(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-11-27
(45)【発行日】2023-12-05
(54)【発明の名称】アツバノリ属抽出物及びその使用
(51)【国際特許分類】
A61K 8/9717 20170101AFI20231128BHJP
A61K 36/04 20060101ALI20231128BHJP
A61Q 19/02 20060101ALI20231128BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231128BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20231128BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20231128BHJP
A23L 33/10 20160101ALI20231128BHJP
【ＦＩ】
A61K8/9717
A61K36/04
A61Q19/02
A61P43/00 111
A61P17/00
A61P37/08
A23L33/10
【請求項の数】
11
(21)【出願番号】P 2021203731
(22)【出願日】2021-12-15
(65)【公開番号】P2023020828
(43)【公開日】2023-02-09
【審査請求日】2022-01-14
(31)【優先権主張番号】110127731
(32)【優先日】2021-07-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】TW
(73)【特許権者】
【識別番号】505171997
【氏名又は名称】國立中山大學
(74)【代理人】
【識別番号】100091683
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼川 俊雄
(74)【代理人】
【識別番号】100179316
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 寛奈
(72)【発明者】
【氏名】温志宏
(72)【発明者】
【氏名】張誌益
(72)【発明者】
【氏名】陳佩津
【審査官】▲高▼ 美葉子
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１３－０３５８０７（ＪＰ，Ａ）
【文献】Chieh-Chih Shih,et al.,Anti-Inflammatory and Antinociceptive Effects of Ethyl Acetate Fraction of an Edible Red Macroalgae Sarcodia ceylanica,International Journal Molecular Sciences(2017),Vol.18
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ８／００－８／９９
Ａ６１Ｑ１／００－９０／００
Ａ６１Ｋ３６／０２
ＣＡｐｌｕｓ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＫＯＳＭＥＴ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤＲｅａｍＩＩＩ）
Ｍｉｎｔｅｌ ＧＮＰＤ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
アツバノリ属抽出物の製造方法であって、（ａ）アルコール系溶媒でアツバノリ属を抽出して、アツバノリ属アルコール系抽出物を取得し、前記アルコール系溶媒はメタノール又はエタノールであり、
（ｂ）有機溶液又は超臨界抽出により前記アツバノリ属アルコール系抽出物を分配抽出することで有機溶媒層と水性層を形成したあと、前記水性層を採取し、前記有機溶液は、有機溶媒又は水と有機溶媒の混合液であり、前記有機溶媒は、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、メチルエーテル、エチルエーテル、ジクロロメタン、クロロホルム又は四塩化炭素であり、
（ｃ）ステップ（ｂ）で取得した水性層を１－ブタノールで分配抽出することで１－ブタノール層と水性層を形成し、続いて、前記水性層を採取することで前記アツバノリ属抽出物を取得する、とのステップを含む製造方法。
【請求項2】
前記アルコール系溶媒はエタノールである請求項１に記載の製造方法。
【請求項3】
前記有機溶媒は酢酸エチルである請求項１に記載の製造方法。
【請求項4】
請求項１に記載の製造方法によって得られるアツバノリ属抽出物の使用であって、前記アツバノリ属抽出物は皮膚美白のための組成物の製造に用いられる使用。
【請求項5】
前記アツバノリ属抽出物は、メラニン生成を抑制するか、メラニンを減少させる請求項４に記載の使用。
【請求項6】
前記組成物には、化粧品組成物、食品又は薬物が含まれる請求項４に記載の使用。
【請求項7】
請求項１に記載の製造方法によって得られるアツバノリ属抽出物の使用であって、前記アツバノリ属抽出物は抗炎症のための薬物の製造に用いられる使用。
【請求項8】
前記抗炎症には炎症性因子の抑制が含まれる請求項７に記載の使用。
【請求項9】
前記炎症性因子には、シクロオキシゲナーゼ－２（ＣＯＸ－２）及び誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）が含まれる請求項８に記載の使用。
【請求項10】
請求項１に記載の製造方法によって得られるアツバノリ属抽出物の使用であって、前記アツバノリ属抽出物は抗炎症のための薬物の製造に用いられる使用であって、
前記薬物は、抗炎症によりアレルギー性皮膚炎を治療する請求項７に記載の使用。
【請求項11】
請求項１に記載の製造方法によって得られるアツバノリ属抽出物の使用であって、前記アツバノリ属抽出物は抗炎症のための薬物の製造に用いられる使用であって、
前記薬物は、抗炎症によりアレルギー性皮膚炎を治療する請求項７に記載の使用であって、
前記アレルギー性皮膚炎にはアトピー性皮膚炎が含まれる請求項１０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アツバノリ属抽出物の新規な使用に関し、特に、抗炎症及び皮膚美白のための組成物の製造における前記アツバノリ属抽出物の使用に関する。
【背景技術】
【0002】
アツバノリ属（Ｓａｒｃｏｄｉａ）は、主としてインド洋及び西太平洋地域に分布している。アツバノリ属は、従属栄養型（ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈ）の海洋大型藻類であり、微量栄養素の含有量が高い。そのため、日本では長寿食材とも呼ばれており、欧米ではアツバノリ属が海の野菜の代表格とみなされている。現在、アツバノリ属の用途の多くは、そのまま食用とするか、食品添加物とされている。食用としてのアツバノリ属の歴史は長いが、その効果に関する研究は極めて少ない。
【0003】
昨今の美容医療の飛躍的な発展に伴って、スキンケア用品市場が急成長している。消費者にスキンケア用品を購入させる要素には、新規性、持続性及び有効性がある。薬用化粧品は、医師と、化学工業をバックグラウンドとする化粧品科学者とを媒介するものである。薬用化粧品は、インビトロ又はインビボ実験による検証を経ることで、特定の用途的価値を更に備えているか、従来の化粧品よりも優れた効果を有している。ここ数年、薬用化粧品（ｃｏｓｍｅｃｅｕｔｉｃａｌｓ）とのワードは広告・宣伝に数多く登場するようになっており、一般化粧品（ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ）と薬品（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）の間に介在している。一般化粧品と比較して、薬用化粧品は含有される生物活性成分がより明確な作用機序及び活性を有しており、薬物と類似したメリットを提供する。
【0004】
そのため、スキンケア用品の産業上の利用可能性は高く、とりわけ、現代人のスキンケア用品に対するニーズは高い。これに対し、現在のところ、皮膚に対するアツバノリ属活性抽出物の応用は存在しない。従って、アツバノリ属には数多くの研究開発の余地がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明では、アツバノリ属を乾燥させたあと、アルコールで抽出することでアルコール抽出物を取得する。次に、前記アルコール抽出物を水中に浸漬し、浮遊させてから水性抽出物を取得する。そして、酢酸エチルを用いて前記水性抽出物を分配抽出することで、酢酸エチル層と水性層を形成したあと、前記水性層を採取する。且つ、取得した前記水性層を１－ブタノールで分配抽出することで１－ブタノール層と水性層を形成する。続いて、前記水性層を採取することで、アツバノリ属抽出物ＥＨを取得する。
【0006】
美白実験において、前記アツバノリ属抽出物ＥＨは、細胞及びゼブラフィッシュ体内におけるメラニンの発現量を低下させることができた。この結果より、前記アツバノリ属抽出物ＥＨが、メラニンの発現を抑制することで美白効果を達成可能なことが示された。
【0007】
抗炎症実験において、前記アツバノリ属抽出物ＥＨは、炎症性因子であるシクロオキシゲナーゼ－２（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ－２，ＣＯＸ－２）及び誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ，ｉＮＯＳ）の発現を抑制可能であった。この結果より、前記アツバノリ属抽出物ＥＨが、炎症性因子の発現を抑制することで抗炎症を達成可能なことが示された。
【0008】
アトピー性皮膚炎実験において、前記アツバノリ属抽出物ＥＨは、マウスのアトピー性皮膚炎の症状（例えば、紅斑、浮腫、表皮剥離及び乾燥等の症状）を改善可能であった。且つ、前記アツバノリ属抽出物ＥＨは、アトピー性皮膚炎に起因して上昇したＩｇＥ発現量を低下させることが可能であった。このほか、アトピー性皮膚炎は、脾臓及びリンパ節を腫大させるが、前記アツバノリ属抽出物ＥＨを投与することで、脾臓及びリンパ節の腫大を改善可能であった。この結果より、前記アツバノリ属抽出物ＥＨが、アトピー性皮膚炎を治療可能なことが示された。
【0009】
本文中の「一の」又は「一種の」との用語は、本発明の部材及び成分を記載するために用いられる。この用語は、記載の便宜上、及び本発明の基本的観念を示すためのものにすぎない。このような記載は、一種又は少なくとも一種を含むと解釈すべきであり、且つ、別途明確に指定する場合を除き、単数で示す場合には複数の場合も含まれる。また、特許請求の範囲において「含む」との用語と合わせて使用する場合、この「一の」との用語は１又は１よりも大きいことを意味し得る。
【0010】
本文において、特許請求の範囲で使用する「又は」との用語は、「及び／又は」を意味する。ただし、別の選択に限る旨を別途明確に示している場合や、その他の選択と互いに排斥し合う場合を除く。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明は、アツバノリ属抽出物の製造方法を提供する。前記方法は、以下のステップを含む。即ち、（ａ）アルコール系溶媒でアツバノリ属を抽出し、アツバノリ属アルコール系抽出物を取得する。前記アルコール系溶媒は、メタノール又はエタノールとする。（ｂ）有機溶液又は超臨界抽出により前記アツバノリ属アルコール系抽出物を分配抽出することで有機溶媒層と水性層を形成したあと、前記水性層を採取する。前記有機溶液は、有機溶媒又は水と有機溶媒の混合液である。前記有機溶媒は、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、メチルエーテル、エチルエーテル、ジクロロメタン、クロロホルム又は四塩化炭素である。（ｃ）ステップ（ｂ）で取得した水性層を１－ブタノールで分配抽出することで１－ブタノール層と水性層を形成する。続いて、前記水性層を採取することで、前記アツバノリ属抽出物を取得する。
【0012】
具体的実施例において、前記アツバノリ属はアツバノリ（Ｓａｒｃｏｄｉａ ｃｅｙｌａｎｉｃａ）である。
【0013】
別の具体的実施例において、前記アルコール系溶媒はエタノールである。好ましい具体的実施例において、前記アツバノリ属アルコール系抽出物はアツバノリ属エタノール抽出物である。
【0014】
具体的実施例において、前記有機溶媒は酢酸エチルである。本発明では、前記アツバノリ属抽出物を水性層から採取して取得するため、前記アツバノリ属抽出物はアツバノリ属水抽出物である。
【0015】
具体的実施例において、前記方法は、前記ステップ（ａ）の前にステップ（ａ１）を含む。前記ステップ（ａ１）では、前記アツバノリ属を乾燥させる。好ましい具体的実施例において、前記アツバノリ属は２０～７０℃の温度下で乾燥させる。より好ましい具体的実施例において、前記アツバノリ属は４０～６０℃の温度下で乾燥させる。別の具体的実施例において、前記アツバノリ属は５０℃で乾燥させる。
【0016】
具体的実施例において、前記アツバノリ属の乾燥時間は１２～４８時間である。好ましい具体的実施例において、前記アツバノリ属の乾燥時間は１６～３２時間である。好ましい具体的実施例において、前記アツバノリ属の乾燥時間は２０～２４時間である。
【0017】
本発明では、前記アツバノリ属を乾燥させたあと、所定のメッシュ（ｍｅｓｈ）孔径サイズの濾過網で濾過し、濾過後にエタノールで抽出する。具体的実施例において、前記方法は、前記ステップ（ａ）の前にステップ（ａ２）を含む。前記ステップ（ａ２）では、３０～７０メッシュ孔径の濾過網で前記アツバノリ属を濾過する。好ましい具体的実施例において、前記方法は、前記ステップ（ａ）の前にステップ（ａ２）を含む。前記ステップ（ａ２）では、４０～６０メッシュ孔径の濾過網で前記アツバノリ属を濾過する。より好ましい具体的実施例において、前記方法は、前記ステップ（ａ）の前にステップ（ａ２）を含む。前記ステップ（ａ２）では、５０メッシュ孔径の濾過網で前記アツバノリ属を濾過する。
【0018】
別の具体的実施例において、前記アツバノリ属は、室温下でアルコール系溶媒により抽出する。好ましい具体的実施例において、ステップ（ａ）では、前記アツバノリ属をアルコール系溶媒に浸漬して３回抽出する。そして、３回分の浸漬液を合わせて濾過し、減圧して濃縮することで前記アツバノリ属アルコール系抽出物を取得する。
【0019】
具体的実施例において、ステップ（ｂ）では、前記有機溶液で前記アツバノリ属アルコール系抽出物を分配抽出することで、有機溶媒層と水性層を形成したあと、前記水性層を採取する。好ましい具体的実施例において、ステップ（ｂ）では、前記有機溶液で前記アツバノリ属アルコール系抽出物を分配抽出する。且つ、分配抽出操作を３回繰り返すことで、有機溶媒層と水性層を形成したあと、前記水性層を採取する。
【0020】
別の具体的実施例において、前記ステップ（ｂ）は、前記有機溶液による抽出の前に、更にステップ（ｂ１）を含む。前記ステップ（ｂ１）では、前記アツバノリ属アルコール系抽出物を水中に浸漬して、アツバノリ属水性溶液を取得する。好ましい具体的実施例において、前記ステップ（ｂ１）では、前記アツバノリ属アルコール系抽出物を水に浸漬して、前記アツバノリ属アルコール系抽出物を水中に浮遊させる。ステップ（ｂ１）の実行後、元のステップ（ｂ）において、ステップ（ｂ１）で取得したアツバノリ属水性溶液を、前記水と有機溶媒の混合液を使用することなく、前記有機溶媒により分配抽出する。これにより、有機溶媒層と水性層を形成したあと、前記水性層を採取する。
【0021】
具体的実施例において、ステップ（ｃ）では、ステップ（ｂ）で取得した水性層を前記１－ブタノールで分配抽出する。且つ、分配抽出操作を３回繰り返すことで、前記１－ブタノール層と前記水性層を形成したあと、前記水性層を採取することで前記アツバノリ属抽出物を取得する。
【0022】
ステップ（ｂ１）の実行後、元のステップ（ｂ）において、ステップ（ｂ１）で取得したアツバノリ属水性溶液を前記超臨界抽出により分配抽出する。具体的実施例において、ステップ（ｂ）では、ステップ（ｂ１）で取得したアツバノリ属水性溶液を前記超臨界抽出で分配抽出することで有機溶媒層と水性層を形成したあと、前記水性層を採取する。別の具体的実施例において、前記超臨界抽出は超臨界ＣＯ２抽出である。本発明において、超臨界ＣＯ２抽出により天然物の栄養成分を分離するプロセスでは、主に超臨界状態の二酸化炭素流体を利用して、高圧・低温条件下で天然物から栄養成分を抽出する。具体的実施例において、前記超臨界ＣＯ２抽出条件は、ＣＯ２：９９％エタノール溶液の流速比＝１０ｍＬ／ｍｉｎ：１ｍＬ／ｍｉｎ、臨界圧力の範囲を１５０～４００バール（ｂａｒ）、及び臨界温度の範囲を２０～６０℃とする。好ましい具体的実施例において、前記超臨界ＣＯ２抽出条件は、ＣＯ２：９５％エタノール溶液の流速比＝１０ｍＬ／ｍｉｎ：１ｍＬ／ｍｉｎ、臨界圧力を２５０バール（ｂａｒ）、及び臨界温度を４０℃とする。超臨界ＣＯ２抽出によっても同様に、超臨界ＣＯ２抽出反応槽内に残留する原料（水性層）と、抽出される物質（有機溶媒層）に分離される。よって、前記超臨界ＣＯ２抽出反応槽内の水性層を１－ブタノールで抽出することで、前記アツバノリ属抽出物を取得する。
【0023】
本発明では、ステップ（ｃ）において、１－ブタノールにより抽出して分離した前記１－ブタノール層及び前記水性層のうち、前記水性層を採取したあと、まずはＣ１８ガラスカラムで濾過し、余分な塩類を除去してから乾燥させることで、前記アツバノリ属抽出物を取得する。具体的実施例において、前記方法は、前記ステップ（ｃ）のあとにステップ（ｄ）を含む。前記ステップ（ｄ）では、ステップ（ｃ）で取得した水性層を濾過し、濾過後に乾燥させることで前記アツバノリ属抽出物を取得する。好ましい具体的実施例において、前記方法は、前記ステップ（ｃ）のあとにステップ（ｄ）を含む。前記ステップ（ｄ）では、ステップ（ｃ）で取得した水性層をＣ１８ガラスカラムで濾過し、濾過後に乾燥させることで前記アツバノリ属抽出物を取得する。
【0024】
別の具体的実施例において、前記アツバノリ属抽出物の成分は多糖を含まない。
【0025】
本発明は、更に、皮膚美白のための組成物の製造におけるアツバノリ属抽出物の使用を提供する。前記アツバノリ属抽出物の製造方法は以下のステップを含む。即ち、（ａ）アルコール系溶媒でアツバノリ属を抽出し、アツバノリ属アルコール系抽出物を取得する。前記アルコール系溶媒は、メタノール又はエタノールとする。
【0026】
具体的実施例において、前記ステップ（ａ）における前記アツバノリ属は、洗浄、乾燥及び／又は粉砕処理が施される。
【0027】
別の具体的実施例において、前記アツバノリ属抽出物の製造方法は、更に、ステップ（ａ）の後にステップ（ｂ）を含む。前記ステップ（ｂ）では、有機溶液又は超臨界抽出により前記アツバノリ属アルコール系抽出物を分配抽出することで、有機溶媒層と水性層を形成する。続いて、前記水性層を採取することでアツバノリ属水性抽出物を取得する。前記有機溶液は、有機溶媒又は水と有機溶媒の混合液である。前記有機溶媒は、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、メチルエーテル、エチルエーテル、ジクロロメタン、クロロホルム又は四塩化炭素である。
【0028】
具体的実施例において、前記アツバノリ属抽出物の製造方法は、更に、前記有機溶液による抽出の前にステップ（ｂ１）を含む。前記ステップ（ｂ１）では、前記アツバノリ属アルコール系抽出物を水中に浸漬してアツバノリ属水性溶液を取得する。好ましい具体的実施例において、ステップ（ｂ）では、ステップ（ｂ１）で取得したアツバノリ属水性溶液を前記有機溶媒で分配抽出することで有機溶媒層と水性層を形成したあと、前記水性層を採取する。
【0029】
別の具体的実施例において、前記アツバノリ属抽出物の製造方法は、更に、ステップ（ｂ）の後にステップ（ｃ）を含む。前記ステップ（ｃ）では、ステップ（ｂ）で取得した水性層を１－ブタノールで分配抽出することで１－ブタノール層と水性層を形成する。続いて、前記水性層を採取することで、前記アツバノリ属抽出物を取得する。
【0030】
具体的実施例において、前記アツバノリ属はアツバノリ（Ｓａｒｃｏｄｉａ ｃｅｙｌａｎｉｃａ）である。
【0031】
別の具体的実施例において、前記アルコール系溶媒はエタノールである。好ましい具体的実施例において、前記アツバノリ属アルコール系抽出物はアツバノリ属エタノール抽出物である。
【0032】
具体的実施例において、前記有機溶媒は酢酸エチルである。
【0033】
本発明において、前記アツバノリ属抽出物は、メラニンの生成抑制又はメラニンの減少を可能とすることで、皮膚美白の効果を達成する。具体的実施例において、前記アツバノリ属抽出物は、メラニン生成を抑制するか、メラニンを減少させる。好ましい具体的実施例において、前記アツバノリ属抽出物は、メラニン生成を抑制するかメラニンを減少させる組成物を製造するために用いられる。より好ましい具体的実施例において、前記アツバノリ属抽出物は、メラニン生成を抑制するかメラニンを減少させる医薬品又は化粧品を製造するために用いられる。
【0034】
具体的実施例において、前記組成物には、化粧品材料組成物、食品添加物又は医薬組成物が含まれる。好ましい具体的実施例において、前記組成物には、化粧品組成物、食品又は薬物が含まれる。よって、前記組成物は、化粧品、食品又は薬物を製造するために使用可能である。別の具体的実施例において、前記アツバノリ属抽出物は、皮膚美白のための医薬品又は化粧品を製造するために用いられる。
【0035】
例示的実施例において、前記組成物は化粧品組成物とすることができる。前記アツバノリ属抽出物以外にも、前記化粧品組成物は、機能性添加物及び化粧品組成物に一般的に含まれる成分を含有し得る。機能性添加物は、水溶性ビタミン、脂溶性ビタミン、ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）、ポリサッカライド（ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、スフィンゴ脂質（ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ）及び海藻抽出物から選択される成分を含み得る。また、これらのほか、油、脂肪、湿潤剤、エモリエント（ｅｍｏｌｌｉｅｎｔ）、界面活性剤、有機又は無機顔料、有機粉末、紫外線吸収剤、防腐剤、殺菌剤、抗酸化剤、植物抽出物、ｐｈ調節剤（ｐＨ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｇｅｎｔ）、アルコール、着色剤、香料、血液循環促進剤、清涼剤、止汗剤又は純水等を更に含んでもよい。
【0036】
化粧品組成物の製剤は特に制限せず、目的に応じて適切に選択すればよい。例えば、洗顔料（ｓｋｉｎ ｌｏｔｉｏｎ）、皮膚軟化剤（ｓｏｆｔｅｎｅｒ）、スキントナー（ｔｏｎｅｒ）、収斂剤（ａｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）、化粧水、乳液（ｍｉｌｋ ｌｏｔｉｏｎ）、保湿ローション（ｍｏｉｓｔｕｒｉｚｉｎｇ ｌｏｔｉｏｎ）、栄養ローション（ｎｏｕｒｉｓｈｉｎｇ ｌｏｔｉｏｎ）、マッサージクリーム（ｍａｓｓａｇｅ ｃｒｅａｍ）、栄養クリーム（ｎｏｕｒｉｓｈｉｎｇ ｃｒｅａｍ）、保湿クリーム（ｍｏｉｓｔｕｒｉｚｉｎｇ ｃｒｅａｍ）、ハンドクリーム（ｈａｎｄ ｃｒｅａｍ）、ファンデーション（ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）、美容液（ｅｓｓｅｎｃｅ）、栄養美容液（ｎｏｕｒｉｓｈｉｎｇ ｅｓｓｅｎｃｅ）、パック（ｐａｃｋ）、石鹸、クレンジングフォーム（ｃｌｅａｎｓｉｎｇ ｆｏａｍ）、クレンジングローション（ｃｌｅａｎｓｉｎｇ ｌｏｔｉｏｎ）、クレンジングクリーム（ｃｌｅａｎｓｉｎｇ ｃｒｅａｍ）、ボディローション（ｂｏｄｙ ｌｏｔｉｏｎ）及びボディソープ（ｂｏｄｙ ｃｌｅａｎｓｅｒ）のうちの１又は複数の製剤で構成される群から選択されるものとして製造可能である（ただし、これらに限らない）。
【0037】
本発明は、更に、メラニン生成抑制又はメラニン減少によって皮膚を美白する方法を提供する。前記方法では、個体の皮膚に有効投与量の組成物を投与する。前記組成物はアツバノリ属抽出物を含み、前記アツバノリ属抽出物の製造方法は以下のステップを含む。即ち、（ａ）アルコール系溶媒でアツバノリ属を抽出し、アツバノリ属アルコール系抽出物を取得する。前記アルコール系溶媒は、メタノール又はエタノールとする。
【0038】
具体的実施例において、前記ステップ（ａ）における前記アツバノリ属は、洗浄、乾燥及び／又は粉砕処理が施される。
【0039】
別の具体的実施例において、前記アツバノリ属抽出物の製造方法は、更に、ステップ（ａ）の後にステップ（ｂ）を含む。前記ステップ（ｂ）では、有機溶液又は超臨界抽出により前記アツバノリ属アルコール系抽出物を分配抽出することで、有機溶媒層と水性層を形成する。続いて、前記水性層を採取することでアツバノリ属水性抽出物を取得する。前記有機溶液は、有機溶媒又は水と有機溶媒の混合液である。前記有機溶媒は、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、メチルエーテル、エチルエーテル、ジクロロメタン、クロロホルム又は四塩化炭素である。
【0040】
具体的実施例において、前記アツバノリ属抽出物の製造方法は、更に、前記有機溶液による抽出の前に、ステップ（ｂ１）を含む。前記ステップ（ｂ１）では、前記アツバノリ属アルコール系抽出物を水中に浸漬してアツバノリ属水性溶液を取得する。好ましい具体的実施例において、ステップ（ｂ）では、ステップ（ｂ１）で取得したアツバノリ属水性溶液を前記有機溶媒で分配抽出することで有機溶媒層と水性層を形成したあと、前記水性層を採取する。
【0041】
別の具体的実施例において、前記アツバノリ属抽出物の製造方法は、更に、ステップ（ｂ）の後にステップ（ｃ）を含む。前記ステップ（ｃ）では、ステップ（ｂ）で取得した水性層を１－ブタノールで分配抽出することで１－ブタノール層と水性層を形成する。続いて、前記水性層を採取することで、前記アツバノリ属抽出物を取得する。
【0042】
具体的実施例において、前記アツバノリ属はアツバノリ（Ｓａｒｃｏｄｉａ ｃｅｙｌａｎｉｃａ）である。
【0043】
別の具体的実施例において、前記アルコール系溶媒はエタノールである。好ましい具体的実施例において、前記アツバノリ属アルコール系抽出物はアツバノリ属エタノール抽出物である。
【0044】
具体的実施例において、前記有機溶媒は酢酸エチルである。
【0045】
別の具体的実施例において、前記個体は動物であり、好ましくは哺乳類であり、より好ましくはヒトである。
【0046】
本発明では、前記組成物が前記個体の皮膚に投与されて、前記皮膚部位のメラニンを抑制又は減少させることで前記箇所の皮膚を美白する。具体的実施例において、前記組成物は、乳液、化粧水、美容液、日焼け止め、化粧下地又はフェイシャルマスクの形式で製造される。
【0047】
本文中の「有効投与量」との用語は、特定の条件において、１つの個体の症状の進行を予防、低下、阻止又は逆転させられるか、前記個体が治療を受け始めた時点において、特別な状況下で存在していた症状を、部分的もしくは完全に緩和可能な治療投与量のことである。当業者であれば、前記アツバノリ属抽出物を個体に投与する際の適切な投与量及び用法を容易に測定可能である。例えば、前記アツバノリ属抽出物は、前記個体に１回又は２回投与可能である。投与量及び用法には、複数回投与する際に、前記個体に投与する前記アツバノリ属抽出物の有効投与量（投与量及び用法の全期間に投与される生成物の総量を含む）を理解し得ることが含まれる。
【0048】
皮膚美白の場合、具体的実施例において、前記アツバノリ属抽出物の有効投与量の範囲は５μｇ／ｍｌ～５００μｇ／ｍｌである。好ましい具体的実施例において、前記アツバノリ属抽出物の有効投与量の範囲は２０μｇ／ｍｌ～２００μｇ／ｍｌである。より好ましい具体的実施例において、前記アツバノリ属抽出物の有効投与量の範囲は５０μｇ／ｍｌ～１００μｇ／ｍｌである。
【0049】
本発明は、更に、抗炎症のための薬物の製造における組成物の使用を提供する。前記組成物はアツバノリ属抽出物を含み、前記アツバノリ属抽出物の製造方法は以下のステップを含む。即ち、（ａ）アルコール系溶媒でアツバノリ属を抽出し、アツバノリ属アルコール系抽出物を取得する。前記アルコール系溶媒は、メタノール又はエタノールとする。
【0050】
具体的実施例において、前記ステップ（ａ）における前記アツバノリ属は、洗浄、乾燥及び／又は粉砕処理が施される。
【0051】
別の具体的実施例において、前記アツバノリ属抽出物の製造方法は、更に、ステップ（ａ）の後にステップ（ｂ）を含む。前記ステップ（ｂ）では、有機溶液又は超臨界抽出により前記アツバノリ属アルコール系抽出物を分配抽出することで、有機溶媒層と水性層を形成する。続いて、前記水性層を採取することでアツバノリ属水性抽出物を取得する。前記有機溶液は、有機溶媒又は水と有機溶媒の混合液である。前記有機溶媒は、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、メチルエーテル、エチルエーテル、ジクロロメタン、クロロホルム又は四塩化炭素である。
【0052】
具体的実施例において、前記アツバノリ属抽出物の製造方法は、更に、前記有機溶液による抽出の前に、ステップ（ｂ１）を含む。前記ステップ（ｂ１）では、前記アツバノリ属アルコール系抽出物を水中に浸漬してアツバノリ属水性溶液を取得する。好ましい具体的実施例において、ステップ（ｂ）では、ステップ（ｂ１）で取得したアツバノリ属水性溶液を前記有機溶媒で分配抽出することで有機溶媒層と水性層を形成したあと、前記水性層を採取する。
【0053】
別の具体的実施例において、前記アツバノリ属抽出物の製造方法は、更に、ステップ（ｂ）の後にステップ（ｃ）を含む。前記ステップ（ｃ）では、ステップ（ｂ）で取得した水性層を１－ブタノールで分配抽出することで１－ブタノール層と水性層を形成する。続いて、前記水性層を採取することで、前記アツバノリ属抽出物を取得する。
【0054】
具体的実施例において、前記アツバノリ属はアツバノリ（Ｓａｒｃｏｄｉａ ｃｅｙｌａｎｉｃａ）である。
【0055】
本文中で使用する「抗炎症」との用語には、炎症症状を治療又は処置することが含まれる（ただし、これに限らない）。
【0056】
具体的実施例において、前記抗炎症には炎症性因子の抑制が含まれる。好ましい具体的実施例において、前記炎症性因子には、シクロオキシゲナーゼ－２（ＣＯＸ－２）及び誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）が含まれる。より好ましい具体的実施例において、前記アツバノリ属抽出物は、シクロオキシゲナーゼ－２（ＣＯＸ－２）及び誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）により引き起こされる炎症を抑制する。
【0057】
つまり、前記アツバノリ属抽出物は炎症を抑制可能であり、更には、アレルギー性皮膚炎の治療に応用可能である。具体的実施例において、前記アツバノリ属抽出物は、抗炎症によりアレルギー性皮膚炎を治療する。好ましい具体的実施例において、前記薬物は、抗炎症によりアレルギー性皮膚炎を治療する。
【0058】
本文中で使用する「治療」との用語は、症状又は合併症の緩和、疾患、病症又は病状の進行の遅延、症状及び合併症の軽減又は緩和、及び／又は、疾患、病症又は病状の治愈又は除去を意味する。
【0059】
本文中で使用される「アレルギー性皮膚炎」との用語は、アレルギー反応を要因とする皮膚疾患の総称であって、慢性的な痒みや、顔、首、肘及び／又は膝の発疹を特徴とする。アレルギー性皮膚炎としては、例えば、接触皮膚炎、アトピー性皮膚炎等が挙げられる。「接触皮膚炎」とは、外来性の抗原が皮膚と接触することで発症する湿疹性の炎症疾患であり、例えば、アレルギー性接触皮膚炎、光接触皮膚炎、全身性接触皮膚炎及び接触性蕁麻疹が挙げられる。また、抗原としては、例えば、金属アレルゲン（コバルト、ニッケル等）、植物アレルゲン（ウルシ、サクラソウ等）及び食物アレルゲン（マンゴー、イチョウ等）が挙げられる。「アトピー性皮膚炎（ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ，ＡＤ）」とは、多数の患者にアトピー性傾向のある皮膚疾患のことを言う。また、悪化と緩和を繰り返す左右対称の全身性湿疹を特徴とし、例えば、びまん性神経皮膚炎、アトピー性湿疹、アトピー性神経皮膚炎、ベニエ痒疹（Ｂｅｓｎｉｅｒ ｐｒｕｒｉｇｏ）、急性乳児湿疹、屈曲部湿疹、四肢小児湿疹、小児アトピー性湿疹、小児乾燥型湿疹、小児湿疹、成人アトピー性皮膚炎、内因性湿疹、小児皮膚炎及び慢性小児湿疹が挙げられる。
【0060】
具体的実施例において、前記アレルギー性皮膚炎には、接触皮膚炎又はアトピー性皮膚炎が含まれる。好ましい具体的実施例において、前記アレルギー性皮膚炎にはアトピー性皮膚炎が含まれる。より好ましい具体的実施例において、前記アトピー性皮膚炎には、びまん性神経皮膚炎、アトピー性湿疹、アトピー性神経皮膚炎、ベニエ痒疹、急性乳児湿疹、屈曲部湿疹、四肢小児湿疹、小児アトピー性湿疹、小児乾燥型湿疹、小児湿疹、成人アトピー性皮膚炎、内因性湿疹、小児皮膚炎又は慢性小児湿疹が含まれる。
【0061】
別の具体的実施例において、前記薬物は、紅斑、浮腫、表皮剥離又は皮膚の乾燥を含むアトピー性皮膚炎の症状を抑制する。
【0062】
具体的実施例において、前記薬物は、前記アトピー性皮膚炎に由来するＩｇＥ発現量の上昇を低下させる。
【0063】
別の具体的実施例において、前記薬物は、前記アトピー性皮膚炎に由来する脾臓又はリンパ節の腫大を改善する。
【0064】
具体的実施例において、前記薬物は、更に、薬学的に許容可能な担体（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｃａｒｒｉｅｒ）を含む。本文中で使用される「薬学的に許容可能な担体」との用語は、特定の組み合わせで適用及び特定の方法で適用される組成物により決定される。本文中で使用される「担体」との用語には、任意及びあらゆる溶媒、分散媒、賦形剤（ｖｅｈｉｃｌｅ）、コーティング、希釈剤、抗菌剤及び抗真菌剤等の浸透・吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液又はコロイド等が含まれる（但し、これらに限らない）。薬物の活性物質に用いられるこれらの媒質及び試薬は前記分野において公知である。いずれかの一般的な媒質又は試薬と活性成分との相性が悪い場合を除き、治療のための組み合わせが考慮されるべきである。また、補足的な活性成分を組成物に混合してもよい。「薬学的に許容可能」との用語は、分子の実体と組成物を被験者に適用したときに、アレルギー又は類似の副反応が発生しないことを言う。タンパク質を活性物質とする水組成物の製造は、前記分野において周知である。通常、この組成物は、液体・溶液、錠剤、カプセル又は懸濁注射剤として製造される。また、注射剤として使用し得る溶解可能な固体又は懸濁液の固体として製造してもよい。別の具体的実施例において、前記薬学的に許容可能な担体には、皮膚学的に許容可能な媒質が含まれる。「皮膚学的に許容可能な媒質」とは、例えば、塩類、エステル類及び／又は酸アミド類の成分といった生物学的に適切な物質を意味する。即ち、この物質は、選択された有効成分と合わせて使用する場合に、個体に投与しても望まない生物学的作用を引き起こすことがない。また、前記物質は、この物質を含む薬剤成分におけるいずれの成分とも有害な相互作用を生じない物質である。同様に、文中の「皮膚学的に許容可能な塩」又は「皮膚学的に許容可能なエステル」は、生物学的に適切な塩又はエステルである。
【0065】
本発明において、前記組成物（前記アツバノリ属抽出物を含む）と薬学的に許容可能な担体の配合には、無菌の水溶液又は分散体、水懸濁液、油エマルション、油中エマルションの水、特定点エマルション、長期滞留エマルション、粘性エマルション、マイクロエマルション、ナノエマルション、リポソーム、微粒子、ミクロスフェア、ナノスフェア、ナノ粒子、マイクロ水銀、及び、持続的に放出される数種類の天然又は合成ポリマーを利用可能である。薬学的に許容可能な担体及び前記アツバノリ属抽出物は、エアロゾル剤、タブレット、丸剤、カプセル、滅菌粉末、座薬、洗剤、クリーム、軟膏剤、ペースト、ゲル、ヒドロゲル、又は組成物の搬送に使用可能なその他の製剤として配合してもよい。
【0066】
また、本発明で言うところの組成物には、局所的及び領域的に投与されて作用する組成物が含まれる。本文で使用される「局所」との用語は、本文中で記載する組成物を使用して適切な薬用担体に混合し、皮膚の部位（例えば、アレルギー性皮膚炎の患部）に塗布することで局所的作用を奏することに関連する。そのため、こうした局所用の前記組成物には、処置対象の皮膚の表面と直接接触して外部から塗布する化合物といった薬物形式が含まれる。この目的のための一般的な薬物形式には、軟膏剤、擦剤、クリーム、シャンプー、エマルション、ペースト、ゲル、スプレー剤、エアロゾル等が含まれる。且つ、治療対象の身体部位に応じて、貼付剤、又は湿潤包帯の形式で使用することも可能である。「軟膏剤」との用語には、油性基質、水溶性基質及びエマルション基質を有する製剤（クリームを含む）が含まれる。前記基質は、例えば、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール類及びこれらを組み合わせた混合物である。
【0067】
本発明の薬物は、更に、薬学的に許容可能な担体を含み、本発明の関連分野で周知の治療方式によって、多数の異なる手段で個体に投与可能である。いくつかの実施例において、前記組成物（前記アツバノリ属抽出物を含む）及び薬学的に許容可能な担体は、外用、静脈、筋肉、皮下、局所、経口又は吸入により投与される。また、前記薬物は、消化及び循環系によって標的箇所に伝達される。
【0068】
別の具体的実施例において、前記個体は動物であり、好ましくは哺乳類であり、より好ましくはヒトである。
【0069】
抗炎症の場合、具体的実施例において、前記アツバノリ属抽出物の有効投与量の範囲は１ｍｇ／体重ｋｇ～２００ｍｇ／体重ｋｇである。好ましい具体的実施例において、前記アツバノリ属抽出物の有効投与量の範囲は５ｍｇ／体重ｋｇ～１００ｍｇ／体重ｋｇである。より好ましい具体的実施例において、前記アツバノリ属抽出物の有効投与量の範囲は１０ｍｇ／体重ｋｇ～４０ｍｇ／体重ｋｇである。
【0070】
アレルギー性皮膚炎を治療する場合には、具体的実施例において、前記アツバノリ属抽出物の有効投与量の範囲は０．０５～２０ｍｇ／ｍｌである。好ましい具体的実施例において、前記アツバノリ属抽出物の有効投与量の範囲は０．１～１０ｍｇ／ｍｌである。より好ましい具体的実施例において、前記アツバノリ属抽出物の有効投与量の範囲は０．５～２ｍｇ／ｍｌである。
【図面の簡単な説明】
【0071】
【図3】図３は、ゼブラフィッシュの魚体色素に対するアツバノリ属抽出物ＥＨの影響を示す。ゼブラフィッシュの胚本体に、受精から９時間後にアツバノリ属抽出物ＥＨを投与し、４８時間浸漬したあと、仔魚を取り出して魚体を撮影及び分析した。また、５．４ｍｇ／ｍＬのアルブチン及び３０．４μｇ／ｍＬのＰＴＵをポジティブコントロール群とした。画像定量ソフトを用いて魚体の腹部をマークし、各群のゼブラフィッシュのメラニン生成発現量を解析した。その結果、ＥＨ（１００μｇ／ｍＬ）はゼブラフィッシュのメラニン生成を抑制可能であり、美白活性を有することが示された。データは、平均値±平均値の標準誤差（ｍｅａｎ±ＳＥＭ）を示している。また、コントロール群と比較して有意差を有していたもの（Ｐ＜０．０５）を＊で示す。
【図4】図４は、リポ多糖（ＬＰＳ）誘導型のｉＮＯＳに対するアツバノリ属抽出物ＥＨの影響を示す。１０ｎｇ／ｍＬのリポ多糖でＲａｗ２６４．７細胞に炎症反応を誘発し、２０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬのアツバノリ属抽出物ＥＨを加えて１６時間培養した。また、１０μＭのデキサメタゾン（Ｄｅｘ）をポジティブコントロール群とした。ウエスタンブロッティングで炎症性因子ｉＮＯＳの発現量を分析した結果、ＥＨがｉＮＯＳを顕著に抑制可能なことが示された。データは、平均値±平均値の標準誤差（ｍｅａｎ±ＳＥＭ）を示している。また、ＬＰＳ群と比較して有意差を有していたもの（Ｐ＜０．０５）を＊で示す。
【図5】図５は、リポ多糖（ＬＰＳ）誘導型のＣＯＸ－２に対するアツバノリ属抽出物ＥＨの影響を示す。１０ｎｇ／ｍＬのリポ多糖でＲａｗ２６４．７細胞に炎症反応を誘発し、２０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬのアツバノリ属抽出物ＥＨを加えて１６時間培養した。また、１０μＭのデキサメタゾン（Ｄｅｘ）をポジティブコントロール群とした。ウエスタンブロッティングで炎症性因子ＣＯＸ－２の発現量を分析した結果、ＥＨがＣＯＸ－２を顕著に抑制可能なことが示された。データは、平均値±平均値の標準誤差（ｍｅａｎ±ＳＥＭ）を示している。また、ＬＰＳ群と比較して有意差を有していたもの（Ｐ＜０．０５）を＊で示す。
【図6】図６は、アトピー性皮膚炎を罹患したマウスの皮膚外観に対するアツバノリ属抽出物ＥＨの影響を示す。図中の（Ａ）は、ＤＮＣＢでアトピー性皮膚炎を誘発し、マウスの皮膚にアトピー性皮膚炎の症状が発現したあと、毎日の薬物塗布を開始して、治療１日目、７日目、１２日目にＤＮＣＢ誘発アトピー性皮膚炎のマウスの皮膚外観をそれぞれ撮影したものを示している。なお、スケールバー＝１ｃｍである。その結果、ＡＤ群と比較して、ＥＨＬ群（低投与量群）とＥＨＨ群（高投与量群）は、いずれもアトピー性皮膚炎の症状を緩やかにする効果を有しており、表皮の浮腫、赤み、乾燥及びかさぶた等の現象がいずれも緩和された。図中の（Ｂ）は、治療１２日目のアツバノリ属抽出物ＥＨによるアトピー性皮膚炎症状緩和の臨床皮膚炎スコアを示している。ＥＨによるアトピー性皮膚炎症状の緩和を臨床皮膚炎スコアで評価した。このとき、４つの皮膚表面症状として、紅斑／出血、浮腫、表皮剥離／びらん、乾燥を用いて皮膚炎の重大性を評価した。そして、各種症状の重症度に応じて０～３点をそれぞれ付与し、点数が高いほど重症とした。皮膚炎の総スコアは上記４種類の点数の合計とし、最高で１２点であった。点数が高いほど皮膚炎の重症度は深刻であった。データは、平均値±平均値の標準誤差（ｍｅａｎ±ＳＥＭ）を示している。また、ＡＤ群と比較して有意差を有していたもの（Ｐ＜０．０５）を＊で示し、ＡＤＶ群と比較して有意差を有していたものを＃で示している。
【図7】図７は、血清中ＩｇＥに対するアツバノリ属抽出物ＥＨの影響を示す。動物を殺処分する前に血液を採取し、血清中のＩｇＥを検出した。ＤＮＣＢ誘発アトピー性皮膚炎によりＩｇＥは上昇したが、アツバノリ属抽出物ＥＨを塗布することでＩｇＥは低下した。データは、平均値±平均値の標準誤差（ｍｅａｎ±ＳＥＭ）を示している。また、ＡＤ群と比較して有意差を有していたもの（Ｐ＜０．０５）を＊で示し、ＡＤＶ群と比較して有意差を有していたものを＃で示している。
【発明を実施するための形態】
【0072】
養殖型アツバノリ属の抽出
本発明では、人工的に養殖したアツバノリ（Ｓａｒｃｏｄｉａ ｃｅｙｌａｎｉｃａ）を使用した。
本発明では、人工的に養殖したアツバノリ（Ｓａｒｃｏｄｉａ ｃｅｙｌａｎｉｃａ）を使用した。
【0073】
アツバノリ属を５０℃の条件下で２４時間乾燥させて、乾燥アツバノリ属を取得した。１０．８ｋｇの乾燥アツバノリ属を粉砕し、５０メッシュ（ｍｅｓｈ）の濾過網で濾過してから、室温で９５％アルコール（ＥｔＯＨ）に浸漬して３回抽出した。そして、３回分の浸漬液を合わせて濾過し、減圧して濃縮することで、３７０．５ｇのアツバノリ属アルコール粗抽出物を取得することができた。次に、上記のアツバノリ属粗抽出物を１Ｌの水に加えて浮遊状としてから、１Ｌの酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）を加えて分配抽出を行った。上記の分配抽出を３回繰り返すことで酢酸エチル層と水性層を形成し、上記酢酸エチル層を除去したあと、前記水性層を採取した。また、前記水性層を１Ｌの１－ブタノール（ｎ－ＢｕＯＨ）で分配抽出し、上記の分配抽出を３回繰り返すことで１－ブタノール層と水性層を形成した。そして、１－ブタノール層を除去し、分離した水性層からＣ１８ガラスカラムによる濾過で余分な塩類を除去したあと、乾燥させることで抽出物ＥＨ（１５０ｇ）を取得した。アツバノリ属の全抽出フローを図１に示す。
【0074】
また、上記の抽出ステップでは、前記アルコール溶液をメタノール溶液に置き換えてもよい。且つ、酢酸エチルで抽出するステップは、その他の有機溶媒に置き換えてもよい。例えば、酢酸プロピル、酢酸ブチル、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、メチルエーテル、エチルエーテル、ジクロロメタン、クロロホルム又は四塩化炭素溶媒を用いて分配抽出するか、超臨界抽出（例えば、超臨界ＣＯ２抽出）を行ったあと、１－ブタノールを用いて抽出することでもＥＨと同じ成分の抽出物を取得可能である。
【0075】
また、水を酢酸エチル又はその他の有機溶媒と混合して有機溶液とし、前記アツバノリ属アルコール粗抽出物を直接抽出してもよい。この場合には、水と有機溶媒を２つのステップに分けてそれぞれ抽出する必要がない。そのほか、事前に水に浸漬するステップを不要とし、酢酸エチル又はその他の有機溶媒をそのまま用いて前記アツバノリ属アルコール粗抽出物を抽出してもよい。上記のステップの変更によっても、最終的にはＥＨと同じ成分の抽出物を取得可能である。
【0076】
上記の超臨界ＣＯ２抽出条件は、ＣＯ２：９５％エタノール溶液の流速比＝１０ｍＬ／ｍｉｎ：１ｍＬ／ｍｉｎ、臨界圧力を２５０バール（ｂａｒ）、及び臨界温度を４０℃とする。超臨界ＣＯ２抽出によっても同様に、超臨界ＣＯ２抽出反応槽内に残留する原料（水性層）と、抽出される物質に分離される。よって、前記超臨界ＣＯ２抽出反応槽内の原料（水性層）を１－ブタノールで抽出することで、前記アツバノリ属抽出物ＥＨを取得する。
【0077】
且つ、本発明では、フェノール－硫酸法でＥＨの多糖含有量を測定した結果、ＥＨは多糖成分を含有していなかった。そのため、事前にアルコールでアツバノリ属を浸漬する抽出方法によって多糖成分が溶出されることはなく、アツバノリ属アルコール粗抽出物に多糖成分は含有されなかった。
【0078】
実験方法
（１）ＥＨの美白効果の評価
（ａ）インビトロ細胞試験
Ｂ１６－Ｆ１０細胞を１ウェルあたり１０４個の細胞密度で２４ウェル培養プレートのウェル内で培養し、細胞インキュベータに配置した。２４時間後に元の細胞培養液を除去し、アツバノリ属抽出液を含有する細胞培養液を加えてから、再びインキュベータに配置して４８時間培養した。次に、トリプシンの作用を利用して細胞を収集し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で細胞を洗浄してから、１００μｌの１Ｎ ＮａＯＨ水溶液を加え、９０℃で１時間反応させた。そして、酵素免疫分析装置で波長４０５ｎｍの吸光値を検出し、データ分析を行った。コントロール群のデータを１００％とし、実験群間の吸光値の強弱を比較することで、アツバノリ属抽出液ＥＨの美白効果を示した。且つ、美白に用いられるアルブチン（Ａｒｂｕｔｉｎ）及びＮ－フェニルチオ尿素（Ｎ－ｐｈｅｎｙｌｔｈｉｏｕｒｅａ，ＰＴＵ）をポジティブコントロール群とした。また、α－メラニン細胞刺激ホルモン（α－Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ，α－ＭＳＨ）を細胞中のメラニン生成の促進に用いた。
（１）ＥＨの美白効果の評価
（ａ）インビトロ細胞試験
Ｂ１６－Ｆ１０細胞を１ウェルあたり１０４個の細胞密度で２４ウェル培養プレートのウェル内で培養し、細胞インキュベータに配置した。２４時間後に元の細胞培養液を除去し、アツバノリ属抽出液を含有する細胞培養液を加えてから、再びインキュベータに配置して４８時間培養した。次に、トリプシンの作用を利用して細胞を収集し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で細胞を洗浄してから、１００μｌの１Ｎ ＮａＯＨ水溶液を加え、９０℃で１時間反応させた。そして、酵素免疫分析装置で波長４０５ｎｍの吸光値を検出し、データ分析を行った。コントロール群のデータを１００％とし、実験群間の吸光値の強弱を比較することで、アツバノリ属抽出液ＥＨの美白効果を示した。且つ、美白に用いられるアルブチン（Ａｒｂｕｔｉｎ）及びＮ－フェニルチオ尿素（Ｎ－ｐｈｅｎｙｌｔｈｉｏｕｒｅａ，ＰＴＵ）をポジティブコントロール群とした。また、α－メラニン細胞刺激ホルモン（α－Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ，α－ＭＳＨ）を細胞中のメラニン生成の促進に用いた。
【0079】
（ｂ）生体ゼブラフィッシュの美白活性分析
実験では、魚齢４ヶ月以上のゼブラフィッシュ（ＡＢ ｓｔｒａｉｎ Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）を用いて実験用に養殖した。ゼブラフィッシュは、フィルタ及び循環システムを備えたアクリル水槽で飼育し、水温を２８．５℃に制御した。また、明暗周期をそれぞれ１４時間と１０時間となるよう制御した。
実験では、魚齢４ヶ月以上のゼブラフィッシュ（ＡＢ ｓｔｒａｉｎ Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）を用いて実験用に養殖した。ゼブラフィッシュは、フィルタ及び循環システムを備えたアクリル水槽で飼育し、水温を２８．５℃に制御した。また、明暗周期をそれぞれ１４時間と１０時間となるよう制御した。
【0080】
受精から９時間後のゼブラフィッシュの胚本体を採取し、９６ウェルプレートに注入した。各ウェル内には、３つの胚本体と１００μＬのハンクスバッファ（Ｈａｎｋ’ｓ ｂｕｆｆｅｒ）（０．０４ ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１．３ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＭｇＳＯ４）が存在するようにした。次に、コントロール群には１００μＬの１％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加え、ポジティブコントロール群と実験群には、それぞれ、１００μＬの５．４ｍｇ／ｍＬのアルブチン（Ａｒｂｕｔｉｎ、シグマアルドリッチ社、ミズーリ州、ＵＳＡ、Ｃａｔ．Ｎｏ．＃Ａ４２５６）、３０．４μｇ／ｍＬのＮ－フェニルチオ尿素（Ｎ－ｐｈｅｎｙｌｔｈｉｏｕｒｅａ，ＰＴＵ、シグマアルドリッチ社、ミズーリ州、ＵＳＡ、Ｃａｔ．Ｎｏ．＃Ｐ７６２９）、及び濃度５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ及び２００μｇ／ｍＬのアツバノリ属抽出物ＥＨ（いずれも１％ＤＭＳＯに溶解）を加えて、温度制御照明付インキュベータ（明／暗周期：１４／１０時間、２８．５℃）に配置して４８時間培養した。薬物処理から４８時間後（即ち、受精から５７時間後）に、幼魚を麻酔剤トリカイン（Ｔｒｉｃａｉｎｅ、１６８ｐｐｍ、ＭＳ－２２２）で麻酔したあと、ホールスライドグラスの凹溝に載置した。そして、２％メチルセルロース（Ｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、シグマアルドリッチ社、ミズーリ州、ＵＳＡ、Ｃａｔ．Ｎｏ．＃Ｍ０５１２）で魚体を固定し、実体顕微鏡（Ｚ１６ ＡＰＯ、ライカ、ヘーアブルーク、スイス）で観察した。また、画像キャプチャシステム及びソフトウェア（ｉｄｅａ ＳＰＯＴ ＆ ＳＰＯＴ ｓｏｆｔｗａｒｅ ＶＥＲＳＩＯＮ ４．６、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）を組み合わせて魚体画像を取得した。魚体画像には画像処理ソフト（Ｉｍａｇｅ Ｊ、アメリカ国立衛生研究所、メリーランド州、ＵＳＡ）を用い、魚体腹部の面積をそれぞれマークして、各群のゼブラフィッシュのメラニン値を定量分析した。そして、コントロール群のメラニン値を１００％として、実験群のメラニン値を比較することで、アツバノリ属抽出物ＥＨの美白効果を評価した。
【0081】
（２）ＥＨの抗炎症活性の評価
インビトロ細胞試験
５×１０５個のＲａｗ２６４．７細胞を６ｃｍシャーレに移植し、付着してから、まずはリポ多糖（ＬＰＳ）（０．０１μｇ／ｍＬ、シグマアルドリッチ社、ミズーリ州、ＵＳＡ、Ｃａｔ．Ｎｏ．＃Ｌ２６５４）を加えた。そして、１０分後に異なる濃度のＥＨを加えるとともに、１０μＭのデキサメタゾン（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，Ｄｅｘ）（シグマアルドリッチ社、ミズーリ州、ＵＳＡ、Ｃａｔ．Ｎｏ．＃Ｄ４９０２）をポジティブコントロール群として、共に１６時間培養した。続いて、ウエスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）によりＥＨの抗炎症活性を評価し、炎症促進に関与するタンパク質であるシクロオキシゲナーゼ－２（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ－２，ＣＯＸ－２）及び誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ，ｉＮＯＳ）の相対的発現量を分析した。また、リポ多糖（ＬＰＳ）を単独で加えた群を１００％とした。最後に、β－アクチン（β－ａｃｔｉｎ）を内在性コントロール群とした。
インビトロ細胞試験
５×１０５個のＲａｗ２６４．７細胞を６ｃｍシャーレに移植し、付着してから、まずはリポ多糖（ＬＰＳ）（０．０１μｇ／ｍＬ、シグマアルドリッチ社、ミズーリ州、ＵＳＡ、Ｃａｔ．Ｎｏ．＃Ｌ２６５４）を加えた。そして、１０分後に異なる濃度のＥＨを加えるとともに、１０μＭのデキサメタゾン（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，Ｄｅｘ）（シグマアルドリッチ社、ミズーリ州、ＵＳＡ、Ｃａｔ．Ｎｏ．＃Ｄ４９０２）をポジティブコントロール群として、共に１６時間培養した。続いて、ウエスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）によりＥＨの抗炎症活性を評価し、炎症促進に関与するタンパク質であるシクロオキシゲナーゼ－２（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ－２，ＣＯＸ－２）及び誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ，ｉＮＯＳ）の相対的発現量を分析した。また、リポ多糖（ＬＰＳ）を単独で加えた群を１００％とした。最後に、β－アクチン（β－ａｃｔｉｎ）を内在性コントロール群とした。
【0082】
（３）アトピー性皮膚炎に対するＥＨの治療効果
本発明で使用した実験動物は、ＢＡＬＢ／ｃ系統マウスであった。マウスを２．５％イソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）で麻酔したあと、シェーバーと除毛クリームでマウスの背部の毛を除去し、直径１ｃｍのシリコーンゴムで印を付けた（面積７８．５ｍｍ２）。次に、２日に１回、上記範囲に２６μＬの２％ ２，４－ジニトロクロロベンゼン（２，４－ｄｉｎｉｔｉｒｏｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ，ＤＮＣＢ）（シグマアルドリッチ社、ミズーリ州、ＵＳＡ、Ｃａｔ．Ｎｏ．＃１３８６３０）を滴下した。これを全部で８回行って、皮膚の病変を誘発した。
本発明で使用した実験動物は、ＢＡＬＢ／ｃ系統マウスであった。マウスを２．５％イソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）で麻酔したあと、シェーバーと除毛クリームでマウスの背部の毛を除去し、直径１ｃｍのシリコーンゴムで印を付けた（面積７８．５ｍｍ２）。次に、２日に１回、上記範囲に２６μＬの２％ ２，４－ジニトロクロロベンゼン（２，４－ｄｉｎｉｔｉｒｏｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ，ＤＮＣＢ）（シグマアルドリッチ社、ミズーリ州、ＵＳＡ、Ｃａｔ．Ｎｏ．＃１３８６３０）を滴下した。これを全部で８回行って、皮膚の病変を誘発した。
【0083】
ＤＮＣＢ誘発から７日後に、１００μＬの媒液（Ｖｅｈｉｃｌｅ）、アツバノリ属抽出物ＥＨ、又はアトピー性皮膚炎治療薬クリサボロール（ｃｒｉｓａｂｏｒｏｌｅ）を毎日塗布した。実験動物は、（１）コントロール群：未誘発、（２）ＡＤ群：２％ＤＮＣＢのみを投与、（３）ＡＤＶ群：２％ＤＮＣＢと媒液（Ｖｅｈｉｃｌｅ）を投与、（４）ＥＨＬ群：ＤＮＣＢ誘発後に５０μｇのＥＨ／１％メチルセルロース１００μＬを投与、（５）ＥＨＨ群：ＤＮＣＢ誘発後に２００μｇのＥＨ／１％メチルセルロース１００μＬを投与、及び（６）Ｃｒｉ群：ＤＮＣＢ誘発後に２５μｇのクリサボロール／１％アセトール（ａｃｅｔｏｎｅ－ＥｔＯＨ）１００μＬを投与、に群分けした（各群３匹）。また、ＤＮＣＢを塗布してから５分後に、ＤＮＣＢの乾燥を待って薬を塗布した。誘発又は薬塗布前に、デジタルカメラで皮膚症状の変化を撮影して記録した。
【0084】
１８日目に動物を殺処分し、採血するとともに、背部の皮膚、脾臓及びリンパ節の組織を採取した。そして、脾臓及び腸骨下リンパ節（Ｓｕｂｉｌｉａｃ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅ）の大きさを観察し、計量して比較した。また、皮膚表面の紅斑／出血（ｅｒｙｔｈｅｍａ／ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）、浮腫（ｅｄｅｍａ）、表皮剥離／びらん（ｅｘｃｏｒｉａｔｉｏｎ／ｅｒｏｓｉｏｎ）、乾燥（ｄｒｙｎｅｓｓ）という４つの症状から、臨床的な皮膚炎の重大性を評価した。各症状の重症度に応じて０～３点をそれぞれ付与し、０点は無症状、１点は軽症、２点は中等症、３点は重症とした。皮膚炎の総スコアは上記４種類の点数の合計とし、最高で１２点であった。点数が高いほど皮膚炎の重症度は深刻であった。
【0085】
殺処分前に、心臓採血法でマウスの血液を採血管（ＢＤ ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ－ＳＳＴ、ニュージャージー州、ＵＳＡ）に採取した。その後、血液を３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけて血清を取得した。血清は、次に使用するまで－８０℃の冷蔵庫で保存した。そして、メーカーの説明書に従って、血清中のＩｇＥ濃度を検出した（ＩｇＥ－ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社、ウィーン、オーストリア）。
【0086】
炎症又は免疫関連の疾患が発生した場合には、リンパ節及び脾臓が腫大（ｓｗｅｌｌ）する。そのため、マウスを殺処分する際にこれら２つの器官を採取して撮影し、重量を計測した。
【0087】
統計分析
全ての実験データは、平均値±平均値の標準誤差（ｍｅａｎ±ＳＥＭ）で示した。複数の群間でデータを比較するために、一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ，ＡＮＯＶＡ）によってデータの統計分析を行った。また、ダンカン法（Ｄｕｎｃａｎ’ｓ Ｍｅｔｈｏｄ）で群間差を多重比較した。且つ、Ｐ値が０．０５よりも小さいときに、群間に有意差があるとした。
全ての実験データは、平均値±平均値の標準誤差（ｍｅａｎ±ＳＥＭ）で示した。複数の群間でデータを比較するために、一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ，ＡＮＯＶＡ）によってデータの統計分析を行った。また、ダンカン法（Ｄｕｎｃａｎ’ｓ Ｍｅｔｈｏｄ）で群間差を多重比較した。且つ、Ｐ値が０．０５よりも小さいときに、群間に有意差があるとした。
【0088】
結果
（１）ＥＨの美白効果
Ｂ１６Ｆ１０細胞に１００ｍＭのα－ＭＳＨを用いてメラニン生成を誘発し、１０μｇ／ｍｌのＥＨ溶液又は１００μＭのＰＴＵを投与して４８時間培養した。その後、細胞を採取し、１Ｎ ＮａＯＨでメラニンを溶解した。最後に、波長４０５ｎｍの吸光値を読み取った。メラニンが多いほど吸光値は高かった。結果は図２に示す通りとなり、コントロール群が１００±５．３３％、ポジティブコントロール群のＰＴＵが３７．４１±３．９４％であったのに対し、１０μｇ／ｍＬのＥＨは細胞のメラニン生成を顕著に抑制可能であった（７２．６４±２．７９）。
（１）ＥＨの美白効果
Ｂ１６Ｆ１０細胞に１００ｍＭのα－ＭＳＨを用いてメラニン生成を誘発し、１０μｇ／ｍｌのＥＨ溶液又は１００μＭのＰＴＵを投与して４８時間培養した。その後、細胞を採取し、１Ｎ ＮａＯＨでメラニンを溶解した。最後に、波長４０５ｎｍの吸光値を読み取った。メラニンが多いほど吸光値は高かった。結果は図２に示す通りとなり、コントロール群が１００±５．３３％、ポジティブコントロール群のＰＴＵが３７．４１±３．９４％であったのに対し、１０μｇ／ｍＬのＥＨは細胞のメラニン生成を顕著に抑制可能であった（７２．６４±２．７９）。
【0089】
環境投薬方式でＥＨの美白活性を評価した。ゼブラフィッシュの胚本体に薬物を投与してから４８時間後に、仔魚の魚体色素を撮影して色素斑を定量分析した。結果は図３に示す通りとなった。コントロール群が１００±６．０６％であり、ポジティブコントロール群のアルブチン及びＰＴＵがいずれも魚体色素を顕著に抑制した（９．８６±１．４０％、３．０８±０．６２％）のに対し、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ及び２００μｇ／ｍＬのＥＨは魚体色素を顕著に抑制可能であった（７８．６１±７．６８％、７０．１２±８．６２％、６３．６４±８．５０％）。
【0090】
（２）ＥＨの抗炎症効果
ＥＨが炎症反応を抑制する効果を有するか否かを検査した。Ｒａｗ２６４．７細胞にＬＰＳを加えて炎症反応を誘発し、濃度２０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬのＥＨを加えて共に１６時間培養した。その後、ウエスタンブロッティングによって炎症性タンパク質ｉＮＯＳ及びＣＯＸ－２の発現量を検出した。結果は図４に示す通りとなった。コントロール群についてはＬＰＳで炎症反応を誘発しなかったため、ｉＮＯＳの発現量は１．０４±０．１５％であった。これに対し、ＬＰＳ群のｉＮＯＳ発現量は１００．００±１０．７４％であった。一方、濃度１０μＭのデキサメタゾン（Ｄｅｘ）をポジティブコントロール群としたところ、この群のｉＮＯＳ発現量は著しく低下した（１４．７８±０．９２％）。また、１００μｇ／ｍＬのＥＨはｉＮＯＳの発現量を顕著に抑制可能であった（６５．９５±１．９５％）。
ＥＨが炎症反応を抑制する効果を有するか否かを検査した。Ｒａｗ２６４．７細胞にＬＰＳを加えて炎症反応を誘発し、濃度２０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬのＥＨを加えて共に１６時間培養した。その後、ウエスタンブロッティングによって炎症性タンパク質ｉＮＯＳ及びＣＯＸ－２の発現量を検出した。結果は図４に示す通りとなった。コントロール群についてはＬＰＳで炎症反応を誘発しなかったため、ｉＮＯＳの発現量は１．０４±０．１５％であった。これに対し、ＬＰＳ群のｉＮＯＳ発現量は１００．００±１０．７４％であった。一方、濃度１０μＭのデキサメタゾン（Ｄｅｘ）をポジティブコントロール群としたところ、この群のｉＮＯＳ発現量は著しく低下した（１４．７８±０．９２％）。また、１００μｇ／ｍＬのＥＨはｉＮＯＳの発現量を顕著に抑制可能であった（６５．９５±１．９５％）。
【0091】
図５に示すように、コントロール群についてはＬＰＳで炎症反応を誘発しなかったため、ＣＯＸ－２の発現量は４．６５±３．１２％であった。これに対し、ＬＰＳ群のＣＯＸ－２の発現量は１００．００±０．９９％であった。一方、濃度１０μＭのデキサメタゾン（Ｄｅｘ）をポジティブコントロール群としたところ、ＣＯＸ－２の発現量が顕著に抑制された（２．９０±０．７１％）。また、２０～１００μｇ／ｍＬのＥＨはＣＯＸ－２を顕著に抑制可能であり、発現量がそれぞれ６８．５５±０．４６％、３５．４３±９．５５％及び７２．７７±７．８１％となった。
【0092】
（３）アトピー性皮膚炎に対するＥＨの治療効果
マウスのＤＮＣＢ誘発アトピー性皮膚炎（ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ，ＡＤ）の症状には、紅斑、浮腫、表皮剥離、乾燥及び苔癬化等の現象が含まれた。マウスに明らかな紅斑、浮腫、表皮剥離及び乾燥等の症状が現れたあと、ＥＨ又はクリサボロール（ｃｒｉｓａｂｏｒｏｌｅ，Ｃｒｉ）を毎日塗布し、ＥＨがＡＤの治療効果を有するか否かをテストした。図６Ａに示すように、マウスの皮膚外観の症状を観察及び撮影・記録するとともに、図６Ｂに示すように、臨床皮膚炎スコアでＥＨの治療効果を定量化した。
マウスのＤＮＣＢ誘発アトピー性皮膚炎（ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ，ＡＤ）の症状には、紅斑、浮腫、表皮剥離、乾燥及び苔癬化等の現象が含まれた。マウスに明らかな紅斑、浮腫、表皮剥離及び乾燥等の症状が現れたあと、ＥＨ又はクリサボロール（ｃｒｉｓａｂｏｒｏｌｅ，Ｃｒｉ）を毎日塗布し、ＥＨがＡＤの治療効果を有するか否かをテストした。図６Ａに示すように、マウスの皮膚外観の症状を観察及び撮影・記録するとともに、図６Ｂに示すように、臨床皮膚炎スコアでＥＨの治療効果を定量化した。
【0093】
コントロール群は、被毛が少ないために皮膚表面が乾燥しており、点数は０．７５±０．２５となった。ＡＤ群及びＡＤＶ群の皮膚表面は角質細胞が増殖し、分厚いかさぶたが形成された。日を追うごとに一部のかさぶたは剥離し、誘発周囲の皮膚の乾燥が観察された。また、皮膚には皺が見られた。且つ、炎症によって、皮膚に紅斑及び浮腫が現れた。しかし、角質細胞が増殖を続けたことで、皮膚表面にはかさぶたも存在していた。これら２つの群の臨床皮膚炎スコアはコントロール群に比べて著しく上昇し、それぞれ、９．１７±０．４０及び９．５０±０．５６となった。これに対し、日を追うごとに、ＥＨ及びクリサボロールを塗布した群は、かさぶたの剥離後に、乾燥、紅斑及び浮腫が観察されたものの、角質細胞の増殖度合はＡＤ群よりも軽微とみられた。そのため、動物の殺処分前に、ＥＨＬ群及びＥＨＨ群の皮膚炎スコアは著しく低下した（４．５０±０．５０及び３．６７±０．６７）。一方、Ｃｒｉ群の皮膚炎スコアは４．８０±０．３７であり、ＡＤ群に対し統計的に有意であった。上記の結果は、ＥＨがＡＤ症状の緩和効果を有することを示している。
【0094】
ＩｇＥは、アトピー性皮膚炎の臨床診断指標の１つである。マウスの殺処分前に、血清を採取してＩｇＥの含有量を測定したところ、結果は図７に示す通りとなった。コントロール群の血清中ＩｇＥ含有量は１．７１±０．１４μｇ／ｍＬであった。また、ＡＤ群及びＡＤＶ群のＩｇＥ濃度は明らかに上昇していた（６８．８９±４．１２μｇ／ｍＬ及び６８．９５±２．６０μｇ／ｍＬ）。これに対し、ＥＨＬ群及びＥＨＨ群のＩｇＥ含有量は、５２．３２±３．４１μｇ／ｍＬ及び４６．３１±３．８１μｇ／ｍＬまで著しく低下した。一方、Ｃｒｉ群の血清ＩｇＥ含有量は、６５．６１±１．７４μｇ／ｍＬまで低下した。アトピー性皮膚炎に伴って上昇した血清中ＩｇＥは、ＥＨを塗布することで低下させることができた。
【0095】
炎症又は免疫関連の疾患が発生した場合には、リンパ節及び脾臓が腫大（ｓｗｅｌｌ）する。そのため、マウスを殺処分する際にこれら２つの器官を採取して撮影し、重量を計測した。脾臓重量の結果は図８に示す通りとなった。コントロール群の脾臓重量は９１．０８±３．６１ｍｇであった。また、ＡＤ群及びＡＤＶ群の脾臓は明らかに腫大し、コントロール群の２．５倍となった（２３４．４６±６．５６ｍｇ及び２２１．１４±１３．３２ｍｇ）。これに対し、ＥＨＬ群及びＥＨＨ群の脾臓重量は著しく低下した（１６１．２３±９．９７ｍｇ及び１７１．０７±５．５８ｍｇ）。一方、Ｃｒｉ群の脾臓重量は著しく低下し、１６７．４６±１０．６１ｍｇとなった。
【0096】
リンパ節の総重量の結果は図９に示す通りとなった。コントロール群の２つのリンパ節の総重量は４．４６±０．２９ｍｇであった。また、ＡＤ群及びＡＤＶ群のリンパ節は明らかに腫大し、コントロール群の３倍となった（１２．０７±０．３３ｍｇ及び１１．６１±０．５４ｍｇ）。これに対し、ＥＨＬ群及びＥＨＨ群のリンパ節重量は著しく低下した（９．０６±０．５４ｍｇ及び９．１３±０．７５ｍｇ）。一方、Ｃｒｉ群のリンパ節重量は著しく低下し、９．４９±０．８１ｍｇとなった。以上の結果より、アトピー性皮膚炎による炎症又は免疫反応に伴って腫大したリンパ節及び脾臓は、ＥＨを塗布することで上記のような現象を抑制可能であった。
【0097】
本発明は、本文中で具体的に開示していない要件又は制限の下で実施可能であることを適切に記載している。記載のために使用した用語は制限を意図していない。これらの用語及びそれ以外の何らかの同等物を使用した表現及び記載に違いはないが、本発明における権利には修正の可能性があると認識すべきである。そのため、本発明では実施例及びその他の状況について説明したが、本文中で開示した内容は当業者によって補足及び変形可能であり、且つ、このような修正及び変形は本発明の権利範囲内であるとみなされる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
