特許7389020幹細胞からインビトロで誘導されたＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド共発現細胞の濃縮
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-11-20
(45)【発行日】2023-11-29
(54)【発明の名称】幹細胞からインビトロで誘導されたＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド共発現細胞の濃縮
(51)【国際特許分類】
C12N 5/071 20100101AFI20231121BHJP
A61K 35/39 20150101ALI20231121BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20231121BHJP
A61L 27/38 20060101ALI20231121BHJP
C12N 5/0735 20100101ALN20231121BHJP
【ＦＩ】
C12N5/071
A61K35/39
A61P3/10
A61L27/38 300
C12N5/0735
【請求項の数】
5
(21)【出願番号】P 2020512652
(86)(22)【出願日】2018-09-11
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-11-19
(86)【国際出願番号】 EP2018074390
(87)【国際公開番号】W WO2019048690
(87)【国際公開日】2019-03-14
【審査請求日】2021-08-16
(31)【優先権主張番号】17190412.1
(32)【優先日】2017-09-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】509091848
【氏名又は名称】ノヴォ ノルディスク アー／エス
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】キェルケゴール、ジャネッテ、シュリクティング
【審査官】上村 直子
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１６－５０４０３７（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１７／１４４６９５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１６－５１３９７２（ＪＰ，Ａ）
【文献】Stem Cells Translational Medicine，2015年，Vol.4，pp.1214-1222
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ ５／００－５／２８
Ａ６１Ｋ ３５／３９
Ａ６１Ｐ ３／１０
Ａ６１Ｌ ２７／３８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを共発現する内分泌細胞凝集体を濃縮する方法であって、（ｉ）幹細胞から得られた、ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを共発現する内分泌細胞凝集体、または、幹細胞から得られた、ＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１を共発現する内分泌前駆細胞凝集体を、単一細胞に解離するステップと、
（ｉｉ）凍結保存媒体を用いて前記単一細胞を処理し、温度を低下させて、凍結保存細胞を得るステップと、
（ｉｉｉ）前記凍結保存細胞を解凍するステップと、
（ｉｖ）前記解凍細胞を再凝集させるステップと、を含む、方法。
【請求項2】
ステップ（ｉ）が、ＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１を共発現する内分泌前駆細胞凝集体を用いる場合、解凍後に得られる細胞を、ステップ（ｉｖ）の間に、ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを共発現する内分泌細胞凝集体に分化させる、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記幹細胞は胚性幹細胞、優先的にヒト胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
凍結保存媒体を用いた単一細胞の処理後に、温度を、一段階で－７０℃～－１９６℃、－８０℃～－１６０℃、または－８０℃～－１２０℃、または－８０℃に低下させて、凍結保存細胞を得る、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
凍結保存媒体を用いた単一細胞の処理後に、温度を、段階的に－７０℃～－１９６℃、－８０℃～－１６０℃、または－８０℃～－１２０℃、または－８０℃に低下させて、凍結保存細胞を得る、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、幹細胞からインビトロで誘導された内分泌細胞、ＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１またはＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを発現する細胞を濃縮および凍結保存する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
インスリン治療は生命を救うものであるが、外因性インスリンにより安定した血糖を得ることは困難であることがあり、不十分な制御は深刻な遅延状態合併症と関連する（Ｎａｔｈａｎ，Ｄ．Ｍ．，２０１４．Ｔｈｅ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｒｉａｌ／ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｓｔｕｄｙ ａｔ ３０ ｙｅａｒｓ：ｏｖｅｒｖｉｅｗ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ ｃａｒｅ，３７（１），ｐｐ．９－１６）。ヒトドナーから単離された膵島の１型糖尿病の患者への移植は、一部の患者がインスリンへの依存性が完全になくなったという良好な結果を示した（Ｂａｒｔｏｎ Ｆ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，２０１２．Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｉｎ Ｏｕｔｃｏｍｅｓ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｓｌｅｔ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：１９９９－２０１０．Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ，３５（７），ｐｐ．１４３６－１４４５）。そのような進歩にもかかわらず、膵島移植に対する主要な課題の１つは限定されたドナー膵臓の利用可能性である。このドナーマテリアルの不足は、ヒト胚性幹細胞の分化によってインビトロで機能的インスリン分泌細胞を生成することによって克服することができる 。幹細胞からのインビトロでの機能的インスリン分泌細胞の生成のためのプロトコルが継続的に開発されている（Ｐａｇｌｉｕｃａ Ｆ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，２０１４．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｈｕｍａｎ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ β Ｃｅｌｌｓ Ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｃｅｌｌ，１５９（２），ｐｐ．４２８－４３９、Ｒｅｚａｎｉａ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｒｅｖｅｒｓａｌ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｗｉｔｈ ｉｎｓｕｌｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３２（１１），ｐｐ．１２１１－１１３３）、ＷＯ２０１２／１７５６３３、ＷＯ２０１４／０３３３２２、ＷＯ２０１５／０２８６１４）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
これらのプロトコルは素晴らしいが、複数の細胞集団を生成し、これらの集団間の比はバッチ間で異なる。細胞を凍結保存するための大規模な方法は、移植前に各細胞バッチに関して品質管理研究を実施し、移植物流をさらに単純化することを可能にする。さらに、最終生成物の内分泌集団を濃縮するいずれの方法も移植有効性および安全性を改善すると考えられる。
【0004】
したがって、表現型および機能の改善を可能にするだけでなく、バッチ出荷研究が被験者にこれらの細胞を移植する前に実施されている間の細胞の貯蔵および維持を可能にする、幹細胞によってインビトロで得られる内分泌集団を濃縮および保存するための大規模方法に対するニーズがある。
【課題を解決するための手段】
【0005】
発明者らは、ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを共発現する内分泌細胞またはＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１を共発現する内分泌前駆細胞を解離、凍結保存および再凝集するステップを含む方法を見出し、これは以下を可能にする。
－ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを共発現する内分泌細胞により細胞凝集体を濃縮する。
－細胞凝集体中の非内分泌細胞（すなわち、ＮＫＸ６．１／Ｃ－ｐｅｐ／Ｇｌｕ陰性細胞）を減少させる。
－クラスターの不均一性およびクラスターの大きさを低減し、インビボでの変動を低減する。
－バッチ間の変動を低減および制御する。
－内分泌細胞および内分泌前駆細胞を貯蔵および維持する。
－バッチ試験を実施することができる、移植からの細胞製造の工程を分離する。
－ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを共発現する内分泌細胞により細胞凝集体を濃縮する。
－細胞凝集体中の非内分泌細胞（すなわち、ＮＫＸ６．１／Ｃ－ｐｅｐ／Ｇｌｕ陰性細胞）を減少させる。
－クラスターの不均一性およびクラスターの大きさを低減し、インビボでの変動を低減する。
－バッチ間の変動を低減および制御する。
－内分泌細胞および内分泌前駆細胞を貯蔵および維持する。
－バッチ試験を実施することができる、移植からの細胞製造の工程を分離する。
【0006】
本発明は、幹細胞からインビトロで誘導されたＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド共発現細胞凝集体を濃縮するための大規模方法を提供する。本方法は、ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを共発現するまたはＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１を共発現する内分泌細胞により幹細胞からインビトロで誘導される細胞凝集体を濃縮することを可能にする。
【0007】
本発明は、（ｉ）細胞凝集体を単一細胞に解離するステップ、および（ｉｉ）単一細胞を凍結保存するステップ、を含む幹細胞からインビトロで誘導される膵内分泌前駆細胞を凍結保存するための方法を提供する。本発明は、幹細胞からインビトロで誘導されるＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１を共発現する冷凍保存単一内分泌前駆細胞またはＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを共発現する単一内分泌細胞に対する方法に関する。
【0008】
本発明は、特にＩ型糖尿病の治療においてＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを共発現する凍結保存内分泌細胞および／またはＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１を共発現する内分泌前駆細胞ならびに冷凍保存後にさらに関する。
【0009】
本発明は、ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド共発現細胞を用いて濃縮された細胞凝集体中に凍結保存細胞を解凍しかつ再凝集することにさらに関する。
【0010】
本発明は、特にＩ型糖尿病の治療におけるＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを共発現する再凝集内分泌細胞またはＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１を共発現する内分泌前駆細胞の医学的使用にさらに関連する。
【0011】
本発明は、不均一性、クラスターの大きさおよびバッチ間変動を低減しつつ、ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド共発現細胞により幹細胞からインビトロで誘導された細胞凝集体を濃縮する方法に関する。
本発明はまた、例示的な実施形態の開示から明らかとなる、さらなる問題を解決することができる。
本発明はまた、例示的な実施形態の開示から明らかとなる、さらなる問題を解決することができる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】図１、プロセスの概要：ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド共発現細胞凝集体の濃縮 ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）は、公開されたプロトコル（ＷＯ２０１５／０２８６１４およびＷＯ２０１７／１４４６９５）を用いて、ＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１を共発現する内分泌前駆細胞またはＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを共発現する内分泌細胞にインビトロで分化されている。いずれの段階でも、細胞凝集体は酵素的消化または非酵素的消化を使用して解離される。解離後、細胞は、例えば、凍結保存媒体に細胞を浸漬して、－８０℃まで温度をゆっくり下げて、凍結された細胞を得ることによって、凍結保存される。これらの凍結保存細胞は迅速に解凍されて、ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを共発現する細胞に再凝集する。
【図2】図２、ＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１を共発現する内分泌前駆細胞の解離、凍結保存および再凝集：インビトロでの内分泌表現型への影響 Ａ）内分泌前駆段階での凍結保存、解凍および再凝集後の内分泌細胞の濃縮。 ｈＥＳＣは、ベータ様細胞に分化されて、内分泌細胞集団および非内分泌細胞集団の分布について分析された。各実験について、同じバッチからの細胞は、解離、凍結保存および再凝集ステップを用いない（対照）または用いるプロトコルを使用して分化された。 Ｂ）上方パネル：内分泌集団は、フローサイトメトリを使用してＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド共発現の存在によって測定される。結果は、対照と比較した％の変化として提示される。 下方パネル：非内分泌細胞の非濃縮は、解離、凍結保存および再凝集ステップを用いるプロトコルを使用して細胞が生成されたときの非内分泌マーカー：ＡＦＰ、ＧＨＲＬ、ＫＲＴ１８およびＫＲＴ８における転写減少によって示される。機能的内分泌細胞の濃縮は、解離、凍結保存および再凝集ステップを用いるプロトコルを使用して細胞が生成されたときの内分泌マーカー：ＧＩＰＲ、ＧＬＰ１ＲおよびＩＡＰＰにおける転写増加によって特徴付けられる。 Ｃ）解凍および再凝集後のサイズおよび不均一性の減少 左上パネルは、解離、凍結保存および再凝集ステップを用いないプロトコルを使用して生成される内分泌細胞凝集体を示す。 左下パネルは、解離、凍結保存および再凝集ステップを用いて生成された内分泌細胞凝集体を示す。 右上パネルおよび右下パネル（棒グラフ）は、は、Ｂｉｏｒｅｐ（登録商標）ｉｓｌｅｔ ｃｏｕｎｔｅｒを使用して測定されたクラスターサイズ分布を示す。
【図3】図３、ＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１を共発現する内分泌前駆細胞の解離、凍結保存および再凝集：インビボでの機能性 Ａ）非糖尿病マウスへの移植後に検証されたときに、内分泌前駆段階での凍結保存後に生成された内分泌細胞は分泌Ｃ－ペプチドを分泌する 同じバッチからのｈＥＳＣは、解離、凍結保存および再凝集ステップを用いずに（対照）または用いて分化されて、ならびに非糖尿病マウスの腎被膜下に移植され、または移植されなかった（対照）。移植片からのＣ－ペプチド分泌を誘発するために、急性インスリン抵抗性が、移植２週間後にインスリン受容体拮抗薬Ｓ９６１によって、または移植７週間後に経口ブドウ糖耐性試験によって誘発された。ヒトＣ－ペプチドは、チャレンジ６０分および１２０分または２０分および６０分後に測定された。解離、凍結保存および再凝集ステップを用いるプロトコルを使用して形成されるクラスターは、解離、凍結保存および再凝集ステップを用いないプロトコルを使用して生成されるものより高いレベルのＣ－ペプチドを分泌した。データは、平均±ＳＥＭとして提示してある。 Ｂ）細胞凝集体を発現するＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドの濃縮は、生体内での変動を低減する。 解離、凍結保存および再凝集ステップを用いるまたは用いないプロトコルを使用して生成される細胞を受ける動物について、Ｓ９６１チャレンジ中のＣ－ペプチドの倍増がプロットされた。解離、凍結保存および再凝集を用いるプロトコルを使用してＣ－ペプチド発現の有効性が改善され、動物間のばらつきが低減された。 Ｃ）ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド共発現細胞凝集体の濃縮は、移植後８週間の非内分泌細胞を除去し、インビボでより均質な移植片に誘導する。 移植８週間後にマウスは終了され、移植片付きの腎臓が採取されて、免疫細胞染色によって分析された。細胞がＣ－ペプチド、ＮＫＸ６．１およびグルカゴンについて染色された。白い矢印で示されているように、非内分泌細胞（ＮＫＸ６．１－／グルカゴン－／Ｃ－ペプチド－）の領域が、解離、凍結保存および再凝集ステップを用いずに生成される細胞を含む対照移植片内に存在していた（４個の移植片のうち４個）。これは、解離、凍結保存および再凝集ステップ（４個の移植片のうち０個）を用いるプロトコルを使用して生成される細胞を有する移植片に対しては観察されなかった。
【図4】図４、ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを共発現する内分泌細胞の解離、凍結保存および再凝集：インビトロでの内分泌細胞表現型への影響 Ａ）内分泌細胞段階での解離、凍結保存、解凍および再凝集後のＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを共発現する内分泌細胞の濃縮（すなわち、ＢＣ０３）。 ｈＥＳＣが、ベータ様細胞に分化されて、内分泌細胞集団および非内分泌細胞集団の分布について分析された。各実験について、同じバッチからの細胞は、解離、凍結保存および再凝集ステップを用いない（対照）または用いるプロトコルを使用して分化された。 右パネル：内分泌細胞集団は、フローサイトメトリを使用してＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド共発現の存在によって測定される。結果は、対照と比較した％の変化として提示される。 左パネル：非内分泌細胞の非濃縮は、解離、凍結保存および再凝集ステップを用いるプロトコルを使用して細胞が生成されたときの非内分泌マーカー：のＡＦＰ、ＧＨＲＬ、ＫＲＴ１８およびＫＲＴ８における転写減少によって示される。 Ｂ）解凍および再凝集後のサイズおよび不均一性の減少 左上パネルは、解離、凍結保存および再凝集ステップを用いないプロトコルを使用して生成される内分泌細胞凝集体を示す。 左下パネルは、解離、凍結保存および再凝集ステップを用いるプロトコルを使用して生成された内分泌細胞凝集体を示す。 右上および右下（棒グラフ）は、Ｂｉｏｒｅｐ（登録商標）ｉｓｌｅｔ ｃｏｕｎｔｅｒを使用して測定されたクラスターサイズ分布を示す。
【図5】図５、ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド共発現内分泌細胞凝集体の解離、凍結保存および再凝集：インビボでの機能性 Ａ）内分泌細胞段階において解離、凍結保存および再凝集される細胞（ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド共発現細胞（ＢＣ０３））は、糖尿病Ｓｃｉｄ－ｂｅｉｇｅマウスへの移植後に血糖を低下させる。 ｈＥＳＣは、解離、凍結保存および再凝集ステップを用いて分化され、糖尿病マウスの腎被膜の下に移植された。移植後に、血糖の急速な低下が観察される。 Ｂ）内分泌細胞段階における解離、凍結保存および再凝集される細胞（ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド共発現細胞（ＢＣ０３））は、糖尿病マウスへの移植後にＣ－ペプチドを分泌する。 移植２０日後の基礎ヒトＣ－ペプチド分泌は、血糖の低下がヒトＣ－ペプチド分泌と相関することを示す。 Ｃ）ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド発現細胞凝集体の濃縮は、移植１０週間後に非内分泌細胞を減少させる。 移植１０週間後にマウスは終了され、移植片付きの腎臓が採取されて、免疫細胞染色によって分析された。細胞がＣ－ペプチド、ＮＫＸ６．１およびグルカゴンについて染色された。白い矢印で示されているように、非内分泌細胞（ＮＫＸ６．１－／グルカゴン－／Ｃ－ペプチド－）の領域が、解離、凍結保存および再凝集ステップを用いないで生成された細胞を含む対照移植片に存在していた（１１個の移植片のうち９個）。これは、解離、凍結保存および再凝集ステップを用いるプロトコルを使用して生成される細胞を有する移植片については観察されなかった（３個の移植片のうち１個）。
【図6】図６、Ｃ－ペプチドの発現直前および発現後初期の内分泌細胞の解離、凍結保存および再凝集：グルコース応答性への効果。 Ａ）Ｃ－ペプチド発現前おおよび後の試験される分化時点およびグルコース応答性への効果の概要。 細胞分化中の異なる時点で凍結保存される細胞の解離、凍結保存および再凝集。細胞は、膵内胚葉段階（ＰＥ）、Ｃ－ペプチド発現の開始１日前（ＢＣ００）、Ｃ－ペプチド発現の開始２日後（ＢＣ０３）、Ｃ－ペプチド発現の開始５日後（ＢＣ０６）、およびＣ－ペプチド発現の開始８日後（ＢＣ０９）に凍結保存され、すべて同じ細胞のバッチからのものであった。細胞は、同じセットアップでＣ－ペプチド発現の開始１３日後（ＢＣ１４）の機能性について、解凍、分化および試験された。 Ｂ）Ｃ－ペプチド発現の開始約１日前および約１～８日後のタイムフレームにあるＢＣ００、ＢＣ０３、ＢＣ０６およびＢＣ０９に凍結保存された細胞の解離、凍結保存および再凝集によるＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド細胞の濃縮。 ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドの発現が、フローサイトメトリを使用してＢＣ１４に測定された。データは、解離、凍結保存および再凝集ステップを用いないプロトコルを使用して同じバッチからの細胞と比較して％で表される。結果は、ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド細胞の濃縮が、ＢＣ００およびＢＣ０３に凍結保存される細胞に対して最も効率的であることを示している。 Ｃ）細胞がＢＣ００、ＢＣ０３、ＢＣ０６およびＢＣ０９に凍結保存される場合の動的グルコース応答。 実験終了時に、機能性が動的灌流システムを使用して試験された。すべての細胞は、２０ｍＭのグルコースおよびエキセンジン－４を用いるチャレンジに対して応答したが、細胞が、ＢＣ００およびＢＣ０３に、すなわち、Ｃ－ペプチド発現の開始約１日前および２日後にそれぞれ凍結保存されたときに、最高の応答が観察された。
【発明を実施するための形態】
【0013】
最も広い意味で、本発明は、幹細胞からインビトロで誘導される膵内分泌細胞を濃縮および凍結保存する方法に関する。
【0014】
本発明は、幹細胞、すなわち胚性幹細胞またはヒト胚性幹細胞からインビトロで誘導されるＮＫＸ６．１およびＮＫＸ２．２またはＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド共発現細胞の内分泌細胞を濃縮する方法に関する。
【0015】
本発明は、幹細胞からインビトロで得られるＮＫＸ６．１およびＮＫＸ２．２を共発現する内分泌前駆細胞またはＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを共発現する内分泌細胞の解離、凍結保存および再凝集後に内分泌細胞を用いて細胞凝集体を濃縮する方法に関する。
【0016】
本発明は、幹細胞からインビトロで誘導される内分泌前駆細胞およびグルコース応答性インスリン分泌細胞を濃縮することにさらに関する。
【0017】
一態様では、内分泌細胞および非内分泌細胞を含む細胞集団からの分泌細胞の選択のための方法が本明細書で説明されている。
【0018】
さらなる態様では、本方法は、内分泌細胞生成を移植から分離することができる。例えば、これは、細胞を輸送すること、または品質および安全性試験を実行して、移植前にバッチ間ばらつきを制御することができる。特に、本明細書に記載されている方法によって得られる凍結保存膵内分泌細胞は、製造のステップと移植のステップとの間に貯蔵することができ、実行される純度試験（例えば、フローサイトメトリによる）および／または機能性試験（例えば、静的ＧＳＩＳの灌流による）を実行するためのサンプルを収集および解凍することができる。
【0019】
さらなる態様では、本方法は、ヒト被験者での移植で使用するための、および糖尿病の治療に使用するためのＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを共発現する均質な凍結保存もしくは再凝集内分泌細胞またはＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１を共発現する内分泌前駆細胞を得ることができる。
【0020】
一態様では、幹細胞からインビトロで誘導される膵内分泌細胞凝集体を凍結保存する方法であって、
（ｉ）前記内分泌細胞凝集体を単一細胞に解離するステップと、
（ｉｉ）凍結保存媒体を用いて前記単一細胞を処理し、温度を、例えば、少なくとも－８０℃に低下させて、凍結保存単一細胞を得るステップと、を含む方法が記載されている。
（ｉ）前記内分泌細胞凝集体を単一細胞に解離するステップと、
（ｉｉ）凍結保存媒体を用いて前記単一細胞を処理し、温度を、例えば、少なくとも－８０℃に低下させて、凍結保存単一細胞を得るステップと、を含む方法が記載されている。
【0021】
さらなる態様では、本発明は、幹細胞からインビトロで誘導されるＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド共発現細胞凝集体を濃縮する方法であって、
（ｉ）細胞凝集体を単一細胞に解離するステップと、
（ｉｉ）凍結保存媒体を用いて単一細胞を処理し、温度を、例えば、－８０℃に低下させて、凍結保存単一細胞を得るステップと、
（ｉｉｉ）凍結保存細胞を解凍するステップと、
（ｉｖ）解凍および再凝集後に得られる細胞は、ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド発現細胞について濃縮されるステップと、を含む方法に関する。
（ｉ）細胞凝集体を単一細胞に解離するステップと、
（ｉｉ）凍結保存媒体を用いて単一細胞を処理し、温度を、例えば、－８０℃に低下させて、凍結保存単一細胞を得るステップと、
（ｉｉｉ）凍結保存細胞を解凍するステップと、
（ｉｖ）解凍および再凝集後に得られる細胞は、ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド発現細胞について濃縮されるステップと、を含む方法に関する。
【0022】
一態様では、本方法は、ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを共発現する内分泌細胞またはＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１を共発現する内分泌前駆細胞凝集体を用いて幹細胞からインビトロで誘導される内分泌細胞凝集体を濃縮する方法であって、
（ｉ）前記内分泌細胞凝集体を単一細胞に解離するステップと、
（ｉｉ）凍結保存媒体を用いて前記単一細胞を処理し、温度を、例えば、少なくとも－８０℃まで低下させて、凍結保存単一細胞を得ることによって、前記単一細胞を凍結保存するステップと、
（ｉｉｉ）前記凍結保存内分泌細胞を解凍するステップと、
（ｉｖ）解凍後に得られる前記内分泌細胞を再凝集するステップと、を含む方法に関する。
（ｉ）前記内分泌細胞凝集体を単一細胞に解離するステップと、
（ｉｉ）凍結保存媒体を用いて前記単一細胞を処理し、温度を、例えば、少なくとも－８０℃まで低下させて、凍結保存単一細胞を得ることによって、前記単一細胞を凍結保存するステップと、
（ｉｉｉ）前記凍結保存内分泌細胞を解凍するステップと、
（ｉｖ）解凍後に得られる前記内分泌細胞を再凝集するステップと、を含む方法に関する。
【0023】
特定の実施形態では、本明細書に記載されている方法のステップ（ｉ）の前記内分泌細胞は、ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを共発現する内分泌細胞またはＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１を共発現する内分泌前駆細胞である。好ましい実施形態では、前記ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを共発現する内分泌細胞は、Ｃ－ペプチド発現が最大７日間、最大６日間、最大５日間、最大４日間、最大３日間または最大２日間、優先的に最大２日間開始される内分泌細胞である。
【0024】
好ましい実施形態では、ステップ（ｉ）の内分泌細胞は、ＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１を共発現する内分泌前駆細胞凝集体であり、前記方法は、前記ＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１を共発現する内分泌前駆細胞をＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを共発現する内分泌細胞凝集体に分化させるステップ（ｖ）をさらに含む。
【0025】
特に、解離ステップ（１）は、凍結保存に対する耐性が小さいように見える単一非内分泌細胞として、内分泌細胞を用いる細胞凝集体を濃縮することができる。さらに、本方法は、クラスター不均一性およびクラスターサイズを低減させることによってインビボ性能におけるばらつきを低減することができる。
【0026】
本発明の別の目的は、ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを共発現する内分泌細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％を含む再凝集内分泌細胞（すなわち、解離、凍結保存および再凝集に続いて得られる細胞凝集体）である。
【0027】
再凝集細胞の細胞集団は、ＦＡＣＳなどの技術を使用して、マーカーＮＫＫ２．２、ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを検出することによって当業者に知られている技術で検出および測定され得る。
【0028】
本明細書で使用される場合、「内分泌細胞」または「膵内分泌細胞」は、本明細書では、「ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド共発現細胞」または「ＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１共発現細胞」、またはＣ－ペプチドの発現の開始３日前から最大開始７日後までに選択される内分泌細胞を意味する。有利なことに、本明細書に記載されている内分泌細胞は、Ｃ－ペプチドの発現の開始２日前から最大５日後までに、またはＣ－ペプチドの発現の開始１日前から最大２日後までに取られたものである。
【0029】
本明細書で使用される場合、「ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド共発現細胞または細胞凝集体」は、内分泌細胞を分泌するグルコース応答性インスリン、または最大７日間、最大６日間、最大５日間、最大４日間、最大３日間または最大２日間、優先的に最大２日間、Ｃ－ペプチドの発現を開始した内分泌細胞を意味する。
【0030】
「グルコース応答性インスリン分泌細胞」または「ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを共発現する細胞」は、小さい細胞クラスター、または膵臓内のランゲルハンス島と呼ばれる細胞凝集体内に存在する細胞を意味する。ベータ細胞は、ペプチドホルモンインスリンを分泌することによって高血糖値に応答し、他の組織に作用して、例えば、グリコーゲン合成によるエネルギー貯蔵を促進する肝臓内で、血液からのグルコース取り込みを促進する。本明細書で使用される場合、「細胞凝集体」は、内分泌細胞の解離、凍結保存および再凝集後に得られる膵島様細胞凝集体を意味する。本明細書で使用される場合、「ＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１共発現細胞」は、ＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１を共発現する内分泌前駆細胞を意味するが、Ｃ－ペプチドまたはインスリンを発現しない。有利なことに、「ＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１共発現細胞」は、Ｃ－ペプチド発現前最大３日で、優先的にＣ－ペプチド発現前最大２日で、より優先的にＣ－ペプチド発現前最大１日で取られた細胞を意味する。
【0031】
本明細書で使用される場合、「ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド共発現細胞または細胞凝集体」は、内分泌細胞を分泌するグルコース応答性インスリン、または、最大７日間、最大６日間、最大５日間、最大４日間、最大３日間または最大２日間、優先的に最大２日間、Ｃ－ペプチドの発現を開始した内分泌細胞を意味する。
【0032】
一態様では、ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドまたはＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１を共発現する細胞を含む細胞集団が体細胞集団から得られる。
【0033】
別の態様では、体細胞集団は、胚様幹（ＥＳ、例えば、多能性）細胞に非分化するように誘発された。かかる非分化細胞はまた、誘発多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）と呼ばれる。
【0034】
一実施形態では、細胞凝集体は酵素または非酵素試薬によって解離される。
【0035】
本明細書で使用される場合、「酵素」は、幹細胞からインビトロで誘導される内分泌細胞凝集体を解離するために適切な酵素を意味する。
【0036】
好ましい実施形態では、酵素または酵素混合物は、プロテアーゼ、プロテアーゼ混合物、トリプシン、コラゲナーゼおよびエラスターゼまたはそれらの混合物からなる群から選択される。優先的に、本方法の酵素は酵素混合物から選択され、優先的に、酵素混合物はアクターゼである。
【0037】
好ましい実施形態では、細胞凝集体は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）またはエチレングリコール－ビス（β－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）などの非酵素試薬により解離され、優先的に非酵素試薬はＥＤＴＡである。
【0038】
さらなる態様では、ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドまたはＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１を共発現する内分泌細胞を含む細胞集団は、胚性幹（ＥＳ、例えば、多能性）細胞から得られる。いくつかの態様では、ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドまたはＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１を共発現する内分泌細胞を含む細胞集団は、ＥＳ様細胞などの多能性細胞である。
【0039】
さらなる態様では、ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドまたはＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１を含む細胞集団は、胚性幹（ＥＳまたは多能性）細胞から、優先的にヒト胚性幹細胞から分化される。
【0040】
さらなる態様では、細胞集団は幹細胞の集団である。いくつかの態様では、細胞集団は、内分泌前駆体系列に対して分化される幹細胞の集団である。いくつかの態様では、細胞集団は、グルコース応答性インスリン分泌細胞に対して分化される幹細胞の集団である。
【0041】
幹細胞を内分泌前駆細胞およびグルコース応答性インスリン分泌細胞に分化するプロトコルの分化は当該技術分野において周知である（それぞれＷＯ２０１５／０２８６１４およびＷＯ２０１７／１４４６９５）。
【0042】
本発明の一目的は、内分泌細胞凝集体を解離することから得られるＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１を共発現するまたはＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを共発現する凍結保存単一細胞である。さらなる態様では、本発明は、
（ｉ）膵内分泌細胞凝集体を単一細胞に解離するステップと、
（ｉｉ）前記単一細胞を凍結保存媒体を用いて処理し、温度を、例えば、少なくとも－８０℃に低下させて、凍結保存単一細胞を得るステップと、を含む方法に従って得られる凍結保存膵内分泌細胞に関する。
（ｉ）膵内分泌細胞凝集体を単一細胞に解離するステップと、
（ｉｉ）前記単一細胞を凍結保存媒体を用いて処理し、温度を、例えば、少なくとも－８０℃に低下させて、凍結保存単一細胞を得るステップと、を含む方法に従って得られる凍結保存膵内分泌細胞に関する。
【0043】
本明細書で使用される場合、「温度を低下させて、凍結保存内分泌細胞を得ること」は、特定の時間の期間かなり低い温度、すなわち、－７０℃～－１９６℃、優先的に少なくとも－８０℃に細胞を冷却して、対象の内分泌単一細胞を損傷させる可能性のあるいずれの酵素活性または化学的活性も防ぐステップを意味する。
【0044】
一実施形態では、ステップ（ｉｉ）の温度は、－７０℃～－１９６℃、－８０℃～－１６０℃、または－８０℃～－１２０℃であり、優先的にステップ（ｉｉ）の温度は少なくとも－８０℃である。一実施形態では、温度は、一段階でまたは段階的に低下されて、凍結保存細胞を得、優先的に温度は一段階で下げられる。
【0045】
本明細書で使用される場合、「凍結保存細胞」または「凍結保存単一細胞」は、細胞凝集体が単一細胞に解離され、凍結保存媒体を用いて処理され、温度をかなり低い温度、例えば－７０℃～－１９６℃に低下させることにより冷凍保存された後に得られる細胞を意味する。
【0046】
本明細書で使用される場合、「凍結保存媒体」は、凍結保存ステップ中に内分泌細胞または内分泌前駆細胞の完全性を維持するのに適した媒体を意味する。ほとんどの凍結保存媒体は、ＤＭＳＯ、血清または合成血清代替物を含み、例えば、炭酸水素ナトリウムのＨＥＰＥＳを使用してｐＨについて緩衝される。
【0047】
一実施形態では、凍結保存媒体は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、血清、合成血清代替物またはグリセロールから選択される化合物を含む。
【0048】
本発明によれば、本明細書に記載されている凍結保存細胞は、少なくとも１時間、少なくとも１日、少なくとも１週間、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも１年、またはこの範囲で提供される任意の時間の間の任意の時間期間の間貯蔵され得る。
【0049】
一実施形態では、本明細書に記載されている凍結保存細胞または再凝集内分泌細胞は、糖尿病の治療に、例えば、このような治療を必要とする患者への移植により使用されてもよい。
【0050】
幹細胞は、単一細胞レベルで自己再生および分化の両方を行うそれらの能力によって規定されて、自己再生前駆体、非再生前駆体、および終末分化細胞を含む子孫細胞を生成する、未分化細胞である。幹細胞はまた、複数の胚葉（内胚葉、中胚葉および外胚葉）から様々な細胞系列の機能細胞にインビトロで分化し、かつ移植に続いて複数の胚葉の組織を生じさせるそれらの能力によって特徴付けられる。
【0051】
幹細胞は、（１）すべての胚性細胞タイプおよび胚体外細胞タイプを生じさせ得る意味の全能性、（２）すべての胚性細胞型を生じさせ得る意味の多能性、（３）細胞系列のサブセットを、特定の組織、器官または生理系（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＨＳＣ（自己再生）、血球制限少能性前駆体、および血液の通常の成分であるすべての細胞タイプおよび要素（例えば、血小板）を含む子孫を生成し得る）内のすべてを生じさせ得る意味の多能性、（４）多能性幹細胞に比べてより制限された細胞系列のサブセットを生じさせ得る意味の小能性、ならびに（５）単一細胞系統（例えば、精子形成幹細胞）を生じさせ得る意味の単能性として、それらの発達的潜在能力により分類されている。
【0052】
本明細書で使用される場合、「分化する」または「分化」は、未分化状態から分化状態に、または未成熟状態から未成熟さが少ない状態に、または未成熟状態から成熟状態に細胞が進行するプロセスを意味する。例えば、初期の未分化胚性膵細胞は、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１およびＰＴＦ１ａなどの特性マーカーを増殖および発現することができる。成熟または分化膵細胞は増殖せず、高レベルの膵内分泌ホルモンまたは消化酵素を分泌し、例えば、完全に分化されたベータ細胞は、グルコースに応答してインスリンを高レベルで分泌する。細胞相互作用および成熟における変化は、細胞が未分化細胞のマーカーを失うまたは分化細胞のマーカーを得るときに生じる。単一マーカーの損失または獲得は、細胞が「成熟または完全に分化」されたことを示し得る。「分化因子」という用語は、ベータ細胞を産生するインスリンも含む成熟内分泌細胞へのそれらの分化を促進するために膵細胞に添加される化合物を意味する。例示的な分化因子としては、肝細胞成長因子、ケラチノサイト成長因子、エキセンジン－４、塩基性線維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子－１、神経成長因子、上皮成長因子、血小板由来成長因子、およびグルカゴン様ペプチド１が挙げられる。一部の態様では、細胞の分化は、１つ以上の分化因子を含む培地において細胞を培養することを含む。
【0053】
成熟または分化膵細胞は増殖せず、高レベルの膵内分泌ホルモンまたは消化酵素を分泌し、例えば、完全に分化されたベータ－細胞は、グルコースに応答して高レベルでインスリンを分泌する。細胞相互作用および成熟における変化は、細胞が未分化細胞のマーカーを失うまたは分化細胞のマーカーを得るときに生じる。単一マーカーの損失または獲得は、細胞が「成熟または完全に分化」されたことを示し得る。
【0054】
「分化因子」という用語は、ＥＰ細胞に対するそれらの分化を促進するためにＥＳ細胞または膵前駆体細胞に添加される化合物を意味する。分化因子はまた、成熟ベータ細胞へのさらなる分化を促進してもよい。
【0055】
例示的な分化因子としては、肝細胞成長因子、ケラチノサイト成長因子、エキセンジン－４、塩基性線維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子－１、神経成長因子、上皮成長因子、血小板由来成長因子、グルカゴン様ペプチド１、インドラクタムＶ、ＩＤＥ１および２ならびにレチノイン酸が挙げられる。
【0056】
一部の態様では、細胞の分化は、１つ以上の分化因子を含む培地において細胞を培養することを含む。
【0057】
一実施形態では、本発明は、少なくとも１つの膵ホルモンの産生が欠損している哺乳動物に膵内分泌機能を提供する方法であって、前記哺乳動物において前記少なくとも１つの膵ホルモンの測定可能量を得るのに十分な量で本発明の方法のいずれかによって得られる内分泌細胞を移植するステップを含む、方法に関する。
【0058】
本明細書で使用される場合、「ヒト多能性幹（ｈＰＳ）細胞」という用語は、任意の源から誘導されてもよく、適切な条件下で、３つの胚葉（内胚葉、中胚葉および外胚葉）のすべての誘導体である異なる細胞タイプのヒト子孫を産生することができる細胞を意味する。ｈＰＳ細胞は、８～１２週間の年老いたＳＣＩＤマウスに奇形腫を形成する能力、および／または組織培養における３つの胚葉すべての識別可能な細胞を形成する能力を有する。ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞としてしばしば示される文献内のヒト胚盤胞由来幹（ｈＢＳ）細胞を含む種々のタイプの胚性細胞はヒト多能性幹細胞の定義に含まれる。
【0059】
一態様では、幹細胞からインビトロで誘導された膵内分泌細胞凝集体を凍結保存する方法であって、
（ｉ）前記内分泌細胞凝集体を単一細胞に解離するステップと、
（ｉｉ）前記単一細胞を凍結保存するステップと、を含み、
前記内分泌細胞は、ＮＫＸ６．１およびＮＫＸ２．２を共発現する内分泌前駆細胞またはＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを共発現する内分泌細胞であり、Ｃ－ペプチド発現は、最大７日間、最大６日間、最大５日間、最大４日間、最大３日間または最大２日間、優先的に最大２日間開始された方法が、本明細書に記載されている。
（ｉ）前記内分泌細胞凝集体を単一細胞に解離するステップと、
（ｉｉ）前記単一細胞を凍結保存するステップと、を含み、
前記内分泌細胞は、ＮＫＸ６．１およびＮＫＸ２．２を共発現する内分泌前駆細胞またはＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを共発現する内分泌細胞であり、Ｃ－ペプチド発現は、最大７日間、最大６日間、最大５日間、最大４日間、最大３日間または最大２日間、優先的に最大２日間開始された方法が、本明細書に記載されている。
【0060】
別の態様では、幹細胞からインビトロで誘導されるＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを共発現する内分泌細胞またはＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１を共発現する内分泌前駆細胞を用いて細胞凝集体を濃縮する方法であって、
（ｉ）前記細胞凝集体を単一細胞に解離するステップと、
（ｉｉ）前記単一細胞を凍結保存するステップと、
（ｉｉｉ）凍結保存細胞を解凍するステップと、
（ｉｖ）解凍および再凝集後に得られる細胞は、ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド発現細胞について濃縮されるステップと、を含み、
前記内分泌細胞は、ＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１を共発現する内分泌前駆細胞またはＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを共発現する内分泌細胞であり、内分泌Ｃ－ペプチド発現は、最大７日間、最大６日間、最大５日間、最大４日間、最大３日間、最大２日間、優先的に最大２日間開始された方法が、本明細書に記載されている。
（ｉ）前記細胞凝集体を単一細胞に解離するステップと、
（ｉｉ）前記単一細胞を凍結保存するステップと、
（ｉｉｉ）凍結保存細胞を解凍するステップと、
（ｉｖ）解凍および再凝集後に得られる細胞は、ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド発現細胞について濃縮されるステップと、を含み、
前記内分泌細胞は、ＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１を共発現する内分泌前駆細胞またはＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを共発現する内分泌細胞であり、内分泌Ｃ－ペプチド発現は、最大７日間、最大６日間、最大５日間、最大４日間、最大３日間、最大２日間、優先的に最大２日間開始された方法が、本明細書に記載されている。
【0061】
一態様では、本発明の方法によって得られたＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドまたはＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１を共発現する再凝集内分泌細胞が本明細書に記載されている。
【0062】
一態様では、ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを共発現する内分泌細胞ならびに／またはＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１を共発現する内分泌前駆細胞の少なくとも５０％を含む再凝集内分泌細胞が本明細書に記載されている。
【0063】
一実施形態では、ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを共発現する内分泌細胞またはＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１を共発現する内分泌前駆細胞の少なくとも６０％を含む再凝集内分泌細胞が本明細書に記載されている。
【0064】
一実施形態では、ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを共発現する内分泌細胞またはＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１を共発現する内分泌前駆細胞の少なくとも７０％を含む再凝集内分泌細胞が本明細書に記載されている。
【0065】
一実施形態では、ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを共発現する内分泌細胞またはＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１を共発現する内分泌前駆細胞の少なくとも８０％を含む再凝集内分泌細胞が本明細書に記載されている。
【0066】
一態様では、本明細書に記載されている再凝集内分泌細胞は薬剤として使用される。
【0067】
一態様では、本明細書に記載されている再凝集内分泌細胞は糖尿病を治療するのに使用される。
【0068】
さらに、本明細書に記載されているＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを共発現するまたはＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１を共発現する再凝集内分泌細胞を含む組成物は糖尿病を治療するのに使用される。
【0069】
さらなる態様において、本明細書による内分泌細胞を用いて濃縮される細胞凝集体を含む薬剤が本明細書に記載されている。好ましい実施形態では、本明細書に記載されている薬剤は、本明細書に記載されているＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを共発現するおよび／またはＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１を共発現する再凝集内分泌細胞を含む。
【0070】
さらなる態様において、凍結予約内分泌細胞、または再凝集内分泌細胞、または再凝集内分泌細胞を含む組成物、または細胞凝集体、または本明細書に記載されている薬剤を含む装置が本明細書に記載されている。
【0071】
本明細書に記載されている様々な方法および他の実施形態は、様々なソースからのｈＰＳ細胞を必要としてもまたは利用してもよい。例えば、使用に適したｈＰＳ細胞は、発生中の胚から得られてもよい。追加的にまたは代替的に、適切なｈＰＳ細胞は、確立された細胞株および／またはヒト誘発多能性幹（ｈｉＰＳ）細胞から得られてもよい。
【0072】
本明細書で使用される場合、「ｈｉＰＳ細胞」という用語はヒト誘発多能性幹細胞を意味する。
【0073】
本明細書で使用される場合、「胚盤胞由来幹細胞」という用語はＢＳ細胞を表し、ヒト形態は「ｈＢＳ細胞」と呼ばれる。文献では、このような細胞はしばしば、胚性幹細胞、より具体的には、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）と呼ばれる。したがって、本発明で同様に使用される多能性幹細胞は、例えば、ＷＯ０３／０５５９９２およびＷＯ２００７／０４２２２５に記載されているように、胚盤胞から調製される胚性幹細胞、または市販のｈＢＳ細胞もしくは細胞株であり得る。しかしながら、例えば、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧおよびＬＩＮ２８などの特定の転写因子を用いて成人細胞を処理することなどにより、多能性細胞に対して再プログラムされる分化成人細胞を含む、任意のヒト多能性幹細胞が本発明で同様に使用され得ることがさらに想定される。
【0074】
本明細書で使用される場合、細胞の「生存性」または「生存細胞」は、凍結保存、解凍および／または再凝集された後の正常な成長および発達の能力を意味する。１つの態様では、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％の再凝集内分泌細胞が生存可能である。
【0075】
本発明はまた、例示的な実施形態の開示により明らかとなるさらなる課題を解決することができる。
【0076】
別段本明細書に示されない限り、単数形で提示される用語はまた、複数の状況も含む。
【0077】
本明細書に引用された刊行物、特許出願、および特許を含む全ての参考文献はこれにより、あたかも各参考文献が個別におよび具体的に参照により組み込まれることが示され、その全体が本明細書に示されるのと同程度に、その全体が参照により組み込まれる（法律によって許容される最大範囲まで）。
【0078】
すべての見出しおよび小見出しは、本明細書では便宜上使用されているだけであり、決して本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
【0079】
本明細書で提示する任意のおよびいっさいの例または例示的な語句（例えば「など（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、単に本発明をより明瞭にするという意図しかなく、特に明記しない限り、本発明の範囲を制限するものではない。本明細書中のいずれの語句も、特許の範囲にない任意の要素が本発明の実施に必須であることを示すと解釈すべきではない。
【0080】
本発明のある特定の特徴を本明細書において例示および説明してきたが、数多くの修正、置換、変更および均等物が当業者には思い浮かぶであろう。したがって、添付の特許請求の範囲が、本発明の真の趣旨の範囲内にあるそのようなすべての修正および変更を網羅することを意図していることが理解されるべきである。
【0081】
発明の実施形態：
実施形態１：幹細胞からインビトロで誘導されたＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド共発現細胞凝集体を濃縮する方法であって、
（ｉ）細胞凝集体を単一細胞に解離するステップと、
（ｉｉ）凍結保存媒体を用いて単一細胞を処理し、温度を、例えば、－８０℃まで低下させて、凍結保存単一細胞を得るステップと、
（ｉｉｉ）凍結保存細胞を解凍するステップと、
（ｉｖ）解凍および再凝集後に得られる細胞は、ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド共発現細胞について濃縮されるステップと、を含む、方法。
実施形態１：幹細胞からインビトロで誘導されたＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド共発現細胞凝集体を濃縮する方法であって、
（ｉ）細胞凝集体を単一細胞に解離するステップと、
（ｉｉ）凍結保存媒体を用いて単一細胞を処理し、温度を、例えば、－８０℃まで低下させて、凍結保存単一細胞を得るステップと、
（ｉｉｉ）凍結保存細胞を解凍するステップと、
（ｉｖ）解凍および再凝集後に得られる細胞は、ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド共発現細胞について濃縮されるステップと、を含む、方法。
【0082】
実施形態２：ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド共発現細胞凝集体は内分泌細胞前駆体細胞またはグルコース応答性インスリン分泌細胞であり、前記ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド発現細胞凝集体は、最大７日間、最大６日間、最大５日間、最大４日間、最大３日間、最大２日間、優先的に最大２日間、Ｃ－ペプチドを発現した内分泌細胞である、実施形態１に記載の方法。
【0083】
実施形態３：内分泌前駆細胞がＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１を共発現する、実施形態２に記載の方法。
【0084】
実施形態４：幹細胞が誘発された多能性幹細胞である、実施形態１～３のいずれか１つに記載の方法。
【0085】
実施形態５：幹細胞が胚性幹細胞である、実施形態１～３のいずれか１つに記載の方法。
【0086】
実施形態６：幹細胞がヒト胚性幹細胞である、実施形態１～３のいずれか１つに記載の方法。
【0087】
実施形態７：ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド発現細胞が、成体型内胚葉に分化された幹細胞からインビトロで誘導された、実施形態１～６のいずれか１つに記載の方法。
【0088】
実施形態８：ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド発現細胞が、膵内胚葉に分化された幹細胞からインビトロで誘導された、実施形態１～６のいずれか１つに記載の方法。
【0089】
実施形態９：ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド発現細胞が、内分泌前駆細胞に分化された幹細胞からインビトロで誘導された、実施形態１～６のいずれか１つに記載の方法。
【0090】
実施形態１０：ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド発現細胞が、ＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１を発現する内分泌前駆細胞に分化された幹細胞からインビトロで誘導される、実施形態１～６のいずれか１つに記載の方法。
【0091】
実施形態１１：ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド発現細胞が、グルコース応答性インスリン分泌細胞に分化された幹細胞からインビトロで誘導される、実施形態１～６のいずれか１つに記載の方法。
【0092】
実施形態１２：ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド発現細胞凝集体が酵素により解離される、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の方法。
【0093】
実施形態１３：ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド発現細胞凝集体が、プロテアーゼまたはプロテアーゼ混合物からなる群から選択される酵素により解離される、実施形態１２に記載の方法。
【0094】
実施形態１４：ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド発現細胞凝集体が、トリプシン、コラゲナーゼおよびエラスターゼまたはそれらの混合物からなる群から選択される酵素により解離される、実施形態１２に記載の方法。
【0095】
実施形態１５：ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド発現細胞凝集体がアクターゼ酵素により解離される、実施形態１２に記載の方法。
【0096】
実施形態１６：アクターゼはプロテアーゼおよびコラゲナーゼの混合物である、実施形態１５に記載の方法。
【0097】
実施形態１７：ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド発現細胞凝集体が非酵素試薬により解離される、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の方法。
【0098】
実施形態１８：ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド発現細胞凝集体が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）またはエチレングリコール－ビス（β－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）などの非酵素試薬により解離される、実施形態１７に記載の方法。
【0099】
実施形態１９：凍結保存媒体が凍結保護剤を有する、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。
【0100】
実施形態２０：凍結保護剤がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である、実施形態１９に記載の方法。
【0101】
実施形態２１：凍結保存媒体が凍結保護剤を有しない、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。
【0102】
実施形態２２：凍結保存媒体を用いる単一細胞の処理後に、温度が、凍結保存細胞を得るように一段階で、－７０℃～－１９６℃、－８０℃～－１６０℃、または－８０℃～－１２０℃、または－８０℃に低下される、実施形態１～２１のいずれか１つに記載の方法。
【0103】
実施形態２３：凍結保存媒体を用いる単一細胞の処理後に、温度が、凍結保存細胞を得るように段階的に、－７０℃～－１９６℃、－８０℃～－１６０℃、または－８０℃～－１２０℃、または－８０℃に低下される、実施形態１～２１のいずれか１つに記載の方法。
【0104】
実施形態２４：凍結保存媒体を用いる単一細胞の処理後に、温度が、凍結保存細胞を得るように一段階で－８０℃に低下される、実施形態１～２１のいずれか１つに記載の方法。
【0105】
実施形態２５：実施形態１のステップ（ｉ）および（ｉｉ）によって得られる凍結保存細胞がＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１を共発現する、実施形態１～２４のいずれか１つに記載の方法。
【0106】
実施形態２６：実施形態１のステップ（ｉ）および（ｉｉ）によって得られる凍結保存細胞の少なくとも２０％がＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１を発現する、実施形態１～２４のいずれか１つに記載の方法。
【0107】
実施形態２７：実施形態１のステップ（ｉ）および（ｉｉ）によって得られる凍結保存細胞の少なくとも４０％がＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１を発現する、実施形態１～２４のいずれか１つに記載の方法。
【0108】
実施形態２８：実施形態１のステップ（ｉ）および（ｉｉ）によって得られる凍結保存細胞の少なくとも６０％がＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１を発現する、実施形態１～２４のいずれか１つに記載の方法。
【0109】
実施形態２９：実施形態１のステップ（ｉ）および（ｉｉ）によって得られる凍結保存細胞の少なくとも８０％がＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１を発現する、実施形態１～２４のいずれか１つに記載の方法。
【0110】
実施形態３０：凍結保存媒体がＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを共発現する、実施形態１～２４のいずれか１つに記載の方法。
【0111】
実施形態３１：実施形態１のステップ（ｉ）および（ｉｉ）によって得られる凍結保存細胞の少なくとも２０％がＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを発現する、実施形態１～２４のいずれか１つに記載の方法。
【0112】
実施形態３２：実施形態１のステップ（ｉ）および（ｉｉ）によって得られる凍結保存細胞の少なくとも４０％または５０％がＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを発現する、実施形態１～２４のいずれか１つに記載の方法。
【0113】
実施形態３３：実施形態１のステップ（ｉ）および（ｉｉ）によって得られる凍結保存細胞の少なくとも６０％または７０％がＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを発現する、実施形態１～２４のいずれか１つに記載の方法。
【0114】
実施形態３４：実施形態１のステップ（ｉ）および（ｉｉ）によって得られる凍結保存細胞の少なくとも８０％がＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを発現する、実施形態１～２４のいずれか１つに記載の方法。
【0115】
実施形態３５：凍結保存細胞は生存可能である、実施形態１～３４のいずれか１つに記載の方法。
【0116】
実施形態３６：実施形態１のステップ（ｉ）および（ｉｉ）によって得られる凍結保存細胞の少なくとも２０％が生存可能である、実施形態１～３４のいずれか１つに記載の方法。
【0117】
実施形態３７：実施形態１のステップ（ｉ）および（ｉｉ）によって得られる凍結保存細胞の少なくとも４０％が生存可能である、実施形態１～３４のいずれか１つに記載の方法。
【0118】
実施形態３８：実施形態１のステップ（ｉ）および（ｉｉ）によって得られる凍結保存細胞の少なくとも６０％が生存可能である、実施形態１～３４のいずれか１つに記載の方法。
【0119】
実施形態３９：実施形態１のステップ（ｉ）および（ｉｉ）によって得られる凍結保存細胞の少なくとも８０％が生存可能である、実施形態１～３４のいずれか１つに記載の方法。
【0120】
実施形態４０：実施形態１～３９のいずれか１つに記載の方法のステップ（ｉ）および（ｉｉ）によって得られる凍結保存細胞。
【0121】
実施形態４１：実施形態１～３９のいずれか１つに記載の方法のステップ（ｉ）および（ｉｉ）によって得られる凍結保存細胞は、少なくとも７日間、優先的に少なくとも１４日間貯蔵される。
【0122】
実施形態４２：実施形態１～３９のいずれか１つに記載の方法のステップ（ｉ）および（ｉｉ）によって得られる凍結保存細胞は、少なくとも２１日間貯蔵される。
【0123】
実施形態４３：実施形態１～３９のいずれか１つに記載の方法のステップ（ｉ）および（ｉｉ）によって得られる凍結保存細胞は、少なくとも１ヶ月間貯蔵される。
【0124】
実施形態４４：実施形態１～３９のいずれか１つに記載の方法のステップ（ｉ）および（ｉｉ）によって得られる凍結保存細胞は、少なくとも２ヶ月間貯蔵される。
【0125】
実施形態４５：実施形態１～３９のいずれか１つに記載の方法のステップ（ｉ）および（ｉｉ）によって得られる凍結保存細胞は、少なくとも３ヶ月間貯蔵される。
【0126】
実施形態４６：実施形態１～３９のいずれか１つに記載の方法のステップ（ｉ）および（ｉｉ）によって得られる凍結保存細胞は、少なくとも１年間貯蔵される。
【0127】
実施形態４７：さらなる分化についての使用のための、実施形態１～３９のいずれか１つに記載の方法のステップ（ｉ）および（ｉｉ）によって得られる凍結保存細胞。
【0128】
実施形態４８：封入についての使用のための、実施形態１～３９のいずれか１つに記載の方法のステップ（ｉ）および（ｉｉ）によって得られる凍結保存細胞。
【0129】
実施形態４９：装置への封入についての使用のための、実施形態１～３９のいずれか１つに記載の方法のステップ（ｉ）および（ｉｉ）によって得られる凍結保存細胞。
【0130】
実施形態５０：被験者への移植についての使用のための、実施形態１～３９のいずれか１つに記載の方法のステップ（ｉ）および（ｉｉ）によって得られる凍結保存細胞。
【0131】
実施形態５１：哺乳動物への移植についての使用のための、実施形態１～３９のいずれか１つに記載の方法のステップ（ｉ）および（ｉｉ）によって得られる凍結保存細胞。
【0132】
実施形態５２：ヒトへの移植についての使用のための、実施形態１～３９のいずれか１つに記載の方法のステップ（ｉ）および（ｉｉ）により得られる凍結保存細胞。
【0133】
実施形態５３：凍結保存細胞がＲｏｃｋ阻害剤の存在下で解凍される、実施形態１～３９のいずれか１つに記載の方法。
【0134】
実施形態５４：凍結保存細胞が１０μＭのＲｏｃｋ阻害剤の存在下で解凍される、実施形態５３に記載の方法。
【0135】
実施形態５５：凍結保存細胞がＲｏｃｋ阻害剤の非存在下で解凍される、実施形態１～３９のいずれか１つに記載の方法。
【0136】
実施形態５６：解凍後に得られる細胞が再凝集される、実施形態１～３９、および５３～５５のいずれか１つに記載の方法。
【0137】
実施形態５７：解凍後に得られる細胞が少なくとも２日間で再凝集される、実施形態１～３９、および５３～５５のいずれか１つに記載の方法。
【0138】
実施形態５８：実施形態１～３９、および５３～５７のいずれか１つによる方法によって得られる再凝集細胞。
【0139】
実施形態５９：前記再凝集細胞がＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを共発現する、実施形態１～３９、および５３～５７のいずれか１つに記載の方法。
【0140】
実施形態６０：再凝集細胞の少なくとも２０％がＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを共発現する、実施形態５９に記載の方法。
【0141】
実施形態６１：再凝集細胞の少なくとも４０％がＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを共発現する、実施形態５９に記載の方法。
【0142】
実施形態６２：再凝集細胞の少なくとも６０％がＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを共発現する、実施形態５９に記載の方法。
【0143】
実施形態６３：再凝集細胞の少なくとも８０％がＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを共発現する、実施形態５９に記載の方法。
【0144】
実施形態６４：再凝集細胞の少なくとも２０％がグルコース応答性インスリン分泌細胞である、実施形態５９に記載の方法。
【0145】
実施形態６５：再凝集細胞の少なくとも４０％がグルコース応答性インスリン分泌細胞である、実施形態５９に記載の方法。
【0146】
実施形態６６：再凝集細胞の少なくとも６０％がグルコース応答性インスリン分泌細胞である、実施形態５９に記載の方法。
【0147】
実施形態６７：再凝集細胞の少なくとも８０％がグルコース応答性インスリン分泌細胞である、実施形態５９に記載の方法。
【0148】
実施形態６８：さらなる分化についての使用のための、実施形態１～３９、５３～５７および５９～６６のいずれか１つによる方法によって得られる再凝集細胞。
【0149】
実施形態６９：封入についての使用のための、実施形態１～３９、５３～５７および５９～６６のいずれか１つによる方法によって得られる再凝集細胞。
【0150】
実施形態７０：装置への封入についての使用のための、実施形態１～３９、５３～５７および５９～６６のいずれか１つによる方法によって得られる再凝集細胞。
【0151】
実施形態７１：被験者への移植についての使用のための、実施形態１～３９、５３～５７および５９～６６のいずれか１つによる方法によって得られる再凝集細胞。
【0152】
実施形態７２：哺乳動物への移植についての使用のための、実施形態１～３９、５３～５７および５９～６６のいずれか１つによる方法によって得られる再凝集細胞。
【0153】
実施形態７３：ヒトへの移植についての使用のための、実施形態１～３９、５３～５７および５９～６６のいずれか１つによる方法によって得られる再凝集細胞。
【0154】
実施形態７４：幹細胞からインビトロで誘導されるＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１またはＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド共発現細胞凝集体を凍結保存する方法であって、
（ｉ）細胞凝集体を単一細胞に解離するステップと、
（ｉｉ）凍結保存媒体を用いて単一細胞を処理し、温度を、例えば、少なくとも－８０℃まで低下させて、凍結保存細胞を得るステップと、を含む、方法。
（ｉ）細胞凝集体を単一細胞に解離するステップと、
（ｉｉ）凍結保存媒体を用いて単一細胞を処理し、温度を、例えば、少なくとも－８０℃まで低下させて、凍結保存細胞を得るステップと、を含む、方法。
【0155】
実施形態７５：凍結保存細胞が解凍される、実施形態７４に記載の方法。
【0156】
実施形態７６：解凍された凍結保存細胞が再凝集される、実施形態７５に記載の方法。
【0157】
実施形態７７：再凝集された凍結保存細胞がＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを共発現する、実施形態７６に記載の方法。
【0158】
実施形態７８：ＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１共発現細胞凝集体は内分泌前駆細胞である、実施形態７４に記載の方法。
【0159】
実施形態７９：幹細胞は誘発された多能性幹細胞である、実施形態７４～７８のいずれか１つに記載の方法。
【0160】
実施形態８０：幹細胞は胚性幹細胞である、実施形態７４～７８のいずれか１つに記載の方法。
【0161】
実施形態８１：幹細胞はヒト胚性幹細胞である、実施形態７４～７８のいずれか１つに記載の方法。
【0162】
実施形態８２：ＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１共発現細胞凝集体は、成体型内胚葉に分化された幹細胞からインビトロで誘導される、実施形態７４～８１のいずれか１つに記載の方法。
【0163】
実施形態８３：ＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１共発現細胞凝集体は、膵内胚葉、すなわち共発現ＰＤＸ－１／ＮＫＸ６．１に分化された幹細胞からインビトロで誘導される、実施形態７４～８１のいずれか１つに記載の方法。
【0164】
実施形態８４：ＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１共発現細胞凝集体は、内分泌前駆体に分化された幹細胞からインビトロで誘導される、実施形態７４～８１のいずれか１つに記載の方法。
【0165】
実施形態８５：ＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１共発現細胞凝集体は酵素によって解離される、実施形態７４～８４のいずれか１つに記載の方法。
【0166】
実施形態８６：前記酵素は、プロテアーゼまたはプロテアーゼ混合物またはプロテアーゼおよびコラゲナーゼの混合物からなる群から選択される、実施形態８５に記載の方法。
【0167】
実施形態８７：前記酵素は、トリプシン、コラゲナーゼおよびエラスターゼまたはそれらの混合物からなる群から選択される、実施形態８５に記載の方法。
【0168】
実施形態８８：前記酵素はアクターゼ酵素である、実施形態８５に記載の方法。
【0169】
実施形態８９：アクターゼはプロテアーゼおよびコラゲナーゼの混合物である、実施形態８８に記載の方法。
【0170】
実施形態９０：ＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１共発現細胞凝集体は非酵素試薬により解離される、実施形態７４～８４のいずれか１つに記載の方法。
【0171】
実施形態９１：前記非酵素試薬は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）またはエチレングリコール－ビス（β－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）から選択される、実施形態９０に記載の方法。
【0172】
実施形態９２：凍結保存媒体は凍結保護剤を有する、実施形態７４～９１のいずれか１つに記載の方法。
【0173】
実施形態９３：低温保護剤はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である、実施形態９２に記載の方法。
【0174】
実施形態９４：凍結保存媒体は凍結保護剤を有しない、実施形態７４～９１のいずれか１つに記載の方法。
【0175】
実施形態９５：凍結保存媒体を用いる単一細胞の処理後に、温度が、凍結保存細胞を得るように一段階で、－７０℃～－１９６℃、－８０℃～－１６０℃、または－８０℃～－１２０℃、または－８０℃に低下される、実施形態７４～９４のいずれか１つに記載の方法。
【0176】
実施形態９６：凍結保存媒体を用いる単一細胞の処理後に、温度が、凍結保存細胞を得るように段階的に、－７０℃～－１９６℃、－８０℃～－１６０℃、または－８０℃～－１２０℃、または－８０℃に低下される、実施形態７４～９４のいずれか１つに記載の方法。
【0177】
実施形態９７：実施形態７４～９６のいずれか１つによる方法によって得られる凍結保存細胞。
【0178】
実施形態９８：凍結保存細胞がＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１を共発現する、実施形態９７に記載の凍結保存細胞。
【0179】
実施形態９９：凍結保存細胞の少なくとも２０％がＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１を共発現する、実施形態９７に記載の凍結保存細胞。
【0180】
実施形態１００：凍結保存細胞の少なくとも４０％がＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１を共発現する、実施形態９７に記載の凍結保存細胞。
【0181】
実施形態１０１：凍結保存細胞の少なくとも６０％がＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１を共発現する、実施形態９７に記載の凍結保存細胞。
【0182】
実施形態１０２：凍結保存細胞の少なくとも８０％がＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１を共発現する、実施形態９７に記載の凍結保存細胞。
【0183】
実施形態１０３：実施形態９７によって得られる凍結保存細胞は、少なくとも７日間貯蔵され得る。
【0184】
実施形態１０４：実施形態９７によって得られる凍結保存細胞は、少なくとも１４日間貯蔵され得る。
【0185】
実施形態１０５：実施形態９７によって得られる凍結保存細胞は、少なくとも２１日間貯蔵され得る。
【0186】
実施形態１０６：実施形態９７によって得られる凍結保存細胞は、少なくとも１ヶ月間貯蔵され得る。
【0187】
実施形態１０７：実施形態９７によって得られる凍結保存細胞は、少なくとも２ヶ月間貯蔵され得る。
【0188】
実施形態１０８：実施形態９７によって得られる凍結保存細胞は、少なくとも３ヶ月間貯蔵され得る。
【0189】
実施形態１０９：実施形態９７によって得られる凍結保存細胞は、少なくとも６ヶ月間貯蔵され得る。
【0190】
実施形態１１０：さらなる分化についての使用のための、実施形態９７～１０９のいずれか１つによって得られる凍結保存細胞。
【0191】
実施形態１１１：封入についての使用のための、実施形態９７～１０９のいずれか１つによって得られる凍結保存細胞。
【0192】
実施形態１１２：装置への封入についての使用のための、実施形態９７～１０９のいずれか１つによって得られる凍結保存細胞。
【0193】
実施形態１１３：被験者への移植ついての使用のための、実施形態９７～１０９のいずれか１つによって得られる凍結保存細胞。
【0194】
実施形態１１４：哺乳動物への移植についての使用のための、実施形態９７～１０９のいずれか１つによって得られる凍結保存細胞。
【0195】
実施形態１１５：ヒトへの移植ついての使用のための、実施形態９７～１０９のいずれか１つによって得られる凍結保存細胞。
【0196】
実施形態１１６：凍結保存細胞がＲｏｃｋ阻害剤の存在下で解凍される、実施形態７４～９６のいずれか１つに記載の方法。
【0197】
実施形態１１７：凍結保存細胞が１０μＭのＲｏｃｋ阻害剤の存在下で解凍される、実施形態１１６に記載の方法。
【0198】
実施形態１１８：凍結保存細胞がＲｏｃｋ阻害剤の非存在下で解凍される、実施形態７４～９６のいずれか１つに記載の方法。
【0199】
実施形態１１９：解凍後に得られる細胞が再凝集される、実施形態７４～９６のいずれか１つに記載の方法。
【0200】
実施形態１２０：解凍後に得られる細胞が２日間で再凝集される、実施形態７４～９６のいずれか１つに記載の方法。
【0201】
実施形態１２１：実施形態７６～９６および１１６～１２０のいずれか１つによる方法によって得られる再凝集細胞。
【0202】
実施形態１２２：前記再凝集細胞がＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを共発現する、実施形態７６～９６および１１６～１２０のいずれか１つに記載の方法。
【0203】
実施形態１２３：前記再凝集細胞の少なくとも２０％がＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを発現する、実施形態７６～９６および１１６～１２０のいずれか１つに記載の方法。
【0204】
実施形態１２４：再凝集細胞の少なくとも４０％がＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを発現する、実施形態７６～９６および１１６～１２０のいずれか１つに記載の方法。
【0205】
実施形態１２５：再凝集細胞の少なくとも６０％がＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを発現する、実施形態７６～９６および１１６～１２０のいずれか１つに記載の方法。
【0206】
実施形態１２６：再凝集細胞の少なくとも８０％がＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを発現する、実施形態７６～９６および１１６～１２０のいずれか１つに記載の方法。
【0207】
実施形態１２７：再凝集細胞の少なくとも２０％がグルコース応答性インスリン分泌細胞である、実施形態７６～９６および１１６～１２０のいずれか１つに記載の方法。
【0208】
実施形態１２８：再凝集細胞の少なくとも４０％がグルコース応答性インスリン分泌細胞である、実施形態７６～９６および１１６～１２０のいずれか１つに記載の方法。
【0209】
実施形態１２９：再凝集細胞の少なくとも６０％がグルコース応答性インスリン分泌細胞である、実施形態７６～９６および１１６～１２０のいずれか１つに記載の方法。
【0210】
実施形態１３０：再凝集細胞の少なくとも８０％がグルコース応答性インスリン分泌細胞である、実施形態７６～９６および１１６～１２０のいずれか１つに記載の方法。
【0211】
実施形態１３１：さらなる分化についての使用のための、実施形態７６～９６および１１６～１２０のいずれか１つによる方法によって得られる再凝集細胞。
【0212】
実施形態１３２：封入についての使用のための、実施形態７６～９６および１１６～１２０のいずれか１つによる方法によって得られる再凝集細胞。
【0213】
実施形態１３３：装置への封入についての使用のための、実施形態７６～９６および１１６～１２０のいずれか１つによる方法によって得られる再凝集細胞。
【0214】
実施形態１３４：被験者への移植についての使用のための実施形態７６～９６および１１６～１２０のいずれか１つによる方法によって得られる再凝集細胞。
【0215】
実施形態１３５：哺乳動物への移植についての使用のための、実施形態７６～９６および１１６～１２０のいずれか１つによる方法によって得られる再凝集細胞。
【0216】
実施形態１３６：ヒトへの移植についての使用のための、実施形態７６～９６および１１６～１２０のいずれか１つによる方法によって得られる再凝集細胞。
【0217】
実施形態１３７：封入剤としての使用のための、実施形態７６～９６および１１６～１２０のいずれか１つによる方法によって得られる再凝集細胞。
【0218】
実施形態１３８：糖尿病の治療での使用のための、実施形態７６～９６および１１６～１２０のいずれか１つによる方法によって得られる再凝集細胞。
【0219】
実施形態１３９：ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを共発現する内分泌細胞の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％を含む再凝集内分泌細胞。
【0220】
実施形態１４０：ＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１を共発現する内分泌前駆細胞の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％を含む再凝集内分泌細胞。
【0221】
実施形態１４１：実施形態１～３９、７６～９６および１１６～１２０のいずれか１つに記載の内分泌細胞凝集体を濃縮する方法によって得られる再凝集内分泌細胞。
【0222】
実施形態１４２：封入剤としての使用のための、実施形態１３８～１４０のいずれか１つに記載の再凝集内分泌細胞。
【0223】
実施形態１４３：糖尿病の治療での使用のための、実施形態１３８～１４０のいずれか１つに記載の再凝集内分泌細胞。
【0224】
実施形態１４４：実施形態６８～７３および１３１～１４３のいずれか１つに記載の再凝集細胞を使用して糖尿病を治療するための薬剤の調製のためのプロセス。
【0225】
実施形態１４５：ＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１を共発現する凍結保存単一内分泌細胞およびＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを共発現する単一内分泌細胞。
【0226】
実施形態１４６：実施形態７４～９６、および１１６～１２０のいずれか１つに記載の凍結保存の方法によって得られるＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１を共発現するまたはＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを共発現する凍結保存単一内分泌細胞。
【0227】
実施形態１４７：被験者への移植での使用のための、実施形態１４５または１４６のいずれか１つに記載の凍結保存単一内分泌細胞。
【0228】
実施形態１４８：糖尿病の治療での使用のための、実施形態１４５または１４６に記載の凍結保存単一内分泌細胞。
【0229】
実施形態１４９：被験者への移植での使用のための、実施形態１４５または１４６に記載の凍結保存単一内分泌細胞。
【0230】
実施形態１５０：薬剤としての使用のための、実施形態１４５または１４６に記載の凍結保存単一内分泌細胞。
【0231】
実施形態１５１：薬剤としての使用のための、実施形態１～３９、７６～９６、１１６～１２０および１２２～１３０のいずれか１つによる方法によって得られる再凝集細胞を含む組成物。
【0232】
実施形態１５２：糖尿病の治療での使用のための、実施形態１～３９、７６～９６、１１６～１２０および１２２～１３０のいずれか１つによる方法によって得られる再凝集細胞を含む組成物。
【0233】
実施形態１５３：薬剤として使用するためのまたは糖尿病、例えば、Ｉ型糖尿病の治療での使用のための、実施形態１３１～１４３に記載の再凝集内分泌細胞を含む組成物。
【0234】
実施形態１５４：実施形態１～３９、７６～９６、１１６～１２０および１２２～１３０のいずれか１つによる方法によって得られる再凝集細胞を含む薬剤。
【0235】
実施形態１５５：実施形態１３１～１４３のいずれか１つに記載の再凝集内分泌細胞を含む薬剤。
【0236】
実施形態１５６：実施形態４０～５２、９７～１１５および１４５～１５０のいずれか１つに記載の凍結保存内分泌細胞、実施形態５８、６８～７３、１３１～１４３または１４９～１５３のいずれか１つに記載の再凝集内分泌細胞、または実施形態１５１～１５３のいずれか１つに記載の組成物、実施形態１５４または１５５に記載の薬剤を含む装置。
【0237】
驚いたことに、濃縮された内分泌細胞の集団は、本発明のプロセスを実施することによって得られる。濃縮された内分泌細胞は、被験者への移植に適切なそれらをレンダリングする均質でかつ小さいクラスターサイズを有する。
略語リスト
Ａｌｋ５ｉ ＩＩ： ＴＧＦβキナーゼ／アクチビン受容体様キナーゼ
ＤＡＰＴ： ジフルオロフェニルアセチル）－アラニル－フェニルグリシン－ｔ－ブチル－エステル
ＤＭＢＩ： （Ｚ）－３－［４－（ジメチルアミノ）ベンジリデニル］インドリン－２－オン
ＤＺＮＥＰ： ３－デアザネプラノシンＡ
ＢＣ： ベータ細胞
ＤＥ： 成体型内胚葉
ＤＮＡ－Ｐｋｉ： ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤Ｖ
ＥＰ： 内分泌前駆体
ＧＡＢＡ： ガンマアミノ酪酸
ｈＢＳ： ヒト胚盤胞由来幹
ｈＥＳ： ヒト胚性幹
ｈＥＳＣ： ヒト胚性幹細胞
ｈｉＰＳ： ヒト誘発多能性幹
ＨＳＣ： 造血幹細胞
ｉＰＳ： 誘導多能性幹
ｉＰＳＣ： 誘導多能性幹細胞
ＫＯＳＲ： ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）血清代替
ＰＥ： 膵内胚葉
Ｒｏｃｋｉ： Ｒｈｏキナーゼ阻害剤
ＳＣ： 幹細胞
略語リスト
Ａｌｋ５ｉ ＩＩ： ＴＧＦβキナーゼ／アクチビン受容体様キナーゼ
ＤＡＰＴ： ジフルオロフェニルアセチル）－アラニル－フェニルグリシン－ｔ－ブチル－エステル
ＤＭＢＩ： （Ｚ）－３－［４－（ジメチルアミノ）ベンジリデニル］インドリン－２－オン
ＤＺＮＥＰ： ３－デアザネプラノシンＡ
ＢＣ： ベータ細胞
ＤＥ： 成体型内胚葉
ＤＮＡ－Ｐｋｉ： ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤Ｖ
ＥＰ： 内分泌前駆体
ＧＡＢＡ： ガンマアミノ酪酸
ｈＢＳ： ヒト胚盤胞由来幹
ｈＥＳ： ヒト胚性幹
ｈＥＳＣ： ヒト胚性幹細胞
ｈｉＰＳ： ヒト誘発多能性幹
ＨＳＣ： 造血幹細胞
ｉＰＳ： 誘導多能性幹
ｉＰＳＣ： 誘導多能性幹細胞
ＫＯＳＲ： ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）血清代替
ＰＥ： 膵内胚葉
Ｒｏｃｋｉ： Ｒｈｏキナーゼ阻害剤
ＳＣ： 幹細胞
【実施例】
【0238】
一般に、ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド共発現細胞を濃縮するプロセスは、様々な段階を経る。濃縮のための例示的方法を図１に概説する。
【0239】
実施例１：内分泌細胞集団の調製
内分泌前駆細胞およびグルコース応答性インスリン分泌細胞を得るためのプロトコルは、特許出願第ＷＯ２０１５／０２８６１４号および第ＷＯ２０１７／１４４６９５号にそれぞれ提供されている。
内分泌前駆細胞およびグルコース応答性インスリン分泌細胞を得るためのプロトコルは、特許出願第ＷＯ２０１５／０２８６１４号および第ＷＯ２０１７／１４４６９５号にそれぞれ提供されている。
【0240】
実施例２：ＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１を共発現する内分泌前駆細胞を凍結保存することによるＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド共発現細胞凝集体の濃縮
幹細胞からインビトロで得られたＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１共発現細胞凝集体は以下のステップが施される。
幹細胞からインビトロで得られたＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１共発現細胞凝集体は以下のステップが施される。
【0241】
（ｉ）解離
幹細胞から得られるＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１共発現細胞凝集体は、アクターゼ（幹細胞＃０７９２０）を使用して単一細胞に解離される。消化は、１２％ＫＯＳＲ（Ｇｉｂｃｏ＃１０８２８－０２８０）が補足されたＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ＃６１８７０－０４４）の添加によって停止され、懸濁液は、いずれの残留クラスターも除去するように４０μｍフィルタでろ過される。
幹細胞から得られるＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１共発現細胞凝集体は、アクターゼ（幹細胞＃０７９２０）を使用して単一細胞に解離される。消化は、１２％ＫＯＳＲ（Ｇｉｂｃｏ＃１０８２８－０２８０）が補足されたＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ＃６１８７０－０４４）の添加によって停止され、懸濁液は、いずれの残留クラスターも除去するように４０μｍフィルタでろ過される。
【0242】
（ｉｉ）凍結保存
遠心分離後に、ＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１共発現細胞は、凍結保存媒体中に再懸濁され、－８０℃までの温度の連続的低下によって保存される。
遠心分離後に、ＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１共発現細胞は、凍結保存媒体中に再懸濁され、－８０℃までの温度の連続的低下によって保存される。
【0243】
（ｉｉ）凍結保存単一細胞の解凍
細胞を培養に戻すために、ＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１共発現細胞は、迅速に３７℃にされて、１２％のＫＯＳＲ（Ｇｉｂｃｏ＃１０８２８－０２８０）が補足された予め温められたＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ＃６１８７０－０４４）中で一回洗浄される。カウント後、細胞は、５０μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅｌ（Ｓｉｇｍａ＃１１２８４９３２００１）および１０μＭのＲｏｃｋｉ（Ｓｉｇｍａ＃Ｙ２７６３２－Ｙ０５０３）が補足された段階特異的培地中に再懸濁される。
細胞を培養に戻すために、ＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１共発現細胞は、迅速に３７℃にされて、１２％のＫＯＳＲ（Ｇｉｂｃｏ＃１０８２８－０２８０）が補足された予め温められたＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ＃６１８７０－０４４）中で一回洗浄される。カウント後、細胞は、５０μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅｌ（Ｓｉｇｍａ＃１１２８４９３２００１）および１０μＭのＲｏｃｋｉ（Ｓｉｇｍａ＃Ｙ２７６３２－Ｙ０５０３）が補足された段階特異的培地中に再懸濁される。
【0244】
（ｉｉｉ）解凍後に得られる細胞の再凝集
解凍後に得られるＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１共発現細胞は、０．５～２ｍｉｏ生存細胞／ｍＬの密度を有する減容の三角フラスコ内で再凝集される。再凝集が、２日間、３７℃において７０ｒｐｍの水平振動で実行されて、培地変更により後続される。
解凍後に得られるＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１共発現細胞は、０．５～２ｍｉｏ生存細胞／ｍＬの密度を有する減容の三角フラスコ内で再凝集される。再凝集が、２日間、３７℃において７０ｒｐｍの水平振動で実行されて、培地変更により後続される。
【0245】
内分泌前駆培地：１２％のＫＯＳＲ（Ｇｉｂｃｏ＃１０８２８－０２８０）、０．１％のＰ／Ｓ（Ｇｉｂｃｏ＃１５１４０－１２２）、１０ｍＭのニコチンアミド（Ｓｉｇｍａ＃Ｎ０６３６）、１０μＭのＡｌｋ５ｉ ＩＩ（Ｅｎｚｏ＃ＡＬＸ－２７０－４４５）、１μＭのＤＺＮＥＰ（Ｔｏｃｒｉｓ＃４７０３）、１０μｇ／ｍＬのヘパリン（Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ＃Ａ３００４ ０２５０）、２．５μＭのＤＡＰＴ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ＃５６５７８４）および１μＭのＴ３（Ｓｉｇｍａ＃Ｔ６３９７）が補足されたＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ＃６１８７０－０４４）。
【0246】
凍結保存後、６０％を超える生存率のＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１を共発現する内分泌前駆細胞が回収される。ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを共発現する内分泌細胞への再凝集および分化後に、上記内分泌細胞は、インビボでより均質な移植片に寄与し得る小さくかつより均質な凝集体をもたらすクラスターを形成する（サイズは約１００μｍ、ＮＫＸ６．１／Ｃ－ＰＥＰ／ＧＬＵ陰性細胞の＜５０％への減少、ＮＫＸ６．１陽性細胞の＞５０％への増加）。インビトロでＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１表現型を共発現する内分泌前駆細胞に対する効果は、図２Ａおよび２Ｂにそれぞれ提供されている。
【0247】
非糖尿病マウスへの移植後、ＮＫＸ２．２およびＮＫＸ６．１を共発現する解離、凍結保存および再凝集内分泌前駆細胞は、Ｓ９６１によって誘発されるグルコースまたは急性インスリン抵抗性でチャレンジされるときに、機能的であり、かつヒトＣ－ペプチドを分泌する（図３Ａ）。
【0248】
解離ステップ、凍結保存ステップ、および再凝集ステップを用いるまたは用いないプロトコルを使用して生成される細胞を受ける動物は、Ｓ９６１チャレンジの間、Ｃ－ペプチドの増加を示した。この結果は、解離、凍結保存、および再凝集を用いるプロトコルを使用して有効性が改善されて、動物間のばらつきが減少されたことを示す（図３Ｂ）。
【0249】
腎移植片に対する免疫組織化学分析は、解離ステップ、凍結保存ステップ、および再凝集ステップが内分泌細胞タイプ（インスリン、グルカゴン、ＮＫＸ６．１）の濃縮および非内分泌細胞タイプの減少につながることを示した（図３Ｃ）。このデータはまた、移植後２週間の非レスポンダの減少について説明し得る。
【0250】
実施例３：ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを共発現する細胞を凍結保存することによるＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド共発現細胞凝集体の濃縮
幹細胞からインビトロで得られるＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド共発現細胞凝集体には、以下のステップが施される。
幹細胞からインビトロで得られるＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド共発現細胞凝集体には、以下のステップが施される。
【0251】
（ｉ）解離
幹細胞から得られるＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド共発現細胞凝集体は、アクターゼ（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ＃０７９２０）を使用して単一細胞に解離される。消化は、１２％ＫＯＳＲ（Ｇｉｂｃｏ＃１０８２８－０２８０）が補足されたＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ＃６１８７０－０４４）の添加によって停止され、懸濁液は、いずれの残留クラスターも除去するように４０μｍフィルタでろ過される。
幹細胞から得られるＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド共発現細胞凝集体は、アクターゼ（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ＃０７９２０）を使用して単一細胞に解離される。消化は、１２％ＫＯＳＲ（Ｇｉｂｃｏ＃１０８２８－０２８０）が補足されたＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ＃６１８７０－０４４）の添加によって停止され、懸濁液は、いずれの残留クラスターも除去するように４０μｍフィルタでろ過される。
【0252】
（ｉｉ）凍結保存
遠心分離後に、ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド共発現細胞は、凍結保存媒体中に再懸濁され、－８０℃までの温度の連続的低下によって保存される。
遠心分離後に、ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド共発現細胞は、凍結保存媒体中に再懸濁され、－８０℃までの温度の連続的低下によって保存される。
【0253】
（ｉｉｉ）凍結保存単一細胞の解凍
細胞を培養に戻すために、ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド共発現細胞は、迅速に３７℃にされて、１２％のＫＯＳＲ（Ｇｉｂｃｏ＃１０８２８－０２８０）が補足された予め温められたＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ＃６１８７０－０４４）中で一回洗浄される。カウント後、細胞は、５０μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅｌ（Ｓｉｇｍａ＃１１２８４９３２００１）および１０μＭのＲｏｃｋｉ（Ｓｉｇｍａ＃Ｙ２７６３２－Ｙ０５０３）が補足された段階特異的培地中に再懸濁される。
細胞を培養に戻すために、ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド共発現細胞は、迅速に３７℃にされて、１２％のＫＯＳＲ（Ｇｉｂｃｏ＃１０８２８－０２８０）が補足された予め温められたＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ＃６１８７０－０４４）中で一回洗浄される。カウント後、細胞は、５０μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅｌ（Ｓｉｇｍａ＃１１２８４９３２００１）および１０μＭのＲｏｃｋｉ（Ｓｉｇｍａ＃Ｙ２７６３２－Ｙ０５０３）が補足された段階特異的培地中に再懸濁される。
【0254】
（ｉｖ）解凍後に得られる細胞の再凝集
解凍後に得られるＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド共発現細胞は、０．５～２ｍｉｏ生存細胞／ｍｌの密度を有する減容の三角フラスコ内で再凝集される。再凝集が、２日間、３７℃において７０ｒｐｍの水平振動で実行されて、培地変更により後続される。
解凍後に得られるＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド共発現細胞は、０．５～２ｍｉｏ生存細胞／ｍｌの密度を有する減容の三角フラスコ内で再凝集される。再凝集が、２日間、３７℃において７０ｒｐｍの水平振動で実行されて、培地変更により後続される。
【0255】
培地：１２％のＫＯＳＲ（Ｇｉｂｃｏ＃１０８２８－０２８０）、０．１％のＰ／Ｓ（Ｇｉｂｃｏ＃１５１４０－１２２）、５０μＭのＧＡＢＡ（ＴＯＣＲＩＳ＃０３４４）、１０μＭのＡｌｋ５ｉ ＩＩ（Ｅｎｚｏ＃ＡＬＸ－２７０－４４５）、１μＭのＤＺＮＥＰ（Ｔｏｃｒｉｓ＃４７０３）、１μＭのＴ３（Ｓｉｇｍａ＃Ｔ６３９７）が補足されたＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ＃６１８７０－０４４）。
【0256】
凍結保存後に、９０％を超える生存率を有するＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド共発現細胞が回収される。ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド共発現細胞の再凝集時に、グルコース応答性インスリン分泌表現型が改善される（サイズ～１５０ｕｍ、＜２５％のＮＫＸ６．１／Ｃ－ＰＥＰ／ＧＬＵ陰性細胞の＜２５％への減少、ＮＫＸ６．１陽性細胞の＞２５％への増加）（図４Ａおよび４Ｂ）。
【0257】
インビボにおいて、ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドを共発現する解離、凍結保存および再凝集された内分泌細胞が、高ヒトＣ－ペプチド分泌と相関する効率的に低下された血糖に対して示されている（図５Ａおよび５Ｂ）。
【0258】
実施例４：ＮＫＸ６．１およびＮＫＸ２．２共発現細胞凝集体またはＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド共発現細胞凝集体の凍結保存に後続する遺伝子発現プロファイル
細胞分化中の異なる時点で凍結保存された細胞の解離、凍結保存および再凝集。細胞は、膵内胚葉段階（ＰＥ）、Ｃ－ペプチド発現の開始１日前（ＢＣ００）、Ｃ－ペプチド発現の開始２日後（ＢＣ０３）、Ｃ－ペプチド発現の開始５日後（ＢＣ０６）およびＣ－ペプチド発現の開始８日後（ＢＣ０９）に凍結保存され、すべてが同じ細胞のバッチからのものである。細胞は、同じセットアップにおいてＣ－ペプチド発現の開始１３日後（ＢＣ１４）に、解凍され、分化され、機能性について試験された。結果は、細胞が段階ＢＣ００およびＢＣ０３に凍結保存されるときに、グルコース応答性ならびにＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド発現がより高くなることを示している（図６Ａ）。
細胞分化中の異なる時点で凍結保存された細胞の解離、凍結保存および再凝集。細胞は、膵内胚葉段階（ＰＥ）、Ｃ－ペプチド発現の開始１日前（ＢＣ００）、Ｃ－ペプチド発現の開始２日後（ＢＣ０３）、Ｃ－ペプチド発現の開始５日後（ＢＣ０６）およびＣ－ペプチド発現の開始８日後（ＢＣ０９）に凍結保存され、すべてが同じ細胞のバッチからのものである。細胞は、同じセットアップにおいてＣ－ペプチド発現の開始１３日後（ＢＣ１４）に、解凍され、分化され、機能性について試験された。結果は、細胞が段階ＢＣ００およびＢＣ０３に凍結保存されるときに、グルコース応答性ならびにＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチド発現がより高くなることを示している（図６Ａ）。
【0259】
ＮＫＸ６．１およびＣ－ペプチドの発現が、フローサイトメトリを使用してＢＣ１４に測定された。データは、解離、凍結保存および再凝集ステップを用いないプロトコルを使用して同じバッチからの細胞と比較して％で表される。結果は、ＮＫＸ６．１細胞およびＣ－ペプチド細胞の濃縮が、ＢＣ００およびＢＣ０３に凍結保存された細胞について最も効率的であることを示している（図６Ｂ）。
【0260】
実験の終了時に、機能性が、動的灌流システムを使用して試験された。すべての細胞は、２０ｍＭのグルコースおよびエキセンジン－４を用いるチャレンジに応答したが、細胞がＢＣ００およびＢＣ０３にそれぞれＣ－ペプチド発現の開始１日前および２日後に凍結保存されたときに、最高の応答性が観察された（図６Ｃ）。
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4】
【図5】
【図6】