特許 7390759 内在性前駆細胞又は幹細胞捕捉能及び捕捉された細胞の血管分化誘導能を有する注入型ヒドロゲル組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-11-24

(45)【発行日】2023-12-04

(54)【発明の名称】内在性前駆細胞又は幹細胞捕捉能及び捕捉された細胞の血管分化誘導能を有する注入型ヒドロゲル組成物

(51)【国際特許分類】

   A61L 27/54 20060101AFI20231127BHJP

   A61K 9/06 20060101ALI20231127BHJP

   A61K 38/08 20190101ALI20231127BHJP

   A61K 47/30 20060101ALI20231127BHJP

   A61K 47/36 20060101ALI20231127BHJP

   A61L 27/20 20060101ALI20231127BHJP

   A61L 27/22 20060101ALI20231127BHJP

   A61L 27/26 20060101ALI20231127BHJP

   A61L 27/48 20060101ALI20231127BHJP

   A61L 27/52 20060101ALI20231127BHJP

【ＦＩ】

A61L27/54

A61K9/06

A61K38/08 ZNA

A61K47/30

A61K47/36

A61L27/20

A61L27/22

A61L27/26

A61L27/48

A61L27/52

【請求項の数】 4

(21)【出願番号】P 2022528310

(86)(22)【出願日】2020-11-17

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-01-19

(86)【国際出願番号】 KR2020016135

(87)【国際公開番号】W WO2021101198

(87)【国際公開日】2021-05-27

【審査請求日】2022-05-16

(31)【優先権主張番号】10-2019-0151219

(32)【優先日】2019-11-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】508095946

【氏名又は名称】アジョウ・ユニバーシティ・インダストリー－アカデミック・コーポレイション・ファウンデイション

【氏名又は名称原語表記】ＡＪＯＵ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＩＮＤＵＳＴＲＹ－ＡＣＡＤＥＭＩＣ ＣＯＯＰＥＲＡＴＩＯＮ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ

【住所又は居所原語表記】２０６，Ｗｏｒｌｄ ｃｕｐ－ｒｏ，Ｙｅｏｎｇｔｏｎｇ－ｇｕ，Ｓｕｗｏｎ－ｓｉ，Ｇｙｅｏｎｇｇｉ－ｄｏ １６４９９ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ

(74)【代理人】

【識別番号】110000729

【氏名又は名称】弁理士法人ユニアス国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】キム、ムン ソク

(72)【発明者】

【氏名】パク、スン フン

【審査官】金子 亜希

(56)【参考文献】

【文献】韓国公開特許第１０－２０１９－００４０７５７（ＫＲ，Ａ）

【文献】韓国公開特許第１０－２０１５－０００６２２３（ＫＲ，Ａ）

【文献】特表２０１９－５３１８１６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１６－５１７９０６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１７－５３５４０５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００２－３０８７９８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１９－１９５３４７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００７－５３６９３６（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１４／１６１０８５（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｌ ２７／５４

Ａ６１Ｋ ９／０６

Ａ６１Ｋ ３８／０８

Ａ６１Ｋ ４７／３０

Ａ６１Ｋ ４７／３６

Ａ６１Ｌ ２７／２０

Ａ６１Ｌ ２７／２２

Ａ６１Ｌ ２７／２６

Ａ６１Ｌ ２７／４８

Ａ６１Ｌ ２７／５２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

血管分化誘導因子とカルボン酸官能基が活性化したアニオン性ヒアルロン酸との反応生成物である、血管分化誘導因子が導入されたアニオン性ヒアルロン酸を含む、第１溶液と、
キトサン、カチオン性デキストラン（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｄｅｘｔｒａｎ）、ポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）、ポリリシン（ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ）及びポリヒスチジン（ｐｏｌｙ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）からなる群から選ばれた１種以上である、カチオン性物質を含む、第２溶液とから構成され、
前記第１溶液及び第２溶液のうちいずれか１つ以上の溶液に幹細胞捕捉因子がさらに含まれ、
前記幹細胞捕捉因子が、サブスタンスＰ（ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ）、ＷＫＹＭＶＭ、ＳＤＦ１α、Ｇ－ＳＣＦ及びＭＣＰ－１からなる群から選ばれた１つ以上であり、
前記第１溶液及び第２溶液が２：１～１：２の比率で混合されると、静電気的な引力によりヒドロゲルが形成され、内在性前駆細胞又は幹細胞の捕捉能、及び捕捉された細胞の血管分化誘導能を有し、
前記血管分化誘導因子が、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む血管内皮細胞成長因子模倣ペプチドである、注入型ヒドロゲル組成物。

【請求項2】

前記第１溶液及び第２溶液の混合によって形成されたヒドロゲルの貯蔵弾性率が、１０～１００Ｐａであることを特徴とする、請求項１に記載の内在性前駆細胞又は幹細胞捕捉能及び捕捉された細胞の血管分化誘導能を有する注入型ヒドロゲル組成物。

【請求項3】

請求項１に記載の内在性前駆細胞又は幹細胞捕捉能及び捕捉された細胞の血管分化誘導能を有する注入型ヒドロゲル組成物を含む、組織再生用注射剤。

【請求項4】

請求項１に記載の内在性前駆細胞又は幹細胞捕捉能及び捕捉された細胞の血管分化誘導能を有する注入型ヒドロゲル組成物を含む、フィラー用注射剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、内在性前駆細胞又は幹細胞捕捉能及び捕捉された細胞の血管分化誘導能を有する注入型ヒドロゲル組成物に関し、より詳細には、血管分化誘導因子が導入されたアニオン性ヒアルロン酸を含む第１溶液と、カチオン性生体素材を含む第２溶液とから構成され、前記第１溶液及び／又は第２溶液に幹細胞捕捉因子をさらに含み、静電気的な引力によりヒドロゲルが形成されることを特徴とする内在性前駆細胞又は幹細胞捕捉能及び捕捉された細胞の血管分化誘導能を有する注入型ヒドロゲル組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

角膜と軟骨を除いて、すべての組織工学の代替物質は、生体内生存に必要な栄養素と酸素供給のために血管神経網が必要である。人工組織において血管新生は、自然的に発生するまで数週間かかるので、この時間の間に、組織は、必須栄養素の供給の不足によって壊死が発生する。したがって、再生医学で血管を形成することは、損傷した組織の再生又は人工臓器の開発において非常に重要な問題である。

【0003】

血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）は、既存の血管の内皮細胞が細胞外基質（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ，ＥＣＭ）を分解し、移動、分裂及び分化して新しい毛細血管を形成する過程であり、傷修復、胚芽発生、腫瘍形成、慢性炎症、肥満などの様々な生理的及び病理的現象に関与する。血管新生過程は、血管内皮細胞の増殖及び血管壁から刺激がある方向の周辺組織への移動を含む。次いで、多様なタンパク質分解酵素が活性化して、血管内皮細胞が基底膜を浸潤させ、ループを形成し、形成されたループが分化して管を形成する。

【0004】

血管新生を誘導したり、促進させるために、幹細胞を血管内皮細胞に分化を誘導する研究が多く行われているが、実際に幹細胞自体が血管新生を誘導するよりは、幹細胞から分泌される成長因子により宿主（ｈｏｓｔ）の血管新生が誘導されるという報告が主をなしている。その他にも、脂肪組織を分解して生成された細胞のうち、間質血管分画（ＳＶＦ）を培養せずに、動物に移植して、血管内皮細胞に分化させることができることが報告された。しかしながら、前記方法は、脂肪幹細胞の継代培養による増殖を誘導しないので、脂肪幹細胞から分化する血管内皮細胞の量が非常に少なく、特に分化した血管内皮細胞の増殖率及び分化率が低いため、その応用が制限的である。

【0005】

幹細胞を用いる方法のうち、「自己再生（ｓｅｌｆ－ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）」を用いる方法は、患者自身の体内に本来存在している内在性前駆細胞／幹細胞を活性化させることによって、損傷した臓器及び／又は組織を再生させ、その機能回復を図ることである。内在性前駆細胞／幹細胞は、接触する細胞の互いに異なる形態、細胞外基質の含有量、サイトカイン及び成長因子のような当該細胞が存在する微細環境に依存して、様々な形態の細胞に分化することができる。

【0006】

内在性前駆細胞／幹細胞を傷部位又は組織損傷部位に捕捉させるために、幹細胞捕捉因子を用いることができ、そのうち、幹細胞捕捉因子と知られたサブスタンスＰ（Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ；ＳＰ）は、いくつかの研究において傷治療を助けることが報告されているが、これは、単純溶液状態で使用したものであり、組織損傷部位に長く留まらないという短所があるので、サブスタンスＰを組織損傷部位から持続的に放出させることができる方法の開発が求められている。

【0007】

これより、本発明では、内在性前駆細胞／幹細胞を効果的に捕捉し、同時に血管分化を誘導して血管形成を促進させることができる物質を開発するために鋭意努力した結果、前駆細胞／幹細胞を血管細胞に分化させることができる血管内皮細胞成長因子模倣ペプチド（ＶＰ）をアニオン性ヒアルロン酸に化学的に導入したＨＡ－ＶＰ及びカチオン性物質を混合した場合、静電気的な引力によりヒドロゲルが形成されることを確認し、前記ヒドロゲルに前駆細胞／幹細胞捕捉因子（ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ、ＷＫＹＭＶＭ、ＳＤＦ１α、Ｇ－ＳＣＦ、ＭＣＰ－１など）を物理的に担持させて生体内注入すると、注入されたヒドロゲルから幹細胞捕捉因子が放出されて、内在性前駆細胞／幹細胞がヒドロゲルに捕捉され、化学的にヒアルロン酸に導入されたＶＰにより血管細胞に分化して、血管形成誘導が促進されることを確認し、本発明を完成した。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明の目的は、前駆細胞／幹細胞捕捉能及び捕捉された細胞の血管分化誘導能を有する注入型ヒドロゲル組成物を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0009】

上記目的を達成するために、
本発明は、血管分化誘導因子が導入されたアニオン性ヒアルロン酸を含む第１溶液と、
カチオン性物質を含む第２溶液とから構成され、
前記第１溶液及び第２溶液のうちいずれか１つ以上の溶液に幹細胞捕捉因子がさらに含まれ、
前記第１溶液及び第２溶液が混合されると、静電気的な引力によりヒドロゲルが形成されることを特徴とする、内在性前駆細胞又は幹細胞捕捉能及び捕捉された細胞の血管分化誘導能を有する注入型ヒドロゲル組成物を提供する。

【0010】

本発明の好ましい一実施例によれば、前記血管分化誘導因子が導入されたアニオン性ヒアルロン酸は、血管分化誘導因子とカルボン酸官能基が活性化したアニオン性ヒアルロン酸を反応させて製造することができる。

【0011】

本発明の好ましい他の一実施例によれば、前記カチオン性物質は、キトサン、カチオン性デキストラン（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｄｅｘｔｒａｎ）、ポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）、ポリリシン（ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ）及びポリヒスチジン（ｐｏｌｙ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）からなる群から選ばれた１種以上でありうる。

【0012】

本発明の好ましいさらに他の一実施例によれば、前記幹細胞捕捉因子は、サブスタンスＰ（ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ）、ＷＫＹＭＶＭ、ＳＤＦ１α、Ｇ－ＳＣＦ及びＭＣＰ－１からなる群から選ばれた１つ以上でありうる。

【0013】

本発明の好ましいさらに他の一実施例によれば、前記第１溶液の血管分化誘導因子が導入されたアニオン性ヒアルロン酸及び第２溶液のカチオン性物質の比率は、３：１～１：３でありうる。

【0014】

本発明の好ましいさらに他の一実施例によれば、前記第１溶液及び第２溶液の混合によって形成されたヒドロゲルの貯蔵弾性率は、１０～１００Ｐａでありうる。

【0015】

また、前記注入用ヒドロゲル組成物を含む組織再生用注射剤又はフィラー用注射剤を提供する。

【0016】

本発明は、一態様において、
血管分化誘導因子が導入されたアニオン性ヒアルロン酸を含む第１溶液と、
カチオン性物質を含む第２溶液とから構成され、
前記第１溶液及び第２溶液のうちいずれか１つ以上の溶液に幹細胞捕捉因子がさらに含まれ、
前記第１溶液及び第２溶液が混合されると、静電気的な引力によりヒドロゲルが形成されることを特徴とする、内在性前駆細胞又は幹細胞捕捉能及び捕捉された細胞の血管分化誘導能を有する注入型ヒドロゲル組成物に関する。

【0017】

前記注入型ヒドロゲル組成物は、より具体的に、血管分化誘導因子が導入されたアニオン性ヒアルロン酸及び幹細胞捕捉因子を含む第１溶液と、カチオン性物質及び幹細胞捕捉因子を含む第２溶液とから構成される。

【0018】

本発明において、前記注入型ヒドロゲルは、血管分化誘導因子が導入されたアニオン性ヒアルロン酸及びカチオン性物質の静電気的な引力を通じて形成されうる。好ましくは、前記第１溶液及び第２溶液が目的部位に注入されるとき、混合されて、ヒドロゲルが形成されうるが、目的によって第１溶液及び第２溶液を注入直前に混合し、ヒドロゲルを形成させた後に注入することができる。

【0019】

前記目的部位は、組織再生が必要な個所であり、損傷した臓器、陥没した組織又は傷部位であり、本発明の内在性前駆細胞又は幹細胞捕捉能及び捕捉された細胞の血管分化誘導能を有する注入型ヒドロゲル組成物は、内在性前駆細胞／幹細胞をヒドロゲルに捕捉し、捕捉された前駆細胞／幹細胞が血管に分化することができるように誘導するので、より効率的に組織を再生することができるという長所がある。

【0020】

本発明において、前記幹細胞は、内在性前駆細胞又は内在性幹細胞を意味し、内在性前駆細胞又は内在性幹細胞は、特定の臓器及び／又は組織に本来存在して、当該臓器及び／又は組織が損傷を受けた場合に、その組織及び／又は臓器の再生に貢献する、自己複製能及び多分化能を有する細胞をいう。具体的な例としては、間葉系幹細胞、角膜幹細胞、心筋幹細胞、神経幹細胞及び血管内皮前駆細胞などが挙げられる。

【0021】

図１は、本発明の内在性前駆細胞又は幹細胞捕捉能及び捕捉された細胞の血管分化誘導能を有する注入型ヒドロゲル組成物を示す模式図であり、本発明では、前駆細胞／幹細胞を血管細胞に分化させることができる血管内皮細胞成長因子模倣ペプチド（ＶＰ）をヒアルロン酸（ＨＡ）に化学的に導入して、ＶＰが化学的に導入されたＨＡ－ＶＰを製造し、アニオン性ＨＡ－ＶＰ（第１溶液）及びカチオン性キトサン（ＣＨ、第２溶液）を混合して、静電気的な引力を通じてヒドロゲルが形成されるようにした。

【0022】

前記ヒドロゲルに前駆細胞／幹細胞捕捉因子（ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ、ＷＫＹＭＶＭ，ＳＤＦ１α、Ｇ－ＳＣＦ、ＭＣＰ－１など）を物理的に担持させるために、ＨＡ－ＶＰ溶液及びキトサン溶液それぞれに前駆細胞／幹細胞捕捉因子を混合し、前駆細胞／幹細胞捕捉因子を含むＨＡ－ＶＰ溶液及びキトサン溶液は、生体内注入時に静電気的な引力を通じてヒドロゲルを形成する。形成されたヒドロゲルから幹細胞捕捉因子が放出されて、内在性前駆細胞／幹細胞がヒドロゲルに捕捉され、ヒドロゲルに捕捉された内在性前駆細胞／幹細胞は、化学的に導入されたＶＰにより血管細胞に分化して、血管形成誘導が促進される。

【0023】

本発明において、前記血管分化誘導因子は、血管内皮細胞成長因子模倣ペプチドであり、配列番号１のアミノ酸配列（ＫＬＴＷＱＥＬＹＱＬＫＹＫＧＩ）を含んでもよいが、これに限定されず、目的によって血管内皮成長因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ｂＦＧＦ）などのような血管新生促進因子又はトロンビンを適用することができる。

【0024】

本発明において、前記血管分化誘導因子が導入されたアニオン性ヒアルロン酸は、血管分化誘導因子とカルボン酸官能基が活性化したアニオン性ヒアルロン酸を反応させて製造することができる。

【0025】

前記ヒアルロン酸の分子量は、５００，０００Ｄａ～６，０００，０００Ｄａの範囲に該当することが好ましい。ここで、ヒアルロン酸の分子量が５００，０００Ｄａ未満の場合、物性が非常に低くなって、有意的にヒドロゲルを成すことができず、６，０００，０００Ｄａ超過の場合、粘度が上昇して、注射剤型としての適用に限界をもたらすことができるので、好ましくない。

【0026】

本発明において、前記カチオン性物質は、キトサン、カチオン性デキストラン（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｄｅｘｔｒａｎ）、ポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）、ポリリシン（ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ）及びポリヒスチジン（ｐｏｌｙ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）からなる群から選ばれた１種以上でありうる。

【0027】

本発明において、前記幹細胞捕捉因子は、サブスタンスＰ（ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ）、ＷＫＹＭＶＭ，ＳＤＦ１α、Ｇ－ＳＣＦ及びＭＣＰ－１からなる群から選ばれた１つ以上でありうる。好ましくは、サブスタンスＰ（ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ）又はサブスタンスＰの誘導体でありうるが、内在性前駆細胞／幹細胞捕捉能力を有する物質を制限なしで使用できる。

【0028】

本発明において、前記注入型ヒドロゲルは、血管分化誘導因子が導入されたアニオン性ヒアルロン酸及びカチオン性物質の静電気的な引力を通じて形成されうる。

【0029】

本発明において、前記第１溶液の血管分化誘導因子が導入されたアニオン性ヒアルロン酸及びカチオン性物質（キトサン）の比率は、３：１～１：３、好ましくは、２：１～１：２でありうる。

【0030】

本発明において、前記第１溶液及び第２溶液の混合によって形成されたヒドロゲルの貯蔵弾性率は、１０～１００Ｐａでありうる。

【0031】

本発明の具体的な一実施例において、カルボン酸官能基が活性化したヒアルロン酸及び血管内皮形成因子模倣ペプチドを反応させて、血管内皮細胞成長因子模倣ペプチドが導入されたヒアルロン酸（ＨＡ－ＶＰ）を製造し（表１及び表２）、キトサン（ＣＨ）溶液とＨＡ－ＶＰ溶液を混合したとき、キトサン及びＨＡ－ＶＰが静電気的な引力を通じてヒドロゲルを形成することを確認した（図２）。

【0032】

カチオン性ポリマーであるキトサン（ＣＨ）、カチオン性デキストラン（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｄｅｘｔｒａｎ；ＣＤ）、ポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ；ＰＥＩ）、ポリリシン（ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ；ＰＬ）又はポリヒスチジン（ｐｏｌｙ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；ＰＨ）とアニオン性であるＨＡ又は血管内皮細胞成長因子模倣ペプチドが導入されたヒアルロン酸（ＨＡ－ＶＰ）の静電気的な引力を通じてヒドロゲルが製造されることを確認した（図３）。

【0033】

また、ＶＰの化学的導入の有無及び幹細胞捕捉因子の有無によってヒドロゲルの形成に影響を与えるかを確認した結果、ＶＰの化学的導入の前後と前駆細胞／幹細胞捕捉因子の混合有無に関係なく、静電気的な引力を通じてヒドロゲルが形成されることを確認し（図４）、ＶＰの導入がヒドロゲルの流動学的特性に大きい影響を与えなかったことを確認した（図５）。

【0034】

本発明の他の具体的な一実施例において、静電気的な引力により製造したヒドロゲルで幹細胞捕捉因子及びＶＰの放出程度を確認した結果、ＶＰの導入がヒドロゲルの伝達体としての特性に影響を与えず、ＶＰを単純混合した場合に比べてＶＰが化学的に導入された場合、高い徐放性を有することを確認した（図６）。

【0035】

また、本発明のヒドロゲルは、毒性がないことを確認し（図７）、幹細胞捕捉因子であるサブスタンスＰ（ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ）が効果的に幹細胞を捕捉することを確認した（図８）。

【0036】

本発明のさらに他の具体的な一実施例において、生体外で本発明のヒドロゲルによる血管形成効果を確認した結果、血管内皮細胞成長因子模倣ペプチドをヒアルロン酸と単純混合して製造したヒドロゲル（ＣＨＨＡ＋ＶＰ）に比べて、血管内皮細胞成長因子模倣ペプチドを化学的にヒアルロン酸に導入して製造したヒドロゲル（ＣＨＨＡ－ＶＰ）においてＣＤ３１を発現する幹細胞の数が顕著に増加し（図８）、また、血管細胞で発現するフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）遺伝子及びＣＤ３１遺伝子の発現が顕著に増加することを確認した（図９）。

【0037】

本発明のさらに他の具体的な一実施例において、生体内で本発明のヒドロゲルによる幹細胞捕捉能力を確認した結果、マウスの尾に注入した間葉系幹細胞が、ヒドロゲルに含まれた幹細胞捕捉因子によりヒドロゲル側に捕捉されることを確認した（図１１ａ及び図１１ｂ）。

【0038】

本発明のヒドロゲルにより生体内で実際に血管形成が誘導されるかを確認した結果、４週間ヒドロゲルが形態を良好に維持しており、ＶＰが化学的に導入された場合に、ヒドロゲルの表面でさらに多い血管が観察されることを確認した（図１２）。また、ＶＰが単純に混合されたヒドロゲル（ＣＨＨＡ＋ＶＰ（＋ＳＰ））に比べて、幹細胞捕捉因子が含まれ、ＶＰが化学的に導入されたヒドロゲル（ＣＨＨＡ－ＶＰ（＋ＳＰ））に捕捉された幹細胞が観察され、ＣＤ３１を発現する幹細胞の数が増加したこと（図１３ａ及び図１３ｂ）を確認しただけでなく、ｖＷＦ遺伝子及びＣＤ３１遺伝子の発現量が顕著に増加したことを確認した（図１４）。

【0039】

すなわち、本発明の内在性前駆細胞又は幹細胞捕捉能及び捕捉された細胞の血管分化誘導能を有する注入型ヒドロゲル組成物は、注入されたヒドロゲルから幹細胞捕捉因子が放出されて、内在性前駆細胞／幹細胞がヒドロゲルに捕捉され、化学的にヒアルロン酸に導入された血管分化誘導因子により血管細胞に分化して、血管形成誘導が促進されることを確認し、特に、血管分化誘導因子を化学的にヒアルロン酸に導入したとき、高い血管形成誘導効果を示すことを確認した。

【0040】

また、本発明では、前駆細胞／幹細胞を外部で注入せず、内在性前駆細胞／幹細胞を捕捉するので、外部細胞へ注入による様々な副作用を解決することができる。したがって、本発明のヒドロゲル組成物は、再生医学分野において内在性前駆細胞／幹細胞を活用した組織再生に活用できるので、組織改善、傷治療、傷跡改善、皮膚組織改善、軟部組織の結合補正、シワ除去又は改善、輪郭補正、組織拡大又は乳房拡大などに適用することができる。

【0041】

本発明は、他の態様において、前記注入用ヒドロゲル組成物を含む組織再生用注射剤に関する。

【0042】

本発明は、さらに他の態様において、前記注入用ヒドロゲル組成物を含むフィラー用注射剤に関する。

【0043】

前記フィラー用注射剤は、好ましくは、皮膚フィラー用注射剤であり、シワ、傷跡又は真皮組織の改善及び治療に適用することができる。

【発明の効果】

【0044】

本発明の内在性前駆細胞又は幹細胞捕捉能及び捕捉された細胞の血管分化誘導能を有する注入型ヒドロゲル組成物は、注入されたヒドロゲルから幹細胞捕捉因子が放出されて、内在性前駆細胞／幹細胞がヒドロゲルに捕捉され、化学的にヒアルロン酸に導入された血管分化誘導因子により血管細胞に分化して、血管形成誘導が促進されることを確認し、特に、血管分化誘導因子を化学的にヒアルロン酸に導入したとき、高い血管形成誘導効果を示すことを確認した。したがって、本発明のヒドロゲル組成物は、内在性前駆細胞／幹細胞捕捉能及び血管分化誘導能に優れているので、血管形成以外に多様な組織再生及び傷治療に有用に適用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0045】

【図1】図１は、本発明の内在性前駆細胞又は幹細胞捕捉能及び捕捉された細胞の血管分化誘導能を有する注入型ヒドロゲル組成物を示す模式図である。

【図2】図２は、カチオン性物質（キトサン）及び血管内皮細胞成長因子模倣ペプチドが導入されたアニオン性ヒアルロン酸（ＨＡ－ＶＰ）の比率によるゼータ電位（Ｚｅｔａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）及び流動学的特性を測定したデータであり、（ａ）反応時間による弾性率、（ｂ）キトサン（ＣＨ）及びヒアルロン酸（ＨＡ）の比率による弾性率、（ｃ）キトサン及びＨＡ－ＶＰの比率による粘度及びゼータ電位、（ｄ）キトサン及びＨＡ－ＶＰの比率による減衰率（ｄａｍｐｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）を示す。

【図3】図３は、カチオン性キトサン（ＣＨ）、カチオン性デキストラン（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｄｅｘｔｒａｎ；ＣＤ）、ポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ；ＰＥＩ）、ポリリシン（ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ；ＰＬ）又はポリヒスチジン（ｐｏｌｙ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；ＰＨ）とアニオン性ヒアルロン酸（ＨＡ）溶液又はＨＡ－ＶＰ溶液を混合したとき、静電気的な引力により形成されたヒドロゲル写真である。

【図4】図４は、静電気的な引力を通じて製造したヒドロゲル写真であり、前駆細胞／幹細胞捕捉因子を含むか、含まないカチオン性キトサン（ＣＨ）溶液とアニオン性ヒアルロン酸（ＨＡ）溶液又はＨＡ－ＶＰ溶液を混合したとき、静電気的な引力により形成されたヒドロゲル写真である。

【図5】図５は、キトサン及びヒアルロン酸を反応させて製造したヒドロゲル（ＣＨＨＡ）及びキトサン及びＨＡ－ＶＰを反応させて製造したヒドロゲル（ＣＨＨＡ－ＶＰ）の（ａ）貯蔵弾性率／損失弾性率及び（ｂ）粘度を測定したデータである。

【図6】図６は、ヒアルロン酸にＶＰ単純混合（ＣＨＨＡ＋ＶＰ）又はＶＰ化学的導入（ＣＨＨＡ－ＶＰ）したとき、静電気的な引力により形成されたヒドロゲルにおいて（ａ）サブスタンスＰ及び（ｂ）ＶＰの放出挙動を測定したデータである。

【図7】図７は、ヒドロゲルの毒性を評価したデータである。

【図8】図８は、サブスタンスＰの幹細胞捕捉能力を確認したデータであり、（ａ）蛍光顕微鏡観察写真（赤色：幹細胞）及び（ｂ）移動した細胞数を示す。

【図9】図９は、生体外で本発明のヒドロゲルによる血管分化誘導程度を確認するために、ＣＤ３１に対する免疫染色を通じて細胞を観察した写真であり、（ａ）蛍光顕微鏡観察写真及び（ｂ）ＣＤ３１発現細胞数の測定結果である。

【図10】図１０は、生体外で本発明のヒドロゲルによる血管分化誘導程度を確認するために、（ａ）ｖＷＦ及び（ｂ）ＣＤ３１遺伝子発現の変化を確認したデータである。

【図11a】図１１ａは、生体内で幹細胞捕捉因子の有無によるヒドロゲルの幹細胞捕捉能力を確認したデータであり、ヒト由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の移動を蛍光測定装置を用いて観察した結果を示す。緑色は、ヒドロゲル、赤色は、細胞を示す。

【図11b】図１１ｂは、生体内で幹細胞捕捉因子の有無によるヒドロゲルの幹細胞捕捉能力を確認したデータであり、図１１ａの結果を定量的に示した。

【図12】図１２は、ヒドロゲルによる血管形成誘導を確認するために、生体内注入したヒドロゲルを摘出したときの外形を示す写真である。

【図13a】図１３ａは、摘出したヒドロゲルにおいてＢｒｄＵ及びＣＤ３１に対する免疫染色した写真を示す。

【図13b】図１３ｂは、摘出したヒドロゲルにおいてＢｒｄＵ及びＣＤ３１陽性細胞を定量化したデータを示す。

【図14】図１４は、摘出したヒドロゲルの（ａ）ｖＷＦ及び（ｂ）ＣＤ３１遺伝子発現の変化を通した血管形成効果を確認したデータである。

【実施例】

【0046】

［発明を実施するための最良の形態］
［実施例１］
血管内皮細胞成長因子模倣ペプチドが導入されたヒアルロン酸の製造
本発明では、内在性前駆細胞又は幹細胞捕捉能及び捕捉された細胞の血管分化誘導能を有する注入型ヒドロゲル組成物を製造するために、まず、血管内皮細胞成長因子模倣ペプチドが導入されたヒアルロン酸を製造した。

【0047】

具体的に、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ；ＨＡ）を蒸留水に１０ｍｇ／ｍｌで溶かして、ＨＡ溶液を製造した後、ＨＡ溶液１０ｍｌにＤＭＴＭＭ（４－（４，６－Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ－１，３，５－ｔｒｉａｚｉｎ－２－ｙｌ）－４－ｍｅｔｈｙｌｍｏｒｐｈｏｌｉｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ，Ｓｉｇｍａ、米国）０．３ｍｇを添加した後、１時間の間撹拌して、ヒアルロン酸のカルボン酸官能基を活性化させた。

【0048】

血管内皮形成因子模倣ペプチド（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｍｉｍｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ；ＶＰ、配列番号１：ＫＬＴＷＱＥＬＹＱＬＫＹＫＧＩ）１．９ｍｇを１ｍｌの蒸留水に溶かして製造したＶＰ溶液に前記カルボン酸官能基を活性化させたＨＡ溶液１０ｍｌを点滴し、２４時間の間撹拌して反応させた。反応溶液を７２時間の間透析し、－８０℃で凍結乾燥して、ＶＰが導入されたＨＡ－ＶＰを製造した。

【0049】

下記表１及び表２に示されたように、ＴＮＢＳＡ分析（ＴＮＢＳＡ ａｓｓａｙ、表１）及び元素分析（Ｅｌｅｍｅｎｔａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ、表２）を通じてＨＡに導入されたＶＰを確認した。

【0050】

【表1】

【0051】

【表2】

【0052】

［実施例２］
（キトサン及びＨＡ－ＶＰの比率によるゼータ電位及び流動学的特性の測定）
本発明では、前記実施例１で製造したＨＡ－ＶＰ及びキトサンが静電気的な引力を通じてヒドロゲルを形成するかを確認するために、キトサン及びＨＡ－ＶＰの比率によるゼータ電位（Ｚｅｔａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）及び流動学的特性を測定した。

【0053】

まず、キトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ；ＣＨ、ｓｉｇｍａ、米国）を０．１Ｍ酢酸水溶液に２０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶かしてＣＨ溶液を製造し、ＨＡ－ＶＰは、蒸留水に２０ｍｇ／ｍｌで溶かしてＨＡ－ＶＰ溶液を製造した。

【0054】

ＣＨ溶液とＨＡ－ＶＰ溶液を比率別に混合し、静電気的な結合を通じて形成されたヒドロゲルのゼータ電位をＥＬＳ－Ｚ（Ｏｔｓｕｋａ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、日本国）で測定し、流動学的特性は、粘弾性測定装置（ｍｏｄｕｌａｒ ｃｏｍｐａｃｔ ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ；ＭＣＲ １０２、Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ、オーストリア）を用いて測定した。流動学的特性の測定条件は、平行板（ｐａｒａｌｌｅｌ ｐｌａｔｅ）が直径２５ｍｍであり、底面との間隔が０．３ｍｍであり、２５℃でストレーン（ｓｔｒａｉｎ）２％、１Ｈｚである。

【0055】

その結果、図２に示されたように、ＣＨ溶液とＨＡ－ＶＰ溶液を混合したとき、４０秒程度にゼラチンポイント（ｇｅｌａｔｉｏｎ ｐｏｉｎｔ）が観察され、比率によってゼータ電位及び弾性率（ｍｏｄｕｌｕｓ）が変化することを確認した。これを通じて、キトサン及びＨＡ－ＶＰが静電気的な結合を形成することを確認した。また、減衰率（Ｄａｍｐｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）が２つの溶液を混合した場合、いずれも、１より小さいことを確認し、これを通じて、キトサン及びＨＡ－ＶＰが静電気的な引力を通じてヒドロゲルを形成することを確認した。

【0056】

［実施例３］
（静電気的な引力を通じたヒドロゲルの製造）
（３－１：カチオン性物質及びアニオン性物質の種類によるヒドロゲル製造）
本発明では、カチオン性ポリマーであるキトサン（ＣＨ）、カチオン性デキストラン（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｄｅｘｔｒａｎ；ＣＤ）、ポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ；ＰＥＩ）、ポリリシン（ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ；ＰＬ）、ポリヒスチジン（ｐｏｌｙ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；ＰＨ）と、アニオン性であるＨＡ又は血管内皮細胞成長因子模倣ペプチドが導入されたヒアルロン酸（ＨＡ－ＶＰ）をそれぞれ混合して、静電気的な引力を通じてヒドロゲルを製造した。

【0057】

まず、キトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ；ＣＨ、ｓｉｇｍａ、米国）を０．１Ｍ酢酸水溶液に２０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶かしてＣＨ溶液を製造し、ＣＤ、ＰＥＩ、ＰＬ、ＰＨ、ＨＡ及びＨＡ－ＶＰをそれぞれ蒸留水に２０ｍｇ／ｍｌで溶かしてＣＤ溶液、ＰＥＩ溶液、ＰＬ溶液、ＰＨ溶液、ＨＡ溶液及びＨＡ－ＶＰ溶液を製造した。

【0058】

次に、ＣＨ溶液、ＣＤ溶液、ＰＥＩ溶液、ＰＬ溶液、ＰＨ溶液と、ＨＡ溶液又はＣＨ溶液、ＣＤ溶液、ＰＥＩ溶液、ＰＬ溶液、ＰＨ溶液と、ＨＡ－ＶＰ溶液を同じ体積で混合してヒドロゲルを製造した。

【0059】

その結果、図３に示されたように、カチオン性物質及びアニオン性ヒアルロン酸は、静電気的な引力によりヒドロゲルが形成されることを確認した。

【0060】

（３－２：幹細胞捕捉因子の含有によるヒドロゲルの製造）
実施例３－１で製造したＣＨ溶液とＨＡ溶液又はＣＨ溶液とＨＡ－ＶＰ溶液を同じ体積で混合してＣＨＨＡヒドロゲル又はＣＨＨＡ－ＶＰヒドロゲルを製造した。また、同じ濃度のＣＨ、ＨＡ、ＨＡ－ＶＰ溶液それぞれにＳＰ、ＷＫＹＭＶＭ、ＳＤＦ１α、Ｇ－ＳＣＦ、ＭＣＰ－１（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、米国）のうちの１つをそれぞれ１μｇ／ｍｌの濃度で溶かした溶液を製造して、上記でヒドロゲルを形成したことと同じ方式で行った。

【0061】

【表3】

【0062】

図４に示されたように、ＶＰの化学的導入の前後と前駆細胞／幹細胞捕捉因子の混合有無に関係なく、静電気的な引力を通じてヒドロゲルが形成されることを確認した。

【0063】

［実施例４］
（ヒドロゲルの流動学的特性の評価）
前記実施例３で製造したＣＨＨＡ及びＣＨＨＡ－ＶＰヒドロゲルの流動学的特性を評価するために、粘弾性測定装置（ｍｏｄｕｌａｒ ｃｏｍｐａｃｔ ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ；ＭＣＲ １０２，Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ、オーストリア）を用いて弾性率及び粘度を測定した。ここで、使用した平行板（ｐａｒａｌｌｅｌ ｐｌａｔｅ）が直径２５ｍｍであり、底面との間隔が０．３ｍｍであり、２５℃で歪み（ｓｔｒａｉｎ）２％、１Ｈｚである。

【0064】

その結果、図５に示されたように、ＣＨＨＡ及びＣＨＨＡ－ＶＰは、同等なレベルの貯蔵弾性率（ｓｔｏｒａｇｅ ｍｏｄｕｌｕｓ）と損失弾性率（ｌｏｓｓ ｍｏｄｕｌｕｓ）を有することを確認し、また、同等なレベルの粘度を示した。したがって、ＶＰの導入がヒドロゲルの流動学的特性に大きな影響を与えなかったことが分かった。

【0065】

［実施例５］
（生体外（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ）における幹細胞捕捉因子及びＶＰの放出挙動の確認）
本発明では、静電気的な引力により製造したヒドロゲルで幹細胞捕捉因子及びＶＰの放出の度合いを確認しようとした。

【0066】

まず、前記実施例３で製造したＨＡ溶液にＶＰを３２０μｇ／ｍｌの濃度で単純混合してＨＡ＋ＶＰ溶液を製造し、ＨＡ溶液及びＨＡ－ＶＰ溶液それぞれに幹細胞捕捉因子であるＳＰを２μｇ／ｍｌの濃度で混合してＨＡ＋ＳＰ溶液とＨＡ－ＶＰ＋ＳＰ溶液をそれぞれ製造した。

【0067】

次に、ＣＨ溶液１００μｌ及びＨＡ＋ＶＰ溶液１００μｌをバイアルで混合して２００μｌのＣＨＨＡ＋ＶＰヒドロゲルを製造し、ＣＨ溶液１００μｌ及びＨＡ－ＶＰ溶液１００μｌをバイアルで混合して２００μｌのＣＨＨＡ－ＶＰヒドロゲルを製造した。

【0068】

また、ＣＨ溶液１００μｌ及びＨＡ＋ＳＰ溶液１００μｌをバイアルで混合して２００μｌのＣＨＨＡ＋ＳＰヒドロゲルを製造し、ＣＨ溶液１００μｌ及びＨＡ－ＶＰ＋ＳＰ溶液１００μｌをバイアルで混合して２００μｌのＣＨＨＡ－ＶＰ＋ＳＰヒドロゲルを製造した。

【0069】

各バイアルに生理食塩水を３ｍｌずつ入れ、１００ｒｐｍ、３７℃の条件でインキュベーターで保管しつつ、定められた時間にバイアルから１ｍｌの生理食塩水を取った後、新しい生理食塩水１ｍｌをバイアルに入れ、これを２８日間行うことで、放出実験を行った。

【0070】

その結果、図６（ａ）に示されたように、ＳＰの放出は、ＶＰの化学的導入と関係なく放出されることを確認し、すなわち、ＶＰの導入がヒドロゲルの伝達体としての特性に影響を与えないことを確認した。

【0071】

また、図６（ｂ）に示されたように、ＶＰの放出結果では、ＶＰを単純混合した場合には、放出実験初期にほぼすべてのＶＰが放出される反面、ＣＨＨＡ－ＶＰのようにＶＰが化学的に導入された場合には、ヒドロゲルの内部でほとんど放出されないことが確認される。すなわち、ＶＰを単純混合した場合に比べてＶＰが化学的に導入された場合、高い徐放性を有することを確認した。

【0072】

［実施例６］
（ヒドロゲルの毒性評価）
本発明で製造したヒドロゲルの毒性有無を評価した。

【0073】

まず、前記実施例３で製造したＣＨ、ＨＡ、ＨＡ－ＶＰ溶液と前記実施例５で製造したＨＡ＋ＶＰ溶液それぞれにヒト由来間葉系幹細胞（Ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ｈＭＳＣ）を１×１０^６個／ｍｌの濃度で混合した。

【0074】

前記製造した溶液で細胞毒性評価試験を行い、ヒドロゲルを形成させるために、（１）ＣＨ溶液２００μｌ及びＨＡ溶液２００μｌを混合して４００μｌのＣＨＨＡヒドロゲルを、（２）ＣＨ溶液２００μｌ及びＨＡ＋ＶＰ溶液２００μｌを混合して４００μｌのＣＨＨＡ＋ＶＰヒドロゲルを、（３）ＣＨ溶液２００μｌ及びＨＡ－ＶＰ ２００μｌを混合して４００μｌのＣＨＨＡ－ＶＰヒドロゲルを２４ウェルプレートに製造した。比較のための対照群として、ｈＭＳＣ４×１０^５個の細胞を２４ウェルプレートに添加した。培地を１ｍｌずつ加え、３日ごとに交替し、１、４、７日にＭＴＴ分析を通して細胞毒性を測定した。

【0075】

その結果、図７に示されたように、すべてのヒドロゲル群において対照群と比較したとき、高い毒性が現れないことを確認した。

【0076】

［実施例７］
（ＳＰの幹細胞捕捉能力の確認）
本発明では、ＳＰの幹細胞捕捉能力を確認した。

【0077】

まず、ヒト由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）をＰＫＨ２６染料（Ｓｉｇｍａ、米国）で標識した後、５×１０^４個の細胞になるように２４ウェルトランスウェルプレート（２４ ｗｅｌｌ ｔｒａｎｓ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ；ＳＰＬ、韓国）の上部チャンバー（Ｕｐｐｅｒ ｃｈａｍｂｅｒ、８．０μｍ ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ）に分注した。血清のないＤＭＥＭ（Ｄｕｂｅｌｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ，Ｇｉｂｃｏ、米国）培地を用いて４８時間の間上部チャンバーで培養した後、１μｇ／ｍｌのＳＰ及び１％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ，Ｇｉｂｃｏ、米国）が含まれたＤＭＥＭを下部ウェル（ｂｏｔｔｏｍ ｗｅｌｌ）に入れ、３日ごとに培地を交替しつつ、蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、日本国）を用いて下部ウェルに移動したｈＭＳＣを観察した。対照群は、下部ウェルにＳＰを含まれていないＤＭＥＭ（１％ＦＢＳを含む）培地を添加して観察した。

【0078】

その結果、図８に示されたように、ＳＰが存在する場合が、そうではない場合よりも、下部に移動した細胞が多いことを確認し、これを通じて、ＳＰが幹細胞を捕捉することを確認した。下記の表４は、サブスタンスＰの幹細胞捕捉能力を確認したデータの定量分析結果である。

【0079】

【表4】

【0080】

［実施例８］
（生体外で本発明のヒドロゲルによる血管形成効果の確認）
（８－１：免疫蛍光分析を通した血管形成の確認）
本発明の注入型ヒドロゲルの血管形成誘導効果を確認するために、前記実施例６と同じ方法でヒト由来間葉系幹細胞が含まれたＣＨＨＡ、ＣＨＨＡ＋ＶＰ及びＣＨＨＡ－ＶＰヒドロゲルをそれぞれ製造し、３日ごとに培地を交換しつつ、４週間培養した。

【0081】

培養１、２、３、４週にヒドロゲルをホルマリンで固定し、血管細胞で発現することが知られたＣＤ３１の発現の有無を観察するために、免疫蛍光（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）分析を行った。

【0082】

その結果、図９に示されたように、血管内皮細胞成長因子模倣ペプチドをヒアルロン酸と単純混合して製造したヒドロゲル（ＣＨＨＡ＋ＶＰ）に比べて、血管内皮細胞成長因子模倣ペプチドを化学的にヒアルロン酸に導入して製造したヒドロゲル（ＣＨＨＡ－ＶＰ）においてＣＤ３１を発現する幹細胞の数が顕著に増加したことを確認した。

【0083】

（８－２：遺伝子発現変化を通した血管形成の確認）
前記実施例８－１のヒドロゲルからｍＲＮＡを抽出した後、抽出したｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡを合成し、ｑＲＴ－ＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を通じて血管細胞で発現するフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）遺伝子及びＣＤ３１遺伝子の発現変化を確認した。

【0084】

【表5】

【0085】

その結果、図１０に示されたように、ＶＰが化学的に導入された場合、ＶＰが存在しない場合、及びＶＰを単純混合した場合に比べて、ｖＷＦ遺伝子及びＣＤ３１遺伝子の発現が高いことが確認された。すなわち、本発明のヒドロゲルは、血管細胞への分化を効果的に誘導することを確認した。

【0086】

［実施例９］
（生体内でヒドロゲルによる幹細胞捕捉能力の確認）
本発明のヒドロゲルにより生体内で実際に幹細胞が捕捉されるかを確認した。

【0087】

まず、蛍光イメージングのために、ＦＩＴＣを標識したキトサン（ＣＨ）溶液とヒアルロン酸（ＨＡ）溶液に幹細胞捕捉因子であるＳＰを１μｇ／ｍｌになるようにそれぞれ入れ、デュアルシリンジを通じてヌードマウスの皮下にそれぞれ１００μｌずつ、合計２００μｌのヒドロゲルを注入した。比較のために、捕捉因子が含まれていないＦＩＴＣを標識したＣＨ溶液とＨＡ溶液を同じ方法で注入した。

【0088】

その後、ヌードマウスの尾静脈にＩＲ－７８３を標識した１×１０^６個のｈＭＳＣを注入し、蛍光イメージングを通じて細胞の移動を観察した。結果は、図１０に示し、ヒドロゲルは緑色、細胞は赤色で示した。

【0089】

その結果、図１１ａ及び図１１ｂに示されたように、幹細胞捕捉因子が存在しない場合は、細胞による赤い蛍光が観察されず、捕捉因子が存在する場合、細胞による赤い蛍光が観察された。すなわち、幹細胞捕捉因子により幹細胞がヒドロゲル側に捕捉することを確認した。

【0090】

［実施例１０］
（生体内でヒドロゲルによる血管形成誘導能の確認）
（１０－１：ヒドロゲルの製造及び注入）
本発明のヒドロゲルにより生体内で実際に血管形成が誘導されるかを確認した。

【0091】

まず、ＣＨ、ＨＡ、ＨＡ＋ＶＰ、ＨＡ－ＶＰ溶液に幹細胞捕捉因子であるＳＰを１μｇ／ｍｌになるようにそれぞれ入れた後、ＣＨ及びＨＡ、ＣＨ及びＨＡ＋ＶＰ、ＣＨ及びＨＡ－ＶＰの組み合わせでデュアルシリンジを通じてヌードマウスの皮下にそれぞれ１００μｌずつ、合計２００μｌのヒドロゲルを注入した。比較のために、捕捉因子が含まれていないＣＨ、ＨＡ、ＨＡ＋ＶＰ、ＨＡ－ＶＰ溶液を同じ方法で注入した。その後、ヌードマウスの尾静脈にＢｒｄＵで標識した１×１０^６個のｈＭＳＣを注入した。ヒドロゲルは、１、２、３、４週に摘出して、血管形成の有無を観察した。

【0092】

その結果、図１２に示されたように、４週間ヒドロゲルが形態を良好に維持しており、ＶＰが化学的に導入された場合に、ヒドロゲルの表面でさらに多い血管が観察されることを確認した。

【0093】

（１０－２：免疫蛍光分析を通した血管形成の確認）
前記実施例１０－１で摘出したヒドロゲルに捕捉されたｈＭＳＣ及び血管形成程度を確認するために、ＢｒｄＵ及びＣＤ３１に対する免疫蛍光分析を行った。観察結果は、図１３ａ及び図１３ｂに示し、ＢｒｄＵは赤色、ＣＤ３１は緑色で染色した。

【0094】

その結果、図１３ａ及び図１３ｂに示されたように、捕捉因子が存在しない場合、赤色が観察されず、これは、ｈＭＳＣが捕捉されないことを意味する。反面、捕捉因子が含まれた場合、ヒドロゲルの内部で赤く染色された細胞が観察され、これを通じて、ヒドロゲルの内部にｈＭＳＣが捕捉されたことを確認した。

【0095】

緑色で染色されたＣＤ３１の場合は、ＶＰが物理的に混合された場合よりも、化学的に導入された場合、ＣＤ３１を発現する細胞数が増加したことを確認した。

【0096】

また、ＢｒｄＵとＣＤ３１が同時に染色された細胞の場合も、ＶＰが化学的に導入されたヒドロゲルにおいてさらに多く増加したことを確認し、これを通じて、捕捉因子が存在する場合、ヒドロゲルの内部にｈＭＳＣが捕捉され、化学的に導入されたＶＰにより、単純混合したＶＰよりも血管細胞への分化と血管形成促進が効果的に誘導されることを確認した。

【0097】

（１０－３：遺伝子発現変化を通した血管形成の確認）
前記実施例１０－１で摘出したヒドロゲルからｍＲＮＡを抽出し、前記実施例８－２と同じ方法でｑＲＴ－ＰＣＲを行った。

【0098】

その結果、図１４に示されたように、ヌードマウスから摘出したヒドロゲルにおいてヒト細胞で発現するｖＷＦ及びＣＤ３１遺伝子が発現したことを確認し、これを通じて、捕捉因子により尾静脈に注入したｈＭＳＣが移動してヒドロゲルに捕捉されたことを確認した。また、ＶＰが化学的に導入された場合に、ＶＰが存在しない場合及びＶＰを単純混合した場合に比べて、ｖＷＦ遺伝子及びＣＤ３１遺伝子の発現量が顕著に増加したことを確認し、これを通じて、本発明のヒドロゲルにより血管形成が誘導されたことを確認した。

【産業上の利用可能性】

【0099】

本発明の内在性前駆細胞又は幹細胞捕捉能及び捕捉された細胞の血管分化誘導能を有する注入型ヒドロゲル組成物は、注入されたヒドロゲルから幹細胞捕捉因子が放出されて、内在性前駆細胞／幹細胞がヒドロゲルに捕捉され、化学的にヒアルロン酸に導入された血管分化誘導因子により血管細胞に分化して血管形成誘導が促進されることを確認し、特に、血管分化誘導因子を化学的にヒアルロン酸に導入したとき、高い血管形成誘導効果を示すことを確認した。したがって、本発明のヒドロゲル組成物は、内在性前駆細胞／幹細胞捕捉能及び血管分化誘導能に優れているので、血管形成以外に多様な組織再生及び傷の治療に有用に適用することができ、産業上の利用可能性が高い。

【配列表フリーテキスト】

【0100】

配列番号１は、血管分化誘導因子である血管内皮細胞成長因子模倣ペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号２は、幹細胞捕捉因子であるサブスタンスＰ（ＳＰ）ペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、幹細胞捕捉因子であるＷＫＹＭＶＭペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号４は、ｖＷＦの正方向プライマーの塩基配列を示す。
配列番号５は、ｖＷＦの逆方向プライマーの塩基配列を示す。
配列番号６は、ＣＤ３１の正方向プライマーの塩基配列を示す。
配列番号７は、ＣＤ３１の逆方向プライマーの塩基配列を示す。
配列番号８は、ＧＡＰＤＨの正方向プライマーの塩基配列を示す。
配列番号９は、ＧＡＰＤＨの逆方向プライマーの塩基配列を示す。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11a】

【図11b】

【図12】

【図13a】

【図13b】

【図14】

【配列表】

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