特許 7389640 アルカリプロテアーゼ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-11-21

(45)【発行日】2023-11-30

(54)【発明の名称】アルカリプロテアーゼ

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/57 20060101AFI20231122BHJP

   C12N 9/54 20060101ALI20231122BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20231122BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20231122BHJP

【ＦＩ】

C12N15/57 ZNA

C12N9/54

C12N15/63 Z

C12N1/21

【請求項の数】 10

(21)【出願番号】P 2019230074

(22)【出願日】2019-12-20

(65)【公開番号】P2021097605

(43)【公開日】2021-07-01

【審査請求日】2022-09-22

(73)【特許権者】

【識別番号】000000918

【氏名又は名称】花王株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000084

【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】日置 貴大

【審査官】小林 薫

(56)【参考文献】

【文献】特開２００４－１８７６６９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１４－１５８４２８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００４－０００１２２（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第９９／０１８２１８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２０１１－２３４６８５（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ１２Ｎ ９／００－ ９／９９

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

改変プロ配列を含むアルカリプロテアーゼであって、
該改変プロ配列は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる親プロ配列において、配列番号１の３位に相当する位置のアミノ酸残基をＬｅｕに置換したアミノ酸配列からなり、
該アルカリプロテアーゼの成熟酵素は、配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、
該改変プロ配列を含むアルカリプロテアーゼは、該親プロ配列を含むアルカリプロテアーゼと比べて、該成熟酵素の生産性が向上している、
アルカリプロテアーゼ。

【請求項2】

前記改変プロ配列を含むアルカリプロテアーゼが、配列番号３のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるシグナル配列をさらに含む、請求項１記載のアルカリプロテアーゼ。

【請求項3】

請求項１又は２記載の改変プロ配列を含むアルカリプロテアーゼをコードする、ポリヌクレオチド。

【請求項4】

請求項３記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。

【請求項5】

請求項３記載のポリヌクレオチド又は請求項４記載のベクターを含有する形質転換体。

【請求項6】

枯草菌又はその変異株である、請求項５記載の形質転換体。

【請求項7】

請求項５又は６記載の形質転換体を培養することを含む、アルカリプロテアーゼの製造方法。

【請求項8】

改変プロ配列を含むアルカリプロテアーゼの製造方法であって、
配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる親プロ配列において、配列番号１の３位に相当する位置のアミノ酸残基をＬｅｕに置換することを含み、
該アルカリプロテアーゼの成熟酵素は、配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、
該改変プロ配列を含むアルカリプロテアーゼは、該親プロ配列を含むアルカリプロテアーゼと比べて、該成熟酵素の生産性が向上している、
方法。

【請求項9】

前記親プロ配列における配列番号１の３位に相当する位置のアミノ酸残基がＰｈｅである、請求項８記載の方法。

【請求項10】

前記改変プロ配列を含むアルカリプロテアーゼが、配列番号３のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるシグナル配列をさらに含む、
請求項８又は９記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、アルカリプロテアーゼに関する。

【背景技術】

【0002】

プロテアーゼは、衣料用洗剤等の洗浄剤に配合される酵素として有用である。特許文献１には、タンパク質汚れだけでなく、タンパク質と皮脂等の混在する複合汚れに対しても優れた洗浄性を有する、バチルス属細菌由来の分子量約４３，０００のアルカリプロテアーゼが記載されている。当該アルカリプロテアーゼは、分泌とフォールディングに重要な働きを担うプレプロ配列を有するプレプロタンパク質の形態で発現された後、細胞外に分泌される。その発現から分泌の過程で、該アルカリプロテアーゼは、プレプロ配列がプロセシングにより切断されて成熟酵素となる。特許文献２には、当該アルカリプロテアーゼのプレプロ配列の５２位、７５位又は１４２位のアミノ酸残基を置換することにより、該アルカリプロテアーゼの分泌能を高め、生産性を向上させることが記載されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【文献】国際公開公報第９９／１８２１８号

【文献】特開２００４－１８７６６９号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本発明は、アルカリプロテアーゼの生産性向上に関する。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明者らは、アルカリプロテアーゼのプロ配列における所定のアミノ酸残基を置換することで、成熟アルカリプロテアーゼの生産性が顕著に向上することを見出した。

【0006】

したがって、本発明は、プロ配列を含むアルカリプロテアーゼであって、
該プロ配列が、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有し且つ配列番号１の３位に相当する位置にＬｅｕを有するアミノ酸配列からなり、
該アルカリプロテアーゼの成熟酵素が、配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる、
アルカリプロテアーゼを提供する。
また本発明は、前記アルカリプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。
また本発明は、前記ポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。
また本発明は、前記ポリヌクレオチド又はベクターを含有する形質転換体を提供する。
また本発明は、前記形質転換体を培養することを含む、アルカリプロテアーゼの製造方法を提供する。
さらに本発明は、改変プロ配列を含むアルカリプロテアーゼの製造方法であって、
配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる親プロ配列において、配列番号１の３位に相当する位置のアミノ酸残基をＬｅｕに置換することを含み、
該アルカリプロテアーゼの成熟酵素が、配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる、
方法を提供する。

【発明の効果】

【0007】

本発明により、アルカリプロテアーゼの生産性が顕著に向上する。

【発明を実施するための形態】

【0008】

本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。

【0009】

本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５－１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ－Ｗｉｎ（Ｖｅｒ．５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。

【0010】

本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列に関する「少なくとも９０％の同一性」とは、９０％以上、好ましくは９２％以上、より好ましくは９４％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性をいう。

【0011】

本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列上の「相当する位置」又は「相当する領域」は、目的配列と参照配列（例えば、配列番号１のアミノ酸配列）とを、最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列のアラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３－４６８０）をデフォルト設定で用いることにより、行うことができる。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ［ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ］）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ［ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｓｅａｒｃｈｅｓ－ｊ．ｈｔｍｌ］）のウェブサイト上で利用することができる。上述のアラインメントにより参照配列の任意の位置にアラインされた目的配列の位置は、当該任意の位置に「相当する位置」とみなされる。また、相当する位置により挟まれた領域、または相当するモチーフからなる領域は、相当する領域とみなされる。

【0012】

当業者であれば、上記で得られたアミノ酸配列のアラインメントを、最適化するようにさらに微調整することができる。そのような最適アラインメントは、アミノ酸配列の類似性や挿入されるギャップの頻度等を考慮して決定するのが好ましい。ここでアミノ酸配列の類似性とは、２つのアミノ酸配列をアラインメントしたときにその両方の配列に同一又は類似のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。類似のアミノ酸残基とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸のうち、極性や電荷の点で互いに類似した性質を有しており、いわゆる保存的置換を生じるようなアミノ酸残基を意味する。そのような類似のアミノ酸残基からなるグループは当業者にはよく知られており、例えば、アルギニンとリシン；グルタミン酸とアスパラギン酸；セリンとトレオニン；グルタミンとアスパラギン；ロイシンとイソロイシン等がそれぞれ挙げられるが、これらに限定されない。

【0013】

本明細書において、「アミノ酸残基」とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸残基、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リシン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、スレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）を意味する。

【0014】

本明細書において、所与のポリペプチドの「親」ポリペプチドとは、そのアミノ酸残基に所定の変異がなされることにより、当該変異ポリペプチドとなるポリペプチドをいう。言い換えると、「親」ポリペプチドとは、変異ポリペプチドに当該変異が加えられる前のポリペプチドである。

【0015】

本発明は、アルカリプロテアーゼの改変プロ配列を提供する。当該改変プロ配列は、配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる親プロ配列における配列番号１の３位に相当する位置のアミノ酸残基を、ロイシンに置換したアミノ酸配列からなる。

【0016】

本発明の改変プロ配列の親プロ配列としては、配列番号１のアミノ酸配列からなるプロ配列が挙げられ、例えば、配列番号１のアミノ酸配列からなる、アルカリプロテアーゼＫＰ４３［バチルス・エスピーＫＳＭ－ＫＰ４３（ＦＥＲＭ ＢＰ－６５３２）由来；特許文献１参照］のプロ配列が挙げられる。該親プロ配列の別の例としては、アルカリプロテアーゼ由来の、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるプロ配列が挙げられる。そのようなプロ配列の例としては、プロテアーゼＫＰ９８６５（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ０８４１５５）［バチルス・エスピーＫＳＭ－９８６５（ＦＥＲＭ Ｐ－１８５６６）由来；特開２００３－１９９５５９号公報参照］のプロ配列が挙げられる。

【0017】

当該親プロ配列において、配列番号１の３位に相当する位置のアミノ酸残基はＬｅｕ以外であればよく、好ましくはＰｈｅ又はＰｒｏであり、より好ましくはＰｈｅである。一方、改変プロ配列において、配列番号１の３位に相当する位置のアミノ酸残基はＬｅｕである。

【0018】

また本発明は、当該改変プロ配列を含むアルカリプロテアーゼを提供する。これは、該改変プロ配列とアルカリプロテアーゼの成熟酵素領域とを含む、アルカリプロテアーゼ前駆体である。該成熟酵素は、配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼである。該成熟酵素は、好ましくはｐＨ８以上のアルカリ性領域で作用するアルカリプロテアーゼであり、より好ましくは、以下の酵素核的性質を有するアルカリプロテアーゼである：ｐＨ８以上のアルカリ性領域で作用する；酸化剤耐性を有する（該アルカリプロテアーゼを５０ｍＭ過酸化水素、５ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭブリットンロビンソン緩衝液（ｐＨ１０）中、３０℃で２０分間放置した後の残存活性が５％以上である）；５０℃、ｐＨ１０で１０分間処理したとき８０％以上の残存活性を有する；かつ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分子量が４３，０００±２，０００である。

【0019】

当該成熟酵素の例としては、配列番号２のアミノ酸配列からなる、上述したアルカリプロテアーゼＫＰ４３の成熟酵素が挙げられる。該成熟酵素の別の例としては、配列番号２のアミノ酸配列に対して以下のアミノ酸置換を行った変異体が挙げられる：４６位をロイシンに置換、５７位をアラニンに置換、１０３位をアルギニンに置換、１０７位をリジンに置換、１２４位をリジン又はアラニンに置換、１３６位をアラニンに置換、１９３位をアラニンに置換、１９５位をアスパラギン、グルタミン酸、アルギニン、プロリン、スレオニン、バリン、ヒスチジン、セリン、リジン、グルタミン、メチオニン、システイン、アラニン、アスパラギン酸、トリプトファン、グリシン又はフェニルアラニンに置換、２４７位をスレオニン又はアルギニンに置換、２５７位をバリンに置換、３４２位をアラニンに置換、６６位のアスパラギン酸への置換と２６４位のセリンへの置換による二重置換（以上、特開２００２－２１８９８９号公報）、８４位をアルギニンに置換、１０４位をプロリンに置換、２５６位をアラニン又はセリンに置換、３６９位をアスパラギンに置換（以上、特開２００２－３０６１７６号公報）、２５１位をアスパラギン、スレオニン、イソロイシン、バリン、ロイシン又はグルタミンに置換、あるいは、２５６位をセリン、グルタミン、アスパラギン、バリン又はアラニンに置換（以上、特開２００３－１２５７８３号公報）。該成熟酵素のさらなる例としては、上述したプロテアーゼＫＰ９８６５、及びプロテアーゼＡ－１（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ０４６４０６）［ＮＣＩＢ１２２８９由来、国際公開公報第８８／０１２９３号］の成熟酵素が挙げられる。

【0020】

該アルカリプロテアーゼ前駆体は、プロ配列と成熟酵素領域とを含むアルカリプロテアーゼのプロタンパク質であってもよいが、シグナル配列（プレ配列）とプロ配列と成熟酵素領域とを含むアルカリプロテアーゼのプレプロタンパク質であってもよい。したがって、本明細書におけるアルカリプロテアーゼ前駆体とは、プロ配列又はプレプロ配列を含む未成熟なアルカリプロテアーゼであり得る。

【0021】

本発明において、アルカリプロテアーゼのプロ配列は、該プロテアーゼのフォールディングに関与する。プロ配列を含むアルカリプロテアーゼ前駆体において、該プロ配列は、該アルカリプロテアーゼ前駆体の成熟酵素領域のＮ末端側に位置する。該プロ配列は、分子内シャペロニンとして作用し、細胞膜の通過前後において成熟アルカリプロテアーゼが正確な立体構造をとるために必須の領域である。プロ配列は最終的に成熟アルカリプロテアーゼにより切断され、さらに小さなペプチドへと分解される。

【0022】

本発明において、アルカリプロテアーゼのプロ配列は、シグナル配列（プレ配列）と連結されてプレプロ配列として存在していてもよい。その場合、本発明のアルカリプロテアーゼ前駆体は、プレプロタンパク質である。該アルカリプロテアーゼのプレプロタンパク質において、シグナル配列はプロ配列のＮ末端側に位置する。シグナル配列は、アルカリプロテアーゼの細胞外への分泌に関与する。該プレプロタンパク質が細胞膜を通過する際に、シグナル配列はシグナルペプチダーゼにより切断され、プロタンパク質が生成される。該シグナル配列の例としては、配列番号３のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる配列が挙げられ、例えば、上述したアルカリプロテアーゼＫＰ４３及びプロテアーゼＫＰ９８６５のシグナル配列が挙げられる。

【0023】

したがって、一実施形態において、本発明のアルカリプロテアーゼ前駆体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有し且つ配列番号１の３位に相当する位置にＬｅｕを有するアミノ酸配列からなるプロ配列を含み、かつ、該アルカリプロテアーゼの成熟酵素は、配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる。

【0024】

別の一実施形態において、本発明のアルカリプロテアーゼ前駆体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有し且つ配列番号１の３位に相当する位置にＬｅｕを有するアミノ酸配列からなるプロ配列を含み、さらに、配列番号３のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるシグナル配列を含み、かつ、該アルカリプロテアーゼの成熟酵素は、配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる。例えば、本発明のアルカリプロテアーゼ前駆体は、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有し且つ配列番号４の３４位に相当する位置にＬｅｕを有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであり得る。

【0025】

親プロ配列のアミノ酸を変異させる手段としては、当技術分野で公知の各種変異導入技術を使用することができる。例えば、置換を導入すべきアミノ酸配列（親プロ配列）をコードするポリヌクレオチド（以下、親遺伝子ともいう）を、変異したアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（以下、変異遺伝子ともいう）に変更し、該変異遺伝子から目的の変異を有する改変プロ配列を発現させることができる。

【0026】

親遺伝子への変異の導入は、基本的には、当業者に周知の様々な部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。部位特異的変異導入法は、例えば、インバースＰＣＲ法やアニーリング法などの任意の手法により行うことができる。市販の部位特異的変異導入用キット（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔや、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ等）を使用することもできる。

【0027】

親遺伝子への部位特異的変異導入は、最も一般的には、導入すべきヌクレオチド変異を含む変異用プライマーを用いて行うことができる。該変異用プライマーは、親遺伝子における変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を含む領域にアニーリングし、かつその変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）に代えて変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）を有するヌクレオチド配列を含むように設計すればよい。変異前及び変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）は、当業者であれば通常の教科書等に基づいて適宜認識し選択することができる。あるいは、部位特異的変異導入は、導入すべきヌクレオチド変異を含む相補的な２つのプライマーを別々に用いて変異部位の上流側及び下流側をそれぞれ増幅したＤＮＡ断片を、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）－ＰＣＲ（Ｇｅｎｅ，１９８９，７７（１）：ｐ６１－６８）により１つに連結する方法を用いることもできる。

【0028】

親遺伝子を含む鋳型ＤＮＡは、親プロ配列を含むアルカリプロテアーゼを産生する株（例えばバチルス・エスピーＫＳＭ－ＫＰ４３）などから、常法によりゲノムＤＮＡを抽出するか、又はＲＮＡを抽出し逆転写によりｃＤＮＡを合成することによって、調製することができる。あるいは、親プロ配列のアミノ酸配列に基づいて、対応するヌクレオチド配列を化学合成して鋳型ＤＮＡとして用いてもよい。必要に応じて、親遺伝子は、本発明のアルカリプロテアーゼ前駆体を発現させる形質転換体の種にあわせて、コドン至適化されてもよい。各種生物が使用するコドンの情報は、Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（[www.kazusa.or.jp/codon/]）から入手可能である。

【0029】

親遺伝子は、親プロ配列のみをコードしていてもよいが、親プロ配列と成熟酵素領域を含むアルカリプロテアーゼのプロタンパク質、又はシグナル配列と親プロ配列と成熟酵素領域を含むアルカリプロテアーゼのプレプロタンパク質をコードしていてもよい。親遺伝子の例としては、配列番号１のアミノ配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ配列をコードするポリヌクレオチド、配列番号５のヌクレオチド配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、などが挙げられる。

【0030】

例えば、親遺伝子から改変プロ配列のみをコードする変異遺伝子を作成し、これを宿主のゲノム上の親プロ配列と置き換えてもよい。あるいは、改変プロ配列をコードするポリヌクレオチドとアルカリプロテアーゼの成熟酵素をコードするポリヌクレオチドとを連結して変異遺伝子を作成し、これを宿主に導入し、発現させてもよい。あるいは、改変プロ配列を含むプロタンパク質又はプレプロタンパク質をコードする変異遺伝子を作成し、これを宿主に導入し、発現させてもよい。

【0031】

したがって、本発明はまた、本発明のアルカリプロテアーゼ前駆体をコードするポリヌクレオチドを提供する。当該本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖又は２本鎖のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡもしくは他の人工核酸を含み得る。該ＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡは、化学合成されていてもよい。また当該本発明のポリヌクレオチドは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に加えて、非翻訳領域（ＵＴＲ）のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。また当該本発明のポリヌクレオチドは、本発明のアルカリプロテアーゼ前駆体の産生用の形質転換体の種にあわせて、コドン至適化されていてもよい。

【0032】

本発明はまた、当該本発明のアルカリプロテアーゼ前駆体をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。該ベクターは、該本発明のポリヌクレオチドを常法により任意のベクター中に挿入することにより作製することができる。該ベクターの種類は特に限定されず、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルス、ＹＡＣベクター、シャトルベクター等の任意のベクターであってよい。また該ベクターは、限定ではないが、好ましくは、細菌内、好ましくはバチルス属細菌（例えば枯草菌又はその変異株）内で増幅可能なベクターであり、より好ましくは、バチルス属細菌内で導入遺伝子の発現を誘導可能な発現ベクターである。中でも、バチルス属細菌と他の生物のいずれでも複製可能なベクターであるシャトルベクターは、本発明の変異体を組換え生産する上で好適に用いることができる。好ましいベクターの例としては、限定するものではないが、ｐＨＡ３０４０ＳＰ６４、ｐＨＳＰ６４Ｒ又はｐＡＳＰ６４（特許第３４９２９３５号）、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（大腸菌と枯草菌の両方を形質転換可能な発現ベクター；Ｊｐｎ Ｊ Ｇｅｎｅｔ，１９８５，６０：２３５－２４３）、ｐＡＣ３（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９８８，１６：８７３２）等のシャトルベクター；ｐＵＢ１１０（Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９７８，１３４：３１８－３２９）、ｐＴＡ１０６０７（Ｐｌａｓｍｉｄ，１９８７，１８：８－１５）等のバチルス属細菌の形質転換に利用可能なプラスミドベクター、等が挙げられる。また大腸菌由来のプラスミドベクター（例えばｐＥＴ２２ｂ（＋）、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ５７、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）を用いることもできる。

【0033】

本発明のアルカリプロテアーゼ前駆体を組換え生産する場合、当該ベクターは発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターは、転写プロモーター、ターミネーター、リボソーム結合部位等の宿主における発現に必須な各種エレメント；ポリリンカー、エンハンサー等のシスエレメント；ポリＡ付加シグナル；リボソーム結合配列（ＳＤ配列）；薬剤（例えばアンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール等）耐性遺伝子等の選択マーカー遺伝子、などの有用な配列を必要に応じて含み得る。あるいは、本発明のアルカリプロテアーゼ前駆体をコードするポリヌクレオチドが、上記の有用な配列を含んでいてもよい。

【0034】

本発明はまた、本発明のアルカリプロテアーゼ前駆体をコードするポリヌクレオチド又はそれを含有するベクターを含む、形質転換体を提供する。該形質転換体は、本発明のアルカリプロテアーゼ前駆体をコードするポリヌクレオチド、又はそれを含有するベクターを宿主に導入することにより製造することができる。

【0035】

当該形質転換体の宿主としては、枯草菌等のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌や、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）菌、酵母などが挙げられ、このうちバチルス属菌が好ましく、枯草菌又はその変異株がより好ましい。したがって、本発明の形質転換体は、好ましくは組換えバチルス属細菌であり、より好ましくは枯草菌又はその変異株の組換え体である。枯草菌変異株としては、ａｐｒＸと、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡから選択される遺伝子とを欠失した株（特開２００６－１７４７０７）などが挙げられる。

【0036】

ポリヌクレオチドやベクターの宿主細胞への導入には、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、パーティクルガン法、ＰＥＧ法等の周知の形質転換技術を適用することができる。例えば枯草菌又はその変異株に適用可能な方法としては、コンピテントセル形質転換法（Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９６７，９３：１９２５－１９３７）、エレクトロポレーション法（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ，１９９０，５５：１３５－１３８）、プロトプラスト形質転換法（Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ，１９７９，１６８：１１１－１１５）、Ｔｒｉｓ－ＰＥＧ法（Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９８３，１５６：１１３０－１１３４）などが挙げられる。

【0037】

当該本発明の形質転換体から、本発明のアルカリプロテアーゼ前駆体を発現させることができる。発現したアルカリプロテアーゼ前駆体はフォールディングとプロ配列の切断を経て、アルカリプロテアーゼの成熟酵素になる。さらに、本発明のアルカリプロテアーゼ前駆体がシグナル配列を有するプレプロタンパク質である場合、該成熟酵素は細胞外に分泌生産される。本発明の改変プロ配列を含むアルカリプロテアーゼ前駆体を発現する細胞は、親プロ配列を含むアルカリプロテアーゼ前駆体を発現する細胞と比べて、アルカリプロテアーゼの成熟酵素の生産性が顕著に向上する。さらに本発明による改変プロ配列は、特許文献２に開示されるような従来の改変アルカリプロテアーゼ前駆体と比べても、成熟酵素の生産性を顕著に向上させる。

【0038】

したがって、本発明はまた、本発明の形質転換体を培養することを含むアルカリプロテアーゼの製造方法を提供する。アルカリプロテアーゼ製造のための当該形質転換体の培養は、当該分野の一般的な方法に従って行うことができる。例えば、該形質転換体が枯草菌又はその変異株である場合、その培養のための培地は、枯草菌の生育に必要な炭素源、及び無機窒素源もしくは有機窒素源を含む。炭素源としては、例えばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖、メタノールなどが挙げられる。無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが挙げられる。必要に応じて、該培地は、他の栄養素、例えば無機塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、カナマイシン、スペクチノマイシン、エリスロマイシン等）などを含んでいてもよい。培養条件、例えば温度、通気撹拌条件、培地のｐＨ及び培養時間等は、微生物の種や形質、培養スケール等に応じて適宜選択され得る。

【0039】

培養後、得られた培養物から、常法によりアルカリプロテアーゼの成熟酵素を回収する。例えば、培養物を回収し、必要に応じて超音波や加圧等による菌体破砕処理を行い、ろ過、遠心分離、限外ろ過、塩析、透析、クロマトグラフィー等を適宜組み合わせることにより、該培養物から成熟酵素を回収することができる。アルカリプロテアーゼ前駆体がシグナル配列を有し成熟酵素が細胞外に分泌生産される場合、細胞を破砕することなくアルカリプロテアーゼの成熟酵素を回収することができる。成熟酵素の精製度は特に限定されない。例えば、培養上清やその粗分離精製物を、成熟酵素を含む組成物として取得することができる。

【0040】

回収されたアルカリプロテアーゼは、衣料洗浄剤、漂白剤、硬質表面洗浄用洗浄剤、排水管洗浄剤、義歯洗浄剤、医療器具用の殺菌洗浄剤などとして使用することができる。

【0041】

本発明はまた、例示的実施形態として以下の物質、製造方法、用途、方法等を包含する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。

【0042】

〔１〕プロ配列を含むアルカリプロテアーゼであって、
該プロ配列が、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有し且つ配列番号１の３位に相当する位置にＬｅｕを有するアミノ酸配列からなり、
該アルカリプロテアーゼの成熟酵素が、配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる、
アルカリプロテアーゼ。
〔２〕好ましくは、前記プロ配列を含むアルカリプロテアーゼが、配列番号３のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるシグナル配列をさらに含む、〔１〕記載のアルカリプロテアーゼ。
〔３〕前記成熟酵素が、
好ましくはｐＨ８以上のアルカリ性領域で作用するアルカリプロテアーゼであり、
より好ましくは、以下の酵素核的性質：
ｐＨ８以上のアルカリ性領域で作用する；
酸化剤耐性を有する（該アルカリプロテアーゼを５０ｍＭ過酸化水素、５ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭブリットンロビンソン緩衝液（ｐＨ１０）中、３０℃で２０分間放置した後の残存活性が５％以上である）；
５０℃、ｐＨ１０で１０分間処理したとき８０％以上の残存活性を有する；かつ、
ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分子量が４３，０００±２，０００である、
を有するアルカリプロテアーゼである、
〔１〕又は〔２〕記載のアルカリプロテアーゼ。

【0043】

〔４〕前記〔１〕～〔３〕のいずれか１項記載のアルカリプロテアーゼをコードするポリヌクレオチド。
〔５〕好ましくは、配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる、〔４〕記載のポリヌクレオチド。
〔６〕前記〔４〕又は〔５〕記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
〔７〕前記〔４〕又は〔５〕記載のポリヌクレオチド、又は前記〔６〕記載のベクターを含有する形質転換体。
〔８〕枯草菌又はその変異株である、〔７〕記載の形質転換体。
〔９〕親プロ配列を含むアルカリプロテアーゼを発現する細胞と比べて、アルカリプロテアーゼの成熟酵素の生産性が向上している、〔７〕又は〔８〕記載の形質転換体。
〔１０〕好ましくは、前記親プロ配列が、配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号１の３位に相当する位置に、好ましくはＰｈｅ又はＰｒｏ、より好ましくはＰｈｅを有する、〔９〕記載の形質転換体。
〔１１〕前記〔７〕～〔１０〕のいずれか１項記載の形質転換体を培養することを含む、アルカリプロテアーゼの製造方法。

【0044】

〔１２〕改変プロ配列を含むアルカリプロテアーゼの製造方法であって、
配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる親プロ配列において、配列番号１の３位に相当する位置のアミノ酸残基をＬｅｕに置換することを含み、
該アルカリプロテアーゼの成熟酵素が、配列番号２のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる、
方法。
〔１３〕前記親プロ配列における配列番号１の３位に相当する位置のアミノ酸残基が、好ましくはＰｈｅ又はＰｒｏであり、より好ましくはＰｈｅである、〔１２〕記載の方法。
〔１４〕好ましくは、前記改変プロ配列を含むアルカリプロテアーゼが、配列番号３のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるシグナル配列をさらに含む、〔１２〕又は〔１３〕記載の方法。
〔１５〕前記成熟酵素が、
好ましくはｐＨ８以上のアルカリ性領域で作用するアルカリプロテアーゼであり、
より好ましくは、以下の酵素核的性質：
ｐＨ８以上のアルカリ性領域で作用する；
酸化剤耐性を有する（該アルカリプロテアーゼを５０ｍＭ過酸化水素、５ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭブリットンロビンソン緩衝液（ｐＨ１０）中、３０℃で２０分間放置した後の残存活性が５％以上である）；
５０℃、ｐＨ１０で１０分間処理したとき８０％以上の残存活性を有する；かつ、
ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分子量が４３，０００±２，０００である、
を有するアルカリプロテアーゼである、
〔１２〕～〔１４〕のいずれか１項記載の方法。

【実施例】

【0045】

以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。

【0046】

（１）ＫＰ４３発現プラスミドの構築
プラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ）を鋳型としてプライマーペアｐＨＹ＿ＫＰ４３＿ｆｗ／ｐＨＹ＿ＫＰ４３＿ｒｖ（配列番号６及び７、表１）及びＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ）を使用してＰＣＲを行った。特開２０１０－２７３６７３の実施例記載の、配列番号５のヌクレオチド配列（配列番号４からなるアルカリプロテアーゼのプレプロタンパク質をコードする）を含むプラスミドｐＨＡ６４ＴＳＡを鋳型とし、プライマーペアＫＰ４３＿ｐＨＹ＿ｆｗ／ＫＰ４３＿ｐＨＹ＿ｒｖ（配列番号８及び９、表１）を使用して、同様にＰＣＲを行った。得られた断片を用いて、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ，ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプロトコルに従ってＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応を行った。Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応液をＥＣＯＳＴＭ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α（ニッポンジーン、３１０－０６２３６）に形質転換してプラスミド（ｐＨＹ－ＫＰ４３）を構築した。このプラスミドは、配列番号４のアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼのプレプロタンパク質（野生型ＫＰ４３）をコードする。

【0047】

（２）ＫＰ４３ Ｆ３４Ｌ変異体発現プラスミドの構築
プラスミドｐＨＹ－ＫＰ４３を鋳型としてプライマーペアＦ３４Ｌ＿ｆｗ／Ｆ３４Ｌ＿ｒｖ（配列番号１０及び１１、表１）及びＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ）を使用してＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液をＥＣＯＳＴＭ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α（ニッポンジーン、３１０－０６２３６）に形質転換してプラスミド（ｐＨＹ－ＫＰ４３ Ｆ３４Ｌ）を構築した。このプラスミドは、配列番号１の３位に相当する位置（配列番号４の３４位）のＰｈｅをＬｅｕに置換した以外は配列番号４のアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼのプレプロタンパク質（ＫＰ４３ Ｆ３４Ｌ変異体）をコードする。

【0048】

【表1】

【0049】

（３）形質転換株の作製
宿主には、枯草菌１６８株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍａｒｂｕｒｇ Ｎｏ．１６８株：Ｎａｔｕｒｅ，３９０，１９９７，ｐ．２４９）を使用した。プラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ）、ｐＨＹ－ＫＰ４３及びｐＨＹ－ＫＰ４３ Ｆ３４Ｌをそれぞれ以下の方法によって導入した。１ｍＬのＬＢ培地に枯草菌１６８株を植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで一晩振盪培養した。１ｍＬの新たなＬＢ培地にこの培養液を１０μＬ植菌して３７℃、２００ｒｐｍで３時間培養した。この培養液を遠心分離してペレットを回収した。ペレットに４ｍｇ／ｍＬのリゾチーム（ＳＩＧＭＡ）を含むＳＭＭＰ（０．５Ｍシュークロース、２０ｍＭマレイン酸二ナトリウム、２０ｍＭ塩化マグネシウム６水塩、３５％（ｗ／ｖ）Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｍｅｄｉｕｍ ３（Ｄｉｆｃｏ））を５００μＬ添加し、３７℃で１時間インキュベートした。次に遠心分離によりペレットを回収し、４００μＬのＳＭＭＰに懸濁した。懸濁液３３μＬ、各プラスミド２０ｎｇを混合し、さらに１００μＬの４０％ＰＥＧを加え攪拌し、さらにＳＭＭＰを３５０μＬ加えた後、３０℃で１時間振盪した。この液２００μＬを、テトラサイクリン（１５μｇ／ｍＬ、ＳＩＧＭＡ）を含むＤＭ３再生寒天培地（０．８％寒天（和光純薬）、０．５％コハク酸２ナトリウム６水塩、０．５％カザミノ酸テクニカル（Ｄｉｆｃｏ）、０．５％酵母エキス、０．３５％リン酸１カリウム、０．１５％リン酸２カリウム、０．５％グルコース、０．４％塩化マグネシウム６水塩、０．０１％牛血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ）、０．５％カルボキメチルセルロース、０．００５％トリパンブルー（Ｍｅｒｃｋ）及びアミノ酸混液（トリプトファン、リジン、メチオニン各１０μｇ／ｍＬ）；％は（ｗ／ｖ）％）に塗抹して３０℃で３日間インキュベートし、形成したコロニーを取得した。

【0050】

（４）酵素生産培養
１５ｐｐｍテトラサイクリンを添加したＬＢ培地５ｍＬを分注した試験管に（３）で得た組換え枯草菌コロニーを植菌した後、３０℃、２５０ｓｐｍで一晩培養した。翌日、培養液５００μＬを２×Ｌ－マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン五水和物、０．０４％塩化カルシウム二水和物、１５ｐｐｍテトラサイクリン；％は（ｗ／ｖ）％）２０ｍＬを分注したひだ付きフラスコに植菌し、３０℃、２１０ｒｐｍで３日間培養した後、菌体から産生された酵素を含む培養上清を遠心分離により回収した。

【0051】

（５）培養上清のタンパク質濃度測定
培養上清のタンパク質濃度測定にはプロテインアッセイラピッドキット ワコーII（富士フイルム和光純薬株式会社）を用いた。ＫＰ４３発現カセットを持たないｐＨＹ３００ＰＬＫ導入株の培養上清のタンパク質濃度をブランクとすることで、培養上清中のＫＰ４３の濃度を概算した。測定の結果、野生型ＫＰ４３を発現するｐＨＹ－ＫＰ４３導入株では、培養上清中のＫＰ４３濃度は１７．２ｍｇ／Ｌであった。一方、ＫＰ４３ Ｆ３４Ｌ変異体を発現するｐＨＹ－ＫＰ４３ Ｆ３４Ｌ導入株では、培養上清中のＫＰ４３濃度は４８．６ｍｇ／Ｌであった。プロ配列中の変異Ｆ３４Ｌの導入によって、野生型ＫＰ４３と比べて、ＫＰ４３成熟酵素の生産性が２．８倍に向上した（表２）。

【0052】

【表2】

【配列表】

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