特許7391181人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来間葉系幹細胞の前駆細胞、及びその製造方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-11-24
(45)【発行日】2023-12-04
(54)【発明の名称】人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来間葉系幹細胞の前駆細胞、及びその製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0775 20100101AFI20231127BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231127BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0775
C12N5/10
【請求項の数】
3
(21)【出願番号】P 2022505336
(86)(22)【出願日】2019-12-24
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-09-29
(86)【国際出願番号】 KR2019018426
(87)【国際公開番号】W WO2021020666
(87)【国際公開日】2021-02-04
【審査請求日】2022-01-25
(31)【優先権主張番号】10-2019-0091269
(32)【優先日】2019-07-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2019-0173078
(32)【優先日】2019-12-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
【微生物の受託番号】KCTC KCTC 14019BP
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】521504245
【氏名又は名称】プレクソジェン インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100107766
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠重
(74)【代理人】
【識別番号】100070150
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠彦
(74)【代理人】
【識別番号】100135079
【弁理士】
【氏名又は名称】宮崎 修
(72)【発明者】
【氏名】スゥ・キム
【審査官】藤澤 雅樹
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１９／１３５６４５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１５－５２３０８３（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２００８／０７０２５８（ＷＯ，Ａ２）
【文献】Int. J. Mol. Sci. (2018) Vol.19, No.3119, pp.1-16
【文献】Stem Cell Reports (2014) Vol.3, pp.414-422, Table S2
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ ５／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
人工多能性幹細胞を、ＦＢＳ及びｂＦＧＦを含む培地で７日間培養する段階、及びＳＳＥＡ－４－細胞を分離し、ＦＢＳ及びｂＦＧＦを含む培地で７日間培養する段階を含むことを特徴とする人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞の製造方法。
【請求項2】
人工多能性幹細胞を、ＦＢＳ及びｂＦＧＦを含む培地で７日間培養する段階、ＳＳＥＡ－４－細胞を分離し、ＦＢＳ及びｂＦＧＦを含む培地で７日間培養する段階、及び
前記培地からエキソソームを分離する段階を含むことを特徴とするエキソソームの生産方法。
【請求項3】
前記培地は、エキソソームの除去されたウシ胎児血清が含まれる、請求項２に記載のエキソソームの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本特許出願は、２０１９年７月２６日に大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０－２０１９－００９１２６９号に対して優先権を主張し、該特許出願の開示事項は、本明細書に援用により組み込まれる。
【0002】
本発明は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来間葉系幹細胞の前駆細胞、及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【0003】
間葉系幹細胞は、多能性の間質細胞で、骨細胞、軟骨細胞、筋細胞、脂肪細胞などを含む様々な細胞へと分化可能な細胞のことを指す。間葉系幹細胞は、軟骨や骨組織、靭帯、骨髄間質などの様々な結合組織へと分化可能なことから、関節炎、創傷、火傷などによって生じた軟部組織の欠陥を治療するなど、様々な疾患に対する治療用途として研究されている。また、間葉系幹細胞は、このような構造的支持機能の他にも、抗炎症性サイトカインの発現やマクロファージのＭ２型マクロファージへの軽質転換等の免疫調節機能又は免疫抑制機能を有するので、炎症反応を抑制し、関節炎、炎症性腸疾患、アトピー性皮膚炎、自己免疫疾患等の免疫系の過度な活性化によって引き起こされる免疫疾患の治療剤として用いるために、数多くの研究がなされている。
【0004】
最近では、間葉系幹細胞自体を使用せず、間葉系幹細胞が分泌するエキソソームを用いて、様々な疾患への治療効果を積極的に研究している。このようなエキソソームを商業的に用いるためには、多量かつ高品質のエキソソームが必要である。しかしながら、間葉系幹細胞から得られるエキソソームの量は非常に少なく、間葉系幹細胞の機能及び増殖能も継代を繰り返すと減少するため、間葉系幹細胞と比較して同等又はより優れた機能性を有しながらも、増殖能に優れた細胞を樹立する技術の開発の必要性が台頭した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】大韓民国公開特許公報 第１０－２０１９－００６３４５３号（２０１９．０１．１５．公開）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明者らは、従来の間葉系幹細胞と比較して同等又はより優れた機能性を有する上に、増殖能にも優れた幹細胞を開発しようと鋭意研究努力した。その結果、人工多能性幹細胞に由来する間葉系幹細胞よりも未分化状態を維持する間葉系前駆細胞を樹立し、その優れた機能性及び増殖能を究明し、本発明を完成するに至った。
したがって、本発明の目的は、人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ ｏｆ ｉＰＳＣ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、該前駆細胞からなる細胞集団（ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）、及びそれらの製造方法を提供することである。
本発明の他の目的は、前記人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞からエキソソームを生産する方法を提供することである。
したがって、本発明の目的は、人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ ｏｆ ｉＰＳＣ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、該前駆細胞からなる細胞集団（ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）、及びそれらの製造方法を提供することである。
本発明の他の目的は、前記人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞からエキソソームを生産する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明の一様態によれば、本発明は、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ＭＳＣ）の前駆細胞を含む細胞集団（ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を提供する。
【0008】
本明細書において用語“幹細胞”とは、自己複製能を有し、２つ以上の異なる種類の細胞に分化する能力を有する未分化細胞を示す。本発明の幹細胞は、自己幹細胞又は同種異系由来幹細胞であってよい。
【0009】
本明細書において用語“間葉系幹細胞”は、骨細胞、軟骨細胞、筋細胞、脂肪細胞などを含む様々な細胞に分化可能な多能性細胞を指す。前記間葉系幹細胞は、骨髄由来の間葉系幹細胞が最も多用されているが、骨髄の他に、臍帯又は臍帯血、脂肪組織、羊膜液、奥歯の歯蕾（ｔｏｏｔｈ ｂｕｄ）に由来してもよい。間葉系幹細胞は、間質細胞（ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ）とも呼ばれる。
【0010】
本明細書において、本発明者らが開発した間葉系幹細胞の前駆細胞は、一般の間葉系幹細胞ではなく、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ｉＰＳＣ）に由来する間葉系幹細胞の前駆細胞である。
前記“人工多能性幹細胞”は、分化した細胞からの人工的なリプログラミングプロセスによって、多能性分化能を有するように誘導された細胞を示し、リプログラミングされた幹細胞とも称する。人工的なリプログラミングプロセスは、レトロウイルス、レンチウイルス、及びセンダイウイルスを用いたウイルス媒介リプログラミング因子、又は非ウイルス性ベクター、タンパク質、及び細胞抽出物などを用いる非ウイルス媒介リプログラミング因子の導入によって行われる。リプログラミングプロセスには、幹細胞抽出物、化合物などによるリプログラミングも含まれる。人工多能性幹細胞は、胚性幹細胞とほぼ同じ特性を有し、特に類似の細胞形態を示し、遺伝子及びタンパク質の発現パターンが類似であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで多能性を有し、テラトーマ（ｔｅｒａｔｏｍａ）を形成し、マウスの胚盤胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）に挿入するとキメラ（ｃｈｉｍｅｒａ）マウスを形成し、遺伝子の生殖細胞系伝達（ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）が可能である。
本発明の人工多能性幹細胞には、ヒト、サル、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギなどのあらゆる種由来の人工多能性幹細胞を含むが、好ましくは、ヒト由来の人工多能性幹細胞である。
また、本発明の前記人工多能性幹細胞がリプログラミングする前の体細胞は、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜、羊水、又は胎盤などに由来する体細胞であるが、これに限定されない。具体的には、前記体細胞は、線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）、肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）、脂肪細胞（ａｄｉｐｏｓｅ ｃｅｌｌ）、上皮細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）、表皮細胞（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｃｅｌｌ）、軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）、筋細胞（ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ）、心筋細胞（ｃａｒｄｉａｃ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ）、メラノサイト（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ）、神経細胞（ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌ）、膠細胞（ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ）、星状膠細胞（ａｓｔｒｏｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ）、単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）、マクロファージ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）などを含むが、これに限定されるものではない。
前記“人工多能性幹細胞”は、分化した細胞からの人工的なリプログラミングプロセスによって、多能性分化能を有するように誘導された細胞を示し、リプログラミングされた幹細胞とも称する。人工的なリプログラミングプロセスは、レトロウイルス、レンチウイルス、及びセンダイウイルスを用いたウイルス媒介リプログラミング因子、又は非ウイルス性ベクター、タンパク質、及び細胞抽出物などを用いる非ウイルス媒介リプログラミング因子の導入によって行われる。リプログラミングプロセスには、幹細胞抽出物、化合物などによるリプログラミングも含まれる。人工多能性幹細胞は、胚性幹細胞とほぼ同じ特性を有し、特に類似の細胞形態を示し、遺伝子及びタンパク質の発現パターンが類似であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで多能性を有し、テラトーマ（ｔｅｒａｔｏｍａ）を形成し、マウスの胚盤胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）に挿入するとキメラ（ｃｈｉｍｅｒａ）マウスを形成し、遺伝子の生殖細胞系伝達（ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）が可能である。
本発明の人工多能性幹細胞には、ヒト、サル、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギなどのあらゆる種由来の人工多能性幹細胞を含むが、好ましくは、ヒト由来の人工多能性幹細胞である。
また、本発明の前記人工多能性幹細胞がリプログラミングする前の体細胞は、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜、羊水、又は胎盤などに由来する体細胞であるが、これに限定されない。具体的には、前記体細胞は、線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）、肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）、脂肪細胞（ａｄｉｐｏｓｅ ｃｅｌｌ）、上皮細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）、表皮細胞（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｃｅｌｌ）、軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）、筋細胞（ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ）、心筋細胞（ｃａｒｄｉａｃ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ）、メラノサイト（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ）、神経細胞（ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌ）、膠細胞（ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ）、星状膠細胞（ａｓｔｒｏｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ）、単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）、マクロファージ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）などを含むが、これに限定されるものではない。
【0011】
本発明の一実施形態において、前記細胞集団は、少なくとも８０％以上の細胞の細胞表面上に発現するマーカータンパク質が、ＣＤ７３＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、又はそれらの組み合わせであることを特徴とする。本発明の特定の実施形態において、前記細胞集団は、少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％以上の細胞の細胞表面上に発現するマーカータンパク質がＣＤ７３＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、又はそれらの組み合わせであることを特徴とする。
【0012】
また、本発明の別の実施形態において、前記細胞集団は、最大で５％の細胞の細胞表面上に発現するマーカータンパク質がＣＤ３４＋、及び／又はＣＤ４５＋であることを特徴とする。本発明の特定の実施形態において、前記細胞集団は、最大で５％、４％、又は３％の細胞の細胞表面上に発現するマーカータンパク質がＣＤ３４＋、及び／又はＣＤ４５＋であることを特徴とする。
【0013】
本明細書において、ＣＤは、細胞表面上の分化抗原群（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を意味し、“＋”又は“（＋）”は、細胞表面に対応する細胞表面マーカーが存在する（陽性）ことを意味し、“－”又は“（－）”は、細胞表面に対応する細胞表面マーカーが存在しない（陰性）ことを意味する。前記マーカーの存在（陽性）又は不在（陰性）は、物理的に絶対的な存在の有無を意味するものではなく、当業界における技術レベルで実験的に検出可能な数値以上であれば存在（陽性）し、その数値以下であれば不在（陰性）すると判断する、相対的な基準に基づく存在又は不在を意味する。
【0014】
本発明の別の実施形態において、本発明の間葉系幹細胞の前駆細胞は、同等な数の間葉系幹細胞に比べて、ＡＮＫＲＤ１、ＣＰＥ、ＮＫＡＩＮ４、ＬＣＰ１、ＣＣＤＣ３、ＭＡＭＤＣ２、ＣＬＳＴＮ２、ＳＦＴＡ１Ｐ、ＥＰＢ４１Ｌ３、ＰＤＥ１Ｃ、ＥＭＩＬＩＮ２、ＳＵＬＴ１Ｃ４、ＴＲＩＭ５８、ＤＥＮＮＤ２Ａ、ＣＡＤＭ４、ＡＩＦ１Ｌ、ＮＴＭ、ＳＨＩＳＡ２、ＲＡＳＳＦ４、及びＡＣＫＲ３からなる群から選ばれる少なくとも１以上の遺伝子をより高いレベルで発現する。
より高いレベルとは、同等の数の間葉系幹細胞によって発現される遺伝子発現の量と比較して、少なくとも３倍、５倍、７倍、又は１０倍高いレベルを意味する。
より高いレベルとは、同等の数の間葉系幹細胞によって発現される遺伝子発現の量と比較して、少なくとも３倍、５倍、７倍、又は１０倍高いレベルを意味する。
【0015】
また、本発明のさらに別の実施形態において、本発明の間葉系幹細胞の前駆細胞は、同等な数の間葉系幹細胞に比べて、ＤＨＲＳ３、ＢＭＰＥＲ、ＩＦＩ６、ＰＲＳＳ１２、ＲＤＨ１０、及びＫＣＮＥ４からなる群から選ばれる少なくとも１以上の遺伝子をより低いレベルで発現する。
より低いレベルとは、同等の数の間葉系幹細胞によって発現される遺伝子発現の量と比較して、少なくとも３倍、５倍、７倍、又は１０倍低いレベルを意味する。
より低いレベルとは、同等の数の間葉系幹細胞によって発現される遺伝子発現の量と比較して、少なくとも３倍、５倍、７倍、又は１０倍低いレベルを意味する。
【0016】
本発明の特定の実施形態において、前記間葉系幹細胞の前駆細胞及び同等な数の間葉系幹細胞は、同種組織由来である。より具体的には、前記間葉系幹細胞の前駆細胞は、同種組織由来の人工多能性幹細胞に由来する間葉系幹細胞の前駆細胞である。
本発明の一実施形態において、前記間葉系幹細胞の前駆細胞は、臍帯組織由来の人工多能性幹細胞に由来する間葉系幹細胞の前駆細胞であり、これと比較される同等な数の間葉系幹細胞は、臍帯組織由来の間葉系幹細胞である。
本発明の一実施形態において、前記間葉系幹細胞の前駆細胞は、臍帯組織由来の人工多能性幹細胞に由来する間葉系幹細胞の前駆細胞であり、これと比較される同等な数の間葉系幹細胞は、臍帯組織由来の間葉系幹細胞である。
【0017】
本発明者らは、前記人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞をＢｘＣ（ｂｒｅｘｏｇｅｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）と命名した。本明細書において前記“人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞（ＢｘＣ）”は、“人工多能性幹細胞由来間葉系前駆細胞”、又は“人工多能性幹細胞由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞”とも表現される。
本明細書において、前記“人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞（ＢｘＣ）”は、“韓国生命工学研究院微生物資源センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ，ＫＣＴＣ）”に受託番号“ＫＣＴＣ１４０１９ＢＰ”として寄託されたものである。
本発明の実施例から立証されるように、本発明の同一組織（例えば、臍帯組織）由来の人工多能性幹細胞の間葉系幹細胞の前駆細胞（ＢｘＣ）は、同一組織（例えば、臍帯組織）由来の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）と比較して、染色体核型異常がなく、増殖能にも優れている。具体的には、本発明のＢｘＣは、９回以上の継代を繰り返した場合に、同一組織由来の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）と比較して１０倍以上の増殖能の差異を示し、１２回以上の継代を繰り返しても増殖能の減少が観察されなかった。また、ＢｘＣは、ＭＳＣに比べて、細胞増殖能に関連するマーカーであるＫｉ６７の２倍以上の発現レベルを示した。
本明細書において、前記“人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞（ＢｘＣ）”は、“韓国生命工学研究院微生物資源センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ，ＫＣＴＣ）”に受託番号“ＫＣＴＣ１４０１９ＢＰ”として寄託されたものである。
本発明の実施例から立証されるように、本発明の同一組織（例えば、臍帯組織）由来の人工多能性幹細胞の間葉系幹細胞の前駆細胞（ＢｘＣ）は、同一組織（例えば、臍帯組織）由来の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）と比較して、染色体核型異常がなく、増殖能にも優れている。具体的には、本発明のＢｘＣは、９回以上の継代を繰り返した場合に、同一組織由来の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）と比較して１０倍以上の増殖能の差異を示し、１２回以上の継代を繰り返しても増殖能の減少が観察されなかった。また、ＢｘＣは、ＭＳＣに比べて、細胞増殖能に関連するマーカーであるＫｉ６７の２倍以上の発現レベルを示した。
【0018】
本発明の一実施形態において、本発明の人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞（ＢｘＣ）は、エンドスタチン（Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、エンドセリン（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ）－１、ＶＥＧＦ－Ａ、トロンボスポンジン（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ）－２、ＰｌＧＦ、ＰＤＧＦ－ＡＡ、ｂｅｔａ－ＮＧＦ、及びＨＢ－ＥＧＦ等のタンパク質を、同等な数の間葉系幹細胞と比較して多量に分泌する。
本明細書において、前記エンドスタチンは、天然に生成されたＸＶＩＩＩ型コラーゲンに由来する２０ｋＤａのＣ末端フラグメントであり、抗血管新生剤として報告されている。
本明細書において、前記エンドセリン－１は、プレプロエンドセリン（ｐｒｅｐｒｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ）－１（ＰＰＥＴ１）とも知られており、ＥＤＮ１遺伝子によってコードされるタンパク質であり、血管内皮細胞で生産される。エンドセリン－１は、強力な血管収縮剤として知られている。
本明細書において、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ－Ａ（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ Ａ））は、ＶＥＧＦＡ遺伝子によってコードされるタンパク質で、血管内皮細胞のＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２との相互作用によって血管の成長を誘導することが知られている。
本明細書において、前記トロンボスポンジン（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ）－２は、ＴＨＢＳ２遺伝子によってコードされるタンパク質で、細胞間相互作用又は細胞－マトリックス相互作用を媒介するものと知られている。トロンボスポンジン－２の癌に対する役割には論議の余地があるが、間葉系幹細胞の細胞表面特性を調節することが報告されており、細胞接着及び細胞移動に関与するものと知られている。
本明細書において、胎盤成長因子（ＰｌＧＦ（ｐｌａｃｅｎｔａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ））は、ＰＧＦ遺伝子によってコードされるタンパク質で、ＶＥＧＦサブファミリーのメンバーとして胚発生段階における血管新生に主要な役割を果たすタンパク質として知られている。
本明細書において、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ－ＡＡ（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ））は、細胞の成長及び分裂を調節する成長因子であり、血管の形成及び成長、及び間葉系幹細胞の増殖、化学走性、及び遊走において重要な役割を担うものと知られている。
本明細書において、神経成長因子（ＮＧＦ（Ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ））は、主にニューロンの成長、維持、増殖、及び生存に関与する神経栄養因子、及び神経ペプチドである。ＮＧＦは、ａｌｐｈａ－ＮＧＦ、ｂｅｔａ－ＮＧＦ、及びｇａｍｍａ－ＮＧＦが、約２：１：２の割合で発現する３種のタンパク質の複合体である。ｇａｍｍａ－ＮＧＦはセリンプロテアーゼとして作用し、ｂｅｔａ－ＮＧＦのＮ末端を切断してＮＧＦを活性化させるものと知られている。
本明細書において、ヘパリン結合性ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ－ＥＧＦ（ｈｅｐａｒｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ＥＧＦ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ））は、ＨＢＥＧＦ遺伝子によってコードされるＥＧＦファミリータンパク質のメンバーである。ＨＢ－ＥＧＦは、心臓の発達及び血管分布に重要な役割を担うものと知られており、皮膚の創傷治癒において上皮化に必須なタンパク質であることが知られている。
本明細書において、前記エンドスタチンは、天然に生成されたＸＶＩＩＩ型コラーゲンに由来する２０ｋＤａのＣ末端フラグメントであり、抗血管新生剤として報告されている。
本明細書において、前記エンドセリン－１は、プレプロエンドセリン（ｐｒｅｐｒｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ）－１（ＰＰＥＴ１）とも知られており、ＥＤＮ１遺伝子によってコードされるタンパク質であり、血管内皮細胞で生産される。エンドセリン－１は、強力な血管収縮剤として知られている。
本明細書において、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ－Ａ（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ Ａ））は、ＶＥＧＦＡ遺伝子によってコードされるタンパク質で、血管内皮細胞のＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２との相互作用によって血管の成長を誘導することが知られている。
本明細書において、前記トロンボスポンジン（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ）－２は、ＴＨＢＳ２遺伝子によってコードされるタンパク質で、細胞間相互作用又は細胞－マトリックス相互作用を媒介するものと知られている。トロンボスポンジン－２の癌に対する役割には論議の余地があるが、間葉系幹細胞の細胞表面特性を調節することが報告されており、細胞接着及び細胞移動に関与するものと知られている。
本明細書において、胎盤成長因子（ＰｌＧＦ（ｐｌａｃｅｎｔａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ））は、ＰＧＦ遺伝子によってコードされるタンパク質で、ＶＥＧＦサブファミリーのメンバーとして胚発生段階における血管新生に主要な役割を果たすタンパク質として知られている。
本明細書において、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ－ＡＡ（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ））は、細胞の成長及び分裂を調節する成長因子であり、血管の形成及び成長、及び間葉系幹細胞の増殖、化学走性、及び遊走において重要な役割を担うものと知られている。
本明細書において、神経成長因子（ＮＧＦ（Ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ））は、主にニューロンの成長、維持、増殖、及び生存に関与する神経栄養因子、及び神経ペプチドである。ＮＧＦは、ａｌｐｈａ－ＮＧＦ、ｂｅｔａ－ＮＧＦ、及びｇａｍｍａ－ＮＧＦが、約２：１：２の割合で発現する３種のタンパク質の複合体である。ｇａｍｍａ－ＮＧＦはセリンプロテアーゼとして作用し、ｂｅｔａ－ＮＧＦのＮ末端を切断してＮＧＦを活性化させるものと知られている。
本明細書において、ヘパリン結合性ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ－ＥＧＦ（ｈｅｐａｒｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ＥＧＦ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ））は、ＨＢＥＧＦ遺伝子によってコードされるＥＧＦファミリータンパク質のメンバーである。ＨＢ－ＥＧＦは、心臓の発達及び血管分布に重要な役割を担うものと知られており、皮膚の創傷治癒において上皮化に必須なタンパク質であることが知られている。
【0019】
本発明の他の実施形態によれば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来の間葉系幹細胞の前駆細胞を調製するための方法が提供され、この方法には以下が含まれる。：
人工多能性幹細胞を、ＦＢＳ及びｂＦＧＦを含む培地で１～１０日間培養する段階；及び
ＳＳＥＡ－４（－）細胞を分離し、ＦＢＳ及びｂＦＧＦを含む培地で１～１０日間培養する段階。
人工多能性幹細胞を、ＦＢＳ及びｂＦＧＦを含む培地で１～１０日間培養する段階；及び
ＳＳＥＡ－４（－）細胞を分離し、ＦＢＳ及びｂＦＧＦを含む培地で１～１０日間培養する段階。
【0020】
本発明の前記間葉系幹細胞の前駆細胞は、上述した間葉系幹細胞の前駆細胞と同一の細胞であるので、これら両者に共通する内容は、その記載を省略する。
本発明の一実施形態によれば、前記人工多能性幹細胞は、ヒトの臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜、羊水、又は胎盤に由来する体細胞をリプログラミング用培地で培養して製造されたものである。
具体的に、前記体細胞は、線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）、肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）、脂肪細胞（ａｄｉｐｏｓｅ ｃｅｌｌ）、上皮細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）、表皮細胞（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｃｅｌｌ）、軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）、筋細胞（ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ）、心筋細胞（ｃａｒｄｉａｃ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ）、メラノサイト（ｍｅｌａｏｎｏｃｙｔｅ）、神経細胞（ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌ）、膠細胞（ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ）、星状膠細胞（ａｓｔｒｏｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ）、単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）、マクロファージ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、又は骨髄、臍帯、臍帯血、脂肪組織、羊膜、奥歯の歯蕾（ｔｏｏｔｈ ｂｕｄ）に由来する間葉系幹細胞などを含むが、これに限定されるものではない。
本発明の一実施形態によれば、前記人工多能性幹細胞は、ヒトの臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜、羊水、又は胎盤に由来する体細胞をリプログラミング用培地で培養して製造されたものである。
具体的に、前記体細胞は、線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）、肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）、脂肪細胞（ａｄｉｐｏｓｅ ｃｅｌｌ）、上皮細胞（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）、表皮細胞（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｃｅｌｌ）、軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）、筋細胞（ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ）、心筋細胞（ｃａｒｄｉａｃ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ）、メラノサイト（ｍｅｌａｏｎｏｃｙｔｅ）、神経細胞（ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌ）、膠細胞（ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ）、星状膠細胞（ａｓｔｒｏｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ）、単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）、マクロファージ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、又は骨髄、臍帯、臍帯血、脂肪組織、羊膜、奥歯の歯蕾（ｔｏｏｔｈ ｂｕｄ）に由来する間葉系幹細胞などを含むが、これに限定されるものではない。
【0021】
本明細書において、ステージ特異的胚性抗原－４（ＳＳＥＡ－４（ｓｔａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ－４））は、ヒトの人工多能性幹細胞及び胚性幹細胞の特徴的な細胞表面マーカーの一つである。本発明の一実施形態において、前記ＳＳＥＡ－４は、本発明の間葉系幹細胞前駆細胞（ＢｘＣ）への分化過程において、人工多能性幹細胞の特徴を失った細胞と、人工多能性幹細胞の特徴を保持する細胞と、を区分するためのスクリーニング因子として用いられてよい。
【0022】
本発明の一実施形態によれば、本発明者は、人工多能性幹細胞を培養し、ＳＳＥＡ－４を発現するか否かを基準にスクリーニングして、ＳＳＥＡ－４（－）細胞を分離した後、追加培養を実施した。
本発明の一実施形態において、人工多能性幹細胞、及びＳＳＥＡ－４（－）細胞の培養は、具体的には１～１０日、３～１０日、５～１０日間行われてよく、より具体的には、５～７日又は７～１０日間行われてよい。
本発明の一実施形態において、人工多能性幹細胞、及びＳＳＥＡ－４（－）細胞の培養は、具体的には１～１０日、３～１０日、５～１０日間行われてよく、より具体的には、５～７日又は７～１０日間行われてよい。
【0023】
本発明の一実施形態において、人工多能性幹細胞を１～１０日間培養した後のＳＳＥＡ－４（－）細胞の分離は、ＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）又はＭＡＣＳ（ｍａｇｎｅｔｉｃ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）方法が用いられてよく、好ましくは、ＦＡＣＳ方法が用いられてよいが、これに限定されず、当業界に知られた細胞の分離方法を制限なく用いることができる。
【0024】
本発明の他の実施形態において、前記細胞を培養する培地は、５～２０％、５～１５％、５～１０％、１０～１５％、又は１０～２０％のＦＢＳを含み、最も具体的には１０％のＦＢＳを含むが、これに限定されない。
本発明の他の実施形態において、前記細胞を培養する培地は、１～２０ｎｇ／ｍｌ、２～２０ｎｇ／ｍｌ、３～２０ｎｇ／ｍｌ、５～２０ｎｇ／ｍｌ、７～２０ｎｇ／ｍｌ、１０～２０ｎｇ／ｍｌ、１～１５ｎｇ／ｍｌ、２～１５ｎｇ／ｍｌ、３～１５ｎｇ／ｍｌ、５～１５ｎｇ／ｍｌ、７～１５ｎｇ／ｍｌ、１０～１５ｎｇ／ｍｌ、１～１０ｎｇ／ｍｌ、２～１０ｎｇ／ｍｌ、３～１０ｎｇ／ｍｌ、５～１０ｎｇ／ｍｌ、７～１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含み、最も具体的には１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含む。
本発明の他の実施形態において、前記細胞を培養する培地は、１～２０ｎｇ／ｍｌ、２～２０ｎｇ／ｍｌ、３～２０ｎｇ／ｍｌ、５～２０ｎｇ／ｍｌ、７～２０ｎｇ／ｍｌ、１０～２０ｎｇ／ｍｌ、１～１５ｎｇ／ｍｌ、２～１５ｎｇ／ｍｌ、３～１５ｎｇ／ｍｌ、５～１５ｎｇ／ｍｌ、７～１５ｎｇ／ｍｌ、１０～１５ｎｇ／ｍｌ、１～１０ｎｇ／ｍｌ、２～１０ｎｇ／ｍｌ、３～１０ｎｇ／ｍｌ、５～１０ｎｇ／ｍｌ、７～１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含み、最も具体的には１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含む。
【0025】
本発明のさらに他の実施形態において、本発明は、次の段階を含むエキソソームの製造方法を提供する：
請求項１から５のいずれか一項に記載の細胞集団を、細胞培養培地において培養する段階；及び
前記細胞培養培地からエキソソームを分離する段階。
請求項１から５のいずれか一項に記載の細胞集団を、細胞培養培地において培養する段階；及び
前記細胞培養培地からエキソソームを分離する段階。
【0026】
本発明の一実施形態において、前記細胞培養培地は、エキソソームの除去されたウシ胎児血清を含む。
本発明の特定の実施形態において、前記細胞培養培地にエキソソームを除去したＦＢＳを使用する理由は、一般的に使用されるＦＢＳにはウシ胎児血清由来のエキソソームが非常に多く含まれており、幹細胞が分泌するエキソソームの他に、ＦＢＳに由来するエキソソームが混入することを防止するためである。
本発明の特定の実施形態において、前記細胞培養培地にエキソソームを除去したＦＢＳを使用する理由は、一般的に使用されるＦＢＳにはウシ胎児血清由来のエキソソームが非常に多く含まれており、幹細胞が分泌するエキソソームの他に、ＦＢＳに由来するエキソソームが混入することを防止するためである。
【0027】
本明細書において、用語“エキソソーム（Ｅｘｏｓｏｍｅ）”は、エンドサイトーシス経路（ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ ｐａｔｈｗａｙ）の細胞小器官である多胞体（ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｂｏｄｙ）と、原形質膜（ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ）との融合により放出されるナノサイズの膜小胞体（ｖｅｓｉｃｌｅ）であり、エキソソームの大部分は真核生物の体液に存在する。
エキソソームの直径は３０～１５０ｎｍ程度であり、ＬＤＬよりは大きいが、赤血球よりは遥かに小さい。エキソソームは、多胞体（ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｂｏｄｉｅｓ）が細胞膜と融合されるときに細胞から放出されるか、或いは細胞膜から直接放出される。エキソソームが細胞性免疫の媒介や細胞間シグナル伝達等の重要ながらも特化した機能を有するということはよく知られている。
エキソソームのマーカータンパク質としては、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１などがよく知られている。
本発明の前記エキソソームは、３０～１５０ｎｍサイズに厳格に限定されるものではなく、前記サイズの範囲内に属する多胞体（ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｂｏｄｙ）、前記サイズ以上の脂質二重層で構成された微小胞（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ）、及びそれらの混合物を含む概念である。
エキソソームの直径は３０～１５０ｎｍ程度であり、ＬＤＬよりは大きいが、赤血球よりは遥かに小さい。エキソソームは、多胞体（ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｂｏｄｉｅｓ）が細胞膜と融合されるときに細胞から放出されるか、或いは細胞膜から直接放出される。エキソソームが細胞性免疫の媒介や細胞間シグナル伝達等の重要ながらも特化した機能を有するということはよく知られている。
エキソソームのマーカータンパク質としては、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１などがよく知られている。
本発明の前記エキソソームは、３０～１５０ｎｍサイズに厳格に限定されるものではなく、前記サイズの範囲内に属する多胞体（ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｂｏｄｙ）、前記サイズ以上の脂質二重層で構成された微小胞（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ）、及びそれらの混合物を含む概念である。
【0028】
本発明の一実施形態において、前記培養は、１２時間～１２０時間、２４時間～９６時間、４８時間～９６時間、又は６０時間～８４時間、最も具体的には７２時間培養されてよいが、これに限定されない。
【0029】
本発明の一実施形態において、前記間葉系幹細胞の前駆細胞は、エキソソームを分離する前に様々な物質で前処理されてよい。例えば、本発明の前記間葉系幹細胞の前駆細胞は、エキソソームを分離する前に、インターフェロンガンマ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｇａｍｍａ）、ピオグリタゾン（ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、メトホルミン（ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ）、ＡＩＣＡＲ（５－Ａｍｉｎｏｉｍｉｄａｚｏｌｅ－４－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、トロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎ）、レスベラトロール（ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）、Ｐ物質（ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ）、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、テトランドリン（ｔｅｔｒａｎｄｒｉｎｅ）、ＰＭＡ（Ｐｈｏｒｂｏｌ １２－ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３－ａｃｅｔａｔｅ）、エキセンジン－４（ｅｘｅｎｄｉｎｅ－４）、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎ）、インスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）、アスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂａｔｅ）、軟骨成長因子（ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＩＧＦ（Ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）、及びＴＧＦ－β１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ β１）などを含む群から選ばれる１種以上の物質で前処理されてよいが、これに限定されない。
【0030】
また、本発明の他の実施形態において、前記細胞培養培地からエキソソームを分離する段階は、前記培養された間葉系幹細胞の前駆細胞から細胞培養培地に分泌したエキソソームを分離する過程である。
本発明の一実施形態において、前記エキソソームの分離方法は、次の通りである。前記培養培地を２００～４００×ｇで５～２０分間遠心分離して、残っている細胞と細胞残余物を除去した後、上清を取り、９，０００～１２，０００×ｇで６０～８０分間高速遠心分離する。このとき、再び上清を取り、９０，０００～１２０，０００×ｇで８０～１００分間遠心分離し、上清を除去することにより、下層に残っているエキソソームを得ることができる。
本発明の特定の実施形態によれば、間葉系幹細胞培養培地を回収し、３００×ｇで１０分間遠心分離して、残っている細胞と細胞残余物を除去し、高速遠心分離機（ｈｉｇｈ ｓｐｅｅｄ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）を用いて１０，０００×ｇ、４℃で７０分間遠心分離する。遠心分離された上清を再び取り、超遠心分離機（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）を用いて１００，０００×ｇ、４℃で９０分間遠心分離して上清を除去することにより、下層に残っているエキソソームを分離する。
本発明の一実施形態において、前記エキソソームの分離方法は、次の通りである。前記培養培地を２００～４００×ｇで５～２０分間遠心分離して、残っている細胞と細胞残余物を除去した後、上清を取り、９，０００～１２，０００×ｇで６０～８０分間高速遠心分離する。このとき、再び上清を取り、９０，０００～１２０，０００×ｇで８０～１００分間遠心分離し、上清を除去することにより、下層に残っているエキソソームを得ることができる。
本発明の特定の実施形態によれば、間葉系幹細胞培養培地を回収し、３００×ｇで１０分間遠心分離して、残っている細胞と細胞残余物を除去し、高速遠心分離機（ｈｉｇｈ ｓｐｅｅｄ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）を用いて１０，０００×ｇ、４℃で７０分間遠心分離する。遠心分離された上清を再び取り、超遠心分離機（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）を用いて１００，０００×ｇ、４℃で９０分間遠心分離して上清を除去することにより、下層に残っているエキソソームを分離する。
【0031】
上述したエキソソームの製造方法は、上述した間葉系幹細胞の前駆細胞を培養してエキソソームを生産するという点で、上述した間葉系幹細胞の前駆細胞と共通する。本明細書において、上述したエキソソームの分離方法は、例示的なものであり、当業界で用いられるエキソソームの分離方法も制限がなく用いられてよい。
【0032】
本発明の製造方法によって製造されたエキソソームは、治療剤を含んでも含まなくてもよい。
本発明の一実施形態において、前記治療剤は、治療用タンパク質、抗体（例えば、全長抗体、モノクローナル抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、又はミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ））、抑制性ＲＮＡ、又は小分子薬物である。
本発明の一実施形態において、治療用タンパク質は、その喪失又は不活性化が疾患の治療に関連するタンパク質である。例えば、腫瘍抑制因子、キナーゼ、ホスファターゼ、又は転写因子である。
本発明の一実施形態において、前記治療剤は、治療用タンパク質、抗体（例えば、全長抗体、モノクローナル抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、又はミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ））、抑制性ＲＮＡ、又は小分子薬物である。
本発明の一実施形態において、治療用タンパク質は、その喪失又は不活性化が疾患の治療に関連するタンパク質である。例えば、腫瘍抑制因子、キナーゼ、ホスファターゼ、又は転写因子である。
【0033】
本発明の一実施形態において、抗体は、細胞内抗原に結合する。そのような細胞内抗原は、細胞増殖及び／又は生存のために活性が必要とされる癌遺伝子などのタンパク質であってよい。場合によっては、抗体が抗原の機能を遮断する。場合によって、抗体はタンパク質間相互作用を妨げる。
【0034】
本発明の一実施形態において、抑制性ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はｐｒｅ－ｍｉＲＮＡである。様々な実施形態において、抑制性ＲＮＡは、特定の疾患状態を維持するために活性が必要なタンパク質、例えば、腫瘍遺伝子の発現を遮断する。癌遺伝子が遺伝子の変異型である場合、抑制性ＲＮＡは、野生型タンパク質ではなく、変異した癌遺伝子の発現を優先的に遮断する。
【0035】
本発明の一実施形態において、前記小分子薬物は造影剤である。本発明の他の実施形態において、前記小分子薬物は化学治療剤である。
本発明の一実施形態において、本組成物は、経口投与のために剤形化されるか、又は非経口投与、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、又は腹腔内注射のために剤形化される。
本発明の一実施形態において、前記治療剤は、抗菌剤を含む。抗菌剤は、ベンザルコニウム塩化物、ベンゼトニウム塩化物、ベンジルアルコール、ブロノポール、セントリミド、セチルピリジニウム塩化物、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、エキセチジン、イミド尿素、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、フェニル水銀硝酸塩、プロピレングリコール、又はチメロサールであってよいが、これに限定されない。
本発明の一実施形態において、本組成物は、経口投与のために剤形化されるか、又は非経口投与、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、又は腹腔内注射のために剤形化される。
本発明の一実施形態において、前記治療剤は、抗菌剤を含む。抗菌剤は、ベンザルコニウム塩化物、ベンゼトニウム塩化物、ベンジルアルコール、ブロノポール、セントリミド、セチルピリジニウム塩化物、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、エキセチジン、イミド尿素、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、フェニル水銀硝酸塩、プロピレングリコール、又はチメロサールであってよいが、これに限定されない。
【0036】
本発明の他の実施形態によれば、本発明は、人工多能性幹細胞に由来する間葉系幹細胞の前駆細胞を提供する。本発明の一実施形態において、前記人工多能性幹細胞は、ヒトの臍帯に由来する。本発明の他の実施形態において、前記前駆細胞は、受託番号ＫＣＴＣ１４０１９ＢＰとして寄託されたものである。
【発明の効果】
【0037】
本発明は、人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞及びその製造方法を提供する。本発明の人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞は、一般の間葉系幹細胞、又は人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞に比べて機能性が増強し、増殖能に優れる。
【図面の簡単な説明】
【0038】
【図1C】図１Ｃは、人工多能性幹細胞を７日間培養し、ＳＳＥＡ－４（－）に該当する細胞を分離した後、７日間培養した後の細胞（ＢｘＣ）の表面発現マーカーＳＳＥＡ－４の発現比率及び顕微鏡写真を示す図である。
【図2】図２は、人工多能性幹細胞の培養０日目（ｉＰＳＣ）、培養７日目（ｐｒｅ－ＢｘＣ）、ＳＳＥＡ－４（－）分離後培養７日目（ＢｘＣ）、及び間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の細胞表面マーカーの種類を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0039】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのもので、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれら実施例に制限されないということは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
【実施例】
【0040】
本明細書の全体を通じて、特定物質の濃度を示すために用いられる“％”は、特に言及がない限り、固体／固体は（重量／重量）％、固体／液体は（重量／体積）％、そして液体／液体は（体積／体積）％である。
【0041】
実施例１：人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来間葉系幹細胞の前駆細胞（ＢｘＣ）の分離及び培養
まず、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を、１０％のＦＢＳ及び１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを添加したＤＭＥＭで７日間培養した。次に、培養された人工多能性幹細胞から、ＦＡＣＳを用いて、細胞表面にＳＳＥＡ－４（ｓｔａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ４）タンパク質を発現していないＳＳＥＡ－４（－）細胞を分離した。また、分離されたＳＳＥＡ－４（－）細胞を継代し、前記と同じ培地で７日間さらに培養し、本発明の人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞を調製した。本発明者らは、前記人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞をＢｘＣ（ｂｒｅｘｏｇｅｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）と命名し、“韓国生命工学研究院微生物資源センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ，ＫＣＴＣ）”に受託番号“ＫＣＴＣ１４０１９ＢＰ”として寄託した。
ＢｘＣと命名された人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞を培養培地［高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ ｎｏ．１１９９５－０６５）、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１％ ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１００Ｘ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ ｎｏ．１１１４０－０５０）］でさらに培養した。
上記の０日目人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）（Ｄ０）、７日培養後の人工多能性幹細胞（Ｐｒｅ－ＢｘＣ）（Ｄ７）、及び本発明の人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞（ＢｘＣ）の各細胞別細胞表面マーカーＳＳＥＡ－４の比率は、下表１及び図１Ａ～図１Ｃ、図２に示した。
最初の人工多能性幹細胞集団の９６．６％は、細胞表面にＳＳＥＡ－４タンパク質を発現させたが（図１Ａ）、７日間培養した後には、ＳＳＥＡ－４タンパク質を発現させるＳＳＥＡ－４（＋）細胞集団が全細胞の３５．８％と減少した（図１Ｂ）。全細胞の残りの６４．２％を占めるＳＳＥＡ－４（－）細胞を分離し、継代して７日間培養した（ＢｘＣ細胞）。その結果、ＳＳＥＡ－４タンパク質発現細胞が全細胞集団の３％以下であることを確認した（図１Ｃ）。
したがって、本発明の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞（ＢｘＣ）の細胞集団では、ＳＳＥＡ－４タンパク質の発現率が５％以下であることがわかる。
まず、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を、１０％のＦＢＳ及び１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを添加したＤＭＥＭで７日間培養した。次に、培養された人工多能性幹細胞から、ＦＡＣＳを用いて、細胞表面にＳＳＥＡ－４（ｓｔａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ４）タンパク質を発現していないＳＳＥＡ－４（－）細胞を分離した。また、分離されたＳＳＥＡ－４（－）細胞を継代し、前記と同じ培地で７日間さらに培養し、本発明の人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞を調製した。本発明者らは、前記人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞をＢｘＣ（ｂｒｅｘｏｇｅｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）と命名し、“韓国生命工学研究院微生物資源センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ，ＫＣＴＣ）”に受託番号“ＫＣＴＣ１４０１９ＢＰ”として寄託した。
ＢｘＣと命名された人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞を培養培地［高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ ｎｏ．１１９９５－０６５）、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１％ ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１００Ｘ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ ｎｏ．１１１４０－０５０）］でさらに培養した。
上記の０日目人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）（Ｄ０）、７日培養後の人工多能性幹細胞（Ｐｒｅ－ＢｘＣ）（Ｄ７）、及び本発明の人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞（ＢｘＣ）の各細胞別細胞表面マーカーＳＳＥＡ－４の比率は、下表１及び図１Ａ～図１Ｃ、図２に示した。
最初の人工多能性幹細胞集団の９６．６％は、細胞表面にＳＳＥＡ－４タンパク質を発現させたが（図１Ａ）、７日間培養した後には、ＳＳＥＡ－４タンパク質を発現させるＳＳＥＡ－４（＋）細胞集団が全細胞の３５．８％と減少した（図１Ｂ）。全細胞の残りの６４．２％を占めるＳＳＥＡ－４（－）細胞を分離し、継代して７日間培養した（ＢｘＣ細胞）。その結果、ＳＳＥＡ－４タンパク質発現細胞が全細胞集団の３％以下であることを確認した（図１Ｃ）。
したがって、本発明の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞（ＢｘＣ）の細胞集団では、ＳＳＥＡ－４タンパク質の発現率が５％以下であることがわかる。
【0042】
実施例２：人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞（ＢｘＣ）の細胞表面マーカー発現
０日目人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）（Ｄ０）、７日培養後の人工多能性幹細胞由来分化細胞（Ｐｒｅ－ＢｘＣ）（Ｄ７）、人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞（ＢｘＣ）、及び間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の各細胞別の細胞表面マーカー（ＳＳＥＡ－４、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５）を次のように分析した。
各段階の細胞をＴｒｙｐＬＥＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｇｉｂｃｏ，１２６０４－０２１）で処理して単細胞懸濁液とし、ＰＢＳで洗浄した。単細胞懸濁液を、ＳＳＥＡ－４（ＢＤ５６０１２８）、ＣＤ７３（ＢＤ５５０２５７）、ＣＤ９０（ＢＤ５５５５９５０）、ＣＤ１０５（ＢＤ５６０８３９）、ＣＤ４５（ＢＤ５５５４８３）、及びＣＤ３４（ＢＤ３４８０５３）に特異的に結合する抗体の波長になるようにチューブに分けて入れ、遠心分離した。細胞ペレットをＦＡＣＳ用のバッファー１００μＬに再懸濁させ、６μＬの抗体を波長が重ならないように２個ずつ共に入れ、暗（ｄａｒｋ）状態にて、室温で３０分間静置した後、ＰＢＳで洗浄した後、３００μＬ ＦＡＣＳバッファーに懸濁させ、ＦＡＣＳ装置で分析した。
幹細胞の細胞表面マーカー（ＳＳＥＡ－４、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５）別発現比率は、下記表１及び図２に示した。
以上の結果から、本発明の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞（ＢｘＣ）の細胞集団には、ＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１０５タンパク質の発現率が９０％以上であることが分かった。
０日目人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）（Ｄ０）、７日培養後の人工多能性幹細胞由来分化細胞（Ｐｒｅ－ＢｘＣ）（Ｄ７）、人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞の前駆細胞（ＢｘＣ）、及び間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の各細胞別の細胞表面マーカー（ＳＳＥＡ－４、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５）を次のように分析した。
各段階の細胞をＴｒｙｐＬＥＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｇｉｂｃｏ，１２６０４－０２１）で処理して単細胞懸濁液とし、ＰＢＳで洗浄した。単細胞懸濁液を、ＳＳＥＡ－４（ＢＤ５６０１２８）、ＣＤ７３（ＢＤ５５０２５７）、ＣＤ９０（ＢＤ５５５５９５０）、ＣＤ１０５（ＢＤ５６０８３９）、ＣＤ４５（ＢＤ５５５４８３）、及びＣＤ３４（ＢＤ３４８０５３）に特異的に結合する抗体の波長になるようにチューブに分けて入れ、遠心分離した。細胞ペレットをＦＡＣＳ用のバッファー１００μＬに再懸濁させ、６μＬの抗体を波長が重ならないように２個ずつ共に入れ、暗（ｄａｒｋ）状態にて、室温で３０分間静置した後、ＰＢＳで洗浄した後、３００μＬ ＦＡＣＳバッファーに懸濁させ、ＦＡＣＳ装置で分析した。
幹細胞の細胞表面マーカー（ＳＳＥＡ－４、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５）別発現比率は、下記表１及び図２に示した。
以上の結果から、本発明の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞（ＢｘＣ）の細胞集団には、ＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１０５タンパク質の発現率が９０％以上であることが分かった。
【0043】
【表1】
【0044】
実施例３：人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞（ＢｘＣ）の染色体分析
本発明の人工多能性幹細胞由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞（ＢｘＣ）と人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の染色体異常の有無を確認するために、それぞれ６回ずつ継代したＢｘＣとＭＳＣの核型を分析した。
図３に示すように、本発明のＢｘＣとＭＳＣは、染色体数及び構造に異常がないことを確認した。
本発明の人工多能性幹細胞由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞（ＢｘＣ）と人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の染色体異常の有無を確認するために、それぞれ６回ずつ継代したＢｘＣとＭＳＣの核型を分析した。
図３に示すように、本発明のＢｘＣとＭＳＣは、染色体数及び構造に異常がないことを確認した。
【0045】
実施例４：人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞（ＢｘＣ）増殖能特性の比較
本発明の人工多能性幹細胞由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞（ＢｘＣ）と人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の増殖能を比較するために次のように実験した。
同一継代数（Ｐ４）の人工多能性幹細胞由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞（ＢｘＣ）と同種組織（臍帯）由来の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）とを、６ウェル培養プレートのウェルにつき１×１０５細胞ずつシード（ｓｅｅｄｉｎｇ）した後、３．５日（１週に２回）ごとに培養培地を除去し、ＰＢＳで洗浄後にＴｒｙｐＬＥＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓを処理して細胞を剥がした。３００×ｇ、５分間遠心分離後に１ｍＬの培養培地に再懸濁させた後、細胞数を測定した。細胞数を測定した細胞は、再びウェルにつき１×１０５細胞ずつシード後に、３．５日間隔で培養を反復しながら継代別細胞数増加量を確認した。
また、各細胞の細胞増殖指標であるＫｉ６７の発現比率を確認するために、次のように実験した。
同一継代数（Ｐ４）の人工多能性幹細胞由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞（ＢｘＣ）と同種組織（臍帯）由来の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）とを、ＴｒｙｐＬＥＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｇｉｂｃｏ，１２６０４－０２１）を処理して単細胞懸濁液とし、ＰＢＳで洗浄した。洗浄後に細胞を冷たい８０％エタノール（ｅｔｈａｎｏｌ）に入れて－２０℃で２時間以上固定し、ＰＢＳで３回洗浄した。ＰＥマウス抗－Ｋｉ－６７キット（ＢＤ５５６０２７）に含まれているバッファー１００μＬにつき２０μＬのＫｉ－６７特異的抗体を新しいチューブに移して、室温で３０分静置後にＰＢＳで洗浄し、インジケーター付き二次抗体と反応させた後、暗（ｄａｒｋ）状態にて、室温で３０分間静置後にＦＡＣＳ装置で分析した。
図４Ａに示すように、本発明の人工多能性幹細胞由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞（ＢｘＣ）は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）と比較して、第９継代目からは１０倍以上の増殖能の差を示した。また、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、第１２継代目からは増殖能が減少したが、本発明の人工多能性幹細胞由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞（ＢｘＣ）は、１２継代以上継代しても増殖能が減少しなかった。
また、図４Ｂに示すように、本発明の人工多能性幹細胞由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞（ＢｘＣ）は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）と比較して、細胞増殖指標のＫｉ６７の発現量が２倍以上高く示された。
したがって、本発明の人工多能性幹細胞由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞（ＢｘＣ）は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に比べて増殖能の面で非常に優れた効果があることが分かった。
本発明の人工多能性幹細胞由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞（ＢｘＣ）と人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の増殖能を比較するために次のように実験した。
同一継代数（Ｐ４）の人工多能性幹細胞由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞（ＢｘＣ）と同種組織（臍帯）由来の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）とを、６ウェル培養プレートのウェルにつき１×１０５細胞ずつシード（ｓｅｅｄｉｎｇ）した後、３．５日（１週に２回）ごとに培養培地を除去し、ＰＢＳで洗浄後にＴｒｙｐＬＥＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓを処理して細胞を剥がした。３００×ｇ、５分間遠心分離後に１ｍＬの培養培地に再懸濁させた後、細胞数を測定した。細胞数を測定した細胞は、再びウェルにつき１×１０５細胞ずつシード後に、３．５日間隔で培養を反復しながら継代別細胞数増加量を確認した。
また、各細胞の細胞増殖指標であるＫｉ６７の発現比率を確認するために、次のように実験した。
同一継代数（Ｐ４）の人工多能性幹細胞由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞（ＢｘＣ）と同種組織（臍帯）由来の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）とを、ＴｒｙｐＬＥＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｇｉｂｃｏ，１２６０４－０２１）を処理して単細胞懸濁液とし、ＰＢＳで洗浄した。洗浄後に細胞を冷たい８０％エタノール（ｅｔｈａｎｏｌ）に入れて－２０℃で２時間以上固定し、ＰＢＳで３回洗浄した。ＰＥマウス抗－Ｋｉ－６７キット（ＢＤ５５６０２７）に含まれているバッファー１００μＬにつき２０μＬのＫｉ－６７特異的抗体を新しいチューブに移して、室温で３０分静置後にＰＢＳで洗浄し、インジケーター付き二次抗体と反応させた後、暗（ｄａｒｋ）状態にて、室温で３０分間静置後にＦＡＣＳ装置で分析した。
図４Ａに示すように、本発明の人工多能性幹細胞由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞（ＢｘＣ）は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）と比較して、第９継代目からは１０倍以上の増殖能の差を示した。また、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、第１２継代目からは増殖能が減少したが、本発明の人工多能性幹細胞由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞（ＢｘＣ）は、１２継代以上継代しても増殖能が減少しなかった。
また、図４Ｂに示すように、本発明の人工多能性幹細胞由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞（ＢｘＣ）は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）と比較して、細胞増殖指標のＫｉ６７の発現量が２倍以上高く示された。
したがって、本発明の人工多能性幹細胞由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞（ＢｘＣ）は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に比べて増殖能の面で非常に優れた効果があることが分かった。
【0046】
実施例５：人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞（ＢｘＣ）のタンパク質分泌能の比較
本発明の人工多能性幹細胞由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞（ＢｘＣ）と人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）との間の機能関連タンパク質の分泌能を比較するために、次のような実験を行った。
同一継代数の人工多能性幹細胞由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞（ＢｘＣ）と間葉系幹細胞（ＭＳＣ）とを、６ウェル培養プレートのウェルにつき１×１０５細胞ずつシードし、２４時間後に上清を除去した。ＤＰＢＳで洗浄した後、無血清培地（ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ ｍｅｄｉａ）を１ｍＬずつ入れ、４８時間後に培地を除去した。３００×ｇ、５分間遠心分離し、死細胞又は破片を沈め、上清のみを取って－８０℃で保管した。Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社のＬｕｍｉｎｅｘ Ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ａｓｓａｙの受託サービス（ｃｕｓｔｏｍ ｓｅｒｖｉｃｅ）を用いてアレイキットを製作し、Ｌｕｍｉｎｅｘ解析（ａｓｓａｙ）を行った。
本発明の人工多能性幹細胞由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞（ＢｘＣ）と人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）との間の機能関連タンパク質の分泌能を比較するために、次のような実験を行った。
同一継代数の人工多能性幹細胞由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞（ＢｘＣ）と間葉系幹細胞（ＭＳＣ）とを、６ウェル培養プレートのウェルにつき１×１０５細胞ずつシードし、２４時間後に上清を除去した。ＤＰＢＳで洗浄した後、無血清培地（ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ ｍｅｄｉａ）を１ｍＬずつ入れ、４８時間後に培地を除去した。３００×ｇ、５分間遠心分離し、死細胞又は破片を沈め、上清のみを取って－８０℃で保管した。Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社のＬｕｍｉｎｅｘ Ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ａｓｓａｙの受託サービス（ｃｕｓｔｏｍ ｓｅｒｖｉｃｅ）を用いてアレイキットを製作し、Ｌｕｍｉｎｅｘ解析（ａｓｓａｙ）を行った。
【0047】
【表2】
【0048】
図５Ａ～図５Ｄに示すように、本発明の人工多能性幹細胞由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞（ＢｘＣ）は、人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）と比較して、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の機能関連タンパク質を相対的に多量分泌した。したがって、本発明の人工多能性幹細胞由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞（ＢｘＣ）は、機能性の面において間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に比べて増強されていることが分かった。
【0049】
実施例６．人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞（ＢｘＣ）の幹細胞性（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）の調査
本発明の人工多能性幹細胞由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞（ＢｘＣ）と間葉系幹細胞（ＭＳＣ）との幹細胞性（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）を比較するために、次のような実験を行った。
１０ｍＬ培養培地［高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ ｎｏ．１１９９５－０６５）、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１％ ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１００Ｘ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ ｎｏ．１１１４０－０５０）］が含まれた１００ｍｍ細胞培養皿（ｄｉｓｈ）に、間葉系幹細胞及び人工多能性幹細胞由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞（ＢｘＣ）をそれぞれ皿につき１０００細胞ずつ播種し、２１日間培養した。培養された細胞が付着した皿をＰＢＳで２回洗浄し、常温で約２分間、９５％メタノールで固定した。固定された細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、０．５％クリスタルバイオレット溶液［クリスタルバイオレット（ｓｉｇｍａ，Ｃ－３８８６，ＵＳＡ）５ｇ、メタノール１００ｍｌ］を添加した後、５分間染色し、水で洗浄後に室温で乾燥させた。各皿において５０個以上の細胞で構成されたコロニーの数を計数して比較した。
図６Ａ及び図６Ｂに示すように、本発明の人工多能性幹細胞由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞（ＢｘＣ）に比べて、人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、コロニー形成単位－線維芽細胞（ＣＦＵ－Ｆ）の個数が約３倍高かった。したがって、本発明の人工多能性幹細胞由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞（ＢｘＣ）は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に比べて幹細胞性（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）に優れていることを確認した。
本発明の人工多能性幹細胞由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞（ＢｘＣ）と間葉系幹細胞（ＭＳＣ）との幹細胞性（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）を比較するために、次のような実験を行った。
１０ｍＬ培養培地［高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ ｎｏ．１１９９５－０６５）、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１％ ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１００Ｘ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ ｎｏ．１１１４０－０５０）］が含まれた１００ｍｍ細胞培養皿（ｄｉｓｈ）に、間葉系幹細胞及び人工多能性幹細胞由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞（ＢｘＣ）をそれぞれ皿につき１０００細胞ずつ播種し、２１日間培養した。培養された細胞が付着した皿をＰＢＳで２回洗浄し、常温で約２分間、９５％メタノールで固定した。固定された細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、０．５％クリスタルバイオレット溶液［クリスタルバイオレット（ｓｉｇｍａ，Ｃ－３８８６，ＵＳＡ）５ｇ、メタノール１００ｍｌ］を添加した後、５分間染色し、水で洗浄後に室温で乾燥させた。各皿において５０個以上の細胞で構成されたコロニーの数を計数して比較した。
図６Ａ及び図６Ｂに示すように、本発明の人工多能性幹細胞由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞（ＢｘＣ）に比べて、人工多能性幹細胞由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、コロニー形成単位－線維芽細胞（ＣＦＵ－Ｆ）の個数が約３倍高かった。したがって、本発明の人工多能性幹細胞由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞（ＢｘＣ）は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に比べて幹細胞性（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）に優れていることを確認した。
【0050】
実施例７．人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞（ＢｘＣ）の特徴的な遺伝子発現パターンに関する調査
本発明の人工多能性幹細胞由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞（ＢｘＣ）と間葉系幹細胞（ＭＳＣ）との遺伝子発現パターンの差異を確認するために、各細胞集団からｍＲＮＡを抽出し、ＲＮＡ－ｓｅｑ分析法で細胞別に遺伝子の発現量を比較した。
遺伝子発現量の差を有する遺伝子の種類及び発現量差（ＢｘＣの遺伝子発現量／ＭＳＣの遺伝子発現量）を、下記表２及び図７Ａ～図７Ｃに示した。
図７Ａ～図７Ｃに示すように、本発明の人工多能性幹細胞由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞（ＢｘＣ）は、同等な数の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に比べて、ＡＮＫＲＤ１、ＣＰＥ、ＮＫＡＩＮ４、ＬＣＰ１、ＣＣＤＣ３、ＭＡＭＤＣ２、ＣＬＳＴＮ２、ＳＦＴＡ１Ｐ、ＥＰＢ４１Ｌ３、ＰＤＥ１Ｃ、ＥＭＩＬＩＮ２、ＳＵＬＴ１Ｃ４、ＴＲＩＭ５８、ＤＥＮＮＤ２Ａ、ＣＡＤＭ４、ＡＩＦ１Ｌ、ＮＴＭ、ＳＨＩＳＡ２、ＲＡＳＳＦ４、及びＡＣＫＲ３の遺伝子発現量が少なくとも１０倍、多くとも５５倍程度高く示された。
これに対し、ＤＨＲＳ３、ＢＭＰＥＲ、ＩＦＩ６、ＰＲＳＳ１２、ＲＤＨ１０、及びＫＣＮＥ４の遺伝子は、本発明の人工多能性幹細胞由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞（ＢｘＣ）において少なくても１０倍から多くても２０倍も、より少なく発現した。
本発明の人工多能性幹細胞由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞（ＢｘＣ）と間葉系幹細胞（ＭＳＣ）との遺伝子発現パターンの差異を確認するために、各細胞集団からｍＲＮＡを抽出し、ＲＮＡ－ｓｅｑ分析法で細胞別に遺伝子の発現量を比較した。
遺伝子発現量の差を有する遺伝子の種類及び発現量差（ＢｘＣの遺伝子発現量／ＭＳＣの遺伝子発現量）を、下記表２及び図７Ａ～図７Ｃに示した。
図７Ａ～図７Ｃに示すように、本発明の人工多能性幹細胞由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞（ＢｘＣ）は、同等な数の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に比べて、ＡＮＫＲＤ１、ＣＰＥ、ＮＫＡＩＮ４、ＬＣＰ１、ＣＣＤＣ３、ＭＡＭＤＣ２、ＣＬＳＴＮ２、ＳＦＴＡ１Ｐ、ＥＰＢ４１Ｌ３、ＰＤＥ１Ｃ、ＥＭＩＬＩＮ２、ＳＵＬＴ１Ｃ４、ＴＲＩＭ５８、ＤＥＮＮＤ２Ａ、ＣＡＤＭ４、ＡＩＦ１Ｌ、ＮＴＭ、ＳＨＩＳＡ２、ＲＡＳＳＦ４、及びＡＣＫＲ３の遺伝子発現量が少なくとも１０倍、多くとも５５倍程度高く示された。
これに対し、ＤＨＲＳ３、ＢＭＰＥＲ、ＩＦＩ６、ＰＲＳＳ１２、ＲＤＨ１０、及びＫＣＮＥ４の遺伝子は、本発明の人工多能性幹細胞由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞（ＢｘＣ）において少なくても１０倍から多くても２０倍も、より少なく発現した。
【0051】
【表3】
【0052】
実施例８．人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞（ＢｘＣ）に由来するエキソソームの分離及び確認
前記実施例１で製造した人工多能性幹細胞由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞（ＢｘＣ）を、エキソソームの除去されたＦＢＳ（Ｅｘｏｓｏｍｅ－ｄｅｐｌｅｔｅｄ ＦＢＳ）を１０％添加した培養培地でさらに培養した。７２時間培養した後、ＢｘＣ細胞培養培地を回収して３００×ｇで１０分間遠心分離し、残っている細胞と細胞片を除去した。高速遠心分離機（ｈｉｇｈ ｓｐｅｅｄ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）を用いて１００００×ｇ、４℃で７０分間遠心分離を行った。遠心分離された上清を、超高速遠心分離機（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）を用いて１００，０００ｘｇ、４℃で９０分間遠心分離して上清を除去し、下層に残っているエキソソームをＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｄ ｓａｌｉｎｅ）で希釈して使用した。分離されたエキソソームを、それぞれナノ粒子トラッキングアッセイ（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｔｒａｃｋｉｎｇ ａｓｓａｙ）（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＮＳ３００，Ｍａｌｖｅｒｎ）を用いてエキソソームの数及びサイズ分布を確認した（図８Ａ）。ウェスタンブロットでエキソソーム特異的な表面抗原であるＴＳＧ１０１及びＣＤ６３の発現を確認した（図８Ｂ）。
前記実施例１で製造した人工多能性幹細胞由来の機能的に増強された間葉系前駆細胞（ＢｘＣ）を、エキソソームの除去されたＦＢＳ（Ｅｘｏｓｏｍｅ－ｄｅｐｌｅｔｅｄ ＦＢＳ）を１０％添加した培養培地でさらに培養した。７２時間培養した後、ＢｘＣ細胞培養培地を回収して３００×ｇで１０分間遠心分離し、残っている細胞と細胞片を除去した。高速遠心分離機（ｈｉｇｈ ｓｐｅｅｄ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）を用いて１００００×ｇ、４℃で７０分間遠心分離を行った。遠心分離された上清を、超高速遠心分離機（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）を用いて１００，０００ｘｇ、４℃で９０分間遠心分離して上清を除去し、下層に残っているエキソソームをＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｄ ｓａｌｉｎｅ）で希釈して使用した。分離されたエキソソームを、それぞれナノ粒子トラッキングアッセイ（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｔｒａｃｋｉｎｇ ａｓｓａｙ）（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＮＳ３００，Ｍａｌｖｅｒｎ）を用いてエキソソームの数及びサイズ分布を確認した（図８Ａ）。ウェスタンブロットでエキソソーム特異的な表面抗原であるＴＳＧ１０１及びＣＤ６３の発現を確認した（図８Ｂ）。
【0053】
［寄託機関名］微生物資源センター（ＫＣＴＣ）
［受託番号］ＫＣＴＣ１４０１９ＢＰ
［受託日］２０１９年１１月１３日
［受託番号］ＫＣＴＣ１４０１９ＢＰ
［受託日］２０１９年１１月１３日
【0054】
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8A】
【図8B】
