特許 7390106 アテローム性動脈硬化症の治療用医薬の調製におけるトリアセチル－３－ヒドロキシフェニルアデノシンの応用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-11-22

(45)【発行日】2023-12-01

(54)【発明の名称】アテローム性動脈硬化症の治療用医薬の調製におけるトリアセチル－３－ヒドロキシフェニルアデノシンの応用

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/7076 20060101AFI20231124BHJP

   A61P 3/06 20060101ALI20231124BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20231124BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20231124BHJP

【ＦＩ】

A61K31/7076

A61P3/06

A61P9/10

A61P43/00 111

【請求項の数】 4

(21)【出願番号】P 2018548733

(86)(22)【出願日】2017-03-10

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2019-04-18

(86)【国際出願番号】 CN2017076304

(87)【国際公開番号】W WO2017157248

(87)【国際公開日】2017-09-21

【審査請求日】2020-01-30

【審判番号】

【審判請求日】2021-09-10

(31)【優先権主張番号】201610141228.1

(32)【優先日】2016-03-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】522337772

【氏名又は名称】北京谷神生命健康科技有限公司

【氏名又は名称原語表記】Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｇｕｓｈｅｎ Ｌｉｆｅ Ｈｅａｌｔｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．

【住所又は居所原語表記】Ｒ１２０２， １１ｔｈ Ｆｌｏｏｒ， Ｂｕｉｌｄｉｎｇ Ｎｏ．１， Ｎｏ．１０５ Ｙａｏｊｉａｙｕａｎ Ｒｏａｄ， Ｃｈａｏｙａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００２６， Ｃｈｉｎａ

(73)【特許権者】

【識別番号】591120284

【氏名又は名称】中国医学科学院葯物研究所

【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＭＡＴＥＲＩＡ ＭＥＤＩＣＡ， ＣＨＩＮＥＳＥ ＡＣＡＤＥＭＹ ＯＦ ＭＥＤＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ

【住所又は居所原語表記】ＮＯ．１， Ｘｉａｎ Ｎｏｎｇ Ｔａｎ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｘｕａｎｗｕ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】100088580

【弁理士】

【氏名又は名称】秋山 敦

(72)【発明者】

【氏名】朱 海波

(72)【発明者】

【氏名】王 晶

【合議体】

【審判長】前田 佳与子

【審判官】岩下 直人

【審判官】渕野 留香

(56)【参考文献】

【文献】中国特許出願公開第１０２１２５５８０（ＣＮ，Ａ）

【文献】Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１２年，Ｖｏｌ．２３７，Ｐａｇｅｓ １２６２－１２７２

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

A61K31/00-33/44

A61P9/00

A61P43/00

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

高脂血症患者の循環血中のＬｙ６Ｃ^ｈｉ炎症性単球数を減少させるための医薬の調製における式（Ｉ）で表されるトリアセチル－３－ヒドロキシフェニルアデノシンの使用であって、有効量の式（Ｉ）で表されるトリアセチル－３－ヒドロキシフェニルアデノシンを含有する前記医薬を前記患者へ投与することにより、前記高脂血症を治療するための前記有効量は、前記患者１ｋｇ当たり５０～２００ｍｇの投与量であることを特徴とする、使用。

【化1】

【請求項2】

高脂血症患者の循環血中のＬｙ６Ｃ^ｈｉ炎症性単球数を減少させるための医薬の調製における医薬組成物の使用において、前記医薬組成物は、式（Ｉ）で表されるトリアセチル－３－ヒドロキシフェニルアデノシンおよび薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含み、有効量の式（Ｉ）で表されるトリアセチル－３－ヒドロキシフェニルアデノシンを含有する前記医薬組成物を前記患者へ投与することにより、前記高脂血症を治療するための前記有効量は、前記患者１ｋｇ当たり５０～２００ｍｇの投与量であることを特徴とする、使用。

【化1】

【請求項3】

前記医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、丸剤または注射剤であることを特徴とする請求項２に記載の使用。

【請求項4】

前記医薬組成物は、徐放性製剤、放出制御製剤または各種の微粒子投薬システムであることを特徴とする請求項２に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、高脂血症に伴う単球増加の予防および／または治療用医薬の調製、ならびにアテローム性動脈硬化症の予防および／または治療用医薬の調製におけるトリアセチル－３－ヒドロキシフェニルアデノシンおよびそれを含む医薬組成物の応用に関し、医薬技術分野に属する。

【背景技術】

【0002】

西洋先進国においても中国においても、食習慣や生活レベルの変化により、心血管疾病は人類の健康や生命を脅かす最大要素となっている。

【0003】

アテローム性動脈硬化症は、心臓や脳血管疾病の主な病理学的根拠の一つであり、アテローム性動脈硬化症の形成過程において、激しい免疫応答と炎症反応が常に伴い、リンパ球と脂質が大動脈内膜に堆積する。脂質を豊富に含むマクロファージである泡沫細胞は、炎症媒体ＭＣＰ－１、ＩＬ－６等の炎症因子を分泌して単球が血管内皮に遷移されるように誘導し、平滑筋細胞を刺激して遷移・増殖し、プラークの形成、成長、破裂および血栓の形成に関与する。

【0004】

中間細胞としての単球は、骨髄中で持続的に生成され、血液中で循環して組織に遷移されてから、さらにマクロファージ、樹状細胞等に分化する。高脂肪飼料で餌付けたａｐｏＥ^－／－マウスはｃｈｏｗに比べると、循環血中の単球数が４倍増加しているが、炎症性表現型Ｌｙ６Ｃ^ｈｉ単球はさらに１４倍増加して、アテローム性プラーク中のマクロファージの数量が顕著に増加している。アテローム性動脈硬化症マウスに関する研究において、骨髄由来の炎症性単球は炎症性マクロファージの前駆体であって、動脈プラークを構成する主な成分であり、かつ多くの研究結果が、アテローム性動脈硬化症における単核／マクロファージがいずれも活性化されることを示していることが見出された。マクロファージは、ｏｘ－ＬＤＬを貪食し続けてさらに泡沫細胞に成長し、泡沫細胞の形成は、初期アテローム性動脈硬化症の重要な指標である。従って、炎症信号経路が活性化して、炎症反応の進行が激しくなる。よって、炎症性単球は、アテローム性動脈硬化症の発生や成長過程において重要な役割を果たす。

【0005】

トリアセチル－３－ヒドロキシフェニルアデノシン（特許番号ＺＬ２００９８０１０１１３１．６、公告番号ＣＮ１０１８７４０３６Ｂ、公告日２０１２年０１月２５日）は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａ Ｍｅｄｉｃａ， ＣＡＭＳ ＆ ＰＵＭＣがコルジセピン誘導体で選別した顕著な血中脂質調節活性を有する新規な構造タイプの化合物であり、また、毒性副作用が少なく、薬物動態学的に優れている等の特徴があり、現在、臨床前の研究段階にある。現在、アテローム性動脈硬化症の炎症性単球増加の治療における該化合物の応用については報告されていない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明が解決しようとする技術課題は、高脂血症に伴う単球増加の予防および／または治療用医薬の調製、ならびにアテローム性動脈硬化症の予防および／または治療用医薬の調製における式（Ｉ）で表されるトリアセチル－３－ヒドロキシフェニルアデノシンの応用を提供することである。

【0007】

本発明の技術課題を解決するため、本発明は以下の技術形態を提供する。

【0008】

本発明の技術形態の第一の態様は、高脂血症に伴う単球増加の予防および／または治療用医薬の調製における式（Ｉ）で表されるトリアセチル－３－ヒドロキシフェニルアデノシンの応用を提供することである。

【化1】

【0009】

本発明の技術形態の第二の態様は、アテローム性動脈硬化症の予防および／または治療用医薬の調製における式（Ｉ）で表されるトリアセチル－３－ヒドロキシフェニルアデノシンの応用を提供することである。

【化1】

【0010】

さらに、前記アテローム性動脈硬化症の予防および／または治療とは、アテローム性動脈硬化症に伴う炎症性単球増加の予防および／または治療を意味する。

【0011】

ここで、前記トリアセチル－３－ヒドロキシフェニルアデノシンによるアテローム性動脈硬化症の治療とは、炎症性単球が骨髄から循環血中に遷移する過程を制御し、アテローム性動脈硬化症により誘発される循環血中の炎症性単球の顕著な増加を改善し、循環血中のＬｙ６Ｃ^ｈｉ炎症性単球数を減らし、血清ＭＣＰ－１炎症性ケモカインのレベルを低減し、炎症反応を軽減することで、動脈プラークの形成を減少することができる作用を発揮することを意味する。

【0012】

本発明は、薬力学的研究方法を用いて、アテローム性動脈硬化症の単球増加の治療におけるトリアセチル－３－ヒドロキシフェニルアデノシンの顕著な作用を実証しており、アテローム性動脈硬化症の単球増加の治療方面におけるトリアセチル－３－ヒドロキシフェニルアデノシンの臨床応用に科学的な根拠を提供した。

【0013】

本発明の技術形態の第三の態様は、高脂血症に伴う単球増加の予防および／または治療用医薬の調製における医薬組成物の応用、およびアテローム性動脈硬化症の予防および／または治療用医薬の調製における該医薬組成物の応用を提供することである。ここで、前記アテローム性動脈硬化症の予防および／または治療とは、アテローム性動脈硬化症に伴う炎症性単球増加の予防および／または治療を意味する。前記医薬組成物は、第一の態様に記載のトリアセチル－３－ヒドロキシフェニルアデノシンおよび薬学的に許容可能な担体または付加剤を含む。

【0014】

該医薬組成物は当該分野の公知の方法に基づいて調製することができる。本発明に係る化合物を一種以上の薬学的に許容可能な固体または液体の賦形剤および／またはアジュバントと組み合わせることで、ヒトや動物への使用に適したいずれかの剤形を調製することができる。本発明に係る化合物のその医薬組成物における含有量は一般的に０．１～９５重量％である。

【0015】

本発明に係る化合物またはそれを含有する医薬組成物は、単位用量の形式で投薬してもよく、投薬経路は、腸または非腸であってもよく、例えば、経口、静脈注射、筋肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、目、肺および呼吸器、皮膚、腟、直腸等である。

【0016】

投薬剤形は、液体剤形、固体剤形または半固体剤形であってもよい。液体剤形は、溶液剤（真溶液およびコロイド溶液を含む）、乳剤（ｏ／ｗ型、ｗ／ｏ型およびダブルエマルションを含む）、懸濁剤、注射剤（水性注射剤、粉末注射剤および点滴を含む）、点眼剤、点鼻剤、洗剤および塗布剤等であってもよい。固体剤形は、錠剤（通常の錠剤、腸溶性錠剤、トローチ剤、分散性錠剤、チュアブル錠剤、発泡錠剤、口腔内崩壊錠剤を含む）、カプセル剤（硬カプセル剤、軟カプセル剤、腸溶性カプセル剤を含む）、顆粒剤、散剤、ピル、滴丸、坐薬、膜剤、パッチ、エアゾールおよび粉末吸入剤、スプレー等であってもよい。半固体剤形は、軟膏剤、ゲル剤、ペースト剤等であってもよい。好ましい医薬組成物の剤形は、錠剤、カプセル剤、丸剤、注射剤から選ばれる。

【0017】

本発明に係る化合物は、通常の製剤に調製してもよく、徐放性製剤、放出制御製剤、標的製剤および各種の微粒子投薬システムに調製してもよい。

【0018】

本発明に係る化合物を錠剤に調製するために、希釈剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、流動促進剤を含む、当該分野で公知の各種の賦形剤を広く使用することができる。希釈剤は、デンプン、デキストリン、スクロース、グルコース、ラクトース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、微結晶セルロース、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、炭酸カルシウム等であってもよい。湿潤剤は、水、エタノール、イソプロパノール等であってもよい。粘着剤は、デンプンペースト、デキストリン、シロップ、蜂蜜、グルコース溶液、微結晶セルロース、アラビアゴムペースト、ゼラチンペースト、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アクリル樹脂、カルボマー、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール等であってもよい。崩壊剤は、乾燥デンプン、微結晶セルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、架橋ポリビニルピロリドン、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムおよびクエン酸、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、ドデシルスルホン酸ナトリウム等であってもよい。潤滑剤および流動促進剤は、タルク、シリカ、ステアリン酸塩、酒石酸、流動パラフィン、ポリエチレングリコール等であってもよい。

【0019】

錠剤を、例えば砂糖コーティング錠、フィルムコーティング錠、腸溶コーティング錠剤、または二層錠剤および多層錠剤のようなコーティング錠にさらに調製することもできる。

【0020】

投薬ユニットをカプセル剤に調製するために、有効成分である本発明に係る化合物を希釈剤、流動促進剤と先ず混合し、混合物を硬カプセル剤または軟カプセル剤中に直接的に入れてもよい。有効成分である本発明に係る化合物を希釈剤、結合剤、崩壊剤と顆粒またはピルに先ず調製してから、硬カプセル剤または軟カプセル剤中に再度入れてもよい。本発明に係る化合物の錠剤の製造に用いられる各種の希釈剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、流動促進剤の品種は、本発明に係る化合物のカプセル剤の製造に用いられてもよい。

【0021】

本発明に係る化合物を注射剤に調製するために、水、エタノール、イソプロパノール、プロピレングリコールまたはこれらの混合物を溶剤として、当該分野で通常用いられる可溶化剤、助溶剤、ｐＨ調整剤、浸透圧調節剤を適量加えてもよい。可溶化剤または流動促進剤は、ポロキサマー、レシチン、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン等であってもよい。ｐＨ調整剤は、リン酸塩、酢酸塩、塩酸、水酸化ナトリウム等であってもよい。浸透圧調節剤は、塩化ナトリウム、マンニトール、グルコース、リン酸塩、酢酸塩等であってもよい。凍結乾燥粉末注射剤を製造する場合、マンニトール、グルコース等をサポートエージェントとしてさらに加えてもよい。

【0022】

また、必要であれば、医薬製剤中に着色剤、防腐剤、香料、香味料またはその他の添加剤を添加してもよい。

【0023】

薬物の使用目的を達成し、治療効果を増大させるため、本発明の医薬または医薬組成物は、任意の公知の投薬方法で投薬することができる。

【0024】

本発明に係る化合物の医薬組成物の投薬用量は、予防または治療すべき疾病の性質および深刻度や、患者または動物のそれぞれの状況に基づき、投薬経路および剤形等を広範囲に変化させてもよい。一般的に、本発明に係る化合物の適切な１日用量の範囲は、０．００１～１５０ｍｇ／ｋｇ体重であり、好ましくは０．１～１００ｍｇ／ｋｇ体重であり、より好ましくは１～６０ｍｇ／ｋｇ体重であり、最も好ましくは２～３０ｍｇ／ｋｇ体重である。上記用量は、１つの用量単位または複数の用量単位に分けて投薬してもよく、これは、医師の臨床経験、およびその他の治療手段の運用を含む投薬方法によって左右される。

【0025】

本発明の化合物または組成物は、単独で服用してもよく、またはその他の治療薬や対症薬と併用してもよい。本発明の化合物は、その他の治療薬との相乗効果がある場合、実際の状況に応じてその用量を調整しなければならない。

【発明の効果】

【0026】

本発明は、このような発症機序が複雑で治療効果が低い慢性疾患であるアテローム性動脈硬化症に、新たな治療用医薬であるトリアセチル－３－ヒドロキシフェニルアデノシンを提供しており、アテローム性動脈硬化症の炎症性単球増加の治療方面において、治療効果が顕著で、毒性副作用が少なく、安全に使用できる。

【0027】

本発明の内容がより容易かつ明瞭に理解されるように、以下、本発明の具体的な実施例によりかつ図面を参照しながら、本発明についてさらに詳しく説明する。

【図面の簡単な説明】

【0028】

【図1】本発明に係る実験例において、ゴールデンハムスターの循環血中の単球数を比較した図である。

【図2】本発明に係る実験例において、ａｐｏＥ^－／－マウスの循環血中の単球、炎症性単球および表現型単球のフロー分析結果を比較した図である。ＩＭＭ－Ｈ００７は、末梢血中のＬｙ６Ｃ^ｈｉ単球を低減させ、（Ａ）高脂肪飼料で餌付けたａｐｏＥ^－／－マウスの末梢血中の単球を分離して、抗－ＣＤ１１ｂ抗体、抗－ＣＤ９０抗体、抗－Ｂ２２０抗体、抗－ＣＤ４９ｂ抗体、抗－ＮＫ１．１抗体、抗－Ｌｙ－６Ｇ抗体を用いてマーキングを行って、ＣＤ１１ｂ^ｈｉＣＤ９０^ｌｏＢ２２０^ｌｏＣＤ４９ｂ^ｌｏＮＫ１．１^ｌｏＬｙ－６Ｇ^ｌｏ単球の比率を段階別に分析し、かつ（Ｂ）Ｌｙ６Ｃ抗体を用いてマーキングを行ってＬｙ－６Ｃ^ｈｉ単球およびＬｙ－６Ｃ^ｌｏ単球をさらに分析して、細胞比率はいずれもｍｅａｎ±ＳＥＭを用いて、（Ｃ）全血中のＣＤ１１ｂ単球および（Ｄ）全末梢血中のＬｙ６Ｃ^ｈｉ単球を表示する。

【図3】本発明に係る実験例において、ａｐｏＥ^－／－マウスの血清ＭＣＰ－１およびＩＬ－６のレベルを比較した図である。

【図4】本発明に係る実験例において、各群のａｐｏＥ^－／－マウスの動脈プラークにおける炎症性単球数を比較した図である。

【図5】本発明に係る実験例において、各群のａｐｏＥ^－／－マウスの大動脈根部および大動脈全長をオイルレッドＯで染色した状況を比較した図である。

【発明を実施するための形態】

【0029】

以下の実施例を用いて本発明をさらに説明するが、本発明を何ら制限するものではない。

【0030】

実験例１：高脂血症に伴う単球増加の治療におけるトリアセチル－３－ヒドロキシフェニルアデノシン（ＩＭＭ－Ｈ００７）の応用

【0031】

一、実験材料
１．試薬
希釈液、溶血剤、シース液、洗浄液、酵素洗浄液とＥＤＴＡ－２Ｋ抗擬固剤とを含むＡｂｂｏｔｔ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＣＤ３７００全血細胞分析試薬。

【0032】

２．機器
全血細胞分析装置（米国、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。

【0033】

３．実験動物
体重９０～１２０ｇ、雄性、ＳＰＦ級の６～８週齢のシリアンゴールデンハムスター（ＬＶＧ ｈａｍｓｔｅｒ，導入元Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）２０匹を、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｖｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．より購入。

【0034】

二、実験方法
１．動物群および飼育
動物が適応するように７日間餌付けた後、体重に基づいて正常対照群（ｎ＝１３）、高脂肪飼料群（ｎ＝１３）、ＩＭＭＨ００７低用量群（５０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝１３）、ＩＭＭＨ００７中用量群（１００ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝１３）、ＩＭＭＨ００７高用量群（２００ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝１３）にランダムに分けて、一日に２回胃内投与する。動物は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａ Ｍｅｄｉｃａ， ＣＡＭＳ ＆ ＰＵＭＣ（中国）の動物実験センター二部で飼育し、飼育条件は、ＳＰＦ級、温度２１±２℃、相対湿度５０±５％、光照射周期１２／１２、各ケージに５匹とする。正常群に正常基礎飼料を与え、高脂肪飼料群に高脂肪飼料（基礎飼料７９．８％、ラード２０％、コレステロール０．２％）を与え、動物は自由に摂食、飲水する。飼料は、ＢＥＩＪＩＮＧ ＨＦＫ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ ＣＯ．，ＬＴＤに委託して生産したものである。

【0035】

２．観察指標および測定方法
２．１ 循環血中の単球の測定
動物を１２時間断食させ、眼角から採血して、それぞれ２００μｌ程度を、３０μｌのＥＤＴＡ－２Ｋ抗凝固剤（２０ｇ／Ｌ、生理食塩水配合）中に溶解し、軽く混ぜて、血液凝固を回避し、全血細胞分析装置で全血細胞を分析する。

【0036】

三、実験結果
高脂肪飼料で餌付けたシリアンゴールデンハムスターの循環血中の単球に対するＩＭＭ－Ｈ００７の影響

【0037】

図１および表１から分かるように、モデル群に比べて、ＩＭＭ－Ｈ００７はシリアンゴールデンハムスターの循環血中の単球数を顕著に低減できる。

【0038】

【表1】

【0039】

実験例２：アテローム性動脈硬化症マウスモデルの循環血中の単球増加の治療におけるトリアセチル－３－ヒドロキシフェニルアデノシン（ＩＭＭ－Ｈ００７）の応用

【0040】

一、実験材料
１．試薬
ＯＣＴ凍結組織包埋剤（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ ＵＳＡ， Ｉｎｃ．）、ペントバルビタールナトリウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ． ＬＬＣ．）、ＰＥＧ６０００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ． ＬＬＣ．）、グリシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ． ＬＬＣ．）、パラホルムアルデヒド、オイルレッドＯ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ． ＬＬＣ．）、ＨＥ染色液（ＢａＳＯ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．， ＬＴＤ．）。

【0041】

２．機器
多用途低温高速遠心分離機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｆ ＡＧ）、凍結ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ Ｃａｍｅｒａ ＡＧ）、止水式恒温水槽、Ｅｎ Ｖｉｓｉｏｎ多機能酵素標識機器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ， Ｉｎｃ．）、小動物麻酔器（Ｍａｔｒｘ ＵＳＡ製品）。

【0042】

３．実験動物
体重１８～２２ｇ、雄性、ＳＰＦ級の５～７週齢のａｐｏＥ^－／－マウス（Ｃ５７ＢＬ背景）を、北京実験動物研究所より購入する。

【0043】

二、実験方法
１．動物群および飼育
動物が適応するように７日間餌付けた後、体重に基づいて高脂肪飼料群（ｎ＝７）、ＩＭＭＨ００７低用量群（５０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝７）、ＩＭＭＨ００７中用量群（１００ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝７）、ＩＭＭＨ００７高用量群（２００ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝９）にランダムに分けて、一日に１回胃内投与する。動物は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａ Ｍｅｄｉｃａ， ＣＡＭＳ ＆ ＰＵＭＣ（中国）の動物実験センター二部で飼育し、飼育条件は、ＳＰＦ級、温度２１±２℃、相対湿度５０±５％、光照射周期１２／１２、各ケージに５匹とする。全ての群毎に高脂肪飼料（基礎飼料７０％にラード２０％およびコレステロール０．２％を加える）を与え、動物は自由に摂食、飲水する。飼料は、ＢＥＩＪＩＮＧ ＨＦＫ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ ＣＯ．，ＬＴＤに委託して生産したものである。実験中、１周間毎に体重を一回記録する。

【0044】

２．観察指標および測定方法
２．１ 循環血中の単球の測定
動物を１２時間断食させ、以下の細胞を得た。

【0045】

循環血中の細胞：心臓に穿刺して５０μｌを採血し、４５０μｌのヘパリン抗凝固剤中に入れ、赤血球溶解液１ｍｌを加えて、１０分間溶解し、１８００ｒ３分で遠心して、上清を吸引して捨て、１００μｌのＰＢＳで細胞を懸濁して用意する。マウスの眼角静脈から致死量を採血し、血清を分離して、－８０℃で保存する。

【0046】

前記血細胞への抗体添加：
ＣＤ９０－ＰＥ ３μｌ、Ｂ２２０－ＰＥ ３μｌ、ＣＤ４９ｂ－ＰＥ ３μｌ、ＮＫ１．１－ＰＥ ３μｌ、Ｌｙ－６Ｇ－ＰＥ ３μｌ、ＣＤ１１ｂ－ｐｅｒｃｐ ６μｌ、Ｌｙ－６Ｃ－ＦＩＴＣ ３μｌを、単一陽性管およびブランク対照管を設置して、氷砂で３０分間培養し、ＰＢＳで３回洗浄し、４００μｌのＰＢＳを用いて細胞を再選択し、ろ過して、フロー検出を行う。単球は、ＣＤ１１ｂ^ｈｉＣＤ９０^ｌｏＢ２２０^ｌｏＣＤ４９ｂ^ｌｏＮＫ１．１^ｌｏＬｙ－６Ｇ^ｌｏ細胞として鑑定する。さらにＬｙ６Ｃの発現状況に基づいて、Ｌｙ６Ｃは、高発現するのが炎症性単球ＬＹ６Ｃ^ｈｉ単球であり、Ｌｙ６Ｃは、低発現するのが表現型単球Ｌｙ６Ｃｌｏ単球である。

【0047】

マウスから脾臓および骨髄を取り経えた後、生理食塩水を用いて心臓にゆっくりと灌流し、マウスの心臓を分離して、４％のパラホルムアルデヒド中に保存する。

【0048】

２．２ 大動脈全長動脈プラークにおけるＬｙ６Ｃｈｉ単球の含有量の分析
動物を１２時間断食させた後、眼角から致死量を採血した後、実体顕微鏡下でマウスの胸、腹腔を切開し、生理食塩水を心臓および血管に灌流し、血管を湿潤に保持した状態で、大動脈全長を剥離して、その表面の脂肪組織を取り出し、分離後に、ＰＢＳを用いて洗浄し、混合酵素（XI型コラゲナーゼ１２５Ｕ／ｍｌ、ヒアルロニダーゼ６０Ｕ／ｍｌ、デオキシリボースシンターゼ６０Ｕ／ｍｌ、I型コラゲナーゼ４５０Ｕ／ｍｌを２．５ｍｌのＰＢＳ中に溶解する）を加え、はさみを用いて血管を剪断し、３７℃で培養して１時間消化させ、０．２２μｍのろ過膜でろ過し、１６００ｒｐｍ／３分で遠心して、上清を捨て、１００μｌのＰＢＳを加えて懸濁して、抗体を加える。

【0049】

ＣＤ９０－ＰＥ ３μｌ、Ｂ２２０－ＰＥ ３μｌ、ＣＤ４９ｂ－ＰＥ ３μｌｌ、ＮＫ１．１－ＰＥ ３μｌ、Ｌｙ－６Ｇ－ＰＥ ３μｌ、ＣＤ１１ｂ－ｐｅｒｃｐ ６μｌ、Ｌｙ－６Ｃ－ＦＩＴＣ ３μｌ、Ｆ４／８０－ＡＰＣ １０μｌ、ＣＤ１１Ｃ－ＡＰＣ ４μｌ、Ｉ－Ａｂ－ＡＰＣ ４μｌを、単一陽性管およびブランク対照管を設置して、氷砂で３０分間培養し、ＰＢＳで３回洗浄し、４００μｌのＰＢＳを用いて細胞を再選択し、ろ過して、フロー検出を行う。

【0050】

２．３ 血清炎症因子の分析
マウスの血清炎症因子は、ＢＤフローマウス炎症因子検出キット（Ｍｓ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ＣＢＡ Ｋｉｔ）（商品番号：５５２３６４）を用いて分析する。

【0051】

２．４ 大動脈根部および大動脈全長のプラークの面積の分析
２．４．１ 凍結切片の作製
心臓組織の切片化前にミクロトームの冷蔵庫の温度を－１９℃に設定し、試料ホルダを－２１℃に設定する。４％パラホルムアルデヒドに保存する心臓をＯＣＴ中に包埋し、液体窒素で迅速に凍結させ、さらに組織をミクロトームの試料台に置いて温度平衡を行う。組織塊を速やかにトリミングした後、連続して切り出し、切片厚さは８μｍであり、清潔なポリリジンが包被されたスライドガラス上に貼り付ける。

【0052】

２．４．２ オイルレッドＯ染色
２．４．２．１ 凍結切片のオイルレッドＯ染色：イソプロパノールを用いて５‰のオイルレッドＯ保存液を配合してから、水で３：２の比率で混ぜて、二重ろ紙を用いてろ過し、染色バットに加え、選ばれたスロットを吊り篭に入れ、染色バットに入れて２時間染色し、６０％のイソプロパノールを用いて数秒色分解し、水道水で軽く洗浄して、ヘマトキシリンで３～５分再度染色し、水道水で２分洗浄して青色に戻し、グリセロゼラチンでシールし、顕微鏡下で観察・撮影する。

【0053】

２．４．２．２ 大動脈全長のオイルレッドＯ染色：大動脈全長を切開し、オイルレッドＯで４時間染色し、イソプロパノールで洗い、実体顕微鏡下に固定し、カメラで撮影する。

【0054】

３．データ分析
データを平均値±標準誤差で表し、全てのデータはＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ５．０ソフトウェアを用いてＯＮＥＷＡＹ－ＡＮＯＶＡ統計分析を行い、画像を比較分析する。

【0055】

三、実験結果
３．１ アテローム性動脈硬化症マウスの循環血中の単球に対するＩＭＭ－Ｈ００７の影響
図２から分かるように、モデル群に比べて、ＩＭＭ－Ｈ００７は、ａｐｏＥ^－／－マウスの循環血中の単球数（図２Ｃ、表２）および炎症性単球数（図２Ｄ、表３）を顕著に低減できる。

【0056】

【表2】

【0057】

【表3】

【0058】

３．２ アテローム性動脈硬化症マウスの血清炎症因子のレベルに対するＩＭＭ－Ｈ００７の影響
マウスの血清炎症因子に対するＩＭＭ－Ｈ００７の影響をさらに観察したところ、ＩＭＭ－Ｈ００７は、血清中のＭＣＰ－１のレベル（図３Ａ）とＩＬ－６のレベルを顕著に低減できる（図３Ｂ）という結果を見出した。

【0059】

３．３ アテローム性動脈硬化症マウスの動脈プラークにおける炎症性単球数に対するＩＭＭ－Ｈ００７の影響
マウスの動脈プラークにおける炎症性単球数に対するＩＭＭ－Ｈ００７の影響をさらに観察したところ、ＩＭＭ－Ｈ００７は、動脈プラーク中の炎症Ｌｙ６Ｃｈｉ単球数を顕著に低減できる（図４）という結果を見出した。

【0060】

３．４ アテローム性動脈硬化症マウスの動脈プラークの形成に対するＩＭＭ－Ｈ００７の影響
ａｐｏＥ^－／－マウスの大動脈根部および大動脈全長に対してオイルレッドＯで染色することにより、ＩＭＭ－Ｈ００７は、ａｐｏＥ^－／－マウスの大動脈全長および大動脈根部における動脈プラークの面積を顕著に低減できる（図５）という結果を見出した。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】