特許 7387885 癌処置のための多重特異性結合タンパク質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-11-17

(45)【発行日】2023-11-28

(54)【発明の名称】癌処置のための多重特異性結合タンパク質

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/46 20060101AFI20231120BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20231120BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20231120BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20231120BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20231120BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20231120BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20231120BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20231120BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20231120BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20231120BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20231120BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20231120BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20231120BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20231120BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20231120BHJP

【ＦＩ】

C07K16/46

C12N15/13 ZNA

C07K16/28

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

A61K39/395 N

A61P35/00

A61P1/00

A61P11/00

A61P43/00 111

A61P43/00 105

A61K45/00

【請求項の数】 21

(21)【出願番号】P 2022520371

(86)(22)【出願日】2020-10-01

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-12-07

(86)【国際出願番号】 EP2020077586

(87)【国際公開番号】W WO2021064137

(87)【国際公開日】2021-04-08

【審査請求日】2022-12-16

(31)【優先権主張番号】19201200.3

(32)【優先日】2019-10-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】503385923

【氏名又は名称】ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング

(74)【代理人】

【識別番号】110001508

【氏名又は名称】弁理士法人 津国

(72)【発明者】

【氏名】ヒップ，スザンヌ

(72)【発明者】

【氏名】アダム，パウル

(72)【発明者】

【氏名】ジェゲルウスキ，ミヒャエル

(72)【発明者】

【氏名】ガネサン，ラクマー

(72)【発明者】

【氏名】ゴーマン，フィリップ・ニコラス

(72)【発明者】

【氏名】グプタ，パンカジ

(72)【発明者】

【氏名】グプタ，プリヤンカー

(72)【発明者】

【氏名】ラサロ，マルシオ

(72)【発明者】

【氏名】シェアー，ジャスティン・エム

(72)【発明者】

【氏名】ヴォイノフ，ウラジミール・エイチ

【審査官】松原 寛子

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１４－５１７８４４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１８－０８８９３８（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１７／１８１００１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１５－５１９３３７（ＪＰ，Ａ）

【文献】Human/Cynomolgus Monkey B7-H6 Antibody ，R＆D systems product catalog [online]，2019年05月28日， [検索日 2022.01.04], インターネット: <URL：https://resources.rndsystems.com/pdfs/datasheets/mab10162.pdf>

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／１３

Ｃ０７Ｋ １６／４６

Ｃ０７Ｋ １６／２８

Ｃ１２Ｎ １５／６３

Ｃ１２Ｎ １／１５

Ｃ１２Ｎ １／１９

Ｃ１２Ｎ １／２１

Ｃ１２Ｎ ５／１０

Ｃ１２Ｐ ２１／０８

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ａ６１Ｐ １／０４

Ａ６１Ｐ １１／００

Ａ６１Ｐ １／０２

Ａ６１Ｐ １１／０２

Ａ６１Ｐ １１／０４

Ａ６１Ｐ ４３／００

Ａ６１Ｋ ４５／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｂ７Ｈ６に特異的に結合する第１の抗原結合単位とＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合単位とを含むタンパク質であって、前記Ｂ７Ｈ６に特異的に結合する第１の抗原結合単位は、ｉ）～ｉｉｉ）：
ｉ）配列番号：７９（ＣＤＲ１）、配列番号：８０（ＣＤＲ２）及び配列番号：８１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：８２（ＣＤＲ１）、配列番号：８３（ＣＤＲ２）及び配列番号：８４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位；
ｉｉ）配列番号：８５（ＣＤＲ１）、配列番号：８６（ＣＤＲ２）及び配列番号：８７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：８８（ＣＤＲ１）、配列番号：８９（ＣＤＲ２）及び配列番号：９０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位；
ｉｉｉ）配列番号：９１（ＣＤＲ１）、配列番号：９２（ＣＤＲ２）及び配列番号：９３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：９４（ＣＤＲ１）、配列番号：９５（ＣＤＲ２）及び配列番号：９６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位
から選択され、
ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合単位は、配列番号：２５７（ＣＤＲ１）、配列番号：２５８（ＣＤＲ２）及び配列番号：２５９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：２６０（ＣＤＲ１）、配列番号：２６１（ＣＤＲ２）及び配列番号：２６２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを含む、
タンパク質。

【請求項2】

前記Ｂ７Ｈ６に特異的に結合する第１の抗原結合単位が、ｉ）～ｉｉｉ）：
ｉ）配列番号：１７１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１７２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン；
ｉｉ）配列番号：１７３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１７４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン；
ｉｉｉ）配列番号：１７５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１７６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン
からなる群より選択される、請求項１に記載のタンパク質。

【請求項3】

前記ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合単位が、
配列番号：２９３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：２９４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン
を含む、請求項１又は２に記載のタンパク質。

【請求項4】

ｉ）前記Ｂ７Ｈ６に特異的に結合する第１の抗原結合単位が、そのＮ末端からＣ末端へ、第１の軽鎖可変ドメインと、第１の軽鎖定常ドメインと、第１のペプチドリンカーと、第１の重鎖可変ドメインと、第１の重鎖定常ＣＨ１ドメインとを含み；及び
ｉｉ）前記ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合単位が、そのＮ末端からＣ末端へ、第２の軽鎖可変ドメインと、第２の軽鎖定常ドメインと、第２のペプチドリンカーと、第２の重鎖可変ドメインと、第２の重鎖定常ＣＨ１ドメインとを含む；
請求項１～３のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項5】

前記Ｂ７Ｈ６に対して特異的な第１の抗原結合単位が、配列番号：２０６、配列番号：２０７、及び配列番号：２０８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＣＤ３に対して特異的な第２の抗原結合単位が、配列番号：３０５のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載のタンパク質。

【請求項6】

第１及び第２のＦｃドメインをさらに含み、前記第１のＦｃドメインは前記第１の抗原結合単位に共有結合されており、前記第２のＦｃドメインは前記第２の抗原結合単位に共有結合されている、請求項４又は５に記載のタンパク質。

【請求項7】

ｉ）前記第１のＦｃドメインが位置３６６にチロシン（Ｙ）［Ｔ３６６Ｙ］を含み、前記第２のＦｃドメインが位置４０７にトレオニン（Ｔ）［Ｙ４０７Ｔ］を含み、又は
ｉｉ）前記第１のＦｃドメインが位置３６６にトリプトファン（Ｗ）［Ｔ３６６Ｗ］を含み、前記第２のＦｃドメインが位置３６６にセリン（Ｓ）［Ｔ３６６Ｓ］、位置３６８にアラニン（Ａ）［Ｌ３６８Ａ］及び位置４０７にバリン（Ｖ）［Ｙ４０７Ｖ］を含み、又は
ｉｉｉ）前記第２のＦｃドメインが位置３６６にチロシン（Ｙ）［Ｔ３６６Ｙ］を含み、前記第１のＦｃドメインが位置４０７にトレオニン（Ｔ）［Ｙ４０７Ｔ］を含み、又は
ｉｖ）前記第２のＦｃドメインが位置３６６にトリプトファン（Ｗ）［Ｔ３６６Ｗ］を含み、前記第１のＦｃドメインが位置３６６にセリン（Ｓ）［Ｔ３６６Ｓ］、位置３６８にアラニン（Ａ）［Ｌ３６８Ａ］及び位置４０７にバリン（Ｖ）［Ｙ４０７Ｖ］を含む、
請求項６に記載のタンパク質。

【請求項8】

前記第１及び／又は前記第２のＦｃドメインが、位置２３４にアラニン［Ｌ２３４Ａ］及び位置２３５にアラニン［Ｌ２３５Ａ］を含む、請求項６又は７に記載のタンパク質。

【請求項9】

配列番号：２３０、配列番号：２３１、及び配列番号：２３２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、Ｂ７Ｈ６に特異的に結合する第１のポリペプチド鎖と、配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２のポリペプチド鎖とを含む、請求項４～８のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項10】

前記第１及び前記第２のポリペプチド鎖が、ジスルフィド結合を介して連結され、二重特異性の、二価の及びヘテロ二量体のタンパク質を形成している、請求項９に記載のタンパク質。

【請求項11】

一方の発現ベクターが配列番号：２３０、配列番号：２３１又は配列番号：２３２のいずれかの第１のポリペプチド鎖をコードし、そして他方の発現ベクターが、配列番号：３３１１の第２のポリペプチド鎖をコードしている、２つの発現ベクターで形質導入された宿主細胞。

【請求項12】

請求項９に記載のタンパク質を製造する方法であって、
ｉ）請求項９に記載のタンパク質の発現を可能にする条件下で、請求項１１に記載の前記宿主細胞を培養することと；
ｉｉ）前記タンパク質を回収すること
を含む、方法。

【請求項13】

前記タンパク質をさらに精製及び／又は修飾及び／又は製剤化することを含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

医薬において使用するための、請求項１～１０のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項15】

請求項１～１０のいずれか一項に記載のタンパク質と、薬学的に許容し得る担体とを含む、医薬組成物。

【請求項16】

癌を処置する方法において使用するための、請求項１～１０のいずれか一項に記載のタンパク質。

【請求項17】

前記癌が、Ｂ７Ｈ６発現腫瘍である、請求項１６に記載の使用のためのタンパク質。

【請求項18】

前記癌が、（転移性）結腸直腸癌（（ｍ）ＣＲＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、又は頭頸部扁平上皮癌腫（ＨＮＳＣＣ）である、請求項１７に記載の使用のためのタンパク質。

【請求項19】

前記タンパク質が、細胞傷害性若しくは細胞分裂阻害性化学療法剤、血管新生を阻害する治療活性化合物、シグナル伝達経路阻害剤（例えば、ＥＧＦＲ阻害剤）、免疫調節剤、免疫チェックポイント阻害剤、有糸分裂チェックポイント阻害剤又はホルモン療法剤と組み合わせて使用される、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の使用のためのタンパク質。

【請求項20】

前記タンパク質が、免疫チェックポイント阻害剤、抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせて使用される、請求項１９に記載の使用のためのタンパク質。

【請求項21】

前記抗ＰＤ－１抗体が、ＰＤ１－１、ＰＤ１－２、ＰＤ１－３、ＰＤ１－４及びＰＤ１－５からなる群より選択される、請求項２０に記載の使用のためのタンパク質。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Ｂ７Ｈ６に対して特異的な第１の抗原結合単位（本明細書では「Ｂ７－Ｈ６」とも呼ばれる）とＣＤ３に対して特異的な第２の抗原結合単位とを含む多重特異性結合タンパク質に関する。本発明は、このような結合タンパク質をコードする核酸、このような結合タンパク質を調製するための方法、このような結合タンパク質を発現する又は発現することができる宿主細胞、このような結合タンパク質を含む組成物、及び特に癌疾患の分野における治療目的のためのこのような結合タンパク質又はこのような組成物の使用にも関する。

【背景技術】

【0002】

Ｂ７Ｈ６は、標的細胞に対する自然免疫を誘引することが知られている腫瘍選択的Ｂ７ファミリーのメンバーであり、細胞外ドメイン中の２つのＩｇ様ドメインと、Ｎ末端ＩｇＶ様ドメインと、Ｃ末端ＩｇＣ１様ドメインとを有する他のＢ７ファミリーのメンバーと類似の機能を共有する。Ｂ７Ｈ６は、ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のＮＫｐ３０媒介性活性化の引き金を引き、脱顆粒及びＩＦＮγ分泌をもたらす。（Brandt et al.,J.Exp.Med.2009 206(7);1495-1503）。現在入手可能なデータは、感染性症状に対する炎症応答における他、固形腫瘍におけるＢ７Ｈ６の役割を示唆している。

【0003】

Ｂ７Ｈ６は、敗血症の急性疾患状態における炎症過程の結果として敗血症患者の末梢血から単離されたＣＤ１４^＋ＣＤ１６^＋細胞上に発現されることが示されている。ＩＬ－１β及びＴＮＦαによる刺激に際してのＣＤ１４^＋ＣＤ１６^＋炎症誘発性単球及び好中球の細胞表面上のＢ７Ｈ６の上方制御のインビトロ分析によって、これらの知見は確認されており（Matta et al.,Blood 2013 122(3)）、敗血症症状に対する炎症応答におけるＢ７Ｈ６の役割が示唆される。

【0004】

前述の敗血症症状は例外として、Ｂ７Ｈ６は、腫瘍細胞において選択的に発現され、定常状態における正常なヒト組織では検出することができなかった。例えば、Ｂ７Ｈ６の発現は、Ｔ細胞リンパ腫、骨髄性白血病、結腸（colon）癌腫、乳癌及び卵巣癌腫細胞株（Brandt et al.,J.Exp.Med.2009 206(7):1495-1503;Li et al.,J.Exp.Med.2011 208(4);Greaves et al.,Blood 2013 121(5);Zhang et al.,Oncology Letters,2018,16:91-96）、非小細胞肺癌組織（Zhang et al.,Int J clin Exp Pathol 2014;7(10):6936-6942）、胃腸腫瘍組織（Chen et al.,Pathol.Oncol.Res.2014 20:203-207;Zhao et al.,Cell Proliferation,2018;e12468）、卵巣癌腫組織（Zhou et al.,Int clin Exp Pathol 2015 8(8)、口腔扁平上皮癌腫組織（Wang et al.,J Oral Pathol Med.2017;46:766-772）及び肝細胞癌腫組織（Li et al.,Int.J.Mol.Sci.2019,20,156）について記載されているが、腫瘍におけるＢ７Ｈ６の機能は完全には理解されていない。

【0005】

ＡＤＣＣ／ＣＤＣ経路を誘導する抗Ｂ７Ｈ６抗体又は抗Ｂ７Ｈ６抗体－薬物抱合体を使用する癌の処置を含む治療用途が、国際公開第２００９／０４６４０７Ａ２号及び国際公開第２０１１／０７０４４Ａ２号に記載されている。

【0006】

しかしながら、ＡＤＣＣ／ＣＤＣ活性に基づくＢ７Ｈ６標的化療法は、Ｂ７Ｈ６の細胞表面発現が低く、固形腫瘍においてＡＤＣＣ／ＣＤＣ活性を有する従来の抗体を使用した成功率が低いため、最適な作用様式ではない。

【0007】

患者の大部分が化学療法処置後に再発し、細胞表面上のＢ７Ｈ６の発現が低いため、Ｂ７Ｈ６特異的抗体薬物抱合体（ＡＤＣ）に基づく標的化療法も制限を有する可能性がある。さらに、ＡＤＣアプローチは、リンカーの不安定性又は分解の結果として遊離の薬物によって引き起こされるオフターゲット毒性をしばしば有する。

【0008】

ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＴ細胞誘導性抗体は、Ｂ７Ｈ６を発現している固形腫瘍の標的化療法のためのさらなるアプローチである（Wu et al.,Gene,2015 22,675-684;Hua et al.,Protein Engineering,Design&Selection,201730(10),713-721;国際公開第２０１７／１８１００１号）。例えば、Ｗｕら（J Immunol.2015 Jun 1;194(11):5305-11）は、Ｂ７Ｈ６特異的ＢｉＴＥを用いた前臨床データを記載しており、ＢｉＴＥは、２つの単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）からなる約５５Ｋｄａの融合タンパク質である二重（Ｂｉ）特異性Ｔ細胞誘導（Engager）を表す。その事例では、Ｂ７Ｈ６特異的ＢｉＴＥは、ＯＫＴ３－ＣＤ３－結合剤及び以前に公開されたＢ７Ｈ６抗体（Zhang et al.,J Immunol.2012 Sep 1;189(5):2290-9；国際公開第２０１３／１６９６９１号）に基づいて操作された。しかしながら、ＯＫＴ３抗体はカニクイザルＣＤ３と交差反応性がなく、したがって、臨床試験の準備のための好ましい試験種であるカニクイザルにおける前臨床毒性試験を可能にしない（Chatenoud et al.,The Rev Diabet Stud 2012;9(4):372-381）。さらなる課題は、比較的小さく容易に分解されるＢｉＴＥ分子の半減期が短いことであり、診療所での連続静脈内投与を必要とする。したがって、このアプローチが成功するかどうかは証明されていない。現在までのところ、Ｂ７－Ｈ６発現腫瘍に対する標的化療法は利用可能ではなく、現在のアプローチによっては対処されていない、満たされていないニーズがなお存在している。

【0009】

例えば、結腸直腸癌（ＣＲＣ）は、Ｂ７－Ｈ６の高い保有率及び予測可能な発現を示す。結腸直腸癌（ＣＲＣ）は、世界中の癌罹患率及び死亡率の主な原因の１つである。ＣＲＣ患者の約２５％が病初に明白な転移を示し、新たに診断された患者の４０～５０％に転移性疾患が発症する。化学療法及び標的化療法における最近の改善は、転移性ＣＲＣの生存期間を延長したが、ほとんどの患者はその疾患で死亡するであろう。

【0010】

進行した疾患を有する癌患者の予後が不良であることに鑑みて、より有効な療法、特に改善された忍容性を有する有効な治療法を特定する必要が存在している。

【0011】

したがって、本発明の目的は、当技術分野で現在使用されている及び／又は公知の作用物質、組成物及び／又は方法と比較してある特定の利点を提供する薬理学的に活性な作用物質、組成物及び／又は処置の方法を提供することである。これらの利点には、改善された治療特性及び薬理学的特性、例えばインビボ有効性、より少ない副作用、低下した免疫原性、改善した治療域、低減した投与（例えば、注入）回数、より少ない投与量、より少ない頻度の投薬を可能にするための延長された半減期、及びその他の有利な特性、例えば、特に当技術分野で既に公知の候補薬物と比較して、改善された調製の容易さ、安定性、従来の抗体過程との適合性、又は削減された商品のコストが含まれる。

【発明の概要】

【0012】

本発明は、Ｔ細胞上に発現されるＣＤ３への結合アームと腫瘍細胞の細胞表面上に発現されるＢ７Ｈ６への結合アームとを有する多重特異性結合タンパク質を用いる二重特異性Ｔ細胞誘導アプローチに基づく。Ｔ細胞と腫瘍細胞に同時に結合することを通じて、本発明のＴ細胞誘導は、２つの細胞間に細胞溶解性シナプスの形成を強制し、それによって標的とされる腫瘍細胞へとＴ細胞活性を選択的にリダイレクトする。

【0013】

一態様において、本発明は、Ｂ７Ｈ６に特異的に結合する第１の抗原結合単位と、ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合単位とを含む多重特異性結合タンパク質であって、前記Ｂ７Ｈ６に特異的に結合する第１の抗原結合単位は、ｉ）～ｘｘｉｖ）：
ｉ）配列番号：１（ＣＤＲ１）、配列番号：２（ＣＤＲ２）及び配列番号：３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：４（ＣＤＲ１）、配列番号：５（ＣＤＲ２）及び配列番号：６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位；
ｉｉ）配列番号：７（ＣＤＲ１）、配列番号：８（ＣＤＲ２）及び配列番号：９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：１０（ＣＤＲ１）、配列番号：１１（ＣＤＲ２）及び配列番号：１２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位；
ｉｉｉ）配列番号：１３（ＣＤＲ１）、配列番号：１４（ＣＤＲ２）及び配列番号：１５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：１６（ＣＤＲ１）、配列番号：１７（ＣＤＲ２）及び配列番号：１８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位；
ｉｖ）配列番号：１９（ＣＤＲ１）、配列番号：２０（ＣＤＲ２）及び配列番号：２１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：２２（ＣＤＲ１）、配列番号：２３（ＣＤＲ２）及び配列番号：２４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位；
ｖ）配列番号：２５（ＣＤＲ１）、配列番号：２６（ＣＤＲ２）及び配列番号：２７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：２８（ＣＤＲ１）、配列番号：２９（ＣＤＲ２）及び配列番号：３０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位；
ｖｉ）配列番号：３１（ＣＤＲ１）、配列番号：３２（ＣＤＲ２）及び配列番号：３３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：３４（ＣＤＲ１）、配列番号：３５（ＣＤＲ２）及び配列番号：３６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位；
ｖｉｉ）配列番号：３７（ＣＤＲ１）、配列番号：３８（ＣＤＲ２）及び配列番号：３９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：４０（ＣＤＲ１）、配列番号：４１（ＣＤＲ２）及び配列番号：４２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位；
ｖｉｉｉ）配列番号：４３（ＣＤＲ１）、配列番号：４４（ＣＤＲ２）及び配列番号：４５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：４６（ＣＤＲ１）、配列番号：４７（ＣＤＲ２）及び配列番号：４８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位；
ｉｘ）配列番号：４９（ＣＤＲ１）、配列番号：５０（ＣＤＲ２）及び配列番号：５１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：５２（ＣＤＲ１）、配列番号：５３（ＣＤＲ２）及び配列番号：５４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位；
ｘ）配列番号：５５（ＣＤＲ１）、配列番号：５６（ＣＤＲ２）及び配列番号：５７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：５８（ＣＤＲ１）、配列番号：５９（ＣＤＲ２）及び配列番号：６０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位；
ｘｉ）配列番号：６１（ＣＤＲ１）、配列番号：６２（ＣＤＲ２）及び配列番号：６３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：６４（ＣＤＲ１）、配列番号：６５（ＣＤＲ２）及び配列番号：６６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位；
ｘｉｉ）配列番号：６７（ＣＤＲ１）、配列番号：６８（ＣＤＲ２）及び配列番号：６９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：７０（ＣＤＲ１）、配列番号：７１（ＣＤＲ２）及び配列番号：７２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位；
ｘｉｉｉ）配列番号：７３（ＣＤＲ１）、配列番号：７４（ＣＤＲ２）及び配列番号：７５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：７６（ＣＤＲ１）、配列番号：７７（ＣＤＲ２）及び配列番号：７８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位；
ｘｉｖ）配列番号：７９（ＣＤＲ１）、配列番号：８０（ＣＤＲ２）及び配列番号：８１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：８２（ＣＤＲ１）、配列番号：８３（ＣＤＲ２）及び配列番号：８４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位；
ｘｖ）配列番号：８５（ＣＤＲ１）、配列番号：８６（ＣＤＲ２）及び配列番号：８７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：８８（ＣＤＲ１）、配列番号：８９（ＣＤＲ２）及び配列番号：９０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位；
ｘｖｉ）配列番号：９１（ＣＤＲ１）、配列番号：９２（ＣＤＲ２）及び配列番号：９３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：９４（ＣＤＲ１）、配列番号：９５（ＣＤＲ２）及び配列番号：９６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位；
ｘｖｉｉ）配列番号：９７（ＣＤＲ１）、配列番号：９８（ＣＤＲ２）及び配列番号：９９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：１００（ＣＤＲ１）、配列番号：１０１（ＣＤＲ２）及び配列番号：１０２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位；
ｘｖｉｉｉ）配列番号：１０３（ＣＤＲ１）、配列番号：１０４（ＣＤＲ２）及び配列番号：１０５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：１０６（ＣＤＲ１）、配列番号：１０７（ＣＤＲ２）及び配列番号：１０８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位；
ｘｉｘ）配列番号：１０９（ＣＤＲ１）、配列番号：１１０（ＣＤＲ２）及び配列番号：１１１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：１１２（ＣＤＲ１）、配列番号：１１３（ＣＤＲ２）及び配列番号：１１４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位；
ｘｘ）配列番号：１１５（ＣＤＲ１）、配列番号：１１６（ＣＤＲ２）及び配列番号：１１７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：１１８（ＣＤＲ１）、配列番号：１１９（ＣＤＲ２）及び配列番号：１２０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位；
ｘｘｉ）配列番号：１２１（ＣＤＲ１）、配列番号：１２２（ＣＤＲ２）及び配列番号：１２３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：１２４（ＣＤＲ１）、配列番号：１２５（ＣＤＲ２）及び配列番号：１２６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位；
ｘｘｉｉ）配列番号：１２７（ＣＤＲ１）、配列番号：１２８（ＣＤＲ２）及び配列番号：１２９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：１３０（ＣＤＲ１）、配列番号：１３１（ＣＤＲ２）及び配列番号：１３２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位；
ｘｘｉｉｉ）配列番号：１３３（ＣＤＲ１）、配列番号：１３４（ＣＤＲ２）及び配列番号：１３５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：１３６（ＣＤＲ１）、配列番号：１３７（ＣＤＲ２）及び配列番号：１３８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位；並びに
ｘｘｉｖ）配列番号：１３９（ＣＤＲ１）、配列番号：１４０（ＣＤＲ２）及び配列番号：１４１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：１４２（ＣＤＲ１）、配列番号：１４３（ＣＤＲ２）及び配列番号：１４４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位；
からなる群より選択される、多重特異性結合タンパク質を提供する。

【0014】

本発明の結合タンパク質のいくつかの実施形態において、Ｂ７Ｈ６に特異的に結合する第１の抗原結合単位は、ｉ）～ｘｘｉｖ）：
ｉ）配列番号：１４５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン；
ｉｉ）配列番号：１４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン；
ｉｉｉ）配列番号：１４９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１５０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン；
ｉｖ）配列番号：１５１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１５２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン；
ｖ）配列番号：１５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１５４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン；
ｖｉ）配列番号：１５５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１５６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン；
ｖｉｉ）配列番号：１５７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン；
ｖｉｉｉ）配列番号：１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１６０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン；
ｉｘ）配列番号：１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１６２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン；
ｘ）配列番号：１６３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１６４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン；
ｘｉ）配列番号：１６５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１６６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン；
ｘｉｉ）配列番号：１６７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１６８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン；
ｘｉｉｉ）配列番号：１６９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１７０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン；
ｘｉｖ）配列番号：１７１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１７２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン；
ｘｖ）配列番号：１７３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１７４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン；
ｘｖｉ）配列番号：１７５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１７６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン；
ｘｖｉｉ）配列番号：１７７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１７８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン；
ｘｖｉｉｉ）配列番号：１７９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１８０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン；
ｘｉｘ）配列番号：１８１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１８２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン；
ｘｘ）配列番号：１８３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１８４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン；
ｘｘｉ）配列番号：１８５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１８６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン；
ｘｘｉｉ）配列番号：１８７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１８８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン；
ｘｘｉｉｉ）配列番号：１８９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１９０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン；並びに
ｘｘｉｖ）配列番号：１９１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１９２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン；
からなる群より選択される。

【0015】

本発明の結合タンパク質のいくつかの実施形態において、ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合単位は、ｉ）～ｖｉ）：
ｉ）配列番号：２５７（ＣＤＲ１）、配列番号：２５８（ＣＤＲ２）及び配列番号：２５９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：２６０（ＣＤＲ１）、配列番号：２６１（ＣＤＲ２）及び配列番号：２６２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位；
ｉｉ）配列番号：２６３（ＣＤＲ１）、配列番号：２６４（ＣＤＲ２）及び配列番号：２６５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：２６６（ＣＤＲ１）、配列番号：２６７（ＣＤＲ２）及び配列番号：２６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位；
ｉｉｉ）配列番号：２６９（ＣＤＲ１）、配列番号：２７０（ＣＤＲ２）及び配列番号：２７１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：２７２（ＣＤＲ１）、配列番号：２７３（ＣＤＲ２）及び配列番号：２７４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位；
ｉｖ）配列番号：２７５（ＣＤＲ１）、配列番号：２７６（ＣＤＲ２）及び配列番号：２７７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：２７８（ＣＤＲ１）、配列番号：２７９（ＣＤＲ２）及び配列番号：２８０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位；
ｖ）配列番号：２８１（ＣＤＲ１）、配列番号：２８２（ＣＤＲ２）及び配列番号：２８３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：２８４（ＣＤＲ１）、配列番号：２８５（ＣＤＲ２）及び配列番号：２８６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位；並びに
ｖｉ）配列番号：２８７（ＣＤＲ１）、配列番号：２８８（ＣＤＲ２）及び配列番号：２８９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：２９０（ＣＤＲ１）、配列番号：２９１（ＣＤＲ２）及び配列番号：２９２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位；
からなる群より選択される。

【0016】

本発明の結合タンパク質のいくつかの実施形態において、ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合単位は、ｉ）～ｖｉ）：
ｉ）配列番号：２９３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：２９４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン；
ｉｉ）配列番号２９５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号２９６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン；
ｉｉｉ）配列番号：２９７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：２９８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン；
ｉｖ）配列番号：２９９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号３００のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン；
ｖ）配列番号：３０１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号３０２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン；並びに
ｖｉ）配列番号３０３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号３０４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン；
からなる群より選択される。

【0017】

本発明の結合タンパク質のいくつかの実施形態において、Ｂ７Ｈ６に特異的に結合する第１の抗原結合単位は、そのＮ末端からＣ末端へ、第１の軽鎖可変ドメインと、第１の軽鎖定常ドメインと、第１のペプチドリンカーと、第１の重鎖可変ドメインと、第１の重鎖定常ＣＨ１ドメインとを含み；及びＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合単位は、そのＮ末端からＣ末端へ、第２の軽鎖可変ドメインと、第２の軽鎖定常ドメインと、第２のペプチドリンカーと、第２の重鎖可変ドメインと、第２の重鎖定常ＣＨ１ドメインとを含む。本発明の結合タンパク質のいくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のペプチドリンカーは、２６～４２個のアミノ酸、好ましくは３０～４０個のアミノ酸、３４～４０個のアミノ酸、又は３６～３９個のアミノ酸の任意の１つ、より好ましくは３８個のアミノ酸を含む。本発明のいくつかの実施形態において、第１のリンカー及び／又は第２のリンカーは、好ましくは配列番号：２５０のアミノ酸配列を含むＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーであり、より好ましくは前記第１及び第２のペプチドリンカーが同じ配列（例えば、配列番号：２５０）を含む。本発明のいくつかの実施形態において、第１の軽鎖定常ドメイン及び第２の軽鎖定常ドメインは、独立して、ヒトのカッパ又はラムダドメインを含む。

【0018】

いくつかの実施形態において、本発明の結合タンパク質のＢ７Ｈ６に対して特異的な第１の抗原結合単位は、配列番号：１９３、配列番号：１９４、配列番号：１９５、配列番号：１９６、配列番号：１９７、配列番号：１９８、配列番号：１９９、配列番号：２００、配列番号：２０１、配列番号：２０２、配列番号：２０３、配列番号：２０４、配列番号：２０５、配列番号：２０６、配列番号：２０７、配列番号：２０８、配列番号：２０９、配列番号：２１０、配列番号：２１１、配列番号：２１２、配列番号：２１３、配列番号：２１４、配列番号：２１５及び配列番号：２１６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、ＣＤ３に対して特異的な第２の抗原結合単位は、配列番号：３０５、配列番号：３０６、配列番号：３０７、配列番号：３０８、配列番号：３０９及び配列番号：３１０からなる群、好ましくは配列番号：３０５より選択されるアミノ酸配列を含む。

【0019】

いくつかの実施形態において、本発明の結合タンパク質は、第１及び第２のＦｃドメインをさらに含み、前記第１のＦｃドメインは前記第１の抗原結合単位に、好ましくは前記第１の抗原結合単位のＣ末端に共有結合されており、前記第２のＦｃドメインは前記第２の抗原結合単位に、好ましくは前記第２の抗原結合単位のＣ末端に共有結合されている。

【0020】

本発明のいくつかの実施形態において、
ｉ）第１のＦｃドメインは位置３６６にチロシン（Ｙ）［Ｔ３６６Ｙ］を含み、第２のＦｃドメインは位置４０７にトレオニン（Ｔ）［Ｙ４０７Ｔ］を含み、又は
ｉｉ）第１のＦｃドメインは位置３６６にトリプトファン（Ｗ）［Ｔ３６６Ｗ］を含み、第２のＦｃドメインは位置３６６にセリン（Ｓ）［Ｔ３６６Ｓ］、位置３６８にアラニン（Ａ）［Ｌ３６８Ａ］及び位置４０７にバリン（Ｖ）［Ｙ４０７Ｖ］を含み、又は
ｉｉｉ）第２のＦｃドメインは位置３６６にチロシン（Ｙ）［Ｔ３６６Ｙ］を含み、第１のＦｃドメインは位置４０７にトレオニン（Ｔ）［Ｙ４０７Ｔ］を含み、又は
ｉｖ）第２のＦｃドメインは位置３６６にトリプトファン（Ｗ）［Ｔ３６６Ｗ］を含み、第１のＦｃドメインは位置３６６にセリン（Ｓ）［Ｔ３６６Ｓ］、位置３６８にアラニン（Ａ）［Ｌ３６８Ａ］及び位置４０７にバリン（Ｖ）［Ｙ４０７Ｖ］を含み、
好ましくは、第１又は第２のＦｃドメインは、さらに、位置４３５にアルギニン［Ｈ４３５Ｒ］及び位置４３６にフェニルアラニン［Ｙ４３６Ｆ］を含む。いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のＦｃドメインは、位置２３４［Ｌ２３４Ａ］及び位置２３５［Ｌ２３５Ａ］にアラニンを含む。

【0021】

いくつかの実施形態において、本発明の結合タンパク質は、配列番号：２１７、配列番号：２１８、配列番号：２１９、配列番号：２２０、配列番号：２２１、配列番号：２２２、配列番号：２２３、配列番号；２２４、配列番号：２２５、配列番号：２２６、配列番号：２２７、配列番号：２２８、配列番号：２２９、配列番号：２３０、配列番号：２３１、配列番号：２３２、配列番号：２３３、配列番号：２３４、配列番号：２３５、配列番号：２３６、配列番号：２３７、配列番号：２３８、配列番号：２３９及び配列番号：２４０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、Ｂ７Ｈ６に特異的に結合する第１のポリペプチド鎖と、配列番号：３１１、配列番号：３１２、配列番号：３１３、配列番号：３１４、配列番号：３１５及び配列番号：３１６からなる群、好ましくは配列番号：３１１より選択されるアミノ酸配列を含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２のポリペプチド鎖とを含む。

【0022】

さらなる態様において、本発明は、ｉ）本発明の結合タンパク質の第１の抗原結合単位及び／若しくは第２の抗原結合単位をコードする、場合により、第１及び／若しくは第２のＦｃドメインをさらにコードする、又はｉｉ）本発明の結合タンパク質の第１及び／若しくは第２のポリペプチド鎖をコードする単離された核酸分子を提供する。さらなる態様では、本発明の核酸分子を含む発現ベクター、このような発現ベクターで形質導入された宿主細胞、及び本発明のタンパク質を製造する方法が本明細書で提供される。

【0023】

本発明のさらなる態様においては、Ｂ７Ｈ６に特異的に結合する第１のポリペプチド鎖とＣＤ３に特異的に結合する第２のポリペプチド鎖とを含む多重特異性結合タンパク質であって、第１のポリペプチド鎖は、第１の軽鎖と、第１のリンカーと、第１の重鎖とを含み、第２のポリペプチド鎖は、第２の軽鎖と、第２のリンカーと、第２の重鎖とを含み、好ましくは第１の軽鎖のＣ末端は、第１のペプチドリンカーを介して第１の重鎖のＮ末端に共有結合されており、第２の軽鎖のＣ末端は、第２のペプチドリンカーを介して第２の重鎖のＮ末端に共有結合されている、多重特異性結合タンパク質が本明細書において提供される。当業者は、本明細書における「軽鎖」又は「重鎖」への任意の言及が、それぞれ抗体軽鎖又は抗体重鎖を指すことを理解するであろう。

【0024】

本発明のタンパク質のいくつかの実施形態において、Ｂ７Ｈ６に特異的に結合する第１のポリペプチド鎖は、本明細書に記載されているＢ７Ｈ６＃１、Ｂ７Ｈ６＃２、Ｂ７Ｈ６＃３、Ｂ７Ｈ６＃４、Ｂ７Ｈ６＃５、Ｂ７Ｈ６＃１２、Ｂ７Ｈ６＃１３、Ｂ７Ｈ６＃１４、Ｂ７Ｈ６＃１５、Ｂ７Ｈ６＃１６、Ｂ７Ｈ６＃１７、Ｂ７Ｈ６＃１８、Ｂ７Ｈ６＃１９、Ｂ７Ｈ６＃２０、Ｂ７Ｈ６＃２１、Ｂ７Ｈ６＃２２、Ｂ７Ｈ６＃２３及びＢ７Ｈ６＃２４の任意の１つの抗原結合単位について定義される、ＣＤＲ配列、ＶＨ／ＶＬ配列及び／又は単鎖Ｆａｂ配列を含む、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ３に特異的に結合する第２のポリペプチド鎖は、本明細書に記載されるように、ＣＤ３＃１の抗原結合単位について定義される、ＣＤＲ配列、ＶＨ／ＶＬ配列及び／又はｓｃＦａｂ配列を含む、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを含む。

【0025】

本発明の結合タンパク質を含むさらなる態様、実施形態、使用及び方法は、本発明の以下の詳細な説明及び添付の特許請求の範囲から明らかになるであろう。

【0026】

本発明は、Ｂ７Ｈ６を発現する癌、例えば（転移性）結腸直腸癌（（ｍ）ＣＲＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）又は頭頸部扁平上皮癌腫（ＨＮＳＣＣ）のより効率的な処置を可能にする新規な結合タンパク質を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0027】

【図1】本発明の二重特異性結合タンパク質の概略図。

【図2】ＣＨＯ－Ｋ１細胞の細胞表面上に発現された細胞外Ｂ７Ｈ６タンパク質の概略図。

【図3】３４の例示的なＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質の、組換えヒトＢ７Ｈ６細胞外タンパク質への結合。

【図4】３４の例示的なＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質の、組換えヒトアラニン変異Ｂ７Ｈ６細胞外タンパク質への結合。

【図5】３４の例示的なＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質の、内因性ヒトＢ７Ｈ６を発現するＨＣＴ－１５細胞への結合。

【図6】２３の例示的なＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質の、カニクイザルＢ７Ｈ６を発現する組換えＣＨＯ－Ｋ１細胞への結合。

【図7】２３の例示的なＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質の、ＣＤ３を発現するヒトＴ細胞への結合。

【図8】２３の例示的なＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質の、Ｂ７Ｈ６陰性ＣＨＯ－Ｋ１細胞への結合。

【図9】ＮＫ－９２ＭＩ細胞によるＢ７Ｈ６依存性ＩＦＮγ分泌の１７の例示的なＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質の阻害活性。

【図10】刺激されていないＴ細胞をヒトＨＣＴ－１５細胞にリダイレクトする１１の例示的なＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質の標的細胞溶解能。

【図11】刺激されていないＴ細胞をヒトＨＣＴ－１５細胞にリダイレクトする２３の例示的なＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質の標的細胞溶解能。

【図12】様々なエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）細胞比での例示的なＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質の標的細胞溶解能。

【図13】刺激されていないＴ細胞をＢ７－Ｈ６で形質導入された組換えＣＨＯ細胞及びＣｈｏ ｗｔ細胞にリダイレクトする２３の例示的なＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質の細胞溶解能。

【図14】６つの例示的なＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質の、ＨＣＴ－１５細胞の存在下でのＴ細胞上のＣＤ２５発現の上方制御能。

【図15】６つの例示的なＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質の、ＨＣＴ－１５細胞の存在下でのＴ細胞中の細胞内パーフォリン発現の上方制御能。

【図16】６つの例示的なＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質の、ＨＣＴ－１５細胞の存在下でのＴ細胞中の細胞内グランザイムＢ発現の上方制御能。

【図17】６つの例示的Ｂ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質の、ＨＣＴ－１５細胞の存在下でのＴ細胞の増殖促進能。

【図18】５つの例示的Ｂ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質の、ＨＣＴ－１５細胞の存在下でのＴ細胞によるＩＦＮγの分泌促進能。

【図19】１つの例示的なＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質の薬物動態プロファイル。

【図20】Ｔ細胞を移植されたマウス異種移植モデルにおける１つの例示的Ｂ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質の抗腫瘍活性。

【図21】例示的なＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質によるＮＣＩ－Ｈ７１６異種移植腫瘍組織におけるＴ細胞浸潤。

【図22】４つの例示的なＢ７Ｈ６結合タンパク質の薬物動態学的プロファイル。

【図23】Ｔ細胞を移植されたマウス異種移植モデルにおける４つの例示的Ｂ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質の抗腫瘍活性。

【図24】ｑ７ｄ又は単回投与として投与されたＴ細胞移植されたマウス異種移植モデルにおける例示的なＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質の抗腫瘍活性。

【発明を実施するための形態】

【0028】

使用される用語及び定義
本発明の上記及び他の態様及び実施形態は、本明細書のさらなる説明から明らかになるであろう。
別段の指示又は定義がない限り、使用される全ての用語は、当業者には明らかであろう当技術分野における通常の意味を有する。例えば、Sambrook et al,’’Molecular Cloning:A Laboratory Manual’’(2nd Ed.),Vols.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989);Lewin,’’Genes IV’’,Oxford University Press,New York,(1990),及びRoitt et al.,’’Immunology’’(2^nd Ed.),Gower Medical Publishing,London,New York(1989)などの標準的なハンドブック並びに本明細書に引用される一般的な背景技術が参照される。さらに、特に指示しない限り、具体的に詳細に記載されていない全ての方法、工程、技術及び操作は、当業者には明らかであるように、それ自体公知の様式で実施することができ、実施されてきた。例えば、標準的なハンドブック、上記で参照された一般的な背景技術、及びそこに引用されているさらなる参考文献が再び参照される。

【0029】

本明細書で使用される場合、「含む（comprising）」という用語及び「含む（comprises）」及び「含む（comprise）」などのその変形は、「含有する（containing）」又は「含む（including）」又は「有する（having）」という用語で置き換えることができる。

【0030】

（例えば、「重鎖／軽鎖配列」、「抗体配列」、「可変ドメイン配列」、「定常ドメイン配列」又は「タンパク質配列」のような用語における）本明細書で使用される「配列」という用語は、一般に、文脈がより限定的な解釈を必要としない限り、関連するアミノ酸配列の他、これをコードする核酸配列又はヌクレオチド配列の両方を含むことが理解されるべきである。

【0031】

本明細書で使用される「抗原結合単位」という用語は、抗体の特異的な標的又は抗原への結合を可能にする抗体に由来する最小の構造上の要件（すなわち、抗体中に典型的に存在する最小の構造上の要件）を含む。したがって、抗原結合単位は、少なくとも３つの軽鎖及び３つの重鎖ＣＤＲ配列を含み、好ましくは、少なくとも軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを含む。

【0032】

抗体又は免疫グロブリンの一般化された構造は、当業者に周知である。これらの分子は、２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖で構成される、典型的には約１５万ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、典型的には完全長抗体と呼ばれる。各軽鎖は、１つのジスルフィド結合によって重鎖に共有結合で連結されてヘテロ二量体を形成し、ヘテロ二量体の２つの同一の重鎖間の共有ジスルフィド結合を通じて、ヘテロ四量体分子が形成される。軽鎖及び重鎖は１つのジスルフィド結合によって一緒に連結されているが、２つの重鎖間のジスルフィド結合の数は免疫グロブリンアイソタイプによって異なる。各重鎖及び軽鎖は、規則的に間隔を置いて配置された鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、続いて３つ又は４つ（ＩｇＥの場合）の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４）、並びにＣＨ１とＣＨ２の間にヒンジ領域を有する。各軽鎖は、２つのドメイン、Ｎ末端可変ドメイン（ＶＬ）及びＣ末端定常ドメイン（ＣＬ）を有する。ＶＬドメインはＶＨドメインと非共有結合的に会合するが、ＣＬドメインは一般にジスルフィド結合を介してＣＨ１ドメインに共有結合で連結されている。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの間の界面を形成すると考えられている（Chothia et al.,1985,J.Mol.Biol.186:651-663）。可変ドメインは、本明細書では可変領域又はＦｖとも呼ばれ、抗原結合部位を有することによって抗原に対する特異性を抗体に付与する部分を示す。

【0033】

本明細書で使用される「軽鎖可変ドメイン」（又は「軽鎖可変領域」）及び「重鎖可変ドメイン」（又は「重鎖可変領域」）は、同じ一般構造を有し、各ドメインは、その配列が広く保存された、当技術分野及び本明細書の以下で、それぞれ、「フレームワーク領域１」又は「ＦＲ１」；「フレームワーク領域２」又は「ＦＲ２」；「フレームワーク領域３」又は「ＦＲ３」；及び「フレームワーク領域４」又は「ＦＲ４」と称される４つのフレームワーク（ＦＲ）領域から本質的になり；これらのフレームワーク領域は、当技術分野及び本明細書の以下で、それぞれ、「相補性決定領域１」又は「ＣＤＲ１」；「相補性決定領域２」又は「ＣＤＲ２」；及び「相補性決定領域３」又は「ＣＤＲ３」と称される３つの超可変領域、ＨＶＲ（又はＣＤＲ）によって中断されている。したがって、免疫グロブリン可変ドメインの一般的な構造又は配列は、以下のように示すことができる：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４。フレームワーク領域はベータシート立体構造をとり、ＣＤＲはベータシート構造を接続するループを形成し得る。各鎖中のＣＤＲは、フレームワーク領域によってそれらの三次元構造に保持され、他方の鎖からのＣＤＲとともに抗原結合部位を形成する。

【0034】

ＣＤＲの様々な定義、例えば、ＩＭＧＴとも呼ばれるＣＣＧに基づく定義（Lefranc MP,Pommie C,Ruiz M,Giudicelli V,Foulquier E,Truong L,Thouvenin-Contet V,Lefranc G.’’IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains.’’Dev Comp Immunol.2003 Jan;27(1):55-77;Giudicelli V,Brochet X,Lefranc MP.’’IMGT/V-QUEST:IMGT standardized analysis of the immunoglobulin(IG)and T cell receptor(TR)nucleotide sequences’’.Cold Spring Harb Protoc.2011;2011(6):695-715）又はChothiaに基づく定義（Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.1987,196:901-917）が、Ｋａｂａｔ（E.A.Kabat,T.T.Wu,H.Bilofsky,M.Reid-Miller and H.Perry,Sequence of Proteins of Immunological Interest,National Institutes of Health,Bethesda(1983)）とともに当技術分野で公知である。本発明の文脈内で、ＣＤＲへの言及はＣＣＧ（ＩＭＧＴ）の定義に基づく。

【0035】

本出願内で使用される「定常ドメイン」又は「定常領域」という用語は、可変領域以外の抗体のドメインの合計を表す。このような定常ドメイン及び領域は、当技術分野で周知であり、例えば、Ｋａｂａｔら（’’Sequence of proteins of immunological interest’’、US Public Health Services,NIH Bethesda,MD,Publication No.91-3242(1991)）によって記載されている。重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、抗体又は免疫グロブリンは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭのクラスに分けられる。重鎖定常領域によれば、異なるクラスの免疫グロブリンは、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２にさらに分割され得る。

【0036】

抗体の「Ｆｃ部分」又は「Ｆｃドメイン」は、抗原への抗体の結合に直接関与しないが、様々なエフェクター機能を示す。「抗体のＦｃ部分／ドメイン」は、当業者に周知の用語であり、抗体のパパイン切断に基づいて定義される。抗体のＦｃ部分は、補体活性化、Ｃ１ｑ結合及びＦｃ受容体結合に基づいて、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞介在性細胞傷害）及びＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）に直接関与する。補体活性化（ＣＤＣ）は、補体因子Ｃ１ｑがほとんどのＩｇＧ抗体サブクラスのＦｃ部分に結合することによって開始される。補体系に対する抗体の影響はある特定の条件に依存するが、Ｃ１ｑへの結合はＦｃ部分中の定義された結合部位によって引き起こされる。このような結合部位は、例えば、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１及びＰ３２９（Ｅｕ付番による付番（Edelman et al,Proc Natl Acad Sci USA.1969 May;63(1):78-85））である。ＩｇＧ１においてＣ１ｑ及びＦｃγ受容体結合を媒介する上でこれらの残基の中で最も重要なのは、Ｌ２３４及びＬ２３５である（Hezareh et al.,J.Virology 75(2001)12161-12168,Shields et al(2001)JBC,276(9):6591-6604）。サブクラスＩｇＧ１及びＩｇＧ３の抗体は、通常、補体活性化並びにＣ１ｑ及びＣ３結合を示すが、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４は補体系を活性化せず、Ｃ１ｑ及びＣ３を結合しない。

【0037】

「抗体」又は「抗体分子」（本明細書では同義的に使用される）という用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、配列最適化された抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、抗体の断片、特にＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）２断片、単鎖抗体、特に単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、単鎖Ｆａｂ断片（ｓｃＦａｂ）、小型モジュール免疫医薬品（ＳＭＩＰ（Small Modular Immunopharmaceutical)）、ドメイン抗体、ナノボディ（登録商標）、ダイアボディを包含する。抗体は、抗体のＦｃ部分によって通常媒介される、ＡＤＣＣ若しくはＣＤＣなどのエフェクター機能を有することがあり得、又は例えばＦｃ部分を欠くか、若しくはブロックされた遮蔽されたＦｃ部分、本質的には補体系などの免疫細胞若しくは免疫系成分によって認識されない若しくは不十分に認識されるＦｃ部分を有することによって、エフェクター機能を有さないことがあり得る。

【0038】

モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、アミノ酸配列が同一である単一特異性抗体である。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、特異的な抗体を産生するＢ細胞の骨髄腫（Ｂ細胞癌）細胞との融合物のクローンを表すハイブリッド細胞株（ハイブリドーマと呼ばれる）からハイブリドーマ技術によって産生され得る（Kohler G,Milstein C.Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.Nature 1975;256:495-7）。あるいは、モノクローナル抗体は、宿主細胞中での組換え発現によって産生され得る（Norderhaug L,Olafsen T,Michaelsen TE,Sandlie I.(May 1997).’’Versatile vectors for transient and stable expression of recombinant antibody molecules in mammalian cells.’’J Immunol Methods 204(1):77-87;以下も参照）。「組換え抗体」又は「組換え結合タンパク質」は、組換え的に操作された宿主細胞によって産生された抗体又は結合タンパク質である。「組換え抗体」又は「組換え結合タンパク質」は、場合により単離又は精製される。

【0039】

本発明による抗体分子には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）２断片などの、抗原結合特性を保持する免疫グロブリンの断片も含まれる。このような断片は、例えばタンパク質分解消化による免疫グロブリンの断片化によって、又はこのような断片の組換え発現によって取得され得る。例えば、免疫グロブリン消化は、例えばパパイン又はペプシンを使用して、日常的な技術によって達成することができる（国際公開第９４／２９３４８号）。抗体のパパイン消化は、典型的には、２つの同一の抗原結合断片（Ｆａｂ）を生成する。Ｆａｂ断片は、重鎖及び軽鎖のそれぞれの１つの定常ドメイン及び１つの可変ドメインから構成される。ペプシン処理は、Ｆ（ａｂ’）２を与える。Ｆａｂ断片において、可変ドメインはそれぞれ、好ましくはヒト起源の免疫グロブリン定常ドメインに融合される。したがって、重鎖可変ドメインはＣＨ１ドメインに融合され（いわゆるＦｄ断片）、軽鎖可変ドメインはＣＬドメインに融合される。Ｆａｂ断片は、宿主細胞中でのそれぞれの核酸の組換え発現によって産生され得る、下記を参照。

【0040】

免疫グロブリンの可変ドメイン又はこのような可変ドメインに由来する分子を異なる分子状況に配置するためのいくつかの技術が開発されている。これらも、本発明による「抗体」又は「抗体分子」と見なされるべきである。一般に、これらの抗体分子は、免疫グロブリンと比較してサイズがより小さく、単一のアミノ酸鎖又はいくつかのアミノ酸鎖を含み得る。例えば、「単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）」は、短いリンカー、通常はセリン（Ｓ）又はグリシン（Ｇ）と一緒に連結された免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の可変領域の融合物である（国際公開第８８／０１６４９号；国際公開第９１／１７２７１号；Huston et al;International Reviews of Immunology,Volume 10,1993,195-217）。「単一ドメイン抗体」又は「ナノボディ（登録商標）」は、単一のＩｇ様ドメイン中に抗原結合部位を有する（国際公開第９４／０４６７８号；国際公開第０３／０５０５３１号、Ward et al.,Nature.1989 Oct 12;341(6242)：５４４－６；Revets et al.,Expert Opin Biol Ther.5(1):111-24,2005)。同じ抗原又は異なる抗原に対する結合特異性を有する１つ以上の単一ドメイン抗体は、一緒に連結され得る。「ダイアボディ」は、２つの可変ドメインを含む２つのアミノ酸鎖からなる二価抗体分子である（国際公開第９４／１３８０４号、Holliger et al.,Proc Natl Acad Sci USA.1993 Jul 15;90(14):6444-8)。抗体様分子の他の例は、「免疫グロブリンスーパーファミリー抗体」である（IgSF;Srinivasan and Roeske,Current Protein Pept.Sci.2005,6(2):185-96）。異なる概念は、単鎖ヒンジに連結されたＦｖドメインと、定常ドメインＣＨ１を欠くエフェクタードメインとを含む、いわゆる「小型モジュール免疫医薬品（ＳＭＩＰ）」をもたらす（国際公開第０２／０５６９１０号）。「単鎖Ｆａｂ」又は「ｓｃＦａｂ」は、軽鎖Ｆａｂドメイン（すなわち、１つの軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）に連結された軽鎖可変ドメイン（ＶＬ））の、重鎖Ｆａｂドメイン（すなわち、１つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ））との融合物である。単鎖Ｆａｂは、抗原を認識して結合することができる。ｓｃＦａｂは、場合により、ＣＬドメインとＶＨドメインの間に位置するリンカー（例えば、ペプチドリンカー）も含有し得る（Hust et al.BMC Biotechnology2007,7:14）。

【0041】

ヒトへの適用のために、マウスなどの他の種に元々由来する、本明細書に記載の抗原結合単位を含む抗体又は結合タンパク質などの治療分子の免疫原性を低下させることがしばしば望ましい。これは、キメラ抗体／結合タンパク質の構築によって、又は「ヒト化」と呼ばれる過程によって行うことができる。これに関連して、「キメラ抗体」；又は「キメラ抗原結合単位」は、異なる種（例えば、ヒト）に由来する配列部分（例えば、定常ドメイン）に融合された１つの種（例えばマウス）に由来する配列部分（例えば、可変ドメイン）を含む抗体又は抗原結合単位であると理解される。これに関連して、「ヒト化抗体」、「ヒト化抗原結合単位」又は「ヒト化ＶＬ／ＶＨドメイン」は、非ヒト種に元々由来する可変ドメインを含む抗体、抗原結合単位又はＶＨ／ＶＬドメインであり、ある特定のアミノ酸が、その可変ドメインの配列全体をヒト可変ドメインの配列により密接に類似させるように変異されている。抗体のヒト化の方法は、当技術分野で周知である（Billetta R,Lobuglio AF.’’Chimeric antibodies’’.Int Rev Immunol.1993;10(2-3):165-76;Riechmann L,Clark M,Waldmann H,Winter G(1988).’’Reshaping human antibodies for therapy’’.Nature:332:323）。

【0042】

本明細書で使用される「ヒト抗体」、「ヒト抗原結合単位」又は「ヒトＶＨ／ＶＬドメイン」という用語には、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変（及び定常、該当する場合）領域を有する抗体、抗原結合単位又はＶＨ／ＶＬドメインが含まれる。本明細書で使用される「ヒト抗体」、「ヒト抗原結合単位」又は「ヒトＶＨ／ＶＬドメイン」という用語は、マウス、ラット又はウサギなどの別の（哺乳動物）種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植された抗体を含むことを意図しない。したがって、本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」、「ヒト抗原結合単位」又は「ヒトＶＨ／ＶＬドメイン」という用語は、タンパク質の全ての部分（例えば、ＣＤＲ、フレームワーク、ＣＬ、ＣＨドメイン（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）、ヒンジ、ＶＬ、ＶＨ）がヒトにおいて実質的に非免疫原性であり、本明細書で以下にさらに記載されているようなわずかな配列変化又は変動のみを有する抗体、抗原結合単位又はＶＨ／ＶＬドメインを指す。

【0043】

このような「ヒト抗体」、「ヒト抗原結合単位」又は「ヒトＶＨ／ＶＬドメイン」を作製するための技術が記載されており、ファージディスプレイ又はトランスジェニック動物の使用が含まれるが、これらに限定されない（WWW.Ablexis.com/technology-alivamab.php;国際公開第９０／０５１４４号;D.Marks,H.R.Hoogenboom,T.P.Bonnert,J.McCafferty,A.D.Griffiths and G.Winter(1991)’’By-passing immunisation.Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage.’’J.Mol.Biol.,222,581-597;Knappik et al.,J.Mol.Biol.296:57-86,2000;S.Carmen and L.Jermutus,’’Concepts in antibody phage display’’.Briefings in Functional Genomics and Proteomics 2002 1(2):189-203;Lonberg N,Huszar D.’’Human antibodies from transgenic mice’’.Int Rev Immunol.1995;13(1):65-93.;Bruggemann M,Taussig MJ.’’Production of human antibody repertoires in transgenic mice’’.Curr Opin Biotechnol.1997 Aug;8(4):455-8)。

【0044】

したがって、ヒト抗体、ヒト抗原結合単位又はヒトＶＨ／ＶＬドメインは、例えばキメラ抗体又はヒト化抗体とは異なる。ヒト抗体、ヒト抗原結合単位又はヒトＶＨ／ＶＬドメインは、機能的に再編成されたヒト免疫グロブリン（例えば、重鎖及び／又は軽鎖）遺伝子を発現することができる非ヒト動物又は原核細胞若しくは真核細胞によって産生され得ることが指摘される。

【0045】

本発明のキメラ、ヒト化又はヒト抗体、抗原結合単位又はＶＨ／ＶＬドメインは、さらに最適化され得、本明細書では「最適化された」又は「配列最適化された」抗体、抗原結合単位又はＶＨ／ＶＬドメインとも呼ばれる。このような最適化には、例えば、ヒトにおける免疫原性を低下させるための、又は脱アミド化、望ましくない電荷若しくは親油性若しくは非特異的結合を回避するための、望ましくないアミノ酸の除去又は交換が含まれるが、これらに限定されない。このような望ましくないアミノ酸の除去又は交換は、例えば、インビトロでのランダムな若しくは部位特異的な突然変異誘発によって又はインビボでの体細胞変異によって導入することができる。さらに、キメラ又はヒト化抗体、抗原結合単位又はＶＨ／ＶＬドメインに関連して、ある特定のマウスＦＲ残基が、最適化された抗体、抗原結合単位及びＶＨ／ＶＬドメインの機能にとって重要であり得ることが理解されよう。したがって、これらの重要なアミノ酸残基は、最適化された抗体、抗原結合単位及びＶＨ／ＶＬドメイン中に保持され得る。

【0046】

「モノマー」という用語は、本明細書に記載の抗体又は多重特異性タンパク質の均一な形態を指す。例えば、完全長抗体の場合、モノマーは、２つの同一の重鎖及び２つの同一の軽鎖を有するモノマー抗体を意味する。本発明の文脈において、モノマーは、本明細書に記載の、Ｂ７Ｈ６に対して特異的な単一の抗原結合単位とＣＤ３に対して特異的な単一の抗原結合単位を有する本発明のタンパク質を意味する。例えば、本明細書中に記載される結合タンパク質のモノマーは、２つのポリペプチド鎖、すなわち、Ｂ７Ｈ６に対して特異的な単鎖Ｆａｂ及び第１のＦｃドメインを含む第１のポリペプチド鎖と、ＣＤ３に対して特異的な単鎖Ｆａｂ及び第２のＦｃドメインを含む第２のポリペプチド鎖とを有し得る。

【0047】

エピトープは、抗体又は抗原結合部分（例えば、本明細書中に記載されるタンパク質の抗原結合単位）によって結合される抗原の領域である。「エピトープ」という用語は、抗体又は抗原結合部分に特異的に結合できる任意のポリペプチド決定基を含む。ある特定の実施形態において、エピトープ決定基は、アミノ酸、グリカン側鎖、ホスホリル又はスルホニルなどの分子の化学的に活性な表面基を含み、ある特定の実施形態において、特定の三次元構造特性及び／又は特定の電荷特性を有し得る。立体構造エピトープ及び非立体構造エピトープは、変性溶媒の存在下において前者への結合は失われるが、後者への結合は失われないという点で区別される。

【0048】

ある特定のエピトープ、抗原又はタンパク質（又はその少なくとも１つの部分、断片若しくはエピトープに対して）「結合する」、「に結合する」、「特異的に結合する」若しくは「に特異的に結合する」ことができる、「（に）結合する」若しくは「に特異的に結合する」、「に対して親和性を有する」、「に対して特異的である」及び／又は「に対して特異性を有する」抗原結合分子／タンパク質（免疫グロブリン、抗体、抗原結合単位、又はこのような抗原結合分子／タンパク質の断片など）は、前記エピトープ、抗原若しくはタンパク質「に対する」若しくは「に対して作られた」又はこのようなエピトープ、抗原若しくはタンパク質に関する「結合」分子／タンパク質であると称される。これらの用語は、本明細書では互換的に使用される。

【0049】

本明細書で使用される場合、「結合する」及び「特異的結合」という用語は、インビトロアッセイ、好ましくは精製された野生型抗原を用いたプラズモン共鳴アッセイ（(Malmqvist M.,’’Surface plasmon resonance for detection and measurement of antibody-antigen affinity and kinetics.’’,Curr Opin Immunol.1993 Apr;5(2):282-6)）における、抗原結合分子／タンパク質（免疫グロブリン、抗体、抗原結合単位、又はこのような抗原結合分子／タンパク質の断片など）の抗原のエピトープへの結合を指す。抗体親和性は、速度論的排除アッセイ（ＫｉｎＥｘＡ）技術（Darling,R.J.,and Brault P-A.,’’Kinetic exclusion assay technology:Characterization of Molecular Interactions.’’ASSAY and Drug Development Technologies.2004,Dec 2(6):647-657）を用いて測定することもできる。例えば、本発明の結合タンパク質又はタンパク質は、その第１の抗原結合単位／第１のポリペプチド鎖でＢ７Ｈ６のエピトープに結合し、その第２の抗原結合単位／第２のポリペプチド鎖でＣＤ３のエピトープに結合する。

【0050】

一般に、「特異性」という用語は、特定の抗原結合分子／タンパク質（免疫グロブリン、抗体、抗原結合単位、又はこのような抗原結合分子／タンパク質の断片など）が結合することができる異なる種類の抗原又はエピトープの数を指す。Ｂ７Ｈ６に対する結合特異性は、本発明の抗原結合タンパク質／分子（例えば、このような結合タンパク質の第１の抗原結合単位）が、構造的に無関係な分子よりもＢ７Ｈ６に対して有意に高い結合親和性を有することを意味する。ＣＤ３に対する結合特異性は、本発明の抗原結合タンパク質／分子（例えば、このような結合タンパク質の第２の抗原結合単位）が、構造的に無関係な分子よりもＣＤ３に対して有意に高い結合親和性を有することを意味する。抗原結合分子／タンパク質の特異性は、その親和性及び／又はアビディティに基づいて決定することができる。抗原結合タンパク質との抗原の解離に対する平衡定数（Ｋ_Ｄ）によって表される親和性は、エピトープと抗原結合分子／タンパク質上の抗原結合部位との間の結合強度の尺度であり、Ｋ_Ｄの値が小さいほど、エピトープと抗原結合部位の間の結合強度がより強くなる（あるいは、親和性は、１／Ｋ_Ｄである親和定数（Ｋ_Ａ）として表すこともできる。）。当業者に明らかなように（例えば、本明細書のさらなる開示に基づいて）、親和性は、関心対象の特異的な抗原に応じて、それ自体公知の様式で決定することができる。アビディティは、抗原結合分子／タンパク質（免疫グロブリン、抗体、抗原結合単位、又はこのような抗原結合分子／タンパク質の断片など）と関連抗原の間での結合強度の尺度である。アビディティは、エピトープと抗原結合分子／タンパク質上のその抗原結合部位との間の親和性と、抗原結合分子／タンパク質上に存在する関連結合部位の数の両方に関連する。

【0051】

抗原結合単位／抗原、リガンド／受容体、又はその他の結合対に言及する場合、「特異的に結合する」又は「選択的に結合する」という用語は、タンパク質及びその他の生物製剤の異種集団中でのタンパク質の存在を決定する結合反応を示す。したがって、指定された条件下では、指定された抗原結合単位は特定の抗原に結合し、試料中に存在する他のタンパク質に有意な量で結合しない。抗原結合単位は、指定された条件下で、無関係な抗原との親和性よりも少なくとも２倍大きい、好ましくは少なくとも１０倍大きい、より好ましくは少なくとも２０倍大きい、最も好ましくは少なくとも１００倍大きい親和性でその抗原に結合する。

【0052】

本明細書で使用される「単離された、」という用語は、その元の又は天然の環境（例えば、天然に存在する場合、自然環境）から取り出された材料を指す。例えば、生きている動物中に存在する天然に存在するポリヌクレオチド又はポリペプチドは単離されておらず、ヒトの介入によって天然系中の共存物質の一部又は全部から分離された同じポリヌクレオチド又はポリペプチドは単離されている。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり得、及び／又はこのようなポリヌクレオチド若しくはポリペプチドは組成物の一部であり得るが、このようなベクター又は組成物は、自然の状態でそれが見出される環境の一部ではないという点で、なおも単離されたものということができる。例えば、核酸、タンパク質／ポリペプチド分子は、その天然の生物学的供給源及び／又は核酸、タンパク質／ポリペプチド分子がそこから得られた反応媒体若しくは培養媒体と比較した場合に、別の核酸、別のタンパク質／ポリペプチド、別の生物学的成分若しくは高分子、又は少なくとも１つの汚染物質、不純物若しくは微量成分などの、前記供給源又は媒体中で核酸、タンパク質／ポリペプチド分子に通常付随している少なくとも１つの他の成分から分離されているときに、「本質的に単離された（形態）（で）」と考えられる。特に、核酸又はタンパク質／ポリペプチド分子は、少なくとも２倍、特に少なくとも１０倍、さらに特に少なくとも１００倍、及び最大１０００倍以上精製されている場合、「本質的に単離された」と考えられる。「本質的に単離された形態で」ある核酸又はタンパク質／ポリペプチド分子は、好ましくは、適切なクロマトグラフィー技術、例えばポリアクリルアミド－ゲル電気泳動などの適切な技術を使用して決定される場合に、本質的に均一である。

【0053】

本明細書で使用される場合、２つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈における「同一の」又は「パーセント同一性、」という用語は、最大の対応のために比較及び整列されたときに、同じである、又は同じであるヌクレオチド若しくはアミノ酸残基の指定された百分率を有する２つ以上の配列又は部分配列を指す。パーセント同一性を決定するために、配列は最適な比較目的のために整列される（例えば、第２のアミノ酸配列又は核酸配列との最適な整列のために、第１のアミノ酸配列又は核酸配列の配列中にギャップを導入することができる）。次いで、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置にあるアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占められている場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一の位置の数／位置の総数（例えば、重なり合う位置）×１００）。いくつかの実施形態において、比較される２つの配列は、適宜、配列内にギャップが導入された後に同じ長さである（例えば、比較されている配列を超えて伸長する追加の配列を除外する）。例えば、可変領域配列を比較する場合、リーダー（シグナルペプチド）及び／又は定常ドメイン配列は考慮されない。２つの配列間の配列比較のために、「対応する」ＣＤＲは、両方の配列において同じ位置にあるＣＤＲを指す（例えば、各配列のＣＤＲ－Ｈ１）。

【0054】

２つの配列間のパーセント同一性又はパーセント類似性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。２つの配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、Karlin and Altschul,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877におけるように改変されたKarlin and Altschul,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Altschul et al.,1990,J.Mol.Biol.215:403-410のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム中に組み込まれる。関心対象のタンパク質をコードする核酸に相同なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いてＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を行うことができる。関心対象のタンパク質に相同なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３でＢＬＡＳＴタンパク質検索を行うことができる。比較目的のためにギャップのある整列を得るために、Altschul et al.,1997,Nucleic Acids Res.25:3389-3402に記載されているように、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用することができる。あるいは、分子間の遠い関係性を検出する反復検索を行うために、ＰＳＩ－Ｂｌａｓｔを使用することができる（同文献）。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ－Ｂｌａｓｔプログラムを使用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）の初期設定パラメータを使用することができる。配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの別の好ましい非限定的な例は、Myers and Miller,CABIOS（１９８９）のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重量残基表、１２のギャップ長ペナルティ及び４のギャップペナルティを使用することができる。配列分析のためのさらなるアルゴリズムは当技術分野で公知であり、Torellis and Robotti,1994,Comput.Appl.Biosci.10:3-5に記載されているＡＤＶＡＮＣＥ及びＡＤＡＭ並びにPearson and Lipman,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444-8に記載されているＦＡＳＴＡが挙げられる。ＦＡＳＴＡ内で、ｋｔｕｐは、探索の感度及び速度を設定する制御オプションである。ｋｔｕｐ＝２の場合、比較されている２つの配列中の類似領域は、整列された残基の対を見ることによって見出され、ｋｔｕｐ＝１の場合、単一の整列されたアミノ酸が調べられる。ｋｔｕｐは、タンパク質配列については２若しくは１に、又はＤＮＡ配列については１～６に設定することができる。ｋｔｕｐが指定されていない場合の初期設定は、タンパク質については２、ＤＮＡについては６である。あるいは、タンパク質配列の整列は、Higgins et al.,1996,Methods Enzymol.266:383-402によって記載されているように、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗアルゴリズムを使用して実施され得る。

【0055】

本明細書で使用される「共有結合で連結された」又は「共有結合で結合された」という用語は、残基間の直接の共有結合、又は２つの残基が直接結合されていないが、両方が中間分子若しくはドメイン、例えば免疫グロブリンの中間ドメイン若しくはリンカーに共有結合で結合されている間接的な連結／結合のいずれかを意味する。

【0056】

本発明の多重特異性結合タンパク質
本発明は、Ｂ７Ｈ６に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合単位（第１の抗原結合単位）と、ＣＤ３に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合単位（第２の抗原結合単位）とを含む多重特異性結合タンパク質を提供する。腫瘍細胞抗原及びＴ細胞上のＣＤ３への同時結合を通して、該結合タンパク質はＴ細胞活性化タンパク質として作用し、本明細書ではＴ細胞誘導とも呼ばれる。「（多重特異性）結合タンパク質」という用語は、本明細書では「（多重特異性）結合分子」という用語と互換的に使用される。本発明の多重特異性結合タンパク質を指すために本明細書で使用されるさらなる用語は、「本発明のタンパク質」、「本発明の結合タンパク質」、「抗原結合タンパク質」及び「多重特異性タンパク質」である。

【0057】

本発明者らは、驚くべきことに、本発明の多重特異性結合タンパク質が、Ｔ細胞の存在下でＢ７Ｈ６陽性結腸直腸癌細胞株の強力かつ選択的な溶解を誘導し、低いエフェクター対標的細胞比で既に活性であることを見出した。重要なことに、本発明の結合タンパク質は、Ｂ７Ｈ６陰性細胞を溶解せず、Ｂ７Ｈ６陽性細胞の非存在下ではＴ細胞活性化、Ｔ細胞増殖及びサイトカイン分泌を引き起こさない。特に、インビトロでＮＫｐ３０を介してＢ７Ｈ６依存性ＮＫ細胞活性化を阻害しない本発明のタンパク質は、Ｂ７Ｈ６陽性腫瘍細胞の溶解においてより強力である。この活性は、例えば、実施例１１のインビトロアッセイに記載されている。

【0058】

疑義を避けるために、本明細書で使用されるＢ７Ｈ６は、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ６８Ｄ８５のヒトＢ７Ｈ６及びそのタンパク質をコードする核酸配列を指す。本明細書で使用されるＣＤ３は、ヒトＣＤ３ε（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０７７６６）及びＣＤ３γ（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０９６９３）複合体（ヒトＣＤ３εγ複合体）を指す。当業者は、Ｂ７Ｈ６及びＢ７－Ｈ６という用語が本明細書では互換的に使用されることを理解するであろう。

【0059】

一態様において、本発明の多重特異性結合タンパク質は、Ｂ７Ｈ６に特異的に結合する第１の抗原結合単位と、ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合単位とを含み、前記第１の結合単位は、ｉ）～ｘｘｉｖ）：
ｉ）配列番号：１（ＣＤＲ１）、配列番号：２（ＣＤＲ２）及び配列番号：３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：４（ＣＤＲ１）、配列番号：５（ＣＤＲ２）及び配列番号：６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位（抗原結合単位Ｂ７Ｈ６＃１）；
ｉｉ）配列番号：７（ＣＤＲ１）、配列番号：８（ＣＤＲ２）及び配列番号：９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：１０（ＣＤＲ１）、配列番号：１１（ＣＤＲ２）及び配列番号：１２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位（抗原結合単位Ｂ７Ｈ６＃２）；
ｉｉｉ）配列番号：１３（ＣＤＲ１）、配列番号：１４（ＣＤＲ２）及び配列番号：１５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：１６（ＣＤＲ１）、配列番号：１７（ＣＤＲ２）及び配列番号：１８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位（抗原結合単位Ｂ７Ｈ６＃３）；
ｉｖ）配列番号：１９（ＣＤＲ１）、配列番号：２０（ＣＤＲ２）及び配列番号：２１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：２２（ＣＤＲ１）、配列番号：２３（ＣＤＲ２）及び配列番号：２４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位（抗原結合単位Ｂ７Ｈ６＃４）；
ｖ）配列番号：２５（ＣＤＲ１）、配列番号：２６（ＣＤＲ２）及び配列番号：２７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：２８（ＣＤＲ１）、配列番号：２９（ＣＤＲ２）及び配列番号：３０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位（抗原結合単位Ｂ７Ｈ６＃５）；
ｖｉ）配列番号：３１（ＣＤＲ１）、配列番号：３２（ＣＤＲ２）及び配列番号：３３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：３４（ＣＤＲ１）、配列番号：３５（ＣＤＲ２）及び配列番号：３６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位（抗原結合単位Ｂ７Ｈ６＃６）；
ｖｉｉ）配列番号：３７（ＣＤＲ１）、配列番号：３８（ＣＤＲ２）及び配列番号：３９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：４０（ＣＤＲ１）、配列番号：４１（ＣＤＲ２）及び配列番号：４２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位（抗原結合単位Ｂ７Ｈ６＃７）；
ｖｉｉｉ）配列番号：４３（ＣＤＲ１）、配列番号：４４（ＣＤＲ２）及び配列番号：４５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：４６（ＣＤＲ１）、配列番号：４７（ＣＤＲ２）及び配列番号：４８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位（抗原結合単位Ｂ７Ｈ６＃８）；
ｉｘ）配列番号：４９（ＣＤＲ１）、配列番号：５０（ＣＤＲ２）及び配列番号：５１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：５２（ＣＤＲ１）、配列番号：５３（ＣＤＲ２）及び配列番号：５４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位（抗原結合単位Ｂ７Ｈ６＃９）；
ｘ）配列番号：５５（ＣＤＲ１）、配列番号：５６（ＣＤＲ２）及び配列番号：５７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：５８（ＣＤＲ１）、配列番号：５９（ＣＤＲ２）及び配列番号：６０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位（抗原結合単位Ｂ７Ｈ６＃１０）；
ｘｉ）配列番号：６１（ＣＤＲ１）、配列番号：６２（ＣＤＲ２）及び配列番号：６３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：６４（ＣＤＲ１）、配列番号：６５（ＣＤＲ２）及び配列番号：６６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位（抗原結合単位Ｂ７Ｈ６＃１１）；
ｘｉｉ）配列番号：６７（ＣＤＲ１）、配列番号：６８（ＣＤＲ２）及び配列番号：６９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：７０（ＣＤＲ１）、配列番号：７１（ＣＤＲ２）及び配列番号：７２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位（抗原結合単位Ｂ７Ｈ６＃１２）；
ｘｉｉｉ）配列番号：７３（ＣＤＲ１）、配列番号：７４（ＣＤＲ２）及び配列番号：７５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：７６（ＣＤＲ１）、配列番号：７７（ＣＤＲ２）及び配列番号：７８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位（抗原結合単位Ｂ７Ｈ６＃１３）；
ｘｉｖ）配列番号：７９（ＣＤＲ１）、配列番号：８０（ＣＤＲ２）及び配列番号：８１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：８２（ＣＤＲ１）、配列番号：８３（ＣＤＲ２）及び配列番号：８４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位（抗原結合単位Ｂ７Ｈ６＃１４）；
ｘｖ）配列番号：８５（ＣＤＲ１）、配列番号：８６（ＣＤＲ２）及び配列番号：８７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：８８（ＣＤＲ１）、配列番号：８９（ＣＤＲ２）及び配列番号：９０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位（抗原結合単位Ｂ７Ｈ６＃１５）；
ｘｖｉ）配列番号：９１（ＣＤＲ１）、配列番号：９２（ＣＤＲ２）及び配列番号：９３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：９４（ＣＤＲ１）、配列番号：９５（ＣＤＲ２）及び配列番号：９６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位（抗原結合単位Ｂ７Ｈ６＃１６）；
ｘｖｉｉ）配列番号：９７（ＣＤＲ１）、配列番号：９８（ＣＤＲ２）及び配列番号：９９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：１００（ＣＤＲ１）、配列番号：１０１（ＣＤＲ２）及び配列番号：１０２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位（抗原結合単位Ｂ７Ｈ６＃１７）；
ｘｖｉｉｉ）配列番号：１０３（ＣＤＲ１）、配列番号：１０４（ＣＤＲ２）及び配列番号：１０５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：１０６（ＣＤＲ１）、配列番号：１０７（ＣＤＲ２）及び配列番号：１０８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位（抗原結合単位Ｂ７Ｈ６＃１８）；
ｘｉｘ）配列番号：１０９（ＣＤＲ１）、配列番号：１１０（ＣＤＲ２）及び配列番号：１１１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：１１２（ＣＤＲ１）、配列番号：１１３（ＣＤＲ２）及び配列番号：１１４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位（抗原結合単位Ｂ７Ｈ６＃１９）；
ｘｘ）配列番号：１１５（ＣＤＲ１）、配列番号：１１６（ＣＤＲ２）及び配列番号：１１７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：１１８（ＣＤＲ１）、配列番号：１１９（ＣＤＲ２）及び配列番号：１２０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位（抗原結合単位Ｂ７Ｈ６＃２０）；
ｘｘｉ）配列番号：１２１（ＣＤＲ１）、配列番号：１２２（ＣＤＲ２）及び配列番号：１２３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：１２４（ＣＤＲ１）、配列番号：１２５（ＣＤＲ２）及び配列番号：１２６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位（抗原結合単位Ｂ７Ｈ６＃２１）；
ｘｘｉｉ）配列番号：１２７（ＣＤＲ１）、配列番号：１２８（ＣＤＲ２）及び配列番号：１２９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：１３０（ＣＤＲ１）、配列番号：１３１（ＣＤＲ２）及び配列番号：１３２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位（抗原結合単位Ｂ７Ｈ６＃２２）；
ｘｘｉｉｉ）配列番号：１３３（ＣＤＲ１）、配列番号：１３４（ＣＤＲ２）及び配列番号：１３５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：１３６（ＣＤＲ１）、配列番号：１３７（ＣＤＲ２）及び配列番号：１３８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位（抗原結合単位Ｂ７Ｈ６＃２３）；並びに
ｘｘｉｖ）配列番号：１３９（ＣＤＲ１）、配列番号：１４０（ＣＤＲ２）及び配列番号：１４１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：１４２（ＣＤＲ１）、配列番号：１４３（ＣＤＲ２）及び配列番号：１４４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位（抗原結合単位Ｂ７Ｈ６＃２４）；
からなる群より選択される。

【0060】

本発明の結合タンパク質のいくつかの実施形態において、前記ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合単位は、ｉ）～ｖｉ）：
ｉ）配列番号：２５７（ＣＤＲ１）、配列番号：２５８（ＣＤＲ２）及び配列番号：２５９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：２６０（ＣＤＲ１）、配列番号：２６１（ＣＤＲ２）及び配列番号：２６２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位（抗原結合単位ＣＤ３＃１）；
ｉｉ）配列番号：２６３（ＣＤＲ１）、配列番号：２６４（ＣＤＲ２）及び配列番号：２６５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：２６６（ＣＤＲ１）、配列番号：２６７（ＣＤＲ２）及び配列番号：２６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位（抗原結合単位ＣＤ３＃２）；
ｉｉｉ）配列番号：２６９（ＣＤＲ１）、配列番号：２７０（ＣＤＲ２）及び配列番号：２７１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：２７２（ＣＤＲ１）、配列番号：２７３（ＣＤＲ２）及び配列番号：２７４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位（抗原結合単位ＣＤ３＃３）；
ｉｖ）配列番号：２７５（ＣＤＲ１）、配列番号：２７６（ＣＤＲ２）及び配列番号：２７７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：２７８（ＣＤＲ１）、配列番号：２７９（ＣＤＲ２）及び配列番号：２８０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位（抗原結合単位ＣＤ３＃４）；
ｖ）配列番号：２８１（ＣＤＲ１）、配列番号：２８２（ＣＤＲ２）及び配列番号：２８３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：２８４（ＣＤＲ１）、配列番号：２８５（ＣＤＲ２）及び配列番号：２８６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位（抗原結合単位ＣＤ３＃５）；並びに
ｖｉ）配列番号：２８７（ＣＤＲ１）、配列番号：２８８（ＣＤＲ２）及び配列番号：２８９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：２９０（ＣＤＲ１）、配列番号：２９１（ＣＤＲ２）及び配列番号：２９２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む抗原結合単位（抗原結合単位ＣＤ３＃６）；
からなる群より選択される。

【0061】

上に概説されるような第１の抗原結合単位ｉ）～ｘｘｉｖ）は、それぞれ、Ｂ７Ｈ６＃１、Ｂ７Ｈ６＃２、Ｂ７Ｈ６＃３、Ｂ７Ｈ６＃４、Ｂ７Ｈ６＃５、Ｂ７Ｈ６＃６、Ｂ７Ｈ６＃７、Ｂ７Ｈ６＃８、Ｂ７Ｈ６＃９、Ｂ７Ｈ６＃１０、Ｂ７Ｈ６＃１１、Ｂ７Ｈ６＃１２、Ｂ７Ｈ６＃１３、Ｂ７Ｈ６＃１４、Ｂ７Ｈ６＃１５、Ｂ７Ｈ６＃１６、Ｂ７Ｈ６＃１７、Ｂ７Ｈ６＃１８、Ｂ７Ｈ６＃１９、Ｂ７Ｈ６＃２０、Ｂ７Ｈ６＃２１、Ｂ７Ｈ６＃２２、Ｂ７Ｈ６＃２３及びＢ７Ｈ６＃２４と称され、上に概説されるような第２の抗原結合単位ｉ）～ｖｉ）は、それぞれ、ＣＤ３＃１、ＣＤ３＃２、ＣＤ３＃３、ＣＤ３＃４、ＣＤ３＃５及びＣＤ３＃６と称される。本発明の特異的抗原結合単位及び完全長結合タンパク質に対する個々のアミノ酸配列の特定を容易に可能にする配列表が本明細書において提供される。概要は、実施例２の表１に示されている。

【0062】

一般に抗原結合単位に関して「第１の」及び「第２の」という用語は、本明細書で使用される場合、これらの単位が（異なる標的抗原に結合するので）２つの異なる単位であることを示すことのみを意図している。したがって、これらの用語は、本発明の結合タンパク質内での単位の正確な順序又は順番を指すと理解されるべきではない。

【0063】

いくつかの実施形態において、本発明の結合タンパク質は、表１に示されているそれぞれのＣＤＲ配列によって定義されるＢ７Ｈ６＃１、Ｂ７Ｈ６＃２、Ｂ７Ｈ６＃３、Ｂ７Ｈ６＃４、Ｂ７Ｈ６＃５、Ｂ７Ｈ６＃６、Ｂ７Ｈ６＃７、Ｂ７Ｈ６＃８、Ｂ７Ｈ６＃９、Ｂ７Ｈ６＃１０、Ｂ７Ｈ６＃１１、Ｂ７Ｈ６＃１２、Ｂ７Ｈ６＃１３、Ｂ７Ｈ６＃１４、Ｂ７Ｈ６＃１５、Ｂ７Ｈ６＃１６、Ｂ７Ｈ６＃１７、Ｂ７Ｈ６＃１８、Ｂ７Ｈ６＃１９、Ｂ７Ｈ６＃２０、Ｂ７Ｈ６＃２１、Ｂ７Ｈ６＃２２、Ｂ７Ｈ６＃２３及びＢ７Ｈ６＃２４からなる群より選択される第１の抗原結合単位と、表１に示されているそれぞれのＣＤＲ配列によって定義されるＣＤ３＃１、ＣＤ３＃２、ＣＤ３＃３、ＣＤ３＃４、ＣＤ３＃５及びＣＤ３＃６からなる群より選択される第２の抗原結合単位とを含む。

【0064】

いくつかの実施形態において、本発明の結合タンパク質は、表１に示されているそれぞれのＣＤＲ配列によって定義されるＢ７Ｈ６＃１、Ｂ７Ｈ６＃２、Ｂ７Ｈ６＃３、Ｂ７Ｈ６＃４、Ｂ７Ｈ６＃５、Ｂ７Ｈ６＃６、Ｂ７Ｈ６＃７、Ｂ７Ｈ６＃８、Ｂ７Ｈ６＃９、Ｂ７Ｈ６＃１０、Ｂ７Ｈ６＃１１、Ｂ７Ｈ６＃１２、Ｂ７Ｈ６＃１３、Ｂ７Ｈ６＃１４、Ｂ７Ｈ６＃１５、Ｂ７Ｈ６＃１６、Ｂ７Ｈ６＃１７、Ｂ７Ｈ６＃１８、Ｂ７Ｈ６＃１９、Ｂ７Ｈ６＃２０、Ｂ７Ｈ６＃２１、Ｂ７Ｈ６＃２２、Ｂ７Ｈ６＃２３及びＢ７Ｈ６＃２４からなる群より選択される第１の抗原結合単位と、表１に示されているそれぞれのＣＤＲ配列によって定義されるＣＤ３＃１の第２の抗原結合単位とを含む。好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、表１に示されているそれぞれのＣＤＲ配列によって定義されるＢ７Ｈ６＃１、Ｂ７Ｈ６＃２、Ｂ７Ｈ６＃３、Ｂ７Ｈ６＃４、Ｂ７Ｈ６＃５、Ｂ７Ｈ６＃１２、Ｂ７Ｈ６＃１３、Ｂ７Ｈ６＃１４、Ｂ７Ｈ６＃１５、Ｂ７Ｈ６＃１６、Ｂ７Ｈ６＃１７、Ｂ７Ｈ６＃１８、Ｂ７Ｈ６＃１９、Ｂ７Ｈ６＃２０、Ｂ７Ｈ６＃２１、Ｂ７Ｈ６＃２２、Ｂ７Ｈ６＃２３及びＢ７Ｈ６＃２４からなる群より選択される第１の抗原結合単位と、表１に示されているそれぞれのＣＤＲ配列によって定義されるＣＤ３＃１の第２の抗原結合単位とを含む。好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、表１に示されているそれぞれのＣＤＲ配列によって定義されるＢ７Ｈ６＃１２、Ｂ７Ｈ６＃１３、Ｂ７Ｈ６＃１４、Ｂ７Ｈ６＃１５、Ｂ７Ｈ６＃１６、Ｂ７Ｈ６＃１７、Ｂ７Ｈ６＃１８、Ｂ７Ｈ６＃１９、Ｂ７Ｈ６＃２０、Ｂ７Ｈ６＃２１、Ｂ７Ｈ６＃２２、Ｂ７Ｈ６＃２３及びＢ７Ｈ６＃２４からなる群より選択される第１の抗原結合単位と、表１に示されているそれぞれのＣＤＲ配列によって定義されるＣＤ３＃１の第２の抗原結合単位とを含む。好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、表１に示されているそれぞれのＣＤＲ配列によって定義されるＢ７Ｈ６＃１２、Ｂ７Ｈ６＃１４、Ｂ７Ｈ６＃１５、Ｂ７Ｈ６＃１６及びＢ７Ｈ６＃２３からなる群より選択される第１の抗原結合単位と、表１に示されているそれぞれのＣＤＲ配列によって定義されるＣＤ３＃１の第２の抗原結合単位とを含む。

【0065】

本明細書に記載されているＣＤＲ配列に加えて、本発明の結合タンパク質の抗原結合単位は、免疫グロブリンフレームワーク領域（ＦＲ）配列を含む。これらの配列は、好ましくはヒトにおいて免疫原性ではなく、したがって、好ましくは、ヒトの、ヒト化された又は最適化されたＦＲ配列である。適切なヒトの、ヒト化された又は最適化されたＦＲ配列は、当技術分野において公知である。具体的に好ましいＦＲ配列は、完全な抗原結合単位、したがってＣＤＲ配列及びＦＲ配列を開示する、本明細書に示されている実施形態から得ることができる。１つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、配列番号：６７（ＣＤＲ１）、配列番号：６８（ＣＤＲ２）及び配列番号：６９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：７０（ＣＤＲ１）、配列番号：７１（ＣＤＲ２）及び配列番号：７２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む、Ｂ７Ｈ６に特異的に結合する第１の抗原結合単位と、配列番号：２５７（ＣＤＲ１）、配列番号：２５８（ＣＤＲ２）及び配列番号：２５９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：２６０（ＣＤＲ１）、配列番号：２６１（ＣＤＲ２）及び配列番号：２６２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合単位とを含む。このような抗原結合タンパク質は、本明細書においてＢ７Ｈ６＃１４／ＣＤ３＃１と呼ばれる。特に好ましい実施形態において、それぞれＢ７Ｈ６及びＣＤ３に特異的に結合する抗原結合単位は各々、ＶＬ／ＶＨドメイン、例えば配列最適化されたＶＬ／ＶＨドメイン内に上記定義のＣＤＲを含む（Ｂ７Ｈ６＃１２／ＣＤ３＃１）。特に好ましい実施形態において、それぞれＢ７Ｈ６及びＣＤ３に特異的に結合する抗原結合単位（Ｂ７Ｈ６＃１２／ＣＤ３＃１）は、それぞれｓｃＦａｂによって形成され、場合によりそれぞれＦｃドメインに連結されている。

【0066】

１つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、配列番号：７９（ＣＤＲ１）、配列番号：８０（ＣＤＲ２）及び配列番号：８１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：８２（ＣＤＲ１）、配列番号：８３（ＣＤＲ２）及び配列番号：８４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む、Ｂ７Ｈ６に特異的に結合する第１の抗原結合単位と、配列番号：２５７（ＣＤＲ１）、配列番号：２５８（ＣＤＲ２）及び配列番号：２５９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：２６０（ＣＤＲ１）、配列番号：２６１（ＣＤＲ２）及び配列番号：２６２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合単位とを含む。このような抗原結合タンパク質は、本明細書においてＢ７Ｈ６＃１４／ＣＤ３＃１と呼ばれる。特に好ましい実施形態において、それぞれＢ７Ｈ６及びＣＤ３に特異的に結合する抗原結合単位は各々、ＶＬ／ＶＨドメイン、例えば配列最適化されたＶＬ／ＶＨドメイン内に上記定義のＣＤＲを含む（Ｂ７Ｈ６＃１４／ＣＤ３＃１）。特に好ましい実施形態において、それぞれＢ７Ｈ６及びＣＤ３に特異的に結合する抗原結合単位（Ｂ７Ｈ６＃１４／ＣＤ３＃１）は、それぞれｓｃＦａｂによって形成され、場合によりそれぞれＦｃドメインに連結されている。

【0067】

１つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、配列番号：８５（ＣＤＲ１）、配列番号：８６（ＣＤＲ２）及び配列番号：８７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：８８（ＣＤＲ１）、配列番号：８９（ＣＤＲ２）及び配列番号：９０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む、Ｂ７Ｈ６に特異的に結合する第１の抗原結合単位と、配列番号：２５７（ＣＤＲ１）、配列番号：２５８（ＣＤＲ２）及び配列番号：２５９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：２６０（ＣＤＲ１）、配列番号：２６１（ＣＤＲ２）及び配列番号：２６２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合単位とを含む。このような抗原結合タンパク質は、本明細書においてＢ７Ｈ６＃１５／ＣＤ３＃１と呼ばれる。特に好ましい実施形態において、それぞれＢ７Ｈ６及びＣＤ３に特異的に結合する抗原結合単位は各々、ＶＬ／ＶＨドメイン、例えば配列最適化されたＶＬ／ＶＨドメイン内に上記定義のＣＤＲを含む（Ｂ７Ｈ６＃１５／ＣＤ３＃１）。特に好ましい実施形態において、それぞれＢ７Ｈ６及びＣＤ３に特異的に結合する抗原結合単位（Ｂ７Ｈ６＃１５／ＣＤ３＃１）は、それぞれｓｃＦａｂによって形成され、場合によりそれぞれＦｃドメインに連結されている。

【0068】

１つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、配列番号：９１（ＣＤＲ１）、配列番号：９２（ＣＤＲ２）及び配列番号：９３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：９４（ＣＤＲ１）、配列番号：９５（ＣＤＲ２）及び配列番号：９６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む、Ｂ７Ｈ６に特異的に結合する第１の抗原結合単位と、配列番号：２５７（ＣＤＲ１）、配列番号：２５８（ＣＤＲ２）及び配列番号：２５９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：２６０（ＣＤＲ１）、配列番号：２６１（ＣＤＲ２）及び配列番号：２６２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合単位とを含む。このような抗原結合タンパク質は、本明細書においてＢ７Ｈ６＃１６／ＣＤ３＃１と呼ばれる。特に好ましい実施形態において、それぞれＢ７Ｈ６及びＣＤ３に特異的に結合する抗原結合単位は各々、ＶＬ／ＶＨドメイン、例えば配列最適化されたＶＬ／ＶＨドメイン内に上記定義のＣＤＲを含む（Ｂ７Ｈ６＃１６／ＣＤ３＃１）。特に好ましい実施形態において、それぞれＢ７Ｈ６及びＣＤ３に特異的に結合する抗原結合単位（Ｂ７Ｈ６＃１６／ＣＤ３＃１）は、それぞれｓｃＦａｂによって形成され、場合によりそれぞれＦｃドメインに連結されている。

【0069】

１つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、配列番号：１３３（ＣＤＲ１）、配列番号：１３４（ＣＤＲ２）及び配列番号：１３５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：１３６（ＣＤＲ１）、配列番号：１３７（ＣＤＲ２）及び配列番号：１３８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む、Ｂ７Ｈ６に特異的に結合する第１の抗原結合単位と、配列番号：２５７（ＣＤＲ１）、配列番号：２５８（ＣＤＲ２）及び配列番号：２５９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲと配列番号：２６０（ＣＤＲ１）、配列番号：２６１（ＣＤＲ２）及び配列番号：２６２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合単位とを含む。このような抗原結合タンパク質は、本明細書においてＢ７Ｈ６＃１４／ＣＤ３＃１と呼ばれる。特に好ましい実施形態において、それぞれＢ７Ｈ６及びＣＤ３に特異的に結合する抗原結合単位は各々、ＶＬ／ＶＨドメイン、例えば配列最適化されたＶＬ／ＶＨドメイン内に上記定義のＣＤＲを含む（Ｂ７Ｈ６＃２３／ＣＤ３＃１）。特に好ましい実施形態において、それぞれＢ７Ｈ６及びＣＤ３に特異的に結合する抗原結合単位（Ｂ７Ｈ６＃２３／ＣＤ３＃１）は、それぞれｓｃＦａｂによって形成され、場合によりそれぞれＦｃドメインに連結されている。

【0070】

本発明の結合タンパク質の好ましい実施形態において、第１及び第２の結合単位は、それぞれ、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを含み、前記軽鎖／重鎖可変ドメインは、第１の抗原結合単位についてはＢ７Ｈ６＃１、Ｂ７Ｈ６＃２、Ｂ７Ｈ６＃３、Ｂ７Ｈ６＃４、Ｂ７Ｈ６＃５、Ｂ７Ｈ６＃６、Ｂ７Ｈ６＃７、Ｂ７Ｈ６＃８、Ｂ７Ｈ６＃９、Ｂ７Ｈ６＃１０、Ｂ７Ｈ６＃１１、Ｂ７Ｈ６＃１２、Ｂ７Ｈ６＃１３、Ｂ７Ｈ６＃１４、Ｂ７Ｈ６＃１５、Ｂ７Ｈ６＃１６、Ｂ７Ｈ６＃１７、Ｂ７Ｈ６＃１８、Ｂ７Ｈ６＃１９、Ｂ７Ｈ６＃２０、Ｂ７Ｈ６＃２１、Ｂ７Ｈ６＃２２、Ｂ７Ｈ６＃２３又はＢ７Ｈ６＃２４の任意の１つのＣＤＲ配列によって定義され、前記軽鎖／重鎖可変ドメインは、第２の抗原結合単位についてはＣＤ３＃１、ＣＤ３＃２、ＣＤ３＃３、ＣＤ３＃４、ＣＤ３＃５又はＣＤ３＃６の任意の１つのＣＤＲ配列によって定義される。本発明の結合タンパク質のいくつかの実施形態において、Ｂ７Ｈ６＃１、Ｂ７Ｈ６＃２、Ｂ７Ｈ６＃３、Ｂ７Ｈ６＃４、Ｂ７Ｈ６＃５、Ｂ７Ｈ６＃６、Ｂ７Ｈ６＃７、Ｂ７Ｈ６＃８、Ｂ７Ｈ６＃９、Ｂ７Ｈ６＃１０、Ｂ７Ｈ６＃１１、Ｂ７Ｈ６＃１２、Ｂ７Ｈ６＃１３、Ｂ７Ｈ６＃１４、Ｂ７Ｈ６＃１５、Ｂ７Ｈ６＃１６、Ｂ７Ｈ６＃１７、Ｂ７Ｈ６＃１８、Ｂ７Ｈ６＃１９、Ｂ７Ｈ６＃２０、Ｂ７Ｈ６＃２１、Ｂ７Ｈ６＃２２、Ｂ７Ｈ６＃２３、Ｂ７Ｈ６＃２４、ＣＤ３＃１、ＣＤ３＃２、ＣＤ３＃３、ＣＤ３＃４、ＣＤ３＃５又はＣＤ３＃６の任意の１つの抗原結合単位のＶＨ及び／又はＶＬドメインは、ヒトの、ヒト化された又は最適化されたＶＨ及び／又はＶＬドメインである。

【0071】

本発明の結合タンパク質の好ましい実施形態において、Ｂ７Ｈ６に特異的に結合する第１の抗原結合単位の軽鎖／重鎖可変ドメインは、以下のようにさらに定義される。
ｉ）配列番号：１４５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合単位Ｂ７Ｈ６＃１）；又は
ｉｉ）配列番号：１４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合単位Ｂ７Ｈ６＃２）；又は
ｉｉｉ）配列番号：１４９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１５０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合単位Ｂ７Ｈ６＃３）；又は
ｉｖ）配列番号：１５１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１５２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合単位Ｂ７Ｈ６＃４）；又は
ｖ）配列番号：１５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１５４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合単位Ｂ７Ｈ６＃５）；又は
ｖｉ）配列番号：１５５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１５６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合単位Ｂ７Ｈ６＃６）；又は
ｖｉｉ）配列番号：１５７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合単位Ｂ７Ｈ６＃７）；又は
ｖｉｉｉ）配列番号：１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１６０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合単位Ｂ７Ｈ６＃８）；又は
ｉｘ）配列番号：１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１６２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合単位Ｂ７Ｈ６＃９）；又は
ｘ）配列番号：１６３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１６４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合単位Ｂ７Ｈ６＃１０）；又は
ｘｉ）配列番号：１６５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１６６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合単位Ｂ７Ｈ６＃１１）；又は
ｘｉｉ）配列番号：１６７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１６８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合単位Ｂ７Ｈ６＃１２）；又は
ｘｉｉｉ）配列番号：１６９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１７０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合単位Ｂ７Ｈ６＃１３）；又は
ｘｉｖ）配列番号：１７１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１７２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合単位Ｂ７Ｈ６＃１４）；又は
ｘｖ）配列番号：１７３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１７４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合単位Ｂ７Ｈ６＃１５）；又は
ｘｖｉ）配列番号：１７５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１７６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合単位Ｂ７Ｈ６＃１６）；又は
ｘｖｉｉ）配列番号：１７７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１７８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合単位Ｂ７Ｈ６＃１７）；又は
ｘｖｉｉｉ）配列番号：１７９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１８０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合単位Ｂ７Ｈ６＃１８）；又は
ｘｉｘ）配列番号：１８１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１８２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合単位Ｂ７Ｈ６＃１９）；又は
ｘｘ）配列番号：１８３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１８４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合単位Ｂ７Ｈ６＃２０）；又は
ｘｘｉ）配列番号：１８５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１８６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合単位Ｂ７Ｈ６＃２１）；又は
ｘｘｉｉ）配列番号：１８７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１８８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合単位Ｂ７Ｈ６＃２２）；又は
ｘｘｉｉｉ）配列番号：１８９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１９０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合単位Ｂ７Ｈ６＃２３）；又は
ｘｘｉｖ）配列番号：１９１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１９２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合単位Ｂ７Ｈ６＃２４）。

【0072】

本発明の結合タンパク質の好ましい実施形態において、ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合単位の軽鎖／重鎖可変ドメインは、以下のようにさらに定義される。
ｉ）配列番号：２９３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：２９４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合単位ＣＤ３＃１）；又は
ｉｉ）配列番号：２９５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：２９６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合単位ＣＤ３＃２）；又は
ｉｉｉ）配列番号：２９７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：２９８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合単位ＣＤ３＃３）；又は
ｉｖ）配列番号：２９９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：３００のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合単位ＣＤ３＃４）；又は
ｖ）配列番号：３０１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：３０２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合単位ＣＤ３＃５）；又は
ｖｉ）配列番号：３０３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：３０４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（抗原結合単位ＣＤ３＃６）。

【0073】

好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、Ｂ７Ｈ６＃１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃４／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃５／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃６／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃７／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃８／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃９／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１０／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１４／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１５／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１６／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１７／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１８／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１９／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２０／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２３／ＣＤ３＃１及びＢ７Ｈ６＃２４／ＣＤ３＃１からなる群より選択される第１及び第２の抗原結合単位の組み合わせを含み、第１及び第２の抗原結合単位は、表１に示されている抗原結合単位のＣＤＲ及び／又はＶＨ及びＶＬ配列によって定義される。

【0074】

好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、Ｂ７Ｈ６＃１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃４／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃５／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１４／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１５／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１６／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１７／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１８／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１９／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２０／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２３／ＣＤ３＃１及びＢ７Ｈ６＃２４／ＣＤ３＃１からなる群より選択される第１及び第２の抗原結合単位の組み合わせを含み、第１及び第２の抗原結合単位は、表１に示されている抗原結合単位のＣＤＲ及び／又はＶＨ及びＶＬ配列によって定義される。

【0075】

好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、Ｂ７Ｈ６＃１２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１４／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１５／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１６／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１７／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１８／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１９／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２０／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２３／ＣＤ３＃１及びＢ７Ｈ６＃２４／ＣＤ３＃１からなる群より選択される第１及び第２の抗原結合単位の組み合わせを含み、第１及び第２の抗原結合単位は、表１に示されている抗原結合単位のＣＤＲ及び／又はＶＨ及びＶＬ配列によって定義される。

【0076】

好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、Ｂ７Ｈ６＃１２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１４／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１５／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１６／ＣＤ３＃１及びＢ７Ｈ６＃２３／ＣＤ３＃１からなる群より選択される第１及び第２の抗原結合単位の組み合わせを含み、第１及び第２の抗原結合単位は、表１に示されている抗原結合単位のＣＤＲ及び／又はＶＨ及びＶＬ配列によって定義される。

【0077】

１つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、（ｉ）配列番号：１６７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインと配列番号：１６８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインとを含む、Ｂ７Ｈ６に特異的に結合する第１の抗原結合単位と、（ｉｉ）配列番号：２９３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインと配列番号：２９４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインとを含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合単位とを含む。このような結合タンパク質は、本明細書においてＢ７Ｈ６＃１２／ＣＤ３＃１と呼ばれる。特に好ましい実施形態において、上で定義されているように、それぞれＢ７Ｈ６及びＣＤ３に特異的に結合する抗原結合単位（Ｂ７Ｈ６＃１２／ＣＤ３＃１）は、それぞれｓｃＦａｂによって形成され、場合によりＦｃドメインに共有結合で連結されている。

【0078】

１つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、（ｉ）配列番号：１７１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインと配列番号：１７２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインとを含む、Ｂ７Ｈ６に特異的に結合する第１の抗原結合単位と、（ｉｉ）配列番号：２９３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインと配列番号：２９４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインとを含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合単位とを含む。このような結合タンパク質は、本明細書においてＢ７Ｈ６＃１４／ＣＤ３＃１と呼ばれる。特に好ましい実施形態において、上で定義されているように、それぞれＢ７Ｈ６及びＣＤ３に特異的に結合する抗原結合単位（Ｂ７Ｈ６＃１４／ＣＤ３＃１）は、それぞれｓｃＦａｂによって形成され、場合によりＦｃドメインに共有結合で連結されている。

【0079】

１つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、（ｉ）配列番号：１７３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインと配列番号：１７４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインとを含む、Ｂ７Ｈ６に特異的に結合する第１の抗原結合単位と、（ｉｉ）配列番号：２９３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインと配列番号：２９４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインとを含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合単位とを含む。このような結合タンパク質は、本明細書においてＢ７Ｈ６＃１５／ＣＤ３＃１と呼ばれる。特に好ましい実施形態において、上で定義されているように、それぞれＢ７Ｈ６及びＣＤ３に特異的に結合する抗原結合単位（Ｂ７Ｈ６＃１５／ＣＤ３＃１）は、それぞれｓｃＦａｂによって形成され、場合によりＦｃドメインに共有結合で連結されている。

【0080】

１つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、（ｉ）配列番号：１７５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインと配列番号：１７６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインとを含む、Ｂ７Ｈ６に特異的に結合する第１の抗原結合単位と、（ｉｉ）配列番号：２９３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインと配列番号：２９４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインとを含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合単位とを含む。このような結合タンパク質は、本明細書においてＢ７Ｈ６＃１６／ＣＤ３＃１と呼ばれる。特に好ましい実施形態において、上で定義されているように、それぞれＢ７Ｈ６及びＣＤ３に特異的に結合する抗原結合単位（Ｂ７Ｈ６＃１６／ＣＤ３＃１）は、それぞれｓｃＦａｂによって形成され、場合によりＦｃドメインに共有結合で連結されている。

【0081】

１つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、（ｉ）配列番号：１８９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインと配列番号：１９０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインとを含む、Ｂ７Ｈ６に特異的に結合する第１の抗原結合単位と、（ｉｉ）配列番号：２９３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインと配列番号：２９４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインとを含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合単位とを含む。このような結合タンパク質は、本明細書においてＢ７Ｈ６＃２３／ＣＤ３＃１と呼ばれる。特に好ましい実施形態において、上で定義されているように、それぞれＢ７Ｈ６及びＣＤ３に特異的に結合する抗原結合単位（Ｂ７Ｈ６＃２３／ＣＤ３＃１）は、それぞれｓｃＦａｂによって形成され、場合によりＦｃドメインに共有結合で連結されている。

【0082】

いくつかの実施形態において、本発明の結合タンパク質は、ｉ）第１のペプチドリンカーで第１の重鎖可変ドメインに共有結合で連結された第１の軽鎖可変ドメインを含む、Ｂ７Ｈ６に特異的に結合する第１の抗原結合単位（例えば、表１に示されているそれぞれのＣＤＲ又はＶＨ／ＶＬ配列によって定義されるＢ７Ｈ６＃１、Ｂ７Ｈ６＃２、Ｂ７Ｈ６＃３、Ｂ７Ｈ６＃４、Ｂ７Ｈ６＃５、Ｂ７Ｈ６＃６、Ｂ７Ｈ６＃７、Ｂ７Ｈ６＃８、Ｂ７Ｈ６＃９、Ｂ７Ｈ６＃１０、Ｂ７Ｈ６＃１１、Ｂ７Ｈ６＃１２、Ｂ７Ｈ６＃１３、Ｂ７Ｈ６＃１４、Ｂ７Ｈ６＃１５、Ｂ７Ｈ６＃１６、Ｂ７Ｈ６＃１７、Ｂ７Ｈ６＃１８、Ｂ７Ｈ６＃１９、Ｂ７Ｈ６＃２０、Ｂ７Ｈ６＃２１、Ｂ７Ｈ６＃２２、Ｂ７Ｈ６＃２３、Ｂ７Ｈ６＃２４の任意の１つ）、及び／又はｉｉ）第２のペプチドリンカーで第２の重鎖可変ドメインに共有結合で連結された第２の軽鎖可変ドメインを含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合単位（例えば、表１に示されているそれぞれのＣＤＲ又はＶＨ／ＶＬ配列によって定義されるＣＤ３＃１、ＣＤ３＃２、ＣＤ３＃３、ＣＤ３＃４、ＣＤ３＃５又はＣＤ３＃６の任意の１つ）を含む。場合により、第１及び第２の抗原結合単位は、ペプチドリンカーで互いに共有結合で連結されている。

【0083】

本発明の結合タンパク質のいくつかの実施形態において、第１及び／又は第２の抗原結合単位は、従来の抗体分子の軽／重Ｆａｂ断片におけるようなＣＬ及びＣＨ１ドメインをさらに含み、したがって前記第１の結合単位は、ａ）第１のＣＬドメインに共有結合で連結された（好ましくは直接結合された）ＶＬドメイン（例えば、Ｂ７Ｈ６＃１、Ｂ７Ｈ６＃２、Ｂ７Ｈ６＃３、Ｂ７Ｈ６＃４、Ｂ７Ｈ６＃５、Ｂ７Ｈ６＃６、Ｂ７Ｈ６＃７、Ｂ７Ｈ６＃８、Ｂ７Ｈ６＃９、Ｂ７Ｈ６＃１０、Ｂ７Ｈ６＃１１、Ｂ７Ｈ６＃１２、Ｂ７Ｈ６＃１３、Ｂ７Ｈ６＃１４、Ｂ７Ｈ６＃１５、Ｂ７Ｈ６＃１６、Ｂ７Ｈ６＃１７、Ｂ７Ｈ６＃１８、Ｂ７Ｈ６＃１９、Ｂ７Ｈ６＃２０、Ｂ７Ｈ６＃２１、Ｂ７Ｈ６＃２２、Ｂ７Ｈ６＃２３又はＢ７Ｈ６＃２４の任意の１つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＣＤＲ）又はＶＬ配列によって定義される）と、ｂ）第１のＣＨ１ドメインに共有結合で連結された（好ましくは直接結合された）ＶＨドメイン（例えば、Ｂ７Ｈ６＃１、Ｂ７Ｈ６＃２、Ｂ７Ｈ６＃３、Ｂ７Ｈ６＃４、Ｂ７Ｈ６＃５、Ｂ７Ｈ６＃６ Ｂ７Ｈ６＃７、Ｂ７Ｈ６＃８、Ｂ７Ｈ６＃９、Ｂ７Ｈ６＃１０、Ｂ７Ｈ６＃１１、Ｂ７Ｈ６＃１２、Ｂ７Ｈ６＃１３、Ｂ７Ｈ６＃１４、Ｂ７Ｈ６＃１５、Ｂ７Ｈ６＃１６、Ｂ７Ｈ６＃１７、Ｂ７Ｈ６＃１８、Ｂ７Ｈ６＃１９、Ｂ７Ｈ６＃２０、Ｂ７Ｈ６＃２１、Ｂ７Ｈ６＃２２、Ｂ７Ｈ６＃２３又はＢ７Ｈ６＃２４の任意の１つの重鎖ＣＤＲ（ＨＣＣＤＲ）又はＶＨ配列によって定義される）とを含み、及び／又は前記第２の抗原結合単位は、ａ）第２のＣＬドメインに共有結合で連結された（好ましくは直接結合された）ＶＬドメイン（例えば、ＣＤ３＃１、ＣＤ３＃２、ＣＤ３＃３、ＣＤ３＃４、ＣＤ３＃５又はＣＤ３＃６の任意の１つのＬＣＣＤＲ又はＶＬ配列によって定義される）と、ｂ）第２のＣＨ１ドメインに共有結合で連結された（好ましくは直接結合された）ＶＨドメイン（例えば、ＣＤ３＃１、ＣＤ３＃２、ＣＤ３＃３、ＣＤ３＃４、ＣＤ３＃５又はＣＤ３＃６の任意の１つのＨＣＣＤＲ又はＶＨ配列によって定義される）とを含む。

【0084】

本発明の文脈において、ＣＬドメインは、抗体軽鎖の定常ドメイン、例えばカッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖のいずれかである。カッパ軽鎖の定常領域の例が配列番号：２４７に示されている。ラムダ軽鎖の定常領域の例が配列番号：２４８に示されている。いくつかの実施形態において、第１及び第２のＣＬドメインは同じであり、例えば、第１及び第２のＣＬドメインは両方ともカッパ軽鎖定常ドメインであるか、又は第１及び第２のＣＬドメインは両方ともラムダ軽鎖定常ドメインである。好ましい実施形態において、第１及び第２のＣＬドメインは異なり、例えば、第１のＣＬドメインは定常カッパドメインであり、及び第２のＣＬドメインは定常ラムダドメインであり、又はその逆である。

【0085】

本発明の文脈において、ＣＨ１ドメインは、抗体重鎖の第１の定常ドメインである。定常ＣＨ１ドメインの一例は、配列番号：２４９に示されている。

【0086】

本発明の結合タンパク質の好ましい実施形態においては、Ｂ７Ｈ６に対して特異的な第１の抗原結合単位（例えば、表１に示されているＣＤＲ及び／又はＶＨ／ＶＬ配列によって定義されるＢ７Ｈ６＃１、Ｂ７Ｈ６＃２、Ｂ７Ｈ６＃３、Ｂ７Ｈ６＃４、Ｂ７Ｈ６＃５、Ｂ７Ｈ６＃６ Ｂ７Ｈ６＃７、Ｂ７Ｈ６＃８、Ｂ７Ｈ６＃９、Ｂ７Ｈ６＃１０、Ｂ７Ｈ６＃１１、Ｂ７Ｈ６＃１２、Ｂ７Ｈ６＃１３、Ｂ７Ｈ６＃１４、Ｂ７Ｈ６＃１５、Ｂ７Ｈ６＃１６、Ｂ７Ｈ６＃１７、Ｂ７Ｈ６＃１８、Ｂ７Ｈ６＃１９、Ｂ７Ｈ６＃２０、Ｂ７Ｈ６＃２１、Ｂ７Ｈ６＃２２、Ｂ７Ｈ６＃２３又はＢ７Ｈ６＃２４の任意の１つ）は、Ｎ末端からＣ末端に：第１の軽鎖可変ドメインと、第１のＣＬドメインと、第１のリンカーペプチドと、第１のＶＨドメインと、第１のＣＨ１ドメインとを含み、及び／又は本発明の結合タンパク質の第２の結合単位（例えば、表１に示されるＣＤＲ及び／又はＶＨ／ＶＬ配列によって定義されるＣＤ３＃１、ＣＤ３＃２、ＣＤ３＃３、ＣＤ３＃４、ＣＤ３＃５又はＣＤ３＃６）は、Ｎ末端からＣ末端に：第２の軽鎖可変ドメインと、第２のＣＬドメインと、第２のリンカーペプチドと、第２のＶＨドメインと、第２のＣＨ１ドメインとを含む。これらの実施形態において、第１及び／又は第２の結合単位は、単鎖Ｆａｂの構造を有する。第１及び／又は第２の抗原結合単位のいずれについても、単鎖Ｆａｂを形成する場合には、Ｎ末端からＣ末端に、抗原結合単位がＶＨ－ＣＨ１－［リンカーペプチド］－ＶＬ－ＣＬを含むように順序を逆にすることができる。本発明のタンパク質のいくつかの実施形態では、第１及び／又は第２の抗原結合単位がＦａｂ又は単鎖Ｆａｂを含む場合には、定常ドメインは同じタイプ（例えば、両方のＣＬドメインはカッパ又はラムダ軽鎖定常ドメインである）又は異なるタイプ（第１のＣＬドメインはカッパであり、第２のＣＬドメインはラムダ軽鎖定常ドメインである、又はその逆である）のものであり得、好ましくは第１及び第２のＣＬドメインは異なるタイプのものである。好ましい実施形態において、第１の抗原結合単位は、Ｂ７Ｈ６に対して特異的な第１の単鎖Ｆａｂ（好ましくは、表１に示されているＣＤＲ及び／又はＶＨ／ＶＬ配列によって定義されるＢ７Ｈ６＃１２、Ｂ７Ｈ６＃１４、Ｂ７Ｈ６＃１５、Ｂ７Ｈ６＃１６又はＢ７Ｈ６＃２３の任意の１つ）からなり、第２の抗原結合単位は、ＣＤ３に対して特異的な第２の単鎖Ｆａｂ（例えば、表１に示されているようなＣＤＲ及び／又はＶＨ／ＶＬ配列によって定義されるようなＣＤ３＃１）からなる。

【0087】

Ｂ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質（例えば、上記のＢ７Ｈ６／ＣＤ３ｓｃＦａｂ）のリンカー配列は、天然に存在する配列又は天然に存在しない配列であり得る。治療目的で使用される場合、リンカーは、好ましくは、本発明の結合タンパク質が投与される対象において非免疫原性である。好ましくは、リンカーは、２６～４２個のアミノ酸、例えば３０～４０個のアミノ酸を含む。さらなる態様では、本発明のタンパク質において使用されるリンカーは、３４～４０個のアミノ酸、例えば３６～３９個のアミノ酸、例えば３８個のアミノ酸を含む。

【0088】

リンカー配列の１つの有用な群は、国際公開第１９９６／３４１０３号及び国際公開第１９９４／０４６７８号に記載されているような重鎖抗体のヒンジ領域に由来するリンカーである。他の例は、Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａなどのポリアラニンリンカー配列である。

【0089】

リンカー配列のさらに好ましい例は、例えば、（ｇｌｙ４ｓｅｒ）３、（ｇｌｙ４ｓｅｒ）５、（ｇｌｙ４ｓｅｒ）７、（ｇｌｙ３ｓｅｒ）３、（ｇｌｙ３ｓｅｒ）５、（ｇｌｙ３ｓｅｒ）７、（ｇｌｙ３ｓｅｒ２）３、（ｇｌｙ３ｓｅｒ２）５及び（ｇｌｙ３ｓｅｒ２）７を含む（ｇｌｙｘｓｅｒｙ）ｚリンカーなどの異なる長さのＧｌｙ／Ｓｅｒリンカー又は配列番号２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５若しくは２５６、好ましくは配列番号２５０の任意の１つのリンカーである。

【0090】

本発明の結合タンパク質のいくつかの実施形態において、第１の抗原結合単位のＶＬドメイン（例えば、表１に示されている、Ｂ７Ｈ６＃１、Ｂ７Ｈ６＃２、Ｂ７Ｈ６＃３、Ｂ７Ｈ６＃４、Ｂ７Ｈ６＃５、Ｂ７Ｈ６＃６、Ｂ７Ｈ６＃７、Ｂ７Ｈ６＃８、Ｂ７Ｈ６＃９、Ｂ７Ｈ６＃１０、Ｂ７Ｈ６＃１１、Ｂ７Ｈ６＃１２、Ｂ７Ｈ６＃１３、Ｂ７Ｈ６＃１４、Ｂ７Ｈ６＃１５、Ｂ７Ｈ６＃１６、Ｂ７Ｈ６＃１７、Ｂ７Ｈ６＃１８ Ｂ７Ｈ６＃１９、Ｂ７Ｈ６＃２０、Ｂ７Ｈ６＃２１、Ｂ７Ｈ６＃２２、Ｂ７Ｈ６＃２３、Ｂ７Ｈ６＃２４の任意の１つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＣＤＲ）又はＶＬ配列によって定義される）は、第１のＧｌｙ／Ｓｅｒリンカー（例えば、２６～４２個のアミノ酸、３０～４０個のアミノ酸、３４～４０個のアミノ酸又は３６～３９個のアミノ酸、好ましくは３８個のアミノ酸の任意の１つのＧｌｙ／Ｓｅｒリンカー）を介して第１の抗原結合単位のＶＨドメイン（例えば、表１に示されている、Ｂ７Ｈ６＃１、Ｂ７Ｈ６＃２、Ｂ７Ｈ６＃３、Ｂ７Ｈ６＃４、Ｂ７Ｈ６＃５、Ｂ７Ｈ６＃６、Ｂ７Ｈ６＃７、Ｂ７Ｈ６＃８、Ｂ７Ｈ６＃９、Ｂ７Ｈ６＃１０、Ｂ７Ｈ６＃１１、Ｂ７Ｈ６＃１２、Ｂ７Ｈ６＃１３、Ｂ７Ｈ６＃１４、Ｂ７Ｈ６＃１５、Ｂ７Ｈ６＃１６、Ｂ７Ｈ６＃１７、Ｂ７Ｈ６＃１８ Ｂ７Ｈ６＃１９、Ｂ７Ｈ６＃２０、Ｂ７Ｈ６＃２１、Ｂ７Ｈ６＃２２、Ｂ７Ｈ６＃２３、Ｂ７Ｈ６＃２４の任意の１つの重鎖ＣＤＲ（ＨＣＣＤＲ）又はＶＨ配列によって定義される）に共有結合で連結されており、第２の抗原結合単位のＶＬドメイン（例えば、表１に示されている、ＣＤ３＃１、ＣＤ３＃２、ＣＤ３＃３、ＣＤ３＃４、ＣＤ３＃５又はＣＤ３＃６の任意の１つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＣＤＲ）又はＶＬ配列によって定義される）は、第２のＧｌｙ／Ｓｅｒリンカー（例えば、２６～４２個のアミノ酸、３０～４０個のアミノ酸、３４～４０個のアミノ酸又は３６～３９個のアミノ酸、好ましくは３８個のアミノ酸の任意の１つのＧｌｙ／Ｓｅｒリンカー）を介して第２の抗原結合単位のＶＨドメイン（例えば、表１に示されている、ＣＤ３＃１、ＣＤ３＃２、ＣＤ３＃３、ＣＤ３＃４、ＣＤ３＃５又はＣＤ３＃６の任意の１つの重鎖ＣＤＲ（ＨＣＣＤＲ）又はＶＨ配列によって定義される）に共有結合で連結されている。より好ましくは、第１及び第２のリンカーは同じである。さらにより好ましくは、第１及び第２のリンカーは、それぞれ、配列番号：２５０のアミノ酸配列を含む。

【0091】

本発明の結合タンパク質の好ましい実施形態において、Ｂ７Ｈ６に特異的に結合する第１の抗原結合単位は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｉ）ＶＬドメイン（例えば、表１に示されている、Ｂ７Ｈ６＃１、Ｂ７Ｈ６＃２、Ｂ７Ｈ６＃３、Ｂ７Ｈ６＃４、Ｂ７Ｈ６＃５、Ｂ７Ｈ６＃６、Ｂ７Ｈ６＃７、Ｂ７Ｈ６＃８、Ｂ７Ｈ６＃９、Ｂ７Ｈ６＃１０、Ｂ７Ｈ６＃１１、Ｂ７Ｈ６＃１２、Ｂ７Ｈ６＃１３、Ｂ７Ｈ６＃１４、Ｂ７Ｈ６＃１５、Ｂ７Ｈ６＃１６、Ｂ７Ｈ６＃１７、Ｂ７Ｈ６＃１８ Ｂ７Ｈ６＃１９、Ｂ７Ｈ６＃２０、Ｂ７Ｈ６＃２１、Ｂ７Ｈ６＃２２、Ｂ７Ｈ６＃２３、Ｂ７Ｈ６＃２４の任意の１つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＣＤＲ）又はＶＬ配列によって定義される）、ｉｉ）第１のＣＬドメイン、ｉｉｉ）第１のＧｌｙ／Ｓｅｒリンカー（例えば、２６～４２個のアミノ酸、３０～４０個のアミノ酸、３４～４０個のアミノ酸又は３６～３９個のアミノ酸、好ましくは３８個のアミノ酸の任意の１つのＧｌｙ／Ｓｅｒリンカー）を介して、ｉｖ）ＶＨドメイン（例えば、表１に示されている、Ｂ７Ｈ６＃１、Ｂ７Ｈ６＃２、Ｂ７Ｈ６＃３、Ｂ７Ｈ６＃４、Ｂ７Ｈ６＃５、Ｂ７Ｈ６＃６、Ｂ７Ｈ６＃７、Ｂ７Ｈ６＃８、Ｂ７Ｈ６＃９、Ｂ７Ｈ６＃１０、Ｂ７Ｈ６＃１１、Ｂ７Ｈ６＃１２、Ｂ７Ｈ６＃１３、Ｂ７Ｈ６＃１４、Ｂ７Ｈ６＃１５、Ｂ７Ｈ６＃１６、Ｂ７Ｈ６＃１７、Ｂ７Ｈ６＃１８ Ｂ７Ｈ６＃１９、Ｂ７Ｈ６＃２０、Ｂ７Ｈ６＃２１、Ｂ７Ｈ６＃２２、Ｂ７Ｈ６＃２３、Ｂ７Ｈ６＃２４の任意の１つの重鎖ＣＤＲ（ＨＣＣＤＲ）又はＶＨ配列によって定義される）及びｖ）第１のＣＨ１ドメインを含み、並びに／又はＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合単位は、Ｎ末端からＣ末端に、ｉ）ＶＬドメイン（例えば、表１に示されている、ＣＤ３＃１、ＣＤ３＃２、ＣＤ３＃３、ＣＤ３＃４、ＣＤ３＃５又はＣＤ３＃６の任意の１つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＣＤＲ）又はＶＬ配列によって定義される）、ｉｉ）第２のＣＬドメイン、ｉｉｉ）第２のＧｌｙ／Ｓｅｒリンカー（例えば、２６～４２個のアミノ酸、３０～４０個のアミノ酸、３４～４０個のアミノ酸又は３６～３９個のアミノ酸、好ましくは３８個のアミノ酸の任意の１つのＧｌｙ／Ｓｅｒリンカー）、ｉｖ）第２の抗原結合単位のＶＨドメイン（例えば、表１に示されている、ＣＤ３＃１、ＣＤ３＃２、ＣＤ３＃３、ＣＤ３＃４、ＣＤ３＃５又はＣＤ３＃６の任意の１つの重鎖ＣＤＲ（ＨＣＣＤＲ）又はＶＨ配列によって定義される）及びｖ）第２のＣＨ１ドメインを含む。好ましくは、ｉ）～ｖ）は、それぞれ、抗原結合単位のＮ末端からＣ末端にｉ）～ｖ）の順序で直接の共有結合を介して連結される（したがって、各抗原結合単位はｓｃＦａｂの構造を有する）。より好ましくは、第１及び第２のリンカーは同じである。さらにより好ましくは、第１及び第２のリンカーは、それぞれ、配列番号：２５０のアミノ酸配列を含む。

【0092】

好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、Ｂ７Ｈ６に対して特異的な第１の抗原結合単位を形成し、配列番号：１９３、配列番号：１９４、配列番号：１９５、配列番号：１９６、配列番号：１９７、配列番号：１９８、配列番号：１９９、配列番号：２００、配列番号：２０１、配列番号：２０２、配列番号：２０３、配列番号：２０４、配列番号：２０５、配列番号：２０６、配列番号：２０７、配列番号：２０８、配列番号：２０９、配列番号：２１０、配列番号：２１１、配列番号：２１２、配列番号：２１３、配列番号：２１４、配列番号：２１５及び配列番号：２１６からなる群より選択される配列を含む第１の単鎖Ｆａｂと、ＣＤ３に対して特異的な第２の抗原結合単位を形成し、配列番号：３０５の配列を含む第２の単鎖Ｆａｂとを含む。

【0093】

好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、Ｂ７Ｈ６に対して特異的な第１の抗原結合単位を形成し、配列番号：１９３、配列番号：１９４、配列番号：１９５、配列番号：１９６、配列番号：１９７、配列番号：２０４、配列番号：２０５、配列番号：２０６、配列番号：２０７、配列番号：２０８、配列番号：２０９、配列番号：２１０、配列番号：２１１、配列番号：２１２、配列番号：２１３、配列番号：２１４、配列番号：２１５及び配列番号：２１６からなる群より選択される配列を含む第１の単鎖Ｆａｂと、ＣＤ３に対して特異的な第２の抗原結合単位を形成し、配列番号：３０５の配列を含む第２の単鎖Ｆａｂとを含む。

【0094】

好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、Ｂ７Ｈ６に対して特異的な第１の抗原結合単位を形成し、配列番号：２０４、配列番号：２０５、配列番号：２０６、配列番号：２０７、配列番号：２０８、配列番号：２０９、配列番号：２１０、配列番号：２１１、配列番号：２１２、配列番号：２１３、配列番号：２１４、配列番号：２１５及び配列番号：２１６からなる群より選択される配列を含む第１の単鎖Ｆａｂと、ＣＤ３に対して特異的な第２の抗原結合単位を形成し、配列番号：３０５の配列を含む第２の単鎖Ｆａｂとを含む。

【0095】

１つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、配列番号：２０４の配列を含む第１の単鎖Ｆａｂと配列番号：３０５の配列を含む第２の単鎖Ｆａｂとを含み、場合により各単鎖ＦａｂはＦｃドメインにさらに連結され、それにより第１のポリペプチド鎖（「Ｂ７Ｈ６鎖」）及び第２のポリペプチド鎖（「ＣＤ３鎖」）を形成する。１つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、配列番号：２０６の配列を含む第１の単鎖Ｆａｂと配列番号：３０５の配列を含む第２の単鎖Ｆａｂとを含み、場合により各単鎖ＦａｂはＦｃドメインにさらに連結され、それにより第１のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６鎖）及び第２のポリペプチド鎖（ＣＤ３鎖）を形成する。１つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、配列番号：２０７の配列を含む第１の単鎖Ｆａｂと配列番号：３０５の配列を含む第２の単鎖Ｆａｂとを含み、場合により各単鎖ＦａｂはＦｃドメインにさらに連結され、それにより第１のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６鎖）及び第２のポリペプチド鎖（ＣＤ３鎖）を形成する。１つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、配列番号：２０８の配列を含む第１の単鎖Ｆａｂと配列番号：３０５の配列を含む第２の単鎖Ｆａｂとを含み、場合により各単鎖ＦａｂはＦｃドメインにさらに連結され、それにより第１のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６鎖）及び第２のポリペプチド鎖（ＣＤ３鎖）を形成する。１つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、配列番号：２１５の配列を含む第１の単鎖Ｆａｂと配列番号：３０５の配列を含む第２の単鎖Ｆａｂとを含み、場合により各単鎖ＦａｂはＦｃドメインにさらに連結され、それにより第１のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６鎖）及び第２のポリペプチド鎖（ＣＤ３鎖）を形成する。

【0096】

いくつかの実施形態において、第１の抗原結合単位（例えば、表１に示されているＣＤＲ及び／又はＶＨ／ＶＬ配列によって定義されるＢ７Ｈ６＃１、Ｂ７Ｈ６＃２、Ｂ７Ｈ６＃３、Ｂ７Ｈ６＃４、Ｂ７Ｈ６＃５、Ｂ７Ｈ６＃６、Ｂ７Ｈ６＃７、Ｂ７Ｈ６＃８、Ｂ７Ｈ６＃９、Ｂ７Ｈ６＃１０、Ｂ７Ｈ６＃１１、Ｂ７Ｈ６＃１２、Ｂ７Ｈ６＃１３、Ｂ７Ｈ６＃１４、Ｂ７Ｈ６＃１５、Ｂ７Ｈ６＃１６、Ｂ７Ｈ６＃１７、Ｂ７Ｈ６＃１８ Ｂ７Ｈ６＃１９、Ｂ７Ｈ６＃２０、Ｂ７Ｈ６＃２１、Ｂ７Ｈ６＃２２、Ｂ７Ｈ６＃２３又はＢ７Ｈ６＃２４の任意の１つ）及び／又は第２の抗原結合単位（例えば、表１に示されているＣＤＲ配列及び／又はＶＨ／ＶＬ配列によって定義されるＣＤ３＃１、ＣＤ３＃２、ＣＤ３＃３、ＣＤ３＃４、ＣＤ３＃５又はＣＤ３＃６の任意の１つ）は、ＣＬドメインに共有結合で連結された（好ましくは直接結合された）ＶＬドメインとＣＨ１ドメインに連結されたＶＨドメインとを含み（一緒になってＦａｂ断片を形成する）、前記ＣＨ１ドメインはＦｃドメインにさらに共有結合で連結され（例えば、直接結合され）、それによって１つの軽鎖及び１つの重鎖を有する従来のＹ字形抗体分子のアームを形成する。いくつかの実施形態において、第１及び第２の抗原結合単位はそれぞれ、Ｆａｂ断片、すなわち第１及び第２のＦａｂ断片を形成し、Ｆａｂ断片は各々、それぞれ第１及び第２のＦｃドメインに共有結合で連結されており（好ましくは直接結合されており）、それによって従来のヘテロ四量体二重特異性及び二価（それぞれ、Ｂ７Ｈ６及びＣＤ３について一価）抗体分子を形成する。

【0097】

好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、（ｉ）Ｂ７Ｈ６に特異的に結合する第１の単鎖Ｆａｂ、すなわち、ペプチドリンカー（例えば、２６～４２個のアミノ酸、３０～４０個のアミノ酸、３４～４０個のアミノ酸又は３６～３９個のアミノ酸、好ましくは３８個のアミノ酸の任意の１つのＧｌｙ／Ｓｅｒリンカー、さらにより好ましくは配列番号：２５０のリンカー）を介して重鎖のＶＨ－ＣＨ１ドメインに共有結合で連結された抗体軽鎖（ＶＬ－ＣＬ）（表１に示されているＣＤＲ及び／又はＶＨ／ＶＬ配列によって定義されるＢ７Ｈ６＃１、Ｂ７Ｈ６＃２、Ｂ７Ｈ６＃３、Ｂ７Ｈ６＃４、Ｂ７Ｈ６＃５、Ｂ７Ｈ６＃６、Ｂ７Ｈ６＃７、Ｂ７Ｈ６＃８、Ｂ７Ｈ６＃９、Ｂ７Ｈ６＃１０、Ｂ７Ｈ６＃１１、Ｂ７Ｈ６＃１２、Ｂ７Ｈ６＃１３、Ｂ７Ｈ６＃１４、Ｂ７Ｈ６＃１５、Ｂ７Ｈ６＃１６、Ｂ７Ｈ６＃１７、Ｂ７Ｈ６＃１８ Ｂ７Ｈ６＃１９、Ｂ７Ｈ６＃２０、Ｂ７Ｈ６＃２１、Ｂ７Ｈ６＃２２、Ｂ７Ｈ６＃２３又はＢ７Ｈ６＃２４の任意の１つのＶＬ及びＶＨドメイン）を含む第１の抗原結合単位であって、該第１の抗原結合単位は第１のＦｃドメインに共有結合で連結されている（例えば、直接結合されている）第１の抗原結合単位と、（ｉｉ）ＣＤ３に特異的に結合する第２の単鎖Ｆａｂ、すなわち、重鎖のＶＨ－ＣＨ１ドメインに共有結合された抗体軽鎖（ＶＬ－ＣＬ）（表１に示されているそれぞれのＣＤＲ又はＶＨ／ＶＬ配列によって定義されるＣＤ３＃１ ＣＤ３＃２、ＣＤ３＃３、ＣＤ３＃４、ＣＤ３＃５、ＣＤ３＃６の任意の１つのＶＬ及びＶＨドメイン）を含む第２の抗原結合単位であって、該第２の抗原結合単位は第２のＦｃドメインに共有結合されている（例えば、直接結合されている）第２の抗原結合単位とを含む。したがって、好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、（ｉ）（ａ）Ｂ７Ｈ６に対して特異的な第１の抗原結合単位であって、該第１の抗原結合単位はＢ７Ｈ６に対して特異的な第１の単鎖Ｆａｂを含む、第１の抗原結合単位（好ましくは、表１に示されているＣＤＲ及び／又はＶＨ／ＶＬ配列によって定義されるＢ７Ｈ６＃１２、Ｂ７Ｈ６＃１４、Ｂ７Ｈ６＃１５、Ｂ７Ｈ６＃１６又はＢ７Ｈ６＃２３の任意の１つ）とｂ）第１のＦｃドメインとを含む第１のポリペプチド鎖（この第１のポリペプチド鎖は、本明細書において「Ｂ７Ｈ６鎖」とも呼ばれる）と、（ｉｉ）（ａ）ＣＤ３に対して特異的な第２の単鎖Ｆａｂを含む第２の抗原結合（ｂｉｄｉｎｇ）単位（好ましくは表１に示されているＣＤＲ及び／又はＶＬ／ＶＨ配列によって定義されるＣＤ３＃１）と（ｂ）第２のＦｃドメインとを含む、ＣＤ３に対して特異的な第２のポリペプチド鎖（この第２のポリペプチド鎖は、本明細書において「ＣＤ３鎖」とも呼ばれる）とを含む。したがって、本明細書で使用される「ポリペプチド鎖」という用語は、少なくともｓｃＦａｂ及びＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態において、第１及び第２のＦｃドメインは同じである。好ましい実施形態において、第１及び第２のＦｃドメインは異なる。得られた本発明の結合タンパク質は、完全なＦｃを有し、２つの独立した結合部位、すなわち、Ｂ７Ｈ６に対して特異的な第１のｓｃＦａｂによって形成される第１の抗原結合単位とＣＤ３に対して特異的な第２のｓｃＦａｂによって形成される第２の結合単位とを有する２つの異なるポリペプチド鎖を含む。

【0098】

好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、それぞれＦｃドメインに共有結合で連結された異なる特異性を有する、ｓｃＦａｂによって形成された抗原結合単位をそれぞれ含む２つの異なるポリペプチド鎖を含み、ポリペプチド鎖は、ジスルフィド結合を介して又は潜在的にペプチドリンカーを介して互いに共有結合で連結されている。好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、２つのポリペプチド鎖、すなわち、Ｂ７Ｈ６に特異的に結合するｓｃＦａｂによって形成された抗原結合単位（例えば、表１に示されているＣＤＲ及び／又はＶＨ／ＶＬ配列によって定義されるＢ７Ｈ６＃１、Ｂ７Ｈ６＃２、Ｂ７Ｈ６＃３、Ｂ７Ｈ６＃４、Ｂ７Ｈ６＃５、Ｂ７Ｈ６＃６、Ｂ７Ｈ６＃７、Ｂ７Ｈ６＃８、Ｂ７Ｈ６＃９、Ｂ７Ｈ６＃１０、Ｂ７Ｈ６＃１１、Ｂ７Ｈ６＃１２、Ｂ７Ｈ６＃１３、Ｂ７Ｈ６＃１４、Ｂ７Ｈ６＃１５、Ｂ７Ｈ６＃１６、Ｂ７Ｈ６＃１７、Ｂ７Ｈ６＃１８ Ｂ７Ｈ６＃１９、Ｂ７Ｈ６＃２０、Ｂ７Ｈ６＃２１、Ｂ７Ｈ６＃２２、Ｂ７Ｈ６＃２３又はＢ７Ｈ６＃２４の任意の１つ）とＦｃドメイン（好ましくは、配列番号：２４２のＦｃドメイン）とを含む一方のポリペプチド鎖（第１のポリペプチド鎖又はＢ７Ｈ６鎖）及びＣＤ３に特異的に結合するｓｃＦａｂによって形成された抗原結合単位（例えば、ＣＤ３＃１、ＣＤ３＃２、ＣＤ３＃３、ＣＤ３＃４、ＣＤ３＃５又はＣＤ３＃６の任意の１つ）とＦｃドメイン（好ましくは、配列番号：２４３のＦｃドメイン）とを含む他方のポリペプチド鎖（第２のポリペプチド鎖又はＣＤ３鎖）を含む二重特異性の、二価の（それぞれ、Ｂ７Ｈ６及びＣＤ３について一価）ヘテロ二量体タンパク質である。いくつかの実施形態において、第１の抗原結合単位は第１の単鎖Ｆａｂからなり、第２の抗原結合単位は第２の単鎖Ｆａｂからなる。結合タンパク質のいくつかの実施形態において、Ｂ７Ｈ６に対して特異的な第１のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６鎖）は、ａ）ｓｃＦａｂからなる第１の抗原結合単位（（好ましくは、表１に示されているＣＤＲ、ＶＨ／ＶＬ及び／又はｓｃＦａｂ配列によって定義されるＢ７Ｈ６＃１２、Ｂ７Ｈ６＃１４、Ｂ７Ｈ６＃１５、Ｂ７Ｈ６＃１６又はＢ７Ｈ６＃２３の任意の１つ）とｂ）第１のＦｃドメインとからなり、ＣＤ３に対して特異的な第２のポリペプチド鎖（ＣＤ３鎖）は、ａ）ｓｃＦａｂからなる第２の抗原結合単位（好ましくは、表１に示されているＣＤＲ、ＶＨ／ＶＬ及び／又はｓｃＦａｂ配列によって定義されるＣＤ３＃１）とｂ）第２のＦｃドメインとからなる。好ましくは、ｓｃＦａｂのＣ末端は、直接の共有結合を介してＦｃドメインのＮ末端に連結されている。好ましくは、第１及び第２のポリペプチド鎖は、ジスルフィド結合を介して互いに共有結合で連結され、従来のＹ字形抗体分子と同様の抗体様構造（図１）を形成する。

【0099】

本発明の文脈において、Ｆｃドメインは、例えばＩｇＧ、例えばＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２又はＩｇＧ_４の重鎖に由来する。例えば、本発明のＦｃドメインは、ＩｇＧ_１又はＩｇＧ_４の重鎖のＦｃドメインであり、ヒンジ領域及び２つの定常ドメイン（Ｃ_Ｈ２及びＣ_Ｈ３）を含む。Ｆｃドメイン（ヒンジ領域を含む）の例は、配列番号：２４１及び２４４に示されている。

【0100】

本発明のタンパク質のアミノ酸鎖中のアミノ酸の付番は、特に明記しない限り、本明細書ではＥｕ付番システム（Edelman et al,PNAS USA 1969 May,63(1):78-85;Cunningham et al.PNAS USA 1969,Nov,64(3):997-1003）に従う。これは、特に明記しない限り、本明細書に示されるアミノ酸番号が、Ｅｕ付番システムに従って、対応するサブタイプ（例えばＩｇＧ_１又はＩｇＧ_４）の重鎖中の位置に対応することを意味する。

【0101】

いくつかの実施形態において、本発明のタンパク質中の第１のＦｃドメイン及び第２のＦｃドメインはそれぞれ、第１及び第２のポリペプチド鎖のヘテロ二量体に代わる第１又は第２のポリペプチド鎖のホモ二量体の形成を低減させる１つ以上のアミノ酸変化を含む。これらの変化を通して、重鎖の１つの界面からの１つ以上の小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置換することによって、Ｆｃドメインの１つに「突出」が生成される。大きいアミノ酸側鎖をより小さいアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はトレオニン）で置き換えることによって、他方のＦｃドメインの界面上に同一又は類似のサイズの代償的な「空洞」が、作り出される。これは、ホモ二量体、特に「突出」を有するＦｃドメインのホモ二量体などの他の望ましくない最終生成物よりもヘテロ二量体の収率を増加させるための機構を提供する（例えば、Ridgway et al.Protein Eng,1996.9(7):p.617-21;Atwell et al,JMB,1997,270,26-35参照）。いくつかの実施形態において、このようなアミノ酸変化は、第１のＦｃドメインの位置３６６におけるチロシン（Ｙ）［Ｔ３６６Ｙ］及び第２のＦｃドメインの位置４０７におけるトレオニン（Ｔ）［Ｙ４０７Ｔ］である。いくつかの実施形態において、第１のＦｃドメインは位置３６６にセリン（Ｓ）［Ｔ３６６Ｓ］を含み、第２のＦｃドメインは位置３６６にトリプトファン（Ｗ）［Ｔ３６６Ｗ］、位置３６８にアラニン（Ａ）［Ｌ３６８Ａ］及び位置４０７にバリン（Ｖ）［Ｙ４０７Ｖ］を含む。好ましい実施形態において、第１のＦｃドメインは位置３６６にトリプトファン（Ｗ）［Ｔ３６６Ｗ］を含み、第２のＦｃドメインは位置３６６にセリン（Ｓ）［Ｔ３６６Ｓ］、位置３６８にアラニン（Ａ）［Ｌ３６８Ａ］及び位置４０７にバリン（Ｖ）［Ｙ４０７Ｖ］を含む。例えば、配列番号：２４１のヒトＩｇＧ１Ｆｃ配列におけるアミノ酸位置１４６に対応する、Ｅｕ付番によるＦｃドメインの位置３６６は、配列番号：２４１中の位置１４６におけるＴから配列番号：２４２中の位置１４６におけるＷに変更され、配列番号：２４１中のアミノ酸位置１４６、１４８及び１８７にそれぞれ対応する、Ｅｕ付番による位置３６６、３６８及び４０７は、配列番号：２４１中のこれらの位置におけるＴ、Ｌ及びＹから、配列番号：２４３中のこれらの位置におけるＳ、Ａ及びＶに変更される。これらの実施形態のいずれにおいても、第１のＦｃドメインについて記載されたアミノ酸変化は、第２のＦｃドメインに位置し得、第２のＦｃドメインに対するそれぞれのアミノ酸変化は、第１のＦｃドメインに位置し得る。換言すれば、「第１の」及び「第２の」という用語は、これらの実施形態において交換することができる。いくつかの実施形態において、このようなＦｃドメインはＩｇＧ_１又はＩｇＧ_４の重鎖に由来するＦｃドメインである。

【0102】

いくつかの実施形態において、第１のＦｃドメインは、位置３６６におけるトリプトファン（Ｗ）［Ｔ３６６Ｗ］に加えて位置３５４におけるシステイン（Ｃ）［Ｓ３５４Ｃ］を含み、第２のＦｃドメインは、位置３６６におけるセリン（Ｓ）［Ｔ３６６Ｓ］、位置３６８におけるアラニン（Ａ）［Ｌ３６８Ａ］及び位置４０７におけるバリン（Ｖ）［Ｙ４０７Ｖ］に加えて位置３４９におけるシステイン（Ｃ）［Ｙ３４９Ｃ］を含む。一態様では、このようなＦｃドメインは、ＩｇＧ_４の重鎖に由来するＦｃドメインである。

【0103】

いくつかの実施形態において、本発明の結合タンパク質中の第１のＦｃドメイン又は第２のＦｃドメインは、ＦｃドメインのプロテインＡへの結合を低減させる１つ以上のアミノ酸変化をさらに含む。いくつかの実施形態において、このようなアミノ酸変化は、Ｆｃドメインの１つの位置４３５におけるアルギニン［Ｈ４３５Ｒ］及び位置４３６におけるフェニルアラニン［Ｙ４３６Ｆ］である。両方の変化は、ヒトＩｇＧ３の配列に由来する（ＩｇＧ３はプロテインＡに結合しない）。これらの２つの変異はＣＨ３ドメイン中に位置し、プロテインＡへの結合を低減させるためにＦｃドメインの１つに組み込まれる（例えば、Jendeberg et al.J Immunol Methods,1997.201(1):p.25-34参照）。これらの２つの変化は、タンパク質精製中にこれらの変化を含む重鎖のホモ二量体の除去を促進する。

【0104】

いくつかの実施形態において、本発明の結合タンパク質において、位置４０７にトレオニン（Ｔ）［Ｙ４０７Ｔ］を含むＦｃドメインは、位置４３５にアルギニン［Ｈ４３５Ｒ］及び位置４３６にフェニルアラニン［Ｙ４３６Ｆ］をさらに含む。この場合には、他方の重鎖は、位置３６６にチロシン（Ｙ）［Ｔ３６６Ｙ］を含むが、位置４３５及び４３６における２つの変化を含まない。あるいは、いくつかの実施形態において、本発明のタンパク質において、位置３６６にセリン（Ｓ）［Ｔ３６６Ｓ］、位置３６８にアラニン（Ａ）［Ｌ３６８Ａ］及び位置４０７にバリン（Ｖ）［Ｙ４０７Ｖ］を含むＦｃドメインは、位置４３５にアルギニン［Ｈ４３５Ｒ］及び位置４３６にフェニルアラニン［Ｙ４３６Ｆ］をさらに含む。この場合には、他方のＦｃドメインは、位置３６６にトリプトファン（Ｗ）［Ｔ３６６Ｗ］を含むが、位置４３５及び４３６における２つの変化を含まない。したがって、上記の「空洞」をもたらすアミノ酸変化を含むＦｃドメインは、プロテインＡへの結合を低減させるアミノ酸変化も含む。このＦｃドメインを含むホモ二量体は、プロテインＡへの低下した結合を通じて除去される。「突出」を含む他方のＦｃドメインのホモ二量体の産生は、「突出」の存在によって低減される。

【0105】

いくつかの実施形態において、本発明のタンパク質のＦｃドメインは、ＹＴＥ変異（Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｅｕ付番（Dall’Acqua et al.J.Biol.Chem.2006,281(33):23514-24）をさらに含んでもよく、又は含まなくてもよい。これらの変異は、ｐＨ６．０での新生児ＦｃＲｎ受容体に対する結合親和性の優先的増強を通じて、Ｆｃドメインの薬物動態特性を改善することが示されている。

【0106】

いくつかの実施形態において、ＩｇＧ１に由来する本発明の第１及び／又は第２のＦｃドメインは、「ＫＯ」変異（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）も含む（Xu et al,Cellular Immunology 2000 Feb 25,200(1):16-26)。さらなる態様では、ＩｇＧ４に由来する本発明の第１及び／又は第２のＦｃドメインは、Ｐｒｏヒンジ変異（Ｓ２２８Ｐ）も含む（Angal et al,Molecular Immunology 1993,30(1):105-108;Labrijn et al,Nature Biotechnology 2009,27:767-771）。

【0107】

本発明の結合タンパク質の好ましい実施形態において、第１のＦｃドメインは配列番号２４２のアミノ酸配列を含み、第２のＦｃドメインは配列番号２４３のアミノ酸配列を含む。

【0108】

本発明の好ましい実施形態において、結合タンパク質は、ｉ）配列番号：２１７のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６＃１／ＣＤ３＃１）、又はｉｉ）配列番号：２１８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６＃２／ＣＤ３＃１）、又はｉｉｉ）配列番号：２１９のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６＃３／ＣＤ３＃１）、又はｉｖ）配列番号：２２０のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６＃４／ＣＤ３＃１）、又はｖ）配列番号：２２１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６＃５／ＣＤ３＃１）、又はｖｉ）配列番号：２２２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６＃６／ＣＤ３＃１）；又はｖｉｉ）配列番号：２２３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６＃７／ＣＤ３＃１）；又はｖｉｉｉ）配列番号：２２４のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６＃８／ＣＤ３＃１）；又はｉｘ）配列番号：２２５のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６＃９／ＣＤ３＃１）；又はｘ）配列番号：２２６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６＃１０／ＣＤ３＃１）；又はｘｉ）配列番号：２２７のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６＃１１／ＣＤ３＃１）；又はｘｉｉ）配列番号：２２８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６＃１２／ＣＤ３＃１）；又はｘｉｉｉ）配列番号：２２９のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６＃１３／ＣＤ３＃１）；又はｘｉｖ）配列番号：２３０のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６＃１４／ＣＤ３＃１）；又はｘｖ）配列番号：２３１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６＃１５／ＣＤ３＃１）、又はｘｖｉ）配列番号：２３２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６＃１６／ＣＤ３＃１）；又はｘｖｉｉ）配列番号：２３３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６＃１７／ＣＤ３＃１）；又はｘｖｉｉｉ）配列番号：２３４のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６＃１８／ＣＤ３＃１）；又はｘｉｘ）配列番号：２３５のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６＃１９／ＣＤ３＃１）；又はｘｘ）配列番号：２３６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６＃２０／ＣＤ３＃１）；又はｘｘｉ）配列番号：２３７のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６＃２１／ＣＤ３＃１）；又はｘｘｉｉ）配列番号：２３８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６＃２２／ＣＤ３＃１）；又はｘｘｉｉｉ）配列番号：２３９のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６＃２３／ＣＤ３＃１）；又はｘｘｉｖ）配列番号：２４０のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６＃２４／ＣＤ３＃１）を含む。好ましくは、第１及び第２のポリペプチド鎖は、１つ以上のジスルフィド結合を介して連結され、従来のＹ字形抗体分子と同様の抗体様構造（図１）を形成する。

【0109】

好ましい実施形態において、第１のポリペプチド鎖は、配列番号：２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９及び２４０の任意の１つからなる群からのアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号３１１のアミノ酸配列を含む。さらにより好ましくは、第１のポリペプチド鎖は、配列番号２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９及び２４０の任意の１つのアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号３１１のアミノ酸配列を含み、第１及び第２のポリペプチド鎖は、１つ以上のジスルフィド結合を介して連結され、従来のＹ字形抗体分子と同様の抗体様構造（図１）を形成する。

【0110】

１つの好ましい実施形態において、結合タンパク質は、配列番号：２２８のアミノ酸配列を含む、Ｂ７Ｈ６に対して特異的な第１のポリペプチド鎖と、配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む、ＣＤ３に対して特異的な第２のポリペプチド鎖とを含む。

【0111】

１つの好ましい実施形態において、結合タンパク質は、配列番号：２３０のアミノ酸配列を含む、Ｂ７Ｈ６に対して特異的な第１のポリペプチド鎖と、配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む、ＣＤ３に対して特異的な第２のポリペプチド鎖とを含む。

【0112】

１つの好ましい実施形態において、結合タンパク質は、配列番号：２３１のアミノ酸配列を含む、Ｂ７Ｈ６に対して特異的な第１のポリペプチド鎖と、配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む、ＣＤ３に対して特異的な第２のポリペプチド鎖とを含む。

【0113】

１つの好ましい実施形態において、結合タンパク質は、配列番号：２３２のアミノ酸配列を含む、Ｂ７Ｈ６に対して特異的な第１のポリペプチド鎖と、配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む、ＣＤ３に対して特異的な第２のポリペプチド鎖とを含む。

【0114】

１つの好ましい実施形態において、結合タンパク質は、配列番号：２３９のアミノ酸配列を含む、Ｂ７Ｈ６に対して特異的な第１のポリペプチド鎖と、配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む、ＣＤ３に対して特異的な第２のポリペプチド鎖とを含む。

【0115】

本明細書に記載されている実施形態の全てについて、「を含む」という用語を使用することによって、それぞれのタンパク質、分子、抗原結合単位又はポリペプチド鎖が、示されているようなアミノ酸配列「からなる」実施形態も含むことが意図されることを理解されたい。

【0116】

１つの好ましい実施形態において、結合タンパク質は、配列番号：２２８のアミノ酸配列からなる、Ｂ７Ｈ６に対して特異的な第１のポリペプチド鎖と、配列番号：３１１のアミノ酸配列からなる、ＣＤ３に対して特異的な第２のポリペプチド鎖とを含む。好ましくは、第１及び第２のポリペプチド鎖は、１つ以上のジスルフィド結合を介して連結され、従来のＹ字形抗体分子と同様の抗体様構造（図１）を形成する。

【0117】

１つの好ましい実施形態において、結合タンパク質は、配列番号：２３０のアミノ酸配列からなる、Ｂ７Ｈ６に対して特異的な第１のポリペプチド鎖と、配列番号：３１１のアミノ酸配列からなる、ＣＤ３に対して特異的な第２のポリペプチド鎖とを含む。好ましくは、第１及び第２のポリペプチド鎖は、１つ以上のジスルフィド結合を介して連結され、従来のＹ字形抗体分子と同様の抗体様構造（図１）を形成する。

【0118】

１つの好ましい実施形態において、結合タンパク質は、配列番号：２３１のアミノ酸配列からなる、Ｂ７Ｈ６に対して特異的な第１のポリペプチド鎖と、配列番号：３１１のアミノ酸配列からなる、ＣＤ３に対して特異的な第２のポリペプチド鎖とを含む。好ましくは、第１及び第２のポリペプチド鎖は、１つ以上のジスルフィド結合を介して連結され、従来のＹ字形抗体分子と同様の抗体様構造（図１）を形成する。

【0119】

１つの好ましい実施形態において、結合タンパク質は、配列番号：２３２のアミノ酸配列からなる、Ｂ７Ｈ６に対して特異的な第１のポリペプチド鎖と、配列番号：３１１のアミノ酸配列からなる、ＣＤ３に対して特異的な第２のポリペプチド鎖とを含む。好ましくは、第１及び第２のポリペプチド鎖は、１つ以上のジスルフィド結合を介して連結され、従来のＹ字形抗体分子と同様の抗体様構造（図１）を形成する。

【0120】

１つの好ましい実施形態において、結合タンパク質は、配列番号：２３９のアミノ酸配列からなる、Ｂ７Ｈ６に対して特異的な第１のポリペプチド鎖と、配列番号：３１１のアミノ酸配列からなる、ＣＤ３に対して特異的な第２のポリペプチド鎖とを含む。好ましくは、第１及び第２のポリペプチド鎖は、１つ以上のジスルフィド結合を介して連結され、従来のＹ字形抗体分子と同様の抗体様構造（図１）を形成する。

【0121】

さらなる態様において、本発明は、Ｂ７Ｈ６に特異的に結合する第１のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６鎖）とＣＤ３に特異的に結合する第２のポリペプチド鎖（ＣＤ３鎖）とを含む結合タンパク質を提供し、Ｂ７Ｈ６に特異的に結合する第１のポリペプチド鎖は、それ自体が第１の重鎖に共有結合で連結されている（例えば、直接結合されている）第１のリンカーに共有結合で連結された（好ましくは、直接結合された）第１の軽鎖を含み、ＣＤ３に特異的に結合する第２のポリペプチド鎖は、それ自体が第２の重鎖に共有結合で連結されている（例えば、直接結合されている）第２のリンカーに共有結合で連結された（好ましくは、直接結合された）第２の軽鎖を含む。

【0122】

具体的に列挙された抗原結合単位を有する本発明の結合タンパク質に関して本明細書で上記されている全ての定義及び好ましい実施形態は、本明細書で特に定義されない限り、第１及び第２のポリペプチド鎖を含む本発明のこの結合タンパク質にも準用される。

【0123】

いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖（本明細書ではＢ７Ｈ６鎖とも呼ばれる）は、そのＮ末端から出発して、Ｂ７Ｈ６に特異的に結合する第１の軽鎖可変ドメインと、第１の軽鎖定常ドメインと、第１のリンカーと、Ｂ７Ｈ６に対して特異的な第１の重鎖可変ドメインと、第１の重鎖定常領域とを含む。いくつかの実施形態において、そのＮ末端から始まる第２のポリペプチド鎖（本明細書ではＣＤ３鎖とも呼ばれる）は、ＣＤ３に特異的に結合する第２の軽鎖可変ドメインと、第２の軽鎖定常ドメインと、第２のリンカーと、ＣＤ３に対して特異的な第２の重鎖可変ドメインと、第２の重鎖定常ドメインとを含む。

【0124】

得られたタンパク質は、完全なＦｃを有し、（軽鎖と重鎖の間にリンカーが存在するために）ＩｇＧよりも大きく、２つの独立した結合部位（例えば、各結合部位は、それぞれの抗原に対して一価である）である、Ｂ７Ｈ６に対する第１の結合部位とＣＤ３に対する第２の結合部位とを有する。好ましくは、第１及び第２のポリペプチド鎖は、１つ以上のジスルフィド結合を介して連結される。したがって、本発明のタンパク質は、それぞれがｓｃＦａｂ及びＦｃドメインを含む２つのポリペプチド鎖を含む、従来の完全長抗体のＹ字形構造（図１参照）を有する抗体様構造である。好ましい実施形態において、本発明のタンパク質は、（ｉ）Ｂ７Ｈ６に対して特異的な第１のｓｃＦａｂ及び第１のＦｃドメインからなる、Ｂ７Ｈ６に対して特異的な第１のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６鎖）と、（ｉｉ）ＣＤ３に対して特異的な第２の単鎖Ｆａｂ及び第２のＦｃドメインからなる、ＣＤ３に対して特異的な第２のポリペプチド鎖（ＣＤ３鎖）とを含む。

【0125】

好ましくは、第１のｓｃＦａｂは直接的な共有結合を介して第１のＦｃドメインに連結され、第２のｓｃＦａｂは直接的な共有結合を介して第２のＦｃドメインに連結される。この二重特異性フォーマットは、望ましくない免疫原性反応を生じる可能性がより低い構造内の結合部分の機能的特性を維持しながら、（例えば、異なる結合特異性を有する軽及び重可変ドメインの誤対合を回避することによって）発現及び精製後の不均一性を大幅に低減する。これは、例えば哺乳動物細胞中でのヘテロ二量体タンパク質の良好な発現も可能にする。

【0126】

本発明のタンパク質の好ましい実施形態において、Ｂ７Ｈ６に特異的に結合する第１のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６鎖）は、ｉ）～ｘｘｉｖ）からなる群より選択されるＣＤＲ配列を含む、第１の軽鎖可変ドメイン及び第１の重鎖可変ドメインを含む：
ｉ）配列番号：１（ＣＤＲ１）、配列番号：２（ＣＤＲ２）及び配列番号：３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：４（ＣＤＲ１）、配列番号：５（ＣＤＲ２）及び配列番号：６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；
ｉｉ）配列番号：７（ＣＤＲ１）、配列番号：８（ＣＤＲ２）及び配列番号：９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：１０（ＣＤＲ１）、配列番号：１１（ＣＤＲ２）及び配列番号：１２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；
ｉｉｉ）配列番号：１３（ＣＤＲ１）、配列番号：１４（ＣＤＲ２）及び配列番号：１５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：１６（ＣＤＲ１）、配列番号：１７（ＣＤＲ２）及び配列番号：１８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；
ｉｖ）配列番号：１９（ＣＤＲ１）、配列番号：２０（ＣＤＲ２）及び配列番号：２１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：２２（ＣＤＲ１）、配列番号：２３（ＣＤＲ２）及び配列番号：２４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；
ｖ）配列番号：２５（ＣＤＲ１）、配列番号：２６（ＣＤＲ２）及び配列番号：２７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：２８（ＣＤＲ１）、配列番号：２９（ＣＤＲ２）及び配列番号：３０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；
ｖｉ）配列番号：３１（ＣＤＲ１）、配列番号：３２（ＣＤＲ２）及び配列番号：３３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：３４（ＣＤＲ１）、配列番号：３５（ＣＤＲ２）及び配列番号：３６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；
ｖｉｉ）配列番号：３７（ＣＤＲ１）、配列番号：３８（ＣＤＲ２）及び配列番号：３９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：４０（ＣＤＲ１）、配列番号：４１（ＣＤＲ２）及び配列番号：４２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；
ｖｉｉｉ）配列番号：４３（ＣＤＲ１）、配列番号４４（ＣＤＲ２）及び配列番号：４５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：４６（ＣＤＲ１）、配列番号：４７（ＣＤＲ２）及び配列番号：４８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；
ｉｘ）配列番号：４９（ＣＤＲ１）、配列番号：５０（ＣＤＲ２）及び配列番号：５１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：５２（ＣＤＲ１）、配列番号：５３（ＣＤＲ２）及び配列番号：５４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；
ｘ）配列番号：５５（ＣＤＲ１）、配列番号：５６（ＣＤＲ２）及び配列番号：５７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：５８（ＣＤＲ１）、配列番号：５９（ＣＤＲ２）及び配列番号：６０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；
ｘｉ）配列番号：６１（ＣＤＲ１）、配列番号：６２（ＣＤＲ２）及び配列番号：６３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：６４（ＣＤＲ１）、配列番号：６５（ＣＤＲ２）及び配列番号：６６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；
ｘｉｉ）配列番号：６７（ＣＤＲ１）、配列番号：６８（ＣＤＲ２）及び配列番号：６９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：７０（ＣＤＲ１）、配列番号：７１（ＣＤＲ２）及び配列番号：７２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；
ｘｉｉｉ）配列番号：７３（ＣＤＲ１）、配列番号７４（ＣＤＲ２）及び配列番号：７５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：７６（ＣＤＲ１）、配列番号：７７（ＣＤＲ２）及び配列番号：７８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；
ｘｉｖ）配列番号：７９（ＣＤＲ１）、配列番号：８０（ＣＤＲ２）及び配列番号：８１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：８２（ＣＤＲ１）、配列番号：８３（ＣＤＲ２）及び配列番号：８４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；
ｘｖ）配列番号：８５（ＣＤＲ１）、配列番号：８６（ＣＤＲ２）及び配列番号：８７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：８８（ＣＤＲ１）、配列番号：８９（ＣＤＲ２）及び配列番号：９０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；
ｘｖｉ）配列番号：９１（ＣＤＲ１）、配列番号：９２（ＣＤＲ２）及び配列番号：９３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：９４（ＣＤＲ１）、配列番号：９５（ＣＤＲ２）及び配列番号：９６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；
ｘｖｉｉ）配列番号：９７（ＣＤＲ１）、配列番号：９８（ＣＤＲ２）及び配列番号：９９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：１００（ＣＤＲ１）、配列番号：１０１（ＣＤＲ２）及び配列番号：１０２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；
ｘｖｉｉｉ）配列番号：１０３（ＣＤＲ１）、配列番号１０４（ＣＤＲ２）及び配列番号：１０５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：１０６（ＣＤＲ１）、配列番号：１０７（ＣＤＲ２）及び配列番号：１０８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；
ｘｉｘ）配列番号：１０９（ＣＤＲ１）、配列番号：１１０（ＣＤＲ２）及び配列番号：１１１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：１１２（ＣＤＲ１）、配列番号：１１３（ＣＤＲ２）及び配列番号：１１４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；
ｘｘ）配列番号：１１５（ＣＤＲ１）、配列番号：１１６（ＣＤＲ２）及び配列番号：１１７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：１１８（ＣＤＲ１）、配列番号：１１９（ＣＤＲ２）及び配列番号：１２０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；
ｘｘｉ）配列番号：１２１（ＣＤＲ１）、配列番号：１２２（ＣＤＲ２）及び配列番号：１２３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：１２４（ＣＤＲ１）、配列番号：１２５（ＣＤＲ２）及び配列番号：１２６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；
ｘｘｉｉ）配列番号：１２７（ＣＤＲ１）、配列番号：１２８（ＣＤＲ２）及び配列番号：１２９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：１３０（ＣＤＲ１）、配列番号：１３１（ＣＤＲ２）及び配列番号：１３２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；
ｘｘｉｉｉ）配列番号：１３３（ＣＤＲ１）、配列番号１３４（ＣＤＲ２）及び配列番号：１３５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：１３６（ＣＤＲ１）、配列番号：１３７（ＣＤＲ２）及び配列番号：１３８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；並びに
ｘｘｉｖ）配列番号：１３９（ＣＤＲ１）、配列番号：１４０（ＣＤＲ２）及び配列番号：１４１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：１４２（ＣＤＲ１）、配列番号：１４３（ＣＤＲ２）及び配列番号：１４４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ。

【0127】

これらのＣＤＲ配列によって定義されるそれぞれの軽鎖／重鎖可変ドメインは、それぞれＢ７Ｈ６＃１、Ｂ７Ｈ６＃２、Ｂ７Ｈ６＃３、Ｂ７Ｈ６＃４、Ｂ７Ｈ６＃５、Ｂ７Ｈ６＃６、Ｂ７Ｈ６＃７、Ｂ７Ｈ６＃８、Ｂ７Ｈ６＃９、Ｂ７Ｈ６＃１０、Ｂ７Ｈ６＃１１、Ｂ７Ｈ６＃１２、Ｂ７Ｈ６＃１３、Ｂ７Ｈ６＃１４、Ｂ７Ｈ６＃１５、Ｂ７Ｈ６＃１６、Ｂ７Ｈ６＃１７、Ｂ７Ｈ６＃１８、Ｂ７Ｈ６＃１９、Ｂ７Ｈ６＃２０、Ｂ７Ｈ６＃２１、Ｂ７Ｈ６＃２２、Ｂ７Ｈ６＃２３及びＢ７Ｈ６＃２４と命名される。

【0128】

本発明の結合タンパク質の好ましい実施形態において、ＣＤ３に特異的に結合する前記第２のポリペプチド鎖（ＣＤ３鎖）は、以下からなる群より選択されるＣＤＲ配列を含む、第２の軽鎖可変ドメイン及び第２の重鎖可変ドメインを含む：
ｉ）配列番号：２５７（ＣＤＲ１）、配列番号：２５８（ＣＤＲ２）及び配列番号：２５９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：２６０（ＣＤＲ１）、配列番号：２６１（ＣＤＲ２）及び配列番号：２６２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；
ｉｉ）配列番号：２６３（ＣＤＲ１）、配列番号：２６４（ＣＤＲ２）及び配列番号：２６５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：２６６（ＣＤＲ１）、配列番号：２６７（ＣＤＲ２）及び配列番号：２６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；
ｉｉｉ）配列番号：２６９（ＣＤＲ１）、配列番号２７０（ＣＤＲ２）及び配列番号：２７１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：２７２（ＣＤＲ１）、配列番号：２７３（ＣＤＲ２）及び配列番号：２７４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；
ｉｖ）配列番号：２７５（ＣＤＲ１）、配列番号：２７６（ＣＤＲ２）及び配列番号：２７７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：２７８（ＣＤＲ１）、配列番号：２７９（ＣＤＲ２）及び配列番号：２８０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ。
ｖ）配列番号：２８１（ＣＤＲ１）、配列番号：２８２（ＣＤＲ２）及び配列番号：２８３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：２８４（ＣＤＲ１）、配列番号：２８５（ＣＤＲ２）及び配列番号：２８６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；並びに
ｖｉ）配列番号：２８７（ＣＤＲ１）、配列番号：２８８（ＣＤＲ２）及び配列番号：２８９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：２９０（ＣＤＲ１）、配列番号：２９１（ＣＤＲ２）及び配列番号：２９２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ。

【0129】

これらのＣＤＲ配列によって定義されるそれぞれの軽鎖／重鎖可変ドメインは、それぞれＣＤ３＃１、ＣＤ３＃２、ＣＤ３＃３、ＣＤ３＃４、ＣＤ３＃５及びＣＤ３＃６と呼ばれる。

【0130】

好ましくは、軽鎖及び重鎖ＣＤＲ配列は、上で定義したＢ７Ｈ６＃１、Ｂ７Ｈ６＃２、Ｂ７Ｈ６＃３、Ｂ７Ｈ６＃４、Ｂ７Ｈ６＃５、Ｂ７Ｈ６＃１２、Ｂ７Ｈ６＃１３、Ｂ７Ｈ６＃１４、Ｂ７Ｈ６＃１５、Ｂ７Ｈ６＃１６、Ｂ７Ｈ６＃１７、Ｂ７Ｈ６＃１８、Ｂ７Ｈ６＃１９、Ｂ７Ｈ６＃２０、Ｂ７Ｈ６＃２１、Ｂ７Ｈ６＃２２、Ｂ７Ｈ６＃２３及びＢ７Ｈ６＃２４からなる群より選択される。

【0131】

１つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、（ｉ）配列番号：６７（ＣＤＲ１）、配列番号：６８（ＣＤＲ２）及び配列番号：６９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを有する第１の軽鎖可変ドメインと、配列番号：７０（ＣＤＲ１）、配列番号：７１（ＣＤＲ２）及び配列番号：７２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを有する第１の重鎖可変ドメインとを含む、Ｂ７Ｈ６に特異的に結合する第１のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６鎖）と、（ｉｉ）配列番号：２５７（ＣＤＲ１）、配列番号：２５８（ＣＤＲ２）及び配列番号：２５９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを有する第２の軽鎖可変ドメインと、配列番号：２６０（ＣＤＲ１）、配列番号：２６１（ＣＤＲ２）及び配列番号：２６２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを有する第２の重鎖可変ドメインとを含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２のポリペプチド鎖とを含む。

【0132】

１つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、（ｉ）配列番号：７９（ＣＤＲ１）、配列番号：８０（ＣＤＲ２）及び配列番号：８１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを有する第１の軽鎖可変ドメインと、配列番号：８２（ＣＤＲ１）、配列番号：８３（ＣＤＲ２）及び配列番号：８４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを有する第１の重鎖可変ドメインとを含む、Ｂ７Ｈ６に特異的に結合する第１のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６鎖）と、（ｉｉ）配列番号：２５７（ＣＤＲ１）、配列番号：２５８（ＣＤＲ２）及び配列番号：２５９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを有する第２の軽鎖可変ドメインと、配列番号：２６０（ＣＤＲ１）、配列番号：２６１（ＣＤＲ２）及び配列番号：２６２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを有する第２の重鎖可変ドメインとを含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２のポリペプチド鎖とを含む。

【0133】

１つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、（ｉ）配列番号：８５（ＣＤＲ１）、配列番号：８６（ＣＤＲ２）及び配列番号：８７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを有する第１の軽鎖可変ドメインと、配列番号：８８（ＣＤＲ１）、配列番号：８９（ＣＤＲ２）及び配列番号：９０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを有する第１の重鎖可変ドメインとを含む、Ｂ７Ｈ６に特異的に結合する第１のポリペプチド鎖と、（ｉｉ）配列番号：２５７（ＣＤＲ１）、配列番号：２５８（ＣＤＲ２）及び配列番号：２５９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを有する第２の軽鎖可変ドメインと、配列番号：２６０（ＣＤＲ１）、配列番号：２６１（ＣＤＲ２）及び配列番号：２６２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを有する第２の重鎖可変ドメインとを含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２のポリペプチド鎖とを含む。

【0134】

１つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、（ｉ）配列番号：９１（ＣＤＲ１）、配列番号：９２（ＣＤＲ２）及び配列番号：９３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを有する第１の軽鎖可変ドメインと、配列番号：９４（ＣＤＲ１）、配列番号：９５（ＣＤＲ２）及び配列番号：９６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを有する第１の重鎖可変ドメインとを含む、Ｂ７Ｈ６に特異的に結合する第１のポリペプチド鎖と、（ｉｉ）配列番号：２５７（ＣＤＲ１）、配列番号：２５８（ＣＤＲ２）及び配列番号：２５９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを有する第２の軽鎖可変ドメインと、配列番号：２６０（ＣＤＲ１）、配列番号：２６１（ＣＤＲ２）及び配列番号：２６２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを有する第２の重鎖可変ドメインとを含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２のポリペプチド鎖とを含む。

【0135】

１つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、（ｉ）配列番号：１３３（ＣＤＲ１）、配列番号：１３４（ＣＤＲ２）及び配列番号：１３５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを有する第１の軽鎖可変ドメインと、配列番号：１３６（ＣＤＲ１）、配列番号：１３７（ＣＤＲ２）及び配列番号：１３８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを有する第１の重鎖可変ドメインとを含む、Ｂ７Ｈ６に特異的に結合する第１のポリペプチド鎖と、（ｉｉ）配列番号：２５７（ＣＤＲ１）、配列番号：２５８（ＣＤＲ２）及び配列番号：２５９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを有する第２の軽鎖可変ドメインと、配列番号：２６０（ＣＤＲ１）、配列番号：２６１（ＣＤＲ２）及び配列番号：２６２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを有する第２の重鎖可変ドメインとを含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２のポリペプチド鎖とを含む。

【0136】

本発明のタンパク質の好ましい実施形態において、前記Ｂ７Ｈ６に特異的に結合する第１のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６鎖）は、ｉ）～ｘｘｉｖ）からなる群より選択される軽鎖可変ドメイン（第１の軽鎖可変ドメイン）と重鎖可変ドメイン（第１の重鎖可変ドメイン）とを含む：
ｉ）配列番号：１４５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（Ｂ７Ｈ６＃１）；
ｉｉ）配列番号：１４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（Ｂ７Ｈ６＃２）；
ｉｉｉ）配列番号：１４９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１５０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（Ｂ７Ｈ６＃３）；
ｉｖ）配列番号：１５１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１５２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（Ｂ７Ｈ６＃４）；
ｖ）配列番号：１５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１５４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（Ｂ７Ｈ６＃５）；
ｖｉ）配列番号：１５５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１５６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（Ｂ７Ｈ６＃６）；
ｖｉｉ）配列番号：１５７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（Ｂ７Ｈ６＃７）；
ｖｉｉｉ）配列番号：１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１６０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（Ｂ７Ｈ６＃８）；
ｉｘ）配列番号：１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１６２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（Ｂ７Ｈ６＃９）；
ｘ）配列番号：１６３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１６４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（Ｂ７Ｈ６＃１０）；
ｘｉ）配列番号：１６５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１６６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（Ｂ７Ｈ６＃１１）；
ｘｉｉ）配列番号：１６７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１６８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（Ｂ７Ｈ６＃１２）；
ｘｉｉｉ）配列番号：１６９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１７０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（Ｂ７Ｈ６＃１３）；
ｘｉｖ）配列番号：１７１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１７２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（Ｂ７Ｈ６＃１４）；
ｘｖ）配列番号：１７３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１７４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（Ｂ７Ｈ６＃１５）；
ｘｖｉ）配列番号：１７５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１７６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（Ｂ７Ｈ６＃１６）；
ｘｖｉｉ）配列番号：１７７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１７８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（Ｂ７Ｈ６＃１７）；
ｘｖｉｉｉ）配列番号：１７９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１８０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（Ｂ７Ｈ６＃１８）；
ｘｉｘ）配列番号：１８１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１８２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（Ｂ７Ｈ６＃１９）；
ｘｘ）配列番号：１８３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１８４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（Ｂ７Ｈ６＃２０）；
ｘｘｉ）配列番号：１８５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１８６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（Ｂ７Ｈ６＃２１）；
ｘｘｉｉ）配列番号：１８７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１８８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（Ｂ７Ｈ６＃２２）；
ｘｘｉｉｉ）配列番号：１８９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１９０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（Ｂ７Ｈ６＃２３）；並びに
ｘｘｉｖ）配列番号：１９１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：１９２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（Ｂ７Ｈ６＃２４）。

【0137】

好ましくは、軽鎖可変及び重鎖可変ドメイン配列は、上で定義したＢ７Ｈ６＃１、Ｂ７Ｈ６＃２、Ｂ７Ｈ６＃３、Ｂ７Ｈ６＃４、Ｂ７Ｈ６＃５、Ｂ７Ｈ６＃１２、Ｂ７Ｈ６＃１３、Ｂ７Ｈ６＃１４、Ｂ７Ｈ６＃１５、Ｂ７Ｈ６＃１６、Ｂ７Ｈ６＃１７、Ｂ７Ｈ６＃１８、Ｂ７Ｈ６＃１９、Ｂ７Ｈ６＃２０、Ｂ７Ｈ６＃２１、Ｂ７Ｈ６＃２２、Ｂ７Ｈ６＃２３及びＢ７Ｈ６＃２４からなる群より選択される。

【0138】

本発明のタンパク質の好ましい実施形態において、前記ＣＤ３に特異的に結合する第２のポリペプチド鎖（ＣＤ３鎖）は、以下からなる群より選択される軽鎖可変ドメイン（第２の軽鎖可変ドメイン）と重鎖可変ドメイン（第２の重鎖可変ドメイン）とを含む：
ｉ）配列番号：２９３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号２９４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＣＤ３＃１）；
ｉｉ）配列番号：２９５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号２９６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＣＤ３＃２）；
ｉｉｉ）配列番号：２９７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号２９８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＣＤ３＃３）
ｉｖ）配列番号：２９９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号３００のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＣＤ３＃４）
ｖ）配列番号：３０１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号３０２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＣＤ３＃５）
ｖｉ）配列番号：３０３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号３０４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＣＤ３＃６）。

【0139】

いくつかの実施形態において、本発明の結合タンパク質は、Ｂ７Ｈ６＃１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃４／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃５／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃６／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃７／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃８／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃９／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１０／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１４／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１５／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１６／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１７／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１８／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１９／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２０／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２４／ＣＤ３＃１からなるリストより選択される軽鎖／重鎖可変ドメインのＣＤＲ並びに／又はＶＨ及びＶＬ配列を含む第１及び第２のポリペプチド鎖を含む。好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、Ｂ７Ｈ６＃１２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１４／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１５／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１６／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２３／ＣＤ３＃１からなるリストより選択される軽鎖／重鎖可変ドメインのＣＤＲ並びに／又はＶＨ及びＶＬ配列を含む第１及び第２のポリペプチド鎖を含む。さらにより好ましくは、第１のポリペプチド鎖は、配列番号２４２のアミノ酸配列を含むＦｃドメインを含み、前記第２のポリペプチド鎖は、配列番号２４３のアミノ酸配列を含むＦｃドメインを含む。

【0140】

１つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、（ｉ）配列番号：１６７の軽鎖可変ドメインと配列番号：１６８の重鎖可変ドメインとを含む、Ｂ７Ｈ６に特異的に結合する第１のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６鎖）と、（ｉｉ）配列番号：２９３の軽鎖可変ドメインと配列番号：２９４の重鎖可変ドメインとを含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２のポリペプチド鎖（ＣＤ３鎖）とを含む。

【0141】

１つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、（ｉ）配列番号：１７１の軽鎖可変ドメインと配列番号：１７２の重鎖可変ドメインとを含む、Ｂ７Ｈ６に特異的に結合する第１のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６鎖）と、（ｉｉ）配列番号：２９３の軽鎖可変ドメインと配列番号：２９４の重鎖可変ドメインとを含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２のポリペプチド鎖（ＣＤ３鎖）とを含む。

【0142】

１つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、（ｉ）配列番号：１７３の軽鎖可変ドメインと配列番号：１７４の重鎖可変ドメインとを含む、Ｂ７Ｈ６に特異的に結合する第１のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６鎖）と、（ｉｉ）配列番号：２９３の軽鎖可変ドメインと配列番号：２９４の重鎖可変ドメインとを含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２のポリペプチド鎖（ＣＤ３鎖）とを含む。

【0143】

１つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、（ｉ）配列番号：１７５の軽鎖可変ドメインと配列番号：１７６の重鎖可変ドメインとを含む、Ｂ７Ｈ６に特異的に結合する第１のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６鎖）と、（ｉｉ）配列番号：２９３の軽鎖可変ドメインと配列番号：２９４の重鎖可変ドメインとを含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２のポリペプチド鎖（ＣＤ３鎖）とを含む。

【0144】

１つの好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質は、（ｉ）配列番号：１８９の軽鎖可変ドメインと配列番号：１９０の重鎖可変ドメインとを含む、Ｂ７Ｈ６に特異的に結合する第１のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６鎖）と、（ｉｉ）配列番号：２９３の軽鎖可変ドメインと配列番号：２９４の重鎖可変ドメインとを含む、ＣＤ３に特異的に結合する第２のポリペプチド鎖（ＣＤ３鎖）とを含む。

【0145】

好ましい実施形態において、Ｂ７Ｈ６に対して特異的な第１のポリペプチド鎖は、配列番号：１９３、配列番号：１９４、配列番号：１９５、配列番号：１９６、配列番号：１９７、配列番号：１９８、配列番号：１９９、配列番号：２００、配列番号：２０１、配列番号：２０２、配列番号：２０３、配列番号：２０４、配列番号：２０５、配列番号：２０６、配列番号：２０７、配列番号：２０８、配列番号：２０９、配列番号：２１０、配列番号：２１１、配列番号：２１２、配列番号：２１３、配列番号：２１４、配列番号：２１５又は配列番号：２１６の任意の１つのアミノ酸配列を有する単鎖Ｆａｂを含み、ＣＤ３に対して特異的な第２のポリペプチド鎖は、配列番号：３０５のアミノ酸配列を有する単鎖Ｆａｂを含む。

【0146】

好ましくは、第１のポリペプチド鎖は、配列番号：１９３、配列番号：１９４、配列番号：１９５、配列番号：１９６、配列番号：１９７、配列番号：２０４、配列番号：２０５、配列番号：２０６、配列番号：２０７、配列番号：２０８、配列番号：２０９、配列番号：２１０、配列番号：２１１、配列番号：２１２、配列番号：２１３、配列番号：２１４、配列番号：２１５及び配列番号：２１６からなる群より選択されるアミノ酸配列、より好ましくは、配列番号：２０４、配列番号：２０５、配列番号：２０６、配列番号：２０７、配列番号：２０８、配列番号：２０９、配列番号：２１０、配列番号：２１１、配列番号：２１２、配列番号：２１３、配列番号：２１４、配列番号：２１５及び配列番号：２１６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単鎖Ｆａｂを含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号：３０５のアミノ酸配列を含む単鎖Ｆａｂを含む。

【0147】

１つの好ましい実施形態において、Ｂ７Ｈ６に対して特異的な第１のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６鎖）は、配列番号：２０４のアミノ酸配列を含む単鎖Ｆａｂを含み、ＣＤ３に対して特異的な第２のポリペプチド鎖（ＣＤ３鎖）は、配列番号：３０５のアミノ酸配列を含む単鎖Ｆａｂを含む。

【0148】

１つの好ましい実施形態において、Ｂ７Ｈ６に対して特異的な第１のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６鎖）は、配列番号：２０６のアミノ酸配列を含む単鎖Ｆａｂを含み、ＣＤ３に対して特異的な第２のポリペプチド鎖（ＣＤ３鎖）は、配列番号：３０５のアミノ酸配列を含む単鎖Ｆａｂを含む。

【0149】

１つの好ましい実施形態において、Ｂ７Ｈ６に対して特異的な第１のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６鎖）は、配列番号：２０７のアミノ酸配列を含む単鎖Ｆａｂを含み、ＣＤ３に対して特異的な第２のポリペプチド鎖（ＣＤ３鎖）は、配列番号：３０５のアミノ酸配列を含む単鎖Ｆａｂを含む。

【0150】

１つの好ましい実施形態において、Ｂ７Ｈ６に対して特異的な第１のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６鎖）は、配列番号：２０８のアミノ酸配列を含む単鎖Ｆａｂを含み、ＣＤ３に対して特異的な第２のポリペプチド鎖（ＣＤ３鎖）は、配列番号：３０５のアミノ酸配列を含む単鎖Ｆａｂを含む。

【0151】

１つの好ましい実施形態において、Ｂ７Ｈ６に対して特異的な第１のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６鎖）は、配列番号：２１５のアミノ酸配列を含む単鎖Ｆａｂを含み、ＣＤ３に対して特異的な第２のポリペプチド鎖（ＣＤ３鎖）は、配列番号：３０５のアミノ酸配列を含む単鎖Ｆａｂを含む。

【0152】

また、ｓｃＦａｂに関するこの特定の実施形態に関して、含むという用語は、より一般的な用語において本明細書で上に定義したアミノ酸配列「からなる」も含むことが意図される。

【0153】

本発明の結合タンパク質のいくつかの実施形態において、第１及び第２のポリペプチド鎖は、ＩｇＧ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４の重鎖に由来するＦｃドメインを含む。例えば、本発明のＦｃドメインは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４の重鎖のＦｃドメインであり、ヒンジ領域及び２つの定常ドメイン（ＣＨ２及びＣＨ３）を含む。ヒトＩｇＧのＦｃドメインの例は、配列番号：２４１及び配列番号：２４４に示されている。

【0154】

本発明の結合タンパク質のいくつかの実施形態において、重鎖は、１つ以上のアミノ酸変化を含む。例えば、このようなアミノ酸変化は、第１の重鎖の位置３６６におけるチロシン（Ｙ）［Ｔ３６６Ｙ］及び第２の重鎖の位置４０７におけるトレオニン（Ｔ）［Ｙ４０７Ｔ］である。いくつかの実施形態において、第１の重鎖は位置３６６にセリン（Ｓ）［Ｔ３６６Ｓ］を含み、第２の重鎖は位置３６６にトリプトファン（Ｗ）［Ｔ３６６Ｗ］、位置３６８にアラニン（Ａ）［Ｌ３６８Ａ］及び位置４０７にバリン（Ｖ）［Ｙ４０７Ｖ］を含む。好ましい実施形態において、第１の重鎖は位置３６６にトリプトファン（Ｗ）［Ｔ３６６Ｗ］を含み、第２の重鎖は位置３６６にセリン（Ｓ）［Ｔ３６６Ｓ］、位置３６８にアラニン（Ａ）［Ｌ３６８Ａ］及び位置４０７にバリン（Ｖ）［Ｙ４０７Ｖ］を含む。例えば、配列番号：２４１のヒトＩｇＧ１Ｆｃ配列におけるアミノ酸位置１４６に対応する、Ｅｕ付番によるＦｃドメインの位置３６６は、配列番号：２４１中の位置１４６におけるＴから配列番号：２４２中の位置１４６におけるＷに変更され、配列番号：２４１中のアミノ酸位置１４６、１４８及び１８７にそれぞれ対応する、Ｅｕ付番による位置３６６、３６８及び４０７は、配列番号：２４１中のこれらの位置におけるＴ、Ｌ及びＹから、配列番号：２４３中のこれらの位置におけるＳ、Ａ及びＶに変更される。これらの実施形態のいずれにおいても、第１の重鎖について記載されたアミノ酸変化は、第２の重鎖に位置し得、第２の重鎖に対するそれぞれのアミノ酸変化は、第１の重鎖に位置し得る。換言すれば、「第１の」及び「第２の」という用語は、これらの実施形態において交換することができる。いくつかの実施形態において、重鎖はＩｇＧ_１又はＩｇＧ_４の重鎖に由来する。

【0155】

いくつかの実施形態において、本発明のタンパク質中の第１の重鎖又は第２の重鎖は、重鎖のプロテインＡへの結合を低減させる１つ以上のアミノ酸変化をさらに含む。いくつかの実施形態において、このようなアミノ酸変化は、重鎖の１つの位置４３５におけるアルギニン［Ｈ４３５Ｒ］及び位置４３６におけるフェニルアラニン［Ｙ４３６Ｆ］である。

【0156】

いくつかの実施形態において、本発明のタンパク質において、位置４０７にトレオニン（Ｔ）［Ｙ４０７Ｔ］を含む重鎖は、位置４３５にアルギニン［Ｈ４３５Ｒ］及び位置４３６にフェニルアラニン［Ｙ４３６Ｆ］をさらに含む。この場合には、他方の重鎖は、位置３６６にチロシン（Ｙ）［Ｔ３６６Ｙ］を含むが、位置４３５及び４３６における２つの変化を含まない。あるいは、いくつかの実施形態において、本発明のタンパク質において、位置３６６にセリン（Ｓ）［Ｔ３６６Ｓ］、位置３６８にアラニン（Ａ）［Ｌ３６８Ａ］及び位置４０７にバリン（Ｖ）［Ｙ４０７Ｖ］を含む重鎖は、位置４３５にアルギニン［Ｈ４３５Ｒ］及び位置４３６にフェニルアラニン［Ｙ４３６Ｆ］をさらに含む。この場合には、他方の重鎖は、位置３６６にトリプトファン（Ｗ）［Ｔ３６６Ｗ］を含むが、位置４３５及び４３６における２つの変化を含まない。したがって、上記の「空洞」をもたらすアミノ酸変化を含む重鎖は、プロテインＡへの結合を低減させるアミノ酸変化も含む。これらの重鎖を含むホモ二量体は、プロテインＡへの低下した結合を通じて除去される。「突出」を含む他方の重鎖のホモ二量体の産生は、「突出」の存在によって低減される。

【0157】

いくつかの実施形態において、本発明のタンパク質の重鎖は、ＹＴＥ変異（Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、Ｅｕ付番（Dall’Acqua et al.J.Biol.Chem.2006,281(33):23514-24））をさらに含んでもよく、又は含まなくてもよい。これらの変異は、ｐＨ６．０での新生児ＦｃＲｎ受容体に対する結合親和性の優先的増強を通じて、重鎖の薬物動態特性を改善することが示されている。

【0158】

いくつかの実施形態において、ＩｇＧ１に由来する本発明の第１及び／又は第２の重鎖は、「ＫＯ」変異（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）も含む（Xu et al,Cellular Immunology 2000 Feb 25,200(1):16-26）。さらなる態様では、ＩｇＧ４に由来する本発明の第１及び／又は第２の重鎖は、Ｐｒｏヒンジ変異（Ｓ２２８Ｐ）も含む（Angal et al,Molecular Immunology 1993,30(1):105-108;Labrijn et al,Nature Biotechnology 2009,27:767-771）。

【0159】

本発明の結合タンパク質の好ましい実施形態において、第１のポリペプチド鎖は、配列番号：２４２のアミノ酸配列を含むＦｃドメインを含み、第２のポリペプチド鎖は、配列番号２４３：のアミノ酸配列を含むＦｃドメインを含む。

【0160】

本発明の好ましい実施形態において、結合タンパク質は、ｉ）配列番号：２１７のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６＃１／ＣＤ３＃１）、又はｉｉ）配列番号：２１８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６＃２／ＣＤ３＃１）、又はｉｉｉ）配列番号：２１９のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６＃３／ＣＤ３＃１）、又はｉｖ）配列番号：２２０のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６＃４／ＣＤ３＃１）、又はｖ）配列番号：２２１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６＃５／ＣＤ３＃１）、又はｖｉ）配列番号：２２２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６＃６／ＣＤ３＃１）；又はｖｉｉ）配列番号：２２３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６＃７／ＣＤ３＃１）；又はｖｉｉｉ）配列番号：２２４のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６＃８／ＣＤ３＃１）；又はｉｘ）配列番号：２２５のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６＃９／ＣＤ３＃１）；又はｘ）配列番号：２２６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６＃１０／ＣＤ３＃１）；又はｘｉ）配列番号：２２７のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６＃１１／ＣＤ３＃１）；又はｘｉｉ）配列番号：２２８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６＃１２／ＣＤ３＃１）；又はｘｉｉｉ）配列番号：２２９のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６＃１３／ＣＤ３＃１）；又はｘｉｖ）配列番号：２３０のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６＃１４／ＣＤ３＃１）；又はｘｖ）配列番号：２３１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６＃１５／ＣＤ３＃１）、又はｘｖｉ）配列番号：２３２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６＃１６／ＣＤ３＃１）；又はｘｖｉｉ）配列番号：２３３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６＃１７／ＣＤ３＃１）；又はｘｖｉｉｉ）配列番号：２３４のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６＃１８／ＣＤ３＃１）；又はｘｉｘ）配列番号：２３５のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６＃１９／ＣＤ３＃１）；又はｘｘ）配列番号：２３６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６＃２０／ＣＤ３＃１）；又はｘｘｉ）配列番号：２３７のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６＃２１／ＣＤ３＃１）；又はｘｘｉｉ）配列番号：２３８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６＃２２／ＣＤ３＃１）；又はｘｘｉｉｉ）配列番号：２３９のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６＃２３／ＣＤ３＃１）；又はｘｘｉｖ）配列番号：２４０のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖（Ｂ７Ｈ６＃２４／ＣＤ３＃１）を含む。好ましくは、第１及び第２のポリペプチド鎖は、１つ以上のジスルフィド結合を介して連結され、従来のＹ字形抗体分子と同様の抗体様構造（図１）を形成する。

【0161】

１つの好ましい実施形態において、結合タンパク質は、配列番号：２２８のアミノ酸配列を含む、Ｂ７Ｈ６に対して特異的な第１のポリペプチド鎖と、配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む、ＣＤ３に対して特異的な第２のポリペプチド鎖とを含む。好ましくは、第１及び第２のポリペプチド鎖は、１つ以上のジスルフィド結合を介して連結され、従来のＹ字形抗体分子と同様の抗体様構造（図１）を形成する。

【0162】

１つの好ましい実施形態において、結合タンパク質は、配列番号：２３０のアミノ酸配列を含む、Ｂ７Ｈ６に対して特異的な第１のポリペプチド鎖と、配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む、ＣＤ３に対して特異的な第２のポリペプチド鎖とを含む。好ましくは、第１及び第２のポリペプチド鎖は、１つ以上のジスルフィド結合を介して連結され、従来のＹ字形抗体分子と同様の抗体様構造（図１）を形成する。

【0163】

１つの好ましい実施形態において、結合タンパク質は、配列番号：２３１のアミノ酸配列を含む、Ｂ７Ｈ６に対して特異的な第１のポリペプチド鎖と、配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む、ＣＤ３に対して特異的な第２のポリペプチド鎖とを含む。好ましくは、第１及び第２のポリペプチド鎖は、１つ以上のジスルフィド結合を介して連結され、従来のＹ字形抗体分子と同様の抗体様構造（図１）を形成する。

【0164】

１つの好ましい実施形態において、結合タンパク質は、配列番号：２３２のアミノ酸配列を含む、Ｂ７Ｈ６に対して特異的な第１のポリペプチド鎖と、配列番号：３１１のアミノ酸配列を含む、ＣＤ３に対して特異的な第２のポリペプチド鎖とを含む。好ましくは、第１及び第２のポリペプチド鎖は、１つ以上のジスルフィド結合を介して連結され、従来のＹ字形抗体分子と同様の抗体様構造（図１）を形成する。

【0165】

さらなる態様では、本発明のタンパク質は、ヒト及びカニクイザルＢ７Ｈ６に対して好ましくは≦１０ｎＭ、より好ましくは≦１ｎＭ、さらにより好ましくは≦０．１ｎＭの親和性で、Ｂ７Ｈ６に対して特異的な第１の抗原結合単位又はポリペプチド鎖を含む。親和性は、例えば実施例に記載されているように、組換えＢ７Ｈ６タンパク質を使用してＳＰＲ（BIAcore（登録商標）ＳＰＲシステム（GE Healthcare Life Sciences)）アッセイ又は当業者に周知の他の方法で測定することができる。タンパク質は、ヒト及びカニクイザルＣＤ３εγ複合体に対して好ましくは≦５００ｎＭ、より好ましくは≦１００ｎＭ、さらにより好ましくは≦１０ｎＭの親和性を有する第２の抗原結合単位又はポリペプチド鎖を含む。

【0166】

さらなる態様では、本発明のＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質は、Ｂ７Ｈ６陰性細胞に結合せず、Ｂ７Ｈ１と交差反応しない（例えば、それぞれ、実施例１０及び実施例４を参照）。

【0167】

好ましい実施形態において、本発明のＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質（例えば、Ｂ７Ｈ６＃１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃４／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃５／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１４／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１５／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１６／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１７／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１８／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１９／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２０／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２４／ＣＤ３＃１の任意の１つ）は、ナチュラルキラー細胞の活性化を阻害しない。特に、インビトロでナチュラルキラー細胞の活性化を阻害しない本発明のＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質は、ＮＫｐ３０相互作用部位がアラニンで置換されたＢ７Ｈ６に結合する。

【0168】

細胞表面上のＢ７Ｈ６は、ＮＫ細胞の細胞表面上のＮＫｐ３０に結合し、これがＮＫ細胞のＮＫｐ３０媒介性活性化、ＮＫ細胞の細胞傷害性及びサイトカイン分泌の引き金を引く（Brandt et al,J.Exp.Med.2009,206(7):1495-503）。この状況は、組換えＢ７Ｈ６細胞外ドメインタンパク質で被覆されたプレート上でＮＫ細胞株（例えばＮＫ９２ＭＩ）又は初代ＮＫ細胞を培養し、ＣＤ２５若しくはＣＤ６９などの活性化マーカーの上方制御又はＮＫ細胞によるサイトカイン分泌をその後分析することによって、インビトロで模倣することができる。このアッセイ設定は、本発明者らのＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質がＢ７Ｈ６とＮＫｐ３０の相互作用を阻害してＩＦＮγ分泌の阻害をもたらすかどうかを評価するため使用された（実施例１１）。

【0169】

ＮＫｐ３０相互作用部位がアラニンで置換されている組換えＡｌａ変異Ｂ７Ｈ６細胞外タンパク質を使用して、２つのグループの結合タンパク質が存在することが明らかとなった：１）野生型Ｂ７Ｈ６に強力に結合するが、組換えＡｌａ変異Ｂ７Ｈ６細胞外タンパク質には結合しないか、又は弱く結合するに過ぎない結合タンパク質は、インビトロでＮＫ細胞によるＩＦＮγのＢ７Ｈ６依存性分泌を阻害することが分かった（「Ｂ７Ｈ６依存性ＮＫ細胞活性化の阻害剤」）、及び２）野生型Ｂ７Ｈ６に強力に結合し、組換えＡｌａ変異Ｂ７Ｈ６細胞外タンパク質にも結合する能力を維持する結合タンパク質は、インビトロでＮＫ細胞のＢ７Ｈ６依存性活性化及び関連するＩＦＮγ分泌を阻害しないことが分かった（「Ｂ７Ｈ６依存性ＮＫ細胞活性化の非阻害剤」）（実施例６及び１１、図４及び９を参照）。驚くべきことに、Ｂ７Ｈ６依存性ＮＫ細胞活性化の非阻害剤である本発明の結合タンパク質は、Ｂ７Ｈ６発現腫瘍細胞のＴ細胞リダイレクト化溶解においてより強力である（実施例１２、図１０及び１１を参照）。理論に束縛されるものではないが、Ｂ７Ｈ６依存性ＮＫ細胞活性化の非阻害剤は、自然免疫を媒介する上でのＢ７Ｈ６の自然の役割に影響を与えることなく、Ｂ７Ｈ６ ＮＫｐ３０相互作用を可能にする可能性がある。

【0170】

さらなる態様において、本発明のＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質は、（ＮＫ細胞が存在しないマウス異種移植モデル、実施例１９、図２０及び２３参照、及びＮＫ細胞の非存在下における細胞溶解アッセイ、実施例１２、図１０及び１１参照、において示されるように）ＮＫ細胞活性とは無関係に腫瘍細胞に対するＴ細胞リダイレクト化細胞傷害性を媒介することができる。

【0171】

本発明のＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質によって媒介される細胞傷害性を測定するために、様々な方法を使用することができる。例えば、細胞傷害性は、実施例１２に記載されている方法を用いて測定することができる。エフェクター細胞は、例えば、刺激された又は刺激されていない（ヒト又はカニクイザル）Ｔ細胞又はＴ細胞のサブセット（例えばＣＤ４、ＣＤ８）又は刺激されていない（ヒト又はカニクイザル）末梢血単核球（ＰＢＭＣ）であり得る。標的細胞は、少なくとも（ヒト又はカニクイザル）Ｂ７Ｈ６の細胞外ドメインを発現すべきであり、内因性（天然）Ｂ７Ｈ６発現を有する細胞、例えばヒト小細胞肺癌腫細胞株ＳＨＰ７７、ＮＣＩ－Ｈ８２、あるいは完全長Ｂ７Ｈ６又はＢ７Ｈ６の細胞外ドメインのいずれかを発現する組換え細胞でもあり得る。エフェクター対標的細胞比（Ｅ：Ｔ）は通常約１０：１であるが、様々であり得る。Ｂ７Ｈ６／ＣＤ３結合分子の細胞傷害活性は、例えば４８又は７２時間のインキュベーション後のＬＤＨ放出アッセイで決定することができる。細胞傷害性の決定のために使用されるインキュベーション時間及び読み出しの変更は可能であり、当業者に公知である。細胞傷害性についての読み出し系は、ＭＴＴ／ＭＴＳアッセイ、ＡＴＰベースのアッセイ、ＦＡＣＳベースのアッセイ、５１－クロム放出アッセイ、スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイ、比色（ＷＳＴ）アッセイ、クローン形成能アッセイ、ＥＣＩＳ技術及び生物発光アッセイを含むことができる。

【0172】

本発明のＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質によって媒介される細胞傷害活性は、好ましくは細胞ベースの細胞傷害性アッセイにおいて測定される。細胞傷害性は、細胞傷害性アッセイにおいて測定されたＥＣ_９０値によって表される。当業者は、精製されたＴ細胞がエフェクター細胞として使用される場合、ＰＢＭＣと比較してＥＣ_９０がより低くなると予想され得ることを認識しており、当業者はまた、刺激されたＴ細胞が使用される場合、ＥＣ_９０がさらに低くなり得ることを認識している。さらに、標的細胞が細胞表面に多数のＢ７Ｈ６を発現する場合、細胞表面に少数のＢ７Ｈ６分子を発現する細胞と比較してＥＣ_９０値がより低いことが予想され得る。Ｂ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質のＥＣ_９０は、好ましくは≦１０ｎＭ、より好ましくは≦５ｎＭ、さらにより好ましくは≦１ｎＭである。

【0173】

好ましくは、本発明の多重特異性結合タンパク質は、Ｂ７Ｈ６陰性細胞の溶解を誘導／媒介しない。Ｂ７Ｈ６陰性細胞の「溶解を誘導／媒介しない」という用語は、Ｂ７Ｈ６／ＣＤ３結合分子が、３０％超、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、特に５％以下又はＢ７Ｈ６陰性細胞の溶解を誘導又は媒介しないが、Ｂ７Ｈ６陽性結腸直腸細胞株の溶解は１００％に設定されることを意味する。これは、通常、１０００ｎＭまでの結合タンパク質の濃度に当てはまる。

【0174】

さらに、本発明のＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質は、二段階精製過程で９５％を超えるモノマー含有量に達することが示されており（実施例２０を参照）、好ましい薬物動態特性及び良好な下流製造可能性を有し、さらに、良好な生体内分布を有することが期待される（例えば、実施例１８を参照）。本発明のタンパク質はさらに、好ましい免疫原性プロファイルを有し（実施例２２を参照）、インビトロ及びインビボで良好な安定性を有する（例えば、実施例２１及び１８を参照）。さらに、本発明のＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質は、ヒト化されたインビボ異種移植マウスモデルにおいて好ましい有効性を示す。Ｂ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質は、Ｂ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質の最初の投与後に既に開始する強い腫瘍退縮を誘導した（例えば、実施例１９を参照）。さらに、本発明のＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質は、週に１回（ｑ７ｄ）投与される０．０５ｍｇ／ｋｇの極めて低い用量で腫瘍退縮を誘導し、本発明のＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質の治療適用性をさらに支持する。特に、本発明のＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質は、Ｂ７Ｈ６陽性標的細胞の存在下でのみ選択的なＴ細胞増殖、Ｔ細胞活性化、Ｔ細胞脱顆粒及びサイトカイン分泌を誘導し（それぞれ、実施例１６、１４、１５、１７を参照）、Ｂ７Ｈ６陰性標的細胞の存在下では誘導せず、腫瘍組織中へのＴ細胞浸潤をさらに有意に増加させる（実施例２４を参照）。

【0175】

本発明のさらなる態様は、本発明の多重特異性結合タンパク質の第１及び／又は第２の抗原結合単位（それぞれ表１に示されているＣＤＲ、ＶＨ／ＶＬ又はｓｃＦａｂ配列によって定義される、抗原結合単位Ｂ７Ｈ６＃１、Ｂ７Ｈ６＃２、Ｂ７Ｈ６＃３、Ｂ７Ｈ６＃４、Ｂ７Ｈ６＃５、Ｂ７Ｈ６＃６、Ｂ７Ｈ６＃７、Ｂ７Ｈ６＃８、Ｂ７Ｈ６＃９、Ｂ７Ｈ６＃１０、Ｂ７Ｈ６＃１１、Ｂ７Ｈ６＃１２、Ｂ７Ｈ６＃１３、Ｂ７Ｈ６＃１４、Ｂ７Ｈ６＃１５、Ｂ７Ｈ６＃１６、Ｂ７Ｈ６＃１７、Ｂ７Ｈ６＃１８、Ｂ７Ｈ６＃１９、Ｂ７Ｈ６＃２０、Ｂ７Ｈ６＃２１、Ｂ７Ｈ６＃２２、Ｂ７Ｈ６＃２３及びＢ７Ｈ６＃２４の任意の１つ並びに／又は抗原結合単位ＣＤ３＃１、ＣＤ３＃２、ＣＤ３＃３、ＣＤ３＃４、ＣＤ３＃５及びＣＤ３＃６の任意の１つ）をコードする単離された核酸分子を提供する。いくつかの実施形態において、核酸分子は、本明細書に記載されている第１及び／又は第２のＦｃドメインをさらにコードし、第１及び／又は第２のＦｃドメインは、それぞれ第１及び／又は第２の抗原結合単位をコードする核酸分子の３’末端に連結されている。いくつかの実施形態において、核酸分子は、ｉ）Ｂ７Ｈ６に対して特異的な第１の単鎖Ｆａｂ（例えば、Ｂ７Ｈ６＃１、Ｂ７Ｈ６＃２、Ｂ７Ｈ６＃３、Ｂ７Ｈ６＃４、Ｂ７Ｈ６＃５、Ｂ７Ｈ６＃６、Ｂ７Ｈ６＃７、Ｂ７Ｈ６＃８、Ｂ７Ｈ６＃９、Ｂ７Ｈ６＃１０、Ｂ７Ｈ６＃１１、Ｂ７Ｈ６＃１２、Ｂ７Ｈ６＃１３、Ｂ７Ｈ６＃１４、Ｂ７Ｈ６＃１５、Ｂ７Ｈ６＃１６、Ｂ７Ｈ６＃１７、Ｂ７Ｈ６＃１８、Ｂ７Ｈ６＃１９、Ｂ７Ｈ６＃２０、Ｂ７Ｈ６＃２１、Ｂ７Ｈ６＃２２、Ｂ７Ｈ６＃２３及びＢ７Ｈ６＃２４の任意の１つ）と第１のＦｃドメインとを含む第１のポリペプチド鎖及び／又はｉｉ）ＣＤ３に対して特異的な第２の単鎖Ｆａｂ（例えば、ＣＤ３＃１、ＣＤ３＃２、ＣＤ３＃３、ＣＤ３＃４、ＣＤ３＃５及びＣＤ３＃６の任意の１つ、好ましくはＣＤ３＃１）と第２のＦｃドメインとを含む第２のポリペプチド鎖をコードする。

【0176】

好ましくは、核酸分子は、配列番号：１９３、配列番号：１９４、配列番号：１９５、配列番号：１９６、配列番号：１９７、配列番号：１９８、配列番号：１９９、配列番号：２００、配列番号：２０１、配列番号：２０２、配列番号：２０３、配列番号：２０４、配列番号：２０５、配列番号：２０６、配列番号：２０７、配列番号：２０８、配列番号：２０９、配列番号：２１０、配列番号：２１１、配列番号：２１２、配列番号：２１３、配列番号：２１４、配列番号：２１５若しくは配列番号：２１６の任意の１つの、Ｂ７Ｈ６に対して特異的な第１の単鎖Ｆａｂ及び／又は配列番号：３０５の第２の単鎖Ｆａｂをコードするヌクレオチド配列を含む。好ましい実施形態において、核酸分子は、配列番号：２０４、配列番号：２０６、配列番号：２０７、配列番号：２０８若しくは配列番号：２１５の任意の１つの、Ｂ７Ｈ６に対して特異的な第１のｓｃＦａｂをコードするヌクレオチド配列、及び／又は配列番号：３０５のアミノ酸配列を含む、ＣＤ３に対して特異的な第２のｓｃＦａｂをコードするヌクレオチド配列を含む。

【0177】

本発明のさらなる態様は、第１及び／又は第２の抗原結合ドメイン（例えば、本発明の第１及び／又は第２の単鎖Ｆａｂ）をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を含有する発現ベクターを提供する。好ましくは、発現ベクターは、第１及び／又は第２の抗原結合ドメイン（例えば、第１及び／又は第２の単鎖Ｆａｂ）をそれぞれコードする核酸分子、好ましくはＤＮＡ分子に連結された、第１及び／又は第２のＦｃドメインをコードする核酸分子、好ましくはＤＮＡ分子をさらに含む。したがって、発現ベクターは、第１のＦｃドメインに連結された第１の単鎖Ｆａｂを含むポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列及び／又は第２のＦｃドメインに連結された第２の単鎖Ｆａｂを含むポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。

【0178】

好ましい実施形態において、発現ベクターは、本発明の、Ｂ７Ｈ６に対して特異的な第１のポリペプチド鎖及び／又はＣＤ３に対して特異的な第２のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を含有する。好ましい実施形態において、発現ベクターは、配列番号：２１７、配列番号：２１８、配列番号：２１９、配列番号：２２０、配列番号：２２１、配列番号：２２２、配列番号：２２３、配列番号；２２４、配列番号：２２５、配列番号：２２６、配列番号：２２７、配列番号：２２８、配列番号：２２９、配列番号：２３０、配列番号：２３１、配列番号：２３２、配列番号：２３３、配列番号：２３４、配列番号：２３５、配列番号：２３６、配列番号：２３７、配列番号：２３８、配列番号：２３９若しくは配列番号：２４０の任意の１つの第１のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列、及び／又は配列番号：３１１を含む第２のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。

【0179】

さらに好ましい実施形態において、発現ベクターは、配列番号：２２８、配列番号：２３０、配列番号：２３１、配列番号：２３２及び配列番号：２３９の任意の１つの第１のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列及び／又は配列番号：３１１を含む第２のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。

【0180】

具体的に好ましい実施形態においては、２つの発現ベクターを使用することができ、それらの１つはＢ７Ｈ６に対して特異的な第１のポリペプチド鎖の発現のために、もう１つはＣＤ３に対して特異的な第２のポリペプチド鎖の発現のために使用され、次いで、これらの２つの発現ベクターはいずれも組換えタンパク質発現のために宿主細胞中に形質導入され得る。

【0181】

好ましくは、発現ベクターは、少なくとも１つの調節配列に機能的に連結された前記１つ又は複数の核酸分子を含むベクターであり、このような調節配列は、プロモーター、エンハンサー又はターミネーター配列、最も好ましくは異種プロモーター、エンハンサー又はターミネーター配列であり得る。

【0182】

別の態様において、本発明は、本発明のＢ７Ｈ６に対して特異的な第１のポリペプチド鎖をコードする発現ベクターと本発明のＣＤ３に対して特異的な第２のポリペプチド鎖をコードする発現ベクターとを有する宿主細胞に関する。

【0183】

特に好ましい実施形態によれば、前記宿主細胞は、哺乳動物細胞などの真核細胞である。別の実施形態において、このような宿主細胞は細菌細胞である。他の有用な細胞は、酵母細胞又は他の真菌細胞である。

【0184】

適切な哺乳動物細胞としては、例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞などが挙げられる。しかしながら、両生類細胞、昆虫細胞、植物細胞、及び異種タンパク質の発現のために当技術分野で使用される任意の他の細胞も使用することができる。

【0185】

抗Ｂ７Ｈ６抗体
本発明のさらなる態様は、以下を含む抗Ｂ７Ｈ６抗体分子を提供する：
ｉ）配列番号：１（ＣＤＲ１）、配列番号：２（ＣＤＲ２）及び配列番号：３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：４（ＣＤＲ１）、配列番号：５（ＣＤＲ２）及び配列番号：６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；又は
ｉｉ）配列番号：７（ＣＤＲ１）、配列番号：８（ＣＤＲ２）及び配列番号：９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：１０（ＣＤＲ１）、配列番号：１１（ＣＤＲ２）及び配列番号：１２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；又は
ｉｉｉ）配列番号：１３（ＣＤＲ１）、配列番号：１４（ＣＤＲ２）及び配列番号：１５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：１６（ＣＤＲ１）、配列番号：１７（ＣＤＲ２）及び配列番号：１８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；又は
ｉｖ）配列番号：１９（ＣＤＲ１）、配列番号：２０（ＣＤＲ２）及び配列番号：２１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：２２（ＣＤＲ１）、配列番号：２３（ＣＤＲ２）及び配列番号：２４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；又は
ｖ）配列番号：２５（ＣＤＲ１）、配列番号：２６（ＣＤＲ２）及び配列番号：２７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：２８（ＣＤＲ１）、配列番号：２９（ＣＤＲ２）及び配列番号：３０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；又は
ｖｉ）配列番号：３１（ＣＤＲ１）、配列番号：３２（ＣＤＲ２）及び配列番号：３３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：３４（ＣＤＲ１）、配列番号：３５（ＣＤＲ２）及び配列番号：３６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；又は
ｖｉｉ）配列番号：３７（ＣＤＲ１）、配列番号：３８（ＣＤＲ２）及び配列番号：３９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：４０（ＣＤＲ１）、配列番号：４１（ＣＤＲ２）及び配列番号：４２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；又は
ｖｉｉｉ）配列番号：４３（ＣＤＲ１）、配列番号４４（ＣＤＲ２）及び配列番号：４５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：４６（ＣＤＲ１）、配列番号：４７（ＣＤＲ２）及び配列番号：４８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；又は
ｉｘ）配列番号：４９（ＣＤＲ１）、配列番号：５０（ＣＤＲ２）及び配列番号：５１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：５２（ＣＤＲ１）、配列番号：５３（ＣＤＲ２）及び配列番号：５４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；又は
ｘ）配列番号：５５（ＣＤＲ１）、配列番号：５６（ＣＤＲ２）及び配列番号：５７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：５８（ＣＤＲ１）、配列番号：５９（ＣＤＲ２）及び配列番号：６０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；又は
ｘｉ）配列番号：６１（ＣＤＲ１）、配列番号：６２（ＣＤＲ２）及び配列番号：６３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：６４（ＣＤＲ１）、配列番号：６５（ＣＤＲ２）及び配列番号：６６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；又は
ｘｉｉ）配列番号：６７（ＣＤＲ１）、配列番号：６８（ＣＤＲ２）及び配列番号：６９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：７０（ＣＤＲ１）、配列番号：７１（ＣＤＲ２）及び配列番号：７２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；又は
ｘｉｉｉ）配列番号：７３（ＣＤＲ１）、配列番号７４（ＣＤＲ２）及び配列番号：７５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：７６（ＣＤＲ１）、配列番号：７７（ＣＤＲ２）及び配列番号：７８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；又は
ｘｉｖ）配列番号：７９（ＣＤＲ１）、配列番号：８０（ＣＤＲ２）及び配列番号：８１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む並びに配列番号：８２（ＣＤＲ１）、配列番号：８３（ＣＤＲ２）及び配列番号：８４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；又は
ｘｖ）配列番号：８５（ＣＤＲ１）、配列番号：８６（ＣＤＲ２）及び配列番号：８７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：８８（ＣＤＲ１）、配列番号：８９（ＣＤＲ２）及び配列番号：９０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；又は
ｘｖｉ）配列番号：９１（ＣＤＲ１）、配列番号：９２（ＣＤＲ２）及び配列番号：９３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：９４（ＣＤＲ１）、配列番号：９５（ＣＤＲ２）及び配列番号：９６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；又は
ｘｖｉｉ）配列番号：９７（ＣＤＲ１）、配列番号：９８（ＣＤＲ２）及び配列番号：９９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：１００（ＣＤＲ１）、配列番号：１０１（ＣＤＲ２）及び配列番号：１０２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；又は
ｘｖｉｉｉ）配列番号：１０３（ＣＤＲ１）、配列番号１０４（ＣＤＲ２）及び配列番号：１０５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：１０６（ＣＤＲ１）、配列番号：１０７（ＣＤＲ２）及び配列番号：１０８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；又は
ｘｉｘ）配列番号：１０９（ＣＤＲ１）、配列番号：１１０（ＣＤＲ２）及び配列番号：１１１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：１１２（ＣＤＲ１）、配列番号：１１３（ＣＤＲ２）及び配列番号：１１４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；又は
ｘｘ）配列番号：１１５（ＣＤＲ１）、配列番号：１１６（ＣＤＲ２）及び配列番号：１１７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：１１８（ＣＤＲ１）、配列番号：１１９（ＣＤＲ２）及び配列番号：１２０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；又は
ｘｘｉ）配列番号：１２１（ＣＤＲ１）、配列番号：１２２（ＣＤＲ２）及び配列番号：１２３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：１２４（ＣＤＲ１）、配列番号：１２５（ＣＤＲ２）及び配列番号：１２６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；又は
ｘｘｉｉ）配列番号：１２７（ＣＤＲ１）、配列番号：１２８（ＣＤＲ２）及び配列番号：１２９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：１３０（ＣＤＲ１）、配列番号：１３１（ＣＤＲ２）及び配列番号：１３２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；又は
ｘｘｉｉｉ）配列番号：１３３（ＣＤＲ１）、配列番号１３４（ＣＤＲ２）及び配列番号：１３５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：１３６（ＣＤＲ１）、配列番号：１３７（ＣＤＲ２）及び配列番号：１３８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ；又は
ｘｘｉｖ）配列番号：１３９（ＣＤＲ１）、配列番号：１４０（ＣＤＲ２）及び配列番号：１４１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：１４２（ＣＤＲ１）、配列番号：１４３（ＣＤＲ２）及び配列番号：１４４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ。

【0186】

上で概説された抗体ｉ）～ｘｘｉｖ）は、それぞれＢ７Ｈ６＃１、Ｂ７Ｈ６＃２、Ｂ７Ｈ６＃３、Ｂ７Ｈ６＃４、Ｂ７Ｈ６＃５、Ｂ７Ｈ６＃６、Ｂ７Ｈ６＃７、Ｂ７Ｈ６＃８、Ｂ７Ｈ６＃９、Ｂ７Ｈ６＃１０、Ｂ７Ｈ６＃１１、Ｂ７Ｈ６＃１２、Ｂ７Ｈ６＃１３、Ｂ７Ｈ６＃１４、Ｂ７Ｈ６＃１５、Ｂ７Ｈ６＃１６、Ｂ７Ｈ６＃１７、Ｂ７Ｈ６＃１８、Ｂ７Ｈ６＃１９、Ｂ７Ｈ６＃２０、Ｂ７Ｈ６＃２１、Ｂ７Ｈ６＃２２、Ｂ７Ｈ６＃２３及びＢ７Ｈ６＃２４と命名される。本発明の特異的抗体に対する個々のアミノ酸配列の特定を容易に可能にする配列表が本明細書において提供される。

【0187】

いくつかの実施形態において、本発明の抗Ｂ７Ｈ６抗体は、キメラ、ヒト化された、ヒトの又は最適化された抗体分子である。いくつかの実施形態において、抗体分子はモノクローナル抗体Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ又はｓｃＦｖである。いくつかの実施形態において、本発明の抗Ｂ７Ｈ６抗体分子は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ及びＩｇＥ定常領域からなる群から選択される重鎖定常領域を含む。いくつかの実施形態において、本発明の抗Ｂ７Ｈ６抗体分子の軽鎖定常領域は、カッパ又はラムダである。

【0188】

いくつかの実施形態において、本発明の抗Ｂ７Ｈ６抗体は、配列番号：１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０及び１９２の任意の１つと少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを有する。好ましくは、抗体分子は、配列番号：１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０又は１９２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを有する。

【0189】

いくつかの実施形態において、抗Ｂ７Ｈ６抗体分子は、配列番号：１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９及び１９１の任意の１つと少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する。好ましくは、抗体分子は、配列番号：１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９及び１９１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する。

【0190】

アミノ酸配列同一性を計算する方法は当技術分野で周知であり、本明細書の定義の項でさらに論じられている。

【0191】

いくつかの実施形態において、抗Ｂ７Ｈ６抗体分子は、ｉ）配列番号１４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号１４５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（Ｂ７Ｈ６＃１）、又はｉｉ）配列番号１４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号１４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（Ｂ７Ｈ６＃２）、又はｉｉｉ）配列番号１５０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号１４９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（Ｂ７Ｈ６＃３）、又はｉｖ）配列番号１５２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号１５１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（Ｂ７Ｈ６＃４）；又はｖ）配列番号１５４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号１５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（Ｂ７Ｈ６＃５）；又はｖｉ）配列番号１５６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号１５５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（Ｂ７Ｈ６＃６）；又はｖｉｉ）配列番号１５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号１５７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（Ｂ７Ｈ６＃７）；又はｖｉｉｉ）配列番号１６０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号１５９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（Ｂ７Ｈ６＃８）；又はｉｘ）配列番号１６２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号１６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（Ｂ７Ｈ６＃９）；又はｘ）配列番号１６４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号１６３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（Ｂ７Ｈ６＃１０）；又はｘｉ）配列番号１６６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号１６５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（Ｂ７Ｈ６＃１１）；又はｘｉｉ）配列番号１６８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号１６７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（Ｂ７Ｈ６＃１２）；又はｘｉｉｉ）配列番号１７０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号１６９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（Ｂ７Ｈ６＃１３）；又はｘｉｖ）配列番号１７２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号１７１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（Ｂ７Ｈ６＃１４）；又はｘｖ）配列番号１７４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号１７３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（Ｂ７Ｈ６＃１５）；又はｘｖｉ）配列番号１７６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号１７５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（Ｂ７Ｈ６＃１６）；又はｘｖｉｉ）配列番号１７８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号１７７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（Ｂ７Ｈ６＃１７）；又はｘｖｉｉｉ）配列番号１８０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号１７９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（Ｂ７Ｈ６＃１８）；又はｘｉｘ）配列番号１８２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号１８１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（Ｂ７Ｈ６＃１９）；又はｘｘ）配列番号１８４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号１８３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（Ｂ７Ｈ６＃２０）；又はｘｘｉ）配列番号１８６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号１８５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（Ｂ７Ｈ６＃２１）；又はｘｘｉｉ）配列番号１８８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号１８７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（Ｂ７Ｈ６＃２２）；又はｘｘｉｉｉ）配列番号１９０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号１８９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（Ｂ７Ｈ６＃２３）；又はｘｘｉｖ）配列番号１９２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号１９１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（Ｂ７Ｈ６＃２４）を有する。

【0192】

いくつかの実施形態において、本発明の抗Ｂ７Ｈ６抗体はマウスモノクローナル抗体である。本発明の文脈において、マウスモノクローナル抗体は、ヒトＢ７Ｈ６タンパク質によるマウスの免疫、ヒトＢ７Ｈ６に一定の親和性で結合する適切なＶＨ及びＶＬ配列のその後の選択、次いで、組換え技術によるマウスに（例えば、マウスＩｇＧ２ａに）由来する定常ドメインへのこのようなＶＨ及びＶＬ配列のさらなる結合からＶＨ及びＶＬが得られ、宿主細胞中での組換え発現によって産生される抗体を含む。例えば、異なる種由来の可変領域及び定常領域を含むキメラ抗体が、本発明によってさらに包含される。いくつかの実施形態において、本発明の抗体分子は、上記のようなマウスに由来するＶＨ及びＶＬドメインを含み、さらに、ヒト、ウサギ、ラット、ヤギ、ロバなどの別の種に由来する定常ドメインを含むキメラ抗体である。いくつかの実施形態において、キメラ抗体は、マウスに由来するＶＨ及びＶＬドメイン、並びに上で定義したように最適化されたさらなるヒト化又は配列を含み、別の種に由来する定常ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態において、キメラ抗体は、ヒトＩｇＧ配列を含むトランスジェニック動物（例えば、マウス）由来のＶＨ及びＶＬドメインを含み、したがってヒトＶＨ及びＶＬ配列を含み、さらに別の種に由来する定常ドメインを含む。上に概説したキメラ抗体の実施形態のいずれかにおいて、重鎖定常領域は、マウス、ヒト、ウサギ、ラット、ヤギ又はロバの重鎖領域である。

【0193】

いくつかの実施形態において、本発明の抗Ｂ７Ｈ６抗体分子は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ及びＩｇＥ定常ドメインからなる群から選択される定常ドメインを有する。好ましい実施形態において、抗Ｂ７Ｈ６抗体はＩｇＧ２ａの定常ドメインを有する。いくつかの実施形態において、抗Ｂ７Ｈ６抗体分子は、カッパ又はラムダである軽鎖定常ドメインを有し、好ましくは、軽鎖定常ドメインは、好ましくは配列番号：２４７の配列を含むカッパ軽鎖定常ドメインである。

【0194】

本明細書で提供されるＢ７Ｈ６特異的抗体は、色素、薬物又は異なる抗原に対する結合特異性を有する別の分子を付着させることによって、（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＦＡＣＳ分析、免疫組織学などにおいて）Ｂ７Ｈ６を発現する細胞を標識し、局在化し、同定し、又は標的化するために使用され得る。

【0195】

本発明の別の態様は、本発明の抗Ｂ７Ｈ６抗体分子の重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインをコードする単離された核酸分子を提供する。

【0196】

好ましくは、核酸分子は、配列番号：１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０又は１９２の任意の１つの重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。好ましくは、核酸分子は、配列番号：１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９又は１９１の任意の１つの軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。

【0197】

本発明のさらなる態様は、本発明の抗Ｂ７Ｈ６抗体分子の重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を含有する発現ベクターを提供する。

【0198】

好ましくは、発現ベクターは、重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインをそれぞれコードする核酸分子、好ましくはＤＮＡ分子に連結された、重鎖の定常ドメイン及び／又は軽鎖の定常ドメインをそれぞれコードする核酸分子、好ましくはＤＮＡ分子をさらに含む。

【0199】

具体的に好ましい実施形態では、一方は重鎖の発現のための、他方は軽鎖の発現のための２つの発現ベクターが使用され得、次いで、その２つの発現ベクターはいずれも組換えタンパク質発現のために宿主細胞中に形質導入され得る。

【0200】

好ましくは、発現ベクターは、少なくとも１つの調節配列に機能的に連結された前記１つ又は複数の核酸分子を含むベクターであり、このような調節配列は、プロモーター、エンハンサー又はターミネーター配列、最も好ましくは異種プロモーター、エンハンサー又はターミネーター配列であり得る。

【0201】

別の態様において、本発明は、本発明の抗Ｂ７Ｈ６抗体分子の重鎖をコードする発現ベクター及び本発明の抗Ｂ７Ｈ６抗体分子の軽鎖をコードする発現ベクターを有する宿主細胞に関する。

【0202】

特に好ましい実施形態によれば、前記宿主細胞は、哺乳動物細胞などの真核細胞である。別の実施形態において、このような宿主細胞は細菌細胞である。他の有用な細胞は、酵母細胞又は他の真菌細胞である。

【0203】

適切な哺乳動物細胞としては、例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞などが挙げられる。しかしながら、両生類細胞、昆虫細胞、植物細胞、及び異種タンパク質の発現のために当技術分野で使用される任意の他の細胞も使用することができる。

【0204】

製造及び精製の方法
本発明はさらに、本発明の多重特異性結合タンパク質を製造する方法を提供し、このような方法は、一般に、
－本発明の結合タンパク質の形成を可能にする条件下で、本発明の結合タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを含む宿主細胞を培養する工程；並びに
－前記宿主細胞によって発現された前記結合タンパク質を培養物から回収する工程；並びに
－場合により、本発明の結合タンパク質をさらに精製する及び／又は修飾する及び／又は製剤化する工程；
を含む。

【0205】

本発明はさらに、本発明の抗Ｂ７Ｈ６抗体を製造する方法を提供し、このような方法は、一般に、
－本発明の抗体分子をコードする核酸を含む発現ベクターを含む宿主細胞を、前記抗体分子の形成を可能にする条件下で、培養する工程；並びに
－前記宿主細胞によって発現された前記抗体分子を培養物から回収する工程；並びに
－場合により、本発明の抗体分子をさらに精製する及び／又は修飾する及び／又は製剤化する工程；
を含む。

【0206】

本発明の核酸は、例えば、コード配列並びに調節配列及び場合により天然若しくは人工のイントロンを含むＤＮＡ分子であり得、又はｃＤＮＡ分子であり得る。本発明の核酸は、その元のコドンを有し得るか、又は意図された宿主細胞若しくは宿主生物における発現に対して特異的に適合された最適化されたコドン使用を有し得る。本発明の一実施形態によれば、本発明の核酸は、上記で定義されるように、本質的に単離された形態である。

【0207】

本発明の核酸は、本明細書に示される本発明のタンパク質のアミノ酸配列に関する情報に基づいて、それ自体公知の方法で（例えば、自動化されたＤＮＡ合成及び／又は組換えＤＮＡ技術によって）調製又は取得され得る。

【0208】

本発明の核酸は、典型的には、発現ベクター、すなわち、適切な宿主細胞又は他の発現系に形質導入された場合にタンパク質の発現を提供することができるベクター中に組み込まれる。

【0209】

本発明の結合タンパク質又は抗体を製造するために、当業者は、当技術分野で周知の多種多様な発現系、例えば、Kipriyanow及びLe Gall,2004によって概説されているものから選択され得る。

【0210】

発現ベクターとしては、プラスミド、レトロウイルス、コスミド、ＥＢＶ由来エピソームなどが挙げられる。発現ベクター及び発現制御配列は、宿主細胞と適合的であるように選択される。Ｂ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質の第１の抗原結合単位（例えば、本発明の結合タンパク質のＢ７Ｈ６特異的単鎖Ｆａｂ又は完全長Ｂ７Ｈ６鎖）をコードするヌクレオチド配列と第２の抗原結合単位（例えば、本発明の結合タンパク質のＣＤ３特異的単鎖Ｆａｂ又は完全長ＣＤ３鎖）をコードするヌクレオチド配列は、別々のベクターに挿入することができる。ある特定の実施形態において、両方のＤＮＡ配列は、同じ発現ベクターに挿入される。Ｂ７Ｈ６抗体の軽鎖をコードするヌクレオチド配列とＢ７Ｈ６抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列は、別々のベクターに挿入することができる。ある特定の実施形態において、両方のＤＮＡ配列は、同じ発現ベクターに挿入される。

【0211】

従来のベクターは、機能的に完全なヒトＣＨ（定常重）免疫グロブリン配列をコードし、単鎖Ｆａｂ配列又は任意の重鎖／軽鎖可変ドメインなどの任意の抗原結合単位が上記のように容易に挿入され、発現され得るように適切な制限部位が操作されているベクターである。抗体重鎖の場合、限定されないが、任意のＩｇＧアイソタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）又は対立遺伝子変異形を含む他の免疫グロブリンであり得る。

【0212】

組換え発現ベクターは、宿主細胞からの完全長ＣＤ３若しくはＢ７Ｈ６鎖又は抗Ｂ７Ｈ６抗体の軽鎖／重鎖の分泌を促進するシグナルペプチドもコードし得る。シグナルペプチドが成熟完全長鎖ＤＮＡのアミノ末端にインフレームで連結されるように、タンパク質鎖をコードするＤＮＡはベクターにクローニングされ得る。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド又は非免疫グロブリンタンパク質由来の異種ペプチドであり得る。あるいは、本発明のタンパク質の完全長鎖をコードするＤＮＡ配列は、シグナルペプチド配列を既に含有し得る。

【0213】

Ｂ７Ｈ６／ＣＤ３鎖をコードするＤＮＡ配列又はＢ７Ｈ６抗体の重鎖／軽鎖をコードするＤＮＡ配列に加えて、典型的には、組換え発現ベクターは、プロモーター、エンハンサー、終結シグナル及びポリアデニル化シグナル並びに宿主細胞におけるタンパク質鎖の発現を制御する他の発現制御エレメントを含む調節配列、場合により異種の調節配列を有する。プロモーター配列の例（哺乳動物細胞での発現のために例示される）は、ＣＭＶ（CMV Simian Virus40(SV40）プロモーター／エンハンサーなど）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、ポリオーマ由来のプロモーター及び／又はエンハンサー、並びに天然の免疫グロブリン及びアクチンプロモーターなどの強力な哺乳動物プロモーターである。ポリアデニル化シグナルの例は、ＢＧＨポリＡ、ＳＶ４０後期又は初期ポリＡであり、あるいは、免疫グロブリン遺伝子などの３’ＵＴＲを使用することができる。

【0214】

組換え発現ベクターは、宿主細胞中でのベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）及び選択可能なマーカー遺伝子も有し得る。第１の抗原結合単位を有する完全長鎖（単鎖Ｆａｂ及びＦｃドメイン）若しくはその抗原結合部分及び／又は第２の抗原結合単位を有する完全長鎖（単鎖Ｆａｂ及びＦｃドメイン）若しくはその抗原結合部分をコードする核酸分子並びにこれらのＤＮＡ分子を含むベクターは、リポソーム媒介形質導入、ポリカチオン媒介形質導入、プロトプラスト融合、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム沈殿、電気穿孔又はウイルスベクターによる導入を含む当技術分野で周知の形質導入方法に従って、宿主細胞、例えば細菌細胞又は高等真核細胞、例えば哺乳動物細胞中に導入することができる。

【0215】

好ましくは、本発明のタンパク質のＢ７Ｈ６及びＣＤ３鎖をコードするＤＮＡ分子は、宿主細胞、好ましくは哺乳動物細胞に同時形質導入される２つの発現ベクター上に存在する。

【0216】

発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は当技術分野で周知であり、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０、ＳＰ２／０細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト癌腫細胞（例えば、ＨｅｐＧ２及びＡ－５４９細胞）、３Ｔ３細胞又は任意のこのような細胞株の誘導体／子孫を含む。ヒト、マウス、ラット、サル及びげっ歯類細胞株を含むがこれらに限定されない他の哺乳動物細胞、又は酵母、昆虫及び植物細胞を含むがこれらに限定されない他の真核細胞、又は細菌などの原核細胞が使用され得る。

【0217】

本発明のタンパク質は、宿主細胞におけるタンパク質の発現を可能にするのに十分な期間にわたって宿主細胞を培養することによって産生される。タンパク質分子は、好ましくは分泌ポリペプチドとして培養培地から回収され、又は例えば分泌シグナルなしで発現される場合、宿主細胞溶解物から回収され得る。タンパク質の実質的に均一な調製物が得られるように、組換えタンパク質及び宿主細胞タンパク質に対して使用される標準的なタンパク質精製方法を使用してタンパク質分子を精製することが必要である。例として、本発明のタンパク質分子を得るために有用な先行技術の精製方法は、第１の工程として、培養培地又は溶解物からの細胞及び／又は粒子状細胞残屑の除去を含む。次いで、タンパク質は、例えば、免疫親和性又はイオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、Ｓｅｐｈａｄｅｘクロマトグラフィー、シリカ又は陽イオン交換樹脂でのクロマトグラフィーによって、夾雑可溶性タンパク質、ポリペプチド及び核酸から精製される。タンパク質分子調製物を得るための過程における最後の工程として、精製されたタンパク質分子は、治療用途のために、以下に記載されているように、乾燥、例えば凍結乾燥され得る。

【0218】

本発明は、少なくとも２つの異なる標的に対して結合特異性を有する結合タンパク質に関する。本発明に関連して、結合分子は抗体に由来する。結合分子を作製するための技術には、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン鎖の組換え共発現（Milstein and Cuello,Nature 305:537(1983)）、国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker et al.,EMBO J.10:3655(1991)参照）、並びに「ノブ・イン・ホール（knob-in-hole)」工学（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、Atwell et al,JMB,1997,270,26-35参照）が含まれるが、これらに限定されない。本発明の結合タンパク質は、抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果を操作すること（国際公開第２００９／０８９００４ Ａ１号）；２つ以上の抗体又は断片を架橋すること（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、及びBrennan et al.,Science,229:81(1985)を参照）；ロイシンジッパーを使用して二重特異性タンパク質を産生すること（例えば、Kostelny et al.,Immunol.,148(5):1547-1553(1992)）；二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993）参照）；及び単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用すること（例えば、Gruber et al.,Immunol.,152:5368(1994)）；及び、例えば、Tutt et al..Immunol.147:60(1991)に記載されるような三重特異性抗体を調製することによっても作製され得る。

【0219】

本明細書に開示される組成物（例えば、多重特異性結合タンパク質及び抗Ｂ７Ｈ６抗体）及び方法は、指定された配列、又はそれと実質的に同一又は類似の配列、例えば指定された配列と少なくとも８５％、９０％、９５％以上同一の配列を有するポリペプチド及び核酸を包含する。アミノ酸配列の文脈において、「実質的に同一」という用語は、本明細書では、第１及び第２のアミノ酸配列が共通の構造ドメイン及び／又は共通の機能的活性を有することができるように、ｉ）第２のアミノ酸配列内の整列されたアミノ酸残基と同一である、又はｉｉ）第２のアミノ酸配列内の整列されたアミノ酸残基の保存的置換である十分な又は最小の数のアミノ酸残基を含有する第１のアミノ酸配列を指すために使用される。例えば、共通の構造ドメインを含有するアミノ酸配列は、参照配列、例えば本明細書で提供される配列に対して少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する。ヌクレオチド配列の文脈において、「実質的に同一」という用語は、第１及び第２のヌクレオチド配列が、共通の機能的活性を有するポリペプチドをコードするか、又は共通の構造ポリペプチドドメイン若しくは共通の機能的ポリペプチド活性をコードするように、第２の核酸配列中の整列されたヌクレオチドと同一である十分な又は最小の数のヌクレオチドを含有する第１の核酸配列、例えば、参照配列に対して少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を指すために本明細書で使用される。

【0220】

本発明の核酸分子には、配列表に示されるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ分子が含まれるが、これらに限定されない。また、本発明は、国際公開第２００７／０４２３０９号に定義されているように、高ストリンジェンシー結合及び洗浄条件下で配列表に示されているポリペプチド配列をコードするＤＮＡ分子にハイブリダイズする核酸分子にも関する。（ｍＲＮＡの観点から）好ましい分子は、本明細書に記載のＤＮＡ分子の１つと少なくとも７５％又は８０％（好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％）の相同性又は配列同一性を有するものである。例として、真核細胞中で抗体を発現させることを考慮して、配列表に示されているＤＮＡ配列は、真核細胞におけるコドン使用と一致するように設計されている。抗体を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現させることが望まれる場合、これらの配列は大腸菌のコドン使用に一致するように変更することができる。本発明のＤＮＡ分子の変異形は、例えば国際公開第２００７／０４２３０９号に記載されているように、いくつかの異なる方法で構築することができる。

【0221】

本発明のタンパク質は、ある特定の発現系（特異的ベクター又は宿主細胞など）を使用することによって発現されるために、又は封入体として若しくは可溶性形態で発現されるために、又は培地若しくは細胞膜腔中に分泌されるために、又は細胞内に含有されるために、又はより均一な産物を得るために分子を最適化するために、修飾されたＮ末端配列、例えばＮ末端アミノ酸の１つ以上の欠失、又は例えば第１のＮ末端アミノ酸の交換（例えば、グルタミン酸をアラニンへ）を有し得る。本発明のポリペプチドは、例えば、このようなポリペプチドの安定性をさらに高めるために又は免疫原性を低下させるために、例えば、国際公開第２０１２／１７５７４１号、国際公開第２０１１／０７５８６１号又は国際公開第２０１３／０２４０５９号に説明されているように、Ｃ末端部分又はフレームワーク領域のいずれかのうちの他の定義された位置でのさらなるアラニン及び／又はさらなるアミノ酸交換などの修飾されたＣ末端配列を有し得る。

【0222】

疑義を避けるために、本明細書に記載されている医薬組成物、キット、処置方法、医学的使用、組み合わせ、投与の方法及び投与量に関する全ての実施形態は、単独での又は（以下で、より詳細に明記されているように）さらなる治療剤と組み合わせた、本明細書に記載される多重特異性結合タンパク質のいずれについても企図される。

【0223】

医薬組成物、投与の方法、投与量
本発明はさらに、（以下で、より詳細に明記されているような）疾患の処置のための医薬組成物に関し、このような組成物は少なくとも１つの本発明の多重特異性結合タンパク質を含む。本発明はさらに、少なくとも１つの本発明の多重特異性結合タンパク質又は以下に示される医薬組成物を使用して疾患（以下で、さらに詳細に明記されている）を処置する方法を包含し、本発明のこのような結合タンパク質又は医薬組成物を使用することによるこのような疾患を処置するための医薬の調製をさらに包含する。

【0224】

本発明の結合タンパク質（例えば、表１に示されている配列によって定義されるＢ７Ｈ６＃１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃４／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃５／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃６／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃７／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃８／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃９／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１０／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１４／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１５／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１６／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１７／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１８／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１９／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２０／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２４／ＣＤ３＃１の任意の１つ）及び／又は本発明の結合タンパク質を含む組成物は、使用されるべき特定の医薬製剤又は組成物に応じて、これらを必要とする患者に任意の適切な様式で投与することができる。したがって、本発明の結合タンパク質及び／又は本発明の結合タンパク質を含む組成物は、例えば、静脈内に（ｉ．ｖ．）、皮下に（ｓ．ｃ．）、筋肉内に（ｉ．ｍ．）、腹腔内に（ｉ．ｐ．）、経皮的に、経口的に、舌下に（例えば、舌の下に配置され、粘膜を介して舌の下の毛細血管網中に吸着される、舌下錠剤、スプレー又はドロップの形態で）、経鼻的（鼻腔内）に（例えば、鼻スプレーの形態で、及び／又はエアロゾルとして）、局所的に、坐剤によって、吸入によって、又は任意の他の適切な様式で、有効な量又は用量で投与され得る。結合タンパク質は、注入、ボーラス又は注射によって投与することができる。好ましい実施形態において、投与は静脈内注入又は皮下注射による。

【0225】

本発明の結合タンパク質及び／又は本発明の結合タンパク質を含む組成物は、処置又は緩和されるべき疾患、障害又は症状を処置及び／又は緩和するのに適した処置のレジメンに従って投与される。臨床医は、一般に、処置又は緩和されるべき疾患、障害又は症状、疾患の重症度、疾患の症候の重症度、使用されるべき本発明の特異的結合タンパク質、具体的な投与経路及び使用されるべき医薬製剤又は組成物、患者の年齢、性別、体重、食事、全身状態、並びに臨床医に周知の同様の要因などの要因に応じて、適切な処置レジメンを決定することができる。一般に、処置レジメンは、１つ以上の本発明の結合タンパク質又は１つ以上の本発明の結合タンパク質を含む１つ以上の組成物の治療有効量又は用量での投与を含む。

【0226】

一般に、本明細書で言及される疾患、障害及び症状の処置及び／又は緩和のために、並びに処置されるべき具体的な疾患、障害又は症状、使用されるべき本発明の特異的結合タンパク質の効力、具体的な投与経路及び使用される具体的な医薬製剤又は組成物に応じて、本発明の結合タンパク質は、一般に、体重１キログラム及び用量（ｄｏｓｅ）当たり０．００５～２０．０ｍｇの間、好ましくは０．０５～１０．０ｍｇ／ｋｇ／用量の間の量で、連続的に（例えば、注入によって）又はより好ましくは単回用量（例えば、１週間に２回、１週間に１回、２週間若しくは３週間に１回、又は１ヶ月に１回など；以下を参照）のいずれかで投与されるが、特に前述のパラメータに応じて著しく変動し得る。したがって、いくつかの事例では、上記の最小用量未満を使用することが十分であり得るが、他の事例では、上限を超えなければならないことがあり得る。多量を投与する場合、多量を一定期間、例えば２日間以上にわたって分散させた多数のより少ない用量に分割することが賢明となり得る。

【0227】

本発明の特異的結合タンパク質並びにその特異的な薬物動態学的及びその他の特性に応じて、本発明の結合タンパク質は毎日、２、３、４、５又は６日毎に、毎週、２週又は３週間毎に１回、毎月などに投与され得る。投与レジメンは、長期処置を含み得る。「長期」とは、少なくとも２週間、好ましくは数ヶ月又は数年の期間を意味する。

【0228】

本発明の多重特異性結合タンパク質及び本発明の多重特異性結合タンパク質を含む組成物の有効性は、関与する具体的な疾患に応じて、それ自体公知の任意の適切なインビトロアッセイ、細胞ベースのアッセイ、インビボアッセイ及び／若しくは動物モデル、又はこれらの任意の組み合わせを使用して試験することができる。適切なアッセイ及び動物モデルは当業者には明らかであり、例えば、以下の実施例で使用されるアッセイ及び動物モデルを含む。

【0229】

製剤
薬学的使用のために、本発明の結合タンパク質は、（ｉ）本発明の少なくとも１つの結合タンパク質（例えば、Ｂ７Ｈ６＃１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃４／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃５／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃６／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃７／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃８／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃９／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１０／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１４／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１５／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１６／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１７／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１８／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１９／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２０／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２４／ＣＤ３＃１の任意の１つ）と、（ｉｉ）少なくとも１つの薬学的に許容し得る担体、希釈剤、賦形剤、佐剤及び／又は安定化剤と、（ｉｉｉ）場合により、１つ以上のさらなる薬理学的に活性なポリペプチド及び／又は化合物とを含む医薬調製物として製剤化され得る。

【0230】

「薬学的に許容し得る」とは、それぞれの材料が、個体に投与されたときにいかなる生物学的又は他の望ましくない効果も示さず、それぞれの材料がその中に含有されている医薬組成物の他の成分（例えば、薬学的に活性な成分など）のいずれとも有害な様式で相互作用しないことを意味する。具体例は、例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences,18th Ed.,Mack Publishing Company,USA(1990)などの標準的なハンドブックに見出すことができる。例えば、本発明の結合タンパク質は、従来の抗体及び抗体断片並びに他の薬学的に活性なタンパク質についてそれ自体公知の任意の様式で製剤化及び投与され得る。したがって、さらなる実施形態によれば、本発明は、少なくとも１つの本発明の結合タンパク質と、少なくとも１つの薬学的に許容し得る担体、希釈剤、賦形剤、佐剤及び／又は安定化剤と、場合により１つ以上のさらなる薬理学的に活性な物質とを、凍結乾燥された又は他の方法で乾燥された製剤又は水性若しくは非水性の溶液若しくは懸濁液の形態で含有する医薬組成物又は調製物に関する。

【0231】

静脈内、筋肉内、皮下注射又は静脈内注入などの非経口投与用の医薬調製物は、例えば、活性成分を含み、場合によりさらなる溶解又は希釈工程の後に、注入又は注射に適している無菌溶液、懸濁液、分散液、エマルジョン又は粉末であり得る。このような調製物に適した担体又は希釈剤には、例えば、無菌水及び薬学的に許容し得る水性緩衝液、及び生理的リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液及びハンクス液などの溶液；水油（ｗａｔｅｒ ｏｉｌｓ）；グリセロール；エタノール；プロピレングリコールなどのグリコール、及び鉱油、動物油及び植物油、例えば落花生油、大豆油、並びにこれらの適切な混合物が含まれるが、これらに限定されない。

【0232】

本発明の結合タンパク質の溶液は、抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、ｐ－ヒドキシベンゾアート、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チオメルサール、エチレンジアミン四酢酸（のアルカリ金属塩）などの、微生物の増殖を防止するための防腐剤も含有し得る。多くの場合には、等張剤、例えば糖、緩衝剤又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい。場合により、乳化剤及び／又は分散剤を使用し得る。適切な流動性は、例えば、リポソームの形成によって、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によって、又は界面活性剤の使用によって維持することができる。吸収を遅延させる他の作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンも添加され得る。溶液は、注射バイアル、アンプル、注入ボトルなどの中に充填され得る。

【0233】

全ての場合において、最終的な剤形は、製造及び貯蔵の条件下で無菌であり、流動性であり、安定でなければならない。無菌注射溶液は、必要とされる量の活性化合物を、必要に応じて、上に列挙されている様々な他の成分とともに適切な溶媒中に組み込み、続いてフィルター滅菌することによって調製される。無菌注射溶液の調製のための無菌粉末の場合には、好ましい調製方法は、真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、これにより、活性成分及び以前に滅菌濾過された溶液中に存在する任意の追加の所望の成分の粉末が得られる。

【0234】

通常、水性の溶液又は懸濁液が好ましい。一般に、本発明の結合タンパク質などの治療用タンパク質のための適切な製剤は、適切な濃度（例えば、０．００１～４００mg/ml、好ましくは０．００５～２００mg/ml、より好ましくは０．０１～２００mg/ml、より好ましくは１．０～１００mg/ml、例えば１．０mg/ml（ｉ．ｖ．投与）又は１００mg/ml（ｓ．ｃ．投与）のタンパク質を含む溶液、及び水性緩衝液、例えば：
－リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４、
－他のリン酸緩衝液、ｐＨ６．２～８．２、
－酢酸緩衝液、ｐＨ３．２～７．５、好ましくはｐＨ４．８～５．５
－ヒスチジン緩衝液、ｐＨ５．５～７．０、
－コハク酸緩衝液、ｐＨ３．２～６．６、及び
－クエン酸緩衝液、ｐＨ２．１～６．２、
などの緩衝溶液、
並びに場合により、溶液の等張性を付与するための塩（例えば、ＮａＣｌ）及び／又は糖（例えば、スクロース及びトレハロースなど）及び／又は他のポリアルコール（例えばマンニトール及びグリセロールなど）である。

【0235】

さらに、洗浄剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）、例えば０．０２％ＴＷＥＥＮ（商標）２０又はＴＷＥＥＮ（商標）－８０などの他の作用物質が、このような溶液中に含まれ得る。皮下適用のための製剤は、最大１００mg/ml又はさらには１００mg/ml超など、著しくより高い濃度の本発明の抗体を含み得る。しかしながら、上記の成分及びその量は、１つの好ましい選択肢のみを表すことが当業者には明らかであろう。その代替形態及び変形形態は、当業者に直ちに明らかであるか、又は上記の開示から出発して容易に想到することができる。上記の製剤は、場合により、溶液、例えば注射用水（ＷＦＩ）中で再構成される凍結乾燥された製剤として提供することができる。

【0236】

本発明のさらなる態様によれば、本発明の結合タンパク質は、タンパク質の投与に有用な装置、例えばシリンジ、ペン型注射器、マイクロポンプ又は他の装置と組み合わせて使用され得る。

【0237】

処置の方法
本発明のさらなる態様は、処置を必要とする患者に治療有効量の本発明の結合タンパク質を投与することを含む、癌を処置する方法を提供する。

【0238】

本発明のさらなる態様は、癌を処置する方法において使用するための本発明の結合タンパク質を提供する。

【0239】

本発明のさらなる態様は、癌を処置するための医薬組成物を調製するための本発明の結合タンパク質の使用である。

【0240】

疑義を避けるために、本発明の医療用途の態様は、上記の本発明の特異的結合タンパク質（例えば、Ｂ７Ｈ６＃１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃４／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃５／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃６／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃７／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃８／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃９／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１０／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１４／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１５／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１６／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１７／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１８／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１９／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２０／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２４／ＣＤ３＃１の任意の１つ）のいずれをも含み得る。

【0241】

本明細書で使用される場合、「癌」という用語は、組織病理学的な種類又は浸潤の段階に関係なく、全ての種類の癌性増殖又は発癌過程、転移組織又は悪性に形質転換された細胞、組織又は器官を含むことを意味する。

【0242】

本明細書に記載されている多重特異性結合タンパク質を使用してその増殖を阻害することができる例示的な癌は、任意のＢ７Ｈ６発現腫瘍、好ましくは結腸直腸癌（例えば、転移性結腸直腸癌、ｍＣＲＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、頭頸部扁平上皮癌腫（ＨＮＳＣＣ）である。

【0243】

本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質を使用してその増殖を阻害することができる癌は、Ｔ細胞リンパ腫、骨髄性白血病、乳癌、卵巣癌、口腔扁平上皮癌腫及び胃腸癌を含むがこれらに限定されない任意のＢ７Ｈ６発現腫瘍である。胃腸癌には、食道癌（例えば、胃食道接合部癌）、胃（胃の）癌、肝細胞癌腫、胆管癌（例えば、胆管細胞癌）、胆嚢癌、膵臓癌又は結腸直腸癌（ＣＲＣ）が含まれるが、これらに限定されない。

【0244】

いくつかの実施形態において、以下の癌、腫瘍及び他の増殖性疾患は、本発明の多重特異性結合タンパク質で処置され得る：頭頸部癌、好ましくはＨＮＳＣＣ；肺癌；好ましくはＮＳＣＬＣ；乳癌；甲状腺癌；子宮頸癌；卵巣癌；子宮内膜癌；肝臓癌（肝芽腫又は肝細胞癌腫）；膵臓癌；前立腺癌；胃肉腫；消化管間質腫瘍、食道癌；結腸癌；結腸直腸癌；腎癌；皮膚癌；脳腫瘍；神経膠芽腫；非ホジキンリンパ腫（Ｔ又はＢ細胞リンパ腫）；白血病（慢性又は急性骨髄性白血病、非リンパ性白血病）、又は多発性骨髄腫。

【0245】

本発明の好ましい実施形態において、癌はｍＣＲＣである。

【0246】

体内のそれらの特定の位置／起源によって特徴付けられる上記の全ての癌、腫瘍、新生物などは、原発性腫瘍及びそれに由来する転移性腫瘍の両方を含むことを意味する。

【0247】

患者がＢ７Ｈ６の高発現を有することを特徴とする癌を有する場合、患者は（本明細書に記載されている）本発明の結合タンパク質による処置に反応する可能性がより高い可能性がある。したがって、いくつかの実施形態において、本発明の結合タンパク質で処置されるべき癌は、Ｂ７Ｈ６の高発現を有する癌であり、例えば、Ｂ７Ｈ６発現は、同じ種類のＢ７Ｈ６発現癌に罹患している患者の集団の癌細胞における平均発現よりも高い。

【0248】

本発明の結合タンパク質は、第一選択、第二選択、又は任意のさらなる選択の処置及び維持処置の状況で治療レジメンにおいて使用され得る。

【0249】

本発明の結合タンパク質は、上記の疾患の予防、短期又は長期処置のために、場合により放射線療法、１つ以上の追加の治療剤及び／又は手術と組み合わせて使用されてもよい。

【0250】

好ましい実施形態において、本発明のタンパク質は、抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤＬ－１抗体などのＰＤ－１アンタゴニストと組み合わせて癌の処置のために使用される。好ましくは、前記抗ＰＤ－１抗体は、本明細書（以下の表Ａ中の配列によって定義される）及び国際公開第２０１７／１９８７４１号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるペンブロリズマブ、ニボルマブ、ピジリズマブ、ＰＤ１－１、ＰＤ１－２、ＰＤ１－３、ＰＤ１－４、及びＰＤ１－５からなる群より選択される。好ましくは、前記抗ＰＤＬ－１抗体は、アテゾリズマブ、アベルマブ及びデュルバルマブからなる群より選択される。特に好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質（好ましくはＢ７Ｈ６＃１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃４／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃５／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１４／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１５／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１６／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１７／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１８／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１９／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２０／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２４／ＣＤ３＃１の任意の１つ）は、ＰＤ１－１と組み合わせて癌の処置のために使用される。特に好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質（好ましくはＢ７Ｈ６＃１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃４／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃５／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１４／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１５／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１６／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１７／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１８／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１９／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２０／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２４／ＣＤ３＃１の任意の１つ）は、ＰＤ１－２と組み合わせて癌の処置のために使用される。特に好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質（好ましくはＢ７Ｈ６＃１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃４／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃５／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１４／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１５／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１６／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１７／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１８／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１９／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２０／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２４／ＣＤ３＃１の任意の１つ）は、ＰＤ１－３と組み合わせて癌の処置のために使用される。特に好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質（好ましくはＢ７Ｈ６＃１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃４／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃５／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１４／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１５／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１６／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１７／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１８／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１９／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２０／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２４／ＣＤ３＃１の任意の１つ）は、ＰＤ１－４と組み合わせて癌の処置のために使用される。特に好ましい実施形態において、本発明の結合タンパク質（好ましくはＢ７Ｈ６＃１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃４／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃５／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１４／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１５／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１６／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１７／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１８／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１９／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２０／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２４／ＣＤ３＃１の任意の１つ）：

【表1】

【0251】

これらの好ましい実施形態及び本発明の態様の他のいずれかによれば、抗体ＰＤ１－１、ＰＤ１－２、ＰＤ１－３、ＰＤ１－４及びＰＤ１－５は、国際公開第２０１７／１９８７４１号に開示される抗体分子であり、上記の表Ａに示される配列によって定義される。

【0252】

したがって、ＰＤ１－１は、配列番号：３３１のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号：３３２のアミノ酸配列を含む軽鎖とを有し、
ＰＤ１－２は、配列番号：３３３のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号：３３４のアミノ酸配列を含む軽鎖とを有し、
ＰＤ１－３は、配列番号：３３５のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号：３３６のアミノ酸配列を含む軽鎖とを有し、
ＰＤ１－４は、配列番号：３３７のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号：３３８のアミノ酸配列を含む軽鎖とを有し、
ＰＤ１－５は、配列番号：３３９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号：３４０のアミノ酸配列を含む軽鎖とを有する。

【0253】

上記は、上記疾患を処置することを必要とする患者に治療有効用量を投与することによって上記疾患を処置する様々な方法における本発明の結合タンパク質の使用、並びにこのような疾患を処置するための医薬の製造のためのこれらの結合タンパク質の使用、並びに本発明のこのような結合タンパク質を含む医薬組成物、並びに本発明のこのような結合タンパク質を含む医薬の調製及び／又は製造なども含む。

【0254】

他の活性物質又は処置との組み合わせ
本発明の結合タンパク質（例えば、Ｂ７Ｈ６＃１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃４／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃５／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃６／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃７／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃８／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃９／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１０／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１４／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１５／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１６／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１７／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１８／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１９／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２０／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２４／ＣＤ３＃１の任意の１つ）は、単独で、又は他の癌治療、例えば手術、放射線療法、化学療法、標的化療法、免疫療法若しくはこれらの組み合わせと組み合わせて使用され得る。例えば、本発明の結合タンパク質は、１つ以上のさらなる治療剤と組み合わせて、特に細胞傷害性又は細胞分裂阻害性化学療法剤、血管新生を阻害する治療活性化合物、シグナル伝達経路阻害剤、例えばＥＧＦＲ阻害剤、免疫調節剤、免疫チェックポイント阻害剤、有糸分裂チェックポイント阻害剤又はホルモン療法剤と組み合わせて、癌の処置のために使用され得る。

【0255】

追加の治療剤は、Ｂ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質の投与と同時に、場合により同じ医薬調製物の成分として、又は投与前若しくは投与後に投与され得る。

【0256】

本発明の結合分子と組み合わせて投与され得る細胞分裂阻害性及び／又は細胞傷害性活性物質には、ホルモン、ホルモン類似体及び抗ホルモン薬、アロマターゼ阻害剤、ＬＨＲＨアゴニスト及びアンタゴニスト、成長因子（例えば血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ヒト上皮成長因子（ＨＥＲ、例えばＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４）及び肝細胞成長因子（ＨＧＦ）などの成長因子）の阻害剤が含まれるが、これらに限定されず、阻害剤は、例えば（抗）成長因子抗体、（抗）成長因子受容体抗体及びチロシンキナーゼ阻害剤、例えばセツキシマブ、ゲフィチニブ、アファチニブ、ニンテダニブ、イマチニブ、ラパチニブ、ボスチニブ及びトラスツズマブなど；代謝拮抗剤（例えば、葉酸代謝拮抗薬、例えば、メトトレキサート、ラルチトレキセド、ピリミジン類似体、例えば、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、ＦＯＬＦＯＸ（フォリン酸、５－ＦＵ及びオキサリプラチンの併用レジメン）、ＦＯＬＦＩＲＩ（フォリン酸、５－ＦＵ及びイリノテカンの併用レジメン）、ゲムシタビン、イリノテカン、ドキソルビシン、ＴＡＳ－１０２、カペシタビン及びゲムシタビン、プリン及びアデノシン類似体、例えば、メルカプトプリン、チオグアニン、クラドリビン及びペントスタチン、シタラビン（ａｒａＣ）、フルダラビン）；抗腫瘍抗生物質（例えばアントラサイクリン）；白金誘導体（例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン）；アルキル化剤（例えば、エストラムスチン、メクロレタミン、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ダカルバジン、シクロホスファミド、イホスファミド、テモゾロミド、ニトロソ尿素、例えば、カルムスチン及びロムスチンなど、チオテパ）；有糸分裂阻害剤（例えばビンカアルカロイド、例えばビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン及びビンクリスチンなど；並びにタキサン、例えばパクリタキセル、ドセタキセル）；ベバシズマブ、ラムシルマブ及びアフリベルセプトを含む血管新生阻害剤、チューブリン阻害剤；ＤＮＡ合成阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤（例えばエピポドフィロトキシン、例えばエトポシド及びエトポフォス、テニポシド、アムサクリン、トポテカン、イリノテカン、ミトキサントロンなど）、セリン／トレオニンキナーゼ阻害剤（例えば、ＰＤＫ１阻害剤、Ｒａｆ阻害剤、Ａ－Ｒａｆ阻害剤、Ｂ－Ｒａｆ阻害剤、Ｃ－Ｒａｆ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ｍＴＯＲＣ１／２阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＰＩ３Ｋα阻害剤、二重ｍＴＯＲ／ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＳＴＫ３３阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、ＰＬＫ１阻害剤（ボラセルチブなど）、ＣＤＫ９阻害剤を含むＣＤＫの阻害剤、オーロラキナーゼ阻害剤）、チロシンキナーゼ阻害剤（例えばＰＴＫ２／ＦＡＫ阻害剤）、タンパク質間相互作用阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＥＲＫ阻害剤、ＦＬＴ３阻害剤、ＢＲＤ４阻害剤、ＩＧＦ－１Ｒ阻害剤、Ｂｃｌ－ｘＬ阻害剤、Ｂｃｌ－２阻害剤、Ｂｃｌ－２／Ｂｃｌ－ｘＬ阻害剤、ＥｒｂＢ受容体阻害剤、ＢＣＲ－ＡＢＬ阻害剤、ＡＢＬ阻害剤、Ｓｒｃ阻害剤、ラパマイシン類似体（例えば、エベロリムス、テムシロリムス、リダフォロリムス、シロリムス）、アンドロゲン合成阻害剤、アンドロゲン受容体阻害剤、ＤＮＭＴ阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ＡＮＧ１／２阻害剤、ＣＹＰ１７阻害剤、放射性医薬品、免疫療法剤、例えば免疫チェックポイント阻害剤（例えばイピリムマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブなどのＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ３及びＴＩＭ３結合分子／免疫グロブリン）並びにアミフォスチン、アナグレリド、クロドロナート、フィルグラスチン、インターフェロン、インターフェロンα、ロイコボリン、リツキシマブ、プロカルバジン、レバミソール、メスナ、ミトタン、パミドロネート及びポルフィマーなどの様々な化学療法剤；プロテアソーム阻害剤（ボルテゾミブなど）；Ｓｍａｃ及びＢＨ３模倣物；ｍｄｍ２－ｐ５３アンタゴニストを含む、ｐ５３機能を回復させる作用物質；Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路の阻害剤；並びに／又はサイクリン依存性キナーゼ９阻害剤である。

【0257】

抗ＰＤ－１及び抗ＰＤ－Ｌ１剤並びに抗ＬＡＧ３剤を含む１つ以上の免疫療法剤と組み合わせた本発明の結合分子による処置が特に好ましい：例示的な抗ＰＤ１剤としては、限定されないが、本明細書（表Ａ）及び国際公開第２０１７／１９８７４１号に開示されている抗ＰＤ－１抗体ＰＤＲ－００１、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、ピジリズマブ並びにＰＤ１－１、ＰＤ１－２、ＰＤ１－３、ＰＤ１－４及びＰＤ１－５が挙げられる。例示的な抗ＰＤＬ－１剤には、アテゾリズマブ、アベルマブ及びデュルバルマブが含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、本発明の結合分子（好ましくはＢ７Ｈ６＃１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃４／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃５／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１４／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１５／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１６／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１７／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１８／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１９／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２０／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２４／ＣＤ３＃１の任意の１つ）は、ＰＤ１－１と組み合わされる。好ましい実施形態において、本発明の結合分子（好ましくはＢ７Ｈ６＃１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃４／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃５／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１４／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１５／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１６／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１７／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１８／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１９／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２０／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２４／ＣＤ３＃１の任意の１つ）は、ＰＤ１－２と組み合わされる。好ましい実施形態において、本発明の結合分子（好ましくはＢ７Ｈ６＃１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃４／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃５／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１４／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１５／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１６／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１７／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１８／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１９／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２０／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２４／ＣＤ３＃１の任意の１つ）は、ＰＤ１－３と組み合わされる。好ましい実施形態において、本発明の結合分子（好ましくはＢ７Ｈ６＃１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃４／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃５／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１４／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１５／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１６／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１７／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１８／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１９／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２０／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２４／ＣＤ３＃１の任意の１つ）は、ＰＤ１－４と組み合わされる。好ましい実施形態において、本発明の結合分子（好ましくはＢ７Ｈ６＃１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃４／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃５／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１４／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１５／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１６／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１７／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１８／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１９／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２０／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２４／ＣＤ３＃１の任意の１つ）は、ＰＤ１－５と組み合わされる。

【0258】

ある特定の実施形態において、追加の治療剤は、ＴＩＭ－１、ＴＩＭ－３、ＴＩＭ－４、ＰＤ－Ｌ２、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ－４、ガレクチン９、ガレクチン－１、ＣＤ６９、ＣＤ１１３、ＧＰＲ５６、ＣＤ４８、ＧＡＲＰ、ＣＡＥＣＡＭ－１、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１６０、ＬＡＩＲ１、２Ｂ４、ＣＥＡＣＡＭ、ＣＤ３９、ＴＧＦβ、ＩＬ－１０、Ｆａｓリガンド、ＩＣＯＳ、Ｂ７ファミリー（Ｂ７－１、Ｂ７－２、Ｂ７－Ｈ１（ＰＤＬ－１）、Ｂ７－ＤＣ（ＰＤ－Ｌ２）、Ｂ７－Ｈ２（ＩＣＯＳ－Ｌ）、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ５（ＶＩＳＴＡ））、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ－Ｂ、ＫＩＲファミリー受容体、ＳＩＲＰα（ＣＤ４７）、ＩＬＴ－２、ＩＬＴ－４、ＩＤＯ、ＣＤ３９、アルギナーゼ、ＣＤ７３、ＨＨＬＡ２、ブチロフィリン又はＡ２ａＲの調節物質などのさらなる免疫療法剤であり得る。

【0259】

いくつかの実施形態において、追加の免疫療法剤は、同族のＴＮＦ受容体ファミリーメンバーに結合する分子のＴＮＦファミリーのメンバーであり、ＣＤ４０及びＣＤ４０Ｌ、ＯＸ－４０、ＯＸ－４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、４－ｌＢＢＬ、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７／ＦＡＰ、ＧＩＴＲ、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２－Ｌ、ＴＲＡＩＬＲ１／ＤＲ４、ＴＲＡＩＬＲ２／ＤＲ５、ＴＲＡＩＬＲ３、ＴＲＡＩＬＲ４、ＯＰＧ、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫＲ／Ｆｎ１４、ＴＷＥＡＫ、ＢＡＦＦＲ、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、ＴＡＣＩ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ、ＬＩＧＨＴ、ＤｃＲ３、ＨＶＥＭ、ＶＥＧＩ／ＴＬｌＡ、ＴＲＡＭＰ／ＤＲ３、ＥＤＡＲ、ＥＤＡｌ、ＸＥＤＡＲ、ＥＤＡ２、ＴＮＦＲ１、リンホトキシンα／ＴＮＦβ、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＬＴβＲ、リンホトキシンα１β２、ＦＡＳ、ＦＡＳＬ、ＲＥＬＴ、ＤＲ６、ＴＲＯＹ、ＮＧＦＲが含まれる。好ましくは、追加の免疫療法剤はＣＤ１３７／ＦＡＰである。

【0260】

いくつかの実施形態において、追加の免疫療法剤は、免疫応答を刺激するために、例えば癌などの増殖性疾患を処置するために、（ｉ）Ｔ細胞活性化を阻害するサイトカイン（例えば、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ；「免疫抑制性サイトカイン」）のアンタゴニスト並びに／又は（ｉｉ）Ｔ細胞活性化を刺激するサイトカイン及び／若しくはＩＬ２などのサイトカインのアゴニストから選択される。

【0261】

いくつかの実施形態において、追加の免疫療法剤は、ＣＤ２８、ＧＩＴＲＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ２７及びＣＤ２８ＨなどのＴ細胞活性化を刺激するタンパク質のアゴニスト又はＳＴＩＮＧアゴニストである。

【0262】

いくつかの実施形態において、追加の治療剤は、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、（ＡｄＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ１又はＨＳＶ２）、レオウイルス、粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）、ポリオウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、マラバウイルス、水痘ウイルス、麻疹ウイルス（ＭＶ）又はニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）に由来する腫瘍溶解性ウイルスを含むがこれらに限定されない腫瘍溶解性ウイルスである。

【0263】

キット
本発明は、少なくとも本発明の多重特異性結合タンパク質（例えば、Ｂ７Ｈ６＃１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃４／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃５／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃６／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃７／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃８／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃９／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１０／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１４／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１５／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１６／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１７／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１８／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１９／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２０／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２４／ＣＤ３＃１の任意の１つ）と、場合により、上記の疾患及び障害の処置のために使用される他の薬物からなる群より選択される１つ以上の他の成分とを含むキットも包含する。

【0264】

一実施形態において、キットは、有効量の単位剤形の本発明の結合タンパク質を含有する組成物を含む。

【0265】

本発明は、少なくとも本発明の多重特異性結合タンパク質と、上記の疾患及び障害の処置のために使用される他の薬物からなる群より選択される１つ以上の他の成分とを含むキットも包含する。

【0266】

一実施形態において、キットは、有効量の単位剤形の本発明の多重特異性結合タンパク質（好ましくは、Ｂ７Ｈ６＃１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃４／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃５／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１４／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１５／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１６／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１７／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１８／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１９／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２０／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２４／ＣＤ３＃１の任意の１つ）を含有する組成物を含む。さらなる実施形態において、キットは、有効量の単位剤形の本発明の多重特異性結合タンパク質（好ましくは、Ｂ７Ｈ６＃１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃４／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃５／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１４／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１５／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１６／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１７／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１８／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃１９／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２０／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２１／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２２／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２３／ＣＤ３＃１、Ｂ７Ｈ６＃２４／ＣＤ３＃１の任意の１つの任意の１つ）を含有する組成物と、有効量の単位剤形のＰＤ－１アンタゴニスト、例えば、抗ＰＤ－１抗体、最も好ましくは、本明細書（例えば、表Ａ）及び国際公開第２０１７／１９８７４１号に記載のＰＤ１－１、ＰＤ１－２、ＰＤ１－３、ＰＤ１－４及びＰＤ１－５を含有する組成物の両方を含む。

【0267】

いくつかの実施形態において、キットは、このような組成物を含有する無菌容器を含み、このような容器は、箱、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、パウチ、ブリスターパック、又は当技術分野で公知の他の適切な容器形態であり得る。このような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属箔又は医薬を保持するのに適した他の材料で作ることができる。さらに、キットは、凍結乾燥された形態の本発明の結合タンパク質を有する第１の容器及び注射用の薬学的に許容し得る希釈剤（例えば、無菌水）を有する第２の容器中に医薬組成物を含み得る。薬学的に許容し得る希釈剤は、結合タンパク質の再構成又は希釈のために使用され得る。

【0268】

所望であれば、本発明の多重特異性結合タンパク質は、癌を有する対象に多重特異性結合タンパク質を投与するための説明書とともに提供される。説明書は、一般に、癌の治療又は予防のための組成物の使用に関する情報を含むであろう。他の実施形態において、説明書は、以下のうちの少なくとも１つを含む：治療剤の説明；癌又はその症候の処置又は予防のための投薬スケジュール及び投与；注意；警告；適応症；禁忌；過量服薬情報；有害反応；動物薬理学；臨床研究；及び／又は参考文献。説明書は、容器に直接印刷されてもよく（存在する場合）、又は容器に貼付されたラベルとして、又は容器内に若しくは容器ともに供給される別個のシート、パンフレット、カード若しくはフォルダとして印刷されてもよい。

【0269】

適切であれば、これらの提案されたキットの構成要素は、当業者による使用のために慣用的な様式で包装され得る。例えば、これらの提案されたキットの構成要素は、溶液中に又は液体分散液などとして提供され得る。

【実施例】

【0270】

以下の実施例は、本発明を例示する。これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。

【0271】

実施例１：Ｂ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質の設計及び構築
本発明者らは、Ｂ７Ｈ６及びＣＤ３を結合し、Ｔ細胞活性化を誘導してＢ７Ｈ６発現腫瘍細胞の溶解をもたらす多重特異性結合タンパク質を開発した。使用される分子設計は、ＩｇＧ抗体骨格及びＩｇＧ様構造を有する。使用される分子設計は、ノブ及びホールアームのヘテロ二量体化のための、Ｆｃにおけるノブ・イン・ホール技術を特徴とする。さらに、結合タンパク質は、各アーム中の軽鎖と対応する重鎖との間に柔軟なペプチド配列を有する。したがって、結合タンパク質は２つのアームを含み、一方はＣＤ３に結合し、他方はＢ７Ｈ６に結合し、各アームは単鎖Ｆａｂ及びＦｃ領域を含む（図１参照）。

【0272】

好ましくは、結合分子は二重特異性及び二価（２つの標的のそれぞれについて一価）である。

【0273】

ハイブリドーマ及び培養された単一Ｂ細胞からのハイスループットＶ遺伝子回収を使用した、Ｂ７Ｈ６及びＣＤ３を認識する結合ドメインの調製。
抗Ｂ７Ｈ６結合剤を得るために、Ｂ７Ｈ６で免疫した野生型マウス及びＡＬＩＶＡＭＡＢ（商標）ヒト化マウス（Ablexis,San Francisco,CA,USA：ヒト免疫グロブリン遺伝子座を有するALIVAMAB MOUSE（商標）トランスジェニックマウスプラットフォーム）に由来するハイブリドーマ又は単一Ｂ細胞をインビトロで培養した。ＡＬＰＨＡＬＩＳＡ（登録商標）イムノアッセイキット（PerkinElmer,Waltham,MA,USA）によって組換えヒトＢ７Ｈ６への結合、ヒトＢ７Ｈ６を発現するＮＣＩ－Ｈ７１６細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）、ＣＣＬ－２５１（商標））への結合、及びフローサイトメトリーによってＣＨＯ細胞上の組換えによって発現されたカニクイザルＢ７－Ｈ６への結合について上清をスクリーニングした。

【0274】

次いで、免疫グロブリン（Ｉｇ）ＶＨ及びＶＬ遺伝子を、同定された陽性クローンから増幅した。ハイブリドーマからＲＮＡを単離するために、単一クローンから約２×１０^６個の細胞をペレット化し、供給源材料として使用した。単一Ｂ細胞の場合、単一に単離されたＢ細胞から増殖させた１００～５００個の細胞を供給源材料として使用した。ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ＰｌｕｓミニＲＮＡ抽出キット（Qiagen,Hilden,Germany）を使用してＲＮＡを単離した。次いで、ＳＭＡＲＴｅｒ（登録商標）ｃＤＮＡ合成キット（Clontech,Mountain View,CA）を製造者の説明書に従って使用してｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡ合成を促進するために、オリゴｄＴを使用して全てのメッセンジャーＲＮＡの逆転写を開始した後、SMARTer IIAオリゴヌクレオチドで「５’キャッピング」した。SMARTer IIAキャップを標的とする５’プライマー及びＣＨ１中のコンセンサス領域を標的とする３’プライマーを使用する２段階ＰＣＲ増幅を使用して、ＶＨ及びＶＬ断片のその後の増幅を行った。簡潔には、各ＰＣＲ反応 ５０μlは、２０μＭ順方向及び逆方向プライマーミックス、PrimeSTAR（登録商標）Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼプレミックス（Clontech）２５μl、未精製ｃＤＮＡ ２μl及び再蒸留されたＨ２Ｏ ２１μlからなる。サイクリングプログラムは、９４℃で３分間、続いて３５サイクル（９４℃で３０秒間、５０℃で１分間、６８℃で１分間）で開始し、７２℃で７分間で終了する。２回目のＰＣＲは、それぞれのｐＴＴ５マザーベクター（ＶＨ及びＶＬ）中のそれぞれの領域を「オーバーラップ」させる１５ｂｐの相補的伸長を含有するＶＬ及びＶＨの２回目のプライマーを用いて行った。２回目のＰＣＲは、同じＰＣＲサイクリングプログラムで行った。

【0275】

ＶＬ遺伝子のｐＴＴ５ ｈｕＩｇＫベクターへの方向性クローニング及びＶＨ遺伝子のｐＴＴ５ ｈｕＩｇＧ１ＫＯベクターへの方向性クローニングのために、In-Fusion（登録商標）HD Cloning Kit(Clontech,U.S.A.）を使用した。In-Fusion（登録商標）HD Cloningを容易にするために、ＰＣＲ産物を精製し、In-Fusion HD Cloningの前にCloning Enhancerで処理した。クローニング及び形質転換は、製造業者のプロトコル（Clontech,U.S.A.）に従って実施した。完全なＶ遺伝子断片が得られたことを確認するために、ミニプレップＤＮＡをサンガー配列決定に供した。

【0276】

この方法論を使用して、Ｂ７Ｈ６に対する特異性を有する結合ドメインをコードするＩｇＶＨ及びＶＬ遺伝子のペアを調製した。対応する重鎖及び軽鎖をコードするプラスミドによるＣＨＯ－Ｅ３７細胞の一過性形質導入によって、組換え抗体を作製した。

【0277】

さらなる抗ＣＤ３結合剤を得るために、ｈｕＣＤ３εペプチド１－２７構築物を使用して、ＷＴマウスを免疫した。組換えｈｕＣＤ３Ｅ＋Ｇ－Ｆｃタンパク質及び組換えｃｙＣＤ３Ｅ＋Ｇ－Ｆｃタンパク質への結合、並びにｈｕＣＤ３陽性及びｃｙＣＤ３陽性細胞への結合について、ハイブリドーマ上清をスクリーニングした。陽性クローンの可変領域を回収し、さらなる評価のためにＩｇＧ又はＩｇＧ様二重特異性構築物としてクローニングした。

【0278】

Ｂ７Ｈ６及びＣＤ３結合剤のヒト化／最適化
上記のＢ７Ｈ６又はＣＤ３結合剤及び文献（Pessano et al.,EMBO J.1985 Feb;4(2):337-44;Salmeron A et al.,J Immunol.1991 Nov 1;147(9):3047-52）に記載されているＣＤ３結合剤の配列をヒト化及び／又は最適化した。抗体の配列最適化／ヒト化は、ヒトにおいて産生された抗体に類似する治療薬として使用するために（特異的抗原／エピトープに対して）非ヒト種において産生された抗体を操作し、それによって特異性を保持しながら免疫原性などの潜在的な有害作用を排除する方法論である。ここで利用された配列最適化／ヒト化アプローチは、Ｓｉｎｇｈら、２０１５（Singh S et al.,mAbs 2015:7(4):778-91）によって記載されているとおりであった。手短に言えば、緊密に合致するヒト生殖系列をインシリコで同定し、ファージスクリーニング法を使用して最適化／ヒト化変異形を評価した。結合、パーセントヒトスコア及びＥｐｉＶａｘ（登録商標）（潜在的な免疫原性のインシリコ予測ツール）スコアに基づいて最終リード候補配列を選択した。

【0279】

Ｂ７Ｈ６及びＣＤ３を結合する二重特異性タンパク質の構築
一般的な分子生物学技術を使用して、Ｂ７Ｈ６及びＣＤ３結合剤の可変領域を発現ベクターｐＴＴ５（National Research Council,Canada）にクローニングして、Ｂ７Ｈ６に結合する単鎖Ｆａｂ及びＦｃ領域を含む１つのＢ７Ｈ６特異的結合アーム（本明細書では、このような結合単位は「Ｂ７Ｈ６アーム」又は「Ｂ７Ｈ６鎖」とも呼ばれる）並びにＣＤ３に結合する単鎖Ｆａｂ及びＦｃ領域を含むＣＤ３特異的結合アーム（本明細書では、このような結合単位は「ＣＤ３アーム」又は「ＣＤ３鎖」とも呼ばれる）を有する二重特異性結合タンパク質を形成した。Ｂ７Ｈ６及びＣＤ３アームのＦｃ領域は、「Ｗ」又は「ＳＡＶ」変異（Atwell et al,JMB,1997,270,26-35）のいずれかを含み、それぞれの鎖はＷ又はＳＡＶ鎖と呼ばれる。マルチフラグメントＤＮＡアセンブリのために、製造業者のプロトコル（New England Biolabs,Ipswich,MA,USA）に従って、Gibson-assembly及びNEBuilder（登録商標）HiFi DNA Assemblyアプローチを使用した。ＤＮＡミニプレップを配列決定した。

【0280】

各発現ベクターは、鎖をコードする遺伝子（Ｂ７Ｈ６又はＣＤ３アーム／鎖）、すなわちシグナル配列並びに軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子のための真核生物プロモーターエレメントと、アンピシリンなどの原核生物選択マーカー遺伝子のための発現カセットと、複製起点とを含有する。これらのＤＮＡプラスミドをアンピシリン耐性大腸菌コロニー及び培養物中で増殖させ、精製した。

【0281】

実施例２：Ｂ７Ｈ６及びＣＤ３を結合する二重特異性結合タンパク質の発現及び精製
Ｂ７Ｈ６及びＣＤ３を結合する二重特異性分子は、Ｂ７Ｈ６／ＣＤ３鎖をコードする遺伝子（一方の鎖はＷ鎖として、他方はＳＡＶ鎖として）を有するｐＴＴ５ベクターでのＣＨＯ－Ｅ細胞の一過性形質導入によって作製された。手短に言えば、無血清培地中の懸濁液中で増殖する形質導入されたＣＨＯ－Ｅ細胞を、振盪フラスコ中で１４０ｒｐｍ、３７℃及び５％ＣＯ_２で撹拌しながら培養し、指数関数的増殖の条件に維持した。形質導入の当日に、Mirus Bio TransIT Pro（登録商標）形質導入試薬を用いて、１：３の質量比で細胞をＷ鎖プラスミド及びＳＡＶ鎖プラスミドで化学的に形質導入した。次いで、Gibco（登録商標）FreeStyle（商標）ＣＨＯ発現培地（LifeTechnologies,NY,US）１Ｌ中に、１～２×１０^６細胞／ｍｌで細胞を播種した。次いで、タンパク質の発現を最適化するために、７日目に２００ｍｌの市販のフィード溶液を１回供給して、軌道振盪下で細胞を１０日間、インキュベートした。製造者の説明書に従って、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）機器（Pall ForteBio,CA,US）及びprotAバイオセンサーチップを使用して、細胞培養上清中の抗体価を決定した。

【0282】

GE Healthcare Life Sciences AKTA（商標）Pureタンパク質精製システムを使用して、２段階過程で、培養上清から組換えＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質を精製した。まず、MabSelect（商標）カラム（GE Healthcare）を用いたプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって、回収された細胞培養液から試料を捕捉した。タンパク質は中性ｐＨでプロテインＡに結合し、高塩（１M NaCl）で洗浄して、細胞培養培地成分及びプロテインＡに非特異的に結合する任意のタンパク質又は成分を除去した。３０mM酢酸ナトリウム、ｐＨ３．５を使用して均一濃度モードで、抗体又は抗体様構築物試料を溶出した。３Ｍ酢酸ナトリウムの１％溶液、ｐＨ９．０を使用して、溶出された試料をｐＨ５．０に中和した。中和されたタンパク質を０．２２μm濾過システムで滅菌濾過した。濃度は、ｎａｎｏｄｒｏｐ ８０００分光光度計によって、ＵＶ２８０によって測定した。第２の精製では、POROS（商標）５０ ＨＳ陽イオン交換樹脂カラム（Applied Biosystems,Carlsbad,CA,USA）を使用して陽イオン交換クロマトグラフィーを、又はHiLoad（登録商標）２６／６００ Superdex（登録商標）２００pgカラム（GE Healthcare）を使用してサイズ排除クロマトグラフィーを適用した。５０mM酢酸ナトリウム及び１００mM ＮａＣｌ、ｐＨ５．０の最終緩衝液中に二段階精製された材料を保存し、試料の純度及び不均一性の程度を分析サイズ排除クロマトグラフィー、質量分析及び分析超遠心分離によって評価した。機能試験に進められた試料は、約９５～９９％のモノマー含有量を有する二段階精製された材料を含んでいた。

【表2】

【0283】

実施例３：組換えタンパク質の作製
・ヒトＢ７Ｈ６－Ｈｉｓ
Lenti-X（商標)Lentiviral System(Clontech)を使用した一過性形質導入によって、ｐＴＴベクター（ヒトＢ７Ｈ６－Ｈｉｓをコードする、配列番号：３１７）を使用して、ヒト－Ｂ７Ｈ６の完全な細胞外ドメインをＨｉｓ６タグとともに発現させた。Gibco（商標）Freestyle（商標）F17発現培地（Thermo Fisher Scientific）中において、形質導入の時点で１．６×１０^６細胞/mlで、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Thermo Fisher）を使用した。１：３の比でのＤＮＡ：ＰＥＩ複合体及び１mg/LのＤＮＡを５分間プレインキュベートし、濾過し、室温でさらに１５分間プレインキュベートした後、細胞に添加した。３７℃、５％ＣＯ_２で細胞をインキュベートし、１４０rpmで振盪した。形質導入の２４時間後に、０．５％の最終濃度になるようにトリプトンＮ１を細胞に添加した。形質導入の４８時間後に、２mMグルタミン及びグルコース ２g/Lを細胞に再度与えた。同時に、温度を３３℃に下げた。形質導入の１２０時間後に、２mMグルタミン及びグルコース １g/Lで最終供給を添加した。形質導入の１４４時間後、６０００rpmで１５分間遠心分離することによって細胞を回収した。Ｇ４フィルターを用いて、上清を滅菌した。

【0284】

タンパク質精製は、２段階で行った。第１に、１０ＣＶの洗浄緩衝液１×ＰＢＳ、ｐＨ７．２＋１０ｍＭイミダゾール、次いで１０ＣＶの洗浄緩衝液１×ＰＢＳ、ｐＨ７．２＋２０ｍＭイミダゾール、及び０．５Ｍイミダゾールを補充した１×ＰＢＳ、ｐＨ７．２の溶出勾配４～６０％でのアフィニティークロマトグラフィーのために、Ｎｉ－ＮＴＡカラムを使用した。画分を収集し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した後、プールし、濃縮した。第２に、ゲル濾過クロマトグラフィー（GE Healthcare Life Sciences）のために、Superdex（登録商標）２００、１６／６００、１２０mlカラムを使用した。アフィニティークロマトグラフィー後の濃縮されたプール、５mlを流速０．５ml/分でカラムにかけた。製剤緩衝液は、２０mM ＨＥＰＥＳ、１００mM ＮａＣｌ、５％スクロース、ｐＨ７．４であった。画分を集め、プールする前にＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析し、次いで、０．２ｕｍフィルターを用いて滅菌した。

【0285】

・Ｃｙｎｏ Ｂ７Ｈ６－Ｈｉｓ
Lenti-X（商標）Lentiviral System(Clontech)を使用した一過性形質導入によって、ｐＴＴベクター（ｃｙｎｏ Ｂ７Ｈ６－Ｈｉｓをコードする、配列番号：３２０）を使用して、Ｃｙｎｏ－Ｂ７Ｈ６の完全な細胞外ドメインをＨｉｓ６タグとともに発現させた。Gibco（商標）Freestyle（商標）F17発現培地（Thermo Fisher Scientific）中において、形質導入の時点で１．６×１０^６細胞/mlで、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Thermo Fisher）を使用した。１：３の比でのＤＮＡ：ＰＥＩ複合体及び１mg/LのＤＮＡを５分間プレインキュベートし、濾過し、室温でさらに１５分間プレインキュベートした後、細胞に添加した。３７℃、５％ＣＯ_２で細胞をインキュベートし、１４０rpmで振盪した。形質導入の２４時間後に、０．５％の最終濃度になるようにトリプトンＮ１を細胞に添加した。形質導入の４８時間後に、２mMグルタミン及びグルコース ２g/Lを細胞に再度与えた。同時に、温度を３３℃に下げた。形質導入の１２０時間後に、２mMグルタミン及びグルコース １g/Lで最終供給を添加した。形質導入の１４４時間後、６０００rpmで１５分間遠心分離することによって細胞を回収した。Ｇ４フィルターを用いて、上清を滅菌した。

【0286】

タンパク質精製は、２段階で行った。第１に、１０ＣＶの洗浄緩衝液１×ＰＢＳ、０．２Ｍスクロース、０．０１％ＣＨＡＰＳ、５％グリセロール、ｐＨ７．２＋１０ｍＭイミダゾール、次いで１０ＣＶの洗浄緩衝液１×ＰＢＳ、ｐＨ７．２＋２０ｍＭイミダゾール、及び０．５Ｍイミダゾールを補充した１×ＰＢＳ、０．２Ｍスクロース、０．０１％ＣＨＡＰＳ、５％グリセロール、ｐＨ７．２の溶出勾配４～６０％でのアフィニティークロマトグラフィーのために、Ｎｉ－ＮＴＡカラムを使用した。画分を収集し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した後、プールし、濃縮した。第２に、ゲル濾過クロマトグラフィー（GE Healthcare Life Sciences）のために、Superdex（登録商標）２００、１６／６００を使用した。アフィニティークロマトグラフィー後の濃縮されたプール、１０mlを流速１．０ml／分でカラムにかけた。製剤緩衝液は、１×ＰＢＳ、０．２Ｍスクロース、０．０１％ＣＨＡＰＳ、５％グリセロール、ｐＨ７．２であった。画分を集め、プールする前にＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析し、次いで、０．２ｕｍフィルターを用いて滅菌した。

【0287】

・ヒトＣＤ３ Ｅ＋Ｇ ＨｕＦｃ－６ｘＨｉｓ（Ｅ＋Ｇはεγサブユニットを示す）
ＨＥＫ－２９３細胞（Thermo Fisher）、Lenti-X（商標）Lentiviral System(Clontech)及びヒトＣＤ３ Ｅ＋Ｇ ＨｕＦｃ－６ｘＨｉｓをコードするプラスミド（ヒトＣＤ３Ｅアクセッション番号：Ｐ０７７６６；ヒトＣＤ３Ｅ＋Ｇ－ＨｕＦｃ－Ｈｉｓ：配列番号：３２２）を用いて、ヒトＣＤ３ Ｅ＋Ｇ ＨｕＦｃ－６ｘＨｉｓを産生するための細胞株を作製した。発現のために、Freestyle（商標）２９３培地（Thermo Fisher Scientific）中、３７℃、加湿された８％ＣＯ_２環境において、１３５rpmで振盪しながら、細胞を培養及び増殖させた。９３００ｘｇで３０分間の遠心分離によって、６日目に、馴化された培養上清を収集した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングによって発現をモニターした。０．２Ｍスクロース、５％グリセロール、０．０１％ＣＨＡＰＳ及び１０mMイミダゾールで、馴化された培養上清を調整した。次いで、ｐＨを７．２に調整した。精製は２段階過程で行った：Ｎｉ／ＮＴＡ樹脂を用いた親和性精製（４Ｃでの一晩のインキュベーション、及び２５０ｍＭイミダゾールによる溶出）；その後、０．２Ｍスクロース、５％グリセロール、０．０１％ＣＨＡＰＳ、１mM ＴＣＥＰ、ｐＨ７．２を含む最終（destination）緩衝液ＰＢＳ中のSuperdex（登録商標）２００カラム（GE Healthcare Life Sciences）でのサイズ排除クロマトグラフィー。最終分析及び保存の前に、１０Ｋ ＭＷＣＯ ＰＥＳ膜Ｖｉｖａｃｅｌｌ（登録商標）１００遠心分離装置を使用して、プールされた材料を濃縮した。精製された材料は、質量分析及び分析超遠心分離によって適格とした。

【0288】

・Ｃｙｎｏ ＣＤ３ Ｅ＋Ｇ ＨｕＦｃ－６ｘＨｉｓ（Ｅ＋Ｇはεγサブユニットを示す）
ＨＥＫ－２９３細胞（Thermo Fisher）、Lenti-X（商標）Lentiviral System(Clontech)及びＣｙｎｏ ＣＤ３ Ｅ＋Ｇ ＨｕＦｃ－６ｘＨｉｓをコードするプラスミド（カニクイザルＣＤ３Ｅアクセッション番号：Ｑ９５ＬＩ５＜、ｃｙｎｏ ＣＤ３ Ｅ＋Ｇ ｈｕＦｃ－Ｈｉｓ：配列番号：３２３）を用いて、Ｃｙｎｏ ＣＤ３ Ｅ＋Ｇ ＨｕＦｃ－６ｘＨｉｓを産生するための細胞株を作製した。発現のために、Freestyle（商標）２９３培地（Thermo Fisher Scientific）中、３７℃、加湿された８％ＣＯ_２環境において、１３５rpmで振盪しながら、細胞を培養及び増殖させた。９３００ｘｇで３０分間の遠心分離によって、６日目に、馴化された培養上清を収集した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングによって発現をモニターした。０．２Ｍスクロース、５％グリセロール、０．０１％ＣＨＡＰＳ及び１０mMイミダゾールで、馴化された培養上清を調整した。次いで、ｐＨを７．２に調整した。精製は２段階過程で行った：Ｎｉ／ＮＴＡ樹脂を用いた親和性精製（４Ｃでの一晩のインキュベーション、及び２５０mMイミダゾールによる溶出）；その後、０．２Ｍスクロース、５％グリセロール、０．０１％ＣＨＡＰＳ、１mM ＴＣＥＰ、ｐＨ７．２を含む最終（destination）緩衝液ＰＢＳ中のSuperdex（登録商標）２００カラム（GE Healthcare Life Sciences）でのサイズ排除クロマトグラフィー。最終分析及び保存の前に、１０Ｋ ＭＷＣＯ ＰＥＳ膜Ｖｉｖａｃｅｌｌ（登録商標）１００遠心分離装置を使用して、プールされた材料を濃縮した。精製された材料は、質量分析及び分析超遠心分離によって適格とした。

【0289】

・Ｆｃ－Ｈｉｓタグ付きヒトＢ７Ｈ６ＥＣＤ
この構築物では、ｈｕＢ７Ｈ６ＥＣＤの後にＧＳリンカーが続き、次いでｈｕＩｇＧ１－Ｆｃドメイン及びＣ末端Ｈｉｓ６タグが続く（配列番号３１８）。ＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞を用いた一過性形質導入によって構築物を発現させ、ＤＮＡ：ＰＥＩ比は１：３であり、ＤＮＡ １mg／Ｌ培養物であった。ＰＥＩ試薬は、直鎖ＰＥＩ ＭＡＸ［Ｍｗ４０，０００］（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ：カタログ番号２４７６５－２）であった。５％ＣＯ_２及び１３０rpmで、３７℃で、形質導入された細胞をインキュベートした。形質導入の２４時間後、トリプトンＮ１（Organotechnie；カタログ番号１９５５３）及びグルコースをそれぞれ０．５％及び１ｇ／Ｌの最終濃度になるように添加した。細胞を５日後に収集した。遠心分離後、０．２μｍメンブランフィルターを通して上清を濾過した。２段階精製：第１に、Ni NTA Agaroseマトリックスでの親和性によって、第２に、Superdex（登録商標）２００、２６／６００カラム（GE Healthcare Life Sciences）を使用したゲル濾過によって、ｈｕＢ７Ｈ６－ＥＣＤ－Ｆｃ－Ｈｉｓタンパク質を精製した。プールされた画分を濾過し、１×ＰＢＳ、０．２Ｍスクロース、５％グリセロール、０．０１％ＣＨＡＰＳ、ｐＨ－７．２製剤緩衝液中で保存した。

【0290】

・Ｆｃ－Ｈｉｓタグ付きヒトＡｌａ変異Ｂ７Ｈ６ＥＣＤ（Ａｌａによって置換されたＮＫｐ３０相互作用部位ａａ３５－３８及びａａ１０２－１０５）。
この構築物（配列番号：３１９）は、３５～３８位及び１０２～１０５位にＡｌａ置換を有するｈｕＢ７Ｈ６を有するので、ＮＫｐ３０を結合しない。ｈｕＢ７Ｈ６－Ａｌａ－ＥＣＤの後にＧＳリンカーが続き、次いでｈｕＩｇＧ１Ｆｃドメイン及びＣ末端Ｈｉｓ６タグが続く。一過性形質導入によってＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞中でこの構築物を発現させ、２段階精製過程で精製し、Ｆｃ－Ｈｉｓタグ付きｈｕＢ７Ｈ６－ＥＣＤ構築物について上述されているように保存した。

【0291】

・ヒトＢ７Ｈ１－Ｆｃ
この構築物（配列番号３２４）は、ｃＭｙｃタグ、トロンビン切断部位及びｈｕＦｃドメインを有するｈｕＢ７Ｈ１を含有する。ＨＥＫ２９３ｆ細胞を用いた一過性形質導入によって構築物を発現させ、ＤＮＡ：ＰＥＩ比は１：１．５であり、ＤＮＡ １mg／Ｌ培養物であった。１３５rpmで振盪しながら、加湿された８％ＣＯ_２環境においてフラスコを３７℃でインキュベートした。細胞を３日後に収集した。細胞の遠心分離後に、タンパク質を上清から精製した。第１に、nProtein A Sepharose（登録商標）４Fast Flow培地（GE Healthcare、＃１７－５２８０－０３）を用いて親和性精製を行い、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１mM ＴＣＥＰ、３ｍＭ ＣａＣｌ_２、ｐＨ８．０中で溶出液を透析した。第２に、Thrombin CleanCleave（商標）樹脂（１mL、Ｓｉｇｍａ）とともに試料をインキュベートした。第３に、前の工程からのプールをnProtein A Sepharose（登録商標）４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ培地に再び結合させた。非結合材料を残しておき、ＰＢＳ、１mM ＴＣＥＰ、ｐＨ７．２緩衝液で平衡化されたSuperdex（登録商標）７５（GE Healthcare）カラムでのゲル濾過によってさらに最終精製を行い、濃縮した。

【0292】

実施例４：組換えＢ７Ｈ６及びＣＤ３εγサブユニットに対する親和性及び種間交差反応性のＳＰＲに基づく決定
Ｂ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質に対するヒト及びｃｙｎｏＢ７Ｈ６並びにヒトＢ７Ｈ１の親和性を決定するために、Biacore（商標）８Ｋ装置（GE Healthcare Life Sciences）で実験を行った。簡潔には、プロテインＡ／Ｇを介してＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質を捕捉した。この実験のためのランニング緩衝液及び全ての連続希釈液は、ＨＢＳ－ＥＰ＋中で調製した。１０μL／分の流速で４２０秒間、両フローセルにわたってＥＤＣ／ＮＨＳの等しい混合物で、ＣＭ５センサーチップを活性化し、１０μL／分の流速で４２０秒間、全てのフローセルにわたって組換えプロテインＡ／Ｇ（１０mM ＮａＯＡｃ中５０μg/ml、ｐＨ４．５）で固定化して、表面上にプロテインＡ／Ｇ約２５００ＲＵを得た。１０μL／分の流速で４２０秒間、全てのフローセルにわたって１Ｍエタノールアミン－ＨＣｌでセンサーチップを不活性化した。

【0293】

１０μL／分の流速で６０秒間、プロテインＡ／Ｇ表面のフローセル２上に、Ｂ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質約７００ＲＵを捕捉した。捕捉されたＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質上に、両方のフローセルにわたって、３０μL／分の流速で３００秒間、１２００秒間の解離で、分析物ＨｕＢ７Ｈ６、ＣｙＢ７Ｈ６及びＨｕＢ７Ｈ１を注入した。ＨｕＢ７Ｈ６及びＣｙＢ７Ｈ６の濃度は、０nM、６．２５nM、１２．５nM、２５nM、５０nM及び１００nMであった。ＨｕＢ７Ｈ１の濃度は、０nM及び１μMであった。両方のフローセルにわたって３０μL／分の流量で１０mMグリシン－ＨＣｌ、ｐＨ１．５を２０秒間注入することによって表面を再生した。

【0294】

参照フローセル１（センサー表面との相互作用）及びブランク（ＨＢＳ－ＥＰ＋又は０ｎＭ分析物）を生データから差し引いた。Biacore（商標）８Ｋ Evaluation Softwareを使用して、センサーグラムを１：１ラングミュア結合に全体的に当てはめて、会合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）及び平衡解離定数（ＫＤ）値を得た。

【0295】

ヒト及びカニクイザルＣＤ３Ｅ＋Ｇ－ｈＦｃに対するＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質の親和性を決定するために、Bio-Rad ProteOn（商標）ＸＰＲ３６装置で実験を行った。簡潔には、ＨｕＣＤ３Ｅ＋Ｇ－ｈＦｃ及びＣｙＣＤ３Ｅ＋ＧをＰｒｏｔｅＯｎ（商標）ＧＬＭセンサーチップ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上にアミンカップリングさせ、固定化された表面上にＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質を流した。この実験のためのランニング緩衝液及び全ての連続希釈液は、ＨＢＳ－ＥＰ＋中で調製した。Ｂｉｏ－Ｒａｄの推奨に従って、ＧＬＭセンサーチップを正規化した。３０μL/分の流速で３００秒間、水平方向にＥＤＣ／ｓ－ＮＨＳの等しい混合物を用いてセンサーチップを活性化した。３０μL/分の流速で３００秒間、１０mMアセタート ｐＨ４．５中０．４μg/mL、０．２μg/mL及び０．１μg/mLで、それぞれＬ１、Ｌ２及びＬ３に垂直方向にＨｕＣＤ３Ｅ＋Ｇ－ｈＦｃを固定化し、Ｌ１上に約１００ＲＵのＨｕＣＤ３Ｅ＋Ｇ－ｈＦｃ、Ｌ２上に４０ＲＵのＨｕＣＤ３Ｅ＋Ｇ－ｈＦｃ、及びＬ３上に０ＲＵのＨｕＣＤ３Ｅ＋Ｇ－ｈＦｃを得た。３０μL/分の流速で３００秒間、１０mMアセタート ｐＨ４．５中０．４μg/mL、０．２μg/mL及び０．１μg/mLで、それぞれＬ４、Ｌ５及びＬ６に垂直方向にＣｙＣＤ３Ｅ＋Ｇ－ｈＦｃを固定化し、Ｌ４上に約３８５ＲＵのＨｕＣＤ３Ｅ＋Ｇ－ｈＦｃ、Ｌ５上に１７０ＲＵのＣｙＣＤ３Ｅ＋Ｇ－ｈＦｃ及びＬ６上に５０ＲＵのＣｙＣＤ３Ｅ＋Ｇ－ｈＦｃを得た。３０μL／分の流速で３００秒間、水平方向に１Ｍエタノールアミン－ＨＣｌを用いてセンサーチップを不活性化した。１００μL／分の流速で水平方向に２回及び垂直方向に２回、１８秒間の０．８５％リン酸でセンサーチップを再生した。

【0296】

３０μL／分の流速で３００秒間、６００秒の解離で、固定化された表面上にＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質分析物を水平に注入した。使用したＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質の濃度は、０nM、１．２nM、３．７nM、１１．１nM、３３．３nM及び１００nMであった。１００μL／分の流速で水平に２回１８秒間、０．８５％リン酸を注入することによって表面を再生した。

【0297】

インタースポット（センサー表面との相互作用）及びブランク（ＨＢＳ－ＥＰ＋又は０nM分析物）を生データから差し引いた。Bio-Rad ProteOn（商標）Managerソフトウェアを使用して、センサーグラムを１：１ラングミュア結合に全体的に当てはめて、会合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）及び平衡解離定数（ＫＤ）値を得た。

【0298】

例示的なＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質（それぞれ、配列番号：２２８、配列番号：２２９、配列番号：２３０、配列番号：２３１、配列番号：２３２、配列番号：２３３、配列番号：２３４、配列番号：２３５、配列番号：２３６、配列番号：２３７、配列番号：２３８、配列番号：２３９又は配列番号：２４０のＢ７Ｈ６鎖と配列番号：３１１のＣＤ３鎖とを含むＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質、及び配列番号：２３０又は配列番号：２３９のＢ７Ｈ６鎖と配列番号：３１２、配列番号：３１３、配列番号：３１４、配列番号：３１５又は配列番号：３１６のＣＤ３鎖とを含むＢ７Ｈ６結合タンパク質）について、上記のように決定された親和性を表２に示す。

【表3】

【0299】

実施例５：細胞表面上にカニクイザルＢ７Ｈ６細胞外ドメインを発現する組換えＣＨＯ－Ｋ１細胞株の作製
細胞表面上にカニクイザルＢ７Ｈ６の細胞外ドメイン（ＮＣＢＩ：ＸＰ＿００５５７８５５７）を発現する安定なＣＨＯ－Ｋ１細胞を作製するために、それぞれのコード配列（ＸＰ＿００５５７８５５７．１のａａ２５～２６２）をｐｃＤＮＡ３．１（Thermo Fisher Scientific）にクローニングした。構築物は、Ｎ末端マウスＩｇＧ Ｖｋリーディング配列、続いて６－Ｈｉｓ－ｍｙｃ－タグ及びカニクイザルＢ７Ｈ６細胞外ドメイン（ＮＣＢＩ ＸＰ＿００５５７８５５７．１のａａ２５～２６２）を含有する。Ｂ７Ｈ６細胞外ドメインの細胞表面局在化を確実にするために、構築物には、リンカー、並びにＥｐＣＡＭの膜貫通ドメイン及び細胞内ドメイン（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１６４２２）を後続させた。マウスモノクローナル抗ｍｙｃ抗体（AbD Serotec）を用いるフローサイトメトリーによって、細胞表面上のＢ７Ｈ６ドメインの発現を確認した。使用した配列を表３に列挙し、構築物の概略図を図２に示す。

【表4】

【0300】

実施例６：組換えヒトＢ７Ｈ６細胞外ドメインタンパク質への例示的なＢ７Ｈ６結合タンパク質の結合
実施例３に記載の組換えヒトＦｃ－Ｈｉｓタグ付きＢ７Ｈ６ＥＣＤ及びヒトＦｃ－Ｈｉｓタグ付きＡｌａ変異Ｂ７Ｈ６細胞外タンパク質へのＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質の結合を評価するために、MediSorp（商標）プレート（Ｎｕｎｃ，４６７３２０）を４℃で一晩、２μl/mlの組換えタンパク質でコーティングした。翌日、室温（ＲＴ）で１時間、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でプレートをブロッキングした。その後、０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０粘性液体を含有するＯＢＳでプレートを洗浄し、Ｂ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質を０．００００１～１０μg/mlの範囲の濃度でインキュベートした。さらなる洗浄工程の後、ペルオキシダーゼがコンジュゲートされたヤギ抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ’）_２特異的二次抗体（Jackson Immunoresearch）によって、結合したＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質を検出し、ＴＭＢ基質溶液（Bender Med Systems）によって可視化した。図３Ａ＋Ｂ及び４Ａ＋Ｂは、組換えヒトＢ７Ｈ６ ＥＣＤ（図３Ａ＋Ｂ）及びヒトＡｌａ変異Ｂ７Ｈ６ ＥＣＤ（図４Ａ＋Ｂ）タンパク質への例示的なＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質（それぞれ、配列番号：２１７、配列番号：２１８、配列番号：２１９、配列番号：２２０、配列番号：２２１、配列番号：２２２、配列番号：２２３、配列番号：２２４、配列番号：２２５、配列番号：２２６、配列番号：２２７、配列番号：２２８、配列番号：２２９、配列番号：２３０、配列番号：２３１、配列番号：２３２、配列番号：２３３、配列番号：２３４、配列番号：２３５、配列番号：２３６、配列番号：２３７、配列番号：２３８、配列番号：２３９又は配列番号：２４０のＢ７Ｈ６鎖と、配列番号：３１１のＣＤ３鎖とを含むＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質、及び配列番号：２３０又は配列番号：２３９のＢ７Ｈ６鎖と配列番号：３１２、配列番号：３１３、配列番号：３１４、配列番号：３１５又は配列番号：３１６のＣＤ３鎖とを含むＢ７Ｈ６結合タンパク質）の結合を示す。

【0301】

全ての試験された例示的なＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質は、組換えヒトＢ７Ｈ６ ＥＣＤへの同等の結合を示す（図３Ａ＋Ｂ）のに対して、それぞれ、配列番号：２１７、配列番号：２１８、配列番号：２１９、配列番号：２２０、配列番号：２２１、配列番号：２２８、配列番号：２２９、配列番号：２３０、配列番号：２３１、配列番号：２３２、配列番号：２３３、配列番号：２３４、配列番号：２３５、配列番号：２３６、配列番号：２３７、配列番号：２３８、配列番号：２３９又は配列番号：２４０のＢ７Ｈ６鎖と配列番号：３１１のＣＤ３鎖とを含むＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質、及び配列番号：２３０又は配列番号：２３９のＢ７Ｈ６鎖と配列番号：３１２、配列番号：３１３、配列番号：３１４、配列番号：３１５又は配列番号：３１６のＣＤ３鎖とを含むＢ７Ｈ６結合タンパク質のみが、ＮＫｐ３０結合部位がアラニンに変異されたヒトＦｃ－Ｈｉｓタグ化Ａｌａ変異Ｂ７Ｈ６細胞外タンパク質への強い結合を示す。配列番号：２２２、配列番号：２２３、配列番号：２２４、配列番号：２２５、配列番号：２２６、又は配列番号：２２７のＢ７Ｈ６鎖、及び配列番号：３１１のＣＤ３鎖を含むＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質は、Ｆｃ－Ｈｉｓタグ化Ａｌａ変異Ｂ７Ｈ６細胞外タンパク質に高濃度で弱い結合のみを示すか、又は結合を示さない。

【0302】

実施例７：Ｂ７Ｈ６陽性ＨＣＴ細胞への結合
ヒト（結腸直腸癌）ＣＲＣ細胞株であるＨＣＴ－１５へのＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質の結合をフローサイトメトリーによって試験した。以前の実験において、ＨＣＴ－１５細胞がＲＮＡレベル及びタンパク質レベルでＢ７－Ｈ６を発現し、細胞表面上に約８，０００個のＢ７－Ｈ６受容体を有することが確認されている（データは示さず）。実施例２に記載されているように、Ｂ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質を作製した。ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／０．０５％アジ化ナトリウム）中の漸増濃度の２段階精製されたＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質でＨＣＴ－１５細胞を染色した。ＰＥをコンジュゲートされた抗ヒト二次抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｐ８０４７）で、結合した分子を検出した。図５Ａ＋Ｂは、ヒトＨＣＴ－１５細胞への例示的なＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質（それぞれ、配列番号：２１７、配列番号：２１８、配列番号：２１９、配列番号：２２０、配列番号：２２１、配列番号：２２２、配列番号：２２３、配列番号：２２４、配列番号：２２５、配列番号：２２６、配列番号：２２７、配列番号：２２８、配列番号：２２９、配列番号：２３０、配列番号：２３１、配列番号：２３２、配列番号：２３３、配列番号：２３４、配列番号：２３５、配列番号：２３６、配列番号：２３７、配列番号：２３８、配列番号：２３９又は配列番号：２４０のＢ７Ｈ６鎖と、配列番号：３１１のＣＤ３鎖とを含むＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質、及び配列番号：２３０又は配列番号：２３９のＢ７Ｈ６鎖と配列番号：３１２、配列番号：３１３、配列番号：３１４、配列番号：３１５又は配列番号：３１６のＣＤ３鎖とを含むＢ７Ｈ６結合タンパク質）の結合を示す。

【0303】

実施例８：カニクイザルＢ７Ｈ６に対する交差反応性
カニクイザルＢ７Ｈ６を発現する組換えＣＨＯ－Ｋ１細胞へのＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質の結合を、フローサイトメトリーによって試験した。実施例２に記載されているように、Ｂ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質を作製した。実施例５に記載されているように、組換えカニクイザルＢ７Ｈ６発現細胞株を作製した。ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／０．０５％アジ化ナトリウム）中の漸増濃度の２段階精製されたＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質で細胞を染色した。ＰＥをコンジュゲートされた抗ヒト二次抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｐ８０４７）で、結合した分子を検出した。図６は、組換えカニクイザルＢ７Ｈ６発現細胞への例示的なＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質（それぞれ、配列番号：２２８、配列番号：２２９、配列番号：２３０、配列番号：２３１、配列番号：２３２、配列番号：２３３、配列番号：２３４、配列番号：２３５、配列番号：２３６、配列番号：２３７、配列番号：２３８、配列番号：２３９又は配列番号：２４０のＢ７Ｈ６鎖と配列番号：３１１のＣＤ３鎖とを含むＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質、及び配列番号：２３０又は配列番号：２３９のＢ７Ｈ６鎖と配列番号：３１２、配列番号：３１３、配列番号：３１４、配列番号：３１５又は配列番号：３１６のＣＤ３鎖とを含むＢ７Ｈ６結合タンパク質）の結合を示す。

【0304】

実施例９：ヒトＴ細胞への結合
精製されたヒトＴ細胞へのＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質の結合をフローサイトメトリーによって試験した。実施例２に記載されているように、Ｂ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質を作製した。オーストリア赤十字から得られたバフィーコートから、Ｔ細胞を単離した。全てのバフィーコートに対し、ヘルシンキ宣言に従ったインフォームドコンセント及びオーストリアの州倫理委員会の承認を得た。

【0305】

Ficoll（登録商標）Paque密度勾配培地（GE Healthcare Lifesciences）を使用してヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を調製し、続いて遠心分離した。ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、輸血のために血液を採取する血液バンクの副産物である濃縮されたリンパ球調製物（バフィーコート）に由来した。したがって、Ficoll（登録商標）密度勾配遠心分離（１４００rpmで、ブレーキなしで３５分間）及びＰＢＳによる徹底した洗浄によって、単核細胞を単離した。ＡＣＫ溶解緩衝液（Thermo Fisher Scientific、Ａ１０４９２０１）中で３分間インキュベートし、続いてＰＢＳ中で洗浄することによって残存する赤血球を除去した後、ＲＰＭＩ１６４０ GlutaMAX（商標）サプリメント（Ｇｉｂｃｏ＃６１８７０－０１０）、５％ヒトＡＢ血清ＡＢ（Ｇｅｍｉｎｉ、ＧｅｍＣｅｌｌカタログ番号１００－５１２ＬＯＴ番号Ｈ５６５００Ｉ）＋１％ＭＥＭ－ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ＃１１１４０－０３５）、１０mM ＨＥＰＥＳ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ＃７３６５－４９－９）、１０μM β－メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ＃２１９８５－０２３）及びピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ＃１１３６０－０３９）を含有するアッセイ培地中に懸濁した。

【0306】

Pan T Cell Isolation Kit II(Miltenyi Biotec#130-091-156)を使用するネガティブ選択によって、Ｔ細胞を単離した。簡単に記載すると、１０Ｍｉｏ細胞あたり緩衝液ＰＢＳ ４０μl／０．５％ＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ参照番号０４１－９４５５３Ｍ）／２mM ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ参照番号１５５７５－０３８）中に細胞を再懸濁し、１０Ｍｉｏ細胞あたりＢｉｏｔｉｎ－Ａｎｔｉｂｏｄｙカクテル １０μlとともに４℃で５分間インキュベートした。その後、緩衝液 ３０μl及び抗ビオチンＭＡＣＳ（登録商標）ＭｉｃｒｏＢｅｄｓ２０μl/１０００万細胞を添加し、４℃で１０分間インキュベートした。その後、適切なＭＡＣＳ（登録商標）マイクロビーズセパレータ（Miltenyi Biotec）の磁場中で予め濯がれた２５ＬＳカラム（Miltenyi Biotec#130-042-401）中に混合物を入れた。フロースルーを収集し、アッセイ培地で洗浄した。

【0307】

ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／０．０５％アジ化ナトリウム）中の漸増濃度の２段階精製されたＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質でＴ細胞を染色した。ＰＥをコンジュゲートされた抗ヒト二次抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｐ８０４７）で、結合した分子を検出した。図７は、ヒトＴ細胞への例示的なＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質（それぞれ、配列番号：２２８、配列番号：２２９、配列番号：２３０、配列番号：２３１、配列番号：２３２、配列番号：２３３、配列番号：２３４、配列番号：２３５、配列番号：２３６、配列番号：２３７、配列番号：２３８、配列番号：２３９又は配列番号：２４０のＢ７Ｈ６鎖と配列番号：３１１のＣＤ３鎖とを含むＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質、及び配列番号：２３０又は配列番号：２３９のＢ７Ｈ６鎖と配列番号：３１２、配列番号：３１３、配列番号：３１４、配列番号：３１５又は配列番号：３１６のＣＤ３鎖とを含むＢ７Ｈ６結合タンパク質）の結合を示す。

【0308】

実施例１０：結合選択性
Ｂ７Ｈ６陰性及びＣＤ３陰性ＣＨＯ－Ｋ１細胞へのＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質の結合を、フローサイトメトリー分析によって試験した。実施例２に記載されているように、Ｂ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質を作製した。ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／０．０５％アジ化ナトリウム）中の漸増濃度の２段階精製されたＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質でＣＨＯ－Ｋ１細胞を染色した。ＰＥをコンジュゲートされた抗ヒト二次抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｐ８０４７）で、結合した分子を検出した。図８は、ＣＨＯ－Ｋ１細胞への例示的なＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質（それぞれ、配列番号：２２８、配列番号：２２９、配列番号：２３０、配列番号：２３１、配列番号：２３２、配列番号：２３３、配列番号：２３４、配列番号：２３５、配列番号：２３６、配列番号：２３７、配列番号：２３８、配列番号：２３９又は配列番号：２４０のＢ７Ｈ６鎖と配列番号：３１１のＣＤ３鎖とを含むＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質、及び配列番号：２３０又は配列番号：２３９のＢ７Ｈ６鎖と配列番号：３１２、配列番号：３１３、配列番号：３１４、配列番号：３１５又は配列番号：３１６のＣＤ３鎖とを含むＢ７Ｈ６結合タンパク質）の結合を示す。

【0309】

実施例１１：Ｂ７Ｈ６依存性ＮＫ細胞活性の阻害
細胞表面に発現されたＢ７Ｈ６は、ＮＫ細胞上のＮＫｐ３０に結合し、これがＮＫ細胞のＮＫｐ３０媒介性活性化、並びにＮＫ細胞の細胞傷害性及びサイトカイン分泌の引き金を引く（Ｂｒａｎｄｔ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００９；２０６（７）：１４９５－１５０３）。ＮＫ細胞のＢ７Ｈ６依存性活性化を評価するために、９６ウェル平底細胞培養プレートを１００ｎＭ組換えヒトＢ７Ｈ６タンパク質（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ＃７１４４－Ｂ７－０５０）で４℃にて一晩コーティングした。翌日、プレートをＰＢＳで洗浄し、続いて漸増濃度のＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質又は組換えＮＫｐ３０タンパク質（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ＃１８４９－ＮＫ－０２５）を添加し、室温で１時間インキュベートした。実施例２に記載されているように、Ｂ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質を作製した。追加の洗浄工程の後、培地 １００μl（１２．５％ウシ胎児血清、１２．５％ウマ血清、０．２mM Ｄ－Ｍｙｏ－イノシトール、０．０２mM葉酸及び０．１mM β－メルカプトエタノールを含有するＭＥＭα）中の１０万個のＮＫ９２ＭＩ（ＡＴＣＣ）細胞をウェルあたり添加し、２４時間インキュベートした。翌日、Ｖ－ＰＬＥＸ Ｈｕｍａｎ ＩＦＮ－ｙ Ｋｉｔ（Meso Scal Discovery）を用いてＩＦＮγ濃度を定量した。図９Ａ＋Ｂは、Ｂ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質（配列番号：２１７、配列番号：２１８、配列番号：２１９、配列番号：２２０、配列番号：２２１、配列番号：２２２、配列番号：２２３、配列番号：２２４、配列番号：２２５、配列番号：２２６、配列番号：２２７、配列番号：２２８、配列番号：２３０、配列番号：２３１、配列番号：２３２、配列番号：２３５、配列番号：２３６のＢ７Ｈ６鎖と配列番号：３１１のＣＤ３鎖とを含むＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質）がＮＫ－９２ＭＩによるＩＦＮγ分泌のＢ７－Ｈ６依存的誘導を阻害する能力を示す。

【0310】

ＮＫｐ３０相互作用部位がアラニンで置換されたＡｌａ変異Ｂ７Ｈ６細胞外タンパク質に結合しないか、又は弱く結合するに過ぎないＢ７Ｈ６結合タンパク質（配列番号：２２２、配列番号：２２３、配列番号：２２４、配列番号：２２５、配列番号：２２６、配列番号：２２７のＢ７Ｈ６鎖と配列番号：３１１のＣＤ３鎖とを含むＢ７－Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質）（図４、実施例６に示されているとおり）は、ＮＫ－９２ＭＩ細胞によるＩＦＮγ分泌のＢ７－Ｈ６依存的誘導を阻害するのに対して、野生型タンパク質と同等のＡｌａ変異Ｂ７Ｈ６細胞外タンパク質への強い結合を示す結合タンパク質（配列番号：２１７、配列番号：２１８、配列番号：２１９、配列番号：２２０、配列番号：２２１、配列番号：２２８、配列番号：２３０、配列番号：２３１、配列番号：２３２、配列番号：２３５、配列番号：２３６のＢ７Ｈ６鎖と配列番号：３１１のＣＤ３鎖とを含むＢ７－Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質）（図４、実施例６に示されているとおり）は、ＮＫ－９２ＭＩ細胞によるＩＦＮγ分泌のＢ７－Ｈ６依存的誘導に影響を及ぼさない。

【0311】

実施例１２：ヒトＨＣＴ－１５細胞に対するＴ細胞リダイレクト性溶解能
細胞溶解に対する計測情報として乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出を使用して、ＨＣＴ－１５細胞に対する非刺激Ｔ細胞の効力を決定した。このアッセイでは、エフェクター細胞としてのヒトＴ細胞及び漸増濃度のＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質とともに、１０：１のエフェクター対標的細胞比で、Ｂ７Ｈ６陽性ＣＲＣ細胞株であるＨＣＴ－１５を７２時間共培養した。実施例２に記載されているように、Ｂ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質を作製した。実施例９に記載されているように、精製されたＴ細胞を単離した。その後、０．００００１ｎＭ～１０ｎＭの濃度のＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質とともに、１：１０の比でのＨＣＴ－１５細胞及びＴ細胞を７２時間インキュベートした。

【0312】

製造業者の説明書に従って、Cytotoxicity Detection Kit^PLUS（Roche）を使用して細胞傷害活性を決定した。簡潔に言えば、この方法は、死細胞又は細胞膜が損傷した細胞からのＬＤＨの放出の使用に基づいている。キットからの反応混合物とともに細胞培養上清を３０分間インキュベートし、細胞溶解の代用として、ＬＤＨ活性の結果としてのホルマザンの形成を５００ｎｍで分光光度計において測定する。以下の式に従って、最大溶解対照に対する細胞傷害性の百分率を計算した：

【数1】

バックグラウンド：標的細胞＋エフェクター細胞
最大溶解：標的細胞＋５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００
最小溶解：標的細胞

【0313】

GraphPad（登録商標）Prism（登録商標）５．０ソフトウェア（GraphPad Software、Inc）を使用して、対応するＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質濃度に対して、最大溶解対照に対する細胞傷害性の百分率をプロットした。Ｓ字形用量反応曲線を評価するための４パラメータロジスティック方程式モデルを用いて用量反応曲線を分析し、ＥＣ_５０値を計算した。

【0314】

図１０Ａ＋Ｂ及び１１Ａ＋Ｂは、例示的なＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質（それぞれ、配列番号：２１７、配列番号：２１８、配列番号：２１９、配列番号：２２０、配列番号：２２１、配列番号：２２２、配列番号：２２３、配列番号：２２４、配列番号：２２５、配列番号：２２６、配列番号：２２７、配列番号：２２８、配列番号：２２９、配列番号：２３０、配列番号：２３１、配列番号：２３２、配列番号：２３３、配列番号：２３４、配列番号：２３５、配列番号：２３６、配列番号：２３７、配列番号：２３８、配列番号：２３９又は配列番号：２４０のＢ７Ｈ６鎖と、配列番号：３１１のＣＤ３鎖とを含むＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質、及び配列番号：２３０又は配列番号：２３９のＢ７Ｈ６鎖と配列番号：３１２、配列番号：３１３、配列番号：３１４、配列番号：３１５又は配列番号：３１６のＣＤ３鎖とを含むＢ７Ｈ６結合タンパク質）によって媒介されるＨＣＴ－１５細胞に対するＴ細胞のリダイレクト性溶解能の例を示す。

【0315】

図１０及び１１は、ＮＫｐ３０相互作用部位がアラニンで置換された組換えＡｌａ変異Ｂ７Ｈ６細胞外タンパク質に、ｗｔタンパク質と同等に結合し、ＮＫ９２ＭＩ細胞によるＩＦＮγのＢ７－Ｈ６依存性分泌を阻害しないＢ７Ｈ６結合タンパク質（それぞれ、配列番号：２１７、配列番号：２１８、配列番号：２１９、配列番号：２２０、配列番号：２２１、配列番号：２２８、配列番号：２２９、配列番号：２３０、配列番号：２３１、配列番号：２３２、配列番号：２３３、配列番号：２３４、配列番号：２３５、配列番号：２３６、配列番号：２３７、配列番号：２３８、配列番号：２３９又は配列番号：２４０のＢ７Ｈ６鎖と配列番号：３１１のＣＤ３鎖とを含むＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質、及び配列番号：２３０又は配列番号：２３９のＢ７Ｈ６鎖と配列番号：３１２、配列番号：３１３、配列番号：３１４、配列番号：３１５又は配列番号：３１６のＣＤ３鎖とを含むＢ７Ｈ６結合タンパク質）（実施例６、１１に示されているとおり）が、組換えＡｌａ変異Ｂ７Ｈ６細胞外タンパク質に結合しないか、又は弱く結合するに過ぎず、ＮＫ９２ＭＩ細胞によるＩＦＮγのＢ７－Ｈ６依存性分泌を阻害するＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質（配列番号：２１７、配列番号：２１８、配列番号：２１９、配列番号：２２０又は配列番号：２２１のＢ７Ｈ６鎖、及び配列番号：ＣＤ３＃１のＣＤ３鎖を含むＢ７－Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質）（実施例６、１１に示されているとおり）より低いＥＣ_５０値（表４Ａ＋Ｂ）を示すことを示す。したがって、Ｂ７Ｈ６依存性ＮＫ細胞活性化を阻害しない結合タンパク質は、驚くべきことに、Ｂ７Ｈ６依存性ＮＫ細胞活性化を阻害する結合タンパク質と比較して、有意により高いＴ細胞媒介性腫瘍細胞溶解を示す。

【0316】

例示的なＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質を用いて図１２に示されているように、活性は、低いエフェクター対標的細胞比を必要とするに過ぎない。

【0317】

【表5】

【0318】

【表6】

【0319】

実施例１３：Ｔ細胞リダイレクト性溶解の交差反応性及び選択性
実施例１２に記載されているように、細胞溶解に対する計測情報として乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出を使用して、ＨＣＴ－１５細胞に対する非刺激Ｔ細胞の効力を決定した。実施例２に記載されているように、Ｂ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質を作製した。実施例５に記載されているように、組換えカニクイザルＢ７Ｈ６発現細胞株を作製した。

【0320】

図１３は、それぞれ、例示的なＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質、配列番号：２２８、配列番号：２２９、配列番号：２３０、配列番号：２３１、配列番号：２３２、配列番号：２３３、配列番号：２３４、配列番号：２３５、配列番号：２３６、配列番号：２３７、配列番号：２３８、配列番号：２３９又は配列番号：２４０のＢ７Ｈ６鎖及び配列番号：３１１のＣＤ３鎖、並びに配列番号：２３０又は配列番号：２３９のＢ７Ｈ６鎖と配列番号：３１２、配列番号：３１３、配列番号：３１４、配列番号：３１５又は配列番号：３１６のＣＤ３鎖とを含むＢ７Ｈ６結合タンパク質）によって媒介されるｃｙｎｏＢ７Ｈ６発現細胞（図１３Ａ）及びＢ７Ｈ６陰性親ＣＨＯ－Ｋ１細胞（図１３Ｂ）のＴ細胞リダイレクト性溶解能の例を示す。

【0321】

実施例１４：Ｔ細胞の活性化の選択性
Ｔ細胞の活性化を決定するために、非刺激Ｔ細胞及び標的細胞としてのＢ７Ｈ６陽性ＨＣＴ－１５細胞を用いた細胞傷害性アッセイを実施例１２に記載されているように準備した。実施例２に記載されているように、Ｂ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質を作製した。Ｔ細胞活性化を決定するために、細胞を遠心分離し、ＣＤ４（ＢＤ＃５５０６３０）、ＣＤ８（ＢＤ＃５５７８３４）及びＣＤ２５（ＢＤ＃３４０９０７）に対する抗体で染色し、フローサイトメトリーによって測定した。図１４は、配列番号：２２８、配列番号：２３０、配列番号：２３１、配列番号：２３２、配列番号：２３５又は配列番号：２３６のＢ７Ｈ６鎖と配列番号：３１１のＣＤ３鎖とを含む例示的なＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質によって媒介される、Ｂ７Ｈ６陽性ＨＣＴ－１５細胞の存在下及び非存在下でのＣＤ４＋（図１４Ａ）及びＣＤ８＋（図１４Ｂ）細胞の活性化能の例を示す。

【0322】

実施例１５：Ｔ細胞の脱顆粒の選択性
パーフォリン及びグランザイムＢの細胞内発現を介したＴ細胞の脱顆粒を決定するために、非刺激Ｔ細胞及び標的細胞としてのＢ７Ｈ６陽性ＨＣＴ－１５細胞を用いた細胞傷害性アッセイを実施例１２に記載されているように準備した。実施例２に記載されているように、Ｂ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質を作製した。グランザイムＢ及びパーフォリンの細胞内レベルを決定するために、細胞を遠心分離し、ＣＤ４（ＢＤ＃５５０６３０）、ＣＤ８（ＢＤ＃５５７８３４）に対する抗体で染色し、その後、Fixation/Permeabilization Solution（ＢＤ＃５５４７１４）を用いて細胞を透過処理し、パーフォリン（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ＃３０８１２０）及びグランザイムＢ（ＢＤ＃５６０２２１）に対する抗体で染色し、フローサイトメトリーによって測定した。図１５は、ＣＤ４^＋（図１５Ａ）及びＣＤ８^＋（図１５Ｂ）細胞における細胞内パーフォリン発現の上方制御能の例を示し、図１６は、配列番号：２２８、配列番号：２３０、配列番号：２３１、配列番号：２３２、配列番号：２３５又は配列番号：２３６のＢ７Ｈ６鎖と配列番号：３１１のＣＤ３鎖とを含む例示的なＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質によって媒介される、Ｂ７Ｈ６陽性ＨＣＴ－１５細胞の存在下及び非存在下でのＣＤ４^＋（図１６Ａ）及びＣＤ８^＋（図１６Ｂ）細胞における細胞内グランザイムＢ発現の上方制御を示す。

【0323】

実施例１６：Ｔ細胞増殖の誘導
非刺激Ｔ細胞及び標的細胞としてのＢ７Ｈ６陽性ＨＣＴ－１５細胞を用いた細胞傷害性アッセイを実施例１２に記載されているように準備した。実施例２に記載されているように、Ｂ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質を作製した。Ｔ細胞の増殖を決定するために、５μＭ Cell Trace（商標）ＣＦＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃ３４５５４）でＰＢＭＣを標識し、抗ＣＤ３抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄカタログ番号：３１７３３６）でＴ細胞を染色した。その後、１０：１の比でのＨＣＴ－１５細胞及び漸増濃度のＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質とともに、標識されたＰＢＭＣを６日間インキュベートした。図１７は、Ｂ７Ｈ６陽性ＨＣＴ－１５細胞の存在下での、配列番号：２２８、配列番号：２３０、配列番号：２３１、配列番号：２３２、配列番号：２３５又は配列番号：２３６のＢ７Ｈ６鎖と配列番号：３１１のＣＤ３鎖とを含む例示的なＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質によるＢ７Ｈ６結合タンパク質によるＴ細胞の増殖の用量依存的誘導を示す。

【0324】

実施例１７：ＩＦＮγ分泌の選択性
非刺激Ｔ細胞及び標的細胞としてのＢ７Ｈ６陽性ＨＣＴ－１５細胞を用いた細胞傷害性アッセイを実施例１２に記載されているように準備した。実施例２に記載されているように、Ｂ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質を作製した。Ｖ－Ｐｌｅｘ Ｈｕｍａｎ ＩＦＮ－γ Ｋｉｔ（ＭＳＤ、ＣＡＴ：Ｋ１５１ＱＯＤ－４）によって、上清中のサイトカインレベルを測定した。図１８は、配列番号：２２８、配列番号：２３０、配列番号：２３１、配列番号：２３５又は配列番号：２３６のＢ７Ｈ６鎖と配列番号：３１１のＣＤ３鎖とを含む５つの例示的なＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質によって誘導されるＩＦＮγの分泌を示す。

【0325】

実施例１８：マウスＰＫ
実施例２に記載されているように、Ｂ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質を作製した。

【0326】

１ｍｇ／ｋｇの単回静脈内投与後に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質のＰＫを評価した。Ｂ７Ｈ６捕捉／ＣＤ３検出アッセイを使用して、Ｂ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質の血清濃度を決定した。

【0327】

簡単に記載すると、雄のＣ５７ＢＬ／６マウスに、１mg/kgの静脈内（ＩＶ）単回投与を与えた（ｎ＝３／分子）。投与前並びに投与後０．２５、２、６、２４、４８、９６、１６８、２４０及び３３６時間に血液試料を収集した。捕捉試薬としてビオチン化されたＢ７Ｈ６及び検出試薬としてスルホタグ付加ＣＤ３εを使用して、ＭＳＤベースのリガンド結合アッセイによって血清薬物レベルを測定した。非コンパートメント分析を使用して、血清濃度時間プロファイルから薬物動態（ＰＫ）パラメータを計算した。以下のＰＫパラメータを評価した：ＡＵＣｔｌａｓｔ（時間０から最後の定量可能な時点までの血清濃度－時間曲線下面積）、ＡＵＣｉｎｆ（無限大まで外挿された血清濃度－時間曲線下面積）、ＣＬ（全身クリアランス）、Ｖｓｓ（分布の定常状態体積）及びＴ_１／２（最終半減期）。

【0328】

例示的なＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質の平均（ＳＤ）血清濃度時間プロファイルを図１９に要約する。これらの例示的なＢＨ６／ＣＤ３結合タンパク質の平均（ＳＤ）ＰＫパラメータを表５に要約する。

【表7】

【0329】

実施例１８Ａ：マウスＰＫ
実施例１８に記載されているように、Ｂ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質のＰＫを評価した。配列番号：２２８、配列番号：２３０、配列番号：２３１又は配列番号：２３２のＢ７Ｈ６鎖と配列番号：３１１のＣＤ３鎖とを含む４つの例示的なＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質の平均（ＳＤ）血清濃度時間プロファイルを図２２に要約する。

【0330】

実施例１９：インビボ有効性
ヒトＴ細胞で再構成されたヒト異種移植マウスモデルを用いて有効性研究を行った。詳細には、致死量以下で照射された（２Ｇｙ、－１日目）雌ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｓｕｇ}／ＪｉｃＴａｃマウスの右背側腹部にヒトＮＣＩ－Ｈ７１６結腸直腸癌細胞（２．５×１０^７個）を皮下（ｓ．ｃ．）注射した（－１６日目）。並行して、（健康なヒト血液ドナーから単離された）ヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞をインビトロで増殖させた。

【0331】

実施例９に記載されているように、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を調製した。

【0332】

Pan T Cell Isolation Kit II(Miltenyi Biotec#130-096-535)を使用するネガティブ選択によって、Ｔ細胞を単離した。簡単に記載すると、１０×１０^６細胞あたり緩衝液ＰＢＳ ４０μl／０．５％ＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ参照番号０４１－９４５５３Ｍ）／２mM ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ参照番号１５５７５－０３８）中に細胞を再懸濁し、１０×１０^６細胞あたりＢｉｏｔｉｎ－Ａｎｔｉｂｏｄｙカクテル １０μlとともに４℃で５分間インキュベートした。その後、緩衝液 ３０μl及び抗ビオチンＭＡＣＳ（登録商標）ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ ２０μl／１０×１０^６細胞を添加し、４℃で１０分間インキュベートした。その後、適切なＭＡＣＳ（登録商標）マイクロビーズセパレータ（Miltenyi Biotec）の磁場中で予め濯がれた２５ＬＳカラム（Miltenyi Biotec#130-042-401）中に混合物を入れた。フロースルーを収集し、アッセイ培地で洗浄した。

【0333】

その後、T Cell Activation/Expansion Kit human(Miltenyi Biotecカタログ番号１３０－０９１－４４１）を用いてＴ細胞を１７日間増殖させた。簡単に記載すると、抗ビオチンMACSiBead（商標）ParticlesにＣＤ２－、ＣＤ３－、ＣＤ２８ビオチンを搭載し、１粒子あたり２細胞の比で精製されたＴ細胞に移し、組換えＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ＃２０２－ＩＬ－０５０／ＣＦ）２０単位の存在下で、０．５～１０^６細胞／mlの密度で１４日間インキュベートする。３日ごとに、新鮮なＩＬ－２ ２０単位を細胞に補充した。動物への注射の３日前に、さらに３日間、４細胞あたり１ビーズの比で、ＣＤ２－、ＣＤ３－、ＣＤ２８ビオチンを搭載された抗ビオチンMACSiBead（商標）ＰａｒｔｉｃｌｅｓでＴ細胞を再刺激した。最後に、MACSiMAG（商標）Separator(Miltenyi Biotec)でビーズを除去し、Ｔ細胞をＰＢＳで洗浄した。

【0334】

－２日目に、腫瘍体積に基づいて動物を無作為に処置群に割り当て、２×１０^７個のヒトＴ細胞を腹腔内（ｉ．ｐ．）に注射した。実施例２に記載されているように、Ｂ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質を作製した。１日目に処置を開始し、Ｂ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質又はビヒクル緩衝液（５０mM ＮａＯＡｃ、１００mM ＮａＣｌ、ｐＨ５．０）を、ｑ７ｄ投薬レジメンで、外側尾静脈中への静脈内（ｉ．ｖ．）ボーラス注射によって投与した。外部キャリパー測定によって腫瘍成長をモニターし、標準半楕円体式を使用して腫瘍体積を計算した。屠殺基準に達した動物は、倫理的理由から研究中早期に安楽死させた。０．０５mg/kgで週に一回、ｉ．ｖ．でのＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質による担腫瘍マウスの処置は、著しく腫瘍退縮を誘導した（図２０）。

【0335】

実施例１９Ａ：インビボ有効性
実施例１９に記載されているように、ヒトＣＤ３^＋Ｔ細胞で再構成されたヒトＮＣＩ－Ｈ７１６異種移植マウスモデルを使用して有効性研究を行った。週に１回、静脈内に０．０５mg/kgで、配列番号：２２８、配列番号：２３０、配列番号：２３１又は配列番号：２３２のＢ７Ｈ６鎖と配列番号：３１１のＣＤ３鎖とを含むＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質で腫瘍担持マウスを処置すると、著しい腫瘍退縮が誘導された（図２３）。

【0336】

実施例１９Ｂ：インビボ有効性
実施例１９に記載されているように、ヒトＣＤ３^＋Ｔ細胞で再構成されたヒトＮＣＩ－Ｈ７１６異種移植マウスモデルを使用して有効性研究を行った。０．０５mg/kgで週に１回又は単回投与として静脈内に投与された例示的なＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質による腫瘍担持マウスの処置は、著しい腫瘍退縮を誘導した（図２４）。

【0337】

実施例２０：Ｂ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質のパーセントモノマー含有量
分析サイズ排除クロマトグラフィー（ａＳＥＣ）によって、Ｂ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質（それぞれ、配列番号：２１７、配列番号：２１８、配列番号：２１９、配列番号：２２０、配列番号：２２１、配列番号：２２２、配列番号：２２３、配列番号：２２４、配列番号：２２５、配列番号：２２５、配列番号：２２７、配列番号：２２８、配列番号：２２９、配列番号：２３０、配列番号：２３１、配列番号：２３２、配列番号：２３３、配列番号：２３４、配列番号：２３５、配列番号：２３６、配列番号：２３７、配列番号：２３８、配列番号：２３９又は配列番号：２４０のＢ７Ｈ６鎖と、配列番号：３１１のＣＤ３鎖とを含むＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質、及び配列番号：２３０又は配列番号：２３９のＢ７Ｈ６鎖と配列番号：３１２、配列番号：３１３、配列番号：３１４、配列番号：３１５又は配列番号：３１６のＣＤ３鎖とを含むＢ７Ｈ６結合タンパク質）についてパーセントモノマーを決定した（表６に示す）。ａＳＥＣは、Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ＳＥＣカラム２００Å、１．７μｍ、４．６×１５０ｍｍ（カタログ番号１８６００５２２５）を使用して、Ｗａｔｅｒｓ（登録商標）（Ｍｉｌｆｒｏｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ（登録商標）システムで実行した。実行条件は以下のとおりであった：移動相：５０ｍＭリン酸ナトリウム、２００ｍＭアルギニン及び０．０５％アジ化ナトリウム；流速：０．５ｍｌ／分；実行時間：５分；試料搭載量：１０μｇ；ピーク検出：Ａ２８０ｎｍ；クロマトグラムの自動化された処理方法。

【表8】

【0338】

実施例２１：熱安定性
熱シフト分析（ＴＳＡ）によって熱安定性を決定し、Ｂ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質（それぞれ、配列番号：２２８、配列番号：２２９、配列番号：２３０、配列番号：２３１、配列番号：２３２、配列番号：２３３、配列番号：２３４、配列番号：２３５、配列番号：２３６、配列番号：２３７、配列番号：２３８、配列番号：２３９又は配列番号：２４０のＢ７Ｈ６鎖と配列番号：３１１のＣＤ３鎖とを含むＢ７Ｈ６結合タンパク質、及び配列番号：２３０又は配列番号：２３９のＢ７Ｈ６鎖と配列番号：３１２、配列番号：３１３、配列番号：３１４、配列番号：３１５又は配列番号：３１６のＣＤ３鎖とを含むＢ７Ｈ６結合タンパク質）の第１の融解転移（Ｔｍ１）の結果が表７に示されている。外因性フルオロフォアとしてＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅタンパク質ゲル染色（Invitrogen、Carlsbad、CA）を用いるQuantStudio（商標）６ＦｌｅｘリアルタイムＰＣＲシステム（Applied Biosystems、Waltham、ＭＡ）を使用して、温度の関数としての蛍光強度プロファイルを取得した。４０ｍＭ塩化ナトリウム及び０．０２％アジ化ナトリウムを加えた１０mMヒスチジン、ｐＨ６．０で試料を０．４mg/mlに希釈した。２５℃から９５℃まで２℃／分の速度での熱勾配で融解曲線を作成し、データは「ＲＯＸ」フィルターセットを通して約０．４℃ごとに収集された（励起：５８０±１０ｎｍ、発光：６２３±１４ｎｍ）。Protein Thermal Shift（商標）Software Version v1.3(ThermoFisher Scientific、Waltham、MA)を用いてデータを分析した。

【表9】

【0339】

実施例２２：Ｅｐｉｖａｘによるインシリコでの予測免疫原性スコア
数学的アルゴリズムを用いて、配列の免疫原性をインシリコで評価した。具体的には、Ｂ７Ｈ６鎖（配列番号：２１７、配列番号：２１８、配列番号：２１９、配列番号：２２０、配列番号：２２１、配列番号：２２２、配列番号：２２３、配列番号：２２４、配列番号：２２５、配列番号：２２５、配列番号：２２７、配列番号：２２８、配列番号：２２９、配列番号：２３０、配列番号：２３１、配列番号：２３２、配列番号：２３３、配列番号：２３４、配列番号：２３５、配列番号：２３６、配列番号：２３７、配列番号：２３８、配列番号：２３９又は配列番号：２４０のＢ７Ｈ６鎖）に対して、及びＣＤ３鎖（配列番号：３１１、配列番号：３１２、配列番号：３１３、配列番号：３１４、配列番号：３１５又は配列番号：３１６のＣＤ３鎖）に対して、免疫原性スコアの尺度としてEpiMatrix（登録商標）Treg-adjusted Score(EpiVax Inc.,Providence RI)）を決定し、様々なＦｃ配列のスコアと比較した。これらのスコアは、Ｔ細胞エピトープ及びＴｒｅｇエピトープを考慮に入れている。免疫原性スコアが低いほど、配列が免疫原性である可能性はより低い。一般に、負のスコアは免疫原性のリスクが低いと考えられ、一方、高い正のスコアは潜在的な免疫原性の指標と見なされる。以下の表８及び９に示されているように、本明細書に記載されている例示的なＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質は極めて低い免疫原性スコアを有し、これらの結合タンパク質については免疫原性であるリスクが低いことを示している。

【表10】

【表11】

【0340】

実施例２３：表面への非特異的結合
高度に帯電したタンパク質を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）ベースのアッセイで、本発明のＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質の特異性をさらに試験した。結合タンパク質が無関係な帯電したタンパク質に著しい結合を有するかどうかを決定するために、バイオセンサー技術を使用して非特異的結合アッセイを開発した。このアッセイでは、２つのＳＰＲ表面、負に帯電したタンパク質（トリプシン阻害剤）でコーティングされたＳＰＲ表面及び正に帯電したタンパク質（リゾチーム）でコーティングされたＳＰＲ表面上にＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質を通した。タンパク質がこれらの表面への著しい非特異的結合を示す場合、結合の原因は、候補上の正又は負の帯電した表面パッチの存在である可能性が高い。タンパク質の非特異的結合は、不良な薬物動態（ＰＫ）及び生体内分布につながることがあり得、下流の製造可能性にも影響を及ぼし得る。

【0341】

実験は、Biacore（登録商標）Ｔ２００ＳＰＲシステム（GE Healthcare Life Sciences）で行った。希釈、表面調製及び結合実験は、１０×ＨＢＳ－ＥＰから調製された１×ＨＢＳ－ＥＰ緩衝液中にて、２５℃で行った。固定化プロトコル及び結合実験の両方の流速は５μL/分であった。

【0342】

非特異的結合実験のための表面を調製するために、製造説明書に従ってアミンカップリングキットを使用して、３０００～５０００ＲＵの表面密度を有するBiacore（登録商標）シリーズＳ ＣＭ５センサーチップ（GE Healthcare sciences）に、手作業で、ニワトリ卵白リゾチーム及びグリシン・マックス大豆由来のトリプシン阻害剤をカップリングさせた。

【0343】

１×ＨＢＳ－ＥＰ緩衝液中に１μMで試料を調製した。１０分間会合及び１５分間解離させて、活性化された表面上に、試料を注入した。Biacore（登録商標）T200 Control Softwareバージョン２．０．１を用いてデータを収集し、Biacore（登録商標）T200 Evaluation Softwareバージョン３．０（GE Healthcare Life Sciences）を用いて分析した。

【0344】

表１０は、例示的なＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質（それぞれ、配列番号：２２８、配列番号：２２９、配列番号：２３０、配列番号：２３１、配列番号：２３２、配列番号：２３３、配列番号：２３４、配列番号：２３５、配列番号：２３６、配列番号：２３７、配列番号：２３８、配列番号：２３９又は配列番号：２４０のＢ７Ｈ６鎖と配列番号：３１１のＣＤ３鎖とを含むＢ７Ｈ６結合タンパク質、及び配列番号：２３０又は配列番号：２３９のＢ７Ｈ６鎖と配列番号：３１２、配列番号：３１３、配列番号：３１４、配列番号：３１５又は配列番号：３１６のＣＤ３鎖とを含むＢ７Ｈ６結合タンパク質）の、２つの高度に帯電したタンパク質であるトリプシン阻害剤及びリゾチームへの結合を示さないか、又は極めて低い結合を示す。

【表12】

【0345】

実施例２４：例示的なＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質によるＳＨＰ７７異種移植腫瘍組織におけるＴ細胞浸潤。
実施例１９に記載される研究におけるマウス由来の残りの腫瘍組織を調製し、ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した。その後、組織切片を調製し、Ｔ細胞上のＣＤ３発現について染色した（抗ＣＤ３（２ＧＶ６）、Ventana Medical Systems）。例示的なＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合タンパク質を有するＮＣＩ－Ｈ７１６異種移植腫瘍組織におけるＴ細胞浸潤を図２１に示す。表１１のスコアリングを使用して、異種移植腫瘍組織におけるＣＤ３発現を定量した。

【表13】

【0346】

実施例２５：ｉ．ｖ．投与のための医薬製剤
本発明の上記結合タンパク質／分子のいずれも、ｉ．ｖ．適用のための医薬製剤の製造のために選択することができる。本発明の抗体についての適切な医薬製剤の例は以下のとおりである。

【0347】

１０mLバイアルは、ヒスチジン、トレハロース、ポリソルベート２０及び注射用水を含む緩衝液中に、１０mg/mLの本発明のＢ７Ｈ６／ＣＤ３結合分子／タンパク質を含有する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【配列表】

0007387885000001.app