特許 7391980 乳がんのバイオマーカとしてのＢＭＭＦ１ ＲＥＰタンパク質の使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-11-27

(45)【発行日】2023-12-05

(54)【発明の名称】乳がんのバイオマーカとしてのＢＭＭＦ１ ＲＥＰタンパク質の使用

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/574 20060101AFI20231128BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20231128BHJP

   C12Q 1/04 20060101ALI20231128BHJP

   C07K 14/47 20060101ALN20231128BHJP

【ＦＩ】

G01N33/574 A

C12N15/12 ZNA

C12Q1/04

C07K14/47

【請求項の数】 5

(21)【出願番号】P 2021549295

(86)(22)【出願日】2020-02-21

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-04-08

(86)【国際出願番号】 EP2020054613

(87)【国際公開番号】W WO2020169796

(87)【国際公開日】2020-08-27

【審査請求日】2021-10-08

(31)【優先権主張番号】19158845.8

(32)【優先日】2019-02-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】512113803

【氏名又は名称】ドイチェス クレブスフォルシュンクスツェントルム

(74)【代理人】

【識別番号】110002697

【氏名又は名称】めぶき弁理士法人

(74)【代理人】

【識別番号】100110973

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷川 洋

(74)【代理人】

【識別番号】100116528

【弁理士】

【氏名又は名称】三宅 俊男

(72)【発明者】

【氏名】ブント， ティモ

(72)【発明者】

【氏名】ド ヴィリエ－ツア ハウゼン， エセル－ミシェル

(72)【発明者】

【氏名】ツア ハウゼン， ハラルド

(72)【発明者】

【氏名】エルンスト， クラウディア

(72)【発明者】

【氏名】テスマー， クラウディア

【審査官】西浦 昌哉

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１９／００８０５２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１６／００５０５４（ＷＯ，Ａ２）

【文献】EILEBRECHT, S. et al.，Expression and replication of virus-like circular DNA in human cells，SCIENTIFIC REPORTS，2018年02月12日，Vol.8/No.2851，p.1-15

【文献】YANG, J. et al.，The role of tumor-associated macrophages in breast carcinoma invasion and metastasis，INTERNATIONA JOURNAL OF CLINICAL AND EXPERIMENTAL PATHOLOGY，2015年06月15日，Vol.8/No. 6，p.6656-6664

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３３／４８－３３／９８

Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００

Ｃ０７Ｋ １／００－ ９／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

乳がんのバイオマーカとしての、ＭＳＢＩ１ゲノムにコードされたＲｅｐタンパク質（ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ）の使用。

【請求項2】

配列番号１のアミノ酸１～１３６、１３７～２２９及び２３０～３２４からなる群より選択されるアミノ酸配列内にあるエピトープに結合する抗Ｒｅｐ抗体によって、対象からの組織サンプル中の、ＭＳＢＩ１ゲノムにコードされたＲｅｐタンパク質（ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ）を検出するステップを含む、前記対象における乳がんの診断又は素因を提供するための方法。

【請求項3】

前記抗Ｒｅｐ抗体が、配列番号２又は配列番号３に含まれるエピトープに結合する、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

対象からの組織サンプルが、癌性乳房組織、癌性組織を取り囲む周囲組織及び（良性）過形成からなる群から選択される、請求項２又は３に記載の方法。

【請求項5】

さらに、ＣＤ６８陽性細胞が抗ＣＤ６８抗体によってサンプル中で検出される、請求項２～４のいずれかに記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、乳がんのバイオマーカとしてのＤＮＡ複製関連（Ｒｅｐ）タンパク質の使用に関する。

【背景技術】

【0002】

浸潤性乳がんは、欧米で最も多く診断されているがんであり、女性のがん死亡原因の第２位である。女性では約３人に１人が、男性でもそれよりもっと低い割合で、生涯のうちに乳がんの診断を受ける。近年、乳がん患者の死亡率はわずかに低下しているが、依然として非常に高い水準にある。これは主に、がんが発生した後に治癒することができないためである。乳がん患者の死亡率を下げるためには、乳がんを発症するリスクの高い患者を特定して治療することが必要である。したがって、前癌性乳房腫瘍を発症した被験者を含め、乳がん発症のリスクが高い患者を特定することは有利である。このため、浸潤性乳がんに発展する可能性のある前癌性腫瘍の生物学を理解し、リスクの高い前癌性乳がんを有する被験者を効果的に治療して乳がんの発生を防ぐことができれば有利である。

【0003】

浸潤性乳がんの発生には、多段階のプロセスがあることはよく知られている。動物実験やヒトの疫学的証拠から、終末期管小葉単位の幹細胞が増殖して過形成になり、次に原発性がんになり、その後、浸潤性乳がんになるという説がある。また、いくつかの後ろ向き及び前向きな臨床研究では、非癌性乳房腫瘍と診断された被験者のうち、異型過形成又は非異型過形成と診断された被験者は、乳がん発症のリスクが高いことが立証されている。以上のことから、組織学的及び疫学的証拠は、過形成病変が浸潤性乳がんを発症する可能性が著しく高い最も初期の前駆病変であることを示している。

【0004】

患者は通常、切除手術を受けた後、放射線療法、全身化学療法、及び／又は免疫療法を受けるが、治療法は腫瘍の巨視的特徴と腫瘍のステージに基づいて決定される。５年無再発生存率は、ここ数年で改善した患者もいれば、改善していない患者もいる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

マンモグラフィーの普及やスクリーニングプログラムの実施にもかかわらず、バイオマーカの予測ができないため、多くの患者が診断を遅らせている。早期発見のためには、乳がんの早期発見を可能にするバイオマーカが必要であり、また、乳がんの発症メカニズムを解明することが求められている。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本願では、本発明者らは、図１に示すような乳がん発症のモデルを作成した。

【0007】

本発明者らは、離乳期の母乳を牛乳製品で代用したり、乳製品や牛肉製品を摂取したりして、生後数ヶ月以内にＢＭＭＦ（牛肉及び牛乳因子）剤を摂取すると、一般的に新生児がＢＭＭＦ抗原に早期に感染することを発見した。母体の抗体（移行抗体）の減少と、しばしば観察される生後ごく初期の新生児の免疫寛容の誘導に関連した免疫系の弱さに基づき、これらの剤は免疫応答を直接逃れるか、又はこれらの剤に対する免疫寛容の状況が誘導されるかのいずれかであろう。その後数年から数十年のうちに、宿主の免疫系に依存して、乳房組織の間質内に蓄積するＢＭＭＦ抗原が増える。この蓄積はまた、ＢＭＭＦに対する受容体に相当する特定の分子の取り込みによって誘発され得る。これらの分子は牛の産物の消費によっても取り込まれ、宿主細胞表面の受容体に代謝される。感染の限局的拡散と共に、ＢＭＭＦの持続的な取り込みによって一定レベルの抗原量に到達すると、宿主免疫応答は慢性及び局所炎症の状態を誘導し、活性酸素種（ＲＯＳ）及びシクロオキシゲナーゼ－２（Ｃｏｘ－２）の安定した増加を生じ、これはＲＯＳによって誘導された周囲の細胞におけるランダムな突然変異の同時固定を伴う脱調節細胞増殖の確率を劇的に増加させる。特に、本質的に高い複製活性を有する細胞は、腫瘍形成及び乳がんの発症の基本的な要件として、突然変異の確率的発現を可能にするランダムなＤＮＡ突然変異を濃縮する標的を表す可能性がある。したがって、ＢＭＭＦは、組織間質内の慢性炎症の誘発の特定の局所的なトリガーを表し、ＲＯＳの増加を引き起こし、周囲の複製細胞の増殖と突然変異を誘発し、最終的には癌の前駆体としての過形成の形成をもたらす。

【0008】

詳しくは、腫瘍の病期が判明している乳がん患者７名の組織サンプルを選択し、マウスモノクローナル抗Ｒｅｐ抗体を用いてＩＨＣ染色を行った。すべての組織は、ＢＭＭＦ１ Ｒｅｐ標的に対して陽性と判定された。例示的に、抗Ｒｅｐ抗体（例えば、ｍＡｂ１０－３、ｍＡｂ３－６）による染色は、乳がん患者サンプル７Ｇ６ＭＪＸ及び１ＨＨＹ７Ｋ内の間質性腫瘍組織領域におけるタンパク質標的の特異的検出を示す（図２及び３）。一般的に、抗Ｒｅｐの検出では、主に間質内の細胞の細胞質領域にある小さなサイズの凝集体が強く染色された。さらに、抗Ｒｅｐで染色されたシグナルは、ＣＤ６８陽性のマクロファージと共局在していることが観察された。Ｒｅｐ特異的抗体が最も多く検出された領域は、ＣＤ６８陽性細胞の検出レベルが最も高い領域と相関しており、Ｒｅｐ特異的抗原が炎症組織領域に局在していることを示唆している。アイソタイプコントロール抗体を用いた対照染色では、シグナルは検出されなかった。一方、母乳小葉の壁を取り囲む上皮細胞では、有意な抗Ｒｅｐ染色パターンが観察され、細胞質内に凝集塊状の局在が認められた。これは、ＢＭＭＦの複製／増殖を可能にする組織領域であると考えられる。乳がんの場合、抗Ｒｅｐの染色パターンは特に腫瘍周囲に見られた（図５参照）。腫瘍そのものでは、染色パターンはあまり意味をなさなかった。

【0009】

これまでに、異なる試験材料（ウシ血清、乳、１つの多発性硬化症患者の剖検の脳組織）から、１８種の、異なるが部分的に関連するＤＮＡ分子のスペクトルが単離された（Ｆｕｎｋ，Ｇｕｎｓｔら、２０１４，Ｇｕｎｓｔ，ｚｕｒ Ｈａｕｓｅｎら、２０１４，Ｌａｍｂｅｒｔｏ，Ｇｕｎｓｔら、２０１４，Ｗｈｉｔｌｅｙ，Ｇｕｎｓｔら、２０１４；ＷＯ２０１５／０６２７２６Ａ２；ＷＯ２０１６／００５０５４Ａ２）。１８分離物を、それらの分子特性に従って、４つの異なるグループＢＭＭＦ１～ＢＭＭＦ４に分けた（ｚｕｒ Ｈａｕｓｅｎら、２０１７）。これらのグループのうち３つは、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）及びサイクロバクター属（Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ）プラスミドと顕著な程度の類似性を明らかにした。第４のグループは、ジェミサーキュラーウイルス（Ｇｅｍｙｃｉｒｕｌａｒｖｉｒｉｄａｅ）の代表的な３つの分離物を含んでいた。推定Ｒｅｐ遺伝子は、利用可能な配列とのインシリコ比較により得られたＢＭＭＦのＤＮＡ配列の一部として同定された。ｒｅｐ遺伝子において隣接するプライマーを使用する増幅はウシ血清からの完全及び部分環状ＤＮＡゲノムの単離を導いた（Ｆｕｎｋら、２０１４）。これは、特定の環状一本鎖ＤＮＡゲノムの存在について、市販の乳製品からのサンプルに拡張された。１４の異なる単離物（約１１００～３０００ヌクレオチド）の全長環状一本鎖ＤＮＡ分子をクローニングし、配列決定した（Ｗｈｉｔｌｅｙら、２０１４； Ｇｕｎｓｔら、２０１４；Ｆｕｎｋら、２０１４；Ｌａｍｂｅｒｔｏら、２０１４）。ヒト脳及び血清（すべて多発性硬化症患者由来）からさらに４つの分離物を得た（Ｗｈｉｔｌｅｙら、２０１４；Ｇｕｎｓｔら、２０１４；Ｌａｍｂｅｒｔｏら、２０１４）。

【0010】

これらの分離物の中で、伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）関連分離物Ｓｐｈｉｎｘ１．７６（１７５８ｂｐ；受入番号ＨＱ４４４４０４）に密接に関連する２つのＤＮＡ分子が、ＭＳ患者の脳組織から分離された。（Ｍａｎｕｅｌｉｄｉｓ Ｌ．２０１１））これらの分離物はＭＳＢＩ１．１７６（ＭＳＢＩ、多発性硬化症脳分離物）（１７６６ｂｐ）及びＭＳＢＩ２．１７６（１７６６ｂｐ）であり、それぞれ「ＭＳＢＩ１ゲノム」及び「ＭＳＢＩ２ゲノム」と命名された。ＭＳＢＩ１．１７６は、Ｓｐｈｉｎｘ１．７６の配列と９８％の配列類似性を共有する。分離物の大きなオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、それらの間で高い類似性を共有する推定ＤＮＡ複製タンパク質をコードする。もう１つの一般的な特徴は、イテロンのようなタンデムリピートの存在である。この反復領域のアラインメントは、コアにおける単一ヌクレオチドの変異を示す。このイテロン様反復は、Ｒｅｐタンパク質の結合部位を構成し得る。分離物の配列はＥＭＢＬ Ｄａｔａｂａｎｋに登録番号ＬＫ９３１４９１（ＭＳＢＩ１．１７６）及びＬＫ９３１４９２（ＭＳＢＩ２．１７６）（Ｗｈｉｔｌｅｙ Ｃ．ら、２０１４）で寄託されており、ＷＯ２０１６／００５０５４Ａ２に整列及び記載されている。

【0011】

牛乳からさらに分離物を入手した。これらの牛乳分離物（ＣＭＩ）は、それぞれ「ＣＭＩ１ゲノム」、「ＣＭＩ２ゲノム」及び「ＣＭＩ３ゲノム」と命名されたＣＭＩ１．２５２、ＣＭＩ２．２１４及びＣＭＩ３．１６８であった。分離物の配列は登録番号ＬＫ９３１４８７（ＣＭＩ１．２５２）、ＬＫ９３１４８８（ＣＭＩ２．２１４）及びＬＫ９３１４８９（ＣＭＩ３．１６８）でＥＭＢＬ Ｄａｔａｂａｎｋに寄託されており、ＷＯ２０１６／００５０５４Ａ２に整列及び記載されている。

【0012】

本発明者らは、ＣＭＩゲノムとＭＳＢＩゲノムの両方で、転写されたＲＮＡが大量に生産され、コードされたＲｅｐタンパク質ががん組織周辺の末梢組織に多く発現していることを発見した。本発明者らは、コードされたＲｅｐタンパク質（ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ、ＭＳＢＩ２ Ｒｅｐ、ＣＭＩ１ Ｒｅｐ、ＣＭＩ２ Ｒｅｐ、ＣＭＩ３ Ｒｅｐ）が乳がんのバイオマーカとなることを見出した。ＤＮＡ複製関連タンパク質（ＲｅｐＢ）として、Ｒｅｐタンパク質はＤＮＡ結合活性を有し、エピソーム又はウイルスＤＮＡ分子の複製の開始に必須であり得る。Ｒｅｐタンパク質は自己オリゴマー化及び凝集の顕著な可能性を示し、これは、インビボ及びインビトロにおける原核生物系内で記載されている（Ｇｉｒａｌｄｏ，Ｍｏｒｅｎｏ－Ｄｉａｚ ｄｅ ｌａ Ｅｓｐｉｎａら、２０１１，Ｔｏｒｒｅｉｒａ，Ｍｏｒｅｎｏ－Ｄｅｌ Ａｌａｍｏら、２０１５）。

【0013】

本発明者らは、Ｒｅｐタンパク質に対するモノクローナル抗体を作製した。特定の実施形態において、抗Ｒｅｐ抗体は、図３に例示されるＲｅｐタンパク質のエピトープに結合する。特に好ましい抗体は、配列番号１のアミノ酸１～１３６、１３７～２２９及び２３０～３２４からなる群より選択されるアミノ酸配列内のエピトープに結合する。例えば、抗体は、配列番号２又は配列番号３に含まれるエピトープに結合する。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】図１は、乳がんの発生について提案されたモデルを示す。

【図2】図２は、乳がん患者組織７Ｇ６ＭＪＸの連続した組織切片におけるＢＭＭＦ１ ＲｅｐのＩＨＣ検出（スケールバー＝１００μｍ）を示す。

【図3】図３は、乳がん患者組織１ＨＨＹ７Ｋの連続した組織切片におけるＢＭＭＦ１ ＲｅｐのＩＨＣ検出（スケールバー＝１００μｍ）を示す。

【図4】図４は、産生された抗体の特徴とＲｅｐ内のエピトープの局在を示す。

【図5】図５は、ＢＭＭＦ１ Ｒｅｐ染色に基づく免疫反応性スコアを示す棒グラフ（Ｘ軸：免疫反応性スコア；Ｙ軸：患者数）を示す。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本発明は、Ｒｅｐタンパク質が乳がん発症のリスクを高めるバイオマーカを示す可能性があり、乳がん患者の全生存予後を判定するためのマーカーとして有用であるという教示を提供するものである。

【0016】

「乳がん」とは、女性又は男性の乳房組織における制御不能な細胞増殖の結果として発生した癌を意味する。これらの悪性腫瘍は、既存の良性腺腫及び過形成の結果として発症することがあり、遺伝子の変化が正常な成長から癌性の成長への移行を促進する。乳がん」とは、前段階、初期段階、後期段階、及びそれらに由来する転移を意味する。

【0017】

異なる実施形態では、本発明はまた、将来の疾患リスクを評価するための、健康な乳房組織（癌の診断を受けていない、あるいは癌の特異的なヒントを持っていない人の組織）の系統的試験を包含し得る。これは、本発明が乳がんを発症する素因を決定するのにも適していることを意味している。

【0018】

本明細書で使用される「Ｒｅｐタンパク質」は、ＤＮＡ複製関連タンパク質（ＲｅｐＢ）を指す。Ｒｅｐタンパク質はＤＮＡ結合活性を有し、エピソーム／ウイルスＤＮＡ分子の複製の開始に必須であり得る。一般に、Ｒｅｐタンパク質は、小さなＳｐｈｉｎｘゲノムの群からのＲｅｐタンパク質を指す（Ｗｈｉｔｌｅｙら、２０１４）。特に、Ｒｅｐタンパク質はＭＳＢＩ１ゲノムコードＲｅｐタンパク質（ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ）、ＭＳＢＩ２ゲノムコードＲｅｐタンパク質（ＭＳＢＩ２ Ｒｅｐ）、ＣＭＩ１ゲノムコードＲｅｐタンパク質（ＣＭＩ１ Ｒｅｐ）、ＣＭＩ２ゲノムコードＲｅｐタンパク質（ＣＭＩ２ Ｒｅｐ）又はＣＭＩ３ゲノムコードＲｅｐタンパク質（ＣＭＩ３ Ｒｅｐ）である。好ましくは、ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐタンパク質は、受入番号ＬＫ９３１４９１の下でＥＭＢＬデータバンクに寄託されたＭＳＢＩ１．１７６によってコードされ、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有し、又はＲｅｐタンパク質は、受入番号ＬＫ９３１４９２の下でＥＭＢＬデータバンクに寄託されたＭＳＢＩ２．１７６によってコードされるＭＳＢＩ２であり、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する（Ｗｈｉｔｌｅｙ， Ｇｕｎｓｔら、２０１４）。別の好ましい実施形態において、ＣＭＩ１ Ｒｅｐタンパク質は、受入番号ＬＫ９３１４８７の下でＥＭＢＬデータバンクに寄託されたＣＭＩ１．２５２によってコードされ、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有する。別の好ましい実施形態において、ＣＭＩ２ Ｒｅｐタンパク質は、受入番号ＬＫ９３１４８８の下でＥＭＢＬデータバンクに寄託されたＣＭＩ２．２１４によってコードされ、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有する。別の好ましい実施形態において、ＣＭＩ３ Ｒｅｐタンパク質は、受入番号ＬＫ９３１４８９の下でＥＭＢＬデータバンクに寄託されたＣＭＩ３．１６８によってコードされ、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する。特に好ましい実施形態において、Ｒｅｐタンパク質は、配列番号１の１～２２９のアミノ酸から本質的になるＢＭＭＦ１ゲノムの間で保存されたＮ末端領域、及び配列番号１のアミノ酸２３０～３２４から本質的になるＭＳＢＩ１．１７６に特異的なＣ末端可変領域を含む。Ｎ末端保存領域は、配列番号１の１～１３６のアミノ酸から本質的になる推定上の第１のＤＮＡ結合ドメインと、配列番号１の１３７～２２９のアミノ酸から本質的になる第２の推定上のＤＮＡ結合ドメインとを含む。Ｃ末端ドメインは、任意の公知のタンパク質とほとんど配列相同性を示さず、そしてアミノ酸２３０～３２４からなる。

【0019】

「Ｒｅｐタンパク質」はまた、配列番号１又は配列番号８のタンパク質のフラグメント及び改変体を包含し、これらは配列番号１又は配列番号８のアミノ酸配列を有するＲｅｐタンパク質に特異的な抗Ｒｅｐ抗体に結合し得る。好ましくはこのようなフラグメントは配列番号１又は配列番号８のアミノ酸配列を有するタンパク質の免疫原性フラグメントであり、これらは配列番号１又は配列番号８のＲｅｐタンパク質に対する抗Ｒｅｐタンパク質抗体のための少なくとも１つのエピトープを含み、そして好ましくは少なくとも７、８、９、１０、１５、２０、２５又は５０の連続するアミノ酸を含む。特定の実施形態では、フラグメントがＲｅｐタンパク質のドメイン、例えば、Ｎ末端保存領域、Ｃ末端可変領域、第１又は第２のＤＮＡ結合ドメインを含むか、又は本質的にそれらからなる。配列番号１又は配列番号８を有するタンパク質の変異体は配列番号１と比較して１つ以上のアミノ酸欠失、置換又は付加を含み、配列番号１又は配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性を有し、変異体は、配列番号１又は配列番号８のアミノ酸配列を有するＲｅｐタンパク質に特異的な抗Ｒｅｐ抗体に結合することができる。変異体の定義内に含まれるのは、例えば、アミノ酸の１つ以上のアナログ（例えば、非天然アミノ酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などを含む）、置換された結合を有するポリペプチド、ならびに天然に存在するもの及び天然に存在しないもの両方の、当技術分野で公知の他の改変を含有するポリペプチドである。Ｒｅｐタンパク質という用語は、異種アミノ酸配列、リーダー配列、又はタグ配列などを有する融合タンパク質を含む。本発明の特定の実施形態において、タンパク質タグは上記のＲｅｐタンパク質（例えば、ＭＳＢＩ１、ＭＳＢＩ２、ＣＭＩ１、ＣＭＩ２又はＣＭＩ３からなる群より選択されるＲｅｐタンパク質）上に遺伝的に移植される。特に、少なくとも１つのタンパク質タグは、配列番号１～３、８～１２、１４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合される。このようなタンパク質タグは、化学物質によって、又は酵素的手段によって除去可能であり得る。タンパク質タグの例は、精製のためのアフィニティー又はクロマトグラフィータグである。例えば、ＲｅｐタンパクはＨｉｓ_６－Ｔａｇ（配列番号４）、Ｔ７－Ｔａｇ（配列番号５）、ＦＬＡＧ－Ｔａｇ（配列番号６）及びＳｔｒｅｐ－ＩＩ－Ｔａｇ（配列番号７）からなるグループから選択されるように、Ｔａｇ配列に融合することができる。Ｈｉｓ－Ｔａｇ （配列番号４）、Ｔ７－Ｔａｇ（配列番号５）、ＦＬＡＧ－Ｔａｇ（配列番号６）、又はＳｔｒｅｐＩＩ－Ｔａｇ（配列番号７）。さらに、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又はその変異体などの蛍光タグを、本発明によるＲｅｐタンパク質に付着させることができる。

【0020】

特に好ましい実施形態において、ＭＳＢＩ１ゲノムコード化Ｒｅｐタンパク質（ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ）はヒト細胞株（例えば、ＨＥＫ－２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３ＦＴ、ＨａＣａＴ、ＨｅＬａ、ＳｉＨａ、ＣａＳｋｉ、ＨＤＭＥＣ、Ｌ１２３６、Ｌ４２８、ＢＪＡＢ、ＭＣＦ７、Ｃｏｌｏ６７８、任意の一次細胞株）ならびにウシ細胞株（例えば、ＭＡＣ－Ｔ）又はマウス細胞株（例えば、ＧＴ１－７）における産生のためにコドン最適化される。これは、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０７５７７４に詳細に記載されている。

【0021】

本発明のＲｅｐタンパク質（上記で定義したＲｅｐ断片及びＲｅｐ変異体を含む）は、古典的化学合成によって調製することができる。合成は、均一溶液中又は固相中で行うことができる。組換えＤＮＡ技術の手段により、ポリペプチドを調製することもできる。

【0022】

本明細書で使用される「対象」は、マウス、ウシ、例えばウシ、サル及びヒトを含む哺乳動物個体又は患者を指す。好ましくは、対象はヒト患者である。

【0023】

本明細書で使用される「抗Ｒｅｐ抗体」は、Ｒｅｐタンパク質に検出可能なレベルで結合する抗体を指し、非Ｒｅｐタンパク質よりも本発明のＲｅｐタンパク質により強く親和性である。好ましくは、Ｒｅｐタンパク質に対する抗原親和性がバックグラウンド結合よりも少なくとも２倍大きい。特に、抗Ｒｅｐ抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ又はＭＳＢＩ２ Ｒｅｐに特異的である。特定の実施形態では、抗体がＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ、ＭＳＢＩ２ Ｒｅｐ、ＣＭＩ１ Ｒｅｐ、ＣＭＩ２ Ｒｅｐ及び／又はＣＭＩ３ Ｒｅｐに対して交差特異的である。特定の実施形態では、抗Ｒｅｐ抗体がＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ、ＭＳＢＩ２ Ｒｅｐ、ＣＭＩ１ Ｒｅｐ、ＣＭＩ２ Ｒｅｐ及び／又はＣＭＩ３ Ｒｅｐの少なくとも２つ、好ましくは全てに対して交差特異的である。

【0024】

本発明者らはまた、抗Ｒｅｐタンパク質抗体を含むことが疑われる検体とＲｅｐタンパク質を、Ｒｅｐタンパク質が検体中に存在する任意のこのような抗体に結合することを可能にする条件下で接触させることによって、乳がん患者の抗体レベルを試験した。このような条件は、典型的には過剰のＲｅｐタンパク質を使用する生理学的温度、ｐＨ及びイオン強度である。検体とのＲｅｐタンパク質のインキュベーションに続いて、抗原を含む免疫複合体を検出する。特定の実施形態において、Ｒｅｐタンパク質はシグナル生成化合物（例えば、検出可能な標識）に結合されるか、又はシグナル生成化合物に結合されるさらなる結合剤（例えば、二次抗ヒト抗体）が、免疫複合体を検出するために使用される。

【0025】

抗Ｒｅｐ抗体はタンパク質抗原としてのＲｅｐタンパク質に基づくアッセイにおいて検出及び定量され得、これは、試料において疑われる哺乳動物（例えば、ヒト）抗体の標的として役立つ。好ましくは、Ｒｅｐタンパク質は精製され、そして検体は例えば、血清又は血漿であり得る。この方法は、マトリックス上へのＲｅｐタンパク質の固定化、続いて、固定化されたＲｅｐタンパク質の検体とのインキュベーションを含む。最後に、Ｒｅｐタンパク質と検体の抗体との間に形成された免疫複合体のＲｅｐ結合抗体を、シグナル生成化合物、例えば、二次ＨＲＰ－（西洋ワサビ－ペルオキシダーゼ）結合検出抗体に結合した検出結合剤によって定量し、ＨＲＰ基質に基づく定量を可能にする。このシグナル生成化合物又は標識は、それ自体が検出可能であるか、又は追加の化合物と反応させて検出可能な生成物を生成することができる。

【0026】

イムノアッセイの設計は、非常に多くのバリエーションがあり、そして多くの形式が当該分野で公知である。プロトコールは例えば、固体支持体又は免疫沈降を使用し得る。ほとんどのアッセイはシグナル生成化合物、例えば、標識抗体又は標識Ｒｅｐタンパク質に結合された結合剤の使用を含む；標識は、例えば、酵素、蛍光、化学発光、放射性、又は色素分子であり得る。免疫複合体からのシグナルを増幅するアッセイも知られており、その例は、ビオチン及びアビジン又はストレプトアビジンを利用するアッセイ、ならびにＥＬＩＳＡアッセイなどの酵素標識及び酵素媒介免疫アッセイである。

【0027】

イムノアッセイは、不均一又は均一フォーマットであり得、そして標準又は競合型であり得る。標準フォーマット及び競合フォーマットの両方が、当技術分野で知られている。

【0028】

免疫沈降又は凝集アッセイフォーマットにおいて、Ｒｅｐタンパク質と抗Ｒｅｐ抗体との間の反応は、溶液又は懸濁液から沈殿し、沈殿物の可視層又はフィルムを形成するネットワークを形成する。抗Ｒｅｐ抗体が検体中に存在しない場合、目に見える沈殿物は形成されない。

【0029】

さらなる実施形態において、本発明者らは、サンプル中の増加した量のＲｅｐタンパク質が乳がんの診断又は素因と相関する方法を使用した。このような実施形態において、サンプル中のＲｅｐタンパク質は、抗Ｒｅｐ抗体によって検出される。

【0030】

本明細書中で使用される「サンプル」は、癌性乳房組織、癌性組織を取り囲む周囲組織、及び（良性）過形成を包含する生物学的サンプルをいう。サンプルは、組織培養物又は生検検体などの組織サンプルを包含する。

【0031】

このような方法は、抗Ｒｅｐ抗体によって被験体由来のサンプル中のＲｅｐタンパク質を検出する工程を包含する。このような方法において、Ｒｅｐタンパク質は、免疫組織化学的方法又は免疫蛍光顕微鏡法によって組織サンプル中で検出される。

【0032】

特定の実施形態において、抗Ｒｅｐ抗体は、サンプル中のＲｅｐタンパク質の検出又は捕捉のために使用される。

【0033】

用語「抗体」は、好ましくは異なるエピトープ特異性を有するプールされたポリクローナル抗体、ならびに個別のモノクローナル抗体調製物から本質的になる抗体に関連する。本明細書で使用される場合、用語「抗体」（Ａｂ）又は「モノクローナル抗体」（Ｍａｂ）は完全な免疫グロブリン分子、ならびにＲｅｐタンパク質に特異的に結合することができる抗体断片（例えば、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ‘）_２断片など）を含むことを意味する。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ‘）_２フラグメントは、インタクトな抗体のＦｃフラグメントを欠き、循環からより迅速に取り除かれ、インタクトな抗体よりも非特異的な組織結合が少ないかもしれない。従って、これらのフラグメント、ならびにＦＡＢ又は他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産物が好ましい。さらに、本発明の目的に有用な抗体には、キメラ、一本鎖、多機能（例えば、二重特異性）及びヒト化抗体又はヒト抗体が含まれる。

【0034】

特定の実施形態において、抗体又はその抗原結合フラグメントはシグナル生成化合物に結合され、例えば、検出可能な標識を有する。抗体又はその抗原結合フラグメントは、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤又は酵素で直接的又は間接的に検出可能に標識することができる。当業者は、通常の実験を用いて、抗体に結合するための他の適切な標識を知っているか、又はそれを確認することができる。

【0035】

抗Ｒｅｐ抗体は好ましくは当業者に周知の方法により、配列番号１又は配列番号８のアミノ酸配列又はその断片を有するＲｅｐタンパクに対し、産生（生成）される。

【0036】

特定の実施形態において、抗Ｒｅｐ抗体は、小さなＳｐｈｉｎｘゲノム（抗Ｓｍａｌｌ－Ｓｐｈｉｎｘ様Ｒｅｐ抗体又は抗ＳＳＬＲｅｐ抗体）の群からのいくつかの又は全ての種類のＲｅｐタンパク質に結合することができる本発明の方法において使用される。このような抗ＳＳＬＲｅｐ抗体は、配列番号１のアミノ酸１～２２９のＲｅｐタンパク質の保存されたＮ末端領域内のエピトープに結合する。特定の実施形態では、配列番号２（配列番号１のアミノ酸３２～４９）又は配列番号３（配列番号１のアミノ酸１９６～２１６）内のエピトープに結合する抗ＳＳＬＲｅｐ型の抗Ｒｅｐ抗体が使用される。配列番号２及び配列番号３のペプチド断片は、小さなＳｐｈｉｎｘゲノム群由来のＲｅｐタンパク質の間で高度に保存されており、それらの親水性のために露出しているようである。抗ＳＳＬＲｅｐ型の抗Ｒｅｐ抗体は、例えばマウス又はモルモットの免疫化によって、配列番号２又は３に示されるアミノ酸配列から本質的になるペプチドによって；又は配列番号１のアミノ酸１～２２９の保存されたＮ末端Ｒｅｐタンパク質領域に由来する、好ましくは少なくとも８～１５アミノ酸を含む他の免疫原性フラグメントによって産生され得る。

【0037】

さらなる実施形態において、ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐタンパク質に特異的な抗Ｒｅｐ抗体が使用される。このような抗体は、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有する全長Ｒｅｐタンパク質でマウス又はモルモットのような哺乳動物を免疫することによって産生され得る。

【0038】

好ましくは、本発明の方法がピコグラムからフェムトグラムまでの範囲までのＲｅｐタンパク質を検出することができる抗Ｒｅｐ抗体を使用する。
このような抗Ｒｅｐ抗体群の例を表１に示す：

【0039】

【表1】

【0040】

グループＡの抗Ｒｅｐ抗体は配列番号３（配列番号１のａａ１９６～２１６）に示されるアミノ酸配列内にエピトープを有し、そして小さなＳｐｈｉｎｘゲノム群のこの保存されたエピトープを含むＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ及びＲｅｐタンパク質（例えば、ＭＳＢＩ２、ＣＭＩ１、ＣＭＩ４）を検出し得る。免疫蛍光アッセイにおいて、このような抗Ｒｅｐ抗体は特異的なＲｅｐ局在化パターンを検出し、ここで、主要な局在化は、細胞質及び核膜にわたって均一に分布され；そしてさらなる弱く均一に分布された局在化が核において見られる。このようなグループＡ抗体の例は、実施例においてグループＡ抗体として使用された抗体ＡＢ０１ ５２３－１－１（抗体１－５とも呼ばれる；ＤＳＭ ＡＣＣ３３２７）である。

【0041】

グループＢの抗Ｒｅｐ抗体は配列番号２（配列番号１のａａ３３～５０）に示されるアミノ酸配列内にエピトープを有し、小さなＳｐｈｉｎｘゲノムグループ（例えば、ＭＳＢＩ２、ＣＭＩ１、ＣＭＩ４）のこの保存されたエピトープを含むＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ及びＲｅｐタンパク質を検出することができる。免疫蛍光アッセイにおいて、このような抗Ｒｅｐ抗体は、Ｒｅｐタンパク質の特異的スペックル（細胞質凝集）（しばしば核膜の周辺）を検出する。このようなグループＢ抗体の例はＡＢ０２ ３０４－４－（抗体５－２とも呼ばれる；ＤＳＭ ＡＣＣ３３２８）として指定される抗体であり、これは、実施例においてグループＢ抗体として使用された。

【0042】

グループＣの抗Ｒｅｐ抗体は、ＭＳＢＩ１（配列番号１）の構造エピトープを特異的に検出する。免疫蛍光アッセイにおいて、このような抗Ｒｅｐ抗体は、特異的なＲｅｐ局在化パターンを検出し、ここで、主要な局在化は、細胞質及び核膜にわたって均一に分布され；そしてさらなる弱く均一に分布された局在化が核において見られる。このようなグループＣ抗体の例は、ａａ２３０～３２４の配列中にエピトープを有するグループＣ抗体として実施例において使用された抗体ＭＳＢＩ１３８１－６－２（抗体３－６とも呼ばれる；ＤＳＭ ＡＣＣ３３２９）である。グループＣ抗体の別の例は、ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ（ａａ２３０～３２４）のＣ末端ドメインにおけるエピトープを検出する抗体ＭＢＳＩ１ ５７２－１３－１９（抗体１０－３とも呼ばれる）である。グループＣ抗体の別の例は、ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ（ａａ１～１３６）のＮ末端ドメインにおけるエピトープを検出する抗体ＭＢＳＩ１ ６１７－１－３（抗体１１－５とも呼ばれる）である。

【0043】

グループＤの抗Ｒｅｐ抗体はＭＳＢＩ１の構造エピトープ（配列番号１）を特異的に検出し、ここで、「Ｄ１」として指定される抗体ＭＳＢＩ１ ９６１－２－２（抗体９－２とも称される；ＤＳＭ ＡＣＣ３３３１）は、ＭＳＢＩ１のＣ末端ドメイン中の配列番号９（ａａ２８１－２８７）に示されるエピトープを検出する。抗体ＭＳＢＩ１７６１－５－１（抗体１３とも呼ばれる；ＤＳＭ ＡＣＣ３３２８）が「Ｄ２」として指定されるが、ＭＳＢＩ１の３Ｄ構造エピトープを検出し、これはインビボ条件下でのみアクセス可能であり、ウェスタンブロットではアクセスできない。免疫蛍光アッセイにおいて、このような抗Ｒｅｐ抗体は、Ｒｅｐタンパク質の特異的スペックル（細胞質凝集）（しばしば核膜の周辺）を検出する。本発明を、以下の実施例によってさらに説明するが、これらに限定されるものではない：

【実施例】

【0044】

実施例１：乳房組織におけるＢＭＭＦタンパク質ターゲットの検出
すべての組織サンプルは、組織バンクの規定及びハイデルベルク大学倫理委員会の承認に基づき、国立腫瘍疾患センター（ＮＣＴ、ハイデルベルク、ドイツ、ハイデルベルク大学病院病理学研究所）の組織バンクから提供された。

【0045】

組織の染色
パラフィン包埋組織切片（約４μｍ厚）を，ＥＤＴＡエピトープ回収（Ｓｉｇｍａ Ｅ１１６１）後、Ｚｙｔｏｍｅｄ Ｃｈｅｍ－Ｐｌｕｓ ＨＲＰ Ｐｏｌｙｍｅｒ－Ｋｉｔ（Ｚｙｔｏｍｅｄ、ＰＯＬＨＲＰ－１００）及びＤＡＢ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ Ｈｉｇｈ Ｃｏｎｔｒａｓｔ（Ｚｙｔｏｍｅｄ、ＤＡＢ５００ｐｌｕｓ）を用いて，所定の抗体インキュベーション（表２参照）及びヘマトキシリン対比染色で染色した。スライドはデジタルスライドスキャナー（浜松）でスキャンし、ＮＤＰ．ｖｉｅｗ２Ｐｌｕｓソフトウェア（浜松）を用いて解析した。

【0046】

【表2】

【0047】

抗Ｒｅｐ抗体（ｍＡｂ１０－３、ｍＡｂ３－６など）を用いた染色では、乳がん患者サンプル７Ｇ６ＭＪＸ及び１ＨＨＹ７Ｋの間質腫瘍組織領域におけるタンパク質ターゲットの特異的な検出が示された（図２及び３）。一般的に、抗Ｒｅｐの検出では、主に間質内の細胞の細胞質領域にある小さなサイズの凝集体が強く染色された。さらに、抗Ｒｅｐ抗体で染色されたシグナルとＣＤ６８陽性のマクロファージとの共局在も観察された。Ｒｅｐ特異的抗体が最も多く検出された領域は、ＣＤ６８陽性細胞が最も多く検出された領域と相関しており、Ｒｅｐ特異的抗原が炎症組織領域に局在していることを示唆している。すなわち、炎症性単球、循環マクロファージ、又は組織内常駐マクロファージが特に多く存在する領域である。アイソタイプコントロール抗体を用いた対照染色では、シグナルは検出されなかった。

【0048】

実施例２：組織の染色と組織の分析
組織マイクロアレイＺＴＭＡ２６は、チューリッヒ大学の提供により作成された。このデータセットには、患者ごとに１つの腫瘍組織スポットが含まれている。ＺＴＭＡ２６の染色はＢＯＮＤ ＭＡＸ機（ライカバイオシステムズ）でＥＤＴＡエピトープリトリーバルバッファー（Ａｂｃａｍ， ＃ａｂ９３６８０）を用いて全自動で行った。一次抗体抗ＢＭＭＦ１ Ｒｅｐ（＃３－６， ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ， ＤＫＦＺ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）とアイソタイプコントロール抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＩｇＧ１， ＭＧ１－４５）を室温で３０分間インキュベートした（４μｇ／ｍｌ）。二次ウサギ抗マウス（Ａｂｃａｍ ＃１２５９０４）を室温で２０分間インキュベートした。検出は、ＤＡＢクロモゲンとヘマトキシリン対比染色を含むＢｏｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅｆｉｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｌｅｉｃａ ＃ＤＳ９８００）を用いて行った。スライドは浜松のＮａｎｏｚｏｏｍｅｒスライドスキャナー（浜松）でスキャンし、ＮＤＰ．ｖｉｅｗ２ Ｐｌｕｓソフトウェア（浜松）で解析した。

【0049】

組織分析
組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）上のＢＭＭＦ１ Ｒｅｐ染色の解析では、抗体染色は、染色された細胞の割合（陽性率）と、組織スポットの間質／間隙部分におけるシグナルの強度（Ｉ）の２つのパラメータに基づいて特徴付けられた。上皮部分や腫瘍細胞は、一般的にＢＭＭＦの陽性化の対象ではないため、解析には含めなかった。ＢＭＭＦ１ Ｒｅｐ染色の陽性度（ＰＯＳ）は、３段階で評価した。０は全く陽性の組織部分がないことを示し、１は１～１０％の陽性、２は１１～３０％の陽性、３は３０％以上の陽性細胞が組織スポットの複数の領域に分布していることを示した。強度（Ｉ）は以下のように評価した。０＝検出されない、１＝中程度、２＝強い染色。統計解析のため、免疫反応性スコア（ＩＲＳ）を以下のように算出した。ＩＲＳ＝ＩｘＰＯＳ；最小値＝０、最大値＝６（表２）。

【0050】

【表3】

【0051】

ＩＲＳ＝Ｉ×ＰＯＳ
ＩＲＳ＝免疫反応性スコア
これらのスクーリング基準を用いて、ＢＭＭＦ１ Ｒｅｐ染色に基づく腫瘍周囲組織（１６名の患者）のサンプルは
１２％の陰性（ＩＲＳ ０）
８８％が陽性（ＩＲＳ１以上）［うち４４％が有意に陽性＝ＩＲＳ２以上］
これらの結果は、図５に棒グラフで示されている。

【0052】

【表4-1】

【0053】

【表4-2】

【0054】

【表4-3】

【0055】

参考文献

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

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