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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-11-27
(45)【発行日】2023-12-05
(54)【発明の名称】分析方法及びキット
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20231128BHJP
C12Q 1/6851 20180101ALI20231128BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALI20231128BHJP
C12Q 1/6886 20180101ALI20231128BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20231128BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20231128BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z
C12Q1/6851 Z
C12Q1/6876 Z
C12Q1/6886 Z ZNA
G01N33/53 M
C12N15/113 Z
【請求項の数】
5
(21)【出願番号】P 2022099483
(22)【出願日】2022-06-21
(62)【分割の表示】P 2020567998の分割
【原出願日】2019-08-02
(65)【公開番号】P2022130509
(43)【公開日】2022-09-06
【審査請求日】2022-06-21
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成３０年度、国立研究開発法人 日本医療研究開発機構 次世代治療・診断実現のための創薬基盤技術開発事業委託研究、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(73)【特許権者】
【識別番号】000003078
【氏名又は名称】株式会社東芝
(74)【代理人】
【識別番号】110001737
【氏名又は名称】弁理士法人スズエ国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】橋本 幸二
(72)【発明者】
【氏名】稲田 美雅
(72)【発明者】
【氏名】伊藤 桂子
【審査官】長谷川 強
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１５／１３３４７７（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／１１
Ｃ１２Ｑ １／６８５１
Ｃ１２Ｑ １／６８７６
Ｃ１２Ｑ １／６８８６
Ｇ０１Ｎ ３３／５３
Ｃ１２Ｎ １５／１１３
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
（Ｓ１）ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐを増幅するためのプライマーセット（以下、「第１プライマーセット」と称する）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐを逆転写するための逆転写用プライマー、及びｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐを伸長するための伸長用プライマーからなる群から選択される少なくとも１種のプライマーを対象由来の試料に用いて核酸を得た後、当該核酸を核酸プローブで検出することで、前記試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐを定量すること；及び（Ｓ２）前記（Ｓ１）で得られた定量値と、対照由来の試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐの定量値とを比較し、前記（Ｓ１）で得られた定量値の方が大きい場合に、前記対象が乳がん、大腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、肉腫、子宮体がん、又は子宮肉腫に罹患している可能性よりも膵臓がんに罹患している可能性の方が高いと判定すること；
を含み、
前記対照は、乳がん、大腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、肉腫、子宮体がん、又は子宮肉腫に罹患した生体である、前記対象における膵臓がんの罹患の有無の判定を補助する方法。
【請求項2】
前記（Ｓ１）は、（Ｓ１－１）ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐの配列（以下、「第１の配列」と称する）とハイブリダイズする第１プライマー部及び第１ＬＡＭＰ認識配列を含む逆転写用プライマーの、前記第１プライマー部を前記第１の配列とハイブリダイズさせ、前記第１の配列を逆転写し、前記第１の配列の相補配列（以下、「第１ａの配列」と称する）を含む逆転写産物を得る逆転写工程、
（Ｓ１－２）前記逆転写産物と前記ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐとを解離させる解離工程、
（Ｓ１－３）前記第１ａの配列とハイブリダイズする第２プライマー部及び第２ＬＡＭＰ認識配列を含む伸長用プライマーの、前記第２プライマー部を前記逆転写産物の前記第１ａの配列とハイブリダイズさせ、前記伸長用プライマー及び前記逆転写産物を、互いを鋳型として伸長させて、前記第１ａの配列の相補配列を含む伸長産物を得る伸長工程、
（Ｓ１－４）第１プライマーセットを用いてＬＡＭＰ反応により前記伸長産物を増幅し、増幅産物を得る増幅工程、及び
（Ｓ１－５）前記増幅産物を核酸プローブで検出する検出工程
を含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記第１プライマーセットは、配列番号８のＦＩＰプライマー、配列番号９のＢＩＰプライマー及び配列番号１０のＬＢプライマーを含むか、
配列番号８のＦＩＰプライマー、配列番号９のＢＩＰプライマー及び配列番号１１のＬＢプライマーを含むか、
配列番号１２のＦＩＰプライマー、配列番号１３のＢＩＰプライマー及び配列番号１０のＬＢプライマーを含むか、又は
配列番号１４のＦＩＰプライマー、配列番号１５のＢＩＰプライマー及び配列番号１０のＬＢプライマーを含み、
前記逆転写用プライマーが配列番号２を含み、前記伸長用プライマーが配列番号３を含むか、
前記逆転写用プライマーが配列番号４を含み、前記伸長用プライマーが配列番号５を含むか、又は
前記逆転写用プライマーが配列番号６を含み、前記伸長用プライマーが配列番号７を含む、
請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐを増幅するためのプライマーセット（以下、「第１プライマーセット」と称する）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐを逆転写するための逆転写用プライマー、及びｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐを伸長するための伸長用プライマーからなる群から選択される少なくとも１種のプライマーと、前記プライマーを用いて得られる核酸にハイブリダイズし、かつ、前記核酸を検出するための核酸プローブと
を含む、
乳がん、大腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、肉腫、子宮体がん及び子宮肉腫に罹患している可能性よりも、膵臓がんに罹患している可能性の方が高いと判定するために用いられるキット。
【請求項5】
前記第１プライマーセットは、配列番号８のＦＩＰプライマー、配列番号９のＢＩＰプライマー及び配列番号１０のＬＢプライマーを含むか、
配列番号８のＦＩＰプライマー、配列番号９のＢＩＰプライマー及び配列番号１１のＬＢプライマーを含むか、
配列番号１２のＦＩＰプライマー、配列番号１３のＢＩＰプライマー及び配列番号１０のＬＢプライマーを含むか、又は
配列番号１４のＦＩＰプライマー、配列番号１５のＢＩＰプライマー及び配列番号１０のＬＢプライマーを含み、
前記逆転写用プライマーが配列番号２を含み、前記伸長用プライマーが配列番号３を含むか、
前記逆転写用プライマーが配列番号４を含み、前記伸長用プライマーが配列番号５を含むか、又は
前記逆転写用プライマーが配列番号６を含み、前記伸長用プライマーが配列番号７を含む、
請求項４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、分析方法及びキットに関する。
【背景技術】
【0002】
近年、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と疾患との関係が注目されている。ｍｉＲＮＡは遺伝子発現を調節する機能を持ち、種々の疾患でその種類や発現量が初期の段階から変化していることが報告されている。即ち、ある疾患を持つ患者では、特定のｍｉＲＮＡ量が健常者と比較して増加又は減少している。そのため、被検者から採取された試料中の該ｍｉＲＮＡの量を調べることは、患者がその疾患に罹患しているか否かを知る手段となる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
本発明は、対象における膵臓がんの罹患の有無を簡便に判定することができる分析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0004】
実施形態によれば、対象由来の試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐを定量することを含む、対象における膵臓がんの罹患の有無を判定する分析方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0005】
【発明を実施するための形態】
【0006】
以下に、図面を参照しながら実施形態の分析方法及びキットについて説明する。
【0007】
・第１の実施形態
（分析方法）
実施形態の分析方法は、対象における膵臓がんの罹患の有無を判定するための方法である。
（分析方法）
実施形態の分析方法は、対象における膵臓がんの罹患の有無を判定するための方法である。
【0008】
対象は、分析に供される動物、即ち、後述する試料を提供する動物である。対象は、何らかの疾患を有する動物であってもよいし、健常な動物であってもよい。例えば、対象は、膵臓がんに罹患している可能性がある動物又は膵臓がんに罹患したことのある動物等であってもよい。
【0009】
対象はヒトであることが好ましい。或いは、対象は他の動物であってもよい。他の動物は、例えば哺乳動物であり、例えば、サル等の霊長類、マウス、ラット又はモルモット等の齧歯類、イヌ、ネコ又はウサギ等の伴侶動物、ウマ、ウシ又はブタ等の家畜動物、或いは展示動物等に属する動物を含む。
【0010】
実施形態に従う膵臓がんは、膵臓内に形成される悪性腫瘍（新生物）をいう。膵臓がんは、一般に「膵臓癌」、「膵がん」又は「膵癌」と称されるものも含む。また、実施形態に従う膵臓がんは、何れの種類の膵臓がんも含み、上皮性腫瘍（例えば、内分泌腫瘍及び外分泌腫瘍）、並びに非上皮性腫瘍を含む。また、膵臓がんは、何れの病期のものも含み、例えば、がんが膵臓の中に留まった状態、更に周辺の組織までがんが及んだ状態、更にリンパ節へがんが転移した状態、及び更に離れた臓器へのがんの転移がある状態等を含む。
【0011】
本分析方法は、図１に示すように、対象由来の試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐを定量すること（定量工程（Ｓ１））を含む。
【0012】
対象由来の試料は、好ましくは、血清である。試料は、その他の体液、例えば、血液、血漿、間質液、尿、便、汗、唾液、口腔内粘膜、鼻腔内粘膜、咽頭粘膜、喀痰、リンパ液、髄液、涙液、母乳、羊水又は精液等であってもよい。或いは、試料は、組織又は細胞等であってもよく、対象から採取され、培養された組織又は細胞、或いはその上清であってもよい。また、細胞株化した培養細胞でもよい。
【0013】
試料の採取方法は、試料の種類に従う一般的な方法を用いることができる。採取された試料は、例えば、後述する逆転写、伸長及び増幅反応を阻害しない状態又はこれらの反応により適した状態となるように公知の何れかの手段により前処理してもよい。前処理は、例えば、細切、ホモジナイズ、遠心、沈殿、抽出及び／又は分離等である。
【0014】
例えば、抽出は、市販の核酸抽出キットを用いて行ってもよい。或いは、市販のキットを使用せずに、例えば、材料を緩衝液で希釈し、８０～１００℃の加熱処理を行い、遠心分離し、その上清を採取することによって抽出を行ってもよい。
【0015】
ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐは、下記の配列：
ＵＧＧＡＧＵＧＵＧＡＣＡＡＵＧＧＵＧＵＵＵＧ（配列番号１）
を有するｍｉＲＮＡである。以下、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐを「標的ｍｉＲＮＡ」とも称する。また、配列番号１の配列を「第１の配列」とも称する。
ＵＧＧＡＧＵＧＵＧＡＣＡＡＵＧＧＵＧＵＵＵＧ（配列番号１）
を有するｍｉＲＮＡである。以下、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐを「標的ｍｉＲＮＡ」とも称する。また、配列番号１の配列を「第１の配列」とも称する。
【0016】
標的ｍｉＲＮＡの定量は、ＲＮＡを定量することができる一般的な方法で行うことができる。例えば、ＰＣＲ法、ｑＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法等、濁度若しくは吸光度測定法、蛍光測定法又は電気化学的測定法、或いはこれらの組み合わせ等を用いることができる。
【0017】
ｑＰＣＲ法を用いる場合、例えば、市販のキットを用いて定量することができる。市販のキットは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｉＲＮＡ Ａｓｓａｙｓ（サーモフィッシャー製、ＩＤ：４７７８２７＿ｍｉｒ）、ｍｉＲＣＵＲＹ ＬＮＡ ｍｉＲＮＡ ＰＣＲ Ａｓｓａｙｓ（キアゲン製、カタログＮｏ．ＹＰ０２１０３１３２）等である。また、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ ｍｉｃｒｏＲＮＡ検出システム（オリジンテクノロジーズ製）及び標的ｍｉＲＮＡを特異的に増幅するプライマーを用いて定量することも可能である。
【0018】
好ましい定量工程（Ｓ１）は、標的ｍｉＲＮＡを特異的に逆転写及び伸長し、伸長産物をＬＡＭＰ法により増幅し、得られた増幅産物を検出する方法により行う。以下、そのような定量工程（Ｓ１）の一例について説明する。定量工程（Ｓ１）は、例えば、図２及び図３に示す、次の工程を含む。
【0019】
（Ｓ１－１）標的ｍｉＲＮＡ１の第１の配列２とハイブリダイズする第１プライマー部４及び第１ＬＡＭＰ認識配列を含む逆転写用プライマー３（以下、「ＲＴプライマー」とも称する）の、第１プライマー部４を第１の配列２とハイブリダイズさせ、第１の配列２を逆転写し、第１ａの配列５（標的ｍｉＲＮＡ１の相補的ＤＮＡ）を含む逆転写産物６を得る逆転写工程、
（Ｓ１－２）逆転写産物６と標的ｍｉＲＮＡ１とを解離させる解離工程、
（Ｓ１－３）第１ａの配列５とハイブリダイズする第２プライマー部８及び第２ＬＡＭＰ認識配列を含む伸長用プライマー７（以下、「ＥＬプライマー」とも称する）の第２プライマー部８を逆転写産物６の第１ａの配列５とハイブリダイズさせ、ＥＬプライマー７及び逆転写産物６を、互いを鋳型として伸長させて、第１ａの配列５の相補配列９（即ち、第１の配列に対応するＤＮＡ配列）を含む伸長産物１０を得る伸長工程、
（Ｓ１－４）伸長産物１０をＬＡＭＰ反応により増幅し、増幅産物を得る増幅工程、及び
（Ｓ１－５）得られた増幅産物を検出する検出工程。
（Ｓ１－２）逆転写産物６と標的ｍｉＲＮＡ１とを解離させる解離工程、
（Ｓ１－３）第１ａの配列５とハイブリダイズする第２プライマー部８及び第２ＬＡＭＰ認識配列を含む伸長用プライマー７（以下、「ＥＬプライマー」とも称する）の第２プライマー部８を逆転写産物６の第１ａの配列５とハイブリダイズさせ、ＥＬプライマー７及び逆転写産物６を、互いを鋳型として伸長させて、第１ａの配列５の相補配列９（即ち、第１の配列に対応するＤＮＡ配列）を含む伸長産物１０を得る伸長工程、
（Ｓ１－４）伸長産物１０をＬＡＭＰ反応により増幅し、増幅産物を得る増幅工程、及び
（Ｓ１－５）得られた増幅産物を検出する検出工程。
【0020】
ＲＴプライマー３の第１プライマー部４は、第１の配列２とハイブリダイズして、第１の配列２を逆転写して相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成するためのプライマーとして働く核酸配列である。第１プライマー部４は、例えば、第１の配列２の３’末端を含む連続した少なくとも５つの塩基配列を有する。
【0021】
ＥＬプライマー７の第２プライマー部８は、第１ａの配列５とハイブリダイズして、その相補配列を生成するためのプライマーとして働く核酸配列である。第２プライマー部８は、例えば、第１ａの配列５の３’末端を含む連続した少なくとも５つの塩基配列を有する。
【0022】
第１プライマー部４、第２プライマー部８は、ＤＮＡのみで構成されていてもよいし、ＬＮＡ及び／又はＰＮＡを含んでいてもよい。これらを多く含むほどハイブリダイゼーションの結合力を強くすることができる。従って、ＬＮＡ及び／又はＰＮＡの数は、ハイブリダイゼーションさせる配列との所望のＴｍ値に従って決定されればよい。例えば、ＬＮＡ及び／又はＰＮＡを含ませると、より高い温度で逆転写工程（Ｓ１－１）及び伸長工程（Ｓ１－３）を行うことができ、非特異的な結合を抑制することが可能である。その結果より精度よく標的ｍｉＲＮＡを逆転写及び伸長することが可能である。
【0023】
第１ＬＡＭＰ認識配列及び第２ＬＡＭＰ認識配列は、増幅工程（Ｓ１－４）においてＬＡＭＰ増幅用プライマーが結合する配列（認識配列）を含む核酸塩基配列である。認識配列は、一般にＬＡＭＰ増幅用プライマーにおいて用いられるものであってもよい。例えば、第１ＬＡＭＰ認識配列は、第１プライマー部４側から５’末端に向かう順番で、Ｂ１配列、Ｂ２配列（及び任意にＬＢ配列）及びＢ１配列を含んでもよい。そして、第２ＬＡＭＰ認識配列は、第２プライマー部８側から５’末端に向かう順番で、Ｆ１配列、Ｆ２配列（及び任意にＬＢ配列）及びＦ１配列を含んでもよい。
【0024】
しかしながら、第１ＬＡＭＰ認識配列及び第２ＬＡＭＰ認識配列は、下記の（１）～（７）の組み合わせで認識配列を含むことが好ましい。ここで、下記の各認識配列の順番は、第１プライマー部４又は第２プライマー部８側から５’末端に向かう順番である。「ｃ」は、その直前に記載された配列の相補配列を意味する。例えば、「ＬＢｃ配列」は、ＬＢ配列の相補配列を意味する。「ダミー配列」は、第１ａの配列、Ｆ２配列、Ｆ１配列、ＬＦ配列、Ｂ１配列、Ｂ２配列、ＬＢ配列及びその相補配列とは異なる塩基配列を有する核酸配列である。
【0025】
（１）第１ＬＡＭＰ認識配列はＢ２配列を含み、
第２ＬＡＭＰ認識配列はＢ１ｃ配列、Ｆ１配列及びＦ２配列を含む。
（この場合、第１ａの配列の相補配列９の少なくとも１部をＬＢ配列とする。）
（２）第１ＬＡＭＰ認識配列はＬＢｃ配列及びＢ２配列を含み、
第２ＬＡＭＰ認識配列はＢ１ｃ配列、Ｆ１配列及びＦ２配列を含む。
（３）第１ＬＡＭＰ認識配列はダミー配列及びＢ２配列を含み、
第２ＬＡＭＰ認識配列はＢ１ｃ配列、Ｆ１配列及びＦ２配列を含む。
（４）第１ＬＡＭＰ認識配列はＢ１配列及びＢ２配列を含み、
第２ＬＡＭＰ認識配列はＦ１配列、ＬＦｃ配列及びＦ２配列を含む。
（５）第１ＬＡＭＰ認識配列はＢ２配列を含み、
第２ＬＡＭＰ認識配列はＦ１配列、ＬＦｃ配列及びＦ２配列を含む。
（６）第１ＬＡＭＰ認識配列はＬＢｃ配列及びＢ２配列を含み、
第２ＬＡＭＰ認識配列はＦ１配列及びＦ２配列を含む。
（７）第１ＬＡＭＰ認識配列はＢ１配列及びＢ２配列を含み、
第２ＬＡＭＰ認識配列はＬＦｃ配列及びＦ２配列を含む。
第２ＬＡＭＰ認識配列はＢ１ｃ配列、Ｆ１配列及びＦ２配列を含む。
（この場合、第１ａの配列の相補配列９の少なくとも１部をＬＢ配列とする。）
（２）第１ＬＡＭＰ認識配列はＬＢｃ配列及びＢ２配列を含み、
第２ＬＡＭＰ認識配列はＢ１ｃ配列、Ｆ１配列及びＦ２配列を含む。
（３）第１ＬＡＭＰ認識配列はダミー配列及びＢ２配列を含み、
第２ＬＡＭＰ認識配列はＢ１ｃ配列、Ｆ１配列及びＦ２配列を含む。
（４）第１ＬＡＭＰ認識配列はＢ１配列及びＢ２配列を含み、
第２ＬＡＭＰ認識配列はＦ１配列、ＬＦｃ配列及びＦ２配列を含む。
（５）第１ＬＡＭＰ認識配列はＢ２配列を含み、
第２ＬＡＭＰ認識配列はＦ１配列、ＬＦｃ配列及びＦ２配列を含む。
（６）第１ＬＡＭＰ認識配列はＬＢｃ配列及びＢ２配列を含み、
第２ＬＡＭＰ認識配列はＦ１配列及びＦ２配列を含む。
（７）第１ＬＡＭＰ認識配列はＢ１配列及びＢ２配列を含み、
第２ＬＡＭＰ認識配列はＬＦｃ配列及びＦ２配列を含む。
【0026】
以上の組み合わせであることによって、標的ｍｉＲＮＡをより特異的に逆転写及び伸長が可能となり、膵臓がん検出の精度が向上する。
【0027】
ＬＡＭＰ認識配列の組み合わせを上記（１）とする場合、以下の表１に示すＲＴプライマー３及びＥＬプライマー７を含む、逆転写及び伸長用プライマーセットＡ又はＢを用いることが好ましい。
【0028】
【表1】
【0029】
ＲＴプライマー３の第１プライマー部４と第１ＬＡＭＰ認識配列との間、ＥＬプライマー７の第２プライマー部８と第２ＬＡＭＰ認識配列との間、及び／又は各ＬＡＭＰ認識配列に含まれる各認識配列の間には、スペーサー配列が存在していてもよい。スペーサー配列は、第１ａの配列、各認識配列及びそれらの相補配列の配列とは異なり、かつ後述する伸長産物の増幅反応に悪影響を与えない核酸配列である。スペーサー配列は、ＤＮＡのみで構成されていてもよいし、ＬＮＡ及び／又はＰＮＡを含んでいてもよい。例えば、スペーサー配列は、１塩基～１６塩基であり、ポリＴ配列又はポリＡ配列等であることが好ましい。
【0030】
逆転写工程（Ｓ１－１）は、例えば、ＲＴプライマー３、逆転写酵素、塩及びデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）等の基質（必要に応じて反応試薬としての増粘剤、ｐＨ調製用緩衝材、界面活性剤、アニーリング特異性を増大するイオン及び／又は逆転写酵素の補因子となるイオン）等を試料に添加することにより行われる。逆転写酵素として、例えば、Ｍ－ＭｕＬＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、トランスクリプター逆転写酵素、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）トランスクリプター逆転写酵素、又はＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素等を用いることができる。温度は、例えば約１０℃～５５℃に維持することが好ましい。
【0031】
解離工程（Ｓ１－２）は、例えば、反応液を８０℃～１００℃に加熱することによって行うことができる。
【0032】
伸長工程（Ｓ１－３）は、例えば、ＥＬプライマー７、ＤＮＡポリメラーゼ、塩及びｄＮＴＰ等の基質（必要に応じて増粘剤、ｐＨ調製用緩衝材、界面活性剤及びイオン）等を、逆転写産物６を含む溶液に添加することにより行われる。温度は、約１０℃～８０℃に維持することが好ましい。
【0033】
増幅工程（Ｓ１－４）は、ＬＡＭＰ法を用いて行われる。この工程においては、例えば、ＬＡＭＰ増幅用プライマーセット、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、塩及びｄＮＴＰ等の基質（必要に応じて増粘剤、ｐＨ調製用緩衝材、界面活性剤及びイオン）等を、伸長産物１０を含む溶液に添加して、それを等温増幅反応条件下で維持することによって行われる。
【0034】
ＬＡＭＰ増幅用プライマーセットの種類及び配列は、第１ＬＡＭＰ認識配列及び第２ＬＡＭＰ認識配列の配列に従って選択される。例えば、ＬＡＭＰ増幅用プライマーセットは、第１ＬＡＭＰ認識配列及び第２ＬＡＭＰ認識配列の配列に対応するＦＩＰプライマー及びＢＩＰプライマーを含む。必要であれば、それはＦ３プライマー、Ｂ３プライマー及び／又はＬＦプライマー若しくはＬＢプライマー等のループプライマーを含んでもよい。
【0035】
ＬＡＭＰ認識配列の組み合わせを上記（１）の組み合わせとする場合、ＬＡＭＰ増幅用プライマーセットとして、例えば、以下の表２に示すＬＡＭＰ増幅用プライマーセットＡ又はＢを用いることができる。なお、ＬＡＭＰ増幅用プライマーセットＡのＬＢプライマーに関しては、配列番号８又は９のどちらかを用いることができる。
【0036】
【表2】
【0037】
以上の工程によれば、標的ｍｉＲＮＡをより特異的に逆転写、伸長及び増幅することができる。特に、表１及び表２に示すプライマーを用いる場合、逆転写、伸長及び増幅の特異性が向上する。したがって、より感度よく膵臓がんの罹患の有無を検出することが可能である。
【0038】
検出工程（Ｓ１－５）は、核酸を検出する一般的な方法により行うことができる。検出工程には、例えば、濁度の信号、光学的信号又は電気化学的信号等を用いることができる。
【0039】
濁度を用いる場合、例えば増幅産物又は増幅反応の存在に応じて増加する反応液の濁度、濁度の変化量又は濁度の立ち上がり時間を検出すればよい。検出は、例えば、濁度計若しくは分光光度計を用いて、又は目視等によって行うことができる。
【0040】
光学的信号を用いる場合、例えば、増幅産物又は増幅反応の存在に応じて変化する光学的信号を生ずる標識物質（蛍光試薬又はインターカレータ等）の存在下で増幅反応を行い、光学的信号の量、変化量又はその立ち上がり時間を検出すればよい。検出は、例えば、公知の何れかの光学センサを用いて、又は目視等によって行うことができる。
【0041】
電気化学的信号を用いる場合、例えば、増幅産物の増加に応じて変化する電気化学的信号を生ずる標識物質（レドックスプローブ等）の存在下で増幅反応を行い、電気化学的信号の量、変化量又は立ち上がり時間を検出すればよい。検出は、例えば、電極を備える電気化学検出用デバイスを用いて行うことができる。
【0042】
電気化学検出用デバイスは、例えばチップを含む。チップは、１つの面上に電極を備える基板を具備する。電極は、例えば金であれば感度が良好であるため好ましい。増幅産物を含む溶液を前記１つの面上に持ち込むと電極が溶液に接し、そこに存在する標識物質からの電気化学的信号を検出することができる。
【0043】
以上に説明した濁度、光学的信号及び電気化学的信号等の検出は、増幅反応の開始から特定の時点で行われてもよいし、経時的に行われてもよい。経時的とは、連続的であってもよいし、所望の時間間隔で複数の時点で検出することであってもよい。
【0044】
また、増幅産物の検出には、例えば、標的ｍｉＲＮＡ、標的ｍｉＲＮＡのｃＤＮＡ又は伸長産物１１の少なくとも１部の配列又はその相補的な配列を含む核酸プローブを用いてもよい。このような核酸プローブと増幅産物とのハイブリダイゼーションを検出することにより、増幅産物を検出することができる。
【0045】
以上のように検出工程（Ｓ１－５）で得られた各信号の量、変化量又は立ち上がり時間は増幅産物の量を反映するものであり、これらの情報から試料中にもともと存在している標的ｍｉＲＮＡの存在量を算出、即ち、定量する。
【0046】
例えば、試料中に存在する標的ｍｉＲＮＡの存在量が多いほど、より短い時間で信号の変化の立ち上がりが観察され得る。故に、立ち上がり時間と標的ｍｉＲＮＡの存在量との関係を表す検量線を用いて、試料中の標的ｍｉＲＮＡの定量を行うことができる。検量線は、異なる既知の濃度で標的ｍｉＲＮＡを含む複数の標準試料について信号の立ち上がり時間を計測することにより作成することができる。この検量線と、対象由来の試料について得られた立ち上がり時間の測定結果とを比較する。それによって、試料中の標的ｍｉＲＮＡの存在量を算出することができる。
【0047】
例えば、試料中の標的ｍｉＲＮＡの存在量は、試料の単位量当たりの標的ｍｉＲＮＡのコピー数として得られ得る。
【0048】
以上に説明した何れかの方法に従う定量工程（Ｓ１）で得られた定量結果から、対象における膵臓がんの罹患の有無を判定することができる。このような判定は、例えば、図４の（ａ）に示す定量工程（Ｓ１）の後に行われ得る判定工程（Ｓ２）によって行われ得る。
【0049】
例えば、判定工程（Ｓ２）では、対象における標的ｍｉＲＮＡの存在量が対照における標的ｍｉＲＮＡの存在量と比較して多い場合に、対象が膵臓がんに罹患していると判定することができる。対照とは、健常体で有り得る。健常体とは、少なくとも膵臓がんに罹患していない個体をいう。健常体は、何れの疾患や異常も有さない健康な個体であることが好ましい。
【0050】
ここで、対照として選択される個体は、本分析方法で検査を受ける対象とは別の個体であってもよいが、同じ種に属する個体、即ち対象がヒトであればヒトであることが好ましい。また、対照の年齢、性別及び身長体重等の身体的条件、又は人数は特に限定されるものではないが、身体的条件は、本分析方法で検査を受ける対象のものと同じ又は類似であることが好ましい。
【0051】
対照における標的ｍｉＲＮＡの存在量は、実施形態の分析方法が行われる前に、同じ又は類似の種類の試料及び方法を用いて予め得られたものであり得る。又は、対照における標的ｍｉＲＮＡの存在量は文献等の過去の知見から得た値であってもよい。
【0052】
或いは、定量工程（Ｓ１）で得られた定量値が予め定められた閾値以上である場合に、対象が膵臓がんに罹患していると判定してもよい。例えば、閾値は、定量工程（Ｓ１）で用いられる方法と同じ方法で健常な個体又は他のがんを有する個体と、膵臓がんを有する個体との標的ｍｉＲＮＡ定量値を測定し、比較することにより決定することができる。各個体は複数でもよい。閾値は、用いられる方法、試料の種類、測定条件に従って異なり得る。
【0053】
ここで、対象が膵臓がんに罹患していると判定することは、膵臓がんへの罹患可能性が高いと判定することも含む。
【0054】
また、対象が膵臓がんに罹患していると判定することは、対象における膵臓がんの罹患の有無を他のがんと区別して判定することも含む。即ち、判定工程（Ｓ２）で膵臓がんに罹患していると判定された場合は、対象が他のがんではなく、膵臓がんに罹患していることを意味し得る。他のがんとは、例えば、膵臓がん以外に分類されるがん（悪性腫瘍、悪性新生物、癌及び肉腫）を含む。他のがんは、例えば、乳がん、大腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、肉腫、子宮体がん及び子宮肉腫等を含む。
【0055】
また、対象が膵臓がんに罹患していると判定することは、対象における膵臓がんの予後又は膵臓がんの再発の有無を判定することも含む。この場合、対象は、例えば本分析方法を行う以前に膵臓がんに罹患していると判定された対象、膵臓がんの治療を受けた対象、膵臓がんから治癒した対象、及び／又は膵臓がんの経過観察中の対象等であり得る。
【0056】
例えば、このような対象において標的ｍｉＲＮＡの定量を行った結果、定量値が対照より高い、又は予め定められた閾値以上である場合には、対象における膵臓がんの予後が不良である又は膵臓がんが再発している、或いはその可能性が高いと判定することが可能である。そのような分析方法は、図４の（ｂ）に示すように、定量工程（Ｓ１）の後、定量の結果から対象における膵臓がんの予後又は膵臓がんの再発の有無を判定する判定工程（Ｓ３）を含む。
【0057】
更なる実施形態においては、判定工程（Ｓ２）又は（Ｓ３）の後、その結果に従って対象に適用するための治療法の種類又は薬剤の種類を選択することも可能である。治療法又は薬剤は、膵臓がんの治療のためのものである。治療法の種類又は薬剤の種類は、治療法又は薬剤の使用量、タイミング若しくは期間を含む。そのような分析方法は、図４の（ｃ）に示すように、判定工程（Ｓ２）又は（Ｓ３）の後、定量の結果から対象に適用するための治療法の種類又は薬剤の種類を選択する選択工程（Ｓ４）を含む。
【0058】
また、更なる実施形態においては、判定工程（Ｓ２）又は（Ｓ３）の後、当該判定をより確かなものにするために、対象を更なる膵臓がん用の検査、例えば、細胞診等に供してもよい。
【0059】
実施形態の分析方法は、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ以外のマーカーを検出又は定量する工程を含まない。そして、膵臓がんの罹患の有無の判定は、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ以外のマーカーの検出又は定量結果を用いることなく行われる。即ち、実施形態の分析方法によれば、１種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ）を定量することにより、簡便に対象における膵臓がんの罹患の有無を判定することが可能である。ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ以外のマーカーは、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、糖タンパク質又はペプチド等を含む。
【0060】
更に、実施形態の分析方法は、健康診断等で容易に採取できる血清を用いることが可能であるため、膵臓がんを早期に発見することができる。加えて、実施形態の分析方法は、細胞診等と比較して対象の肉体的及び経済的負担を大きく軽減することができるとともに、手順が容易であるため検査者にとっても負担が少ない。また、血清は、そこに含まれるｍｉＲＮＡ濃度が安定しているため、より正確な検査を行うことが可能である。
【0061】
（マーカー）
実施形態によれば、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐを含む、膵臓がん検出用マーカーが提供される。
実施形態によれば、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐを含む、膵臓がん検出用マーカーが提供される。
【0062】
実施形態の膵臓がん検出用マーカーは、例えば、対象における膵臓がんの罹患の有無の判定、対象における膵臓がんの予後判定、及び対象における膵臓がんの再発の有無の判定等に使用することができる。
【0063】
また、実施形態のマーカーは、対象に適用する治療方法の種類又は薬剤の種類の選択にも使用することができる。ここで、治療方法又は薬剤は、膵臓がんの治療のためのものである。
【0064】
或いは、実施形態のマーカーは、試料中の膵臓がん細胞の検出にも使用することが可能である。
【0065】
（キット）
実施形態によれば、膵臓がん検出用キットが提供される。
実施形態によれば、膵臓がん検出用キットが提供される。
【0066】
当該キットは、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐを増幅するためのプライマーセット（以下、「第１プライマーセット」と称する）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐを逆転写するためのＲＴプライマー、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐを伸長するためのＥＬプライマー、及びｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐを検出するための核酸プローブからなる群から選択される少なくとも１種の核酸を含む。
【0067】
第１プライマーセットは、例えばＬＡＭＰ増幅用のプライマーセットである。第１プライマーセットとして、例えば、表２に示すＬＡＭＰ増幅用プライマーセットＡ又はＢの少なくとも１つを用いることができる。
【0068】
実施形態のキットがＲＴプライマー及びＥＬプライマーを含む場合、表１に示す逆転写及び伸長用プライマーセットＡ又はＢの少なくとも１つを用いることができる。
【0069】
核酸プローブは、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐの少なくとも１部の配列又はその相補配列、或いは、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐのｃＤＮＡの少なくとも１部の配列又はその相補配列を含む。
【0070】
キットに含まれる上記核酸は、個別に又は何れかが組み合わされて、適切な担体とともに容器に収容されて提供されてもよい。適切な担体は、例えば、水又は緩衝液等である。容器は、例えば、チューブ又はマイクロタイタープレート等である。或いは、これらの核酸はマイクロ流体チップ等の固相に付着又は固定されて提供されてもよい。
【0071】
キットは、上記核酸の他に、逆転写、伸長及び／又は増幅に用いられる試薬、検出に用いられる指示薬（例えば、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎやＥＶＡ Ｇｒｅｅｎなどの蛍光色素、電流検出する場合はルテニウムヘキサアミンなどの金属錯体）等を含んでもよい。
【0072】
実施形態の膵臓がん検出用キットは、例えば、対象における膵臓がんの罹患の有無の判定、対象における膵臓がんの予後判定、及び対象における膵臓がんの再発の有無の判定等に使用することができる。また、実施形態のキットは、対象に適用する治療方法の種類又は薬剤の種類の選択にも使用することができる。ここで、治療方法又は薬剤は、膵臓がんの治療のためのものである。或いは、実施形態のキットは、試料中の膵臓がん細胞の検出にも使用することが可能である。
【0073】
更なる実施形態によれば、膵臓がん検出用キットは、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐを増幅するためのプライマーセット、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐを逆転写するためのＲＴプライマー、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐを伸長するためのＥＬプライマー、及びｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐを検出するための核酸プローブからなる群から選択される少なくとも１種の核酸を含む膵臓がんの診断用組成物又は診断薬として提供される。また、実施形態によれば、膵臓がんの診断用組成物又は膵臓がんの診断薬の製造における上記核酸の少なくとも１種の使用も提供される。
【0074】
・第２の実施形態
第２の実施形態において、図５の（ａ）に示すように、対象由来の試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐを定量すること（定量工程（Ｓ１１））を含む、対象における膵臓がんの罹患の有無の判定を補助するための分析方法も提供される。
第２の実施形態において、図５の（ａ）に示すように、対象由来の試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐを定量すること（定量工程（Ｓ１１））を含む、対象における膵臓がんの罹患の有無の判定を補助するための分析方法も提供される。
【0075】
「判定を補助する」とは、例えば、対象が膵臓がんに罹患している可能性に関する情報を取得することを含む。そのような分析方法は、図５の（ｂ）に示すように、以下の工程を含む。
【0076】
（Ｓ１１）対象由来の試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐを定量する定量工程、及び
（Ｓ１２）対象が膵臓がんに罹患している可能性に関する情報を得る情報取得工程。
（Ｓ１２）対象が膵臓がんに罹患している可能性に関する情報を得る情報取得工程。
【0077】
定量工程（Ｓ１１）は、上記の定量工程（Ｓ１）と同様の方法により行うことができる。情報取得工程（Ｓ１２）で得られる情報とは、例えば、定量工程（Ｓ１１）の定量結果から得られる、試料中における標的ｍｉＲＮＡの存在量に関する情報である。例えば、情報は、増幅産物の定量値又は試料中の標的ｍｉＲＮＡの定量値等である。
【0078】
当該情報は、上記のような対照又は予め定められた閾値と比較されることにより、試料の由来となる対象における膵臓がんの罹患の有無の判定、対象における膵臓がんの予後判定、膵臓がんの再発の有無の判定、或いは対象に適用される治療法の種類又は薬剤の種類の選択等に用いることができる。
【0079】
［例］
以下に、実施形態の分析方法又はキットを用いて行った実験について記載する。
以下に、実施形態の分析方法又はキットを用いて行った実験について記載する。
【0080】
例１．健常者血清及びがん患者血清中のｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐの定量（ｑＲＴ－ＰＣＲ法）
健常者１６検体、乳がん患者２２検体、大腸がん患者６検体、胃がん患者６検体、肺がん患者３検体、卵巣がん患者６検体、膵臓がん患者１１検体、胆管がん患者５検体、食道がん患者５検体、肝臓がん患者５検体、脳腫瘍患者５検体、膀胱がん患者５検体、膵臓がん患者５検体、肉腫患者５検体、子宮体がん患者５検体、子宮肉腫患者５検体から得られた血清を用意した。
健常者１６検体、乳がん患者２２検体、大腸がん患者６検体、胃がん患者６検体、肺がん患者３検体、卵巣がん患者６検体、膵臓がん患者１１検体、胆管がん患者５検体、食道がん患者５検体、肝臓がん患者５検体、脳腫瘍患者５検体、膀胱がん患者５検体、膵臓がん患者５検体、肉腫患者５検体、子宮体がん患者５検体、子宮肉腫患者５検体から得られた血清を用意した。
【0081】
全ての血清からＲＮＡを抽出した。抽出は、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ｍｉＲＮＡ Ｐｌａｓｍａ（商品名、タカラバイオ社製）を用いて行った。
【0082】
次に、抽出サンプル中に存在する短鎖ＲＮＡを逆転写しｃＤＮＡを合成及び増幅した。合成は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｉＲＮＡ Ａｓｓａｙ（商品名、サーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）の取扱説明書にしたがって、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｉＲＮＡ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（商品名、サーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）を用いて行った。
【0083】
続いて、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（商品名、サーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）及びＴａｑＭａｎ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｉＲＮＡ Ａｓｓａｙ ＩＤ：４７７８５５＿ｍｉｒを用いてＴａｑＭａｎ ＰＣＲを行い、Ｃｔ値を測定し、ｍｉＲＮＡを定量した。１０２コピーでは検出限界以下であった。
【0084】
【0085】
具体的には、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐは、健常者では１０３～１０４コピーオーダー、膵臓がん以外のがん患者では１０４～１０５コピーオーダー、膵臓がん患者では１０４～６コピーオーダーで分布していた。がん患者は健常者より高い値に分布し、さらに膵臓がん患者は他のがんよりも高い値を示した。この結果から、膵臓がん患者では血清中のｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐの存在量が多いことが示された。
【0086】
健常者及びがん患者、膵臓がん患者及び健常者＋他のがん患者、膵臓がん患者及び他のがん患者をそれぞれ切り分けるＡＵＣ（Ａｒｅａ Ｕｎｄｅｒ Ｃｕｒｖｅ）を以下の表３に示す。
【0087】
【表3】
【0088】
健常者とがん患者とを切り分けるＡＵＣは約０．９５であり、膵臓がん患者と健常者＋他のがん患者との間のＡＵＣは約０．８５であり、膵臓がん患者と他のがん患者との間のＡＵＣは約０．８３であった。
【0089】
したがって、配列番号１のｍｉＲＮＡ、即ちｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐは、膵臓がんを健常者及び他のがんと区別して検出するためのマーカーとして高性能であることが示された。
【0090】
例２．健常者血清及びがん患者血清中のｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐの定量（ＬＡＭＰ法）
検体の内訳は例１と同じである。また、ＲＮＡの抽出は、例１と同じ方法で行った。抽出サンプル２μＬを、反応体積２０μＬ、１６℃１０分、４２℃５分、８５℃５分の条件で逆転写した。逆転写反応液の組成は、６７ｕｎｉｔ ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（＊）、１×ＲＴ Ｂｕｆｆｅｒ（＊）、０．１ｍＭのｄＮＴＰｓ（＊）、４ＵのＲＮａｓｅＯＵＴ（商品名、サーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）、１０ｎＭのＲＴプライマー（表５、配列番号２）であった。「＊」を付したものは全てＨｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（商品名、サーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）に含まれているものを用いた。
検体の内訳は例１と同じである。また、ＲＮＡの抽出は、例１と同じ方法で行った。抽出サンプル２μＬを、反応体積２０μＬ、１６℃１０分、４２℃５分、８５℃５分の条件で逆転写した。逆転写反応液の組成は、６７ｕｎｉｔ ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（＊）、１×ＲＴ Ｂｕｆｆｅｒ（＊）、０．１ｍＭのｄＮＴＰｓ（＊）、４ＵのＲＮａｓｅＯＵＴ（商品名、サーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）、１０ｎＭのＲＴプライマー（表５、配列番号２）であった。「＊」を付したものは全てＨｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（商品名、サーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）に含まれているものを用いた。
【0091】
逆転写後の反応液に、伸長液５μＬを添加して、９５℃２分後、９５℃２０秒－５９℃３０秒－７２℃１０秒のサイクルを２０回かけて伸長を行った。伸長液は、２５μＬ伸長反応液中に、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（ｅｘｏ－）ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（０．５Ｕ、ニューイングランドバイオ）を含み、終濃度が、０．２×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ Ｂｕｆｆｅｒ（ＤｅｅｐＶｅｎｔ（ｅｘｏ－）ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ付属）、０．２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１２ｍＭのｄＮＴＰｓ、１０ｎＭのＥＬプライマー（表５、配列番号３）となるよう調整した。
【0092】
次に、伸長した産物１μＬを、反応体積２５μＬ、６５℃６０分の条件でＬＡＭＰ増幅を行い、同時に蛍光強度の立ち上り時間を測定した。ＬＡＭＰ増幅液は、８ＵのＴｉｎ（ｅｘｏ－）ＬＦ ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｏｐｔｉｇｅｎｅ）、０．５μＬのＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）（Ｂｉｏｔｉｕｍ）を含み、終濃度がそれぞれ、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭのＫＣｌ、８ｍＭのＭｇＳＯ４、１０ｍＭの（ＮＨ４）ＳＯ４、０．１％のＴｗｅｅｎ－２０、０．８Ｍのベタイン、各１．４ｍＭのｄＮＴＰｓ、１．６μＭのＦＩＰプライマー（表５、配列番号６）、１．６μＭのＢＩＰプライマー（表５、配列番号７）、及び０．８μＭのＬＢプライマー（表５、配列番号８）となるよう調整した。リアルタイムＰＣＲ装置にて、経時的に蛍光強度を測定し、閾値を超える時間を測定した。
【0093】
【表4】
【0094】
配列番号１の合成ＲＮＡの０、１０２、１０３、１０４及び１０５コピー／μＬを表５のプライマーセットＡを用いて逆転写、伸長及びＬＡＭＰ増幅し、同様に蛍光強度の立ち上り時間を測定した。この結果を用いて配列番号１のＲＮＡのコピー数と立ち上がり時間の検量線を作成した（図７）。検量線は、濁度の立ち上がり時間のｍｉＲＮＡ濃度依存性について優れていた。このことから、プライマーセットＡは標的ｍｉＲＮＡを特異的に伸長及び増幅することが可能であることが明らかとなった。この検量線を用いて、各検体における立ち上がり時間からＲＮＡのコピー数を算出した。
【0095】
定量の結果を図８に示す。図８は、健常者、膵臓がん以外のがん患者及び膵臓がん患者の定量結果を示す箱ひげ図である。定量値は、健常者では１０４～１０５コピーオーダー、膵臓がん以外のがん患者では１０５コピーオーダー、膵臓がん患者では１０６コピーオーダーで分布していた。がん患者は健常者より高い値に分布し、更に膵臓がん患者は他のがんよりも高い値を示した。この結果から、膵臓がん患者では血清中のｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐの存在量が多いことが示された。
【0096】
健常者及びがん患者、膵臓がん患者及び健常者＋他のがん患者、膵臓がん患者及び他のがん患者をそれぞれ切り分けるＡＵＣ（Ａｒｅａ Ｕｎｄｅｒ Ｃｕｒｖｅ）を以下の表４に示す。
【0097】
【表5】
【0098】
健常者とがん患者とを切り分けるＡＵＣは約０．８５であり、膵臓がん患者と健常者＋他のがん患者との間のＡＵＣは約０．８３であり、膵臓がん患者と他のがん患者との間のＡＵＣは約０．８０であった。
【0099】
この結果から、配列番号１のｍｉＲＮＡ、即ちｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐは、膵臓がんを健常者及び他のがんと区別して検出するためのマーカーとして高性能であることが示された。また、ＬＡＭＰ法を用いた本例の結果は、例１のようにｑＲＴ－ＰＣＲを用いるより高い分離能であることが明らかとなった。
【0100】
例３．ＬＢ配列の検討
例２において作製した合成ＲＮＡによる検量線用伸長産物を、配列番号８のＬＢ配列に代えて、表６に示す配列番号９のＬＢ配列を用いて例２と同様の方法で増幅した。
例２において作製した合成ＲＮＡによる検量線用伸長産物を、配列番号８のＬＢ配列に代えて、表６に示す配列番号９のＬＢ配列を用いて例２と同様の方法で増幅した。
【0101】
【表6】
【0102】
その結果、配列番号９のＬＢプライマーを用いた場合も、濁度の立ち上がり時間のｍｉＲＮＡ濃度依存性が良好であり、ｍｉＲＮＡのコピー数が０であるときの非特異的増幅が少なかった。したがって、配列番号９のＬＢ配列も本ＬＡＭＰ増幅系において有効に用いることが可能であることが示された。
【0103】
例４．プライマーセットの特異性の評価
また、表７に示すプライマーセットＢを用いて、例２と同じ条件で、配列番号１の合成ＲＮＡの０、１０３、１０４、１０５及び１０６コピー／μＬの逆転写、伸長及びＬＡＭＰ増幅を行い、濁度の立ち上がり時間を計測した。
また、表７に示すプライマーセットＢを用いて、例２と同じ条件で、配列番号１の合成ＲＮＡの０、１０３、１０４、１０５及び１０６コピー／μＬの逆転写、伸長及びＬＡＭＰ増幅を行い、濁度の立ち上がり時間を計測した。
【0104】
【表7】
【0105】
結果を図９に示す。プライマーセットＢを用いた場合でも、濁度の立ち上がり時間のｍｉＲＮＡ濃度依存性が良好であった。この結果から、プライマーセットＢも標的ｍｉＲＮＡを特異的に伸長及び増幅することが可能であることが明らかとなった。したがって、このプライマーセットを用いれば、膵臓がんの検出の精度が向上することが示唆された。
【0106】
例５．電気化学的検出
例２で使用したＦＩＰプライマー及びＢＩＰプライマー（各４８μＭ）、ＬＢプライマー（２４μＭ）を含むプライマー溶液を調製した。シリコーン製流路パッキン（流路幅×高さ：１ｍｍ×１ｍｍ）にプライマー溶液１００ｎＬを、微量分注機を用いてスポットした。電極をパターニングしたＤＮＡチップ基板（ガラス（０．８ｍｍ）／チタン（５００ｎｍ）／金（２０００ｎｍ））と該流路パッキンとをカセットに組み込み、チップを作製した。
例２で使用したＦＩＰプライマー及びＢＩＰプライマー（各４８μＭ）、ＬＢプライマー（２４μＭ）を含むプライマー溶液を調製した。シリコーン製流路パッキン（流路幅×高さ：１ｍｍ×１ｍｍ）にプライマー溶液１００ｎＬを、微量分注機を用いてスポットした。電極をパターニングしたＤＮＡチップ基板（ガラス（０．８ｍｍ）／チタン（５００ｎｍ）／金（２０００ｎｍ））と該流路パッキンとをカセットに組み込み、チップを作製した。
【0107】
次に、表８に示す組成のＬＡＭＰ増幅反応液を調整した。
【0108】
【表8】
【0109】
上記ＬＡＭＰ増幅反応液に、例２で用いた伸長後の鋳型を１μＬ添加し、表９に示す条件で電気化学測定を行った。
【0110】
【表9】
【0111】
ＬＡＭＰ増幅反応が開始されると、ルテニウムヘキサアミン（ＲｕＨｅｘ）の還元電流値が増加し始めた。電流が増加する時間は、伸長産物の存在量が多いほど早く、本チップを用いて定量検出が可能であることが明らかとなった。
【0112】
本発明の幾つかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら新規な実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これらの実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれるとともに、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれる。
以下に、本願出願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］
対象由来の試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐを定量することを含む、前記対象における膵臓がんの罹患の有無を判定する分析方法であって、
前記判定においては、前記対象が他のがんではなく、膵臓がんに罹患していると判定する、分析方法。
［２］
対象由来の試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐを定量することを含む、前記対象における膵臓がんの罹患の有無の判定を補助する分析方法であって、
前記判定においては、前記対象が他のがんではなく、膵臓がんに罹患していると判定する、分析方法。
［３］
前記膵臓がんの罹患の有無の判定は、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ以外のマーカーの検出又は定量結果を用いることなく行われる、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］
前記対象におけるｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐの存在量が、対照におけるｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐの存在量よりも多い場合、前記対象が膵臓がんに罹患していると判定する判定工程を更に含む［１］～［３］の何れか１つに記載の方法。
［５］
前記膵臓がんの罹患の有無の判定は、前記対象における膵臓がんの予後判定、又は前記対象における膵臓がんの再発の有無の判定を含む、［１］～［４］の何れか１つに記載の方法。
［６］
前記他のがんは、乳がん、大腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、肉腫、子宮体がん及び子宮肉腫を含む、［５］に記載の方法。
［７］
前記試料は、血清である、［１］～［６］の何れか１つに記載の方法。
［８］
前記定量は、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐを増幅するためのプライマーセット（以下、「第１プライマーセット」と称する）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐを逆転写するための逆転写用プライマー、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐを伸長するための伸長用プライマー、及びｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐを検出するための核酸プローブからなる群から選択される少なくとも１種の核酸を用いて行われる、［１］～［７］の何れか１つに記載の方法。
［９］
前記定量は、
（Ｓ１－１）ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐの配列（以下、「第１の配列」と称する）とハイブリダイズする第１プライマー部及び第１ＬＡＭＰ認識配列を含む逆転写用プライマーの、前記第１プライマー部を前記第１の配列とハイブリダイズさせ、前記第１の配列を逆転写し、前記第１の配列の相補配列（以下、「第１ａの配列」と称する）を含む逆転写産物を得る逆転写工程、
（Ｓ１－２）前記逆転写産物と前記ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐとを解離させる解離工程、
（Ｓ１－３）前記第１ａの配列とハイブリダイズする第２プライマー部及び第２ＬＡＭＰ認識配列を含む伸長用プライマーの、前記第２プライマー部を前記逆転写産物の前記第１ａの配列とハイブリダイズさせ、前記伸長用プライマー及び前記逆転写産物を、互いを鋳型として伸長させて、前記第１ａの配列の相補配列を含む伸長産物を得る伸長工程、
（Ｓ１－４）第１プライマーセットを用いてＬＡＭＰ反応により前記伸長産物を増幅し、増幅産物を得る増幅工程、及び
（Ｓ１－５）得られた前記増幅産物を検出する検出工程
を含む、
［８］に記載の方法。
［１０］
前記第１プライマーセットは、
配列番号８のＦＩＰプライマー、配列番号９のＢＩＰプライマー及び配列番号１０のＬＢプライマーを含むか、
配列番号８のＦＩＰプライマー、配列番号９のＢＩＰプライマー及び配列番号１１のＬＢプライマーを含むか、
配列番号１２のＦＩＰプライマー、配列番号１３のＢＩＰプライマー及び配列番号１０のＬＢプライマーを含むか、又は
配列番号１４のＦＩＰプライマー、配列番号１５のＢＩＰプライマー及び配列番号１０のＬＢプライマーを含み、
前記逆転写用プライマーが配列番号２を含み、前記伸長用プライマーが配列番号３を含むか、
前記逆転写用プライマーが配列番号４を含み、前記伸長用プライマーが配列番号５を含むか、又は
前記逆転写用プライマーが配列番号６を含み、前記伸長用プライマーが配列番号７を含む、
［８］又は［９］に記載の方法。
［１１］
ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐを増幅するためのプライマーセット（以下、「第１プライマーセット」と称する）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐを逆転写するための逆転写用プライマー、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐを伸長するための伸長用プライマー、及びｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐを検出するための核酸プローブからなる群から選択される少なくとも１種の核酸を含む、膵臓がんを検出するためのキットであって、
前記検出は、他のがんではなく、膵臓がんを検出することである、
キット。
［１２］
前記第１プライマーセットは、
配列番号８のＦＩＰプライマー、配列番号９のＢＩＰプライマー及び配列番号１０のＬＢプライマーを含むか、
配列番号８のＦＩＰプライマー、配列番号９のＢＩＰプライマー及び配列番号１１のＬＢプライマーを含むか、
配列番号１２のＦＩＰプライマー、配列番号１３のＢＩＰプライマー及び配列番号１０のＬＢプライマーを含むか、又は
配列番号１４のＦＩＰプライマー、配列番号１５のＢＩＰプライマー及び配列番号１０のＬＢプライマーを含み、
前記逆転写用プライマーが配列番号２を含み、前記伸長用プライマーが配列番号３を含むか、
前記逆転写用プライマーが配列番号４を含み、前記伸長用プライマーが配列番号５を含むか、又は
前記逆転写用プライマーが配列番号６を含み、前記伸長用プライマーが配列番号７を含む、［１１］に記載のキット。
［１３］
前記他のがんは、乳がん、大腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、肉腫、子宮体がん及び子宮肉腫を含む、［１１］に記載のキット。
以下に、本願出願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］
対象由来の試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐを定量することを含む、前記対象における膵臓がんの罹患の有無を判定する分析方法であって、
前記判定においては、前記対象が他のがんではなく、膵臓がんに罹患していると判定する、分析方法。
［２］
対象由来の試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐを定量することを含む、前記対象における膵臓がんの罹患の有無の判定を補助する分析方法であって、
前記判定においては、前記対象が他のがんではなく、膵臓がんに罹患していると判定する、分析方法。
［３］
前記膵臓がんの罹患の有無の判定は、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐ以外のマーカーの検出又は定量結果を用いることなく行われる、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］
前記対象におけるｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐの存在量が、対照におけるｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐの存在量よりも多い場合、前記対象が膵臓がんに罹患していると判定する判定工程を更に含む［１］～［３］の何れか１つに記載の方法。
［５］
前記膵臓がんの罹患の有無の判定は、前記対象における膵臓がんの予後判定、又は前記対象における膵臓がんの再発の有無の判定を含む、［１］～［４］の何れか１つに記載の方法。
［６］
前記他のがんは、乳がん、大腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、肉腫、子宮体がん及び子宮肉腫を含む、［５］に記載の方法。
［７］
前記試料は、血清である、［１］～［６］の何れか１つに記載の方法。
［８］
前記定量は、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐを増幅するためのプライマーセット（以下、「第１プライマーセット」と称する）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐを逆転写するための逆転写用プライマー、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐを伸長するための伸長用プライマー、及びｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐを検出するための核酸プローブからなる群から選択される少なくとも１種の核酸を用いて行われる、［１］～［７］の何れか１つに記載の方法。
［９］
前記定量は、
（Ｓ１－１）ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐの配列（以下、「第１の配列」と称する）とハイブリダイズする第１プライマー部及び第１ＬＡＭＰ認識配列を含む逆転写用プライマーの、前記第１プライマー部を前記第１の配列とハイブリダイズさせ、前記第１の配列を逆転写し、前記第１の配列の相補配列（以下、「第１ａの配列」と称する）を含む逆転写産物を得る逆転写工程、
（Ｓ１－２）前記逆転写産物と前記ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐとを解離させる解離工程、
（Ｓ１－３）前記第１ａの配列とハイブリダイズする第２プライマー部及び第２ＬＡＭＰ認識配列を含む伸長用プライマーの、前記第２プライマー部を前記逆転写産物の前記第１ａの配列とハイブリダイズさせ、前記伸長用プライマー及び前記逆転写産物を、互いを鋳型として伸長させて、前記第１ａの配列の相補配列を含む伸長産物を得る伸長工程、
（Ｓ１－４）第１プライマーセットを用いてＬＡＭＰ反応により前記伸長産物を増幅し、増幅産物を得る増幅工程、及び
（Ｓ１－５）得られた前記増幅産物を検出する検出工程
を含む、
［８］に記載の方法。
［１０］
前記第１プライマーセットは、
配列番号８のＦＩＰプライマー、配列番号９のＢＩＰプライマー及び配列番号１０のＬＢプライマーを含むか、
配列番号８のＦＩＰプライマー、配列番号９のＢＩＰプライマー及び配列番号１１のＬＢプライマーを含むか、
配列番号１２のＦＩＰプライマー、配列番号１３のＢＩＰプライマー及び配列番号１０のＬＢプライマーを含むか、又は
配列番号１４のＦＩＰプライマー、配列番号１５のＢＩＰプライマー及び配列番号１０のＬＢプライマーを含み、
前記逆転写用プライマーが配列番号２を含み、前記伸長用プライマーが配列番号３を含むか、
前記逆転写用プライマーが配列番号４を含み、前記伸長用プライマーが配列番号５を含むか、又は
前記逆転写用プライマーが配列番号６を含み、前記伸長用プライマーが配列番号７を含む、
［８］又は［９］に記載の方法。
［１１］
ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐを増幅するためのプライマーセット（以下、「第１プライマーセット」と称する）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐを逆転写するための逆転写用プライマー、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐを伸長するための伸長用プライマー、及びｈｓａ－ｍｉＲ－１２２－５ｐを検出するための核酸プローブからなる群から選択される少なくとも１種の核酸を含む、膵臓がんを検出するためのキットであって、
前記検出は、他のがんではなく、膵臓がんを検出することである、
キット。
［１２］
前記第１プライマーセットは、
配列番号８のＦＩＰプライマー、配列番号９のＢＩＰプライマー及び配列番号１０のＬＢプライマーを含むか、
配列番号８のＦＩＰプライマー、配列番号９のＢＩＰプライマー及び配列番号１１のＬＢプライマーを含むか、
配列番号１２のＦＩＰプライマー、配列番号１３のＢＩＰプライマー及び配列番号１０のＬＢプライマーを含むか、又は
配列番号１４のＦＩＰプライマー、配列番号１５のＢＩＰプライマー及び配列番号１０のＬＢプライマーを含み、
前記逆転写用プライマーが配列番号２を含み、前記伸長用プライマーが配列番号３を含むか、
前記逆転写用プライマーが配列番号４を含み、前記伸長用プライマーが配列番号５を含むか、又は
前記逆転写用プライマーが配列番号６を含み、前記伸長用プライマーが配列番号７を含む、［１１］に記載のキット。
［１３］
前記他のがんは、乳がん、大腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、胆管がん、食道がん、肝臓がん、脳腫瘍、膀胱がん、肉腫、子宮体がん及び子宮肉腫を含む、［１１］に記載のキット。
【符号の説明】
【0113】
１…標的ｍｉＲＮＡ，２…第１の配列，３…逆転写用プライマー（ＲＴプライマー），
４…第１プライマー部，５…第１ａの配列，６…逆転写産物，
７…伸長用プライマー（ＥＬプライマー），８…第２プライマー部，
９…第１ａの配列の相補配列，１０…伸長産物
４…第１プライマー部，５…第１ａの配列，６…逆転写産物，
７…伸長用プライマー（ＥＬプライマー），８…第２プライマー部，
９…第１ａの配列の相補配列，１０…伸長産物
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】