するｍＳＯＤ１の凝集体を模倣するために使用される）で予めコーティングしたものと共培養し、ＧＩＴＲ、ＰＤ－１、及びＣＴＬＡ－４の細胞表面発現に対する効果を監視した（以下を参照。図１８）。 さらに、ＩＬ－１０の産生をＥＬＩＳＡアッセイを実施することにより評価した（以下を参照。図１８）。 ＡＬＳを標的とする抗ｍＳＯＤ１ ＣＡＲには、ＤＧ０５－２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２４）からなる改変Ｔｒｅｇｓを含んでいた。
【0261】
改変されたＴｒｅｇの分離、拡大及びＣＡＲの形質導入は、実施例４で一般的に説明されているように行われた。より具体的には、実施例４に記載されているように、ヒトＰＢＭＣからＣＡＲ Ｔｒｅｇを調製し、抗ｍＳＯＤ１ ＣＡＲＤＧ０５－２８－３ζを有するＰＧ１３レトロウイルスを用いて、１０日目と１１日目の形質導入に使用した。
【0262】
この実施例では、解凍後のＣＡＲ Ｔｒｅｇの凍結保存及び回復は以下のように進行した。１６日目のＣＡＲ Ｔｒｅｇは、９０％熱不活性化ＦＢＳ及びＭＲ中の１０％ＤＭＳＯの溶液中で、２０×１０６個の細胞／ｍＬのクライオビアル中に凍結保存した。ＦＲＯＳＴＹ（登録商標）冷凍コンテナを－８０°Ｃで２４時間保持し、液体窒素に移す。細胞を解凍してＰＢＳで洗浄し、Ｘ－ＶＩＶＯ（登録商標）－１５ ＋ １０％ヒト血清＋ ５００ ｕ／ｍＬのＩＬ－２で２ ｘ １０６個の細胞／ｍＬに再懸濁し、２４時間インキュベートした。細胞を遠心分離して細胞をペレット化し、４ｍＬのＸ－ＶＩＶＯ（登録商標）－１５培地に再懸濁し、４ ｍＬのＬＹＭＰＨＯＰＲＥＰ（登録商標）分離培地で８００ ｘ ｇで２０分間遠心分離して、間期の細胞を収集し、Ｘ－ＶＩＶＯ（登録商標）－１５で洗浄し、ペレット化した。Ｘ－ＶＩＶＯ（登録商標）－１５ ＋ １０％ヒト血清（ＩＬ－２なし）で細胞を１ ｘ １０６個の細胞／ｍＬに再懸濁した。
【0263】
この実施例のビーズベースのアッセイで使用するための抗原被覆ポリスチレンビーズの調製は、以下のように進行した。精製してビオチン化された、Ｈｉｓタグ付きのヒト変異体Ｇ９３Ａ ＳＯＤ１タンパク質（ｍＳＯＤ１）は、Ｒｏｏｓ博士（シカゴ大学メディカルセンター、シカゴ、イリノイ、米国）から寄贈された。ＳＰＨＥＲＯ（登録商標）ストレプトアビジン被覆粒子 直径６μｍのポリスチレン（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ 製品番号：ＳＶＰ－６０－５、レイクフォレスト、イリノイ、米国）及びＳＰＨＥＲＯ（登録商標）Ｒａｂｂｉｔ 抗６Ｘ Ｈｉｓ被覆粒子 直径０．６ μｍのポリスチレン（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ 製品番号：ＨＩＳＰ－０５－２、レイクフォレスト、イリノイ、米国）を、滅菌１％熱不活性化ＦＢＳを含むＰＢＳで洗浄した。ビーズを１２，０００ ｘ ｇで２分間の微量遠心分離によりペレット化した。２μｇ／ｍＬのｍＳＯＤ１を含む、または含まない１％ＦＢＳにビーズを再懸濁し、ＲＴで１．５時間インキュベートした。細胞をペレット化し、１％ＦＢＳで洗浄して、Ｘ－ＶＩＶＯ（登録商標）－１５ ＋ １０％ヒト血清に再懸濁した。
【0264】
ビーズ結合抗原によるＣＡＲ Ｔｒｅｇ活性化を含む、この実施例のビーズベースのアッセイは、以下のように進行した。ＣＡＲ Ｔｒｅｇは、組織培養処理された１２ウェルプレートに、Ｘ－ＶＩＶＯ（登録商標）－１５ ＋ １０％ヒト血清中１．６ ｘ １０６個の細胞／０．８ ｍＬ／ウェルで播種された。コーティングされていない及びｍＳＯＤ１でコーティングされた直径６μｍのポリスチレンビーズを、ビーズ：セル比４：１で添加した。コーティングされていない及びｍＳＯＤ１でコーティングされた直径０．６μｍのポリスチレンビーズを、ビーズ：セル比１００：１で添加した。メディアのみのコントロールとして、一部のウェルにはビーズは添加されていない。２４時間のインキュベーション後、無細胞培地をヒトＩＬ－１０ ＥＬＩＳＡ用（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、サンディエゴ、カリフォルニア、米国）に収集した。フローサイトメトリー用に細胞を収集して、細胞表面マーカーを評価した。細胞を、ＡＰＣ抗ヒトＧＩＴＲ（クローン６２１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、サンディエゴ、カリフォルニア、米国）、ＡＰＣ抗ヒトＰＤ－１（クローンＥＨ１２．２Ｈ７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、サンディエゴ、カリフォルニア、米国）、及びＰＥ抗－ヒトＣＴＬＡ－４（クローンＢＮＩ３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、サンディエゴ、カリフォルニア、米国）で標識した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定し、ＡＣＣＵＲＩ（登録商標）Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、アナーバー、ミシガン、米国）を使用してヒストグラムを製造した。非染色細胞を使用して、非特異的バックグラウンドシグナルのしきい値を設定した（以下を参照。図１８、６つのフローサイトメトリープロットのそれぞれの垂直線）。
【0265】
ここで図１８を参照。結果は、予めコーティングされた６．０ｕｍまたは０．６ ｕｍビーズで共培養した改変されたＴｒｅｇｓが、ＧＩＴＲ、ＰＤ－１、及びＣＴＬＡ－４の細胞表面発現を増加させることを実証した（２４時間後のフローサイトメトリー、平均ＭＦＩを表示）（以下を参照。図「図１８、６つのフローサイトメトリープロット）。
【0266】
さらに、この実施例のＩＬ－１０ ＥＬＩＳＡアッセイは、抗原でコーティングされていないビーズまたは媒体単独に対するＩＬ－１０産生の増加によって示されるように、改変されたヒトＴｒｅｇがｍＳＯＤ１コーティングされたビーズに応答したように、改変されたヒトＴｒｅｇがｍＳＯＤ１に対する応答性を実証した。（以下を参照。図１８、上清グラフに２つのＩＬ－１０）。
【0267】
例１１：ＡＬＳを標的とする改変されたＴｒｅｇの機能活性
この実施例では、ＡＬＳを標的とする改変されたＴｒｅｇの機能活性を、改変されたＴｒｅｇをヒトｍＳＯＤ１を発現するトランスジェニックマウス由来の脊髄組織外植片と共培養することにより評価した。さらに、ＡＬＳをターゲットとする改変されたＴｒｅｇの機能活性は、改変されたＴｒｅｇを、ヒトｍＳＯＤ１を発現するトランスジェニックマウスに由来する脊椎、肝臓、または肺組織外植片と共培養することにより評価した。改変されたＴｒｅｇには、ＤＧ０５－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（図。１９Ａ及び図１９ＢではＤＧ０５－２８ｚと呼ばれる）（配列番号：２４）、及び陰性対照として、抗ＡβＣＡＲ（図１９Ａ及び図１９Ｂ）ではＤＧ０３－２８ｚと呼ばれる）（ＤＧ０３－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２２））からなる改変されたＴｒｅｇｓを用いた。
この実施例では、ＡＬＳを標的とする改変されたＴｒｅｇの機能活性を、改変されたＴｒｅｇをヒトｍＳＯＤ１を発現するトランスジェニックマウス由来の脊髄組織外植片と共培養することにより評価した。さらに、ＡＬＳをターゲットとする改変されたＴｒｅｇの機能活性は、改変されたＴｒｅｇを、ヒトｍＳＯＤ１を発現するトランスジェニックマウスに由来する脊椎、肝臓、または肺組織外植片と共培養することにより評価した。改変されたＴｒｅｇには、ＤＧ０５－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（図。１９Ａ及び図１９ＢではＤＧ０５－２８ｚと呼ばれる）（配列番号：２４）、及び陰性対照として、抗ＡβＣＡＲ（図１９Ａ及び図１９Ｂ）ではＤＧ０３－２８ｚと呼ばれる）（ＤＧ０３－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２２））からなる改変されたＴｒｅｇｓを用いた。
【0268】
改変されたＴｒｅｇの分離、拡大及びＣＡＲの形質導入は、実施例４で一般的に説明されているように行われた。より具体的には、実施例４に記載されるように、ＣＡＲ ＴｒｅｇをヒトＰＢＭＣから調製した。抗ｍＳＯＤ１ ＣＡＲ ＤＧ０５－ＣＤ２８－ＣＤ３ζまたは抗ＡβＣＡＲ ＤＧ０３－ＣＤ２８－ＣＤ３ζを含むＰＧ１３レトロウイルスを、１０日目と１１日目の形質導入に使用した。
【0269】
解凍後のＣＡＲ Ｔｒｅｇの凍結保存と回復は次のように進行した。１６日目のＣＡＲ Ｔｒｅｇを、９０％熱不活性化ＦＢＳ及び１０％ＤＭＳＯの溶液中で、－８０℃で２４時間、２０ ｘ １０６個の細胞／ｍＬのクライオビアルで凍結保存し、液体窒素に移した。細胞を解凍してＰＢＳで洗浄し、Ｘ－ＶＩＶＯ（登録商標）－１５ ＋ １０％ヒト血清＋ ５００ ｕ／ｍＬのＩＬ－２で２ ｘ １０６個の細胞／ｍＬに再懸濁し、２４時間インキュベートした。細胞を遠心分離して細胞をペレット化し、４ｍＬのＸ－ＶＩＶＯ（登録商標）－１５培地に再懸濁し、４ ｍＬのＬＹＭＰＨＯＰＲＥＰ（登録商標）分離培地で８００ ｘ ｇで２０分間遠心分離して、間期の細胞を収集し、Ｘ－ＶＩＶＯ（登録商標）－１５で洗浄し、ペレット化した。Ｘ－ＶＩＶＯ（登録商標）－１５ ＋ １０％ヒト血清（ＩＬ－２なし）で細胞を１ ｘ １０６個の細胞／ｍＬに再懸濁した。
【0270】
この実施例では、マウス組織外植片によるＣＡＲ Ｔｒｅｇ活性化は以下のように進行した。この実施例では、Ｂ６ＳＪＬ．ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａ（ストック番号００２７２６、ジャクソン研究所、バーハーバー、メイン州、米国）及び非トランスジェニックの同腹仔を使用した。ｍＳＯＤ１トランスジェニックマウスを体重減少と四肢麻痺について監視した。脊髄組織は、非トランスジェニックマウスまたはｍＳＯＤ１トランスジェニックマウスから、疾患発生の様々な段階で収集した。１３週間（麻痺前）、１４週間（臨床発症）、１６週間（麻痺）、または１８週間（１５％の体重減少及び後肢麻痺として定義される疾患末期週）。また、肝臓及び肺は、疾患末期のｍＳＯＤ１トランスジェニックマウスから収集された。組織を氷冷したＸ－ＶＩＶＯ（登録商標）－１５培地に移し、２ｍｍ ｘ ２ｍｍのピースに切断し、培地のない９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルに５分間入れた後、ＣＡＲ Ｔｒｅｇを０．２ｍＬのＸ－ＶＩＶＯ（登録商標）－１５＋１０％ヒト血清（ＩＬ－２は含まない）中に５０，０００個の細胞／ウェルで添加した。２４時間のインキュベーション後、無細胞培地をヒトＩＬ－１０ ＥＬＩＳＡ用（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、サンディエゴ、カリフォルニア、米国）に収集した。
【0271】
ここで図１９Ａを参照。ｍＳＯＤ１を標的とするＤＧ０５－ＣＤ２８－ＣＤ３ζはＩＬ１０の産生を刺激したが、陰性対照のＣＡＲ（ＤＧ０３－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ）を発現するＴｒｅｇは、脊髄外植片との共培養ではＩＬ１０の産生を刺激しなかった。（ｎｓ＝ 重要ではない、＊＝ ｐ ＜ ０．０５、＊＊＝ ｐ ＜ ０．０１、＊＊＊＝ ｐ ＜ ０．００１ 研究のｔテストによる（図１９Ａの場合はｎ＝ ８））。
【0272】
ここで図１９Ｂを参照。ｍＳＯＤ１を標的とするＤＧ０５－ＣＤ２８－ＣＤ３ζは、脊髄組織と共培養した場合にＩＬ１０の産生を刺激したが、肝臓または肺組織と共培養した場合はＩＬ１０の産生を刺激しなかった。一方、陰性対照ＣＡＲ（ＤＧ０３－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ）脊髄、肝臓、または肺組織のいずれかと共培養した場合、ＩＬ－１０の産生を刺激しなかった（ｎｓ＝ 重要ではない、＊＝ ｐ ＜ ０．０５、＊＊＝ ｐ ＜ ０．０１、＊＊＊＝ ｐ ＜ ０．００１ 研究のｔテストによる（図１９Ｂの場合はｎ＝ ３））。
【0273】
例１２：アルツハイマー病を標的とする改変されたＴｒｅｇの機能活性
この実施例では、アルツハイマー病を標的とする改変されたＴｒｅｇの機能活性を、前記の改変されたＴｒｅｇをオリゴマー化Ａβに曝露し、ＩＬ－１０及びＩＬ－４のｍＲＮＡ及びタンパク質分泌レベルを監視することにより評価した。改変されたＴｒｅｇは、抗ＡβＣＡＲＤＧ０３－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２２）からなる改変されたＴｒｅｇｓを含んでいた。
この実施例では、アルツハイマー病を標的とする改変されたＴｒｅｇの機能活性を、前記の改変されたＴｒｅｇをオリゴマー化Ａβに曝露し、ＩＬ－１０及びＩＬ－４のｍＲＮＡ及びタンパク質分泌レベルを監視することにより評価した。改変されたＴｒｅｇは、抗ＡβＣＡＲＤＧ０３－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２２）からなる改変されたＴｒｅｇｓを含んでいた。
【0274】
改変されたＴｒｅｇの分離、拡大及びＣＡＲの形質導入は、実施例１で一般的に説明されているように行われた。より具体的には、実施例１に記載されるように、１７日目のＣＡＲ ＴｒｅｇをヒトＰＢＭＣから調製した。抗ＡβＣＡＲＤＧ０３－ＣＤ２８－ＣＤ３ζを含むＰＧ１３レトロウイルスを１０日目と１１日目の形質導入に使用した。
【0275】
この実施例で使用するためのオリゴマー化Ａβの調製は、以下のように進行した。２００μＭのＰＢＳ中のＡβ１－４２ペプチドを、ＰＢＳ中３７℃で７日間インキュベートした。オリゴマー化Ａβを４０ μＭに希釈し、等分して－２０℃で保存した。
【0276】
この実施例では、オリゴマー化ＡβによるＣＡＲ Ｔｒｅｇの活性化は以下のように進行した。ＣＡＲ Ｔｒｅｇは、Ｘ－ＶＩＶＯ（登録商標）－１５ ＋ １０％ヒト血清（１００ ｎＭＡβの有無にかかわらず）中で組織培養処理された９６ウェルプレートに、５０，０００個の細胞／０．２ ｍＬ／ウェルで、コーティングし、２４時間インキュベートした。ヒトＩＬ－４及びヒトＩＬ－１０ ＥＬＩＳＡ用に、無細胞培地を収集した（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、サンディエゴ、カリフォルニア、米国）。
【0277】
この実施例では、定性ＲＴ－ＰＣＲは以下のように進行した。ＣＡＲ Ｔｒｅｇは、Ｘ－ＶＩＶＯ（登録商標）－１５ ＋ １０％ヒト血清に１．０ ｘ １０６細胞／１．０ ｍＬ／ウェルで組織培養処理した、１２ウェルプレートにコーティングし、一晩インキュベートした。オリゴマー化Ａβ（１００ ｎＭ）を翌日に加え、一部のウェルは未処理（抗原なし）のままにした。オリゴマー化Ａβを細胞に添加して７．５時間後に細胞を回収し、ペレット化し、次にＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、マサチューセッツ、米国）を使用してＲＮＡを抽出した。溶出したＲＮＡを分光光度法で定量し、１μｇをＱＳＣＲＩＰＴ（登録商標）ｃＤＮＡ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ビバリー、マサチューセッツ、米国）を使用して逆転写した。反応混合物には、２ ｎｇのｃＤＮＡ、２００ ｎＭのｄＮＴＰ、４００ ｎＭのプライマー、１×標準Ｔａｑバッファー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、及び０．６２５ ＵのＴＡＱポリメラーゼ（ＢｉｏＬａｂｓ）が含まれ、総反応容量は２５ μｌであった。使用したプライマーの配列は以下の通りであった：ヒトβ－アクチン（１０１－ｂｐ産物）、フォワード、５'－ ＧＧＣ ＣＧＡ ＧＧＡ ＣＴＴ ＴＧＡ ＴＴＧ Ｃ － ３ '（配列番号：２５５）、リバース、５'－ ＴＧＧ ＧＧＴ ＧＧＣ ＴＴＴ ＴＡＧ ＧＡＴ ＧＧ －３'（配列番号：２５６）、ヒトＩＬ－４（１４８－ｂｐ製品）、フォワード、５'－ ＧＣＴ ＴＣＣ ＣＣＣ ＴＣＴ ＧＴＴ ＣＴＴ ＣＣ －３'（配列番号：２５７）、リバース、５'－ ＧＡＴ ＧＴＣ ＴＧＴ ＴＡＣ ＧＧＴ ＣＡＡ ＣＴＣ Ｇ －３'（配列番号：２５８）、及びヒトＩＬ－１０（８２ ｂｐ製品）、フォワード、５'－ ＴＣＡ ＡＧＧ ＣＧＣ ＡＴＧ ＴＧＡ ＡＣＴ ＣＣ －３'（配列番号：２５９）、リバース、５'－ ＣＡＧ ＧＧＡ ＡＧＡ ＡＡＴ ＣＧＡ ＴＧＡ ＣＡＧ Ｃ －３'（配列番号：２６０）。サンプルを２７２０サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティー、カリフォルニア、米国）に９５°Ｃで２分間入れ、続いて９５°Ｃで３０秒間、６０°Ｃで３０秒間、その後６８ ３５°Ｃ、３５サイクル。増幅産物を、１ ｘ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｓａｆｅ ＤＮＡゲル染色剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、マサチューセッツ、米国）を含む１．５％アガロースゲル上で１０５ Ｖで３５分間電気泳動した。バンドは、Ａｌｐｈａ Ｉｍａｇｅｒ ＥＰゲルドキュメンテーションシステム（Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ、サン・レアンドロ、カリフォルニア、米国）を使用して、３０２ ｎｍで可視化及び画像化した。
【0278】
ここで図２０Ａを参照。オリゴマー化したＡβに曝露された改変されたＴｒｅｇは、ＲＴ－ＰＣＲゲル染色で監視したように、オリゴマー化Ａβに曝露されていない改変されたＴｒｅｇと比較して、ＩＬ－１０及びＩＬ－４ ｍＲＮＡレベルの増加を示しました。β－アクチン染色が対照として使用した（以下を参照。図２０Ａ）。
【0279】
ここで図２０Ｂを参照。オリゴマー化Ａβに曝露された改変されたＴｒｅｇは、ＥＬＩＳＡによってモニターされるように、オリゴマー化Ａβに曝露されなかった改変されたＴｒｅｇと比較して、ＩＬ－１０及びＩＬ－４産生の増加を示した。
【0280】
例１３：ＡＬＳを標的とする改変されたＴｒｅｇの機能活性
この実施例では、抗変異型ＳＯＤ１ ＣＡＲの抗原特異的抗炎症活性を、以下に記載されるアッセイで評価した。改変されたＴｒｅｇには、抗ｍＳＯＤ１ ＣＡＲＤＧ０５－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２４）からなる改変されたＴｒｅｇｓを含んでいた。
この実施例では、抗変異型ＳＯＤ１ ＣＡＲの抗原特異的抗炎症活性を、以下に記載されるアッセイで評価した。改変されたＴｒｅｇには、抗ｍＳＯＤ１ ＣＡＲＤＧ０５－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２４）からなる改変されたＴｒｅｇｓを含んでいた。
【0281】
改変されたＴｒｅｇの分離、拡大及びＣＡＲの形質導入は、実施例４で一般的に説明されているように行われた。より具体的には、実施例４に記載されるように、ＣＡＲ ＴｒｅｇをヒトＰＢＭＣから調製した。抗ｍＳＯＤ１ ＣＡＲＤＧ０５－ＣＤ２８－ＣＤ３ζを含むＰＧ１３レトロウイルスを１０日目と１１日目の形質導入に使用した。
【0282】
この実施例では、解凍後のＣＡＲ Ｔｒｅｇの凍結保存及び回復は以下のように進行した。１６日目のＣＡＲ Ｔｒｅｇを、９０％熱不活性化ＦＢＳ及び１０％ＤＭＳＯの溶液中で、－８０℃で２４時間、２０ ｘ １０６個の細胞／ｍＬのクライオビアルで凍結保存し、液体窒素に移した。細胞を解凍してＰＢＳで洗浄し、Ｘ－ＶＩＶＯ（登録商標）－１５ ＋ １０％ヒト血清＋ ５００ ｕ／ｍＬのＩＬ－２で２ ｘ １０６個の細胞／ｍＬに再懸濁し、２４時間インキュベートした。細胞を遠心分離して細胞をペレット化し、４ｍＬのＸ－ＶＩＶＯ（登録商標）－１５培地に再懸濁し、４ ｍＬのＬＹＭＰＨＯＰＲＥＰ（登録商標）分離培地で８００ ｘ ｇで２０分間遠心分離して、間期の細胞を収集し、Ｘ－ＶＩＶＯ（登録商標）－１５で洗浄し、ペレット化した。Ｘ－ＶＩＶＯ（登録商標）－１５ ＋ １０％ヒト血清（ＩＬ－２なし）で細胞を１ ｘ １０６個の細胞／ｍＬに再懸濁した。
【0283】
この実施例のＣＡＲ Ｔｒｅｇの事前活性化は、以下のように進行した。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、１０μｇ／ｍＬの精製変異型ＳＯＤ１タンパク質または５ｕｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体（抗ＣＤ３）をＰＢＳ中で５０μＬ／ウェルにコーティングし、４℃で一晩静置した。非活性化ＣＡＲ Ｔｒｅｇｓのコントロールウェルはコーティングされていないままにした。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、その後０．１ｍＬ／ウェルのＸ－ＶＩＶＯ（登録商標）－１５ ＋ １０％ヒト血清でブロックしました。ＣＡＲ Ｔｒｅｇを１００，０００個の細胞／０．２ｍＬ／ウェルで加え、６時間インキュベートした。次に細胞を収集し、Ｘ－ＶＩＶＯ（登録商標）－１５ ＋ １０％ヒト血清で５００，０００ ＣＡＲ Ｔｒｅｇ／ｍＬに希釈しました。
【0284】
この実施例の予め活性化されたＣＡＲ Ｔｒｅｇ及び単球／マクロファージの共培養は、以下のように進行した。単球をＣＤ１４の陰性選択（ＳｔｅｍＣｅｌｌ １９３５９）によりヒトＰＢＭＣ（ＣＡＲ Ｔｒｅｇとは異なるドナー）から分離し、９６ウェル組織培養処理済みの白色ルミノメータープレート（ＣＯＲＮＩＮＧ(R) ＣＯＳＴＡＲ(R) ３７１９）で５０，０００個の細胞／０．１ｍＬ／ウェルで６時間インキュベートした。非活性化、ｍＳＯＤ１事前活性化、または抗ＣＤ３事前活性化ＣＡＲ Ｔｒｅｇを４０，０００個の細胞／０．１ｍＬ／ウェルで追加した。共培養した細胞を、０．２ ｍＬ／ウェルの最終容量で２日間インキュベートした。
【0285】
この実施例のＣＡＲ Ｔｒｅｇ／マクロファージ共培養の刺激は以下のように進行した。インキュベーションの２日後、ＣＡＲ Ｔｒｅｇ／マクロファージ共培養を、ホルボールミリスチン酸アセテート（ＰＭＡ、４０ ｎＭ）、ザイモサン粒子（２０μｇ／ｍＬ）、またはリポ多糖（ＬＰＳ、２０ ｎｇ／ｍＬ）のいずれかを追加して刺激した。スーパーオキシドの生成を測定するために、ルシゲニン（５ μＭ）にＰＭＡまたはザイモサンを加え、ルシゲニンを介した生物発光を、Ｃｅｎｔｒｏ ＬＢ ９６０マイクロプレートルミノメーター（２秒の露出）で６時間にわたり７つのタイムポイントで測定した。ＥＬＩＳＡ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、サンディエゴ、カリフォルニア、米国）でＴＮＦ－αを測定するために、ＬＰＳ添加の６時間後に無細胞培地を回収した。
【0286】
ここで図２１Ａを参照。ｍＳＯＤ１または抗ＣＤ３抗体のいずれかで事前刺激されたＤＧ０５－ＣＤ２８－ＣＤ３ζを含む改変されたＴｒｅｇで、ＰＭＡ刺激スーパーオキシド生成の抑制を示した（ルシゲニン媒介発光によって測定）。図２１Ａについて。ｎｓ＝重要ではない。 ＊＊＝ ｐ ＜ ０．０１ Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較テスト（ｎ＝ ３）による非活性化されたＣＡＲ Ｔｒｅｇとの相対比較。
【0287】
ここで図２１Ｂを参照。ｍＳＯＤ１または抗ＣＤ３抗体のいずれかで事前刺激されたＤＧ０５－ＣＤ２８－ＣＤ３ζを含む改変されたＴｒｅｇで、ＰＭＡ刺激スーパーオキシド生成の抑制を示した（ルシゲニン媒介発光によって測定）。図２１Ｂについて。ｎｓ＝重要ではない。 ＊＊＝ ｐ ＜ ０．０１ Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較テスト（ｎ＝ ３）による非活性化されたＣＡＲ Ｔｒｅｇとの相対比較。
【0288】
ここで図２１Ｃを参照。ＤＧ０５－ＣＤ２８－ＣＤ３ζを抗ＣＤ３抗体であらかじめ刺激したＤＧ０５－ＣＤ２８－ＣＤ３ζからなる改変Ｔｒｅｇｓは、ＬＰＳ刺激によるＴＮＦ－α産生を２４時間後のＥＬＩＳＡ法で測定したところ、ＬＰＳ刺激によるＴＮＦ－α産生を抑制しなかった。図２１Ｃについて。ｎｓ＝重要ではない。 ＊＊＝ ｐ ＜ ０．０１ Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較テスト（ｎ＝ ３）による非活性化されたＣＡＲ Ｔｒｅｇとの相対比較。
【0289】
例１４：アルツハイマー病を標的とする改変されたＴｒｅｇの機能活性
この実施例では、抗ＡβＣＡＲの抗原特異的抗炎症活性を、以下に記載されるアッセイで評価した。改変されたＴｒｅｇは、抗ＡβＣＡＲＤＧ０３－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２２）からなる改変されたＴｒｅｇｓを含んでいた。
この実施例では、抗ＡβＣＡＲの抗原特異的抗炎症活性を、以下に記載されるアッセイで評価した。改変されたＴｒｅｇは、抗ＡβＣＡＲＤＧ０３－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ（配列番号：２２）からなる改変されたＴｒｅｇｓを含んでいた。
【0290】
改変されたＴｒｅｇの分離、拡大及びＣＡＲの形質導入は、実施例１で一般的に説明されているように行われた。より具体的には、実施例１に記載されるように、ＣＡＲ ＴｒｅｇをヒトＰＢＭＣから調製した。抗ＡβＣＡＲＤＧ０３－ＣＤ２８－ＣＤ３ζを含むＰＧ１３レトロウイルスを１０日目と１１日目の形質導入に使用した。
【0291】
この実施例では、改変されたＣＡＲ Ｔｒｅｇの凍結保存と解凍後の回収は、以下のように進行した。１６日目のＣＡＲ Ｔｒｅｇを、９０％熱不活性化ＦＢＳ及び１０％ＤＭＳＯの溶液中で、－８０℃で２４時間、２０ ｘ １０６個の細胞／ｍＬのクライオビアルで凍結保存し、液体窒素に移した。細胞を解凍してＰＢＳで洗浄し、Ｘ－ＶＩＶＯ（登録商標）－１５ ＋ １０％ヒト血清＋ ５００ ｕ／ｍＬのＩＬ－２で２ ｘ １０６個の細胞／ｍＬに再懸濁し、２４時間インキュベートした。細胞を遠心分離して細胞をペレット化し、４ｍＬのＸ－ＶＩＶＯ（登録商標）－１５培地に再懸濁し、４ ｍＬのＬＹＭＰＨＯＰＲＥＰ（登録商標）分離培地で８００ ｘ ｇで２０分間遠心分離して、間期の細胞を収集し、Ｘ－ＶＩＶＯ（登録商標）－１５で洗浄し、ペレット化した。Ｘ－ＶＩＶＯ（登録商標）－１５ ＋ １０％ヒト血清（ＩＬ－２なし）で細胞を１ ｘ １０６個の細胞／ｍＬに再懸濁した。
【0292】
この実施例の改変されたＣＡＲ Ｔｒｅｇの事前活性化は、以下のように進行した。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、５０μＬ／ウェルの３μｇ／ｍＬのＡβ１－４２ペプチドまたは５ｕｇ／ｍＬ ＯＫＴ３抗体（抗ＣＤ３）を含むＰＢＳ溶液で、４℃で一晩コーティングした。非活性化されたＣＡＲ Ｔｒｅｇのコントロールウェルはコーティングされていない。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、その後０．１ｍＬ／ウェルのＸ－ＶＩＶＯ（登録商標）－１５ ＋ １０％ヒト血清でブロックしました。ＣＡＲ Ｔｒｅｇを１００，０００個の細胞／０．２ｍＬ／ウェルで加え、６時間インキュベートした。次に細胞を収集し、Ｘ－ＶＩＶＯ（登録商標）－１５ ＋ １０％ヒト血清で５００，０００ ＣＡＲ Ｔｒｅｇ／ｍＬに希釈しました。
【0293】
この実施例の予め活性化された改変されたＣＡＲ Ｔｒｅｇ及び単球／マクロファージの共培養は、以下のように進行した。単球をＣＤ１４の陰性選択（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ４８００６０、サンディエゴ、カリフォルニア、米国）によりヒトＰＢＭＣ（ＣＡＲ Ｔｒｅｇとは異なるドナー）から分離し、９６ウェル組織培養処理済みの白色ルミノメータープレート（ＣＯＲＮＩＮＧ(R) ＣＯＳＴＡＲ(R) ３７１９）で５０，０００個の細胞／０．１ｍＬ／ウェルで６時間インキュベートした。非活性化、Ａβ予備活性化、または抗ＣＤ３予備活性化ＣＡＲ Ｔｒｅｇを５０，０００個の細胞／０．１ｍＬ／ウェルで追加した。共培養した細胞を、０．２ ｍＬ／ウェルの最終容量で２日間インキュベートした。
【0294】
この実施例の改変されたＣＡＲ Ｔｒｅｇ／マクロファージ共培養の刺激は以下のように進行した。インキュベーションの２日後、ＣＡＲ Ｔｒｅｇ／マクロファージ共培養を、ホルボールミリスチン酸アセテート（ＰＭＡ、４０ ｎＭ）、ザイモサン粒子（２０μｇ／ｍＬ）、またはリポ多糖（ＬＰＳ、２０ ｎｇ／ｍＬ）のいずれかを追加して刺激した。スーパーオキシドの生成を測定するために、ルシゲニン（５ μＭ）にＰＭＡまたはザイモサンを加え、ルシゲニンを介した生物発光を、Ｃｅｎｔｒｏ ＬＢ ９６０マイクロプレートルミノメーター（２秒の露出）で６時間にわたり７つのタイムポイントで測定した。ＥＬＩＳＡ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、サンディエゴ、カリフォルニア、米国）でＩＬ－６を測定するために、ＬＰＳ添加の２４時間後に無細胞培地を回収した。
【0295】
ここで図２２Ａを参照。ＤＧ０３－ＣＤ２８－ＣＤ３ζを含む改変されたＴｒｅｇは、プレート結合Ａβ抗原または抗ＣＤ３抗体のいずれかで事前刺激され、ＰＭＡ刺激スーパーオキシド生成を抑制した（ルシゲニン媒介発光によって測定）。図２２Ａについて。＊＊＝ ｐ ＜ ０．０１ Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較テスト（ｎ＝ ３）による非活性化ＣＡＲ Ｔｒｅｇとの相対比較。
【0296】
ここで図２２Ｂを参照。ＤＧ０３－ＣＤ２８－ＣＤ３ζを含む改変されたＴｒｅｇは、プレート結合Ａβ抗原または抗ＣＤ３抗体のいずれかで事前刺激され、ザイモサン刺激スーパーオキシド生成を抑制した（ルシゲニン媒介発光によって測定）。図２２Ｂについて。＊＊＝ ｐ ＜ ０．０１ Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較テスト（ｎ＝ ３）による非活性化ＣＡＲ Ｔｒｅｇとの相対比較。
【0297】
ここで図２２Ｃを参照。ＤＧ０３－ＣＤ２８－ＣＤ３ζを含む改変されたＴｒｅｇは、プレート結合Ａβ抗原または抗ＣＤ３抗体のいずれかで事前刺激され、ＥＬＩＳＡで２４時間測定すると、ＬＰＳ刺激ＩＬ－６産生を抑制した。図２２Ｃについて。＊＊＝ ｐ ＜ ０．０１ Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較テスト（ｎ＝ ３）による非活性化ＣＡＲ Ｔｒｅｇとの相対比較。
【0298】
例１５：抗酸化剤や成長因子を発現するように設計された神経変性疾患修飾分子（ＮＤＭＭ）Ｔｒｅｇの機能活性に関する研究
この実施例では、ヒトＴｒｅｇで発現された神経変性疾患修飾分子（ＮＤＭＭ）の細胞保護活性を評価した。
この実施例では、ヒトＴｒｅｇで発現された神経変性疾患修飾分子（ＮＤＭＭ）の細胞保護活性を評価した。
【0299】
この実施例のＮＤＭＭ－Ｔｒｅｇの単離、拡大、及び形質導入は、以下のように進行した。実施例１、実施例４、及び実施例６に記載されているように、ＮＤＭＭの改変されたＴｒｅｇは、ヒトＰＢＭＣから調製された。ＣＡＲ構成物の代わりに、１０日目と１１日目のＴｒｅｇ形質導入に使用したＰＧ１３レトロウイルスは、Ｎｒｆ２（Ｋｅａｐ１阻害剤ペプチド）（配列番号：５１）、ヒトカタラーゼ（配列番号：５２）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）（配列番号：５３）、及びインスリン成長因子－１（ＩＧＦ－１）（配列番号：５４）のためのＮＤＭＭ構成物を有するものであった。ＮＤＭＭ構成物は、共発現されたトランケートされたマウスＣＤ１９を構成して、形質導入効率を監視する。模擬の形質導入Ｔｒｅｇ（ＰＧ１３レトロウイルスなし）を対照として使用した。
【0300】
この実施例のＮＤＭＭ Ｔｒｅｇのフローサイトメトリーは、以下のように進行した。ＮＤＭＭで形質導入されたＴｒｅｇの割合は、ＰＥ抗マウスＣＤ１９（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、サンディエゴ、カリフォルニア、米国）を用いて共発現させたマウス切断型ＣＤ１９を間接的に標識することで測定した。細胞は、ＡＣＣＵＲＩ（登録商標）Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、アナーバー、ミシガン、米国）を使用して分析した。非染色細胞を使用して、非特異的バックグラウンドシグナルのしきい値を設定した。
【0301】
この実施例のＮＤＭＭ Ｔｒｅｇの解凍後の凍結保存及び回復は、以下のように進行した。１７日目のＣＡＲ Ｔｒｅｇを、９０％熱不活性化ＦＢＳ及び１０％ＤＭＳＯの溶液中で、－８０℃で２４時間、２０ ｘ １０６個の細胞／ｍＬのクライオビアルで凍結保存し、液体窒素に移した。細胞を解凍してＰＢＳで洗浄し、Ｘ－ＶＩＶＯ（登録商標）－１５ ＋ １０％ヒト血清＋ ５００ ｕ／ｍＬのＩＬ－２で２ ｘ １０６個の細胞／ｍＬに再懸濁し、２４時間インキュベートした。細胞を遠心分離して細胞をペレット化し、４ｍＬのＸ－ＶＩＶＯ（登録商標）－１５培地に再懸濁し、４ ｍＬのＬＹＭＰＨＯＰＲＥＰ分離培地で８００ ｘ ｇで２０分間遠心分離して、間期の細胞を収集し、Ｘ－ＶＩＶＯ（登録商標）－１５で洗浄し、ペレット化した。細胞を、１０％熱不活性化ＦＢＳ、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、ＨＥＰＥＳ（１０ ｍＭ）、及びペニシリン／ストレプトマイシン溶液を添加した不完全なダルベッコ高グルコース修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｈｙｃｌｏｎｅ ３００２２）で２ ｘ １０６細胞／ｍＬに再懸濁しました。
【0302】
この実施例のＮＤＭＭ－Ｔｒｅｇ及びルシフェラーゼ発現ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経細胞の共培養は、以下のように進行する。以前にルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）を発現するように形質導入されたヒト神経バルストマ細胞株ＳＨ－ＳＹ５Ｙは、１０％熱不活性化ＦＢＳ、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、２－メルセプトエタノール（５０μＭ）、及びペニシリン／ストレプトマイシン溶液を補充した完全ＤＭＥＭ中で６０％～９０％の密集度にまで増殖させた。Ｌｕｃ－ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞をトリプシン化により回収し、５００×ｇで５分間遠心分離によりペレット化して、不完全ＤＭＥＭ（ピルビン酸ナトリウム及び２－メルセプトエタノールを含まない）に再懸濁し、９６ウェル組織培養処理した白色ルミノメータープレート（ＣＯＲＮＩＮＧ(R) ＣＯＳＴＡＲ(R) ３７１９）に１０，０００個の細胞／０．１ｍＬ／ウェルでプレート化した。３時間のインキュベーション後、不完全なＤＭＥＭ培地のＮＤＭＭまたはモックＴｒｅｇをＬｕｃ－ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞に１００，０００ Ｔｒｅｇ／０．０５ｍＬ／ウェル（最終容量０．１５ ｍＬ／ウェル）で加えた。共培養した細胞を２４時間インキュベートした。
【0303】
この実施例の過酸化水素毒性アッセイは、以下のように実施した。ＮＤＭＭ－Ｔｒｅｇ／ｌｕｃ－ＳＨ－ＳＹ５Ｙ共培養の２４時間のインキュベーション後、最終濃度が０、２０、４０、６０、８０、及び３２０μＭの過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を含む５０μＬの不完全なＤＭＥＭメディアを追加した。Ｈ２Ｏ２に曝露した共培養物を２４時間インキュベートし、生存しているｌｕｃ－ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経細胞の相対数を生物発光で測定した。ルシフェリン（５０ μｇ／ｍＬ）を各ウェルに加え、３０分間インキュベートし、生物発光をＣｅｎｔｒｏ ＬＢ ９６０マイクロプレートルミノメーター（２秒露光）で測定した。
【0304】
ここで図２３Ａを参照。抗酸化物質（Ｋｅａｐ１阻害剤ペプチドまたはカタラーゼ）を発現するように設計されたエクス・ビボで拡張及び形質導入されたヒトＴｒｅｇにより、過酸化水素毒性からヒトＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経細胞（ルシフェラーゼを発現）を保護した。図２３Ａについて。ｎｓ＝重要ではない。 ＊＝ ｐ ＜ ０．０５、＊＊＝ ｐ ＜ ０．０１ Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較テスト（ｎ＝ ３）によるモック変換されたＴｒｅｇと相対比較。
【0305】
ここで図２３Ｂを参照。成長因子（ＢＤＮＦまたはＩＧＦ－１）を発現するように改変されたエクス・ビボで拡張及び形質導入したところ、ヒトＴｒｅｇは、過酸化水素毒性からヒトＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経細胞（ルシフェラーゼを発現）を保護した。図２３Ｂについて。ｎｓ＝重要ではない。 ＊＝ ｐ ＜ ０．０５、＊＊＝ Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較テスト（ｎ＝ ３）によるモック変換されたＴｒｅｇとの相対比較。
【0306】
前記の手順では、様々な工程について説明した。しかし、以下の特許請求の範囲に記載される例示的な手順のより広い範囲から逸脱することなく、様々な修正及び変更がそれに加えられてもよく、追加の手順が実装されてもよいことは明らかであろう。
付録Ａ -アミノ酸及び核酸配列
ＤＧ０１ ＳＣＦＶ（配列番号：１）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFAFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGTKKYYTDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNTLRAEDTAVYYCARDRGIGARRGPYYMDVWGKGTTVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK
ＤＧ０２ ＳＣＦＶ（配列番号：２）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMSWVRQAPGKGLEWVASIRSGGGRTYYSDNVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRYDHYSGSSDYWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQKPGQSPQRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPRTFGQGTKVEIK
ＤＧ０３ ＳＣＦＶ（配列番号：３）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLELVASINSNGGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGDYWGQGTTVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVYSNGDTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGQGTKVEIK
ＤＧ０４ ＳＣＦＶ（配列番号：４）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSQVELVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINASGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGKGNTHKPYGYVRYFDVWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCLQIYNMPITFGQGTKVEIK
ＤＧ０５ ＳＣＦＶ（配列番号：５）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAGSGFTFSSYSMHWLRQAPGKGLEWVSAIGTAGGTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREYFFGSGNYGYWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK
ＤＧ０６ ＳＣＦＶ（配列番号：６）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYGIHWVRQAPGKGLEWVAIIWHDGSNSYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARIIGGAFDIWGQGTMVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPITFGQGTRLEIK
ＤＧ０７ ＳＣＦＶ（配列番号：７）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSISGYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGGEKYYGDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCVMAGGLDYWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWYTFGQGTKLEIK
ＤＧ０８ ＳＣＦＶ（配列番号：８）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVRLSCRASGYNFIDFHIHWVRQAPGEGLEWMGWSNPQSGNSSSAQRFQGRVTMTTDTSMSAAYMDLNWLTLDDTAVYYCTRPHDGAGNYRFDTWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSSYELTQPPSVSVAPGQTARITCSGDALPKHYAHWYQQKPGQVPIVVIYKDTERPSGIPERFSGSTSGTTVTLTISGVQAEDEAHYYCQSADVSSTYVVFGGGTKLTVL
ＤＧ０９ ＳＣＦＶ（配列番号：９）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVESGGGLVEPGGSLRLSCAVSGFDFEKAWMSWVRQAPGQGLQWVARIKSTADGGTTSYAAPVEGRFIISRDDSRNMLYLQMNSLKTEDTAVYYCTSAHWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSSYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGEALPMQFAHWYQQRPGKAPVIVVYKDSERPSGVPERFSGSSSGTTATLTITGVQAEDEADYYCQSPDSTNTYEVFGGGTKLTVL
ＤＧ１０ ＳＣＦＶ（配列番号：１０）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYAMHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGKRKYSQKFQDRVTINRDTSASTIYMELSSLGSEDTAVYYCAREEDHAGSGSYLSMDVWGQGSTVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQNVLYSSNNKNYLAWYQQKPGHPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTITSLQTEDVAVYYCQQYYSSPLTFGGGTKVEIK
ＤＧ１１ ＳＣＦＶ（配列番号：１１）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVETGGGLVQPKGSLKLSCATSGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRTKSNDYATYYADSVKGRITISRDDSQSMLYLQMNNLKTEDTAMYYCVRVGYRPYAMDYWGQGTSVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQNIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPTLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGAGTKLELK
４－１ＢＢ共刺激ドメイン（配列番号：１２）
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配列番号：１３）
GGGGSGGGGSGGGGS
Ｔ２Ａ（配列番号：１４）
RAKRSGSGEGRGSLITCGDVEENPGP
Ｐ２Ａ（配列番号：１５）
RAKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP
ＣＤ３Ｚ（配列番号：１６）
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
ヒトアミロイドベータ、アイソフォーム ＡＰＰ７７０（ＩＤ： Ｐ０５０６７－１）（配列番号： １７）
MLPGLALLLLAAWTARALEVPTDGNAGLLAEPQIAMFCGRLNMHMNVQNGKWDSDPSGTKTCIDTKEGILQYCQEVYPELQITNVVEANQPVTIQNWCKRGRKQCKTHPHFVIPYRCLVGEFVSDALLVPDKCKFLHQERMDVCETHLHWHTVAKETCSEKSTNLHDYGMLLPCGIDKFRGVEFVCCPLAEESDNVDSADAEEDDSDVWWGGADTDYADGSEDKVVEVAEEEEVAEVEEEEADDDEDDEDGDEVEEEAEEPYEEATERTTSIATTTTTTTESVEEVVREVCSEQAETGPCRAMISRWYFDVTEGKCAPFFYGGCGGNRNNFDTEEYCMAVCGSAMSQSLLKTTQEPLARDPVKLPTTAASTPDAVDKYLETPGDENEHAHFQKAKERLEAKHRERMSQVMREWEEAERQAKNLPKADKKAVIQHFQEKVESLEQEAANERQQLVETHMARVEAMLNDRRRLALENYITALQAVPPRPRHVFNMLKKYVRAEQKDRQHTLKHFEHVRMVDPKKAAQIRSQVMTHLRVIYERMNQSLSLLYNVPAVAEEIQDEVDELLQKEQNYSDDVLANMISEPRISYGNDALMPSLTETKTTVELLPVNGEFSLDDLQPWHSFGADSVPANTENEVEPVDARPAADRGLTTRPGSGLTNIKTEEISEVKMDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIATVIVITLVMLKKKQYTSIHHGVVEVDAAVTPEERHLSKMQQNGYENPTYKFFEQMQN
ヒトスーパーオキシドジスムターゼ、ＩＤ：Ｐ００４４１－１（配列番号： １８）MATKAVCVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLHGFHVHEFGDNTAGCTSAGPHFNPLSRKHGGPKDEERHVGDLGNVTADKDGVADVSIEDSVISLSGDHCIIGRTLVVHEKADDLGKGGNEESTKTGNAGSRLACGVIGIAQ
ヒトα－シヌクレイン、アイソフォーム１（ＩＤ：Ｐ３７８４０－１）（配列番号：１９）
MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEAAGKTKEGVLYVGSKTKEGVVHGVATVAEKTKEQVTNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGAGSIAAATGFVKKDQLGKNEEGAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMPSEEGYQDYEPEA
ＤＧ０１．２８．Ｚ ＣＡＲ（配列番号：２０）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFAFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGTKKYYTDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNTLRAEDTAVYYCARDRGIGARRGPYYMDVWGKGTTVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP
ＤＧ０２．２８．Ｚ ＣＡＲ（配列番号：２１）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMSWVRQAPGKGLEWVASIRSGGGRTYYSDNVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRYDHYSGSSDYWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQKPGQSPQRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPRTFGQGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP
ＤＧ０３．２８．Ｚ ＣＡＲ（配列番号：２２）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLELVASINSNGGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGDYWGQGTTVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVYSNGDTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGQGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP
ＤＧ０４．２８．Ｚ ＣＡＲ（配列番号：２３）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSQVELVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINASGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGKGNTHKPYGYVRYFDVWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCLQIYNMPITFGQGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP
ＤＧ０５．２８．Ｚ ＣＡＲ（配列番号：２４）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAGSGFTFSSYSMHWLRQAPGKGLEWVSAIGTAGGTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREYFFGSGNYGYWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP
ＤＧ０６．２８．Ｚ ＣＡＲ（配列番号：２５）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYGIHWVRQAPGKGLEWVAIIWHDGSNSYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARIIGGAFDIWGQGTMVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPITFGQGTRLEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP
ＤＧ０７．２８．Ｚ ＣＡＲ（配列番号：２６）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSISGYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGGEKYYGDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCVMAGGLDYWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWYTFGQGTKLEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP
ＤＧ０８．２８．Ｚ ＣＡＲ（配列番号：２７）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVRLSCRASGYNFIDFHIHWVRQAPGEGLEWMGWSNPQSGNSSSAQRFQGRVTMTTDTSMSAAYMDLNWLTLDDTAVYYCTRPHDGAGNYRFDTWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSSYELTQPPSVSVAPGQTARITCSGDALPKHYAHWYQQKPGQVPIVVIYKDTERPSGIPERFSGSTSGTTVTLTISGVQAEDEAHYYCQSADVSSTYVVFGGGTKLTVLASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP
ＤＧ０９．２８．Ｚ ＣＡＲ（配列番号：２８）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVESGGGLVEPGGSLRLSCAVSGFDFEKAWMSWVRQAPGQGLQWVARIKSTADGGTTSYAAPVEGRFIISRDDSRNMLYLQMNSLKTEDTAVYYCTSAHWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSSYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGEALPMQFAHWYQQRPGKAPVIVVYKDSERPSGVPERFSGSSSGTTATLTITGVQAEDEADYYCQSPDSTNTYEVFGGGTKLTVLASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP
ＤＧ１０．２８．Ｚ ＣＡＲ（配列番号：２９）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYAMHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGKRKYSQKFQDRVTINRDTSASTIYMELSSLGSEDTAVYYCAREEDHAGSGSYLSMDVWGQGSTVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQNVLYSSNNKNYLAWYQQKPGHPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTITSLQTEDVAVYYCQQYYSSPLTFGGGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP
ＤＧ１１．２８．Ｚ ＣＡＲ（配列番号：３０）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVETGGGLVQPKGSLKLSCATSGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRTKSNDYATYYADSVKGRITISRDDSQSMLYLQMNNLKTEDTAMYYCVRVGYRPYAMDYWGQGTSVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQNIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPTLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGAGTKLELKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP
シグナル伝達シーケンス（配列番号：３１）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHS
ヒトＣＤ２８ヒンジ（配列番号：３２）
VKGKHLCPSPLFPGPSKP
マウスＣＤ２８ヒンジ（配列番号：３３）
IKEKHLCHTQSSPKL
ヒトＣＤ８Ａヒンジ（配列番号：３４）
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
ヒトＤＡＰ１０ヒンジ（配列番号：３５）
QTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLP
ヒトＣＤ２８ ＴＭ（配列番号：３６）
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
マウスＣＤ２８ ＴＭ（配列番号：３７）
FWALVVVAGVLFCYGLLVTVALCVIWT
ヒトＣＤ８Ａ ＴＭ（配列番号：３８）
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
ヒトＤＡＰ１０ ＴＭ（配列番号：３９）
LLAGLVAADAVASLLIVGAVF
ＤＧ０５－ＣＤ２８ｔｍ－ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ（配列番号：４０）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAGSGFTFSSYSMHWLRQAPGKGLEWVSAIGTAGGTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREYFFGSGNYGYWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGKLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
ＤＧ０５－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ４４－ＣＤ３ζ（配列番号：４１）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAGSGFTFSSYSMHWLRQAPGKGLEWVSAIGTAGGTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREYFFGSGNYGYWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVSRRRCGQKKKLVINSGNGAVEDRKPSGLNGEASKSQEMVHLVNKESSETPDQFMTADETRNLQNVDMKIGVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
ＤＧ０５－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ３ζ（配列番号： ４２）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAGSGFTFSSYSMHWLRQAPGKGLEWVSAIGTAGGTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREYFFGSGNYGYWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
ＤＧ０５－ＣＤ２８（配列番号：４３）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAGSGFTFSSYSMHWLRQAPGKGLEWVSAIGTAGGTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREYFFGSGNYGYWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
ＤＧ０５－ＣＤ２８ｔｍ（配列番号：４４）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAGSGFTFSSYSMHWLRQAPGKGLEWVSAIGTAGGTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREYFFGSGNYGYWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSD
ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ－ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ（配列番号：４５）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLELVASINSNGGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGDYWGQGTTVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVYSNGDTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGQGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGKLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ４４－ＣＤ３ζ（配列番号：４６）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLELVASINSNGGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGDYWGQGTTVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVYSNGDTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGQGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVSRRRCGQKKKLVINSGNGAVEDRKPSGLNGEASKSQEMVHLVNKESSETPDQFMTADETRNLQNVDMKIGVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ－４－１－ＢＢ－ＣＤ３ζ（配列番号：４７）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLELVASINSNGGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGDYWGQGTTVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVYSNGDTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGQGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSLEKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELKLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ３ζ（配列番号：４８）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLELVASINSNGGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGDYWGQGTTVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVYSNGDTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGQGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
ＤＧ０３－ＣＤ２８（配列番号：４９）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLELVASINSNGGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGDYWGQGTTVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVYSNGDTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGQGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ（配列番号：５０）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLELVASINSNGGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGDYWGQGTTVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVYSNGDTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGQGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
ＮＤＭＭ Ｎｒｆ２（Ｋｅａｐ１阻害剤ペプチド）発現用構成物（配列番号：５１）
MMDLELPPPGLPSQQDMDLIDILWRQDIDLGVSREVFDFSQRRKEYELEKQKKLEKERQEQLQKEQEKAFFAQLQLDEETGEFLPIQPAQ
ＮＤＭＭヒトカタラーゼ発現用構成物（配列番号：５２）
MADSRDPASDQMQHWKEQRAAQKADVLTTGAGNPVGDKLNVITVGPRGPLLVQDVVFTDEMAHFDRERIPERVVHAKGAGAFGYFEVTHDITKYSKAKVFEHIGKKTPIAVRFSTVAGESGSADTVRDPRGFAVKFYTEDGNWDLVGNNTPIFFIRDPILFPSFIHSQKRNPQTHLKDPDMVWDFWSLRPESLHQVSFLFSDRGIPDGHRHMNGYGSHTFKLVNANGEAVYCKFHYKTDQGIKNLSVEDAARLSQEDPDYGIRDLFNAIATGKYPSWTFYIQVMTFNQAETFPFNPFDLTKVWPHKDYPLIPVGKLVLNRNPVNYFAEVEQIAFDPSNMPPGIEASPDKMLQGRLFAYPDTHRHRLGPNYLHIPVNCPYRARVANYQRDGPMCMQDNQGGAPNYYPNSFGAPEQQPSALEHSIQYSGEVRRFNTANDDNVTQVRAFYVNVLNEEQRKRLCENIAGHLKDAQIFIQKKAVKNFTEVHPDYGSHIQALLDKYNAEKPKNAIHTFVQSGSHLAAREKANL
ＮＤＭＭ ＢＤＮＦ発現用構成物（配列番号：５３）
MTILFLTMVISYFGCMKAAPMKEANIRGQGGLAYPGVRTHGTLESVNGPKAGSRGLTSLADTFEHVIEELLDEDQKVRPNEENNKDADLYTSRVMLSSQVPLEPPLLFLLEEYKNYLDAANMSMRVRRHSDPARRGELSVCDSISEWVTAADKKTAVDMSGGTVTVLEKVPVSKGQLKQYFYETKCNPMGYTKEGCRGIDKRHWNSQCRTTQSYVRALTMDSKKRIGWRFIRIDTSCVCTLTIKRGR
ＮＤＭＭ ＩＧＦ－１発現用構成物（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４）
MGKISSLPTQLFKCCFCDFLKVKMHTMSSSHLFYLALCLLTFTSSATAGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARSVRAQRHTDMPKTQKYQPPSTNKNTKSQRRKGWPKTHPGGEQKEGTEASLQIRGKKKEQRREIGSRNAECRGKKGK
ＤＧ０１ ＳＣＦＶ（配列番号：２０１）
atggaatgga cctgggtgtt cctgtttctg ctgtccgtga ccgctggcgt gcacagccag gtgcagctgg tggaaagcgg cggaggagtc gtgcagcctg gcagaagcct gaggctgagc tgtgccgcca gcggcttcgc cttcagctcc tacggcatgc actgggtgag acaggcccct ggcaagggac tggagtgggt ggctgtgatc tggttcgacg gcaccaagaa gtactacacc gacagcgtca agggcaggtt caccatctcc agggacaata gcaagaatac cctgtacctc caaatgaaca ccctgagggc cgaggacacc gccgtgtatt actgcgccag ggatagggga atcggcgcca ggagaggccc ctactacatg gacgtgtggg gcaagggcac aacagtgacc gtttcttctg ctggaggagg aggttctgga ggaggaggaa gcggaggagg aggctccgac atccagatga cacagtcccc cagctccctg tccgccagcg tgggcgatag agtgaccatc acctgcaggg ccagccagag catctccagc tacctgaact ggtatcaaca gaagcccggc aaagccccca aactgctgat ctacgctgcc agcagcctgc agagcggcgt gccttccaga ttcagcggct ccggcagcgg caccgatttc acactgacca tctccagcct gcagcccgag gacttcgcca cctactactg ccagcagagc tacagcaccc ccctgacctt tggcggaggc accaaggtgg agatcaaa
ＤＧ０２ ＳＣＦＶ（配列番号：２０２）
atggaatgga cctgggtgtt tctgttcctg ctgagcgtga cagccggcgt gcacagcgag gtgcagctgc tggagagcgg aggaggactg gtgcaacccg gcggaagcct cagactgagc tgtgccgcca gcggcttcac cttcagcaac tatggcatga gctgggtgag gcaggcccct ggcaaaggcc tcgaatgggt ggcttccatt aggagcggcg gcggcaggac ctattacagc gacaacgtga agggcaggtt caccatctcc agggacaata gcaagaacac cctgtacctg cagatgaact ccctgagggc cgaggatacc gccgtgtact actgcgtgag gtacgaccac tacagcggct ccagcgacta ttggggacag ggcaccctgg tgacagtgtc cagcgccgga ggaggcggca gcggcggcgg cggcagcggc ggcggcggaa gcgatgtggt gatgacccag tcccccctga gcctgcctgt gacacctgga gagcccgcca gcatcagctg taagagcagc cagagcctcc tggacagcga cggcaaaacc tacctgaact ggctcctgca gaagcccgga caaagccccc agaggctgat ctacctggtg agcaaactgg acagcggcgt gcctgacaga ttctccggct ccggcagcgg caccgacttc acactgaaga tcagcagagt ggaggctgag gacgtgggcg tctactactg ctggcagggc acccacttcc ccaggacctt cggccaggga accaaggtgg agatcaag
ＤＧ０３ ＳＣＦＶ（配列番号：２０３）
atggaatgga cctgggtgtt cctgtttctg ctctccgtga ccgccggagt gcacagcgag gtgcagctgg tcgaaagcgg cggaggactg gtgcagcctg gcggcagcct gagactgagc tgtgccgcct ccggcttcac ctttagcagc tacggaatgt cctgggtgag acaggctcct ggcaagggcc tggaactggt ggccagcatc aatagcaacg gcggcagcac ctactaccct gatagcgtga agggcaggtt caccatctcc agggacaacg ccaagaacag cctgtacctg cagatgaaca gcctcagggc cgaggacaca gccgtgtact actgcgccag cggcgactat tggggacagg gaacaaccgt gaccgtcagc agcgccggcg gcggcggcag cggcggcggc ggcagcggcg gcggcggctc cgatatcgtg atgacccaga gccccctgtc cctgcctgtc acacctggcg aacccgccag cattagctgc aggtccagcc agagcctggt gtacagcaat ggcgacacct acctgcactg gtacctgcag aagcctggcc agagccccca gctgctgatc tacaaggtga gcaacaggtt ctccggagtg cctgacaggt tcagcggctc cggcagcgga accgatttca ccctcaagat cagcagagtg gaggccgagg acgtgggcgt ctactattgt agccagagca cccacgtgcc ctggaccttt ggccagggca ccaaggtgga gatcaaa
ＤＧ０４ ＳＣＦＶ（配列番号：２０４）
atggaatgga cctgggtgtt tctgttcctc ctgagcgtga ccgccggagt gcacagccaa gtggagctgg tggagagcgg aggaggactg gtgcagcctg gaggctccct gaggctgagc tgtgctgcca gcggcttcac cttcagctcc tatgctatga gctgggtgag acaggcccct ggcaaaggcc tggagtgggt gagcgccatc aacgcctccg gcaccaggac ctactatgcc gactccgtga agggcaggtt caccatctcc agggacaaca gcaagaacac cctgtacctg cagatgaaca gcctgagggc tgaagacacc gccgtgtact actgtgccag gggcaagggc aacacacaca agccctatgg ctacgtgaga tacttcgacg tgtggggaca gggcaccctg gtgacagtga gcagcgccgg aggaggaggt tctggaggag gaggaagcgg cggaggagga agcgacatcg tgctgacaca atcccccgcc acactgtccc tgtcccctgg cgagagggcc acactgagct gcagggccag ccagagcgtg tcctcctcct acctggcctg gtaccagcag aaacctggcc aggcccccag gctgctgatc tatggcgcca gcagcagagc cacaggagtg cctgccagat ttagcggcag cggcagcggc accgacttta ccctgaccat ttccagcctg gagcccgagg acttcgccac ctactactgc ctgcagatct acaacatgcc tatcaccttc ggccagggca caaaagtgga aatcaag
ＤＧ０５ ＳＣＦＶ（配列番号： ２０５）
atggaatgga cctgggtgtt tctgttcctc ctgtccgtga ccgccggagt gcactccgaa gtgcagctgg tgcagtccgg cggaggactg gtgaaacccg gaggaagcct cagactgagc tgcgccggca gcggctttac cttctccagc tactccatgc actggctgag acaggcccct ggcaagggcc tggaatgggt cagcgccatc ggcaccgccg gaggcacata ctatgccgac agcgtgaagg gcaggttcac catcagcagg gacaacgcca agaacagcct gtacctgcag atgaactctc tgagggccga ggataccgct gtgtactact gcgccaggga gtacttcttt ggcagcggca actacggata ctggggccag ggcaccctgg tgacagtgag ctccgccgga ggaggaggaa gcggaggagg cggaagcgga ggaggcggca gcgaaatcgt gctgacccag agccctgcca ccctgagcct gagccctggc gaaagggcca ccctgagctg cagagccagc cagagcgtga gcagctacct ggcctggtac cagcagaagc ccggacaggc ccccagactg ctgatctacg acgccagcaa cagagccacc ggcattcccg ccagattctc cggcagcggc agcggaaccg acttcacact gaccatcagc tccttagaac ccgaggactt cgccgtgtac tactgtcagc agagaagcaa ctggcctccc accttcggcc agggcacaaa ggtggagatc aag
ＤＧ０６ ＳＣＦＶ（配列番号：２０６）
atggaatgga cctgggtgtt cctgttcctc ctgagcgtga ccgctggcgt ccacagccag gtgcagctgg tggaaagcgg aggcggagtg gtgcagcctg gaaggtccct cagactgagc tgcgctgcca gcggcttcac cttcagcaac tacggcatcc actgggtgag acaagccccc ggcaaaggcc tggagtgggt ggccatcatc tggcacgacg gcagcaactc ctactacgtg gactccgtga agggcaggtt cacaatcagc agagacaaca gcaagaatac cctgtacctg cagatgaaca gcctcagggc cgaagatacc gccgtgtact tctgcgccag gatcatcggc ggcgcctttg acatttgggg ccaaggcact atggttaccg tgagcagcgc tggcggaggc ggcagcggcg gcggcggcag cggcggcggc ggaagcgaca tccagatgac ccagagccct tccagcctca gcgcctccgt gggagacaga gtgaccatca cctgcagggc cagccagggc atctccagct ggctggcctg gtaccagcag aagcctgaga aagcccccaa gagcctgatc tacgctgcct ccagcctgca gtccggcgtg ccttccagat tctccggcag cggcagcggc accgacttta ccctgaccat ttccagcctg caacccgagg acttcgccac ctactactgc cagcagtaca acagctaccc catcaccttt ggccagggca ccagactgga gatcaag
ＤＧ０７ ＳＣＦＶ（配列番号： ２０７）
atggaatgga cctgggtgtt cctgttcctg ctgtccgtga ccgccggagt ccacagcgag gtgcagctgg tggaaagcgg cggaggactg gtgcagcctg gaggcagcct gaggctgagc tgtgctgcca gcggcttctc catcagcggc tactggatgt cctgggtgag gcaggcccct ggaaagggct tagaatgggt ggccaacatc aaacaggacg gcggcgagaa gtactacgga gacagcgtca agggcagatt caccatcagc agggacaacg ccaagaacag cctgtacctg cagatgaaca gcctgagggc cgaggacacc gctgtgtact actgcgtgat ggccggaggc ctggattatt ggggccaggg cacactggtg acagtgagca gcgccggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc gagatcgtgc tgacccagag ccctgccaca ctgagcctga gccccggcga aagagccacc ctcagctgca gggccagcca gagcgtgagc agctacctgg cctggtacca gcagaagccc ggacaggccc ctaggctgct gatctacgat gccagcaaca gagccaccgg catccctgct aggttcagcg gttctggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctggagcct gaggacttcg ctgtctacta ctgccagcag aggagcaact ggtatacctt cggccaggga accaagctgg agatcaag
ＤＧ０８ ＳＣＦＶ（配列番号：２０８）
atggaatgga cctgggtgtt cctgttcctg ctcagcgtga ccgccggagt gcactcccag gtgcagctgg tgcagagcgg cgccgaagtg aaaaagcccg gcgccagcgt gagactctcc tgtagagcca gcggctacaa cttcatcgac ttccacatcc actgggtgag acaggcccct ggagagggcc tggagtggat gggctggagc aacccccaga gcggcaatag cagcagcgcc cagaggttcc agggcagagt gaccatgacc accgatacct ccatgagcgc cgcctacatg gacctgaact ggctgaccct ggacgacacc gccgtgtact actgcaccag gcctcacgac ggcgctggca actacaggtt cgacacctgg ggacagggaa ccctggtgac agtcagcagc gcgggaggtg gtggtagcgg tggtgggggt tccggtggag gtggcagttc atatgagctt acacaacccc caagtgtgag cgtggctcct ggccagacag ccaggatcac ctgcagcgga gacgccctgc ccaaacacta cgcccactgg tatcagcaga aacccggcca ggtgcccatc gtggtgatct acaaggacac cgagagacct agcggcatcc ccgagagatt cagcggcagc accagcggca ccacagtcac cctgaccatc tccggcgtgc aggccgagga tgaagcccac tactactgcc aaagcgccga cgtgtcctcc acctatgtgg tgttcggcgg cggcaccaag ctgaccgtcc tc
ＤＧ０９ ＳＣＦＶ（配列番号：２０９）
atggagtgga cttgggtatt cctgtttttg ttgtccgtaa ctgctggggt acactcagag gtgcagctgg tagagtctgg aggggggctc gtcgaaccag gcggctctct caggctttcc tgtgccgtaa gcgggtttga ttttgagaaa gcatggatgt cctgggtaag gcaagctcca gggcagggac tccagtgggt agcgcggata aagtcaacag ctgatggcgg aaccacctct tatgcagcac cggttgaggg aaggttcatc atctcacgag acgattcccg caacatgttg tatctgcaga tgaacagttt gaaaactgaa gacacagctg tttactactg tacttcagcg cattggggac agggtactct tgtgacggtc tctagcgccg gggggggagg ctctggaggg gggggttcag ggggtggtgg cagctcctat gagctgactc aaccgccttc agtaagcgta agccctggtc agaccgctag aataacctgt agtggagagg ccctgccgat gcaattcgcc cactggtatc agcagaggcc tggaaaagcc ccagtgattg tcgtttacaa agattccgaa cgccctagcg gggttcccga acgctttagc ggtagttcaa gcgggacaac agcaaccctt acgataaccg gtgtacaagc ggaagacgaa gcggattact attgccaatc acctgatagt acaaatactt atgaggtatt tggcggggga acgaagttga ctgtactg
ＤＧ１０ ＳＣＦＶ（配列番号：２１０）
atggaatgga cctgggtgtt cctcttcctc ctgtccgtca ccgctggcgt gcacagccag gtgcagctgg tccagagcgg agccgaggtg aaaaagcccg gcgcctccgt gaaggtcagc tgcaaggcct ccggctacac cttcaccaac tacgccatgc actgggtgag acaggcccct ggccagagac tggagtggat gggctggatc aacgccggca acggcaagag aaagtacagc cagaagtttc aggacagggt gaccatcaac agggacacca gcgcctccac catctacatg gagctgtcca gcctgggcag cgaggatacc gccgtgtact actgtgccag agaggaggat cacgctggca gcggcagcta cctgagcatg gacgtctggg gacagggcag caccgtgaca gtgagcagcg ctggaggcgg cggctccggc ggcggaggaa gcggaggcgg aggctccgac atcgtgatga cccagtcccc cgatagcctg gctgtgagcc tgggcgagag ggccacaatc aactgtaaga gcagccagaa cgtgctgtac tcctccaaca acaagaacta cctggcctgg taccagcaga aacctggcca tccccccaag ctgctgatct actgggccag caccagggag agcggagtgc ctgacaggtt tagcggcagc ggcagcggca cagactttac cctgaccatc acctccctgc agaccgagga cgtggccgtg tactattgcc agcagtacta cagctcccct ctgaccttcg gcggcggcac caaagtggag atcaaa
ＤＧ１１ ＳＣＦＶ（配列番号：２１１）
atggagtgga cttgggtatt ccttttcctc ctctccgtga cagcgggtgt gcactctgaa gtacaacttg tagagaccgg tgggggattg gtgcaaccca agggttccct gaaactctca tgtgctacct ctggttttac tttcaacacc tatgcaatga attgggttag gcaagcaccc ggtaaaggac ttgagtgggt ggcacggata cgcactaaga gtaatgacta tgctacgtac tacgcagact ccgtaaaagg ccggatcacc atatctcgag acgatagcca gtctatgctg tatcttcaaa tgaacaacct caaaacggaa gatacggcga tgtattactg cgtgcgagtt ggttataggc cttatgctat ggattactgg ggacagggca cgtctgtcac ggtaagttct gccggagggg ggggcagcgg aggaggagga tctggcggag ggggctccga tgtccttatg acacagactc ccctcagttt gcccgtgtcc ttgggggacc aggcttctat atcatgccgc agttcccaaa atatcgtcca ttcaaatggc aatacttacc ttgagtggta tttgcagaag cctggacaga gcccgacgct tctgatctat aaggtaagca acaggttcag tggtgtaccc gacagattta gtggaagtgg gtccggaact gatttcactc ttaagattag tcgggtagag gctgaagacc ttggggtgta ttattgcttt caagggagtc acgtccctct tacatttggt gctgggacta agttggagct gaag
４－１ＢＢ共刺激ドメイン（配列番号：２１２）
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt gaactg
（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配列番号：２１３）
ggcggaggcg gatcaggagg aggaggatca ggcggaggag gatca
Ｔ２Ａ（配列番号：２１４）
agagccaaaa ggtctggctc cggtgagggc agaggaagtc ttataacatg cggtgacgtg gaggagaatc ccggccct
Ｐ２Ａ（配列番号：２１５）
agagccaaaa ggtccggaag cggcgccacc aacttcagcc tgctgaagca ggccggcgac gtggaagaga atcctggccc c
ＣＤ３Ｚ（配列番号：２１６）
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc
ＤＧ０１．２８．Ｚ ＣＡＲ（配列番号：２２０）
atggaatgga cctgggtgtt cctgtttctg ctgtccgtga ccgctggcgt gcacagccag gtgcagctgg tggaaagcgg cggaggagtc gtgcagcctg gcagaagcct gaggctgagc tgtgccgcca gcggcttcgc cttcagctcc tacggcatgc actgggtgag acaggcccct ggcaagggac tggagtgggt ggctgtgatc tggttcgacg gcaccaagaa gtactacacc gacagcgtca agggcaggtt caccatctcc agggacaata gcaagaatac cctgtacctc caaatgaaca ccctgagggc cgaggacacc gccgtgtatt actgcgccag ggatagggga atcggcgcca ggagaggccc ctactacatg gacgtgtggg gcaagggcac aacagtgacc gtttcttctg ctggaggagg aggttctgga ggaggaggaa gcggaggagg aggctccgac atccagatga cacagtcccc cagctccctg tccgccagcg tgggcgatag agtgaccatc acctgcaggg ccagccagag catctccagc tacctgaact ggtatcaaca gaagcccggc aaagccccca aactgctgat ctacgctgcc agcagcctgc agagcggcgt gccttccaga ttcagcggct ccggcagcgg caccgatttc acactgacca tctccagcct gcagcccgag gacttcgcca cctactactg ccagcagagc tacagcaccc ccctgacctt tggcggaggc accaaggtgg agatcaaagc tagcgtgaaa gggaaacacc tttgtccaag tcccctattt cccggacctt ctaagccctt ttgggtgctg gtggtggttg gtggagtcct ggcttgctat agcttgctag taacagtggc ctttattatt ttctgggtga ggagtaagag gagcaggctc ctgcacagtg actacatgaa catgactccc cgccgccccg ggcccacccg caagcattac cagccctatg ccccaccacg cgacttcgca gcctatcgct ccaagcttag agtgaagttc agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag cagggccaga accagctcta taacgagctc aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag atggggggaa agccgagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa gataagatgg cggaggccta cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt acagccacca aggacaccta cgacgccctt cacatgcagg ccctgccccc t
ＤＧ０２．２８．Ｚ ＣＡＲ（配列番号：２２１）
atggaatgga cctgggtgtt tctgttcctg ctgagcgtga cagccggcgt gcacagcgag gtgcagctgc tggagagcgg aggaggactg gtgcaacccg gcggaagcct cagactgagc tgtgccgcca gcggcttcac cttcagcaac tatggcatga gctgggtgag gcaggcccct ggcaaaggcc tcgaatgggt ggcttccatt aggagcggcg gcggcaggac ctattacagc gacaacgtga agggcaggtt caccatctcc agggacaata gcaagaacac cctgtacctg cagatgaact ccctgagggc cgaggatacc gccgtgtact actgcgtgag gtacgaccac tacagcggct ccagcgacta ttggggacag ggcaccctgg tgacagtgtc cagcgccgga ggaggcggca gcggcggcgg cggcagcggc ggcggcggaa gcgatgtggt gatgacccag tcccccctga gcctgcctgt gacacctgga gagcccgcca gcatcagctg taagagcagc cagagcctcc tggacagcga cggcaaaacc tacctgaact ggctcctgca gaagcccgga caaagccccc agaggctgat ctacctggtg agcaaactgg acagcggcgt gcctgacaga ttctccggct ccggcagcgg caccgacttc acactgaaga tcagcagagt ggaggctgag gacgtgggcg tctactactg ctggcagggc acccacttcc ccaggacctt cggccaggga accaaggtgg agatcaaggc tagcgtgaaa gggaaacacc tttgtccaag tcccctattt cccggacctt ctaagccctt ttgggtgctg gtggtggttg gtggagtcct ggcttgctat agcttgctag taacagtggc ctttattatt ttctgggtga ggagtaagag gagcaggctc ctgcacagtg actacatgaa catgactccc cgccgccccg ggcccacccg caagcattac cagccctatg ccccaccacg cgacttcgca gcctatcgct ccaagcttag agtgaagttc agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag cagggccaga accagctcta taacgagctc aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag atggggggaa agccgagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa gataagatgg cggaggccta cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt acagccacca aggacaccta cgacgccctt cacatgcagg ccctgccccc t
ＤＧ０３．２８．Ｚ ＣＡＲ（配列番号：２２２）
atggaatgga cctgggtgtt cctgtttctg ctctccgtga ccgccggagt gcacagcgag gtgcagctgg tcgaaagcgg cggaggactg gtgcagcctg gcggcagcct gagactgagc tgtgccgcct ccggcttcac ctttagcagc tacggaatgt cctgggtgag acaggctcct ggcaagggcc tggaactggt ggccagcatc aatagcaacg gcggcagcac ctactaccct gatagcgtga agggcaggtt caccatctcc agggacaacg ccaagaacag cctgtacctg cagatgaaca gcctcagggc cgaggacaca gccgtgtact actgcgccag cggcgactat tggggacagg gaacaaccgt gaccgtcagc agcgccggcg gcggcggcag cggcggcggc ggcagcggcg gcggcggctc cgatatcgtg atgacccaga gccccctgtc cctgcctgtc acacctggcg aacccgccag cattagctgc aggtccagcc agagcctggt gtacagcaat ggcgacacct acctgcactg gtacctgcag aagcctggcc agagccccca gctgctgatc tacaaggtga gcaacaggtt ctccggagtg cctgacaggt tcagcggctc cggcagcgga accgatttca ccctcaagat cagcagagtg gaggccgagg acgtgggcgt ctactattgt agccagagca cccacgtgcc ctggaccttt ggccagggca ccaaggtgga gatcaaagct agcgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagcccttt tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc caagcttaga gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct
ＤＧ０４．２８．Ｚ ＣＡＲ（配列番号：２２３）
atggaatgga cctgggtgtt tctgttcctc ctgagcgtga ccgccggagt gcacagccaa gtggagctgg tggagagcgg aggaggactg gtgcagcctg gaggctccct gaggctgagc tgtgctgcca gcggcttcac cttcagctcc tatgctatga gctgggtgag acaggcccct ggcaaaggcc tggagtgggt gagcgccatc aacgcctccg gcaccaggac ctactatgcc gactccgtga agggcaggtt caccatctcc agggacaaca gcaagaacac cctgtacctg cagatgaaca gcctgagggc tgaagacacc gccgtgtact actgtgccag gggcaagggc aacacacaca agccctatgg ctacgtgaga tacttcgacg tgtggggaca gggcaccctg gtgacagtga gcagcgccgg aggaggaggt tctggaggag gaggaagcgg cggaggagga agcgacatcg tgctgacaca atcccccgcc acactgtccc tgtcccctgg cgagagggcc acactgagct gcagggccag ccagagcgtg tcctcctcct acctggcctg gtaccagcag aaacctggcc aggcccccag gctgctgatc tatggcgcca gcagcagagc cacaggagtg cctgccagat ttagcggcag cggcagcggc accgacttta ccctgaccat ttccagcctg gagcccgagg acttcgccac ctactactgc ctgcagatct acaacatgcc tatcaccttc ggccagggca caaaagtgga aatcaaggct agcgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagcccttt tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc caagcttaga gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct
ＤＧ０５．２８．Ｚ ＣＡＲ（配列番号：２２４）
atggaatgga cctgggtgtt tctgttcctc ctgtccgtga ccgccggagt gcactccgaa gtgcagctgg tgcagtccgg cggaggactg gtgaaacccg gaggaagcct cagactgagc tgcgccggca gcggctttac cttctccagc tactccatgc actggctgag acaggcccct ggcaagggcc tggaatgggt cagcgccatc ggcaccgccg gaggcacata ctatgccgac agcgtgaagg gcaggttcac catcagcagg gacaacgcca agaacagcct gtacctgcag atgaactctc tgagggccga ggataccgct gtgtactact gcgccaggga gtacttcttt ggcagcggca actacggata ctggggccag ggcaccctgg tgacagtgag ctccgccgga ggaggaggaa gcggaggagg cggaagcgga ggaggcggca gcgaaatcgt gctgacccag agccctgcca ccctgagcct gagccctggc gaaagggcca ccctgagctg cagagccagc cagagcgtga gcagctacct ggcctggtac cagcagaagc ccggacaggc ccccagactg ctgatctacg acgccagcaa cagagccacc ggcattcccg ccagattctc cggcagcggc agcggaaccg acttcacact gaccatcagc tccttagaac ccgaggactt cgccgtgtac tactgtcagc agagaagcaa ctggcctccc accttcggcc agggcacaaa ggtggagatc aaggctagcg tgaaagggaa acacctttgt ccaagtcccc tatttcccgg accttctaag cccttttggg tgctggtggt ggttggtgga gtcctggctt gctatagctt gctagtaaca gtggccttta ttattttctg ggtgaggagt aagaggagca ggctcctgca cagtgactac atgaacatga ctccccgccg ccccgggccc acccgcaagc attaccagcc ctatgcccca ccacgcgact tcgcagccta tcgctccaag cttagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccct
ＤＧ０６．２８．Ｚ ＣＡＲ（配列番号：２２５）
atggaatgga cctgggtgtt cctgttcctc ctgagcgtga ccgctggcgt ccacagccag gtgcagctgg tggaaagcgg aggcggagtg gtgcagcctg gaaggtccct cagactgagc tgcgctgcca gcggcttcac cttcagcaac tacggcatcc actgggtgag acaagccccc ggcaaaggcc tggagtgggt ggccatcatc tggcacgacg gcagcaactc ctactacgtg gactccgtga agggcaggtt cacaatcagc agagacaaca gcaagaatac cctgtacctg cagatgaaca gcctcagggc cgaagatacc gccgtgtact tctgcgccag gatcatcggc ggcgcctttg acatttgggg ccaaggcact atggttaccg tgagcagcgc tggcggaggc ggcagcggcg gcggcggcag cggcggcggc ggaagcgaca tccagatgac ccagagccct tccagcctca gcgcctccgt gggagacaga gtgaccatca cctgcagggc cagccagggc atctccagct ggctggcctg gtaccagcag aagcctgaga aagcccccaa gagcctgatc tacgctgcct ccagcctgca gtccggcgtg ccttccagat tctccggcag cggcagcggc accgacttta ccctgaccat ttccagcctg caacccgagg acttcgccac ctactactgc cagcagtaca acagctaccc catcaccttt ggccagggca ccagactgga gatcaaggct agcgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagcccttt tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc caagcttaga gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct
ＤＧ０７．２８．Ｚ ＣＡＲ（配列番号：２２６）
atggaatgga cctgggtgtt cctgttcctg ctgtccgtga ccgccggagt ccacagcgag gtgcagctgg tggaaagcgg cggaggactg gtgcagcctg gaggcagcct gaggctgagc tgtgctgcca gcggcttctc catcagcggc tactggatgt cctgggtgag gcaggcccct ggaaagggct tagaatgggt ggccaacatc aaacaggacg gcggcgagaa gtactacgga gacagcgtca agggcagatt caccatcagc agggacaacg ccaagaacag cctgtacctg cagatgaaca gcctgagggc cgaggacacc gctgtgtact actgcgtgat ggccggaggc ctggattatt ggggccaggg cacactggtg acagtgagca gcgccggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc gagatcgtgc tgacccagag ccctgccaca ctgagcctga gccccggcga aagagccacc ctcagctgca gggccagcca gagcgtgagc agctacctgg cctggtacca gcagaagccc ggacaggccc ctaggctgct gatctacgat gccagcaaca gagccaccgg catccctgct aggttcagcg gttctggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctggagcct gaggacttcg ctgtctacta ctgccagcag aggagcaact ggtatacctt cggccaggga accaagctgg agatcaaggc tagcgtgaaa gggaaacacc tttgtccaag tcccctattt cccggacctt ctaagccctt ttgggtgctg gtggtggttg gtggagtcct ggcttgctat agcttgctag taacagtggc ctttattatt ttctgggtga ggagtaagag gagcaggctc ctgcacagtg actacatgaa catgactccc cgccgccccg ggcccacccg caagcattac cagccctatg ccccaccacg cgacttcgca gcctatcgct ccaagcttag agtgaagttc agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag cagggccaga accagctcta taacgagctc aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag atggggggaa agccgagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa gataagatgg cggaggccta cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt acagccacca aggacaccta cgacgccctt cacatgcagg ccctgccccc t
ＤＧ０８．２８．Ｚ ＣＡＲ（配列番号：２２７）
atggaatgga cctgggtgtt cctgttcctg ctcagcgtga ccgccggagt gcactcccag gtgcagctgg tgcagagcgg cgccgaagtg aaaaagcccg gcgccagcgt gagactctcc tgtagagcca gcggctacaa cttcatcgac ttccacatcc actgggtgag acaggcccct ggagagggcc tggagtggat gggctggagc aacccccaga gcggcaatag cagcagcgcc cagaggttcc agggcagagt gaccatgacc accgatacct ccatgagcgc cgcctacatg gacctgaact ggctgaccct ggacgacacc gccgtgtact actgcaccag gcctcacgac ggcgctggca actacaggtt cgacacctgg ggacagggaa ccctggtgac agtcagcagc gcgggaggtg gtggtagcgg tggtgggggt tccggtggag gtggcagttc atatgagctt acacaacccc caagtgtgag cgtggctcct ggccagacag ccaggatcac ctgcagcgga gacgccctgc ccaaacacta cgcccactgg tatcagcaga aacccggcca ggtgcccatc gtggtgatct acaaggacac cgagagacct agcggcatcc ccgagagatt cagcggcagc accagcggca ccacagtcac cctgaccatc tccggcgtgc aggccgagga tgaagcccac tactactgcc aaagcgccga cgtgtcctcc acctatgtgg tgttcggcgg cggcaccaag ctgaccgtcc tcgctagcgt gaaagggaaa cacctttgtc caagtcccct atttcccgga ccttctaagc ccttttgggt gctggtggtg gttggtggag tcctggcttg ctatagcttg ctagtaacag tggcctttat tattttctgg gtgaggagta agaggagcag gctcctgcac agtgactaca tgaacatgac tccccgccgc cccgggccca cccgcaagca ttaccagccc tatgccccac cacgcgactt cgcagcctat cgctccaagc ttagagtgaa gttcagcagg agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg caggccctgc cccct
ＤＧ０９．２８．Ｚ ＣＡＲ（配列番号：２２８）
atggagtgga cttgggtatt cctgtttttg ttgtccgtaa ctgctggggt acactcagag gtgcagctgg tagagtctgg aggggggctc gtcgaaccag gcggctctct caggctttcc tgtgccgtaa gcgggtttga ttttgagaaa gcatggatgt cctgggtaag gcaagctcca gggcagggac tccagtgggt agcgcggata aagtcaacag ctgatggcgg aaccacctct tatgcagcac cggttgaggg aaggttcatc atctcacgag acgattcccg caacatgttg tatctgcaga tgaacagttt gaaaactgaa gacacagctg tttactactg tacttcagcg cattggggac agggtactct tgtgacggtc tctagcgccg gggggggagg ctctggaggg gggggttcag ggggtggtgg cagctcctat gagctgactc aaccgccttc agtaagcgta agccctggtc agaccgctag aataacctgt agtggagagg ccctgccgat gcaattcgcc cactggtatc agcagaggcc tggaaaagcc ccagtgattg tcgtttacaa agattccgaa cgccctagcg gggttcccga acgctttagc ggtagttcaa gcgggacaac agcaaccctt acgataaccg gtgtacaagc ggaagacgaa gcggattact attgccaatc acctgatagt acaaatactt atgaggtatt tggcggggga acgaagttga ctgtactggc tagcgtgaaa gggaaacacc tttgtccaag tcccctattt cccggacctt ctaagccctt ttgggtgctg gtggtggttg gtggagtcct ggcttgctat agcttgctag taacagtggc ctttattatt ttctgggtga ggagtaagag gagcaggctc ctgcacagtg actacatgaa catgactccc cgccgccccg ggcccacccg caagcattac cagccctatg ccccaccacg cgacttcgca gcctatcgct ccaagcttag agtgaagttc agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag cagggccaga accagctcta taacgagctc aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag atggggggaa agccgagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa gataagatgg cggaggccta cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt acagccacca aggacaccta cgacgccctt cacatgcagg ccctgccccc t
ＤＧ１０．２８．Ｚ ＣＡＲ（配列番号：２２９）
atggaatgga cctgggtgtt cctcttcctc ctgtccgtca ccgctggcgt gcacagccag gtgcagctgg tccagagcgg agccgaggtg aaaaagcccg gcgcctccgt gaaggtcagc tgcaaggcct ccggctacac cttcaccaac tacgccatgc actgggtgag acaggcccct ggccagagac tggagtggat gggctggatc aacgccggca acggcaagag aaagtacagc cagaagtttc aggacagggt gaccatcaac agggacacca gcgcctccac catctacatg gagctgtcca gcctgggcag cgaggatacc gccgtgtact actgtgccag agaggaggat cacgctggca gcggcagcta cctgagcatg gacgtctggg gacagggcag caccgtgaca gtgagcagcg ctggaggcgg cggctccggc ggcggaggaa gcggaggcgg aggctccgac atcgtgatga cccagtcccc cgatagcctg gctgtgagcc tgggcgagag ggccacaatc aactgtaaga gcagccagaa cgtgctgtac tcctccaaca acaagaacta cctggcctgg taccagcaga aacctggcca tccccccaag ctgctgatct actgggccag caccagggag agcggagtgc ctgacaggtt tagcggcagc ggcagcggca cagactttac cctgaccatc acctccctgc agaccgagga cgtggccgtg tactattgcc agcagtacta cagctcccct ctgaccttcg gcggcggcac caaagtggag atcaaagcta gcgtgaaagg gaaacacctt tgtccaagtc ccctatttcc cggaccttct aagccctttt gggtgctggt ggtggttggt ggagtcctgg cttgctatag cttgctagta acagtggcct ttattatttt ctgggtgagg agtaagagga gcaggctcct gcacagtgac tacatgaaca tgactccccg ccgccccggg cccacccgca agcattacca gccctatgcc ccaccacgcg acttcgcagc ctatcgctcc aagcttagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag gacacctacg acgcccttca catgcaggcc ctgccccct
ＤＧ１１．２８．Ｚ ＣＡＲ（配列番号：２３０）
atggagtgga cttgggtatt ccttttcctc ctctccgtga cagcgggtgt gcactctgaa gtacaacttg tagagaccgg tgggggattg gtgcaaccca agggttccct gaaactctca tgtgctacct ctggttttac tttcaacacc tatgcaatga attgggttag gcaagcaccc ggtaaaggac ttgagtgggt ggcacggata cgcactaaga gtaatgacta tgctacgtac tacgcagact ccgtaaaagg ccggatcacc atatctcgag acgatagcca gtctatgctg tatcttcaaa tgaacaacct caaaacggaa gatacggcga tgtattactg cgtgcgagtt ggttataggc cttatgctat ggattactgg ggacagggca cgtctgtcac ggtaagttct gccggagggg ggggcagcgg aggaggagga tctggcggag ggggctccga tgtccttatg acacagactc ccctcagttt gcccgtgtcc ttgggggacc aggcttctat atcatgccgc agttcccaaa atatcgtcca ttcaaatggc aatacttacc ttgagtggta tttgcagaag cctggacaga gcccgacgct tctgatctat aaggtaagca acaggttcag tggtgtaccc gacagattta gtggaagtgg gtccggaact gatttcactc ttaagattag tcgggtagag gctgaagacc ttggggtgta ttattgcttt caagggagtc acgtccctct tacatttggt gctgggacta agttggagct gaaggctagc gtgaaaggga aacacctttg tccaagtccc ctatttcccg gaccttctaa gcccttttgg gtgctggtgg tggttggtgg agtcctggct tgctatagct tgctagtaac agtggccttt attattttct gggtgaggag taagaggagc aggctcctgc acagtgacta catgaacatg actccccgcc gccccgggcc cacccgcaag cattaccagc cctatgcccc accacgcgac ttcgcagcct atcgctccaa gcttagagtg aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg taccagcagg gccagaacca gctctataac gagctcaatc taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagagacg tggccgggac cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac gcccttcaca tgcaggccct gccccct
シグナル伝達シーケンス（配列番号：２３１）
atggaatgga cctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccac
ヒトＣＤ２８ヒンジ（配列番号：２３２）
gtgaaaggga aacacctttg tccaagtccc ctatttcccg gaccttctaa gccc
マウスＣＤ２８ヒンジ（配列番号：２３３）
ataaaagaga aacatctttg tcatactcag tcatctccta agctg
ヒトＣＤ８Ａヒンジ（配列番号：２３４）
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg gacttcgcct gtgat
ヒトＤＡＰ１０ヒンジ（配列番号：２３５）
cagacgaccc caggagagag atcatcactc cctgcctttt accctggcac ttcaggctcc tgttccggat gtgggtccct ctctctgccg
ヒトＣＤ２８ ＴＭ（配列番号：２３６）
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg gcctttatta ttttctgggt g
マウスＣＤ２８ ＴＭ（配列番号：２３７）
ttttgggcac tggtcgtggt tgctggagtc ctgttttgtt atggcttgct agtgacagtg gctctttgtg ttatctggac a
ヒトＣＤ８Ａ ＴＭ（配列番号：２３８）
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc accctttact gc
ヒトＤＡＰ１０ ＴＭ（配列番号：２３９）
ctcctggcag gcctcgtggc tgctgatgcg gtggcatcgc tgctcatcgt gggggcggtg ttc
ＤＧ０５－ＣＤ２８ｔｍ－ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ（配列番号：２４０）
ATGGAATGGACCTGGGTGTTTCTGTTCCTCCTGTCCGTGACCGCCGGAGTGCACTCCGAAGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGGAGGACTGGTGAAACCCGGAGGAAGCCTCAGACTGAGCTGCGCCGGCAGCGGCTTTACCTTCTCCAGCTACTCCATGCACTGGCTGAGACAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGGTCAGCGCCATCGGCACCGCCGGAGGCACATACTATGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACTCTCTGAGGGCCGAGGATACCGCTGTGTACTACTGCGCCAGGGAGTACTTCTTTGGCAGCGGCAACTACGGATACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGAGCTCCGCCGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGCGGAAGCGGAGGAGGCGGCAGCGAAATCGTGCTGACCCAGAGCCCTGCCACCCTGAGCCTGAGCCCTGGCGAAAGGGCCACCCTGAGCTGCAGAGCCAGCCAGAGCGTGAGCAGCTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGACAGGCCCCCAGACTGCTGATCTACGACGCCAGCAACAGAGCCACCGGCATTCCCGCCAGATTCTCCGGCAGCGGCAGCGGAACCGACTTCACACTGACCATCAGCTCCTTAGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGTCAGCAGAGAAGCAACTGGCCTCCCACCTTCGGCCAGGGCACAAAGGTGGAGATCAAGGCTAGCGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCCTGTGCGCACGCCCACGCCGCAGCCCCGCCCAAGAAGATGGCAAAGTCTACATCAACATGCCAGGCAGGGGCAAGCTTAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
ＤＧ０５－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ４４－ＣＤ３ζ（配列番号：２４１）
ATGGAATGGACCTGGGTGTTTCTGTTCCTCCTGTCCGTGACCGCCGGAGTGCACTCCGAAGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGGAGGACTGGTGAAACCCGGAGGAAGCCTCAGACTGAGCTGCGCCGGCAGCGGCTTTACCTTCTCCAGCTACTCCATGCACTGGCTGAGACAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGGTCAGCGCCATCGGCACCGCCGGAGGCACATACTATGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACTCTCTGAGGGCCGAGGATACCGCTGTGTACTACTGCGCCAGGGAGTACTTCTTTGGCAGCGGCAACTACGGATACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGAGCTCCGCCGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGCGGAAGCGGAGGAGGCGGCAGCGAAATCGTGCTGACCCAGAGCCCTGCCACCCTGAGCCTGAGCCCTGGCGAAAGGGCCACCCTGAGCTGCAGAGCCAGCCAGAGCGTGAGCAGCTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGACAGGCCCCCAGACTGCTGATCTACGACGCCAGCAACAGAGCCACCGGCATTCCCGCCAGATTCTCCGGCAGCGGCAGCGGAACCGACTTCACACTGACCATCAGCTCCTTAGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGTCAGCAGAGAAGCAACTGGCCTCCCACCTTCGGCCAGGGCACAAAGGTGGAGATCAAGGCTAGCGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGTCGAAGAAGGTGTGGGCAGAAGAAAAAGCTAGTGATCAACAGTGGCAATGGAGCTGTGGAGGACAGAAAGCCAAGTGGACTCAACGGAGAGGCCAGCAAGTCTCAGGAAATGGTGCATTTGGTGAACAAGGAGTCGTCAGAAACTCCAGACCAGTTTATGACAGCTGATGAGACAAGGAACCTGCAGAATGTGGACATGAAGATTGGGGTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
ＤＧ０５－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ３ζ（配列番号：２４２）
ATGGAATGGACCTGGGTGTTTCTGTTCCTCCTGTCCGTGACCGCCGGAGTGCACTCCGAAGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGGAGGACTGGTGAAACCCGGAGGAAGCCTCAGACTGAGCTGCGCCGGCAGCGGCTTTACCTTCTCCAGCTACTCCATGCACTGGCTGAGACAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGGTCAGCGCCATCGGCACCGCCGGAGGCACATACTATGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACTCTCTGAGGGCCGAGGATACCGCTGTGTACTACTGCGCCAGGGAGTACTTCTTTGGCAGCGGCAACTACGGATACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGAGCTCCGCCGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGCGGAAGCGGAGGAGGCGGCAGCGAAATCGTGCTGACCCAGAGCCCTGCCACCCTGAGCCTGAGCCCTGGCGAAAGGGCCACCCTGAGCTGCAGAGCCAGCCAGAGCGTGAGCAGCTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGACAGGCCCCCAGACTGCTGATCTACGACGCCAGCAACAGAGCCACCGGCATTCCCGCCAGATTCTCCGGCAGCGGCAGCGGAACCGACTTCACACTGACCATCAGCTCCTTAGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGTCAGCAGAGAAGCAACTGGCCTCCCACCTTCGGCCAGGGCACAAAGGTGGAGATCAAGGCTAGCGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
ＤＧ０５－ＣＤ２８（配列番号：２４３）
ATGGAATGGACCTGGGTGTTTCTGTTCCTCCTGTCCGTGACCGCCGGAGTGCACTCCGAAGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGGAGGACTGGTGAAACCCGGAGGAAGCCTCAGACTGAGCTGCGCCGGCAGCGGCTTTACCTTCTCCAGCTACTCCATGCACTGGCTGAGACAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGGTCAGCGCCATCGGCACCGCCGGAGGCACATACTATGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACTCTCTGAGGGCCGAGGATACCGCTGTGTACTACTGCGCCAGGGAGTACTTCTTTGGCAGCGGCAACTACGGATACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGAGCTCCGCCGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGCGGAAGCGGAGGAGGCGGCAGCGAAATCGTGCTGACCCAGAGCCCTGCCACCCTGAGCCTGAGCCCTGGCGAAAGGGCCACCCTGAGCTGCAGAGCCAGCCAGAGCGTGAGCAGCTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGACAGGCCCCCAGACTGCTGATCTACGACGCCAGCAACAGAGCCACCGGCATTCCCGCCAGATTCTCCGGCAGCGGCAGCGGAACCGACTTCACACTGACCATCAGCTCCTTAGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGTCAGCAGAGAAGCAACTGGCCTCCCACCTTCGGCCAGGGCACAAAGGTGGAGATCAAGGCTAGCGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC
ＤＧ０５－ＣＤ２８ｔｍ（配列番号：２４４）
ATGGAATGGACCTGGGTGTTTCTGTTCCTCCTGTCCGTGACCGCCGGAGTGCACTCCGAAGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGGAGGACTGGTGAAACCCGGAGGAAGCCTCAGACTGAGCTGCGCCGGCAGCGGCTTTACCTTCTCCAGCTACTCCATGCACTGGCTGAGACAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGGTCAGCGCCATCGGCACCGCCGGAGGCACATACTATGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACTCTCTGAGGGCCGAGGATACCGCTGTGTACTACTGCGCCAGGGAGTACTTCTTTGGCAGCGGCAACTACGGATACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGAGCTCCGCCGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGCGGAAGCGGAGGAGGCGGCAGCGAAATCGTGCTGACCCAGAGCCCTGCCACCCTGAGCCTGAGCCCTGGCGAAAGGGCCACCCTGAGCTGCAGAGCCAGCCAGAGCGTGAGCAGCTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGACAGGCCCCCAGACTGCTGATCTACGACGCCAGCAACAGAGCCACCGGCATTCCCGCCAGATTCTCCGGCAGCGGCAGCGGAACCGACTTCACACTGACCATCAGCTCCTTAGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGTCAGCAGAGAAGCAACTGGCCTCCCACCTTCGGCCAGGGCACAAAGGTGGAGATCAAGGCTAGCGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGAC
ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ－ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ（配列番号：２４５）
ATGGAATGGACCTGGGTGTTCCTGTTTCTGCTCTCCGTGACCGCCGGAGTGCACAGCGAGGTGCAGCTGGTCGAAAGCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCTCCGGCTTCACCTTTAGCAGCTACGGAATGTCCTGGGTGAGACAGGCTCCTGGCAAGGGCCTGGAACTGGTGGCCAGCATCAATAGCAACGGCGGCAGCACCTACTACCCTGATAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTCAGGGCCGAGGACACAGCCGTGTACTACTGCGCCAGCGGCGACTATTGGGGACAGGGAACAACCGTGACCGTCAGCAGCGCCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCTCCGATATCGTGATGACCCAGAGCCCCCTGTCCCTGCCTGTCACACCTGGCGAACCCGCCAGCATTAGCTGCAGGTCCAGCCAGAGCCTGGTGTACAGCAATGGCGACACCTACCTGCACTGGTACCTGCAGAAGCCTGGCCAGAGCCCCCAGCTGCTGATCTACAAGGTGAGCAACAGGTTCTCCGGAGTGCCTGACAGGTTCAGCGGCTCCGGCAGCGGAACCGATTTCACCCTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTCTACTATTGTAGCCAGAGCACCCACGTGCCCTGGACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAAGCTAGCGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCCTGTGCGCACGCCCACGCCGCAGCCCCGCCCAAGAAGATGGCAAAGTCTACATCAACATGCCAGGCAGGGGCAAGCTTAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ４４－ＣＤ３ζ（配列番号：２４６）
ATGGAATGGACCTGGGTGTTCCTGTTTCTGCTCTCCGTGACCGCCGGAGTGCACAGCGAGGTGCAGCTGGTCGAAAGCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCTCCGGCTTCACCTTTAGCAGCTACGGAATGTCCTGGGTGAGACAGGCTCCTGGCAAGGGCCTGGAACTGGTGGCCAGCATCAATAGCAACGGCGGCAGCACCTACTACCCTGATAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTCAGGGCCGAGGACACAGCCGTGTACTACTGCGCCAGCGGCGACTATTGGGGACAGGGAACAACCGTGACCGTCAGCAGCGCCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCTCCGATATCGTGATGACCCAGAGCCCCCTGTCCCTGCCTGTCACACCTGGCGAACCCGCCAGCATTAGCTGCAGGTCCAGCCAGAGCCTGGTGTACAGCAATGGCGACACCTACCTGCACTGGTACCTGCAGAAGCCTGGCCAGAGCCCCCAGCTGCTGATCTACAAGGTGAGCAACAGGTTCTCCGGAGTGCCTGACAGGTTCAGCGGCTCCGGCAGCGGAACCGATTTCACCCTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTCTACTATTGTAGCCAGAGCACCCACGTGCCCTGGACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAAGCTAGCGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGTCGAAGAAGGTGTGGGCAGAAGAAAAAGCTAGTGATCAACAGTGGCAATGGAGCTGTGGAGGACAGAAAGCCAAGTGGACTCAACGGAGAGGCCAGCAAGTCTCAGGAAATGGTGCATTTGGTGAACAAGGAGTCGTCAGAAACTCCAGACCAGTTTATGACAGCTGATGAGACAAGGAACCTGCAGAATGTGGACATGAAGATTGGGGTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ－４－１－ＢＢ－ＣＤ３ζ（配列番号：２４７）
ATGGAATGGACCTGGGTGTTCCTGTTTCTGCTCTCCGTGACCGCCGGAGTGCACAGCGAGGTGCAGCTGGTCGAAAGCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCTCCGGCTTCACCTTTAGCAGCTACGGAATGTCCTGGGTGAGACAGGCTCCTGGCAAGGGCCTGGAACTGGTGGCCAGCATCAATAGCAACGGCGGCAGCACCTACTACCCTGATAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTCAGGGCCGAGGACACAGCCGTGTACTACTGCGCCAGCGGCGACTATTGGGGACAGGGAACAACCGTGACCGTCAGCAGCGCCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCTCCGATATCGTGATGACCCAGAGCCCCCTGTCCCTGCCTGTCACACCTGGCGAACCCGCCAGCATTAGCTGCAGGTCCAGCCAGAGCCTGGTGTACAGCAATGGCGACACCTACCTGCACTGGTACCTGCAGAAGCCTGGCCAGAGCCCCCAGCTGCTGATCTACAAGGTGAGCAACAGGTTCTCCGGAGTGCCTGACAGGTTCAGCGGCTCCGGCAGCGGAACCGATTTCACCCTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTCTACTATTGTAGCCAGAGCACCCACGTGCCCTGGACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAAGCTAGCGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCCTCGAGAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAAGCTTAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ３ζ（配列番号：２４８）
ATGGAATGGACCTGGGTGTTCCTGTTTCTGCTCTCCGTGACCGCCGGAGTGCACAGCGAGGTGCAGCTGGTCGAAAGCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCTCCGGCTTCACCTTTAGCAGCTACGGAATGTCCTGGGTGAGACAGGCTCCTGGCAAGGGCCTGGAACTGGTGGCCAGCATCAATAGCAACGGCGGCAGCACCTACTACCCTGATAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTCAGGGCCGAGGACACAGCCGTGTACTACTGCGCCAGCGGCGACTATTGGGGACAGGGAACAACCGTGACCGTCAGCAGCGCCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCTCCGATATCGTGATGACCCAGAGCCCCCTGTCCCTGCCTGTCACACCTGGCGAACCCGCCAGCATTAGCTGCAGGTCCAGCCAGAGCCTGGTGTACAGCAATGGCGACACCTACCTGCACTGGTACCTGCAGAAGCCTGGCCAGAGCCCCCAGCTGCTGATCTACAAGGTGAGCAACAGGTTCTCCGGAGTGCCTGACAGGTTCAGCGGCTCCGGCAGCGGAACCGATTTCACCCTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTCTACTATTGTAGCCAGAGCACCCACGTGCCCTGGACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAAGCTAGCGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
ＤＧ０３－ＣＤ２８（配列番号：２４９）
ATGGAATGGACCTGGGTGTTCCTGTTTCTGCTCTCCGTGACCGCCGGAGTGCACAGCGAGGTGCAGCTGGTCGAAAGCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCTCCGGCTTCACCTTTAGCAGCTACGGAATGTCCTGGGTGAGACAGGCTCCTGGCAAGGGCCTGGAACTGGTGGCCAGCATCAATAGCAACGGCGGCAGCACCTACTACCCTGATAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTCAGGGCCGAGGACACAGCCGTGTACTACTGCGCCAGCGGCGACTATTGGGGACAGGGAACAACCGTGACCGTCAGCAGCGCCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCTCCGATATCGTGATGACCCAGAGCCCCCTGTCCCTGCCTGTCACACCTGGCGAACCCGCCAGCATTAGCTGCAGGTCCAGCCAGAGCCTGGTGTACAGCAATGGCGACACCTACCTGCACTGGTACCTGCAGAAGCCTGGCCAGAGCCCCCAGCTGCTGATCTACAAGGTGAGCAACAGGTTCTCCGGAGTGCCTGACAGGTTCAGCGGCTCCGGCAGCGGAACCGATTTCACCCTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTCTACTATTGTAGCCAGAGCACCCACGTGCCCTGGACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAAGCTAGCGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC
ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ（配列番号：２５０）
ATGGAATGGACCTGGGTGTTCCTGTTTCTGCTCTCCGTGACCGCCGGAGTGCACAGCGAGGTGCAGCTGGTCGAAAGCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCTCCGGCTTCACCTTTAGCAGCTACGGAATGTCCTGGGTGAGACAGGCTCCTGGCAAGGGCCTGGAACTGGTGGCCAGCATCAATAGCAACGGCGGCAGCACCTACTACCCTGATAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTCAGGGCCGAGGACACAGCCGTGTACTACTGCGCCAGCGGCGACTATTGGGGACAGGGAACAACCGTGACCGTCAGCAGCGCCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCTCCGATATCGTGATGACCCAGAGCCCCCTGTCCCTGCCTGTCACACCTGGCGAACCCGCCAGCATTAGCTGCAGGTCCAGCCAGAGCCTGGTGTACAGCAATGGCGACACCTACCTGCACTGGTACCTGCAGAAGCCTGGCCAGAGCCCCCAGCTGCTGATCTACAAGGTGAGCAACAGGTTCTCCGGAGTGCCTGACAGGTTCAGCGGCTCCGGCAGCGGAACCGATTTCACCCTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTCTACTATTGTAGCCAGAGCACCCACGTGCCCTGGACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAAGCTAGCGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG
ＮＤＭＭ Ｎｒｆ２（Ｋｅａｐ１阻害剤ペプチド）発現用構成物（配列番号：２５１）
ATGATGGATTTGGAACTTCCCCCCCCAGGGCTCCCATCCCAACAAGACATGGATCTCATAGACATACTGTGGAGACAGGACATCGATCTGGGGGTCAGCCGCGAAGTTTTCGACTTTTCACAAAGGCGGAAAGAATATGAATTGGAAAAGCAGAAAAAATTGGAAAAAGAACGCCAGGAACAGCTTCAGAAGGAGCAGGAAAAAGCCTTTTTTGCCCAGCTTCAGCTGGACGAGGAAACAGGGGAATTTCTCCCCATCCAACCAGCCCAG
ＮＤＭＭヒトカタラーゼ発現用構成物（配列番号：２５２）
ATGGCAGACAGTCGAGACCCTGCTagcGACCAAATGCAACATTGGAAAGAGCAACGGGCGGCCCAGAAAGCCGACGTTTTGACCACTGGGGCAGGTAATCCTGTTGGAGATAAGCTGAACGTcATcACGGTTGGACCCCGGGGACCGCTGCTCGTTCAAGACGTGGTTTTTACGGATGAGATGGCCCATTTTGATCGAGAGAGGATACCAGAAAGGGTTGTGCACGCTAAGGGCGCAGGTGCCTTCGGATATTTCGAGGTAACTCACGACATTACTAAGTATAGCAAGGCCAAGGTATTTGAACACATTGGCAAGAAGACGCCGATAGCGGTCCGATTCAGTACAGTGGCGGGCGAGTCAGGTTCAGCCGATACCGTGAGAGATCCGAGAGGATTTGCCGTGAAATTTTATACAGAGGACGGCAACTGGGACTTGGTAGGAAACAATACCCCAATATTTTTCATAAGGGACCCAATCCTTTTTCCCAGCTTTATTCATTCACAGAAGCGGAACCCACAAACGCACTTGAAAGATCCTGACATGGTGTGGGATTTTTGGAGCTTGAGGCCAGAGAGCCTGCACCAAGTGAGCTTCTTGTTCAGCGACAGAGGCATACCGGACGGTCATAGACACATGAACGGTTACGGTAGTCACACCTTCAAACTGGTGAACGCCAACGGAGAGGCTGTCTATTGTAAGTTCCACTATAAAACCGATCAAGGCATCAAAAACCTGAGCGTAGAGGACGCAGCCCGCCTTTCTCAAGAAGATCCAGACTATGGGATCCGGGATCTCTTTAACGCCATAGCTACGGGTAAATATCCCTCTTGGACGTTCTATATCCAGGTAATGACATTCAATCAAGCAGAGACTTTCCCCTTTAACCCGTTTGACCTTACTAAAGTATGGCCGCATAAGGACTACCCTCTGATTCCCGTCGGCAAACTCGTGCTTAACAGGAATCCAGTCAACTATTTCGCAGAAGTCGAGCAAATCGCCTTTGACCCTTCTAACATGCCGCCGGGAATCGAAGCGTCACCGGACAAGATGCTTCAAGGTCGGCTTTTCGCATACCCCGACACTCACCGACACAGACTGGGTCCGAATTATCTTCACATACCTGTCAACTGCCCATATAGAGCACGCGTTGCGAACTACCAGCGCGATGGTCCGATGTGCATGCAGGACAACCAGGGGGGGGCACCCAACTATTATCCAAATTCATTTGGGGCGCCGGAACAACAACCGTCAGCCCTTGAACACTCCATCCAGTATTCTGGCGAAGTAAGACGCTTCAACACGGCTAATGATGACAACGTTACACAGGTTAGAGCGTTTTATGTGAACGTCTTGAACGAGGAACAACGGAAACGACTTTGCGAAAACATAGCGGGTCATTTGAAAGATGCTCAGATTTTTATCCAAAAAAAAGCCGTCAAAAATTTTACCGAAGTCCACCCCGATTACGGTTCACATATTCAGGCCCTGTTGGATAAGTACAACGCGGAAAAGCCCAAGAATGCAATACACACGTTTGTTCAGAGCGGGAGCCACCTCGCTGCTCGAGAGAAAGCAAATCTG
ＮＤＭＭ ＢＤＮＦ発現用構成物（配列番号：２５３）
ATGACGATCCTGTTTCTGACAATGGTGATTAGCTATTTCGGATGTATGAAAGCCGCCCCGATGAAGGAGGCCAATATCAGGGGACAAGGTGGGCTGGCTTATCCGGGCGTAAGGACACACGGCACACTGGAGAGTGTGAACGGCCCGAAGGCCGGATCACGAGGATTGACGAGCCTCGCAGATACGTTTGAGCATGTAATCGAAGAGCTCTTGGATGAAGACCAAAAGGTCCGCCCCAATGAGGAGAACAACAAAGACGCAGACCTGTACACATCACGAGTTATGCTGTCAAGTCAAGTGCCGCTCGAACCACCACTCCTCTTTCTGCTGGAGGAGTACAAAAACTATTTGGACGCTGCTAACATGTCTATGCGAGTGCGCAGACATAGTGACCCTGCCAGACGCGGTGAGCTTTCAGTCTGTGATTCTATAAGTGAGTGGGTAACCGCAGCAGATAAGAAGACTGCCGTAGACATGTCAGGGGGAACTGTGACTGTACTTGAAAAGGTTCCCGTTTCTAAAGGGCAGCTCAAACAGTATTTCTATGAAACAAAGTGTAATCCAATGGGGTACACCAAGGAAGGTTGCAGGGGAATCGACAAGCGACATTGGAACAGTCAATGTCGGACCACTCAGAGCTACGTCCGCGCTCTCACGATGGATAGTAAGAAACGCATCGGGTGGAGATTCATCAGAATCGACACCTCTTGCGTCTGTACTCTTACAATTAAGCGAGGGCGA
ＮＤＭＭ ＩＧＦ－１発現用構成物（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５４）
ATGGGGAAAATCTCCTCTCTCCCTACCCAGTTGTTCAAGTGTTGCTTTTGTGACTTCTTGAAGGTAAAAATGCACACTATGTCATCCAGTCACCTTTTTTATTTGGCTCTGTGCCTCCTCACATTCACCAGTTCAGCTACTGCCGGGCCTGAAACACTCTGCGGCGCCGAACTCGTTGATGCGCTTCAATTCGTGTGTGGAGATAGGGGGTTTTACTTTAACAAGCCGACGGGTTATGGTAGCTCAAGTAGACGAGCGCCACAGACTGGAATAGTAGATGAATGCTGTTTCCGCTCATGCGACCTTCGCAGATTGGAAATGTACTGCGCTCCTCTTAAACCAGCAAAGAGTGCGCGGTCCGTGCGAGCCCAACGACATACCGATATGCCAAAAACCCAGAAATATCAGCCGCCGTCTACCAACAAGAACACCAAGAGTCAGAGGAGAAAGGGTTGGCCCAAGACGCACCCGGGTGGCGAACAAAAAGAAGGTACTGAGGCAAGTTTGCAAATTCGAGGAAAGAAGAAAGAACAACGAAGAGAGATAGGTTCTCGCAATGCGGAATGTCGAGGCAAAAAAGGTAAG
フォワードプライマーヒトβ－アクチン（配列番号：２５５）
GGC CGA GGA CTT TGA TTG C
リバースプライマーヒトβ－アクチン（配列番号：２５６）
TGG GGT GGC TTT TAG GAT GG
フォワードプライマーヒトＩＬ－４（配列番号：２５７）
GCT TCC CCC TCT GTT CTT CC
リバースプライマーヒトＩＬ－４（配列番号：２５８）
GAT GTC TGT TAC GGT CAA CTC G
フォワードプライマーヒトＩＬ－１０（配列番号：２５９）
TCA AGG CGC ATG TGA ACT CC
リバースプライマーヒトＩＬ－１０（配列番号：２６０）
CAG GGA AGA AAT CGA TGA CAG C
付録Ａ -アミノ酸及び核酸配列
ＤＧ０１ ＳＣＦＶ（配列番号：１）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFAFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGTKKYYTDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNTLRAEDTAVYYCARDRGIGARRGPYYMDVWGKGTTVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK
ＤＧ０２ ＳＣＦＶ（配列番号：２）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMSWVRQAPGKGLEWVASIRSGGGRTYYSDNVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRYDHYSGSSDYWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQKPGQSPQRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPRTFGQGTKVEIK
ＤＧ０３ ＳＣＦＶ（配列番号：３）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLELVASINSNGGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGDYWGQGTTVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVYSNGDTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGQGTKVEIK
ＤＧ０４ ＳＣＦＶ（配列番号：４）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSQVELVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINASGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGKGNTHKPYGYVRYFDVWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCLQIYNMPITFGQGTKVEIK
ＤＧ０５ ＳＣＦＶ（配列番号：５）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAGSGFTFSSYSMHWLRQAPGKGLEWVSAIGTAGGTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREYFFGSGNYGYWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK
ＤＧ０６ ＳＣＦＶ（配列番号：６）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYGIHWVRQAPGKGLEWVAIIWHDGSNSYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARIIGGAFDIWGQGTMVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPITFGQGTRLEIK
ＤＧ０７ ＳＣＦＶ（配列番号：７）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSISGYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGGEKYYGDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCVMAGGLDYWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWYTFGQGTKLEIK
ＤＧ０８ ＳＣＦＶ（配列番号：８）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVRLSCRASGYNFIDFHIHWVRQAPGEGLEWMGWSNPQSGNSSSAQRFQGRVTMTTDTSMSAAYMDLNWLTLDDTAVYYCTRPHDGAGNYRFDTWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSSYELTQPPSVSVAPGQTARITCSGDALPKHYAHWYQQKPGQVPIVVIYKDTERPSGIPERFSGSTSGTTVTLTISGVQAEDEAHYYCQSADVSSTYVVFGGGTKLTVL
ＤＧ０９ ＳＣＦＶ（配列番号：９）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVESGGGLVEPGGSLRLSCAVSGFDFEKAWMSWVRQAPGQGLQWVARIKSTADGGTTSYAAPVEGRFIISRDDSRNMLYLQMNSLKTEDTAVYYCTSAHWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSSYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGEALPMQFAHWYQQRPGKAPVIVVYKDSERPSGVPERFSGSSSGTTATLTITGVQAEDEADYYCQSPDSTNTYEVFGGGTKLTVL
ＤＧ１０ ＳＣＦＶ（配列番号：１０）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYAMHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGKRKYSQKFQDRVTINRDTSASTIYMELSSLGSEDTAVYYCAREEDHAGSGSYLSMDVWGQGSTVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQNVLYSSNNKNYLAWYQQKPGHPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTITSLQTEDVAVYYCQQYYSSPLTFGGGTKVEIK
ＤＧ１１ ＳＣＦＶ（配列番号：１１）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVETGGGLVQPKGSLKLSCATSGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRTKSNDYATYYADSVKGRITISRDDSQSMLYLQMNNLKTEDTAMYYCVRVGYRPYAMDYWGQGTSVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQNIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPTLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGAGTKLELK
４－１ＢＢ共刺激ドメイン（配列番号：１２）
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配列番号：１３）
GGGGSGGGGSGGGGS
Ｔ２Ａ（配列番号：１４）
RAKRSGSGEGRGSLITCGDVEENPGP
Ｐ２Ａ（配列番号：１５）
RAKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP
ＣＤ３Ｚ（配列番号：１６）
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
ヒトアミロイドベータ、アイソフォーム ＡＰＰ７７０（ＩＤ： Ｐ０５０６７－１）（配列番号： １７）
MLPGLALLLLAAWTARALEVPTDGNAGLLAEPQIAMFCGRLNMHMNVQNGKWDSDPSGTKTCIDTKEGILQYCQEVYPELQITNVVEANQPVTIQNWCKRGRKQCKTHPHFVIPYRCLVGEFVSDALLVPDKCKFLHQERMDVCETHLHWHTVAKETCSEKSTNLHDYGMLLPCGIDKFRGVEFVCCPLAEESDNVDSADAEEDDSDVWWGGADTDYADGSEDKVVEVAEEEEVAEVEEEEADDDEDDEDGDEVEEEAEEPYEEATERTTSIATTTTTTTESVEEVVREVCSEQAETGPCRAMISRWYFDVTEGKCAPFFYGGCGGNRNNFDTEEYCMAVCGSAMSQSLLKTTQEPLARDPVKLPTTAASTPDAVDKYLETPGDENEHAHFQKAKERLEAKHRERMSQVMREWEEAERQAKNLPKADKKAVIQHFQEKVESLEQEAANERQQLVETHMARVEAMLNDRRRLALENYITALQAVPPRPRHVFNMLKKYVRAEQKDRQHTLKHFEHVRMVDPKKAAQIRSQVMTHLRVIYERMNQSLSLLYNVPAVAEEIQDEVDELLQKEQNYSDDVLANMISEPRISYGNDALMPSLTETKTTVELLPVNGEFSLDDLQPWHSFGADSVPANTENEVEPVDARPAADRGLTTRPGSGLTNIKTEEISEVKMDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIATVIVITLVMLKKKQYTSIHHGVVEVDAAVTPEERHLSKMQQNGYENPTYKFFEQMQN
ヒトスーパーオキシドジスムターゼ、ＩＤ：Ｐ００４４１－１（配列番号： １８）MATKAVCVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLHGFHVHEFGDNTAGCTSAGPHFNPLSRKHGGPKDEERHVGDLGNVTADKDGVADVSIEDSVISLSGDHCIIGRTLVVHEKADDLGKGGNEESTKTGNAGSRLACGVIGIAQ
ヒトα－シヌクレイン、アイソフォーム１（ＩＤ：Ｐ３７８４０－１）（配列番号：１９）
MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEAAGKTKEGVLYVGSKTKEGVVHGVATVAEKTKEQVTNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGAGSIAAATGFVKKDQLGKNEEGAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMPSEEGYQDYEPEA
ＤＧ０１．２８．Ｚ ＣＡＲ（配列番号：２０）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFAFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGTKKYYTDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNTLRAEDTAVYYCARDRGIGARRGPYYMDVWGKGTTVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP
ＤＧ０２．２８．Ｚ ＣＡＲ（配列番号：２１）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYGMSWVRQAPGKGLEWVASIRSGGGRTYYSDNVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRYDHYSGSSDYWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQKPGQSPQRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPRTFGQGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP
ＤＧ０３．２８．Ｚ ＣＡＲ（配列番号：２２）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLELVASINSNGGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGDYWGQGTTVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVYSNGDTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGQGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP
ＤＧ０４．２８．Ｚ ＣＡＲ（配列番号：２３）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSQVELVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINASGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGKGNTHKPYGYVRYFDVWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCLQIYNMPITFGQGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP
ＤＧ０５．２８．Ｚ ＣＡＲ（配列番号：２４）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAGSGFTFSSYSMHWLRQAPGKGLEWVSAIGTAGGTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREYFFGSGNYGYWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP
ＤＧ０６．２８．Ｚ ＣＡＲ（配列番号：２５）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYGIHWVRQAPGKGLEWVAIIWHDGSNSYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARIIGGAFDIWGQGTMVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPITFGQGTRLEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP
ＤＧ０７．２８．Ｚ ＣＡＲ（配列番号：２６）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSISGYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGGEKYYGDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCVMAGGLDYWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWYTFGQGTKLEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP
ＤＧ０８．２８．Ｚ ＣＡＲ（配列番号：２７）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVRLSCRASGYNFIDFHIHWVRQAPGEGLEWMGWSNPQSGNSSSAQRFQGRVTMTTDTSMSAAYMDLNWLTLDDTAVYYCTRPHDGAGNYRFDTWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSSYELTQPPSVSVAPGQTARITCSGDALPKHYAHWYQQKPGQVPIVVIYKDTERPSGIPERFSGSTSGTTVTLTISGVQAEDEAHYYCQSADVSSTYVVFGGGTKLTVLASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP
ＤＧ０９．２８．Ｚ ＣＡＲ（配列番号：２８）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVESGGGLVEPGGSLRLSCAVSGFDFEKAWMSWVRQAPGQGLQWVARIKSTADGGTTSYAAPVEGRFIISRDDSRNMLYLQMNSLKTEDTAVYYCTSAHWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSSYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGEALPMQFAHWYQQRPGKAPVIVVYKDSERPSGVPERFSGSSSGTTATLTITGVQAEDEADYYCQSPDSTNTYEVFGGGTKLTVLASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP
ＤＧ１０．２８．Ｚ ＣＡＲ（配列番号：２９）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYAMHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGKRKYSQKFQDRVTINRDTSASTIYMELSSLGSEDTAVYYCAREEDHAGSGSYLSMDVWGQGSTVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQNVLYSSNNKNYLAWYQQKPGHPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTITSLQTEDVAVYYCQQYYSSPLTFGGGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP
ＤＧ１１．２８．Ｚ ＣＡＲ（配列番号：３０）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVETGGGLVQPKGSLKLSCATSGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRTKSNDYATYYADSVKGRITISRDDSQSMLYLQMNNLKTEDTAMYYCVRVGYRPYAMDYWGQGTSVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQNIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPTLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGAGTKLELKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP
シグナル伝達シーケンス（配列番号：３１）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHS
ヒトＣＤ２８ヒンジ（配列番号：３２）
VKGKHLCPSPLFPGPSKP
マウスＣＤ２８ヒンジ（配列番号：３３）
IKEKHLCHTQSSPKL
ヒトＣＤ８Ａヒンジ（配列番号：３４）
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
ヒトＤＡＰ１０ヒンジ（配列番号：３５）
QTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLP
ヒトＣＤ２８ ＴＭ（配列番号：３６）
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
マウスＣＤ２８ ＴＭ（配列番号：３７）
FWALVVVAGVLFCYGLLVTVALCVIWT
ヒトＣＤ８Ａ ＴＭ（配列番号：３８）
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
ヒトＤＡＰ１０ ＴＭ（配列番号：３９）
LLAGLVAADAVASLLIVGAVF
ＤＧ０５－ＣＤ２８ｔｍ－ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ（配列番号：４０）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAGSGFTFSSYSMHWLRQAPGKGLEWVSAIGTAGGTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREYFFGSGNYGYWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGKLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
ＤＧ０５－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ４４－ＣＤ３ζ（配列番号：４１）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAGSGFTFSSYSMHWLRQAPGKGLEWVSAIGTAGGTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREYFFGSGNYGYWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVSRRRCGQKKKLVINSGNGAVEDRKPSGLNGEASKSQEMVHLVNKESSETPDQFMTADETRNLQNVDMKIGVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
ＤＧ０５－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ３ζ（配列番号： ４２）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAGSGFTFSSYSMHWLRQAPGKGLEWVSAIGTAGGTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREYFFGSGNYGYWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
ＤＧ０５－ＣＤ２８（配列番号：４３）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAGSGFTFSSYSMHWLRQAPGKGLEWVSAIGTAGGTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREYFFGSGNYGYWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
ＤＧ０５－ＣＤ２８ｔｍ（配列番号：４４）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAGSGFTFSSYSMHWLRQAPGKGLEWVSAIGTAGGTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREYFFGSGNYGYWGQGTLVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSD
ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ－ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ（配列番号：４５）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLELVASINSNGGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGDYWGQGTTVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVYSNGDTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGQGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGKLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ４４－ＣＤ３ζ（配列番号：４６）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLELVASINSNGGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGDYWGQGTTVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVYSNGDTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGQGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVSRRRCGQKKKLVINSGNGAVEDRKPSGLNGEASKSQEMVHLVNKESSETPDQFMTADETRNLQNVDMKIGVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ－４－１－ＢＢ－ＣＤ３ζ（配列番号：４７）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLELVASINSNGGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGDYWGQGTTVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVYSNGDTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGQGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSLEKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELKLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ３ζ（配列番号：４８）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLELVASINSNGGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGDYWGQGTTVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVYSNGDTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGQGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
ＤＧ０３－ＣＤ２８（配列番号：４９）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLELVASINSNGGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGDYWGQGTTVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVYSNGDTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGQGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ（配列番号：５０）
MEWTWVFLFLLSVTAGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLELVASINSNGGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGDYWGQGTTVTVSSAGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVYSNGDTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPWTFGQGTKVEIKASVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
ＮＤＭＭ Ｎｒｆ２（Ｋｅａｐ１阻害剤ペプチド）発現用構成物（配列番号：５１）
MMDLELPPPGLPSQQDMDLIDILWRQDIDLGVSREVFDFSQRRKEYELEKQKKLEKERQEQLQKEQEKAFFAQLQLDEETGEFLPIQPAQ
ＮＤＭＭヒトカタラーゼ発現用構成物（配列番号：５２）
MADSRDPASDQMQHWKEQRAAQKADVLTTGAGNPVGDKLNVITVGPRGPLLVQDVVFTDEMAHFDRERIPERVVHAKGAGAFGYFEVTHDITKYSKAKVFEHIGKKTPIAVRFSTVAGESGSADTVRDPRGFAVKFYTEDGNWDLVGNNTPIFFIRDPILFPSFIHSQKRNPQTHLKDPDMVWDFWSLRPESLHQVSFLFSDRGIPDGHRHMNGYGSHTFKLVNANGEAVYCKFHYKTDQGIKNLSVEDAARLSQEDPDYGIRDLFNAIATGKYPSWTFYIQVMTFNQAETFPFNPFDLTKVWPHKDYPLIPVGKLVLNRNPVNYFAEVEQIAFDPSNMPPGIEASPDKMLQGRLFAYPDTHRHRLGPNYLHIPVNCPYRARVANYQRDGPMCMQDNQGGAPNYYPNSFGAPEQQPSALEHSIQYSGEVRRFNTANDDNVTQVRAFYVNVLNEEQRKRLCENIAGHLKDAQIFIQKKAVKNFTEVHPDYGSHIQALLDKYNAEKPKNAIHTFVQSGSHLAAREKANL
ＮＤＭＭ ＢＤＮＦ発現用構成物（配列番号：５３）
MTILFLTMVISYFGCMKAAPMKEANIRGQGGLAYPGVRTHGTLESVNGPKAGSRGLTSLADTFEHVIEELLDEDQKVRPNEENNKDADLYTSRVMLSSQVPLEPPLLFLLEEYKNYLDAANMSMRVRRHSDPARRGELSVCDSISEWVTAADKKTAVDMSGGTVTVLEKVPVSKGQLKQYFYETKCNPMGYTKEGCRGIDKRHWNSQCRTTQSYVRALTMDSKKRIGWRFIRIDTSCVCTLTIKRGR
ＮＤＭＭ ＩＧＦ－１発現用構成物（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４）
MGKISSLPTQLFKCCFCDFLKVKMHTMSSSHLFYLALCLLTFTSSATAGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARSVRAQRHTDMPKTQKYQPPSTNKNTKSQRRKGWPKTHPGGEQKEGTEASLQIRGKKKEQRREIGSRNAECRGKKGK
ＤＧ０１ ＳＣＦＶ（配列番号：２０１）
atggaatgga cctgggtgtt cctgtttctg ctgtccgtga ccgctggcgt gcacagccag gtgcagctgg tggaaagcgg cggaggagtc gtgcagcctg gcagaagcct gaggctgagc tgtgccgcca gcggcttcgc cttcagctcc tacggcatgc actgggtgag acaggcccct ggcaagggac tggagtgggt ggctgtgatc tggttcgacg gcaccaagaa gtactacacc gacagcgtca agggcaggtt caccatctcc agggacaata gcaagaatac cctgtacctc caaatgaaca ccctgagggc cgaggacacc gccgtgtatt actgcgccag ggatagggga atcggcgcca ggagaggccc ctactacatg gacgtgtggg gcaagggcac aacagtgacc gtttcttctg ctggaggagg aggttctgga ggaggaggaa gcggaggagg aggctccgac atccagatga cacagtcccc cagctccctg tccgccagcg tgggcgatag agtgaccatc acctgcaggg ccagccagag catctccagc tacctgaact ggtatcaaca gaagcccggc aaagccccca aactgctgat ctacgctgcc agcagcctgc agagcggcgt gccttccaga ttcagcggct ccggcagcgg caccgatttc acactgacca tctccagcct gcagcccgag gacttcgcca cctactactg ccagcagagc tacagcaccc ccctgacctt tggcggaggc accaaggtgg agatcaaa
ＤＧ０２ ＳＣＦＶ（配列番号：２０２）
atggaatgga cctgggtgtt tctgttcctg ctgagcgtga cagccggcgt gcacagcgag gtgcagctgc tggagagcgg aggaggactg gtgcaacccg gcggaagcct cagactgagc tgtgccgcca gcggcttcac cttcagcaac tatggcatga gctgggtgag gcaggcccct ggcaaaggcc tcgaatgggt ggcttccatt aggagcggcg gcggcaggac ctattacagc gacaacgtga agggcaggtt caccatctcc agggacaata gcaagaacac cctgtacctg cagatgaact ccctgagggc cgaggatacc gccgtgtact actgcgtgag gtacgaccac tacagcggct ccagcgacta ttggggacag ggcaccctgg tgacagtgtc cagcgccgga ggaggcggca gcggcggcgg cggcagcggc ggcggcggaa gcgatgtggt gatgacccag tcccccctga gcctgcctgt gacacctgga gagcccgcca gcatcagctg taagagcagc cagagcctcc tggacagcga cggcaaaacc tacctgaact ggctcctgca gaagcccgga caaagccccc agaggctgat ctacctggtg agcaaactgg acagcggcgt gcctgacaga ttctccggct ccggcagcgg caccgacttc acactgaaga tcagcagagt ggaggctgag gacgtgggcg tctactactg ctggcagggc acccacttcc ccaggacctt cggccaggga accaaggtgg agatcaag
ＤＧ０３ ＳＣＦＶ（配列番号：２０３）
atggaatgga cctgggtgtt cctgtttctg ctctccgtga ccgccggagt gcacagcgag gtgcagctgg tcgaaagcgg cggaggactg gtgcagcctg gcggcagcct gagactgagc tgtgccgcct ccggcttcac ctttagcagc tacggaatgt cctgggtgag acaggctcct ggcaagggcc tggaactggt ggccagcatc aatagcaacg gcggcagcac ctactaccct gatagcgtga agggcaggtt caccatctcc agggacaacg ccaagaacag cctgtacctg cagatgaaca gcctcagggc cgaggacaca gccgtgtact actgcgccag cggcgactat tggggacagg gaacaaccgt gaccgtcagc agcgccggcg gcggcggcag cggcggcggc ggcagcggcg gcggcggctc cgatatcgtg atgacccaga gccccctgtc cctgcctgtc acacctggcg aacccgccag cattagctgc aggtccagcc agagcctggt gtacagcaat ggcgacacct acctgcactg gtacctgcag aagcctggcc agagccccca gctgctgatc tacaaggtga gcaacaggtt ctccggagtg cctgacaggt tcagcggctc cggcagcgga accgatttca ccctcaagat cagcagagtg gaggccgagg acgtgggcgt ctactattgt agccagagca cccacgtgcc ctggaccttt ggccagggca ccaaggtgga gatcaaa
ＤＧ０４ ＳＣＦＶ（配列番号：２０４）
atggaatgga cctgggtgtt tctgttcctc ctgagcgtga ccgccggagt gcacagccaa gtggagctgg tggagagcgg aggaggactg gtgcagcctg gaggctccct gaggctgagc tgtgctgcca gcggcttcac cttcagctcc tatgctatga gctgggtgag acaggcccct ggcaaaggcc tggagtgggt gagcgccatc aacgcctccg gcaccaggac ctactatgcc gactccgtga agggcaggtt caccatctcc agggacaaca gcaagaacac cctgtacctg cagatgaaca gcctgagggc tgaagacacc gccgtgtact actgtgccag gggcaagggc aacacacaca agccctatgg ctacgtgaga tacttcgacg tgtggggaca gggcaccctg gtgacagtga gcagcgccgg aggaggaggt tctggaggag gaggaagcgg cggaggagga agcgacatcg tgctgacaca atcccccgcc acactgtccc tgtcccctgg cgagagggcc acactgagct gcagggccag ccagagcgtg tcctcctcct acctggcctg gtaccagcag aaacctggcc aggcccccag gctgctgatc tatggcgcca gcagcagagc cacaggagtg cctgccagat ttagcggcag cggcagcggc accgacttta ccctgaccat ttccagcctg gagcccgagg acttcgccac ctactactgc ctgcagatct acaacatgcc tatcaccttc ggccagggca caaaagtgga aatcaag
ＤＧ０５ ＳＣＦＶ（配列番号： ２０５）
atggaatgga cctgggtgtt tctgttcctc ctgtccgtga ccgccggagt gcactccgaa gtgcagctgg tgcagtccgg cggaggactg gtgaaacccg gaggaagcct cagactgagc tgcgccggca gcggctttac cttctccagc tactccatgc actggctgag acaggcccct ggcaagggcc tggaatgggt cagcgccatc ggcaccgccg gaggcacata ctatgccgac agcgtgaagg gcaggttcac catcagcagg gacaacgcca agaacagcct gtacctgcag atgaactctc tgagggccga ggataccgct gtgtactact gcgccaggga gtacttcttt ggcagcggca actacggata ctggggccag ggcaccctgg tgacagtgag ctccgccgga ggaggaggaa gcggaggagg cggaagcgga ggaggcggca gcgaaatcgt gctgacccag agccctgcca ccctgagcct gagccctggc gaaagggcca ccctgagctg cagagccagc cagagcgtga gcagctacct ggcctggtac cagcagaagc ccggacaggc ccccagactg ctgatctacg acgccagcaa cagagccacc ggcattcccg ccagattctc cggcagcggc agcggaaccg acttcacact gaccatcagc tccttagaac ccgaggactt cgccgtgtac tactgtcagc agagaagcaa ctggcctccc accttcggcc agggcacaaa ggtggagatc aag
ＤＧ０６ ＳＣＦＶ（配列番号：２０６）
atggaatgga cctgggtgtt cctgttcctc ctgagcgtga ccgctggcgt ccacagccag gtgcagctgg tggaaagcgg aggcggagtg gtgcagcctg gaaggtccct cagactgagc tgcgctgcca gcggcttcac cttcagcaac tacggcatcc actgggtgag acaagccccc ggcaaaggcc tggagtgggt ggccatcatc tggcacgacg gcagcaactc ctactacgtg gactccgtga agggcaggtt cacaatcagc agagacaaca gcaagaatac cctgtacctg cagatgaaca gcctcagggc cgaagatacc gccgtgtact tctgcgccag gatcatcggc ggcgcctttg acatttgggg ccaaggcact atggttaccg tgagcagcgc tggcggaggc ggcagcggcg gcggcggcag cggcggcggc ggaagcgaca tccagatgac ccagagccct tccagcctca gcgcctccgt gggagacaga gtgaccatca cctgcagggc cagccagggc atctccagct ggctggcctg gtaccagcag aagcctgaga aagcccccaa gagcctgatc tacgctgcct ccagcctgca gtccggcgtg ccttccagat tctccggcag cggcagcggc accgacttta ccctgaccat ttccagcctg caacccgagg acttcgccac ctactactgc cagcagtaca acagctaccc catcaccttt ggccagggca ccagactgga gatcaag
ＤＧ０７ ＳＣＦＶ（配列番号： ２０７）
atggaatgga cctgggtgtt cctgttcctg ctgtccgtga ccgccggagt ccacagcgag gtgcagctgg tggaaagcgg cggaggactg gtgcagcctg gaggcagcct gaggctgagc tgtgctgcca gcggcttctc catcagcggc tactggatgt cctgggtgag gcaggcccct ggaaagggct tagaatgggt ggccaacatc aaacaggacg gcggcgagaa gtactacgga gacagcgtca agggcagatt caccatcagc agggacaacg ccaagaacag cctgtacctg cagatgaaca gcctgagggc cgaggacacc gctgtgtact actgcgtgat ggccggaggc ctggattatt ggggccaggg cacactggtg acagtgagca gcgccggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc gagatcgtgc tgacccagag ccctgccaca ctgagcctga gccccggcga aagagccacc ctcagctgca gggccagcca gagcgtgagc agctacctgg cctggtacca gcagaagccc ggacaggccc ctaggctgct gatctacgat gccagcaaca gagccaccgg catccctgct aggttcagcg gttctggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctggagcct gaggacttcg ctgtctacta ctgccagcag aggagcaact ggtatacctt cggccaggga accaagctgg agatcaag
ＤＧ０８ ＳＣＦＶ（配列番号：２０８）
atggaatgga cctgggtgtt cctgttcctg ctcagcgtga ccgccggagt gcactcccag gtgcagctgg tgcagagcgg cgccgaagtg aaaaagcccg gcgccagcgt gagactctcc tgtagagcca gcggctacaa cttcatcgac ttccacatcc actgggtgag acaggcccct ggagagggcc tggagtggat gggctggagc aacccccaga gcggcaatag cagcagcgcc cagaggttcc agggcagagt gaccatgacc accgatacct ccatgagcgc cgcctacatg gacctgaact ggctgaccct ggacgacacc gccgtgtact actgcaccag gcctcacgac ggcgctggca actacaggtt cgacacctgg ggacagggaa ccctggtgac agtcagcagc gcgggaggtg gtggtagcgg tggtgggggt tccggtggag gtggcagttc atatgagctt acacaacccc caagtgtgag cgtggctcct ggccagacag ccaggatcac ctgcagcgga gacgccctgc ccaaacacta cgcccactgg tatcagcaga aacccggcca ggtgcccatc gtggtgatct acaaggacac cgagagacct agcggcatcc ccgagagatt cagcggcagc accagcggca ccacagtcac cctgaccatc tccggcgtgc aggccgagga tgaagcccac tactactgcc aaagcgccga cgtgtcctcc acctatgtgg tgttcggcgg cggcaccaag ctgaccgtcc tc
ＤＧ０９ ＳＣＦＶ（配列番号：２０９）
atggagtgga cttgggtatt cctgtttttg ttgtccgtaa ctgctggggt acactcagag gtgcagctgg tagagtctgg aggggggctc gtcgaaccag gcggctctct caggctttcc tgtgccgtaa gcgggtttga ttttgagaaa gcatggatgt cctgggtaag gcaagctcca gggcagggac tccagtgggt agcgcggata aagtcaacag ctgatggcgg aaccacctct tatgcagcac cggttgaggg aaggttcatc atctcacgag acgattcccg caacatgttg tatctgcaga tgaacagttt gaaaactgaa gacacagctg tttactactg tacttcagcg cattggggac agggtactct tgtgacggtc tctagcgccg gggggggagg ctctggaggg gggggttcag ggggtggtgg cagctcctat gagctgactc aaccgccttc agtaagcgta agccctggtc agaccgctag aataacctgt agtggagagg ccctgccgat gcaattcgcc cactggtatc agcagaggcc tggaaaagcc ccagtgattg tcgtttacaa agattccgaa cgccctagcg gggttcccga acgctttagc ggtagttcaa gcgggacaac agcaaccctt acgataaccg gtgtacaagc ggaagacgaa gcggattact attgccaatc acctgatagt acaaatactt atgaggtatt tggcggggga acgaagttga ctgtactg
ＤＧ１０ ＳＣＦＶ（配列番号：２１０）
atggaatgga cctgggtgtt cctcttcctc ctgtccgtca ccgctggcgt gcacagccag gtgcagctgg tccagagcgg agccgaggtg aaaaagcccg gcgcctccgt gaaggtcagc tgcaaggcct ccggctacac cttcaccaac tacgccatgc actgggtgag acaggcccct ggccagagac tggagtggat gggctggatc aacgccggca acggcaagag aaagtacagc cagaagtttc aggacagggt gaccatcaac agggacacca gcgcctccac catctacatg gagctgtcca gcctgggcag cgaggatacc gccgtgtact actgtgccag agaggaggat cacgctggca gcggcagcta cctgagcatg gacgtctggg gacagggcag caccgtgaca gtgagcagcg ctggaggcgg cggctccggc ggcggaggaa gcggaggcgg aggctccgac atcgtgatga cccagtcccc cgatagcctg gctgtgagcc tgggcgagag ggccacaatc aactgtaaga gcagccagaa cgtgctgtac tcctccaaca acaagaacta cctggcctgg taccagcaga aacctggcca tccccccaag ctgctgatct actgggccag caccagggag agcggagtgc ctgacaggtt tagcggcagc ggcagcggca cagactttac cctgaccatc acctccctgc agaccgagga cgtggccgtg tactattgcc agcagtacta cagctcccct ctgaccttcg gcggcggcac caaagtggag atcaaa
ＤＧ１１ ＳＣＦＶ（配列番号：２１１）
atggagtgga cttgggtatt ccttttcctc ctctccgtga cagcgggtgt gcactctgaa gtacaacttg tagagaccgg tgggggattg gtgcaaccca agggttccct gaaactctca tgtgctacct ctggttttac tttcaacacc tatgcaatga attgggttag gcaagcaccc ggtaaaggac ttgagtgggt ggcacggata cgcactaaga gtaatgacta tgctacgtac tacgcagact ccgtaaaagg ccggatcacc atatctcgag acgatagcca gtctatgctg tatcttcaaa tgaacaacct caaaacggaa gatacggcga tgtattactg cgtgcgagtt ggttataggc cttatgctat ggattactgg ggacagggca cgtctgtcac ggtaagttct gccggagggg ggggcagcgg aggaggagga tctggcggag ggggctccga tgtccttatg acacagactc ccctcagttt gcccgtgtcc ttgggggacc aggcttctat atcatgccgc agttcccaaa atatcgtcca ttcaaatggc aatacttacc ttgagtggta tttgcagaag cctggacaga gcccgacgct tctgatctat aaggtaagca acaggttcag tggtgtaccc gacagattta gtggaagtgg gtccggaact gatttcactc ttaagattag tcgggtagag gctgaagacc ttggggtgta ttattgcttt caagggagtc acgtccctct tacatttggt gctgggacta agttggagct gaag
４－１ＢＢ共刺激ドメイン（配列番号：２１２）
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt gaactg
（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配列番号：２１３）
ggcggaggcg gatcaggagg aggaggatca ggcggaggag gatca
Ｔ２Ａ（配列番号：２１４）
agagccaaaa ggtctggctc cggtgagggc agaggaagtc ttataacatg cggtgacgtg gaggagaatc ccggccct
Ｐ２Ａ（配列番号：２１５）
agagccaaaa ggtccggaag cggcgccacc aacttcagcc tgctgaagca ggccggcgac gtggaagaga atcctggccc c
ＣＤ３Ｚ（配列番号：２１６）
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc
ＤＧ０１．２８．Ｚ ＣＡＲ（配列番号：２２０）
atggaatgga cctgggtgtt cctgtttctg ctgtccgtga ccgctggcgt gcacagccag gtgcagctgg tggaaagcgg cggaggagtc gtgcagcctg gcagaagcct gaggctgagc tgtgccgcca gcggcttcgc cttcagctcc tacggcatgc actgggtgag acaggcccct ggcaagggac tggagtgggt ggctgtgatc tggttcgacg gcaccaagaa gtactacacc gacagcgtca agggcaggtt caccatctcc agggacaata gcaagaatac cctgtacctc caaatgaaca ccctgagggc cgaggacacc gccgtgtatt actgcgccag ggatagggga atcggcgcca ggagaggccc ctactacatg gacgtgtggg gcaagggcac aacagtgacc gtttcttctg ctggaggagg aggttctgga ggaggaggaa gcggaggagg aggctccgac atccagatga cacagtcccc cagctccctg tccgccagcg tgggcgatag agtgaccatc acctgcaggg ccagccagag catctccagc tacctgaact ggtatcaaca gaagcccggc aaagccccca aactgctgat ctacgctgcc agcagcctgc agagcggcgt gccttccaga ttcagcggct ccggcagcgg caccgatttc acactgacca tctccagcct gcagcccgag gacttcgcca cctactactg ccagcagagc tacagcaccc ccctgacctt tggcggaggc accaaggtgg agatcaaagc tagcgtgaaa gggaaacacc tttgtccaag tcccctattt cccggacctt ctaagccctt ttgggtgctg gtggtggttg gtggagtcct ggcttgctat agcttgctag taacagtggc ctttattatt ttctgggtga ggagtaagag gagcaggctc ctgcacagtg actacatgaa catgactccc cgccgccccg ggcccacccg caagcattac cagccctatg ccccaccacg cgacttcgca gcctatcgct ccaagcttag agtgaagttc agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag cagggccaga accagctcta taacgagctc aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag atggggggaa agccgagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa gataagatgg cggaggccta cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt acagccacca aggacaccta cgacgccctt cacatgcagg ccctgccccc t
ＤＧ０２．２８．Ｚ ＣＡＲ（配列番号：２２１）
atggaatgga cctgggtgtt tctgttcctg ctgagcgtga cagccggcgt gcacagcgag gtgcagctgc tggagagcgg aggaggactg gtgcaacccg gcggaagcct cagactgagc tgtgccgcca gcggcttcac cttcagcaac tatggcatga gctgggtgag gcaggcccct ggcaaaggcc tcgaatgggt ggcttccatt aggagcggcg gcggcaggac ctattacagc gacaacgtga agggcaggtt caccatctcc agggacaata gcaagaacac cctgtacctg cagatgaact ccctgagggc cgaggatacc gccgtgtact actgcgtgag gtacgaccac tacagcggct ccagcgacta ttggggacag ggcaccctgg tgacagtgtc cagcgccgga ggaggcggca gcggcggcgg cggcagcggc ggcggcggaa gcgatgtggt gatgacccag tcccccctga gcctgcctgt gacacctgga gagcccgcca gcatcagctg taagagcagc cagagcctcc tggacagcga cggcaaaacc tacctgaact ggctcctgca gaagcccgga caaagccccc agaggctgat ctacctggtg agcaaactgg acagcggcgt gcctgacaga ttctccggct ccggcagcgg caccgacttc acactgaaga tcagcagagt ggaggctgag gacgtgggcg tctactactg ctggcagggc acccacttcc ccaggacctt cggccaggga accaaggtgg agatcaaggc tagcgtgaaa gggaaacacc tttgtccaag tcccctattt cccggacctt ctaagccctt ttgggtgctg gtggtggttg gtggagtcct ggcttgctat agcttgctag taacagtggc ctttattatt ttctgggtga ggagtaagag gagcaggctc ctgcacagtg actacatgaa catgactccc cgccgccccg ggcccacccg caagcattac cagccctatg ccccaccacg cgacttcgca gcctatcgct ccaagcttag agtgaagttc agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag cagggccaga accagctcta taacgagctc aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag atggggggaa agccgagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa gataagatgg cggaggccta cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt acagccacca aggacaccta cgacgccctt cacatgcagg ccctgccccc t
ＤＧ０３．２８．Ｚ ＣＡＲ（配列番号：２２２）
atggaatgga cctgggtgtt cctgtttctg ctctccgtga ccgccggagt gcacagcgag gtgcagctgg tcgaaagcgg cggaggactg gtgcagcctg gcggcagcct gagactgagc tgtgccgcct ccggcttcac ctttagcagc tacggaatgt cctgggtgag acaggctcct ggcaagggcc tggaactggt ggccagcatc aatagcaacg gcggcagcac ctactaccct gatagcgtga agggcaggtt caccatctcc agggacaacg ccaagaacag cctgtacctg cagatgaaca gcctcagggc cgaggacaca gccgtgtact actgcgccag cggcgactat tggggacagg gaacaaccgt gaccgtcagc agcgccggcg gcggcggcag cggcggcggc ggcagcggcg gcggcggctc cgatatcgtg atgacccaga gccccctgtc cctgcctgtc acacctggcg aacccgccag cattagctgc aggtccagcc agagcctggt gtacagcaat ggcgacacct acctgcactg gtacctgcag aagcctggcc agagccccca gctgctgatc tacaaggtga gcaacaggtt ctccggagtg cctgacaggt tcagcggctc cggcagcgga accgatttca ccctcaagat cagcagagtg gaggccgagg acgtgggcgt ctactattgt agccagagca cccacgtgcc ctggaccttt ggccagggca ccaaggtgga gatcaaagct agcgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagcccttt tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc caagcttaga gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct
ＤＧ０４．２８．Ｚ ＣＡＲ（配列番号：２２３）
atggaatgga cctgggtgtt tctgttcctc ctgagcgtga ccgccggagt gcacagccaa gtggagctgg tggagagcgg aggaggactg gtgcagcctg gaggctccct gaggctgagc tgtgctgcca gcggcttcac cttcagctcc tatgctatga gctgggtgag acaggcccct ggcaaaggcc tggagtgggt gagcgccatc aacgcctccg gcaccaggac ctactatgcc gactccgtga agggcaggtt caccatctcc agggacaaca gcaagaacac cctgtacctg cagatgaaca gcctgagggc tgaagacacc gccgtgtact actgtgccag gggcaagggc aacacacaca agccctatgg ctacgtgaga tacttcgacg tgtggggaca gggcaccctg gtgacagtga gcagcgccgg aggaggaggt tctggaggag gaggaagcgg cggaggagga agcgacatcg tgctgacaca atcccccgcc acactgtccc tgtcccctgg cgagagggcc acactgagct gcagggccag ccagagcgtg tcctcctcct acctggcctg gtaccagcag aaacctggcc aggcccccag gctgctgatc tatggcgcca gcagcagagc cacaggagtg cctgccagat ttagcggcag cggcagcggc accgacttta ccctgaccat ttccagcctg gagcccgagg acttcgccac ctactactgc ctgcagatct acaacatgcc tatcaccttc ggccagggca caaaagtgga aatcaaggct agcgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagcccttt tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc caagcttaga gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct
ＤＧ０５．２８．Ｚ ＣＡＲ（配列番号：２２４）
atggaatgga cctgggtgtt tctgttcctc ctgtccgtga ccgccggagt gcactccgaa gtgcagctgg tgcagtccgg cggaggactg gtgaaacccg gaggaagcct cagactgagc tgcgccggca gcggctttac cttctccagc tactccatgc actggctgag acaggcccct ggcaagggcc tggaatgggt cagcgccatc ggcaccgccg gaggcacata ctatgccgac agcgtgaagg gcaggttcac catcagcagg gacaacgcca agaacagcct gtacctgcag atgaactctc tgagggccga ggataccgct gtgtactact gcgccaggga gtacttcttt ggcagcggca actacggata ctggggccag ggcaccctgg tgacagtgag ctccgccgga ggaggaggaa gcggaggagg cggaagcgga ggaggcggca gcgaaatcgt gctgacccag agccctgcca ccctgagcct gagccctggc gaaagggcca ccctgagctg cagagccagc cagagcgtga gcagctacct ggcctggtac cagcagaagc ccggacaggc ccccagactg ctgatctacg acgccagcaa cagagccacc ggcattcccg ccagattctc cggcagcggc agcggaaccg acttcacact gaccatcagc tccttagaac ccgaggactt cgccgtgtac tactgtcagc agagaagcaa ctggcctccc accttcggcc agggcacaaa ggtggagatc aaggctagcg tgaaagggaa acacctttgt ccaagtcccc tatttcccgg accttctaag cccttttggg tgctggtggt ggttggtgga gtcctggctt gctatagctt gctagtaaca gtggccttta ttattttctg ggtgaggagt aagaggagca ggctcctgca cagtgactac atgaacatga ctccccgccg ccccgggccc acccgcaagc attaccagcc ctatgcccca ccacgcgact tcgcagccta tcgctccaag cttagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccct
ＤＧ０６．２８．Ｚ ＣＡＲ（配列番号：２２５）
atggaatgga cctgggtgtt cctgttcctc ctgagcgtga ccgctggcgt ccacagccag gtgcagctgg tggaaagcgg aggcggagtg gtgcagcctg gaaggtccct cagactgagc tgcgctgcca gcggcttcac cttcagcaac tacggcatcc actgggtgag acaagccccc ggcaaaggcc tggagtgggt ggccatcatc tggcacgacg gcagcaactc ctactacgtg gactccgtga agggcaggtt cacaatcagc agagacaaca gcaagaatac cctgtacctg cagatgaaca gcctcagggc cgaagatacc gccgtgtact tctgcgccag gatcatcggc ggcgcctttg acatttgggg ccaaggcact atggttaccg tgagcagcgc tggcggaggc ggcagcggcg gcggcggcag cggcggcggc ggaagcgaca tccagatgac ccagagccct tccagcctca gcgcctccgt gggagacaga gtgaccatca cctgcagggc cagccagggc atctccagct ggctggcctg gtaccagcag aagcctgaga aagcccccaa gagcctgatc tacgctgcct ccagcctgca gtccggcgtg ccttccagat tctccggcag cggcagcggc accgacttta ccctgaccat ttccagcctg caacccgagg acttcgccac ctactactgc cagcagtaca acagctaccc catcaccttt ggccagggca ccagactgga gatcaaggct agcgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagcccttt tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc caagcttaga gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct
ＤＧ０７．２８．Ｚ ＣＡＲ（配列番号：２２６）
atggaatgga cctgggtgtt cctgttcctg ctgtccgtga ccgccggagt ccacagcgag gtgcagctgg tggaaagcgg cggaggactg gtgcagcctg gaggcagcct gaggctgagc tgtgctgcca gcggcttctc catcagcggc tactggatgt cctgggtgag gcaggcccct ggaaagggct tagaatgggt ggccaacatc aaacaggacg gcggcgagaa gtactacgga gacagcgtca agggcagatt caccatcagc agggacaacg ccaagaacag cctgtacctg cagatgaaca gcctgagggc cgaggacacc gctgtgtact actgcgtgat ggccggaggc ctggattatt ggggccaggg cacactggtg acagtgagca gcgccggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc gagatcgtgc tgacccagag ccctgccaca ctgagcctga gccccggcga aagagccacc ctcagctgca gggccagcca gagcgtgagc agctacctgg cctggtacca gcagaagccc ggacaggccc ctaggctgct gatctacgat gccagcaaca gagccaccgg catccctgct aggttcagcg gttctggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctggagcct gaggacttcg ctgtctacta ctgccagcag aggagcaact ggtatacctt cggccaggga accaagctgg agatcaaggc tagcgtgaaa gggaaacacc tttgtccaag tcccctattt cccggacctt ctaagccctt ttgggtgctg gtggtggttg gtggagtcct ggcttgctat agcttgctag taacagtggc ctttattatt ttctgggtga ggagtaagag gagcaggctc ctgcacagtg actacatgaa catgactccc cgccgccccg ggcccacccg caagcattac cagccctatg ccccaccacg cgacttcgca gcctatcgct ccaagcttag agtgaagttc agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag cagggccaga accagctcta taacgagctc aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag atggggggaa agccgagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa gataagatgg cggaggccta cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt acagccacca aggacaccta cgacgccctt cacatgcagg ccctgccccc t
ＤＧ０８．２８．Ｚ ＣＡＲ（配列番号：２２７）
atggaatgga cctgggtgtt cctgttcctg ctcagcgtga ccgccggagt gcactcccag gtgcagctgg tgcagagcgg cgccgaagtg aaaaagcccg gcgccagcgt gagactctcc tgtagagcca gcggctacaa cttcatcgac ttccacatcc actgggtgag acaggcccct ggagagggcc tggagtggat gggctggagc aacccccaga gcggcaatag cagcagcgcc cagaggttcc agggcagagt gaccatgacc accgatacct ccatgagcgc cgcctacatg gacctgaact ggctgaccct ggacgacacc gccgtgtact actgcaccag gcctcacgac ggcgctggca actacaggtt cgacacctgg ggacagggaa ccctggtgac agtcagcagc gcgggaggtg gtggtagcgg tggtgggggt tccggtggag gtggcagttc atatgagctt acacaacccc caagtgtgag cgtggctcct ggccagacag ccaggatcac ctgcagcgga gacgccctgc ccaaacacta cgcccactgg tatcagcaga aacccggcca ggtgcccatc gtggtgatct acaaggacac cgagagacct agcggcatcc ccgagagatt cagcggcagc accagcggca ccacagtcac cctgaccatc tccggcgtgc aggccgagga tgaagcccac tactactgcc aaagcgccga cgtgtcctcc acctatgtgg tgttcggcgg cggcaccaag ctgaccgtcc tcgctagcgt gaaagggaaa cacctttgtc caagtcccct atttcccgga ccttctaagc ccttttgggt gctggtggtg gttggtggag tcctggcttg ctatagcttg ctagtaacag tggcctttat tattttctgg gtgaggagta agaggagcag gctcctgcac agtgactaca tgaacatgac tccccgccgc cccgggccca cccgcaagca ttaccagccc tatgccccac cacgcgactt cgcagcctat cgctccaagc ttagagtgaa gttcagcagg agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg caggccctgc cccct
ＤＧ０９．２８．Ｚ ＣＡＲ（配列番号：２２８）
atggagtgga cttgggtatt cctgtttttg ttgtccgtaa ctgctggggt acactcagag gtgcagctgg tagagtctgg aggggggctc gtcgaaccag gcggctctct caggctttcc tgtgccgtaa gcgggtttga ttttgagaaa gcatggatgt cctgggtaag gcaagctcca gggcagggac tccagtgggt agcgcggata aagtcaacag ctgatggcgg aaccacctct tatgcagcac cggttgaggg aaggttcatc atctcacgag acgattcccg caacatgttg tatctgcaga tgaacagttt gaaaactgaa gacacagctg tttactactg tacttcagcg cattggggac agggtactct tgtgacggtc tctagcgccg gggggggagg ctctggaggg gggggttcag ggggtggtgg cagctcctat gagctgactc aaccgccttc agtaagcgta agccctggtc agaccgctag aataacctgt agtggagagg ccctgccgat gcaattcgcc cactggtatc agcagaggcc tggaaaagcc ccagtgattg tcgtttacaa agattccgaa cgccctagcg gggttcccga acgctttagc ggtagttcaa gcgggacaac agcaaccctt acgataaccg gtgtacaagc ggaagacgaa gcggattact attgccaatc acctgatagt acaaatactt atgaggtatt tggcggggga acgaagttga ctgtactggc tagcgtgaaa gggaaacacc tttgtccaag tcccctattt cccggacctt ctaagccctt ttgggtgctg gtggtggttg gtggagtcct ggcttgctat agcttgctag taacagtggc ctttattatt ttctgggtga ggagtaagag gagcaggctc ctgcacagtg actacatgaa catgactccc cgccgccccg ggcccacccg caagcattac cagccctatg ccccaccacg cgacttcgca gcctatcgct ccaagcttag agtgaagttc agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag cagggccaga accagctcta taacgagctc aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag atggggggaa agccgagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa gataagatgg cggaggccta cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt acagccacca aggacaccta cgacgccctt cacatgcagg ccctgccccc t
ＤＧ１０．２８．Ｚ ＣＡＲ（配列番号：２２９）
atggaatgga cctgggtgtt cctcttcctc ctgtccgtca ccgctggcgt gcacagccag gtgcagctgg tccagagcgg agccgaggtg aaaaagcccg gcgcctccgt gaaggtcagc tgcaaggcct ccggctacac cttcaccaac tacgccatgc actgggtgag acaggcccct ggccagagac tggagtggat gggctggatc aacgccggca acggcaagag aaagtacagc cagaagtttc aggacagggt gaccatcaac agggacacca gcgcctccac catctacatg gagctgtcca gcctgggcag cgaggatacc gccgtgtact actgtgccag agaggaggat cacgctggca gcggcagcta cctgagcatg gacgtctggg gacagggcag caccgtgaca gtgagcagcg ctggaggcgg cggctccggc ggcggaggaa gcggaggcgg aggctccgac atcgtgatga cccagtcccc cgatagcctg gctgtgagcc tgggcgagag ggccacaatc aactgtaaga gcagccagaa cgtgctgtac tcctccaaca acaagaacta cctggcctgg taccagcaga aacctggcca tccccccaag ctgctgatct actgggccag caccagggag agcggagtgc ctgacaggtt tagcggcagc ggcagcggca cagactttac cctgaccatc acctccctgc agaccgagga cgtggccgtg tactattgcc agcagtacta cagctcccct ctgaccttcg gcggcggcac caaagtggag atcaaagcta gcgtgaaagg gaaacacctt tgtccaagtc ccctatttcc cggaccttct aagccctttt gggtgctggt ggtggttggt ggagtcctgg cttgctatag cttgctagta acagtggcct ttattatttt ctgggtgagg agtaagagga gcaggctcct gcacagtgac tacatgaaca tgactccccg ccgccccggg cccacccgca agcattacca gccctatgcc ccaccacgcg acttcgcagc ctatcgctcc aagcttagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag gacacctacg acgcccttca catgcaggcc ctgccccct
ＤＧ１１．２８．Ｚ ＣＡＲ（配列番号：２３０）
atggagtgga cttgggtatt ccttttcctc ctctccgtga cagcgggtgt gcactctgaa gtacaacttg tagagaccgg tgggggattg gtgcaaccca agggttccct gaaactctca tgtgctacct ctggttttac tttcaacacc tatgcaatga attgggttag gcaagcaccc ggtaaaggac ttgagtgggt ggcacggata cgcactaaga gtaatgacta tgctacgtac tacgcagact ccgtaaaagg ccggatcacc atatctcgag acgatagcca gtctatgctg tatcttcaaa tgaacaacct caaaacggaa gatacggcga tgtattactg cgtgcgagtt ggttataggc cttatgctat ggattactgg ggacagggca cgtctgtcac ggtaagttct gccggagggg ggggcagcgg aggaggagga tctggcggag ggggctccga tgtccttatg acacagactc ccctcagttt gcccgtgtcc ttgggggacc aggcttctat atcatgccgc agttcccaaa atatcgtcca ttcaaatggc aatacttacc ttgagtggta tttgcagaag cctggacaga gcccgacgct tctgatctat aaggtaagca acaggttcag tggtgtaccc gacagattta gtggaagtgg gtccggaact gatttcactc ttaagattag tcgggtagag gctgaagacc ttggggtgta ttattgcttt caagggagtc acgtccctct tacatttggt gctgggacta agttggagct gaaggctagc gtgaaaggga aacacctttg tccaagtccc ctatttcccg gaccttctaa gcccttttgg gtgctggtgg tggttggtgg agtcctggct tgctatagct tgctagtaac agtggccttt attattttct gggtgaggag taagaggagc aggctcctgc acagtgacta catgaacatg actccccgcc gccccgggcc cacccgcaag cattaccagc cctatgcccc accacgcgac ttcgcagcct atcgctccaa gcttagagtg aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg taccagcagg gccagaacca gctctataac gagctcaatc taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagagacg tggccgggac cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac gcccttcaca tgcaggccct gccccct
シグナル伝達シーケンス（配列番号：２３１）
atggaatgga cctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccac
ヒトＣＤ２８ヒンジ（配列番号：２３２）
gtgaaaggga aacacctttg tccaagtccc ctatttcccg gaccttctaa gccc
マウスＣＤ２８ヒンジ（配列番号：２３３）
ataaaagaga aacatctttg tcatactcag tcatctccta agctg
ヒトＣＤ８Ａヒンジ（配列番号：２３４）
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg gacttcgcct gtgat
ヒトＤＡＰ１０ヒンジ（配列番号：２３５）
cagacgaccc caggagagag atcatcactc cctgcctttt accctggcac ttcaggctcc tgttccggat gtgggtccct ctctctgccg
ヒトＣＤ２８ ＴＭ（配列番号：２３６）
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg gcctttatta ttttctgggt g
マウスＣＤ２８ ＴＭ（配列番号：２３７）
ttttgggcac tggtcgtggt tgctggagtc ctgttttgtt atggcttgct agtgacagtg gctctttgtg ttatctggac a
ヒトＣＤ８Ａ ＴＭ（配列番号：２３８）
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc accctttact gc
ヒトＤＡＰ１０ ＴＭ（配列番号：２３９）
ctcctggcag gcctcgtggc tgctgatgcg gtggcatcgc tgctcatcgt gggggcggtg ttc
ＤＧ０５－ＣＤ２８ｔｍ－ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ（配列番号：２４０）
ATGGAATGGACCTGGGTGTTTCTGTTCCTCCTGTCCGTGACCGCCGGAGTGCACTCCGAAGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGGAGGACTGGTGAAACCCGGAGGAAGCCTCAGACTGAGCTGCGCCGGCAGCGGCTTTACCTTCTCCAGCTACTCCATGCACTGGCTGAGACAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGGTCAGCGCCATCGGCACCGCCGGAGGCACATACTATGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACTCTCTGAGGGCCGAGGATACCGCTGTGTACTACTGCGCCAGGGAGTACTTCTTTGGCAGCGGCAACTACGGATACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGAGCTCCGCCGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGCGGAAGCGGAGGAGGCGGCAGCGAAATCGTGCTGACCCAGAGCCCTGCCACCCTGAGCCTGAGCCCTGGCGAAAGGGCCACCCTGAGCTGCAGAGCCAGCCAGAGCGTGAGCAGCTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGACAGGCCCCCAGACTGCTGATCTACGACGCCAGCAACAGAGCCACCGGCATTCCCGCCAGATTCTCCGGCAGCGGCAGCGGAACCGACTTCACACTGACCATCAGCTCCTTAGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGTCAGCAGAGAAGCAACTGGCCTCCCACCTTCGGCCAGGGCACAAAGGTGGAGATCAAGGCTAGCGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCCTGTGCGCACGCCCACGCCGCAGCCCCGCCCAAGAAGATGGCAAAGTCTACATCAACATGCCAGGCAGGGGCAAGCTTAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
ＤＧ０５－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ４４－ＣＤ３ζ（配列番号：２４１）
ATGGAATGGACCTGGGTGTTTCTGTTCCTCCTGTCCGTGACCGCCGGAGTGCACTCCGAAGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGGAGGACTGGTGAAACCCGGAGGAAGCCTCAGACTGAGCTGCGCCGGCAGCGGCTTTACCTTCTCCAGCTACTCCATGCACTGGCTGAGACAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGGTCAGCGCCATCGGCACCGCCGGAGGCACATACTATGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACTCTCTGAGGGCCGAGGATACCGCTGTGTACTACTGCGCCAGGGAGTACTTCTTTGGCAGCGGCAACTACGGATACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGAGCTCCGCCGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGCGGAAGCGGAGGAGGCGGCAGCGAAATCGTGCTGACCCAGAGCCCTGCCACCCTGAGCCTGAGCCCTGGCGAAAGGGCCACCCTGAGCTGCAGAGCCAGCCAGAGCGTGAGCAGCTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGACAGGCCCCCAGACTGCTGATCTACGACGCCAGCAACAGAGCCACCGGCATTCCCGCCAGATTCTCCGGCAGCGGCAGCGGAACCGACTTCACACTGACCATCAGCTCCTTAGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGTCAGCAGAGAAGCAACTGGCCTCCCACCTTCGGCCAGGGCACAAAGGTGGAGATCAAGGCTAGCGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGTCGAAGAAGGTGTGGGCAGAAGAAAAAGCTAGTGATCAACAGTGGCAATGGAGCTGTGGAGGACAGAAAGCCAAGTGGACTCAACGGAGAGGCCAGCAAGTCTCAGGAAATGGTGCATTTGGTGAACAAGGAGTCGTCAGAAACTCCAGACCAGTTTATGACAGCTGATGAGACAAGGAACCTGCAGAATGTGGACATGAAGATTGGGGTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
ＤＧ０５－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ３ζ（配列番号：２４２）
ATGGAATGGACCTGGGTGTTTCTGTTCCTCCTGTCCGTGACCGCCGGAGTGCACTCCGAAGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGGAGGACTGGTGAAACCCGGAGGAAGCCTCAGACTGAGCTGCGCCGGCAGCGGCTTTACCTTCTCCAGCTACTCCATGCACTGGCTGAGACAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGGTCAGCGCCATCGGCACCGCCGGAGGCACATACTATGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACTCTCTGAGGGCCGAGGATACCGCTGTGTACTACTGCGCCAGGGAGTACTTCTTTGGCAGCGGCAACTACGGATACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGAGCTCCGCCGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGCGGAAGCGGAGGAGGCGGCAGCGAAATCGTGCTGACCCAGAGCCCTGCCACCCTGAGCCTGAGCCCTGGCGAAAGGGCCACCCTGAGCTGCAGAGCCAGCCAGAGCGTGAGCAGCTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGACAGGCCCCCAGACTGCTGATCTACGACGCCAGCAACAGAGCCACCGGCATTCCCGCCAGATTCTCCGGCAGCGGCAGCGGAACCGACTTCACACTGACCATCAGCTCCTTAGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGTCAGCAGAGAAGCAACTGGCCTCCCACCTTCGGCCAGGGCACAAAGGTGGAGATCAAGGCTAGCGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
ＤＧ０５－ＣＤ２８（配列番号：２４３）
ATGGAATGGACCTGGGTGTTTCTGTTCCTCCTGTCCGTGACCGCCGGAGTGCACTCCGAAGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGGAGGACTGGTGAAACCCGGAGGAAGCCTCAGACTGAGCTGCGCCGGCAGCGGCTTTACCTTCTCCAGCTACTCCATGCACTGGCTGAGACAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGGTCAGCGCCATCGGCACCGCCGGAGGCACATACTATGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACTCTCTGAGGGCCGAGGATACCGCTGTGTACTACTGCGCCAGGGAGTACTTCTTTGGCAGCGGCAACTACGGATACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGAGCTCCGCCGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGCGGAAGCGGAGGAGGCGGCAGCGAAATCGTGCTGACCCAGAGCCCTGCCACCCTGAGCCTGAGCCCTGGCGAAAGGGCCACCCTGAGCTGCAGAGCCAGCCAGAGCGTGAGCAGCTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGACAGGCCCCCAGACTGCTGATCTACGACGCCAGCAACAGAGCCACCGGCATTCCCGCCAGATTCTCCGGCAGCGGCAGCGGAACCGACTTCACACTGACCATCAGCTCCTTAGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGTCAGCAGAGAAGCAACTGGCCTCCCACCTTCGGCCAGGGCACAAAGGTGGAGATCAAGGCTAGCGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC
ＤＧ０５－ＣＤ２８ｔｍ（配列番号：２４４）
ATGGAATGGACCTGGGTGTTTCTGTTCCTCCTGTCCGTGACCGCCGGAGTGCACTCCGAAGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGGAGGACTGGTGAAACCCGGAGGAAGCCTCAGACTGAGCTGCGCCGGCAGCGGCTTTACCTTCTCCAGCTACTCCATGCACTGGCTGAGACAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGGTCAGCGCCATCGGCACCGCCGGAGGCACATACTATGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACTCTCTGAGGGCCGAGGATACCGCTGTGTACTACTGCGCCAGGGAGTACTTCTTTGGCAGCGGCAACTACGGATACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGAGCTCCGCCGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGCGGAAGCGGAGGAGGCGGCAGCGAAATCGTGCTGACCCAGAGCCCTGCCACCCTGAGCCTGAGCCCTGGCGAAAGGGCCACCCTGAGCTGCAGAGCCAGCCAGAGCGTGAGCAGCTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGACAGGCCCCCAGACTGCTGATCTACGACGCCAGCAACAGAGCCACCGGCATTCCCGCCAGATTCTCCGGCAGCGGCAGCGGAACCGACTTCACACTGACCATCAGCTCCTTAGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGTCAGCAGAGAAGCAACTGGCCTCCCACCTTCGGCCAGGGCACAAAGGTGGAGATCAAGGCTAGCGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGAC
ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ－ＤＡＰ１０－ＣＤ３ζ（配列番号：２４５）
ATGGAATGGACCTGGGTGTTCCTGTTTCTGCTCTCCGTGACCGCCGGAGTGCACAGCGAGGTGCAGCTGGTCGAAAGCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCTCCGGCTTCACCTTTAGCAGCTACGGAATGTCCTGGGTGAGACAGGCTCCTGGCAAGGGCCTGGAACTGGTGGCCAGCATCAATAGCAACGGCGGCAGCACCTACTACCCTGATAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTCAGGGCCGAGGACACAGCCGTGTACTACTGCGCCAGCGGCGACTATTGGGGACAGGGAACAACCGTGACCGTCAGCAGCGCCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCTCCGATATCGTGATGACCCAGAGCCCCCTGTCCCTGCCTGTCACACCTGGCGAACCCGCCAGCATTAGCTGCAGGTCCAGCCAGAGCCTGGTGTACAGCAATGGCGACACCTACCTGCACTGGTACCTGCAGAAGCCTGGCCAGAGCCCCCAGCTGCTGATCTACAAGGTGAGCAACAGGTTCTCCGGAGTGCCTGACAGGTTCAGCGGCTCCGGCAGCGGAACCGATTTCACCCTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTCTACTATTGTAGCCAGAGCACCCACGTGCCCTGGACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAAGCTAGCGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCCTGTGCGCACGCCCACGCCGCAGCCCCGCCCAAGAAGATGGCAAAGTCTACATCAACATGCCAGGCAGGGGCAAGCTTAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ４４－ＣＤ３ζ（配列番号：２４６）
ATGGAATGGACCTGGGTGTTCCTGTTTCTGCTCTCCGTGACCGCCGGAGTGCACAGCGAGGTGCAGCTGGTCGAAAGCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCTCCGGCTTCACCTTTAGCAGCTACGGAATGTCCTGGGTGAGACAGGCTCCTGGCAAGGGCCTGGAACTGGTGGCCAGCATCAATAGCAACGGCGGCAGCACCTACTACCCTGATAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTCAGGGCCGAGGACACAGCCGTGTACTACTGCGCCAGCGGCGACTATTGGGGACAGGGAACAACCGTGACCGTCAGCAGCGCCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCTCCGATATCGTGATGACCCAGAGCCCCCTGTCCCTGCCTGTCACACCTGGCGAACCCGCCAGCATTAGCTGCAGGTCCAGCCAGAGCCTGGTGTACAGCAATGGCGACACCTACCTGCACTGGTACCTGCAGAAGCCTGGCCAGAGCCCCCAGCTGCTGATCTACAAGGTGAGCAACAGGTTCTCCGGAGTGCCTGACAGGTTCAGCGGCTCCGGCAGCGGAACCGATTTCACCCTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTCTACTATTGTAGCCAGAGCACCCACGTGCCCTGGACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAAGCTAGCGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGTCGAAGAAGGTGTGGGCAGAAGAAAAAGCTAGTGATCAACAGTGGCAATGGAGCTGTGGAGGACAGAAAGCCAAGTGGACTCAACGGAGAGGCCAGCAAGTCTCAGGAAATGGTGCATTTGGTGAACAAGGAGTCGTCAGAAACTCCAGACCAGTTTATGACAGCTGATGAGACAAGGAACCTGCAGAATGTGGACATGAAGATTGGGGTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ－４－１－ＢＢ－ＣＤ３ζ（配列番号：２４７）
ATGGAATGGACCTGGGTGTTCCTGTTTCTGCTCTCCGTGACCGCCGGAGTGCACAGCGAGGTGCAGCTGGTCGAAAGCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCTCCGGCTTCACCTTTAGCAGCTACGGAATGTCCTGGGTGAGACAGGCTCCTGGCAAGGGCCTGGAACTGGTGGCCAGCATCAATAGCAACGGCGGCAGCACCTACTACCCTGATAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTCAGGGCCGAGGACACAGCCGTGTACTACTGCGCCAGCGGCGACTATTGGGGACAGGGAACAACCGTGACCGTCAGCAGCGCCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCTCCGATATCGTGATGACCCAGAGCCCCCTGTCCCTGCCTGTCACACCTGGCGAACCCGCCAGCATTAGCTGCAGGTCCAGCCAGAGCCTGGTGTACAGCAATGGCGACACCTACCTGCACTGGTACCTGCAGAAGCCTGGCCAGAGCCCCCAGCTGCTGATCTACAAGGTGAGCAACAGGTTCTCCGGAGTGCCTGACAGGTTCAGCGGCTCCGGCAGCGGAACCGATTTCACCCTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTCTACTATTGTAGCCAGAGCACCCACGTGCCCTGGACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAAGCTAGCGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCCTCGAGAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAAGCTTAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ３ζ（配列番号：２４８）
ATGGAATGGACCTGGGTGTTCCTGTTTCTGCTCTCCGTGACCGCCGGAGTGCACAGCGAGGTGCAGCTGGTCGAAAGCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCTCCGGCTTCACCTTTAGCAGCTACGGAATGTCCTGGGTGAGACAGGCTCCTGGCAAGGGCCTGGAACTGGTGGCCAGCATCAATAGCAACGGCGGCAGCACCTACTACCCTGATAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTCAGGGCCGAGGACACAGCCGTGTACTACTGCGCCAGCGGCGACTATTGGGGACAGGGAACAACCGTGACCGTCAGCAGCGCCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCTCCGATATCGTGATGACCCAGAGCCCCCTGTCCCTGCCTGTCACACCTGGCGAACCCGCCAGCATTAGCTGCAGGTCCAGCCAGAGCCTGGTGTACAGCAATGGCGACACCTACCTGCACTGGTACCTGCAGAAGCCTGGCCAGAGCCCCCAGCTGCTGATCTACAAGGTGAGCAACAGGTTCTCCGGAGTGCCTGACAGGTTCAGCGGCTCCGGCAGCGGAACCGATTTCACCCTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTCTACTATTGTAGCCAGAGCACCCACGTGCCCTGGACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAAGCTAGCGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
ＤＧ０３－ＣＤ２８（配列番号：２４９）
ATGGAATGGACCTGGGTGTTCCTGTTTCTGCTCTCCGTGACCGCCGGAGTGCACAGCGAGGTGCAGCTGGTCGAAAGCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCTCCGGCTTCACCTTTAGCAGCTACGGAATGTCCTGGGTGAGACAGGCTCCTGGCAAGGGCCTGGAACTGGTGGCCAGCATCAATAGCAACGGCGGCAGCACCTACTACCCTGATAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTCAGGGCCGAGGACACAGCCGTGTACTACTGCGCCAGCGGCGACTATTGGGGACAGGGAACAACCGTGACCGTCAGCAGCGCCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCTCCGATATCGTGATGACCCAGAGCCCCCTGTCCCTGCCTGTCACACCTGGCGAACCCGCCAGCATTAGCTGCAGGTCCAGCCAGAGCCTGGTGTACAGCAATGGCGACACCTACCTGCACTGGTACCTGCAGAAGCCTGGCCAGAGCCCCCAGCTGCTGATCTACAAGGTGAGCAACAGGTTCTCCGGAGTGCCTGACAGGTTCAGCGGCTCCGGCAGCGGAACCGATTTCACCCTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTCTACTATTGTAGCCAGAGCACCCACGTGCCCTGGACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAAGCTAGCGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC
ＤＧ０３－ＣＤ２８ｔｍ（配列番号：２５０）
ATGGAATGGACCTGGGTGTTCCTGTTTCTGCTCTCCGTGACCGCCGGAGTGCACAGCGAGGTGCAGCTGGTCGAAAGCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCTCCGGCTTCACCTTTAGCAGCTACGGAATGTCCTGGGTGAGACAGGCTCCTGGCAAGGGCCTGGAACTGGTGGCCAGCATCAATAGCAACGGCGGCAGCACCTACTACCCTGATAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTCAGGGCCGAGGACACAGCCGTGTACTACTGCGCCAGCGGCGACTATTGGGGACAGGGAACAACCGTGACCGTCAGCAGCGCCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCTCCGATATCGTGATGACCCAGAGCCCCCTGTCCCTGCCTGTCACACCTGGCGAACCCGCCAGCATTAGCTGCAGGTCCAGCCAGAGCCTGGTGTACAGCAATGGCGACACCTACCTGCACTGGTACCTGCAGAAGCCTGGCCAGAGCCCCCAGCTGCTGATCTACAAGGTGAGCAACAGGTTCTCCGGAGTGCCTGACAGGTTCAGCGGCTCCGGCAGCGGAACCGATTTCACCCTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCCGAGGACGTGGGCGTCTACTATTGTAGCCAGAGCACCCACGTGCCCTGGACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAAGCTAGCGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG
ＮＤＭＭ Ｎｒｆ２（Ｋｅａｐ１阻害剤ペプチド）発現用構成物（配列番号：２５１）
ATGATGGATTTGGAACTTCCCCCCCCAGGGCTCCCATCCCAACAAGACATGGATCTCATAGACATACTGTGGAGACAGGACATCGATCTGGGGGTCAGCCGCGAAGTTTTCGACTTTTCACAAAGGCGGAAAGAATATGAATTGGAAAAGCAGAAAAAATTGGAAAAAGAACGCCAGGAACAGCTTCAGAAGGAGCAGGAAAAAGCCTTTTTTGCCCAGCTTCAGCTGGACGAGGAAACAGGGGAATTTCTCCCCATCCAACCAGCCCAG
ＮＤＭＭヒトカタラーゼ発現用構成物（配列番号：２５２）
ATGGCAGACAGTCGAGACCCTGCTagcGACCAAATGCAACATTGGAAAGAGCAACGGGCGGCCCAGAAAGCCGACGTTTTGACCACTGGGGCAGGTAATCCTGTTGGAGATAAGCTGAACGTcATcACGGTTGGACCCCGGGGACCGCTGCTCGTTCAAGACGTGGTTTTTACGGATGAGATGGCCCATTTTGATCGAGAGAGGATACCAGAAAGGGTTGTGCACGCTAAGGGCGCAGGTGCCTTCGGATATTTCGAGGTAACTCACGACATTACTAAGTATAGCAAGGCCAAGGTATTTGAACACATTGGCAAGAAGACGCCGATAGCGGTCCGATTCAGTACAGTGGCGGGCGAGTCAGGTTCAGCCGATACCGTGAGAGATCCGAGAGGATTTGCCGTGAAATTTTATACAGAGGACGGCAACTGGGACTTGGTAGGAAACAATACCCCAATATTTTTCATAAGGGACCCAATCCTTTTTCCCAGCTTTATTCATTCACAGAAGCGGAACCCACAAACGCACTTGAAAGATCCTGACATGGTGTGGGATTTTTGGAGCTTGAGGCCAGAGAGCCTGCACCAAGTGAGCTTCTTGTTCAGCGACAGAGGCATACCGGACGGTCATAGACACATGAACGGTTACGGTAGTCACACCTTCAAACTGGTGAACGCCAACGGAGAGGCTGTCTATTGTAAGTTCCACTATAAAACCGATCAAGGCATCAAAAACCTGAGCGTAGAGGACGCAGCCCGCCTTTCTCAAGAAGATCCAGACTATGGGATCCGGGATCTCTTTAACGCCATAGCTACGGGTAAATATCCCTCTTGGACGTTCTATATCCAGGTAATGACATTCAATCAAGCAGAGACTTTCCCCTTTAACCCGTTTGACCTTACTAAAGTATGGCCGCATAAGGACTACCCTCTGATTCCCGTCGGCAAACTCGTGCTTAACAGGAATCCAGTCAACTATTTCGCAGAAGTCGAGCAAATCGCCTTTGACCCTTCTAACATGCCGCCGGGAATCGAAGCGTCACCGGACAAGATGCTTCAAGGTCGGCTTTTCGCATACCCCGACACTCACCGACACAGACTGGGTCCGAATTATCTTCACATACCTGTCAACTGCCCATATAGAGCACGCGTTGCGAACTACCAGCGCGATGGTCCGATGTGCATGCAGGACAACCAGGGGGGGGCACCCAACTATTATCCAAATTCATTTGGGGCGCCGGAACAACAACCGTCAGCCCTTGAACACTCCATCCAGTATTCTGGCGAAGTAAGACGCTTCAACACGGCTAATGATGACAACGTTACACAGGTTAGAGCGTTTTATGTGAACGTCTTGAACGAGGAACAACGGAAACGACTTTGCGAAAACATAGCGGGTCATTTGAAAGATGCTCAGATTTTTATCCAAAAAAAAGCCGTCAAAAATTTTACCGAAGTCCACCCCGATTACGGTTCACATATTCAGGCCCTGTTGGATAAGTACAACGCGGAAAAGCCCAAGAATGCAATACACACGTTTGTTCAGAGCGGGAGCCACCTCGCTGCTCGAGAGAAAGCAAATCTG
ＮＤＭＭ ＢＤＮＦ発現用構成物（配列番号：２５３）
ATGACGATCCTGTTTCTGACAATGGTGATTAGCTATTTCGGATGTATGAAAGCCGCCCCGATGAAGGAGGCCAATATCAGGGGACAAGGTGGGCTGGCTTATCCGGGCGTAAGGACACACGGCACACTGGAGAGTGTGAACGGCCCGAAGGCCGGATCACGAGGATTGACGAGCCTCGCAGATACGTTTGAGCATGTAATCGAAGAGCTCTTGGATGAAGACCAAAAGGTCCGCCCCAATGAGGAGAACAACAAAGACGCAGACCTGTACACATCACGAGTTATGCTGTCAAGTCAAGTGCCGCTCGAACCACCACTCCTCTTTCTGCTGGAGGAGTACAAAAACTATTTGGACGCTGCTAACATGTCTATGCGAGTGCGCAGACATAGTGACCCTGCCAGACGCGGTGAGCTTTCAGTCTGTGATTCTATAAGTGAGTGGGTAACCGCAGCAGATAAGAAGACTGCCGTAGACATGTCAGGGGGAACTGTGACTGTACTTGAAAAGGTTCCCGTTTCTAAAGGGCAGCTCAAACAGTATTTCTATGAAACAAAGTGTAATCCAATGGGGTACACCAAGGAAGGTTGCAGGGGAATCGACAAGCGACATTGGAACAGTCAATGTCGGACCACTCAGAGCTACGTCCGCGCTCTCACGATGGATAGTAAGAAACGCATCGGGTGGAGATTCATCAGAATCGACACCTCTTGCGTCTGTACTCTTACAATTAAGCGAGGGCGA
ＮＤＭＭ ＩＧＦ－１発現用構成物（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５４）
ATGGGGAAAATCTCCTCTCTCCCTACCCAGTTGTTCAAGTGTTGCTTTTGTGACTTCTTGAAGGTAAAAATGCACACTATGTCATCCAGTCACCTTTTTTATTTGGCTCTGTGCCTCCTCACATTCACCAGTTCAGCTACTGCCGGGCCTGAAACACTCTGCGGCGCCGAACTCGTTGATGCGCTTCAATTCGTGTGTGGAGATAGGGGGTTTTACTTTAACAAGCCGACGGGTTATGGTAGCTCAAGTAGACGAGCGCCACAGACTGGAATAGTAGATGAATGCTGTTTCCGCTCATGCGACCTTCGCAGATTGGAAATGTACTGCGCTCCTCTTAAACCAGCAAAGAGTGCGCGGTCCGTGCGAGCCCAACGACATACCGATATGCCAAAAACCCAGAAATATCAGCCGCCGTCTACCAACAAGAACACCAAGAGTCAGAGGAGAAAGGGTTGGCCCAAGACGCACCCGGGTGGCGAACAAAAAGAAGGTACTGAGGCAAGTTTGCAAATTCGAGGAAAGAAGAAAGAACAACGAAGAGAGATAGGTTCTCGCAATGCGGAATGTCGAGGCAAAAAAGGTAAG
フォワードプライマーヒトβ－アクチン（配列番号：２５５）
GGC CGA GGA CTT TGA TTG C
リバースプライマーヒトβ－アクチン（配列番号：２５６）
TGG GGT GGC TTT TAG GAT GG
フォワードプライマーヒトＩＬ－４（配列番号：２５７）
GCT TCC CCC TCT GTT CTT CC
リバースプライマーヒトＩＬ－４（配列番号：２５８）
GAT GTC TGT TAC GGT CAA CTC G
フォワードプライマーヒトＩＬ－１０（配列番号：２５９）
TCA AGG CGC ATG TGA ACT CC
リバースプライマーヒトＩＬ－１０（配列番号：２６０）
CAG GGA AGA AAT CGA TGA CAG C
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【図17A】
【図17B】
【図18】
【図19A】
【図19B】
【図20A】
【図20B】
【図21A】
【図21B】
【図21C】
【図22A】
【図22B】
【図22C】
【図23A】
【図23B】
【配列表】