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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-11-27
(45)【発行日】2023-12-05
(54)【発明の名称】ペプチド、及び苦味付与剤
(51)【国際特許分類】
C07K 7/06 20060101AFI20231128BHJP
A23L 27/21 20160101ALI20231128BHJP
C07K 5/103 20060101ALI20231128BHJP
【ＦＩ】
C07K7/06
A23L27/21 B
C07K5/103 ZNA
【請求項の数】
2
(21)【出願番号】P 2020049286
(22)【出願日】2020-03-19
(65)【公開番号】P2021147354
(43)【公開日】2021-09-27
【審査請求日】2023-01-16
(73)【特許権者】
【識別番号】000157887
【氏名又は名称】ＫＩＳＣＯ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100106002
【弁理士】
【氏名又は名称】正林 真之
(74)【代理人】
【識別番号】100120891
【弁理士】
【氏名又は名称】林 一好
(72)【発明者】
【氏名】上前 健太朗
(72)【発明者】
【氏名】寺西 弘志
【審査官】長谷川 強
(56)【参考文献】
【文献】特開平７－６９９２２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開平８－２３１５８８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００６－５２０８０９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００４－３５７５９６（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１１／１２８９５３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１３／０１１７６０（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ ７／０６
Ａ２３Ｌ ２７／２１
Ｃ０７Ｋ ５／１０３
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１、配列番号２、又は配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる、ペプチド。
【請求項2】
請求項１に記載のペプチドからなる、苦味付与剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ペプチド、及び苦味付与剤に関する。
【背景技術】
【0002】
ゴマペプチドは、ゴマから抽出されるタンパク質の酵素分解物であり、血圧降下作用等を有することが知られる（例えば、特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【文献】特開平８－２３１５８８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
他方で、新規なゴマペプチドの探索や、ゴマペプチドが有し得る上記以外の作用について研究が進められている。
【0005】
本発明は、上記の状況に鑑みてなされたものであり、新規なゴマペプチドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者らは、所定の配列からなる新規なゴマペプチドを見出し、本発明を完成するに至った。具体的には、本発明は以下のものを提供する。
【0007】
（１） 配列番号１、配列番号２、又は配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる、ペプチド。
【0008】
（２） （１）に記載のペプチドからなる、苦味付与剤。
【発明の効果】
【0009】
本発明によれば、新規なゴマペプチドが提供される。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【発明を実施するための形態】
【0011】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施形態に限定されない。
【0012】
＜本発明のペプチド＞
本発明のペプチドは、下記の配列番号１～３のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドである。なお、以下、アミノ酸配列は、Ｎ末端を左端に置き、Ｎ末端からＣ末端にかけて記載する。
配列番号１：ＶＩＲＡＭＰ
配列番号２：ＦＮＶＰＱＥＴ
配列番号３：ＩＬＫＹ
本発明のペプチドは、下記の配列番号１～３のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドである。なお、以下、アミノ酸配列は、Ｎ末端を左端に置き、Ｎ末端からＣ末端にかけて記載する。
配列番号１：ＶＩＲＡＭＰ
配列番号２：ＦＮＶＰＱＥＴ
配列番号３：ＩＬＫＹ
【0013】
本発明者らは、ゴマペプチドの酵素（特に、サーモライシン）分解物について検討した結果、飲食品等への苦味付与効果を示すペプチドとして、上記の新規なゴマペプチドを発見した。
【0014】
本発明において「苦味付与」とは、本発明のペプチドを配合する対象（飲食品等）に対して、本発明のペプチドに由来する苦味を付与したり、対象が有する苦味を向上又は強化させたりできることを意味する。
本発明のペプチドを配合する対象が苦味を有しないものである場合（乳製品、飲料（ジュース等）、調味料、パン、菓子、デザート類（甘味料を含む飲食品等）、介護食等）、本発明のペプチドを配合することで該対象に苦味を付与し、嗜好性を高めることができる。
本発明のペプチドを配合する対象が苦味を有するものである場合（茶飲料、酒類（ビール、日本酒等）、栄養ドリンク、コーヒー、苦味香辛料等）、本発明のペプチドを配合することで、該対象が有する苦味を強化し、嗜好性を高めることができる。
本発明のペプチドを配合する対象が苦味を有しないものである場合（乳製品、飲料（ジュース等）、調味料、パン、菓子、デザート類（甘味料を含む飲食品等）、介護食等）、本発明のペプチドを配合することで該対象に苦味を付与し、嗜好性を高めることができる。
本発明のペプチドを配合する対象が苦味を有するものである場合（茶飲料、酒類（ビール、日本酒等）、栄養ドリンク、コーヒー、苦味香辛料等）、本発明のペプチドを配合することで、該対象が有する苦味を強化し、嗜好性を高めることができる。
【0015】
本発明によって奏される苦味は、実施例に示した官能評価によって、その有無や程度を特定できる。
【0016】
（本発明のペプチドの製造方法）
本発明のペプチドは、植物タンパク質（ゴマタンパク質等）の加水分解や、化学合成等によって得られる。
本発明のペプチドは、植物タンパク質（ゴマタンパク質等）の加水分解や、化学合成等によって得られる。
【0017】
植物タンパク質の原料としては、タンパク質を含む植物組織（種子等）であれば特に限定されないが、ゴマ、穀類（米、小麦、大麦、オート麦、トウモロコシ等）、豆類（インゲン、ソラマメ、大豆、緑豆等）等が挙げられる。
上記のうち、本発明のペプチドが得られやすいという観点から、植物タンパク質の原料としては、ゴマが好ましい。
上記のうち、本発明のペプチドが得られやすいという観点から、植物タンパク質の原料としては、ゴマが好ましい。
【0018】
植物タンパク質は、原料の種類等に応じ、従来知られる方法で抽出できる。例えば、破砕、脱脂、加熱、溶媒への溶解等を経て、原料から植物タンパク質を得ることができる。
【0019】
植物タンパク質の加水分解の方法としては、加水分解酵素を用いた方法、強酸又は強塩基を用いた方法等が挙げられる。
【0020】
加水分解酵素を用いた方法においては、任意の生物（動物、植物、微生物等）由来の加水分解酵素を使用できる。例えば、好ましい加水分解酵素として、サーモライシン等が挙げられる。
【0021】
加水分解酵素を用いた加水分解の条件としては、特に限定されず、用いる酵素に応じて適切なｐＨ、温度、反応時間を設定できる。
【0022】
強酸を用いた方法においては、任意の強酸（塩酸、硝酸、硫酸等）を使用できる。
【0023】
強塩基を用いた方法においては、任意の強塩基（アルカリ金属水酸化物（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム等）、アルカリ金属炭酸塩（炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等）、アルカリ金属炭酸水素塩（炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム等）等）を使用できる。
【0024】
加水分解の条件としては、特に限定されず、用いる酵素、強酸又は強塩基に応じて適切なｐＨ、反応温度、反応時間を設定できる。
【0025】
加水分解後、得られた反応液から、本発明のペプチドを任意の方法によって精製してもよい。精製方法としては、各種クロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー、逆相液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等）を用いた方法が挙げられる。
あるいは、加水分解後、得られた反応液を、本発明のペプチドを含む分解産物として精製せずにそのまま任意の用途に用いてもよい。
あるいは、加水分解後、得られた反応液を、本発明のペプチドを含む分解産物として精製せずにそのまま任意の用途に用いてもよい。
【0026】
化学合成の方法としては、特に限定されないが、ペプチド合成に通常用いられる方法である液相法又は固相法のいずれであってもよい。具体的には、Ｆｍｏｃ法、Ｂｏｃ法等が挙げられる。
【0027】
化学合成されたペプチドは、精製してもよい。精製方法としては、各種クロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー、逆相液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等）を用いた方法が挙げられる。
【0028】
各種方法によって得られたペプチドのアミノ酸配列は、ＧＣ－ＭＳ等で分析できる。
【0029】
（本発明のペプチドの形態）
本発明のペプチドは、任意の形態（固体、液体等）に調製できる。例えば、本発明のペプチドは乾燥物として調製してもよいし、溶媒（水等）に溶解させて溶液として調製してもよい。
本発明のペプチドは、任意の形態（固体、液体等）に調製できる。例えば、本発明のペプチドは乾燥物として調製してもよいし、溶媒（水等）に溶解させて溶液として調製してもよい。
【0030】
＜苦味付与剤＞
本発明のペプチドは、上記のとおり、本発明のペプチドを配合する対象に対して、苦味を付与したり、苦味を向上させたりすることができる。したがって、本発明のペプチドは、苦味付与剤として好ましく用いることができる。
本発明のペプチドは、上記のとおり、本発明のペプチドを配合する対象に対して、苦味を付与したり、苦味を向上させたりすることができる。したがって、本発明のペプチドは、苦味付与剤として好ましく用いることができる。
【0031】
本発明のペプチドを配合する対象としては、苦味の付与を要する任意の対象であり得る。本発明のペプチドを配合する対象は、例えば、飲食品、医薬品等であってもよい。本発明のペプチドを配合する対象は苦味を有するものであってもよく、苦味を有さないものであってもよい。
【0032】
本発明のペプチドを配合できる飲食品としては、特に限定されないが、任意の形態のもの（固体、液体、ゲル、ゼリー等）であってもよい。
例えば、飲料類（茶飲料（緑茶、紅茶、烏龍茶）、コーヒー、ジュース、乳飲料、スポーツ飲料、アルコール飲料等）、デザート類、菓子類、パン類、調味料類、介護食、等が挙げられる。
例えば、飲料類（茶飲料（緑茶、紅茶、烏龍茶）、コーヒー、ジュース、乳飲料、スポーツ飲料、アルコール飲料等）、デザート類、菓子類、パン類、調味料類、介護食、等が挙げられる。
【0033】
本発明のペプチドを配合できる医薬品としては、特に限定されないが、任意の形態（粉末状、溶液状、懸濁液状等）の経口投与剤であってもよい。
【0034】
本発明のペプチドを配合する対象への、本発明のペプチドの配合量は特に限定されず、得ようとする苦味の程度等に応じて適宜設定できる。
例えば、本発明のペプチドを飲料類に配合する場合、良好な苦味を付与しやすいという観点から、飲料類全体に対して、本発明のペプチドを、好ましくは１．０×１０－５ｍｇ／ｍｌ以上、より好ましくは１．０×１０－４ｍｇ／ｍｌ以上配合してもよい。
また、本発明のペプチドを飲料類に配合する場合、その上限は過度でなくともよく、飲料類全体に対して、本発明のペプチドを、好ましくは１０ｍｇ／ｍｌ以下、より好ましくは１．０ｍｇ／ｍｌ以下配合してもよい。
例えば、本発明のペプチドを飲料類に配合する場合、良好な苦味を付与しやすいという観点から、飲料類全体に対して、本発明のペプチドを、好ましくは１．０×１０－５ｍｇ／ｍｌ以上、より好ましくは１．０×１０－４ｍｇ／ｍｌ以上配合してもよい。
また、本発明のペプチドを飲料類に配合する場合、その上限は過度でなくともよく、飲料類全体に対して、本発明のペプチドを、好ましくは１０ｍｇ／ｍｌ以下、より好ましくは１．０ｍｇ／ｍｌ以下配合してもよい。
【0035】
本発明のペプチドは、任意のタイミングで対象に配合できる。
例えば、本発明のペプチドを、配合しようとする対象の材料とともに混合して対象を製造・成形してもよいし、配合しようとする対象を製造・成形した後に本発明のペプチドを添加（対象の表面にふりかける等）してもよい。
例えば、本発明のペプチドを、配合しようとする対象の材料とともに混合して対象を製造・成形してもよいし、配合しようとする対象を製造・成形した後に本発明のペプチドを添加（対象の表面にふりかける等）してもよい。
【実施例】
【0036】
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【0037】
＜ゴマタンパク質の作製＞
液体窒素にて凍結破砕されたゴマ１００ｍｇを、ＳＤＳサンプルバッファー（１ｍｌ）に溶解させた。得られた溶液を１５，０００ｒｐｍ、４℃で、５分間遠心分離後、その上清を、種々のゴマタンパク質を含む溶液として回収した。
液体窒素にて凍結破砕されたゴマ１００ｍｇを、ＳＤＳサンプルバッファー（１ｍｌ）に溶解させた。得られた溶液を１５，０００ｒｐｍ、４℃で、５分間遠心分離後、その上清を、種々のゴマタンパク質を含む溶液として回収した。
【0038】
＜ゴマペプチド由来の短ペプチドの作製＞
上記で得られたゴマタンパク質を酵素（サーモライシン）で加水分解した。得られた加水分解物（種々のペプチドの混合物）に対して、液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）によるショットガン解析を行い、該加水分解物に含まれるペプチドを網羅的に同定した。その同定結果に基づき、検出強度等の情報から、加水分解物中に相対的に多く含まれる候補ペプチドを選択した。
次いで、これらの候補ペプチドが加水分解物中に含まれる量を、逆相カラムを使用したＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（使用装置「ＡＰＩ４０００」、ＡＢＳｃｉｅｘ社製）で特定し、上記加水分解産物には、下記の６種類のペプチド（ゴマペプチド由来の短ペプチド）が実際に含まれることを特定した。
（ペプチド１）配列番号１で表されるアミノ酸配列（ＶＩＲＡＭＰ）からなるペプチド
（ペプチド２）配列番号２で表されるアミノ酸配列（ＦＮＶＰＱＥＴ）からなるペプチド
（ペプチド３）配列番号３で表されるアミノ酸配列（ＩＬＫＹ）からなるペプチド
（ペプチド４）配列番号４で表されるアミノ酸配列（ＶＩＹ）からなるペプチド
（ペプチド５）配列番号５で表されるアミノ酸配列（ＩＶＹ）からなるペプチド
（ペプチド６）配列番号６で表されるアミノ酸配列（ＭＬＰＡＹ）からなるペプチド
上記で得られたゴマタンパク質を酵素（サーモライシン）で加水分解した。得られた加水分解物（種々のペプチドの混合物）に対して、液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）によるショットガン解析を行い、該加水分解物に含まれるペプチドを網羅的に同定した。その同定結果に基づき、検出強度等の情報から、加水分解物中に相対的に多く含まれる候補ペプチドを選択した。
次いで、これらの候補ペプチドが加水分解物中に含まれる量を、逆相カラムを使用したＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（使用装置「ＡＰＩ４０００」、ＡＢＳｃｉｅｘ社製）で特定し、上記加水分解産物には、下記の６種類のペプチド（ゴマペプチド由来の短ペプチド）が実際に含まれることを特定した。
（ペプチド１）配列番号１で表されるアミノ酸配列（ＶＩＲＡＭＰ）からなるペプチド
（ペプチド２）配列番号２で表されるアミノ酸配列（ＦＮＶＰＱＥＴ）からなるペプチド
（ペプチド３）配列番号３で表されるアミノ酸配列（ＩＬＫＹ）からなるペプチド
（ペプチド４）配列番号４で表されるアミノ酸配列（ＶＩＹ）からなるペプチド
（ペプチド５）配列番号５で表されるアミノ酸配列（ＩＶＹ）からなるペプチド
（ペプチド６）配列番号６で表されるアミノ酸配列（ＭＬＰＡＹ）からなるペプチド
【0039】
酵素によって加水分解される前の主要なゴマタンパク質（１１Ｓ ｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｅｅｄ ｓｔｏｒａｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ２ （１１ＳＧ））の全長配列（配列番号７）を表１に示す。全長配列中、ペプチド１、２、３、５についてはそれぞれに対応する部分に下線を付した。なお、ＶＩＹやＭＬＰＡＹは他の種類のゴマタンパク質に含まれている。
【0040】
【表1】
【0041】
＜ゴマペプチド由来の短ペプチドの官能評価＞
上記で得られたゴマペプチド由来の短ペプチド、及び、ゴマペプチドを下記の官能評価に供した。
上記で得られたゴマペプチド由来の短ペプチド、及び、ゴマペプチドを下記の官能評価に供した。
【0042】
（ペプチド試料の調製）
各ペプチドを純水に溶解させ、ペプチド試料を調製した。なお、対照試料としてアルギニン（苦味の強いアミノ酸として知られる。）を純水に溶解させたアルギニン試料も調製した。なお、各試料の濃度は下記のとおりである。
（試料Ａ）アルギニン：１ｍｇ／ｍｌ
（試料Ｂ）アルギニン：１０ｍｇ／ｍｌ
（試料Ｃ）ペプチド１（ＶＩＲＡＭＰ）：１ｍｇ／ｍｌ
（試料Ｄ）ペプチド２（ＦＮＶＰＱＥＴ）：１ｍｇ／ｍｌ
（試料Ｅ）ペプチド３（ＩＬＫＹ）：１ｍｇ／ｍｌ
（試料Ｆ）ペプチド４（ＶＩＹ）：１ｍｇ／ｍｌ
（試料Ｇ）ペプチド５（ＩＶＹ）：１ｍｇ／ｍｌ
（試料Ｈ）ペプチド６（ＭＬＰＡＹ）：１ｍｇ／ｍｌ
（試料Ｉ）ゴマペプチド：１ｍｇ／ｍｌ
（試料Ｊ）ゴマペプチド：１０ｍｇ／ｍｌ
各ペプチドを純水に溶解させ、ペプチド試料を調製した。なお、対照試料としてアルギニン（苦味の強いアミノ酸として知られる。）を純水に溶解させたアルギニン試料も調製した。なお、各試料の濃度は下記のとおりである。
（試料Ａ）アルギニン：１ｍｇ／ｍｌ
（試料Ｂ）アルギニン：１０ｍｇ／ｍｌ
（試料Ｃ）ペプチド１（ＶＩＲＡＭＰ）：１ｍｇ／ｍｌ
（試料Ｄ）ペプチド２（ＦＮＶＰＱＥＴ）：１ｍｇ／ｍｌ
（試料Ｅ）ペプチド３（ＩＬＫＹ）：１ｍｇ／ｍｌ
（試料Ｆ）ペプチド４（ＶＩＹ）：１ｍｇ／ｍｌ
（試料Ｇ）ペプチド５（ＩＶＹ）：１ｍｇ／ｍｌ
（試料Ｈ）ペプチド６（ＭＬＰＡＹ）：１ｍｇ／ｍｌ
（試料Ｉ）ゴマペプチド：１ｍｇ／ｍｌ
（試料Ｊ）ゴマペプチド：１０ｍｇ／ｍｌ
【0043】
（官能評価）
１５名のパネルによって、各試料の苦味、渋味、辛味、生臭さ、及び悪臭を評価した。評価基準は以下のとおりである。
１５名のパネルによって、各試料の苦味、渋味、辛味、生臭さ、及び悪臭を評価した。評価基準は以下のとおりである。
【0044】
［苦味の評価基準］
試料Ａ（アルギニン：１ｍｇ／ｍｌ）の結果を「３」とした場合の、５段階の相対評価として評価した。数字が高いほど苦味が強いことを意味する。
試料Ａ（アルギニン：１ｍｇ／ｍｌ）の結果を「３」とした場合の、５段階の相対評価として評価した。数字が高いほど苦味が強いことを意味する。
【0045】
［苦味以外の評価基準］
渋味、辛味、生臭さ、及び悪臭の強さを５段階評価した。数字が高いほど渋味等が強いことを意味する。
渋味、辛味、生臭さ、及び悪臭の強さを５段階評価した。数字が高いほど渋味等が強いことを意味する。
【0046】
（結果）
各評価項目に関する結果の平均値を図１及び２に示す。図１は苦味の評価結果であり、図２は辛味の評価結果である。なお、統計処理は一元配置分散分析によって行った（＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５）。
各評価項目に関する結果の平均値を図１及び２に示す。図１は苦味の評価結果であり、図２は辛味の評価結果である。なお、統計処理は一元配置分散分析によって行った（＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５）。
【0047】
図１に示されるとおり、試料Ｃ、Ｄ、Ｅ（いずれも本発明のペプチドを含む）は、いずれもアルギニンと同等の苦味を有していた。これらの試料の苦味は、ゴマペプチドよりも高い傾向にあった。他方で、試料Ｆ、Ｇ、Ｈは、試料Ｃ、Ｄ、Ｅ同様にゴマペプチド由来の短ペプチドを含むにもかかわらず、苦味がほぼ認められなかった。
【0048】
図２に示されるとおり、いずれのゴマペプチド由来の短ペプチドも、辛味の強さにおいて違いがほぼ認められなかった。図を示していないが、辛味以外（渋味、生臭さ、及び悪臭）の評価結果も、辛味同様の結果であった。
【0049】
以上から、本発明のペプチドは、強い苦味を呈し、嗜好性の高い食品素材等として利用できることがわかった。
【0050】
＜参考試験：ゴマペプチド由来の短ペプチドのアンジオテンシン変換酵素阻害活性評価＞
上記で得られた様々なゴマペプチドの酵素分解物（上記ペプチド１～３、５を含む）のそれぞれについて、アンジオテンシン変換酵素阻害活性（以下、「ＡＣＥ阻害活性」）を評価した。
上記で得られた様々なゴマペプチドの酵素分解物（上記ペプチド１～３、５を含む）のそれぞれについて、アンジオテンシン変換酵素阻害活性（以下、「ＡＣＥ阻害活性」）を評価した。
【0051】
（ＡＣＥ阻害活性の測定）
本発明におけるＡＣＥ阻害活性（ＩＣ５０）の測定において使用した試薬、及び測定方法は以下のとおりである。
本発明におけるＡＣＥ阻害活性（ＩＣ５０）の測定において使用した試薬、及び測定方法は以下のとおりである。
【0052】
［使用試薬］
ＡＣＥ阻害性活性測定キット、商品名「ＡＣＥ Ｋｉｔ－ＷＳＴ（Ｃｏｄｅ：Ａ５０２）」、同仁化学研究所製
該キットは、「Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ」、「Ｅｎｚｙｍｅ Ａ」、「Ｅｎｚｙｍｅ Ｂ」、「Ｅｎｚｙｍｅ Ｃ」、「Ｃｏｅｎｚｙｍｅ」、「Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ」を含む。
ＡＣＥ阻害性活性測定キット、商品名「ＡＣＥ Ｋｉｔ－ＷＳＴ（Ｃｏｄｅ：Ａ５０２）」、同仁化学研究所製
該キットは、「Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ」、「Ｅｎｚｙｍｅ Ａ」、「Ｅｎｚｙｍｅ Ｂ」、「Ｅｎｚｙｍｅ Ｃ」、「Ｃｏｅｎｚｙｍｅ」、「Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ」を含む。
【0053】
取扱説明書に基づき、以下の試薬を調製した。
（１）「Ｅｎｚｙｍｅ ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ」
「Ｅｎｚｙｍｅ Ｂ」にシリンジで滅菌水２ｍｌを加えて「Ｅｎｚｙｍｅ Ｂ」溶液を調製した。次いで、「Ｅｎｚｙｍｅ Ａ」に「Ｅｎｚｙｍｅ Ｂ」溶液１．５ｍｌを加えて、「Ｅｎｚｙｍｅ ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ」を調製した。
（２）「Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ」
「Ｅｎｚｙｍｅ Ｃ」及び「Ｃｏｅｎｚｙｍｅ」のそれぞれにシリンジで滅菌水３ｍｌを加えて「Ｅｎｚｙｍｅ Ｃ」溶液及び「Ｃｏｅｎｚｙｍｅ」溶液を調製した。次いで、「Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ」に、「Ｅｎｚｙｍｅ Ｃ」溶液、及び「Ｃｏｅｎｚｙｍｅ」溶液を２．８ｍｌずつ加えて、「Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ」を調製した。
（１）「Ｅｎｚｙｍｅ ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ」
「Ｅｎｚｙｍｅ Ｂ」にシリンジで滅菌水２ｍｌを加えて「Ｅｎｚｙｍｅ Ｂ」溶液を調製した。次いで、「Ｅｎｚｙｍｅ Ａ」に「Ｅｎｚｙｍｅ Ｂ」溶液１．５ｍｌを加えて、「Ｅｎｚｙｍｅ ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ」を調製した。
（２）「Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ」
「Ｅｎｚｙｍｅ Ｃ」及び「Ｃｏｅｎｚｙｍｅ」のそれぞれにシリンジで滅菌水３ｍｌを加えて「Ｅｎｚｙｍｅ Ｃ」溶液及び「Ｃｏｅｎｚｙｍｅ」溶液を調製した。次いで、「Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ」に、「Ｅｎｚｙｍｅ Ｃ」溶液、及び「Ｃｏｅｎｚｙｍｅ」溶液を２．８ｍｌずつ加えて、「Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ」を調製した。
【0054】
［測定方法］
以下の方法で、下記３種の試料のそれぞれについてＡＣＥ阻害活性（ＩＣ５０）を算出した。
「ｓａｍｐｌｅ」：各ペプチド試料を含む溶液
「ｂｌａｎｋ １」：「Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ」を含む溶液（各ペプチド試料を含まない）
「ｂｌａｎｋ ２」：滅菌水（各ペプチド試料及び「Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ」を含まない）
以下の方法で、下記３種の試料のそれぞれについてＡＣＥ阻害活性（ＩＣ５０）を算出した。
「ｓａｍｐｌｅ」：各ペプチド試料を含む溶液
「ｂｌａｎｋ １」：「Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ」を含む溶液（各ペプチド試料を含まない）
「ｂｌａｎｋ ２」：滅菌水（各ペプチド試料及び「Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ」を含まない）
【0055】
微量遠心管に、各ペプチド溶液、又は滅菌水を２０μｌずつ入れた後、さらに、「Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ」を２０μｌずつ加えた。なお、この際に、「ｂｌａｎｋ ２」には「Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ」の代わりに滅菌水を２０μｌずつ加えた。
次いで、各ペプチド溶液、及び「ｂｌａｎｋ １」に、「Ｅｎｚｙｍｅ ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ」を２０μｌずつ加え、３７℃で６０分間インキュベートした。
インキュベート後、各微量遠心管に、「Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ」を２００μｌずつ加え、室温で１０分間インキュベートした。
「Ｅｎｚｙｍｅ ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ」によって、３－Ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｙｌ－ＧｌｙＧｌｙ－Ｇｌｙ（３ＨＢ－ＧＧＧ）から生じた３－Ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ（３ＨＢ）量を、４５０ｎｍの吸光度で測定した。測定結果に基づき、以下の式により各試料の阻害率を求め、ＡＣＥ阻害活性（ＩＣ５０）を算出した。
ＡＣＥ阻害活性値（阻害率）（％）＝［（「ｂｌａｎｋ １」－「ｓａｍｐｌｅ」）／（「ｂｌａｎｋ １」－「ｂｌａｎｋ ２」）］×１００
次いで、各ペプチド溶液、及び「ｂｌａｎｋ １」に、「Ｅｎｚｙｍｅ ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ」を２０μｌずつ加え、３７℃で６０分間インキュベートした。
インキュベート後、各微量遠心管に、「Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ」を２００μｌずつ加え、室温で１０分間インキュベートした。
「Ｅｎｚｙｍｅ ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ」によって、３－Ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｙｌ－ＧｌｙＧｌｙ－Ｇｌｙ（３ＨＢ－ＧＧＧ）から生じた３－Ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ（３ＨＢ）量を、４５０ｎｍの吸光度で測定した。測定結果に基づき、以下の式により各試料の阻害率を求め、ＡＣＥ阻害活性（ＩＣ５０）を算出した。
ＡＣＥ阻害活性値（阻害率）（％）＝［（「ｂｌａｎｋ １」－「ｓａｍｐｌｅ」）／（「ｂｌａｎｋ １」－「ｂｌａｎｋ ２」）］×１００
【0056】
（結果）
各ペプチドのＡＣＥ阻害活性（ＩＣ５０）を表２に示す。表２に示されるとおり、本発明のペプチド（上記ペプチド１～３）は、いずれもアンジオテンシン変換酵素阻害活性を有することを確認した。したがって、本発明のペプチドは、血圧降下作用を有することがわかった。
各ペプチドのＡＣＥ阻害活性（ＩＣ５０）を表２に示す。表２に示されるとおり、本発明のペプチド（上記ペプチド１～３）は、いずれもアンジオテンシン変換酵素阻害活性を有することを確認した。したがって、本発明のペプチドは、血圧降下作用を有することがわかった。
【0057】
【表2】
【図1】
【図2】
【配列表】