7389733 ミトコンドリアを単離するための製品および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-11-21

(45)【発行日】2023-11-30

(54)【発明の名称】ミトコンドリアを単離するための製品および方法

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/12 20060101AFI20231122BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20231122BHJP

   C12N 1/02 20060101ALI20231122BHJP

【ＦＩ】

C12M1/12

C12M1/00 A

C12N1/02

【請求項の数】 29

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2020173126

(22)【出願日】2020-10-14

(62)【分割の表示】P 2017517221の分割

【原出願日】2015-06-12

(65)【公開番号】P2021013380

(43)【公開日】2021-02-12

【審査請求日】2020-11-12

(31)【優先権主張番号】62/012,045

(32)【優先日】2014-06-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】501475701

【氏名又は名称】チルドレンズ メディカル センター コーポレイション

(73)【特許権者】

【識別番号】301033259

【氏名又は名称】ベス・イスラエル・ディーコネス・メディカル・センター，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000855

【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】マッカリー、ジェームズ ディー．

(72)【発明者】

【氏名】カウアン、ダグラス ビー．

(72)【発明者】

【氏名】パカク、クリスティーナ エイ．

(72)【発明者】

【氏名】レヴィツキー、シドニー

【審査官】斉藤 貴子

(56)【参考文献】

【文献】米国特許第０２８５４１４３（ＵＳ，Ａ）

【文献】Cell Biology(Third Edition) A Laboratory Handbook，2006, Vol.2，p.69-77

【文献】Free Radical Biology & Medicine，2007, Vol.42，p.1039-1048

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｍ

Ｂ０１Ｄ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

遠心分離管内に受容されるように構成され、ルーメンと、第１及び第２の端部とを備え、各端部は開口を備える、管状本体と、
前記ルーメン内に配置及び固定される第１のフィルタであって、３０μｍから５０μｍの細孔サイズを有する該フィルタと、
前記ルーメン内に前記第１のフィルタに隣接して配置及び固定され、５μｍから２０μｍの細孔サイズを有する第２のフィルタと、
前記ルーメン内に前記第１のフィルタ及び前記第２のフィルタの間に配置及び固定され、３０μｍから５０μｍの細孔サイズを有する第３のフィルタと、
を含む、生存し呼吸可能なミトコンドリアを単離するための濾過装置であって、
生存ミトコンドリアを含む細胞ホモジネートを前記第２のフィルタに通すことによって得られた濾液内に、生存し呼吸可能なミトコンドリアを収集する、
上記濾過装置。

【請求項2】

遠心分離管内に受容されるように構成され、ルーメンと、第１及び第２の端部とを備え、各端部は開口を備える、管状本体と、
前記ルーメン内に配置及び固定される第１のフィルタであって、３０μｍから５０μｍの細孔サイズを有する該フィルタと、
前記ルーメン内に前記第１のフィルタに隣接して配置及び固定され、５μｍから２０μｍの細孔サイズを有する第２のフィルタと、
を含む、生存し呼吸可能なミトコンドリアを単離するための濾過装置であって、
濾液内に生存し呼吸可能なミトコンドリアを収集する、
上記濾過装置。

【請求項3】

遠心分離管内に受容されるように構成され、ルーメンと、第１及び第２の端部とを備え、各端部は開口を備える、管状本体と、
前記ルーメン内に配置及び固定される第１のフィルタであって、３０μｍから５０μｍの細孔サイズを有する該フィルタと、
前記ルーメン内に前記第１のフィルタに隣接して配置及び固定され、５μｍから２０μｍの細孔サイズを有する第２のフィルタと、
前記ルーメン内に前記第１のフィルタ及び前記第２のフィルタの間に配置及び固定され、１５μｍから５０μｍの細孔サイズを有する第３のフィルタと、
を含む、生存し呼吸可能なミトコンドリアを単離するための濾過装置であって、
濾液内に生存し呼吸可能なミトコンドリアを収集する、
上記濾過装置。

【請求項4】

前記第１のフィルタは、ナイロン、マイラー、ステンレス鋼、ワイヤメッシュ、アルミニウム、合成メッシュ、スペクトラ、ケブラー、プラスチック、又は紙を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の装置。

【請求項5】

前記第１のフィルタは、約４０μｍの細孔サイズを有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の装置。

【請求項6】

前記第２のフィルタは、ナイロン、マイラー、ステンレス鋼、ワイヤメッシュ、アルミニウム、合成メッシュ、スペクトラ、ケブラー、プラスチック、又は紙を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の装置。

【請求項7】

前記第２のフィルタは、約１０μｍの細孔サイズを有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の装置。

【請求項8】

前記装置が第３のフィルタを有する場合であって、前記第３のフィルタは、約４０μｍの細孔サイズを有する、請求項１又は３～７のいずれか一項に記載の装置。

【請求項9】

前記装置が第３のフィルタを有する場合であって、前記第３のフィルタは、約２０μｍの細孔サイズを有する、請求項３～７のいずれか一項に記載の装置。

【請求項10】

前記装置が第３のフィルタを有する場合であって、前記第３のフィルタは、ナイロン、マイラー、ステンレス鋼、ワイヤメッシュ、アルミニウム、合成メッシュ、スペクトラ、ケブラー、プラスチック、又は紙を含む、請求項１又は３～９のいずれか一項に記載の装置。

【請求項11】

前記装置が第３のフィルタを有する場合であって、前記装置が第４のフィルタを備える、請求項１又は３～１０のいずれか一項に記載の装置。

【請求項12】

前記第４のフィルタは、ナイロン、マイラー、ステンレス鋼、ワイヤメッシュ、アルミニウム、合成メッシュ、スペクトラ、ケブラー、プラスチック、又は紙を含む、請求項１１に記載の装置。

【請求項13】

装置が無菌である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の装置。

【請求項14】

生存ミトコンドリアを含む細胞ホモジネートを提供することと；
請求項１～１３のいずれかに記載の濾過装置を提供することと；
細胞ホモジネートを前記装置に通過させ、それにより生存ミトコンドリアを含む濾液を形成することと；
濾液を収集し、それにより生存ミトコンドリアを単離することと
を含む、生存し呼吸可能なミトコンドリアを単離するための方法。

【請求項15】

生存ミトコンドリアを含む細胞ホモジネートを提供することと；
前記細胞ホモジネートを、３０μｍから５０μｍの細孔サイズを有する第１のフィルタを通過させ；次に
５μｍから２０μｍの細孔サイズを有する第２のフィルタを通過させ、それにより濾液を形成させることと；
生存し呼吸可能なミトコンドリアを含む濾液を収集することと
を含む、生存し呼吸可能なミトコンドリアを単離するための方法。

【請求項16】

前記第１のフィルタの細孔サイズは４０μｍであり、及び前記第２のフィルタの細孔サイズは１０μｍである、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記細胞ホモジネートを、遠心分離を行うことなく前記第１のフィルタ及び前記第２のフィルタに通過させる、請求項１５又は１６に記載の方法。

【請求項18】

さらに、前記細胞ホモジネートを前記第２のフィルタを通過させる前に、１５μｍから５０μｍの細孔サイズを有する第３のフィルタに前記細胞ホモジネートを通過させることを含む、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記第３のフィルタの細孔サイズが４０μｍである、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記細胞ホモジネートを、遠心分離を行うことなく前記第１のフィルタ、前記第２のフィルタ、及び前記第３のフィルタに通過させる、請求項１８又は１９に記載の方法。

【請求項21】

さらに、細胞ホモジネートを第４のフィルタに通過させることを含む、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記細胞ホモジネートを、遠心分離を行うことなく前記第１のフィルタ、前記第２のフィルタ、前記第３のフィルタ、及び前記第４のフィルタに通過させる、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

３００ｍＭのスクロース；１０ｍＭのＫ^＋ＨＥＰＥＳ；及び１ｍＭのＫ^＋ＥＧＴＡを含む溶液中で組織を均質化し、それにより前記細胞ホモジネートを提供することを含む、請求項１４～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記細胞ホモジネートが４℃で提供される、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記第１のフィルタ及び前記第２のフィルタを装置に配置し、かつ前記濾液を収集する前に前記装置を１×ｇで遠心分離する、請求項１４～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

ミトコンドリア単離に要する時間は３０分未満である、請求項１４～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

遠心分離管内に受容されるように構成され、ルーメンと、第１及び第２の端部とを備え、各端部は開口を備える、管状本体と、
前記ルーメン内に配置及び固定される第１のフィルタであって、３０μｍから５０μｍの細孔サイズを有する該フィルタと、
前記ルーメン内に前記第１のフィルタに隣接して配置及び固定され、５μｍから２０μｍの細孔サイズを有する第２のフィルタと、
前記ルーメン内に前記第１のフィルタ及び前記第２のフィルタの間に配置及び固定され、３０μｍから５０μｍの細孔サイズを有する第３のフィルタと、
からなる、請求項１に記載の濾過装置。

【請求項28】

遠心分離管内に受容されるように構成され、ルーメンと、第１及び第２の端部とを備え、各端部は開口を備える、管状本体と、
前記ルーメン内に配置及び固定される第１のフィルタであって、３０μｍから５０μｍの細孔サイズを有する該フィルタと、
前記ルーメン内に前記第１のフィルタに隣接して配置及び固定され、５μｍから２０μｍの細孔サイズを有する第２のフィルタと、
からなる、請求項２に記載の濾過装置。

【請求項29】

遠心分離管内に受容されるように構成され、ルーメンと、第１及び第２の端部とを備え、各端部は開口を備える、管状本体と、
前記ルーメン内に配置及び固定される第１のフィルタであって、３０μｍから５０μｍの細孔サイズを有する該フィルタと、
前記ルーメン内に前記第１のフィルタに隣接して配置及び固定され、５μｍから２０μｍの細孔サイズを有する第２のフィルタと、
前記ルーメン内に前記第１のフィルタ及び前記第２のフィルタの間に配置及び固定され、１５μｍから５０μｍの細孔サイズを有する第３のフィルタと、
からなる、請求項３に記載の濾過装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本出願は、参照により本明細書に組み入れられる、２０１４年６月１３日に出願された米国出願第６２／０１２，０４５号の利益を主張する。
連邦政府資金による研究開発

【0002】

本発明は、国立衛生研究所により授与された助成金番号ＨＬ１０４６４２の下での米国政府援助によりなされた。政府は、本出願においてある特定の権利を有する。

【0003】

本発明は、臨床状況において使用され得る無傷生存ミトコンドリアを単離するための濾過装置、キットおよび方法に関する。

【背景技術】

【0004】

ミトコンドリアは、赤血球以外の体内の全ての細胞内に存在し、多くの重要な細胞および代謝プロセスに関与している（ｖａｎ Ｌｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ ９：１０３１－１０４２，２００２；Ｓｚａｂａｄｋａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）２３：８４－９４ ｄｏｉ：０．１１５２／ｐｈｙｓｉｏｌ．０００４６．２００７，２００８；Ｃｈａｎ，Ｃｅｌｌ １２５：１２４１－１２５２，２００６；Ｐｉｃａｒｄ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６，ｅ１８３１７，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００１８３１７，２０１１）。これらの多くの機能のため、ミトコンドリア損傷は、有害な影響を有し得る（Ｃｈａｎ，Ｃｅｌｌ １２５：１２４１－１２５２，２００６）。ミトコンドリア機能および機能不全を調査するために、いくつかのミトコンドリア単離方法が説明されている。最も早く発表されたミトコンドリア単離の記事は、１９４０年代まで遡るようである（Ｂｅｎｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｔ Ｒｅｃ ６０：４４９－４５５，１９３４；Ｃｌａｕｄｅ，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ８４：６１－８９，１９４６；Ｈｏｇｅｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １７２：６１９－６３５，１９４８；Ｅｒｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９１（３ Ｐｔ ２），２２７ｓ－２５５ｓ，１９８１）。１つの試みは、乳鉢内での肝臓組織の粉砕に続く塩溶液中での低速での遠心分離によるミトコンドリア単離を実証した（Ｂｅｎｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｔ Ｒｅｃ ６０：４４９－４５５，１９３４；Ｅｒｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９１（３ Ｐｔ ２），２２７ｓ－２５５ｓ，１９８１）。他のグループは、元の手順を拡張し、分別遠心分離に基づく組織分画を実証した（Ｃｌａｕｄｅ，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ８４：６１－８９，１９４６；Ｈｏｇｅｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １７２：６１９－６３５，１９４８；Ｅｒｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９１（３ Ｐｔ ２），２２７ｓ－２５５ｓ，１９８１）。これらの初期の方法は、多くの場合均質化および／または分別遠心分離を組み込んでいる、現在の当技術分野において知られている技法の基礎を形成した（Ｐａｌｌｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ８０：３－４４，２００７；Ｓｃｈｍｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ４４３：６６－７４，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｂ．２０１３．０８．００７，２０１３；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ－Ｖｉｚａｒｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ １０：２５３－２６２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｉｔｏ．２００９．１２．１４８，２０１０；Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ Ｃｈａｐｔｅｒ ３，Ｕｎｉｔ ３．３，ｄｏｉ：１０．１００２／０４７１１４３０３０．ｃｂ０３０３ｓ０４，２００１；Ｆｒｅｚｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ２：２８７－２９５，２００７；Ｗｉｅｃｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ４：１５８２－１５９０，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２００９．１５１，２００９；Ｇｏｓｔｉｍｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ（４３），ｐｉｉ：２２０２，ｄｏｉ：１０．３７９１／２２０２，２０１０）。均質化および遠心分離ステップの数は、プロトコル間で様々である。これらの反復ステップは、ミトコンドリア単離のための時間を増加させ、最終的に生存率を低下させる。さらに、手作業による均質化は、適切に制御されない場合、ミトコンドリア損傷、および一貫性のない結果をもたらし得る（Ｓｃｈｍｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ４４３：６６－７４，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｂ．２０１３．０８．００７，２０１３；Ｇｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ４１８：２１３－２２３，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｂ．２０１１．０７．０１７，２０１１）。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本開示は、少なくとも部分的に、分別濾過により高収率および高純度で生存呼吸可能ミトコンドリアが単離され得るという発見に基づく。特に、出願人らは、約５μｍから約２０μｍ、例えば約６μｍ、８μｍ、１０μｍ、１２μｍ、１５μｍ、または約１８μｍの細孔サイズを有するフィルタによって、ミトコンドリアが濾液中に収集され得、一方細胞残屑および他の細胞小器官は、フィルタにより保持されることを見出した。したがって、本明細書は、例えば、生存呼吸可能ミトコンドリアを単離するための濾過装置、キットおよび方法を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0006】

一態様において、本開示は、遠心分離管内に受容されるように構成され、ルーメンと、第１および第２の端部とを有し、各端部は開口を有する、管状本体と；ルーメン内に配置および固定される第１のフィルタであって、約３０μｍから約５０μｍ、例えば約３３μｍ、３５μｍ、３８μｍ、４０μｍ、４２μｍ、４５μｍ、または約４８μｍの細孔サイズを有するフィルタと；ルーメン内に第１のフィルタに隣接して配置および固定され、約５μｍから約２０μｍ、例えば約６μｍ、８μｍ、１０μｍ、１２μｍ、１５μｍ、または約１８μｍの細孔サイズを有する第２のフィルタとを有する濾過装置を提供する。いくつかの実施形態において、濾過装置は、ルーメン内に第１のフィルタおよび第２のフィルタに隣接して配置および固定され、約１５μｍから約５０μｍ、例えば約１８μｍ、２０μｍ、２２μｍ、２５μｍ、２８μｍ、３０μｍ、３３μｍ、３５μｍ、３８μｍ、４０μｍ、４２μｍ、４５μｍ、または約４８μｍの細孔サイズを有する第３のフィルタを有してもよい。いくつかの実施形態において、第１のフィルタおよび第３のフィルタは、同じ細孔サイズ、例えば３０μｍ、３３μｍ、３５μｍ、３８μｍ、４０μｍ、４２μｍ、４５μｍ、４８μｍ、または約５０μｍの細孔サイズを有する。いくつかの実施形態において、第２のフィルタおよび第３のフィルタは、同じ細孔サイズ、例えば１５μｍ、１６μｍ、１７μｍ、１８μｍ、１９μｍ、または約２０μｍの細孔サイズを有する。一実施形態において、濾過装置は、無菌であってもよい。いくつかの実施形態において、第１、第２および第３のフィルタは、ナイロン、マイラー、ステンレス鋼、ワイヤメッシュ、アルミニウム、合成メッシュ、スペクトラ、ケブラー、プラスチック、紙、またはそれらの任意の組み合わせを含む。さらに別の実施形態において、遠心分離管は、５０ｍＬの遠心分離管である。

【0007】

別の態様において、本開示は、少なくとも１個、例えば２個、３個、５個または１０個以上の上述の濾過装置、例えば、遠心分離管内に受容されるように構成され、ルーメンと、第１および第２の端部とを有し、各端部は開口を有する、管状本体と；ルーメン内に配置および固定される第１のフィルタであって、約３０μｍから約５０μｍ、例えば約３３μｍ、３５μｍ、３８μｍ、４０μｍ、４２μｍ、４５μｍ、または約４８μｍの細孔サイズを有するフィルタと；ルーメン内に第１のフィルタに隣接して配置および固定され、約５μｍから約２０μｍ、例えば約６μｍ、８μｍ、１０μｍ、１２μｍ、１５μｍ、または約１８μｍの細孔サイズを有する第２のフィルタとを有する装置を有するキットを提供する。一実施形態において、キットは、３００ｍＭのスクロース；１０ｍＭのＫ^＋ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２；および１ｍＭのＫ^＋ＥＧＴＡ、ｐＨ８．０を有する第１の溶液と；第１の溶液１ｍＬ当たり２ｍｇのサブチリシンＡ（Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ａ）を有する第２の溶液と；第１の溶液１ｍＬ当たり１０ｍｇのＢＳＡを有する第３の溶液と；第１の溶液１ｍＬ当たり１ｍｇのＢＳＡを有する第４の溶液と；５０ｍＬの遠心分離管と；１．５ｍＬの微小遠心分離管とを含んでもよい。いくつかの実施形態において、５０ｍＬの遠心分離管および１．５ｍＬの微小遠心分離管は、無菌である。

【0008】

さらに別の態様において、本開示は、生存呼吸可能ミトコンドリアを単離するための方法を提供する。方法は、生存ミトコンドリアを有する細胞ホモジネートを提供することと；上述の濾過装置、例えば、遠心分離管内に受容されるように構成され、ルーメンと、第１および第２の端部とを有し、各端部は開口を有する、管状本体と；ルーメン内に配置および固定される第１のフィルタであって、約３０μｍから約５０μｍ、例えば約３３μｍ、３５μｍ、３８μｍ、４０μｍ、４２μｍ、４５μｍ、または約４８μｍの細孔サイズを有するフィルタと；ルーメン内に第１のフィルタに隣接して配置および固定され、約５μｍから約２０μｍ、例えば約６μｍ、８μｍ、１０μｍ、１２μｍ、１５μｍ、または約１８μｍの細孔サイズを有する第２のフィルタとを有する装置を提供することと；任意選択で、濾過装置を比較的直立位置に位置付けることと；細胞ホモジネートが、第１のフィルタ、続いて第２のフィルタに接触して、それらを通して濾過され、それにより濾液を形成するように、細胞ホモジネートを第１の端部の開口内に導入することと；濾液を収集し、それにより生存ミトコンドリアを単離することとを含んでもよい。

【0009】

一実施形態において、方法は、３００ｍＭのスクロース；１０ｍＭのＫ^＋ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２；および１ｍＭのＫ^＋ＥＧＴＡ、ｐＨ８．０を含む溶液中で、組織、例えば哺乳動物組織、例えば組織生検からの哺乳動物組織を均質化し、それにより細胞ホモジネートを提供することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、細胞ホモジネートを導入する前に、３００ｍＭのスクロース；１０ｍＭのＫ^＋ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２；および１ｍＭのＫ^＋ＥＧＴＡ、ｐＨ８．０を含む溶液１ｍＬ中の１ｍｇのＢＳＡを含む溶液で、第２のフィルタを湿潤させることを含んでもよい。一実施形態において、方法は、濾液を収集する前に、装置を約１×ｇで３分間遠心分離することを含んでもよい。いくつかの実施形態において、濾液は、４℃で５分間９０００ｒｐｍで遠心分離される。一実施形態において、細胞ホモジネートは、無菌ガラス粉砕容器内で組織を均質化することにより提供され得る。

【0010】

別段に定義されていない限り、本明細書において使用されている技術的用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書において、本発明における使用のための方法および材料が記載されているが、当該技術分野において知られている他の好適な方法および材料もまた使用され得る。材料、方法、および例は例示のみを目的としており、限定を意図するものではない。本明細書において言及されるすべての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照することによりその全体が組み入れられる。不一致が生じる場合は、定義を含めて本明細書が優先される。

【0011】

本発明の他の特徴および利点は、以下の記載および図から、ならびに特許請求の範囲から明らかとなる。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】例示的濾過装置を示す概略図である。

【図2】３０分未満の全手順時間で組織解離および分別濾過を使用してミトコンドリアを単離するためのスキームを示す図である。

【図3A】骨格筋および肝臓の０．１８±０．０４ｇの組織（湿潤重量）から単離された血球計および粒子サイズカウンタのミトコンドリア数を示す棒グラフである。

【図3B】粒子サイズカウンタにより検出されたミトコンドリアサイズ分布を示す線グラフである。

【図3C】骨格筋および肝臓のミトコンドリアタンパク質（ｍｇ／ｇ）組織湿潤重量を示す棒グラフである。

【図3D】単離されたミトコンドリアの透過型電子顕微鏡像である。スケールバーは１００ｎｍである。矢印は、非ミトコンドリア粒子および損傷ミトコンドリアによる可能な汚染を示す。

【図4A】位相差照明下での単離されたミトコンドリアの顕微鏡写真である。スケールバーは、２５μｍである。

【図4B】蛍光照明下での単離されたミトコンドリアの顕微鏡写真であり、ミトコンドリアはＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＣＭＸＲｏｓにより標識化されている。スケールバーは、２５μｍである。

【図4C】蛍光照明下での単離されたミトコンドリアの顕微鏡写真であり、ミトコンドリアはＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＣＭＸＲｏｓにより標識化されている。スケールバーは、５μｍである。

【図4D】ＡＴＰアッセイにより決定されたＡＴＰ含量ｎｍｏｌ／ｍｇミトコンドリアタンパク質を示す棒グラフである。

【図4E】クラーク電極により決定された呼吸調節率（ＲＣＩ）（状態３／状態４）を示す棒グラフである。

【図5】ＡＴＰアッセイのプレートマップを示す表である。

【発明を実施するための形態】

【0013】

分別遠心分離および／またはＦｉｃｏｌｌ勾配遠心分離を使用した以前に説明されたミトコンドリア単離方法は、典型的には、完了するのに６０から１００分を必要とする。本明細書に記載されるのは、組織からのミトコンドリアの迅速な単離のための濾過装置、キットおよび方法である。本明細書に記載のある特定の方法は、組織解離器および分別濾過を使用する。この方法では、手作業の均質化を組織解離器の標準化された均質化サイクルで置き換えることができ、これによって、手作業の均質化では容易に達成されない組織の均一および一貫した均質化が可能となる。組織解離後に、細胞ホモジネートは、ナイロンメッシュフィルタを通して濾過され、これにより反復的遠心分離ステップが排除される。その結果、ミトコンドリア単離は、３０分未満で実行され得る。本明細書に記載の濾過装置、キットおよび方法を使用した典型的な単離は、０．１８±０．０４ｇ（湿潤重量）の組織試料から、約２×１０^１０個の生存した呼吸可能なミトコンドリアを得ることができる。

【0014】

本明細書に記載の濾過装置は、無傷生存ミトコンドリアを、３０分以内で、例えば２８分、２５分または２０分以内で迅速に単離するために使用され得る。ミトコンドリアを単離する方法において、標準的な分別遠心分離の代わりに分別濾過を使用することにより、標準的な分別遠心分離プロトコルを使用した場合よりも、手順時間が大幅に削減され、ミトコンドリアがより少ない機械的ストレスに供される。例えば、いくつかの遠心分離ステップを組み込んだプロトコルは、ミトコンドリアを単離するのに６０分から１００分を要し得る（Ｆｒｅｚｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ２：２８７－２９５，２００７；Ｗｉｅｃｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ４：１５８２－１５９０，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２００９．１５１，２００９；Ｇｏｓｔｉｍｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ（４３），ｐｉｉ：２２０２，ｄｏｉ：１０．３７９１／２２０２，２０１０；Ｇｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ４１８：２１３－２２３，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｂ．２０１１．０７．０１７，２０１１；Ｍａｓｕｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３０４：Ｈ９６６－Ｈ９８２，ｄｏｉ：１０．１１５２／ａｊｐｈｅａｒｔ．００８８３．２０１２，２０１３）。本発明の濾過装置、キットおよび単離方法の別の利点は、組織均質化が標準化されるという点である。組織解離器は、標準化されたサイクルを提供し、一貫した再現性のある結果を生成する。これは、使用者による変動性および非一貫性に曝される手作業の均質化とは対照的である。本発明の方法により提供される単離時間枠は、臨床的および手術治療的介入に適合する（Ｍａｓｕｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３０４：Ｈ９６６－Ｈ９８２，ｄｏｉ：１０．１１５２／ａｊｐｈｅａｒｔ．００８８３．２０１２，２０１３；ＭｃＣｕｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２９６：Ｈ９４－Ｈ１０５，ｄｏｉ：１０．１１５２／ａｊｐｈｅａｒｔ．００５６７．２００８，２００９）。

【0015】

装置
本明細書に記載の濾過装置は、以下でさらに説明され、図１に示される複数のフィルタを収容するように構成された本体（例えば管状本体）を特徴とする。本体（１０）は、遠心分離管（９０）内に適合するような形状であってもよい。本体（１０）および遠心分離管（９０）は、任意のサイズであってもよい。本体（１０）は、それぞれ開口（３０）および（７０）を有する第１および第２の端部（２０）および（８０）を有する。本体は、試料が一方の端部で本体内に設置され、ルーメン（４０）を通って移動し、例えば重力、毛管作用、および／または遠心分離により、本体内に配置された少なくとも２つのフィルタを通して試料が進行した後に、反対の端部で回収され得るように、ルーメン（４０）を有する。一方または両方の端部（２０および／または８０）は、それぞれ開口を有するが、いくつかの実施形態において、例えば無菌性を保つ、および／または濾液を収集するための領域を提供するために可逆的にキャップされ得ることが、当業者に理解されるであろう。典型的には、本体は、本体の長さに沿ってほぼ円形の断面を有する。しかしながら、本体の断面は、任意の所望の形状、例えば楕円形、正方形、長方形、三角形等であってもよいことが、当業者に理解されるであろう。いくつかの実施形態において、本体が市販の遠心分離管（９０）、例えば５０ｍＬの遠心分離管内に受容され得るように、断面はほぼ円形である。管状本体（１０）は、任意の当該技術分野において知られた材料、例えばポリプロピレンまたはポリスチレンから構築されてもよいことが、当業に理解されるであろう。本体の一方の端部、例えば端部（８０）は、遠心分離管内への本体の挿入を容易化するために、および／または本体内のフィルタ（複数を含む）の保持を補助するために、テーパ型構成（図１に示される）を有してもよい。

【0016】

装置は、ルーメン内に配置および固定される第１のフィルタ（５０）を含み、フィルタは、約３０μｍから約５０μｍ、例えば約３０μｍ、３３μｍ、３５μｍ、３８μｍ、４０μｍ、４２μｍ、４５μｍ、４８μｍ、または約５０μｍの細孔サイズを有する。第１のフィルタは、任意の当技術分野において知られたフィルタ材料、例えばナイロン、マイラー、ステンレス鋼、ワイヤメッシュ、アルミニウム、合成メッシュ、スペクトラ、ケブラー、プラスチック、紙、またはそれらの任意の組み合わせから構築されてもよい。装置はまた、ルーメン内に第１のフィルタに隣接して配置および固定され、約５μｍから約２０μｍ、例えば約５μｍ、６μｍ、８μｍ、１０μｍ、１２μｍ、１５μｍ、１８μｍ、または約２０μｍの細孔サイズを有する第２のフィルタ（６０）を含む。第２のフィルタは、任意の当技術分野において知られたフィルタ材料、例えばナイロン、マイラー、ステンレス鋼、ワイヤメッシュ、アルミニウム、合成メッシュ、スペクトラ、ケブラー、プラスチック、紙、またはそれらの任意の組み合わせから構築されてもよい。第１および第２のフィルタは、それらが互いに接触するように、またはいくらかの距離だけ離れて離間するように本体内に位置付けられてもよい。例えば、第１および第２のフィルタは、本体の使用目的および／または長さに依存して、少なくともまたは約０．５ｍｍ、例えば少なくとももしくは約１ｍｍ、２ｍｍ、３ｍｍ、４ｍｍ、５ｍｍ、８ｍｍ、１ｃｍ、２ｃｍ、５ｃｍ、または少なくとももしくは約１０ｃｍの距離だけ離して本体内に配置されてもよい。

【0017】

装置は、任意選択で、ルーメン内に第１のフィルタおよび第２のフィルタに隣接して配置および固定され、約１５μｍから約５０μｍ、例えば約１５μｍ、１８μｍ、２０μｍ、２２μｍ、２５μｍ、２８μｍ、３０μｍ、３３μｍ、３５μｍ、３８μｍ、４０μｍ、４２μｍ、４５μｍ、４８μｍ、または約５０μｍの細孔サイズを有する第３のフィルタを含んでもよい。第３のフィルタは、任意の当技術分野において知られたフィルタ材料、例えばナイロン、マイラー、ステンレス鋼、ワイヤメッシュ、アルミニウム、合成メッシュ、スペクトラ、ケブラー、プラスチック、紙、またはそれらの任意の組み合わせから構築されてもよい。第３のフィルタは、第１のフィルタと第２のフィルタとの間に配置されてもよい。いくつかの実施形態において、第３のフィルタは、第１のフィルタと第１の開口との間に、すなわち、第１のフィルタよりも第１の開口の近くに配置される。他の実施形態において、第３のフィルタは、第２のフィルタと第２の開口との間に、すなわち、第２のフィルタよりも第２の開口の近くに配置される。第３のフィルタは、第１のフィルタおよび／もしくは第２のフィルタに接触するように配置されてもよく、または、３つのフィルタは、均一に離間しても、もしくは不均一に離間してもよい。例えば、第３のフィルタが第１のフィルタと第２のフィルタとの間に配置される場合、第１および第３のフィルタは、互いに接触してもよく、あるいは、少なくともまたは約０．５ｍｍ離れて、例えば少なくとももしくは約１ｍｍ、２ｍｍ、３ｍｍ、４ｍｍ、５ｍｍ、８ｍｍ、１ｃｍ、２ｃｍ、５ｃｍ、または少なくとももしくは約１０ｃｍ離れていてもよく；第３および第２のフィルタは、互いに接触してもよく、あるいは、少なくともまたは約０．５ｍｍ離れて、例えば少なくとももしくは約１ｍｍ、２ｍｍ、３ｍｍ、４ｍｍ、５ｍｍ、８ｍｍ、１ｃｍ、２ｃｍ、５ｃｍ、または少なくとももしくは約１０ｃｍ離れていてもよい。

【0018】

いくつかの場合において、使用目的に依存してさらなるフィルタ（例えば、第４のフィルタ、第５のフィルタ、第６のフィルタ等）が追加されてもよいことが、当業者に理解されるであろう。いくつかの実施形態において、装置は、無菌である。フィルタは、任意の当技術分野において知られた方法を使用して、例えば、接着剤の使用、圧入、および／または、フィルタをルーメン内に保持させるようにルーメン壁を構成することにより（例えば、ルーメン壁が隆起部、溝、もしくは他の保持要素を有するように設計することにより）本体内に固定され得ることが、当業者に理解されるであろう。

【0019】

キット
本開示はまた、生存ミトコンドリアを単離するための、本明細書に記載の濾過装置を特徴とするキットを提供する。そのようなキットは、少なくとも１個、例えば２個、３個、５個または１０個の上述の濾過装置を含む。キットは、本明細書に記載のミトコンドリア単離方法を実行するのに有用な１種または複数種の溶液をさらに含んでもよい。例えば、キットは、３００ｍＭのスクロース；１０ｍＭのＫ^＋ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２；および１ｍＭのＫ^＋ＥＧＴＡ、ｐＨ８．０を含む第１の溶液を含んでもよい。代替として、またはそれに追加して、キットは、第１の溶液１ｍＬ当たり２ｍｇのサブチリシンＡを含む第２の溶液を含んでもよい。代替として、またはそれに追加して、キットは、第１の溶液１ｍＬ当たり１０ｍｇのＢＳＡを含む第３の溶液を含んでもよい。代替として、またはそれに追加して、キットは、不活性ヒト血清アルブミンまたはアセチル化ヒト血清アルブミンを含む溶液を含んでもよい。代替として、またはそれに追加して、キットは、第１の溶液１ｍＬ当たり１ｍｇのＢＳＡを含む第４の溶液を含んでもよい。いくつかの場合において、キットは、濾過装置を適合させることができる５０ｍＬの遠心分離管を含んでもよい。代替として、またはそれに追加して、キットは、１．５ｍＬの微小遠心分離管を含んでもよい。いくつかの一実施形態において、５０ｍＬの遠心分離管および１．５ｍＬの微小遠心分離管は、無菌である。

【0020】

ミトコンドリアを単離する方法
例示的方法において、無傷生存ミトコンドリアは、組織、例えば哺乳動物組織、例えば組織生検からの哺乳動物組織から単離される。例えば、哺乳動物からの組織は、例えばメスを用いて切り刻み、３００ｍＭスクロース；１０ｍＭのＫ^＋ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２；および１ｍＭのＫ^＋ＥＧＴＡ、ｐＨ８．０を含有する第１の溶液中で、電動式乳棒を有する無菌ガラス粉砕容器（Ｔｈｏｍａｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）内で、４℃で５から１０秒間均質化することができる。次いで、第１の溶液１ｍＬ当たり２ｍｇのサブチリシンＡを含有する溶液をホモジネートに添加し、氷上で１０分間インキュベートする。

【0021】

氷上でのインキュベーション後、細胞ホモジネートを、本明細書に記載のように、比較的直立に位置付けられた無菌濾過装置に導入する。いくつかの実施形態において、ある体積の細胞ホモジネート、例えば約１００μＬ、２００μＬ、３００μＬ、４００μＬ、５００μＬ、６００μＬ、７００μＬ、８００μＬ、９００μＬ、１ｍＬ、１．５ｍＬ、２ｍＬ、２．５ｍＬ、３ｍＬ、４ｍＬ、５ｍＬ、６ｍＬ、７ｍＬ、１０ｍＬ、１５ｍＬ、２０ｍＬ、２５ｍＬ、３０ｍＬ、３５ｍＬ、４０ｍＬ、４５ｍＬ、または約５０ｍＬを、第１の端部の開口内に、細胞ホモジネートが第２のフィルタに接触する前に第１のフィルタに接触するように導入し、例えば重力または遠心分離により両方のフィルタを通過した後に、管、例えば遠心分離管、バイアル、微小遠心分離管、または試験管内に濾液を収集し、無傷の生存呼吸可能ミトコンドリアを単離する。代替として、またはそれに追加して、濾過装置は、濾液を収集することができるキャップを第２の端部に有してもよく、重力または遠心分離により濾液が第１のフィルタ、第２のフィルタ、および存在する場合には第３のフィルタを通って流動した後に、キャップを開ける、またはねじって外して濾液を収集することができる。いくつかの実施形態において、ある体積の細胞ホモジネートを、約３０μｍから約５０μｍ、例えば約３３μｍ、３５μｍ、３８μｍ、４０μｍ、４２μｍ、４５μｍ、または約４８μｍの細孔サイズを有するフィルタに通過させることができ、任意選択で、濾液を、約１５μｍから約５０μｍ、例えば約１８μｍ、２０μｍ、２２μｍ、２５μｍ、２８μｍ、３０μｍ、３３μｍ、３５μｍ、３８μｍ、４０μｍ、４２μｍ、４５μｍ、または約４８μｍの細孔サイズを有する別のフィルタに通過させてから、約５μｍから約２０μｍ、例えば約６μｍ、８μｍ、１０μｍ、１２μｍ、１５μｍ、または約１８μｍの細孔サイズを有するフィルタに通過させることができる。

【0022】

細胞ホモジネートを濾過装置に導入する前に、３００ｍＭのスクロース；１０ｍＭのＫ^＋ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２；および１ｍＭのＫ^＋ＥＧＴＡ、ｐＨ８．０を含む溶液１ｍＬ中の１ｍｇのＢＳＡを含む溶液で、約５μｍから約２０μｍ、例えば約６μｍ、８μｍ、１０μｍ、１２μｍ、１５μｍ、または約１８μｍの細孔サイズを有するフィルタを湿潤させてもよい。本明細書に記載の方法において常に必要とされるわけではないが、濾液収集は、装置を例えば１×ｇで３分間遠心分離することにより容易化され得ることが、当業者により理解される。ミトコンドリアは、濾液を４℃で５分間９０００ｒｐｍで遠心分離することにより濃縮され得ることが、当業者により理解される。

【実施例】

【0023】

いくつかの一般的なプロトコルを以下で説明するが、これらは、本明細書に記載の方法のいずれにおいても使用することができ、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない。

【0024】

実施例１：原液
無傷の生存呼吸可能ミトコンドリアを単離するために、以下の溶液を調製した。本発明の方法を使用してミトコンドリアを成功裏に単離するために、全ての溶液および組織試料を氷上に保持し、ミトコンドリアの生存を保つべきである。氷上に維持された場合であっても、単離されたミトコンドリアは、経時的に機能活性の低下を示す（Ｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２４２：３２５－３３２，１９６７）。全ての溶液は、可能な場合には事前に調製されるべきである。
１ＭのＫ－ＨＥＰＥＳ原液（ＫＯＨでｐＨを７．２に調整）。
０．５ＭのＫ－ＥＧＴＡ原液（ＫＯＨでｐＨを８．０に調整）。
１ＭのＫＨ_２ＰＯ_４原液。
１ＭのＭｇＣｌ_２原液。
均質化緩衝液（ｐＨ７．２）：３００ｍＭのスクロース、１０ｍＭのＫ－ＨＥＰＥＳ、および１ｍＭのＫ－ＥＧＴＡ。４℃で保存した。
呼吸緩衝液：２５０ｍＭのスクロース、２ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、２０ｍＭのＫ－ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）、および０．５ｍＭのＫ－ＥＧＴＡ（ｐＨ８．０）。４℃で保存した。
１０×ＰＢＳ原液：８０ｇのＮａＣｌ、２ｇのＫＣｌ、１４．４ｇのＮａ_２ＨＰＯ_４、および２．４ｇのＫＨ_２ＰＯ_４を、１Ｌの再蒸留Ｈ_２Ｏ（ｐＨ７．４）に溶解させた。
１００ｍＬの１０×ＰＢＳを１Ｌの再蒸留Ｈ_２Ｏに滴下することにより、１×ＰＢＳを調製した。
４ｍｇのＳｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ａを１．５ｍＬの微小遠心分離管に量り入れることにより、Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ａ原液を調製した。使用するまで－２０℃で保存した。
２０ｍｇのＢＳＡを１．５ｍＬの微小遠心分離管に量り入れることにより、ＢＳＡ原液を調製した。使用するまで－２０℃で保存した。

【0025】

実施例２：ミトコンドリア単離
組織解離および分別濾過を使用したミトコンドリアの単離における手順ステップの概要を説明した図を、図２に示す。２つの６ｍｍ生検穿孔試料を、解離Ｃ管内の５ｍＬの均質化緩衝液に移し、試料を組織解離器の１分間の均質化プログラムを使用して均質化した（Ａ）。サブチリシンＡ原液（２５０μＬ）を解離Ｃ管内のホモジネートに添加し、１０分間氷上でインキュベートした（Ｂ）。氷上の５０ｍＬの円錐遠心分離管内に、事前に湿潤させた４０μｍメッシュフィルタを通してホモジネートを濾過し、次いで２５０μＬのＢＳＡ原液を濾液に添加した（Ｃ）。氷上の５０ｍＬの円錐遠心分離内に、新しい事前に湿潤させた４０μｍのメッシュフィルタを通して濾液を再び濾過した（Ｄ）。氷上の５０ｍＬの円錐遠心分離管内に、新しい事前に湿潤させた１０μｍのメッシュフィルタを通して濾液を再び濾過した（Ｅ）。濾液を１．５ｍＬの微小遠心分離管に移し、４℃で１０分間９０００×ｇで遠心分離した（Ｆ）。上清を除去し、ミトコンドリアを含有するペレットを再び懸濁させ、１ｍＬの呼吸緩衝液に組み合わせた（Ｇ）。

【0026】

単離直前に、サブチリシンＡを１ｍＬの均質化緩衝液に溶解した。単離直前に、ＢＳＡを１ｍＬの均質化緩衝液に溶解した。６ｍｍ生検試料穿孔を使用して２つの新鮮な組織試料を収集し、氷上の５０ｍＬの円錐遠心分離管内で１×ＰＢＳ中で保存した。２つの６ｍｍ組織穿孔試料を、５ｍＬの氷冷均質化緩衝液を含有する解離Ｃ管に移した。組織解離器上に解離Ｃ管を取り付け、事前設定されたミトコンドリア単離サイクル（６０秒の均質化）を選択することにより、組織を均質化した。

【0027】

解離Ｃ管を取り除いて、アイスペールに移した。サブチリシンＡ原液（２５０μＬ）をホモジネートに添加し、転倒混和し、ホモジネートを氷上で１０分間インキュベートした。４０μｍのメッシュフィルタを氷上の５０ｍＬの円錐遠心分離管上に設置し、均質化緩衝液でフィルタを予め湿潤させ、ホモジネートを氷上の５０ｍＬの円錐遠心分離管内に濾過した。

【0028】

新しく調製したＢＳＡ原液（２５０μＬ）を濾液に添加し、転倒混和した。（このステップは、ミトコンドリアタンパク質決定が必要である場合には省略した。）４０μｍのメッシュフィルタを氷上の５０ｍＬの円錐遠心分離管上に設置し、均質化緩衝液でフィルタを事前に湿潤させ、ホモジネートを氷上の５０ｍＬ円錐遠心分離管内に濾過した。１０μｍのフィルタを氷上の５０ｍＬの円錐遠心分離管上に設置し、均質化緩衝液でフィルタを事前に湿潤させ、ホモジネートを氷上の５０ｍＬ円錐遠心分離管内に濾過した。濾液を２つの事前に冷却された１．５ｍＬの微小遠心分離管に移し、４℃で１０分間９０００×ｇで遠心分離した。上清を除去し、ペレットを再び懸濁させ、１ｍＬの氷冷呼吸緩衝液に組み合わせた。

【0029】

実施例３：ＡＴＰアッセイ
単離されたミトコンドリアの代謝活性を決定するために、ＡＴＰアッセイキットを使用してＡＴＰ発光アッセイを行った。プロトコル、試薬および標準は、アッセイキットに提供されていた。手順の要約を以下に記載する。

【0030】

キット試薬を室温に平衡化した。凍結乾燥ＡＴＰペレットを１，１７０μＬの再蒸留水に溶解することにより、１０ｍＭのＡＴＰ原液を調製した。ＡＴＰ標準原液および調製されたミトコンドリア試料を氷上で保存した。

【0031】

基質緩衝溶液（５ｍＬ）を、凍結乾燥基質溶液のバイアルに添加し、穏やかに混合し、暗所に設置した。呼吸緩衝液（１００μＬ）を、黒色の不透明底部９６ウェルプレートの全てのウェルに添加した。調製された試料からのミトコンドリア（１０μＬ）を９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。試料を３つ組で播種し、標準用の列および陰性対照（呼吸緩衝液）用の３つのウェルを含めた。哺乳動物細胞溶解溶液（５０μＬ）を、標準および対照を含む全てのウェルに添加した。９６ウェルプレートを３７℃で５分間、オービタルシェーカー上で１２５ｒｐｍでインキュベートした。インキュベーションの間、ＡＴＰ標準を、１０ｍＭのＡＴＰ原液から０．１ｍＭ、０．０５ｍＭ、０．０１ｍＭ、０．００５ｍＭ、０．００１ｍＭ、および０．０００１ｍＭのＡＴＰの濃度で調製し、氷上で保存した。インキュベーション後、１０μＬのＡＴＰ標準を、プレートマップ（図５）上に示されるように対応するウェルに添加した。このプレートマップは、ＡＴＰアッセイ用に標準（Ａ１～Ａ１２）、ミトコンドリア試料（Ｂ１～Ｃ６）、および陰性対照（Ｃ７～Ｃ９）を設定する方法を示している。アッセイの間、１００μＬの呼吸緩衝液、５０μＬの哺乳動物細胞溶解溶液、および５０μＬの再構成基質溶液を全てのウェル（Ａ１～Ｃ９）に添加した。再構成された基質溶液（５０μＬ）を各ウェルに添加し、９６ウェルプレートを、オービタルシェーカー上で１２５ｒｐｍで５分間、３７℃でインキュベートした。

【0032】

プレートをＯｐｅｎ Ｇｅｎ５ １．１１ソフトウェアにより制御された分光光度計で読み出した。より高い値は、増加したＡＴＰレベルおよびより高い代謝活性に関連している。

【0033】

実施例４：代表的結果
６ｍｍ生検穿孔を使用して組織試料を得た。組織重量は０．１８±０．０４ｇ（湿潤重量）であった。粒子サイズ計数により決定された単離されたミトコンドリアの数は、骨格筋において２．４×１０^１０±０．１×１０^１０ミトコンドリア、および肝臓調製物において２．７５×１０^１０±０．１×１０^１０ミトコンドリアであった（図３Ａ）。また、比較を可能とするために、血球計によりミトコンドリア数を決定した。血球計により決定した場合、ミトコンドリアの数は少なく見積もられ、骨格筋において０．１１×１０^１０±０．０４×１０^１０ミトコンドリア、および肝臓調製物において０．３４×１０^１０±０．０９×１０^１０ミトコンドリアであった（図３Ａ）。サイズに基づく粒子カウンタにより決定されたミトコンドリア直径を、図３Ｂに示す。代表的なトレースは、単離されたミトコンドリアが、以前の報告と一致して、０．３８±０．１７μｍの平均直径で１つのピーク下に局在することを示している（Ｈｏｇｅｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １７２：６１９－６３５，１９４８）。

【0034】

ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイにより決定されたミトコンドリアタンパク質／ｇ（湿潤重量）出発組織は、骨格筋および肝臓試料においてそれぞれ４．８±２．９ｍｇ／ｇ（湿潤重量）および７．３±３．５ｍｇ／ｇ（湿潤重量）であった（図３Ｃ）。

【0035】

透過型電子顕微鏡によりミトコンドリア純度を決定したが、これを図３Ｄに示す。ミトコンドリアは、電子密度が高いように観察され、破砕または損傷しているのは０．０１％未満である。非ミトコンドリア粒子による汚染は、０．００１％未満である。

【0036】

以前に説明されたように、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄにより、ミトコンドリア生存率を決定した（Ｍａｓｕｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３０４：Ｈ９６６－Ｈ９８２，ｄｏｉ：１０．１１５２／ａｊｐｈｅａｒｔ．００８８３．２０１２，２０１３；ＭｃＣｕｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２９６：Ｈ９４－Ｈ１０５，ｄｏｉ：１０．１１５２／ａｊｐｈｅａｒｔ．００５６７．２００８，２００９）。本発明の方法は、膜電位を維持する単離されたミトコンドリアを生成する（図４Ａ～Ｃ）。これらの画像は、ミトコンドリアが膜電位を維持したことを示している。矢印は、膜電位を有さないミトコンドリアまたは残屑を示す（図４Ａ）。

【0037】

発光アッセイキットを使用してＡＴＰを決定した。ＡＴＰアッセイのプレートマップを図５に示す。ＡＴＰ標準は、２つ組で播種した。ミトコンドリア試料および陰性対照は、３つ組で播種した。ＡＴＰ含量は、骨格筋および肝臓試料においてそれぞれ１０．６７±４．３８ｎｍｏｌ／ｍｇミトコンドリアタンパク質および１４．８３±４．３６ｎｍｏｌ／ｍｇミトコンドリアタンパク質であった（図４Ｄ）。

【0038】

以前に説明されたように、クラーク型電極を使用して、ミトコンドリア呼吸を評価した（Ｍａｓｕｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３０４：Ｈ９６６－Ｈ９８２，ｄｏｉ：１０．１１５２／ａｊｐｈｅａｒｔ．００８８３．２０１２，２０１３；ＭｃＣｕｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２９６：Ｈ９４－Ｈ１０５，ｄｏｉ：１０．１１５２／ａｊｐｈｅａｒｔ．００５６７．２００８，２００９）。ミトコンドリア酸素消費速度は、骨格筋において１７８±１７ｎＭ Ｏ_２／分／ｍｇミトコンドリアタンパク質、および肝臓調製物において１７６±２３ｎＭ Ｏ_２／分／ｍｇミトコンドリアタンパク質であった。呼吸調節率（ＲＣＩ）値は、骨格筋および肝臓試料調製物においてそれぞれ２．４５±０．３４および２．６７±０．１７であった（図４Ｅ）。これらの結果は、ミトコンドリアを単離するために手作業の均質化および分別遠心分離を使用した以前の研究において報告されたものに類似している（Ｍａｓｕｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３０４：Ｈ９６６－Ｈ９８２，ｄｏｉ：１０．１１５２／ａｊｐｈｅａｒｔ．００８８３．２０１２，２０１３；ＭｃＣｕｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２９６：Ｈ９４－Ｈ１０５，ｄｏｉ：１０．１１５２／ａｊｐｈｅａｒｔ．００５６７．２００８，２００９）。

【0039】

他の実施形態
本発明をその詳細な説明と併せて、説明してきたが、上記説明は本発明を例示することを意図し、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲を限定する意図はないことを理解されたい。他の態様、利点、および修正は、以下の特許請求の範囲内である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】