(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-11-21
(45)【発行日】2023-11-30
(54)【発明の名称】ＨＣＶ抗原のマルチエピトープ融合タンパク質およびその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 14/18 20060101AFI20231122BHJP
C07K 14/245 20060101ALI20231122BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20231122BHJP
G01N 33/576 20060101ALI20231122BHJP
C12N 15/51 20060101ALN20231122BHJP
【ＦＩ】
C07K14/18 ZNA
C07K14/245
C12P21/02 A
G01N33/576 Z
C12N15/51
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2020502704
(86)(22)【出願日】2018-07-24
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-09-24
(86)【国際出願番号】 EP2018069985
(87)【国際公開番号】W WO2019020599
(87)【国際公開日】2019-01-31
【審査請求日】2021-07-09
(31)【優先権主張番号】17183523.4
(32)【優先日】2017-07-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】591003013
【氏名又は名称】エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ－ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【氏名又は名称】中西 基晴
(72)【発明者】
【氏名】ボルハーゲン，ラルフ
(72)【発明者】
【氏名】ウプマイアー，バルバラ
(72)【発明者】
【氏名】ツァルント，トラルフ
【審査官】林 康子
(56)【参考文献】
【文献】特開２００８－２６３９８３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００７－１２７６７１（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１６／０６９７６２（ＷＯ，Ａ２）
【文献】特表２０１５－５２９２１１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００９－２８４９０２（ＪＰ，Ａ）
【文献】Journal of Immunology Research，2015年，Vol 2015 ID 762426，1-12
【文献】Immunology Letters，2002年，Vol 84 No 2，89-95
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １４／１８
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）コアタンパク質のアミノ酸配列に存在する２～６つの異なる非オーバーラップ線形ペプチドを含む、マルチエピトープ融合タンパク質であって、前記ペプチドのそれぞれが、前記マルチエピトープ融合タンパク質中に１～５重に存在し、前記異なるペプチドのそれぞれが、シャペロンアミノ酸配列を含む非ＨＣＶアミノ酸配列からなるスペーサーによって、他の前記ペプチドから分離されており、さらなるＨＣＶ特異的アミノ酸配列が、前記マルチエピトープ融合タンパク質に存在しない、マルチエピトープ融合タンパク質であって、ここで、前記２～６つの線形ペプチドのそれぞれが５～５０個のアミノ酸の長さを有し、
前記シャペロンが、ＳｌｙＤ、ＳｌｐＡ、ＦｋｐＡ、およびＳｋｐからなる群から選択される、
前記マルチエピトープ融合タンパク質。
【請求項2】
前記ＨＣＶコアタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列に対応する、請求項１に記載のマルチエピトープ融合タンパク質。
【請求項3】
前記２～６つの線形ペプチドのそれぞれが、５～３１個のアミノ酸、ある実施形態では５～２５個のアミノ酸、ある実施形態では７～２１個のアミノ酸、ある実施形態では１５～２１個のアミノ酸、ある実施形態では１５～３０個のアミノ酸の長さを有する、請求項１または２に記載のマルチエピトープ融合タンパク質。
【請求項4】
前記ＨＣＶコアタンパク質のアミノ酸配列に存在する３つの異なる線形ペプチドが、前記マルチエピトープ融合タンパク質の一部である、請求項１から３のいずれかに記載のマルチエピトープ融合タンパク質。
【請求項5】
前記３つの異なる線形ペプチドが、配列番号１のアミノ酸５５位～８０位、配列番号１のアミノ酸９０位～１２０位、および配列番号１のアミノ酸１４５位～１７５位内に存在する線形アミノ酸配列を含む、請求項４に記載のマルチエピトープ融合タンパク質。
【請求項6】
式Ｘ－スペーサー－Ｙ－スペーサー－Ｚ
（式中、Ｘ、Ｙ、およびＺは、ＨＣＶコアタンパク質に存在する異なる非オーバーラップ線形アミノ酸配列を指し、Ｚが、１～５重に存在し、スペーサーが、シャペロンアミノ酸配列を含む非ＨＣＶアミノ酸の配列を指す）
を有する、請求項１から５のいずれかに記載のマルチエピトープ融合タンパク質。
【請求項7】
Ｘが、配列番号１のアミノ酸５５位～８０位内に存在する線形アミノ酸配列を含み、Ｙが、配列番号１のアミノ酸９０位～１２０位内に存在する線形アミノ酸配列を含み、Ｚが、配列番号１のアミノ酸１４５位～１７５位内に存在する線形アミノ酸配列を含む、請求項６に記載のマルチエピトープ融合タンパク質。
【請求項8】
前記スペーサーが、少なくとも２５個の非ＨＣＶアミノ酸、ある実施形態では少なくとも１００個、ある実施形態では少なくとも１５０個、ある実施形態では少なくとも２００個、ある実施形態では２５個～２００個の非ＨＣＶアミノ酸の配列を含む、請求項１から７のいずれかに記載のマルチエピトープ融合タンパク質。
【請求項9】
配列番号４から６のいずれかからなる、請求項１から８のいずれかに記載のマルチエピトープ融合タンパク質。
【請求項10】
可溶性マルチエピトープ融合タンパク質を産生する方法であって、ａ）請求項１から９のいずれかに記載のマルチエピトープ融合タンパク質をコードする作動可能に連結された組換えＤＮＡ分子を含む発現ベクターが形質導入された宿主細胞を培養するステップと、
ｂ）前記マルチエピトープ融合タンパク質を発現させるステップと、
ｃ）前記マルチエピトープ融合タンパク質を製するステップと
を含む方法。
【請求項11】
ＨＣＶコア抗原を検出するためのインビトロ試験における、キャリブレーターおよび／またはコントロール材料としての、請求項１から９のいずれかに記載のＨＣＶコア抗原のアミノ酸配列を含むマルチエピトープ融合タンパク質の使用。
【請求項12】
インビトロイムノアッセイにおいてＨＣＶコア抗原を検出するための方法であって、請求項１から９のいずれかに記載のマルチエピトープ融合タンパク質が、キャリブレーターおよび／またはコントロール材料として使用される、方法。
【請求項13】
ＨＣＶコア抗原の検出のための試薬キットであって、別個の容器または単一の容器の別個のコンパートメントに、少なくとも１つのＨＣＶコア抗原特異的結合剤、およびキャリブレーター材料としての少なくとも１つの請求項１から９のいずれかに記載のマルチエピトープ融合タンパク質を含む、試薬キット。
【請求項14】
少なくとも２つのＨＣＶコア抗原特異的結合剤を含み、前記少なくとも２つのＨＣＶコア抗原特異的結合剤のうちの１つが、検出できるように標識されている、請求項１３に記載の試薬キット。
【請求項15】
マイクロ粒子をさらに含む、請求項１３および１４のいずれかに記載の試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
信頼性のあるコントロールおよびキャリブレーター材料は、特に、感染性疾患の分野において、血清学的インビトロ診断アッセイに欠かせない部分である。ウイルス感染診断の支援に関して、核酸試験およびウイルス抗原の検出は、当該技術分野において周知の方法に属する。Ｃ型肝炎は、肝臓に罹患し、慢性化する傾向にあるＲＮＡウイルスであるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）によって引き起こされる、世界中に蔓延しているウイルス感染症である。ＨＣＶは、血液と血液との接触によって（たとえば、静脈内薬物の使用、輸血、妊娠／出産中の母親から子への伝播によって）伝播される。ＲＮＡ試験以外では、ＨＣＶの構造抗原、たとえば、コア抗原の血清学的検出が、Ｃ型肝炎感染の早期検出の一般的な方法である。
【0002】
Ａｂｂｏｔｔ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ ＨＣＶ Ａｇ、Ｏｒｔｈｏ ＨＣＶ Ｃｏｒｅ Ａｇ ＥＩＡ、Ｆｕｊｉｒｅｂｉｏ Ｌｕｍｉｐｕｌｓｅ ＩＩ ＨＣＶコアアッセイ、Ｍｕｒｅｘ ＨＣＶ Ａｇ／Ａｂ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｍｏｎｏｌｉｓａ ＨＣＶ Ａｇ－Ａｂ Ｕｌｔｒａなど、ＨＣＶコア抗原を検出するための複数の市販キットが、入手可能である。これらのアッセイのそれぞれには、陰性標本および陽性標本を区別するための信頼性のあるカットオフを生成するために、キャリブレーション材料が必要である。定量的アッセイについては、キャリブレーション材料は、試験されている検体の機器での測定値と、この検体の実際の濃度との間の相関性を示し、それを証明するために、試験システムの読取りを調節するために使用することもできる。加えて、キャリブレーション検証材料または（品質）コントロール材料もまた、必要である。定量的アッセイについては、そのようなコントロール材料は、公知の検体濃度を有し、患者サンプルと同じ様式で試験される。コントロールの測定値により、試験システムが、報告可能な測定範囲全体にわたり、サンプルを正確に測定していることが、保証される。単に検体の存在を判定する定性的アッセイについては、コントロールの測定値により、試験システムが、適正に作動しており、したがって、品質の良い結果をもたらすことについてそれを頼ることができることが保証される。
【0003】
ＨＣＶコアのインビトロ診断アッセイについては、感染患者に由来する天然の血清または組換えで産生されたＨＣＶコア抗原のいずれかが、キャリブレーション材料として使用され、しばしば、コントロール材料としても使用される。ＨＣＶ感染症の有効な治療的処置を踏まえると、ＨＣＶ陽性患者の血清の入手可能性は、ますます困難になっている。したがって、組換えＨＣＶコア抗原を産生し、次いで、天然の血清または人工マトリックスおよび緩衝系を、組換え材料でスパイクすることが、１つの選択肢である。しかしながら、そのような人工的に産生されたマトリックスにおける回収が、天然の血清における回収と非常に近似していること、ならびに人工マトリックス自体が、いずれの干渉も引き起こさないことを、注意深く評価しなければならない。
【0004】
ヒト血清または血漿におけるＨＣＶコア抗原の安定性については、ほとんど知られていない。Ｔａｎａｋａら（Ｈｅｐａｔｏｌ Ｒｅｓ ２００３，２６（４）：２６１～２６７）は、ＨＣＶコア抗原が、２５℃で７日間インキュベートした場合に、熱的ストレスに対して非常に安定であると記載している。このストレス手順の後、依然として、ＥＬＩＳＡによりＨＣＶコア抗原を検出することができる。しかしながら、本発明者らは、コア抗原陽性のヒト血清の反応性、ならびに組換えＨＣＶコア抗原でスパイクしたサンプルの反応性は、室温で数日間保管した後に、著しく減少することを発見した。
【0005】
したがって、観察されている制限を克服する、ＨＣＶイムノアッセイをキャリブレートおよびコントロールするための、より高い長期安定性およびより長い保管寿命を有する材料を提供することが、本発明の目的である。
【発明の概要】
【0006】
本発明は、マルチエピトープ融合タンパク質、ならびにＨＣＶコア抗原を検出するためのインビトロ診断イムノアッセイにおけるキャリブレーターおよび／またはコントロールとしてのその使用に関する。マルチエピトープ融合タンパク質は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）コアタンパク質のアミノ酸配列に存在する２～６つの異なる非オーバーラップ線形ペプチドを含み、ここで、前記異なるペプチドのそれぞれは、前記マルチエピトープ融合タンパク質において、１～５重に存在し、前記異なるペプチドのそれぞれは、非ＨＣＶアミノ酸配列からなり、かつシャペロンアミノ酸配列を含む、スペーサーによって、他の前記ペプチドから分離されている。さらなるＨＣＶ特異的アミノ酸配列は、前記ポリペプチドに存在しない。
【0007】
ある実施形態において、前記線形ペプチドのそれぞれは、５～５０個のアミノ酸の長さを有し、別の実施形態では、３つの異なる線形ペプチドが、マルチエピトープ融合タンパク質に存在する。さらなる態様は、キャリブレーターもしくはコントロールまたはその両方としての前記マルチエピトープ融合タンパク質を含むマルチエピトープ融合抗原を含む、ＨＣＶコア抗原を検出するための試薬キットに関する。
開示されるアミノ酸配列の凡例
配列番号１、ＨＣＶコア、ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ２６６６４による遺伝子型１ａ（アイソレート１）、１９１個のアミノ酸
MSTNPKPQKK NKRNTNRRPQ DVKFPGGGQI VGGVYLLPRR GPRLGVRATR KTSERSQPRG
RRQPIPKARR PEGRTWAQPG YPWPLYGNEG CGWAGWLLSP RGSRPSWGPT DPRRRSRNLG
KVIDTLTCGF ADLMGYIPLV GAPLGGAARA LAHGVRVLED GVNYATGNLP GCSFSIFLLA
LLSCLTVPAS A
配列番号２、ＨＣＶエンベロープＥ１、ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ２６６６４による遺伝子型１ａ（アイソレート１）、１９２個のアミノ酸
YQVRNSTGLY HVTNDCPNSS IVYEAADAIL HTPGCVPCVR EGNASRCWVA MTPTVATRDG
KLPATQLRRH IDLLVGSATL CSALYVGDLC GSVFLVGQLF TFSPRRHWTT QGCNCSIYPG
HITGHRMAWD MMMNWSPTTA LVMAQLLRIP QAILDMIAGA HWGVLAGIAY FSMVGNWAKV
LVVLLLFAGV DA
配列番号３、ＨＣＶエンベロープＥ２、ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ２６６６４による遺伝子型１ａ（アイソレート１）、３６３個のアミノ酸
ETHVTGGSAG HTVSGFVSLL APGAKQNVQL INTNGSWHLN STALNCNDSL NTGWLAGLFY
HHKFNSSGCP ERLASCRPLT DFDQGWGPIS YANGSGPDQR PYCWHYPPKP CGIVPAKSVC
GPVYCFTPSP VVVGTTDRSG APTYSWGEND TDVFVLNNTR PPLGNWFGCT WMNSTGFTKV
CGAPPCVIGG AGNNTLHCPT DCFRKHPDAT YSRCGSGPWI TPRCLVDYPY RLWHYPCTIN
YTIFKIRMYV GGVEHRLEAA CNWTRGERCD LEDRDRSELS PLLLTTTQWQ VLPCSFTTLP
ALSTGLIHLH QNIVDVQYLY GVGSSIASWA IKWEYVVLLF LLLADARVCS CLWMMLLISQ
AEA
配列番号４、ＨＣＶコア－３エピトープのキャリブレーター（ＨＣＶコア－３Ｅｐｉ－ＥｃＳ－ＦＰ）、４３２個のアミノ酸。３つの異なるＨＣＶコアエピトープが、２つの大腸菌ＳｌｙＤスペーサーポリペプチドによって分離されている。下線で示した部分が、３つの異なるＨＣＶコアペプチドである。
MRGSGRRQPI PKARRPEGRT GGGSGGGMKV AKDLVVSLAY QVRTEDGVLV DESPVSAPLD
YLHGHGSLIS GLETALEGHE VGDKFDVAVG ANDAYGQYDE NLVQRVPKDV FMGVDELQVG
MRFLAETDQG PVPVEITAVE DDHVVVDGNH MLAGQNLKFN VEVVAIREAT EEELAHGHVH
GAHDHHHDHD HDGGGSGGGL LSPRGSRPSW GPTDPRRRSR GGGSGGGMKV AKDLVVSLAY
QVRTEDGVLV DESPVSAPLD YLHGHGSLIS GLETALEGHE VGDKFDVAVG ANDAYGQYDE
NLVQRVPKDV FMGVDELQVG MRFLAETDQG PVPVEITAVE DDHVVVDGNH MLAGQNLKFN
VEVVAIREAT EEELAHGHVH GAHDHHHDHD HDGGGSGGGA HGVRVLEDGV NYATGNLPGG
GGSGGGHHHH HH
配列番号５、ＨＣＶコア－３エピトープのキャリブレーター（ＨＣＶコア－３Ｅｐｉ－ＥｃＳ－ＦＰ、ＸＹ（Ｚ、エクストラロング、Ｃ／Ａ））、４７３個のアミノ酸。３つの異なるＨＣＶコアエピトープが、２つの大腸菌ＳｌｙＤスペーサーポリペプチドによって分離されている。下線で示した部分が、３つの異なるＨＣＶコアペプチドである。
MRGSGRRQPI PKARRPEGRT GGGSGGGMKV AKDLVVSLAY QVRTEDGVLV DESPVSAPLD
YLHGHGSLIS GLETALEGHE VGDKFDVAVG ANDAYGQYDE NLVQRVPKDV FMGVDELQVG
MRFLAETDQG PVPVEITAVE DDHVVVDGNH MLAGQNLKFN VEVVAIREAT EEELAHGHVH
GAHDHHHDHD HDGGGSGGGL LSPRGSRPSW GPTDPRRRSR GGGSGGGMKV AKDLVVSLAY
QVRTEDGVLV DESPVSAPLD YLHGHGSLIS GLETALEGHE VGDKFDVAVG ANDAYGQYDE
NLVQRVPKDV FMGVDELQVG MRFLAETDQG PVPVEITAVE DDHVVVDGNH MLAGQNLKFN
VEVVAIREAT EEELAHGHVH GAHDHHHDHD HDGGGSGGGD PRRRSRNLGK VIDTLTAGFA
DLMGYIPLVG APLGGAARAL AHGVRVLEDG VNYATGNLPG GGGSGGGHHH HHH
配列番号６、ＨＣＶコア－３エピトープのキャリブレーター（ＨＣＶコア－３Ｅｐｉ－ＥｃＳ－ＦＰ、ＸＹ（Ｚ）４）、５１３個のアミノ酸。３つの異なるＨＣＶコアエピトープが、２つの大腸菌ＳｌｙＤスペーサーポリペプチドによって分離されている。下線で示した部分は、３つの異なるＨＣＶコアペプチドを表す。Ｃ末端エピトープは、４回存在しているが、２つの他のエピトープは、単一エピトープとして存在している。
MRGSGRRQPI PKARRPEGRT GGGSGGGMKV AKDLVVSLAY QVRTEDGVLV DESPVSAPLD
YLHGHGSLIS GLETALEGHE VGDKFDVAVG ANDAYGQYDE NLVQRVPKDV FMGVDELQVG
MRFLAETDQG PVPVEITAVE DDHVVVDGNH MLAGQNLKFN VEVVAIREAT EEELAHGHVH
GAHDHHHDHD HDGGGSGGGL LSPRGSRPSW GPTDPRRRSR GGGSGGGMKV AKDLVVSLAY
QVRTEDGVLV DESPVSAPLD YLHGHGSLIS GLETALEGHE VGDKFDVAVG ANDAYGQYDE
NLVQRVPKDV FMGVDELQVG MRFLAETDQG PVPVEITAVE DDHVVVDGNH MLAGQNLKFN
VEVVAIREAT EEELAHGHVH GAHDHHHDHD HDGGGSGGGA HGVRVLEDGV NYATGNLPGG
GGSGGGAHGV RVLEDGVNYA TGNLPGGGGS GGGAHGVRVL EDGVNYATGN LPGGGGSGGG
AHGVRVLEDG VNYATGNLPG GGGSGGGHHH HHH
開示されるアミノ酸配列の凡例
配列番号１、ＨＣＶコア、ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ２６６６４による遺伝子型１ａ（アイソレート１）、１９１個のアミノ酸
MSTNPKPQKK NKRNTNRRPQ DVKFPGGGQI VGGVYLLPRR GPRLGVRATR KTSERSQPRG
RRQPIPKARR PEGRTWAQPG YPWPLYGNEG CGWAGWLLSP RGSRPSWGPT DPRRRSRNLG
KVIDTLTCGF ADLMGYIPLV GAPLGGAARA LAHGVRVLED GVNYATGNLP GCSFSIFLLA
LLSCLTVPAS A
配列番号２、ＨＣＶエンベロープＥ１、ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ２６６６４による遺伝子型１ａ（アイソレート１）、１９２個のアミノ酸
YQVRNSTGLY HVTNDCPNSS IVYEAADAIL HTPGCVPCVR EGNASRCWVA MTPTVATRDG
KLPATQLRRH IDLLVGSATL CSALYVGDLC GSVFLVGQLF TFSPRRHWTT QGCNCSIYPG
HITGHRMAWD MMMNWSPTTA LVMAQLLRIP QAILDMIAGA HWGVLAGIAY FSMVGNWAKV
LVVLLLFAGV DA
配列番号３、ＨＣＶエンベロープＥ２、ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ２６６６４による遺伝子型１ａ（アイソレート１）、３６３個のアミノ酸
ETHVTGGSAG HTVSGFVSLL APGAKQNVQL INTNGSWHLN STALNCNDSL NTGWLAGLFY
HHKFNSSGCP ERLASCRPLT DFDQGWGPIS YANGSGPDQR PYCWHYPPKP CGIVPAKSVC
GPVYCFTPSP VVVGTTDRSG APTYSWGEND TDVFVLNNTR PPLGNWFGCT WMNSTGFTKV
CGAPPCVIGG AGNNTLHCPT DCFRKHPDAT YSRCGSGPWI TPRCLVDYPY RLWHYPCTIN
YTIFKIRMYV GGVEHRLEAA CNWTRGERCD LEDRDRSELS PLLLTTTQWQ VLPCSFTTLP
ALSTGLIHLH QNIVDVQYLY GVGSSIASWA IKWEYVVLLF LLLADARVCS CLWMMLLISQ
AEA
配列番号４、ＨＣＶコア－３エピトープのキャリブレーター（ＨＣＶコア－３Ｅｐｉ－ＥｃＳ－ＦＰ）、４３２個のアミノ酸。３つの異なるＨＣＶコアエピトープが、２つの大腸菌ＳｌｙＤスペーサーポリペプチドによって分離されている。下線で示した部分が、３つの異なるＨＣＶコアペプチドである。
MRGSGRRQPI PKARRPEGRT GGGSGGGMKV AKDLVVSLAY QVRTEDGVLV DESPVSAPLD
YLHGHGSLIS GLETALEGHE VGDKFDVAVG ANDAYGQYDE NLVQRVPKDV FMGVDELQVG
MRFLAETDQG PVPVEITAVE DDHVVVDGNH MLAGQNLKFN VEVVAIREAT EEELAHGHVH
GAHDHHHDHD HDGGGSGGGL LSPRGSRPSW GPTDPRRRSR GGGSGGGMKV AKDLVVSLAY
QVRTEDGVLV DESPVSAPLD YLHGHGSLIS GLETALEGHE VGDKFDVAVG ANDAYGQYDE
NLVQRVPKDV FMGVDELQVG MRFLAETDQG PVPVEITAVE DDHVVVDGNH MLAGQNLKFN
VEVVAIREAT EEELAHGHVH GAHDHHHDHD HDGGGSGGGA HGVRVLEDGV NYATGNLPGG
GGSGGGHHHH HH
配列番号５、ＨＣＶコア－３エピトープのキャリブレーター（ＨＣＶコア－３Ｅｐｉ－ＥｃＳ－ＦＰ、ＸＹ（Ｚ、エクストラロング、Ｃ／Ａ））、４７３個のアミノ酸。３つの異なるＨＣＶコアエピトープが、２つの大腸菌ＳｌｙＤスペーサーポリペプチドによって分離されている。下線で示した部分が、３つの異なるＨＣＶコアペプチドである。
MRGSGRRQPI PKARRPEGRT GGGSGGGMKV AKDLVVSLAY QVRTEDGVLV DESPVSAPLD
YLHGHGSLIS GLETALEGHE VGDKFDVAVG ANDAYGQYDE NLVQRVPKDV FMGVDELQVG
MRFLAETDQG PVPVEITAVE DDHVVVDGNH MLAGQNLKFN VEVVAIREAT EEELAHGHVH
GAHDHHHDHD HDGGGSGGGL LSPRGSRPSW GPTDPRRRSR GGGSGGGMKV AKDLVVSLAY
QVRTEDGVLV DESPVSAPLD YLHGHGSLIS GLETALEGHE VGDKFDVAVG ANDAYGQYDE
NLVQRVPKDV FMGVDELQVG MRFLAETDQG PVPVEITAVE DDHVVVDGNH MLAGQNLKFN
VEVVAIREAT EEELAHGHVH GAHDHHHDHD HDGGGSGGGD PRRRSRNLGK VIDTLTAGFA
DLMGYIPLVG APLGGAARAL AHGVRVLEDG VNYATGNLPG GGGSGGGHHH HHH
配列番号６、ＨＣＶコア－３エピトープのキャリブレーター（ＨＣＶコア－３Ｅｐｉ－ＥｃＳ－ＦＰ、ＸＹ（Ｚ）４）、５１３個のアミノ酸。３つの異なるＨＣＶコアエピトープが、２つの大腸菌ＳｌｙＤスペーサーポリペプチドによって分離されている。下線で示した部分は、３つの異なるＨＣＶコアペプチドを表す。Ｃ末端エピトープは、４回存在しているが、２つの他のエピトープは、単一エピトープとして存在している。
MRGSGRRQPI PKARRPEGRT GGGSGGGMKV AKDLVVSLAY QVRTEDGVLV DESPVSAPLD
YLHGHGSLIS GLETALEGHE VGDKFDVAVG ANDAYGQYDE NLVQRVPKDV FMGVDELQVG
MRFLAETDQG PVPVEITAVE DDHVVVDGNH MLAGQNLKFN VEVVAIREAT EEELAHGHVH
GAHDHHHDHD HDGGGSGGGL LSPRGSRPSW GPTDPRRRSR GGGSGGGMKV AKDLVVSLAY
QVRTEDGVLV DESPVSAPLD YLHGHGSLIS GLETALEGHE VGDKFDVAVG ANDAYGQYDE
NLVQRVPKDV FMGVDELQVG MRFLAETDQG PVPVEITAVE DDHVVVDGNH MLAGQNLKFN
VEVVAIREAT EEELAHGHVH GAHDHHHDHD HDGGGSGGGA HGVRVLEDGV NYATGNLPGG
GGSGGGAHGV RVLEDGVNYA TGNLPGGGGS GGGAHGVRVL EDGVNYATGN LPGGGGSGGG
AHGVRVLEDG VNYATGNLPG GGGSGGGHHH HHH
【発明を実施するための形態】
【0008】
天然に存在する抗原に対応する組換え抗原は、天然の検体を効果的に模倣すると考えられる。ＨＣＶ抗原の部分的な配列は、先行技術分野において広範に説明されている。国際公開第ＷＯ２０１６／１７２１２１号は、全長コア抗原の部分的な配列を含むＣ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドについて説明している。開示される抗原は、ラクダ抗体を産生するため、およびその後のスクリーニングのための免疫原として使用することができる。この公開は、安定性の問題に関して言及しておらず、コア抗原をキャリブレーターまたはコントロールとして使用することについてのいずれの情報も開示していない。しかしながら、本発明者らは、使用されたマトリックス（血清、血漿、または人工マトリックス、たとえば、水性緩衝液）とは無関係に、天然の全長コア抗原に近似するサイズのＣ型肝炎コア抗原が、数日以内に、これらのマトリックスのそれぞれにおけるその反応性を、かなりの程度まで喪失することを観察した。この不安定性の原因は、不明であるが、タンパク質分解もしくは化学分解、または前記マトリックスに含有される他の物質による抗原のマスキングに起因する可能性がある。また、機械的ストレスおよび熱的ストレスも、ＨＣＶコア抗原の安定性に影響を及ぼす可能性がある。
【0009】
驚くべきことに、ほぼ全長のコア抗原（１６８個のアミノ酸）の代わりに、コア抗原の短い切片のみを、インビトロ診断イムノアッセイにおいてマルチエピトープ融合抗原として使用し、適用した場合、結果として得られるシグナル回収は、３５℃で１４日間の熱的ストレス試験において、非常に高かった。組換えマルチエピトープ融合タンパク質のシグナルの減少は、１０％未満であったが、全長コア抗原は、もともとのシグナルの約３分の２への継続的なシグナル喪失を示した。
【0010】
本発明は、したがって、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）コアタンパク質のアミノ酸配列に存在する２～６つの異なる非オーバーラップ線形ペプチドを含む、マルチエピトープ融合タンパク質であって、前記異なるペプチドのそれぞれが、前記マルチエピトープ融合タンパク質中に１～５重に存在し、前記異なるペプチドのそれぞれが、シャペロンアミノ酸配列を含む非ＨＣＶアミノ酸配列からなるスペーサーによって、他の前記ペプチドから分離されており、さらなるＨＣＶ特異的アミノ酸配列が、前記ポリペプチドに存在しない、マルチエピトープ融合タンパク質に関する。
【0011】
「マルチエピトープ融合タンパク質」という用語は、「マルチエピトープ融合抗原」と同義である。マルチエピトープ融合タンパク質は、抗体、たとえば、エピトープを検出するためのイムノアッセイにおいて試薬として適用される抗体によって特異的に認識および結合される結合部位である、１つを上回るエピトープを含む。
【0012】
本発明によるマルチエピトープ融合タンパク質は、ＨＣＶコアタンパク質のみのエピトープを含む。これは、２～６つの異なる非オーバーラップ線形ペプチドが、たとえば、コアペプチドとエンベロープペプチドの混合物のエピトープではなく、コアタンパク質の明確なエピトープを表すことを意味する。いくつかのウイルスタンパク質またはいくつかのウイルスタンパク質のエピトープが、マルチエピトープ融合タンパク質の一部、たとえば、ＨＣＶコア、ｅｎｖ、ＮＳ３、およびＮＳ４である、先行技術分野、たとえば、国際特許出願第ＷＯ９７／４４４６９号またはＣｈｉｅｎら（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １９９９，３７（５）：１３９３～１３９７）において説明されているＣ型肝炎マルチエピトープ融合抗原は、本発明によって包含されない。先行技術とは対照的に、本発明のマルチエピトープ融合タンパク質は、天然に存在するＨＣＶコア抗原に存在するエピトープを含む。代表的なＨＣＶコアタンパク質（遺伝子型１ａ、アイソレート１）のアミノ酸配列は、配列番号１に示されている。配列番号２および３は、それぞれ、エンベロープ１（Ｅ１）およびエンベロープ２（Ｅ２）のアミノ酸配列を示す。
【0013】
マルチエピトープ融合タンパク質は、上述のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）コアタンパク質のアミノ酸配列に存在する２～６つの異なる非オーバーラップ線形ペプチドを含み、ある実施形態では、３つの異なる線形ペプチドを含む。線形ペプチドは、直接配列で、アミノ酸が、１つずつ順番にペプチド結合を介して連結されたものであり、ここで、個々のアミノ酸は、互いに隣接しており、共有結合で連結されている。マルチエピトープ融合タンパク質は、共有結合で連結されたアミノ酸の継続的な中断されない連続的な鎖である。
【0014】
「非オーバーラップ」という用語は、選択されたアミノ酸領域が、天然のコア抗原内で、オーバーラップするアミノ酸配列を共通して有さない、別個のエピトープであることを意味する。例示として、アミノ酸６０位～７５位のコアエピトープがエピトープとして選択される場合、追加で選択されるエピトープは、７６位から開始し得るか、または５９位で終了し得る。６０位～７５位、９７位～１１７位、および１５２位～１７１位のエピトープの組合せは、非オーバーラップの要件を満たす例である。
【0015】
このマルチエピトープ融合タンパク質内のエピトープは、通常、連続的なポリペプチド鎖上に少なくとも５つのアミノ酸、ある実施形態では５～５０個のアミノ酸、ある実施形態では５～３１個のアミノ酸、ある実施形態では５～２５個のアミノ酸、ある実施形態では７～２１個のアミノ酸、ある実施形態では１５～２１個のアミノ酸を含む。
【0016】
ペプチドおよびポリペプチドという用語は、本明細書において、同義であると理解され、最大で５０個のアミノ酸からできた分子を指す。タンパク質という用語は、５０個を上回るアミノ酸からできたポリペプチドを指す。抗原は、ポリペプチドまたはタンパク質のいずれかであり得る。抗原という用語は、抗体がそれに特異的に結合することができるという事実を指す。抗原は、少なくとも１つのエピトープ（抗体への結合部位）を含むが、通常、１つを上回るエピトープを有する。
【0017】
通常、マルチエピトープ融合タンパク質に含まれるペプチドは、線形ペプチド配列が、イムノアッセイにおいてＨＣＶ構造タンパク質、ある実施形態ではＨＣＶコア抗原を検出する特異的試薬として適用される抗体によって認識されるエピトープに対応するような様式で、選択される。個々のペプチドは、天然の検体のある特定のエピトープを模倣する。人工的に構成されたマルチエピトープ融合タンパク質が、天然のサンプルにおけるコアタンパク質の場合のように、アッセイの指定物、すなわち、検体特異的結合剤と非常に近似する様式で反応することが、重要である。そうでなければ、インビトロ診断アッセイは、適切にキャリブレートすることができない。ある実施形態において、３つの異なる非オーバーラップ線形ペプチドは、マルチエピトープ融合タンパク質の一部である。別の実施形態において、前記３つの異なる線形ペプチドは、配列番号１のアミノ酸５５位～８０位、配列番号１のアミノ酸９０位～１２０位、および配列番号１のアミノ酸１４５位～１７５位内に存在する線形アミノ酸配列を含む。さらなる実施形態において、前記３つの異なる線形ペプチドは、配列番号１のアミノ酸６０位～７５位、配列番号１のアミノ酸９７位～１１７位、および配列番号１のアミノ酸１５２位～１７１位からなる。別の実施形態において、前記３つの異なる線形ペプチドは、配列番号１のアミノ酸６０位～７５位、配列番号１のアミノ酸９７位～１１７位、および配列番号１のアミノ酸１１１位～１７１位からなる。
【0018】
異なるＨＣＶ遺伝子型のコア抗原など、配列番号１のバリアントもまた、包含される。これらのバリアントは、開示されるアミノ酸配列の保存的または相同的置換（たとえば、システインのアラニンまたはセリンへの置換など）によって、当業者によって容易に作製することができる。この文脈における「バリアント」という用語はまた、前記ポリペプチドに実質的に類似するポリペプチドにも関連する。具体的には、バリアントは、最も出現度の高いタンパク質アイソフォームのアミノ酸配列と比較して、アミノ酸の交換、欠失、または挿入を示す、アイソフォームであり得る。一実施形態において、そのような実質的に類似するタンパク質は、最も出現度の高いタンパク質アイソフォームに対して、少なくとも９０％、別の実施形態では少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する。配列番号１のバリアントは、たとえば、ＨＣＶ遺伝子型１～７のコアアミノ酸配列である。ＨＣＶ遺伝子型、それらの出現度、および全体的な分布は、当該技術分野において十分に説明されており、たとえば、Ｍｅｓｓｉｎａら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２０１５ ６１（１）、７７～８７ページによって概説されている。
【0019】
２～６つの異なる非オーバーラップ線形ペプチドを除き、さらなるＨＣＶ特異的アミノ酸配列は、前記マルチエピトープ融合タンパク質に存在しない。「さらなるＨＣＶ特異的アミノ酸配列はない」および「非ＨＣＶアミノ酸配列」という用語は、さらなるアミノ酸片が、マルチエピトープ融合タンパク質の一部であり得ることを意味する。しかしながら、非ＨＣＶ特異的アミノ酸配列が存在する場合、これらの非ＨＣＶ特異的配列のいずれかに対する抗体が、ＨＣＶ構造抗原、たとえば、コア抗原に、高い親和性で結合することはないと予想される。そのような抗体のＨＣＶ構造抗原に対する親和性は、１０３ｌ／ｍｏｌよりも低いと予想される。２～６つの異なるペプチドのみが、患者サンプル中の抗体、またはＨＣＶ構造タンパク質を検出するために特異的イムノアッセイ試薬として使用される抗体と、免疫反応することができる。典型的には、イムノアッセイにおいてＨＣＶ構造タンパク質に特異的に結合する抗体は、前記タンパク質に対して、少なくとも１０７ｌ／ｍｏｌ、ある実施形態では１０９ｌ／ｍｏｌの親和性を有する。
【0020】
ある実施形態において、２～６つの線形ペプチドは、選択された配列がオーバーラップしないような様式で、選択される。
さらに別の実施形態において、本発明は、式Ｘ－スペーサー－Ｙ－スペーサー－Ｚ（式中、Ｘ、Ｙ、およびＺは、ＨＣＶコアタンパク質に存在する異なる非オーバーラップ線形アミノ酸配列を指し、スペーサーは、非ＨＣＶアミノ酸の配列を指し、シャペロンアミノ酸配列を含む）を有するマルチエピトープ融合タンパク質である。ある実施形態において、Ｘ、Ｙ、およびＺのそれぞれは、１～５重に存在する。別の実施形態において、Ｚは、１～５重に存在する。上記に提供されているすべての説明および定義は、本実施形態にも適用される。ある実施形態において、Ｘは、配列番号１のアミノ酸５５位～８０位内に存在する線形アミノ酸配列を含み、Ｙは、配列番号１のアミノ酸９０位～１２０位内に存在する線形アミノ酸配列を含み、Ｚは、配列番号１のアミノ酸１４５位～１７５位内に存在する線形アミノ酸配列を含む。ある実施形態において、Ｘは、配列番号１のアミノ酸位６０位～７５位からなり、Ｙは、配列番号１のアミノ酸位９７位～１１７位からなり、Ｚは、配列番号１のアミノ酸位１５２～１７１位からなり、ある実施形態では、Ｚは、配列番号１のアミノ酸位１１１～１７１位からなる。
さらに別の実施形態において、本発明は、式Ｘ－スペーサー－Ｙ－スペーサー－Ｚ（式中、Ｘ、Ｙ、およびＺは、ＨＣＶコアタンパク質に存在する異なる非オーバーラップ線形アミノ酸配列を指し、スペーサーは、非ＨＣＶアミノ酸の配列を指し、シャペロンアミノ酸配列を含む）を有するマルチエピトープ融合タンパク質である。ある実施形態において、Ｘ、Ｙ、およびＺのそれぞれは、１～５重に存在する。別の実施形態において、Ｚは、１～５重に存在する。上記に提供されているすべての説明および定義は、本実施形態にも適用される。ある実施形態において、Ｘは、配列番号１のアミノ酸５５位～８０位内に存在する線形アミノ酸配列を含み、Ｙは、配列番号１のアミノ酸９０位～１２０位内に存在する線形アミノ酸配列を含み、Ｚは、配列番号１のアミノ酸１４５位～１７５位内に存在する線形アミノ酸配列を含む。ある実施形態において、Ｘは、配列番号１のアミノ酸位６０位～７５位からなり、Ｙは、配列番号１のアミノ酸位９７位～１１７位からなり、Ｚは、配列番号１のアミノ酸位１５２～１７１位からなり、ある実施形態では、Ｚは、配列番号１のアミノ酸位１１１～１７１位からなる。
【0021】
２～６つの異なる非オーバーラップ線形ペプチドは、Ｃ型肝炎ポリタンパク質には存在しない、特に、ＨＣＶ構造抗原コアまたはｅｎｖのいずれにも存在しない、アミノ酸配列からなるスペーサーによって、分離されている。少なくとも２５個の非ＨＣＶアミノ酸、ある実施形態では少なくとも１００個、ある実施形態では少なくとも１５０個、ある実施形態では少なくとも２００個、ある実施形態では２５～２００個の非ＨＣＶアミノ酸の長さを有する任意の非ＨＣＶポリペプチドは、スペーサーとして機能し得る。ある実施形態において、スペーサーは、シャペロン、またはＨＣＶ特異的ペプチドに結合することが想定される抗体と免疫学的に交差反応しない任意の他のタンパク質の、アミノ酸配列を含む。ある実施形態において、前記シャペロンは、ＳｌｙＤ、ＳｌｐＡ、ＦｋｐＡ、およびＳｋｐからなる群から選択される。
【0022】
異なるペプチドのそれぞれは、マルチエピトープ融合タンパク質に、１～５重に存在し得る。これは、個々のエピトープの同一な反復が存在することを意味する。これらの反復的エピトープは、シャペロンアミノ酸配列によって分離されている必要はないが、非シャペロン配列、たとえば、短い非ＨＣＶペプチドを含むスペーサーによって分離されていてもよい。例として、反復されるグリシン残基のような、２～１５個のアミノ酸を含むスペーサーにより、同一なＨＣＶコアエピトープが分離されていてもよい。同一なエピトープを分離しているスペーサーのさらなる例は、アミノ酸配列ＧＧＧＳＧＧＧである。
【0023】
さらなる態様において、マルチエピトープ融合タンパク質は、たとえば、クローニング手順に起因して存在し得るか、または精製目的で必要とされ得る、さらなる非ＨＣＶアミノ酸が隣接していてもよい。これらの追加のアミノ酸は、Ｎ末端もしくはＣ末端、または両方の末端に付加され得る。
【0024】
別の実施形態において、マルチエピトープ融合タンパク質は、配列番号４からなる。さらなる実施形態において、これは、配列番号５または６からなる。
本発明のさらなる態様は、上述の節に記載されている可溶性マルチエピトープ融合タンパク質を産生する方法であって、ａ）上記に詳述されているマルチエピトープ融合タンパク質をコードする作動可能に連結された組換えＤＮＡ分子を含む発現ベクターが形質導入された宿主細胞を培養するステップと、ｂ）前記ポリペプチドを発現させるステップと、ｃ）前記ポリペプチドを精製するステップとを含む方法に関する。組換えＤＮＡ技術は、当業者に公知であり、先行技術において、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）によって、詳細に説明されている。本発明のなおも別の態様は、本発明による作動可能に連結された組換えＤＮＡ分子、すなわち、１つのＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）構造タンパク質のアミノ酸配列に存在する２～６つの異なる線形ペプチドを含むマルチエピトープ融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子を含む、発現ベクターであって、前記ペプチドのそれぞれが、非ＨＣＶアミノ酸配列からなるスペーサーによって、他の前記ペプチドから分離されており、さらなるＨＣＶ特異的アミノ酸配列が、前記ポリペプチドに存在しない、発現ベクターである。
本発明のさらなる態様は、上述の節に記載されている可溶性マルチエピトープ融合タンパク質を産生する方法であって、ａ）上記に詳述されているマルチエピトープ融合タンパク質をコードする作動可能に連結された組換えＤＮＡ分子を含む発現ベクターが形質導入された宿主細胞を培養するステップと、ｂ）前記ポリペプチドを発現させるステップと、ｃ）前記ポリペプチドを精製するステップとを含む方法に関する。組換えＤＮＡ技術は、当業者に公知であり、先行技術において、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）によって、詳細に説明されている。本発明のなおも別の態様は、本発明による作動可能に連結された組換えＤＮＡ分子、すなわち、１つのＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）構造タンパク質のアミノ酸配列に存在する２～６つの異なる線形ペプチドを含むマルチエピトープ融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子を含む、発現ベクターであって、前記ペプチドのそれぞれが、非ＨＣＶアミノ酸配列からなるスペーサーによって、他の前記ペプチドから分離されており、さらなるＨＣＶ特異的アミノ酸配列が、前記ポリペプチドに存在しない、発現ベクターである。
【0025】
さらなる態様は、ＨＣＶコア抗原の２～６つの異なる非オーバーラップ線形ペプチドを含む可溶性で安定性かつ免疫反応性のマルチエピトープ融合タンパク質を産生するための方法である。この方法は、
ａ）前記マルチエピトープ融合タンパク質をコードする遺伝子を含む上述の発現ベクターが形質導入された宿主細胞を培養するステップと、
ｂ）前記マルチエピトープ融合タンパク質をコードする遺伝子を発現させるステップと、
ｃ）前記マルチエピトープ融合タンパク質を精製するステップと
を含む。
ａ）前記マルチエピトープ融合タンパク質をコードする遺伝子を含む上述の発現ベクターが形質導入された宿主細胞を培養するステップと、
ｂ）前記マルチエピトープ融合タンパク質をコードする遺伝子を発現させるステップと、
ｃ）前記マルチエピトープ融合タンパク質を精製するステップと
を含む。
【0026】
別の実施形態において、本発明は、ＨＣＶコア抗原を検出するためのインビトロ診断試験における、キャリブレーターおよび／またはコントロール材料としての、本明細書において開示されるＨＣＶコアタンパク質のアミノ酸配列を含むマルチエピトープ融合タンパク質の使用に関する。
【0027】
ＨＣＶ抗原を検出するためのイムノアッセイを行うインビトロ診断（ＩＶＤ）機器のキャリブレーションは、次のように機能する：具体的なアッセイについてのＩＶＤ機器のキャリブレーション手順は、通常、分析装置に特異的なアッセイ指示に適したオペーレーターマニュアルに従って行われる。一般に、すべての試薬パックが、提供されたキャリブレーター材料を使用して、キャリブレーションされる。例として、ＨＣＶコア抗原については、異なるコア特異的抗体を、標識された形式および／または抗体が固相に付着するのを可能にする形式で、使用される。キャリブレーター材料、ある実施形態では本明細書に記載されるマルチエピトープ融合タンパク質は、特定のコア抗体とともにインキュベートされ、サンプルと同じ様式でプロセシングされる。シグナルを検出した後、この結果を、所定の値と比較し、適切な測定範囲が設定される。製造業者の説明書に応じて、たとえば、品質管理の所見が、指定された限度から外れている場合、キャリブレーションは、所定の間隔でかまたは必要に応じて反復される。
【0028】
ある実施形態において、本明細書に定義されるマルチエピトープ融合タンパク質は、品質コントロールのための材料として使用される。これは、マルチエピトープ融合タンパク質が、ＩＶＤシステムが適正に作動していること、および特に定量的アッセイについては、正確に測定していることを検証するために、サンプルの代わりに既定の濃度で使用される。
【0029】
本発明のなおもさらなる態様は、ＨＣＶコア抗原を検出するための方法である。前記方法は、より上記に詳細に記載されているマルチエピトープ融合タンパク質を、キャリブレーターもしくはコントロール材料またはその両方として適用する。ある実施形態において、前記方法は、ａ）体液サンプルを、少なくとも１つのＨＣＶコア抗原特異的結合剤と混合することによって、免疫反応混合物を形成するステップと、ｂ）前記免疫反応混合物を、体液サンプル中に存在するＨＣＶコア抗原が前記少なくとも１つのＨＣＶコア抗原特異的結合剤と免疫反応して、免疫反応生成物を形成することを可能にするのに十分な期間、維持するステップと、ｃ）前記免疫反応生成物のいずれかの存在および／または濃度を検出するステップとを含み、ここで、本明細書に開示されるマルチエピトープ融合タンパク質は、キャリブレーターおよび／またはコントロール材料として使用される。
【0030】
タンパク質の検出のためのイムノアッセイは、当該技術分野において周知であり、そのようなアッセイを実行するための方法ならびに実践的な応用および手順も同様に周知である。ある実施形態において、マルチエピトープ融合タンパク質は、サンドイッチ形式で使用され、ここで、前記マルチエピトープ融合タンパク質には、少なくとも２つの抗体、標識化された抗体および固相への結合を可能にする抗体が結合する。しかしながら、マルチエピトープ融合タンパク質がキャリブレーターおよび／またはコントロール材料としての機能を果たす場合、このタンパク質は検体を模倣するため、任意の検出原理（たとえば、酵素イムノアッセイ、電気化学発光アッセイ、放射性同位体アッセイなど）またはアッセイ形式（たとえば、試験ストリップアッセイ、サンドイッチアッセイ、間接的試験概念、もしくは同種アッセイなど）を選択することができる。
【0031】
本発明のある実施形態において、イムノアッセイは、マイクロ粒子を固相として適用する、粒子に基づくイムノアッセイである。「粒子」は、本明細書において使用されるとき、体積、質量、または平均サイズなどの物理的特性が帰属し得る、小さな局在化した対象物を意味する。マイクロ粒子は、したがって、対称的な、球状、本質的に球状もしくは球形の形状であり得るか、または不規則な非対称の形状もしくは形式であり得る。本発明によって想定される粒子のサイズは、多様であり得る。一実施形態において、使用されるマイクロ粒子は、球状形状であり、たとえば、ナノメートルおよびマイクロメートル範囲の直径を有するマイクロ粒子である。一実施形態において、本開示による方法において使用されるマイクロ粒子は、５０ナノメートルから２０マイクロメートルの直径を有する。さらなる実施形態では、マイクロ粒子は、１００ｎｍ～１０μｍの直径を有する。一実施形態において、本開示による方法において使用されるマイクロ粒子は、２００ｎｍ～５μｍまたは７５０ｎｍ～５μｍの直径を有する。
【0032】
本明細書において上記に定義されているマイクロ粒子は、当業者に公知の任意の好適な材料を含み得るかまたはそれからなり得る、たとえば、マイクロ粒子は、無機または有機材料を含み得るか、またはそれからなり得るか、または本質的にそれからなり得る。典型的には、マイクロ粒子は、金属もしくは金属の合金、または有機材料を含み得るか、それからなり得るか、または本質的にそれからなり得るか、あるいは、炭水化物エレメントを含み得るか、それからなり得るか、または本質的にそれからなり得る。想定されるマイクロ粒子材料の例としては、アガロース、ポリスチレン、ラテックス、ポリビニルアルコール、シリカ、および強磁性金属、合金、または複合材料が挙げられる。一実施形態において、マイクロ粒子は、磁性もしくは常磁性の金属、合金、または組成物である。さらなる実施形態において、材料は、特定の特性を有し得る、たとえば、疎水性または親水性であり得る。そのようなマイクロ粒子は、典型的に、水溶液中に分散され、小さな負の表面電荷を保持し、マイクロ粒子を分離したまま保ち、非特異的なクラスタリングを回避する。
【0033】
本発明の一実施形態において、マイクロ粒子は、常磁性マイクロ粒子であり、本開示による測定方法におけるそのような粒子の分離は、磁力によって促進される。磁力は、常磁性粒子または磁性粒子を、溶液／懸濁液から引き出し、それらを所望される通りに保持するように適用され、その間に、溶液／懸濁液の液体を除去することができ、粒子を、たとえば、洗浄および再懸濁することができる。
【0034】
当業者に公知のすべての生物学的液体は、単離されたサンプルとして使用することができる。通常使用されるサンプルは、全血、血清、血漿、尿、脳脊髄流体（脳脊髄液）、または唾液であり、ある実施形態では血清または血漿である。
【0035】
本発明の別の部分は、ＨＣＶコア抗原の検出のための試薬キットであって、別個の容器または単一の容器の別個のコンパートメントに、少なくとも１つのＨＣＶコア抗原特異的結合剤、およびキャリブレーター材料としての少なくとも１つの本明細書に定義されるマルチエピトープ融合タンパク質を含む、試薬キットに関する。
【0036】
単一の容器という用語は、Ｒｏｃｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓからのＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）分析装置シリーズなどの多くの自動分析装置について、ある特定の検体を測定するために必要とされる試薬が、試薬パックの形式で、すなわち、分析装置に適合し、目的の検体の測定に必要とされるすべての重要な試薬を異なるコンパートメントに格納する、１つの容器ユニットとして、提供されるという事実に関する。
【0037】
ある実施形態において、キットは、少なくとも２つのＨＣＶコア抗原特異的結合剤を含み、ここで、前記少なくとも２つのＨＣＶコア抗原特異的結合剤のうちの１つは、検出できるように標識されている。加えて、上記に定義されるマイクロ粒子は、試薬キットの一部であり得る。ある実施形態において、試薬キットは、結合ペアの第１のパートナーがコーティングされたマイクロ粒子を含み、前記少なくとも２つのＨＣＶコア抗原特異的結合剤のうちの第２のものは、前記結合ペアの第２のパートナーに結合されている。
【0038】
別の態様において、キットは、コントロール材料としての、本明細書に記載されるマルチエピトープ融合タンパク質を含む、追加の別個の容器を含む。
加えて、上記に定義される試薬キットは、コントロールおよび標準溶液、ならびに平均的な当業者によって使用される一般的な添加剤、緩衝剤、塩、界面活性剤などを有する１つまたは複数の溶液中の試薬を、使用のための説明書とともに含む。
加えて、上記に定義される試薬キットは、コントロールおよび標準溶液、ならびに平均的な当業者によって使用される一般的な添加剤、緩衝剤、塩、界面活性剤などを有する１つまたは複数の溶液中の試薬を、使用のための説明書とともに含む。
【0039】
以下の実施形態もまた、本発明の一部である。
１． Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）コアタンパク質のアミノ酸の配列に存在する２～６つの異なる非オーバーラップ線形ペプチドを含む、マルチエピトープ融合タンパク質であって、前記異なるペプチドのそれぞれが、１～５重に存在し、前記異なるペプチドのそれぞれが、シャペロンアミノ酸配列を含む非ＨＣＶアミノ酸配列からなるスペーサーによって、他の前記ペプチドから分離されており、さらなるＨＣＶ特異的アミノ酸配列が、前記ポリペプチドに存在しない、マルチエピトープ融合タンパク質。
２． 前記ＨＣＶコアタンパク質が、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対応する、実施形態１のいずれかに記載のマルチエピトープ融合タンパク質。
３． 前記２～６つの線形ペプチドのそれぞれが、５～５０個のアミノ酸、ある実施形態では５～３１個のアミノ酸、ある実施形態では５～２５個のアミノ酸、ある実施形態では７～２１個のアミノ酸、ある実施形態では１５～２１個のアミノ酸の長さを有する、実施形態１から２のいずれかに記載のマルチエピトープ融合タンパク質。
４． １つのＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）構造タンパク質のアミノ酸配列に存在する３つの異なる線形ペプチドが、前記マルチエピトープ融合タンパク質の一部である、実施形態１から３のいずれかに記載のマルチエピトープ融合タンパク質。
５． 前記３つの異なる線形ペプチドが、配列番号１のアミノ酸５５位～８０位、配列番号１のアミノ酸９０位～１２０位、および配列番号１のアミノ酸１４５位～１７５位内に存在する線形アミノ酸配列を含む、実施形態１から４のいずれかに記載のマルチエピトープ融合タンパク質。
６． 前記３つの異なる線形ペプチドが、配列番号１のアミノ酸６０位～７５位、配列番号１のアミノ酸９７位～１１７位、および配列番号１のアミノ酸１５２位～１７１位からなる、実施形態１から５のいずれかに記載のマルチエピトープ融合タンパク質。
７． 式
Ｘ－スペーサー－Ｙ－スペーサー－Ｚ
（式中、Ｘ、Ｙ、およびＺが、ＨＣＶコアタンパク質に存在する異なる非オーバーラップ線形アミノ酸配列を指し、スペーサーが、シャペロンアミノ酸配列を含む非ＨＣＶアミノ酸の配列を指す）
を有する、実施形態１から６のいずれかに記載のマルチエピトープ融合タンパク質。
８． Ｘが、配列番号１のアミノ酸５５位～８０位内に存在する線形アミノ酸配列を含み、Ｙが、配列番号１のアミノ酸９０位～１２０位内に存在する線形アミノ酸配列を含み、Ｚが、配列番号１のアミノ酸１４５位～１７５位内に存在する線形アミノ酸配列を含む、実施形態７に記載のマルチエピトープ融合タンパク質。
９． Ｘが、配列番号１のアミノ酸６０位～７５位からなり、Ｙが、配列番号１のアミノ酸９７位～１１７位からなり、Ｚが、配列番号１のアミノ酸１５２位～１７１位からなる、実施形態７から８のいずれかに記載のマルチエピトープ融合タンパク質。
１０． 前記スペーサーが、少なくとも２５個の非ＨＣＶアミノ酸、ある実施形態では少なくとも１００個、ある実施形態では少なくとも１５０個、ある実施形態では少なくとも２００個、ある実施形態では２５個～２００個の非ＨＣＶアミノ酸の配列を含む、実施形態１から９のいずれかに記載のマルチエピトープ融合タンパク質。
１１． 前記シャペロンが、ＳｌｙＤ、ＳｌｐＡ、ＦｋｐＡ、およびＳｋｐからなる群から選択される、実施形態１から１０のいずれかに記載のマルチエピトープ融合タンパク質。
１２． 配列番号４、５、および６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、実施形態１から１１のいずれかに記載のマルチエピトープ融合タンパク質。
１３． 可溶性マルチエピトープ融合タンパク質を産生する方法であって、
ａ）実施形態１から１２のいずれかに記載のマルチエピトープ融合タンパク質をコードする作動可能に連結された組換えＤＮＡ分子を含む発現ベクターが形質導入された宿主細胞を培養するステップと、
ｂ）前記ポリペプチドを発現させるステップと、
ｃ）前記ポリペプチドを精製するステップと
を含む方法。
１４． ＨＣＶ抗原、ある実施形態ではＨＣＶコア抗原を検出するためのインビトロ診断試験における、キャリブレーターおよび／またはコントロール材料としての、実施形態１から１２のいずれかに記載のＨＣＶコアタンパク質のアミノ酸配列を含むマルチエピトープ融合タンパク質の使用。
１５． イムノアッセイにおいてＨＣＶコア抗原を検出するための方法であって、実施形態１から１２のいずれかに記載のマルチエピトープ融合タンパク質が、キャリブレーターおよび／またはコントロール材料として使用される、方法。
１６． 単離されたサンプル中のＨＣＶコア抗原を検出するための方法であって、
ａ）体液サンプルを、少なくとも１つのＨＣＶコア抗原特異的結合剤と混合することによって、免疫反応混合物を形成するステップと、
ｂ）前記免疫反応混合物を、体液サンプル中に存在するＨＣＶコア抗原が前記少なくとも１つのＨＣＶコア抗原特異的結合剤と免疫反応して、免疫反応生成物を形成することを可能にするのに十分な期間、維持するステップと、
ｃ）前記免疫反応生成物のいずれかの存在および／または濃度を検出するステップと
を含み、
実施形態１から１２のいずれかに記載のマルチエピトープ融合タンパク質が、キャリブレーターおよび／またはコントロール材料として使用される、方法。
１７． ＨＣＶコア抗原の検出のための試薬キットであって、別個の容器または単一の容器の別個のコンパートメントに、少なくとも１つのＨＣＶコア抗原特異的結合剤、およびキャリブレーター材料としての少なくとも１つの実施形態１から１２のいずれかに記載のマルチエピトープ融合タンパク質を含む、試薬キット。
１８．少なくとも２つのＨＣＶコア抗原特異的結合剤を含み、前記少なくとも２つのＨＣＶコア抗原特異的結合剤のうちの１つが、検出できるように標識されている、実施形態１７に記載の試薬キット。
１９． マイクロ粒子をさらに含む、実施形態１７および１８のいずれかに記載の試薬キット。
２０． 前記マイクロ粒子が、結合ペアの第１のパートナーでコーティングされており、前記少なくとも２つのＨＣＶコア抗原特異的結合剤のうちの第２のものが、前記結合ペアの第２のパートナーに結合されている、実施形態１９に記載の試薬キット。
２１． 実施形態１から１２のいずれかにに記載のマルチエピトープ融合タンパク質をコントロール材料として含むさらなる別個の容器を含む、実施形態１７に記載のＨＣＶコア抗原の検出のための試薬キット。
１． Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）コアタンパク質のアミノ酸の配列に存在する２～６つの異なる非オーバーラップ線形ペプチドを含む、マルチエピトープ融合タンパク質であって、前記異なるペプチドのそれぞれが、１～５重に存在し、前記異なるペプチドのそれぞれが、シャペロンアミノ酸配列を含む非ＨＣＶアミノ酸配列からなるスペーサーによって、他の前記ペプチドから分離されており、さらなるＨＣＶ特異的アミノ酸配列が、前記ポリペプチドに存在しない、マルチエピトープ融合タンパク質。
２． 前記ＨＣＶコアタンパク質が、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対応する、実施形態１のいずれかに記載のマルチエピトープ融合タンパク質。
３． 前記２～６つの線形ペプチドのそれぞれが、５～５０個のアミノ酸、ある実施形態では５～３１個のアミノ酸、ある実施形態では５～２５個のアミノ酸、ある実施形態では７～２１個のアミノ酸、ある実施形態では１５～２１個のアミノ酸の長さを有する、実施形態１から２のいずれかに記載のマルチエピトープ融合タンパク質。
４． １つのＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）構造タンパク質のアミノ酸配列に存在する３つの異なる線形ペプチドが、前記マルチエピトープ融合タンパク質の一部である、実施形態１から３のいずれかに記載のマルチエピトープ融合タンパク質。
５． 前記３つの異なる線形ペプチドが、配列番号１のアミノ酸５５位～８０位、配列番号１のアミノ酸９０位～１２０位、および配列番号１のアミノ酸１４５位～１７５位内に存在する線形アミノ酸配列を含む、実施形態１から４のいずれかに記載のマルチエピトープ融合タンパク質。
６． 前記３つの異なる線形ペプチドが、配列番号１のアミノ酸６０位～７５位、配列番号１のアミノ酸９７位～１１７位、および配列番号１のアミノ酸１５２位～１７１位からなる、実施形態１から５のいずれかに記載のマルチエピトープ融合タンパク質。
７． 式
Ｘ－スペーサー－Ｙ－スペーサー－Ｚ
（式中、Ｘ、Ｙ、およびＺが、ＨＣＶコアタンパク質に存在する異なる非オーバーラップ線形アミノ酸配列を指し、スペーサーが、シャペロンアミノ酸配列を含む非ＨＣＶアミノ酸の配列を指す）
を有する、実施形態１から６のいずれかに記載のマルチエピトープ融合タンパク質。
８． Ｘが、配列番号１のアミノ酸５５位～８０位内に存在する線形アミノ酸配列を含み、Ｙが、配列番号１のアミノ酸９０位～１２０位内に存在する線形アミノ酸配列を含み、Ｚが、配列番号１のアミノ酸１４５位～１７５位内に存在する線形アミノ酸配列を含む、実施形態７に記載のマルチエピトープ融合タンパク質。
９． Ｘが、配列番号１のアミノ酸６０位～７５位からなり、Ｙが、配列番号１のアミノ酸９７位～１１７位からなり、Ｚが、配列番号１のアミノ酸１５２位～１７１位からなる、実施形態７から８のいずれかに記載のマルチエピトープ融合タンパク質。
１０． 前記スペーサーが、少なくとも２５個の非ＨＣＶアミノ酸、ある実施形態では少なくとも１００個、ある実施形態では少なくとも１５０個、ある実施形態では少なくとも２００個、ある実施形態では２５個～２００個の非ＨＣＶアミノ酸の配列を含む、実施形態１から９のいずれかに記載のマルチエピトープ融合タンパク質。
１１． 前記シャペロンが、ＳｌｙＤ、ＳｌｐＡ、ＦｋｐＡ、およびＳｋｐからなる群から選択される、実施形態１から１０のいずれかに記載のマルチエピトープ融合タンパク質。
１２． 配列番号４、５、および６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、実施形態１から１１のいずれかに記載のマルチエピトープ融合タンパク質。
１３． 可溶性マルチエピトープ融合タンパク質を産生する方法であって、
ａ）実施形態１から１２のいずれかに記載のマルチエピトープ融合タンパク質をコードする作動可能に連結された組換えＤＮＡ分子を含む発現ベクターが形質導入された宿主細胞を培養するステップと、
ｂ）前記ポリペプチドを発現させるステップと、
ｃ）前記ポリペプチドを精製するステップと
を含む方法。
１４． ＨＣＶ抗原、ある実施形態ではＨＣＶコア抗原を検出するためのインビトロ診断試験における、キャリブレーターおよび／またはコントロール材料としての、実施形態１から１２のいずれかに記載のＨＣＶコアタンパク質のアミノ酸配列を含むマルチエピトープ融合タンパク質の使用。
１５． イムノアッセイにおいてＨＣＶコア抗原を検出するための方法であって、実施形態１から１２のいずれかに記載のマルチエピトープ融合タンパク質が、キャリブレーターおよび／またはコントロール材料として使用される、方法。
１６． 単離されたサンプル中のＨＣＶコア抗原を検出するための方法であって、
ａ）体液サンプルを、少なくとも１つのＨＣＶコア抗原特異的結合剤と混合することによって、免疫反応混合物を形成するステップと、
ｂ）前記免疫反応混合物を、体液サンプル中に存在するＨＣＶコア抗原が前記少なくとも１つのＨＣＶコア抗原特異的結合剤と免疫反応して、免疫反応生成物を形成することを可能にするのに十分な期間、維持するステップと、
ｃ）前記免疫反応生成物のいずれかの存在および／または濃度を検出するステップと
を含み、
実施形態１から１２のいずれかに記載のマルチエピトープ融合タンパク質が、キャリブレーターおよび／またはコントロール材料として使用される、方法。
１７． ＨＣＶコア抗原の検出のための試薬キットであって、別個の容器または単一の容器の別個のコンパートメントに、少なくとも１つのＨＣＶコア抗原特異的結合剤、およびキャリブレーター材料としての少なくとも１つの実施形態１から１２のいずれかに記載のマルチエピトープ融合タンパク質を含む、試薬キット。
１８．少なくとも２つのＨＣＶコア抗原特異的結合剤を含み、前記少なくとも２つのＨＣＶコア抗原特異的結合剤のうちの１つが、検出できるように標識されている、実施形態１７に記載の試薬キット。
１９． マイクロ粒子をさらに含む、実施形態１７および１８のいずれかに記載の試薬キット。
２０． 前記マイクロ粒子が、結合ペアの第１のパートナーでコーティングされており、前記少なくとも２つのＨＣＶコア抗原特異的結合剤のうちの第２のものが、前記結合ペアの第２のパートナーに結合されている、実施形態１９に記載の試薬キット。
２１． 実施形態１から１２のいずれかにに記載のマルチエピトープ融合タンパク質をコントロール材料として含むさらなる別個の容器を含む、実施形態１７に記載のＨＣＶコア抗原の検出のための試薬キット。
【図面の簡単な説明】
【0040】
【0041】
本発明は、実施例によってさらに例証される。
【実施例】
【0042】
実施例１
方法
モノクローナル抗体
適切な動物の免疫付与に必要とされる組換えＨＣＶコア抗原は、当該技術分野において公知の標準的な技法を使用して、所望される抗原アミノ酸配列をコードするＤＮＡフラグメントを、大腸菌発現プラスミドに挿入し、続いて、タンパク質の過剰発現および精製を行うことによって得た。これらの標準的な分子生物学的方法は、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９において説明されている。
方法
モノクローナル抗体
適切な動物の免疫付与に必要とされる組換えＨＣＶコア抗原は、当該技術分野において公知の標準的な技法を使用して、所望される抗原アミノ酸配列をコードするＤＮＡフラグメントを、大腸菌発現プラスミドに挿入し、続いて、タンパク質の過剰発現および精製を行うことによって得た。これらの標準的な分子生物学的方法は、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９において説明されている。
【0043】
ＨＣＶコアに対するマウスまたはウサギモノクロ－ナル抗体は、それぞれ、当業者に公知の標準的なハイブリドーマ技術によってかまたは組換え核酸技法によって、たとえば国際公開第ＷＯ２０１６／０９１７５５号に記載されるものと類似の様式で、調製した。
【0044】
以下の実施例において捕捉化合物として使用されるＨＣＶコアタンパク質に対するモノクローナル抗体は、ＨＣＶコアタンパク質（配列番号１）のアミノ酸１５７～１６９および６５～７１のエピトープに結合する。非常に類似するエピトープおよびそれらの判定は、すでに欧州公開第ＥＰ１３０８５０７号に開示されている。検出化合物として、欧州公開第ＥＰ０９６７４８４号および同第ＥＰ１３０８５０７号にも記載されているエピトープに関連するエピトープであるアミノ酸１０２～１１２のコアエピトープに結合することができるモノクローナル抗体を、選択した。マウスおよびウサギの免疫付与については、ＨＣＶ遺伝子型１によってコードされる完全ポリタンパク質を開示しているＧｅｎｂａｎｋ受託番号Ｐ２６６６４．３ ＧＩ：１３０４５５（配列番号１）による遺伝子型１ａのＨＣＶコア抗原配列を、使用した。
【0045】
具体的には、国際公開第ＷＯ ０３／０００８７８号Ａ２、米国公開第ＵＳ ２００９／０２９１８９２号Ａ１、国際公開第ＷＯ ２０１３／１０７６３３号Ａ１に開示されている手順に従った大腸菌ＳｌｙＤを有する組換え融合タンパク質としてのアミノ酸１１０～１７１に由来するペプチド、またはＢｏｕｌａｎｔ，Ｓ．ら、２００５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：１１３５３～１１３６５により説明されている手順に従った組換えタンパク質としてのアミノ酸２～１６９に由来するペプチドのいずれかを、免疫付与に使用した。追加のアプローチにおいて、ＫＬＨ（キーホール・リンペットヘモシアニン）に連結した、アミノ酸８２～１１７に由来するペプチドを、公知の方法による免疫付与に使用した。
キャリブレーター／コントロール試薬として使用される組換えＨＣＶコア抗原
アミノ酸２～１６９に由来する組換えＨＣＶコア抗原（組換えＨＣＶコア（２～１６９））を、Ｂｏｕｌａｎｔ，Ｓ．ら、２００５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：１１３５３～１１３６５により説明されている手順に従って調製した。
キャリブレーター／コントロール試薬として使用される組換えＨＣＶコア抗原
アミノ酸２～１６９に由来する組換えＨＣＶコア抗原（組換えＨＣＶコア（２～１６９））を、Ｂｏｕｌａｎｔ，Ｓ．ら、２００５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：１１３５３～１１３６５により説明されている手順に従って調製した。
【0046】
上述の３つのモノクローナル抗ＨＣＶコア抗体のエピトープおよび２つの大腸菌ＳｌｙＤユニットを含む組換えＨＣＶコア抗原融合タンパク質（組換えＨＣＶコア－３Ｅｐｉ－ＥｃＳ－ＦＰ、配列番号４）をコードする合成遺伝子を、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎ（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）のｐＥＴ２４ａ発現プラスミドに基づいて、以下のクローニングステップを実行した。ベクターを、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化させ、記載される融合タンパク質を含むカセットを挿入した。結果として得られたプラスミドのインサートを、シーケンシングし、所望される融合タンパク質をコードすることが見出された。結果として得られたタンパク質のアミノ酸配列（配列番号４）を、本発明の配列プロトコールで示す。これは、Ｎｉ－ＮＴＡに補助される精製を促進するＣ末端ヘキサヒスチジンタグを含んでいた。組換えＨＣＶコア－３Ｅｐｉ－ＥｃＳ－ＦＰを、以下のプロトコールに従って精製した。発現プラスミドを有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地においてＯＤ６００が１になるまで成長させ、３７℃の成長温度において、１ｍＭの最終濃度までイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加することによって、サイトゾル過剰発現を誘導した。誘導の４時間後に、細胞を、遠心分離（５０００×ｇにおいて２０分間）により採取し、－２０℃で凍結させ、保管した。細胞溶解のために、凍結したペレットを、２０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．０、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０Ｕ／ｍｌのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）、１錠のＣｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）、および１錠のＣｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）ＥＤＴＡ不含（緩衝液５０ｍｌ当たり）（プロテアーゼ阻害剤カクテル）中に再懸濁させ、結果として得られた懸濁液を、高圧均質化により溶解させた。粗溶解物に、最大２０ｍＭのイミダゾールを補充した。遠心分離の後に、上清を、緩衝液Ａ（１００ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ８．０、３００ｍＭの塩化ナトリウム、２０ｍＭのイミダゾール、１錠のＣｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）ＥＤＴＡ不含（緩衝液５０ｍｌ当たり））中で事前に平衡処理したＮｉ－ＮＴＡ（ニッケル－ニトリロトリアセテート）カラムに適用した。溶出の前に、混入タンパク質を除去するために、イミダゾール濃度を、４０ｍＭに上昇させた。次いで、２５０ｍＭの濃度のイミダゾールを適用することによって、タンパク質を溶出させた。透析の後に、タンパク質を、イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）によってさらに精製した。最後に、タンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィーに供し、タンパク質を含有する画分をプールした。
タンパク質の判定
精製したポリペプチドのタンパク質濃度は、ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて計算したモル吸光係数を使用して、または比色分析ＢＣＡ法を使用して、２８０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）を判定することによって判定した。
タンパク質の判定
精製したポリペプチドのタンパク質濃度は、ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて計算したモル吸光係数を使用して、または比色分析ＢＣＡ法を使用して、２８０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）を判定することによって判定した。
【0047】
実施例２
活性化ビオチン標識試薬の合成
ビオチン－ＰＥＧｎ－ＮＨＳ－ビオチン標識試薬（ＣＡＳ番号３６５４４１－７１－０、ｎ＝エチレンオキシドユニットの数）は、ＩＲＩＳ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨから入手したか、または社内で合成したかのいずれかであった。
活性化ビオチン標識試薬の合成
ビオチン－ＰＥＧｎ－ＮＨＳ－ビオチン標識試薬（ＣＡＳ番号３６５４４１－７１－０、ｎ＝エチレンオキシドユニットの数）は、ＩＲＩＳ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨから入手したか、または社内で合成したかのいずれかであった。
【0048】
デノボ合成では、明確なエチレンオキシドユニット数のコントロールは、ＣｈｅｎおよびＢａｋｅｒ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９９，６４，６８４０～６８７３により記載される方法に従って、より短いＰＥＧ、たとえば、テトラエチレングリコールの段階的伸長によって、確実に行った。
【0049】
第１のステップにおいて、ビス－トリチル－ＰＥＧｎ１を、得た（当然ながら、ｎは、エチレングリコールユニットの数を表す）。
ジオキサン中１ＭのＨＣｌにおいて、室温で１時間撹拌することによって、１の脱保護を実行した。蒸発させた後、残渣を、透明な溶液が得られるまでメタノール中で還流させ、フラスコを、４℃で一晩保持した。濾過した後、溶液を、ヘキサンで抽出し、メタノール層を蒸発させ、乾燥させて、対応するＰＥＧｎ－ジオール２を、油またはワックスとして得た（稠度は、長さ／ＰＥＧのユニット数（ｎ）に依存する）。
ジオキサン中１ＭのＨＣｌにおいて、室温で１時間撹拌することによって、１の脱保護を実行した。蒸発させた後、残渣を、透明な溶液が得られるまでメタノール中で還流させ、フラスコを、４℃で一晩保持した。濾過した後、溶液を、ヘキサンで抽出し、メタノール層を蒸発させ、乾燥させて、対応するＰＥＧｎ－ジオール２を、油またはワックスとして得た（稠度は、長さ／ＰＥＧのユニット数（ｎ）に依存する）。
【0050】
次に、ＳｅｉｔｚおよびＫｕｎｚ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９７，６２，８１３～８２６に従い、ナトリウムに触媒されるＰＥＧｎ－ジオールのｔｅｒｔ－ブチルアクリレートへの添加によって、酸官能基の導入を行った。このようにして、化合物３を得る。
【0051】
塩化メチレン中のＨＯ－ＰＥＧｎ－ＣＯＯｔＢｕ ３（１当量）およびトリエチルアミン（２．５当量）の溶液に、メチルスルホニルクロリド（２当量）を、０℃で滴下添加した。１時間撹拌した後、水性の後処理および蒸発を続いて行った。
【0052】
ジメチルホルムアミドを室温で２日間撹拌することによって、メシレート４（１当量）を、ＮａＮ３（２当量）と直接的に反応させた。固体およびジメチルホルムアミドを除去した後、ジエチルエーテルおよびＮａ２ＣＯ３での水系後処理を続いて行った。
【0053】
粗生成物５を、１５／１の酢酸エチル／メタノールにおいて、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィーによって精製した。４／１のテトラヒドロフラン／水中で、トリフェニルホスフィン（１．１当量）とともに２４時間撹拌することによって、アジド５（１当量）の還元を行った。蒸発させた後、残渣を、水中に懸濁し、酢酸エチルで数回洗浄した。水層を、蒸発させ、乾燥させて、アミン６を無色の油として得た。
【0054】
ｔｅｒｔ－ブチルエーテルの切断を、水中５％のトリフルオロ酢酸で行った。アミノ－ＰＥＧｎ－酸７を、水での数回の蒸発によって得た。
ビオチンを、ジメチルホルムアミド中で、室温で一晩、トリエチルアミン（４当量）とともに対応するＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル８（１．０５当量）とカップリングさせることによって、導入した。蒸発させた後、粗生成物９を、アセトニトリル／水でのＲＰ－ＨＰＬＣによって精製した。
ビオチンを、ジメチルホルムアミド中で、室温で一晩、トリエチルアミン（４当量）とともに対応するＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル８（１．０５当量）とカップリングさせることによって、導入した。蒸発させた後、粗生成物９を、アセトニトリル／水でのＲＰ－ＨＰＬＣによって精製した。
【0055】
最後に、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル１０を、塩化メチレン中のＮ－ヒドロキシスクシンイミド（１．１当量）およびエチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド（１．１当量）との反応によって、形成した。反応の完了後に、反応混合物を、塩化メチレンで希釈し、水で洗浄した。蒸発および乾燥により、純粋なビオチン－ＰＥＧｎ－ＮＨＳ １０を、エチレンオキシドユニットの数に応じて、それぞれ、油、ワックス、または固体として得た。
【0056】
【化1】
【0057】
実施例３
抗体の標識化
ビオチン部分およびルテニウム部分それぞれの、抗体へのカップリング：
抗体は、当業者には完全に熟知されている、最新の手順に従って入手し、精製した。
抗体の標識化
ビオチン部分およびルテニウム部分それぞれの、抗体へのカップリング：
抗体は、当業者には完全に熟知されている、最新の手順に従って入手し、精製した。
【0058】
標識化の前に、検出抗体を、ペプシンで切断して、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを得、干渉の傾向があるＦｃフラグメントを排除した（方法は、Ａ．ＪｏｈｎｓｔｏｎｅおよびＲ．Ｔｈｏｒｐｅ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｉｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ １９８７によって説明されている）。精製したＦ（ａｂ’）２フラグメントを、さらに、ホモ二官能性架橋性スベリン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＳ）を用いて重合させ、Ｓ４００ゲル濾過クロマトグラフィーに適用して、最適なサイズ範囲のＦ（ａｂ’）２ポリマーを収集した（原理は、ＤＥ３６４０４１２において記載されている）。
【0059】
それぞれの標識の付加のために、一般に、抗体のリシンε－アミノ基を、Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミド活性化化合物による標的とした。１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度において、抗体を、それぞれ、Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミド活性化ビオチン標識試薬（ビオチン－ＰＥＧ２４－ＮＨＳ）およびＮ－ヒドロキシ－スクシンイミド活性化ルテニウム標識化試薬と反応させた。ビオチン標識またはルテニウム標識化試薬の標識／タンパク質の比は、それぞれ、５～６：１または１５：１であった。反応緩衝液は、５０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ８．５）、１５０ｍＭのＫＣｌであった。反応は、室温で１５分間実行し、Ｌ－リシンを１０ｍＭの最終濃度まで添加することによって停止させた。標識の加水分解による不活性化を回避するために、それぞれのストック溶液は、無水ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）において調製した。カップリング反応の後に、未反応の遊離ビオチンまたはルテニウム標識は、粗抗体コンジュゲートをゲル濾過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅ×２００ ＨＩ Ｌｏａｄ）に通すことによって、または透析によって、除去した。
【0060】
実施例４
プロトタイプＥｌｅｃｓｙｓ ＨＣＶコア抗原アッセイ
Ｅｌｅｃｓｙｓ ＨＣＶコア抗原プロトタイプアッセイの測定は、自動化ｃｏｂａｓ（登録商標）ｅ６０１またはｅ８０１分析装置（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）において、サンドイッチアッセイ形式で行った。この分析装置におけるシグナルの検出は、電気化学発光に基づく。このサンドイッチアッセイにおいて、１つまたは複数の捕捉抗体－ビオチンコンジュゲート（すなわち、検体特異的結合剤）は、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズの表面に固定化されている。検出抗体（さらなる検体特異的結合剤）は、シグナル伝達部分として、錯体形成したルテニウムカチオンを有する。検体の存在下において、ルテニウム錯体は、固相に架橋され、分析装置の測定セルに含まれる白金電極での励起の後に、６２０ｎｍで光を放出する。シグナル出力は、任意の光ユニット単位である。測定は、いくつかの供給源から購入したＨＣＶコア抗原陽性および陰性のヒト血清および血漿サンプル（表１および２）、ならびに組換え抗原ＨＣＶコア（２～１６９、配列番号１のアミノ酸２位～１６９位に対応する）、およびＨＣＶコア－３Ｅｐｉ－ＥｃＳ－ＦＰ（配列番号４、表１ならびに図１および２）、ＨＣＶコア－３Ｅｐｉ－ＥｃＳ－ＦＰ、ＸＹ（Ｚ、エクストラロング、Ｃ／Ａ）（配列番号５、表２および図２）、およびＨＣＶコア－３Ｅｐｉ－ＥｃＳ－ＦＰ、ＸＹ（Ｚ）４（配列番号６、表２および図２）を用いて行った。
プロトタイプＥｌｅｃｓｙｓ ＨＣＶコア抗原アッセイ
Ｅｌｅｃｓｙｓ ＨＣＶコア抗原プロトタイプアッセイの測定は、自動化ｃｏｂａｓ（登録商標）ｅ６０１またはｅ８０１分析装置（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）において、サンドイッチアッセイ形式で行った。この分析装置におけるシグナルの検出は、電気化学発光に基づく。このサンドイッチアッセイにおいて、１つまたは複数の捕捉抗体－ビオチンコンジュゲート（すなわち、検体特異的結合剤）は、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズの表面に固定化されている。検出抗体（さらなる検体特異的結合剤）は、シグナル伝達部分として、錯体形成したルテニウムカチオンを有する。検体の存在下において、ルテニウム錯体は、固相に架橋され、分析装置の測定セルに含まれる白金電極での励起の後に、６２０ｎｍで光を放出する。シグナル出力は、任意の光ユニット単位である。測定は、いくつかの供給源から購入したＨＣＶコア抗原陽性および陰性のヒト血清および血漿サンプル（表１および２）、ならびに組換え抗原ＨＣＶコア（２～１６９、配列番号１のアミノ酸２位～１６９位に対応する）、およびＨＣＶコア－３Ｅｐｉ－ＥｃＳ－ＦＰ（配列番号４、表１ならびに図１および２）、ＨＣＶコア－３Ｅｐｉ－ＥｃＳ－ＦＰ、ＸＹ（Ｚ、エクストラロング、Ｃ／Ａ）（配列番号５、表２および図２）、およびＨＣＶコア－３Ｅｐｉ－ＥｃＳ－ＦＰ、ＸＹ（Ｚ）４（配列番号６、表２および図２）を用いて行った。
【0061】
実験的ＨＣＶコア抗原アッセイは、以下のように行った。５．４％のマンニトールおよび５．９％のＤ（＋）－スクロース、０．０１％のＮ－メチルイソチアゾロン塩酸塩、０．１％のオキシプリオン、および０．４％のウシアルブミンを含有する３６ｍＭのＨＥＰＥＳ－緩衝液中の、５０μｌの正常ヒト血清、ＨＣＶ抗原陽性サンプル、または組換え抗原であるＨＣＶコア（２～１６９）、またはＨＣＶコア－３Ｅｐｉ－ＥｃＳ－ＦＰ、またはＨＣＶコア－３Ｅｐｉ－ＥｃＳ－ＦＰ、ＸＹ（Ｚ、エクストラロング、Ｃ／Ａ）、またはＨＣＶコア－３Ｅｐｉ－ＥｃＳ－ＦＰ、ＸＹ（Ｚ）４、ならびに前処置試薬（ＰＴ：０．２５Ｍ ＫＯＨ、１．１２５Ｍ ＫＣｌ、１．５％のヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド（ＨＴＡＣ）、０．８５％オクチルグリコシド）を含有する２５μｌの界面活性剤を、９分間一緒にインキュベートして、抗原を放出させた後、２つの異なる抗体－ビオチンコンジュゲート（１．５μｇ／ｍｌおよび０．９μｇ／ｍＬ）の混合物３５μｌ、ならびに同じアッセイ緩衝液（２００ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．０、２２５ｍＭのＫＣｌ、０．５％のタウロデオキシコール酸ナトリウム、０．３％の双性イオン３～１４、０．１％のオキシプリオン、０．０１％のメチルイソチアゾリノン、０．２％のウシ血清アルブミン、０．２％のウシＩｇＧ、５０μｇ／ｍｌのＭＡＫ３３－ＩｇＧ１、５０μｇ／ｍｌのＭＡＫ３３－Ｆ（ａｂ’）２－ポリ、５０μｇ／ｍｌのＭＡＫ ＩｇＧ２ｂ／Ｆａｂ２ａ－ポリ）中の１．２μｇ／ｍｌの検出抗体ルテニウム標識コンジュゲートＲ１およびＲ２ ４０μｌを添加した。さらに９分間のインキュベーションの後、５０μｌのストレプトアビジンコーティング常磁性マイクロ粒子を添加し、さらに９分間インキュベートした。その後、ＨＣＶコア抗原を検出した（これらの実験において生成された電気化学発光シグナルを介して）。
【0062】
図１は、１４日間にわたる３５℃のストレス後の、両方の組換えＨＣＶコア抗原（ほぼ全長の組換えＨＣＶコア、組換えＨＣＶコア（２～１６９）、および組換えＨＣＶコア－３Ｅｐｉ－ＥｃＳ－ＦＰ）のシグナル回収を示す。０日目（熱的ストレスよりも前）に、両方のキャリブレーターを比較するために、両方のキャリブレーターのシグナルを、１００％として設定した。しかしながら、熱的ストレスの期間（キャリブレーターの３５℃でのインキュベーション）の間は、マルチエピトープ融合タンパク質を含むキャリブレーターが、コア（２～１６９）キャリブレーターよりも優れており、組換えＨＣＶコア－３Ｅｐｉ－ＥｃＳ－ＦＰのシグナルは、４日後には１０％未満減少し、熱的ストレス後の数日間、安定なままであった。もとのシグナルの約３分の２までのＨＣＶコア（２～１６９）の継続的なシグナル喪失は、観察された期間にわたって、より顕著であった。この状況は、キャリブレーターおよび／またはコントロールを含む試薬キットが、輸送中の高い外気温条件下など、不適切な条件下で保管された場合の、現実的な条件を反映している。また、キットの一部であり得るキャリブレーターの保管寿命は、増大される。安定性の理由で、組換えＨＣＶコア－３Ｅｐｉ－ＥｃＳ－ＦＰなどのマルチエピトープ融合タンパク質は、全長またはほぼ全長の組換えキャリブレーターＨＣＶコア（２～１６９）よりも、キャリブレーターまたは／およびコントロール試薬として、より好適である。
【0063】
表１は、実施例４に記載されるイムノアッセイの結果を示し、ここで、本発明によるマルチエピトープ融合タンパク質は、「Ｃａｌ２」（３５０ｐｇ／ｍｌの組換えＨＣＶコア－３Ｅｐｉ－ＥｃＳ－ＦＰを検体類似体として含む陽性キャリブレーター）として適用された。「Ｃａｌ１」は、いずれのＨＣＶ抗体も含有しない陰性キャリブレーター（プールした正常サンプル）である。Ｃａｌ２キャリブレーターで提供されたシグナルは、正常な（陰性）サンプルプールで得られたシグナルよりも約１２倍高く、アッセイが陽性結果と陰性結果とを区別することができるような優れた測定範囲を提供する。「ＣＯＩ」は、カットオフインデックスを意味し、測定されたシグナルを所定のカットオフで除すことによって得られる比である。カットオフは、陽性サンプルと陰性サンプルを区別するための閾値である。この事例では、カットオフは、陽性キャリブレーターＣａｌ２の平均値に０．２を乗じることによって判定され（表１を参照されたい）、カットオフとして２０４１のカウントが得られた。この数よりも低いカウントを有するサンプルは、陰性として分類され、２０４１カウントを上回るサンプルは、陽性（反応性または感染）サンプルとして分類される。
【0064】
測定結果に移ると、正常（陰性）サンプルで得られた値は、陰性（Ｃａｌ １）キャリブレーターに非常に近い。同じことが、すべてが陰性として検出された血液ドナーサンプルにも当てはまる。一方で、陽性（ＨＣＶ－感染）サンプルも、陽性として正しく検出されている。換言すると、本明細書に記載されるマルチエピトープ融合タンパク質は、ＨＣＶ構造抗原を検出するため、特に、ＨＣＶコア抗原を検出するためのイムノアッセイをキャリブレートするための信頼性のある材料としての機能を果たす。
【0065】
図２は、追加のマルチエピトープ融合タンパク質である組換えＨＣＶコア－３Ｅｐｉ－ＥｃＳ－ＦＰ、ＸＹ（Ｚ、エクストラロング、Ｃ／Ａ）、および組換えＨＣＶコア－３Ｅｐｉ－ＥｃＳ－ＦＰ、ＸＹ（Ｚ）４によって拡張した、図１に関して記載されるように実行された独立した実験の結果を示す。一貫して、安定性の理由から、マルチエピトープ融合タンパク質、たとえば、組換えＨＣＶコア－３Ｅｐｉ－ＥｃＳ－ＦＰ、組換えＨＣＶコア－３Ｅｐｉ－ＥｃＳ－ＦＰ、ＸＹ（Ｚ、エクストラロング、Ｃ／Ａ）、および組換えＨＣＶコア－３Ｅｐｉ－ＥｃＳ－ＦＰ、ＸＹ（Ｚ）４が、全長またはほぼ全長の組換えキャリブレーターＨＣＶコア（２～１６９）よりも、キャリブレーターまたは／およびコントロール試薬として、より好適である。
【0066】
表２は、表１および実施例４に記載されるように実行した独立した実験の結果を報告し、ここで、追加の本発明によるマルチエピトープ融合タンパク質を、「Ｃａｌ２」（検体類似体として４００ｐｇ／ｍｌの組換えＨＣＶコア－３Ｅｐｉ－ＥｃＳ－ＦＰ、ＸＹ（Ｚ、エクストラロング、Ｃ／Ａ）または５２０ｐｇ／ｍｌの組換えＨＣＶコア－３Ｅｐｉ－ＥｃＳ－ＦＰ、ＸＹ（Ｚ）４を含有する陽性キャリブレーター）として適用した。組換えＨＣＶコア－３Ｅｐｉ－ＥｃＳ－ＦＰの他に、マルチエピトープ融合タンパク質組換えＨＣＶコア－３Ｅｐｉ－ＥｃＳ－ＦＰ、ＸＹ（Ｚ、エクストラロング、Ｃ／Ａ）および組換えＨＣＶコア－３Ｅｐｉ－ＥｃＳ－ＦＰ、ＸＹ（Ｚ）４もまた、ＨＣＶ構造抗原を検出するため、特にＨＣＶコア抗原を検出するためのイムノアッセイをキャリブレートするための信頼性のある材料としての機能を果たす。
【0067】
【表1】
【0068】
【表2】
【図1】
【図2】
【配列表】